JP2010519934A - 肝細胞の維持、増殖及び/又は分化のためのヒアルロナン、他のマトリックス成分、ホルモン及び増殖因子の複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2007年3月6日出願の米国特許仮出願第60/893,277号の優先権を主張し、その開示の全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
胎児肝。肝組織は、正式認可を受けた代理店(Advanced Biological Resources,San Francisco,CA)により、妊娠の選択的終結によって得られた妊娠18〜22週齢の胎児から提供された。研究プロトコールは、UNCのIRB for Human Research Studiesによって審査され、承認された。
胎児肝。ヒト胎児肝組織を処理するための方法は、以前に、例えばSchmelzer E.et al.2006(Stem Cells)において報告されている。すべての処理及び細胞増殖手順は、0.1%ウシ血清アルブミン(BSA Fraction V、0.1%、Sigma,St.Louis,Mo.)を添加した基礎培地(RPMI 1640)、それぞれ5μg/mlのインスリンと鉄飽和トランスフェリン(Sigma,St.Louis,MO.)、微量元素(亜セレン酸、300pM、及びZnSO4、50pM)、及び抗生物質(AAS,Gibco BRL/Invitrogen Corporation,Carlsbad,California)から構成される細胞洗浄緩衝液中で実施した。肝組織を3mLフラグメントに再分割し(総容量は2−12mLの範囲であった)、IV型コラゲナーゼ及びデオキシリボヌクレアーゼ(Sigma Chemical Co.St Louis,どちらも6mg/mL)を含む細胞洗浄緩衝液25mL中、32ECで頻繁に撹拌しながら15〜20分間消化した。これは細胞凝集物の均質な懸濁液を生じさせ、それを40ゲージのメッシュに通して、1200RPMで5分間遠心した後、細胞洗浄液に再懸濁した。赤血球を、低速遠心分離によって又は懸濁液を抗ヒト赤血球(RBC)抗体(Rockland,No.109−4139)(1:5000希釈)で15分間、37℃で処理し、続いてLowToxモルモット補体(Cedarlane Labs,No.CL4051)(1:3000希釈)で10分間、37℃で処理することによって除去した。トリパンブルー排除法による推定細胞生存能力は常に95%超であった。さらなる詳細については補足データ参照。
肝芽細胞について増殖させたヒト肝前駆細胞の懸濁液を、2.5%ウシ胎児血清(FBS)を添加したHK培地を含むプラスチック上に接種した。37℃、5%CO2で16時間のインキュベーション後、試験の残りの期間中、培地を無血清HK培地に交換した。プラスチック上の細胞を、実験の終了時まで3日ごとに培地を交換して培養した。培養の最初の16時間以内に付着しなかった細胞を、培地交換の時点で吸引した。実験終了時に、HK培地の吸引後にプレートに4%パラホルムアルデヒドを添加して細胞を固定した。
関連蛍光プローブで直接標識した一次抗体を使用して、又は一次抗体の後に蛍光プローブに結合した二次抗体を用いる2段階染色を用いて、細胞を免疫蛍光で染色した(下記の表2参照)。染色の前に、デブリを全て洗い流すために、対象とする部位にリン酸緩衝液(PBS)約1mlをかけた。組織内の非特異的結合部位をブロックするためにヤギ血清(PBS液中10%)を1時間添加した。ブロッキングを取り除き、この部位を1×PBSで洗浄した。モノクローナル抗体を添加し、一晩インキュベートした。4℃で一晩(例えば18時間)インキュベートした後、一次モノクローナル抗体溶液を取り除き、試料を1×PBSで各々10分間ずつ3回洗浄した。二次抗体(Alexa 488又はAlexa 594,Molecular Probes)を1:750又は1:1000の希釈で添加した。試料を遮光し、室温で1時間放置してインキュベートした。試料を1×PBSで3回洗浄し、顕微鏡用のDPX封入剤(Electron Microscopy Sciences) 又はDAPI封入剤を含むVector Shield(Vector Laboratories)のいずれかを用いてカバーガラスで調製した。
ヒアルロナン(平均分子量は、1,500,000)をKraeber GMBH and Co.(Waldhofstr,Germany)より入手した。アジピン酸ジヒドラジド(ADH)及びエチル−3−[3−ジメチルアミノ]プロピルカルボジイミド(EDCI)をSigma−Aldrich(St.Louis,MO)より購入した。これら及び本明細書において開示する他の試薬は多数の供給業者より入手可能であり、それらはすべて本発明に関する実施に適した試薬を供給する。細胞培養用に構成したヒアルロナンマトリックスを、以前に公表されたプロトコールから修正された方法を用いてアルデヒド架橋によって調製した。例えば、Vercruysse KP,et al.,Synthesis and In Vitro Degradation of New Polyvalent Hydrazide Cross−Linked Hydrogels of Hyaluronic Acid.Bioconjugate Chemistry 1997;8:686−694、及びKim A.et al.,Characterization of DNA−hyaluronan matrix for sustained gene transfer.Journal of Controlled Release 2003;90:81−95を参照されたい。これらの開示全体が参照することにより本明細書の一部をなすものとする。
HAヒドロゲルを、培養ウエル、すなわち6穴培養処理ポリスチレン、又はより小さいサイズのヒドロゲルマトリックスについては、チャンバー型カバーグラス培養用スライド (Lab−Tek−Nunc,Napersville,IL)のいずれかに入れた。より小さなヒドロゲルは、あらかじめHK培地に浸す以外は、新たに単離した細胞の接種前に何の操作(プライミング)も必要としなかった。より大きなヒドロゲルについては、ヒドロゲルから気泡を確実に除去するためのわずかな操作が有用であった。ほとんどの場合、ヒドロゲルへHK培地を3ml添加することによって気泡を捕え、ヒドロゲルのわずかな圧縮−弛緩が側面から空気を押し出すことによって、機械的に気泡を除去することができる。
肝芽細胞について増殖させたヒト肝前駆細胞の懸濁液を、2.5%ウシ胎児血清(FBS)を添加したHK培地を含むプラスチック上に接種した。37℃、5%CO2で16時間のインキュベーション後、試験の残りの期間中、培地を無血清HK培地に交換した。プラスチック上の細胞を、実験の終了時まで3日ごとに培地を交換して培養した。培養の最初の16時間以内に付着しなかった細胞は培地交換の時点で吸引した。実験終了時に、細胞を4%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。
アルブミンの生産を酵素結合免疫検定法(ELISA)によって測定した。培地上清を、対照(プラスチック)培養物及びHAヒドロゲルから、4週間の培養期間の間、1日1回又は1日おきに回収した。培養物からの培地を凍結し、分析時まで−20℃で保存した。精製ヒトアルブミンを標準として使用し、ペルオキシダーゼがコンジュゲートされた抗体をアルブミンに対する蛍光プローブとして使用した。測定はSpectromax 250マルチウエルプレートリーダー(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)で行った。
遺伝子特異的mRNAを以下のように作製した。肝からの全RNAをRNeasyキット(Qiagen, Valencia,CA)を用いて抽出し、Superscript II逆転写酵素(Invitrogen)及びオリゴ−dT(12−18)プライマーによって逆転写した。cDNAを従来のPCRにおける鋳型として遺伝子特異的プライマー(配列については下記の表3参照)と共に使用し、そのうち順方向プライマーはT7プロモーター配列に対する5’オーバーハング(5’gac tcg taa tac gac tca cta tag gg)を有していた。この増幅された遺伝子特異的DNAをT7−RNAポリメラーゼ(Promega)を用いたインビトロでの転写のために使用し、遺伝子特異的RNA(T7−RNAポリメラーゼによって加えられた付加的な5’gggを有する)を作製した。この遺伝子特異的RNAを、5’オーバーハングを持たない遺伝子特異的プライマーを用いた定量的RT−PCRにおける標準として使用‘した。標準の範囲は、1〜108鋳型の線状であった。定量的RT−PCRを、LightCycler RNA Master SYBR Green I kitを用いてLightCycler装置(Roche)において実施した。試料からのRNAを、RNeasyミニキット(Qiagen)を用いて抽出した。
Claims (60)
- (a)細胞を提供する工程と、
(b)無血清培地中、並びに他の細胞外マトリックス成分を含む又は含まないヒアルロナンの複合体上であって、及び細胞集団を維持する、増殖させる及び/又は分化させるためのホルモン又は増殖因子を含む又は含まないヒアルロナンの複合体上で前記細胞を培養する工程と
を含む、三次元(3−D)であり、長期的な維持、増殖及び/又は分化を許容する条件下で、細胞をエクスビボで維持する方法。 - 前記細胞が肝幹細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が肝芽細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞がコミットされた前駆細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が成熟細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンが、他の細胞外マトリックス成分及び/又はホルモン若しくは増殖因子と複合体を形成している、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックス成分が、1種以上のコラーゲン(例えばIII型コラーゲン)、1種以上の基底膜接着分子(例えばラミニン)、1種以上のプロテオグリカン若しくはそれらのグリコサミノグリカン鎖(例えばヘパリンプロテオグリカン)、又はそれらの混合物である、請求項6に記載の方法。
- 1種以上のホルモンをさらに含む請求項5に記載の方法。
- 前記ホルモンが、インスリン、トランスフェリン/鉄、トリヨードチロニン、T3、成長ホルモン、グルカゴン、又はそれらの組合せである、請求項8に記載の方法。
- 1種以上の増殖因子をさらに含む請求項5に記載の方法。
- 前記増殖因子が、上皮増殖因子(EGF)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、インターロイキン、白血病阻害因子(LIF)、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)、又はそれらの組合せである、請求項10に記載の方法。
- 前記インターロイキンが、IL−6、IL−11、IL−13、又はそれらの組合せである、請求項11に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンが化学的に架橋されている、請求項1に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンがアルデヒド結合を介して化学的に架橋されている、請求項13に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンがジスルフィド結合を介して化学的に架橋されている、請求項13に記載の方法。
- ジスルフィド結合を介して架橋されたヒアルロナンを含む細胞外マトリックスが、Etracell−LGTMと呼ばれる、請求項15に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスが、1種以上の特定のコラーゲン、基底膜接着分子の1種以上の特定のアイソフォーム、1種以上の種特異的又は組織特異的プロテオグリカン若しくはそれらのグリコサミノグリカン鎖、1種以上のホルモン、及び/又は1種以上の増殖因子、又はそれらの混合物をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が肝から得られる、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞が成人肝細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記肝が胎児肝である、請求項18に記載の方法。
- 前記肝が新生児肝である、請求項18に記載の方法。
- 前記肝が小児肝である、請求項18に記載の方法。
- 前記肝が成人肝である、請求項18に記載の方法。
- 無血清培地がインスリン、トランスフェリン又はその両方を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記無血清培地が、実質的にインスリン、トランスフェリン、脂質、カルシウム、亜鉛及びセレンから成る、請求項1に記載の方法。
- 前記無血清培地が、実質的にインスリン、トランスフェリン、脂質、カルシウム、亜鉛及びセレンから成る、請求項1に記載の方法。
- 前記無血清培地が、インスリン及びトランスフェリン以外のいかなる増殖因子又はホルモンもさらに含まない、請求項1に記載の方法。
- (a)細胞を提供する工程と、
(b)無血清培地中、並びに細胞集団の長期的生存、増殖及び/又は分化を可能にするヒアルロナン上で前記細胞を培養する工程と
を含む、エクスビボで細胞を増殖させる方法。 - 前記細胞が幹細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記細胞が肝芽細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記細胞がコミットされた前駆細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記細胞が成熟肝細胞又は成熟胆管細胞である、請求項28に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスが、1種以上のコラーゲン、1種以上の基底膜接着分子、1種以上のプロテオグリカン若しくはそれらのグリコサミノグリカン(GAG)鎖、1種以上のホルモン、1種以上の増殖因子、又はそれらの組合せをさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン又はV型コラーゲンである、請求項33に記載の方法。
- 前記基底膜接着分子が、ラミニン又はフィブロネクチン又はその両方のアイソフォームである、請求項33に記載の方法。
- 前記プロテオグリカン/GAGが、ヘパリン、ヘパリンプロテオグリカン、コンドロイチン硫酸/コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸/デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸/ヘパラン硫酸プロテオグリカン、又はそれらの組合せである、請求項33に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンが化学的に架橋されている、請求項28に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンがアルデヒド結合を介して化学的に架橋されている、請求項37に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンがジスルフィド結合を介して化学的に架橋されている、請求項37に記載の方法。
- 細胞の細胞培養物、無血清培地、及びヒアルロナンを含む細胞外マトリックス複合体を含む組成物。
- 前記細胞が幹細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞が肝芽細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞がコミットされた前駆細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞が成熟肝細胞又は成熟胆管上皮細胞である、請求項40に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスが、1種以上のコラーゲン、1種以上の基底膜接着分子、1種以上のプロテオグリカン若しくはその/それらのGAG鎖、1種以上のホルモン、1種以上の増殖因子、又はそれらの組合せをさらに含む、請求項40に記載の方法。
- 前記コラーゲンがIII型コラーゲンである、請求項45に記載の方法。
- 前記基底膜接着分子がラミニンである、請求項45に記載の方法。
- 前記プロテオグリカン/GAGが、ヘパリン又はヘパリンプロテオグリカンである、請求項45に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンが化学的に架橋されている、請求項40に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンがアルデヒド結合を介して化学的に架橋されている、請求項49に記載の方法。
- 前記ヒアルロナンがジスルフィド結合を介して化学的に架橋されている、請求項49に記載の方法。
- (a)容器と、
(b)ヒアルロナン並びに、コラーゲン、基底膜接着タンパク質、プロテオグリカン又はそれらのグリコサミノグリカン鎖、ホルモン、及び増殖因子から成る群より選択される少なくとも1つの他の細胞外マトリックス成分を含む不溶性物質と
を含み、前記不溶性物質が前記容器内の懸濁液中に存在するか、前記容器の少なくとも1つの表面を実質的に被覆する、肝前駆細胞の増殖のための容器。 - 前記容器が、組織培養プレート、バイオリアクター、ラボセル(a lab cell)又はラボチップである、請求項52に記載の容器。
- 前記コラーゲンが、I型コラーゲン、III型コラーゲン、IV型コラーゲン、V型コラーゲン、VIII型コラーゲン、XII型コラーゲン、XIII型コラーゲン、又はそれらの組合せである、請求項52に記載の容器。
- 前記基底膜接着タンパク質が、ラミニン又はフィブロネクチンのアイソフォームである、請求項52に記載の容器。
- 前記グリコサミノグリカンが、ヘパリン硫酸、ヘパリン、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、又はそれらの組合せである、請求項52に記載の容器。
- プロテオグリカンの前記グリコサミノグリカン鎖が、ヘパリン硫酸−PG、ヘパリン−PG、コンドロイチン硫酸−PG、デルマタン硫酸−PG、又はそれらの組合せである、請求項52に記載の容器。
- 前記ホルモンが、インスリン、トランスフェリン/鉄、成長ホルモン、トリヨードチロニン、グルカゴン、又はそれらの組合せである、請求項52に記載の容器。
- 前記増殖因子が、上皮増殖因子(EGF)のアイソフォーム、線維芽細胞増殖因子(FGF)のアイソフォーム、トランスフォーミング増殖因子β(TGF−β)のアイソフォーム、肝細胞増殖因子(HGF)のアイソフォーム、白血病阻害因子(LIF)のアイソフォーム、インターロイキン6(IL6)、インターロイキン11(IL11)、インターロイキン13(IL13)、オンコスタチンM、又はそれらの組合せである、請求項52に記載の容器。
- グルココルチコイドがヒドロコルチゾンである、請求項58に記載の容器。
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