ES2725549T3

ES2725549T3 - Sustrato biocompatible para facilitar las interconexiones entre células madre y tejidos diana y métodos para implantarlo

Info

Publication number: ES2725549T3
Application number: ES11807411T
Authority: ES
Inventors: Mark Humayun; Ashish Ahuja; Yu-Chong Tai; David Hinton; Robert Grubbs; Dennis Clegg; Lincoln Vallance Johnson; Sherry T Hikita
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; University of California; University of Southern California USC
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; University of California; University of Southern California USC
Priority date: 2010-07-12
Filing date: 2011-07-12
Publication date: 2019-09-24
Anticipated expiration: 2031-07-12
Also published as: EP2593117B1; US20190151499A1; AU2016204936B2; EP4245370A3; US11154639B2; ES2963295T3; JP7336885B2; US20150147377A1; AU2015200823A1; EP3549617B1; US20120009159A1; EP4245370A2; EP2593117A2; US8808687B2; JP2017217530A; JP2016104791A; JP6215977B2; US10188769B2; JP5876045B2; AU2011279250A1

Abstract

Un sustrato para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o danado, que comprende: un polimero no poroso que esta configurado para su implante en tejido ocular, comprendiendo el polimero: una superficie apical de parileno plana para el crecimiento de celulas que tiene un grosor entre 0,1 y 6 micrometros; y una superficie basal de parileno que comprende caracteristicas de soporte, siendo las caracteristicas de soporte soportes polimericos periodicos que tienen una altura de entre 3 μm y 150 μm y que proporcionan rigidez estructural al sustrato; el sustrato configurado para mantener una poblacion de celulas adecuada para el tratamiento del tejido ocular enfermo o danado tras el implante en una region de tejido ocular enfermo o danado de un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Sustrato biocompatible para facilitar las interconexiones entre células madre y tejidos diana y métodos para implantarlo

Antecedentes

Campo de la invención

La presente solicitud se refiere en líneas generales a sustratos que facilitan la administración de células madre a tejidos diana en el contexto de tratamiento de células madre, así como a herramientas para manipular e implantar dichos sustratos en un tejido diana.

Descripción de la técnica relacionada

El ámbito de la enfermedad humana que implica la pérdida o el daño de células es inmenso e incluye, aunque sin limitación, enfermedad ocular, enfermedad neurodegenerativa, enfermedades endocrinas, cánceres y enfermedad cardiovascular. El tratamiento celular implica el uso de células y, en algunos casos, células madre para tratar tejidos enfermos o dañados. Está ganando terreno rápidamente a las tecnologías que están preparadas para tratar muchas enfermedades, en particular aquellas que afectan a individuos que no son sensibles a tratamientos farmacológicos tradicionales.

De hecho, muchas enfermedades que son candidatas para la aplicación de tratamiento celular no son mortales, pero implican la pérdida de función fisiológica normal. Por ejemplo, las enfermedades oculares a menudo implican degeneración funcional de diversos tejidos oculares, que afecta a la visión y, por tanto, a la calidad de vida de numerosos individuos.

El ojo de mamífero es un órgano sensitivo especializado que puede convertir los fotones entrantes enfocados por óptica anterior (cornea y cristalino) en una señal neuroquímica. Este proceso de fototransducción permite la visión mediante el envío de potenciales de acción a centros corticales superiores mediante el nervio óptico. La retina del ojo comprende fotorreceptores que son sensibles a diversos niveles de luz e interneuronas que transmiten señales desde los fotorreceptores hasta las células de los ganglios retinianos. Estos fotorreceptores son las células más metabólicamente activas en el ojo (sino en el cuerpo) y se ven mantenidas metabólica y funcionalmente por las células epiteliales pigmentadas retinianas (RPE). Estas RPE están ubicadas en una monocapa en el ojo y son críticas para la visión.

Numerosas patologías pueden comprometer o eliminar completamente la capacidad de un individuo de percibir imágenes visuales, incluyendo traumatismo en el ojo, infección, degeneración, irregularidades vasculares y problemas inflamatorios. La parte central de la retina se conoce como mácula, que es responsable de la visión central, la visualización fina y la diferenciación de los colores. La función de la mácula puede verse afectada de forma adversa por degeneración macular senil (húmeda o seca), edema macular diabético, neovascularización coroidal idiopática, degeneración macular por elevada miopía o retinitis pigmentosa avanzada, entre otras patologías.

La degeneración macular senil normalmente causa una pérdida de visión en el centro del campo visual. La degeneración macular se produce en la forma "húmeda" y "seca". Tomadas en conjunto, estas enfermedades afectan a aproximadamente 1,75 millones de personas solamente en los EE. UU. Se espera que la prevalencia de los individuos que quedan ciegos por AMD aumente a más de 2,95 millones en 2020. (Véase, por ejemplo, Friedman, DS et al., Prevalence of age-related macular degeneration in the United States. Arch Ophthalmol 2004; 122:564-72). En la forma seca, los desechos celulares (drusa) se acumulan entre la retina y la coroides, el suministro sanguíneo desde la retina exterior, debido a la incapacidad de las células RPE enfermas de fagocitar los segmentos de disco exterior desprendidos de los fotorreceptores (PR). Los lípidos endurecidos resultantes (lipofuscina) impiden el intercambio recíproco de nutrientes y productos residuales entre la retina y la coroides, y dan lugar a muerte de los PR. En la forma húmeda más grave, los vasos sanguíneos recién formados desde la coroides se infiltran en el espacio por detrás de la mácula. Las paredes de estos vasos recién formados son mecánicamente débiles y extremadamente susceptibles a rotura. La hemorragia habitualmente produce pérdida de visión de forma extremadamente rápida en comparación con AMD seca. Junto con la pérdida de las células funcionales en el ojo, los vasos sanguíneos recién formados son frágiles y a menudo filtran sangre y líquido intersticial, que puede dañar adicionalmente la mácula.

Aunque las enfermedades que causan daños a células o tejidos específicos son claros candidatos para tratamiento celular, sigue existiendo una necesidad en la técnica de métodos, sustratos y herramientas para mejorar la eficacia del tratamiento celular. El documento US 2005/0214345 (Leng et al.) divulga un implante de retina que comprende una única capa de un material biocompatible artificial que tiene poros para permitir la difusión a través del material, y fisuras superficiales para permitir el anclaje de procesos celulares. Wang et al., (2010) J. Microelectromechanical Systems 19(2): 367-374 divulga la fabricación y caracterización de una matriz de microelectrodos tridimensional basada en parileno para su uso en prótesis de retina.

Sumario

La invención proporciona un sustrato para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende:

un polímero no poroso que tiene un eje corto y un eje largo y que está configurado para su implante en tejido ocular, comprendiendo el polímero:

una superficie apical de parileno plana para el crecimiento de células

que tiene un grosor entre 0,1 y 5 micrómetros; y

una superficie basal de parileno que comprende características de soporte, siendo las características de soporte soportes poliméricos periódicos que tienen

una altura entre 1 |jm y 500 |jm y que proporcionan rigidez estructural al sustrato;

el sustrato configurado para mantener una población de células adecuada para el tratamiento del tejido ocular enfermo o dañado tras el implante en una región de tejido ocular enfermo o dañado de un sujeto.

Muchos tejidos son estructural o funcionalmente dinámicos porque los tejidos se flexionan durante la función normal, están sometidos a flujo de fluidos u otras tensiones de corte, o tienen numerosos tipos celulares especializados en cercana yuxtaposición, limitando de ese modo la selección de sitios diana para el suministro de células. Por tanto, el tratamiento celular puede requerir dispositivos específicos y métodos para administrar células a un tejido diana que potencien la actividad y los efectos beneficiosos de las células administradas en el tejido diana durante un periodo prolongado de tiempo. Dependiendo del tipo de enfermedad, el sitio de administración, el avance de la patología y el tipo y transcurso de tiempo de la integración requerida entre el injerto y el hospedador, los dispositivos y métodos para el tratamiento celular requieren especificaciones que optimizan la seguridad y la eficacia del agente terapéutico específico.

En varias realizaciones, se proporciona un sustrato para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende un polímero no poroso que tiene una superficie apical y basal, en el que el sustrato está configurado para mantener una población de células adecuadas para el tratamiento de tejido ocular enfermo o dañado y, en el que, tras el implante en un sujeto, el sustrato mantiene la población de células durante un periodo de tiempo suficiente para el tratar el tejido ocular enfermo o dañado.

En varias realizaciones, la superficie apical del sustrato es sustancialmente homogénea y adecuada para el crecimiento de células sobre el mismo. En algunas realizaciones, el grosor de la superficie apical sustancialmente homogénea varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 micrómetros. En una realización, el grosor de la superficie apical sustancialmente homogénea es entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 0,5 micrómetros. En algunas realizaciones, la superficie apical sustancialmente homogénea es rugosa o está tratada de otro modo para permitir que una población de células tenga una superficie que no sea plana para crecer sobre la misma. La superficie apical sustancialmente homogénea, por lo tanto, no tiene que ser completamente uniforme en todas las realizaciones. En su lugar, varias realizaciones comprenden superficies apicales que no son uniformes, aunque aún son sustancialmente homogéneas. En varias realizaciones, el grosor de la superficie apical sustancialmente homogénea para el crecimiento de células impide el paso de proteínas más grandes de aproximadamente 60 kDa a través del sustrato. El grosor puede alterarse en diferentes realizaciones dependiendo del tipo celular y el tamaño de proteínas que tienen que restringirse (o permitirse). La dimensión a medida permite el paso de nutrientes a través del sustrato (o la eliminación de subproductos metabólicos a través del sustrato).

En varias realizaciones, la superficie basal no es homogénea. En una realización, la superficie basal comprende una pluralidad de características de soporte yuxtapuestas con la superficie apical. En una realización, hay una única característica de soporte continua presente. En otras realizaciones, se proporcionan múltiples características de soporte. Las características de soporte proporcionan suficiente estructura al sustrato para permitir el implante quirúrgico, pero no tanta rigidez como para que el sustrato se arrugue o se pliegue de otro modo durante el proceso de implante. En varias realizaciones, la altura de las características de soporte varía de aproximadamente 3 jm a aproximadamente 150 jm . En una realización, las características de soporte varían de aproximadamente 3 jm a aproximadamente 8 jm . En algunas realizaciones, el sustrato es oblongo (por ejemplo, más largo que ancho) y, en algunas de dichas realizaciones, las características de soporte discurren longitudinalmente a lo largo del eje largo del sustrato. De esta manera, proporcionan rigidez estructural a lo largo del eje largo, pero permiten flexibilidad a lo largo del eje más corto. En otras realizaciones, las características de soporte comprenden columnas de cualquier forma geométrica apropiada. En algunas realizaciones, el sustrato es redondo, en algunas realizaciones, el sustrato es cuadrado y, en algunas realizaciones, el sustrato es rectangular. En una realización, la longitud y la anchura del sustrato cada una varía de aproximadamente 0,3 mm a aproximadamente 7 mm.

En varias realizaciones, los bordes exteriores y las esquinas del sustrato son redondeadas, para minimizar el riesgo de daño al sustrato durante el implante (por ejemplo, quedarse atrapado o enganchado al tejido durante el implante).

En algunas realizaciones, la superficie apical sustancialmente homogénea comprende además un labio elevado que rodea la superficie, en la que el labio elevado tiene una altura que varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 micrómetros y una anchura que varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 micrómetros. En varias realizaciones, el labio sirve no solamente para proteger las células que crecen sobre el sustrato, sino también para reducir el traumatismo al tejido durante el implante.

En varias realizaciones, el polímero no poroso que comprende el sustrato no es biodegradable. En varias realizaciones, el polímero no poroso se selecciona del grupo que consiste en parileno A, parileno AM, parileno C, parileno tratado con amoniaco, parileno X, parileno N, cualquiera de los polímeros anteriores recubierto con polidopamina, cualquiera de los polímeros anteriores recubierto con matrigel, cualquiera de los polímeros anteriores recubierto con vitronectina y cualquiera de los polímeros anteriores recubierto con retronectina.

En una realización, el polímero no poroso está tratado con oxígeno. En una realización, el polímero no poroso es parileno C recubierto con uno o más de matrigel, vitronectina y retronectina. En una realización, los polímeros tratados con oxígeno están recubiertos con uno o más de matrigel, vitronectina y retronectina (o combinaciones de los mismos). En otras realizaciones, también pueden usarse alternativas a matrigel, vitronectina y retronectina en lugar de o además de matrigel, vitronectina y retronectina. Asimismo, pueden emplearse otros tratamientos modificadores (además de o en lugar de tratamiento con oxígeno).

Se divulga que un polímero no poroso puede ser un polímero biodegradable, tal como PLGA, polietilenglicol modificado y policaprolactona.

En más realizaciones adicionales, se usan combinaciones de polímeros biodegradables y no biodegradables.

En varias realizaciones, los sustratos divulgados en este documento están configurados para mantener una población de células epiteliales pigmentadas retinianas (RPE). En una realización, las células epiteliales pigmentadas retinianas son células RPE derivadas de células madre embrionarias humanas. En varias realizaciones, después de sembrar un sustrato con RPE (u otras células madre), el sustrato sembrado con células es adecuado para su implante en el espacio subretiniano del ojo de un sujeto, tratando de ese modo una enfermedad degenerativa de la retina exterior. En varias realizaciones, los sustratos son adecuados para su implante para tratar una o más enfermedades degenerativas de la retina exterior (incluyendo, aunque sin limitación) AMD seca, AMD húmeda, enfermedad de Stargardt y amaurosis congénita de Leber.

En varias realizaciones, también se proporciona un sustrato para el tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende un polímero no poroso, en el que el sustrato comprende una superficie apical sustancialmente homogénea para el crecimiento de una población de células RPE derivadas de células madre embrionarias humanas, en la que el grosor de la superficie apical sustancialmente homogénea varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 micrómetros, en el que la superficie apical sustancialmente homogénea se seleccionadas del grupo que consiste en parileno A, parileno AM, parileno tratado con amoniaco y parileno C, en el que el sustrato comprende una superficie basal no homogénea que comprende características de soporte yuxtapuestas con la superficie apical sustancialmente homogénea, en el que la superficie basal no homogénea comprende un polímero seleccionadas del grupo que consiste en parileno A, parileno AM, parileno tratado con amoniaco y parileno C, en el que una o más de la superficie apical sustancialmente homogénea y la superficie basal no homogénea se trata con uno o más de matrigel, poli-L-dopamina, vitronectina o retronectina, en el que la altura de las características de soporte varía de aproximadamente 3 |jm a aproximadamente 150 |jm; y en el que, tras el implante en un sujeto, el sustrato mantiene la población de células durante un periodo de tiempo suficiente para el tratar el tejido ocular enfermo o dañado. En algunas realizaciones, una o más de la superficie apical sustancialmente homogénea y la superficie basal no homogénea se trata con oxígeno.

En varias realizaciones, se proporciona un sustrato para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende un polímero biodegradable no poroso, en el que el sustrato comprende una superficie apical sustancialmente homogénea que tiene un grosor de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 micrómetros para el crecimiento de células, en el que el sustrato comprende una superficie basal sustancialmente homogénea yuxtapuesta con la superficie apical sustancialmente homogénea, en el que el sustrato está configurado para mantener una población de células adecuadas para el tratamiento de tejido ocular enfermo o dañado y, en el que, tras el implante en un sujeto, el sustrato mantiene la población de células durante un periodo de tiempo suficiente para el tratar el tejido ocular enfermo o dañado.

En una realización, el sustrato sembrado con células es adecuado para su implante en el espacio subretiniano del ojo de un sujeto. En una realización, el sustrato se siembra con células RPE y, en el que, después del implante, las células RPE en el sustrato encajan funcionalmente con los segmentos exteriores de los fotorreceptores del ojo del sujeto.

En este documento se divulga un método de tratamiento de un sujeto que tiene enfermedad degenerativa de la retina exterior, que comprende: colocar quirúrgicamente un sustrato que comprende un polímero no poroso que tiene una superficie apical y basal, en el que la superficie apical se siembra con una población de células en una posición yuxtapuesta a los segmentos externos de los fotorreceptores en el ojo del sujeto, tratando de ese modo la enfermedad degenerativa. El sustrato puede colocarse quirúrgicamente en el espacio subretiniano o adyacente al lado epirretiniano de la retina de un ojo del sujeto.

En varias realizaciones, las células a sembrar en el sustrato son células RPE. Las células RPE pueden mantener funcional y/o metabólicamente los fotorreceptores dañados o enfermos, tratando de ese modo la enfermedad degenerativa. Las células RPE pueden mantener funcional y metabólicamente los fotorreceptores sanos también. Las RPE pueden mantener los fotorreceptores mediante encajes metabólicamente funcionales con los segmentos externos de los fotorreceptores.

El sustrato puede usarse para tratar enfermedades degenerativas de la retina externa que incluyen, aunque sin limitación, AMD seca, a Md húmeda, enfermedad de Stargardt y amaurosis congénita de Leber, y retinitis pigmentosa.

En varias realizaciones, se proporciona un sustrato para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende un polímero no poroso que tiene una topología de superficie apical rugosa para el crecimiento de células y una superficie basal no homogénea que comprende características de soporte yuxtapuestas con la topología de superficie apical rugosa, en el que el sustrato está configurado para mantener una población de células adecuadas para el tratamiento de tejido ocular enfermo o dañado y, en el que, tras el implante en un sujeto, el sustrato mantiene la población de células durante un periodo de tiempo suficiente para el tratar el tejido ocular enfermo o dañado. En varias realizaciones, el sustrato se fabrica en un marco de sustrato que comprende una pluralidad de sustratos.

En algunas realizaciones, el grosor de la superficie apical sustancialmente homogénea varía de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 4 micrómetros. En varias realizaciones, el grosor de la superficie apical sustancialmente homogénea para el crecimiento de células impide el paso de proteínas más grandes de aproximadamente 75 kDa a través del sustrato. En algunas realizaciones, la superficie apical sustancialmente homogénea comprende además un labio elevado que rodea la superficie. En algunas de dichas realizaciones, el labio elevado tiene una altura que varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 micrómetros y una anchura que varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 1000 micrómetros. Otras realizaciones no tienen un labio. En algunas realizaciones, la altura de las características de soporte varía de aproximadamente 3 |jm a aproximadamente 150 |jm.

Se divulga que el polímero no poroso puede ser biodegradable o no biodegradable. Un polímero biodegradable puede ser policaprolactona modificada con polietilenglicol, PLGA, silicona modificada con gelatina o un polímero anhídrido. En varias realizaciones, el polímero no poroso se seleccionadas del grupo que consiste en parileno A, parileno AM, parileno C, parileno C tratado con amoniaco y/u oxígeno (con el fin de añadir grupos funcionales y hacer que la superficie sea rugosa) y parileno C tratado con polidopamina, vitronectina, retronectina o matrigel. En una realización, el polímero no poroso comprende parileno A^mtratado con polidopamina y la superficie basal no homogénea comprende parileno. En una realización, el sustrato está configurado para mantener una población de células epiteliales pigmentadas retinianas (RPE). En una realización, las células epiteliales pigmentadas retinianas son células RPE derivadas de células madre embrionarias humanas.

En varias realizaciones, el sustrato es adecuado para que se siembre sobre su superficie apical sustancialmente homogénea células seleccionadas del grupo que consiste en: células RPE, RPE y fotorreceptores, células gliales de Müller, células ganglionares, una mezcla de células gliales de Müller y células ganglionares, células endoteliales de la córnea, una mezcla de células endoteliales de la córnea y colágeno, células epiteliales de la córnea, una mezcla de células epiteliales de la córnea y colágeno, células endoteliales, pericitos, una mezcla de células endoteliales y pericitos.

Se divulga que un sustrato sembrado con células puede implantarse en el espacio subretiniano del ojo de un sujeto. Las células RPE pueden encajarse con los segmentos externos de los fotorreceptores del ojo del sujeto. Las células RPE pueden encajarse con la capa nuclear externas de los fotorreceptores.

Un sustrato sembrado con células puede implantarse adyacente al lado epirretiniano de la retina del ojo de un sujeto. Un sustrato sembrado con células puede implantarse adyacente al tejido de la córnea del ojo de un sujeto.

El sustrato sembrado con células puede ser adecuado para tratamiento celular para el tratamiento de AMD seca, para el tratamiento de enfermedad de la córnea, para el tratamiento de glaucoma, para el tratamiento de retinopatía diabética, para el tratamiento de oclusiones de la vena retiniana, para el tratamiento de AMD húmeda y/o para el tratamiento de retinitis pigmentosa. También pueden tratarse otras enfermedades oculares con dichos sustratos. En este documento se divulga un sustrato para preparar células para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende un polímero no poroso que comprende una superficie apical sustancialmente homogénea para el crecimiento células en una monocapa interconectada de células, en el que antes del suministro a un sujeto, la monocapa interconectada de células se desprende del sustrato y la monocapa se implanta en el sujeto, tratando de ese modo el tejido ocular enfermo o dañado.

En varias realizaciones, se proporciona un sustrato para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende un polímero no poroso, permeable, y no biodegradable seleccionado del grupo que consiste en parileno A, parileno AM, parileno grabado con amoniaco y parileno acoplado con polidopamina configurado para formar una superficie apical rugosa para el crecimiento de células, en el que la superficie apical sustancialmente homogénea está recubierta con uno o más arginina-glicina-ácido aspártico cíclico o lineal o una matriz sintética de crecimiento, y una superficie basal no homogénea que comprende características de soporte yuxtapuestas con la superficie apical sustancialmente homogénea. En varias realizaciones, el sustrato está configurado para mantener una población de células adecuadas para el tratamiento de tejido ocular enfermo o dañado y, tras el implante en un sujeto, el sustrato mantiene la población de células durante un periodo de tiempo suficiente para el tratar el tejido ocular enfermo o dañado. Se divulga que el grosor de la superficie apical sustancialmente homogénea puede variar de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 6 micrómetros, y la altura de las características de soporte puede variar de aproximadamente 3 |jm a aproximadamente 150 |jm.

En este documento se divulga un sistema para preparar un sustrato para tratamiento celular, que comprende: un marco de sustrato polimérico que comprende una pluralidad de sustratos individuales y un dispositivo para mantener temporalmente el marco de sustrato en una posición fija dentro un recipiente de cultivo.

Los sustratos individuales pueden tener la capacidad de retirarse individualmente del marco de sustrato. El dispositivo puede estar configurado para evitar el crecimiento de células en al menos una parte de cada uno de la pluralidad de sustratos individuales, y puede estar configurado para permitir la retirada selectiva de un sustrato individual del marco de sustrato.

El marco de sustrato polimérico y los sustratos individuales pueden comprender un polímero no biodegradable, o el marco de sustrato polimérico y los sustratos individuales pueden comprender un polímero biodegradable.

Se divulga que los sustratos pueden retirarse cortando una parte del sustrato que conecta el sustrato al marco de sustrato. El dispositivo configurado para evitar el crecimiento de células puede comprender una abertura a través de la que puede cortarse la parte del sustrato.

En este documento se divulga un método de tratamiento de un sujeto que tiene enfermedad degenerativa de la retina exterior, que comprende colocar quirúrgicamente un sustrato como se divulga en este documento en una posición yuxtapuesta a la capa nuclear externa de los fotorreceptores en el ojo del sujeto. Las células RPE sembradas en el sustrato pueden mantener los fotorreceptores, tratando de ese modo la enfermedad degenerativa. En este documento se divulga una cesta de sustrato implantable tridimensional para tratamiento celular para tratar enfermedad degenerativa de la retina externa. La cesta de sustrato puede comprender una cubierta exterior que tiene uno o más poros en la misma y configurada para formar una luz interior que está configurada para recibir células madre. Los poros pueden estar configurados para retener el uno o más tipos de células madre dentro de la luz interior, mientras se permite una interacción entre uno o más tipos de células madre y las células del tejido diana. En este documento se divulga un método para tratar degeneración de la retina, que comprende cultivar una pluralidad de células madre, recoger las células madre, implementar las células madre cultivadas en una cesta de sustrato polimérico tridimensional, implantar la cesta en un tejido diana.

La cubierta exterior del sustrato puede ser polimérica. El sustrato puede comprender además una característica de reporte. La característica de reporte puede comprender tecnología de sistemas microelectromecánicos (MEMS). La característica de reporte de MEMS puede informar a un usuario respecto a la viabilidad de las células alojadas dentro del sustrato.

Las células son células RPE y el tejido diana es la mácula que se ha dañado por degeneración macular senil u otra enfermedad ocular. La permeabilidad del sustrato se define únicamente por el grosor del sustrato biocompatible. Los poros pueden ser de entre 0,5 y 1,5 jm . La cubierta exterior puede comprender policaprolactona. La cubierta de policaprolactona puede comprender además uno o más de ^pE^gy arginina-glicina-asparagina. Los poros pueden generarse exponiendo el sustrato polimérico a un medio acuoso.

En este documento se divulga un método de fabricación de una cesta de sustrato tridimensional para tratamiento celular, que comprende preparar un sustrato para el crecimiento de células, generar poros dentro del sustrato y esterilizar el sustrato. Pueden cultivarse uno o más tipos de células madre en el sustrato y, después de ello, una cesta de sustrato tridimensional puede alinearse y sellarse, conteniendo de ese modo las células.

En este documento se divulga un método de fabricación de una cesta de sustrato tridimensional para tratamiento celular, que comprende preparar dos moldes correspondientes a la parte superior e inferior de la cesta de sustrato tridimensional y configurados para formar una luz interior tras el ensamblaje, polimerizar una solución polimérica en cada parte del molde, generar poros dentro de la parte superior y/o inferior del sustrato; y sellar la parte o partes restantes de la cesta de sustrato con el sustrato, creando de ese modo una cesta de sustrato tridimensional para tratamiento celular. La cesta de sustrato puede esterilizarse y sellarse, y después las células pueden suministrarse a la luz interior antes del implante.

La cesta de sustrato puede suministrarse al espacio subretiniano de un individuo que tiene enfermedad degenerativa de la retina, y la cesta de sustrato puede retener las células madre en la cesta de sustrato después del implante, pero también permite procesos de las células retinianas que pasan a través de los poros e interactúan con los fotorreceptores en el espacio subretiniano. La cesta de sustrato puede suministrarse al espacio subretiniano de un individuo que tiene enfermedad degenerativa de la retina, y la cesta de sustrato puede retener las células madre después del implante, pero también permite la interacción química y celular entre las células encapsuladas y los fotorreceptores mediante los poros de la cesta de sustrato. La interacción puede mantener los fotorreceptores, tratando de ese modo la degeneración de la retina. La interconexión puede comprender además una o más células del espacio subretiniano del individuo que pasan a través de los poros e interactúan con la cesta de sustrato o las células. La cesta de sustrato puede implantarse mediante una aproximación quirúrgica desde el interior. La cesta de sustrato puede implantarse mediante una aproximación quirúrgica desde el exterior. El individuo afectado con degeneración de la retina puede ser un mamífero, tal como se un ser humano. Las células madre pueden implementarse en la cesta de sustrato inmediatamente antes del implante.

Breve descripción de los dibujos

Las fig. 1A-1B representan estructuras de sustrato generales de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

Las fig. 2A-2B representan vistas internas de varias realizaciones divulgadas en este documento. La fig. 2A representa una vista lateral de una estructura de sustrato de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento. La fig. 2B representa una vista interna de una estructura de cesta de sustrato de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

La fig. 3 representa una vista transversal de un sustrato de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

La fig. 4 representa una representación de una cesta de sustrato con cámaras personalizables de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

La fig. 5 representa una representación del campo visual de un paciente usado en la fabricación de una cesta de sustrato personalizada de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

La fig. 6 representa un ejemplo de un mapa de escotoma usado para construir un sustrato ocular personalizado. La fig. 7 representa una cubierta de molde usada en varias realizaciones de fabricación de un sustrato personalizado.

La fig. 8 representa un ejemplo de un sustrato fabricado personalizado construido de acuerdo con métodos divulgados en este documento.

La fig. 9 representa la carga de células de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento. La fig. 10 representa una sección transversal de un sustrato de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

Las fig. 11A-11B representan la similitud entre células RPE derivadas de hESC cultivadas (fig. 11A) y células RPE adultas (fig. 11B).

Las fig. 12A-12B representan características de RPE-hESC cultivadas. La fig. 12A muestra la microscopia electrónica de barrido de RPE-hESC polarizadas que muestra la especialización apical y las microvellosidades. La fig. 12B representa la actividad fagocítica de hESC similar a la de RPE fetales nativas humanas.

Las fig. 13A-13C representan la visualización de células RPE después del implante. La fig. 13A representa una fotografía del fondo de rata que muestra RPE-PLGA una semana después del implante en el espacio subretiniano; La fig. 13B representa un barrido OCT que revela la lámina de RPE-PLGA (flecha blanca); La fig.

13C representa la imagen OCT a través de la zona sin trasplante.

Las fig. 14A-B representan RPE-hESC trasplantadas en el espacio subretiniano de ratas RCS. La fig. 14A representa la tinción nuclear (DAPI) de fotorreceptores conservados (ONL) en la zona trasplantada en comparación con la zona sin trasplante adyacente (FIG. 14B).

Las fig. 15A-15B representan el crecimiento de células sobre diversos sustratos de acuerdo con varias realizaciones de este documento. La fig. 15A representa RPE-hESC en PLGA por microscopia electrónica de barrido (sección transversal). La fig 15B muestra el crecimiento de parileno modificado en superficie con RPE-hESC.

Las fig. 16A-16B representan las imágenes SDOCT de alta resolución de la retina usadas en varias realizaciones divulgadas en este documento.

Las fig. 17A-17B representan vistas superiores y laterales, respectivamente, de una cesta de sustrato de múltiples cámaras, que comprende un sustrato usado para suministrar células de acuerdo con varias realizaciones de este documento. El sustrato puede ser degradable o no degradable, lo que facilita la interacción entre las células en las cámaras superior e inferior mediante especificaciones de material definidas. En algunas realizaciones, la tasa de degradación y el grosor del material puede depender del tiempo requerido para que las células en ambas cámaras se implanten en la ubicación diana y generen conexiones sinápticas valiosas con, o permitan el intercambio de nutrientes recíproco apropiado entre células proximales.

Las fig. 18A-18D representan diversas realizaciones de diseños de sustrato en marcos de sustrato.

Las fig. 19A-19B representan vistas superiores de diversas formas de sustrato de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

Las fig. 20A-20F representan diversos sustratos divulgados en este documento y datos de permeabilidad relacionados. Se muestra en la fig. 20A una vista lateral de un sustrato asimétrico que tiene una superficie apical homogénea 100 y una superficie basal no homogénea que comprende estructuras de soporte de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento. Algunas realizaciones comprenden además un labio que rodea la superficie apical 120 (véase la fig. 20B). Algunas realizaciones comprenden además un recubrimiento sobre la superficie de crecimiento celular (fig. 20C-20D). La manipulación del grosor del sustrato permite afinar la exclusión de amaño molecular y la difusión (fig. 20E y 20F, respectivamente).

Las fig. 21A-21C representan diversas realizaciones de sustrato divulgadas en este documento. La fig. 21A representa una imagen de microscopio electrónico de barrido de la superficie apical plana de una realización de un sustrato descrito en este documento. La fig. 21B representa una imagen de microscopio electrónico de barrido de la superficie de soporte inferior de una realización de un sustrato. La fig. 21C representa un crecimiento de células madre sobre la superficie apical plana de un sustrato.

La fig. 22A representa una realización adicional del diseño de sustrato en un marco de sustrato.

La fig. 22B representa una realización de un dispositivo usado para alojar un marco de sustrato y cortar sustratos individuales del marco.

Las fig. 23A-23D representan resultados histológicos del implante de un sustrato sembrado con células madre implantado en el ojo de una rata.

La fig. 24 representa microscopia electrónica de transmisión de células RPE implantadas en el ojo de una rata distrófica a los 9 días después del implante.

La fig. 25 representa microscopia electrónica de transmisión de células RPE implantadas en el ojo de una rata distrófica a los 58 días después del implante. El encaje es visible entre las microvellosidades de ^rP^ey los discos de segmento externo de los fotorreceptores.

La fig. 26 representa microscopia electrónica de transmisión de células RPE implantadas en el ojo de una rata distrófica a los 58 días después del implante. El encaje es visible entre las microvellosidades de ^rP^ey los discos de segmento externo de los fotorreceptores.

La fig. 27 representa microscopia electrónica de barrido de células RPE que crecen sobre la superficie apical de un sustrato de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

Las fig. 28A-28C representan imágenes de inmunohistoquímica fluorescente de células RPE sembradas sobre un sustrato polimérico de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento.

Las fig. 29A-29C representan imágenes de inmunohistoquímica fluorescente adicionales de células RPE sembradas sobre un sustrato polimérico de acuerdo con varias realizaciones divulgadas en este documento. La fig. 30 representa los datos de nistagmo optocinético (OKN) recogidos de ratas ciegas transgénicas normales no tratadas, y de ratas ciegas transgénicas tratadas después de una inyección en bolo de células RPE en el espacio subretiniano del ojo de las ratas.

La fig. 31 representa los datos de OKN recogidos de ratas ciegas transgénicas normales no tratadas, y de ratas ciegas transgénicas tratadas después del implante de un sustrato sembrado con células RPE en el espacio subretiniano del ojo de las ratas, como se divulga en este documento.

La fig. 32 representa evidencias de encaje funcional (por detección de rodopsina) entre fotorreceptores y células RPE sembradas sobre un sustrato e implantadas en el ojo de una rata ciega transgénica.

Descripción detallada

El tratamiento celular, la introducción de nuevas células en un tejido para tratar una enfermedad, representa un método posible para reparar o remplazar tejido enfermo con tejido sano. Muchas estrategias implican la administración de células (por ejemplo, células madre) a un tejido diana, que a menudo produce bajas tasas de retención e incidencia disminuida de persistencia a largo plazo de las células trasplantadas (o implantadas). Esto puede deberse a diversos factores, incluyendo la eliminación de células y/o bajas tasas de supervivencia celular en el medio de suministro. Sin embargo, algunas enfermedades no requieren el suministro o injerto de las células per se, sino que en su lugar pueden requerir factores de crecimiento, señales químicas u otras interacciones con las células suministradas. Varias realizaciones divulgadas en este documento se refieren al tratamiento de dichas enfermedades y, por tanto, comprenden sustratos configurados para suministrar los efectos beneficiosos de las células (incluyendo físicos, químicos u otra interacción) mientras se retienen las células dentro del sustrato.

En particular, varias realizaciones se refieren a sustratos en que se depositan células madre en o sobre el sustrato antes de la administración del sustrato a un sujeto de tratamiento celular, y que funcionan, después de la administración, reteniendo las células dentro o sobre el sustrato mientras se facilita simultáneamente una interacción física entre las células madre dentro o sobre el sustrato y partes del tejido diana. En varias realizaciones en particular, las células madre depositadas dentro o sobre el sustrato proporcionan efectos de soporte para las células dañadas o enfermas de un tejido diana, incluyendo, aunque sin limitación, interacción física célula-célula, liberación de nutrientes o factores de crecimiento al tejido diana, atracción de otros tipos celulares y similares. En varias realizaciones, los efectos beneficiosos incluyen una o más de secreción de factores de crecimiento que mantienen la integridad estructural del endotelio coriocapilar y fotorreceptores (por ejemplo, PEDF y VEGF), supresión de factores inmunosupresores que ayuda al estado inmunoprivilegiado del ojo (que ayuda a suprimir la infiltración de células inmunitarias en el ojo), secreción de factores neurotróficos, beneficios metabólicos (por ejemplo, intercambio de glucosa y ácidos grasos), beneficios funcionales (por ejemplo, suministro de retinol, fagocitosis de segmentos de disco externo desprendidos y/o la reisomerización y restauración de pigmentos visuales después de fotoblanqueo) o soporte de actividad neural. En algunas realizaciones, el soporte de actividad neural se produce mediante encaje de las células dentro o sobre el sustrato con células de tejido diana. Por ejemplo, en una realización, las microvellosidades apicales de las células epiteliales pigmentadas retinianas dentro de un sustrato implantado encajan con fotorreceptores del hospedador, incurriendo de ese modo en un efecto beneficioso sobre los fotorreceptores. En varias realizaciones, el beneficio es mediante formación de sinapsis (por ejemplo, célula PR/bipolar) u otro soporte físico o químico de viabilidad celular general). En varias realizaciones, se produce uno o más de estos beneficios mientras se retiene parcial o completamente los somas celulares dentro o sobre el sustrato. En algunas realizaciones, las células de los tejidos hospedadores se proyectan o infiltran en el sustrato mediante el acceso biológico presente en algunas realizaciones del sustrato. Por ejemplo, en algunas realizaciones, nuevos vasos sanguíneos o tejido fibroso sobresalen al interior del sustrato. En algunas realizaciones, estas protuberancias ayudan a anclar el sustrato, mientras que en otras realizaciones, se logran otros efectos beneficiosos (por ejemplo, suministro de nutrientes, suministro de sangre). Por tanto, como se usa en este documento, al término "interacción" se le debe dar su significado habitual y también debe referirse a una interconexión unidireccional (células implantadas al tejido diana o tejido diana a las células implantadas) entre células o una interconexión bidireccional (se produce tanto de células implantadas a tejido diana como de tejido diana a células implantadas).

Además, en algunas realizaciones, se proporcionan métodos para fabricar un sustrato personalizado para tratar un tejido dañado o enfermo de un individuo, usando tratamiento de células madre personalizado.

Los sustratos proporcionados son no porosos (por ejemplo, no tienen un orificio o acceso), pero son permeables. Varias de estas realizaciones controlan la permeabilidad del sustrato basándose en cambios en el grosor del sustrato. También se divulga que los sustratos pueden ser porosos; o tanto permeables como porosos, facilitando la permeabilidad y la porosidad las interconexiones entre las células implantadas y las células nativas. En varias realizaciones, el sustrato se configura para recibir células y colocar las células recibidas de una manera óptima para facilitar la regeneración de un tejido diana dañado o enfermo. En algunas realizaciones, los sustratos tienen características específicas (por ejemplo, tamaños, formas, porosidad) que retienen las células dentro del sustrato, promueven simultáneamente la interacción física, química u otra interacción entre las células y el tejido diana. Como se usa en el presente documento, al término "promover" se dará su significado habitual y también se leerá indicando posibilitar, potenciar, permitir, facilitar, fomentar, impulsar, inducir y sinónimos de los mismos. En algunas realizaciones, se proporciona un sustrato no biodegradable. En algunas realizaciones, el sustrato es parcialmente biodegradable y parcialmente no biodegradable. En varias realizaciones, son particularmente ventajosos sustratos completamente no biodegradable, ya que su colocación respecto a las células implantadas evita el acceso de las células inmunitarias en el sitio del trasplante y reduce el riesgo de infección. Además, en varias realizaciones, un sustrato no biodegradable permite la identificación y explante de las células trasplantadas si se requiere la eliminación o remplazo de las células (por ejemplo, "dosis" adicionales de células). En varias realizaciones, los sustratos en este documento se fabrican como un sistema microelectromecánico (MEMS). En varias realizaciones, las células suministradas y retenidas dentro del sustrato son células madre. En varias realizaciones, el sustrato, y las células retenidas en el mismo, se usan para tratar el daño asociado con una enfermedad, tal como degeneración ocular, cardiopatía, enfermedad vascular y similares.

Sustratos

Como se analiza anteriormente, la diversidad de enfermedades que da lugar a daño o pérdida de función de tipos celulares particulares es inmensa y representa un área de medicina que necesita estrategias de tratamiento que vayan más allá de las estrategias quirúrgicas o farmacológicas típicas. Para abordar esta necesidad, el tratamiento celular implica el uso de células y, en algunos casos, células madre embrionarias humanas o cordón umbilical, derivadas de placenta, adultas o inducidas y/o sus derivados celulares parcial o completamente diferenciados para tratar tejidos enfermos o dañados mediante remplazo regeneración. En varias realizaciones, se proporcionan sustratos que mejoran la eficacia del tratamiento celular. Como se usa en el presente documento, al término "sustrato" se le debe dar su significado habitual y también debe usarse indistintamente con el término "implante" y/o "dispositivo", aunque se apreciará que algunas realizaciones descritas en este documento no requieren implante per se (por ejemplo, las que funcionan como un "parche en una superficie de tejido diana"). La base contextual dejará claro a un experto en la materia si una realización particular debe implantarse dentro de un tejido diana. Además, como se usa en este documento, al término "suministrar" se le debe dar su significado habitual y también debe referirse a la interacción física, química o de otro tipo que las células alojadas dentro del sustrato proporcionan al tejido diana sin la liberación de células del sustrato y/o injerto de las células en el tejido diana.

Tipos de sustrato

Basándose en la diversidad de enfermedades en que puede emplearse tratamiento celular, diversos diferentes tipos de sustrato puede ser ventajosa, dependiendo de la enfermedad. En general, aunque muchos de los sustratos divulgados en este documento tienen de forma inherente tres dimensiones (por ejemplo, una longitud, una anchura y una altura), algunos sustratos divulgados en este documento se diseñan con atención particular dirigida a una o más de estas dimensiones. Por ejemplo, como se analiza más completamente a continuación, varias realizaciones se mencionan como cestas de sustrato 3D. En dichas realizaciones, el sustrato es suficiente para permitir la formación de al menos una luz interior. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una estructura de cesta con un diseño deliberado tridimensional funciona proporcionando una o más luces o cavidades dentro del sustrato, que funciona reteniendo células dentro de la estructura después del suministro a un sitio diana (mientras que sigue permitiendo interacciones entre las células y el tejido diana). Sin embargo, se apreciará que los métodos de fabricación, implante y usos divulgados en este documento serán aplicables a cualquier diversidad de sustratos, dispositivos o implantes descritos en este documento, salvo que se especifique expresamente de otro modo.

En varias realizaciones, el sustrato es asimétrico y no homogéneo con distintas características estructurales en las superficies apical y basal del sustrato. Como se usa en el presente documento, a las expresiones "asimétrico" y "sustancialmente no homogéneo" se les debe dar su significado habitual y también se referirá a superficies sustancialmente no planas o variables. Asimismo, como se usa en este documento, a la expresión "sustancialmente homogéneo" se le dará su significado habitual y también se referirá a superficies que son en gran medida o completamente planas, o aquellas que tienen superficies mínimamente variables. La expresión sustancialmente homogéneo no excluirá determinadas características accesorias que causan que una superficie no sea completamente plana. Por ejemplo, la superficie apical del sustrato está rodeada, en algunas realizaciones, por un aro en el perímetro que está destinado a proteger la integridad de la monocapa celular de una fuerza de corte conferida durante el trasplante y para inhibir la proliferación celular lateral fuera de los límites definidos por el sustrato (véase, por ejemplo, 120 en la figura 20B). Aunque no son completamente planas, dichas realizaciones están destinadas a visualizarse como sustancialmente homogéneas. En varias realizaciones, la superficie basal tiene soportes poliméricos periódicos o columnas que proporcionan estabilidad mecánica al sustrato de este (1) facilitando la manipulación durante el cultivo celular, y la carga en la herramienta personalizada y el posterior implante quirúrgico, y (2) protegiendo una membrana más delgada y superponiendo la lámina celular desde su alteración mecánica por la fuerza conferida debido a presión de aire positiva o negativa.

Como se usa en el presente documento, a los términos "tridimensional" y "3D" se les debe dar sus significados habituales y también deben referirse a aquellos dispositivos que se parecen a una cesta (por ejemplo, que tienen una o más luces interiores o cavidades). A la luz de dicha variabilidad en el diseño de sustratos divulgados en este documento, la divulgación a continuación, salvo que se especifique de otro modo, se apreciará que es aplicable a cualquiera de dicha diversidad de sustratos.

Dimensiones

Basándose en la diversidad de enfermedades en que puede emplearse tratamiento celular, y las limitaciones de suministro de células en solitario, varias realizaciones proporcionan sustratos para tratamiento celular mejorado. En varias realizaciones, la enfermedad a tratar o las células a abordar definen, al menos en parte, las dimensiones del sustrato. Por ejemplo, en varias realizaciones, los sustratos se dimensionan para su implante en tejidos diana particulares, mientras que en otras realizaciones, los sustratos se dimensionan para su colocación en o cerca de un tejido diana.

En varias realizaciones, los sustratos divulgados en esta ocasión se utilizan en el tratamiento de enfermedad ocular. En dichas realizaciones, se utilizan determinadas dimensiones de sustrato dependiendo del tejido ocular a abordar. Por ejemplo, un sustrato a implantarse en la cámara vítrea probablemente diferiría en su dimensión de un sustrato a implantar en el espacio supracoroideo. En general, las dimensiones de determinadas cavidades oculares, espacios y tejido pueden obtenerse del conocimiento general de la anatomía ocular. En determinadas realizaciones, se obtienen mediciones específicas de un individuo para determinar las dimensiones específicas requeridas para fabricar un sustrato personalizado.

En varias realizaciones, se fabrican características de anclaje en el sustrato para permitir la colocación fija y precisa del sustrato en un sitio diana. En algunos casos, una vez que el sustrato está en su sitio y las células dentro o sobre el sustrato han establecido una interconexión con las células diana, los micromovimientos del sustrato dañarían y/o romperían la interconexión, reduciendo de este modo la eficacia terapéutica de las células. Por lo tanto, en varias realizaciones, las estructuras de anclaje se adhieren y/o incorporan a los sustratos divulgados en este documento. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se proporcionan uno o más orificios que permiten que el sustrato se sutura al tejido diana. En algunas realizaciones, se usa un bioadhesivo y/o una proteína adhesiva. En algunas realizaciones, microcapilares o una superficie rugosa del sustrato proporciona anclaje basado en fricción del sustrato. En algunas realizaciones, se usan características de MEMS tales como grapas o pasadores para sujetar o conectar de otro modo el sustrato al tejido diana. En algunas realizaciones, el tejido diana se dimensiona suficientemente para mantener de forma fija un sustrato sin la necesidad de anclajes especializados.

Con referencia a la fig. 1, se proporcionan determinadas dimensiones generales para sustratos tridimensionales (por ejemplo, cesta) de acuerdo con varias realizaciones descritas en este documento. En varias realizaciones, el sustrato 10 comprende un cuerpo de sustrato 20 y una cola de sustrato 30. En algunas realizaciones, la longitud de la cola del sustrato D1 varía de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 5 mm. En algunas realizaciones, la cola mide de aproximadamente 0,5 a 1 mm, de aproximadamente 1,0 a 1,5 mm, de aproximadamente 1,5 a 2,0 mm, de aproximadamente 2,0 a 2,5 mm, de aproximadamente 2,5 a 3,0 mm, de aproximadamente 3,0 a 3,5 mm, de aproximadamente 3,5 a 4,0 mm, de aproximadamente 4,0 a 4,5 mm, de aproximadamente 4,5 a 5,0 mm e intervalos solapantes de los mismos. En algunas realizaciones, la cola del sustrato mide entre aproximadamente 0,7 a 1,3 mm, incluyendo 0,8, 0,9, 1,0, 1,1 y 1,2 mm. En varias realizaciones, la cola del sustrato, el cuerpo del sustrato (por debajo) o las dimensiones totales del sustrato como un conjunto son tales que pueden usarse pinzas para sujetar y manipular el sustrato. Al mismo tiempo, estas dimensiones se equilibran manteniendo una estructura suficiente para que el sustrato no se doble fácilmente, se arrugue o se dañe de otro modo durante la manipulación o el implante.

En varias realizaciones, el cuerpo del sustrato es en general circular (véase, por ejemplo, la fig. 1A y la fig. 19A). Sin embargo, en algunas realizaciones (véase, por ejemplo, la fig. 1B y la fig. 19B), se usan otras formas, incluyendo, aunque sin limitación, rectángulos, cuadrados, óvalos y cilindros. Con referencia a la fig. 1 A, u otras realizaciones un cuerpo en general circular, el radio del cuerpo de sustrato mide de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mm. En algunas realizaciones, el radio mide de aproximadamente 0,5 a 1 mm, de aproximadamente 1,0 a 1,5 mm, de aproximadamente 1,5 a 2,0 mm, de aproximadamente 2,0 a 2,5 mm, de aproximadamente 2,5 a 3,0 mm, de aproximadamente 3,0 a 3,5 mm, de aproximadamente 3,5 a 4,0 mm, de aproximadamente 4,0 a 4,5 mm, de aproximadamente 4,5 a 5,0 mm e intervalos solapantes de los mismos. En algunas realizaciones, el radio del cuerpo de sustrato mide entre aproximadamente 0,7 a 1,3 mm, incluyendo 0,8, 0,9, 1,0, 1,1 y 1,2 mm.

Se usan dimensiones similares en varias realizaciones que no tienen un cuerpo redondeado o circular. Con referencia a la fig. 1B, D1A representa la longitud del sustrato, y en algunas realizaciones, varía de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 5 mm. En algunas realizaciones, la longitud mide de aproximadamente 0,5 a 1 mm, de aproximadamente 1,0 a 1,5 mm, de aproximadamente 1,5 a 2,0 mm, de aproximadamente 2,0 a 2,5 mm, de aproximadamente 2,5 a 3,0 mm, de aproximadamente 3,0 a 3,5 mm, de aproximadamente 3,5 a 4,0 mm, de aproximadamente 4,0 a 4,5 mm, de aproximadamente 4,5 a 5,0 mm e intervalos solapantes de los mismos. La dimensión D2A representa la anchura del sustrato y puede tener mediciones similares a D1A anterior.

Con referencia ahora a la fig. 2A, que es una vista lateral que representa la estructura tridimensional de varias realizaciones divulgadas en este documento, las dimensiones D3 y D4 representan el grosor de la pared de la cesta de sustrato 30. D3 y D4 tienen la misma dimensión en algunas realizaciones, mientras que en otras realizaciones, las dimensiones varían entre las dos. En algunas realizaciones, D3 y/o D4 miden entre aproximadamente 1,0 y 5,0 micrómetros. En algunas realizaciones, el grosor de la pared varía de aproximadamente 0,5 a 1 |jm, de aproximadamente 1,0 a 1,5 jm , de aproximadamente 1,5 a 2,0 jm , de aproximadamente 2,0 a 2,5 jm , de aproximadamente 2,5 a 3,0 jm , de aproximadamente 3,0 a 3,5 jm , de aproximadamente 3,5 a 4,0 jm , de aproximadamente 4,0 a 4,5 jm , de aproximadamente 4,5 a 5,0 jm e intervalos solapantes de los mismos. En algunas realizaciones, el grosor de D3 y/o D4 varía de aproximadamente 1,5 a 2,5 jm , incluyendo 1,6, 1,7. 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3 y 2,4 jm . En una realización, D3 es como máximo aproximadamente 7 jm , que permite que las microvellosidades penetren en el acceso 60 completamente. En una realización, D4 es mayor que ^d3 para proporcionar rigidez estructural a la cesta de sustrato. En algunas realizaciones, una o más superficies de la cesta de sustrato se fabrica en una forma de "acordeón" flexible, para permitir que la cesta de sustrato se expanda tras el suministro de las células a la luz de la cesta de sustrato. En algunas realizaciones, esta expansión se hace posible usando un polímero altamente elastomérico. En algunas realizaciones, la solución de suministro de células comprende un volumen global más grande que el volumen de células que se desea retener dentro de la cesta de sustrato. Por tanto, la forma de acordeón de algunas realizaciones, permite que la cesta de sustrato se expanda para acomodar este exceso de líquido y después se retrae según pasa el exceso de líquido a través de los poros de la cesta de sustrato.

Como se muestra en la FIG. 2A, la luz 50 es un espacio abierto dentro de la cubierta exterior de la cesta de sustrato que aloja las células que proporcionarán un efecto terapéutico al tejido diana. Dependiendo del tipo celular a suministrar, la cantidad de células a alojar dentro de la cesta de sustrato, y otros parámetros físicos limitantes del tejido diana, la altura de la luz D6 puede variar de aproximadamente 4 jm a aproximadamente 75 jm . En algunas realizaciones, D6 mide de aproximadamente 4 a 10 jm , de aproximadamente 5 a 20 jm, de aproximadamente 10 a 30 jm , de aproximadamente 25 a 40 jm , de aproximadamente 30 a 50 jm, de aproximadamente 45 a 60 jm , de aproximadamente 50 a 75 jm , de aproximadamente 65 a 75 jm , o intervalos solapantes de los mismos. En varias realizaciones, D6 varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 jm . En algunas realizaciones, la altura D5 de la luz 50 es igual que la altura de la membrana 70, que permite el suministro de células a la luz, pero evita el flujo de retorno celular. Sin embargo, en algunas realizaciones, dependiendo de la forma global del sustrato puede variar, de modo que una primera parte no tiene la misma dimensión que una segunda parte.

La altura total de la cesta de sustrato D5 es una función de D3, D4 y D5, así como cualquier característica del tejido diana que tenga que tenerse en cuenta en la fabricación de la cesta de sustrato. En algunas realizaciones, D5 varía de aproximadamente 6 a aproximadamente 85 jm , incluyendo de 5 a 20 jm , de 20 a 30 jm , de 30 a 40 jm , de 40 a 50 jm , de 50 a 60 jm , de 60 a 70 jm , de 70 a 85 jm e intervalos solapantes de los mismos. En algunas realizaciones, las dimensiones se ajustan teniendo en cuenta la ubicación del tejido diana. Por ejemplo, si el tejido diana está frecuentemente bajo carga (por ejemplo, presión, contracción, etc.), pero presenta una pequeña zona adecuada para implante, la cesta de sustrato puede fabricarse con paredes más gruesas y una altura global adecuada (D3 y/o D4 más grandes respecto a D5). Como resultado, D6 sería más pequeño. En otras realizaciones, las paredes de la cesta de sustrato pueden fabricarse para maximizar D6 respecto a D5. Por tanto, en varias realizaciones, las dimensiones de la cesta de sustrato se personalizan para el tejido diana en general, o en algunas realizaciones, para las dimensiones del tejido diana de un individuo particular.

Con referencia a las figuras 18A y 22A, en varias realizaciones, se ubica una pluralidad de sustratos dentro de un recipiente de cultivo para permitir la siembra simultánea de células a través de la pluralidad de sustratos. En varias realizaciones, el diámetro D8 se diseña para que sea ligeramente más pequeño que las placas de cultivo celular disponibles en el mercado adecuadas para aumento de escala de GMPc de modo que el marco de sustrato se ajuste cómodamente en la placa (por ejemplo, se ajuste para reducir/minimizar el movimiento del sustrato). Basándose en el diámetro D8 (o la anchura, si no es circular) del marco de sustrato del recipiente de cultivo, el número de sustratos que se siembra simultáneamente con células variará. En algunas realizaciones, y dependiendo del diámetro de la placa de cultivo, D8 es aproximadamente 14-15 cm, aproximadamente 9-10 cm o aproximadamente 4-5 cm. En algunas realizaciones, D8 es de menos que aproximadamente 4 cm, incluyendo 3, 2, 1 y 0,5 cm. En varias realizaciones, se usan recipientes de cultivo de múltiples pocillos. Por ejemplo, en varias realizaciones, se usan placas de 6 pocillos, 12 pocillos, 24 pocillos o 48 pocillos. En algunas realizaciones, se usan placas de 96 pocillos. En varias realizaciones, la profundidad de los pocillos varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 1,7 mm, incluyendo de aproximadamente 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6 mm. En varias realizaciones, el diámetro de los pocillos (que puede optimizarse basándose en el número de sustratos a cultivar en el pocillo) varía de aproximadamente 3 a aproximadamente 20 mm, incluyendo de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 mm, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 9 a aproximadamente 11 mm, de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 mm, de aproximadamente 13 a aproximadamente 15 mm, de aproximadamente 15 a aproximadamente 17 mm, de aproximadamente 17 a aproximadamente 19 mm, de aproximadamente 19 de aproximadamente 20 mm e intervalos solapantes de los mismos. En varias realizaciones, la altura de las paredes laterales varía de aproximadamente 10-20 mm, incluyendo de aproximadamente 10 a aproximadamente 12 mm, de aproximadamente 12 a aproximadamente 14 mm, de aproximadamente 14 a aproximadamente 16 mm, de aproximadamente 16 a aproximadamente 18 mm, de aproximadamente 18 de aproximadamente 20 mm e intervalos solapantes de los mismos. Determinadas realizaciones, de dichos recipientes de cultivo, están disponibles en el mercado con dimensiones de pocillo establecidas.

En algunas realizaciones, se usa un recipiente de cultivo que es rectangular o cuadrado para maximizar la zona de cultivo del recipiente. En algunas realizaciones, y especialmente con respecto a placas rectangulares o cuadradas, se diseña y fabrica un recipiente de cultivo de tamaño personalizado (por ejemplo, no disponible en el mercado). Las especificaciones de estas placas personalizadas tales como anchura y longitud se definen por múltiples variables incluyendo, aunque sin limitación, (1) el número mínimo de sustratos o cabezales de herramienta personalizados requeridos para proporcionar un muestreo adecuado en un ensayo de liberación final para mostrar una coherencia de un lote a otro, (2) forma de sustrato finalizada (circular (figura 19A) o rectangular (figura 19B)) y dimensiones laterales asociadas (D9-D11 con respecto a la realización circular; D10, D12, D13 con respecto a la realización oblonga o rectangular con bordes redondeados, o un híbrido de forma oval de los dos), etc.

Basándose en las dimensiones de recipiente de cultivo, y el tejido diana para el sustrato, las dimensiones de los sustratos pueden variar. Como se analiza a continuación con más detalle y como se muestra en general en la fig.

19A, en varias realizaciones, se proporciona un sustrato sustancialmente no homogéneo que tiene un cuerpo circular y una cola. Las dimensiones de este tipo de sustrato, aunque solapantes con las cestas de sustrato tridimensionales descritas anteriormente, se diseñan específicamente con la resistencia, durabilidad y capacidad de manipulación de sustratos que no tiene una estabilidad aumentada de forma natural formándose en una estructura de tipo cesta o no requiere una luz. En algunas realizaciones, se usa un sustrato completamente plano. En algunas realizaciones, tanto la superficie superior como la inferior no son planas.

Por tanto, el diámetro D9 de dichos sustratos no homogéneos varía de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 8 mm, incluyendo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 mm, de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 mm, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7 mm, de aproximadamente 7 de aproximadamente 8 mm e intervalos solapantes de los mismos. En determinadas realizaciones, se usan diámetros de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 mm, incluyendo 3,2, 3,4, 3,6, 3,8, 4,0, 4,2, 4,4, 4,6, 4,8 y 5,0 mm.

La anchura de la cola (o mango) D10 varía, en varias realizaciones, entre aproximadamente 0,1 mm a aproximadamente 6 mm, incluyendo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 1,0 mm, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 mm, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 mm, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0 mm, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0 mm, de aproximadamente 5,0 de aproximadamente 6,0 mm e intervalos solapantes de los mismos.

La longitud de la cola (o mango) Dll varía, en varias realizaciones, entre aproximadamente 1 mm a aproximadamente 20 mm, incluyendo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 mm, de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 mm, de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 mm, de aproximadamente 4 a aproximadamente 5 mm, de aproximadamente 5 a aproximadamente 6 mm, de aproximadamente 6 a aproximadamente 7 mm, de aproximadamente 7 a aproximadamente 8 mm, de aproximadamente 8 a aproximadamente 9 mm, de aproximadamente 9 a aproximadamente 10 mm, de aproximadamente 10 a aproximadamente 11 mm, de aproximadamente 11 a aproximadamente 12 mm, de aproximadamente 12 a aproximadamente 13 mm, de aproximadamente 13 a aproximadamente 14 mm, de aproximadamente 14 a aproximadamente 15 mm, de aproximadamente 15 a aproximadamente 16 mm, de aproximadamente 16 a aproximadamente 17 mm, de aproximadamente 17 a aproximadamente 18 mm, de aproximadamente 18 a aproximadamente 19 mm, de aproximadamente 19 de aproximadamente 20 mm e intervalos solapantes de los mismos.

Se usa anchura y longitud de cola similares en sustratos oblongos (por ejemplo, ovales o en gran medida rectangulares), como se representa en general en la fig. 19B. La anchura D12 de dichos sustratos varía, en varias realizaciones, entre aproximadamente 0,2 y aproximadamente 7 mm, incluyendo de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,4 mm, de aproximadamente 0,4 a aproximadamente 0,6 mm, de aproximadamente 0,6 mm a aproximadamente 0,8 mm, de aproximadamente 0,8 mm a aproximadamente 1,0 mm, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 mm, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 mm, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0 mm, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0 mm, de aproximadamente 5,0 de aproximadamente 6,0 mm e intervalos solapantes de los mismos.

La longitud D13 de dichos sustratos oblongos varía, en varias realizaciones, entre aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 9 mm, incluyendo aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,0 mm, de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 2,0 mm, de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 3,0 mm, de aproximadamente 3,0 a aproximadamente 4,0 mm, de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 5,0 mm, de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0 mm, de aproximadamente 6,0 a aproximadamente 7,0 mm, de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0 mm, de aproximadamente 8,0 de aproximadamente 9,0 mm e intervalos solapantes de los mimos. En algunas realizaciones, la longitud D13 varía de aproximadamente 4 a aproximadamente 7 mm, incluyendo 4,2, 4,4, 4,6, 4,8, 5,0, 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,8 y 7,0 mm.

Con referencia a la fig. 20, se proporcionan determinadas dimensiones de sección transversal general para sustratos no homogéneos con y sin un labio perimetral (figura 20B). Pueden usarse realizaciones que emplean estas estructuras de sección transversal con placas de cultivo celular disponibles en el mercado u otros tipos de placas tales como los descritos anteriormente. En varias realizaciones, el sustrato tiene una capa apical homogénea 100 que proporciona una superficie para el crecimiento celular. En varias realizaciones, el grosor D14 de la superficie de crecimiento celular apical 100 es de menos de aproximadamente 4 |jm de grosor. En algunas realizaciones, el grosor varía de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 0,1 jm , de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 0,2 jm , de aproximadamente 0,2 a aproximadamente 0,5 jm , de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,5 jm, de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 3,0 jm , de aproximadamente 0,7 a aproximadamente 3,0 jm , de aproximadamente 1,0 a aproximadamente 3,0 jm, de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 2,5 jm , de aproximadamente 1,8 a aproximadamente 2,2 jm e intervalos solapantes de los mismos. En algunas realizaciones, el grosor varía entre aproximadamente 0,5 y 1,0 jm, incluyendo 0,6, 0,7, 0,8 y 0,9 jm . En determinadas realizaciones, se usa una superficie de crecimiento celular apical más gruesa. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la superficie de crecimiento celular apical varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 jm , de aproximadamente 3 a aproximadamente 4 jm, de aproximadamente 4 jm a aproximadamente 5 jm , de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 6 jm e intervalos solapantes de los mismos. Dependiendo del tejido diana, y de la región específica del tejido diana, y el tipo celular, también pueden usarse superficies apicales más gruesas o más delgadas. Como se muestra, la superficie de crecimiento celular apical 100 se empareja con soportes más gruesos 110 en la superficie basal. Los soportes 110 proporcionan, en algunas realizaciones, rigidez mecánica, que ayuda a mantener la superficie de crecimiento celular apical completa durante la manipulación y la inserción quirúrgica. En esas realizaciones en las que las células que crecen sobre la superficie son células RPE, después de la inserción quirúrgica, la superficie de crecimiento celular apical (y las células RPE) se yuxtapondrán con los fotorreceptores en el ojo, sirviendo de ese modo para mantener la salud de los fotorreceptores. En varias realizaciones, los soportes también inhiben el crecimiento lateral de las células y la posible extensión del crecimiento al lado basal del sustrato. Los soportes, en varias realizaciones, también inhiben el crecimiento celular en el vitreo mediante alteración mecánica de la integridad de la retina. (Los último provoca una complicación conocida como vitreorretinopatía proliferativa (PVR)). Por lo tanto, dichas realizaciones tienen una superficie apical homogénea que da lugar a crecimiento celular emparejado con una superficie basal que tiene una topología no homogénea, pero periódica, definida por el tamaño y paso de los soportes. En algunas realizaciones, los soportes son de forma columnar, mientras que en otras realizaciones, se usan otras formas (por ejemplo, cuboides). En algunas realizaciones, se emplea un reborde en la superficie apical para inhibir el crecimiento lateral y protegerlo de la fuerza de corte durante el implante quirúrgico.

Como se muestra en las fig. 20A y 20B, los soportes 110 de la superficie basal varían en su altura total D15 (medida desde la capa de superficie de crecimiento celular apical hasta la terminación del soporte) entre aproximadamente 3 jm y aproximadamente 15 jm , incluyendo de aproximadamente 3 a aproximadamente 5 jm , de aproximadamente 5 a aproximadamente 7 jm, de aproximadamente 7 a aproximadamente 9 jm , de aproximadamente 9 s aproximadamente 11 jm, de aproximadamente 11 a aproximadamente 13 jm , de aproximadamente 13 a aproximadamente 15 jm e intervalos solapantes de los mismos. En algunas realizaciones, los soportes varían en su altura entre aproximadamente 5 |jm a aproximadamente 8 |jm, incluyendo 5,2, 5,4, 5,6, 5,8, 6,0, 6,2, 6,4, 6,6, 6,8, 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8 y 8,0 jm . Dependiendo de la realización, también pueden usarse soportes más grandes (por ejemplo, mayor altura) o más pequeños (por ejemplo, menor altura). Por ejemplo, en varias realizaciones, la altura de las características de soporte varía de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 500 jm , incluyendo de aproximadamente 5 jm a aproximadamente 50 jm , de aproximadamente 50 jm a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 jm a aproximadamente 150 jm, de aproximadamente 150 jm a aproximadamente 200 jm, de aproximadamente 200 jm a aproximadamente 300 jm , de aproximadamente 300 jm a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 jm a aproximadamente 500 jm e intervalos solapantes de los mismos. Asimismo, en varias realizaciones, la altura de las características de soporte varían de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 5 jm , incluyendo de aproximadamente 1 jm a aproximadamente 1,5 jm , de aproximadamente 1.5 jm a aproximadamente 2,0 jm , de aproximadamente 2,0 jm a aproximadamente 2,5 jm , de aproximadamente 2.5 jm a aproximadamente 3,0 jm , de aproximadamente 3,0 jm a aproximadamente 3,5 jm , de aproximadamente 3.5 jm a aproximadamente 4,0 jm , de aproximadamente 4,0 jm a aproximadamente 5,0 jm e intervalos solapantes de los mismos.

En varias realizaciones, las superficies apical y basal comprenden diferentes materiales. Por ejemplo, en una realización, la superficie de crecimiento celular apical puede estar hecha de un primer material que es más conductor para el crecimiento celular, mientras que la superficie basal está hecha de un segundo (o primer material modificado) que confiere resistencia y/o durabilidad al sustrato como conjunto. En algunas realizaciones, la superficie apical comprende un recubrimiento o capa delgada de material depositado 100' que ayuda al crecimiento celular y/o la adherencia. (véanse, por ejemplo, las fig. 20C y 20D). En varias realizaciones, esta capa es entre aproximadamente 10 y 100 nm de grosor. En algunas realizaciones, la capa es de entre aproximadamente 20 a 30 nm, de entre aproximadamente 30 a 40 nm, de entre aproximadamente 40 a 50 nm, de entre aproximadamente 50 a 60 nm, de entre aproximadamente 60 a 70 nm, de entre aproximadamente 70 a 80 nm, de entre aproximadamente 80 a 90 nm, de entre aproximadamente 90 a 100 nm e intervalos solapantes de los mismos.

En varias realizaciones, la capa 100' comprende parileno AM. En varias realizaciones, la capa comprende parileno C tratado con amoniaco. En varias realizaciones, la capa comprende parileno C y polidopamina. En varias realizaciones, se usa parileno AM, parileno C, parileno C tratado con amoniaco y/u oxígeno (con el fin de añadir grupos funcionales y hacer que la superficie sea rugosa) y parileno C tratado con polidopamina, vitronectina, retronectina o matrigel. En varias de estas realizaciones, la segunda capa (100 en las fig. 20A-20D) comprende una mezcla de restos de arginina-glicina-acido aspártico cíclicos y lineales. En varias realizaciones, la segunda capa comprende una matriz de crecimiento celular sintética (por ejemplo, SYNTHEMAX™ de Corning). En una realización, la superficie basal no homogénea comprende parileno C, con una capa de parileno AM como superficie apical sustancialmente homogénea. En una realización, el parileno AM está recubierto con uno o más de matrigel, vitronectina, retronectina, poli-L-dopamina. En una realización, el sustrato comprende parileno C, que está recubierto y/o tratado directamente. En varias realizaciones, el recubrimiento de poli-L-dopamina se genera haciendo reaccionar PEG-(N-Boc-L-DOPA)²) con arginina-glicina-aspártico cíclico en un medio acuoso oxidativo (tal como peryodato de sodio (NaIO4) para generar un recubrimiento de poli-L-dopa. Como alternativa, se hace reaccionar PEG-(N-Boc-L-DOPA)²) con RGD-L-DOPA en un medio acuoso oxidativo (tal como peryodato de sodio (NaIO4) para generar un recubrimiento de poli-L-dopa. En varias realizaciones, el sustrato comprende parileno C, que está recubierto y/o tratado directamente. En una realización, el sustrato está recubierto con matrigel, retronectina, vitronectina, equivalentes de los mismos y/o combinaciones de los mismos. Además, en varias realizaciones, se usa un recubrimiento sobre la superficie del sustrato junto con otro método de tratamiento superficial tal como, por ejemplo, tratamiento con oxígeno de la superficie del sustrato (divulgado en mayor detalle a continuación).

Realizaciones alternativas, un ejemplo no limitante de las cuales se muestra en la fig. 20B, comprenden además un labio de sustrato 120 que reviste el perímetro de la superficie de crecimiento celular apical 100 que funciona protegiendo las células que crecen en la superficie apical de la sobrecarga por corte de fluidos durante el cultivo de las células, la manipulación del sustrato y/o durante o después del implante quirúrgico en un tejido diana (por ejemplo, el ojo). El labio funciona además definiendo un límite para controlar el crecimiento de las células sobre la superficie; evitando de ese modo el crecimiento de las células desde la superficie apical (superficie de crecimiento celular 100) hasta el lado basal del sustrato. Además, el labio de sustrato 120 limita la alteración de la integridad de la monocapa durante la separación de un sustrato individual de una matriz de sustratos (por ejemplo, los mostrados en las fig. 18A o 22A). En varias realizaciones, el labio tiene una anchura de D18 que varía de entre aproximadamente 10 jm a aproximadamente 1500 jm (1.5 mm). En algunas realizaciones, la anchura varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 jm , de aproximadamente 300 a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 600 jm , de aproximadamente 600 a aproximadamente 700 jm , de aproximadamente 700 a aproximadamente 800 jm , de aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1100 jm , de aproximadamente 1100 a aproximadamente 1200 jm, de aproximadamente 1200 a aproximadamente 1300 jm, de aproximadamente 1300 a aproximadamente 1400 jm , de aproximadamente 1400 a aproximadamente 1500 jm e intervalos solapantes de los mismos.

En varias realizaciones, el labio tiene una altura D19 que varía de entre aproximadamente 10 jm a aproximadamente 1500 |jm (1,5 mm). En algunas realizaciones, la altura varía de entre aproximadamente 10 a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 a aproximadamente 300 jm , de aproximadamente 300 a aproximadamente 400 jm , de aproximadamente 400 a aproximadamente 500 jm , de aproximadamente 500 a aproximadamente 600 jm , de aproximadamente 600 a aproximadamente 700 jm , de aproximadamente 700 a aproximadamente 800 jm , de aproximadamente 800 a aproximadamente 1000 jm , de aproximadamente 1000 a aproximadamente 1100 jm , de aproximadamente 1100 a aproximadamente 1200 jm , de aproximadamente 1200 a aproximadamente 1300 jm , de aproximadamente 1300 a aproximadamente 1400 jm, de aproximadamente 1400 a aproximadamente 1500 jm e intervalos solapantes de los mismos. En algunas realizaciones, la altura varía de entre aproximadamente 20 a aproximadamente 300 jm, incluyendo de aproximadamente 20 a aproximadamente 50 jm, de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 jm , de aproximadamente 100 a aproximadamente 150 jm , de aproximadamente 150 a aproximadamente 200 jm , de aproximadamente 200 a aproximadamente 250 jm , de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 jm e intervalos solapantes de los mismos.

Como se muestra en las fig. 21A-21C, dichos sustratos que tienen una superficie de crecimiento celular apical y una superficie de soporte estructural basal pueden fabricarse por los métodos divulgados en este documento y mantener el crecimiento celular. La fig. 21A representa una imagen de microscopia electrónica de barrido de la superficie de crecimiento celular apical de un sustrato de acuerdo con la descripción anterior. Como se muestra, la superficie de crecimiento celular apical es homogénea, mientras, como se muestra en la fig. 21B, la superficie basal no es homogénea, que comprende múltiples estructuras de soporte. Además, como se muestra en la fig. 21C, la superficie de crecimiento celular apical es adecuada para el crecimiento de células, por ejemplo, células madre (se muestran células RPE-hESC H9 que proliferan sobre una superficie de crecimiento de parileno).

Como se analiza anteriormente, el tejido particular que está dañado o enfermo y tiene que abordarse con un sustrato de carga celular puede definir las dimensiones o características estructurales del sustrato. Por ejemplo, un sustrato usado para dirigir células a la superficie del hígado de un individuo podría fabricarse con dimensiones mucho más grandes que las descritas anteriormente. De manera similar, un sustrato fabricado para abordar el tejido cardiaco de un paciente también podría diseñarse con dimensiones globales más grandes. Sin embargo, algunos sustratos, tales como aquellos para abordar tejidos neurales, pueden beneficiarse de dimensiones más similares a las descritas anteriormente. Dado el conocimiento anatómico de los expertos en la materia, pueden obtenerse fácilmente dimensiones para diversos tejidos diana, o como se analiza en este documento, medirse específicamente para un determinado individuo.

Porosidad y permeabilidad

Con referencia a las fig. 1 y 2, en varias realizaciones, las cestas de sustrato comprenden materiales porosos. En algunas realizaciones, el material es un material permeable. Como se muestra, poros 60 están presentes en la cubierta exterior de la cesta de sustrato. En algunas realizaciones, los poros están presentes en las superficies superior 30a e inferior 30b de la cesta de sustrato. Como se usa en el presente documento, al término poro se le debe dar su significado habitual y también se refiere a "acceso biológico", en el sentido de que funcionan como paso para permitir interacciones físicas, químicas o de otros tipos y/o interconexiones descritas en este documento. Los términos "poro" y "acceso" deben leerse indistintamente salvo que se indique contextualmente lo contrario. En algunas realizaciones, los accesos en el lado superior de la cesta de sustrato permiten el paso de microvellosidades apicales de las células contenidas dentro de la cesta de sustrato, mientras que los accesos en el lado inferior proporcionan soporte a los cuerpos celulares. En algunas realizaciones, la densidad de poros en el lado superior e inferior es similar, mientras que en otras realizaciones, la densidad de poro es diferente.

En varias realizaciones, la densidad de poro varía de entre aproximadamente 1 x 106 y 2,5 x 109 poros por cm2. En algunas realizaciones, los poros tienen una distancia entre ellos de aproximadamente 0,2 micrómetros y aproximadamente 2 micrómetros de paso de centro a centro. Se usa un espaciado y paso mayor o menor en otras realizaciones. En varias realizaciones, los parámetros descritos anteriormente (diámetros de poro, densidad y grosor del sustrato) afectan a la conductividad hidráulica y la tasa de difusión de nutrientes y macromoléculas a través del sustrato. En una realización, el flujo neto a través de ambos sustratos es cero. Por tanto, en varias realizaciones, la superficie inferior tiene una densidad de poro mayor en comparación con la superior. Para este fin, puede emplearse un flujo de proceso fotolitográfico de doble capa que permite reducir el diámetro de poro eficaz permisible definido por el grosor de la capa de sacrificio para fabricación del sustrato basal. En algunas de dichas realizaciones, una primera capa de material se fabrica con pasajes que comunican con cualquier superficie de la capa. Esto produce, en sección transversal, un patrón "de tipo bloque". Véase, por ejemplo, la fig. 10. Después de ello se fabrica una segunda capa, de nuevo con pasajes similares. Para mantener el diámetro de poro deseado, la segunda capa se coloca fotolitográficamente sobre la primera capa con un tamaño de hueco 60 conocido que corresponde al tamaño deseado del acceso biológico.

En otras realizaciones más, los accesos están presentes únicamente en uno de los lados, por ejemplo, superior o inferior. En algunas realizaciones, aunque no se muestra expresamente en las figuras, la superficie apical y/o basal comprende además un material de sustrato diferente que se hibrida con la superficie apical o basal durante el proceso de fabricación. En varias realizaciones, los accesos varían en diámetro de aproximadamente de 0,5 a aproximadamente 10 |jm. El diámetro de poro puede variar dependiendo del tipo de célula a alojar dentro de la cesta de sustrato, el sitio de implante o el tejido diana. En varias realizaciones, el diámetro de poro varía de aproximadamente 1 a 3 jm, de 3 a 5 jm , de 5-7 jm, de 7 a 10 jm o intervalos solapantes de los mismos. En varias realizaciones, el diámetro de poro varía de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5 jm , incluyendo 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3 y 1.4 jm . Aunque en varias realizaciones, el diámetro de poro es suficientemente grande para permitir que el proceso celular alcance la cesta de sustrato hasta el tejido diana, el diámetro de poro no es suficientemente grande para permitir que la propia célula escape de la cesta de sustrato. Por tanto, el diámetro de acceso sirve para retener las células dentro de la cesta de sustrato, pero permite que el efecto terapéutico de las células alcance el tejido diana, ya sea esto una interacción física (por ejemplo, entre un proceso celular y el tejido diana), química o de otro tipo. Sin embargo, en algunas realizaciones, las cestas de sustrato están diseñadas para permitir que al menos una parte de las células dentro de la cesta de sustrato escapen.

En varias realizaciones, el diámetro de poro se varía a través de la superficie de la cesta de sustrato durante el proceso de fabricación. En varias realizaciones, el tamaño de poro puede variarse para permitir que las células en una determinada posición en la luz de la cesta de sustrato escapen mientras otras células se retienen dentro de la cesta de sustrato. En algunas realizaciones, la cesta de sustrato se fabrica con múltiples cámaras, y el tamaño de poro puede variar dependiendo de la cámara con que el poro está en comunicación. Por ejemplo, una primera cámara puede alojar un primer tipo de células a retener dentro de la cesta de sustrato y proporcionar un efecto terapéutico al tejido diana. En dichas realizaciones, la primera cámara se fabricaría con un tamaño de poro que retuviera las células dentro de la cesta de sustrato. Véase, por ejemplo, la fig. 2B, cámara 50a y poro 60a. Sin embargo, un segundo tipo de células puede alojarse dentro de una segunda cámara, proporcionando el segundo tipo de células un efecto adicional al primer tipo de células y/o al tejido diana tras el escape del sustrato. Por tanto, en dichas realizaciones, la segunda cámara se fabricaría con poros de un diámetro suficiente para permitir que el segundo tipo de células escape de la cesta de sustrato. Véase, por ejemplo, FIG. 2B, cámara 50b y poro 60b. En otras realizaciones, diferentes cámaras pueden alojar fármacos u otros agentes adicionales y, por lo tanto, se fabrican con una porosidad definida por la tasa de liberación requerida o deseada del fármaco o agente. En algunas realizaciones, no se requieren cámaras adicionales para un fármaco o agente adicional. El fármaco o agentes adicionales se usan para mantener la viabilidad de las células, promover la interacción de las células con el tejido diana, inhibir o promover la vascularización del sustrato o tejido cerca del sustrato (dependiendo del tejido diana) u otros efectos adicionales que potencian o mejoran de otro modo los efectos terapéuticos de las células sobre el tejido diana.

Con referencia a la fig. 4, también pueden fabricarse diferentes cámaras 50, 50a, 50b y 50c de manera concéntrica o semiconcéntrica. Las cámaras individuales se crean mediante divisores 90, 90a y 90b. En varias realizaciones, los divisores comprenden el mismo material que el cuerpo de la cesta de sustrato. En varias realizaciones, se construyen divisores de un material diferente del cuerpo de la cesta de sustrato. En algunas realizaciones, los divisores comprenden cables a través de los que puede pasar una corriente eléctrica para crear y sellar una cámara del resto de la luz de la cesta de sustrato. En otras realizaciones, los materiales que generan las cámaras pueden alterarse para permitir la visualización de la cesta de sustrato in situ. Por ejemplo, 90, 90a y 90b, pueden comprender un anillo de cromo u otro compuesto que permita la visualización. Estas estructuras también pueden funcionar como conectores para detectores químicos que permitan presentar información respecto al entorno alrededor del sustrato (debajo). Además, podrían funcionar como mecanismo para afianzar una parte apical y basal de un sustrato entre sí, antes o después de sembrar las células.

En varias realizaciones, los sustratos son no porosos, por ejemplo, no existen orificios o accesos que pasen a través del grosor del material sustrato. Aunque carece de un paso específico para el paso de nutrientes o procesos celulares, los sustratos no porosos tienen una permeabilidad que puede manipularse basándose en el grosor del material usado. Por ejemplo, el grosor del material de sustrato permite que el sustrato actúe como tamiz molecular, evitando que determinadas proteínas de un determinado tamaño pasen a través del sustrato, mientras se permite el paso de proteínas de otros tamaños a través del sustrato. Véanse las fig. 20E y 20F, que representan datos relacionados con la difusión de moléculas (dextrano) a través de sustratos que varían de 0,15 a 0,80 jm de grosor. Los coeficientes de difusión (relacionados con el grosor) varían entre aproximadamente 10-10 y 10-13 cm2/segundo. En algunas realizaciones, pueden conseguirse tasas mayores o menores de difusión manipulando el grosor del sustrato.

Como se analiza anteriormente, varias realizaciones de sustrato asimétrico, no homogéneo (aquellas con una superficie de crecimiento celular apical y una superficie basal no homogénea) son no porosas, pero son permeables. Es necesario un determinado grado de permeabilidad del material de sustrato para mantener las células que han crecido sobre el sustrato de modo que sean tanto metabólica como funcionalmente viables a lo largo del tiempo (por ejemplo, tanto en cultivo como después del implante). Por ejemplo, en varias realizaciones, sustratos de parileno que tienen un grosor (por ejemplo, D14 en las fig. 20A-20B) de menos de aproximadamente 0.80 jm tienen un límite de exclusión de peso molecular de aproximadamente 70-75 kDa. Dicho sustrato excluiría proteínas o moléculas más grandes de aproximadamente 70-75 kDa, que permitiría el paso de la mayoría de proteínas presentes en el torrente sanguíneo que serían necesarias para mantener las células sobre el sustrato después del implante. En algunas realizaciones, puede conseguirse una exclusión molecular mayor o menor manipulando el grosor del sustrato (por ejemplo, límites de exclusión que varían de aproximadamente 25 kDa a aproximadamente 150 kDa, incluyendo de aproximadamente 25 a aproximadamente 30 kDa, de aproximadamente 30 a aproximadamente 35 kDa, de aproximadamente 35 a aproximadamente 40 kDa, de aproximadamente 40 a aproximadamente 45 kDa, de aproximadamente 45 a aproximadamente 50 kDa, de aproximadamente 50 a aproximadamente 55 kDa, de aproximadamente 55 a aproximadamente 60 kDa, de aproximadamente 60 a aproximadamente 65 kDa, de aproximadamente 65 a aproximadamente 70 kDa, de aproximadamente 70 a aproximadamente 75 kDa, de aproximadamente 75 a aproximadamente 100 kDa, de aproximadamente 100 a aproximadamente 125 kDa, de aproximadamente 125 a aproximadamente 150 kDa e intervalos solapantes de los mismos.

Aunque se aprecia en la técnica que el suministro de nutrientes a células implantadas (y a células existente) es importante para la viabilidad de las células, es particularmente ventajoso que determinadas realizaciones de los sustratos divulgados en este documento no requieran un poro o un orificio para proporcionar dichos nutrientes. Por ejemplo, la AMD húmeda implica neovascularización anómala mediante vasos que tienen paredes mecánicamente más débiles. Esta vasculatura frágil tiene el riesgo de rotura, posterior hemorragia y la rápida pérdida de visión debido a muerte celular. Dicha rotura podría agravarse por el implante de sustratos que tienen poros, a través de los que podrían crecer dichos vasos frágiles. Aunque la AMD seca es una enfermedad no neovascularizante, en algunos casos, el crecimiento de vasos a través de los poros de una cesta de sustrato podrían provocar daño a los vasos, alteración de las células dentro de la cesta de sustrato. Como se analiza anteriormente, determinadas realizaciones comprenden cesta de sustrato no porosas que son permeables a los nutrientes del torrente sanguíneo. En dichas realizaciones, los poros en la cesta de sustrato, así como el crecimiento de vasos en dichos poros, no es posible, limitando de ese modo la posibilidad de rotura de los vasos sanguíneos y/o alteración de las células que crecen sobre la cesta de sustrato.

En algunas realizaciones, pueden usarse determinados materiales que son tanto permeables como porosos. La selección y/o ajuste de la formulación de materiales seleccionados (por copolímeros) se usan, en algunas realizaciones, para adaptar la permeabilidad y/o la porosidad de los materiales (y el sustrato resultante).

Materiales

Puede usarse diversos materiales para fabricar los sustratos divulgados en este documento. En algunas realizaciones, los sustratos son biodegradables mientras que en otras realizaciones, los sustratos son no biodegradables. En otras realizaciones más, una parte del sustrato es biodegradable mientras que otra parte no. En varias realizaciones, las partes biodegradables de los sustratos pueden fabricarse para degradarse a una tasa conocida. Dichos materiales biodegradables incluyen cualquier material adecuado que se degrade o erosione a lo largo del tiempo cuando se coloca en el organismo humano o animal. Por consiguiente, como se usa el término en este documento, material biodegradable incluye materiales bioerosionables.

En varias realizaciones biodegradables, los materiales seleccionados se optimizan para conseguir una tasa particular de biodegradación. Por ejemplo, en varias realizaciones que emplean polímeros, la composición de los polímeros se controla para conseguir una determinada tasa de biodegradación y, por tanto, un tiempo de permanencia del sustrato in vivo. A modo de ejemplo, en una realización en que el sustrato comprende un copolímero de PLGA, la tasa de biodegradación del copolímero de PLGA se controla variando la relación de unidades de ácido láctico a ácido glicólico en el copolímero. En algunas realizaciones, la tasa de biodegradación se controla para conseguir una permanencia de aproximadamente 4 semanas después del implante. En algunas realizaciones, el sustrato se degrada en aproximadamente 1-3 semanas, 2-4 semanas o más, incluyendo de aproximadamente 4-6 semanas o varios meses.

Además de los materiales usados para fabricar el propio sustrato, varias realizaciones comprenden una capa o recubrimiento biodegradable adicional que funciona retardando la interacción entre el tejido diana y las células alojadas dentro o sobre el sustrato durante un periodo conocido de tiempo. Por ejemplo, podría usarse un recubrimiento con una tasa rápida de degradación para encapsular el sustrato y proteger de ese modo las células dentro o sobre el sustrato durante el proceso de implante y/o evitar que los poros del sustrato queden obstruidos o bloqueados con tejido durante el proceso de implante. Tras completarse el implante, la capa se degradaría rápidamente y comenzaría la interacción entre las células dentro o sobre el sustrato y el tejido diana. En contraste, en algunas realizaciones, puede usarse un recubrimiento de degradación más lenta. Por ejemplo, si el procedimiento de implante se realizó como un procedimiento quirúrgico (o junto con un procedimiento quirúrgico), las medicaciones postquirúrgicas (por ejemplo, antiinflamatorios y/o antibióticos) que pueden afectar de forma adversa a las células dentro o sobre el sustrato pueden estar presentes durante un periodo prolongado de tiempo en o cerca del tejido diana. En dichos casos, la tasa de degradación del recubrimiento podría adaptarse para evitar la exposición de las células al tejido diana hasta un momento en que ya no hay agente dañino presente.

Algunas realizaciones comprenden un material no biodegradable combinado con un material biodegradable, ayudando el último, que proporciona soporte estructural y mecánico adicional, a la manipulación del sustrato durante la siembra celular y el cultivo y/o durante la inserción quirúrgica en un tejido (por ejemplo, el espacio subretiniano). El material también puede usarse para añadir masa al sustrato para ayudar en el mismo y/o para ayudar en la orientación del sustrato. En varias realizaciones, el soporte está en forma de columnas que conectan las partes superior e inferior de una cesta de sustrato o sobre la parte basal de un sustrato no homogéneo. En otras realizaciones, el soporte comprende una capa adicional en la parte superior o inferior de la cesta o la superficie basal de un sustrato no homogéneo.

Los sustratos pueden formarse de metales, polímeros, plásticos o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, el material permite que el sustrato tenga suficiente elasticidad, flexibilidad y alargamiento potencial no solamente para conformarse a la anatomía diana durante y después del implante, sino también para permanecer inarrugable, no rasgable, imperforable y con una luz notoria durante y después del implante. En varias realizaciones, el material de sustrato ventajosamente sería procesable de una manera práctica, tal como, por ejemplo, por moldeo, extrusión, termoformación y similares, así como por los métodos de fabricación de MEMS analizados a continuación.

El fin de la modificación de la superficie, en algunas realizaciones, es promover la viabilidad y la adhesión celular. Esto se hace funcionalizando la superficie. Para este fin, los ejemplos ilustrativos de materiales adecuados para el sustrato incluyen polipropileno de parileno, poliimida, vidrio, nitinol, poli(alcohol vinílico), polivinilpirrolidona, colágeno, colágeno tratado químicamente, polietersulfona (PES), poli(glicerol-sebacato) PGS, poli(estireno-isobutil-estireno), poliuretano, acetato de etilvinilo (EVA), polietereter cetona (PEEK), Kynar (poli(fluoruro de vinilideno; PVDF), politetrafluoroetileno (PTFE), polimetilmetacrilato (PMMA), Pebax, acrílico, poliolefina, polidimetilsiloxano (PDMS) y otros elastómeros de silicona, polipropileno, hidroxiapatita, titanio, oro, plata, platino, otros metales y aleaciones, cerámicas, plásticos y mezclas o combinaciones de los mismos. Materiales adicionales adecuados usados para construir determinadas realizaciones de los sustratos incluyen, aunque sin limitación, poli-para-xililenos (por ejemplo, parileno, incluyendo, aunque sin limitación, parileno A, parileno AM, parileno C, parileno tratado con amoniaco, parileno C tratado con polidopamina), poli(ácido láctico) (PLA), polietileno-acetato de vinilo, poli(ácido láctico-coglicólico) (PLGA), poli(D,L-láctido), poli(D,L-láctido-co-carbonato de trimetileno), colágeno, colágeno heparinizado, colágeno desnaturalizado, colágeno modificado (por ejemplo, silicona con gelatina), otras matrices de crecimiento celular (tales como SYNTHEMAX™), poli(caprolactona), poli(ácido glicólico) y/u otros polímeros, copolímeros o copolímeros de bloque, poli(caprolactona) que contiene arginina-glicina-asparagina cíclica, arginina-glicina-ácido aspártico cíclico o lineal, mezclas de policaprolactona y polietilenglicol (PCL-PEG), poliuretanos termoplásticos, polieteruretanos modificados con silicona, poli(carbonatouretano) o poliimida. Los poliuretanos termoplásticos son polímeros o copolímeros que pueden comprender poliuretanos alifáticos, poliuretanos aromáticos, materiales formadores de hidrogel de poliuretano, poliuretanos hidrófilos o combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitantes incluyen elastano (poli(eteruretano)) tales como Elasthane™ 80A, Lubrizol, Tecophilic™, Pellethane™, carbothane™, Tecothane™, Tecoplast™ y Estane™. Los polieteruretanos modificados con silicona pueden incluir Carbosil™ 20 o Pursil™ 20 80A, y similares. El poli(carbonatouretano) puede incluir Bionate™ 80A o polímeros similares.

Fabricación y manipulación del sustrato

Dependiendo de los materiales seleccionados y el tipo de sustrato a fabricar (por ejemplo, cesta de sustrato 3D o sustrato no homogéneo asimétrico), pueden usarse diversas técnicas para fabricar los dispositivos. Debe apreciarse que los procedimientos enumerados en este documento no son exhaustivos ni deben interpretarse como una lista exclusiva. También pueden usarse técnicas adicionales conocidas en la técnica, pero no divulgadas expresamente en este documento para fabricar varias realizaciones de la invención. También debe apreciarse que varias realizaciones de los sustratos divulgados en este documento comprenden combinaciones de materiales y, por lo tanto, pueden usarse combinaciones de técnicas de fabricación.

En varias realizaciones, el sustrato se fabrica por extrusión, trefilado, moldeo por inyección, sinterizado, micromecanizado, mecanizado láser y/o electroerosión, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, los sustratos tridimensionales se fabrican como una única pieza, sin embargo, en varias realizaciones, el sustrato se fabrica de forma modular. Por ejemplo, en una realización, las partes superior e inferior de una cesta de sustrato tridimensional se fabrican independientemente entre sí. Dicha estrategia es ventajosa en la producción de sustratos que difieren entre sí en uno o más aspectos (por ejemplo, un primer sustrato tiene superficies apical y basal porosas y un segundo tiene una superficie apical no porosa), pero conservan la misma dimensión global. En dichas realizaciones, las piezas modulares deseadas pueden seleccionarse y después ensamblarse en una cesta de sustrato tridimensional completa. Después de haber seleccionado las piezas modulares deseadas, se alinean y sellan para crear una cesta de sustrato tridimensional con la dimensión y características deseadas. En algunas realizaciones, también se sella una cesta de sustrato tridimensional fabricada a partir de una única pieza. Por ejemplo, en una realización, las partes superior e inferior se forman como una única pieza plana y después una parte se pliega sobre la otra y se sella la cesta de sustrato tridimensional resultante. El sellado puede conseguirse con soldadura por calor, atemperado, adhesivos biocompatibles o epoxis, y similares. Algunas realizaciones incluyen opcionalmente una cubierta o marco que comprende material adicional que no funciona como superficie de crecimiento celular. En algunas realizaciones, la cubierta o marco proporciona al usuario uno o más sitios de agarre y/o manipulación del sustrato sin dañar la superficie de crecimiento celular y/o las células que crecen sobre dicha superficie.

Aunque las cestas de sustrato tridimensional que funcionan alentando la interacción entre las células y el tejido diana mientras retienen las células en la cesta después del implante se prefieren en varias realizaciones, tal como se ha tratado anteriormente, varias realizaciones comprenden un material de sustrato (por ejemplo, un material biodegradable) que tiene al menos una superficie de crecimiento celular homogénea y características adicionales para soporte estructural. Algunas de dichas realizaciones son ventajosas porque su producción puede simplificarse en comparación con una cesta de sustrato tridimensional. Además, en varias realizaciones, los sustratos con una superficie de crecimiento celular apical homogénea son adecuado para su ubicación en un sitio diana de una manera que aún retiene las células sobre la superficie homogénea (apical) del sustrato y facilita la interacción terapéutica con el tejido diana. En otras palabras, la ausencia de una estructura tridimensional o de tipo caja no reduce la eficacia terapéutica de los sustratos divulgados en este documento.

En varias realizaciones, la fabricación de una pluralidad de sustratos (o las partes modulares de los mismos) se consigue simultáneamente. En algunas realizaciones, las células a usar para el efecto terapéutico se cultivan sobre el material que comprende el sustrato (o una parte del mismo) antes de la fabricación final del sustrato. En algunas realizaciones, los sustratos (o partes modulares de los mismos) se usan de manera eficaz como un sustrato de cultivo in vitro para las células y en un tiempo apropiado, se procesan mediante las fases finales de fabricación (si hay alguna necesaria, dependiendo de la realización) y quedan listos para su implante in vivo con las células precargadas en o sobre el sustrato. Por ejemplo, en una realización, se usa una lámina grande de material polimérico como sustrato para cultivar una pluralidad de células a suministrar en condiciones de laboratorio controladas. Cuando se determina que las células están en un estado óptimo para suministro (por ejemplo, una determinada fase del ciclo celular o una determinada densidad de población), se retira una pluralidad de sustratos individuales de la lámina polimérica, se sellan y quedan listos para implantarse.

Varias realizaciones con superficies apicales homogéneas son particularmente susceptibles a siembra y crecimiento de células simultáneamente sobre una pluralidad de sustratos, que se unen durante el proceso de cultivo y se separan en sustratos individuales antes de su inserción o implante. Por ejemplo, como se muestra en líneas generales en las fig. 18A-18C, pueden fabricarse múltiples sustratos a partir de una pieza contigua del material elegido (por ejemplo, un polímero biodegradable; a partir de ahora en este documento mencionado como el marco). Como se muestra en la fig. 18A, un único marco circular puede proporcionar soporte mecánico para múltiples sustratos implantables individuales. En varias realizaciones, cada sustrato se adhiere al marco más grande mediante una extensión (por ejemplo, un mango; véanse en general las fig. 18B y 18C). Las dimensiones de los sustratos y mangos se describen en mayor detalle anteriormente. En varias realizaciones, el mango del sustrato está libre de crecimiento celular, lo que permite la manipulación y carga en una herramienta quirúrgica sin alterar la integridad de la monocapa.

En varias realizaciones, el marco se dimensiona para maximizar el área superficial disponible para el crecimiento de células sembradas sobre el sustrato. Por ejemplo, el marco puede hacerse opcionalmente en una forma rectangular y estar comprendido de una pluralidad de sustratos rectangulares. En una realización, los sustratos rectangulares más el marco tomados conjuntamente maximizan la relación de polímero a área superficial de la placa de cultivo expuesta empleando una estructura de tipo "peine" de encaje (véase, por ejemplo, la fig. 18D). Debe apreciarse que esta figura es simplemente representativa y puede usarse un número mayor o menor de implantes, dependiendo de la realización. En varias realizaciones, se prefiere un marco circular, ya que dichos marcos pueden dimensionarse para ajustar dentro de una placa de cultivo celular convencional (por ejemplo, una placa de 10 cm). En dichas realizaciones, la cercana yuxtaposición de los bordes del marco con las paredes de la placa de cultivo reduce el flujo y la turbulencia del medio de cultivo sobre la superficie de crecimiento celular, que puede alterar la integridad de determinadas poblaciones celulares en crecimiento. En algunas realizaciones, se usan diámetros mayores o menores de marco de sustrato (por ejemplo, diámetros entre aproximadamente 5 cm a aproximadamente 10 cm, de aproximadamente 6 cm a aproximadamente 9 cm, de aproximadamente 7 cm a aproximadamente 8 cm e intervalos solapantes de los mismos (los marcos también pueden dimensionarse para ajustarse en cualquiera de diversos recipientes de cultivo como se describe en este documento).

Como se analiza en este documento, la pluralidad de sustratos individuales puede fabricarse a partir de un único marco de sustrato más grande, usando técnicas fotolitográficas, moldeo por inyección y similares.

También como se analiza en este documento, los sustratos individuales pueden ser, sin limitación, circulares, oblongos o de cualquier forma personalizada para una patología específica de un paciente individual (véanse, por ejemplo, las fig. 5-8). La personalización de sustratos se describe en mayor detalle a continuación, que puede determinarse por ensayo electrofisiológico (por ejemplo, mfERG), ensayo psicofísico (por ejemplo, microperimetría cinética o estática) o diversas modalidades de imágenes oculares (es decir, tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT), fotografía del fondo, autofluorescencia del fondo (FAF) u oftalmoscopia con láser de barrido confocal (cSLO).

En varias realizaciones, el marco de sustrato no está diseñado para optimizar necesariamente o maximizar una superficie de crecimiento celular contigua, sino que en su lugar está configurado para permitir la selección y retirada de un único sustrato sin alterar otros sustratos en que aún están creciendo células. Como se muestra en líneas generales en la fig. 22A, en algunas realizaciones, se fabrica una pluralidad de sustratos 10' sobre un único marco circular 130 ubicado de una manera que permite el acceso al mango 30' del sustrato mediante una herramienta de manipulación (por ejemplo, pinzas). Una vez fabricado, un único sustrato circular puede entonces sembrarse con células (por ejemplo, RPE-hESC H9) y cultivarse hasta ese momento en que las células han alcanzado un estado de crecimiento óptimo (por ejemplo, una monocapa confluyente sobre el sustrato). Entonces se cortan sustratos oblongos individuales del marco más grande usando un par de tijeras esterilizadas y sometidas a autoclave o una herramienta de retención/corte diseñada a medida. En varias realizaciones, cada sustrato comprende un identificador 155' para ayudar al cirujano a la orientación del sustrato. En algunas realizaciones, el identificador comprende un indicador visual o químico (por ejemplo, un tinte fluorescente que puede visualizarse). En algunas realizaciones, se emplea un sistema de reporte ^mE^mS y puede informar de la viabilidad de las células u otras condiciones ambientales locales alrededor del sustrato. En varias realizaciones, se incrusta una barrera o indicador metálico en el sustrato. Los metales adecuados incluyen, aunque sin limitación, nitinol, titanio, oro, plata, platino, otros metales y aleaciones, láminas hechas de los mismos y similares. En algunas realizaciones, los sustratos se dopan con un fluoróforo para tomar imágenes del sustrato. En dichas realizaciones, la pérdida o migración de células desde el sustrato podría identificarse después del implante o después de la operación, proporcionando de este modo un medio para evaluar la calidad del procedimiento de implante y para determinar si debe implantarse un sustrato alternativo o adicional. En algunas realizaciones, los sustratos comprenden además un código de barras u otro identificador único para el control de calidad/información del lote y con fines de inventario.

Un ejemplo no limitante de una herramienta de retención/corte diseñada a medida 140 se muestra en la fig. 22B. La herramienta de corte de hecho funciona de múltiples maneras adicionales, más allá de posibilitar simplemente el corte de un sustrato individual del marco. Por ejemplo, en varias realizaciones, la herramienta funciona como un peso que aloja marco de sustrato en su posición dentro de un recipiente de cultivo. En varias realizaciones, el dispositivo de retención/corte se adhiere de forma reversible al reverso de una placa de cultivo tisular. En varias realizaciones, el dispositivo de retención/corte se integra en el reverso de una placa de cultivo tisular personalizada. En dichas realizaciones, el soporte/cortador se preesteriliza ventajosamente. En algunas realizaciones, esto es particularmente ventajoso, ya que algunos tipos de células requieren un mayor volumen de medio, lo que aumenta el flujo del medio en todo el recipiente durante la manipulación normal. Dicho flujo de fluido podría alterar la integridad de las poblaciones celulares en crecimiento, aumentando de ese modo el tiempo global para preparar un sustrato para su implante y/o afectar de forma adversa a la viabilidad de las células en el sustrato. Además, la herramienta permite el corte constante y repetible de sustratos individuales.

Además, la herramienta, que tiene una pluralidad de puntos de contacto 150 con el marco, evita el crecimiento de células en una parte del mango del sustrato. Esta parte sin células es la parte que se sujeta por las herramientas de manipulación (por ejemplo, pinzas) que se usan en algunas realizaciones. En dichas realizaciones, el uso de pinzas no altera las células que están creciendo sobre la superficie de crecimiento de sustrato, manteniendo de ese modo la integridad y viabilidad de las células durante la transición del recipiente de cultivo al sitio diana de un sujeto. Cada punto de contacto también comprende una ranura o abertura 151 que está dimensionada para permitir que un dispositivo de corte (por ejemplo, un escalpelo o cuchilla esterilizable diseñada a medida) se inserte a través del punto de contacto y corte el mango de sustrato subyacente, liberando de ese modo el sustrato individual del marco. El punto de corte asociado en el marco de sustrato se muestra como 151' en la fig. 22A.

En algunas realizaciones, los sustratos que se cortan del marco se manipulan e implantan con una herramienta especializada, que se describe en mayor detalle a continuación.

Son ventajosas disposiciones que comprenden una pluralidad de sustratos dentro de un marco, en algunas realizaciones, ya que de la pluralidad de sustratos, puede usarse un determinado número de sustratos para el ensayo de liberación del lote (por ejemplo, ensayos que prueban el genotipo, fenotipo y la función), que consiste en uno o múltiples marcos circulares, mientras que otra parte de los sustratos puede retenerse para el implante en el sujeto. Además, dicho diseño posibilita la evaluación de cada uno de los sustratos en el marco para la identificación del sustrato que se adecua mejor a un procedimiento de implante particular (por ejemplo, tiene números de células, densidad celular, etc. apropiados) y la posterior selección de ese sustrato, sin la perturbación de los otros sustratos en el marco.

La fabricación de una pluralidad de sustratos con células que han crecido previamente en el material proporciona determinadas ventajas adicionales en algunas realizaciones. En una realización, la posibilidad de contaminación de las células se minimiza porque las células (y el material sobre el que crecen) ya están en condiciones de cultivo estéril y la manipulación antes del implante está limitada.

Además, en algunas realizaciones, el crecimiento de células sobre una pluralidad de sustratos permite la selección de las poblaciones celulares más sanas y viables antes del implante. Adicionalmente, esas células que no son óptimas en el momento de la evaluación no tienen que descartarse, sino que pueden cultivarse durante un periodo más largo de tiempo y/o en diferentes condiciones, hasta el momento en que son óptimas para el implante. En algunas realizaciones, un único punto de conexión entre cada sustrato y el marco más grande ayuda en el corte simple y dislocación del sustrato antes de la cirugía, minimizando además la posible contaminación o daño a las células en comparación con diseños similares que requieren la eliminación o corte completo del sustrato a lo largo de su perímetro completo (que puede comprometer la salud y/o integridad de una o más células en la periferia del sustrato). Además, el aumento de escala en la fabricación de una pluralidad de sustratos con células que crecen previamente se consigue fácilmente.

Además de los métodos usados en la fabricación del sustrato, en algunas realizaciones, se emplean procesos adicionales para adaptar además el sustrato, o los materiales de los que se fabrica el sustrato, a las células particulares a usar o el tejido diana. Por ejemplo, en una realización, un sustrato polimérico, tal como parileno, se usa para fabricar el sustrato. En una realización, la superficie de material que formará el sustrato celular del sustrato fabricado se modifica de forma hidrófila usando tratamiento con oxígeno. Este tratamiento hidrófilo genera una superficie ideal para que determinados tipos celulares crezcan sobre la misma.

En algunas realizaciones, En algunas realizaciones, se realiza tratamiento con plasma de oxígeno usando un grabado con iones reactivos (RIE). El grabado se realiza durante dos minutos a una potencia de 100 W y una presión de cámara de O2 mantenida de 200 mTorr. En varias realizaciones, la modificación superficial de parileno C permite que la superficie permanezca hidrófila durante un periodo prolongado de tiempo en comparación con otros polímeros biocompatibles usados habitualmente. El tratamiento con plasma de O2 permitirá, en algunas realizaciones, la densidad máxima de células sembradas, aumentado de este modo la dosis eficaz del agente terapéutico a la zona diana.

Por ejemplo, las células epiteliales pigmentadas retinianas (RPE) crecen particularmente bien sobre una superficie hidrófila, ya que las células RPE se polarizan y, por tanto, se orientan a sí mismas con respecto a la superficie hidrófila. En varias realizaciones, el sustrato potencia la capacidad de las células sembradas sobre el mismo de polarizar, reduciendo de este modo la probabilidad de desprendimiento o migración del sustrato durante el proceso de suministro.

En varias realizaciones, se altera una o más superficies del sustrato para potenciar la manipulación y/o visualización del sustrato. Por ejemplo, las superficies exteriores del sustrato pueden grabarse para dar aspereza a la superficie. La superficie rugosa, en algunas realizaciones, proporciona una superficie que difracta la luz a un grado mayor que una superficie de sustrato lisa, que refleja la luz. En algunas realizaciones, esta difracción de la luz permite que un usuario visualice el sustrato y/o los tejidos por debajo o distales al sustrato más claramente.

Características de MEMS

Como se analiza anteriormente, en varias realizaciones, el sustrato es dispositivos MEMS y/o incorporan tecnología MEMS. En varias realizaciones, el sustrato comprende una unidad central para el procesamiento de datos, uno o más microdetectores que evalúan el entorno celular dentro del dispositivo y/o rodeando el tejido diana. En varias realizaciones, el sustrato comprende además una unidad de información que indica determinada información acerca del entorno que rodea el sustrato o las células dentro del sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato informa sobre la viabilidad o el estado metabólico de las células dentro del sustrato. En algunas realizaciones, pueden usarse electrodos para informar del valor de impedancia eléctrica en la superficie de contacto del dispositivo-tejido, y para cuantificar la proximidad y/o fuerza mecánica y presión. Estos electrodos también se usan, en algunas realizaciones, para medir la concentración de oxígeno y/o para medir el flujo de sangre. En algunas realizaciones, el sustrato informa sobre el grado de interacción entre las células dentro del sustrato y las del tejido diana. Por ejemplo, en determinadas realizaciones oculares, el dispositivo reporta a un usuario información respecto al grado de interacción física que tiene lugar entre las células RPE dentro del dispositivo y las células fotorreceptoras diana. En algunas realizaciones, se usa Fast CV para controlar las concentraciones basales de especies electroactivas (como se analiza anteriormente) para evaluar la salud de las células y los tejidos. Esto es ventajoso en algunas realizaciones, ya que la sobrecarga fotooxidativa es una causa conocida de AMD y el dispositivo se implantaría suficientemente cerca de la coroides para medir la tasa de flujo sanguíneo. Además, en varias realizaciones, el dispositivo permite la evaluación de la morfología celular subyacente y la salud mediante el uso de herramientas de imagen avanzadas (por ejemplo, tomografía de coherencia óptica de dominio espectral (SD-OCT), angiografía con fluoresceína (FA), fotografía del fondo, SD-OCT complementada con óptica adaptativa (AO-SD-OCT). En una realización, el límite entre las células RPE dentro del dispositivo y los fotorreceptores endógenos (el límite de RPE-PR-coriocapilar) es visible usando imágenes de SD-OCT de longitud de onda larga, posibilitando de ese modo la evaluación adecuada de la capacidad de las células de restaurar la función.

En varias realizaciones, el sustrato está configurado para detectar electroquímicamente las especies electroactivas (por ejemplo, concentración de neurotransmisores, tales como noradrenalina (norepinefrina), adrenalina, serotonina y dopamina). En algunas realizaciones, se usa voltimetría cíclica rápida, medición de proximidad a tejido usando la impedancia u otros métodos de detección electroquímica similares para permitir que el dispositivo informe sobre la presencia y/o concentración de especies electroactivas.

En varias realizaciones, las características del sustrato descrito en este documento facilitan el uso de técnicas de imágenes. En particular, se usan técnicas de imágenes oculares en algunas realizaciones. En algunas realizaciones referidas al ojo, por ejemplo, las características del dispositivo permiten la evaluación de la salud del RPE y PR endógeno. Se usa tomografía de coherencia óptica (OCT) en algunas realizaciones y permite las imágenes no invasivas (por ejemplo, sin inyección de tintes o marcadores radioactivos) con un elevado grado de resolución. Dichas técnicas permiten la formación de imágenes de aproximadamente 10-100 células en un ojo intacto. Además, las técnicas avanzadas de imágenes permiten la evaluación de la dinámica de flujo sanguíneo a nivel de capilar que mantiene las células RPE (coriocapilar) y también la evaluación del blanqueado y rejuvenecimiento de los pigmentos visuales fotorreceptores; siendo estos dos mediciones importantes de la funcionalidad del complejo RPE-PR.

De forma ventajosa, muchos de los materiales usados en dispositivos de MEMS tradicionales son los descritos en este documento como adecuados para la fabricación del sustrato. Por ejemplo, los componentes de MEMS del dispositivo pueden fabricarse a partir, por ejemplo, polímeros, silicona o diversos metales. En esas realizaciones en que se fabrican dispositivos de MEMS basados en polímero, pueden usarse procesos tales como moldeo por inyección, estampado o estereolitografía. En esas realizaciones en que se fabrican dispositivos de MEMS basados en silicona, procedimientos tales como depósito de capas de material, formación de patrones de las capas por fotolitografía y después grabado para producir las formas requeridas. En esas realizaciones en que se fabrican dispositivos de MEMS basados en metal, pueden usarse procedimientos tales como galvanoplastia, evaporación y/o pulverización. Se usan otros procesos tales como moldeado y enchapado, grabado húmedo o grabado seco, mecanizado por electroerosión (EDM) y otros procesos similares conocidos en la técnica en varias realizaciones.

En varias realizaciones, se usan características de MEMS para anclar un dispositivo a un tejido diana. En algunas realizaciones, se usan pasadores o grapas de MEMS para sujetar la superficie de un tejido diana.

Fabricación personalizada

En varias realizaciones, los sustratos se fabrican de forma personalizada dependiendo de la enfermedad a tratar y las características o síntomas particulares del individuo afectado con la enfermedad. En varias realizaciones, un médico hará una determinación respecto a la distribución de células dañadas o enfermas en un paciente particular. Como resultado, se genera un sustrato personalizado que coloca el sustrato y las células asociadas con el sustrato en las regiones que se correlacionan con las células dañadas o enfermas.

Por ejemplo, en aplicaciones oculares, puede determinarse el campo visual de un paciente por cualquier técnica de diagnóstico conocida apropiada, tal como perimetría cinética de Goldmann (véase, por ejemplo, la fig. 5). Después de ello (o en lugar de), puede determinarse la función visual local por cualquier técnica conocida apropiada, para generar un electrorretinograma multifocal (véase, por ejemplo, la fig. 6). Con estos datos, puede fabricarse un sustrato personalizado que coloque las células en yuxtaposición con la zona de función perdida o disminuida visual, correspondiendo esa zona a fotorreceptores funcionalmente dañados o muertos.

En varias realizaciones, se forma un molde por inyección basado en la determinación del campo visual/función visual de un individuo (véase, por ejemplo, la fig. 7). En algunas realizaciones, el molde comprende plástico, aluminio u otro material que se pueda trabajar fácilmente (por ejemplo, mecanizable). En algunas realizaciones, el molde puede estamparse o modelarse a partir de materiales elastoméricos en un flujo de proceso fotográfico. En varias realizaciones, los materiales se recubren por rotación sobre discos más grandes de material antes del estampado, generando de este modo un grosor más uniforme en el sustrato estampado resultante. En algunas realizaciones, la forma del molde corresponde a la superficie apical o basal del sustrato. El material de elección para el sustrato, por ejemplo, parileno (u otro material adecuado descrito en este documento) se conforma al molde. En una realización, se deposita una solución de moléculas de polímero de parileno en el molde y se cura por UV. Las superficies apical y basal después de ello se alinean y sellan, como se describe en el presente documento. En varias realizaciones, se deposita una cantidad mínima de metal sobre las superficies apical y basal del sustrato (por ejemplo, alrededor del perímetro) para potenciar la alineación y sellado de las dos partes del sustrato (véase el elemento 90 en la fig. 8). En algunas realizaciones, se deposita una cantidad mínima de platino sobre las mitades del sustrato por evaporación con haz de electrones seguida de depósito de platino electroquímico. En algunas realizaciones, se deposita un óxido de indio-estaño consiguiéndose el sellamiento de las mitades por unión flip-chip. En varias realizaciones, se usan pasadores MEMS para adherir los diversos componentes del sustrato entre sí. Se usan otras cantidades mínimas de metal y técnicas de unión conocidas en la técnica en otras realizaciones. No solamente esta cantidad mínima de metal proporciona alineación potenciada de las mitades del sustrato, también proporciona opcionalmente un grosor adicional (dependiendo de la cantidad de metal depositado) y añade soporte estructural al sustrato (por ejemplo, para evitar el plegado u ondulado durante el proceso de implante).

En varias realizaciones, las células alojadas en dicha cesta de sustrato para tratamiento ocular son células RPE. Debe apreciarse que las células RPE también pueden usarse en otras realizaciones que no son de cesta. Los sustratos de acuerdo con varias realizaciones descritas en este documento son particularmente ventajosos para su uso en aplicaciones oculares, ya que la función de los fotorreceptores dañados puede mantenerse (por ejemplo, se vuelve a obtener función o se evita y/o minimiza la pérdida adicional de función) mediante una interacción física entre las células RPE retenidas dentro del sustrato y los fotorreceptores; no se requiere injerto de RPE.

En varias realizaciones, las células madre de RPE se modifican para que secreten factores neurotróficos que mantienen adicionalmente la supervivencia de las células fotorreceptoras. En determinadas realizaciones de este tipo, se clonan genes que codifican uno o más factores neurotróficos en las células RPE antes del trasplante de modo que se produzca protección significativa y potenciada para las neuronas fotorreceptoras. Los ejemplos de dichos posibles factores incluyen PEDF, CNTF, ^bDⁿF. La sobreexpresión de otros genes puede permitir la función potenciada de RPE. Los ejemplos incluyen: sobreexpresión de integrinas superficiales (que han demostrado aumentar la adhesión de RPE a BM), melanina (grupos étnicos con producción aumentada de melanina están en menor riesgo de AMD) o receptores necesarios para la fagocitosis de discos desprendidos (por ejemplo, CD36, MerTK). En algunas realizaciones, la sobreexpresión de receptores requerida para la fagocitosis es ventajosa, porque en el momento de la intervención terapéutica, probablemente hay una acumulación de lipofiscina y productos residuales metabólicos que requerirían su eliminación.

En varias realizaciones, los sustratos y las células alojadas en los mismos se emplean en el tratamiento de AMD senil y en varias realizaciones preferidas, AMD seca. Otras estrategias para el tratamiento de AMD seca incluyen translocación macular y trasplante de RPE autólogo. Ambos son procedimientos quirúrgicos complejos que requieren anestesia general y ambos están asociados con altas tasas desprendimiento de retina. Además, no hay tratamientos farmacológicos eficaces aprobados por la FDA para AMD seca. Las multivitaminas únicamente ralentizan la progresión de AMD prematura. Con respecto a otras estrategias de tratamiento celular, la diferenciación de hESC o progenitores retinianos en fotorreceptores es compleja, ya que los fotorreceptores implantados tendrían que integrarse y formar sinapsis con el tejido hospedador. En contraste, los sustratos divulgados en este documento permiten el mantenimiento de fotorreceptores existentes mediante la interacción entre las células RPE dentro del sustrato sin la necesidad de injerto y/o formación de sinapsis. Además, varias realizaciones de sustratos divulgadas en este documento promueven la formación de una monocapa de células dentro del sustrato, lo que es ventajoso en comparación con una suspensión celular. En algunas realizaciones, una monocapa de células en un sustrato imita más estrechamente la estructura de la membrana de Bruch, que no puede proporcionar, en AMD, un sustrato para la adhesión y diferenciación adicional de suspensiones celulares inyectadas. Por tanto, algunas realizaciones de los sustratos proporcionan un remplazo sintético de los tejidos dañados en AMD, en lugar de intentar suministrar células que pueden no tener un tejido óptimo al que adherirse in vivo.

Crecimiento celular

En varias realizaciones, las cestas de sustrato (y/o los sustratos no homogéneos) se fabrican de una manera que proporciona una superficie y entorno ideales para el crecimiento, supervivencia y función de las células. Como se analiza anteriormente, pueden alterarse diversas características de los sustratos con objeto de aspectos quirúrgicos del sustrato. Para reiterar, la forma, el espesor, diámetro de poro y densidad de poro se varían, en determinadas realizaciones para permitir de forma óptima que las células alojadas prosperen y produzcan interacciones con el tejido diana, mientras se retienen dentro (o sobre) el sustrato. Por tanto, en algunas realizaciones, el sustrato confiere el beneficio terapéutico de las células alojadas a las células diana sin el injerto de las células alojadas dentro del sustrato. Por ejemplo, en una realización, una capa epitelial de células dentro del sustrato (por ejemplo, RPE) que se diferencian a partir de hESC tratan la degeneración neurológica (por ejemplo, degeneración de fotorreceptores), sin la necesidad de formación de sinapsis o integración neural. Además, estas características pueden optimizarse para evitar la migración de células desde (o fuera de) el sustrato y al interior del tejido diana. Además, estas características pueden variarse para proporcionar suficiente estructura y flexibilidad para que el sustrato se implante in vivo sin dañar el sustrato o las células alojadas en el sustrato.

Como se analiza anteriormente, la superficie de crecimiento celular también puede alterarse (antes o después de completarse la fabricación) para optimizar la superficie para un tipo celular particular. En varias realizaciones, la superficie celular se trata con oxígeno para generar una superficie de crecimiento celular hidrófila sobre el sustrato. En algunas realizaciones, el tratamiento con oxígeno comprende además un compuesto adicional, tal como matrigel, para mantener el crecimiento de células polarizadas (por ejemplo, RPE). En varias realizaciones, dichos compuestos de matrigel están libres de material xenógeno. También como se analiza anteriormente, en determinadas realizaciones, el diámetro de poro puede ajustarse dependiendo del tipo celular a alojar en el sustrato.

En varias realizaciones, también pueden suministrarse agentes inmunosupresores para evitar el rechazo de células alogénicas introducidas por el sustrato. En algunas realizaciones, el sustrato puede usarse para proporcionar suministro dirigido y liberado de estos agentes o fármacos tales como corticoesteroides (por ejemplo, prednisona), metotrexato, ciclosporina, antimetabolitos, inhibidores de linfocitos T y agentes alquilantes. La administración de dichos agentes inmunosupresores se usa para evitar el rechazo de injertos o trasplantes o en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios. Sin embargo, pueden requerirse dosis elevadas, y la administración oral, o incluso el suministro más localizado y dirigido mediante inyección puede ser peligroso debido a un riesgo aumentado de infección. En varias realizaciones, la introducción de estos agentes mediante liberación controlada y dirigida desde los sustratos divulgados en este documento aumenta la probabilidad de aceptación de injerto alogénico, y minimiza el riesgo de infección causada por supresión inmunitaria.

Otros fármacos que han usado los ensayos clínicos para el tratamiento para AMD pueden liberarse por el sustrato de una manera controlada y dirigida similar por incrustación en una parte biodegradable o en el propio proceso de interconexión. Los ejemplos incluyen estatinas que reducen los lípidos, retinoides (por ejemplo, acitretina, alitretinoina, bexarotene, etretinato fenretinida, isotretinoína, tazaroteno, tretinoina) y fármacos anti-VEGF.

Como se analiza anteriormente, en varias realizaciones, se atempera un segundo sustrato al sustrato principal. Por ejemplo, en algunas realizaciones, se emplea un sustrato biodegradable. En una realización, se usa un material de policaprolactona biodegradable (PCL) combinado con polietilenglicol (PEG). El material de PCL-PEG de polimerización se recubre por rotación en cubreobjetos de vidrio para generar películas delgadas de un grosor deseado. Tras el tratamiento con tampón acuoso o medio, el PEG soluble en agua se retira por lavado y crea poros en la película. Como se analiza anteriormente, pueden personalizarse realizaciones biodegradables y, en una realización, la relación del PCL a PEG afecta a la tasa de degradación del sustrato. Como el PEG se retira por lavado para formar poros, los poros aumentan el área superficial del polímero expuesto a agua y, por lo tanto, aumenta la tasa de degradación. Mediante esta estrategia, tanto la porosidad de las películas como la tasa de degradación pueden manipularse basándose en la cantidad de PEG añadida a la mezcla de polímero. En algunas realizaciones, se atemperan polímeros con aminoácidos cíclicos (Arg-Gly-Asp; cRGD) con la película polimérica, proporcionando de este modo una superficie polimérica que promueva la adhesión celular y el crecimiento imitando la proteína de matriz extracelular, fibronectina.

Carga celular

En varias realizaciones, las células a usar en o sobre el sustrato suministrado se cultivan sobre el sustrato antes de la fabricación final del sustrato. Como se analiza anteriormente, esto proporciona varias ventajas con respecto a minimizar el riesgo de contaminación o daño a las células o el sustrato. Sin embargo, en varias realizaciones, las células se implementan en o sobre un sustrato completamente fabricado y esterilizado. Los sustratos como se describe en este documento pueden esterilizarse por irradiación gamma, óxido de etileno, autoclave, esterilización por UV u otros procedimientos conocidos sin degradación o daño. Dicha implementación celular se realiza en condiciones estériles de cultivo celular o estériles de área quirúrgica. Dichas realizaciones tienen la ventaja, entre otras, de que pueden seleccionarse células óptimamente sanas y robustas y depositarse en el sustrato justo antes del implante. Por ejemplo, en varias realizaciones, se cargan células en una cesta de sustrato 3D por un cirujano mientras se está en la sala de operaciones. Esta metodología es ventajosa porque un cirujano podría seleccionar de varias diversidades de sustratos, dependiendo de las características del paciente u otros parámetros, y después cargar de forma óptima las células sanas en el sustrato. En algunas realizaciones, un dispositivo de presión de vacío funciona ayudando al cirujano a mantener y rellenar la cesta de sustrato con células. En varias realizaciones, esto es ventajoso porque la presión de vacío que mantiene la cesta de sustrato también permite que el volumen de fluido de suministro celular (que es potencialmente más grande que el volumen de células) se retire de la cesta de sustrato a través del acceso biológico. En algunas realizaciones, el sustrato se carga en un introductor quirúrgico y después se carga con células. En algunas realizaciones, el sustrato se carga con células, después se coloca en el introductor quirúrgico. En varias realizaciones usando sustratos no homogéneos asimétricos, las células se siembran previamente y se cultivan de forma estable en la superficie apical del sustrato, antes de la selección y el posterior implante del implante por un cirujano.

Con referencia a las fig. 2A-2B y la fig. 9, algunas realizaciones del sustrato comprenden una característica de retención celular 70. Dicha característica funciona proporcionando un pase unidireccional para células a la luz 50 de la cesta de sustrato. En varias realizaciones, la característica de retención se conforma de forma personalizada para proporcionar un bloqueo con una pipeta (u otro dispositivo) 100 que suministra las células a la luz de la cesta de sustrato. En varias realizaciones, se usa una membrana resellable o "autorreparable" de modo que una pipeta o aguja pueda perforar a través de la membrana hasta la luz para el suministro de células, pero tras la extracción de la pipeta o aguja, no deja orificio abierto para que las células escapen. En algunas realizaciones, se usa un viscoelástico. En algunas realizaciones, se usa un adhesivo biocompatible. En otras realizaciones más, se usa una válvula unidireccional. Dicha válvula puede comprender dos o más solapas que se abren hasta la luz tras el avance de una pipeta de suministro, lo que permite el depósito de células en la luz. Tras la retirada de la pipeta, las solapas vuelven a su posición cerrada, reteniendo de ese modo las células depositadas dentro de la luz. En algunas realizaciones, la válvula unidireccional se forma de modo que se cree un sellamiento estanco a líquidos para evitar el retroflujo de las células, mientras que en otras realizaciones, no se forma un sellamiento a estanco a fluidos.

Tipos celulares

Dada la amplia diversidad de enfermedades que inducen daño celular o muerte celular, puede alojarse una amplia diversidad de tipos celulares dentro de los sustratos descritos en este documento para conseguir efectos terapéuticos. En algunas realizaciones, se usan células cultivadas. En varias realizaciones, se usan células almacenadas. En algunas realizaciones, las células cultivadas comprenden células madre. Las células madre son células pluripotentes que pueden diferenciarse en diversos tipos celulares diferentes. En algunas realizaciones, se usan células madre embrionarias, mientras que en otras realizaciones, se usan células madre adultas. En varias realizaciones, las células madre embrionarias son células madre embrionarias humanas. Las células madre embrionarias, que se obtienen normalmente de un embrión en fase tardía, tienen el potencial de desarrollarse en cualquier tipo de célula en el organismo. En algunas realizaciones, se usan líneas de células madre H1, H7, H9, SHEF-1 u otras similares aprobadas por la FDA. En la medida en que el material de origen embrionario humano, por ejemplo, células madre embrionarias humanas, mencionado en la descripción de la invención se obtiene por la destrucción de un embrión humano, el material embrionario humano no forma parte de la invención reivindicada y se menciona con motivos de referencia únicamente. Esto se aplica independientemente de si la destrucción es directa o indirecta, por ejemplo, en casos donde el material embrionario se obtiene de una línea celular que se había establecido mediante la destrucción de un embrión humano. Las células madre adultas son normalmente multipotentes y pueden desarrollarse en un número más limitado de tipos celulares, normalmente aquellos que están relacionados con el tipo tisular del que se aislaron las células. En algunas realizaciones, las células madre son alogénicas para el destinatario (por ejemplo, como es el caso con las células madre embrionarias). En algunas realizaciones, las células madre son autólogas para el destinatario. En otras realizaciones, se usan células singénicas, mientras que en otras realizaciones más, se usan células xenogénicas. En algunas realizaciones, se cultivan células recién aisladas e implementadas en o sobre el sustrato para su implante en un individuo destinatario. En otras realizaciones, se usan células crioconservadas. En algunas realizaciones, se usan células madre pluripotentes inducidas.

En varias realizaciones, se aíslan células madre (o se descongelan) y se cultivan en condiciones de cultivo in vitro estériles convencionales. En algunas realizaciones, las células se cultivan en medio de cultivo tisular convencional conocido y usado para el crecimiento de células madre. En otras realizaciones, se usa un medio de cultivo libre de material xenógeno. En algunas realizaciones, el medio de cultivo se complementa con uno o más factores de crecimiento para mantener la viabilidad de las células y/o inducir la diferenciación en un tipo celular particular. En algunas realizaciones, se incluyen factores de crecimiento en suero usados para complementar el medio de crecimiento. En algunas realizaciones, se añaden factores específicos, tales como, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento transformante (por ejemplo, TGFp1), factor de crecimiento de tipo insulina, por ejemplo, IGF-1). Las células pueden cultivarse, pasarse y cultivarse de forma continua hasta el momento en que las células tienen características óptimas para implementarse en los sustratos descritos en este documento. En este punto, las células (si son células en suspensión) simplemente pueden recogerse, ajustarse hasta una densidad celular deseada e implementare (por ejemplo, inyectarse) en el sustrato. Las células que se cultivan sobre una superficie pueden digerirse enzimáticamente (por ejemplo, tratarse con tripsina) o desprenderse mecánicamente de la superficie, ajustarse hasta una densidad celular deseada e implementare (por ejemplo, inyectarse) en el sustrato.

Debido a las características y ventajas de varias realizaciones de los sustratos descritos en este documento, en varias realizaciones, los números celulares que se implementan en o sobre el sustrato son relativamente bajos. En varias realizaciones, el número de células implementadas varía de aproximadamente 1,0 x 103 a 1,0 x 108. En varias realizaciones, los números de células implementadas en o sobre el sustrato varían de aproximadamente 1,0 x 104 a aproximadamente 1,0 x 107, de aproximadamente 1,0 x 105 a aproximadamente 1,0 x 106, e intervalos solapantes de los mismos. En una realización, se usan aproximadamente 1,5 x 105 células. En otras realizaciones, se usan números mayores o menores de células.

Como se analiza anteriormente, pueden usarse células de diversos tejidos. En varias realizaciones, se usan células oculares para tratar enfermedades oculares incluyendo, aunque sin limitación, degeneración macular senil (húmeda o seca), edema macular diabético, neovascularización coroidal idiopática o degeneración macular por alta miopía. En algunas realizaciones oculares, se usan células RPE. En varias realizaciones, se usan células madre cardiacas para tratar trastornos cardiovasculares tales como infarto de miocardio, daño isquémico al tejido cardiaco, insuficiencia cardíaca congestiva, aneurisma, eventos inducidos por ateroesclerosis, accidente cerebrovascular (apoplejía) y arteriopatía coronaria. En varias realizaciones, se usan células madre hepáticas para tratar una enfermedad hepática tal como hepatitis, cirrosis, cáncer y similares. Las enfermedades en otros tejidos, tales como el riñón, pulmón, páncreas, intestino y tejidos neurales, entre otros, pueden tratarse con los métodos y dispositivos divulgados en este documento. En algunas realizaciones, pueden usarse células madre de médula ósea recogidas para repoblar células hematopoyéticas que se reducen debido a leucemias, cánceres o tratamientos que reducen los recuentos de células sanguíneas.

Métodos de suministro

Los sustratos de acuerdo con realizaciones descritas en este documento pueden suministrarse mediante diversos métodos dependiendo del tejido diana. Los sustratos pueden suministrarse durante un proceso quirúrgico abierto. Por ejemplo, durante cirugía ocular, puede suministrarse un sustrato a una región del ojo. En varias realizaciones, los sustratos se implantan en un procedimiento de suministro específico. En algunas realizaciones oculares, los sustratos se suministran al espacio subretiniano. En algunas realizaciones, se usa un procedimiento desde el interior. En otras realizaciones, se usa un procedimiento desde el exterior. En algunas realizaciones, se usa una aproximación quirúrgica a la parte plana para el implante. En otras realizaciones se usa una aproximación transescleral para el implante. En varias realizaciones, los sustratos se fijan (por ejemplo, se suturan, se adhieren) a una superficie. En varias realizaciones, los sustratos se suministran por vía endoscópica, mediante métodos basados en catéter, por vía intravascular, por vía intramuscular, por vía estereotáctica (por ejemplo, para el suministro del sustrato/células al cerebro u otro tejido neural) o mediante otro medio conocido en la técnica para un tejido diana particular. Dependiendo del diseño del sustrato y el tejido diana, se usan herramientas quirúrgicas personalizadas para hacer que el suministro de los sustratos sea menos traumático, más rápido o por lo demás de menos riesgo o más beneficioso para el sujeto.

En varias realizaciones, la aproximación quirúrgica para implante ocular es una aproximación a la parte plana. En algunas especies, la parte planta se encuentra aproximadamente 3,5-4 mm desde la córnea. En varias realizaciones, el sustrato se suministra paralelo a la pared posterior del ojo.

Ejemplos

Se pretende que los ejemplos proporcionados a continuación no sean realizaciones limitantes de la invención.

Ejemplo 1 - Determinación del diámetro de poro que retiene células RPE

En el ojo, una membrana de Bruch sana funciona como tamiz molecular que regula el intercambio de nutrientes y residuos metabólicos entre la retina y la coroides. Basándose en la ubicación subretiniana de determinados sustratos dirigidos al ojo divulgados en este documento, la porosidad del sustrato de forma ideal simularía estas funciones de una membrana de Bruch sana.

Para investigar el intervalo de diámetro de poro que permitiría que funcionara, se realizaron ensayos de migración celular. Se fabricaron discos circulares de parileno con diámetros variables de poro (1,2, 3 y 5 um) y se colocaron en la parte superior de inserto de cultivo celular de poliéster (PET) de Transwell con poro de 8 um. Los insertos se colocaron en placas de cultivo de 24 pocillos. Las células RPE se sembraron en los discos de parileno con medio sin suero dentro de los insertos de cultivo celular de PET y medio que contenía 20 |jg/ml de PDGF humano recombinante (como un quimioatrayente) fuera de los insertos. Después de cultivo durante una noche, las membranas de inserto de PET y las placas de cultivo de 24 pocillos que mantenían los insertos se tiñeron ambas con hematoxilina. Los resultados indicaron que los cuerpos celulares RPE podían migrar a través de poros de 2, 3 y 5 jm de diámetro, pero no a través de poros de 1 jm . Por tanto, se concluyó que los tamaños de poro que varían de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 1,5 jm son óptimos para determinados sustratos que contienen RPE.

Ejemplo 2- Sustratos poliméricos biodegradables

Como se analiza anteriormente, se usan sustratos de parileno en varias realizaciones. Se usa material de policaprolactona (PCL) combinado con polietilenglicol (PEG) para ensayar la formación de poros en sustratos. Durante la polimerización, el material de PCL-PEG se recubre por rotación en cubreobjetos de vidrio para generar películas delgadas de un grosor deseado, como se analiza anteriormente. Aminoácidos cíclicos (Arg-Gly-Asp; cRGD) unidos covalentemente a un copolímero de PEG-PCL se atemperaron en la superficie de las películas. Tras el tratamiento con tampón acuoso o medio, el PEG soluble en agua se retira por lavado y crea poros en la película. La relación de PCL-PE^gafecta a la tasa de degradación del sustrato. Estos poros aumentan el área superficial del polímero expuesto al agua y, por lo tanto, aumentan la tasa de degradación. Mediante esta estrategia, tanto la porosidad de las películas como la tasa de degradación pueden manipularse basándose en la cantidad de PEG añadido a la mezcla de polímero.

Ejemplo 3 - Análisis in vitro de RPE-hESC

El presente ejemplo demuestra que colonias de hESC cultivadas hasta superconfluencia, en ausencia de FGF2, en capas de alimentación de ratón o humanas o en matrigel, producen de forma rutinaria focos pigmentados diferenciados, que crecen en tamaño. Estos focos pigmentados pueden escindirse y expandirse para producir monocapas altamente diferenciadas que son similar a RPE fetal cultivado o RPE cultivado humano adulto. Véase la fig. 11. Las células pueden producirse en cantidades necesarias para uso clínico a una pureza de un 99 %, que se determina por análisis microscópicos de células pigmentadas, así como PCR cuantitativa para nanog y Oct-4, marcadores de posibles hESC indiferenciadas contaminantes. Los cultivos en monocapa son fenonormalmente estables después de cultivo prolongado (11 meses) sin pase. Además, puede mantenerse el fenotipo y el cariotipo normal durante hasta al menos 4 pases. Basándose en los números de células en cultivo, algunas realizaciones emplean aproximadamente 1,5 x 105 células en un sustrato de 5 mm de diámetro que se usan para cada ojo tratado.

Se han caracterizado múltiples líneas de RPE derivadas de diferentes líneas de hESC con respecto al patrón de expresión de ARN global, y el análisis cuantitativo de los ARNm marcadores clave de RPE y proteínas. El RPE-ESC humano es notablemente similar al RPE fetal humano nativo en sus patrones de expresión (coeficiente de correlación de 0,97 entre RPE-hESC y RPE humano fetal cultivado). La RT-PCR cuantitativa mostró niveles similares de transcritos específicos de RPE importantes en la regulación génica (Mit-F, OTX-2, Rax, Six-3), síntesis de pigmentos (Tyr, Tryp-1, Tryp-2, Silver), producción de retinol (CRALBP, RPE65), formación de unión ocluyente (ZO-1, Claudina-3) y otros marcadores clave de RPE (Bestrofina, Emmprina, Transtirretina, factor derivado del epitelio pigmentado (PEDF). El RPE-hESC expresa proteínas asociadas con estos transcritos, así como otros marcadores de RPE cruciales (integrinas, lamininas, fibronectina, apoE, fibulina-5, pMell7. La expresión de RPE65 por estas células es de particular importancia, ya que deficiencias en esta proteína dan lugar a ceguera.

Como el RPE nativo, las monocapas de RPE-hESC están polarizadas con microvellosidades apicales, núcleos basales y pies terminales, y uniones ocluyentes laterales, que se detecta por análisis de microscopia electrónica y medición de resistencia transepitelial (TER). Realizan el tráfico dirigido en la membrana con ubicación apical de Na/K ATPasa, expresión de integrina alfavbeta5, secreción apical de PEDF y secreción basal de colágeno IV y VEGF. Además, la superficie apical de RPE-HESC incluye 1-2 cilios por célula que expresan tubulina a-acetilada, con una estructura 9+0 típica de RPE fetal human y de roedor posnatal temprana. Las láminas polarizadas de RPE-hESC expresan proteínas de unión ocluyente (ocludina, claudina y Z01) ubicadas en las regiones de contacto entre células típicas de células RPE maduras, y generan TER típico de RPE nativo in situ. Véase la fig. 12A.

Para mostrar que las células RPE-hESC tienen capacidad de fagocitosis eficaz de los segmentos externos de los fotorreceptores (un proceso que se produce en un ciclo diurno in vivo y es necesario para la visión), se añadieron segmentos externos de bastones fotorreceptores (ROS) marcados con fluorescencia a las láminas de RPE-hESC, RPE fetal o fibroblastos H2S7 (control negativo) in vitro y se cuantificó la unión/fagocitosis. Véase la fig. 12B. El RPE-hESC se cuantitativamente similar al RPE fetal en su capacidad fagocítica, y en que la actividad se bloqueaba por anticuerpos contra integrina alfavbeta5 o receptores MerTK. Adicionalmente, se colocó retina humana primaria (obtenida de cirugía de translocación macular) en láminas de RPE-hESC, y se detectó la fagocitosis de segmentos externos de fotorreceptores humanos.

Se realizaron análisis funcionales adicionales en algunos experimentos. Por ejemplo, en varias realizaciones, se evalúa la isomerización de todo-trans-retinaldehído en 11-cis-retinaldehído. Es una función realizada por el RPE in situ que es importante para el ciclo visual y el mantenimiento de la visión. La capacidad de RPE-hESC de realizar esta isomerización enzimática se controlará por análisis de HPLC de la conversión de palmitato de todo-trans-retinilo en la forma 11-cis en homogeneizados celulares acuosos. Otra función importante de las células RPE in situ es la eliminación fagocítica de la membrana del segmento externo de los fotorreceptores desprendidos. La fagocitosis se controla usando segmentos externos de fotorreceptores de bastones bovinos marcados con SNAFI-2 (Molecular Probes) para permitir la diferenciación entre los segmentos externos unidos a superficie e internalizados. El factor derivado de epitelio pigmentado (PEDF) es un producto de secreción principal de las células RPE in situ. Actúa como inhibidor de la angiogénesis y tiene potentes propiedades neuroprotectoras. Su secreción por RPE fetal humano cultivado y RPE-hESC es característica del establecimiento de una monocapa epitelial polarizada con alta resistencia transepitelial en varias realizaciones, por lo tanto, la presencia de PEDF en medio acondicionado de células RPE-hESC se controla en un ensayo ELISA.

Ejemplo 4 - Actividad modificadora de enfermedad de RPE-hESC en modelos animales de distrofia de la retina

El RPE-hESC puede rescatar los fotorreceptores y la función visual. Las células RPE-hESC trasplantadas en retina de rata RCS distrófica sobrevivieron en el espacio subretiniano, continuaron su maduración in vivo y fagocitaron ROS. Algunas estrategias favorecieron la inyección subretiniana de RPE-hESC, nuestra estrategia es cultivar RPE derivado de hESC en sustratos biocompatibles e implantar estos "parches" en el espacio subretiniano para volver a establecer una superficie de contacto funcional de RPE-fotorreceptor. Aunque puede ser más fácil realizar la inyección de suspensiones celulares, se usa el suministro de células sobre un sustrato que imita la membrana de Bruch en varias realizaciones. Hay dos razones principales para este cambio de estrategia. En primer lugar, la mácula envejecida contiene tanto una membrana de Bruch envejecida como células RPE envejecidas, y esta membrana envejecida no mantiene la adhesión y el crecimiento de células RPE. En segundo lugar, una gran proporción de células inyectadas finalmente se perderá en el proceso debido a procesos mecánicos o apoptóticos; un fenómeno que se ha demostrado en estudios de inyección de suspensión celular. En contraste, el RPE-hESC cultivado en ácido glicólico poliláctico (PLGA; un polímero biodegradable); trasplantado en el espacio subretiniano de ratas RCS inmunosuprimidas, puede plasmarse en imágenes de forma precisa mediante tomografía del fondo y OCT. Véase la fig. 13. Además, se realizan imágenes de alta resolución y se usan para evaluar la colocación y la integridad de los injertos subretinianos. La tecnología de OCT de dominio espectral de alta velocidad (SDOCT), permite plasmar imágenes tridimensionales detalladas de la retina de roedor y la visualización de diversas capas. Véase, por ejemplo, la fig. 16.

El sustrato está configurado para degradarse completamente en 90 días desde su implante. Tres semanas después del trasplante, los ojos se procesaron para examen patológico. La inmunotinción usando el marcador específico humano TRA-1-85 reveló supervivencia de las células RPE-hESC trasplantas en el espacio subretiniano de ratas RCS distróficas y conservación de los fotorreceptores superpuestos en la capa nuclear externa (ONL) en comparación con la retina adyacente, los ojos de control o las inyecciones con polímero en solitario. Véase la fig. 14.

Ejemplo 5- Tratamiento de degeneración macular senil

La degeneración macular senil es una afección encontrada en adultos ancianos en que la zona de la mácula de la retina sufre adelgazamiento, atrofia y hemorragia. Esto provoca la pérdida de visión en la zona central de visión, particularmente la incapacidad de ver detalles finos. La AMD se clasifica como seca (no neovascular) o húmeda (neovascular), dando lugar normalmente la AMD húmeda a una pérdida de visión más grave. La generación macular seca se diagnostica cuando manchas amarillentas conocidas como drusas empiezan a acumulares desde depósitos o desechos del tejido en deterioro principalmente en la zona de la mácula. Puede producirse pérdida de visión central gradual con generación macular seca. La AMD seca puede progresar a AMD húmeda, en que nuevos vasos sanguíneos crecen por debajo de la retina y derraman sangre y líquido. La acumulación de derrame y presión daña las células retinianas altamente sensibles (fotorreceptores), que pierden función o mueren, dando lugar de ese modo a manchas ciegas en la visión central.

Se han desarrollado estrategias de trasplante de RPE para AMD durante los últimos 20 años, con el objetivo de volver a establecer la interacción crítica entre el RPE y el fotorreceptor. Los avances han provenido de una gran cantidad de trabajo en animales y más recientemente de varios ensayos en seres humanos usando las propias células del paciente. Sin embargo, las estrategias actuales se han visto impedidas por las complejidades en el procedimiento quirúrgico y las limitaciones en el suministro y calidad de las células. La evidencia más apremiante de más de 260 trasplantes de RPE homólogos y autólogos, principalmente de AMD neovascular, proviene de estudios de translocación macular. Este procedimiento quirúrgico complejo y arriesgado implica desprender y mover la retina de modo que la zona macular dañada de la retina se ponga en contacto con RPE sano. Aunque no es estrictamente trasplante de RPE, es funcionalmente un trasplante de RPE autólogo.

Otras estrategias para trasplante de RPE autólogo han evolucionada de la rotación del colgajo del pedículo de RPE-coroides submacular a la trasposición de injerto sin RPE-coroides submacular, la inyección submacular de suspensión de células RPE del fondo periférico y, actualmente, la inserción submacular de injerto de parche de RPE-coroides desde el fondo periférico. La última técnica implica recoger un injerto de parche de RPE-coroides de la periferia, seguido de inserción bajo la mácula y se está usando actualmente por varios grupos europeos.

Aunque estos resultados son alentadores porque se restaura la visión en muchos casos, destacan la complejidad de los procedimientos, que requieren dos incisiones grandes en la retina; la primera para recoger y la segunda para implantar. Dichas incisiones grandes en la retina (retinotomías) están asociadas con un alto riesgo de desprendimiento de retina. La estrategia de usar suspensiones celulares tiene el inconveniente añadido de que las células no adheridas pueden escapar fácilmente al interior de la cavidad vítrea, dando lugar a proliferación y cicatrización en la superficie de la retina interna, dando como resultado desprendimientos de retina complejos y a menudo irreparables (vitreorretinopatía proliferativa (PVR).

También se han trasplantado células RPE en el cerebro en ensayos clínicos para enfermedad de Parkinson, ya que se ha demostrado que producen dopamina. De forma relevante para varias realizaciones divulgadas en este documento, estos estudios no detectaron ninguna formación tumoral por RPE. En seres humanos adultos, el RPE no se replica de forma extensiva, y los informes de tumores derivados de RPE que se producen espontáneamente son extremadamente infrecuentes.

Se usan sustratos como se divulga en este documento para suministrar células RPE al espacio subretiniano de sujetos que tienen AMD para tratar la pérdida de visión facilitando la interacción de las células RPE con los fotorreceptores, manteniendo de ese modo los fotorreceptores y evitando la pérdida adicional de función o la muerte de los fotorreceptores.

Se realizan estudios in vivo en modelos de rata de AMD. Se suministran sustratos sembrados con células RPE a animales tratados en comparación con ratas enfermedades que reciben sustratos simulados (por ejemplo, vacíos) o ratas normales con operación simulada.

Se realiza seguimiento clínico y caracterización tanto en las ratas tratadas como en los controles. La evaluación clínica se hace usando angiografía del fondo (FA) (para evaluar la salud de la vasculatura), fotografía del fondo, autofluorescencia del fondo (FAF), nistagmo optocinético (OKN), electrorretinografía (ERG) y ERG multifocal (mfERG). La evaluación histopatológica se realiza por evidencias de formación de tumor local/teratoma, mantenimiento de un fenotipo de RPE diferenciado de las células trasplantadas con ausencia de proliferación celular (inmunohistoquímica usando anticuerpos específicos de ciclo celular), migración de células desde la monocapa, pérdida celular o daño a fotorreceptores adyacentes o el complejo de membrana de Bruch/coroides e inflamación (macrófagos, linfocitos T), o reacción con el sustrato. El RPE-hESC trasplantado se identificará controlando la expresión de una proteína marcadora humana (TRA-1-85). La necesidad de inmunosupresión se evalúa midiendo la expresión de MHC de clase I y II in vitro (con y sin activación por interferón gamma) e in vivo por inmunohistoquímica. Las ratas tratadas muestran evaluación clínica mejorada con respecto a uno o más de los parámetros medidos.

Ejemplo 6 - Generación de sustratos que contienen células madre

Como se analiza anteriormente, en varias realizaciones, el RPE-hESC puede diferenciarse en monocapas polarizadas en sustratos biodegradables y no biodegradables. En varias realizaciones, las células se cultivan previamente sobre un sustrato que finalmente se incorpora en una cesta de sustrato tridimensional para su implante. Una lámina de sustrato adecuado, tal como un copolímero de policaprolactona y polietilenglicol (PCL-PEG) se polimeriza al grosor deseado. Mientras se polimeriza, el copolímero se recubre por rotación sobre un cubreobjetos para adaptar el grosor. Un copolímero de PCL-PEG que contiene aminoácido cíclico se atempera en el sustrato polimerizado. Entonces se añade medio acuoso para disolver el PEG soluble en agua y generar poros. Entonces se esteriliza el sustrato poroso. Después se cultivan las células madre en la lámina esterilizada hasta una densidad celular deseada. Después se corta una o más piezas de sustrato de mantenimiento celular de la lámina, se alinean y atemperan con una o más piezas adicionales de copolímero para generar una cesta de sustrato tridimensional que contiene células adecuada para el implante directo.

En varias realizaciones, se usa PLGA para formar un sustrato biodegradable. Como se muestra en la fig. 15A, el RPE-hESC cultivado en PLGA muestra microvellosidades apicales bien desarrolladas después de 3 semanas de cultivo. Otras realizaciones emplean material no biodegradable. El RPE-hESC cultivado en parileno no biodegradable modificado en superficie también muestra excelente adhesión y desarrollo de microvellosidades apicales (véase el recuadro de la fig. 15B) en 48 h de cultivo. Aunque en algunas realizaciones las células se cultivan sobre un sustrato antes de la fabricación del sustrato final, en otras realizaciones, las células se implementan en un sustrato completamente fabricado antes del implante.

Ejemplo 7- Generación de sustratos configurados para recibir células madre

Como se analiza anteriormente, en varias realizaciones, se fabrican cestas de sustrato que después pueden tener una o más variedades de células madre implementadas dentro de las cestas de sustrato antes del implante en un tejido diana. Se crean dos moldes que corresponden a una parte superior (apical) y parte inferior (basal) de las cestas de sustrato tridimensionales deseadas. Los moldes están configurados para proporciona una luz interior tras el ensamblaje de las dos partes de las cestas de sustrato y un medio de acceso para suministrar células madre a la luz después del ensamblaje. Se polimeriza un polímero dentro de cada parte del molde. Tras la polimerización, el polímero se retira de su molde y se expone a un medio acuoso para generar poros dentro del sustrato. Los poros están configurados para retener células dentro de la cesta de sustrato final y aún permitir la interacción (física, química o de otro tipo) entre las células y un tejido diana. Las dos partes poliméricas entonces se alinean y atemperan para generar una cesta de sustrato poroso tridimensional que es adecuada para recibir células madre y después implantarse en un destinatario para generar un efecto terapéutico en dicho destinatario mediante la interacción de las células y el tejido diana.

Ejemplo 8 - Encaje de RPE-hESC y segmentos externos PR en ojo de rata

Usando un sustrato de parileno que comprende al menos una superficie de crecimiento celular plana, se demostró el encaje de RPE-hESC H9 con los segmentos externos fotorreceptores (PR). La rata de Royal College of Surgeons (RCS) es un modelo animal establecido para degeneración de la retina hereditaria. El defecto genético en ratas RCS causa la incapacidad del epitelio pigmentado de la retina (RPE) de fagocitar los segmentos externos fotorreceptores. Se sembraron células RPE-hESC en sustratos de parileno y se cultivaron de acuerdo con las técnicas descritas anteriormente. Una vez que las células RPE han crecido hasta confluencia, se implantó un sustrato en el ojo de la rata RCS, con la superficie de crecimiento celular yuxtapuesta con la capa nuclear exterior de los fotorreceptores. Se implantaron sustratos de control (sin células) en ratas RCS para las comparaciones.

La fig. 23A muestran una foto del fondo suturado de sustrato de parileno implantado en el ojo de la rata RCS. La fig.

23B representa la tinción con hematoxilina y eosina (H y E) una semana después del implante en rata RCS. El panel inferior derecho de la fig. 23B muestra que RPE-hESC encaja con los segmentos externos PR. La mayoría del RPE-hESC se retiene en la superficie apical del sustrato. Los sustratos de control sin sembrar no muestran dicha conectividad (panel inferior izquierdo 24B). La fig. 23C muestra una sección transversal de la órbita aislada de rata con implante (1 semana después del implante). La fig. 23D es un primer plano de alta resolución del sustrato de parileno sembrado con RPE-hESC. Puede observarse encaje y localización de los somas de RPE en la superficie del sustrato. Véase también la fig. 27, que es una imagen de microscopia electrónica de barrido de RPE-hESC sembrado en un sustrato de parileno.

Ejemplo 9 - Encaje de RPE-hESC y segmentos externos PR en ojo de rata

Como se analiza anteriormente, el encaje de las células RPE-hESC con los segmentos externos de los fotorreceptores permite que tenga lugar la interacción funcional y metabólica entre las células RPE y los fotorreceptores. Esta interacción mantiene la viabilidad de los fotorreceptores y como se analiza en los ejemplos previos, da lugar a la recuperación funcional de la visión. En este ejemplo, se evaluó el injerto y el encaje a largo plazo de células RPE en ratas distróficas por microscopia electrónica de transmisión.

Como con los ejemplos anteriores, se implantaron sustratos que comprenden células RPE en el espacio subretiniano de ratas RCS distróficas en el día 29 después del nacimiento. El sustrato usado en este ejemplo era de aproximadamente 6,5 micrómetros de grosor, aunque como se analiza anteriormente, pueden usarse otras dimensiones en diversas realizaciones. Los animales se sacrificaron en el día 38 después del nacimiento (9 días después de la cirugía) y 87 después del nacimiento (58 días después de la cirugía). No se administró tratamiento inmunosupresor a las ratas.

Como se muestra en la fig. 24, en el día 9 después del implante, las microvellosidades de RPE están ubicadas cerca de los discos de segmento externo. En el día 58 después del implante, mostrado en las fig. 25 y 26, puede observarse encaje entre las microvellosidades de RPE y los discos de segmento externo. Por tanto, incluso en puntos temporales prolongados, las células RPE son viable y están encajadas funcionalmente con el segmento externo fotorreceptor. Estos datos demuestran que los RPE implantados de acuerdo con los métodos divulgados en este documento, y usando los sustratos divulgados en este documento, proporcionan injerto funcional a largo plazo de RPE en el ojo.

Ejemplo 10 - Sustratos sembrados con células implantados restauran la función

Como se analiza en este documento, el suministro de células a un sitio diana requiere no solamente que las células realmente alcancen el sitio diana, sino que sean viables y funcionales en el sitio diana. Preferiblemente, la duración de la viabilidad y la funcionalidad es suficiente para proporciona un efecto terapéutico apreciable. Se sembraron RPE-hESC H9 en un sustrato de parileno de película delgada de 0,3 micrómetros (con características de soporte de 6,5 micrómetros (altura) en la parte basal) como se describe en este documento. El sustrato sembrado de células se introdujo quirúrgicamente en el espacio subretiniano de una rata RCS de acuerdo con varias realizaciones anteriores. Como se muestra en las fig. 28A-28C, el sustrato de parileno puede identificarse por la flecha blanca. Como se analiza anteriormente, el diseño del sustrato proporciona soporte para el propio sustrato, y protege adicionalmente las células durante el procedimiento de implante. Además, el sustrato está diseñado para permitir el intercambio recíproco de nutrientes entre las células RPE sembradas en el sustrato y el rico suministro sanguíneo de la coroides. La fig. 28A muestra la tinción para TRA-1-85, que es un marcador antigénico humano, que muestra que las células sembradas en el sustrato están presentes en una monocapa intacta. La tinción también confirma que las células que componente la monocapa son de origen humano. La fig. 28B representa la tinción para RPE65, que es una proteína implicada en el proceso de regeneración del pigmento visual en las células PR. La presencia de RPE65 muestra no solamente que las células RPE implantas son viables (a los 2 meses después del implante), sino también que son funcionales y activas en los procesos normales asociados con la fototransducción. La fig. 28C muestra tinción DAPI (un marcador celular no específico) que se superpone con TRA-1-85 y REP65. Las fig. 29A-29C muestran una serie adicional de imágenes inmunofluorescentes de otro experimento realizado como se describe anteriormente. Como se analiza anteriormente, estas imágenes muestran que la monocapa de células RPE sembradas es intacta y también es funcional 2 meses después del implante.

Se realizaron experimentos adicionales para determinar el grado de función visual restaurada después del implante de sustratos sembrados con RPE. Las ratas RCS recibieron una inyección en bolo de células RPE o un implante de parileno sembrado con células como se divulga en este documento en el día 28-32 después del nacimiento. Las fig.

30 y 31 representan los datos recogidos del ensayo de OKN posterior. En el ensayo de OKN, los sujetos (ratas en estos experimentos) se colocan en una cámara rodeada por videomonitores que generan un patrón de columnas negras y blancas que se mueven alrededor del sujeto. El tiempo que emplea el sujeto en rastrear la imagen visual es indicativa de la función visual del sujeto (por ejemplo, más tiempo de rastreo se asocia con mayor función visual). La fig. 30 representa los datos de OKN recogidos de ratones ciegos transgénicos normales no tratados y ratones ciegos transgénicos tratados con RPE-hESC H9 inyectado en el espacio subretiniano en una suspensión celular (sin sustrato de soporte). Como se esperaba, las ratas normales obtuvieron el máximo tiempo de rastreo en comparación con las ratas ciegas tratadas y no tratadas (las normales se ensayaron únicamente desde el día 45 después del nacimiento). En el día 40 después del nacimiento, las ratas ciegas tratadas y no tratadas no diferían significativamente en su función visual. Sin embargo, entre el día 40 después del nacimiento y el día 45 después del nacimiento, las ratas tratadas mantenían aproximadamente la misma función visual. En contraste, las ratas no tratadas experimentaron el inicio de una disminución en la función visual, que continuó hasta el día 60 después del nacimiento. Entre el día 45 después del nacimiento y el día 60 después del nacimiento, las ratas tratadas mostraron una disminución pequeña, pero significativa en la función visual, pero aún tenían una función manifiestamente mejorada en comparación con las ratas no tratadas.

La fig. 31 muestra los datos de OKN de ratones ciegos transgénicos normales no tratados y ratones ciegos transgénicos tratados con RPE-hESC H9 sembrado en un sustrato de parileno e implantado en el espacio subretiniano. De nuevo, en el periodo temprano después del implante, los diversos grupos no eran significativamente diferentes en su tiempo de rastreo. En el día 45 después del nacimiento, las ratas normales, como se esperaba, obtuvieron un tiempo de rastreo sustancialmente mayor en comparación con ratas no tratadas y tratadas. Aunque las ratas tratadas con sustratos no mostraban una diferencia significativa en la función visual en comparación con las ratas no tratadas, pasado el día 45 después del nacimiento, los animales tratados mostraron mejoras significativas repetidas en la función visual. No solamente estos datos muestran una mejora clara en la función visual como resultado del implante de sustrato sembrado con células mostrado en comparación con animales no tratados, sino que la mejora también es notablemente mayor que cuando se administra una suspensión de células RPE.

Por ejemplo, el tiempo de rastreo con la cabeza en el día 60 después del nacimiento en ratones tratados con una inyección en bolo era de aproximadamente 12 segundos, mientras que por el contrario, los animales tratados con un sustrato sembrado con células rastreaban las imágenes visualmente durante cerca de 30 segundos. Además, la tendencia de aumento del tiempo de rastreo en los animales tratados con un sustrato sembrado con células sugiere que se lograría una mayor mejora en puntos temporales posteriores.

La fig. 32 es una representación adicional de las células RPE después del implante que han encajado funcionalmente con los fotorreceptores hospedadores y son metabólicamente activos. Como se muestra, el sustrato se ubica en la parte inferior de la figura. Colocadas en la superficie apical del sustrato están las células RPE sembradas. Mostrados en la parte superior de la figura están los fotorreceptores residentes. Las cabezas de flecha blancas representan segmentos externos (que se desprenden del PR) que se tiñen positivos a rodopsina. Las flechas blancas dentro de la capa RPE representan fagosomas dentro del RPE que contienen fragmentos positivos a rodopsina de segmentos externos. Esto demuestra que las células RPE son viables, estables y funcionalmente activas porque están recogiendo los segmentos externos desprendidos del RPE, una de las funciones normal de las células RPE nativas.

Por tanto, en varias realizaciones, los sustratos divulgados en este documento no solamente proporcionan una superficie para la formación de una monocapa de células RPE sembradas, sino que protegen las células durante el implante en el ojo de un sujeto, y también mantienen la viabilidad de las células después del implante. El diseño del sustrato es tal que los nutrientes aún pueden alcanzar las células RPE sembradas, pero el sustrato proporciona suficiente soporte para permitir que las células mantengan una monocapa in vivo. Además, la viabilidad continuada de las células contribuye a la restauración global de la función visual, ya que las células RPE sembradas remplazan funcionalmente las células RPE muertas o dañadas, como se evidencia por su captación de segmentos externos desprendidos de las células PR.

Además, en varias realizaciones, se usan métodos quirúrgicos especializados para implantar dichos sustratos sembrados con células. Estos procedimientos quirúrgicos no solamente permiten la colocación de un sustrato que es específico para un sujeto particular, sino que también permiten la colocación de uno, dos o más sustratos, dependiendo de la gravedad del daño al tejido ocular del sujeto.

Adicionalmente, los sustratos y métodos divulgados en este documento son útiles para el tratamiento de diversas distrofias de la retina externa. No solamente son adecuados los sustratos divulgados en este documento para su implante en diversos lugares de la retina, cuyo diseño posibilita que los nutrientes alcancen las células sembradas en los mismos, los sustratos son adecuados para mantener el crecimiento y la función de una amplia diversidad de tipos celulares. Únicamente a modo de ejemplo, los sustratos que se divulgan en este documento podrían, en algunas realizaciones, fabricarse para sembrarse con fotorreceptores e implantarse para tratar la retinitis pigmentosa.

Debe entenderse que la invención no se limita a las realizaciones expuestas en este documento con fines de ejemplificación, sino que tiene que estar definida únicamente por la lectura de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sustrato para tratamiento celular para tratar tejido ocular enfermo o dañado, que comprende: un polímero no poroso que está configurado para su implante en tejido ocular, comprendiendo el polímero:

una superficie apical de parileno plana para el crecimiento de células que tiene un grosor entre 0,1 y 6 micrómetros; y

una superficie basal de parileno que comprende características de soporte, siendo las características de soporte soportes poliméricos periódicos que tienen una altura de entre 3 |jm y 150 |jm y que proporcionan rigidez estructural al sustrato;

2. El sustrato de la reivindicación 1, en el que dicha superficie apical para el crecimiento de células comprende además un labio elevado que rodea dicha superficie apical, en donde dicho labio elevado tiene una altura que varía de 10 a 1000 micrómetros y una anchura que varía de 10 a 1000 micrómetros, y en donde la longitud y la anchura de dicho polímero es de entre 0,5 mm y 5 mm.

3. Un sustrato de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la longitud del sustrato es de entre 0,5 mm y 5 mm, y en donde la anchura del sustrato es de entre 0,5 mm y 5 mm.

4. Un sustrato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas características de soporte inhiben el crecimiento lateral de las células desde la superficie apical hasta la superficie basal del sustrato.

5. Un sustrato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el grosor de la superficie apical para el crecimiento de células impide el paso de moléculas que tengan un peso molecular de más de 70-75 kDa a través del sustrato.

6. Un sustrato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho parileno se selecciona del grupo que consiste en parileno A, parileno AM, parileno C, parileno tratado con amoniaco, parileno X, parileno N y parileno C.

7. El sustrato de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho parileno está recubierto con uno o más de polidopamina, matrigel, vitronectina y retronectina.

8. El sustrato de la reivindicación 7, en el que dicho parileno es parileno C recubierto con uno o más de matrigel, vitronectina y retronectina.

9. Un sustrato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho parileno está tratado con oxígeno.

10. Un sustrato de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho sustrato es adecuado para siembra de la superficie apical del sustrato con células seleccionadas del grupo que consiste en: células epiteliales pigmentadas retinianas (RPE), RPE y fotorreceptores, células gliales de Müller, células ganglionares, una mezcla de células gliales de Müller y células ganglionares, células endoteliales de la córnea, una mezcla de células endoteliales de la córnea y colágeno, células epiteliales de la córnea, una mezcla de células epiteliales de la córnea y colágeno, células endoteliales, pericitos, una mezcla de células endoteliales y pericitos.

11. El sustrato de la reivindicación 10, en el que dichas células RPE son células RPE derivadas de células madre embrionarias humanas.

12. El sustrato de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el sustrato es adecuado para su implante en el espacio subretiniano del ojo de un sujeto, implante adyacente al lado epirretiniano de la retina del ojo de un sujeto o implante adyacente al tejido de la córnea del ojo de un sujeto.

13. El sustrato de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento por tratamiento celular de una o más de AMD seca, enfermedad de la córnea, glaucoma, retinopatía diabética, oclusiones de la vena retiniana, AMD húmeda y/o retinitis pigmentosa.