CN103987855A

CN103987855A - 未分化细胞检测方法及复合糖检测方法

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Publication number: CN103987855A
Application number: CN201280053624.9A
Authority: CN
Inventors: 馆野浩章; 平林淳; 伊藤弓弦; 小沼泰子; 浅岛诚; 久野敦; 藁科雅岐; 福田雅和
Original assignee: Wako Pure Chemical Industries Ltd; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST; Fujifilm Corp
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2014-08-13
Anticipated expiration: 2032-10-31
Also published as: JPWO2013065302A1; US20150204870A1; KR20140086973A; WO2013065302A1; EP2774994A1; EP2774994B1; JP6083649B2; SG11201401956XA; CA2853464A1; KR101924673B1; EP2774994A4; CN103987855B; US9500650B2

Abstract

本发明的目的是提供使用培养了干细胞的培养上清液评价细胞的分化状态的方法。本发明中，能够提供包含“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖链结构的“未分化糖链标志物”，其能够使用干细胞的培养上清液以高灵敏度判定干细胞的未分化状态。同时，发现能够以高灵敏度识别该“未分化糖链标志物”的BC2LCN凝集素或其变体是能够以培养上清液来判定细胞的未分化状态的、优秀的“未分化糖链标志物检测用探针”。

Description

未分化细胞检测方法及复合糖检测方法

技术领域

本发明涉及使用细胞培养上清液来判定细胞的状态的方法。特别地，涉及评价未分化细胞的存在、不存在的方法。另外，本发明涉及检测糖蛋白质等具有糖链的检测对象物质的方法。

背景技术

多能干细胞因其能够分化为构成机体的所有细胞的性质以及能够维持其未分化性的性质而获得关注，不仅限于创新药物筛选或阐明疾病机理的应用，而且在世界范围内正将其作为再生医疗的材料进行研究。

2010年世界上首次利用人ES细胞的第1期临床试验在美国针对急性脊髓损伤开始展开，进而，针对视网膜变性疾病的使用人ES细胞的第1/2期临床试验的新药临床试验申请(IND)被FDA批准，利用人多能干细胞的再生医疗研究正在持续飞跃性发展。

特别地，日本发现的作为新的人多能干细胞的iPS细胞因为不使用受精卵等理由故而伦理障碍较低，并且具有能够从自体组织建立这样的极大的优点，再生医疗临床界也对其充满期待。在日本，物理化学研究所发生·再生科学综合研究中心及先端医疗中心等计划从2013年开始以老年黄斑变性症患者为对象使用iPS细胞进行临床研究，庆应大学也有2015年开始对脊髓损伤患者进行临床研究的方针。

由此，虽然ES细胞、iPS细胞这类人多能干细胞的临床应用已被展开，但关于确保品质和安全性地供给细胞的体制尚未准备充分。对多能干细胞而言，制造方法、培养条件、保存条件等对未分化性、分化能力、增殖能力等品质产生影响。因此，如果不基于适当的方法进行管理，则有产生因生产者、使用者而异的结果的可能性。这是干细胞治疗的可靠性较低、及招致因为治疗导致发生健康损害等的弊端的原因。因此，可靠性和再现性高的维持培养法及计测·评价系统是必需的。

例如，细胞治疗中，多能干细胞并非原样使用，而是分化为目标细胞之后用于移植，但在分化为目标细胞的细胞源中混入了未分化的细胞时，有报道称该未分化细胞将是肿瘤形成的原因。因此，需要开发对细胞治疗中使用的细胞中是否混入了未分化细胞即肿瘤形成细胞进行评价的技术。

另一方面，成体干细胞的种类和特性较之ES细胞、iPS细胞这类人多能干细胞而言更加多种多样，其在临床中的应用已作为既有技术存在。但是，稳定获得品质适于移植的细胞并不容易，因此确立充质干细胞的品质验证方法以及基于此确立稳定的培养方法一直是极其重要的课题。此外，即使在进行了对利用成体干细胞的细胞移植的有效性的评价、对其机制的理解及风险评价的基础上，仍需要开发对移植前的细胞的品质验证方法。

本发明的发明人等以前使用了凝集素微阵列，对从五种不同的体细胞(皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜)制作的人iPS细胞(114份检测样本)和人ES细胞(9份检测样本)的糖链情况进行了广泛的分析。

结果发现，尽管最初的体细胞随组织不同而具有各异的糖链情况，但制作的iPS细胞均显示出基本相同的糖链情况，通过导入重编程基因而均收敛为与ES细胞类似的糖链结构。对人ES·iPS细胞与人体细胞的凝集素阵列数据进行了详细的分析，根据分析结果，推定未分化的人ES·iPS细胞较之体细胞而言α2-6Sia、α1-2Fuc、1型LacNAc的表达量显著增加。进而，通过利用了DNA阵列的糖转移酶基因的表达分析以及利用质谱仪的方法，发现rBC2LCN仅与未分化的人ES·iPS细胞结合(非专利文献1)。

上述rBC2LCN是使BC2LCN凝集素(YP_002232818)(其对应于来自革兰氏阴性菌(洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cenocepacia))的BC2L-C蛋白质的N末端结构域)在大肠杆菌转化体中表达而得的重组体，其为识别复合糖链的非还原末端的“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”以及“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖链结构的凝集素(非专利文献1、3)。

本发明的发明人等在利用上述凝集素阵列的实验中，发现rBC2LCN虽然与未分化的人ES·iPS细胞反应，但与分化了的体细胞(皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜)完全不反应。认为rBC2LCN与具有“α1-2Fuc”、“1型LacNAc”及“α2-6Sia”中的两个(α1-2Fuc、1型LacNAc)的“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(＝H1型结构)”及“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(＝H3型结构)”的糖链结构特异性反应。这两个糖链结构在人ES·iPS细胞中高表达，并且是在分化了的皮肤、胎儿肺、子宫内膜、胎盘动脉、羊膜的细胞中几乎不表达的糖链。

因此显示，rBC2LCN识别的糖链配体为未分化细胞特有的新颖的未分化糖链标志物，并且显示，rBC2LCN可用作针对该未分化糖链标志物“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”和/或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”(下文中有时将二者合称为“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”)的特异性探针。

这之后，Drukker等人的团队也发现，识别“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”的抗体能识别未分化状态的ES细胞及iPS细胞(非专利文献2)，证实了本发明的发明人的上述发现。

但是，Drukker等人的上述抗体虽然与“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(＝H1型结构)”特异性反应，但与“(Fucα1-2Galβ1-3GalNAc＝H3型结构)”不反应。与rBC2LCN比较而言，其不能检测未分化细胞中的“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”或“含有Fucα1-2Galβ1-3GalNAc的糖链”，故而较之本发明的发明人的rBC2LCN而言存在灵敏度不够充分的缺点。

专利文献1：日本特开平9-301995号

专利文献2：WO2007/027495

非专利文献1：Tateno H,Toyota M,Saito S,Onuma Y,Ito Y,HiemoriK,Fukumura M,Matsushima A,Nakanishi M,Ohnuma K,Akutsu H,Umezawa A,Horimoto K,Hirabayashi J,Asashima M.,J Biol Chem.2011,286(23):20345-53.

非专利文献2：Tang C,Lee AS,Volkmer JP,Sahoo D,Nag D,MosleyAR,Inlay MA,Ardehali R,Chavez SL,Pera RR,Behr B,Wu JC,WeissmanIL,Drukker M.,Nat Biotechnol.2011,29(9):829-34.

非专利文献3：Sulak O,Cioci G,Delia M,LahmannM,Varrot A,Imberty A,Wimmerova M.,Structure.2010,18(1):59-72.

非专利文献4：Suemori H.,Yasuchika K.,HasegawaK.,Fujioka T.,Tsuneyoshi N.,Nakatsuji N.Biochem.Biophys.Res.Commun.2006,345,926-932.

非专利文献5：Draper JS,Pigott C,Thomson JA,Andrews PW.J Anat.2000,200,249-58.

非专利文献6：Iijima et al.Chem.Bio.Chem.2009,10,999-1006

非专利文献7：Tateno,H.,Nakamura-Tsuruta,S.,and Hirabayashi,J.Nat.Protoc.2007,2,2529-2537

非专利文献8：Nielsen,J.S.,and McNagny,K.M.J Am Soc Nephrol,2009,20,1669-1676.

发明内容

现在，检查细胞品质时，通常利用测序仪、微阵列、流式细胞术、免疫组织科学等对细胞的基因表达、表观基因组状态、细胞表面标志物等的差异进行分析。但是，这些方法必须要使用细胞本身进行分析，因此存在下述大问题：不仅必需繁杂的细胞回收工序，还要将珍贵的用于细胞治疗的细胞在检查中就使用消耗掉。

此外，如上文所述，根据本发明的发明人等，能够确定作为识别未分化细胞和分化细胞的未分化糖链标志物的糖链结构自身。但是，不仅限于Drukker等人的方法，在本发明的发明人等以前使用rBC2LCN的技术在观察细胞表面的糖蛋白或糖脂质等具有的糖链这一点上均停留在现有技术阶段。即，这些技术同样需要回收被测细胞的工序或者进一步纯化的工序，并没有解决检测评价工序中的工序繁杂、浪费有效细胞这样的一直以来的问题。

因此，本发明的主要目的在于提供不减少被测细胞、非侵袭性地调查细胞的状态的方法。

本发明的发明人等制作了将rBC2LCN作为针对“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”的特异性探针固定化于载玻片上的基板，使用该基板评价ES细胞及iPS干细胞的分化状态时，还尝试了同时评价研究与培养上清液的反应性以代替评价研究细胞自身(破碎物)。

结果，出人意料地发现，将从被测细胞培养基采集的1滴培养上清液(相当于1μL)以不施加任何纯化工序的状态直接供给至基板表面的凝集素，仅通过上述操作就能够使用基板上的rBC2LCN评价分化状态。具体而言，rBC2LCN与对照培养基及视黄酸存在下进行培养并分化了的iPS细胞的培养上清液不反应，但是与不存在视黄酸时维持了未分化状态的iPS细胞的培养上清液发生特异性反应。

从以上结果可见，其显示：具有上述“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”糖链结构的未分化糖链标志物在未分化细胞的培养上清液中通常被分泌，但随着通过分化诱导分化逐渐进行而减少，若完全分化则该未分化糖链标志物会消失。

由此，本发明中，不仅首次发现“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”糖链作为培养上清液中可观察到的未分化糖链标志物发挥作用，并且，通过本发明相当于首次提供了培养上清液中可观察到的未分化糖链标志物。需要说明的是，仅就本发明的发明人等知道的内容而言，在此之前，从来不存在表明在培养下维持未分化状态的ES细胞及iPS干细胞的细胞表面的糖蛋白或糖脂质等能够以在培养液中能被检测的状态溶出的教导。

即表明，在对分化诱导ES细胞、iPS细胞等未分化细胞时的分化状态进行评价时，或者为了评价将这些未分化细胞以维持未分化状态的形式保存时的保存状态，可采集这些未分化细胞的培养上清液，通过培养上清液中“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”的存在·不存在(利用该糖链结构特异性的凝集素及抗体等)来进行评价。使用了培养上清液的该手段不需要回收作为靶标的被测细胞自身的工序，也不需要纯化特定靶标分子的工序，可以说是极其简便的技术。特别地，“BC2LCN凝集素”具有能以高灵敏度识别“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”及“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”中任一的糖链结构的特性，因此通过使用该凝集素，能够提供更可靠的未分化状态评价系统。

基于上述发现完成了本发明。

即，本发明包含以下的发明。

(1)一种判定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，测定干细胞的培养上清液中下述(式1)或(式2)表示的未分化糖链标志物的是否存在或存在量：

(式1)

其中，R1表示OH基或任意的糖链，R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质、脂质或其它分子，

(式2)

其中，R1表示OH基或任意的糖链，R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质、脂质或其它分子。

通过该方法，能够不使用细胞自身、而是使用培养细胞的培养上清液来评价细胞的分化状态。

(2)根据上述(1)所述的方法，其特征在于，使用特异性识别(式1)或(式2)表示的糖链结构的蛋白质来测定上述未分化糖链标志物的有无或存在量。

(3)根据上述(2)所述的方法，其中，上述蛋白质为下述蛋白质：所述蛋白质包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且特异性识别上述(式1)或(式2)表示的糖链结构。

(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的方法，其特征在于，上述干细胞的培养上清液为对该干细胞施加了分化诱导处理后的培养上清液。

(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的方法，其特征在于，测定来源于足糖萼蛋白(Podocalyxin)的上述(式1)和/或(式2)表示的上述未分化糖链标志物的是否存在或存在量。

(6)根据上述(1)～(5)所述的方法，其特征在于，通过使用下述蛋白质的凝集素-凝集素夹心法检测上述未分化糖链标志物，所述蛋白质特异性识别上述(式1)或(式2)表示的糖链结构，包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且没有糖链。

(7)一种获得没有混入未分化细胞的分化细胞的方法，其特征在于，确认施加了分化诱导处理的干细胞的培养上清液中不存在下述(式1)或(式2)表示的未分化糖链标志物并进行采集。

(式1)

(式2)

(8)根据上述(7)所述的方法，其中，关于上述未分化糖链标志物不存在的确认使用下述蛋白质来进行，所述蛋白质特异性识别上述(式1)或(式2)表示的糖链结构，并且包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。

(9)一种用于判定干细胞的分化状态的方法的试剂盒，其特征在于，包含特异性识别下述(式1)或(式2)表示的糖链结构的蛋白质，

(式1)

(式2)

(10)根据上述(9)所述的试剂盒，其中，所述蛋白质为下述蛋白质：所述蛋白质特异性识别上述(式1)或(式2)表示的糖链结构，并且包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。

根据本发明涉及的判定干细胞的分化状态的方法，通过使被测细胞的培养上清液直接与凝集素等对未分化糖链标志物具有特异性的蛋白质反应，能够不破坏细胞、非侵袭性地评价细胞的状态。因此，本发明特别能够用于对未分化细胞的状态进行简便且高效地判定，能够期待其在再生医疗和生物制品等中的应用。

附图说明

[图1]为用于说明凝集素-凝集素夹心法的具体步骤的一个例子的图。

[图2]为用经Cy3标记的rBC2LCN及Tra1-60对未分化的ES细胞(KhES1株)进行了染色的照片(实施例1)。作为阴性对照，与经Cy3标记的BSA反应。为了确认细胞的存在，分别进行了利用DAPI的核染色。

[图3]为用经Cy3标记的rBC2LCN及Tra1-60对未分化的ES细胞(KhES1株)和施加了分化诱导处理(视黄酸处理)的ES细胞进行了染色的照片(实施例2)。为了确认细胞的存在，分别进行了利用DAPI的核染色。

[图4]为显示施加了分化诱导处理(视黄酸处理)的iPS细胞(201B7株、253G1株)的培养上清液与没有处理的未分化状态的iPS细胞(201B7株、253G1株、TIGMKOS#19株)的培养上清液对rBC2LCN的反应性的比较结果的图(实施例3)。需要说明的是，作为对照测定了仅培养基的情况。

[图5]为显示通过凝集素-凝集素夹心法检测未分化糖链标志物的结果的图(实施例4)。

[图6]为显示对用于通过凝集素-凝集素夹心法检测未分化糖链标志物的检测用凝集素(印盖(overlay)凝集素)进行筛选的结果的图(实施例5)。

[图7]为显示通过凝集素-凝集素夹心法对未分化糖链标志物进行检测的结果的图(实施例6)。

[图8]为显示凝集素-凝集素夹心法中未分化细胞数的标准曲线的图(实施例7)。

[图9]为显示凝集素-凝集素夹心法中未分化细胞数的标准曲线的图(实施例7)。

[图10]为显示凝集素-凝集素夹心法中未分化细胞数的标准曲线的图(实施例7)。

[图11]为显示凝集素-凝集素夹心法中未分化细胞数的标准曲线的图(实施例7)。

[图12]为显示对未分化糖链标志物进行鉴定的结果的照片(实施例8)。

[图13]为显示对rBC2LCN识别的糖链结构进行分析的结果的图(实施例9)。

具体实施方式

A.干细胞的分化状态判定方法等

1.本发明的可在培养上清液中测定的未分化糖链标志物

本发明的可在培养上清液中检测的未分化糖链标志物(下文中也简称为“未分化糖链标志物”)为具有“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”即“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H1型糖链)”或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H3型糖链)”的糖链结构、在人ES·iPS细胞的细胞表面显著表达的、糖蛋白及糖脂质等的复合糖。需要说明的是，下文实施例8中，作为该复合糖之一，鉴定了足糖萼蛋白(podocalyxin)。预想足糖萼蛋白的糖链的结构中含有“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H3型糖链)”。

本发明是具有下述特征的发明：首次发现上述两种糖链常在ES细胞、iPS细胞等未分化状态的细胞的培养上清液中分泌，但是在分化了的体细胞中却不分泌到培养上清液中，即，上述糖链配体仅在未分化状态的情况下被分泌至细胞上清液中，这些糖链配体作为“可在细胞上清液中测定的未分化糖链标志物”有用。

“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”的糖链结构中，在GlcNAc的4位的位置上的羟基也可被单糖(优选为岩藻糖)或带支链或无支链的寡糖链(优选为2～5个糖形成的糖链)取代。此外，在未分化细胞的干细胞表面，作为膜构成成分，该糖链结构为在GlcNAc的1位的位置上结合至糖蛋白、糖脂质或糖类等非还原末端的糖链，因此即使作为被分泌至未分化状态的干细胞的培养上清液中的糖链结构，在GlcNAc的1位的位置上也结合有OH基、或其它糖类、蛋白质、或脂质、或其它分子的非还原末端。即，可作为下述(式1)表示。

(式1)

其中，R1表示OH基或任意的糖链，例如4αFuc基团。R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质、脂质或其它分子

同样地，“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖链结构中，在GalNAc的1位的位置上的羟基也可被带支链或无支链的寡糖链(优选为2～5个糖形成的糖链)取代。此外，在未分化细胞的干细胞表面，作为膜构成成分，该糖链结构为在GalNAc的1位的位置上结合至糖蛋白、糖脂质或糖类等非还原末端的糖链，因此即使作为被分泌至未分化状态的干细胞的培养上清液中的糖链结构，在GalNAc的1位的位置上也结合有OH基、或其它糖类、蛋白质、或脂质、或其它分子的非还原末端。即，可作为下述(式2)表示。

(式2)

其中，R1表示OH基或任意的糖链，例如Galβ1-4Glc基团。R2表示OH基或任意的糖链、蛋白质、脂质或其它分子。

2.本发明的“未分化糖链标志物”的检测用探针

作为本发明的培养上清液中的未分化糖链标志物的“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(式1)”或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(式2)”的检测用探针，一般可使用蛋白质探针，只要是与该未分化糖链标志物特异性结合的蛋白质，则可以使用任意蛋白质。典型地，优选使用本发明的发明人等发现的识别上述(式1)和(式2)的两种糖链结构的凝集素即BC2LCN或其变体，但也可使用识别(式1)或(式2)中的任一个的凝集素。

此外，并不限于凝集素，只要是能够识别未分化糖链标志物的抗体或其片段、或TCR或其片段等其它蛋白质则可以使用。具体而言，能够举例Drukker等人的“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H1型糖链)”抗体(非专利文献2)等。

虽然将在下文中描述，通过将固定化有本发明的“未分化糖链标志物”的检测用探针的基板、使该基板表面与干细胞的培养上清液接触的手段以及对固定化于基板上的上述检测用探针或培养上清液进行标记的手段组合，能够获得用于判定干细胞的分化状态的试剂盒。特别地，作为“未分化糖链标志物”使用BC2LCN或其变体的情况下，获得能够以极高的灵敏度判定干细胞的分化状态的试剂盒。

此处，提及“基板”时，其不限于载玻片等平坦形状的基材，也包含ELISA板、磁性珠粒、过滤器等可适用于通常的蛋白质固化法的任意形状、材质的基材。作为“基板材料”，优选为通常的微阵列中使用的物质，可使用硅晶圆、玻璃、聚碳酸酯、膜、聚苯乙烯或聚氨酯这类高分子膜及多孔性物质。

3.关于rBC2LCN

如上文“2.”中所述，本发明中，作为用于检测未分化糖链标志物(H1型糖链和/或H3型糖链)即(式1)或(式2)的糖链结构的探针，显示出与这些糖链结构的结合特异性的蛋白质全部都可以使用，但这些蛋白质中最优选的凝集素为本发明的发明人等以前发现的“rBC2LCN”，因此下文中针对“rBC2LCN”进行说明。

本发明中，提及“rBC2LCN”时，是指将从革兰氏阴性菌(洋葱伯克霍尔德菌，Burkholderia cenocepacia)发现的凝集素在大肠杆菌中表达而成的重组体，但该凝集素相当于被称为BC2L-C的蛋白质的N末端结构域(GenBank/NCBI-GI登录号：YP_002232818)(非专利文献3)。已知rBC2LCN显示出与TNF样蛋白质的构造相似性，形成三聚体。利用糖链阵列进行分析发现，该凝集素除对“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H1型糖链)”、“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H3型糖链)”外还对含有H1型或H3型糖链的糖链结构即“Lewis b糖链(Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc)”、“Globo H糖链(Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc)”也表现出结合特异性。

rBC2LCN不含糖链，因此也可通过转化的细菌大量生产。具体而言，可使用编码GenBank/NCBI-GI登录号：YP_002232818(Genome ID：206562055)的氨基酸序列(序列号1)的BC2LCN基因，针对适当的宿主进行优化后，从经转化的大肠杆菌表达，通过通常的蛋白质纯化手段进行纯化。

此时，作为BC2LCN，并不必需对应于序列号1的全长，此外，即使是序列号1中部分地一部分氨基酸被缺失、取代、插入、添加的情况下，只要维持特异性识别“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”即(式1)或(式2)表示的糖链结构的特性即可。

具体而言，本发明的BC2LCN或其变体例如可如下所示地表示。

“包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列、并且特异性识别“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc”或“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc”的糖链结构的蛋白质”。

此外，若使用上述(式1)及(式2)表示糖链结构，则可表示为“包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列、并且特异性识别(式1)或(式2)表示的糖链结构的蛋白质”。

需要说明的是，本文中，“数个”表示20个以下、优选10个以下、更优选5个以下的自然数。

4.本发明的“未分化糖链标志物”的检测、测定

(1)培养上清液的采集方法

本发明中，通过微量移液器等采集一定量的未分化状态的干细胞或分化诱导后的细胞的培养上清液，分析与和本发明的未分化糖链标志物特异性结合的蛋白质之间的反应性。培养液一般每过一定时间(约1日)更换为新鲜的培养液。因此，在未分化糖链标志物从未分化细胞或分化不充分的细胞以可检测到的量分泌至更换后的培养液中之后进行未分化糖链标志物的检测。培养液更换后，直到培养液中溶出可检测到的量的未分化糖链标志物所需要的时间随细胞的种类和培养条件而有所不同。因此，培养液更换后，直至采集用于检测未分化糖链标志物的培养上清液的时间可根据细胞的种类和培养条件适当地设定，例如为18～30小时左右。因为通常每24小时左右进行一次培养基更换，因此优选利用此时被弃去的培养上清液。

根据该分析方法，在未分化状态的干细胞经分化诱导时，从细胞上清液中没有检测到上述未分化糖链标志物(与背景值相同水平)的孔、培养皿或烧瓶内的细胞中，能够评价为仅由没有混入未分化细胞的分化细胞形成的细胞群，因此能够以孔、培养皿或烧瓶为单位大量且迅速地获得没有未分化细胞混入之虞的分化细胞。

本文中，作为将干细胞“分化诱导”为神经细胞、消化系统细胞等的方法，可以使用任何方法，例如能够适用在视黄酸存在下培养干细胞分化为神经系统细胞的方法、以增殖被停止的NIH3T3细胞表面为基础形成表皮细胞的方法等各种公知方法。本发明的未分化糖链标志物在分化了的细胞表面的表达量为可以忽略的程度，因此无论在何种分化诱导条件下噪声预计都极少。

此外，为了对意欲维持其未分化状态的干细胞进行品质管理，可定期或根据需要采集培养上清液、或者使用培养基更换时弃去的培养上清液，测定本发明的未分化糖链标志物的量，则能够确认保存中的所有细胞是否维持为未分化状态。例如，作为典型的干细胞的未分化状态的维持培养方法，有在小鼠成纤维细胞等供体(feeder)细胞表面进行培养的方法，其需要至少每天一次去除培养上清液并更换为新鲜培养基。可使用该经去除而被弃去的培养上清液，进行分化/未分化判定。

本文中，作为以一定量采集培养上清液的手段，虽可进行人工操作，但通过自动培养装置等自动、机械地进行采集是可靠的，特别地，想要尽早获得分化诱导后没有混入未分化细胞的仅是分化了的细胞群的情况下，通过以一定时间间隔采集、分析，能够快速地获得仅是确实分化了的细胞群。

(2)本发明的“未分化糖链标志物”的分析方法

也可以对作为与本发明的未分化糖链标志物特异性结合的蛋白质的凝集素、抗体等进行标记，将其直接添加进培养上清液中，对标记的强度进行计测，但优选将凝集素、抗体等固定化于基板上，用“Cy3-NHS酯”(GE Healthcare Bioscience公司制)等对培养上清液进行荧光标记，通过ELISA法、利用了渐消波(evanescent wave)激发荧光型扫描器的方法等进行检测、测定。

从干细胞的培养液采集的培养上清液不经纯化工序而原样供给至检测工序，或者将其稀释、或预先以抗体·凝集素等浓缩之后供给至检测工序。除本发明的发明人等以前开发的在固定化于基板上的凝集素表面接触、利用渐消波激发荧光型扫描器的方法之外，还可使用共焦型扫描器、荧光板式计数器(fluorescence plate reader)等进行检测。对被固定化的抗体也可适用相同的方法。

但是，不限于该方法，还可通过ELISA、表面等离振子共振传感器、平衡透析法、滴定量热法、石英晶体谐振传感器检测法等方法来测定结合活性。此外，通过通常的竞争法、下文所述的“凝集素-凝集素夹心法”等，也可测定本发明涉及的未分化糖链标志物。使用“凝集素-凝集素夹心法”的情况下，能够以良好的定量性测定培养上清液中的未分化糖链标志物，因此能够以更高的精度判定分化的完成(未分化细胞消失)。

对分化诱导后的培养上清液施加上述分析、确认到没有混入未分化细胞后，通过分离回收该孔、培养皿或烧瓶内的细胞，能够获得分化细胞。相反，在保持为未分化维持状态的状态的干细胞保存方法中，通过对培养基更换时的弃用培养上清液适用上述分析方法，能够确认到干细胞的品质保持状态。

(3)基于分析本发明的“未分化糖链标志物”的、用于判定干细胞的分化状态的试剂盒或装置

若将本发明的未分化糖链标志物的检测用探针(优选为BC2LCN或其变体)与下述(1)～(3)的手段一起制作为试剂盒或装置，则可获得可进行未分化糖链标志物分析的试剂盒或装置，因此可获得用于判定干细胞的分化状态的试剂盒或装置。需要说明的是，本发明的未分化糖链标志物的检测用探针优选固定化于基板表面而使用。

(1)使其与干细胞的培养上清液接触的手段；但是，该手段也可人工操作进行，故而并非必需。

(2)用于对检测用探针或培养上清液进行荧光标记的荧光标记；本文中，提及“对培养上清液进行荧光标记”时，表示能够对培养上清液中作为检测对象的本发明的未分化糖链标志物(即，“(式1)或(式2)表示的糖链结构或含有该糖链结构的物质”)进行荧光标记的荧光物质(例如，“Cy3-NHS-酯”)。

(3)用于检测荧光标记的手段或装置。

通过将固定化了本发明的未分化糖链标志物检测用探针的基板与对在基板表面固定化了的蛋白质或培养上清液进行标记的手段进行组合，能够获得用于判定干细胞的分化状态的试剂盒。优选地，还可组合使干细胞的培养上清液接触该基板表面的手段或装置、进而还可组合用于检测荧光标记的手段或装置。特别地，作为未分化糖链标志物使用BC2LCN或其变体的情况下，可获得能够以极高的灵敏度判定干细胞的分化状态的试剂盒。

(4)使用了rBC2LCN的未分化糖链标志物的测定步骤

以下，主要描述使用了作为本发明的典型的凝集素的rBC2LCN的情况，但如上文所述，本发明不仅限于rBC2LCN。

(甲)使经“Cy3-NHS酯”等标记化的培养上清液针对在载玻片上固定了rBC2LCN的基板直接反应，通过渐消波激发荧光检测系统测定其结合。该情况下，有时也预先以物理或化学方式将培养上清液浓缩之后用于分析。

(乙)此外，也可使预先经酶、荧光、生物素等标记化的培养上清液针对在ELISA板、磁性珠粒、过滤器等基板上固定了rBC2LCN的材料进行反应，通过显色、发光、荧光等检测其结合。或者，培养上清液反应后，也可对与结合至rBC2LCN的蛋白质结合的经标记的抗体或凝集素从上方反应。特别地，通过利用使用了与结合至rBC2LCN的蛋白质结合的凝集素的“凝集素-凝集素夹心法”(下文将详述)，能够以更高的灵敏度进行测定。

(丙)本发明中，还可使培养上清液在固定化了针对“未分化糖链标志物”的抗体或凝集素的材料上反应，使预先经酶、生物素、荧光等标记化的rBC2LCN反应。可通过常规方法用荧光、酶、生物素等对rBC2LCN进行标记化，通过荧光染色、流式细胞术、ELISA、凝集素印迹等公知的方法对其进行检测。对rBC2LCN标记化之际，若使用向氨基酸序列中的任意位点导入荧光标记氨基酸的公知的芳坂等人的方法(参考非专利文献6)或一般的荧光共振能量转移(FRET)法、PerkinElmer公司的化学扩增发光接近均相检验法(Amplified LuminescenceProximity Homogeneous Assay，http://www.perkinelmer.co.jp/products_ls/assays/assays_0010.html)，则能够制作向rBC2LCN的糖链结合结构域的特定位点导入有荧光标记氨基酸的突变体，因此仅通过将该rBC2LCN突变体与细胞的培养上清液混合，就可评价细胞的分化度。

(丁)rBC2LCN的情况下，灵敏度极高，因此将培养上清液针对固定了rBC2LCN的基板反应的情况下，本发明的未分化糖链标志物“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”的量即使为皮摩尔(pM)或纳摩尔(nM)的水平也能判定存在、不存在，因此可采集分化诱导中的培养液的培养上清液的一部分的0.1～10μl左右进行测定。一般而言，优选利用定期(例如每天)进行的培养基更换时弃去的培养上清液进行测定。

(戊)作为判定施加了分化诱导的细胞的分化程度时的对照，通常使用仅相同组成的培养基的情况的测定值，但在精确定量的情况下，优选使用没有施加分化诱导的细胞的培养上清液的值作为对照。

5.关于作为对象的被测细胞

本说明书中，作为对象的被测细胞为处于未分化状态的“干细胞”或者对该细胞进行分化诱导而针对各种组织特异性地分化了的细胞。此时的“干细胞”广义表示处于未分化状态的细胞，除了例如多能干细胞(胚胎干细胞：ES细胞)、造血干细胞、神经干细胞、皮肤组织干细胞等多种成体干细胞之外，还包括向体细胞中导入了干细胞特异性表达基因等而使得其去分化获得的干细胞(iPS细胞)。此外，以ES细胞为代表的干细胞不限于人，鉴于认为哺乳动物中有相当大的部分以共通的机制进行调节，因此，作为本发明的干细胞，也能够适用于使用来自人以外的哺乳动物，例如猴、猪、牛、山羊、绵羊、小鼠、大鼠的干细胞的情况。

B.具有糖链的检测对象物质的检测方法

[概要]

接下来，关于本发明所涉及的具有糖链的检测对象物质的检测方法进行说明。

一直在进行将伴随罹患疾病或疾病进展等而在生物体试样中被检测到的蛋白质用作疾病标志物的尝试。通过检测血液、尿及唾液等生物体试样中出现的疾病标志物，能够非侵袭性地判定是否罹患或者进展程度等，能够对疾病的早期诊断、治疗效果的评价以及预后诊断等有用。迄今为止，报道了在各种癌中特异性地检测到粘蛋白(mucin)等糖蛋白。此外，还报道了根据癌的种类特定的糖蛋白的糖链结构发生变化。

以往，作为特异性检测包含糖蛋白的蛋白质的方法，已知有使用两种抗体将蛋白质夹在中间进行检测的“抗体-抗体夹心法”。抗体-抗体夹心法中，首先，使用能与目标蛋白质结合的第一抗体(捕捉用抗体)从试样中特异性分离目标蛋白质。接着，使能与目标蛋白质结合的第二抗体(检测用抗体)接触至“捕捉用抗体-目标蛋白质”的复合体上，形成“捕捉用抗体-目标蛋白质-检测用抗体”的复合体。关于检测用抗体，可使用经荧光等标记的抗体，通过荧光等的检测检测试样中的上述复合体，由此进行对目标蛋白质的检测。抗体-抗体夹心法中，通过使用两种针对相同抗原的抗体，能够以高特异性以及高灵敏度检测目标蛋白质。

一般而言，糖链的抗原性较低，因此难以获得仅与具有特定糖链结构的蛋白质结合的抗体。因此，抗体-抗体夹心法存在不适用于构建糖蛋白质的糖链的检测系统的问题。此外，为了实施抗体-抗体夹心法，必须要获得与目标蛋白质特异性结合的抗体，因此，首先必须要获得目标蛋白质的纯化物。

为了解决上述课题，本发明提供下文所述的用于检测具有糖链的检测对象物质的方法(下文中也称为“凝集素-凝集素夹心法”)以及试剂盒。

(1)检测对象物质的检测方法，其中，使具有糖链的检测对象物质与针对上述糖链具有结合性的凝集素1和凝集素2接触，形成由上述凝集素1与上述检测对象物质与上述凝集素2构成的复合体，通过检测该复合体来进行所述检测方法，其中上述凝集素1和上述凝集素2中的至少一者为不具有糖链的凝集素。

(2)根据上述(1)所述的检测方法，其中，上述检测对象物质为选自糖蛋白、糖脂质、蛋白聚糖、糖肽、脂多糖、肽聚糖及在类固醇化合物上结合了糖链的糖苷的复合糖。

(3)根据上述(1)或(2)所述的检测方法，上述凝集素1与上述凝集素2具有针对互相不同的糖链结构的结合性。

(4)根据上述(1)～(3)中任一项所述的检测方法，其中，上述不具有糖链的凝集素为在原核细胞中表达了的重组型凝集素或改变了天然型蛋白质的糖链结构而得的突变型凝集素。

(5)根据上述(1)～(4)中任一项所述的检测方法，其中，使上述检测对象物质与结合至不溶性载体的不具有糖链的上述凝集素1和未结合至不溶性载体的上述凝集素2接触形成上述复合体，通过检测该复合体来进行上述检测方法。

(6)根据上述(5)所述的检测方法，包括：

第一步骤：使上述检测对象物质与结合至不溶性载体的不具有糖链的上述凝集素1接触，获得由上述凝集素1与上述检测对象物质构成的复合体1，和

第二步骤：使上述复合体1与上述凝集素2接触，获得由上述凝集素1与上述检测对象物质与上述凝集素2构成的复合体2。

(7)根据上述(1)～(6)中任一项所述的检测方法，其中，上述凝集素1与上述凝集素2两者均为不具有糖链的凝集素。

(8)用于检测具有糖链的检测对象物质的试剂盒，所述试剂盒包含具有针对上述糖链的结合性的凝集素1和凝集素2，上述凝集素1和上述凝集素2中的至少一者为不具有糖链的凝集素。

(9)根据上述(8)所述的试剂盒，包含：

不溶性载体，和

结合至上述不溶性载体的、不具有糖链的上述凝集素1，和

未结合至上述不溶性载体的凝集素2。

(10)根据上述(8)或(9)所述的试剂盒，其中，上述凝集素1和上述凝集素2两者均为不具有糖链的凝集素。

此处，针对本发明涉及的凝集素-凝集素夹心法等中使用的用语进行说明。

“糖链”表示具有单糖通过糖苷键结合、连接为链状(直链或树枝状分枝的支链)而得的结构的一组化合物。作为构成糖链的单糖，可举出葡萄糖、半乳糖、甘露糖等己糖；L-岩藻糖等脱氧己糖；N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺等己糖胺；N-乙酰基神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸等唾液酸；木糖、L-阿拉伯糖等戊糖等。构成“糖链”的单糖的数目没有特别限定，其为2～数万左右。

“凝集素”表示下述蛋白质，所述蛋白质能识别、结合在下述复合糖上结合了的糖链的部分结构或全部结构，所述复合糖为糖蛋白、糖脂质、蛋白聚糖、糖肽、脂多糖、肽聚糖及类固醇化合物等的糖苷等。

(凝集素-凝集素夹心法)

下面，针对本发明涉及的凝集素-凝集素夹心法进行说明。凝集素-凝集素夹心法包括“复合体形成步骤”和“检测步骤”。“复合体形成步骤”为使具有糖链的检测对象物质与针对上述糖链具有结合性的凝集素1和凝集素2接触、形成由凝集素1与检测对象物质与凝集素2构成的复合体(“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体)的步骤。此外，“检测步骤”为通过检测在复合体形成步骤中形成的“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体来进行对检测对象物质的检测的步骤。

本发明涉及的凝集素-凝集素夹心法中，“检测对象物质”只要为具有糖链的物质(以下也称为“复合糖”)即可，具体而言，为糖蛋白、糖脂质、蛋白聚糖、糖肽、脂多糖、肽聚糖及糖链结合至类固醇化合物等而得的糖苷等。

此外，本发明涉及的凝集素-凝集素夹心法中，作为可包含检测对象物质的“试样”，可举出例如血液、血清、血浆、尿、唾液、淋巴液、髓液、胸水、腹水、泪液等来自生物体的材料，但不限于这些。

(凝集素1、凝集素2)

用于复合体形成步骤中的凝集素1和凝集素2均为能识别、结合检测对象物质所具有的糖链的部分结构或全部结构的物质(具有结合性的物质)。凝集素1识别的糖链结构和凝集素2识别的糖链结构可以相同，但优选互相不同。通过使用结合至不同糖链结构的凝集素1和凝集素2，能够进一步提高对检测对象物质的检测特异性。

凝集素1可为单种凝集素，或者也可以是多种凝集素的混合物。凝集素2也同样。此外，使用多种凝集素的混合物作为凝集素1的情况下，混合物中含有的凝集素所识别的糖链结构可以相同也可以不同。关于凝集素2的情况也同样。

此处，虽然原本凝集素其自身具有糖链，但在本步骤中，对凝集素1和凝集素2中的至少一者使用没有糖链的凝集素。更优选地，将不具有糖链的凝集素用于凝集素1和凝集素2两者。

本发明的发明人等进行了研究，结果表明，使用具有糖链的凝集素作为凝集素1和凝集素2的情况下，检测“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体时背景变高，不能进行高灵敏度的检测。作为背景上升的主要原因，本发明的发明人等推测：使用具有糖链的凝集素作为凝集素1和凝集素2的情况下，存在生成下述复合体的可能性：各凝集素1之间结合至彼此的糖链而成的复合体、各凝集素2之间结合至彼此的糖链而成的复合体、或凝集素1和凝集素2结合至彼此的糖链而成的复合体。此外，本发明的发明人等尝试使用没有糖链的凝集素作为凝集素1和/或凝集素2来抑制这些复合体的生成，发现由此能够以较好的灵敏度检测“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体。

即明确发现，通过对凝集素1和凝集素2的两者均使用没有糖链的凝集素，不生成各凝集素1之间的复合体、各凝集素2之间的复合体、及凝集素1和凝集素2的复合体，能够以高灵敏度仅检测“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体。此外，即使通过对凝集素1和凝集素2中的一者使用没有糖链的凝集素，各凝集素1之间的复合体、各凝集素2之间的复合体、及凝集素1和凝集素2的复合体的生成也被抑制，能够以较好的灵敏度检测“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体。

需要说明的是，此处，关于“没有糖链的凝集素”，除了完全没有糖链的修饰的凝集素之外，还包括没有可能引起糖链介导的各凝集素之间的结合的糖链的凝集素。更具体而言，关于“没有糖链的凝集素1”，只要是没有被具有能被凝集素1识别的糖链结构的糖链和/或具有能被凝集素2识别的糖链结构的糖链修饰的凝集素即可使用。原因在于，凝集素1即使具有糖链，但只要该糖链中不含凝集素1和/或凝集素2识别的糖链结构，就不生成各凝集素1之间的复合体和/或凝集素1和凝集素2的复合体。同样，关于“没有糖链的凝集素2”，只要是没有被具有能被凝集素1识别的糖链结构的糖链和/或具有能被凝集素2识别的糖链结构的糖链修饰的凝集素即可使用。

作为没有糖链的凝集素，具体而言，可举出在原核细胞中表达了的重组型凝集素，或者改变了天然型蛋白质的糖链结构而得的突变型凝集素。

(重组型凝集素)

原核细胞因为没有将糖链修饰于细胞内合成的蛋白质上的膜结构，因此用原核细胞作为宿主细胞表达了的重组型凝集素(重组凝集素)没有糖链。如下文所说明的，重组型凝集素可使用通常的遗传工程方法简便并且低成本地大量生产。

作为重组型凝集素的制造方法的一个例子来说明的话，首先，将包含编码对目标糖链结构具有结合性的凝集素的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列按照常规方法并入合适的表达用载体中，获得表达用重组载体。也可以向表达用载体中并入包含编码对目标糖链结构具有结合性的凝集素的氨基酸序列中仅糖链结构结合部分的氨基酸序列的碱基序列的碱基序列。

表达载体只要能在各种宿主细胞中表达重组凝集素、具有产生重组凝集素的功能即可，没有特别限制。作为表达载体，例如，可举出质粒载体、噬菌体载体及病毒载体。具体而言，可举出例如pTrcHis2载体、pcDNA3.1/myc-His载体(Invitrogen公司制)、pUC119(宝酒造公司制)、pBR322(宝酒造公司制)、pBluescript II KS+Stratagene公司制)、Pqe-tri(Qiagen公司制)、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL等质粒载体，λENBL3(Stratagene公司制)、λDASHII(Funakoshi公司制)等噬菌体载体、Charomid DNA(和光纯药工业(株)制)、Lorist6(和光纯药工业(株)制)等粘粒载体等。并且，除来自大肠杆菌的质粒(例如pTrc99A、pKK223、pET3a)、λ噬菌体等噬菌体等之外，还可举出pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等。

为了容易地检测和纯化重组凝集素，也可将凝集素作为与标签肽或其它蛋白质的融合蛋白表达。作为融合的标签肽，可举出FLAG标签、3XFLAG标签、His标签(His tag，例如6×His标签)等。

接着，通过使用获得的表达用重组载体转化(转导)适当的宿主细胞，制备转化体。关于宿主细胞，可使用对重组蛋白不进行糖链修饰而表达、生产的细胞。作为宿主细胞，可举出例如原核生物，具体而言大肠杆菌(Escherichia coli.)、芽孢杆菌(Bacillus)属(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、短芽孢杆菌(B.brevis)、波茨坦芽孢杆菌(B.borstelenis)等)等。作为大肠杆菌，例如可使用BL21、BL21(DE3)、K-12、DH1、DH5、DH5α、M15，HB101、C600、XL-1Blue、JM109、JM105、JM127、XL1-Blue、VCS257、TOP10等。此外，还可使用质粒、噬菌体DNA的导入效率更高的感受态细胞(Competent Cell)。作为感受态细胞，可举出例如大肠杆菌DH5α感受态细胞、大肠杆菌JM109感受态细胞(TakaraBio公司制)等。

利用表达用重组载体进行的对宿主细胞的转化可以使用以往公知的方法来进行。例如，宿主细胞为大肠杆菌的情况下，可利用Cohen等人的方法(参考Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,(1972)9,2110)、原生质体法(参考Mol.Gen.Genet.,(1979)168,111)或感受态法(参考J.Mol.Biol.,(1971)56,209)、M.Morrison的方法(参考Method in Enzymology,68,326-331,1979)等进行。此外，使用市售的感受态细胞的情况下，可根据该制品的操作流程来进行转化。

为了确认转化体(转导体)表达、产生重组凝集素，可适用例如利用探针的通过DNA杂交(Southern hybridization)、菌落杂交等杂交的常规方法。此外，还采用以下的方法。

重组凝集素在例如作为跨膜型蛋白表达的情况下等，在不分泌进转化体的培养液中的情况下，通过破坏或溶解细胞的常规方法(例如超声波处理、以均质机等进行处理、通过适当的表面活性剂等的膜溶解剂处理等)对得到的转化体进行处理，得到其裂解物(lysate)。然后，针对裂解物，根据需要对蛋白质进行进一步纯化，之后进行例如利用针对标签肽的抗体的通常的免疫测定法(斑点蛋白质印迹法、蛋白质印迹法等)，确认裂解物中标签肽的表达。

此外，重组凝集素分泌进转化体的培养液中的情况下，针对培养液(培养上清液)，进行与上述针对裂解物进行的情况相同的确认步骤。

在营养培养基中培养转化体，使得重组凝集素生成。培养可通过以往公知的方法进行，温度、培养基的pH及培养时间也可被适当地设定。培养宿主细胞是大肠杆菌的转化体的情况下，可以以培养大肠杆菌的常规方法的条件、利用通常使用的液体培养基来进行即可。

重组凝集素可按照下文所述从通过培养得到的培养物来获得。即，重组凝集素存在于转化体的周质或细胞质内时，通过过滤或离心分离等方法从培养物中回收菌体或细胞，并再悬浊于适当的缓冲液中。然后，通过例如表面活性剂处理、超声波处理、溶菌酶处理、冷冻熔解等方法破坏回收的细胞等的细胞壁和/或细胞膜之后，通过离心分离、过滤等方法获得含有重组凝集素的粗制提取液。重组凝集素被分泌进转化体的培养液中的情况下，获得培养液(培养上清液)。然后，按照通常使用的方法，以不混入糖类(糖链)的方式，从粗制提取液或培养液(培养上清液)分离、纯化重组凝集素。

作为重组凝集素的分离、纯化方法，可举出例如盐析、溶剂沉淀法等利用溶解度的方法，透析、超滤、凝胶过滤、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳等利用分子量差异的方法，离子交换色谱等利用电荷的方法，亲和层析等利用特异性亲和性的方法，反相高效液相色谱等利用疏水性差异的方法、等电点电泳等利用等电点的差异的方法等。可通过例如利用了抗His抗体的ELISA等来确认经纯化的重组凝集素。

(突变型凝集素)

突变型凝集素可通过用酸或糖分解酶处理天然型凝集素来获得。

通过用高碘酸或其盐(钠盐、钾盐等)、三氟甲磺酸等酸对天然型凝集素进行处理，可氧化糖链的羟基，使得糖链的全体结构或糖链中的部分结构变化。此外，也可通过基于碱处理的β分解除去糖链结构。由此，可改变天然型凝集素的糖链中存在的、该天然型凝集素识别的糖链结构或其它凝集素识别的糖链结构，将该天然型凝集素转变为不引起由糖链介导的各凝集素之间的结合的突变型凝集素。需要说明的是，酸处理通过以往公知的方法来进行即可(还参考下文所述的实施例11)。

此外，通过聚糖酶(N-聚糖酶、O-聚糖酶等)、甘露糖苷酶、半乳糖苷酶、角质素酶、软骨素酶、唾液酸酶、岩藻糖苷酶、N-乙酰葡糖胺酶、N-乙酰氨基己糖苷酶等糖分解酶对天然型凝集素进行处理，可从天然型凝集素中除去糖链。或者，通过糖分解酶进行处理，能够切断天然型凝集素的糖链，使得糖链的全体结构或糖链中的部分结构变化。由此，可改变天然型凝集素的糖链中存在的、该天然型凝集素识别的糖链结构或其它凝集素识别的糖链结构，将该天然型凝集素转变为不引起由糖链介导的各凝集素之间的结合的突变型凝集素。需要说明的是，酶处理可通过以往公知的方法来进行即可(还参考下文所述的实施例11)。

需要说明的是，通过酸处理、碱处理或糖分解酶处理得到的突变型凝集素由于蛋白质变性因此有时存在对糖链的结合性消失或变弱的情况。因此，用于复合体形成步骤中的凝集素1和凝集素2，使用上述的重组型凝集素是更为优选的。重组型凝集素能简便且低成本地大量生产，从这点来看也是优选的。

(复合体形成步骤)

在复合体形成步骤中，使检测对象物质与凝集素1和凝集素2接触时，凝集素1和凝集素2可同时与试样反应，也可依次反应。此外，复合体形成步骤中，可进行使用不溶性载体进行B/F分离的异质性(heterogeneous)方法，也可进行不进行B/F分离的同质性(homogeneous)方法。

关于与试样反应的凝集素1和凝集素2的量(浓度)，可根据检测对象物质的种类、所需要的测定灵敏度、测定方法、测定装置等适当地设定。

使用不溶性载体进行B/F分离的方法，例如可通过将结合至不溶性载体的凝集素1与不和不溶性载体结合的游离凝集素2与检测对象物质接触、形成复合体来进行。更具体而言，进行B/F分离的方法通过下述步骤来进行：第一步骤：使检出对象物质与结合至不溶性载体的凝集素1接触，获得由凝集素1与检测对象物质构成的复合体1；第二步骤：使复合体1与游离的凝集素2接触，获得由凝集素1和检测对象物质和凝集素2构成的复合体2。

此时，关于结合至不溶性载体的凝集素1，优选使用没有糖链的凝集素，更优选对凝集素1和凝集素2两者均使用没有糖链的凝集素。需要说明的是，此处，以使凝集素1与不溶性载体结合为例进行说明，但凝集素2结合至不溶性载体当然也是可能的，此时，优选对凝集素2使用没有糖链的凝集素，更优选对凝集素2和凝集素1两者均使用没有糖链的凝集素。

关于用于B/F分离的不溶性载体，可使用载玻片、ELISA板、磁性珠粒、过滤器(filter)、膜(film)、薄膜(membrane)等用于通常的蛋白质固定化法中的基材。关于基材的材料，通常可使用玻璃、硅、聚碳酸酯、聚苯乙烯或者聚氨酯等。

将凝集素固定于不溶性载体上的方法没有特别限制，可使用化学键合法(通过共价键固定化的方法)、物理吸附法等公知的方法。还可能利用抗生物素-生物素反应这样非常强的结合反应将凝集素固定于不溶性载体上。此时，将在凝集素上结合了生物素的生物素化凝集素固定于涂布了链亲和素(streptavidin)的链亲和素板上即可。此外，还可通过本领域中常用的各种连接体(linker)将凝集素固定于不溶性载体上。

使用不溶性载体进行B/F分离的方法中，在将试样与被固定化至不溶性载体上的凝集素1进行反应的第一步骤之后、进行将复合体1(不溶性载体-凝集素1-检测对象物质)与游离的凝集素2反应的第二步骤之前，为了从固相表面除去不需要的物质，还可含有清洗步骤。此外，第二步骤之后、进行检测步骤之前，也可含有清洗步骤。通过清洗步骤，可以从固相表面除去试样中的杂质、未反应的凝集素2，可将仅复合体2(不溶性载体-凝集素1-检测对象物质-凝集素2)分离于固相表面上。

在不进行B/F分离的方法中，作为用于分离凝集素1与检测对象物质与凝集素2的复合体的方法，可适用例如色谱法、高效液相色谱法、电泳法、毛细管电泳法、毛细管芯片电泳法、利用了例如LiBASys(岛津制作所(株)制)等自动免疫分析装置的方法等。具体条件根据试样、检测对象物质、凝集素1和凝集素2的种类·性状而适当地设定。例如，使用HPLC进行分离的情况下，可按照Anal.Chem.65,5,613-616(1993)及专利文献1等中记载的方法来进行即可。使用毛细管电泳法的情况下，可按照J.Chromatogr.593253-258(1992)、Anal.Chem.641926-1932(1992)和专利文献2等中记载的方法来进行即可。此外，作为自动免疫分析装置使用例如LiBASys的情况下，可按照生物试样分析第22卷第4号303-308(1999)中记载的方法来进行即可。

如前文已经说明的，本步骤中，通过对凝集素1和凝集素2两者均使用没有糖链的凝集素，不生成各凝集素1之间的复合体、各凝集素2之间的复合体及凝集素1和凝集素2的复合体，能够选择性地仅形成“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体。此外，即使通过只对凝集素1和凝集素2中的一者使用没有糖链的凝集素，也能够抑制各凝集素1之间的复合体、各凝集素2之间的复合体及凝集素1和凝集素2的复合体的生成，选择性地形成“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体。

(检测步骤)

关于对复合体形成步骤中形成的“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体的检测，可通过例如使用了标记物质的方法来进行。作为标记物质，例如，通常的免疫测定法等中使用的酶类、放射性同位素、荧光性物质、发光性物质、在紫外区有吸收的物质、具有作为自旋标记物的性质的物质等通常用于本领域的标记物质全部都可例示。

关于使标记物质结合至凝集素1和/或凝集素2，适当地利用例如在通常的免疫测定法等中进行的标记方法来进行即可。此外，还可采用经由一个或数个氨基酸、或者经由一个或数个氨基酸与连接体、使得标记物质结合至凝集素的方法。进而，还有各种使得标记物质与蛋白质结合的试剂盒已被市售，因此也可以使用它们按照试剂盒所附的操作说明书进行标记。

复合体的检测和测定可根据标记物质所具有的可通过某种方法检测到的性质、按照分别规定的方法来实施。例如，下文概括了使用固定化至不溶性载体的凝集素1与经作为标记物质的辣根过氧化物酶(HRP)标记的游离凝集素2进行B/F分离的方法。

即，使含有具有糖链的检测对象物质的试样与固定化了凝集素1的不溶性载体接触，在4～40℃反应3分钟～20小时、在固相表面上生成凝集素1与检测对象物质的复合体1。接着，将含有经HRP标记的凝集素2的溶液添加至固相表面，在4～40℃反应3分钟～16小时、生成固定化凝集素1-检测对象物质-标记凝集素2的复合体2。接下来，添加适当浓度的TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)溶液，使其反应一定时间。之后，添加1M硫酸等反应停止液，使反应停止，测定450nm的吸光度。从得到的测定值与预先对浓度已知的检测对象物质的溶液进行了同样的测定得到的标准曲线，可计算出试样中的检测对象物质的量。

此外，还可使用例如经Alexa Fluor-488四氟苯基酯等标记了的凝集素1与例如经Alexa Fluor-647琥珀酰亚胺酯(succinimidyl ester)等标记的凝集素2，根据公知的荧光相关光谱法(Fluorescence CorrelationSpectroscopy，FCCS)测定检测对象物质。

此外，关于“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体的检测，还可通过不使用标记物质、利用例如来自复合体的性质进行测定的方法(具体而言，表面等离振子共振等均相免疫检验等方法)来进行。

如前文已经说明的那样，通过在复合体形成步骤中对凝集素1和凝集素2两者均使用没有糖链的凝集素，在本步骤中能够以高灵敏度仅检测“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体。此外，通过在复合体形成步骤中即使只对凝集素1和凝集素2中的一者使用没有糖链的凝集素，在本步骤中也能够以较好的灵敏度检测“凝集素1-检测对象物质-凝集素2”的复合体。

(实施方式例)

下面，对凝集素-凝集素夹心法的实施方式的具体例进行描述。需要说明的是，各操作之后，根据需要，也可进行除去不需要的物质的操作(清洗等)。

(1-1)利用被固定化至不溶性载体的凝集素1与未固定化至不溶性载体的游离的非标记凝集素2的方法1

(i)将试样与固定化至不溶性载体的凝集素1和游离的非标记凝集素2接触，形成固定化至不溶性载体的凝集素1与检测对象物质与非标记凝集素2的复合体，

(ii)测定该复合体的量，

(iii)基于获得的该复合体的量，测定试样中的检测对象物质的量。

(1-2)利用被固定化至不溶性载体的凝集素1与游离的非标记凝集素2的方法2

(i)将试样与固定化至不溶性载体的凝集素1接触，形成固定化至不溶性载体的凝集素1与检测对象物质的复合体1，接着

(ii)将该复合体1与游离的非标记凝集素2接触，形成复合体1与非标记凝集素2的复合体2，接着

(iii)测定该复合体2的量，

(iv)基于该复合体2的量，测定试样中的检测对象物质的量。

(2-1)利用被固定化至不溶性载体的凝集素1与经标记物质标记的游离的凝集素2的方法1

(i)将试样与固定化至不溶性载体的凝集素1和经标记物质标记的游离的凝集素2接触，形成固定化至不溶性载体的凝集素1与检测对象物质与标记凝集素2的复合体，

(ii)测定该复合体中的标记物质的量，

(iii)基于获得的标记物质的量，测定试样中的检测对象物质的量。

(2-2)利用被固定化至不溶性载体的凝集素1与经标记物质标记的游离的凝集素2的方法2

(i)将试样与固定化至不溶性载体的凝集素1接触，形成固定化至不溶性载体的凝集素1与检测对象物质的复合体1，接着，

(ii)将该复合体1与经标记物质标记的游离的凝集素2接触，形成复合体1与标记凝集素2的复合体2，接着，

(iii)测定该复合体2中的标记物质的量，

(iv)基于获得的标记物质的量，测定试样中的检测对象物质的量。

(3-1)利用游离的凝集素的方法1

(i)将试样与游离的凝集素1和游离的凝集素2接触，形成凝集素1与检测对象物质与凝集素2的复合体，

(ii)测定该复合体的量，

(3-2)利用游离的凝集素的方法2

(i)将试样与游离的凝集素1接触，形成检测对象物质与凝集素1的复合体1，接着，

(ii)将该复合体1与游离的凝集素2接触，形成凝集素1与检测对象物质与凝集素2的复合体2，接着，

(iii)测定该复合体2的量，

(iv)基于获得的该复合体2的量，测定试样中的检测对象物质的量。

(4-1)利用游离的凝集素1与经标记物质标记的游离的凝集素2的方法1

(i)将试样与游离的凝集素1和经标记物质标记的游离的凝集素2接触，形成凝集素1与检测对象物质与标记凝集素2的复合体，

(ii)测定该复合体中的标记物质的量，

(4-2)利用游离的凝集素1与经标记物质标记的游离的凝集素2的方法2

(iii)测定该复合体2中的标记物质的量，

(5-1)利用经标记物质标记的游离的凝集素1与经标记物质标记的游离的凝集素2的方法1

(i)将试样与经标记物质标记的游离的凝集素1和经标记物质标记的游离的凝集素2接触，形成标记凝集素1与检测对象物质与标记凝集素2的复合体，

(ii)测定该复合体中的标记物质的量，

(5-2)利用经标记物质标记的游离的凝集素1与经标记物质标记的游离的凝集素2的方法2

(i)将试样与经标记物质标记的游离的凝集素1接触，形成检测对象物质与标记凝集素1的复合体1，接着，

(iii)测定该复合体2中的标记物质的量，

(凝集素-凝集素夹心法的有利效果)

根据上文说明的凝集素-凝集素夹心法，例如检测糖蛋白(作为复合糖)的情况下，如果糖蛋白具有多条糖链，则能够使得与该糖链反应的凝集素结合至多个糖蛋白上。此外，即使在糖蛋白仅具有一条糖链的情况下，若凝集素中与这一条糖链反应的结构存在多个，则该凝集素也能够结合至多个糖蛋白。与之相对地，以往的抗体-抗体夹心法中，糖蛋白的一个表位上仅能结合一个抗体。因此，通过凝集素-凝集素夹心法，较之抗体-抗体夹心法而言，能够显著提高糖蛋白的检测灵敏度。

此外，即使在难于获得仅与具有特定糖链结构的糖蛋白结合的抗体、无法通过抗体-抗体夹心法构建检测系统时，根据凝集素-凝集素夹心法，也能够利用与该糖链结构反应的凝集素容易地构建检测系统。进而，凝集素-凝集素夹心法中，作为凝集素使用重组蛋白质的话，能够以低成本构建检测系统。

根据最近的研究，已经明白了糖链的多种功能。特别是在癌(转移、肿瘤标志物等)、免疫(免疫受体调节、免疫细胞分化、抗体医药等)、受精、发生·分化(再生医疗等)、感染症(流感、幽门螺杆菌、霍乱毒素等)、生物医药、脑、血型等中，发现糖链发挥令人注目的重要作用。因此，能进行对特定的糖链结构的检测的本发明的凝集素-凝集素夹心法，能特别有效地利用于例如癌标志物(SLX抗原、CA19-9抗原等)等的疾病相关生物标志物的研究(发现·开发等)、通过检测该生物标志物对癌及其它疾病的诊断·判定(例如癌的恶性程度判定、癌转移能力的评价等)、各疾病的发病机理的阐明以及治疗法的开发、充质干细胞标志物·分化标志物等的研究、生物医药的品质管理及其开发、细胞的品质管理等领域中。

需要说明的是，本发明涉及的凝集素-凝集素夹心法，不限于人工操作，还可适用于利用了自动分析装置的测定系统、容易且迅速地进行测定。关于使用人工操作或自动分析装置进行测定的情况下的试剂类等的组合等，没有特别的限制，可根据适用的自动分析装置的环境、型号，或者考虑到其它因素，适当选择认为是最佳的试剂类等的组合来使用。进而，本发明所涉及的凝集素-凝集素夹心法还可应用至Micro-TAS(微整合分析系统：μ-TAS，Micro-Total Analysis Systems)。

(具体例)

下面，以检测上述干细胞的培养上清液中的未分化糖链标志物(作为复合糖)的情况为例，进一步具体说明凝集素-凝集素夹心法。此处，参照图1，对上述实施方式例中根据“(2-2)利用被固定化至不溶性载体的凝集素1与经标记物质标记的游离的凝集素2的方法2”的方法进行说明。

(甲)复合体形成步骤的第一步骤

首先，使培养上清液接触不溶性载体的固相表面S，进行反应，所述不溶性载体的固相表面S上固定化了作为凝集素L₁的重组型BC2LCN(下文中也称为“rBC2LCN”)(参考图A)。rBC2LCN对培养上清液中作为检测对象物质T含有的、具有上述(式1)或(式2)表示的未分化糖链标志物的糖链结构G₁(Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc)具有结合性。由此，在反应后的固相表面S上，形成了凝集素L₁经由糖链结构G1介导而与检测对象物质T结合了的复合体1(参考图B)。

凝集素L₁优选对检测对象物质T具有的糖链结构G₁具有高特异性。关于这点，rBC2LCN对糖链结构“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”具有高特异性。因此，本步骤中，通过凝集素L₁与糖链结构G₁的特异性结合，能够将培养上清液中的未分化糖链标志物特异性地捕捉到固相表面S上。

本步骤中，通过使用没有糖链的rBC2LCN作为凝集素L₁，在下文说明的第二步骤中，能够防止生成凝集素L₁与凝集素L₂的复合体。

(乙)复合体形成步骤的第二步骤

接着，使通过荧光物质等标记了的游离的凝集素L₂接触至固相表面S上形成的复合体1，进行反应。作为前序步骤，还可进行清洗，以除去固相表面S存在的杂质。

关于凝集素L₂，可使用已明确与未分化糖链标志物具有结合性的SRL、CGL2、ABA、XCL(参考实施例6)。这些凝集素的氨基酸序列示于序列号2～5中。序列表中，分别地，序列号2表示ABA的氨基酸序列，序列号3表示XCL的氨基酸序列，序列号4表示SRL的氨基酸序列，序列号5表示CGL2的氨基酸序列。这些凝集素也可两种以上组合使用。图中，具有未分化糖链标志物的糖链结构中，这些凝集素结合的糖链结构以符号G₂表示。

需要说明的是，SRL、CGL2、ABA及XCL只要维持特异性识别未分化糖链标志物的特性，则并不必需对应于序列号2～5的全长，并且序列号2～5中部分地一部分氨基酸也可以被缺失、取代、插入、添加。

通过本步骤，在固相表面S上，在凝集素L₁经由糖链结构G₁介导与检测对象物质T结合而得的复合体1上，进一步经由糖链结构G₂介导与凝集素L₂结合而形成复合体2(参考图C)。

上述第一步骤中，通过使用没有糖链的rBC2LCN作为凝集素L₁，在本步骤中可以防止凝集素L₂结合至凝集素L₁的糖链形成复合体，能够选择性地在固相表面S上仅形成由rBC2LCN与未分化糖链标志物与凝集素L₂形成的复合体2。

进而，通过对凝集素L₂也使用没有糖链的rSRL、rCGL2、rABA、rXCL，能够防止凝集素L₁结合至凝集素L₂的糖链形成复合体、或者各凝集素L₂之间形成复合体。

(丙)检测步骤

最后，通过对应于荧光检测等的标记物质的性质的检测方法，通过检测标记至凝集素L₂上的标记物质，检测固相表面S上形成的复合体2。通过在复合体形成步骤中针对凝集素L₁和凝集素L₂两者均使用没有糖链的重组型凝集素，在本步骤中能够以高灵敏度仅检测复合体2。

进而，还可通过测定荧光强度等测定标记物质的量，基于得到的标记物质的量，测定培养上清液中的未分化糖链标志物的量。作为前序步骤，还可进行清洗，以除去固相表面S存在的杂质和/或未反应的凝集素L2。

本具体例中，通过组合使用与不同糖链结构结合的rBC2LCN(凝集素L₁)与rSRL、rCGL2、rABA和/或rXCL(凝集素L₂)进行夹心法，较之仅使用rBC2LCN进行检测的情况而言，能够提高未分化糖链标志物的检测特异性。

此外，根据本具体例，通过使用经标记的rSRL、rCGL2、rABA和/或rXCL(凝集素L₂)进行夹心法，较之仅使用经标记的rBC2LCN(凝集素L₁)进行检测的情况、或较之仅使用rBC2LCN检测经标记的试样的情况而言，能获得更强的检测信号。因此，根据本具体例，在基于检测信号的强度定量检测未分化糖链标志物时，能够以更高的精度进行定量(参考实施例7)。

(试剂盒)

本发明涉及的用于检测具有糖链的检测对象物质的试剂盒包含对所述糖链具有结合性的凝集素1和凝集素2，其中，凝集素1和凝集素2中的至少一者为没有糖链的凝集素。

关于试剂盒的必要组件的优选实施方式和具体例，如上文关于凝集素-凝集素夹心法的说明中所记载的那样。此外，这些试剂的浓度等的优选方式，也通常从本领域中通常使用的浓度范围适当地选择即可。

此外，试剂盒中含有的试剂中，可以含有通常本领域中使用的试剂类，例如缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定剂、防腐剂等不抑制共存的试剂等的稳定性、不抑制检测对象物质与凝集素1和凝集素2的反应的物质。此外，其浓度通常也可从本领域中通常使用的浓度范围适当地选择。

此外，试剂盒中还可含有用于针对检测对象物质制作标准曲线的标准品。标准品可以使用市售的物质，也可使用按照公知的方法制造的物质。

本发明中使用的用语和概念基于本领域中惯常使用的用语的含义，为了实施本发明使用的各种技术除了特别明示其文献来源的技术之外，本领域技术人员可基于公知的文献等容易且确实可行地实施。

此外，各种分析等，按照使用的分析仪器或试剂、试剂盒的操作说明书、目录册等中记载的方法进行。

需要说明的是，本说明书中引用的技术文献、专利文献及专利申请说明书中的记载内容作为本发明的记载内容而被参考。

实施例

下文中示出实施例，对本发明进行具体说明，但本发明不限定于这些实施例。

需要说明的是，在各实施例中，以每天将培养基更换为新鲜的培养液的方式对细胞进行培养。此外，利用在培养基更换时获得的待弃去的培养液，即，使用将培养基更换为新鲜培养液之后经过了约24小时的培养液的培养上清液进行了各种检测。

(实施例1)ES细胞的细胞染色

本实施例中使用的ES细胞(KhES1株)为从京都大学再生医科学研究所干细胞医学研究中心分获的。通过Suemori等人的方法(参考非专利文献4)进行了培养。将细胞以4％低聚甲醛固定，用PBS清洗，之后添加经荧光标记化(结合了Cy3)的rBC2LCN在室温下反应1小时(图2，中部的左图。右图为对相同细胞的核进行了染色的图)。

作为比较对象，使特异性识别ES细胞、iPS细胞的Tra1-60抗体与KhES1细胞菌落反应，之后进一步与作为二抗的抗小鼠IgM-Alexa488反应，获得菌落的染色图，其示于图2上部的左图。该上部的右图为用DAPI对相同细胞的核进行了染色的图。

经荧光标记的rBC2LCN与Tra1-60抗体同样地对ES细胞强烈染色(图2中部的左图，右图为对相同组织的核进行了染色的图)。作为阴性对照，对BSA进行荧光标记化，使用其的情况下没有观察到荧光(图2下部的左图，右图为对相同细胞的核进行了染色的图)，因此可知rBC2LCN能以与Tra1-60抗体相同的程度或更高的程度有效地检测ES细胞。

因为上述实验中是不破碎细胞进行的，因此可以看出，与Tra1-60抗体识别细胞表面的糖蛋白抗原相同，rBC2LCN识别的糖链结构的“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”作为在未分化状态的干细胞表面大量表达的糖蛋白及糖脂质的构成糖以覆盖细胞表面的形式存在。

(实施例2)ES细胞的分化诱导时的细胞染色

向以与实施例1相同的方法制备的ES细胞(KhES1株)培养液中，按照Draper等人的方法(参考非专利文献5)，添加视黄酸至终浓度为10^-5M进行培养，由此进行了对ES细胞的分化诱导。培养了8天，结果从细胞形态观察确认到进行了充分的分化，将经荧光标记的rBC2LCN与各细胞反应(图3)。作为比较对象，Tra1-60抗体反应后，进而与作为二抗的抗小鼠IgM-Alexa488反应。图中，“+RA”的部分表示进行了视黄酸处理向神经方向分化的情况，“-RA”的部分表示未处理的情况。需要说明的是，图3右的“DAPI”表示对相同细胞的核以DAPI进行了染色的结果。

分化为神经细胞的KhES1株中基本检测不到rBC2LCN的荧光。而与之相对，Tra1-60抗体的荧光强度则仍保持为可被充分观察到的强度。该实验结果表明，作为公知的未分化标志物使用的Tra1-60抗体识别的糖蛋白抗原在即使进行了分化的状态下也仍然在细胞表面维持相当大的表达量，而与之相对地，在rBC2LCN识别的糖链结构“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”的情况下，虽然其在未分化状态下以覆盖细胞表面的形式表达，但随着分化进行表达几乎消失。

从以上结果明显可见，“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”的糖链结构是作为用于判定分化、未分化的未分化糖链标志物而言非常优秀的标志物。此外，可知，rBC2LCN固定化基板能特异性识别具有未分化性的ES细胞、iPS细胞等干细胞，具有作为优秀的分化、未分化判定用试剂盒的高有用性。

(实施例3)对经荧光标记化的培养上清液的直接分析

该实验中使用的iPS细胞(201B7株、253G1株)是从物理化学研究所生物资源中心(Riken BioResource Center)分获的。该TIGMKOS#19株是由(独)产业技术综合研究所干细胞工学研究中心建立的(论文未发表)。通过Tateno等人的方法(参考非专利文献1)进行了培养。回收培养了约24小时的培养液，通过离心分析分离了仅液体成分，获得了培养上清液。

使用固定化的rBC2LCN，对培养上清液中是否存在“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”的糖链结构进行了调查。具体而言，以与实施例2相同的方法，对iPS细胞的201B7株和253G1株培养了8天并进行了分化诱导。作为对照，在无视黄酸(RA)的情况下，针对相同的iPS细胞的201B7株和253G1株也进行了相同天数的培养。此外，针对TIGMKOS#19株也在无视黄酸(RA)的情况下培养了4天。培养液每天进行培养基更换，更换为新鲜的培养液，得到的待弃去的培养上清液被供给至以下的测定工序。对各iPS细胞的培养上清液进行荧光标记化，与被固定化于载玻片上的rBC2LCN于20℃反应一夜，清洗之后，通过渐消波激发荧光型扫描器检测了其结合(图4)。

结果，rBC2LCN虽然与无视黄酸的情况下培养的维持了未分化的iPS细胞(201B7株、253G1株、TIGMKOS#19株)的培养上清液反应，但与存在视黄酸时培养的分化了的iPS细胞(201B7株、253G1株)和对照培养基不显示反应性。这切实验证了

“Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc”的糖链结构作为用于判定培养上清液中的分化、未分化的未分化糖链标志物有效地发挥作用。

利用本性质，可以不采集细胞、使用培养上清液来验证ES细胞、iPS细胞的建立。此外，还可以验证这些干细胞被保存时、或想使其以维持未分化性的方式增殖时没有混入分化细胞。此外，利用本性质，从ES细胞、iPS细胞等干细胞制作各种器官细胞(心肌细胞、肝脏细胞、神经细胞、胰岛细胞、软骨细胞、骨细胞等)时，可以仅通过检查培养上清液对维持了未分化性的残留下来的细胞简便且迅速地检测。

需要说明的是，以往虽然作为未分化细胞的标志物公知有Nanog、POU5F1、DNMT3B、TERT、UTF1(未分化胚胎细胞转录因子1，undifferentiated embryonic cell transcription factor1)、FOXD3、LIN28、BRIX等蛋白质，但认为这些蛋白质大多局限于核内，不可能在培养上清液中检测。

(实施例4)通过凝集素印盖对培养上清液的分析

为了以更高的灵敏度检测培养上清液中的未分化糖链标志物，尝试了针对被捕捉至载玻片上的rBC2LCN(凝集素1)的未分化糖链标志物，使得检测用凝集素(凝集素2)结合上去，通过凝集素-凝集素夹心法进行检测。关于检测用凝集素，使用了生物素化的rAAL。

即，采集实施例3中无视黄酸(RA)的iPS细胞(TIGMKOS#19株)和仅培养基(对照培养基)培养了4天的培养上清液，使其在固定化了rBC2LCN的载玻片上于20℃反应一夜。清洗后，使生物素化的rAAL于20℃反应一夜，之后使1μg/mL的Cy3标记化了的链亲和素于20℃反应30分钟，之后，通过渐消波激发荧光型扫描器检测了结合(图5)。针对对照培养基也进行了相同的处理和测定。

从本实施例的结果明确可见，通过利用固定化于载玻片上的rBC2LCN和经生物素标记的AAL进行的本发明的凝集素-凝集素夹心法，能够检测培养上清液中的未分化糖链标志物。

(实施例5)印盖凝集素的筛选

本实施例中，为了通过凝集素-凝集素夹心法检测未分化糖链标志物，对能够作为与作为捕捉用凝集素的rBC2LCN共同使用的检测用凝集素(印盖凝集素)进行了筛选。作为筛选对象的重组型凝集素示于以下的“表1”中。

表1

*PDB：RCSB蛋白数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)、NCBI(National Center of Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed))

**Ref.1：“Carbohydrate binding specificity of a fucose-specific lectinfrom Aspergillus oryzae:a novel probe for core fucose.”J Biol Chem.2007May25；282(21):15700-8

Ref.2：“A Novel Core Fucose-specific Lectin from the MushroomPholiota squarrosa.”J Biol Chem.2012Oct5；287(41):33973-82

将固定化于环氧活性化的载玻片(#1066643、SCHOTT)上的rBC2LCN与对照培养基或iPS细胞(TIG/MKOS)以每天更换培养基的方式培养3天，将培养第3天的培养上清液(培养基更换后经过约24小时的培养上清液)于20℃反应一夜。接着，用溶液(25mM Tris-HClpH7.5、140mM NaCl(TBS)、2.7mM KCl、1mM CaCl2、1mM MnCl2和1％Triton X-100)清洗1次。之后，添加Cy3标记化重组型凝集素，在20℃孵育3小时。用GlycoStation^TM Reader1200(GP BioSciences)测定了荧光强度，结果示于图6。图的纵轴表示从培养上清液得到的荧光强度值减去从对照培养基得到的荧光强度值的差值。

如图6所示，除实施例4中使用的AAL之外，以SRL、CGL2、ABA、XCL这四种重组型凝集素观察到了特别优异的荧光强度值。由此明确可知，这四种凝集素作为通过凝集素-凝集素夹心法检测未分化糖链标志物时的检测用凝集素有用。

(实施例6)凝集素-凝集素夹心法(重组凝集素)

本实施例中，关于凝集素2(检测用凝集素)使用实施例5中被特定了的rSRL、rCGL2、rABA、rXCL，关于凝集素1(捕捉用凝集素)使用rBC2LCN，通过凝集素-凝集素夹心法进行了对未分化糖链标志物的检测。

在链亲和素板(Nunc,#436020)上固定了生物素化的rBC2LCN。在视黄酸(RA)存在下或不存在下以每天更换培养基的方式对iPS细胞进行了8天培养，回收得到培养第8天的培养上清液(培养基更换后经过约24小时的培养上清液)，将其滴加至清洗后的板，于37℃反应1小时。向进行了再次清洗的板上，添加经HRP标记化的上述重组型凝集素，于37℃反应1小时。清洗后，滴加1-step ULTRA TMB-ELISA(Thermo,#34028)，在室温下反应30分钟后，添加1M硫酸停止反应，测定450nm的吸光度。

结果示于图7。图7中，将从培养上清液得到的吸光度值除以用对照培养基得到的吸光度值而得的值表示为S/N。使每种凝集素反应的情况下，未分化的iPS细胞的培养上清液(253G1(RA-))均显示出高的S/N值，与之相比，分化了的iPS细胞的培养上清液(253G1(RA+))显示出较低的S/N值。四种印盖凝集素中，rABA显示出最高的S/N值。另一方面，供体细胞(MEF)的培养上清液中，与视黄酸(RA)的添加无关，显示出与对照培养基基本相同程度的反应性。

(实施例7)凝集素-凝集素夹心法中标准曲线的制作

本实施例中，在基于实施例6构建的凝集素-凝集素夹心法的未分化糖链标志物的检测系统中，制作了用于对培养上清液中的未分化细胞数目进行定量的标准曲线。

对iPS细胞(201B7或253G4)进行24小时培养后，回收培养基(Medium WakoB、Nutristem、ReproFF或MEF-CM)，对培养基中的iPS细胞的细胞数目进行计数。对iPS细胞的培养上清液进行系列稀释，用与实施例6相同的方法进行分析，获得显示得到的吸光度值与细胞数的关系的回归直线作为标准曲线。使用rABA作为检测用凝集素得到的标准曲线示于图8、图9中，使用rSRL得到的标准曲线示于图10、图11。图8～图11所示的标准曲线均显示出0.961以上的高相关系数。

从本实施例的结果可知，若通过特定的凝集素的组合进行对培养上清液中的未分化糖链标志物的测定，则能够定量检测未分化细胞，进行未分化细胞数是否为0的判定。

(实施例8)未分化糖链标志物的鉴定

本实施例中，进行了对未分化糖链标志物的鉴定

以每天更换培养基的方式培养了3天获得的ES细胞的培养上清液(KhES1sup)、培养了3天获得的iPS细胞的培养上清液(253G1sup)(培养基更换后经过了约24小时的培养上清液)及各自的对照培养基各取1mL，与rBC2LCN固定化珠粒混合，在室温下使其反应3小时。反应后，将珠粒在0.2％SDS100μL中于95℃加热5分钟，使结合的级分溶出。取结合的级分10μL于丙烯酰胺凝胶上进行电泳，并进行了银染色和基于HRP-rABA或HRP-rSRL的印迹杂交(blot)。

结果示于图12的A～C。基于HRP-rABA及HRP-rSRL的印迹杂交中，具有240kDa以上的分子量的分子显示了信号(参见B、C)。

进而，用抗足糖萼蛋白抗体进行印迹杂交的结果示于图12D。以显示出240kDa以上的分子量的分子确认到信号，明确了该分子是足糖萼蛋白或者足糖萼蛋白的一部分。

从该结果将足糖萼蛋白鉴定为未分化糖链标志物之一。关于足糖萼蛋白已知：足糖萼蛋白是1型跨膜糖蛋白，其是从作为足细胞已知的上皮性肾小球(glomerulus)细胞鉴定的，在肾小球的功能·形态的保持中具有重要的作用，此外还与各种癌的发展也有关联(参考非专利文献8)。

此外，从本实施例的结果和进行了对足糖萼蛋白的碱消化的实验结果推测，足糖萼蛋白在修饰糖链的结构中包含“Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H3型糖链)”。需要说明的是，不明确足糖萼蛋白中是否存在H1型糖链。

本实施例中，具有H3型糖链的足糖萼蛋白被鉴定的事实表明了能够利用抗足糖萼蛋白抗体、即特异性识别足糖萼蛋白的H3型糖链的修饰位点的抗体作为用于检测未分化细胞的探针的可能性。

(实施例9)对rBC2LCN的结合特性的分析

本实施例中，进行了对rBC2LCN识别的糖链结构的分析。

按照馆野等人的方法(参考非专利文献7)，将rBC2LCN固定化于NHS活化的Sepharose4FF(GE)上，上样至微型柱(内径，2mm；长度，10mm，柱床体积，31.4μl)后，连接至高效液相色谱。将从人iPS细胞(201B7)分离的吡啶氨基化糖链注入柱中，以激发285nm、荧光350nm检测了荧光。分析的结果可知，rBC2LCN针对从iPS细胞分离的包含H3型的O型糖链以Ka＝2.5x104M-1的亲和性结合(参见图13)。

图13(A)中，虚线表示作为对照PA化糖链的Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA的溶出情况。实线表示作为从iPS细胞分离的PA化糖链的Fucα1-2Galβ1-3(Galβ1-3GlcNAcβ1-6)GalNAc-PA的溶出情况。此外，图13(B)为Fucα1-2Galβ1-3(Galβ1-3GlcNAcβ1-6)GalNAc-PA(包含H3型的O型糖链)的模式图。圆圈表示半乳糖，白方块表示N-乙酰半乳糖胺，黑方块表示N-乙酰葡糖胺，三角形表示岩藻糖。此外，半乳糖和N-乙酰葡糖胺之间、半乳糖和N-乙酰半乳糖胺之间的粗线表示β连接，半乳糖和岩藻糖之间的细线表示α连接。

(参考实施例10)使用天然型凝集素的比较实验

本参考实施例中，在凝集素-凝集素夹心法中，验证了利用具有糖链的凝集素的情况的问题点。

向将96种凝集素固定化于载玻片上而得的高密度天然型凝集素阵列(参考非专利文献1)滴加PNGaseF，于37℃反应一夜。反应后进行1次清洗，滴加Cy3标记化重组型凝集素(rOrysata)，于20℃反应一夜。反应后进行2次清洗，用GlycoStation^TM Reader1200(GP BioSciences)测定了荧光强度。此外，作为比较，还使用没有进行PNGase处理的高密度天然型凝集素阵列进行了同样的操作。

结果，没有进行PNGaseF处理的凝集素阵列中，用SSA、SNA、RCA120、MCA时检测到了信号，rOrysata与这四种凝集素结合。另一方面，进行了PNGaseF处理的凝集素阵列中，来自SSA、SNA、RCA120、MCA的信号消失。这表明，在凝集素-凝集素夹心法中，使用具有糖链的凝集素的情况下，各凝集素之间并不介入检测对象物质，而是经由该凝集素自身具有的糖链结合从而形成并非目标的复合体。即，明确在凝集素-凝集素夹心法中若使用天然型凝集素，则在糖链检测中产生假阳性的可能性变高。

(实施例11)凝集素夹心法(糖链被除去的天然型凝集素)

本参考实施例中，使用通过糖分解酶处理天然型凝集素阵列得到的突变型凝集素阵列，进行了基于凝集素-凝集素夹心法的糖蛋白检测。

向参考实施例10中使用的天然型凝集素阵列中滴加PNGaseF，于37℃孵育一夜。孵育后，清洗2次，滴加甲状腺球蛋白(10μg/mL)，于37℃反应一夜。反应后进行2次清洗，滴加Cy3标记化的重组型凝集素(rOrysata)，于20℃反应三小时。反应后进行2次清洗，通过GlycoStation^TM Reader1200(GP BioSciences)测定了荧光强度。此外，作为比较，不滴加甲状腺球蛋白进行了同样的操作，算出了以滴加了甲状腺球蛋白的阵列得到的荧光强度值(信号)和以未滴加的阵列得到的荧光强度值(噪声)之比(S/N比)。需要说明的是，从甲状腺球蛋白的糖链结构推测SSA、SNA、RCA120、MCA和rOrysata每种均对甲状腺球蛋白具有结合性。

结果示于“表2”。

表2

未进行PNGaseF处理的凝集素阵列的SSA(天然型凝集素)的S/N比为约1.9。与之相对，进行了PNGaseF处理的凝集素阵列的SSA(糖链被除去的天然型凝集素)的S/N比则为约8.0，其被显著改善。同样，对SNA、RCA120、MCA亦然，进行了PNGaseF处理的凝集素阵列较之未进行PNGaseF处理的凝集素阵列而言甲状腺球蛋白检测的S/N比显著改善了。

从该结果和实施例10的结果认为，未进行PNGaseF处理的阵列中，rOrysata（检测用凝集素）不经由甲状腺球蛋白（检测对象物质）而与SSA、SNA、RCA120、MCA（捕捉用凝集素）直接结合，发生噪声。与之相对，进行了PNGaseF处理的阵列中，通过除去捕捉用凝集素的糖链，检测用凝集素与捕捉用凝集素之间的直接结合被防止，能够以高灵敏度检测由捕捉用凝集素与检测对象物质与检测用凝集素的复合体产生的信号。

从本实施例的结果确认了，进行凝集素-凝集素夹心法分析的情况下，通过排除凝集素的糖链的影响，防止使用的凝集素的糖链上结合其它凝集素，将测定的背景控制为较低水平，能够以高灵敏度测定检测对象物质。

符号说明

1：复合体1（凝集素L₁与检测对象物质T的复合体）

2：复合体2（凝集素L₁与检测对象物质T与凝集素L₂的复合体）

L₁：凝集素1

L₂：凝集素2

G₁、G₂：糖链结构

S：固相表面

T：检测对象物质

Claims

1.一种判定干细胞的分化状态的方法，其特征在于，测定干细胞的培养上清液中下述(式1)或(式2)表示的未分化糖链标志物的是否存在或存在量：

(式1)

(式2)

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用特异性识别(式1)或(式2)表示的糖链结构的蛋白质来测定所述未分化糖链标志物的有无或存在量。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述蛋白质为下述蛋白质：所述蛋白质包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且特异性识别所述(式1)或(式2)表示的糖链结构。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其特征在于，所述干细胞的培养上清液为对该干细胞施加了分化诱导处理后的培养上清液。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其特征在于，测定来源于足糖萼蛋白的上述(式1)和/或(式2)表示的所述未分化糖链标志物的是否存在或存在量。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其特征在于，通过使用下述蛋白质的凝集素-凝集素夹心法检测所述未分化糖链标志物，所述蛋白质特异性识别所述(式1)或(式2)表示的糖链结构，包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列，并且没有糖链。

7.一种获得没有混入未分化细胞的分化细胞的方法，其特征在于，确认施加了分化诱导处理的干细胞的培养上清液中不存在下述(式1)或(式2)表示的未分化糖链标志物并进行采集，

(式1)

(式2)

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，关于所述未分化糖链标志物不存在的确认使用下述蛋白质来进行，所述蛋白质特异性识别所述(式1)或(式2)表示的糖链结构，并且包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。

9.一种用于判定干细胞的分化状态的方法的试剂盒，其特征在于，包含特异性识别下述(式1)或(式2)表示的糖链结构的蛋白质，

(式1)

(式2)

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，所述蛋白质为下述蛋白质：所述蛋白质特异性识别所述(式1)或(式2)表示的糖链结构，并且包含序列号1所示的氨基酸序列或该氨基酸序列的一个或数个氨基酸被缺失、取代、插入或添加而得的氨基酸序列。

11.检测对象物质的检测方法，其中，使具有糖链的检测对象物质与针对所述糖链具有结合性的凝集素1和凝集素2接触，形成由所述凝集素1与所述检测对象物质与所述凝集素2构成的复合体，通过检测该复合体来进行所述检测方法，其中所述凝集素1和所述凝集素2中的至少一者为不具有糖链的凝集素。

12.根据权利要求11所述的检测方法，其中，所述检测对象物质为选自糖蛋白、糖脂质、蛋白聚糖、糖肽、脂多糖、肽聚糖及在类固醇化合物上结合了糖链的糖苷的复合糖。

13.根据权利要求11或12所述的检测方法，其中，所述凝集素1与所述凝集素2具有针对互相不同的糖链结构的结合性。

14.根据权利要求11～13中任一项所述的检测方法，其中，所述不具有糖链的凝集素为在原核细胞中表达了的重组型凝集素或改变了天然型蛋白质的糖链结构而得的突变型凝集素。

15.根据权利要求11～14中任一项所述的检测方法，其中，使所述检测对象物质与结合至不溶性载体的不具有糖链的所述凝集素1和未结合至不溶性载体的所述凝集素2接触形成所述复合体，通过检测该复合体来进行所述检测方法。

16.根据权利要求15所述的检测方法，包括：

第一步骤：使所述检测对象物质与结合至不溶性载体的不具有糖链的所述凝集素1接触，获得由所述凝集素1与所述检测对象物质构成的复合体1，和

第二步骤：使所述复合体1与所述凝集素2接触，获得由所述凝集素1与所述检测对象物质与所述凝集素2构成的复合体2。

17.根据权利要求11～16中任一项所述的检测方法，其中，所述凝集素1与所述凝集素2两者均为不具有糖链的凝集素。

18.用于检测具有糖链的检测对象物质的试剂盒，所述试剂盒包含针对所述糖链具有结合性的凝集素1和凝集素2，所述凝集素1和所述凝集素2中的至少一者为不具有糖链的凝集素。

19.根据权利要求18所述的试剂盒，包含：

不溶性载体，

结合至所述不溶性载体的、不具有糖链的所述凝集素1，和

未结合至所述不溶性载体的凝集素2。

20.根据权利要求18或19所述的试剂盒，其中，所述凝集素1和所述凝集素2两者均为不具有糖链的凝集素。