BR112019026444A2

BR112019026444A2 - composições de enxerto tipo patch graft para enxerto celular

Info

Publication number: BR112019026444A2
Application number: BR112019026444-2A
Authority: BR
Inventors: Wencheng Zhang; Eliane Wauthier; Lola M. Reid
Original assignee: The University Of North Carolina At Chapel Hill
Priority date: 2017-06-12
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2020-07-14
Also published as: IL271146A; CN111032090A; US20180361027A1; IL296689A; EP3638310A1; KR20200028391A; US20240082461A1; US20190015556A1; MX2019014912A; US20220347350A1; US20180353652A1; US11738117B2; SG11201911701SA; US11129923B2; AU2018282728A1; US20180353651A1; RU2020100063A3; AU2020283472A1; US20190388584A1; US20180361028A1

Abstract

São fornecidos composições e métodos de transplante de células por meio de estratégias de enxerto em órgãos sólidos. Esses métodos e composições podem ser usados para reparar órgãos doentes ou para estabelecer modelos de estados de doença em hospedeiros experimentais. O método envolve a fixação na superfície de um tecido ou órgão, de um enxerto tipo patch graft, uma cobertura "tipo curativo adesivo", contendo células epiteliais com suporte de células mesenquimais no estágio de linhagem inicial. As células são incorporadas em biomateriais formadores de gel preparados em condições definidas sem soro que suportam em conjunto a similaridade das células doadoras com células-tronco. O enxerto é coberto com um suporte biodegradável biocompatível e biorreabsorvível usado para fixar o enxerto ao local alvo. As células no enxerto migram para e em todo o tecido de modo que, em duas semanas, elas sejam uniformemente dispersas dentro do tecido receptor (hospedeiro). Os mecanismos pelos quais o enxerto e a integração de células doadoras ao órgão ou tecido envolvem múltiplas formas de MMPs associadas à membrana e secretadas.

Description

COMPOSIÇÕES DE ENXERTO TIPO PATCH GRAFT PARA ENXERTO CELULAR REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica prioridade sob o 35 U.S.C. S$ 119(e) ao Pedido U.S. Nº 62/518,380, depositado em 12 de junho de 2017, e ao Pedido U.S. Nº 62/664,694, depositado em 30 de abril de 2018, cujo conteúdo está aqui incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção é direcionada, de modo geral, ao campo de transplante de células ou enxerto de tecido. Mais especificamente, de órgãos ou tecidos sólidos em órgãos ou tecidos sólidos, especialmente para órgãos internos. A invenção refere-se a composições e métodos que fornecem estratégias para transplante rápido, enxertos e integração de células em órgãos e tecidos sólidos para tratar doenças ou condições de órgãos ou tecidos sólidos ou para estabelecer sistemas de modelo de uma doença. Exemplos “representativos deste potencial são terapias celulares para tratamento de doenças hepáticas ou pancreáticas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0003] Há muito tempo há a necessidade de estratégias de enxerto para células de órgãos sólidos, estratégias distintas daquelas usadas para transplante de células hematopoiéticas ou para células-tronco/progenitores mesenquimais. Turner, R., et al. Transplantation 90, 807- 810 (2010); Gattinoni, L. et al. Nature Medicine 23, 18-27 (2017); Trounson A. et al. Cell Stem Cell 17, 11-22 (2015);

Sun B.K. et al. Science 346, 941-945 (2014); Lainas, P. et al. J Hepatol 49, 354-362 (2008). O transplante de células hematopoiéticas e de células mesenquimais é feito rotineiramente pela entrega de células através de um canal vascular e é dependente da ativação de moléculas de adesão em células transplantadas quando em sítios alvo relevantes por causa da sinalização microambiental, um processo referido como "homing". Métodos usados para a pele (e semelhantes para alvos oculares) empregam métodos de enxerto com células aplicadas diretamente a sítios alvo. Sun B.K. et al. Science 346, 941-945 (2014). Muitos métodos de enxerto para a pele são utilizáveis para células de órgãos internos sólidos, mas exigem modificações substanciais para acomodar o microambiente desses órgãos internos. Os enxertos têm que competir com forças mecânicas exercidas pelas interações dos tecidos e órgãos uns sobre os outros; exemplos incluem os efeitos dos pulmões durante a respiração, ou a compressão do fígado contra o diafragma, ou os efeitos transitórios das forças mecânicas exercidas pelo trato intestinal em tecidos vizinhos durante o processamento dos alimentos. Enxertos, especialmente aqueles para órgãos internos, são difíceis de projetar por causa de questões em relação ao tamanho, forma e complexidade na estrutura de órgãos, além das forças mecânicas dinâmicas evidentes.

[0004] Por décadas, terapias celulares para células de órgãos sólidos que não a pele foram tentadas usando transplante através de uma via vascular ou por injeção direta no tecido. A maioria das células transplantadas,

quando entregues por qualquer uma dessas estratégias, ou morrem ou são transportadas para sítios ectópicos, onde elas podem viver por meses e criar tecido em sítios inapropriados, resultando potencialmente em efeitos adversos clinicamente. Turner, R., et al. Transplantation 90, 807-810 (2010); Lanzoni, G. et al. Stem Cells 31, 2047- 2060 (2013). O enxerto no fígado pode ser melhorado pelo revestimento das células com hialuronanos e entregando-os vascularmente ao fígado; o aumento da eficiência do enxerto é devido ao processo natural do fígado de depuração de hialuronanos. Nevi et al. Stem Cell Research & Therapy 8, 68, 2017. No entanto, essa melhora ainda é menos eficiente do que a com estratégias de enxerto e, importantemente, ainda permite a entrega de células para locais ectópicos.

[0005] Continua a existir uma necessidade de métodos melhorados de enxerto de células em órgãos sólidos. Esta divulgação atende a essa necessidade e oferece vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0006] Há muito tempo há uma necessidade de estratégias de enxerto para células de órgãos sólidos (Turner, R., et al. Transplantation 90, 807-810 (2010), estratégias distintas daquelas usadas para transplante de células hematopoiéticas, células-tronco mesenquimais ou para a pele. O transplante de células hematopoiéticas e células mesenquimais é feito rotineiramente através de um canal vascular e depende da ativação de moléculas de adesão em sítios alvo relevantes por causa da sinalização microambiental, um processo referido como "homing". Métodos usados para a pele empregam métodos de enxerto com células aplicadas diretamente a sítios alvo.

[0007] O transplante de células de órgãos sólidos que não a pele faz uso, há tempos, da entrega vascular. Isto não é lógico, uma vez que as moléculas de adesão nessas células são sempre ativadas e resultam em uma agregação rápida de células (segundos) que pode gerar êmbolos que ameaçam a vida. Mesmo que os êmbolos sejam gerenciados com êxito para minimizar os riscos de saúde, a eficiência do enxerto de células é baixa, apenas -20% para as células adultas e ainda mais baixa (<5%) para tronco/progenitores. A maioria das células transplantadas morre ou é transportada para sítios ectópicos, onde elas podem viver por meses, criando tecido em sítios inapropriados resultando em possíveis efeitos adversos clinicamente. A pequena porcentagem de células que enxertam nos sítios alvo se integram lentamente, exigindo de semanas a meses para que se tornem uma parte significativa do tecido. Há melhora no enxerto no fígado se as células forem revestidas com hialuronanos e entregues vascularmente devido à depuração do tecido (por exemplo, do fígado) de hialuronanos. (Nevi et al. Stem Cell Research & Therapy 8, 68, 2017).

[0008] os depositantes propõem uma abordagem radicalmente diferente, um achado ainda mais bem sucedido do que as células de revestimento com hialuronanos: colocação de enxertos diretamente sobre a superfície do sítio alvo e uso de biomateriais de enxerto e os traços fenotípicos exclusivos de certas células quando estão em condições de biomateriais de enxerto para melhorar o transplante. Isto faz paralelo com alguns aspectos das estratégias de terapias celulares para a pele, mas requer modificações substanciais para órgãos internos, dados efeitos mecânicos, abrasão ou compressão de órgãos próximos entre si, e dado os microambientes fluidos exclusivos em torno de órgãos específicos e o tamanho, estrutura e complexidade dos órgãos.

[0009] São descritas neste documento novas composições de enxerto tipo patch graft e métodos para transplante de células em tecido e órgãos sólidos. Em algumas concretizações, os métodos e enxertos são adaptados para órgãos internos, com características de projeto dependentes do nível de maturidade das células, especialmente se as células são células-tronco ou células maduras. Em algumas concretizações, as células doadoras (opcionalmente autólogas ou alógenas) para os enxertos tipo patch graft são divulgadas neste documento incorporadas nos biomateriais de enxerto, opcionalmente como uma mistura de células ou a forma de organoides, agregados de células- tronco epiteliais e seus parceiros de célula mesenquimais apropriados no estágio de linhagem - por exemplo células tronco/progenitoras mesenquimais tais como células mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ELSMCS). Em algumas concretizações, as células doadoras são células adultas incorporadas aos materiais de enxerto como suspensões celulares do epitélio adulto e colocadas juntas com células tronco/progenitoras mesenquimais, opcionalmente ELSMCS, em proporções projetadas para otimizar sua expressão de metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas à membrana e/ou secretadas. Em algumas concretizações, outras variáveis de importância são os biomateriais de enxerto e o material de suporte, ambos obrigados a serem neutros nos efeitos sobre a diferenciação das células doadoras.

[00010] Aspectos da divulgação referem-se a um enxerto tipo patch graft para sustentar e manter uma população de células únicas ou uma população mista de células, compreendendo: (a) um único tipo celular ou uma população mista tendo dois ou mais tipos celulares, pelo menos um dos quais está em um estágio de linhagem inicial que é capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas à membrana e ou/secretadas, ou que possuem MMPs incluídas de outra fonte (por exemplo, MMPs purificadas ou recombinantes), a referida população celular ou população mista sustentada em um meio presente em uma matriz de hidrogel com uma viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista, opcionalmente, dentro ou para fora do referido hidrogel e/ou dentro ou para fora do enxerto tipo patch graft; (b) um suporte compreendendo um material biocompatível e biodegradável com uma viscoelasticidade suficiente para inibir uma migração da referida população mista em uma direção do referido suporte; e, opcionalmente, (c) um hidrogel sobreposto em uma superfície serosa (isto é, do lado de fora) do referido suporte, que é oposto àquele em contato com a referida população mista e, em concretizações onde o enxerto tipo patch graft é conectado ao sítio alvo, é oposto ao lado em contato com o sítio alvo (por exemplo, órgão ou tecido). Em algumas “concretizações, esta camada impede ou inibe aderências por ou de outros tecidos ou órgãos. Em algumas concretizações, o enxerto tipo patch graft é configurado para sustentar e manter a referida população mista enquanto inibe o referido pelo menos um tipo celular em estágio de linhagem inicial a partir da diferenciação ou maturação posterior a um estágio de linhagem tardio que já não é mais capaz de expressar MMPs associadas à membrana e/ou secretadas. O enxerto tipo patch graft pode ser uma camada única mais um revestimento ou múltiplas camadas.

[00011] Em algumas concretizações, o referido suporte é poroso ou não poroso. Em algumas concretizações, o suporte compreende uma malha porosa, scaffold ou membrana. Em algumas concretizações, o revestimento compreende seda; um têxtil sintético; ou um material natural, tal como âmnion, placenta ou omento; ou uma combinação destes. Em algumas concretizações, o referido suporte compreende uma malha porosa infundida com um hidrogel. Em outras concretizações, tal infusão impede a migração celular para fora do órgão ou tecido alvo. Em algumas concretizações, o referido suporte compreende um material sólido.

[00012] Em algumas concretizações, um ou mais dos referidos hidrogéis compreendem hialuronanos.

[00013] Em algumas concretizações, o referido meio compreende o meio de Kubota ou outro meio de apoio de células-tronco e capaz de manter a potencialidade das células-tronco (“stemness”).

[00014] Em algumas concretizações, a referida população mista compreende células mesenquimais e células epiteliais. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais podem ser ectodérmicas, endodérmicas ou mesodérmicas. Em algumas concretizações, as referidas células mesenquimais compreendem células mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ELSMCS) . Em algumas concretizações, as referidas ELSMCS compreendem um ou mais dentre angioblastos, precursores para endotélio ou precursores para células estreladas e células-tronco mesenquimais (MSCs) . Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células-tronco epiteliais. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células-tronco de árvore biliar (BTSCs). Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células epiteliais comprometidas e/ou maduras. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais comprometidas e/ou maduras compreendem células parenquimais maduras. Em algumas concretizações, as referidas células parenquimais maduras compreendem um ou mais de hepatócitos, colangiócitos e células de ilhota. Em algumas concretizações, as referidas células mesenquimais e células epiteliais ambas compreendem células-tronco.

[00015] Em algumas concretizações, a referida população mista compreende células autólogas e/ou alogênicas.

[00016] Em algumas concretizações, um ou mais tipos celulares são geneticamente modificados.

[00017] Aspectos adicionais relacionados a métodos empregando as composições de enxerto tipo patch graft são divulgadas. Nesse sentido, são fornecidos neste documento métodos de enxerto de células em um tecido alvo compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato o tecido alvo com um enxerto tipo patch graft divulgado acima neste documento.

[00018] Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é selecionado do grupo que consiste em fígado, pâncreas, árvore biliar, tireoide, timo, gastrointestino, pulmão, próstata, mama, cérebro, bexiga, medula espinhal, pele e tecidos dérmicos subjacentes, tecidos uterino, renal, muscular, de vaso sanguíneo, cardíaco, cartilaginoso, dos tendões e ósseo. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido hepático. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido pancreático. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido de árvore biliar. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido gastrointestinal. Em algumas concretizações, o tecido está doente, danificado ou com um distúrbio. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido renal.

[00019] Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é um órgão. Em algumas concretizações dos métodos, o órgão é um órgão do sistema musculoesquelético, sistema digestivo, sistema respiratório, sistema urinário, sistema reprodutivo feminino, sistema reprodutivo masculino, sistema endócrino, sistema circulatório, sistema linfático, sistema nervoso ou sistema tegumentar. Em algumas concretizações dos métodos, o órgão é selecionado do grupo que consiste em fígado, pâncreas, árvore biliar tireoide, timo, estômago, intestinos, pulmão, próstata, mama, cérebro, bexiga, medula espinhal, pele e tecidos dérmicos subjacentes, útero, rim, músculo, vaso sanguíneo, coração, cartilagem, tendões e osso. Em algumas concretizações, o órgão está doente, danificado ou com um distúrbio.

[00020] Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio hepático, os métodos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato o fígado do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado acima. Em algumas concretizações dos métodos, a doença ou distúrbio hepático é fibrose hepática, cirrose hepática, hemocromatose, câncer do fígado, atresia biliar, esteatose hepática não alcoólica, hepatite, hepatite viral, hepatite autoimune, fasciolíase, doença hepática alcoólica, deficiência de alfa l-antitripsina, doença do armazenamento de glicogênio tipo II, amiloidoise hereditária relacionada à transtirretina, síndrome de Gilbert, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, síndrome de Budd-Chiari, trauma hepático ou doença de Wilson.

[00021] Em outros aspectos, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio do pâncreas, os métodos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato com o pâncreas do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado acima neste documento. Em algumas concretizações dos métodos, a doença ou distúrbio pancreático é diabetes mellitus, insuficiência pancreática exócrina, pancreatite, câncer pancreático, disfunção do esfíncter de Oddi, fibrose cística, pâncreas divisum, pâncreas anular, trauma pancreático ou hemosuccus pancreaticus.

[00022] Em outros aspectos, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio gastrointestinal, o método compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato com um ou mais dos intestinos do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado acima neste documento. Em algumas concretizações, a doença ou distúrbio gastrointestinal é gastroenterite, câncer gastrointestinal, ileíte, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável, doença de úlcera péptica, doença celíaca, fibrose, angiodisplasia, doença de Hirschsprung, colite pseudomembranosa ou trauma gastrointestinal.

[00023] Em alguns aspectos, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio do rim, os métodos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato com um ou mais dos rins do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado acima neste documento. Em algumas concretizações dos métodos, a doença ou distúrbio renal é nefrite, nefrose, síndrome nefrítica, síndrome nefrótica, doença renal crônica, lesão renal aguda, trauma renal, doença renal cística, doença renal policística, glomerulonefrite, nefropatia por IgA, nefrite lúpica,

câncer renal, síndrome de Alport, amiloidose, síndrome de Goodpasture ou granulomatose de Wegener.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00024] As Figuras 1A-1D fornecem informações sobre células doadoras suínas para os enxertos tipo patch graft. Figura 1A é um esquema do processo e estimativas do tempo necessário para a preparação de organoides, montagem de enxertos tipo patch graft e realização de cirurgias. Na Figura 1B, células doadoras para os enxertos tipo patch graft de células-tronco foram isoladas de suspensões celulares de tecido de árvore biliar de porcos transgênicos; as células foram preparadas como organoides em meio de Kubota sem soro e em placas de cultura de baixa aderência. Organoides de células-tronco de árvore biliar (BTSCS) e de seus parceiros de célula mesenquimal de estágio inicial (ELSMCS), angioblastos e precursores para endotélios e células estreladas. Eles são mostrados em uma micrografia de fase versus um demonstrando expressão do transgene, proteína verde fluorescente (GFP). Todas as células do agregado são verdes, uma vez que o transgene está nas células epiteliais e nas células mesenquimais. O transgene foi acoplado ao locus de histona (H-2B). Histologia dos organoides de células-tronco que foram embebidos em parafina, seccionados e corados com hematoxilina/eosina. (d) Imagem ampliada de um organoide de BTSC e ELSMCs. A Figura 1C mostra imuno-histoquímica (IHC) demonstrando a expressão de marcadores de células-tronco, hepáticos e pancreáticos, indicando que essas células são precursoras para o fígado e para o pâncreas. Os ensaios de

IHC indicam camadas externas com marcadores de células- tronco de estágio intermediário, tais como EpCAM e células interiores expressando genes muito primitivos, tais como genes de pluripotência e fatores de transcrição endodérmica (por exemplo, SOX17, SOX9, PDXl). A Figura 1D é um aRT-PCR representativo que avalia a expressão de vários genes nos organoides e indica que as células são células-tronco ou progenitores iniciais. Os controles foram hepatócitos maduros de fígados de leitões.

[00025] As Figuras 2A-2F fornecem informações sobre os principais componentes dos enxertos tipo patch graft. A Figura 2A é um esquema de um enxerto tipo patch graft afixado ao fígado de um porco e à direita, a composição dos enxertos. As células do estágio de linhagem iniciais, tanto do epitélio quanto as células mesenquimais, são fontes para a produção de metaloproteinases de matriz (MMPs), reguladores principais do enxerto. Os componentes da matriz dos biomateriais de enxerto nos quais as células doadoras são colocadas são suaves (-100 Pa), sem (ou com mínima) sulfatação, tais como hidrogéis de hialuronano. A estrutura do enxerto consiste em camadas de biomateriais e células conectadas ao sítio alvo. Os componentes médios são desprovidos de soro, fatores de crescimento e citocinas influentes à diferenciação das células doadoras e devem ser feitos sob medida para a sobrevida e expansão de células de estágio de linhagem inicial, tais como tronco/progenitores. O suporte tem resistência à tração suficiente para ser usado em procedimentos cirúrgicos, mas ser neutro em seus efeitos na diferenciação das células doadoras (por exemplo,

aqueles com colágeno tipo I devem ser evitados). O suporte é impregnado ou coberto por um hidrogel 10X mais rígido (-700 Pa) para servir como uma barreira para orientar a migração de células doadoras em direção ao tecido alvo e para minimizar as aderências. Após a ligação ao sítio alvo, um hidrogel HA 2X, um que é suficientemente fluido para ser revestido ou pintado sobre a superfície serosa, é adicionado e usado para minimizar ainda mais as aderências. A Figura 2B retrata a prótese afixada ao fígado ou ao pâncreas de um hospedeiro. A Figura 2C é um esquema do enxerto que demonstra as camadas que constituem a composição do enxerto. A Figura 2D representa os resultados dos ensaios avaliando empiricamente as propriedades reológicas ou viscoelásticas (forças mecânicas de cisalhamento e compressão) das camadas específicas de hidrogel. A Figura 2E fornece uma formulação das propriedades viscoelásticas das 3 camadas de hidrogéis. A Figura 2F é uma imagem aproximada de um enxerto tipo patch graft suturado à superfície do fígado de um porco.

[00026] As Figuras 3A-3D representam o resultado de imuno-histoquímica (IHC) e histologia dos enxertos tipo patch graft do fígado. A Figura 3A mostra os resultados da coloração tricromo do enxerto tipo patch graft em uma semana. O tricromo identifica colágenos (azul), citoplasma (vermelho) e núcleos (preto), e foi usado para identificar a cápsula de Glisson (normalmente adjacente à superfície dos lóbulos do fígado) e aderências (na superfície serosa dos enxertos). Há um alto nível de coloração azul nas camadas na superfície serosa e implicam aderências ao enxerto.

Além disso, o enxerto se separou do tecido hospedeiro na interface entre o suporte e o hospedeiro; isto foi frequentemente encontrado devido à riqueza de MMPs produzidas nesta interface.

As regiões de remodelamento fornecem evidência da perda da estrutura lobular clássica do fígado; elas resultam em uma região na qual as células doadoras estão migrando para o tecido e, em paralelo, alterando a estrutura do tecido hospedeiro.

Em imagens de baixa ampliação (a), coloração tricromo de enxertos colocados no fígado validou que a remodelação extensiva da cápsula de Glisson estava ocorrendo e resultou frequentemente em uma separação entre o enxerto e o fígado hospedeiro.

Em imagens de ampliação mais alta (b) a região de remodelamento é notavelmente ampla e constituída por áreas (c) próximas ao enxerto onde a estrutura de lobulação hepática está faltando por completo e (d) regiões dentro dos lóbulos hepáticos restantes que estão sofrendo colapso no processo de remodelação.

A Figura 3B mostra os resultados da coloração tricromo do enxerto tipo patch graft em três semanas.

Os hialuronanos no enxerto foram reabsorvidos, deixando apenas o revestimento (a). Com a reabsorção de HA, a cápsula de Glisson reaparece (b) e os lóbulos hepáticos próximos ao enxerto se estabilizaram novamente em seus padrões histológicos típicos, tais como lóbulos e ácinos para o fígado.

A seta em (b) indica o reaparecimento de colágenos na reformação da cápsula de Glisson.

As Figura 3C e Figura 3D mostram os resultados da coloração de hematoxilina/eosina de uma seção dos enxertos em uma semana após a enxerto (C) e duas semanas após o enxerto (D). As figuras na parte superior são 40X. Em sítios dentro da figura (a, b, c) estão amplificações que são ampliadas a 100X; a imagem retangular abaixo de cada uma é ampliada a 200 X. 3 sítios da prótese são mostrados: (a) um sítio dentro do revestimento e biomateriais de enxerto associados; (b) um sítio na interface entre enxerto e tecido hospedeiro; e (c) um sítio dentro dos lóbulos hepáticos. A coloração de hematoxilina/eosina produz imagens que contribuem para uma apreciação do processo de enxerto e migração que incorpora características de processos inflamatórios.

[00027] As Figuras 4A-4C mostram enxerto, migração e maturação rápida para destino adulto dentro de uma semana. A Figura 4A é uma imagem de baixa ampliação do enxerto tipo patch graft sobre a superfície de um fígado de porco após uma semana. A linha tracejada indica a interface do enxerto e do fígado hospedeiro. Células GFP+ doadoras (com núcleos rosa; setas brancas indicam áreas com grandes números das células-tronco GFP+ doadoras) foram visualizadas pela marcação com um anticorpo para GFP e secundariamente com um acoplado a Novo Red, uma fluorosonda vermelha. Núcleos foram marcados em azul com 4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI) possibilitando o reconhecimento de células hospedeiras tendo apenas núcleos azuis e doadoras tendo núcleos rosa (fusão de DAPI e o Novo Red). O tecido hospedeiro (a) estende-se para dentro dos hialuronanos (HA, o fundo preto) do enxerto; o tecido pelo revestimento contém organoides ocasionais (inseridos), mas com a maioria das células doadoras dispersas em células únicas; grandes números de células-tronco GFP+ doadoras dispersas (b) são vistas através do tecido hospedeiro.

Não há evidências para a cápsula de Glisson nesta área que constitui a região de remodelação.

A Figura 4B demonstra que enxerto e migração de células doadoras foram rápidos; dentro de uma semana, todas as células doadoras estavam dentro do fígado hospedeiro; havia células doadoras perto do sítio de enxerto e também no lado oposto do lobo do fígado (estimativa da distância é pelo menos 1,5 cm do enxerto)

Estudos em andamento estão analisando regiões dos fígados de leitões em distâncias maiores (ou seja, outros lobos do fígado) para definir mais precisamente quão longe a migração pode passar pelas células doadoras dentro de um período de tempo definido.

São mostradas células doadoras (núcleos rosa) perto dos lóbulos de hepatócitos maduros do hospedeiro (cor verde floresta de autofluorescência de lipofuscinas) no lado distante do lobo do fígado a partir do sítio do enxerto.

A Figura 4C mostra que a maturação das células doadoras a destinos adultos ocorreu em paralelo com HAs sendo reabsorvida.

A amplificação de uma região contendo células GFP+ doadoras (células simples com núcleos rosa) perto de hepatócitos hospedeiros (a), verde floresta em cor (autofluorescência de lipofuscinas) e facilmente distinguido de hepatócitos maduros (b) derivados de doadores que são de cor lavanda (fusão de rosa-GFP, azul- DAPI e as lipofuscinas verdes), ou seja, eles foram restritos por linhagem a partir de células-tronco GFP+ doadoras.

Com outros ensaios de IHC (dados não mostrados), a cor verde primavera brilhante das células em meio às placas de ambos os hepatócitos hospedeiros e doadores provou ser células de endotélios e estreladas.

[00028] As Figuras 5A-5C comparam o enxerto e a maturação das células nos enxertos tipo patch graft de fígado após uma semana e duas semanas após o transplante. A Figura 5A é um exame de fígado de suínos l1 semana após o enxerto tipo patch graft. Coloração vermelha de Sirius, um colágeno de coloração de corante azo foi usado e imuno- histoquímica para pan-citoqueratina (pCK) e Sox9I; e coloração de imunofluorescência (IF) foram realizadas em seções de 3 um em série. No sítio do enxerto tipo patch graft, células doadoras enxertadas se mesclaram com lóbulos hepáticos. Nos painéis superiores (ampliação original=5X), enxertos tipo patch graft são compostos de células pCK* (setas) epiteliais e mesenquimais. Nos painéis centrais, uma ampliação maior é fornecida (20x). Células epiteliais mostram um imunofenótipo que é típico de células-tronco de árvore biliar (BTSCs) expressando citoqueratinas biliares (pcK) e o marcador de células-tronco endodérmicas Sox9. Os BTSCs dentro do enxerto tipo patch graft são dispostos em tiras de células remontando os ductos biliares (setas) e estão em continuidade direta com as placas de hepatócitos do lóbulo hepático adjacente (ponta de seta). os hepatócitos hospedeiros nos lóbulos são negativos para pCK e Sox9. Nos painéis inferiores (ampliação original=20X), a imunofluorescência para GFP permite identificar células enxertadas individuais e sua progênie. Os hepatócitos nos lóbulos adjacentes ao enxerto tipo patch graft foram positivos para GFP indicando que estas eram células doadoras derivadas que tinham se mesclado com o parênquima do fígado hospedeiro.

Na interface entre os ductos pCK*/GFP*t, enxerto tipo patch graft e lóbulos hepáticos (ou seja, colangiócitos derivados de doadores) estavam em continuidade direta com células GFP*!/pCK- É (hepatócitos derivados de doadores) dentro dos lóbulos (ponta de seta), sugerindo uma maturação de células de enxerto em direção a um destino de hepatócitos.

A Figura 5B é um exame de fígados de suínos 2 semanas após o enxerto tipo patch graft.

Colorações IF revelarem que células GFP*' estão presentes dentro dos lóbulos distantes do sítio do enxerto.

Eles são dispersos uniformemente e, assim, estão em uma mistura de células hospedeiras (com núcleos azuis de DAPI) e de células doadoras (núcleos rosa/roxo da fusão do azul de DAPI e o vermelho do marcador de GFP). Eles co-expressam marcadores de hepatócitos maduros, tais como o Fator Nuclear de Hepatócitos (HNF) 4a (uma mistura de núcleos verde e rosa/roxo) e albumina (citoplasma verde e com núcleos rosa/roxo). Canais separados ou fundidos foram incluídos.

Núcleos foram exibidos em azul (DAPI). Ampliação original: 40x.

A Figura 5C é uma avaliação de fígados suínos uma semana após o enxerto tipo patch graft e demonstração da ampla região de remodelação que ocorre na interface entre o enxerto tipo patch graft e o tecido hospedeiro.

A seção na imagem de baixa ampliação e na imagem ampliada de 1 é hematoxilina/eosina (levemente corada); que em 2 está corada com Vetor-SG fornecendo uma cor azul acinzentada; que em 3 está corada para alfa- fetoproteina com fundo de hematoxilina/eosina.

Sítios específicos dentro de 5C são numerados e correlacionam-se com amplificações que indicam as mudanças que ocorrem dentro dos lóbulos. Os lóbulos do fígado hospedeiro e ácinos estão colapsando devido à riqueza de MMPs inundando a área juntamente com as células doadoras. As células doadoras são observadas nas regiões limítrofes dos lóbulos, sítios que também demonstram marcadores específicos de fígado, tais como HNF4-a e a-fetoproteína, o que significa que as células estão amadurecendo para um destino hepático. Esses traços não foram expressos pelos BTSCs e, portanto, estas são indicações de que as células doadoras estão passando por maturação para um destino hepático.

[00029] As Figuras 6A-6D fornecem informações sobre enxertos tipo patch graft de células-tronco organoides conectadas ao pâncreas. A Figura 6A é uma imagem de baixa ampliação (varredura panorâmica) de células doadoras GFP+ que se enxertaram em grande parte do pâncreas e na submucosa do duodeno (uma região contendo as glândulas de Brunner). Coloração imunofluorescente de pâncreas, fígado e duodeno de porco no sítio do enxerto tipo patch graft. GFP (verde), Insulina (vermelho), DAPI (azul). Células GFP+ derivadas de doador ocorrem na proximidade do sítio onde o enxerto tipo patch graft foi posicionado e aparecem integrados no parênquima do pâncreas. A malha de seda do molde cirúrgico SERI é observada interposta entre pâncreas, fígado e duodeno. A Figura 6B mostra que as células doadoras amadurecem a ilhotas funcionais. Em ampliação maior, células beta GFP+/Insulina+t derivadas de doador (amarelo-da fusão do GFP e do vermelho de coloração para insulina) são observadas mescladas com células beta GFP- /Insulina+ (vermelhas) hospedeiras no parênquima do pâncreas. Circundando as células da ilhota está um grande número de células GFP+ que exibem uma morfologia consistente com a das células exócrinas pancreáticas, incluindo células acinares e ductais. Apoiando esta interpretação estão as descobertas em C e D que, de fato, essas células estão produzindo amilase, um marcador acinar clássico. A Figura 6C e Figura 6D mostram evidência de células acinares funcionais derivadas de células-tronco doadoras. Coloração imunofluorescente de uma seção em série do mesmo bloco de tecido no sítio do enxerto tipo patch graft e com foco na região de células doadoras de GFP+ enxertadas. Amilase (verde), Insulina (vermelho), Glucagon (branco - não visível na varredura panorâmica em C, mas visível com ampliação maior em D), DAPI (azul). Células acinarest+tamilase são a grande maioria do tecido exócrino do pâncreas. Ao comparar a coloração apresentada nas seções em série em ampliações baixas e altas, é deduzido que a maioria das células GFP+ derivadas de doador no pâncreas adquiriram um destino amilase+ acinares.

[00030] As Figuras 7A-7TH oferecem uma caracterização de metaloproteinases de matriz (MMPs). MMPs são compostas de uma grande família de genes de enzimas contendo zinco dependentes de cálcio que dissolvem componentes de matriz extracelular. Há pelo menos 24 isoformas conhecidas em porcos dos quais um dos subconjuntos são fatores secretados (por exemplo, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9) e um dos subconjuntos são associados à membrana (por exemplo, MMP1l4, MMP15). MMP1 foi identificado por IHC, especialmente nas áreas de remodelação, mas não por RNA-segq, uma vez que ainda não havia uma forma anotada de MMPl suíno disponível para análises de RNA seq.

As Figuras 7A, 7B, 7C, e 7D mostram as isoformas das categorias secretadas e associadas à membrana que foram expressas por ambos as células troncos/progenitoras e maduras.

A quantificação dos níveis de expressão indicou que as formas associadas à membrana foram semelhantes para ambas as células tronco/progenitoras e maduras (observe as comparações na Figura 7D). Por outro lado, as formas secretadas foram expressas em níveis muito elevados em tronco/progenitoras e em níveis baixos Ou insignificantes em tipos celulares maduros.

As populações de células adultas analisadas foram isoladas de suspensões de fígados de leitões e tecido de árvore biliar e compreendem células CD45+ (células hematopoiéticas), células CD1l46+ (células estreladas), células CD31+ (endotélios), células EpCAM+/CD45 (hepatócitos diploides adultos e colangiócitos). Essas células EpCAM+/CD45- são as células parenquimais maduras encontradas em fígados de leitões.

Os BTSCs foram isolados da árvore biliar pelos protocolos dados nos exemplos.

A Figura 7E mostra a expressão representativa de MMP em regiões de remodelação com um enxerto BTSC/ELSMCs.

Em uma seção adjacente ao enxerto tipo patch graft de BTSCs/ELSMCSs foram coradas com tricromo indicando a região (suporte) da remodelação.

A região aparece como listas lineares vermelhas e azuis sendo células e componentes de matriz que sofrem dissolução pelo "mar" de MMPs.

As listras terminam nas bordas dos lóbulos que ainda estão em sua maioria intacta, mas começam a "ruir" em seus limites dos efeitos das MMPs derivadas das células invasoras. A Figura 7F mostra imagens representativas de ensaios de IHC para MMP1l (Novo-redt). O verde de metila é a coloração de fundo. A estrutura lobular/acinar do fígado se dissolveu nos redemoinhos ondulantes das células e marcada pela forte expressão de MMP1, uma isoforma secretada de MMPs. A Figura 7G mostra uma seção corada para MMP2 (Novo-red+). A hematoxilina é a coloração de fundo. A estrutura lobular/acinar do fígado desapareceu e foi substituída por uma mistura de células com forte coloração para MMP2 (cor marrom ferrugem). A Figura 7H mostra o processo de remodelação em curso dentro dos lóbulos hepáticos. Os lóbulos hepáticos tornaram-se tiras de células interespaçadas por células invasoras; a expressão de MMP2+ (cor de ferrugem) é muito elevada e contribui para a perda de estruturas lobulares/acinares. Com a depuração de hialuronanos (por 2-3 semanas), as estruturas lobulares reapareceram.

[00031] A Figura 8 é uma demonstração esquemática do enxerto e fenômenos de integração no fígado e no pâncreas.

[00032] As Figuras 9A-9E fornecem informações sobre enxertos tipo patch graft de hepatócitos maduros (adultos) em parceria com células mesenquimais maduras (MMCs), tais como endotélio ou células estreladas. Esses enxertos tipo patch graft foram incapazes de enxertar. O enxerto seria alcançável se os hepatócitos formassem uma parceria com células mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ELSMCS), aqui sendo células-tronco mesenquimais suínas

(MSCs). Se apresentado com ELSMCs, então o enxerto ocorreu, mas com restrição a regiões próximas ao enxerto.

A Figura 9A mostra coloração tricromo de fígado de porco normal.

A barra é 200 um para imagem de baixa ampliação (a) e 50 pm para a imagem de ampliação maior (b). Observe os colágenos na cápsula de Glisson e nos limites entre ácinos hepático.

A Figura 9B mostra que a coloração tricromo de enxerto tipo patch graft de hepatócitos adultos normais, em parceria com células mesenquimais maduras (MMCs), endotélios e células estreladas, não enxertaram.

Na imagem de baixa ampliação (a) observe que a cápsula de Glisson está intacta, e as células permanecem no topo da cápsula. (b) na ampliação maior, há evidência de alguma remodelação (fenômenos de plasticidade) de células no lóbulo próximo ao enxerto (a cor vermelha mosqueada dentro dos hepatócitos). Esta plasticidade é assumida devido aos MMPs associados à membrana conhecidos por estarem presentes em células-tronco e células adultas.

A Figura 9C mostra os ensaios de IHC no enxerto tipo patch graft de hepatócitos adultos normais, em parceria com células mesenquimais maduras (MMCs). A seção foi corada com anticorpo para RBMY-1 e com hematoxilina como a contra-coloração.

A cápsula de Glisson está intacta assim como as zonas limítrofes entre os lóbulos.

Na ampliação maior (b), é evidente que o enxerto não ocorreu. (d) controle negativo (coloração sem anticorpo primário para indicar coloração não específica.

A Figura 9D mostra que a coloração tricromo de enxerto tipo patch graft de hepatócitos adultos normais, em parceria com ELSMCSs que aqui eram células-tronco mesenquimais suínas (MSCs desempenhou o papel de uma fonte celular de MMPs.

O enxerto está se separando na interface entre o enxerto e o tecido hospedeiro.

O suporte indica a região de remodelação.

Observe que os lóbulos hepáticos perderam a matriz que normalmente constitui zonas limítrofes entre eles e aparecem desgastados nas bordas.

Na ampliação maior (a) são vistas células doadoras (vermelho claro em comparação com as em vermelho escuro nos centros dos lóbulos) em toda a imagem; em (b) é uma ampliação de uma região mostrando que a cápsula de Glisson é consideravelmente mais fina sob o enxerto (compare com a região à esquerda da caixa) e em (Cc). A remodelação extensiva foi evidente nas células adjacentes ao enxerto (c). A Figura 9E mostra um enxerto tipo patch graft de hepatócitos em parceria com ELSMCsS (MSCs suínos) após uma semana.

A seção (a) foi corada com anticorpo para RBMY-1 (marrom) e com verde de metila como a contra-coloração.

As células doadoras enxertaram (regiões de cor vermelha ferrugem) e maturaram em células parenquimais adultas nos ácinos próximos ao enxerto.

A seção (b) mostra uma amplificação da imagem próximo aos restos da cápsula de Glisson afinadas que mostrou que as células doadoras (núcleos marrons escuros) foram intercaladas uniformemente com células hospedeiras (núcleos eram cor verde de metila). A seção (c) é o controle negativo para (b). A seção (d) foi corada com anticorpo para GFP (pareado com vermelho Novus e produzindo uma cor marrom ferrugem) e com verde de metila como a contra- coloração.

A maioria das células enxertou e formou uma banda de hepatócitos escuros, de doador (maduros) dentro dos ácinos do fígado hospedeiro. A cápsula de Glisson permaneceu, mas diminuiu em espessura. A migração muito além da região do fígado próximo ao enxerto não foi observada dentro do período de três semanas dos experimentos.

[00033] A Figura 10 é um esquema comparando o enxerto de células-tronco em relação a células adultas.

[00034] A Figura 11 mostra evidências de que o processo de enxerto envolve a migração de células para distâncias consideráveis dentro do tecido hospedeiro. Aqui estão demonstrados os enxertos de organoides de BTSCs/ELSMCS uma semana após transplante. O esquema do fígado dividido em 8 zonas diferentes é usado para indicar as regiões avaliadas para a presença de células doadoras. As seções são preparadas a partir das regiões 1-8 e então coradas para permitir a identificação das células doadoras. Na tabela estão resumidas as descobertas mostrando as distâncias entre o enxerto e cada região e a proporção de células GFP+ encontradas. As imagens à esquerda da tabela são varreduras de uma seção representativa de cada zona. A coloração marrom escuro é mais forte em 6 perto do enxerto e fica mais fraca com o aumento da distância do enxerto, a mais clara sendo a zona 1.

[00035] As Figuras 12A-12E fornece evidências para a migração de células doadoras por todo o fígado hospedeiro. células GFP+ são coradas com Novo-red (cor marrom ferrugem); as células hospedeiras são coradas com verde de metila. A Figura 12A é uma imagem de baixa ampliação da interface do enxerto e do fígado hospedeiro. A separação do enxerto do fígado hospedeiro foi muitas vezes vista (observe isso também na Figura 3) e foi mostrada correlacionada com níveis excepcionalmente altos de MMPs secretadas. A amplificação das regiões (a) e (b) são dadas abaixo. Observe as áreas na imagem de baixa ampliação e na amplificação em (b) em que a coloração é mosqueada e com áreas mostrando uma aparência lavada e que se provou devido aos níveis de hialuronano no tecido. A Figura 12B representa as zonas intermediárias às quais as células migraram. As células doadoras estão em todo o tecido, tanto nos ductos biliares quanto no parênquima dos ácinos. A Figura 12C mostra as zonas de distância às quais as células migraram. Observe que apenas os ductos biliares estão corados. A Figura 12D fornece amplificações mostrando células doadoras nos ductos biliares. As Figura 12E e Figura 12F fornecem amplificações dentro do parênquima para mostrar que as células doadoras têm marcação GFP nos núcleos.

[00036] A Figura 13 mostra as condições adversas obtidas para enxertos tipo patch graft com certos suportes (consulte também Tabelas 1 e 2). Estes incluíam necrose, aderências e sítios de colestase encontrados quando enxertos foram colocados muito perto de alguns ductos, de modo que o inchaço causou oclusão dos ductos.

[00037] A Figura 14 mostra um gráfico de ambos os estágios de linhagem para células epiteliais (Figura 14A) e células “mesenquimais (Figura 14B) e os perfis de biomarcador correspondentes.

[00038] A Figura 15 mostra patch de organoides H2B-

GFP+ BTSCs/ELSMCs enxertados no rim. A avaliação foi feita em 1 semana após o enxerto. O painel A mostra coloração tricromo de rim enxertado. O rim foi preparado em seção transversal para expor a camada mais profunda com o enxerto em forma de "V". A metade inferior do “”“V” com coloração azul brilhante é o lado do enxerto no rim; a parte superior do “V” na figura é uma camada mais profunda à camada enxertada. O painel B mostra a coloração H&E para a mesma seção do rim enxertado. O painel C é a ampliação maior do rim enxertado com enxerto tipo patch graft. A cápsula do rim sob o enxerto foi afrouxada (da dissolução por MMPs) de uma forma semelhante à do fígado. O painel D mostra coloração de IHC de células GFP+ (vermelho escuro) que enxertaram no rim em uma camada sob o patch. O painel E mostra a enxerto das células GFP+ (vermelho escuro) em camadas mais profundas do rim. Relatórios de necrópsia indicaram que não houve necrose encontrada no rim enxertado ou em outra parte nos animais que foram submetidos a enxertos tipo patch graft.

BREVE DESCRIÇÃO DAS TABELAS

[00039] TABELA 1 fornece um sumário de abordagens cirúrgicas ou outras abordagens para enxerto tipo patch graft.

[00040] TABELA 2 fornece uma comparação dos suportes testados para os enxertos tipo patch graft exemplares.

[00041] TABELA 3 fornece um sumário dos anticorpos usados para IHC e IF nos exemplos.

[00042] TABELA 4 fornece um sumário dos iniciadores usados para ensaios de qRT-PCR.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00043] As concretizações de acordo com a presente divulgação serão descritas mais detalhadamente adiante neste documento. Os aspectos da divulgação podem, no entanto, ser incorporados em diferentes formas e não devem ser interpretados como limitados às concretizações estabelecidas neste documento. Em vez disso, essas concretizações são fornecidas de modo que esta divulgação será minuciosa e completa, e transmitirá totalmente o escopo da invenção para aqueles versados na técnica. A terminologia usada na descrição neste documento tem a finalidade de descrever concretizações particulares apenas e não se destina a ser limitante da invenção. Todas as publicações, pedidos de patente, patentes e outras referências mencionadas neste documento são incorporadas por referência em sua totalidade.

[00044] Salvo definido em contrário, todos os termos (incluindo termos técnicos e científicos) usados neste documento têm o mesmo significado comumente entendido por aquele versado na técnica à qual esta invenção pertence. Será entendido ainda que os termos, tais como aqueles definidos em dicionários comumente usados, devem ser interpretados como tendo um significado que seja consistente com seu significado no contexto do presente pedido e da técnica pertinente e não devem ser interpretados em um sentido idealizado ou excessivamente formal a menos que expressamente definido neste documento. Embora não explicitamente definido abaixo, tais termos devem ser interpretados de acordo com seu significado comum.

[00045] A prática da presente tecnologia empregará, a menos que indicado de outra forma, técnicas convencionais de cultura de tecidos, imunologia, biologia molecular, microbiologia, biologia celular e DNA recombinante, que estão dentro da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook e Russell eds. (2012) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4º edição; a série Ausubel et al. eds. (2012) Current Protocols in Molecular Biology; a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (2014) Antibodies, A Laboratory Manual, 2º edição; Freshney (2011) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 6º edição; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Patente U.S. Nº 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1985) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory) Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); e Herzenberg et al. eds (1996) Weir'"s Handbook of Experimental Immunology.

[00046] A menos que o contexto indique de outra forma, pretende-se especificamente que as várias características da invenção descritas neste documento possam ser usadas em qualquer combinação. Além disso, a divulgação também contempla que, em algumas concretizações, qualquer característica ou combinação de características estabelecidas neste documento pode ser excluída ou omitida. Para ilustrar, se o relatório descritivo declara que um complexo compreende componentes A, B e C, pretende-se especificamente que qualquer um dentre A, B ou C, ou uma combinação destes, possa ser omitido e eximidas singularmente ou em qualquer combinação.

[00047] Todas as designações numéricas, por exemplo, pH, temperatura, tempo, concentração e peso molecular, incluindo faixas, são aproximações que são variadas ( + ) ou (= ) por incrementos de 1,0 ou 0,1, conforme apropriado, ou alternativamente por uma variação de +/- 15%, ou alternativamente 10%, ou alternativamente 5%, ou alternativamente 2%. Deve ser entendido, embora nem sempre declarado explicitamente, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo "cerca de". Também deve ser entendido, embora nem sempre declarado explicitamente, que os reagentes descritos neste documento são meramente exemplificativos e que equivalentes destes são conhecidos na técnica.

Definições

[00048] Conforme usado na descrição da invenção e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma" e "o/a" destinam-se a incluir as formas plurais também, a menos que o contexto indique claramente o contrário.

[00049] O termo "cerca de", conforme usado neste documento, ao se referir a um valor mensurável, tal como uma quantidade ou concentração (por exemplo, a porcentagem de colágeno nas proteínas totais no molde de biomatriz) e similares, destina-se a abranger variações de 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% ou mesmo 0,1% da quantidade especificada.

[00050] os termos "aceitável", "eficaz" ou "suficiente" quando usados para descrever a seleção de quaisquer componentes, faixas, formas de dosagem, etc. divulgados neste documento, pretendem que os referidos componente, faixas, forma de dose, etc. sejam adequados para a finalidade divulgada.

[00051] Também conforme usado neste documento, "e/ou" refere-se e abrange toda e qualquer combinação possível de um ou mais dos itens listados associados, bem como a falta de combinações quando interpretadas em alternativa ("ou").

[00052] Conforme usado neste documento, o termo "compreendendo" destina-se a significar que as composições e métodos incluem os elementos citados, mas não excluem outros. Conforme usado neste documento, a frase de transição "consistindo essencialmente em" (e variantes gramaticais) deve ser interpretada como englobando os materiais citados ou etapas "e aqueles que não afetam materialmente as características básicas e novas" da concretização recitada. Ver, In re Herz, 537 F.2d 549, 551- 52, 190 U.S.P.Q. 461, 463 (CCPA 1976) (ênfase no original); consulte também MPEP S$ 2111,03. Assim, o termo "consistindo essencialmente em", conforme usado neste documento, não deve ser interpretado como equivalente a "compreendendo". "Consistindo em" significa excluir mais do que traços de elementos de outros ingredientes e etapas substanciais de método para administrar as composições divulgadas neste documento. Os aspectos definidos por cada um desses termos de transição estão dentro do escopo da presente divulgação.

[00053] Conforme usado neste documento, o termo "enxerto tipo patch graft" refere-se a uma composição de células incorporadas ou compreendidas em um biomaterial apropriado que permite o transplante de células doadoras (alogênicas ou autólogas) ao hospedeiro. Em algumas concretizações, o termo refere-se a uma composição de células incorporadas ou compreendidas em um biomaterial apropriado que permite o transplante de células doadoras para o hospedeiro. Os biomateriais são aqueles que podem ser preparados sob condições definidas (por exemplo, um meio basal opcionalmente complementado e/ou um meio de fatores nutricionais, vitaminas, aminoácidos, carboidratos, minerais, insulina, transferrina/Fe e/ou lipídios (ácidos graxos livres purificados complexados com albumina purificada mais uma molécula de carreador de lipoproteína, tal como lipoproteína de alta densidade)) e compreendidos, opcionalmente solidificados, em um gel mole (abaixo de 200 Pa, opcionalmente, aproximadamente 100 Pa) e são cobertos com um revestimento que tem resistência à tração suficiente para permitir a fixação cirúrgica ou, de outra forma, conectados ao tecido ou órgão do hospedeiro e ainda ser de uma química com efeitos mínimos sobre a diferenciação das células doadoras. Suplementos com fatores que podem induzir a diferenciação das células, especialmente as células mesenquimais no estágio da linhagem inicial (ELSMCsS) devem ser evitados; estes incluem soro, fatores de crescimento e citocinas que afetam ELSMCS e componentes matriciais maduros (por exemplo, colágeno tipo II).

[00054] O termo "suporte", conforme usado neste documento, refere-se a um material que serve como um revestimento ou barreira sobre a superfície do enxerto tipo patch graft capaz de conectar o enxerto a um sítio alvo e/ou facilitar a migração das células do mesmo para o sítio alvo e/ou prevenir ou inibir a migração das células em direção ao suporte. O suporte é ou compreende um "material biodegradável, biocompatível", "material “biocompatível, biodegradável" ou qualquer variação dos mesmos referindo-se a um material que (i) seja biocompatível com o sujeito no qual está sendo transplantado, (ii) exibe resistência mecânica para suportar as forças compressivas e de cisalhamento que ocorrem em órgãos e tecidos (especialmente internos) que, por sua vez, permitem que este material funcione como um tecido cirúrgico, e (iii) tenha um efeito neutro ou mínimo sobre o status de diferenciação das células que entram em contato com o material. Em algumas concretizações, o suporte do enxerto tipo patch graft compreende tal material. Em tais concretizações, a resistência mecânica de (ii) deve ser de tal modo que o suporte possa conectar o enxerto ao sítio alvo. Em outras concretizações, o suporte direciona a migração celular em direção ao sítio alvo - por exemplo ao afetar a diferenciação dessas células que migram em direções distantes do sítio alvo ou bloqueando fisicamente a referida migração. A este respeito, materiais adequados incluem, mas não estão limitados a, Seri-seda, opcionalmente o contorno Seri-Seda, ou derivados dos mesmos, âmnios ou extratos dos mesmos (por exemplo, do lado voltado para o feto e/ou um patch ou têxtil composto por PGA e/ou PLLA. Exemplos não limitantes de patches de materiais sintéticos adequados incluem um patch de tecido composto por 91% de PGA-co-9% PLLA, um patch de malha composto por 91% de PGA-co-9% PLLA, ou um patch não tecido composto por 100% de PGA. Mais geralmente, suportes adequados podem incluir formas de bicho da seda Bombyx, como Serif Surgical Silk Scaffolds (Sofregen, Nova York, NY), outros derivados do bicho da seda Bombyx e tecidos sintéticos, tais como formas de ácido poliglicólico ácido- co-poli-L-láctico (PGA/PLLA).

[00055] Em algumas concretizações, o suporte também é biorreabsorvível. Conforme usado neste documento, "biorreabsorvível" refere-se a um material que pode ser quebrado pelo corpo de um hospedeiro ou receptor do enxerto e não requer remoção mecânica. Em algumas concretizações, O suporte biorreabsorvível é biorreabsorvível dentro de um intervalo de cerca de 2 a cerca de 10 semanas, cerca de 2 a cerca de 20 semanas, cerca de 2 a cerca de 52 semanas, cerca de 4 a cerca de 16 semanas, cerca de 4 a cerca de 12 semanas, ou cerca de 4 a cerca de 8 semanas. Em algumas concretizações, o suporte biorreabsorvível é biorreabsorvível dentro de um intervalo de cerca de 4 a cerca de 8 semanas; cerca de 4 a cerca de 12 semanas, cerca de 4 a cerca de 16 semanas, cerca de 4 a cerca de 20 semanas e cerca de 4 a cerca de 52 semanas.

[00056] Conforme usado neste documento, os biomateriais do enxerto e independentes do revestimento incluem aqueles que podem formar hidrogéis. O termo "gel" refere-se a um material gelatinoso sólido que pode ter propriedades que variam de macio e fraco a duro e resistente. os géis são definidos como um sistema reticulado substancialmente diluído, que não exibe fluxo quando no estado estacionário. Em peso, géis são principalmente líquidos, mas eles se comportam como sólidos devido a uma rede reticulada tridimensional dentro do líquido. É a reticulação dentro do fluido que dá a um gel sua estrutura (propriedades de dureza, rigidez, mecânica ou viscoelasticidade) e contribui para a sua adesividade. Desta forma, géis são uma dispersão de moléculas de um líquido dentro de um sólido em que o sólido é a fase contínua e o líquido é a fase descontínua. Um "hidrogel", também referido neste documento como uma "matriz de hidrogel", é um exemplo não limitativo de um gel composto por um gel de polímero macromolecular construído de uma rede de cadeias poliméricas. Os hidrogéis são sintetizados a partir de monômeros hidrofílicos ou dímeros hidrofílicos (por exemplo, no caso de hialuronano) por crescimento de cadeia ou etapa, juntamente com a formação de rede. Uma estrutura tipo rede, juntamente com imperfeições vazias, aumentam a capacidade do hidrogel de absorver grandes quantidades de água através de ligação de hidrogênio. Como resultado, os hidrogéis desenvolvem características mecânicas firmes porém elásticas. Eles são capazes de sofrer formação espontânea de novas ligações quando ligações antigas são quebradas dentro de um material. A estrutura dos hidrogéis juntamente com forças de atração eletrostática impulsionam a formação de ligação nova através de ligação de hidrogênio não covalente.

[00057] Os biomateriais utilizados para os enxertos têm propriedades mecânicas, rigidez, que pode ser mais rigorosamente definida como a viscoelasticidade dos biomateriais. Ver https://en.wikipedia.org/wiki/Viscoelasticidade. os biomateriais de enxerto propícios para enxertos devem ser muito macios (por exemplo, cerca de 100 Pa), condições permissivas para que as células doadoras permaneçam imaturas (Lozoya et al. Biomaterials 2011; 32 (30): 7389- 7402) e seja capaz de produzir formas de MMPs associadas à membrana e/ou secretadas.

[00058] Conforme usado neste documento, o termo "viscoelasticidade" refere-se à propriedade de materiais que exibem características viscosas e elásticas quando submetidas à deformação. Materiais viscosos, como mel, resisten ao fluxo de cisalhamento e à deformidade linearmente com o tempo quando uma tensão é aplicada. Materiais elásticos deformam quando esticados e rapidamente retornam ao seu estado original uma vez que a tensão é removida. Materiais viscoelásticos têm elementos de ambas essas propriedades e, como tal, apresentam deformidade dependente do tempo. Considerando que a elasticidade é geralmente o resultado do estiramento por ligação ao longo dos planos cristalográficos em um sólido ordenado, a viscosidade é o resultado da difusão de átomos ou moléculas dentro de um material amorfo. Embora existam muitos instrumentos que testam a resposta mecânica e viscoelástica dos materiais, a espectroscopia viscoelástica de banda larga (BVS) e a espectroscopia de ultrassom ressonante (RUS) são mais comumente usadas para testar o comportamento viscoelástico, pois podem ser usadas acima e abaixo das temperaturas ambiente e são mais específicas para testar viscoelasticidade. Esses dois instrumentos empregam um mecanismo de amortecimento em várias frequências e faixas de tempo, sem apelo para a sobreposição de tempo- temperatura. Usar BVS e RUS para estudar as propriedades mecânicas dos materiais é importante para compreender como um material que apresenta viscoelasticidade irá funcionar.

[00059] Conforme usado neste documento, o termo "hialuronano", ou "ácido hialurônico", refere-se a um polímero de unidades de dissacarídeo composto de glucosamina e ácido glucurônico [1-3] ligado por ligações B1-4, B1-3 e sais dos mesmos. Assim, o termo hialuronano refere-se a formas naturais e sintéticas de hialuronanos. O polissacarídeo solúvel em água compreendendo unidades de dissacarídeo de ácido D-glucurônico (GICUA) e N-acetil-D- glucosamina (GlecNAc) e hialuronano (HA) de ocorrência natural, que são alternadamente ligados, formando “um polímero linear. O HA de alto peso molecular pode compreender 100 a 10.000 unidades de dissacarídeos. HAs frequentemente ocorrem naturalmente como o sal de sódio, hialuronato de sódio. HA; hialuronato de sódio, e preparações de HA ou hialuronato de sódio são frequentemente referidos como "hialuronano". Exemplos não limitantes de sais de hialuronato aceitáveis incluem hialuronato de potássio, hialuronato de magnésio e hialuronato de cálcio.

[00060] Outros glicosaminoglicanos (GAGs) também podem ser usados no hidrogel. Estes incluem formas de sulfato de condroitina (CSs) e dermatan sulfatos (DSs), polímeros de ácido glucurônico e galactosamina e heparan sulfatos (HSs) e heparinas (HPs), polímeros de ácido glucurônico e glucosamina. A extensão e o padrão de sulfatação destes GAGs são cruciais, uma vez que os padrões de sulfatação ditam a formação de complexos com múltiplas famílias de proteínas (por exemplo, proteínas de coagulação, fatores de crescimento, citocinas, enzimas neutrofílicas). Ver, por exemplo, Powell AK, Yates EA, Fernig DG, Turnbull JE. Interactions of heparin/heparan sulfate with proteins: appraisal of structural factors and experimental approaches. Glycobiology. Abril de 2004;14(4) : 17R-30R] Aqueles apropriados para enxertos tipo patch grafts que otimizam o enxerto compreendem hialuronanos, GAGs não sulfatados e aqueles com mínima sulfatação, tais como formas de sulfatos de condroitina encontrados em nichos de células-tronco, como mostrado em Karumbaiah L, et al. Chondroitin Sulfate Glycosaminoglycan Hydrogels Create Endogenous Niches for Neural Stem Cells. Bioconjug Chem. 16 de dezembro de 2015;26(12):2336-49 e Hayes AJ, et al. Chondroitin sulfate sulfation motifs as putative biomarkers for isolation of articular cartilage progenitor cells. J Histochem Cytochem. Fevereiro de 2008;56(2) :125-38 (incorporado aqui por referência).

[00061] Conforme usado neste documento, o termo "célula" refere-se a uma ou mais células no enxerto. As células da presente divulgação são eucarióticas. Em algumas concretizações, esta célula é de origem animal, opcionalmente de um órgão humano, e pode ser uma célula- tronco, uma célula somática madura, célula progenitora ou intermediários nos estágios de linhagem das células-tronco para as células maduras. O termo "população de células" ou "células" refere-se a um grupo de uma ou mais células do mesmo ou diferente tipo celular de mesma origem ou origem diferente; este termo é usado de maneira intercambiável neste documento com o termo "células doadoras", que se destina a células que podem ser autólogas ou alogênicas. Em algumas concretizações, esta população de células pode ser derivada de uma linhagem celular, de células recém- isoladas, ou em algumas concretizações, esta população de células pode ser derivada de uma porção de um órgão ou tecido, opcionalmente de um doador ou um receptor.

[00062] o termo "célula-tronco" refere-se a populações de células que podem autorreplicar (produzir células filhas idênticas à célula-mãe) e que são multipotentes, ou seja, podem dar origem a mais de um tipo de célula adulta. O termo "célula progenitora" ou "precursora", conforme usado neste documento, é amplamente definido para abranger progênie de células-tronco e seus descendentes. Progenitores são populações de células que podem ser multipotentes, bipotentes ou unipotentes, mas têm uma capacidade mínima (se houver) de se autorreplicar. Progenitores comprometidos são aqueles que são unipotentes e podem diferenciar em uma linhagem particular, levando a apenas um tipo de célula madura. Exemplos não limitantes de células-tronco incluem, mas não estão limitados a células- tronco embrionárias (ES), células tronco pluripotentes induzidas (iPS), células-tronco da camada germinativa, células-tronco determinadas, (ectodérmica, mesodérmica ou endodérmica), células-tronco perinatais, células-tronco derivadas de fluidos amnióticos, células-tronco mesenquimais (MSCs), angioblastos e aqueles derivados do cordão umbilical, geleia de Wharton e/ou placenta. Intermediários entre células-tronco e progenitores comprometidos incluem populações de células, tais como hepatoblastos e progenitores ductais pancreáticos e outras formas de células amplificadoras de trânsito que podem ser multipotentes, mas têm potencial proliferativo potencial, mas capacidade autorreplicante mais limitada (se houver).

[00063] O termo "células mesenquimais" refere-se a células derivadas do mesênquima, incluindo, mas não limitado a angioblastos, precursores de endotélios, precursores de células estreladas, endotélios, células estreladas, células estromais, várias subpopulações de células maduras e progenitoras e células-tronco mesenquimais (MSCs) que são células estromais multipotentes e várias subpopulações de células mesenquimais maduras e progenitoras. Os MSCs são populações de células preparadas por processos de seleção de cultura dos tecidos (Cathery et al.) Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al.

Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015; PMID: 26273305. Existem pelo menos duas categorias principais de células mesenquimais maduras: (a) células mesenquimais maduras (células estreladas/estromais) que produzem e são rodeadas por formas de matriz extracelular que compreendem colágenos fibrilar (por exemplo, tipo 1, III, V) e componentes de matriz associados (fibronectinas, proteoglicanos de sulfato de condroitina, proteoglicanos de dermatan sulfato)e sinais ligados (por exemplo, fatores de crescimento, citocinas) que formam um complexo e sinais ligados (por exemplo, fatores de crescimento/citocinas) que formam um complexo associado a células que são populações de células tipicamente lineares (tipo linha) . Exemplos não limitantes dessas células incluem células estreladas, tendões, estroma e miofibroblastos. (b) Células mesenquimais maduras, tais como endotélios que produzem e são rodeadas por formas de matriz extracelular que compreendem colágenos de rede (por exemplo, tipo IV, tipo VI, VIII, X) e moléculas de matriz associadas (lamininas proteoglicanos de heparan sulfato, proteoglicanos de heparina) e sinais ligados (por exemplo, fatores de crescimento, citocinas) que juntos estão associados a células tendo mais morfologias escamosas ou cuboide ou de como paralelepípedo (“Ycobblestone”). Exemplos não limitantes dessas células incluem endotélios e mioepitelial.

[00064] Os precursores para esses tipos celulares mesenquimais incluem, mas não estão limitados a angioblastos que são multipotentes e que podem se diferenciar em linhagens de endotélios (os estágios finais dos quais são endotélios fenestrados) ou células estreladas (os estágios finais das quais são miofibroblastos (estroma). Os precursores também incluem células-tronco mesenquimais (MSCs), que são células multipotentes e podem se diferenciar em fibroblastos (estroma), osteoblastos (células ósseas), condrócitos (células de cartilagem) miócitos (células musculares) e adipócitos (células de gordura)). As MSCs podem ser, opcionalmente, preparadas por métodos de seleção de cultura (Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan AI. Stem Cells Int. 2015; PMID: 26273305.

[00065] O termo "expansão de células epiteliais" está correlacionado com o diâmetro de uma colônia de células epiteliais que tipicamente formam colônias com morfologias cuboide ou como paralelepípedo e com estimativas de crescimento sendo a combinação dos diâmetros das células da colônia. Em contraste, as estimativas de crescimento de colônias de células mesenquimais estão correlacionadas com a densidade da colônia, uma vez que as células mesenquimais são mais migratórias e móveis, e a densidade de colônia é um reflexo da soma líquida das células que permanecem dentro dos limites da colônia.

[00066] O termo "células epiteliais" refere-se a células derivadas do epitélio, células especializadas que fornece diferentes funções para o tecido e/ou as necessidades sistêmicas de um hospedeiro. Elas são reconhecidas por sua capacidade de migrar como precursoras ou células imaturas; com a maturação, elas se tornam estacionárias e formam camadas de células polarizadas escamosas ou como paralelepípedo ou colunares com lados apical, basal e lateral, e que são ligadas umas às outras por uma variedade de junções (conexinas, junções estreitas, aderentes). Seu potencial de expansão é indicado pelo diâmetro de uma colônia (não por sua densidade). Células epiteliais maduras fornecem funções diversas, tais como secreção de produtos especializados ou contribuições para metabolismo (hepatócitos, colangiócitos), desintoxicação (hepatócitos), produção de enzimas (células acinares), produção de fatores endócrinos (por exemplo, ilhotas ou outras células endócrinas), atividade elétrica (células neuronais) e absorção (células intestinais).

[00067] O termo "células-tronco de árvore biliar" (BTSCs) refere-se a células-tronco epiteliais encontradas em toda a árvore biliar e localizadas dentro de glândulas peribiliares (PBGs), glândulas de Brunner, ambos extramural e intramural, bem como dentro das criptas das vilosidades da vesícula biliar. Elas têm a capacidade de fazer a transição para células progenitoras comprometidas hepáticas e/ou pancreáticas. Os descendentes hepáticos entram nos sinusoides do fígado através de canais de Hering; os progenitores “pancreáticos são encontrados dentro das glândulas do ducto pancreático (PDGs), regiões da árvore biliar localizadas dentro do pâncreas.

[00068] Até agora, pelo menos 7 subpopulações de populações de células-tronco foram identificadas com traços sobrepostos e variando de BTSCs extremamente primitivas a populações de células-tronco definíveis como células-tronco hepáticas ou pancreáticas.

A descrição do que é conhecido para estas é dada abaixo.

As mais primitivas são encontradas nas glândulas peribiliárias extramurais- aquelas conectadas à superfície dos ductos biliares - e; glândulas peribiliárias intramurais - aquelas encontradas dentro das paredes do ducto biliar.

As glândulas peribiliárias intramurais (PBGs) próximas à camada fibromuscular nos centros das paredes do ducto biliar também podem ser consideradas criptas (em paralelo a criptas intestinais), nichos nos quais são encontradas as populações de células-tronco mais primitivas.

Os números maiores de PBGs dentro da rede de árvore biliar são encontrados dentro do ducto comum hepato-pancreático e dentro dos ductos biliares intra-hepáticos grandes.

Nenhuma PBGs ocorre na vesícula biliar e, em vez disso, os nichos de células-tronco dentro da vesícula biliar são os fundos das vilosidades da vesícula biliar que contêm populações de células-tronco de estágio intermediário a tardio que são precursores de células-tronco hepáticas.

As BTSCs são precursoras para o fígado e para o pâncreas.

Elas dão origem a células-tronco hepáticas, precursoras ao fígado e células-tronco pancreáticas, precursoras ao pâncreas, e estas são encontrados em toda a árvore biliar, mas em números influenciados pela proximidade ao fígado versus ao pâncreas.

Assim, pequenos números de células-tronco pancreáticas e grandes números de células-tronco hepáticas estão localizados nas PBGs dos ductos biliares intra- hepáticos grandes, enquanto pequenos números de células- tronco hepáticas e grandes números de células-tronco pancreáticas estão localizados nas PBGs do ducto comum hepato-pancreático.

[00069] Sumários de assinaturas genéticas são apresentados nas Figuras. Em geral, todas as subpopulações de BTSCs expressam biomarcadores genéricos que incluem fatores de transcrição endodérmica para fígado e pâncreas (por exemplo, SOX9, SOX17, PDXl), genes de pluripotência (por exemplo, OCT4, SOX2, NANOG, SALL4, KLF4/KLF5, BMI-1); uma ou mais isoformas do receptor de hialuronano (isoformas padrão e/ou variante) de CD44; CXCR4; e citoqueratinas 8 e

18. As subpopulações de células-tronco dentro da árvore biliar e PBGs incluem: (1) Células-tronco de Glândulas de Brunner na submucosa do duodeno e que expressam CK7, TRA- 160 e 181 e com traços distinguíveis de células-tronco no intestino; (2) células-tronco de árvore biliar intramural (BTSCs) de estágio inicial que expressam o co-transportador de sódio/iodeto (NIS) e CXCR4, OCT4, SOX2, NANOG, mas não expressam LGR5 ou EpCAM; (3) BTSCs intramurais de estágio intermediário que expressam menos de NIS mas ganham expressão de LGR5 mas não EpCAM; (4) BTSCs intramurais de estágio tardio (as únicos BTSCs encontradas na vesícula biliar) e também encontradas em números elevados nos ductos biliares intra-hepáticos grandes e no ducto comum hepato- pancreático. Elas expressam LGR5 e EpCAM. Essas são precursoras para células-tronco hepáticas (no fígado e expressando SOX17, mas não PDXl1) e para as células-tronco pancreáticas (no ducto comum hepato-pancreático e expressando —PDX1, mas não SOX17); (5) células-tronco hepáticas podem ser encontradas nos canais de Hering, em

PBGs de grandes ductos biliares intra-hepáticos, em PBGs na árvore biliar extra-hepática; e nos PBGs do ducto comum hepato-pancreático, mas os números mais altos são aqueles em sítios intra-hepáticos.

As células-tronco hepáticas retêm a capacidade de autorreplicar e ser multipotentes.

Os biomarcadores para essas células incluem SOX9, SOX17, HNF-4 alfa, ITGBl (CD29), ONECUT 2, SALL4, LGR5, CD44, molécula de adesão celular epitelial (EPpCAM) encontrada no citoplasma e na membrana plasmática, molécula de adesão celular neural (NCAM) , CD133 (prominina), níveis negligenciáveis (ou nenhum) de albumina, ausência completa de alfa-fetoproteína (AFP), ausência de P450 A7 e ausência de receptor de secretina (SR). Células-tronco hepáticas e hepatoblastos expressam citoqueratinas 8, 18 e 19; (6 células-tronco pancreáticas são encontradas em pequenos números por toda a árvore biliar (mesmo nos PBGs nos ductos biliares intra-hepáticos grandes), mas são encontrados em números elevados em PBGs do ducto comum hepato-pancreático.

Elas têm os genes de pluripotência e expressão para os outros genes observados para todas as populações de células-tronco, mas diferem por não ter mais SOXl7; as subpopulações, que irão restringir a linhagem a ilhotas, expressam NGN3. Elas expressam EpCAM através das células e na membrana plasmática e expressam pouca (ou nenhuma) insulina.

A maturação das mesmas está correlacionada com o aumento da expressão de insulina, bem como com a expressão de outros hormônios da ilhota (por exemplo, glucagon). Aquelas maturando em populações acinares expressarão MUC6 e amilase.

[00070] Observa-se que células-tronco hepáticas e pancreáticas “também podem ser encontradas em seus respectivos órgãos de origem quando estiverem no início do desenvolvimento (por exemplo, como ESCs ou de outra forma), e que qualquer uma das células divulgadas neste documento pode ser alternativamente gerada por indução (isto é, como iPSCs).

[00071] Conforme usado neste documento, o termo "apoio" é usado para descrever as células que são capazes de auxiliar na propagação de células de outro estágio de linhagem ou fornece assistência às células vizinhas através da produção de "sinais parácrinos", fatores ativos em seus efeitos em células vizinhas em termos de sobrevida, expansão, migração, diferenciação e maturação. Por exemplo, células mesenquimais de apoio podem ser definidas pela sua capacidade de influenciar células epiteliais, opcionalmente através da secreção de metaloproteinases de matriz (MMPs e/ou um ou mais sinais parácrinos ou fatores de crescimento. Muitos delas estão resumidas em revisões recentes. (Cathery et al. Stem Cells 2018; PMID:29732653; Graceb et al. Biochimie 2018: PMID 29698670; Caplan ALI. Stem Cells Int. 2015; PMID: 26273305.

[00072] O termo "parceiros de estágio de linhagem" refere-se aqui a células mesenquimais e/ou células epiteliais que são de um estágio de linhagem apropriado para apoiar o enxerto das células. Para as células-tronco de árvore biliar ou hepática, estas são compostas de angioblastos (CDl17+, CDl133+, VEGFr+, CD3l-negativo) e seus descendentes imediatos, precursores de endotélios (CD1l33+,

VEGFr+, CD31+, Fator de Van Wildebrand (VWE+) ) e precursores de células estreladas (CDl46+, ICAM-l+, alfa actina de músculo liso+t (ASMA), vitamina A-negativo). Elas podem ser imitadas, em parte e/ou em certa medida, pelo uso de células-tronco mesenquimais (MSCs), tais como, mas não limitadas a, aquelas derivados de medula óssea ou tecido adiposo. Não querendo ser limitado pela teoria, acredita-se que tais células devem ser usadas imediatamente após o isolamento do tecido ou após a passagem mínima, idealmente sob condições sem soro. Essas células são coletivamente referidas neste documento como células mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ELSMCs).

[00073] Intermediários na rede de linhagem são referidos como "células amplificadoras de trânsito", que são células que podem ser bipotentes (ou multipotentes), têm potencial proliferativo considerável, mas demonstram pouca (se houver) autorreplicação verdadeira, têm expressão do gene de pluripotência de baixa a moderada (ou mesmo nenhuma), e expressam traços que indicam o comprometimento com um destino hepático (por exemplo, albumina, alfa- fetoproteína) ou pancreático (por exemplo, insulina, MUC6, amilase). Estas incluem hepatoblastos (a rede dando origem ao fígado) e progenitores ductais pancreáticos (a rede dando origem ao pâncreas).

[00074] Conforme usado neste documento, o termo "progenitores ductais pancreáticos" refere-se a células bipotentes “encontradas dentro das glândulas ductais pancreáticas (PDGs) dentro do pâncreas e dando origem a células acinares e ilhotas. Em nossos estudos, concluímos que eles expressam SOX9, PDXl, PTFla, HNF1B, EpCAM, LGR5, ICAM-1, CD44 e subpopulações expressam NGN3 ou MUC6 ou amilase. Eles foram amplamente caracterizados por outros. Ver, por exemplo, Rezanejad H, Ouziel-Yahalom L, Keyzer CA, Sullivan BA, Hollister-Lock J, Li WC, Guo L, Deng S, Lei J, Markmann J, Bonner-Weir S. Heterogeneity of SOX9 and HNFI1£ is dynamic. Stem Cell Reports. 13 de março de 2018;10(3) :725-738.

[00075] Conforme usado neste documento, o termo "hepatoblastos" refere-se a células hepáticas bipotentes que podem dar origem a linhagens de hepatócitos e colangiócitos e são encontradas em ou adjacentes a canais de Hering ou em PBGs dentro dos ductos biliares intra- hepáticos grandes. Eles têm uma capacidade extraordinária de proliferar (ou seja, expandir), mas menos capacidade (se houver) para autorreplicar em relação ao observado em células-tronco hepáticas ou BTSCs. Estas células são caracterizadas por um perfil de biomarcador que se sobrepõe a, mas é distinto de, células-tronco hepáticas ou células- tronco de árvore biliar. Eles expressam SOX9, baixos (ou mesmo insignificantes) níveis de SOXl7, altos níveis de LGR5, HNF4-alfa e EpCAM, encontrados principalmente na membrana plasmática e expressando P450A7, citoqueratina 7, receptor de secretina, expressão consistente de albumina em todos os hepatoblastos, níveis elevados de alfa- fetoproteína (AFP), molécula de aderência intercelular (ICAM-1), mas nenhuma expressão de NCAM, e expressão negligenciável ou nenhuma de genes de pluripotência (por exemplo, SALL4, KL4/KLF5, OCT4, SOX2, NANOG). e nenhuma expressão de marcadores parenquimais hepáticos maduros (por exemplo, P450s como P4503A).

[00076] Conforme usado neste documento, o termo "progenitor comprometido" refere-se a uma célula progenitora unipotente que dá origem a um único tipo de célula, por exemplo, uma célula progenitora hepatocítica comprometida. Em algumas concretizações, eles não expressam genes de pluripotência. Os progenitores hepatocíticos comprometidos são reconhecidos pela expressão de albumina, AFP, glicogênio, ICAM-l, várias enzimas envolvidas com síntese de glicogênio e o gene de junção de gap, conexina

28. Estes dão origem aos hepatócitos. Um progenitor biliar (ou colangiocítico) comprometido dá origem a colangiócitos e é reconhecido pela expressão de EpCAM, citoqueratinas 7 e 19, aquaporinas, CFTR (Regulador de Condutância Transmembrana de Fibrose Cística) e bombas de membrana associadas à produção de bile. Em algumas concretizações um progenitor da ilhota comprometido expressa insulina, glucagon e outros hormônios da ilhota embora a níveis baixos; com a maturação, os níveis de expressão dos hormônios da ilhota aumentam, mas com células particulares expressando preferencialmente certos hormônios.

[00077] Conforme usado neste documento, o termo "agregados" refere-se a uma pluralidade de células que são acumuladas juntas. Os agregados podem variar em tamanho e forma ou podem ser substancialmente uniformes em tamanho e/ou forma. Os agregados de células usados neste documento podem ser de várias formas, tais como, por exemplo, uma esfera, um cilindro (preferencialmente com altura e diâmetro iguais), ou similares a uma haste entre outros. Embora agregados de outras formas possam ser usados, em uma concretização da divulgação, é geralmente preferível que os agregados de células sejam esféricos ou cilíndricos. O termo "não agregado" refere-se a células tronco/progenitoras ou células maduras individuais ou únicas. Em algumas concretizações, as composições fornecidas neste documento podem compreender células substancialmente agregadas, células substancialmente não agregadas, ou uma mistura destas.

[00078] o termo "organoide" se refere neste documento a um agregado celular específico de células epiteliais doadoras com células mesenquimais que é automontado "através de métodos de extração simples descritos neste documento. Em algumas concretizações, as células mesenquimais são células mesenquimais de apoio. Em algumas concretizações, os organoides são formados após o cultivo em placas de baixa fixação e sob condições definidas livres de soro adaptadas ao(s) estágio(s) de linhagen das células agregadas em suspensão. Outros preparam organoides utilizando extratos de matriz específicos, tais como Matrigel. De fato, esta substância é conhecida por ser o padrão da indústria. Ver Hindley et al. Desv. Biology 2016; 420:251-261. PMID:27364469. As condições descritas nas quais esses organoides são mantidos não funcionarão com sucesso para o uso desses organoides nos enxertos tipo patch graft descritos nesta invenção. Os fatores, tais como aqueles encontrados em Matrigel, interromperão ou reduzirão substancialmente a produção de

MMP pelas células que são necessárias para o sucesso desses enxertos tipo patch graft. Além disso, Matrigel não pode ser componente de condições para as células serem usadas clinicamente em pessoas ou para fins veterinários.

[00079] O termo "cultura" ou "cultura celular" significa a manutenção de células em um ambiente artificial, in vitro. Um "sistema de cultura celular" é usado neste documento para se referir a condições de cultura em que uma população de células pode ser cultivada ex vivo (fora do corpo)

[00080] O termo "meio de cultura" é usado neste documento para se referir a uma solução nutriente para o cultivo, crescimento ou proliferação de células. O meio de cultura pode ser caracterizado por propriedades funcionais, tais como, mas não limitadas a, a capacidade de manter células em um estado específico (por exemplo, um estado pluripotente, um estado proliferativo, estado quiescente, etc.), para células maduras - em alguns casos, especificamente, para promover a diferenciação de células progenitoras em células de uma linhagem específica. Exemplos não limitantes de meio de cultura são meios suplementados com soro (SSM) sendo qualquer meio basal suplementado com soro em níveis que são tipicamente cerca de 10% a cerca de 20%. O soro pode ser autólogo (a mesma espécie que as células) ou, mais comumente, soro de animais que são rotineiramente abatidos para fins comerciais (por exemplo, galinhas, vacas, porcos, etc.). Notavelmente, as presentes concretizações envolvendo células-tronco empregam meios que evitam a incorporação de componentes de soro e/ou soro que direcionam a diferenciação. O meio de Kubota, um meio sem soro projetado para tronco/progenitores endodérmicos e composto por um meio basal (nutrientes, aminoácidos, vitaminas, sais, carboidratos) sem cobre, pouco cálcio (<0,5 mM) e suplementado com selênio, zinco, insulina, transferrina, lipídios, mas sem citocinas ou fatores de crescimento. Outros meios encontrados de apoio de células-tronco também podem ser utilizáveis, mas devem evitar quaisquer fatores que façam com que as células se diferenciem, uma vez que o processo de maturação resultará na mutação da produção de MMPs associadas à membrana e/ou secretadas.

[00081] Os meios basais são tampões usados para a cultura de células e são compostos de aminoácidos, açúcares, lipídios, vitaminas, minerais, sais, oligoelementos e vários nutrientes em composições que imitam os constituintes químicos do fluido intersticial em torno das células. Além disso, o meio de cultura celular geralmente é composto por meio basal suplementado com uma pequena porcentagem (tipicamente 2-10%) de soro. Para as tecnologias de enxerto descritas neste documento, as condições são usadas para manter as células como células- tronco ou células progenitoras iniciais e, assim, evita-se o soro ou qualquer um dos suplementos típicos que possam direcionar as células em direção a um destino celular maduro. Além dos meios basais habituais, vários suplementos nutricionais, lipídios (mistura de ácidos graxos livres complexados com albumina e moléculas carreadoras, tais como lipoproteina de alta densidade). Apenas dois fatores hormonais/de crescimento são adicionados: insulina necessária para metabolismo de carboidratos e transferrina, necessária como um carreador de Fe para as polimerases. O meio de Kubota, um meio livre de soro projetado para tronco/progenitores endodérmicos, é composto por um meio basal (sem nenhum cobre, pouco cálcio (<0,5 mM) suplementado com zinco, selênio, insulina, transferrina, lipídios, mas sem citocinas ou fatores de crescimento. Outros fatores de crescimento e citocinas e especialmente soro devem ser evitados uma vez que irão induzir a diferenciação das células doadoras e, assim, minimizar a produção de MMPs, que são necessários para os processos de enxerto e migração.

[00082] O "Meio de Kubota", conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer meio que não contenha cobre, cálcio (<0,5 Mm), selênio, zinco, insulina, transferrina/Fe, uma mistura de ácidos graxos livres ligados à albumina purificada e, opcionalmente, também a lipoproteína de alta densidade (HDL) . Em algumas concretizações, o Meio de Kubota compreende qualquer meio (por exemplo, RPMI 1640 ou DMEM-F12) sem cobre, baixo teor de cálcio (por exemplo, 0,3 mM), -10-9 M de selênio, -0,1% de albumina sérica bovina ou albumina sérica humana (altamente purificada e sem ácido graxo), - 4,5 mM de nicotinamida, -0,1 nM de sulfato de zinco hepta-hidratado, -10-8 M de hidrocortisona (componente opcional usado para precursores hepáticos mas não pancreáticos) -5 pa/ml de transferrina/Fe, -5 pg/ml de insulina, -10 upg/ml de lipoproteína de alta densidade, e uma mistura de ácidos graxos livres purificados que são adicionados após a ligação à albumina sérica purificada. A mistura de ácidos graxos livres consiste em -100 mM de ácido palmítico, ácido palmitoleico, ácido oleico, ácido linoleico, ácido linolênico e ácido esteárico. Métodos exemplares não limitantes para a preparação desses meios foram publicados em outro lugar, por exemplo , Kubota H, LM Reid, Proc. Nat. Acad. Cieno. (EUA) 2000; 97:12132-12137, cuja divulgação é incorporada neste documento em sua totalidade por referência.

[00083] Em algumas concretizações, as condições desses enxertos tipo patch graft são, portanto, contrárias ao uso de rotina de meios suplementados com um soro em pequena porcentagem (tipicamente 2-10%). O soro tem sido adicionado há muito tempo para fornecer moléculas de sinalização de requisito (hormônios, fatores de crescimento, citocinas) necessários para conduzir um processo biológico (por exemplo, proliferação, diferenciação). Em algumas concretizações, o soro não está incluído para evitar a diferenciação das células e/ou evitar a inativação ou a mutação da produção de MMPs, especialmente as formas secretadas.

[00084] Conforme usado neste documento, o termo "eficaz quantidade" ou "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade que é suficiente para tratar estados ou condições da doença (por exemplo, doenças hepáticas ou pancreáticas). Uma quantidade eficaz pode ser administrada em uma ou mais administrações, aplicações ou dosagens. Tal liberação depende de uma série de variáveis, incluindo o período de tempo durante o qual a unidade de dosagem individual deve ser usada, a biodisponibilidade da composição, a via de administração, etc. Entende-se, no entanto, que quantidades específicas das composições para qualquer paciente em particular depende de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do agente específico empregado, a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo e a dieta do paciente, o tempo de administração, a taxa de excreção, a combinação da composição, a gravidade da doença específica (por exemplo, fígado ou doença pancreática) sendo tratada e forma de administração.

[00085] Os termos "equivalente" ou "equivalente biológico" são usados de forma intercambiável quando se refere a um material de molécula, biológico ou celular específico e pretende ter homologia mínima ao mesmo tempo em que mantém a estrutura ou funcionalidade desejada.

[00086] Conforme usado neste documento, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é posteriormente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Se o polinucleotídeo for derivado do DNA genômico, a expressão pode incluir edição do mRNA em uma célula eucariótica. O nível de expressão de um gene pode ser determinado pela medição da quantidade de mRNA ou proteína em uma célula ou amostra de tecido; além disso, o nível de expressão de genes múltiplos pode ser determinado para estabelecer um perfil de expressão para uma amostra em particular.

[00087] Conforme usado neste documento, o termo

"funcional" pode ser usado para modificar qualquer material molecular, biológico ou celular para a intenção de que ele realize um efeito em particular especificado.

[00088] o termo "gene", conforme usado neste documento, destina-se a incluir amplamente qualquer sequência de ácido nucleico transcrita em uma molécula de RNA, se o RNA for codificante (por exemplo, mRNA) ou não codificante (por exemplo, ncRNA).

[00089] Conforme usado neste documento, o termo "gerar" e seus equivalentes (por exemplo gerando, gerado, etc.) são usados de maneira intercambiável com "produzir" e seus equivalentes quando se refere às etapas do método que produzem o organoide da presente divulgação.

[00090] O termo "isolado", tal como utilizado neste documento, refere-se a materiais moleculares ou biológicos ou celulares sendo substancialmente livres de outros materiais.

[00091] os termos "ácido nucleico", "polinucleotídeo" e "oligonucleotídeo" são usados de forma intercambiável e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos ou análogos dos mesmos. Polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional (3D) e podem executar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os seguintes são exemplos não limitantes de polinucleotídeos: um gene ou fragmento de gene (por exemplo, uma sonda, iniciador, marcador EST ou SAGE), éxons, íntrons, RNA mensageiro (MRNA) , RNA transportador, RNA ribossomal, RNAi, ribozimas, CDNA,

polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico e iniciadores.

[00092] Um polinucleotídeo pode compreender nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presentes, modificações na estrutura nucleotídica podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polinucleotídeo. A sequência de nucleotídeos pode ser interrompida por componentes não nucleotídicos. Um polinucleotídeo pode ser adicionalmente modificado após a polimerização, tal como pela conjugação com um componente de marcação. O termo também se refere a moléculas de fita dupla e única. A menos que especificado de outra forma ou exigido, qualquer aspecto desta tecnologia que seja um polinucleotídeo engloba a forma de fita dupla e cada uma de duas formas de fita única complementares conhecidas ou previstas para compor a forma de fita dupla.

[00093] o termo "proteína", "peptídeo" e "polipeptídeo" são usados de forma intercambiável e em seu sentido mais amplo para se referir a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidade, análogos de aminoácido ou peptidomiméticos. As subunidades podem ser ligadas por ligações peptídicas. Em outro aspecto, a subunidade pode ser ligada por outras ligações, por exemplo, éster, éter, etc. Uma proteína ou peptídeo deve conter pelo menos dois aminoácidos e nenhuma limitação é colocada no número máximo de aminoácidos que podem compreender uma sequência de proteína ou peptídeo. Conforme usado neste documento, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros ópticos D e DL, análogos de aminoácido e peptidomiméticos.

[00094] Conforme usado neste documento, o termo "sujeito" e "paciente" são usados de forma intercambiável e destinam-se a significar qualquer animal. Em algumas concretizações, o sujeito pode ser um mamífero. Em algumas concretizações, o mamífero é bovino, equino, suíno, canino, felino, símio, murino, humano ou rato. Em algumas concretizações, o sujeito é um humano.

[00095] O termo "tecido" é usado neste documento para se referir ao tecido de um organismo vivo ou falecido ou qualquer tecido derivado ou projetado para imitar um organismo vivo ou falecido. O tecido pode ser saudável, doente, lesionado por trauma, danificado e/ou ter mutações genéticas. O termo "tecido natural" ou "tecido biológico" e variações dos mesmos, conforme usado neste documento, referem-se ao tecido biológico como existe em seu estado natural ou em um estado não modificado de quando foi derivado de um organismo. Um "micro-órgão" refere-se a um segmento de "tecido biomanipulado" que imita "tecido natural".

[00096] O tecido biológico pode incluir qualquer tecido único (por exemplo, uma coleção de células que podem ser interligadas) ou um grupo de tecidos que compõem um órgão ou parte ou região do corpo de um organismo. O tecido pode compreender um material celular homogêneo ou pode ser uma estrutura composta, tal como aquela encontrada em regiões do corpo, incluindo o tórax, que, por exemplo, pode incluir tecido pulmonar, tecido esquelético e/ou tecido muscular. Os tecidos exemplares incluem, mas não estão limitados àqueles derivados do fígado, pâncreas, árvore biliar, pulmão, intestinos, tireoide, timo, bexiga, rins, próstata, útero, mama, pele e tecidos dérmicos subjacentes, cérebro, medula espinhal, vasos sanguíneos (por exemplo, aorta, veia ilíaca,), coração, músculo, incluindo qualquer combinação destes.

[00097] Como usado neste documento, "tratar" ou "tratamento" de uma doença em um sujeito refere-se a (1) impedir que os sintomas ou doença ocorram em um sujeito que seja pré-disposto ou que ainda não exiba sintomas da doença; (2) inibir a doença ou suspender seu desenvolvimento; ou (3) melhorar ou causar a regressão da doença ou dos sintomas da doença. Como compreendido na técnica, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para os fins da presente tecnologia, os resultados benéficos ou desejados podem incluir um ou mais dentre, mas não estão limitados a, alívio ou melhora de um ou mais sintomas, diminuição da extensão de uma condição (incluindo uma doença), estabilização (ou seja, sem piora) do estado de uma condição (incluindo doença), atraso ou desaceleração da condição (incluindo doença), progressão, melhora ou paliação da condição (incluindo doença), estados e remissão (seja parcial ou total), detectáveis ou indetectáveis.

Abreviações

[00098] AFP, a-fetoproteína; ALB, albumina; BTSCs,

células-tronco da árvore biliar; CD, determinante comum; CD44, receptores de hialuronano; CD133, prominina; CFTR, regulador de condutância transmembrana de fibrose cística; CK, proteína de citoqueratina; CXCRA4, receptor de quimiocina CXC 4 (também chamado de fusina ou CD184; também chamado de fator de plaqueta 4; EGF, fator de crescimento epidérmico; ELSMCs, células “mesenquimais em estágio inicial, consistindo em angioblastos e seus descendentes, precursores para endotélios e células estreladas; EpCAM, molécula de adesão celular epitelial; FGF, fator de crescimento de fibroblasto; HBs, hepatoblastos; HGF, fator de crescimento de hepatócitos; HpSCs, células-tronco hepáticas; KM, Meio de Kubota, um meio sem soro projetado para células-tronco endodérmicas; KRT, gene da citoqueratina; LGR5, receptor 5 acoplado a proteína G de repetição de leucina que se liga a R-espondina; MMPs, metaloproteinases de matriz, uma grande família de proteinases associada à dissolução da matriz extracelular, com migração celular e respostas regenerativas; NANOG, um fator de transcrição criticamente envolvido com a autorrenovação; NCAM, molécula de adesão celular neural; NIS, simportador de sódio/iodeto; ocT4, (fator de transcrição de ligação a octâmero 4) também conhecido como POUSF1 (domínio POU, classe 5, fator de transcrição 1), um gene expresso por células-tronco; PDX1, homeobox pancreático e duodenal 1, um fator de transcrição crítico para o desenvolvimento pancreático; PBGs, glândulas peribiliárias, nichos de células-tronco para células-tronco da árvore biliar; SALLA, a proteína similar a sal 4 encontrada como sendo fornecida para autorreplicação de células-tronco; SOX, caixa HMG relacionada ao Sry; SOX2, um fator de transcrição que é essencial para manter a autorrenovação, ou pluripotência em células-tronco embrionárias e determinadas; SOX9, fator de transcrição associado aos tecidos endodérmicos (fígado, intestino e pâncreas); SOXl17, um fator de transcrição essencial para a diferenciação do fígado; VEGF, fator de crescimento celular de endotélios vasculares; vWF, Fator de Von Willebrand.

Modos de Praticar a Presente Divulgação

[00099] Nos exemplos fornecidos neste documento, os Depositantes estabelecem o enxerto tipo patch graft, um novo método para transplante de células para órgãos internos com características de projeto que dependem das células serem células-tronco ou células maduras. Os Depositantes demonstram esses métodos neste documento com enxertos de células-tronco de árvore biliar (BTSCs), precursores para fígado e pâncreas e transplantados para fígado ou pâncreas. Os hospedeiros usados para desenvolver esses métodos são raças de suínos, Sus scrofa domesticus. São espécies animais importantes usadas em pesquisa translacional, modelos cirúrgicos e treinamento sobre procedimentos e são usadas cada vez mais como alternativas a macacos em estudos pré-clínicos.

[000100] Foi obtido sucesso exemplar com organoides de células-tronco de árvore biliar (BTSCsS), precursores para fígado e pâncreas, em parceria com células mesenquimais em estágio de linhagem inicial (ELSMCS) e compreendidos em hidrogéis de hialuronano (HA) suaves (-100

Pa). Hidrogéis de HA contendo organoides foram colocados em retalhos seri-seda (um material de malha) impregnados em seus lados serosos com hidrogel de HA mais rígido (-700 Pa) e foram cirurgicamente ou de outra forma ligados à superfície do fígado ou pâncreas. Dentro de uma semana, os enxertos causaram a remodelação de cápsulas de órgãos e tecido adjacente e, opcionalmente, tecido parenquimal distantes seguido por uma fusão de células hospedeiras e doadoras. Em duas semanas, as células doadoras tinham amadurecido até destinos adultos funcionais, tais como hepatócitos (albumina) ou ilhotas (células-fB-insulina). Em três semanas, com liberação de HAs, as cápsulas de órgãos e histologia normal do tecido retornaram. Os processos de enxerto/migração/integração se provaram dependentes de múltiplas regiões de plasma associadas à membrana e de metaloproteinases de matriz secretadas pelas células.

[000101] Os resultados desses exemplos contrastam com aqueles de esforços anteriores para transplante de células de órgãos sólidos para órgãos internos, em que o transplante foi realizado por injeção direta ou através da distribuição de células através de uma via vascular (ver análises por Bhatia et al., Lanzoni et al., Weber e outros). Os métodos de transplante anteriores resultam em pequenos números de células sendo enxertadas, em riscos de êmbolos que podem ameaçar à vida e em níveis significativos de distribuição ectópica de células. Esses problemas têm feito com que terapias celulares para órgãos sólidos internos fossem usadas ao mínimo ou evitadas completamente.

[000102] A estratégia de enxerto tipo patch graft oferece um método alternativo para terapias celulares, que pode permitir a distribuição de números de células adequados e de sua integração ao tecido para oferecer restauração de funções significativa. os exemplos demonstram “segurança desde que os biomateriais e o revestimento usados suportem a manutenção de algumas ou todas as células doadoras como imaturas e assim capazes de produzir o repertório relevante de MMPs. Uma causa comum de falha foi qualquer fator resultando na diferenciação das células doadoras. Sem estar limitado pela teoria, é contemplado neste documento que MMPs purificadas podem ser incorporadas a biomateriais de enxerto e/ou células podem ser transformadas para secretar MMPs usando um sistema de expressão recombinante ou outra técnica de modificação genética, como uma alternativa a fornecer células no enxerto que produzam naturalmente as MMPs necessárias. Em tais concretizações, a combinação de MMPs incorporadas ou transduzidas através de construto deve incluir aqueles identificados nos perfis de expressão fornecidos nos exemplos abaixo.

Composição de um Enxerto Tipo Patch Graft

[000103] Aspectos divulgados neste documento referem- se a um enxerto tipo patch graft compreendendo uma camada que compreende uma única população ou duas ou mais populações de células (por exemplo, células doadoras que podem ser autólogas ou alogênicas) e uma fonte de MMPs e um suporte que compreende um material biodegradável e biocompatível, que pode ser usado para fixar o enxerto a um sítio alvo. Em algumas concretizações, a população ou populações de células incluem uma população de células epiteliais e uma população de células mesenquimais. Em algumas concretizações, as populações de células devem ser mantidas em um estado específico ou "estágio de linhagem" como parte do enxerto, o que significa que elas não se diferenciam ou amadurecem mais até a incorporação ao órgão. Isso pode ser obtido ao equilibrar variáveis relacionadas às qualidades da fonte de células, teor de MMP, meio utilizado e o suporte. Cada um desses aspectos é descrito mais detalhadamente abaixo.

[000104] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que enxertos tipo patch graft podem ser bem sucedidos com (1) uma população de células ou mistura de células ideal - por exemplo, células epiteliais doadoras e uma população de células tronco/progenitoras mesenquimais que gere MMPs associadas à membrana e/ou secretadas - em um meio e hidrogel que não levem à diferenciação da população de células tronco/progenitoras mesenquimais de apoio ou que, de outra forma, contenham MMPs apropriadas, e (2) um suporte adequado para fixar o enxerto ao sítio alvo e impedir a migração das células no enxerto em direção ao suporte, para longe do sítio alvo.

Células Exemplares

[000105] Sem estar limitado pela teoria, as células podem estar em qualquer estágio de linhagem de maturação incluindo células-tronco embrionárias (ES), células-tronco pluripotentes induzidas (iPS), células-tronco determinadas, progenitores comprometidos, células amplificadoras transitórias, ou células maduras. No entanto, em certas concretizações, uma fonte de MMPs deve estar presente no enxerto tipo patch graft. Assim, são contempladas neste documento fontes celulares das MMPs para uso nos enxertos tipo patch graft. Tais fontes celulares devem estar em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases de matriz associadas à membrana e/ou secretadas. Um exemplo não limitativo de tal estágio de linhagem inicial são células-tronco mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ESMLCsS).

[000106] Em algumas concretizações, as células a serem enxertadas são células epiteliais em parceria com células mesenquimais. Em algumas concretizações, as células epiteliais compreendem células-tronco epiteliais. Em algumas concretizações, as células epiteliais compreendem células epiteliais comprometidas e/ou maduras. Em algumas concretizações, as células epiteliais comprometidas e/ou maduras "compreendem células parenquimais maduras. Em algumas concretizações, as células parenquimais maduras compreendem um ou mais dentre hepatócitos, colangiócitos ou células de ilhotas. Em algumas concretizações, as células mesenquimais compreendem ELSMCs. Em algumas concretizações, as ELSMCS compreendem um ou mais dentre angioblastos, precursores de endotélios, precursores de células estreladas e MSCs. Em algumas concretizações, as células epiteliais e as células mesenquimais são parceiras de estágio de linhagem uma da outra. Em algumas concretizações, as células epiteliais e as células mesenquimais não são parceiras de estágio de linhagem uma da outra, por exemplo, não estão aproximadamente no mesmo estágio de linhagem ou estágio de maturação, respectivamente. Em algumas concretizações, as células epiteliais são células maduras. Em algumas concretizações, as células mesenquimais são ELSMCs.

[000107] Em algumas concretizações, pelo menos uma dentre as células epiteliais e as células mesenquimais são derivadas de um doador. Em algumas concretizações, o doador é um sujeito que necessita de um transplante de tecido. Em algumas concretizações, o doador é a fonte de células saudáveis para um transplante de tecido. Em algumas concretizações, pelo menos uma das células epiteliais e das células mesenquimais são autólogas a um receptor pretendido do enxerto tipo patch graft. Em algumas concretizações, todas as células (isto é, epiteliais e mesenquimais) são autólogas ao receptor pretendido do enxerto. Em algumas concretizações, o doador de células pode ser diferente do receptor (aloenxerto) ou também pode ser o sujeito (autólogo) tendo o órgão interno em uma condição doente ou disfuncional, opcionalmente, em que são obtidos de uma porção do órgão interno que não é doente ou disfuncional e/ou que as células foram geneticamente modificadas para restaurar a função.

[000108] Em outro aspecto, as células mesenquimais são parceiras de estágio de linhagem das células doadoras, por exemplo, em um estágio de linhagem comparável ou correspondente. Em outro aspecto, as células mesenquimais não são parceiras de estágio de linhagem apropriadas das células doadoras. As células em estágio de linhagem mesenquimal podem ser angioblastos, precursores em estágio de linhagem inicial dos endotélios e/ou células estreladas, células-tronco mesenquimais, endotélios ou células estreladas, ou derivados dessas populações celulares.

[000109] Para transplantes de células-tronco, as células epiteliais devem formar uma parceria com suas células mesenquimais parceiras de estágio de linhagem nativas (angioblastos e/ou precursores de endotélios ou células estreladas). Para células epiteliais adultas, parceiros apropriados incluem células mesenquimais em estágio de linhagem inicial (ELSMCS) que são compostas por angioblastos e/ou precursores de células estreladas e células endoteliais. Os Depositantes mostraram que podem usar preparações de células-tronco mesenquimais (MSCs) em combinação com células adultas para obter enxertos. Em algumas concretizações, certas MSCs podem ser preferíveis a outras. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que enxertos podem ser otimizados selecionando-se combinações de células que exigem mínimo ou nenhum cultivo das células e que evitarão componentes de soro e matriz que podem impulsionar a diferenciação das células. Sem estar limitado pela teoria, entende-se ainda que a relação epitelial- mesenquimal é importante, uma vez que a sinalização parácrina suporta a produção de MMPs. No entanto, células epiteliais maduras com uma parceria com endotélios maduros irão sobreviver no enxerto e serão células funcionais, mas não irão enxertar. Assim, se as células epiteliais maduras formarem uma parceira com o estroma maduro para formar um enxerto, os enxertos resultantes provavelmente se tornarão fibróticos.

[000110] Para o tratamento de um órgão doente ou disfuncional, as células podem ser de um doador que não seja o receptor (aloenxertos) ou também podem ser transplantes autólogos e assim provenientes do sujeito com o órgão interno em uma condição doente ou disfuncional, opcionalmente, em que são obtidas de uma porção do órgão interno que não esteja doente ou disfuncional e/ou cujas células foram geneticamente modificadas para restaurar a função.

[000111] Para estabelecer um sistema modelo para estudar uma doença, as células podem ser aquelas que têm a doença e que são transplantadas sobre/dentro do tecido normal em um hospedeiro experimental.

[000112] Em algumas concretizações, as células epiteliais podem ser células-tronco combinadas com células mesenquimais de apoio, opcionalmente ELSMCS, para formar organoides, que opcionalmente se automontam. Esses organoides podem ser incorporados ou compreendidos em um hidrogel de hialuronano. As células-tronco e/ou progenitores da presente divulgação podem incluir qualquer célula-tronco e/ou progenitor conhecido na técnica, incluindo, por exemplo, uma célula-tronco embrionária (ESC), uma célula germinativa embrionária (EGC), uma célula-tronco pluripotente induzida (iPSC), uma célula- tronco pancreática (PSC), célula-tronco hepática (HpSC), célula-tronco da árvore biliar (BTSC), um hepatoblasto, progenitor ductal pancreático, célula progenitora pancreática comprometida, ou uma célula progenitora hepática comprometida. Em algumas concretizações, as populações de células compreendem apenas células-tronco, tais como células-tronco Ppancreáticas, células-tronco hepáticas, células-tronco de árvore biliar (BTSCs) ou células-tronco de Glândulas de Brunner. Em outras concretizações, as células compreendem apenas subpopulações progenitoras multipotentes, tais como hepatoblastos ou células progenitoras ductais pancreáticas, ou o enxerto pode conter progenitores unipotentes comprometidos (por exemplo, células progenitoras comprometidas hepatocíticas ou biliares ou das ilhotas ou acinares). Em outras concretizações, as células compreendem uma mistura de células-tronco e progenitores.

[000113] Se células epiteliais adultas forem usadas, então elas podem ser misturadas em proporções relevantes com ELSMCSs nos biomateriais de enxerto. As proporções da mistura celular podem ser determinadas de modo a imitar o tecido alvo. Alternativamente, ou além disso, as proporções podem ser determinadas através da automontagem dos organoides. Os organoides ou misturas celulares são incorporados aos biomateriais de enxerto suave, tais como o hidrogel suave de hialuronano. Se for um enxerto de células-tronco, então as células-tronco e/ou progenitoras da presente divulgação podem incluir qualquer célula-tronco e/ou progenitora conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, uma célula-tronco embrionária (ESC), uma célula germinativa embrionária (EGC), uma célula-tronco pluripotente induzida (IpSC), uma célula-tronco de glândulas de Brunner (BGSCs), uma célula-tronco de árvore biliar (BTSC), uma célula-tronco pancreática (PSC), uma célula-tronco hepática (HpSC), células-tronco amplificadoras transitórias (por exemplo, hepatoblastos ou progenitores ductais pancreáticos) e progenitores unipotentes “comprometidos (por exemplo, um progenitor pancreático ou hepatocítico ou colangiocítico comprometido). Em algumas concretizações, as populações de células compreendem apenas células-tronco. Em outras concretizações, as células compreendem apenas subpopulações progenitoras. Em outras concretizações, as células compreendem uma mistura de células-tronco e progenitores ou uma mistura de células-tronco/progenitoras e células mais maduras. Em ainda outras concretizações, pode haver uma mistura quimérica de células adultas (por exemplo, hepatócitos, colangiócitos, enterócitos, ilhotas) e ELSMCs.

[000114] As células-tronco e/ou células progenitoras podem ser identificadas por qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica. Exemplos não limitantes incluem usar uma combinação de ensaios que definem capacidade autorreplicante e aqueles que demonstram multipotência por análise morfológica, por expressão de genes e/ou proteínas, marcadores de superfície celular e similares. Em algumas concretizações, as células-tronco e/ou progenitoras expressam pelo menos um marcador indicativo de célula de linhagem de células hepáticas de estágio inicial (por exemplo, SOX 17, HNF4alfa, HNFG6, HES1, CK19), e pelo menos um marcador indicativo de linhagem de células pancreáticas de estágio inicial (por exemplo, PDXl, PROX1l, NGN3, HNFBl). Por exemplo, células- tronco e/ou progenitoras, em particular, BTSCs, podem ser identificadas pela expressão de SOX9, SOX1l17, PDXl, CD133 NCAM, sonic hedgehog (SHH), simportador de iodeto de sódio (NIS), LGR5, LGR6, EpCAM, várias isoformas de CD44, CXCR4 e vários genes de pluripotência (por exemplo, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, KLF5, SALL4, BMi-l) ou qualquer combinação destes.

[000115] Em algumas concretizações, as células-tronco e/ou progenitoras expressam pelo menos um marcador indicativo de linhagens celulares de estágio parental inicial tais como linhagens parentais para fígado e pâncreas. Assim, elas expressariam um(s) compartilhado (s) por linhagens hepáticas e pancreáticas (por exemplo, SOX9, LGR5/LGR6, EpCAM, CD133, CKl19) e um(s) para linhagens hepáticas (por exemplo, SOX 17, HNF-4-alfa, HNF6, HES1) e um(s) para linhagem(s) de células pancreáticas de estágio inicial (por exemplo, PDX1, PROX1, NGN3, HNFBl). Por exemplo, células-tronco e/ou progenitoras, em particular, BTSCs, podem ser identificadas pela expressão de SOX9, SOX17, PDXl, CD133, NCAM, sonic hedgehog (SHH), simportador de iodeto de sódio (NIS), LGR5, LGR6, EpCAM e vários genes de pluripotência (por exemplo, OCT4, SOX2, NANOG, KLFA4, KLF5, SALL4, BMi-l) ou qualquer combinação destes.

Geração de Tipos de Células Maduras

[000116] As células-tronco e/ou progenitoras também podem ser diferenciadas em um tipo de célula mais madura, se for desejado. Isso pode ser feito in vitro por diferenciação espontânea e/ou por diferenciação direcionada. A diferenciação direcionada pode envolver o uso de meios definidos, modificando geneticamente as células-tronco e/ou progenitoras para expressar um gene de interesse, ou combinações destes.

[000117] Exemplos não limitantes de meios definidos para diferenciar as células incluem o meio definido por hormônio (HDM) usado para a diferenciação de células-tronco endodérmicas em destinos adultos. Suplementos podem ser adicionados ao Meio de Kubota para gerar um meio definido por hormônio (HDM) livre de soro que facilite a diferenciação das células-tronco de árvore biliar ou hepáticas normais nos destinos adultos específicos. Estes incluem suplementação com cálcio para atingir a uma concentração igual ou superior a 0,6 mM, 1 nM de tri- iodotironina (T3), 10? M de cobre, 10 nM de hidrocortisona e 20 ng/ml de fator de crescimento de fibroblastos básicos (DFGF). As condições médias e acima delas necessárias para produzir seletivamente os hepatócitos (HDM-H) versus colangiócitos (HDM-C) versus ilhotas pancreáticas (HDM-P) são: 1) HDM-H: suplemento adicional com 7 uung/L de glucagon, 2 g/L de galactose, 10 ng/ml de fator de crescimento epidérmico (EGF) e 20 ng/ml de fator de crescimento de hepatócitos (HGF); 2) HDM-C: suplemento adicional com 20 ng/ml de fator de crescimento de células endoteliais vasculares (VEGF) e ng/ml de HGF; e 3) HDM-P: preparado sem glicocorticoide e suplementado ainda com 1% de B27, 0,1 mM de ácido ascórbico, 0,25 um de ciclopamina, 1 um de ácido retinoico, ng/ml de FGF-7 por 4 dias, então alterado com um suplementado com 50 ng/ml de exendina-4 e 20 ng/ml de HGF por mais 6 dias de indução.

[000118] O HDM aqui apresentado pode ser complementado com fatores de crescimento adicionais, incluindo, mas não limitado a, sinais de Wnt, fatores de crescimento epidérmico (EGFs), fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs), fatores de crescimento de hepatócitos (HGFs), fatores de crescimento de insulina (IGFs), fatores de crescimento de transformação (TGFs), fatores de crescimento de nervos (NGFs), fatores neurotróficos, diversas interleucinas, fatores de inibição de leucemia (LIFsS), fatores de crescimento de células vasculares endoteliais (VEGFs), fatores de crescimento derivados de plaquetas (PDGFs), fatores de células-tronco (SCFs), fatores estimuladores de colônias (CSFs), GM-CSF eritropoietina, trombopoieitina, fatores de crescimento que se ligam a heparina, proteínas de ligação a IGF, e/ou fatores de crescimento da placenta.

[000119] O HDM apresentado neste documento pode ser complementado com citocinas, incluindo, mas não limitado a interleucinas, linfinas, monocinas, fatores estimuladores de colônia, quimiocinas, interferons e fator de necrose tumoral (TNF).

[000120] os Depositantes mostraram que os hialuronanos podem influenciar células-tronco e/ou progenitoras para expressar fatores que regulam moléculas de adesão de células críticas necessárias para a ligação celular e interações celulares e para impedir as células- tronco e/ou progenitoras de internalizarem tais fatores de fixação após preparações de suspensão celular, criopreservação ou com transplante. Exemplos não limitantes de tais fatores de fixação incluem integrinas. Integrinas são uma grande família de glicoproteínas transmembrana heterodiméricas que servem para ligar células a proteínas de matriz extracelular da membrana basal, ligantes em outras células e ligantes solúveis. As integrinas contêm uma subunidade grande e pequena, referida como a e Bb, respectivamente. Essas subunidades formam heterodímeros ab e pelo menos 18 a e oito subunidades B são conhecidas em humanos, gerando 24 heterodímeros. Em algumas concretizações, as células-tronco e/ou progenitoras expressam níveis mais elevados de subunidades de integrina, por exemplo, ITGal, ITGa2, ITGaZ2B, ITGa3, ITGA4, ITGAS, ITGA6, ITGA7, ITGA8, ITGa9, ITGalO, ITGall, ITGaD, ITGaAE, ITGaL, ITGOM, ITGAV, ITGAX, ITGBl, ITGB2, ITGÊ3, ITGLA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7 e ITGR8. Em uma concretização preferencial, as células-tronco e/ou progenitoras expressam níveis mais elevados de beta 1 da subunidade de integrina (ITGB1) e/ou unidade de integrina beta 4 (ITGB4). Takada Y. et al. (2007) Genome, Biol. 8(5): 215.

[000121] Em algumas concretizações, as células-tronco e/ou progenitoras da presente divulgação diferem de células-tronco e/ou progenitoras de ocorrência natural pelo menos por expressarem uma subunidade integrina em uma quantidade que é pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 200% maior do que a quantidade da subunidade de integrina em células-tronco e/ou progenitoras não modificadas. Contempla-se que um aumento na subunidade de integrina pode ajudar a célula-tronco e/ou progenitora a ligar-se, formar interações célula-célula e impedir as células-tronco e/ou progenitoras de se internalizarem se isso for desejado.

MMPs

[000122] As MMPs são um dos fatores-chave que facilitam o enxerto e integração. MMPs são compostas de muitas isoformas (pelo menos 28; nos porcos, 24 isoformas são conhecidas) dos quais algumas são secretadas (por exemplo, MMP1, MMP2, MMP7, MMP9) e algumas são associadas à membrana plasmática (por exemplo, MMPl4, MMP15). Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que uma mistura destas é necessária para enxertos, especialmente uma mistura das formas secretadas. Todas as células examinadas produzem quantidades variáveis de ambas as formas secretadas e associadas à membrana, mas as células-tronco/progenitoras produzem níveis muito altos das formas secretadas. O enxerto depende destas MMPs secretadas (e com algumas sinergias conhecidas com as formas associadas à membrana). Uma fonte celular destas é a maneira prática de fornecer as MMPs necessárias para obter os enxertos. Como uma abordagem alternativa, os Depositantes contemplam a incorporação de formas purificadas/recombinantes das MMPs nos biomateriais de enxerto e/ou na engenharia genética das células no enxerto para produzir as MMPs necessárias.

[000123] As células podem enxertar com sucesso desde que existam fontes, idealmente fontes celulares, de melatoproteinases de matriz múltipla (MMPs), opcionalmente uma ou ambas dentre aquelas secretadas e associadas à membrana. As MMPs são produzidas por todos os tipos de células, tanto células imaturas quanto maduras, mas variam em relação a quais isoformas são produzidas e em qual nível de expressão de MMPs particulares. As representativas secretadas incluem MMP1, MMP2, MMP7 e MMP9. As representativas associadas à membrana incluem MMPl4 e MMP15. Empiricamente, descobriu-se que a produção mais alta de MMPs secretadas é por células de estágio de linhagem inicial, células-tronco e progenitores iniciais. os biomateriais do enxerto estimulam a capacidade de ambas as células epiteliais e mesenquimais de produzir essas múltiplas formas de metaloproteinases de matriz (MMPs) que dissolvem cápsulas em torno de órgãos ou tecidos e permitem a migração de células por meio da dissolução de múltiplas formas de componentes de matriz extracelular.

[000124] Mais geralmente, as metaloproteinases de matriz (MMPs) são uma grande família de proteinases dependentes de zinco que estão envolvidas na decomposição e modulação do componente da matriz extracelular e que estão envolvidas na implantação, invasão, angiogênese, vascularização e migração em processos normais e patogênicos. Há pelo menos 28 isoformas que compreendem matrixinas, adamalisinas, astacinas, serralisinas, etc. Suas funções foram caracterizadas em processos normais, tais como a implantação da placenta, bem como em estudos patogênicos, tais como invasão e metástases de câncer.

[000125] os estudos descritos neste documento oferecem evidências para funções inteiramente novas de MMPs que contribuem para enxertos, migração e integração de células transplantadas.

Células-tronco/progenitoras, tanto epiteliais quanto mesenquimais, expressam múltiplas isoformas de MMP que são especialmente potentes nessas funções.

A maturação das células resulta na mutação da expressão de uma ou mais das MMPs potentes associados a células-tronco/progenitoras e assim diminuindo os processos de invasão e migração.

As células adultas também expressam MMPs, principalmente as que são ligadas à membrana (MT- MMPs), tais MMPs estando envolvidas em processos de plasticidade, mas não no enxerto e integração generalizada de células aos tecidos.

No entanto, existem algumas sinergias entre os MT-MMPs e as formas secretadas.

A soma líquida desta concretização é que os biomateriais de enxerto, o revestimento e outras condições devem ser aqueles que, dentre outras características, otimizam a expressão das vários MMPs, tais como as MMPs secretadas, permitindo que os processos de enxerto e migração ocorram.

Portanto, os fatores que direcionam a diferenciação das células transplantadas, em paralelo, silenciarão as respostas das MMPs complexas.

Esta descoberta significa que fatores a serem evitados incluem soro (que impulsiona diferenciação), sinais solúveis que impulsionam a diferenciação (por exemplo, certos fatores de crescimento, citocinas e hormônios); componentes de matriz extracelular que impulsionam a diferenciação (por exemplo, colágenos, moléculas de adesão, glicosaminoglicanos/proteoglicanos altamente sulfatados); e forças mecânicas que contribuem para a rigidez (as propriedades de viscoelasticidade, que direcionam a diferenciação) do enxerto.

[000126] Em algumas concretizações, uma ou mais das células na mistura é uma fonte de MMPs secretadas e/ou associadas à membrana. As MMPs secretadas podem, opcionalmente, ser produzidas naturalmente por uma ou mais células epiteliais ou mesenquimais ou, opcionalmente, serem produzidas devido à transformação de uma ou mais células epiteliais ou mesenquimais com um vetor de expressão recombinante ou edição genética para produção de MMPs. Em algumas concretizações, tais como, mas não limitadas àquelas envolvendo populações de células- tronco/progenitoras que secretam naturalmente MMPs, as variáveis que silenciam a expressão de MMP - opcionalmente expressão de MMP associada à membrana e/ou secretada - são controladas no enxerto tipo patch graft. Exemplos não limitantes de tais variáveis incluem variáveis que resultam na maturação de células-tronco/progenitoras, tais como, mas não limitadas a, suplementação de soro para meios ou para biomateriais de enxerto, hormônios ou outros sinais solúveis que influenciam a diferenciação das células epiteliais e/ou mesenquimais, níveis de oxigênio (já que as condições anaeróbicas mantêm as células imaturas, considerando que níveis de oxigênio mais altos promovem a diferenciação), e a rigidez dos materiais de enxerto (como rigidez ou forças mecânicas, tais como força de cisalhamento e compressão pode impulsionar a diferenciação).

[000127] Para enxertos de células-tronco, ambas as células epiteliais e seus parceiros de célula mesenquimais são células-tronco ou progenitores idealmente, uma vez que fornecem contribuições de múltiplos tipos de MMPs. Para enxertar células adultas, uma dentre as células epiteliais ou mesenquimais deve idealmente fornecer uma fonte celular de MMPs associadas à membrana e/ou secretadas, por exemplo, usando opcionalmente ELSMCs como a fonte celular de MMPs associadas à membrana e/ou secretadas. Assim, enxertos em que tanto os epitélios quanto as células mesenquimais são tipos de células maduras não são bem sucedidos para enxertos. Se forem endotélios maduros, então as células epiteliais provavelmente sobreviverão e irão se proliferar e funcionar, mas não irão enxertar; se o estroma for maduro, então os enxertos provavelmente se tornarão fibróticos.

[000128] Em resumo, ocorrerá enxerto se ambos os parceiros de células mesenquimais-epiteliais forem células- tronco/progenitores ou se pelo menos uma dentre as células epiteliais ou mesenquimais for células-tronco, por exemplo, usando opcionalmente ELSMCS como uma fonte de isoformas associadas à matriz e/ou secretadas de metaloproteases de matriz (MMPs), ou se as formas purificadas/recombinantes destas MMPs forem fornecidas nos biomateriais de enxerto. As células mesenquimais em estágio de linhagem inicial (ELSMCS) apropriadas para enxertos tipo patch graft podem ser angioblastos, precursores de endotélios, endotélios em estágio de linhagem inicial, precursores de células estreladas, células estreladas em estágio de linhagem inicial, ou células-tronco mesenquimais (MSCs), ou misturas destes.

[000129] Assim, é contemplada neste documento uma composição para uso como um enxerto tipo patch graft compreendendo pelo menos uma população de células (por exemplo, células epiteliais e mesenquimais) e uma fonte de MMPs (ou seja, uma população de células em um estágio de linhagem inicial que é capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas à membrana e/ou secretadas, opcionalmente suportadas pelas condições do meio e/ou hidrogel.

Componentes do Meio

[000130] Para uso em combinação com as células e a fonte de MMPs divulgadas neste documento, pode-se usar qualquer meio (compreendendo nutrientes, vitaminas, sais etc.) junto com fatores solúveis críticos tais como insulina, transferrina/Fe e lipídios que sejam considerados úteis para expansão e/ou sobrevida de células- tronco/progenitoras. Deve-se evitar todos os fatores que fazem com que as células amadureçam, já que a maturação resulta em uma redução ou silenciamento da expressão de MMPs. Os fatores a serem evitados incluem soro, sinais solúveis que impulsionem a diferenciação, componentes da matriz extracelular que impulsionem a diferenciação e rigidez ou forças mecânicas (compressão, abrasão). Um exemplo não limitativo de tais meios é o meio de Kubota.

[000131] Assim, é contemplado neste documento uma composição para uso como um enxerto tipo patch graft compreendendo pelo menos uma população de células e uma fonte de MMPs (por exemplo, uma população de células em uma fase de linhagem inicial que seja capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas à membrana e/ou secretadas, apoiadas em um meio adequado ou MMPs purificadas). Um exemplo não limitativo de um meio adequado é o meio de Kubota. Outros meios de células-tronco, tais como aqueles usados para células-tronco embrionárias (ES ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) podem ser igualmente adequados, desde que eles não contenham sinais solúveis ou sinais de matriz que impulsionarão a diferenciação das células que são a fonte dos MMPs ou desde que MMPs estejam presentes ou sejam incluídas a partir de outras fontes.

Hidrogel

[000132] O enxerto tipo patch graft compreende um ou mais componentes de hidrogel. Em alguns aspectos, os biomateriais que podem formar hidrogéis, ou um complexo insolúvel paralelo (por exemplo, uma gelatina não colagenosa), compreendem hialuronanos, hialuronanos modificados por tiol, outros glicosaminoglicanos (GAGs) ou combinações destes. Um gatilho para solidificação pode ser qualquer fator que provoque a reticulação dos componentes da matriz ou gelificação dos componentes que podem gelificar. o agente reticulante pode compreender poli (etilenoglicol) (PEG) ou hidrogel PEG-diacrilato (PEGDA) ou um derivado destes contendo dissulfeto. Notavelmente, os biomateriais compreendidos no hidrogel devem ser selecionados pela capacidade de suportar a potencialidade das células-tronco (“stemness”) em uma ou mais populações de células divulgadas para uso no enxerto tipo patch graft, por exemplo, ELSMCs.

[000133] Os componentes da matriz que suportam a manutenção da potencialidade das células-tronco (“stemness”) podem ser usados, mas não os componentes que impulsionam a diferenciação. Exemplos não limitantes de componentes de suporte incluem hialuronanos ou glicosaminoglicanos não sulfatados (ou iminalmente sulfatados). Estes são especialmente úteis, uma vez que podem ser "regulados", isto é, modificados para terem níveis variáveis de rigidez (opcionalmente medidos como viscoelasticidade). Consequentemente, em alguns aspectos, a população de células, opcionalmente células isoladas de um órgão interno, pode ser solidificada ex vivo dentro dos biomateriais antes de introduzir as células nos hospedeiros, ou alternativamente, injetada como uma substância fluida e deixada solidificar in vivo.

[000134] As versões muito suaves (por exemplo, -+-100 Pa) de hidrogéis são ideais para manter as células doadoras em um estado imaturo). Versões mais rígidas (por exemplo >500 Pa) podem ser usadas para fazer com que as células amadureçam o suficiente para interromper a produção de MMP e assim bloquear a migração. Versões mais rígidas também podem minimizar aderências de tecidos vizinhos. Em certas concretizações, a população de células e a fonte de MMPs, opcionalmente, outra população de células (ou seja, a população de células em um estágio de linhagem inicial que é capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs associadas à membrana e/ou secretadas).

[000135] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que as formas de matriz extracelular encontradas nos âmnios são capazes de manter as células doadoras imaturas. Assim, os âmnios são contemplados para uso no hidrogel e, opcionalmente, como um material biocompatível e biodegradável alternativo.

[000136] Notavelmente, os materiais conhecidos por causar maturação incluem certos componentes derivados da matriz extracelular madura, tais como, mas não limitados a colágeno tipo I. Esses materiais devem ser excluídos de todos os elementos do enxerto tipo patch graft, incluindo, mas não se limitando às células, ao hidrogel, ao meio, ao suporte e/ou quaisquer componentes adicionais.

[000137] Assim, é contemplado neste documento uma composição para uso no enxerto tipo patch graft compreendendo pelo menos uma população de células e uma fonte de MMPs (isto é, uma população de células em uma fase de linhagem inicial que é capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas à membrana e/ou secretadas, apoiadas em um meio adequado e compreendidas em um hidrogel.

[000138] Como observado acima, a rigidez pode impulsionar a capacidade das células de diferenciar-se. Outros hidrogéis rígidos podem ter um efeito sobre a capacidade das células de migrar. Já que as células devem migrar para o órgão, o hidrogel em que as células estão compreendidas deve ter uma viscoelasticidade suficiente para permitir a migração de tais células, opcionalmente, dentro ou fora do hidrogel e/ou do enxerto tipo patch graft. Exemplos não limitantes de tal viscoelasticidade incluem mas não estão limitados a uma viscoelasticidade que varia de cerca de 50 a cerca de 100 Pa ou cerca de 250 Pa, por exemplo, pelo menos cerca de 50 Pa, pelo menos cerca de 100 Pa, pelo menos cerca de 150 Pa, pelo menos cerca de 200 Pa, no máximo cerca de 250 Pa, no máximo cerca de 200 Pa, no máximo cerca de 150 Pa, no máximo cerca de 100 Pa, e/ou qualquer valor individual entre estes, tais como, mas não limitados a, cerca de 50 Pa, cerca de 100 Pa, cerca de 150 Pa, cerca de 200 Pa e cerca de 250 Pa.

[000139] Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que quando as células migram do enxerto tipo patch graft para dentro do órgão ou tecido alvo, elas migram com parte do hidrogel associado a elas ou revestindo-nas. O hidrogel protege as células dos sinais no microambiente tecidual, o que influenciaria as células a diferenciar-se ou amadurecer, e permite que as células permaneçam imaturas. Isto facilita para que as células migrem através do tecido parenquimal. Conforme os hialuronanos no hidrogel gradualmente se degradam e são removidos, as células começam a diferenciar-se ou amadurecer e iniciam as funções celulares adultas.

Métodos de Geração de Organoides

[000140] Sem estar vinculado pela teoria, determinou- se que as células em estágio de linhagem inicial podem ter uma alta taxa de sucesso de enxerto quando incorporadas em um organoide ou um agregado. Tal organização pode, opcionalmente, compreender estágios de linhagem inicial de células epiteliais e mesenquimais.

[000141] Assim, é fornecido aqui um método de formação de organoides, o método compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente no cultivo de uma mistura de células epiteliais e células mesenquimais em um recipiente adequado para a cultura de tecidos e na presença de um meio de cultura, remoção de células maduras que aderem a uma superfície do recipiente por panning e recuperação de organoides automontados a partir da suspensão de células no meio de cultura. Também é divulgada neste documento uma composição compreendendo um organoide gerado desta maneira.

[000142] Em algumas concretizações, o procedimento envolve panning para eliminar células maduras por adesão seletiva e rápida (15-30 minutos) a placas de cultura regulares sob condições sem soro e a 37ºC, já que mesmo sob essas condições, as células maduras expressam vários componentes de matriz que permitem a adesão celular. Várias rodadas (por exemplo, 4-5) de tal processo de panning enriquece a suspensão celular para as células de estágio de linhagem mais iniciais. Em seguida, a suspensão celular é transferida para placas de baixa aderência e novamente em meio livre de soro, um projetado para as células de estágio de linhagem inicial, e deixada durante a noite em uma incubadora a 37'C. As condições promovem a automontagem das células epiteliais e mesenquimais correspondentes em estágio de linhagem em organoides. Organoides podem ser obtidos a partir da mistura dos estágios iniciais de epitélios (células ES, células iPS, células-tronco determinadas, células amplificadoras transitórias, progenitores) com estágios iniciais de células mesenquimais (angioblastos, precursores de endotélios, precursores de células estreladas).

[000143] Misturas de células epiteliais adultas com células mesenquimais maduras e misturas quiméricas de células epiteliais maduras com células mesenquimais em estágio de linhagem inicial (ELSMCs) geralmente não geram organoides, mas podem ser usadas como misturas das células em suspensão nos biomateriais de enxerto. Se epitélios maduros (por exemplo, hepatócitos, colangiócitos, ilhotas, células acinares, enterócitos etc.) formarem parceira com células mesenquimais maduras (por exemplo, endotélios, células estreladas, células estromais, miofibroblastos), as misturas não resultarão em integração bem-sucedida dos enxertos no sítio ou órgão alvo, mas sim naqueles que persistem na superfície dos órgãos ou tecidos. Se misturas quiméricas compreendendo células adultas e tronco/progenitoras forem usadas (por exemplo, hepatócitos maduros com angioblastos), então ocorrerá de fato enxerto, uma vez que haverá uma fonte de MMPs que permitem enxerto e migração das células.

[000144] Em outro aspecto, as células isoladas do órgão interno podem ser solidificadas ex vivo dentro dos biomateriais antes de introduzir as células nos hospedeiros, ou alternativamente, injetadas como uma substância fluida e deixadas solidificar em um enxerto in vivo. Preferencialmente, as células são introduzidas no ou perto do tecido doente ou disfuncional e podem ser introduzidas através de injeção ou enxertadas sobre/dentro do tecido ou usando um método cirúrgico adequado.

[000145] Em outro aspecto, os biomateriais que podem formar hidrogéis, ou um complexo insolúvel paralelo, podem compreender hialuronanos, hialuronanos modificados por tiol ou outros glicosaminoglicanos (GAGs). Um gatilho para solidificação pode ser qualquer fator que provoque a reticulação dos componentes da matriz ou gelificação dos componentes que podem gelificar. O agente reticulante pode compreender poli(etilenoglicol) (PEG) ou hidrogel PEG- diacrilato (PEGDA) ou um derivado destes contendo dissulfeto.

[000146] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para formação de organoides cultivando um primeiro tipo de células (epitélios) com um ou mais segundo tipo de células (células mesenquimais), em que o segundo tipo de células está em um estágio de maturação suficiente para ser um parceiro de linhagem adequado do primeiro tipo de células. Em algumas concretizações, isto pode ser conseguido removendo células maduras que aderem às placas de cultura por meio de panning; transferindo as células que não aderiram para as placas de cultura de baixa aderência e em um meio apropriado; e recuperando os organoides que se automontarem sob essas condições. O primeiro tipo de células pode ser células-tronco epiteliais, progenitores comprometidos de células epiteliais ou células maduras (por exemplo, hepatócitos). O segundo tipo de células pode ser células-tronco das linhagens mesenquimais (por exemplo, angioblastos, células-tronco mesenquimais), progenitores dessas linhagens (por exemplo, progenitores de células endoteliais ou estreladas), ou uma mistura de células mesenquimais em estágio de linhagem inicial. É importante notar que essa formação não ocorre sob certas condições. Por exemplo, o cultivo em Matrigel não gera organoides adequados para um enxerto tipo patch graft bem sucedido. Embora os organoides preparados por Matrigel possam enxertar, a extensão do enxerto será silenciada em relação àquela com organoides preparados em condições definidas. Além disso, o Matrigel não pode ser um componente de condições que se destinam a ser usadas para produtos clínicos.

[000147] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para enxerto de células em um órgão compreendendo colocar um enxerto tipo patch graft compreendendo múltiplas camadas, incluindo um suporte biodegradável e biocompatível que seja neutro em efeitos sobre a diferenciação das células doadoras; uma segunda camada que compreende um ou mais biomateriais, tais como hialuronanos, que possam ser solidificados, tal como em um hidrogel; uma mistura de células epiteliais e células mesenquimais de apoio que são incorporadas ao biomaterial solidificado; e esta estrutura semelhante a um curativo adesivo aderido a um sítio alvo por meio de suturas ou cola cirúrgica. Na superfície serosa do suporte é adicionada uma camada dos biomateriais solidificados preparados para atingir 400 Pa ou mais, um nível pelo menos duas vezes maior que o encontrado nos biomateriais suaves aos quais as células doadoras são incorporadas. As células dentro do enxerto tipo patch graft são capazes de enxertar e migrar para e por todo o tecido/órgão e depois de amadurecer em destinos adultos relevantes, ditados pelo microambiente em que se encontram.

Os níveis de Pascal mais elevados dos biomateriais incorporados ou compreendidos em um suporte poroso bloqueiam a migração das células na direção errada e isso somado à superfície serosa do enxerto minimiza a adesão de células de outros órgãos e tecidos.

Organoides

[000148] De acordo com uma concretização divulgada neste documento, organoides, agregados flutuantes de células-tronco de árvore biliar (doravante “BTSCsS”) e células mesenquimais em estágio de linhagem inicial (doravante “ELMCS”) comprovaram-se o método mais bem- sucedido de incorporação de células aos enxertos. É divulgado neste documento que as BTSCs e ELMCs podem autosselecionar em organoides por meio de panning para eliminar as células estreladas/estromais maduras, e isso se mostrou mais eficiente e eficaz no estabelecimento de parceiros epiteliais-mesenquimais apropriados em termos de estágio de linhagem para os enxertos. Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para formação de organoides mediante cultivo de um primeiro tipo de células com um segundo tipo de células, em que o segundo tipo de células é um parceiro no estágio de linhagem apropriado do primeiro tipo de células, removendo células maduras que aderem à placa de cultura por meio de panning e recuperando os organoides automontados da suspensão da cultura. O primeiro tipo de células pode ser células-tronco epiteliais ou células epiteliais comprometidas. O segundo tipo de células pode ser células da linhagem mesenquimal, células- tronco mesenquimais ou células mesenquimais em estágio da linhagem inicial. Aspectos adicionais referem-se ao organoide automontado e usos deste.

[000149] Em algumas concretizações, as células doadoras e/ou as células mesenquimais de apoio expressam metaloproteinases de matriz (doravante MMPs). Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que as MMPs permitem a fusão de células doadoras e hospedeiras e a dissolução da cápsula de Glisson (ou a cápsula equivalente ao redor do tecido ou órgão). A divulgação neste documento demonstra que, em algumas concretizações, as células-tronco em estágio de linhagem inicial ou ELMCS expressam altos níveis de MMPs, enquanto os hepatócitos maduros expressam baixos níveis de MMPs. Em algumas concretizações, os hepatócitos maduros em parceria com endotélios sinusoidais maduros (CD3l1+++, receptor de VEGF+, colágeno tipo IV+ e negativo para CDl17) e aqueles para colangiócitos adultos estão associados com células estreladas e estromais maduras (ICAM-1+, ASMA+, Vitamina A++, colágeno tipo I+) resulta em agregados celulares que permanecem na superfície do órgão e não podem ser enxertados efetivamente. Em algumas concretizações, o enxerto de células epiteliais maduras requer que elas formem parcerias com células mesenquimais imaturas que produzam as MMPs necessárias para enxerto e migração.

[000150] De acordo com uma concretização divulgada neste documento, organoides, agregados flutuantes de células-tronco/progenitoras, tais como BTSCs e ELSMCs, provaram-se a representação mais bem-sucedida de células para o sucesso do enxerto tipo patch graft. É divulgado neste documento que as BTSCs e ELSMCs podem autosselecionar em organoides pela eliminação das células mesenquimais maduras por procedimentos de panning padrão para células que aderem a placas regulares sob condições sem soro, seguido por cultivo das células restantes (aquelas que não aderiram) em placas de fixação baixas e em meio definido sem soro. Os organoides se automontam sob essas condições.

[000151] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para formação de organoides mediante cultivo de um primeiro tipo de células, epitelial, com um segundo tipo de células, células mesenquimais, em que o segundo tipo de células é um parceiro em estágio de linhagem apropriado do primeiro tipo de células, remoção de células maduras que aderem às placas de cultura regulares por procedimentos de panning, e recuperação dos organoides que se automontam a partir da suspensão da cultura em placas de cultura que são de baixa aderência. O primeiro tipo de células pode ser células-tronco epiteliais, células amplificadoras transitórias ou progenitores epiteliais comprometidos. O segundo tipo de células pode ser células-tronco das linhagens celulares mesenquimais, células amplificadoras de trânsito ou progenitores mesenquimais comprometidos.

[000152] Em algumas concretizações, as células doadoras e/ou as células mesenquimais de apoio expressam metaloproteinases de matriz (doravante MMPs). Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que as MMPs resultam na dissolução das cápsulas em torno de tecidos ou órgãos e permite a fusão de células hospedeiras e hospedeiros. A divulgação neste documento demonstra que, em algumas concretizações, as células-tronco em estágio de linhagem inicial ou ELMCS expressam altos níveis de MMPs, enquanto os hepatócitos maduros expressam baixos níveis de MMPs. Em algumas concretizações, os hepatócitos maduros em parceria com endotélios sinusoidais maduros (CD3l+++, receptor de VEGF+, colágeno tipo IV+ e negativo para CDl17) e aqueles para colangiócitos adultos estão associados com células estreladas e estromais maduras (ICAM-l+, ASMA+, Vitamina A++, colágeno tipo I+) resulta em agregados celulares que permanecem na superfície do órgão e não podem ser enxertados efetivamente. Em algumas concretizações, o enxerto de células epiteliais maduras requer que elas formem parcerias com células mesenquimais imaturas que produzam as MMPs necessárias para enxerto e migração.

[000153] De acordo com uma concretização divulgada neste documento, organoides, agregados flutuantes de células-tronco/progenitoras, tais como BTSCs e ELSMCs, provaram-se a representação mais bem-sucedida de células para o sucesso do enxerto tipo patch graft. É divulgado neste documento que as BTSCs e ELSMCSs podem autosselecionar em organoides pela eliminação das células mesenquimais maduras por procedimentos de panning padrão para células que aderem a placas regulares sob condições sem soro, seguido por cultivo das células restantes (aquelas que não aderiram) em placas de aderência baixa e em meio definido sem soro. Os organoides se automontam sob essas condições.

[000154] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para formação de organoides mediante cultivo de um primeiro tipo de células, epitélios, com um segundo tipo de células, células mesenquimais, em que o segundo tipo de células é um parceiro em estágio de linhagem apropriado do primeiro tipo de células, remoção de células maduras que aderem às placas de cultura regulares por procedimentos de panning, e recuperação dos organoides que se automontam a partir da suspensão da cultura em placas de cultura que são de baixa aderência. O primeiro tipo de células pode ser células-tronco epiteliais, células amplificadoras transitórias ou progenitores epiteliais comprometidos. O segundo tipo de células pode ser células-tronco das linhagens celulares mesenquimais, células amplificadoras de trânsito ou progenitores mesenquimais comprometidos.

[000155] Em algumas concretizações, para que as estratégias de enxerto tipo patch graft obtenham sucesso, as células doadoras e/ou as células mesenquimais de apoio devem expressar múltiplas metaloproteinases de matriz (doravante MMPs) e especialmente formas secretadas de MMPs. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que múltiplas isoformas das MMPs permitem a dissolução da cápsula em torno do órgão ou tecido, seguido pela rápida migração das células doadoras para o tecido hospedeiro. A divulgação neste documento fornece que células-tronco epiteliais de estágio de linhagem inicial e/ou ELSMCS expressam altos níveis de MMPs associadas à membrana e/ou secretadas, enquanto as células maduras (por exemplo, hepatócitos) expressam baixos níveis de MMPs secretadas mesmo se expressarem MMPs associadas à membrana plasmática. O enxerto de tais células adultas (por exemplo, hepatócitos, colangiócitos, ilhotas, enterócitos etc.) requer que o parceiro mesenquimal seja uma fonte celular de MMPs, particularmente as formas secretadas de MMPs se o enxerto ocorrer. Uma alternativa é fornecer as isoformas relevantes de MMPs, isto é, formas purificadas destas, nos biomateriais do enxerto.

[000156] De acordo com esta divulgação, os números de células que podem ser enxertadas usando um enxerto tipo patch graft são consideráveis (>108) e ditados pelas dimensões do enxerto, o número e tamanho dos organoides (ou o número de células — se não forem parte de organoides), se as células doadoras são células-tronco ou células maduras e a expressão de MMPs secretadas e associadas à membrana (seja dos epitélios e/ou das células mesenquimais). Essas descobertas são bem distintas dos números limitados de células (por exemplo, 105-1069) viáveis com liberação vascular ou por enxerto por injeção.

[000157] É divulgado neste documento que a produção dos enxertos compreende a mistura de células com biomateriais apropriados que podem se tornar insolúveis e manter as células localizadas no sítio alvo. Em outro aspecto, as células isoladas do órgão interno podem ser solidificadas ex vivo dentro dos biomateriais antes de introduzir as células nos hospedeiros, ou alternativamente, injetadas como uma substância fluida e deixadas solidificar in vivo. Em outro aspecto, os biomateriais que podem formar hidrogéis, ou um complexo insolúvel paralelo, podem compreender hialuronanos ou outros glicosaminoglicanos não sulfatados ou minimamente sulfatados, um hialuronato de sódio modificado por tiol ou material derivado de plantas

(por exemplo, alginatos). Um gatilho para solidificação pode ser qualquer fator que provoque a reticulação dos componentes da matriz ou gelificação dos que podem gelificar. O agente reticulante pode compreender diacrilato de polietilenoglicol ou um derivado deste contendo dissulfeto. Preferencialmente, o complexo insolúvel de células e biomateriais possui uma viscoelasticidade que varia de cerca de 0,1 a 200 Pa, preferencialmente de cerca de 0,1 a cerca de 1 Pa, cerca de 1 a cerca de 10 Pa, cerca de 10-100 Pa, ou cerca de 100 a cerca de 200.

[000158] Preferencialmente, as células são introduzidas no ou perto do tecido doente ou disfuncional e podem ser introduzidas através de injeção ou administração cirúrgica. Sem estar limitado pela teoria, é uma hipótese neste documento que hidrogéis de HA mais rígidos (por exemplo >500 Pa), acionam a diferenciação das células e reduzem o enxerto devido, em parte, à redução na expressão de MMPs com maturação e, em paralelo, à redução da capacidade de migrar.

Suporte

[000159] Existem várias opções para o suporte biodegradável e biocompatível com neutralidade ao estado de maturação das células doadoras. Eles incluem formas da seda de bicho-da-seda Bombyx, tais como Serif Surgical Silk Scaffolds ou Contour Seri-Silk (Sofregen, Nova York, NY), outros derivados de seda de bicho-da-seda Bombyx, derivados de âmnio, omento, placenta e tecidos ou materiais sintéticos, tais como formas de ácido poliglicólico-co-L- láctico (PGA/PLLA). É fundamental para a eficácia do suporte que ele tenha efeitos mínimos sobre a diferenciação das células doadoras. Assim, muitas formas de retrocesso usadas clinicamente não são úteis para enxerto tipo patch graft, uma vez que são compostas de componentes (por exemplo, formas de tipos maduros de matriz extracelular) que induzem a diferenciação das células doadoras.

[000160] O suporte deve ter resistência à tração suficiente para permitir a fixação do enxerto ao sítio alvo por suturas ou por cola cirúrgica. Deve ser composto por um material biodegradável e biocompatível que seja capaz de degradar dentro de alguns meses, mas com produtos de degradação que não alterem o estado de maturação das células doadoras. Assim, os produtos devem ter efeitos mínimos sobre o pH ou sobre outras facetas do ambiente. O suporte também deve ser capaz de caber na superfície do sítio alvo; portanto, um suporte flexível facilitará o uso dos enxertos em sítios de curvatura significativa. Seri- Silk é um exemplo não limitativo de um material adequado para o suporte. Uma alternativa derivada de âmnio também é contemplada como um material adequado para o suporte, tal como, mas não limitado ao material derivado de âmnio produzido pela Osiris Therapeutics, Inc (Columbia, MD).

[000161] O suporte pode ser originado de um molde poroso, tal como Seri-Silk, ou uma membrana não porosa, tal como âmnio ou membrana placentária ou omento, ou pode ser um tecido sintético poroso ou não poroso, ou uma combinação destes. se o suporte for poroso, ele deve ser infundido/impregnado com um biomaterial para vedá-lo e assim inibir a migração de tal população de células na direção do suporte, ou seja, para longe do sítio alvo, ou através do suporte. As características fundamentais do material do suporte são que é biocompatível, biodegradável, neutro, conforme definido acima, e tem resistência à tração suficiente conforme descrito acima. Além disso, o material pode opcionalmente ser biorreabsorvível.

[000162] O suporte pode ser ainda mais otimizado dependendo do uso. Por exemplo, em algumas concretizações, um enxerto tipo patch graft é útil para a pele e tecidos dérmicos subjacentes se compreender um suporte projetado para sobreviver ao efeito de secagem do ar.

[000163] Matrizes de hidrogel, conforme divulgadas neste documento, podem também ser úteis em outras partes do enxerto tipo patch graft. Por exemplo, se o suporte biodegradável e biocompatível for poroso, um hidrogel pode ser usado para inibir a migração de tal população de células na direção do suporte. Tal hidrogel exigiria uma maior viscoelasticidade em comparação com o hidrogel, por exemplo, entre 1,5 e 15 vezes maior, por exemplo, 2 vezes maior. Exemplos não limitantes de uma viscoelasticidade adequada incluem, mas não estão limitados a, propriedades de viscoelasticidade que variam de cerca de 250 a cerca de 600 Pa, por exemplo, de pelo menos cerca de 250 Pa, pelo menos cerca de 300 Pa, pelo menos cerca de 350 Pa, pelo menos cerca de 400 Pa, pelo menos cerca de 450 Pa, pelo menos cerca de 500 Pa, pelo menos cerca de 550 Pa, no máximo cerca de 600 Pa, no máximo cerca de 550 Pa, no máximo cerca de 500 Pa, no máximo cerca de 450 Pa, no máximo cerca de 400 Pa, no máximo cerca de 350 Pa, no máximo cerca de 200 Pa, e/ou qualquer valor individual entre estes tais como, mas não limitados a, cerca de 250 Pa, cerca de 300 Pa, cerca de 350 Pa, cerca de 400 Pa, cerca de 450 Pa, cerca de 500 Pa, cerca de 550 Pa e cerca de 600 Pa. Exemplos —não limitantes adicionais de viscoelasticidade adequada incluem, mas não estão limitados a, uma viscoelasticidade que varia de cerca de 600 a cerca de 800 Pa, por exemplo, pelo menos cerca de 600 Pa, pelo menos cerca de 650 Pa, pelo menos cerca de 700 Pa, pelo menos cerca de 750 Pa, no máximo cerca de 800 Pa, no máximo cerca de 750 Pa, no máximo cerca de 700 Pa, no máximo cerca de 650 Pa, no máximo cerca de 600 Pa, e/ou qualquer valor individual entres estes, tais como, mas não limitados a, cerca de 600 Pa, cerca de 650 Pa, cerca de 700 Pa, cerca de 750 Pa e cerca de 800 Pa. Ainda outros exemplos não limitantes incluem o intervalo de cerca de 250 Pa a cerca de 800 Pa.

[000164] Além disso, os hidrogéis divulgados neste documento podem ser úteis como um suporte para impedir a adesão à superfície serosa do suporte, que fica do lado oposto ao do suporte adjacente às células. Tal hidrogel pode ter uma viscoelasticidade entre aquela adequada para o hidrogel que compreende as células e aquela adequada para vedar o suporte. Exemplos não limitantes de uma viscoelasticidade adequada incluem, não estão limitados a, uma viscoelasticidade que varia de cerca de 250 a cerca de 400 Pa ou cerca de 500 Pa, por exemplo, pelo menos cerca de 250 Pa, pelo menos cerca de 300 Pa, pelo menos cerca de 350 Pa, pelo menos cerca de 400 Pa, pelo menos cerca de 450 Pa,

no máximo cerca de 500 Pa, no máximo cerca de 450 Pa, no máximo cerca de 400 Pa, no máximo cerca de 350 Pa, no máximo cerca de 200 Pa e/ou qualquer valor individual entre estes, tais como, mas não limitados a, cerca de 250 Pa, cerca de 300 Pa, cerca de 350 Pa, cerca de 400 Pa, cerca de 450 Pa e cerca de 500 Pa.

Enxertos, Em Geral

[000165] Em geral, um enxerto tipo patch graft pode ser projetado usando os métodos e componentes supracitados para transplante de células doadoras (alogênicas ou autólogas) para um órgão ou tecido sólido e com condições que sustentam e mantêm as células doadoras em um estágio de linhagen de maturação inicial. Mais particularmente, um enxerto tipo patch graft é contemplado, que é útil para transplante de células doadoras (alogênicas ou autólogas para um órgão ou tecido sólido, com condições que sustentam e mantêm algumas ou todas as células doadoras em um estágio de linhagem de maturação inicial. Em algumas concretizações, as células doadoras são uma mistura de células epiteliais e mesenquimais. Em algumas concretizações, ambas as populações de células doadoras são células-tronco/progenitoras. Em algumas concretizações, as células epiteliais são células maduras (por exemplo, hepatócitos, ilhotas, etc.) e as células mesenquimais são células-tronco/progenitoras. Em algumas concretizações, as condições dos biomateriais de enxerto, por exemplo, o meio e os componentes da matriz permitem que ambas as populações de células doadoras ou pelo menos a população de células mesenquimais permaneçam como células-tronco/progenitoras.

Em algumas concretizações o meio compreende um meio basal e sinais solúveis.

Em outras concretizações, este meio basal e sinais solúveis suportam a manutenção da potencialidade das células-tronco (“stemness”) em ambas as populações doadoras ou pelo menos na população de células mesenquimais.

Em algumas concretizações, a matriz, opcionalmente constituída por componentes de matriz extracelular, e seu nível de rigidez suportam a manutenção da potencialidade das células-tronco (“stemness”) de ambas as populações doadoras ou pelo menos a população de células mesenquimais.

Em algumas concretizações, a matriz compreende hialuronanos, opcionalmente preparados como um hidrogel suave com uma viscoelasticidade de cerca de 50 Pa a cerca de 150 Pa.

Em algumas concretizações, o enxerto tipo patch graft compreende um suporte que tem resistência mecânica suficiente para permitir que o enxerto seja fixado ao sítio alvo e consiste em um material biodegradável e biocompatível que não altera significativamente o estágio de linhagem de maturação das células doadoras.

Opcionalmente, sem modificações adicionais, o suporte deve ser adequado por conta própria para proteger a camada que contém as células doadoras sem afetar significativamente o estágio de linhagem de maturação das células doadoras.

Em algumas concretizações, o suporte é uma malha ou molde e é ainda impregnado com um biomaterial, tal como hialuronano com uma viscoelasticidade suficientemente alta para fazer com que quaisquer células que migrarem para ela amadureçam o suficiente para cessar a migração das células doadoras em uma direção diferente da direção do sítio alvo.

Em algumas concretizações, esta viscoelasticidade é de cerca de 500 Pa ou superior. Em algumas concretizações, a superfície serosa do enxerto é revestida com um biomaterial para minimizar a adesão de tecidos ou órgãos adjacentes. Em algumas concretizações, esses biomateriais têm uma viscoelasticidade de cerca de 200 Pa a cerca de 300 Pa.

[000166] É contemplado que o suporte proposto tem resiliência suficiente para aguentar forças mecânicas, é capaz de ser fixada a um órgão ou tecido alvo e tem flexibilidade suficiente para ser fixada aos locais com curvatura. Além disso, qualquer “biomaterial (exceto hidrogel) pode ser utilizado, desde que o biomaterial seja capaz de sustentar e manter as populações de células e tenha propriedades de viscoelasticidade suficientes para permitir a migração da população de células dentro ou para fora do enxerto tipo patch graft.

[000167] Em outra concretização, o enxerto tipo patch graft é útil para sustentar e manter uma população de células e compreende: (a) uma população de células (opcionalmente de um único tipo), apoiada em um meio em um hidrogel ou outro biomaterial com viscoelasticidade suficiente para permitir a migração das células dentro ou para fora do enxerto tipo patch graft; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível e biodegradável com uma viscoelasticidade suficiente para inibir (ou fornecer uma barreira contra) a migração da população de células na direção do suporte.

[000168] É importante observar que as MMPs podem ser MMPs associadas à membrana e/ou secretadas; elas podem ser fornecidas por células produtoras de MMPs, derivadas de tais células, ou podem ser adicionadas às composições de interesse (por exemplo, purificadas ou produzidas de forma recombinante).

[000169] Em outra concretização, um forro ou revestimento para um enxerto tipo patch graft ou tecido que compreende um hidrogel ou outro biomaterial com viscoelasticidade e resiliência suficientes para suportar forças mecânicas, incluindo forças de outros tecidos e órgãos, é fornecido. Por meio do uso do forro ou revestimento, um método é fornecido para inibir ou prevenir a formação de adesão (que pode envolver ou resultar de forças mecânicas ou contato de outros órgãos e tecidos), em que o método compreende forrar ou revestir uma superfície com um hidrogel ou outro biomaterial comparável.

[000170] Em ainda outra concretização, é fornecido um método de enxerto de células em um tecido alvo, que compreende o contato de um tecido alvo com um enxerto tipo patch graft, compreendendo: (a) uma população de células, incluindo pelo menos uma população em um estágio de linhagem inicial, compreendendo um único tipo ou múltiplos tipos de células apoiadas em um meio em um hidrogel ou outro biomaterial com propriedades reológicas (por exemplo, viscoelasticidade) suficientes para permitir a migração de células da população dentro ou para fora do enxerto tipo patch graft; e (b) um suporte compreendendo um material biodegradável e biocompatível com propriedades reológicas (por exemplo, viscoelasticidade) suficientes para inibir (ou fornecer uma barreira contra) a migração de células da população em direção a tal suporte, sendo o enxerto tipo patch graft configurado para sustentar e manter tal população de células, ao mesmo tempo em que inibe tal pelo menos uma população em um estágio de linhagem inicial de diferenciar-se ou amadurecer ainda mais até um estágio de linhagem posterior. Em uma concretização adicional, um método é fornecido em que uma população com um estágio de linhagem inicial é capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas à membrana e/ou secretadas. Em outra concretização, as células não têm esta capacidade, mas MMPs estão presentes ou são incluídas de outras fontes (por exemplo, recombinantes).

Enxertos com uma Fonte Celular de MMPs

[000171] Aspectos da divulgação referem-se a um enxerto tipo patch graft para sustentar e manter uma população mista de células, compreendendo: (a) uma população mista tendo dois ou mais tipos de células, pelo menos um dos quais está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar as metaloproteinases de matriz (MMPs) secretadas e/ou associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio presente em uma matriz de hidrogel tendo uma viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista, opcionalmente dentro ou para fora do referido hidrogel e/ou dentro ou para fora do enxerto tipo patch graft; (b) um suporte compreendendo um material biocompatível e biodegradável tendo uma viscoelasticidade suficiente para inibir uma migração da referida população mista em uma direção do referido suporte; e, opcionalmente, ((c) um hidrogel sobreposto sobre uma superfície serosa (isto é, exterior) do referido suporte, que é oposta ao que está em contato com a referida população mista e, em concretizações onde o enxerto tipo patch graft é ligado a um sítio alvo, é oposto ao lado em contato com o sítio alvo (por exemplo, órgão ou tecido). Em algumas concretizações, esta camada impede ou inibe aderências por ou de outros tecidos ou órgãos. Em algumas concretizações, o enxerto tipo patch graft é configurado para sustentar e manter a referida população mista enquanto inibe o referido pelo menos um tipo celular em estágio de linhagem inicial a partir da diferenciação ou maturação posterior a um estágio de linhagem tardio que já não é mais capaz de expressar MMPs associadas à membrana e/ou secretadas.

[000172] Em algumas concretizações, o enxerto pode conter apenas um tipo de célula, tal como uma célula-tronco embrionária (ES) ou células-tronco pluripotentes induzidas (iPS). Isso pode ser bem sucedido desde que essas células sejam uma fonte celular de MMPs ou, alternativamente, outras fontes tais como formas purificadas (por exemplo, recombinantes) de MMPs sejam adicionadas ao enxerto.

[000173] Em algumas concretizações, o referido suporte é poroso ou não poroso. Em algumas concretizações, o suporte compreende uma malha porosa e/ou não porosa, molde ou membrana. Em algumas concretizações, o suporte compreende seda; um tecido sintético; ou um material natural tal como o âmnio, placenta ou omento ou derivados destes; ou uma combinação destes. Em algumas concretizações, o referido suporte compreende uma malha porosa infundida com um hidrogel ou outro biomaterial usado para convertê-la em uma barreira. Em outras concretizações, tal infusão impede a migração celular para longe do órgão ou tecido alvo. Em algumas concretizações, o referido suporte compreende um material sólido.

[000174] Em algumas concretizações, um ou mais dos referidos hidrogéis compreendem hialuronanos.

[000175] Em algumas concretizações, o referido meio compreende o meio de Kubota ou outro meio de apoio de células-tronco e capaz de manter a potencialidade das células-tronco (“stemness”"”).

[000176] Em algumas concretizações, a referida população mista compreende células mesenquimais e células epiteliais. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais podem ser ectodérmicas, endodérmicas ou mesodérmicas. Em algumas concretizações, as referidas células mesenquimais compreendem células mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ELSMCS) . Em algumas concretizações, as referidas ELSMCS compreendem um ou mais dentre angioblastos, precursores para endotélio ou precursores para células estreladas e células-tronco mesenquimais (MSCs) . Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células-tronco epiteliais. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células-tronco de árvore biliar (BTSCs). Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células epiteliais comprometidas e/ou maduras. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais comprometidas e/ou maduras compreendem células parenquimais maduras. Em algumas concretizações, as referidas células parenquimais maduras compreendem um ou mais dos hepatócitos, colangiócitos e células da ilhota. Em algumas concretizações, as referidas células mesenquimais e células epiteliais ambas compreendem células-tronco.

[000177] Em algumas concretizações, a referida população mista compreende células autólogas e/ou alogênicas.

[000178] Em algumas concretizações, um ou mais tipos celulares são geneticamente modificados.

Enxertos em "Camadas"

[000179] Em algumas concretizações, o enxerto tipo patch graft é entendido como um enxerto de múltiplas camadas. Por exemplo, são fornecidos neste documento enxertos tipo patch graft compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em múltiplas camadas, incluindo, pelo menos: (a) uma primeira camada suave de hidrogel compreendendo células doadoras, opcionalmente células epiteliais e/ou células mesenquimais; (b) uma segunda camada rígida de hidrogel; e (c) uma terceira camada compreendendo um suporte biodegradável e biocompatível. Em algumas concretizações, em particular aquelas em que a terceira camada é porosa, a segunda camada é incorporada, impregnada e/ou infundida na terceira camada. Em algumas concretizações, os enxertos tipo patch graft compreendem ainda uma quarta camada de hidrogel. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a quarta camada é revestida ou pintada sobre uma superfície serosa do enxerto. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a primeira camada é adaptada para entrar em contato diretamente com um tecido ou órgão alvo.

[000180] Conforme usado neste documento, "suave" refere-se a uma camada de hidrogel que exibe um baixo nível de pressão interna, conforme determinado quantitativamente por ensaios de Pascal (Pa). Um Pascal é definido como um newton por metro quadrado. Em algumas concretizações, uma camada suave tem uma viscosidade de cerca de 10 Pa a cerca de 300 Pa, cerca de 50 Pa a cerca de 250 Pa, cerca de 100 Pa a cerca de 250 Pa, cerca de 50 Pa a cerca de 200 Pa, cerca de 150 Pa a cerca de 200 Pa, ou cerca de 100 Pa a cerca de 200 Pa. Em uma concretização particular, uma camada de hidrogel suave tem uma viscosidade que é inferior a ou de cerca de 200 Pa.

[000181] Conforme usado neste documento, "rígido" refere-se a uma camada de hidrogel que exibe um alto nível de pressão interna, conforme determinado quantitativamente por ensaios de Pascal (Pa). Em algumas concretizações, uma camada rígida tem uma viscosidade de cerca de 300 Pa a cerca de 3000 Pa, cerca de 300 Pa a cerca de 1000 Pa, cerca de 400 Pa a cerca de 750 Pa, cerca de 400 Pa a cerca de 550 Pa, cerca de 450 Pa a cerca de 600 Pa, ou cerca de 500 Pa a cerca de 600 Pa. Em uma determinada concretização, uma camada de hidrogel rígida tem uma viscosidade que é superior a ou de cerca de 500 Pa.

[000182] Preferencialmente, para a primeira camada do enxerto em camadas, o complexo insolúvel de células e biomateriais possui uma viscosidade ou viscoelasticidade que varia de cerca de 0,1 a 200 Pa, preferencialmente cerca de 0,1 a cerca de 1 Pa, cerca de 1 a cerca de 10 Pa, cerca de 10 a 100 Pa, ou cerca de 100 à cerca de 200, ou cerca de 50 a cerca de 250 Pa, ou cerca de 200 Pa. Preferencialmente, para a primeira camada do enxerto em camadas, o complexo insolúvel de células e biomateriais possui uma viscoelasticidade que varia de cerca de 0,1 a 200 Pa, preferencialmente de cerca de 0,1 a cerca de 1 Pa, de cerca de 1 a cerca de 10 Pa, de cerca de 10-100 Pa, ou de cerca de 100 a cerca de 200.

[000183] Em algumas concretizações, uma ou mais das células na mistura é uma fonte de MMPs secretadas e/ou associadas à membrana. Em algumas concretizações, tais como, mas não limitadas àquelas envolvendo populações de células-tronco/progenitoras que secretam naturalmente MMPs, as variáveis que silenciam a expressão de MMPs - opcionalmente expressão de MMPs secretadas - são controladas no enxerto tipo patch graft. Exemplos não limitantes de tais variáveis incluem variáveis que resultam na maturação de células-tronco/progenitoras, tais como, mas não limitadas a, suplementação de soro para meios ou para biomateriais de enxerto, hormônios ou outros sinais solúveis que influenciam a diferenciação das células epiteliais e/ou mesenquimais, níveis de oxigênio (já que as condições anaeróbicas mantêm as células imaturas, enquanto níveis mais elevados de oxigênio promovem a diferenciação), e a rigidez dos materiais de enxerto (já que forças mecânicas tais como força de cisalhamento e compressão podem impulsionar a diferenciação).

[000184] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da primeira camada é de cerca de 50 a cerca de 250 Pa. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da primeira camada é de cerca de 200 Pa. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da segunda camada é de cerca de 250 Pa a cerca de 600 Pa. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da segunda camada é de cerca de 500 Pa. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da quarta camada é de cerca de 250 a cerca de 500 Pa. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da quarta camada é de cerca de 400 Pa. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da segunda camada é maior que a viscosidade da camada 1. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a viscosidade da segunda camada é de cerca de 1,5 a cerca de 15 vezes maior do que a viscosidade da primeira camada. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a segunda camada é cerca de 2 vezes maior do que a viscosidade da primeira camada.

[000185] Em uma concretização, um enxerto tipo patch graft compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em camadas, começando com aquela em contato com o sítio alvo e constituído por células doadoras incorporadas em um hidrogel macio (<200 Pa) preparado em um meio definido sem soro (essas células devem enxertar e migrar para o tecido); uma segunda camada do hidrogel preparada no mesmo meio e acionada para possuir uma rigidez maior (por exemplo, -500 Pa ou maior) fornecendo uma barreira para as células doadoras migrarem em qualquer direção que não seja para o tecido alvo; uma terceira camada, um suporte biocompatível, biodegradável e biorreabsorvível que tem efeito neutro no estado maturacional das células doadoras e que pode ser usada cirurgicamente ou por outros meios para ligar o enxerto ao sítio alvo; e uma última camada do hidrogel que é intermediária em rigidez entre o hidrogel macio e o muito rígido e suficientemente fluida para ser pintada ou revestida sobre uma superfície para minimizar aderências por tecidos próximos.

[000186] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a primeira e a segunda camadas compreendem, cada uma, um ou mais hialuronanos. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a quarta camada compreende um ou mais hialuronanos.

[000187] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células epiteliais e as células mesenquimais formam um ou mais agregados. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o um ou mais agregados é um organoide. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células epiteliais compreendem células-tronco epiteliais. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células epiteliais compreendem células epiteliais biliares. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células epiteliais compreendem células epiteliais comprometidas e/ou maduras. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células epiteliais comprometidas e/ou maduras compreendem células parenquimáticas maduras. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células parenquimáticas maduras —compreentem um ou mais dentre hepatócitos, colangiócitos e células das ilhotas.

[000188] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células mesenquimais são células mesenquimais de apoio. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células mesenquimais compreendem células mesenquimais em estágio de linhagem inicial (ELSMCs). Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as ELSMCS compreendem um ou mais do grupo que consiste em angioblasto, precursor para endotélio, precursor para células estreladas e células-tronco mesenquimais (MSC).

[000189] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células epiteliais e as células mesenquimais não são parceiras de estágio de linhagem uma da outra. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células epiteliais são células maduras. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, as células mesenquimais são ELSMCs.

[000190] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, pelo menos uma das células epiteliais e das células mesenquimais são derivadas de um doador. Em algumas concretizações, o doador é um sujeito que necessita de um transplante de tecido. Em algumas concretizações, o doador é a fonte de células saudáveis para um transplante de tecido. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a pelo menos uma das células epiteliais e das células mesenquimais são autólogas a um receptor pretendido do enxerto tipo patch graft. Em algumas concretizações,

todas as células (isto é, epiteliais e mesenquimais) são autólogas ao receptor pretendido do enxerto. Em algumas concretizações, o doador de células pode ser diferente do receptor (aloenxerto) ou também pode ser o sujeito (autólogo) tendo o órgão interno em uma condição doente ou disfuncional, opcionalmente, em que são obtidos de uma porção do órgão interno que não é doente ou disfuncional e/ou que as células foram geneticamente modificadas para restaurar a função. Para estabelecer um sistema modelo para estudar uma doença, as células doadoras podem ser aquelas que têm a doença e que são transplantadas sobre/no tecido normal em um hospedeiro experimental.

[000191] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, pelo menos uma das células epiteliais ou células mesenquimais são modificadas. Em algumas concretizações, todas as células são modificadas. Em algumas concretizações, a modificação é modificação genética. Em algumas concretizações, uma ou mais células são modificadas para expressar um ácido nucleico ou polipeptídeo terapêuticos. Em algumas concretizações, uma ou mais células são modificadas para expressar um alelo selvagem de um ácido nucleico ou polipeptídeo.

[000192] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o suporte biocompatível e biodegradável é biorreabsorvível. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o suporte biocompatível e biodegradável compreende um material poroso. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o suporte biocompatível e biodegradável compreende um molde ou membrana. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o molde ou membrana compreende seda, âmnion, um têxtil sintético ou uma combinação destes. Em algumas concretizações, o suporte biocompatível e biodegradável não compreende nenhum fator que induz ou impede diferenciação nas células. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o suporte biocompatível e biodegradável não inclui um ou mais componentes derivados da matriz extracelular madura. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o componente derivado da matriz extracelular madura é colágeno tipo I.

[000193] Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, o enxerto tipo patch graft compreende ainda uma ou mais metaloproteinases de matriz (MMPs). Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a MMP é uma MMP associada à membrana. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a MMP associada à membrana é fornecida por uma ou mais células epiteliais ou células mesenquimais. Em algumas concretizações do enxerto tipo patch graft, a MMP é uma MMP secretada. As MMPs secretadas podem, opcionalmente, ser produzidas naturalmente pelas uma ou mais células epiteliais ou mesenquimais ou, opcionalmente, ser produzidas devido à transformação das uma ou mais células epiteliais ou mesenquimais com um vetor de expressão recombinante para produção de MMP.

[000194] Em alguns aspectos, é apresentado neste documento um enxerto tipo patch graft compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em múltiplas camadas, incluindo, pelo menos: uma primeira camada macia de hidrogel compreendendo células-tronco de árvore biliar; uma segunda camada rígida de hidrogel; e uma terceira camada compreendendo um suporte biocompatível e biodegradável.

[000195] Em uma concretização, um enxerto tipo patch graft consiste em camadas de materiais e células que formam coletivamente um “enxerto tipo bandagem” que pode ser fixado cirurgicamente ou de outra forma a um sítio alvo. A primeira camada, aquela contra o sítio alvo, compreende um hidrogel macio (menos de 200 Pa) no qual é semeada uma mistura de células epiteliais e células mesenquimais de apoio suspensas em um meio definido, sem soro e rico em nutrientes projetado para expansão e/ou sobrevida das células; uma segunda camada contendo um hidrogel preparado no mesmo meio, mas gelificado a um nível mais rígido (isto é, níveis de Pascal maiores) e formando uma barreira que impede as células de migrarem em uma direção que não seja para sítios alvo; um terceiro nível compreendendo um suporte biocompatível e biodegradável que não afeta ou afeta minimamente o nível de diferenciação das células doadoras, mas agindo como um estrutura de apoio mecânica para o patch; uma quarta camada formada por hidrogel que pode ser pintado (de novo, como hialuronanos) que está em um nível de rigidez intermediário entre o do hidrogel macio e o do rígido e serve para minimizar as aderências ao enxerto de células de tecidos vizinhos. Os hidrogéis devem consistir em um material biocompatível, biodegradável e "ajustável", o que significa regulável em relação à rigidez. Um material efetivo para os hidrogéis é o hialuronano modificado por tiol que pode ser acionado para formar hidrogéis quando exposto a oxigênio e/ou ao diacrilato de poli(etilenoglicol) (PEGDA) e prontamente "ajustável" pelas proporções precisas de concentrações de hialuronano e PEGDA (e/ou níveis de oxigênio).

[000196] Em outra concretização, um enxerto tipo patch graft compreende múltiplas camadas. A primeira camada, aquela contra o sítio alvo, é de um hidrogel macio que é minimamente GAG sulfatado ou não sulfatado ou outro biomaterial não sulfatado ou neutro que pode ser gelificado ou solidificado e no qual são colocadas células doadoras Uma segunda camada de um hidrogel ou biomaterial mais rígida e incorporada em/sobre ou dentro de um suporte, um suporte biocompatível, biodegradável, biorreabsorvível que permite que o patch seja manipulado para fins cirúrgicos ou outros, e que sirva como uma barreira forçando as células a migrar em direção ao tecido alvo. O lado seroso do suporte é recoberto no momento da cirurgia com biomateriais tais como hialuronanos (ou outros GAGs minimamente sulfatados ou não sulfatados ou outros materiais que podem ser gelificados ou solidificados) e em que os níveis de Pascal são pelo menos duas vezes maiores que os níveis de Pascal encontrados na camada de biomateriais macios; isto serve para minimizar as aderências de tecidos vizinhos. O enxerto tipo patch graft é fixado ao órgão ou tecido alvo, e as células são capazes de migrar para o tecido ou órgão e se tornarem totalmente incorporadas.

[000197] Em uma concretização particular, um enxerto tipo patch graft compreende uma primeira camada de um biomaterial macio (<200 Pa), tal como um hidrogel macio de hialuronano, e no qual são colocadas as células doadoras a serem transplantadas em um meio definido sem soro adaptado para o estágio de linhagem das células. Esta camada é colocada sobre uma camada mais rígida (por exemplo, um hidrogel mais rígido) que serve como uma barreira forçando as células doadoras a serem direcionadas em sua migração para o tecido alvo. A camada mais rígida é preparada com antecedência sobre um suporte, um suporte biocompatível e biodegradável que permite o manuseio do patch para procedimentos cirúrgicos ou outros procedimentos de modo a fixar o patch no sítio alvo. A camada final é um biomaterial que é intermediário em rigidez entre a das células doadoras no tecido alvo e a da barreira. Esta camada é adicionada no lado seroso do enxerto e no momento da cirurgia e serve para minimizar aderências de tecidos vizinhos. O suporte biocompatível e biodegradável pode ser seda Seri ou um derivado desta.

Métodos de Uso e Distribuição de Enxertos Tipo Patch Graft

[000198] Aspectos da divulgação referem-se a composições e métodos de enxerto de células em um órgão. Os esforços para transplante de células de órgãos sólidos em órgãos internos normalmente usam injeção direta ou distribuição de células através de uma via vascular. Lanzoni, G. et al. Stem Cells 31, 2047-2060 (2013). Esses métodos de transplante resultam em pequenos números de células sendo transplantadas para o sítio alvo e em riscos de embolia que podem ser fatais. O transplante é melhorado se as células forem entregues por “enxerto de injeção”, em que as células são suspensas ou revestidas com hialuronanos e depois co-injetadas com um gatilho (PEGDA) que faz com que o hialuronano gelifique in situ conforme descrito em Turner R. et al. Hepatology 57, 7T75-784 (2013). Metodologias de enxerto de injeção fornecem uma estratégia para localizar células para um sítio específico, embora em pequenos números, normalmente 10º”-107 , 10º-10? ou 1055-106 células por sítio de injeção. Esta estratégia elimina ou minimiza a distribuição celular ectópica e otimiza a integração das células no sítio. No entanto, se células funcionais maduras forem usadas, elas podem ser altamente imunogênicas, necessitando de imunossupressão em longo prazo. Além disso, a quantidade de células que podem ser injetadas pode ser insuficiente para alcançar os resultados clínicos exigidos.

[000199] Esses obstáculos e preocupações são superados por estratégias de "enxerto tipo patch graft" descritas neste documento. Em algumas concretizações, enxertos "tipo bandagem" são fixados cirurgicamente ou de outra forma à superfície de um órgão ou tecido; as condições do enxerto são de tal modo que as células enxertam totalmente no sítio, migram por todo o órgão/tecido e, em seguida, amadurecem em tipos de células adultas relevantes. O potencial para transplante de grandes números de células (>10º células) é moldada ou determinada pelo tamanho do patch, pelo número ou mistura de células dentro do enxerto e pela fonte de múltiplas formas de MMPs, idealmente fontes celulares das MMPs. Além disso, em algumas concretizações, o uso de organoides facilita a capacidade de armazenar células doadoras, dada a facilidade pela qual os organoides podem ser criopreservados sob condições definidas sem soro.

[000200] A composição do enxerto tipo patch graft fornecida neste documento é direcionada para direcionar o enxerto de células no tecido ou no órgão sólido. O método é seguro, evita a distribuição de êmbolos e células ectópicas e otimiza o enxerto de número celular e a distribuição em e por todo o tecido.

[000201] Nesse sentido, são fornecidos neste documento métodos de enxerto de células em um tecido alvo compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato o tecido alvo com um enxerto tipo patch graft divulgado acima neste documento.

[000202] Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é selecionado do grupo que consiste em fígado, pâncreas, árvore biliar, tireoide, timo, gastrointestino, pulmão, próstata, mama, cérebro, bexiga, medula espinhal, pele e tecidos dérmicos subjacentes, útero, rim, músculo, vaso sanguíneo, coração, cartilagem, tendões e tecido ósseo. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido hepático. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido pancreático. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido de árvore biliar. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido gastrointestinal. Em algumas concretizações, o tecido está doente, danificado ou com um distúrbio. Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é tecido renal.

[000203] Em algumas concretizações dos métodos, o tecido alvo é um órgão. Em algumas concretizações dos métodos, o órgão é um órgão do sistema musculoesquelético, sistema digestivo, sistema respiratório, sistema urinário, sistema reprodutivo feminino, sistema reprodutivo masculino, sistema endócrino, sistema circulatório, sistema linfático, sistema nervoso ou sistema tegumentar. Em algumas concretizações dos métodos, o órgão é selecionado do grupo que consiste em fígado, pâncreas, árvore biliar, tireoide, timo, intestinos, pulmão, próstata, mama, cérebro, bexiga, medula espinhal, pele e tecidos dérmicos subjacentes, útero, rim, músculo, vaso sanguíneo, coração, cartilagem, tendão e osso. Em algumas concretizações, oO órgão está doente, danificado ou com um distúrbio.

[000204] Também são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio hepático, os métodos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato o fígado do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado acima. Em algumas concretizações dos métodos, a doença ou distúrbio hepático é fibrose hepática, cirrose hepática, hemocromatose, câncer do fígado, atresia biliar, doença hepática não alcoólica, hepatite, hepatite viral, hepatite autoimune, fasciolíase, doença hepática alcoólica, deficiência de alfa l-antitripsina, doença do armazenamento de glicogênio tipo II, amiloidoise hereditária relacionada à transtirretina, síndrome de Gilbert, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, síndrome de Budd-Chiari, trauma hepático ou doença de Wilson.

[000205] Em outros aspectos, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio do pâncreas, os métodos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato com o pâncreas do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado neste documento acima. Em algumas concretizações dos métodos, a doença ou distúrbio pancreático é diabetes mellitus, insuficiência pancreática exócrina, pancreatite, câncer pancreático, disfunção do esfíncter de Oddi, fibrose cística, pâncreas divisum, pâncreas anular, trauma pancreático ou hemosuccus pancreaticus.

[000206] Em outros aspectos, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio gastrointestinal, o método compreendendo, consistindo ou consistindo essencialmente em por em contato com um ou mais dos intestinos do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado neste documento acima. Em algumas concretizações, a doença ou distúrbio gastrointestinal é gastroenterite, câncer gastrointestinal, ileíte, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável, doença de úlcera péptica, doença celíaca, fibrose, angiodisplasia, doença de Hirschsprung, colite pseudomembranosa ou trauma gastrointestinal.

[000207] Em alguns aspectos, são fornecidos neste documento métodos de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio do rim, os métodos compreendendo, consistindo em ou consistindo essencialmente em pôr em contato com um ou mais dos rins do sujeito um enxerto tipo patch graft divulgado acima neste documento. Em algumas concretizações dos métodos, a doença ou distúrbio renal é nefrite, nefrose, síndrome nefrítica, síndrome nefrótica, doença renal crônica, lesão renal aguda, trauma renal, doença renal cística, doença renal policística, glomerulonefrite, nefropatia por IgA, nefrite lúpica, câncer renal, síndrome de Alport, amiloidose, síndrome de Goodpasture ou granulomatose de Wegener.

[000208] Em algumas concretizações dos métodos terapêuticos, pelo menos uma das células epiteliais e das células mesenquimais são derivadas de um doador. Em algumas concretizações, o doador é um sujeito que necessita de um transplante de tecido. Em algumas concretizações, o doador é a fonte de células saudáveis para um transplante de tecido. Em algumas concretizações, pelo menos uma das células epiteliais e das células mesenquimais são autólogas a um receptor pretendido do enxerto tipo patch graft. Em algumas concretizações, todas as células (isto é, epiteliais e mesenquimais) são autólogas ao receptor pretendido do enxerto. Em algumas concretizações, o doador de células pode ser diferente do receptor (aloenxerto) ou também pode ser o sujeito (autólogo) tendo o órgão interno em uma condição doente ou disfuncional, opcionalmente, em que são obtidos de uma porção do órgão interno que não é doente ou disfuncional e/ou que as células foram geneticamente modificadas para restaurar a função.

[000209] Em algumas concretizações, o enxerto tipo patch graft usado nos métodos divulgados acima é um enxerto tipo patch graft compreendendo múltiplas camadas incluindo, pelo menos: uma primeira camada de hidrogel compreendendo células epiteliais e células mesenquimais; uma segunda camada de hidrogel; uma terceira camada compreendendo um suporte biocompatível e biodegradável; e, opcionalmente, uma quarta camada de hidrogel. Em algumas concretizações os métodos compreendem ainda permitir que as células contidas no enxerto tipo patch graft passem a ser incorporadas ao tecido. Em algumas concretizações dos métodos, a primeira camada de hidrogel é macia. Em algumas concretizações dos métodos, a segunda camada de hidrogel é rígida. Em algumas concretizações dos métodos, as células mesenquimais são células mesenquimais de apoio.

[000210] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para enxerto de células em um órgão que compreende o uso de um enxerto tipo patch graft, um compósito tipo bandagem com múltiplas camadas de materiais e células que coletivamente podem ser fixadas de forma cirúrgica ou de outra forma a um sítio alvo. A primeira camada, aquela contra o sítio alvo, compreende um hidrogel macio (menos de 200 Pa) no qual é semeada uma mistura de células epiteliais e células mesenquimais de apoio suspensas em um meio definido, sem soro e rico em nutrientes projetado para expansão e/ou sobrevida das células; uma segunda camada contendo um hidrogel, preparado no mesmo meio, mas gelificado a um nível mais rígido (isto é, níveis de Pascal maiores) e formando uma barreira que impede células de migrarem em uma direção que não seja para os sítios alvo; uma terceiro camada compreendendo um suporte biocompatível e biodegradável que não afeta ou afeta minimamente o nível de diferenciação das células doadoras e, portanto, é "neutra"; uma quarta camada composta por hidrogel que pode ser pintado (de novo, como hialuronanos) que está em um nível de rigidez intermediário entre o do hidrogel macio e o do rígido e servindo para minimizar as aderências ao enxerto de células de tecidos vizinhos. Os hidrogéis devem consistir em um material biocompatível, biodegradável e "ajustável", o que significa regulável em relação à rigidez. Um material efetivo para os hidrogéis é o hialuronano modificado por tiol que pode ser acionado para formar hidrogéis quando exposto a oxigênio e/ou ao diacrilato de poli(etilenoglicol) (PEGDA) e prontamente "ajustável" pelas proporções precisas de concentrações de hialuronano e PEGDA (e/ou níveis de oxigênio). As células sob as condições dos biomateriais do enxerto produzem várias metaloproteinases de matriz (MMPs) que facilitam o enxerto, a migração e a integração das células doadoras no tecido do receptor. O microambiente do tecido receptor dita o destino adulto das células transplantadas.

[000211] Em outro aspecto, esta divulgação fornece um método para enxerto de células em um órgão que compreende o contato com um enxerto tipo patch graft compreendendo múltiplas camadas, incluindo, pelo menos, uma primeira camada compreendendo um suporte biocompatível e biodegradável, uma segunda camada compreendendo um ou mais hialuronanos, incluindo uma mistura de células epiteliais e células mesenquimais de apoio e uma terceira camada que compreende um ou mais hialuronanos, em que a camada em que as células são incorporadas é muito macia (menos de 200 Pa); uma camada associada ao suporte é mais rígida (-500 Pa ou mais); e uma terceira camada é intermediária no nível de Pascal e ajuda a minimizar as aderências de tecidos ou órgãos próximos. Em ainda outro aspecto, as células podem ser enxertadas em um órgão selecionado do grupo constituído por fígado, pâncreas, árvore biliar, tireoide, timo, intestinos, pulmão, próstata, mama, cérebro, medula espinhal, gânglios neurais, pele e tecidos dérmicos subjacentes, útero, osso, timo, intestinos, útero, osso, rim, músculo, vasos sanguíneos ou coração.

[000212] Em ainda outro aspecto, as células podem ser enxertadas em um órgão selecionado do grupo que consiste no fígado, pâncreas, árvore biliar, tireoide, timo, intestinos, pulmão, próstata, mama, cérebro, medula espinhal, gânglios “neural, pele e tecidos dérmicos subjacentes, útero, osso, tendão, cartilagem, rim, músculo, vasos sanguíneos ou coração.

[000213] Um exemplo não limitativo de um enxerto tipo patch graft adequado para os métodos divulgados neste documento é um enxerto tipo patch graft compreendendo: (a) uma população mista tendo dois ou mais tipos de células pelo menos um dos quais está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs) secretadas e/ou associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio presente em uma matriz de hidrogel com uma viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista, opcionalmente, dentro ou para fora do referido hidrogel e/ou dentro ou para fora do enxerto tipo patch graft; (b) um suporte compreendendo um material biocompatível e biodegradável com uma viscoelasticidade suficiente para inibir ou fornecer uma barreira para a migração da referida população mista em uma direção do referido suporte; e, opcionalmente, ((c) um hidrogel sobreposto sobre uma superfície serosa (ou seja, exterior) do referido suporte, que é oposto ao que está em contato com a referida população mista e, em concretizações onde o enxerto tipo patch graft é fixado a um sítio alvo, é oposto ao lado em contato com o sítio alvo (ou seja, órgão ou tecido). Em algumas concretizações, esta camada impede ou inibe aderências por ou de outros tecidos ou órgãos. Em algumas concretizações, o enxerto tipo patch graft é configurado para sustentar e manter a referida população mista enquanto inibe o referido pelo menos um tipo celular em estágio de linhagem inicial a partir da diferenciação ou maturação posterior a um estágio de linhagem tardio que já não é mais capaz de expressar MMPs associadas à membrana e/ou secretadas.

[000214] Em algumas concretizações, o referido suporte é poroso ou não poroso. Em algumas concretizações, o suporte compreende uma malha, molde ou membrana porosa. Em algumas concretizações, o suporte compreende seda; um têxtil sintético; ou um material natural, tal como âmnion, placenta ou omento; ou uma combinação destes. Em algumas concretizações, o referido suporte compreende uma malha porosa infundida com um hidrogel. Em outras concretizações, tal infusão impede a migração celular para longe do órgão ou tecido alvo. Em algumas concretizações, o referido suporte compreende um material sólido.

[000215] Em algumas concretizações, o enxerto tipo patch graft compreende ainda um hidrogel sobreposto sobre uma superfície serosa do referido suporte, que é oposto ao que está em contato com a referida população de células únicas ou células mistas.

[000216] Em algumas concretizações, um ou mais dos referidos hidrogéis compreendem hialuronanos.

[000217] Em algumas concretizações, o referido meio compreende o meio de Kubota ou outro meio de apoio de células-tronco e capaz de manter a potencialidade das células-tronco (“stemness”).

[000218] Em algumas concretizações, a referida população mista compreende células mesenquimais e células epiteliais. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais podem ser ectodérmicas, endodérmicas ou mesodérmicas. Em algumas concretizações, as referidas células mesenquimais compreendem células mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ELSMCS) . Em algumas concretizações, as referidas ELSMCS compreendem um ou mais dentre angioblastos, precursores para endotélio ou precursores para células estreladas e células-tronco mesenquimais (MSCs) . Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células- tronco/progenitoras epiteliais. Em algumas concretizações as referidas células epiteliais compreendem células-tronco de árvore biliar (BTSCs). Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais compreendem células epiteliais comprometidas e/ou maduras. Em algumas concretizações, as referidas células epiteliais comprometidas e/ou maduras compreendem “células parenquimais maduras. Em algumas concretizações, as referidas células parenquimais maduras compreendem um ou mais dos hepatócitos, colangiócitos e células da ilhota. Em algumas concretizações, as referidas células mesenquimais e células epiteliais ambas compreendem células-tronco.

[000219] Em algumas concretizações, a referida população mista compreende células autólogas e/ou alogênicas.

[000220] Em algumas concretizações, um ou mais tipos celulares são geneticamente modificados.

Exemplos

[000221] Os exemplos a seguir são ilustrativos e não limitativos de procedimentos que podem ser usados em várias instâncias na realização da divulgação em vigor. Além disso, todas as referências divulgadas abaixo são incorporadas por referência em sua totalidade.

EXEMPLO 1: Modelo Suíno Para Validação de Enxerto Tipo Patch Graft Animais

[000222] Animais usados como hospedeiros ou como doadores de células foram mantidos em instalações na Faculdade de Medicina Veterinária na NCSU (Raleigh, NC). Cirurgias, necropsias e a coleta de todos os fluidos biológicos e tecidos foram realizadas nessas instalações Todos os procedimentos foram aprovados pelo comitê IACUC na NCSU. Os porcos sendo usados como receptores foram uma mistura de seis raças diferentes: um cruzamento de seis vias consistindo em Yorkshires, Large Whites, Landraces (das porcas), Durocs, Spots e Piétrains (dos javalis). Este fundamento genético altamente heterogêneo é desejável no sentido de que é paralelo às composições genéticas heterogêneas das populações humanas. Os animais hospedeiros eram todos fêmeas, de aproximadamente seis semanas de idade e -15 kg.

[000223] Havia duas categorias. a) porcos machos, aproximadamente seis semanas de idade e -15 kg, foram usados como doadores para transplante de células em fêmeas; b) animais doadores transgênicos portando um transgene GFP. Os animais doadores de GFP+ foram obtidos através da reprodução de um javali H2B-GFP transgênico com uma marrã de tipo selvagem por inseminação artificial padrão. O modelo foi desenvolvido através de reparo direcionado por homologia (HDR) mediado por CRISPR-Cas9 de IRES-pH2B-eGFP no locus de Bractina endógena (ACTB) . os animais transgênicos mostram expressão ubíqua de pH2B-eGFP em todos os tecidos. A fusão do GFP para H2B resulta na localização do marcador de GFP para o nucleossomo e permite a visualização nuclear clara, bem como o estudo da dinâmica do cromossomo. A linha iniciadora foi analisada extensivamente e a expressão localizada ubíqua e nuclear foi confirmada. Além disso, a reprodução demonstrou transmissão do H2B-GFP para a próxima geração. Todos os animais eram saudáveis e múltiplas gestações foram estabelecidas com progênie mostrando a proporção Mendeliana esperada para a transmissão do pH2B-eGFP. A descendência masculina foi genotipada no nascimento, e aqueles que eram positivos para o transgene foram humanamente eutanasiados para a coleta de tecido e isolamento das células doadoras.

[000224] Para cada animal doador e receptor, os loci de antígeno de leucócitos de suínos classe I (SLA-I) e classe II (SLA-IIL) foram amplificados por PCR usando iniciadores projetados para amplificar alelos conhecidos nessas regiões com base na estratégia de PCR de iniciador específico de sequência. O sistema consiste em 47 conjuntos de iniciadores de SLA-I discriminatórios que amplificam os loci*?* de SLA-l, SLA-2 e SLA-3 e 47 conjuntos de iniciadores de SLA-II discriminatórios que amplificam os loci de DRBl, DOBl e DOA. Esses conjuntos de iniciadores foram desenvolvidos para diferenciar alelos por grupos que compartilham motivos de sequência similares e foram mostrados que podem detectar alelos SLA-I e SLA-II conhecidos de forma fácil e inequívoca. Quando usados juntos, esses conjuntos de iniciadores forneceram eficazmente um haplótipo para cada animal que foi testado, proporcionando assim um ensaio para confirmar facilmente um haplótipo combinado ou não combinado em animais doadores e receptores.

Meios e Soluções

[000225] Todos os meios foram filtrados por esterilização (filtro de 0,22 um) e mantidos no escuro a 4ºC antes do uso. O meio basal e o soro bovino fetal (FBS) foram comprados da GIBCO/Invitrogen. Todos os fatores de crescimento foram comprados de Sistemas de P&D. Todos os outros reagentes, exceto aqueles observados, foram obtidos da Sigma.

[000226] Uma lavagem celular foi formulada com 599 mL de meio basal (por exemplo, RPMI 1640; Gibco nº 11875-093) suplementado com 0,5 gramas de albumina sérica (Sigma, nº ASS96-5G, sem ácido graxo), 10º M de selênio e 5 mL de antibióticos (Gibco nº35240-062, AAS). Ela foi usada para lavar tecidos e células durante o processamento.

[000227] Tampão de colagenase foi feito e consiste em 100 mL de lavagem celular suplementada com colagenase (Sigma nº C5138) com uma concentração final de 600 U/mL (R1451 25 mg) para tecido de árvore biliar (ductos) e 300 U/mL (12,5 mg) para tecido órgão-parenquimal (fígado, pâncreas).

[000228] O meio de Kubota, um meio definido e sem soro projetado para células-tronco/progenitoras endodérmicas, foi usado para preparar suspensões celulares, organoides e hidrogéis de HA. Este meio consiste em qualquer meio basal (sendo aqui RPMI 1640) sem cobre, com baixo teor de cálcio (0,3 mM), 1 nM de selênio, 0,1% de albumina de soro bovino (purificada, sem ácido graxo; fração V), 4,5 mM de nicotinamida, O0O,l nM de sulfato de zinco hepta-hidratado, 5 pg/mL de transferrina/Fe, 5 vg/mL de insulina, 10 pg/mL de lipoproteína de alta densidade, e uma mistura de ácidos graxos livres purificados que são apresentados complexados com albumina sem ácido graxo, albumina altamente purificada. Sua preparação é dada em detalhes em uma revisão de métodos”. Além disso, está disponível comercialmente junto à PhoenixSong Biologicals (Branford, CT).

[000229] Formas de cadeia longa solúveis de HA (Sigma nº Catálogo 52747) foram usadas na estabilização de culturas organoides e em criopreservação.

Aquelas usadas para produzir os hidrogéis, HAs modificados com tiol, foram obtidas da Glysan Biosciences, uma subsidiária da Biotime.

Os componentes para estes HAs modificados com tiol foram feitos por um processo de fermentação bacteriana proprietário usando Bacillus subtilis como o hospedeiro em um processo ISO 9001:2000 (www.biopolymer.novozymes.com/) Os componentes foram produzidos pela Novozymes sob o nome comercial HyAcareG e estão 100% livres de matérias-primas derivadas de animais e restos de solventes orgânicos.

Nenhum ingrediente derivado de animal é usado na produção e há níveis de proteína muito baixos e nenhuma endotoxina.

A produção segue os padrões estabelecidos pela Farmacopeia Europeia). Os hidrogéis de HA foram preparados usando Glicosil (HyStemO HAs, ESI BIO-CG313), os HAs modificados com tiol, que podem ser acionados para formar pontes de dissulfeto usando diacrilato de polietilenoglicol (PEGDA). GlycosilGO é reconstituído como uma solução a 1% de HA tiolizado em solução salina tamponada com fosfato a 1% (PBS) usando água desgaseificada, ou, em nosso caso, em Meio de Kubota.

Após a reconstituição, ele permanece líquido por várias horas, mas pode sofrer "alguma gelificação se exposto a oxigênio.

A gelificação mais precisa ocorre sem nenhuma mudança de temperatura ou de pH se o Glycosil for tratado com um reticulante, tal como PEGDA, fazendo com que a gelificação ocorra dentro de alguns minutos.

[000230] O nível de reticulação dita o nível de rigidez e pode ser definido precisamente pela proporção dos HAs modificados com tiol para PEGDA. Em estudos anteriores, as populações de células-tronco foram testadas em hidrogéis de HA de nível variante de rigidez e verificou-se que permanecem como células-tronco, tanto antigenicamente quanto funcionalmente (por exemplo, em relação à capacidade de migrar), apenas se o nível de rigidez fosse inferior a 200 Pa??º?. Fizemos uso desta descoberta para projetar os enxertos com uma camada muito macia e com camadas mais rígidas de hidrogéis de hialuronano no lado seroso para formar uma barreira para a migração em direções que não sejam para o tecido alvo, bem como para minimizar aderências de células de tecidos próximos. As 3 versões dos hidrogéis com níveis distintos de rigidez são caracterizadas na FIG. 2, caracterizações que incluíram medições diretas das propriedades reológicas. A barreira mais rígida, aquela do hidrogel de HA 10X (rigidez = 760 Pa), foi preparada no suporte com antecedência e poderia ser criopreservada, se desejado. No momento da cirurgia, as células doadoras foram preparadas no hidrogel de HA 1X macio (rigidez = 60 Pa); colocadas sobre o hidrogel 10X mais rígido (já no suporte); e o patch foi fixado ao sítio alvo. Após a ligação, o lado seroso do enxerto foi revestido ou pintado com o hidrogel de HA 2X (rigidez = 106 Pa) usando uma NORM-JECT 4010.200V0O Plastic Syringe com uma agulha BD Micro-Fine" IV permanentemente anexada.

[000231] As propriedades reológicas em escala macro dos hidrogéis foram determinadas usando um reômetro de cone-e-placa controlado por tensão (TA Instruments, AR-G2, diâmetro de cone de 40 mm, ângulo de 1º). Géis polimerizados ativamente no reômetro ao oscilar a uma frequência de 1 rad/s e amplitude de tensão de 0,6 Pa com o módulo monitorado continuamente para consulta para conclusão suficiente da reação de reticulação. Uma vez equilibrado, os hidrogéis foram submetidos a uma varredura de frequência oscilatória (amplitude de tensão: 0,6 Pa, faixa de frequência: 0,01 - 100 Hz). As propriedades de viscoelasticidade (reológicas) das 3 versões de hidrogéis de hialuronano que foram usadas estão resumidas em FIG 2.

[000232] As células doadoras mais comumente usadas foram derivadas de porcos H2B-GFP transgênicos conforme descrito acima. Elas oferecem uma vantagem significativa para estudos de transplante de células no sentido de que todas as células são identificadas com GFP. O uso de proteínas fluorescentes como marcadores moleculares permitiu que as células doadoras fossem rastreadas em sua migração e enxerto após o transplante. Esta proteína de fusão é direcionada aos nucleossomos resultando em um sinal de GFP nuclear/cromatina. Nos enxertos descritos, as células-tronco expressam GFP inteiramente no núcleo, mas essa linhagem restringindo-se a tipos de células adultas pode tê-lo no citoplasma ou núcleo. Observe que o nível de GFP citoplasmático é especialmente alto na primeira semana e é reduzido com o tempo. Isto ocorre porque o processo de enxerto/invasão/integração resulta em efeitos nas células que podem fazer com que o GFP ligado a H2B seja encontrado citoplasmicamente. Isso não significa que as células estão morrendo, mas sim que elas estão respondendo aos altos níveis de MMPs e sinalização associada que fazem parte das zonas de remodelação. De fato, as células GFP+ detectadas são claramente viáveis e proliferamy todas expressando várias funções adultas (por exemplo albumina, HNF4a, AFP, insulina, glucagon ou amilase).

[000233] Conforme descrito em mais detalhes nas caracterizações dos enxertos, a autofluorescência tanto do suporte (cor verde primavera) como também de lipofuscinas (cor verde floresta escuro) em hepatócitos maduros apresentou um desafio devido à sobreposição em comprimentos de onda com aqueles de GFP. Portanto, os Depositantes alteraram o sinal de GFP+ para uma cor rosa ou rosada usando um anticorpo para GFP e, secundariamente, para um anticorpo com uma fluorosonda vermelha. Isto resultou nas células-tronco sendo reconhecidas como células pequenas com núcleos rosas (fusão da coloração DAPI azul nuclear com o rótulo GFP+ de cor rosa marcada com anticorpo). Quaisquer células doadoras que amadurecerem em hepatócitos foram reconhecidas como tendo uma cor de lavanda da fusão da autofluorescência verde (lipofuscinas), o azul (DAPI) e à cor rosada (GFP) (FIG. 4).

[000234] Tecido de árvore biliar extra-hepática suína (vesícula biliar, ducto comum, ductos hepáticos) foram obtidos a partir de porcos transgênicos. Os tecidos foram misturados com um martelo cirúrgico de aço inoxidável esterilizado para eliminar as células parenquimáticas, mantendo cuidadosamente a ligação dos ductos biliares intra-hepáticos e extra-hepáticos. A árvore biliar foi então lavada com o tampão de "lavagem celular" composto por um meio basal estéril sem soro suplementado com antibióticos, 0,1% de albumina sérica e 1 nM de selênio (10º? M). Ela foi então mecanicamente dissociada com bisturis cruzados e os agregados foram dispersos enzimaticamente em uma suspensão celular em RPMI-1640 suplementada com 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), 1 nM de selênio, 300 U/mL de colagenase tipo IV, 0,3 mg/mL de desoxirribonuclease (DNAse) e antibióticos. A digestão foi feita a 32ºC com agitação frequente por 30-60 minutos. A maioria dos tecidos exigiu duas rodadas de digestões seguidas por centrifugação a 1100 rpm a 4ºC. Os péletes celulares foram combinados e ressuspensos em lavagem celular. A suspensão celular foi centrifugada a 30 G durante 5 minutos a 4ºC para remover hemácias. Os péletes celulares foram novamente ressuspensos em lavagem celular e filtrados através de um coador de célula de nylon de 40 um (Becton Dickenson Falcon nº 352340) e com lavagem celular fresca. Os números de células foram determinados e a viabilidade foi avaliada usando Trypan Blue. A viabilidade celular acima de 90-95% foi observada rotineiramente.

[000235] Em estudos anteriores, os Depositantes definiram o perfil antigênico de populações de células mesenquimais que fornece sinais críticos parácrinos necessários para células-tronco de árvore hepática e biliar versus outros necessários para células parenquimáticas maduras. As células mesenquimais que se associam com BTSCs são subpopulações desprovidas de antígenos MHC, com baixa dispersão lateral e identificáveis como angioblastos

(CD117+, CD1I33+, VEGF-receptort e negativo para CD31), precursores para endotélios (CD133+, VEGF-receptort e CD31+) e precursores de células estreladas (CDl46+, ICAM1l+, VCAM+, alfa actina de músculo liso (ASMA)+ e negativos para vitamina A). Essas 3 subpopulações são referidas coletivamente como células mesenquimais no estágio da linhagem inicial (ELSMCSs). Em contraste, os hepatócitos adultos são associados a endotélios sinusoidais maduros (CD31+++, colágeno tipo IV+, receptor de VEGF+ e negativo para CD117) e aqueles para colangiócitos adultos que estão associados a células estreladas e estromais maduras (ICAM- 1+, ASMA+, Vitamina A++, colágeno tipo I+).

[000236] As suspensões celulares foram adicionadas às Placas de Cultura de Célula de Fundo Plano Multiwell (Corning nº 353043) em Meio de Kubota sem soro e incubadas por -uma hora a 37ºC para facilitar a ligação de células mesenquimais maduras. Células mesenquimais maduras ligaram- se às placas dentro de 10-15 minutos, mesmo que o meio estivesse livre de soro. As células restantes em suspensão foram transferidas para outra placa e novamente incubadas por até uma hora. Repetições disto resultaram na depleção de uma fração significativa das células mesenquimais maduras. Após a depleção das células mesenquimais maduras, as células flutuantes restantes foram semeadas em -2 X 10º células por poços em meio de Kubota sem soro nas placas de fixação ultrabaixa da Corning (Corning t3471) e foram incubadas durante a noite a 37'C em uma incubadora de COº. Organoides compostos pelas células-tronco de árvore biliar (BTSCs) e de ELMScs foram formados durante a noite (FIG.

1). Essas culturas de organoides sobreviveram durante semanas no Meio de Kubota, especialmente se o meio foi suplementado (0,1%) com formas solúveis de HAs (Sigma); elas também poderiam ser criopreservadas conforme descrito abaixo. De cada grama de tecido de árvore biliar de porco neonatal, obtivemos -1,5 X 107 células. Usamos -3-6 X 10º células por poço de uma placa de ligação ultrabaixa de 6 poços e incubadas no Meio de Kubota sem soro. As células produziram, em média, de 6000 a 20.000 pequenos organoides (-50-100 células/organoide/poço). Para os enxertos, usamos pelo menos 100.000 organoides (>10' células). Dependendo do tamanho do suporte, os Depositantes foram capazes de aumentar o número de organoides nos enxertos a até 10º organoides (isto é, -10º células) ou mais fixados em -1 mL de hidrogel de hialuronano macio em um suporte de 3 cm X 4,5 cm.

[000237] Organoides de células-tronco isolados foram criopreservados em CS10, um tampão de criopreservação isotônico contendo fatores anticongelantes, dextrano e DMSO (Bioliife, Seattle, Washington; https://www.stemcell.com/products/cryostor-csl10.html). A viabilidade das células melhorou ainda mais com a suplementação com 0,1% de HAs (Sigma nº 52747). Criopreservação foi feita usando Congeladores de Taxa Controlada CryOmed". A viabilidade no descongelamento foi superior a 90%, e as células após descongelamento foram capazes de se anexar, expandir ex vivo e in vivo e dar origem às células maduras esperadas in vitro e in vivo.

[000238] O isolamento das células e a montagem dos enxertos são caracterizados em um esquema na FIG. 1 e com os detalhes resumidos na FIG. 2. Os enxertos foram formados usando um suporte (TABELA 1) no qual foram colocados os organoides de células-tronco incorporados nos hidrogéis de hialuronano macios. Eles foram prontamente preparados com antecedência e mantidos em uma placa de cultura em uma incubadora durante a noite. Os enxertos se mostraram estáveis no sítio alvo por toda a duração dos experimentos. A criopreservação dos organoides foi alcançada facilmente, mas a dos organoides, quando dentro do hidrogel macio, não foi. Isto significou que a incorporação dos organoides no hidrogel macio teve que ser feita logo antes da cirurgia.

Cirurgias

[000239] A anestesia foi induzida pela administração de uma combinação de cetamina/xilazina (2-3 mg/kg de peso cada) injetada IV ou 20 mg/kg de cetamina mais 29m/kg de xilazina IM e foi mantida por isoflurano em oxigênio administrado através de uma unidade anestésica de gás de circuito-fechado.

[000240] Os animais foram posicionados em decúbito dorsal, e o abdômen ventral foi cortado do xifoide à púbis. A pele foi preparada assepticamente com esfoliação iodada alternada e soluções de álcool. Após a entrada no pacote cirúrgico, a preparação da pele foi repetida usando técnica estéril e a área foi coberta com uma solução de iodo tópico antes da aplicação de panos cirúrgicos estéreis. Os cirurgiões usaram técnica asséptica apropriada. Uma incisão no ventrículo médio foi feita através da pele, através de tecidos subcutâneos e da linha alba, começando no processo xifoide e estendendo-se caudalmente por 8-12 cm. A divisão hepática esquerda foi exposta e um enxerto tipo patch graft de 3 x 4,5 cm foi aplicado à superfície ventral do fígado e contendo 1X HA (-60 Pa) com organoides incorporados colocados sobre o suporte contendo 10X HA (-760 Pa), e o enxerto tipo patch graft foi colocado em contato direto sobre a superfície da cápsula do fígado. O enxerto tipo patch graft foi suturado ao fígado usando-se 4-6 suturas simples interrompidas de polipropileno 4-0. A superfície exposta do enxerto foi então tratada com 2 mL de hidrogel 2X HA (-106 Pa), um nível de rigidez que era fluido o suficiente para permitir que fosse pintado ou revestido sobre o lado seroso do enxerto; ele serviu para minimizar adicionalmente as aderências de tecidos vizinhos. Após a colocação do enxerto cirúrgico, a linha alba foi fechada com uma sutura contínua simples usando O-PDS. A linea foi bloqueada com 2 mg/kg de bupivacaína, IM a 0,5%. Os tecidos subcutâneos e a pele foram fechados com suturas contínuas PDS 2-0 e Monocril 3-0, respectivamente. Adesivo de tecido foi colocado sobre a superfície da pele.

[000241] os transplantes de enxerto dos porcos transgênicos para os receptores eram alogênicos e, portanto, exigiram imunossupressão. Os protocolos de imunossupressão utilizados foram aqueles estabelecidos por outros. Todos os porcos receberam dosagens orais das drogas imunossupressoras Tacrolimo (0,5 mg/kg) e Micofenolato (500 mg) duas vezes ao dia, começando 24 horas antes da cirurgia. As drogas foram administradas continuamente durante todo o período experimental. Estas poderiam ser oferecidas aos animais facilmente se misturadas com seus alimentos favoritos.

[000242] Todos os animais foram eutanasiados humanamente no ponto de tempo designado por sedação com Cetamina/Xilazina e anestesia de isofluorano, seguidas por uma injeção intravenosa de uma dose letal de pentobarbital de sódio. Após a confirmação da morte, a carcaça foi cuidadosamente dissecada e os órgãos alvo foram removidos e colocados em Meio de Kubota resfriado para transporte ao laboratório. Além do fígado, os pulmões, coração, rim e baço foram coletados e fixados em formalina neutra a 10%.

Caracterização dos Enxertos

[000243] Após 48+ horas de fixação, amostras de tecidos foram colocadas em cassetes marcados em etanol a 70% e foram processadas em um ciclo longo a 60 graus em um Leica ASP30OS Tissue Processor por aproximadamente 10 horas. Após a conclusão do processamento durante a noite, as amostras foram incorporadas usando a Leica EG1l160 Embedding Station. Um molde foi preenchido com cera e a amostra foi colocada na orientação correta de modo que as seções desejadas pudessem ser coletadas. A cassete foi resfriada até que o bloco e a amostra de tecido pudessem ser removidos como uma unidade do molde. O bloco foi seccionado a 5 micra usando um micrótomo Leica RM2235; as seções foram flutuadas no banho-maria e colocadas em lâminas. As lâminas foram deixadas secar ao ar durante a noite antes da coloração. As seções foram coradas para Hematoxilina e Eosina (H&E; reagentes nº 7211 e nº 7111) ou Tricromo de Masson (Masson's Trichrome Stain: Blue Collagen

Kit nº 87019) usando produtos histológicos da Richard Allan Scientific e seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante; o protocolo é programado em um Leica Autostainer XL.

[000244] O tecido foi incorporado e congelado em OCT e congelado instantaneamente a -20º C para seccionamento congelado. As seções congeladas foram coradas para IHC seguindo o protocolo descrito acima. Para imunofluorescência, as seções congeladas foram descongeladas por 1 hora em temperatura ambiente e, em seguida, fixadas em formaldeído 10%, acetona ou metanol, de acordo com as especificações do anticorpo. Após a fixação, as seções foram lavadas 3 vezes em solução salina tamponada com fosfato a 1% (PBS), seguida pelo bloqueio com 2,5% de soro de cavalo em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. Anticorpos primários diluídos em 10% de soro de cabra em PBS foram adicionados e incubados durante a noite a 4ºC. Na manhã seguinte, as seções foram enxaguadas 3 vezes com PBS e incubadas com anticorpos secundários diluídos em 2,5% de soro de cavalo em PBS por 2 horas a temperatura ambiente. As imagens foram tiradas usando um microscópio de varredura a laser confocal Zeiss CLSM 710 (Carl Zeiss Microscopy). Os anticorpos estão listados na TABELA 3.

[000245] Para as imagens na FIG. 5, seções (3 um) foram coradas com hematoxilina-eosina e vermelho Sirius, de acordo com protocolos padrão. Para imuno-histoquímica, a atividade de peroxidase endógena foi bloqueada por uma incubação de 30 min em peróxido de hidrogênio metanólico (2,5%). Antígenos foram recuperados, conforme indicado pelo fornecedor, aplicando-se Proteinase K (código S3020, Dako, Glostrup, Dinamarca) por 10 min à temperatura ambiente.

As seções foram então incubadas durante a noite a 4ºC com anticorpos “primários (pan-Citoqueratina, Dako, código: 720622, diluição: 1:100; Sox9, Millipore, código: AB5535, diluição: 1:200). As amostras foram enxaguadas duas vezes com PBS por 5 min, incubadas por 20 min à temperatura ambiente com anticorpo biotinilado secundário (LSAB+ System-HRP, código K0690; Dako, Glostrup, Dinamarca) e depois com Estreptavidina-HRP (LSABY System-HRP, código K0690, Dako, Glostrup, Dinamarca). Diaminobenzidina (Dako, Glostrup, Dinamarca) foi usada como substrato e as seções foram contramarcadas com hematoxilina (PMID: 29248458). Para imunofluorescência, ligações proteicas não específicas foram bloqueadas por soro de cabra normal a 5%. Os espécimes foram incubados durante a noite a 4ºC com anticorpos primários (anti-GFP de galinha, Abcam, código: abl3970, diluição = 1:200; anti-HNF4a de coelho, Abcam, código: 92378, diluição: 1:50, anti-albumina de coelho, ab2406, diluição = 1:500). Os espécimes foram lavados e incubados por lh com anticorpos secundários específicos de isotipo marcados (AlexaFluor-546 anti-galinha, Alexafluor- 488 anti-camundongo, Alexafluor-488 anti-coelho, Invitrogen, Life Technologies Ltd, Paisley, Reino Unido) e contramarcados com 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para visualização de núcleos de célula (PMID: 26610370). Para todas as imunorreações, controles negativos (o anticorpo primário foi substituído por soro pré-imune) também foram incluídos.

As seções foram examinadas de forma codificada pelo Leica Microsystems DM 4500 B Light and Fluorescence Microscopy (Leica Microsystems, Weltzlar, Alemanha), equipado com um Jenoptik Prog Res C10 Plus Cinocam (Jena Alemanha). As marcações de imunofluorescência também foram analisadas pelo Confocal Microscopy (Leica TCS-SP2). Lâminas foram processadas ainda com um Image Analysis System (IAS - Delta Sistemi, Roma- Itália) e foram independentemente avaliadas por dois pesquisadores de forma cega. As marcações de imunofluorescência foram varridas por um scanner digital (Aperio Scanscope FL System, Aperio Technologies, Inc, Oxford, Reino Unido) e processadas pelo ImagEscope.

[000246] Seções congeladas foram problemáticas, dada a alta autofluorescência em hepatócitos (lipofuscina) e a fluorescência do suporte de seda Seri. Os Depositantes tiveram maior sucesso preparando seções de parafina e coloração para GFP usando um anticorpo policlonal de coelho para GFP (Novus Biologicals, NE600-308); o anticorpo anti- GFP de coelho foi usado em combinação com um anticorpo secundário de IgG H&L anti-coelho de jumento (Alexa Fluor 568; abl75470, Invitrogen), enquanto o anticorpo de IgG Alexa Fluor 488 anti-Cabra de Jumento foi usado para excluir marcações não específicas de autofluorescência hepática. A autofluorescência foi reduzida ao suprimi-la com o uso de corantes e que incluiu Trypan Blue. O Trypan Blue foi usado em tecidos/células a 0,4% em PBS. Isso reduz a base significativamente.

[000247] O RNA total foi extraído dos organoides ou enxertos usando Trizol (Invitrogen). cDNA de primeira fita sintetizado usando o Primescript lst strand cDNA synthesis kit (Takara) foi usado como um modelo para amplificação por PCR. Análises quantitativas de níveis de mRNA foram realizadas usando o Faststart Universal Probe Master (Roche Diagnostics) com o ABI PRISM 7900HT Sequence Detection System (Applied Biosystems) . os iniciadores foram projetados com o Universal Probe Library Assay Design Center (Roche Applied Science). As sequências de iniciador estão listadas na TABELA 4. Os iniciadores foram anelados a 50ºC por 2 min e 95ºC por 10 min, seguido por 40 ciclos de 95ºC (158) e 60ºC (1 min). A expressão de gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH) foi usada geralmente como um controle e um padrão.

[000248] O RNA foi purificado a partir de células usando a análise de integridade de RNA do Qiagen RNeasy Kit (RIN) foi realizada usando um Agilent 2000 Bioanalyzer. As bibliotecas de cDNA foram geradas usando o kit de preparação de mRNA TruSeq Stranded e sequenciadas na plataforma TIllumina HiSeq 2500. Duas amostras foram sequenciadas por faixa, ocupando um total de 8 faixas para todas as amostras (uma célula de fluxo). A análise de controle de qualidade foi concluída usando Fasto. o mapeamento de leituras de sequência ao genoma humano (hgl9) foi realizado com MapSplice2 usando parâmetros padrões. A quantificação de transcrição foi realizada por análise RSEM e DESeq foi usado para normalizar a expressão gênica e identificar genes expressos diferencialmente. MapSplice2 também foi usado para detectar transcrições de fusão candidatas. As chamadas de fusão foram baseadas na profundidade e complexidade das leituras abrangendo junções de fusão candidatas. Perfis de expressão gênica foram comparados usando análise de correlação de Pearson e agrupamento hierárquico foi realizado em R. O agrupamento hierárquico foi realizado após a Transformação Estabilizadora da Variância fornecida no pacote DESeq. Análise de enriquecimento de vias foi realizada com o software Ingenuity Pathway Analysis (IPA). Análise de expressão gênica diferencial foi realizada apenas em genes com uma contagem normalizada média mínima >50 em pelo menos uma categoria.

[000249] Diferenças estatisticamente significativas entre as amostras foram calculadas usando o teste t de Student bicaudal e os resultados são apresentados como a média + desvio padrão (SD). Valores P de menos de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

[000250] Em estudos anteriores sobre enxerto de injeção, verificou-se que enxertos necessitavam do cotransplante de células epiteliais com seus parceiros de célula mesenquimal apropriados no estágio de linhagem. Para células tronco de árvore hepática e biliar, essas células mesenquimais são compostas de angioblastos (CDl17+, CD133+, VEGFr+, CD3l-negativo) e seus descendentes imediatos, precursores de endotélio (CDl33+, VEGFr+, CD3l+, Fator de Van MWillebrand+) e precursores de células estreladas (CDl46+, ICAM-l+, alfa actina de músculo liso+t (ASMA), vitamina A-negativo). Os Depositantes se referem a estes coletivamente como células mesenquimais de estágio de linhagem inicial (ELSMCS). Os Depositantes também tiveram sucesso parcial com células-tronco mesenquimais suínas isoladas (MSCs) preparadas pelos métodos de outros e isolamento das células de fígados de porco neonatais.

[000251] Em estudos anteriores, os Depositantes conseguiram isolar estágios de células epiteliais e mesenquimais correspondentes usando citometria multiparamétrica de fluxo para determinar as proporções dos parceiros do estágio de linhagem das células epiteliais e mesenquimais nas suspensões celulares e então usaram essas razões dentro dos enxertos usando células imunosselecionadas. Nestes estudos, os depositantes constataram mais eficiência para esgotar as suspensões celulares de células mesenquimais maduras por procedimentos de seleção ("panning") repetidos seguidos pela cultura de suspensões celulares restantes em placas de baixa fixação e no meio de Kubota sem soro por 6-8 horas. Organoides automontados com cada agregado contendo aproximadamente 50- 100 células. Análises de marcador indicaram a parceria de BTSCs com ELSMCs (Figura 1). Conforme resumido no esquema da Figura (1A, eles foram usados imediatamente ou criopreservados sob condições definidas determinadas anteriormente e descongelados conforme necessário para enxertos. Organoides de BTSCs/ELSMCs foram caracterizados usando imunofluorescência (IF), qgRT-PCR e RNA-segq e mostraram expressar traços clássicos de BTSCs (Figura 1) e de ELSMCS (dados não mostrados). As BTSCs nos organoides não expressaram nenhum gene hepático ou pancreático maduro, mas níveis baixos de genes de pluripotência (por exemplo,

OCT4, SOX2) e genes de células-tronco endodérmicas (por exemplo, EpCAM, SOX9, SOXl7, PDXl, LGR5, CXCR4, MAFA, NGN3 e NIS). Os ensaios de qgRT-PCR representativos confirmaram os achados de IF e de IHC nas células antes do transplante (Figura 1D). Os ensaios de IHC indicaram que mais células primitivas (por exemplo, aquelas que expressam genes de pluripotência) foram distribuídas para os interiores dos organoides e estágios de linhagem de maturação posteriores nos perímetros (por exemplo, células que expressam EpCAM ou albumina) (Figura 1C).

[000252] Os resultados dos enxertos tipo patch graft foram comparados com aqueles dos enxertos de injeção com métodos estabelecidos anteriormente e compostos por injeção de células e com localização ao sítio, induzindo hialuronanos com diacrilato de polietilenoglicol (PEGDA) ao gel em minutos. Enxertos de injeção no parênquima do fígado suíno resultaram em essencialmente 100% de enxerto, mas com uma migração mínima (se houve) e com integração no tecido hospedeiro ocorrendo lentamente durante semanas (dados não mostrados). Os achados foram semelhantes aos observados anteriormente com enxertos de injeção de células-tronco hepáticas!. Enxertos de injeção no mesentério adjacente a ductos hepáticos/ramificações das veias portais imediatamente caudais aos lobos hepáticos foram viáveis com grandes ductos, mas fizeram com que os indivíduos menores se ocluíssem dos efeitos de inchaço dos hidrogéis HA e resultasse na colestase (Figura 13). O sucesso com o enxerto tipo patch graft nos levou a abandonar outros esforços com estratégias de enxerto de injeção.

[000253] A composição dos enxertos para células- tronco envolveu o uso de condições com 3 camadas distintas de hidrogéis de hialuronano (HA) com concentrações precisas de HA para PEGDA para alcançar um nível de rigidez avaliado por ensaios reológicos (Figura 2C). As células doadoras foram incorporadas em uma camada macia de HA (-100 Pa) e colocadas contra a superfície do fígado/pâncreas; oS hidrogéis macios mantiveram traços característicos das células-tronco (»stemness”)?? que nestes estudos se provaram essenciais para a enxerto. Esta camada foi colocada sobre uma camada rígida (10X; -+-700 Pa) HA preparada antes do tempo no suporte e serve como uma barreira para a migração. O patch foi fixado ao sítio alvo com suturas ou cola cirúrgica. Um hidrogel 2X HA, macio o suficiente (rigidez = -200 Pa) para permitir a pintura ou revestimento da superfície serosa do enxerto no momento da cirurgia e servir para minimizar adicionalmente as aderências de tecidos próximos.

[000254] Enxertos tipo patch graft foram colocados na superfície do fígado, ou seja, superficiais à cápsula de Glisson ou cápsula pancreática e ligados por suturas ou cola cirúrgica nos cantos (Figura 2F). A rigidez de Seri- Silk resultou em enxertos serem colocados em locais com curvatura mínima e longe dos locais com forças mecânicas significativas (por exemplo, perto do diafragma). Nos enxertos no pâncreas, o enxerto foi fixado entre o duodeno e o pâncreas.

[000255] A única variante de enxerto tipo patch graft tentada e depois abandonada foi após remoção cirúrgica aguda da cápsula. A hemorragia foi excessiva, afastando uso futuro em hospedeiros com hemostasia alterada associada à falha hepática ou mesmo em hospedeiros normais dadas as influências adversas do soro nas células doadoras. Sem tais esforços para alterar as cápsulas de órgãos, enxertos tipo patch graft se provaram fáceis para procedimentos cirúrgicos.

[000256] Uma série de suportes foram testados com foco naqueles usados clinicamente em cirurgias abdominais (TABELA 1 e TABELA 2). Tudo, exceto Seri-Silk, causou problemas que resultaram em sua eliminação para consideração posterior. Os problemas incluíam fragilidade (por exemplo, Seprafilm, Retroglicida); indução de necrose ou fibrose e níveis significativos de aderências (por exemplo, Surgisis, Vetrix); e formações de aderência graves com uma versão de esponja filamentosa de Seri-Silk ou qualquer um dos suportes suplementados com carboximetilcelulose ("belly jelly") ao abdome. Dos testados, SERI Surgical Silk?i-º26 (Allergan, Inc. Irvine, CA) forneceu a melhor combinação de suporte mecânico e mínimas aderências, um efeito reforçado ainda pela aplicação de 2X HA à superfície serosa do SeriSilk após a ligação ao sítio alvo. O produto é uma fibroína purificada de seda de Bombyx e foi desenvolvido por David Kaplan (Tuft's University, Boston, MA). os depositantes constataram ser rígida, uma propriedade considerada útil para manipulações cirúrgicas e colocação em órgãos planos/rígidos como o fígado. A rigidez tornou difícil aplicar a sítios com curvatura significativa ou necessidade de flexibilidade. Ainda assim, sua rigidez mostrou-se neutra em relação aos efeitos de maturação nas células doadoras, uma descoberta que tornou este apoio aceitável para o enxerto tipo patch graft. Em enxertos, em 3 semanas, Seri-Silk foi envolvida por faixas de colágeno, sugerindo uma reação a corpo estranho suave. A avaliação de outros suportes candidatos, como têxteis sintéticos, está em curso.

[000257] Evidências para remodelação na semana um após a cirurgia foram validadas com coloração de Tricromo (FIGS. 3, 7) ou Safranina O, tendo corantes que marcam colágenos e outros componentes de matriz extracelular. As imagens do enxerto (FIGURA 3A-B) que são coradas com Tricromo são comparadas com algumas do mesmo sítio e coradas com hematoxilina/eosina (Figura 3C-D). A reconstituição da cápsula de Glisson e dos lóbulos ocorreu por 3 semanas em paralelo com HAs sendo reabsorvidas. As faixas que compreendem a área de remodelação foram surpreendentemente grandes (FIGS. 3-5, 7).

[000258] Células doadoras derivadas de porcos GFP+ transgênicos foram identificadas prontamente pela expressão de GFP através de ensaios de IHC. No pâncreas, as células doadoras foram identificadas pela fluorescência verde. No entanto, no fígado, a autofluorescência das lipofusões em picos de hepatócitos em um comprimento de onda sobrepõe-se àquela para GFP. Portanto, identificamos células doadoras em fígados com um anticorpo para GFP (anticorpo anti-GFP de coelho; Novus, NB600-308) e acoplado a um anticorpo secundário com uma fluorosonda vermelha (anti-coelho Donkey

555, Invitrogen), fazendo com que as células doadoras tenham núcleos rosa (a fluorosonda vermelha mais DAPI azul). Células hospedeiras foram reconhecidas considerando seus núcleos azuis (marcação DAPI), mas sem expressão de GFP (Figura 4).

[000259] Os lobos hepáticos de hepatócitos maduros ficaram verde-floresta a partir da autofluorescência (lipofuscinas) (Figura 4B). Células GFP+ doadoras que tinham maturado aos agregados de hepatócitos ficaram de uma cor de lavanda e com núcleos rosa (Figura 4C) devido à fusão da fluorosonda vermelha a partir de GFP, o azul da DAPI e o verde escuro autofluorescente de lipofuscinas. Os hepatócitos, quer derivados de hospedeiro ou doador, foram agrupados por células mesenquimais hospedeiras (endotélio, células estreladas) com autoflorescência amarela/verde brilhante, presumimos, para a vitamina A, nas células estreladas maduras (Figura 4C); os dados de IHC para endotélio e células estreladas não são mostrados.

[000260] Dentro de uma semana, os enxertos tipo patch graft dos organoides de BTSCs/ELSMCS resultaram na remodelação da cápsula do órgão e nos lóbulos adjacentes, seguido por uma fusão das células hospedeiras e doadoras (FIGS. 3-5, 7). Extensões semelhantes a dedos de células doadoras se estenderam para dentro dos lóbulos hepáticos do tecido hospedeiro; em paralelo, células hospedeiras se estenderam para dentro de HAs dos enxertos (Fig. 4). No caso do pâncreas, o enxerto foi colocado entre o pâncreas e o duodeno e, por uma semana após a cirurgia, o enxerto de células doadoras ocorreu tanto no pâncreas quanto nas glândulas de Brunner da submucosa do duodeno (Figura 6). A integração das células dentro de grandes regiões do fígado (ou pâncreas) foi concluída por 2 semanas, após esse tempo as camadas de HAs foram na maior parte reabsorvidas; as células doadoras tinham linhagem restrita em destinos hepáticos parenquimais adultos, tanto colangiocíticos quanto hepatocíticos (Figura 5) ou em destinos pancreáticos (Figura 6).

[000261] Em 3 semanas, as camadas de HA foram reabsorvidas inteiramente, deixando apenas o suporte. Isto correlacionou-se com o reaparecimento da cápsula do órgão e da estrutura histológica do tecido próximo às cápsulas (FIGS. 3, 5, 6) ou da cápsula pancreática e das estruturas histológicas pancreáticas (Figura 6). No pâncreas, células maduras foram identificadas por marcadores funcionais que incluíam insulina para células da ilhota (células beta) e amilase para células acinares.

[000262] A eficiência do enxerto para o fígado e para o pâncreas foi próxima a 100% por uma semana, uma vez que todas as células doadoras identificadas foram consideradas viáveis e dentro do fígado ou pâncreas; não nos restos dos enxertos acima das cápsulas do órgão; e com evidência negligenciável ou não de distribuição ectópica de células em outros órgãos (por exemplo, pulmão).

[000263] A velocidade de migração das células doadoras nos enxertos de BTSC/ELSMC através do fígado e através do pâncreas provou notável resultado em células doadoras na maioria das regiões do órgão (fígado ou pâncreas) até o fim de uma semana e com células uniformemente dispersas por todo o tecido (fígado/pâncreas em 2-3 semanas (FIGS. 3-6).

[000264] Correlacionou-se com a dissolução e remodelamento da cápsula de Glisson (ou cápsula pancreática) e lóbulos de fígado vizinhos (ou tecido pancreático) e correlacionou-se com enxertos significativos a expressão elevada de múltiplos MMPs, enzimas conhecidas por dissolver componentes de matriz extracelular e estarem associadas à migração de células. Na Figura 7 estão resumidos dados de estudos de RNA-segq e ensaios de IHC em MMPs expressas por células tronco/progenitoras versus células adultas. As BTSCs expressaram altos níveis de MMPs, compostos de ambas as formas secretadas (por exemplo, MMP2, MMP7), bem como formas associadas à membrana (por exemplo, MMP14 e MMP15). Os ELSMCs, precursores de endotélio e de células estreladas, também contribuíram para múltiplos MMPs.

[000265] Os resultados dos dados de RNA-seq foram confirmados por ensaios de IHC para as proteínas codificadas por genes MMP (Figura 7). Os ensaios de IHC confirmaram a presença das formas secretadas de MMPs (por exemplo, MMPl1, MMP2, MMP7, MMP9) especialmente nas regiões de remodelação. A expressão de proteína de MMP1 foi encontrada em organoides de BTSCsS/ELSMCS e também em regiões de remodelamento de enxertos; no entanto, bancos de dados existentes de achados de RNA-seq não incluem MMP1 devido a uma ausência de uma espécie anotadas de MMP1l suína a ser usada para as análises. Portanto, o reconhecimento de sua expressão é baseado em ensaios de IHC.

[000266] Variáveis causando diferenciação das células doadoras resultaram em uma mutação da expressão de MMPs, especialmente as formas secretadas e, em paralelo, uma perda no potencial para enxertos e migração (dados não mostrados). Esses fatores incluíam soro, vários sinais reguladores solúveis (fatores de crescimento, citocinas, hormônios) conhecidos por influenciar a diferenciação das células doadoras, componentes da matriz extracelular, quer nos hidrogéis ou nos suportes (especialmente delimitação contendo colágeno tipo I), e a rigidez dos hidrogéis HA (isto é, os níveis de Pa). Se a diferenciação das ELSMCsS progrediu preferencialmente para o estroma, os enxertos se tornaram fibróticos; se para o endotélio, os enxertos retiram células viáveis e tecidos, mas permaneceram superficiais à cápsula do órgão (dados não mostrados).

[000267] Organoides de BTSCs/ELSMCS comprovaram O arranjo mais bem sucedido das células para enxerto. No passado, tínhamos parceiros mesenquimais-epiteliais cotransplantados mediante a imunosseleção deles de suspensões celulares por citometria de fluxo usando seus antígenos de superfície distintos e, em seguida, misturando-os de acordo com as razões encontradas nas suspensões de células de tecidos recém-isolados!”. Aqui, descobrimos que deixar que se autosselecionassem em organoides após a remoção por meio da cultura de células mesenquimais maduras provou-se mais eficiente e eficaz no estabelecimento de parceiros epiteliais-mesenquimais apropriados em estágio de linhagem com sinalização parácrina relevante para os enxertos e produzindo organoides sob condições definidas (sem soro), que os tornaram criopreservadas com facilidade e segurança.

[000268] O projeto primário dos enxertos consistia na mistura de células com biomateriais apropriados que podem se tornar insolúveis e manter as células localizadas no sítio alvo. Para enxertos, os biomateriais ideais provaram ser glicosaminoglicanos não sulfatados ou minimamente sulfatados (GAGs), tais como hialuronanos (HAs), encontrados em todos os nichos de células-tronco, com receptores para HAs sendo traços de células-tronco clássicos. Manutenção de células como expressão otimizada de células tronco/progenitoras de MMPs secretadas e associadas à membrana eficazes para enxerto.

[000269] A evidência de processos de enxerto foi particularmente dramática dentro das regiões de remodelação que ocorreram na interface do enxerto e do tecido hospedeiro. Para validar os achados de remodelação, coloração Tricromo e Safranina O foram usados tendo corantes que possuem componentes de matriz extracelular e analisados em paralelo com seções adjacentes marcadas com hematoxilina/eosina (Figuras 3, 7). Isso confirmou a remodelação da cápsula do órgão e do tecido adjacente dentro de uma semana após a cirurgia. Em 3 semanas após a cirurgia, esses ensaios demonstraram a reconstituição das cápsulas do órgão e da histologia normal do tecido após a liberação de HAs. A zona de remodelamento foi surpreendentemente grande (Figuras 3, 7), especialmente em uma semana após a cirurgia e mostrou envolver múltiplas formas de MMPs (Figura 7).

[000270] Embora existam muitas fontes e tipos de HAs,

entre os mais úteis estão aqueles estabelecidos por Glenn Prestwich (Universidade de Utah, Salt Lake City, UT) e que podem ser desencadeados com PEGDA para formar um hidrogel com propriedades bioquímicas e mecânicas precisas. Essas propriedades de HAs conferem elasticidade perfeita, permitem o acesso ao enxerto de todos os sinais solúveis no sangue, linfa ou fluido intersticial, e minimizam a maturação das células doadoras até que haja enxerto e migração. A capacidade de variar os fatores reológicos com mudanças simples nas concentrações de HA e PEGDA forneceu vantagens adicionais na orientação da direção da migração das células e na minimização de aderências. Hidrogéis de HA macios, aqueles que imitam as propriedades em nichos de células-tronco, foram permissivos para expressão do repertório associado a células tronco/progenitoras de MMPs. Assim, as propriedades mecânicas de HAs, estudadas por anos nas funções de tecidos esqueléticos, são importantes também na gestão de estratégias de enxerto?

[000271] Enxertos tipo patch graft contendo células- tronco/progenitoras resultaram em um fenômeno impressionante de enxertos "derretendo-se" nos tecidos dentro de alguns dias, seguido por uma fusão de células doadoras e hospedeiras e uma distribuição de células ao longo da maioria das regiões do órgão em uma a duas semanas. Posteriormente, a maturação das células doadoras e restauração das cápsulas do órgão ocorreu em paralelo com a depuração do tecido de HAs.

[000272] [6] processo de enxerto e integração correlacionou-se com a expressão de múltiplas MMPs, uma família de endopeptidases dependentes de cálcio, que contêm zinco, que degradam os componentes da matriz extracelular. Usando estudos de RNA-seq, encontramos um padrão de MMPs associadas a células-tronco/progenitoras, composto por altos níveis de formas secretadas (por exemplo, MMP2, MMP7), bem como formas associadas à membrana (por exemplo, MMP14, MMP15). Os ensaios de IHC indicaram que os níveis de proteína de MMPs secretados (por exemplo, MMPl, MMP2, MMP7) foram encontrados ricamente expressos em áreas de remodelação (Figura 7). As condições (fatores de crescimento solúveis, citocinas, soro, componentes da matriz, forças mecânicas) que causaram a diferenciação das células doadoras resultaram na redução de MMPs, especialmente as formas secretadas e, em paralelo, anulação do processo de enxerto.

[000273] Os biomateriais dos enxertos, especialmente as HAs, foram mostrados ex vivo e in vivo mantendo traços característicos das células-tronco (“stemness”) nas células. Visto que os enxertos são desprovidos de sinais conhecidos que podem desencadear a determinação de destino, os achados de células doadoras que tinham amadurecido em destinos adultos distintos, dependendo se o enxerto foi colocado no fígado ou no pâncreas, implica o microambiente local do tecido hospedeiro como a fonte lógica de fatores relevantes para os processos de maturação.

[000274] os números de células que podem ser enxertadas são consideráveis (>10º) e ditados pelas dimensões do enxerto, os números de células e o repertório de MMPs associados à membrana de plasma e secretadas. Esses achados estão em contraste com os números limitados de células (por exemplo, 10º-106) viáveis com liberação vascular ou por enxerto de injeção.

[000275] O enxerto tipo patch graft é uma estratégia segura para o transplante de grande número de células em um órgão sólido, incluindo órgãos internos, e pode provar útil para o tratamento de pacientes, especialmente se o enxerto puder ocorrer suficientemente sob condições da doença. Porém, há preocupação de que o enxerto aberrante possa ocorrer onde o tecido é fibrótico ou afetado pela cirrose. Nesse sentido, são fornecidos exemplos neste documento para determinar a eficácia dos enxertos tipo patch graft para os aspectos do método.

EXEMPLO 2: Tratamento de doença hepática.

[000276] Este exemplo descreve um método exemplar de tratamento de um sujeito tendo uma doença ou distúrbio hepático usando um enxerto tipo patch graft. As células doadoras são preparadas como organoides de células-tronco de árvore biliar (BTSCsS), precursores para fígado e pâncreas, agregados com células mesenquimais de estágio inicial (ELSMCS) que consistem em angioblastos e seus descendentes de estágio inicial de linhagem, precursores de endotélio e precursores de células estreladas, como descrito neste documento. Os organoides de BTSC/ELSMCs são incorporados em hidrogéis de hialuronano macio (<200 Pa) colocados sobre um suporte que é preso a um sítio alvo do fígado do sujeito.

[000277] Após a administração do enxerto tipo patch graft, o sujeito é monitorado quanto à melhora na função hepática. Testes comumente usados para verificar a função hepática incluem, mas não estão limitados aos testes de alanina transaminase (ALT), aspartato aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (ALP), albumina e bilirrubina. Os testes de ALT e AST medem as enzimas que são liberadas pelo fígado em resposta a danos ou doenças. Os testes de albumina e bilirrubina medem o quão bem o fígado cria albumina, uma proteína, e o quão bem ele dispõe de bilirrubina, um produto residual do sangue. Espera-se que, após cerca de 2 semanas a cerca de 36 semanas, uma melhora na função hepática seja detectada. A melhora é determinada pela detecção de um valor melhorado de um ou mais dos testes de função hepática em relação ao valor antes da administração do enxerto e/ou uma melhoria ou melhora de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio hepático.

EXEMPLO 3: Tratamento de doença pancreática.

[000278] Este exemplo descreve um método exemplar de tratamento de um sujeito tendo uma doença ou distúrbio do pâncreas usando um enxerto tipo patch graft. As células doadoras são preparadas como organoides de células-tronco de árvore biliar (BTSCs), agregados com células mesenquimais no estágio inicial de linhagem (ELSMCS) consistindo em angioblastos e seus descendentes de estágio inicial de descendência, precursores para endotélio e precursores para células estreladas, como descrito neste documento. Os organoides de BTSC/ELSMCs são incorporados em hidrogéis de hialuronano macios (<200 Pa) colocados sobre um suporte que é preso a um sítio alvo do pâncreas do sujeito.

[000279] Após a administração do enxerto tipo patch graft, o sujeito é monitorado para melhora na função pancreática. Testes comumente usados para verificar a função pancreática incluemy mas não estão limitados a exames de sangue para níveis de enzimas pancreáticas amilase e lipase, o teste de função pancreática direta após a administração de secretina ou colecistocinina, teste de elastase fecal, tomografia computadorizada com corante de contraste, ultrassom abdominal, colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (ERCP), ultrassom endoscópico e colangiopancreatografia por ressonância magnética. Espera- se que, após cerca de 2 semanas a cerca de 36 semanas, uma melhora na função pancreática seja detectada. A melhora é determinada pela detecção de um valor melhorado de um ou mais dos testes de função pancreática em relação ao valor antes da administração do enxerto e/ou uma melhora ou alívio de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio do pâncreas.

EXEMPLO 4: Tratamento de doença do rim.

[000280] Este exemplo descreve um método exemplar de tratamento de um sujeito tendo uma doença ou distúrbio do rim usando um enxerto tipo patch graft. As células doadoras são preparadas como organoides de células-tronco de árvore biliar (BTSCs), agregados com células mesenquimais no estágio inicial de linhagem (ELSMCSs) consistindo em angioblastos e seus descendentes de estágio inicial de descendência, precursores para endotélio e precursores para células estreladas, como descrito neste documento. Os organoides de BTSC/ELSMCs são incorporados em hidrogéis de hialuronano macios (<200 Pa) colocados sobre um suporte que é preso a um sítio alvo do rim do sujeito.

[000281] Após a administração do enxerto tipo patch graft, o indivíduo é monitorado quanto à melhora na função renal. Testes comumente usados para verificar a função pancreática incluem, mas não estão limitados a resultados clinicamente relevantes da função renal conhecidos na técnica. Espera-se que, após cerca de 2 semanas a cerca de 36 semanas, uma melhora na função renal seja detectada. A melhora é determinada pela detecção de um valor melhorado de um ou mais dos testes de função renal em relação ao valor antes da administração do enxerto e/ou uma melhora ou alívio de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio do rim.

EXEMPLO 5: Tratamento da doença GI.

[000282] Este exemplo descreve um método exemplar de tratamento de um sujeito tendo uma doença ou distúrbio gastrointestinal usando um enxerto tipo patch graft. As células doadoras são preparadas como organoides de células- tronco de árvore biliar (BTSCs), agregados com células mesenquimais no estágio inicial de linhagem (ELSMCs) consistindo em angioblastos e seus descendentes de estágio inicial de descendência, precursores para endotélio e precursores para células estreladas, como descrito neste documento. Os organoides de BTSC/ELSMCs são incorporados em hidrogéis de hialuronano macios (<200 Pa) colocados sobre um suporte que é preso a um sítio alvo dos intestinos do sujeito.

[000283] Após a administração do enxerto tipo patch graft, o sujeito é monitorado quanto à melhora na função intestinal.

Testes comumente usados para verificar a função intestinal incluem, mas não estão limitados a resultados clinicamente relevantes da função intestinal conhecidos na técnica.

Espera-se que, após cerca de 2 semanas a cerca de 36 semanas, uma melhora na função intestinal seja detectada.

A melhora é determinada pela detecção de um valor melhorado de um ou mais dos testes de função intestinal em relação ao valor antes da administração do enxerto e/ou uma melhora ou alívio de um ou mais sintomas da doença ou distúrbio gastrointestinal.

APÊNDICE AO RELATÓRIO DESCRITIVO TABELAS 1 — 4 PATCH GRAFTS 2018 Tabela 1. tratamento tipo patch direta no periductal direta sob graft parênquima na bifurca- a cápsula diretamente do fígado ção ductal em torno na dos ductos superfície biliares do fígado (por exemplo, ducto biliar comum) Animal no N=23 N=3 N=3 N=3 grupo Células por —0,5-5 E7 0,5-5 E7 0,5-2 E7 0,5-2 E7 enxertos* por mL por mL por por 0,5mL por O,5mL injeções múltiplas Resultados Bom Bom Bom, mas Ruim limitado Limitações/ Seguro para Números de Os números Resultou na Contraindica- fígado células/ de células oclusão dos ções normal e por injeção por injeção ductos e para são são sintomas animais limitados** limitados subse- lesionados, ; múltiplas devido à quentes da eficiente injeções limitação colestase. para a podem dos sítios administra- causar adequados ção de maior risco de injeção grande de hemorra- em número de gia. hospedei- células ros. doadoras no Múltiplas fígado; os injeções componentes não podem dos ser enxertos alcança- tipo patch das. graft podem ser adaptados devido aos estágios de disfunções hepáticas. " Indicações Quaisquer Potenciala Recomendado Não para aplicação disfunções ser usado para recomendá- hepáticas, para erros enxertos de vel especialmen de nascença lobo te erros de do esquerdo nascença do metabolismo metabolismo e cirrose no estágio inicial

“*Células por enxertos são números de células por ML de HA reticulado **Neste estudo, para receptores leitões saudáveis de 10 kg de BW (peso corporal), não foram observados mais de 0,5 mL por injeção.

Tabela 2. Comparação dos suportes testados para enxertos tipo patch graft Facili- Reações Aderên- Informações sobre o Suportes dade de adversas cias suporte manuseio Seda de de bicho- da-seda Bombyx Gaze de David Kaplan Seda Sim Não Mínimo* (Universidade de Cirúrgica Tuft, Boston, MA),

SERIO Sofragen (Boston, MA) Vetrix Tecnologia de BioSIS Sim 2-3 Medicina ECM Regenerativa Tendeu a SurgisisoES expelir e m sim www.cooksurgical/14 dobrar-se; 2-3 Enxerto de 7O Necrose, Tecido Mole Descolo- Tecido ração, Alloderm sim 2-3 descelularizado da Fibrose derme humana Tela Tricotada sim Grave Ethicon Vicryl Muito https://www.seprafi Seprafilm Não 2 frágil lIm.us/

frágil nc) com/technologies po ese **Aderências: Estas variaram em extensão de gravidade.

Nós atribuímos um número para indicar essa gravidade: 0= sem aderências; 1l1= aderências finas e facilmente rompidas; 2= aderências exigindo dissecação com força bruta para rompimento; 3 = Aderências densas que foram dispersas apenas com o uso de força considerável, resultando em dano total ou parcial às vísceras. *A versão de esponja filamentosa da Seri-Silk causou aderências significativas.

As aderências mais graves observadas com qualquer um dos suportes usados em combinação com "belly jelly", carboximetilcelulose.

Revestimento da superfície serosa do suporte com HA mais concentrado reduziu e minimizou aderências.

Imunossupressão.

Todos os porcos receberam dosagens orais das drogas imunossupressoras Tacrolimo (0,5 mg/kg) e Micofenolato (500 mg) duas vezes ao dia, começando 24 horas antes da cirurgia e continuamente dadas após o período pós-cirúrgico.

Tabela 3 Anticorpos Anticorpos primários Clonali- Número Diluição Catego- |Anti- |Hospe- dade/ Iso- | Forne- do /Aplica- ria corpo | deiro | Conjuga- |tipo cedor Jcatálo- ção ção go Santa Pluripo- Poli, não Cruz IHC-P oOCT4 Gt IgG Sc-9081 tente conjugado Biotechn (1:100 ology IHC-P Poli, não (1:200) EpCAM Rb IgG Abcam jab71916 conjugado IF (1:200) ICC (1: Poli, não Rb IgG lchemicon |AB5535 | 800) IF conjugado (1:500) IHC- Endoder- P/ICC me Poli, não Sistema PDX1 Gt IgG AF2419 (1:200) multipo- conjugado R&D

IF tente (1:50) IHC- Mono-Cit: NIS Ms IgG1 Abcam Jabl7795 P/ICC SPM186 (1:50) IHC-P Mono-CiH: (1:100) SOX17 Ms IgG1l Abcam jab84990 OTI3B10 IF/ICC (1:50)

Santa Cromosso- Poli, não Cruz sc- IHC-P RBMY1 Rb IgG mo Y conjugado Biotechn | 28727 (1:400) ology IHC-P Novus Poli, não NB600- (1:500) GFP GFP Rb IgG Biologic conjugado 308 IF als (1:200) Thermo IF-P/ Tag Poli, Fisher IF-F/ GFP-555 Rb IgG IA-31851 GFP Alexa-555 Scientif ICC ic (1:350) Insu- Poli, não IAb19595 IF Gp IgG Abcam lina conjugado 6 (1:100) Marcado- Sigma- Gluca- IF res Ms Mono- IgGl Millipor | G2654 gon (1:100) pancreá- e ticos alfa- Sigma- Poli, não IF Amila- Rb Millipor | A8273 conjugado (1:200) se e Sigma- Poli, não M4696- MMP1 Gt IgG Millipor 10 pg/ml conjugado 100UG etalopro e teinases |MMP 2 de Matriz (Cc- Mono-Cit: IHC-P Ms IgG Abcam jab86607 termi- 6E3F8 (1:300) nal)

Tabela 3 Anticorpos (Continuação) Anticorpos Secundários Thermo Poli, Anti- IgG Fisher SA5- Dk DyLight 1:1000 Gt-488 (H+L) |Scientif | 10086 488 ic Thermo Poli, Anti- IgG Fisher SA5- Dk DyLight 1:1000 Rb-594 (H+L) |Scientif | 10040 594 ice Thermo Poli, Anti- IgG Fisher SA5- DK DyLight 1:1000 Ms-488 (H+L) |IScientif | 10166 Ensaio 488 1C fluoro- Thermo gênico Poli,

Anti- I9G Fisher SA5- (Adsorvi- Dk DyLight 1:1000 Gt-350 (H+L) |Scientif | 10085 do de 350 ic forma Thermo cruzada) Poli, Anti- IgG Fisher Dk Alexa A21206 1:400 Rb-488 (H+L) |Scientif Fluor 488 ic Poli, Jackson Anti- IgG 706- Dk Alexa Immuno 1:400 Gp-647 (H+L) 605-148 Fluor 647 Research Thermo Poli, Anti- IgG Fisher Dk Alexa A21207 1:400 Ms-594 (H+L) |IScientif Fluor 594 ic

Kit de petec- Vector Micropolím Pronto ção Hs IgG |laborato MP-7401 ero HRP para uso Anti- ries Rb Kit de Detec- Vector Micropolím Pronto ção Hs IgG |llaborato MP-7402 ero HRP para uso Anti- ries Ensaio Ms cromogêni Kit de co petec- Vector Micropolím Pronto ção Hs IgG |llaborato MP-7405 ero HRP para uso Anti- ries Gt Kit de petec- Vector Micropolím Pronto ção Hs IgG |laborato MP-7402 ero HRP para uso Anti- ries Ms Abreviações U Hospedeiro: Gt, cabra; Rb, coelho; Dk, burro; Hs, cavalo; Ms, camundongo; Gp, Porquinho da Índia . Clonalidade ou Conjugação: Poli, policlonal; Mono-C *, número de clone monoclonal U Aplicação: IHC, imuno-histoquímica; IHC-F, seções congeladas por imuno-histoquímica; IHC-P, amostras fixadas por imunohistoquímica-parafina; ICC, imunocitoquímica IF, imunofluorescência; HRP, peroxidase de raiz forte

Tabela 4: Iniciadores (qPCR) Número Comprim Tm Categoria de Sequência (5' a 3') ento c (ºC) Acesso (bp) Senso: Gene

ATCCTGGGCTACACTGAGG constitutivo NM 00120 GAPDH = AC 473 60ºC (“Housekeepi 6359.1 Antissenso: ng”)

AGTGGTCTCGTTATG Senso:

TTCCTTCCTCCATGGATCT NM 00112 |G Nanog 214 62ºC

9971.1 Antissenso:

ATCTGCTGGAGGCTGAGGT

A Senso:

GCCCTGCAGTACAACTCCA Genes NM 00112 |T pluripotente | Sox2 216 60ºC 3197 Antissenso: s

GCTGATCATGTCCCGTAGG

T Senso:

AGAAGCTGGACAAGGAGAA JN633978 |G Oct4 176 60ºC al Antissenso:

GCTGAACACCTTCCCAAAG

A Genes NM 21441 | Senso: EpCAM - 314 53ºC primitivos 9.1 AGAGAGAATGCTATCCAGA

Antissenso:

CTCACTCGCTCCAAACAGG Senso:

CCTTGGCCCTGAACAAAAT NM 00131 Lgr5 A 110 60ºC

5762.1 Antissenso:

ATTCTTTCCCAGGGAGTGG Senso:

CGGTTCGAGCAAGAATAAG NM 21384 |C Sox9 " 229 60ºC

3.2 Antissenso: TCT

GTAATCCGGGTGGTCCTTC

T Senso:

TCATTGATGCCACAACCAT NM 00128 |T Bmil " 189 60ºC

5971.1 Antissenso:

TGAAAAGCCCCGGAACTAA

T Senso:

GGCTGCTCATTGAGAGGAG NC 01044 Muc2 = T 249 60ºC 4,3 Genes Antissenso: relacionados ATGTTCCCGAACTCCAAGG ao trato GI Senso: CDX2 NC 01045 | AGAACCCCCAGGTCTCTGT 115 56ºC 3,4 cTT

CCGAACCGAAACACTCCCT

CACA Senso:

CTTCTTCTGGTTGCTTACA NM 21431 |C AFP " 609

7.1 Antissenso: Genes

ACTTCTTGCTCTTGGCCTT relacionados

GG a células Senso: parenquimais

AGTCTGCCAAGCTGCTGAT hepáticas Albumi | AY663543 | A 115 56 na 1 Antissenso:

AGCCTTGGGAAATCTCTGG Cc Senso:

AGTGATACTGGATTGGCGT NM 00114 | TG PDX-1 " 139 62

1984.2 Antissenso: Genes

TAGGGAGCCTTCCAATGTG relacionados

T a endócrinas Senso: pancreáticas

GCTTCAGCAAGGAGGTC NC 01044 MAFA = Antissenso: 120 62 6,4 ! TCTCGCTCTCCAGAATGTG Cc

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Enxerto tipo patch graft para sustentar e manter uma população mista de células caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma população mista com dois ou mais tipos de células, em que pelo menos uma delas está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases (MMPs) de matriz associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio em um hidrogel com viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista dentro ou fora do enxerto; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível e biodegradável com uma viscoelasticidade suficiente para inibir uma migração da referida população mista em uma direção do referido suporte ou barreira, em que o enxerto tipo patch graft é configurado para sustentar e manter a referida população mista inibindo pelo menos um do referido tipo de célula em estágio inicial a partir da diferenciação ou maturação adicional até um estágio de linhagem posterior que já não há mais capacidade de expressar MMPs associadas à membrana e/ou secretadas.

2. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido suporte compreende uma malha porosa infundida com um hidrogel.

3. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda:

(c) um hidrogel sobreposto sobre uma superfície serosa do referido suporte, em que a superfície serosa está oposta ao que está em contato com a referida população mista.

4, Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o hidrogel do elemento (a) compreende um ou mais hialuronanos.

5. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o hidrogel do elemento (b) compreende um ou mais hialuronanos.

6. Engxzerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o hidrogel do elemento (c) compreende um ou mais hialuronanos.

7. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido meio compreende Meio de Kubota ou outro meio que suporta "similaridade à célula-tronco".

8. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida população mista compreende células mesenquimais e células epiteliais.

9. Enxerto tipo patch graft, de acordo com àa reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as células mesenquimais compreendem células mesenquimais em estágio de linhagem inicial (ELSMCsS).

10. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as referidas ELSMCS “compreendem um ou mais dentre angioblastos, precursores para endotélio ou precursores para células estreladas ou células-tronco mesenquimais (MSCs).

11. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as referidas células epiteliais compreendem células-tronco epiteliais.

12. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as referidas células epiteliais compreendem células-tronco do trato biliar (BTSCs).

13. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as referidas células epiteliais compreendem células epiteliais comprometidas e/ou maduras.

14. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as referidas células epiteliais comprometidas e/ou maduras compreendem células parenquimais maduras.

15. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que as referidas células parenquimais maduras compreendem um ou mais dentre hepatócitos, colangiócitos e células da ilhota.

16. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as referidas células mesenquimais e células epiteliais compreendem células-tronco.

17. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida população mista compreende células autólogas e/ou alogênicas.

18. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um ou mais tipos de célula são geneticamente modificados.

19. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o suporte compreende uma malha porosa, andaime ou membrana.

20. Engerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o suporte compreende material não poroso.

21. Engerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o material não poroso é selecionado dentre seda, âmnion, placenta, omento, um tecido sintético, derivados dos expostos anteriormente ou combinações destes.

22. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o suporte tem resiliência suficiente para aguentar forças mecânicas, é capaz de ser fixado a um órgão ou tecido alvo e tem flexibilidade suficiente para ser fixado aos locais com curvatura.

23. Enxerto tipo patch graft, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que qualquer biomaterial (exceto hidrogel) pode ser utilizado, desde que o biomaterial seja capaz de sustentar e manter as populações de células e tenha propriedades reológicas (por exemplo, viscoelasticidade) suficientes para permitir a migração da referida população de células dentro ou fora do enxerto tipo patch graft.

24. Enxerto tipo patch graft para sustentar e manter uma população mista de células, caracterizado pelo fato de que: compreende: (a) uma população de células (opcionalmente de um único tipo), apoiada em um meio em um hidrogel ou outro biomaterial com propriedades reológicas (por exemplo, viscoelasticidade) suficientes para permitir a migração das referidas células dentro ou fora enxerto tipo patch graft; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível e biodegradável com uma viscoelasticidade suficiente para inibir (ou fornecer uma barreira para) a migração da referida população de células em uma direção do referido revestimento,

25. Cobertura ou revestimento para um enxerto tipo patch graft tecido, caracterizado pelo fato de que compreende um hidrogel ou outro biomaterial com viscoelasticidade e resiliência suficientes para suportar forças mecânicas, incluindo forças de outros tecidos e órgãos.

26. Método para evitar aderências envolvendo ou resultantes de forças mecânicas ou contato de outros órgãos e tecidos, caracterizado pelo fato de que compreende cobrir ou revestir uma superfície com um hidrogel ou outro biomaterial comparável.

27. Método de enxerto de células em um tecido alvo caracterizado pelo fato de que compreende colocar o tecido alvo em contato com um enxerto de tipo patch graft compreendendo: (a) uma população mista com dois ou mais tipos de células, em que pelo menos uma delas está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases (MMPs)

de matriz associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio em um hidrogel com viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista em direção e para dentro de um tecido alvo; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível biodegradável com viscoelasticidade suficiente para inibir a migração da referida população mista para longe de um tecido alvo e por meio do referido suporte ou barreira.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que compreende ainda permitir que as células contidas no enxerto de tipo patch graft passem a ser incorporadas ao tecido.

29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo é selecionado do grupo que consiste em fígado, pâncreas, trato biliar, tireoide, timo, gastrointestino, pulmão, próstata, mama, cérebro, bexiga, medula espinhal, pele, uterino, rim, músculo, vaso sanguíneo, coração, cartilagem, tendões e tecido ósseo.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo é o tecido hepático.

31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo é tecido pancreático.

32. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo é tecido do trato biliar.

33. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo é tecido gastrointestinal.

34, Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo é tecido renal.

35. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o tecido alvo é um órgão.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o órgão é um órgão do sistema musculoesquelético, sistema digestivo, sistema respiratório, sistema urinário, sistema reprodutivo feminino, sistema reprodutivo masculino, sistema endócrino, sistema circulatório, sistema linfático, sistema nervoso ou sistema tegumentar.

37. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o órgão é selecionado do grupo que consiste em fígado, pâncreas, trato biliar, tireoide, timo, intestinos, pulmão, próstata, mama, cérebro, bexiga, medula espinhal, pele, útero, rim, músculo, vaso sanguíneo, coração, cartilagem, tendões e tecido ósseo.

38. Método de enxerto de células em um tecido alvo caracterizado pelo fato de que compreende colocar um tecido alvo em contato com um enxerto de tipo patch graft compreendendo: (a) uma população de células, incluindo uma população com um estágio de linhagem inicial, compreendendo um tipo único ou múltiplos tipos de células, apoiada em um meio em um hidrogel ou outro biomaterial com propriedades reológicas (por exemplo, viscoelasticidade) suficientes para permitir a migração das células da população dentro ou fora do enxerto tipo patch graft; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível e biodegradável com propriedades reológicas (por exemplo, viscoelasticidade) suficientes para inibir (ou fornecer uma barreira para) a migração de células da população em uma direção do referido revestimento, em que o enxerto tipo patch graft é configurado para sustentar e manter a referida população de células inibindo a referida população com um estágio inicial a partir da diferenciação ou maturação adicional até um estágio de linhagem posterior.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que uma população com um estágio de linhagem inicial é capaz de expressar metaloproteinases de matriz (MMPs) associadas à membrana e/ou secretadas.

40. Método de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio hepático, o método caracterizado pelo fato de que compreende colocar o fígado do sujeito em contato com um enxerto tipo patch graft compreendendo: (a) uma população mista com dois ou mais tipos de células, em que pelo menos uma delas está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases (MMPs) de matriz associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio em um hidrogel com viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista em direção e para dentro de um tecido alvo; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível biodegradável com viscoelasticidade suficiente para inibir a migração da referida população mista para longe do tecido alvo e por meio do referido suporte ou barreira, e permitindo que as células contidas no enxerto tipo patch graft passem a ser incorporadas no fígado restaurando, assim, alguma função hepática.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio hepático é fibrose hepática, cirrose hepática, hemocromatose, câncer do fígado, atresia biliar, esteatose hepática não alcoólica, hepatite, hepatite viral, hepatite autoimune, fasciolíase, esteatose hepática alcoólica, deficiência de alfa-l- antitripsina, doença do armazenamento de glicogênio tipo II, amiloidoise hereditária relacionada à transtirretina, síndrome de Gilbert, cirrose biliar primária, colangite esclerosante primária, síndrome de Budd-Chiari, trauma hepático ou doença de Wilson.

42. Método de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio pancreático, o método caracterizado pelo fato de que compreende colocar o pâncreas do sujeito em contato com um enxerto tipo patch graft compreendendo: (a) uma população mista com dois ou mais tipos de células, em que pelo menos uma delas está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases (MMPs) de matriz associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio em um hidrogel com viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista em direção e para dentro de um tecido alvo; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível biodegradável com viscoelasticidade suficiente para inibir a migração da referida população mista para longe do tecido alvo e por meio do referido suporte ou barreira, e permitindo que as células contidas no enxerto tipo patch graft passem a ser incorporadas no pâncreas restaurando, assim, alguma função pancreática.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio pancreático é diabetes mellitus, insuficiência pancreática exócrina, pancreatite, câncer pancreático, disfunção do esfíncter de Oddi, fibrose cística, pâncreas divisum, pâncreas anular, trauma pancreático ou hemosuccus pancreaticus.

44, Método de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio gastrointestinal, o método caracterizado pelo fato de que compreende colocar um ou mais dos intestinos do sujeito em contato com um enxerto tipo patch graft compreendendo: (a) uma população mista com dois ou mais tipos de células, em que pelo menos uma delas está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases (MMPs) de matriz associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio em um hidrogel com viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista em direção e para dentro de um tecido alvo; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível biodegradável com viscoelasticidade suficiente para inibir a migração da referida população mista para longe do tecido alvo e por meio do referido suporte ou barreira, e permitindo que as células contidas no enxerto tipo patch graft passem a ser incorporadas no intestino restaurando, assim, alguma função intestinal.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio gastrintestinal é gastroenterite, câncer gastrointestinal, ileíte, doença intestinal inflamatória, doença de Crohn, colite ulcerativa, síndrome do intestino irritável, doença de úlcera péptica, doença celíaca, fibrose, angiodisplasia, doença de Hirschsprung, colite pseudomembranosa ou trauma gastrintestinal.

46. Método de tratamento de um sujeito com uma doença ou distúrbio renal, o método caracterizado pelo fato de que compreende colocar um ou mais dos rins do sujeito em contato com um enxerto tipo patch graft compreendendo: (a) uma população mista com dois ou mais tipos de células, em que pelo menos uma delas está em um estágio de linhagem inicial capaz de expressar metaloproteinases (MMPs) de matriz associadas à membrana e/ou secretadas, a referida população mista apoiada em um meio em um hidrogel com viscoelasticidade suficiente para permitir a migração da referida população mista em direção e para dentro de um tecido alvo; e (b) um suporte que compreende um material biocompatível biodegradável com viscoelasticidade suficiente para inibir a migração da referida população mista para longe do tecido alvo e por meio do referido suporte ou barreira, e permitindo que as células contidas no enxerto tipo patch graft passem a ser incorporadas no rim restaurando, assim, alguma função renal.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a doença ou distúrbio renal é nefrite, nefrose, síndrome nefrítica, síndrome nefrótica, doença renal crônica, lesão renal aguda, trauma renal, doença renal cística, doença renal policística, glomerulonefrite, nefropatia por IgA, nefrite lúpica, câncer renal, síndrome de Alport, amiloidose, síndrome de Goodpasture ou granulomatose de Wegener.