KR20140086973A

KR20140086973A - 미분화 세포 검출 방법 및 복합 당질 검출 방법

Info

Publication number: KR20140086973A
Application number: KR1020147010277A
Authority: KR
Inventors: 히로아키 다테노; 준 히라바야시; 유주루 이토; 야스코 오누마; 마코토 아사시마; 아츠시 구노; 마사키 와라시나; 마사카즈 후쿠다
Original assignee: 내셔날 인스티튜트 오브 어드밴스드 인더스트리얼 사이언스 앤드 테크놀로지; 와코 쥰야꾸 고교 가부시키가이샤
Priority date: 2011-11-01
Filing date: 2012-10-31
Publication date: 2014-07-08
Also published as: KR101924673B1; JPWO2013065302A1; CN103987855B; WO2013065302A1; EP2774994B1; US9500650B2; JP6083649B2; CA2853464A1; CN103987855A; EP2774994A4; US20150204870A1; EP2774994A1; SG11201401956XA

Abstract

본 발명의 목적은 줄기 세포를 배양하고 있는 배양 상청을 이용하여, 세포의 분화 상태를 평가하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명에서, 「Fucα1-2Galβ1-3 GlcNAc」 또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 포함하고, 줄기 세포의 배양 상청을 이용하여 줄기 세포의 미분화 상태를 고감도로 판별할 수 있는 「미분화 당쇄 마커」를 제공할 수 있었다. 동시에 당해 「미분화 당쇄 마커」를 고감도로 인식할 수 있는 BC2LCN 렉틴 또는 그의 개변체가 세포의 미분화 상태를 배양 상청으로 판별할 수 있는, 우수한 「미분화 당쇄 마커 검출용 프로브」인 것을 발견하였다.

Description

미분화 세포 검출 방법 및 복합 당질 검출 방법{UNDIFFERENTIATED CELL DETECTION METHOD AND COMPLEX CARBOHYDRATE DETECTION METHOD}

본 발명은 세포 배양 상청을 이용하여 세포의 상태를 판별하는 방법에 관한 것이다. 특히, 미분화 세포의 존재, 비존재를 평가하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당단백질 등의 당쇄를 갖는 검출 대상 물질을 검출하는 방법에 관한 것이다.

다능성 줄기 세포는 몸을 구성하는 모든 세포로 분화할 수 있는 성질이나 그의 미분화성을 유지할 수 있는 성질에 의해 주목을 받고, 창약 스크리닝이나 질환메커니즘 해명에의 응용뿐만 아니라, 재생 의료의 재료로서 온 세계에서 연구가 진행되고 있다.

2010년에 세계 최초의 인간 ES 세포를 이용한 제1상 임상 시험이 미국에서 급성 척수 손상에 대하여 시작되고, 또한 망막 변성 질환에 대한 인간 ES 세포를 이용한 제1/2상 임상 시험의 임상 실험 허가 신청(IND)이 FDA에 의해 승인되고, 인간 다능성 줄기 세포를 이용한 재생 의료 연구는 비약적인 발전을 계속하고 있다.

특히, 일본에서 시작된 새로운 인간 다능성 줄기 세포인 iPS 세포는 수정배(受精胚)를 사용하지 않는 등의 이유에서 윤리적인 장벽이 낮고, 또한 자가 조직으로부터도 수립할 수 있다는 매우 큰 이점이 있으며, 재생 의료 현장에서도 큰 기대를 모으고 있다. 일본에서는 이화학 연구소 발생·재생 과학 종합 연구 센터나 선단 의료 센터 등이 가령 황반 변성증의 환자를 대상으로, iPS 세포를 사용한 임상 연구를 2013년도부터 개시하는 계획에 있고, 게이오 대학도 2015년에 척수 손상 환자에 대한 임상 연구를 시작할 방침이다.

이와 같이, ES 세포나 iPS 세포라는 인간 다능성 줄기 세포의 임상 응용이 개시되는 중에, 품질과 안전성을 확보하여 세포를 공급하는 체제에 대해서는 충분히 정비가 이루어져 있지 않다. 다능성 줄기 세포는 제작 방법, 배양 조건, 보존 조건 등이 미분화성, 분화능, 증식능 등의 품질에 영향을 준다. 이 때문에 적절한 방법에 기초하지 않고서 관리되면, 생산자나 사용자마다 다른 결과를 낼 가능성이 있다. 이것은 줄기 세포 치료의 신뢰성 저하, 치료에 의한 건강 피해의 발생 등의 폐해를 끼치는 원인이 된다. 그 때문에, 신뢰성이나 재현성이 높은 유지 배양법이나 계측·평가 시스템이 필요하다.

예를 들면, 세포 치료에는 다능성 줄기 세포를 그대로 이용하는 것이 아니고, 목적으로 하는 세포로 분화시키고 나서 이식에 이용하는데, 목적으로 하는 세포로 분화시킨 세포원에 미분화 세포가 혼입한 경우, 그 미분화 세포가 종양 형성의 원인이 되는 것이 지적되고 있다. 그래서 세포 치료에 이용하는 세포에 미분화 세포, 즉 종양 형성 세포가 혼입하고 있는지의 여부를 평가하는 기술의 개발이 요구되고 있다.

한편, 체성 줄기 세포의 종류나 특성은 ES 세포나 iPS 세포라는 인간 다능성 줄기 세포와 비교하여 다종 다양한데, 임상에의 적용이 기존 기술로서 존재한다. 그러나, 이식에 적합한 품질의 세포를 안정적으로 얻기가 용이하지 않기 때문에, 간엽계 줄기 세포의 품질 검증 방법의 확립과, 그에 기초를 둔 안정적인 배양 방법의 확립은 매우 중요한 과제로 되어 있다. 또한, 체성 줄기 세포를 이용한 세포 이식의 유효성 평가, 그의 메카니즘에 대한 이해 및 리스크 평가를 행하는 외에도, 이식 전 세포의 품질 검증 방법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 이전, 렉틴 마이크로어레이를 이용하여, 5 종류의 다른 체세포(피부, 태아 폐, 자궁 내막, 태반 동맥, 양막)로부터 제작한 인간 iPS 세포(114 검체)와 인간 ES 세포(9 검체)의 당쇄 프로파일을 망라하여 해석하였다.

그 결과, 원래의 체세포가 조직마다 다른 당쇄 프로파일을 가졌음에도 불구하고, 제작된 iPS 세포는 모두 거의 동일한 당쇄 프로파일을 나타내고, 초기화 유전자의 도입에 의해 한결같이 ES 세포와 유사한 당쇄 구조로 수속화하는 것을 발견하였다. 인간 ES·iPS 세포와 인간 체세포와의 렉틴 어레이 데이터를 상세히 해석한 결과에 의하면, 미분화된 인간 ES·iPS 세포로서는 체세포와 비교하여 α2-6 Sia, α1-2Fuc, 타입1 LacNAc의 발현량이 현저히 증가하고 있는 것이 추정되었다. 또한, DNA 어레이를 이용한 당 전이 효소 유전자의 발현 해석, 및 질량 분석계를 이용한 방법에 의해서, rBC2LCN이 미분화의 인간 ES·iPS 세포에만 결합하는 것을 발견하였다(비특허문헌 1).

상기 rBC2LCN은 그램 음성 세균(Burkholderia cenocepacia)에서 유래하는 BC2L-C 단백질의 N 말단 도메인에 대응한 BC2LCN 렉틴(YP_002232818)을 형질 전환대장균으로 발현시킨 재조합체이고, 복합 당쇄의 비환원 말단의 「Fucα1-2Galβ 1-3GlcNAc」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 인식하는 렉틴이다(비특허문헌 1, 3).

본 발명자들은, 상술한 렉틴 어레이를 이용한 실험에 있어서, rBC2LCN이 미분화의 인간 ES·iPS 세포와 반응하지만, 분화한 체세포(피부, 태아 폐, 자궁 내막, 태반 동맥, 양막)와는 전혀 반응하지 않는 것을 발견하였다. rBC2LCN은 「α1-2Fuc」, 「타입1 LacNAc」 및 「α2-6Sia」중 2개(α1-2Fuc, 타입1 LacNAc)를 갖는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(=H타입1구조)」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(=H타입3구조)」의 당쇄 구조와 특이적으로 반응하고 있다고 해석된다. 이들 2개의 당쇄 구조는 인간 ES·iPS 세포에서 고발현하고 있고, 분화한 피부, 태아 폐, 자궁 내막, 태반 동맥, 양막의 세포에서는 거의 발현이 없는 당쇄이다.

이것은 rBC2LCN이 인식하는 당쇄 리간드는 미분화 세포의 특징인 신규 미분화 당쇄 마커임을 나타내는 것으로, 또한 rBC2LCN은 당해 미분화 당쇄 마커 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및/또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」(이하, 양자를 합하여 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」라 칭하기도 함)에 특이적인 프로브로서 사용할 수 있음을 보이고 있다.

그 후, 드루커(Drukker) 등의 팀도, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」를 인식하는 항체가 미분화 상태의 ES 세포 및 iPS 세포를 인식하는 것을 발견하였고(비특허문헌 2), 본 발명자들의 상기 지견이 뒷받침되었다.

다만, Drukker 등의 상기 항체는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(=H타입1구조)」에는 특이적으로 반응하지만, 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(=H타입3구조)」와는 반응하지 않는다. rBC2LCN과 비교하면, 미분화 세포 중 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」 또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc 함유 당쇄」를 검출할 수 없기 때문에, 본 발명자들의 rBC2LCN과 비교하면, 충분한 감도가 오르지 않는 결점이 있다.

일본 특허 공개 (평)9-301995호 WO2007/027495

Tateno H, Toyota M, Saito S, OnumaY, Ito Y, Hiemori K, Fukumura M, Matsushima A, Nakanishi M, Ohnuma K, Akutsu H, Umezawa A, Horimoto K, Hirabayashi J, Asashima M., J Biol Chem. 2011, 286(23): 20345-53. Tang C, Lee AS, Volkmer JP, SahooD, Nag D, Mosley AR, Inlay MA, Ardehali R, Chavez SL, Pera RR, Behr B, Wu JC, Weissman IL, Drukker M., Nat Biotechnol. 2011, 29(9): 829-34. Sulak O, Cioci G, Delia M, Lahmann M, Varrot A, Imberty A, Wimmerova M., Structure. 2010, 18(1): 59-72. Suemori H., Yasuchika K., HasegawaK., Fujioka T., Tsuneyoshi N., Nakatsuji N. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2006, 345, 926-932. Draper JS, Pigott C, Thomson JA, Andrews PW. J Anat. 2000, 200, 249-58. Iijima et al. Chem. Bio. Chem. 2009, 10, 999-1006 Tateno, H., Nakamura-Tsuruta, S., and Hirabayashi, J. Nat. Protoc. 2007, 2, 2529-2537 Nielsen, J. S., and McNagny, K. M.J Am Soc Nephrol, 2009, 20, 1669-1676.

현재 세포의 품질을 검사하는 경우에는, 세포의 유전자 발현, 에피 게놈 상태, 세포 표면 마커 등의 차이를 서열분석기, 마이크로어레이, 유세포 분석기, 면역조직 과학 등으로 분석하는 것이 일반적이다. 그러나, 이들 방법에서는 세포 그 자체를 분석에 이용할 필요가 있기 때문에, 세포를 회수하는 번잡한 공정이 필요할 뿐만 아니라, 세포 치료에 이용하기 위한 귀중한 세포를 검사에서 사용해버린다는 큰 문제점이 있다.

또한, 상술한 바와 같이, 본 발명자들에 의하여 미분화 세포와 분화 세포를 식별하는 미분화 당쇄 마커가 되는 당쇄 구조 자신은 확정할 수 있었다. 그러나, Drukker 등의 방법뿐만 아니라, 본 발명자들의 이전의 rBC2LCN을 이용하는 기술은 세포 표면의 당단백질 또는 당지질 등이 갖는 당쇄를 관찰하는 점에서는 종래 기술의 범주를 벗어나지 않는 것이다. 즉, 이들 기술은 피검 세포를 회수하는 공정, 또는 정제 공정을 추가로 요구하는 점도 동일하고, 검출 평가 공정에서 공정의 번잡함, 유효 세포의 낭비라는 종래부터의 문제점을 해결할만한 것이 아니었다.

따라서, 본 발명은 피검 세포를 감하는 일 없이, 비침습적으로 세포의 상태를 조사하는 방법을 제공하는 것을 주된 목적으로 한다.

본 발명자들은 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」에 특이적인 프로브로서 rBC2LCN을 슬라이드 글라스 상에 고정화한 기판을 제작하고, 당해 기판을 이용하여 ES 세포 및 iPS 줄기 세포의 분화 상태를 평가할 때에, 세포 자신(파쇄물)을 대신하여, 배양 상청과의 반응성도 동시에 평가 검토하여 보았다.

그 결과, 놀랍게도 기판 상의 rBC2LCN은 피검 세포 배지로부터 채취해 온 1 방울의 배양 상청(1μL 상당)을 아무런 정제 공정도 실시하지 않은 상태대로 기판 표면의 렉틴 상에 공급하는 것만으로, 분화 상태를 평가할 수 있는 것을 발견하였다. 구체적으로는, rBC2LCN은 컨트롤 배지나 레티노산 존재 하에서 배양하여 분화시킨 iPS 세포의 배양 상청과는 반응하지 않는 데 대하여, 레티노산 비존재 하에서 미분화 상태를 유지한 iPS 세포의 배양 상청과는 특이적으로 반응하였다.

이상의 결과로 보아, 상기 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」의 당쇄 구조를 갖는 미분화 당쇄 마커가 미분화 세포의 배양 상청에는 항상 분비되어 있는 데 대하여, 분화 유도에 의해 분화가 진행함에 따라서 감소하여, 완전히 분화하면 당해 미분화 당쇄 마커는 소실된다는 것을 나타내는 것이다.

이것은, 본원 발명에서 처음으로 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」 당쇄가 배양 상청 중에서 관찰 가능한 미분화 당쇄 마커로서 기능하는 것을 발견했을 뿐만 아니라, 본 발명에 의해 처음으로 배양 상청 중에서 관찰 가능한 미분화 당쇄 마커가 제공된다는 것에 상당한다. 또한, 본 발명자들이 아는 한, 배양 하에서 미분화 상태를 유지한 ES 세포 및 iPS 줄기 세포의 세포 표면의 당단백질 또는 당지질 등이 배양액 내에 검출 가능한 상태로 용출할 수 있는 것을 나타내는 지견은 지금까지 존재하지 않는다.

즉, ES 세포, iPS 세포 등 미분화 세포를 분화 유도할 때의 분화 상태를 평가하는 경우, 또는 이들 미분화 세포를 미분화 상태를 유지한 채로 보존할 때의 보존 상태의 평가를 위해서는, 이들 미분화 세포의 배양 상청을 채취하여, 배양 상청중의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」의 존재·비존재를, 당해 당쇄 구조 특이적인 렉틴 및 항체 등에 의해 평가하는 것이 가능한 것을 나타내는 것이다. 배양 상청을 이용하는 당해 방법은 표적이 되는 피검 세포 자신을 회수하는 공정도, 특정한 표적 분자를 정제하는 공정도 불필요한, 매우 간편한 기술이라고 말할 수 있다. 특히, 「BC2LCN 렉틴」은 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 및 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 어느 쪽의 당쇄 구조도 고감도로 인식하는 특성을 갖기 때문에, 당해 렉틴을 이용함으로써 더욱 확실한 미분화 상태의 평가 시스템을 제공할 수 있다.

이상의 지견을 얻은 것으로 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

〔1〕줄기 세포의 배양 상청 중 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 미분화 당쇄 마커의 존재 유무 또는 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 줄기 세포의 분화 상태를 판별하는 방법.

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타냄)

이 방법에 따르면, 세포 그 자체가 아니고, 세포를 배양하고 있는 배양 상청을 이용하여, 세포의 분화 상태를 평가할 수 있다.

〔2〕상기 미분화 당쇄 마커의 유무 또는 존재량을, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕에 기재된 방법.

〔3〕상기 단백질이 하기의 단백질인 상기 〔2〕에 기재된 방법.

서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질

〔4〕상기 줄기 세포의 배양 상청이 당해 줄기 세포에 대하여 분화 유도 처리를 실시한 후의 배양 상청인 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 한 항에 기재된 방법.

〔5〕포도칼릭신에서 유래되는 상기 화학식 1 또는/및 화학식 2로 표시되는 상기 미분화 당쇄 마커의 존재 유무 또는 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 한 항에 기재된 방법.

〔6〕상기 미분화 당쇄 마커를, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하고, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 당쇄를 갖지 않는 단백질을 이용한 렉틴렉틴 샌드위치법에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는, 상기 〔1〕 내지 〔5〕에 기재된 방법.

〔7〕분화 유도 처리를 실시한 줄기 세포의 배양 상청 중 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 미분화 당쇄 마커가 존재하지 않는 것을 확인하여 채취하는 것을 특징으로 하는, 미분화 세포가 혼입하지 않은 분화 세포의 취득 방법.

[화학식 1]

[화학식 2]

〔8〕상기 미분화 당쇄 마커가 존재하지 않는 것의 확인을, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질을 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는, 상기〔7〕에 기재된 방법.

〔9〕줄기 세포의 분화 상태를 판별하는 방법에 이용하기 위한 키트로서, 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.

[화학식 1]

[화학식 2]

〔10〕상기 단백질이 하기의 단백질인 상기 〔9〕에 기재된 키트.

서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하여, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질

본 발명에 따른 줄기 세포의 분화 상태를 판별하는 방법에 따르면, 피검 세포의 배양 상청을 직접 렉틴 등의 미분화 당쇄 마커 특이적인 단백질과 반응시킴으로써, 세포를 파괴하는 일 없이, 비침습적으로 세포의 상태를 평가할 수 있다. 따라서, 본 발명은 특히 미분화 세포의 상태를 간편하고, 또한 효율적으로 판별하는 데에 사용할 수 있기 때문에, 재생 의료나 생물 제제(biologics) 등에의 응용을 기대할 수 있다.

도 1은 렉틴렉틴 샌드위치법의 구체적 절차의 일례를 설명하기 위한 도면이다.
도 2는 미분화 ES 세포(KhES1주)를 Cy3 라벨한 rBC2LCN 및 Tra1-60으로 염색한 사진이다(실시예 1). 네가티브 컨트롤로서는 Cy3 라벨한 BSA를 반응시켰다. 세포의 존재를 확인하기 위해서, DAPI로의 핵염색을 각각 행하였다.
도 3은 미분화 ES 세포(KhES1주) 및 분화 유도 처리(레티노산 처리)한 ES 세포를 Cy3 라벨한 rBC2LCN 및 Tra1-60으로 염색한 사진이다(실시예 2). 세포의 존재를 확인하기 위해서, DAPI로의 핵염색을 각각 행하였다.
도 4는 분화 유도 처리(레티노산 처리)한 iPS 세포(201B7주, 253G1주) 배양 상청과, 처리를 하지 않은 미분화 상태의 iPS 세포(201B7주, 253G1주, TIGMKOS #19주)배양 상청과의 rBC2LCN에 대한 반응성의 비교 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 3). 또한, 컨트롤로서 배지만의 경우를 측정.
도 5는 미분화 당쇄 마커를 렉틴렉틴 샌드위치법에 의해 검출한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 4).
도 6은 미분화 당쇄 마커를 렉틴렉틴 샌드위치법에 의해 검출하기 위한 검출용 렉틴(오버레이 렉틴)을 스크리닝한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 5).
도 7은 미분화 당쇄 마커를 렉틴렉틴 샌드위치법에 의해 검출한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 6).
도 8은 렉틴렉틴 샌드위치법에서의 미분화 세포수의 검량선을 나타내는 그래프이다(실시예 7).
도 9는 렉틴렉틴 샌드위치법에서의 미분화 세포수의 검량선을 나타내는 그래프이다(실시예 7).
도 10은 렉틴렉틴 샌드위치법에서의 미분화 세포수의 검량선을 나타내는 그래프이다(실시예 7).
도 11은 렉틴렉틴 샌드위치법에서의 미분화 세포수의 검량선을 나타내는 그래프이다(실시예 7).
도 12는 미분화 당쇄 마커를 동정한 결과를 나타내는 사진이다(실시예 8).
도 13은 rBC2LCN이 인식하는 당쇄 구조를 해석한 결과를 나타내는 그래프이다(실시예 9).

A. 줄기 세포의 분화 상태 판별 방법 등

1. 본 발명의 배양 상청으로 측정 가능한 미분화 당쇄 마커

본 발명의 배양 상청으로 검출 가능한 미분화 당쇄 마커(이하, 단순히 「미분화 당쇄 마커」라고도 함)는 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」, 즉 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H타입1당쇄)」 또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H타입3당쇄)」의 당쇄 구조를 갖고, 인간 ES·iPS 세포의 세포 표면에 현저히 발현하고 있는, 당단백질 및 당지질 등의 복합 당질이다. 또한, 후술하는 실시예 8에서는, 이 복합 당질의 하나로서 포도칼릭신(podocalyxin)이 동정되어 있다. 포도칼릭신의 당쇄 구조에는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H타입3당쇄)」가 포함되어 있는 것으로 예상되었다.

본 발명에서는, 이들 2종의 당쇄가 ES 세포, iPS 세포 등 미분화 상태의 세포에서는 배양 상청 중에 항상 분비되어 있지만, 분화한 체세포에서는 배양 상청 중에의 분비가 없는 것, 즉 이들 당쇄 리간드가 미분화 상태인 경우에서만 세포 상청 중에 분비되는 것을 처음으로 발견한 점에 특징을 갖는 발명이고, 이들 당쇄 리간드는 「세포 상청 중에서 측정 가능한 미분화 당쇄 마커」로서 유용하다.

「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」의 당쇄 구조는 GlcNAc의 4위치의 수산기는 단당(바람직하게는 푸코스) 또는 분지한 또는 분지하지 않은 올리고당쇄(바람직하게는 2 내지 5의 당을 포함하는 당쇄)로 치환되어 있을 수도 있다. 또한, 당해 당쇄 구조는 미분화 세포의 줄기 세포 표면에서는, 막 구성 성분으로서 GlcNAc의 1위치에서 당단백질, 당지질 또는 당류 등의 비환원 말단에 결합하고 있는 당쇄이기 때문에, 미분화 상태의 줄기 세포의 배양 상청 중에 분비되어 있는 당쇄 구조로서도 GlcNAc의 1위치에서 OH기, 또는 다른 당류, 단백질 또는 지질, 또는 그 밖의 분자의 비환원 말단이 결합하고 있다. 즉, 하기 화학식 1로서 표시할 수 있다.

[화학식 1]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄, 예를 들면 4αFuc기를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 그 밖의 분자를 나타냄)

마찬가지로, 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조는 GalNAc의 1위치의 수산기는 분지한 또는 분지하지 않은 올리고당쇄(바람직하게는 2 내지 5의 당을 포함하는 당쇄)로 치환되어 있을 수도 있다. 또한, 당해 당쇄 구조는 미분화 세포의 줄기 세포 표면에서는, 막 구성 성분으로서 GalNAc의 1위치에서 당단백질, 당지질 또는 당류 등의 비환원 말단에 결합하고 있는 당쇄이기 때문에, 미분화 상태의 줄기 세포의 배양 상청 중에 분비되어 있는 당쇄 구조로서도 GalNAc의 1위치에서 OH기, 또는 다른 당류, 단백질 또는 지질, 또는 그 밖의 분자의 비환원 말단이 결합하고 있다. 즉, 하기 화학식 2로서 표시할 수 있다.

[화학식 2]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄, 예를 들면 Galβ1-4Glc기를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 그 밖의 분자를 나타냄)

2. 본 발명의 「미분화 당쇄 마커」의 검출용 프로브

본 발명의 배양 상청 중 미분화 당쇄 마커의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(화학식 1)」 또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(화학식 2)」의 검출용 프로브로서는 일반적으로 단백질 프로브가 이용되고, 당해 미분화 당쇄 마커와 특이적으로 결합하는 단백질이면 어떠한 것이라도 사용할 수 있다. 전형적으로는, 본 발명자들이 발견한 상기 화학식 1 및 화학식 2의 양쪽 당쇄 구조를 인식하는 렉틴인 BC2LCN 또는 그의 개변체가 바람직하게 이용되지만, 화학식 1 또는 화학식 2 중 어느 쪽을 인식하는 렉틴으로서도 사용할 수 있다.

또한, 렉틴뿐만 아니라 미분화 당쇄 마커를 인식할 수 있는 항체 또는 그의 프래그먼트, 또는 TCR 또는 그의 프래그먼트 등 다른 단백질이면 사용할 수 있다. 구체적으로는, Drukker 등의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H타입1당쇄)」항체(비특허문헌 2) 등을 예시할 수 있다.

후술하겠지만, 본 발명의 「미분화 당쇄 마커」의 검출용 프로브를 고정화한 기판과 함께, 당해 기판 표면과 줄기 세포의 배양 상청을 접촉시키는 수단, 및 기판에 고정화한 상기 검출용 프로브 또는 배양 상청을 표지화하는 수단을 세트로 함으로써 줄기 세포의 분화 상태 판별용 키트로 할 수 있다. 특히, 「미분화 당쇄 마커」로서, BC2LCN 또는 그의 개변체를 이용한 경우에는 매우 고감도로 줄기 세포의 분화 상태를 판정할 수 있는 키트가 된다.

여기서, 「기판」이라 할 때, 슬라이드 글라스 등 평탄한 형상의 것에는 한정되지 않고, ELISA 플레이트, 자기 비드, 필터 등, 통상의 단백질 고정화법을 적용할 수 있는 임의의 형상, 재질의 기재가 포함된다. 「기판 재료」로서, 바람직하게는 통상의 마이크로어레이로 사용되는 물질이고, 실리콘 웨이퍼, 유리, 폴리카보네이트, 막, 폴리스티렌 또는 폴리우레탄과 같은 고분자 필름 및 다공성 물질이 이용된다.

3. rBC2LCN에 대해서

상기 2에서 기술한 바와 같이, 본 발명에서 미분화 당쇄 마커(H타입1당쇄 및/또는 H타입3당쇄), 즉, 화학식 1 또는 화학식 2의 당쇄 구조를 검출하기 위한 프로브로서는 이들 당쇄 구조에 결합 특이성을 나타내는 단백질은 전부 사용 가능한데, 이들 단백질 중에서 가장 바람직한 렉틴은 본 발명자들이 이전에 발견한 「rBC2LCN」이기 때문에, 이하 「rBC2LCN」에 대하여 설명한다.

본 발명에서 「rBC2LCN」이라 할 때, 그램 음성 세균(Burkholderia cenocepacia)에서 발견된 렉틴을 대장균으로 발현시킨 재조합체의 것을 가리키지만, 이 렉틴은 BC2L-C라고 불리는 단백질의 N말단 도메인(GenBank/NCBI-GI 등록 번호: YP_002232818)에 상당한다(비특허문헌 3). rBC2LCN은 TNF 유사 단백질에 구조유사성을 나타내고, 3량체를 형성하는 것이 알려져 있다. 당쇄 어레이를 이용한 해석으로부터, 이 렉틴은 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc(H타입1당쇄)」, 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H타입3당쇄)」와 함께, H타입1 또는 H타입3당쇄를 함유하는 당쇄 구조인, 「Lewis b 당쇄 (Fucα1-2Galβ1-3(Fucα1-4)GlcNAc)」, 「Globo H 당쇄(Fucα1-2Galβ1-3GalNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc)」에 대해서도 결합 특이성을 나타내는 것이 분명해졌다.

rBC2LCN은, 당쇄를 포함하지 않기 때문에, 형질 전환 세균에 의해서도 대량 생산 가능하다. 구체적으로는, GenBank/NCBI-GI 등록 번호: YP_002232818(Genome ID:206562055)의 아미노산 서열(서열 번호 1)을 코딩하는 BC2LCN 유전자를 이용하여, 적당 숙주에 대하여 최적화한 후, 형질 전환한 대장균으로부터 발현시켜, 통상의 단백질 정제 수단에 의해 정제할 수 있다.

그때, BC2LCN으로서는 서열 번호 1에 대응하는 전장은 필요로 하지 않고, 또한 서열 번호 1에서 부분적으로 일부의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 부가되어 있는 경우에도, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」, 즉, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 특성을 유지할 수도 있다.

구체적으로는, 본 발명의 BC2LCN 또는 그의 개변체는, 예를 들면 이하와 같이 표현할 수 있다.

「서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고,「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc」 또는 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc」의 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질. 」

또한, 상기 화학식 1 및 화학식 2를 이용하여 당쇄 구조를 나타내면, 「서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질. 」이라 표현할 수 있다.

또한, 여기서, 수개란 20개 이하, 바람직하게는 10개 이하, 보다 바람직하게는 5개 이하의 자연수를 나타낸다.

4. 본 발명의 「미분화 당쇄 마커」의 검출, 측정

(1) 배양 상청의 채취 방법

본 발명에서는 미분화 상태의 줄기 세포 또는 분화 유도 후 세포의 배양 상청을 마이크로 피펫 등으로 일정량 채취하여, 본 발명의 미분화 당쇄 마커에 특이적으로 결합하는 단백질과의 반응성을 해석한다. 배양액은 일반적으로 일정 기간(약 1일)마다 신선한 배양액과 교환한다. 이 때문에, 미분화 당쇄 마커의 검출은 미분화 당쇄 마커가 미분화 세포 또는 분화가 불충분한 세포로부터 교환 후의 배양액 내에 검출 가능한 양 분비된 후에 행한다. 배양액 교환 후, 배양액 내에 검출 가능한 양의 미분화 당쇄 마커가 용출될 때까지 요하는 시간은 세포의 종류나 배양 조건에 따라 다르게 얻는다. 따라서, 배양액 교환 후, 미분화 당쇄 마커의 검출에 이용하는 배양 상청을 채취하기까지의 시간은 세포의 종류나 배양 조건에 따라서 적절히 설정될 수 있지만, 예를 들면 18 내지 30시간 정도라고 된다. 통상은 24시간 정도마다 배지 교환을 행하기 때문에, 그때에 폐기하는 배양 상청을 이용하는 것이 바람직하다.

이러한 해석 방법에 따르면, 미분화 상태의 줄기 세포를 분화 유도했을 때에, 세포 상청 중에서 상기 미분화 당쇄 마커가 검출되지 않게 된 (백그라운드값과 같은 레벨이 됨) 웰, 샬레 또는 플라스크 내의 세포 중에는 벌써 미분화 세포가 혼입하지 않은 분화 세포만으로 이루어지는 세포군이라고 평가할 수 있으므로, 웰, 샬레 또는 플라스크 단위로 미분화 세포가 혼입할 우려가 없는 분화 세포를 대량, 또한 신속히 취득할 수 있다.

여기서, 줄기 세포를 신경 세포, 소화기계 세포 등으로 「분화 유도」하는 방법으로서는 어떠한 방법이어도 좋고, 예를 들면 줄기 세포를 레티노산 존재 하에서 배양하여 신경계 세포로 분화하는 방법, 증식을 정지시킨 NIH3T3 세포 표면을 토대로서 표피 세포를 형성시키는 방법 등 여러 가지 공지된 방법을 적용할 수 있다. 본 발명의 미분화 당쇄 마커의 분화한 세포 표면에서의 발현량은 무시할 수 있을 정도이기 때문에, 어떤 분화 유도 조건 하에서도 노이즈가 매우 적은 것이 예상된다.

또한, 미분화 상태를 유지해 두고 싶은 줄기 세포의 품질 관리를 위해서는 정기적으로, 또는 필요에 따라서 배양 상청을 채취하여, 또는 배지 교환 시에 폐기하는 배양 상청을 이용하여, 본 발명의 미분화 당쇄 마커량을 측정하면, 보존 중의 모든 세포가 미분화 상태로 유지되어 있는지의 여부를 확인할 수 있다. 예를 들면, 전형적인 줄기 세포의 미분화 상태 유지 배양 방법으로서, 마우스 섬유 아세포 등의 피더 세포 표면에서 배양하는 방법이 있지만, 적어도 1일 1회는 배양 상청을 제거하여 신선한 배지와 교환한다. 이를 제거하여 폐기하는 배양 상청을 이용하여 분화/미분화 판정을 행할 수 있다.

여기서, 배양 상청을 일정량 채취하는 수단으로서는 수작업일 수도 있지만, 자동 배양 장치 등에 의해 자동적으로 기계적으로 채취하는 것이 확실하고, 특히 분화 유도 후에 미분화 세포의 혼입이 없는 분화한 세포군만을 가능한 한 빠르게 얻고자 하는 경우에는, 일정 시간 간격으로 채취하여 해석함으로써, 확실하게 분화한 세포군만을 빠르게 취득할 수 있다.

(2) 본 발명의 「미분화 당쇄 마커」의 해석 방법

본 발명의 미분화 당쇄 마커와 특이적으로 결합하는 단백질인 렉틴이나 항체 등을 표지화하여, 배양 상청 중에 직접 첨가하여 표지의 강도를 계측할 수도 있지만, 바람직하게는 렉틴이나 항체 등을 기판 상에 고정화하여, 배양 상청을 「Cy3-NHS ester」(GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 등으로 형광 표지하고, ELISA법이나 소멸파 여기 형광형 스캐너를 이용하는 방법 등에 의해 검출, 측정한다.

줄기 세포의 배양액으로부터 채취한 배양 상청은, 정제 공정을 거치지않고 그대로 또는 희석하여 또는 미리 항체나 렉틴 등으로 농축하여 검출 공정에 제공한다. 본 발명자들이 이전에 개발한 기판 상에 고정화한 렉틴 표면에 접촉시키고, 소멸파 여기 형광형 스캐너를 이용하는 방법 외에, 공초점형 스캐너, 형광 플레이트 리더 등을 이용하여 검출할 수 있다. 고정화된 항체도 동일한 방법을 적용할 수 있다.

그러나, 당해 방법에 한정되는 일은 없고, ELISA, 표면 플라즈몬 공명 센서, 평형 투석법, 적정 열량 측정법, 수정 발진자 센서 검출법 등의 방법에 의해서도 결합 활성을 측정할 수 있다. 또한, 통상의 경합법이나, 후술하는 「렉틴-렉틴 샌드위치법」에 의해서도, 본 발명에 따른 미분화 당쇄 마커의 측정을 할 수 있다. 「렉틴-렉틴 샌드위치법」을 이용한 경우에는 배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커를 정량적으로 측정할 수 있기 때문에, 보다 정밀도 좋게 분화의 완료(미분화 세포가 없어진 점)를 판정할 수 있다.

분화 유도 후의 배양 상청에 대하여, 상기 해석을 실시하고, 미분화 세포가 혼입하지 않은 것을 확인한 후, 당해 웰, 샬레 또는 플라스크 내의 세포를 분수(分收)함으로써, 분화 세포를 취득할 수 있다. 반대로, 미분화 유지 상태로 유지한 상태의 줄기 세포 보존 방법에 있어서, 배지 교환시의 폐기용 배양 상청에 대하여 상기 해석 방법을 적용함으로써 줄기 세포의 품질 유지 상태를 확인할 수 있다.

(3) 본 발명의 「미분화 당쇄 마커」의 해석에 의한, 줄기 세포의 분화 상태 판별용 키트 또는 장치

본 발명의 미분화 당쇄 마커의 검출용 프로브, 바람직하게는 BC2LCN 또는 그의 개변체를, 하기 (1) 내지 (3)의 수단과 함께 키트 또는 장치라고 하면, 미분화 당쇄 마커의 해석 가능한 키트, 또는 장치가 되므로, 줄기 세포의 분화 상태 판별용 키트 또는 장치로 할 수 있다. 또한, 본 발명의 미분화 당쇄 마커의 검출용 프로브는 기판 표면에 고정화하여 이용하는 것이 바람직하다.

(1) 줄기 세포의 배양 상청과 접촉시키는 수단; 다만, 당해 수단은 수작업이라도 가능하기 때문에 필수가 아니다.

(2) 검출용 프로브 또는 배양 상청을 형광 표지하기 위한 형광 표지; 여기서, 「배양 상청을 형광 표지한다」라고 할 때, 배양 상청 중에서의 검출 대상인 본 발명의 미분화 당쇄 마커 즉, 「화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조 또는 당해 당쇄 구조 함유 물질」을 형광 표지할 수 있는 형광 물질(예를 들면, 「Cy3-NHS ester」)을 의미한다.

(3) 형광 표지를 검출하기 위한 수단 또는 장치.

본 발명의 미분화 당쇄 마커의 검출용 프로브를 고정화한 기판과 함께, 기판 표면에 고정화한 단백질 또는 배양 상청을 표지화하는 수단을 세트로 함으로써 줄기 세포의 분화 상태 판별용 키트로 할 수 있다. 바람직하게는, 당해 기판 표면에 줄기 세포의 배양 상청을 접촉시키는 수단 또는 장치를 세트로 할 수도 있고, 또한 형광 표지를 검출하기 위한 수단 또는 장치를 세트로 할 수도 있다. 특히, 미분화 당쇄 마커로서, BC2LCN 또는 그의 개변체를 이용한 경우에는 매우 고감도로 줄기 세포의 분화 상태를 판정할 수 있는 키트가 된다.

(4) rBC2LCN을 이용한 미분화 당쇄 마커의 측정 절차

이하, 본 발명의 전형적인 렉틴인 rBC2LCN을 이용한 경우에 대하여 주로 기술하는데, 본 발명은 rBC2LCN에만 한정되지 않는 것은 상기와 같다.

(가) rBC2LCN을 슬라이드 글라스 상에 고정화한 기판에 대하여 「Cy3-NHS ester」 등으로 라벨화한 배양 상청을 직접 반응시켜, 소멸파 여기 형광 검출계에서 그의 결합을 측정한다. 이 경우, 배양 상청은 미리 물리적 또는 화학적으로 농축하고 나서 해석에 이용하는 경우도 있다.

(나) 또한, rBC2LCN을 ELISA 플레이트, 자기 비드, 필터 등의 기판에 고정화한 것에 대하여 미리 효소, 형광, 비오틴 등으로 라벨화한 배양 상청을 반응시켜, 그의 결합을 발색, 발광, 형광 등으로 검출하는 것도 가능하다. 또는, 배양 상청 반응 후, rBC2LCN에 결합하고 있는 단백질에 결합하는 라벨화한 항체나 렉틴을, 위와 같이 반응시킬 수도 있다. 특히, rBC2LCN에 결합하고 있는 단백질에 결합하는 렉틴을 이용한 「렉틴렉틴 샌드위치법」(상세하게는 후술)을 이용함으로써 보다 고감도인 측정이 가능해진다.

(다) 본 발명의 내미분화 당쇄 마커에 대한 항체나 렉틴을 고정화한 것에 배양 상청을 반응시켜, 미리 효소, 비오틴, 형광 등으로 라벨화한 rBC2LCN을 반응시키는 것도 가능하다. rBC2LCN은 통상의 방법에 의해 형광이나 효소, 비오틴 등으로 라벨화하여, 형광 염색, 유세포 분석기, ELISA, 렉틴 블로팅 등의 공지된 방법으로 검출한다. rBC2LCN을 라벨화할 때에, 아미노산 서열 중 임의의 부위에 형광 표지 아미노산을 도입하는 공지된 호사카 등의 방법(비특허문헌 6 참조) 또는 일반적인 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)법이나 퍼킨 엘머사의 화학 증폭형 발광 프록시미티 동종 어세이법(http://www.perkinelmer.co.jp/products_ ls/assays/assays_ 0010.html)을 이용하면, rBC2LCN의 당쇄 결합 도메인의 특정한 부위에 형광 표지 아미노산을 도입한 변이체를 제작할 수 있으므로, 당해 rBC2LCN 변이체를 세포의 배양 상청과 혼합하는 것만으로 세포의 분화도를 평가할 수 있다.

(라) rBC2LCN의 경우에는 매우 감도가 좋으므로, rBC2LCN을 고정한 기판에 대하여 배양 상청을 반응시키는 경우, 본 발명의 미분화 당쇄 마커 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」양은 피코몰(pM) 또는 나노몰(nM) 레벨이라도 존재, 비존재를 판별 가능하기 때문에, 분화 유도 중의 배양액의 배양 상청 1부의 0.1 내지 10μl 정도를 채취하여 측정하는 것도 가능하다. 일반적으로는, 정기적(예를 들면, 1일마다)으로 행하는 배지 교환 시에, 폐기하는 배양 상청을 이용하여 측정하는 것이 바람직하다.

(마) 분화 유도를 실시한 세포의 분화 정도를 판정할 때의 컨트롤로서는, 통상 동일 조성의 배지만의 측정치를 이용하는데, 정확하게 정량하는 경우에는, 분화 유도를 실시하지 않은 세포의 배양 상청에서의 값을 컨트롤로서 이용하는 것이 바람직하다.

5. 대상이 되는 피검 세포에 대해서

본 명세서에 있어서, 대상이 되는 피검 세포는 미분화 상태에 있는 「줄기 세포」, 또는 당해 세포를 분화 유도하여 여러 가지 조직 특이적으로 분화한 세포이다. 그때의 「줄기 세포」란, 미분화 상태에 있는 세포를 넓게 의미하고, 예를 들면 다능성 줄기 세포(배성 줄기 세포: ES 세포), 조혈 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 피부 조직 줄기 세포 등의 여러 가지 체성 줄기 세포 외에, 체세포에 줄기 세포 특이적 발현 유전자 등을 도입하여 탈분화시킨 줄기 세포(iPS 세포)도 포함된다. 또한, ES 세포를 비롯한 줄기 세포는 인간에게 한하지 않고, 포유동물에서는 상당한 부분에서 공통된 조직으로 제어된다고 생각되기 때문에, 본 발명의 줄기 세포로서는 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 원숭이, 돼지, 소, 염소, 양, 마우스, 래트 유래의 줄기 세포를 이용하는 경우에도 적용할 수 있다.

B. 당쇄를 갖는 검출 대상 물질의 검출 방법

[개요]

다음으로, 본 발명에 따른 당쇄를 갖는 검출 대상 물질의 검출 방법에 대하여 설명한다.

질환에의 이환 또는 질환의 진전 등에 따라 생체 시료 중에 검출되는 단백질을 질환 마커로서 이용하는 시도가 이루어져 오고 있다. 혈액, 뇨 및 타액 등의 생체 시료 중에 출현하는 질환 마커를 검출함으로써 이환 유무 또는 진전의 정도 등을 비침습적으로 판정할 수 있고, 질환의 조기 진단, 치료 효과의 평가 및 예후의 진단 등에 유용할 수 있다. 지금까지, 여러 가지 암에서, 뮤신 등의 당단백질이 특이적으로 검출되는 것이 보고되어 있다. 또한, 암의 종류에 따라서 특정한 당단백질의 당쇄 구조가 변화하는 것도 보고되어 있다.

종래, 당단백질을 포함하는 단백질을 특이적으로 검출하기 위한 방법으로서, 단백질을 2종의 항체를 이용하여 사이에 끼워 검출하는 「항체-항체 샌드위치법」이 알려져 있다. 항체-항체 샌드위치법에서는 우선, 목적 단백질에 결합하는 제1 항체(포착용 항체)를 이용하여 시료 중에서 목적 단백질을 특이적으로 분리한다. 다음으로, 「포착용 항체-목적 단백질」의 복합체에, 목적 단백질에 결합하는 제2 항체(검출용 항체)를 접촉시켜, 「포착용 항체-목적 단백질-검출용 항체」의 복합체를 형성시킨다. 검출용 항체에는 형광 등으로 표지된 항체가 이용되고, 형광 등의 검출에 의하여 시료 중의 상기 복합체를 검출함으로써 목적 단백질의 검출이 행하여진다. 항체-항체 샌드위치법에서는 동일 항원에 대한 2종의 항체를 이용함으로써 목적 단백질을 특이성 높게, 또한 고감도로 검출하는 것이 가능하다.

일반적으로 당쇄는 항원성이 낮기 때문에, 특정한 당쇄 구조를 갖는 단백질에만 결합하는 항체를 얻기는 어렵다. 이 때문에, 항체-항체 샌드위치법에는 당단백질의 당쇄 검출계의 구축에는 알맞지 않다는 문제가 있다. 또한, 항체-항체 샌드위치법을 실시하기 위해서는 목적 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 얻을 필요가 있지만, 그를 위해서는 우선 목적 단백질의 정제물을 얻을 수 있어야 한다.

상기 과제를 해결하기 위해서, 본 발명은 이하에 기재하는, 당쇄를 갖는 검출 대상 물질을 검출하기 위한 방법(이하, 「렉틴-렉틴 샌드위치법」이라고도 칭함) 및 키트를 제공한다.

〔1〕당쇄를 갖는 검출 대상 물질과 상기 당쇄에 대하여 결합성을 갖는 렉틴 1 및 렉틴 2를 접촉시켜, 상기 렉틴 1과 상기 검출 대상 물질과 상기 렉틴 2로 구성되는 복합체를 형성시키고, 상기 복합체를 검출함으로써 행하는 상기 검출 대상 물질의 검출 방법으로서, 상기 렉틴 1 및 상기 렉틴 2의 적어도 한쪽은 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 검출 방법.

〔2〕상기 검출 대상 물질이 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸, 글리코펩타이드, 리포다당, 펩타이드글리칸 및 스테로이드 화합물에 당쇄가 결합한 배당체로 이루어지는 군에서 선택되는 복합 당질인 상기 〔1〕에 기재된 검출 방법.

〔3〕상기 렉틴 1과 상기 렉틴 2가 서로 다른 당쇄 구조에 대한 결합성을 갖는 것인 상기 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 검출 방법.

〔4〕상기 당쇄를 갖지 않는 렉틴이 원핵 세포로 발현한 조환형 렉틴, 또는 천연형 단백질의 당쇄 구조를 개변하여 얻은 개변형 렉틴인 상기 〔1〕 내지 〔3〕 중 어느 한 항에 기재한 검출 방법.

〔5〕상기 검출 대상 물질과, 불용성 담체에 결합한, 당쇄를 갖지 않는 상기 렉틴 1과, 불용성 담체에 결합하지 않은 상기 렉틴 2를 접촉시켜 상기 복합체를 형성시키고, 상기 복합체를 검출함으로써 행하는 상기 〔1〕 내지 〔4〕 중 어느 한 항에 기재한 검출 방법.

〔6〕상기 검출 대상 물질과, 불용성 담체에 결합한, 당쇄를 갖지 않는 상기 렉틴 1을 접촉시켜, 상기 렉틴 1과 상기 검출 대상 물질로 구성되는 복합체 1을 얻는 제1 절차와, 상기 복합체 1과 상기 렉틴 2를 접촉시켜, 상기 렉틴 1과 상기 검출 대상 물질과 상기 렉틴 2로 구성되는 복합체 2를 얻는 제2 절차를 포함하는 상기 〔5〕에 기재한 검출 방법.

〔7〕상기 렉틴 1과 상기 렉틴 2가 모두 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 상기 〔1〕 내지 〔6〕 중 어느 한 항에 기재한 검출 방법.

〔8〕당쇄를 갖는 검출 대상 물질의 검출에 이용되는 키트로서, 상기 당쇄에 대하여 결합성을 갖는 렉틴 1 및 렉틴 2를 포함하고, 상기 렉틴 1 및 상기 렉틴 2의 적어도 한쪽은 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 키트.

〔9〕불용성 담체와, 상기 불용성 담체에 결합한, 당쇄를 갖지 않는 상기 렉틴 1과, 상기 불용성 담체에 결합하지 않은 렉틴 2를 포함하는 상기 〔8〕에 기재한 키트.

〔10〕상기 렉틴 1과 상기 렉틴 2가 모두 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 상기 〔8〕 또는 〔9〕에 기재한 키트.

여기서, 본 발명에 따른 렉틴-렉틴 샌드위치법 등에서 이용하는 용어에 대하여 설명한다.

「당쇄」란, 단당이 글리코사이드 결합에 의해서, 쇄상(직쇄 또는 수상으로 분지한 분지쇄)으로 연결된 구조를 갖는 일군의 화합물을 의미한다. 당쇄를 구성하는 단당으로서는 글루코스, 갈락토스, 만노스 등의 헥소스; L-푸코스 등의 디옥시헥소스; N-아세틸글루코사민, N-아세틸갈락토사민 등의 헥소사민; N-아세틸뉴라민산, N-글리코릴뉴라민산 등의 시알산; 자일로오스, L-아라비노오스 등의 펜토스 등을 들 수 있다. 「당쇄」를 구성하는 단당의 수는 특별히 한정되지 않으며, 2 내지 수만 정도이다.

「렉틴」이란, 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸, 글리코펩타이드, 리포다당, 펩타이드글리칸 및 스테로이드 화합물 등의 배당체 등의 복합 당질에 결합한 당쇄의 부분 구조 또는 전체 구조를 인식하여, 결합하는 단백질을 의미한다.

[렉틴-렉틴 샌드위치법]

이하, 본 발명에 따른 렉틴-렉틴 샌드위치법에 대하여 설명한다. 렉틴-렉틴 샌드위치법은 「복합체 형성 절차」와 「검출 절차」를 포함한다. 「복합체 형성절차」는 당쇄를 갖는 검출 대상 물질과 상기 당쇄에 대하여 결합성을 갖는 렉틴 1 및 렉틴 2를 접촉시켜, 렉틴 1과 검출 대상 물질과 렉틴 2로 구성되는 복합체(「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체)를 형성시키는 절차이다. 또한, 「검출 절차」는 복합체 형성 절차로 형성한 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체를 검출함으로써, 검출 대상 물질의 검출을 행하는 절차이다.

본 발명에 따른 렉틴-렉틴 샌드위치법에 있어서, 「검출 대상 물질」은 당쇄를 갖는 물질(이하, 「복합 당질」이라고도 칭함)일 수도 있고, 구체적으로는 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸, 글리코펩타이드, 리포다당, 펩타이드글리칸 및 스테로이드 화합물 등에 당쇄가 결합한 배당체 등으로 된다.

또한, 본 발명에 따른 렉틴-렉틴 샌드위치법에 있어서, 검출 대상 물질을 포함할 수 있는 「시료」로서는, 예를 들면 혈액, 혈청, 혈장, 뇨, 타액, 림프, 수액, 흉수, 복수, 누액 등의 생체 유래 재료를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

[렉틴 1, 렉틴 2]

복합체 형성 절차에 이용하는 렉틴 1 및 렉틴 2는 모두 검출 대상 물질이 갖는 당쇄의 부분 구조 또는 전체 구조를 인식하고, 결합하는 것(결합성을 갖는 것)이다. 렉틴 1이 인식하는 당쇄 구조 및 렉틴 2가 인식하는 당쇄 구조는 동일할 수도 있지만, 서로 다른 것이 바람직하다. 다른 당쇄 구조에 결합하는 렉틴 1 및 렉틴 2를 이용함으로써 검출 대상 물질의 검출 특이성을 보다 높일 수 있다.

렉틴 1은 단일의 렉틴일 수도 있고, 또는 복수 종의 렉틴 혼합물일 수도 있다. 렉틴 2도 동일하다. 또한, 렉틴 1로서 복수 종의 렉틴 혼합물을 사용하는 경우, 혼합물 중에 포함되는 렉틴이 인식하는 당쇄 구조는 동일하거나 상이할 수도 있다. 렉틴 2에 대해서도 동일하다.

여기서, 원래 렉틴은 그 자신이 당쇄를 갖는 것인데, 본 절차에서는 렉틴 1 및 렉틴 2의 적어도 한쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용한다. 보다 바람직하게는, 렉틴 1과 렉틴 2의 양쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴이 이용된다.

본 발명자들의 검토 결과, 렉틴 1 및 렉틴 2로서 당쇄를 갖는 렉틴을 이용한 경우에는, 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체를 검출할 때에 백그라운드가 높아지고, 고감도인 검출을 할 수 없는 것이 분명해졌다. 백그라운드의 상승 요인으로서, 본 발명자들은 렉틴 1 및 렉틴 2로서 당쇄를 갖는 렉틴을 이용한 경우에, 렉틴 1끼리 서로의 당쇄에 결합하여 이루어지는 복합체, 렉틴 2끼리 서로의 당쇄에 결합하여 이루어지는 복합체, 또는 렉틴 1과 렉틴 2가 서로의 당쇄에 결합하여 이루어지는 복합체를 생성하고 있을 가능성을 상정하였다. 그리고, 본 발명자들은 렉틴 1 및/또는 렉틴 2로서 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용하여 이들 복합체의 생성을 억제하는 것을 시도하고, 이에 의하여 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체를 감도 좋게 검출할 수 있는 것을 발견하였다.

즉, 렉틴 1 및 렉틴 2의 양쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용함으로써 렉틴 1끼리의 복합체, 렉틴 2끼리의 복합체, 및 렉틴 1과 렉틴 2의 복합체의 생성을 없애서, 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체만을 고감도로 검출할 수 있는 것이 분명해졌다. 또한, 렉틴 1 및 렉틴 2의 한쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용함으로써도, 렉틴 1끼리의 복합체, 렉틴 2끼리의 복합체, 및 렉틴 1과 렉틴 2의 복합체의 생성을 억제하여, 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체를 감도 좋게 검출할 수 있다.

또한, 여기서, 「당쇄를 갖지 않는 렉틴」에는 당쇄의 수식이 전혀 없는 렉틴에 더하여, 당쇄를 통한 렉틴끼리의 결합을 일으킬 수 있는 당쇄를 갖지 않는 렉틴이 포함되는 것으로 한다. 보다 구체적으로는, 「당쇄를 갖지 않는 렉틴 1」에는 렉틴 1이 인식하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 및/또는 렉틴 2가 인식하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄가 수식되지 않은 렉틴이면 사용 가능하다. 렉틴 1이 당쇄를 갖고 있더라도, 상기 당쇄 중에 렉틴 1 및/또는 렉틴 2가 인식하는 당쇄 구조가 포함되지 않는 경우에는 렉틴 1끼리의 복합체 및/또는 렉틴 1과 렉틴 2의 복합체가 생성되지 않기 때문이다. 마찬가지로, 「당쇄를 갖지 않는 렉틴 2」에는 렉틴 1이 인식하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄 및/또는 렉틴 2가 인식하는 당쇄 구조를 갖는 당쇄가 수식되어 있지 않은 렉틴이면 사용할 수 있다.

당쇄를 갖지 않는 렉틴으로서, 구체적으로는 원핵 세포로 발현한 조환형 렉틴, 또는 천연형 단백질의 당쇄 구조를 개변하여 얻은 개변형 렉틴을 들 수 있다.

[조환형 렉틴]

원핵 세포는 세포 내에서 합성한 단백질에 당쇄를 수식하는 막계 구조를 갖지 않기 때문에, 원핵 세포를 숙주 세포로서 발현한 조환형 렉틴(재조합 렉틴)은 당쇄를 갖지 않는다. 이하에 설명하는 바와 같이, 조환형 렉틴은 일반적인 유전 공학적 방법을 이용하여 간편하고, 또한 저비용으로 대량 생산이 가능하다.

조환형 렉틴의 제조 방법의 일례를 설명하면, 우선, 목적으로 하는 당쇄 구조에 대하여 결합성을 갖는 렉틴의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열을 포함하는 염기 서열을, 통상의 방법에 따라서 적당한 발현용 벡터에 도입하여, 발현용 조환 벡터를 얻는다. 발현용 벡터에는 목적으로 하는 당쇄 구조에 대하여 결합성을 갖는 렉틴의 아미노산 서열 중 당쇄 구조 결합 부분의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열만을 포함하는 염기 서열을 도입할 수 있다.

발현 벡터는 각종 숙주 세포 중에서 재조합 렉틴을 발현하여, 재조합 렉틴을 생산하는 기능을 갖는 것이면 특별히 제한되지 않다. 발현 벡터로서는, 예를 들면 플라스미드 벡터, 파지 벡터 및 바이러스 벡터를 들 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 pTrcHis2 벡터, pcDNA3.1/myc-His 벡터(Invitrogen사 제조), pUC119(다까라주조사 제조), pBR322(다까라주조사 제조), pBluescript II KS+ Stratagene사 제조), Pqe-tri(Qiagen사 제조), pET, pGEM-3Z, pGEX, pMAL 등의 플라스미드 벡터, λENBL3(Stratagene사 제조), λDASHII(푸나코시사 제조) 등의 박테리오파지 벡터, Charomid DNA(와코 준야꾸 고교(주) 제조), Lorist6(와코 준야꾸 고교(주) 제조) 등의 코스미드 벡터 등을 들 수 있다. 또한, 대장균 유래의 플라스미드(예를 들면, pTrc99A, pKK223, pET3a), λ 파지 등의 박테리오파지 등 외에, pA1-11, pXT1, pRc/CMV, pRc/RSV, pcDNA I/Neo, p3×FLAG-CMV-14, pCAT3, pcDNA3.1, pCMV 등도 들 수 있다.

재조합 렉틴의 검출이나 정제를 쉽게 하기 위해서, 렉틴은 태그 펩타이드나 다른 단백질과의 융합 단백으로서 발현시킬 수도 있다. 융합시키는 태그 펩타이드로서는 FLAG 태그, 3 XFLAG 태그, His 태그(His tag, 예를 들면 6×His 태그) 등을 들 수 있다.

이어서, 얻어진 발현용 조환 벡터를 이용하여, 적당한 숙주 세포를 형질 전환(형질 도입)함으로써, 형질 전환체를 제조한다. 숙주 세포에는 재조합 단백질을 당쇄 수식 없이 발현, 생산하는 세포가 이용된다. 숙주 세포로서는, 예를 들면 원핵 생물, 구체적으로는 대장균(Escherichia coli.)이나 바실러스속균(B. subtilis, B. brevis, B. borstelenis 등) 등을 들 수 있다. 대장균으로서는, 예를 들면 BL21, BL21(DE3), K-12, DH1, DH5, DH5α, M15, HB101, C600, XL-1 Blue, JM109, JM105, JM127, XL1-Blue, VCS257, TOP10 등을 사용할 수 있다. 또한, 플라스미드나 파지 DNA의 도입 효율이 보다 높은, 수용성 세포(Competent Cell)를 사용할 수도 있다. 수용성 세포로서는, 예를 들면 E. coli DH5α Competent Cell, E. coli JM109 Competent Cells(다카라바이오사 제조) 등을 들 수 있다.

발현용 조환 벡터에 의한 숙주 세포의 형질 전환은 종래 공지된 방법을 이용하여 행할 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포가 대장균인 경우에는 코헨(Cohen) 등의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., (1972) 9, 2110 참조), 프로토플라스트법(Mol. Gen. Genet., (1979) 168, 111 참조) 또는 컴피던트법(J. Mol. Biol., (1971) 56, 209 참조), 엠. 모리슨(M.Morrison)의 방법(Method in Enzymology, 68, 326-331, 1979 참조) 등에 의해 행할 수 있다. 또한, 시판되고 있는 수용성 세포(Competent Cell)를 이용하는 경우에는 그 제품 프로토콜에 따라서 형질 전환을 할 수도 있다.

형질 전환체(형질 도입체)가 재조합 렉틴을 발현, 생산하고 있는 것을 확인하기 위해서는, 예를 들면 프로브를 이용한 서던 혼성화, 콜로니 혼성화 등의 혼성화에 의한 통상의 방법을 적용할 수 있다. 또한, 이하의 방법도 채용할 수 있다.

재조합 렉틴이, 예를 들면 막관통형 단백으로서 발현한 경우 등, 형질 전환체의 배양액 내에 분비되지 않는 경우에는, 세포를 파괴 또는 용해하는 통상의 방법(예를 들면, 초음파 처리함, 균질기 등으로 처리함, 적당한 계면활성제 등의 막용해제로 처리함 등)으로 얻어진 형질 전환체를 처리하여, 그의 라이세이트를 얻는다. 그리고, 라이세이트에 대해서, 필요하면, 추가로 단백질을 정제한 후, 예를 들면 태그 펩타이드에 대한 항체를 이용한 통상의 면역학적 측정법(도트 웨스턴 블로팅법, 웨스턴 블로팅법 등)을 행하여, 라이세이트 중에 태그 펩타이드가 발현하고 있는 것을 확인한다.

또한, 재조합 렉틴이 형질 전환체의 배양액 내에 분비되어 나오는 경우에는 배양액(배양 상청)에 대해서, 상기 라이세이트에 대하여 행하는 경우와 마찬가지의 확인 절차를 행한다.

형질 전환체를, 영양 배지 중에서 배양하여, 재조합 렉틴을 생성시킨다. 배양은 종래 공지된 방법에 의해 행해지고, 온도, 배지의 pH 및 배양 시간도 적절히 설정될 수 있다. 숙주 세포가 대장균인 형질 전환체를 배양하는 경우에는, 대장균을 배양하는 통상의 방법의 조건으로, 통상 이용되는 액체 배지에서 행할 수도 있다.

재조합 렉틴은 배양에 의해 얻어지는 배양물로부터 이하와 같이 취득할 수 있다. 즉, 재조합 렉틴이 형질 전환체의 주변 세포질 또는 세포질 내에 존재하는 경우에는 여과 또는 원심 분리 등의 방법에 의하여 배양물로부터 균체 또는 세포를 회수하여, 적당한 완충액에 재현탁한다. 그리고, 예를 들면 계면활성제 처리, 초음파 처리, 리소자임 처리, 동결 융해 등의 방법으로, 회수된 세포 등의 세포벽 및/또는 세포막을 파괴한 후, 원심 분리나 여과 등의 방법으로 재조합 렉틴을 함유하는 조추출액을 얻는다. 재조합 렉틴이 형질 전환체의 배양액 내에 분비되어 나오는 경우에는 배양액(배양 상청)을 얻는다. 그리고, 일반적으로 이용되는 방법에 따라서, 당류(당쇄)의 혼입이 없도록, 조추출액 또는 배양액(배양 상청)으로부터 재조합 렉틴을 단리, 정제한다.

재조합 렉틴의 단리, 정제 방법으로서는, 예를 들면 염석, 용매 침전법 등의 용해도를 이용하는 방법, 투석, 한외여과, 겔여과, 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기 영동 등 분자량의 차이를 이용하는 방법, 이온 교환크로마토그래피 등의 하전을 이용하는 방법, 친화성 크로마토그래피 등의 특이적 친화성을 이용하는 방법, 역상 고속 액체 크로마토그래피 등의 소수성의 차이를 이용하는 방법, 등전점 전기 영동 등의 등전점의 차이를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 정제된 재조합 렉틴은 예를 들면, 항His 항체를 이용한 ELISA 등에 의해 확인할 수 있다.

[개변형 렉틴]

개변형 렉틴은 천연형 렉틴을 산 또는 당분해 효소로 처리함으로써 얻을 수 있다.

과요오드산 또는 그의 염(나트륨염, 칼륨염 등), 트리플루오로메탄술폰산 등의 산에 의해 천연형 렉틴을 처리함으로써 당쇄의 수산기를 산화하여, 당쇄의 전체 구조 또는 당쇄 중의 부분 구조를 변화시킬 수 있다. 또한, 알칼리 처리에 의한 β분해에 의해 당쇄 구조를 제거할 수도 있다. 이에 따라, 천연형 렉틴의 당쇄 중에 존재하는, 상기 천연형 렉틴이 인식하는 당쇄 구조 또는 다른 렉틴이 인식하는 당쇄 구조를 개변하여, 상기 천연형 렉틴을, 당쇄를 통한 렉틴끼리의 결합을 야기하지 않는 개변형 렉틴으로 변환할 수 있다. 또한, 산 처리는 종래 공지된 방법에 의하여 행할 수 있다(후술하는 실시예 11도 참조).

또한, 글리카나제(N-글리카나제, O-글리카나제 등), 만노시다제, 갈락토시다제, 케라타나제, 콘드로이티나제, 시아리나제, 푸코시다제, N-아세틸글루코사미니다제, N-아세틸헥소사미니다제 등의 당분해 효소에 의해 천연형 렉틴을 처리함으로써 천연형 렉틴으로부터 당쇄를 제거할 수 있다. 또는, 당분해 효소 처리에 의해 천연형 렉틴의 당쇄를 절단하여, 당쇄의 전체 구조 또는 당쇄 중의 부분 구조를 변화시킬 수 있다. 이들에 의해, 천연형 렉틴의 당쇄 중에 존재하는, 상기 천연형 렉틴이 인식하는 당쇄 구조 또는 다른 렉틴이 인식하는 당쇄 구조를 개변하여, 상기 천연형 렉틴을, 당쇄를 통한 렉틴끼리의 결합을 야기하지 않는 개변형 렉틴으로 변환할 수 있다. 또한, 효소 처리는 종래 공지된 방법에 의하여 행할 수 있다 (후술하는 실시예 11도 참조).

또한, 산 처리, 알칼리 처리 또는 당분해 효소 처리에 의하여 얻은 개변형 렉틴에서는 단백질 변성에 의해서 당쇄에 대한 결합성이 상실하거나 약해지기도 하는 경우가 있다. 그 때문에, 복합체 형성 절차에 이용하는 렉틴 1 및 렉틴 2에는 상술한 조환형 렉틴을 이용하는 것이 보다 바람직하다. 조환형 렉틴은 간편하고, 또한 저비용으로 대량 생산이 가능한 점에서도 바람직하다.

[복합체 형성 절차]

복합체 형성 절차에 있어서, 검출 대상 물질과 렉틴 1 및 렉틴 2를 접촉시킬 때, 렉틴 1과 렉틴 2는 동시에 시료와 반응시킬 수도 있고, 순차로 반응시킬 수도 있다. 또한, 복합체 형성 절차는 불용성 담체를 이용하여 B/F 분리를 행하는 헤테로지니어스 방법으로 행할 수도 있고, B/F 분리를 행하지 않는 호모지니어스 방법으로 행할 수도 있다.

시료와 반응시키는 렉틴 1 및 렉틴 2의 양(농도)은 검출 대상 물질의 종류, 필요한 측정 감도, 측정 방법이나 측정 장치 등에 따라서 적절히 설정된다.

불용성 담체를 이용하여 B/F 분리를 행하는 방법은 예를 들면, 불용성 담체에 결합한 렉틴 1과, 불용성 담체에 결합하지 않은 유리의 렉틴 2와, 검출 대상 물질을 접촉시켜 복합체를 형성시킴으로써 행해진다. 보다 구체적으로는, B/F 분리를 행하는 방법은 검출 대상 물질과, 불용성 담체에 결합한 렉틴 1을 접촉시켜, 렉틴 1과 검출 대상 물질로 구성되는 복합체 1을 얻는 제1 절차와, 복합체 1과 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 렉틴 1과 검출 대상 물질과 렉틴 2로 구성되는 복합체 2를 얻는 제2절차에 의하여 행해진다.

이때, 불용성 담체에 결합하고 있는 렉틴 1에는 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용하는 것이 바람직하고, 렉틴 1 및 렉틴 2의 양쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 여기서는 렉틴 1을 불용성 담체에 결합시키는 예를 설명했지만, 렉틴 2를 불용성 담체에 결합하는 것도 당연히 가능하고, 이 경우, 바람직하게는 렉틴 2에, 보다 바람직하게는 렉틴 2 및 렉틴 1의 양쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴이 이용된다.

B/F 분리를 위한 불용성 담체에는 슬라이드 글라스, ELISA 플레이트, 자기 비드, 필터, 필름, 막질 등, 통상의 단백질 고정화법에 사용되는 기재를 사용할 수 있다. 기재의 재료에는, 통상 유리, 실리콘, 폴리카보네이트, 폴리스티렌 또는 폴리우레탄 등이 사용된다.

렉틴을 불용성 담체에 고정화시키는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 화학적 결합법(공유 결합에 의해 고정화하는 방법), 물리적으로 흡착시키는 방법 등의 공지된 방법을 적용할 수 있다. 아비딘-비오틴 반응과 같은 매우 강고한 결합 반응을 이용하여 렉틴을 불용성 담체에 고정화하는 것도 가능하다. 이 경우, 렉틴에 비오틴을 결합한 비오틴화 렉틴을, 스트렙토아미딘을 코팅한 스트렙토아미딘 플레이트에 고정화할 수 있다. 또한, 이 분야에서 통상 사용되는 각종 링커를 통해, 렉틴을 불용성 담체에 고정화시킬 수도 있다.

불용성 담체를 이용하여 B/F 분리를 행하는 방법으로서는 시료와 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1을 반응시키는 제1 절차 후, 복합체 1(불용성 담체-렉틴 1- 검출 대상 물질)과 유리의 렉틴 2를 반응시키는 제2 절차를 행하기 전에, 고상 표면 상에서 불필요한 물질을 제거하기 위한 세정 절차를 포함할 수도 있다. 또한, 제2 절차 후, 검출 절차를 행하기 전에도, 세정 절차를 포함할 수도 있다. 세정 절차에 의해서, 고상 표면 상에서 시료 중의 협잡물이나 미반응된 렉틴 2를 제거하고, 복합체 2(불용성 담체-렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2)만을 고상 표면 상에 분리할 수 있다.

B/F 분리를 행하지 않는 방법으로서는 렉틴 1과 검출 대상 물질과 렉틴 2의 복합체를 분리하기 위한 방법으로서, 예를 들면 크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법, 전기 영동법, 모세관 전기 영동법, 모세관칩 전기 영동법, 예를 들면 LiBASys(시마즈 세이사꾸쇼(주) 제조) 등의 자동 면역 분석 장치를 이용한 방법 등을 적용할 수 있다. 구체적인 조건은 시료, 검출 대상 물질, 렉틴 1 및 렉틴 2의 종류나 성상에 따라서 적절히 설정된다. 예를 들면 HPLC를 이용하여 분리하는 경우, Anal. Chem. 65, 5, 613-616(1993) 및 특허문헌 1 등에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다. 모세관 전기 영동법을 이용하는 경우에는 J. Chromatogr. 593 253-258 (1992), Anal. Chem. 64 1926-1932 (1992), 및 특허문헌 2 등에 기재된 방법에 준하여 행할 수 있다. 또한, 자동 면역 분석 장치로서, 예를 들면 LiBASys를 이용하는 경우, 생물 시료 분석 22권 4호 303-308(1999)에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다.

이미 설명한 바와 같이, 본 절차에 있어서 렉틴 1 및 렉틴 2의 양쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용함으로써 렉틴 1끼리의 복합체, 렉틴 2끼리의 복합체, 및 렉틴 1과 렉틴 2의 복합체의 생성을 없애서, 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체만을 선택적으로 형성시킬 수 있다. 또한, 렉틴 1 및 렉틴 2의 한쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 이용함으로써도, 렉틴 1끼리의 복합체, 렉틴 2끼리의 복합체, 및 렉틴 1과 렉틴 2의 복합체의 생성을 억제하여, 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체를 선택적으로 형성시키는 것이 가능하다.

[검출 절차]

복합체 형성 절차로 형성된 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체의 검출은 예를 들면, 표지 물질을 사용한 방법에 의해 행할 수 있다. 표지 물질로서는, 예를 들면 통상의 면역 측정법 등에서 사용되는 효소류, 방사성 동위 원소, 형광성 물질, 발광성 물질, 자외부에 흡수를 갖는 물질, 스핀 라벨화제로서의 성질을 갖는 물질 등, 통상 이 분야에서 사용되고 있는 표지 물질을 전부 들 수 있다.

표지 물질을 렉틴 1 및/또는 렉틴 2에 결합시키기 위해서는, 예를 들면 통상의 면역 측정법 등에서 행해지고 있는 표지 방법을 적절하게 사용하여 행할 수 있다. 또한, 1개 또는 수개의 아미노산을 통해, 또는 1개 또는 수개의 아미노산과 링커를 통해, 렉틴에 표지 물질을 결합시키는 방법도 채용할 수 있다. 또한, 표지 물질을 단백질에 결합시키는 각종 키트도 시판되고 있기 때문에, 이들을 이용하여, 키트에 첨부된 취급 설명서에 따라서 표지를 행할 수도 있다.

복합체의 검출 및 측정은 표지 물질이 갖고 있는, 어떠한 방법에 의하여 검출할 수 있는 성질에 따라서, 각각 소정의 방법에 따라서 실시된다. 예를 들면, 불용성 담체에 고정화한 렉틴 1과, 표지 물질로서 서양 고추 냉이 퍼옥시다제(HRP)를 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하여 B/F 분리를 행하는 방법은 개략 이하와 같다.

즉, 당쇄를 갖는 검출 대상 물질을 함유하는 시료를, 렉틴 1을 고정화한 불용성 담체에 접촉시키고, 4 내지 40℃에서 3분 내지 20시간 반응을 행하여, 고상 표면 상에 렉틴 1과 검출 대상 물질의 복합체 1을 생성시킨다. 다음으로, HRP로 표지한 렉틴 2를 함유하는 용액을 고상 표면 상에 가하고, 4 내지 40℃에서 3분 내지 16시간 반응시켜, 고정화 렉틴 1-검출 대상 물질-표지 렉틴 2의 복합체 2를 생성시킨다. 계속해서, 적당한 농도의 TMB(3,3',5, 5'-테트라메틸벤지딘) 용액을 첨가하여, 일정 시간 반응시킨다. 그 후, 1M 황산 등의 반응 정지액을 가하여 반응을 정지시키고, 450nm의 흡광도를 측정한다. 얻어진 측정치와, 미리 농도가 알려진 검출 대상 물질의 용액에 대하여 같은 측정을 행하여 얻은 검량선으로부터, 시료 중 검출 대상 물질의 양을 구할 수 있다.

또한, 예를 들면 알렉사 플루오르-488-테트라플루오로페닐에스테르(Alexa Fluor-488 tetrafluorophenyl ester) 등으로 표지한 렉틴 1과, 예를 들면 알렉사 플루오르-647 숙신이미딜에스테르(Alexa Fluor-647 succinimidyl ester) 등으로 표지한 렉틴 2를 사용하여, 공지된 형광 상호 상관 분광법(Fluorescence Correlation Spectroscopy, FCCS)에 따라서 검출 대상 물질을 측정할 수도 있다.

또한, 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체의 검출은 표지 물질을 이용하는 일없이, 예를 들면 복합체에서 유래하는 성질을 이용하여 측정하는 방법, 구체적으로는 표면 플라즈몬 공명 등의 동종 면역 어세이계 등의 방법에 의해서도 행하는 것이 가능하다.

이미 설명한 바와 같이, 복합체 형성 절차에 있어서, 렉틴 1 및 렉틴 2의 양쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 사용함으로써, 본 절차에서는 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체만을 고감도로 검출할 수 있다. 또한, 복합체 형성 절차에 있어서, 렉틴 1 및 렉틴 2의 한쪽에 당쇄를 갖지 않는 렉틴을 사용함으로써도, 본 절차에서 「렉틴 1-검출 대상 물질-렉틴 2」의 복합체를 감도 좋게 검출하는 것이 가능해진다.

[실시 형태예]

이하에, 렉틴-렉틴 샌드위치법의 실시 형태의 구체예를 진술한다. 또한, 각 조작 후에 필요에 따라서 불필요 물질을 제거하는 조작(세정 등)을 행할 수도 있다.

(1-1) 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과, 불용성 담체에 고정화되지 않은 유리의 비표지 렉틴 2를 사용하는 방법(1)

(i) 시료와, 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과, 유리의 비표지 렉틴 2를 접촉시켜, 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과 검출 대상 물질과 비표지 렉틴 2의 복합체를 형성시키고,

(ii) 상기 복합체의 양을 측정하고,

(iii) 얻어진 상기 복합체의 양에 기초하여, 시료 중의 검출 대상 물질의 양을 측정한다.

(1-2) 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과, 유리의 비표지 렉틴 2를 사용하는 방법(2)

(i) 시료와 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1을 접촉시켜, 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과 검출 대상 물질의 복합체 1을 형성시키고, 이어서

(ii) 상기 복합체 1과 유리의 비표지 렉틴 2를 접촉시켜, 복합체 1과 비표지 렉틴 2의 복합체 2를 형성시키고, 이어서

(iii) 상기 복합체 2의 양을 측정하고,

(iv) 상기 복합체 2의 양에 기초하여, 시료 중의 검출 대상 물질의 양을 측정한다.

(2-1) 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하는 방법(1)

(i) 시료와, 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과 검출 대상 물질과 표지 렉틴 2의 복합체를 형성시키고,

(ii) 상기 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고,

(iii) 얻어진 표지 물질량에 기초하여, 시료 중의 검출 대상 물질의 양을 측정한다.

(2-2) 불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하는 방법(2)

(ii) 상기 복합체 1과 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 복합체 1과 표지 렉틴 2의 복합체 2를 형성시키고, 이어서

(iii) 상기 복합체 2중의 표지 물질량을 측정하고,

(iv) 얻어진 표지 물질량에 기초하여, 시료 중의 검출 대상 물질의 양을 측정한다.

(3-1) 유리의 렉틴을 사용하는 방법(1)

(i) 시료와 유리의 렉틴 1과 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 렉틴 1과 검출 대상 물질과 렉틴 2의 복합체를 형성시키고,

(ii) 상기 복합체의 양을 측정하고,

(3-2) 유리의 렉틴을 사용하는 방법(2)

(i) 시료와 유리의 렉틴 1을 접촉시켜, 검출 대상 물질과 렉틴 1의 복합체 1을 형성시키고, 이어서

(ii) 상기 복합체 1과 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 렉틴 1과 검출 대상 물질과 렉틴 2의 복합체 2를 형성시키고, 이어서

(iii) 상기 복합체 2의 양을 측정하고,

(iv) 얻어진 상기 복합체 2의 양에 기초하여, 시료 중의 검출 대상 물질량을 측정한다.

(4-1) 유리의 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하는 방법(1)

(i) 시료와 유리의 렉틴 1과 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 렉틴 1과 검출 대상 물질과 표지 렉틴 2의 복합체를 형성시키고,

(ii) 상기 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고,

(4-2) 유리의 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하는 방법(2)

(ii) 상기 복합체 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 복합체 1과 표지 렉틴 2의 복합체 2를 형성시키고, 이어서

(iii) 상기 복합체 2 중의 표지 물질량을 측정하고,

(5-1) 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하는 방법(1)

(i) 시료와, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 접촉시켜, 표지 렉틴 1과 검출 대상 물질과 표지 렉틴 2의 복합체를 형성시키고,

(ii) 상기 복합체 중의 표지 물질량을 측정하고,

(5-2) 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하는 방법(2)

(i) 시료와 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 1을 접촉시켜, 검출 대상 물질과 표지 렉틴 1의 복합체 1을 형성시키고, 이어서

(ii) 상기 복합체 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 표지 렉틴 2를 접촉시켜, 복합체 1과 표지 렉틴 2의 복합체 2를 형성시키고, 이어서

(iii) 상기 복합체 2 중의 표지 물질량을 측정하고,

[렉틴렉틴 샌드위치법의 유리한 효과]

이상에서 설명한 렉틴렉틴 샌드위치법에 따르면, 예를 들면 복합 당질로서 당단백질의 검출을 행하는 경우에, 당단백질이 복수의 당쇄를 갖고 있으면, 당해 당쇄에 반응하는 렉틴을 복수 당단백질에 결합시킬 수 있다. 또한, 당단백질이 하나의 당쇄밖에 갖고 있지 않은 경우에도, 그 하나의 당쇄에 렉틴이 반응하는 구조가 복수 존재하면, 당해 렉틴을 복수 당단백질에 결합시킬 수 있다. 이에 비하여, 종래의 항체-항체 샌드위치법에서는 당단백질의 하나의 에피토프에 하나의 항체밖에 결합시킬 수 없다. 이 때문에, 렉틴렉틴 샌드위치법에 따르면, 항체-항체 샌드위치법에 비하여, 당단백질의 검출 감도를 현저히 높일 수 있다.

또한, 특정한 당쇄 구조를 갖는 당단백질에만 결합하는 항체를 얻는 것은 어렵고, 항체-항체 샌드위치법에 의한 검출계를 구축할 수 없는 경우에도, 렉틴렉틴 샌드위치법에 따르면, 당해 당쇄 구조에 반응하는 렉틴을 이용하여 용이하게 검출계를 구축할 수 있다. 또한, 렉틴렉틴 샌드위치법에서는 렉틴으로서 재조합 단백질을 사용하면, 저비용 검출계의 구축이 가능하다.

최근의 연구에 의해, 당쇄의 다양한 기능이 분명해졌다. 특히, 암(전이, 종양 마커 등), 면역(면역 수용체 조절, 면역 세포 분화, 항체 의약 등), 수정, 발생·분화(재생 의료 등), 감염증(인플루엔자, 피롤리균, 콜레라 독소 등), 바이오 의약, 뇌, 혈액형 등에 있어서, 당쇄는 주목받는 중요한 역할을 하고 있는 것을 알게 되어 왔다. 따라서, 특정한 당쇄 구조의 검출을 행할 수 있는 본 발명의 렉틴렉틴 샌드위치법은 예를 들면, 암 마커(SLX 항원, CA19-9 항원 등) 등의 질환 관련 바이오 마커의 연구(발견·개발 등), 상기 바이오 마커의 검출에 의한 암 기타 질환의 진단·판정(예를 들면, 암의 악성도 판정, 암 전이능 평가 등), 각 질환의 발증 기구의 해명 및 치료법의 개발, 간엽계 줄기 세포 마커·분화 마커 등의 연구, 바이오 의약품의 품질 관리 및 그의 개발, 세포의 품질 관리 등의 분야에서 특히 유효하게 이용된다.

또한, 본 발명에 따른 렉틴렉틴 샌드위치법은 용수법에 한하지 않고, 자동 분석 장치를 이용한 측정계에 적용하여 용이, 또한 신속히 측정을 행할 수도 있다. 용수법 또는 자동 분석 장치를 이용하여 측정을 행하는 경우의 시약류 등의 조합 등에 대해서는 특별히 제약은 없고, 적용하는 자동 분석 장치의 환경, 기종에 더하여, 또는 다른 요인을 고려하여 가장 좋다고 생각되는 시약류 등의 조합을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 렉틴렉틴 샌드위치법은 Micro-TAS(Micro-Total Analysis Systems: μ-TAS, μ종합 분석 시스템)에의 응용도 가능하다.

[구체예]

이하, 복합 당질로서 상술한 줄기 세포의 배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커를 검출하는 경우를 예로 들어, 렉틴렉틴 샌드위치법을 더욱 구체적으로 설명한다. 여기서는, 상기한 실시 형태예 중「(2-2)불용성 담체에 고정화된 렉틴 1과, 표지 물질로 표지한 유리의 렉틴 2를 사용하는 방법(2)」에 따른 방법을, 도 1을 참조하면서 설명한다.

(가) 복합체 형성 절차의 제1 절차

우선, 렉틴(L₁)으로서 조환형 BC2LCN(이하, 「rBC2LCN」이라고도 칭함)이 고정화된 불용성 담체의 고상 표면(S)(도A 참조)에 배양 상청을 접촉시켜, 반응을 행한다. rBC2LCN은 배양 상청에 검출 대상 물질(T)로서 포함되는, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 미분화 당쇄 마커가 갖는 당쇄 구조(G₁)(Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc)에 대하여 결합성을 갖는다. 따라서, 반응 후의 고상 표면(S)에는 렉틴(L₁)이 당쇄 구조(G₁)를 통해 검출 대상 물질(T)과 결합한 복합체 1이 형성된다(도B 참조).

렉틴(L₁)은 검출 대상 물질(T)이 갖는 당쇄 구조(G₁)에 대하여 높은 특이성을 갖는 것이 바람직하다. 이 점, rBC2LCN은 당쇄 구조 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」에 대하여 높은 특이성을 갖는다. 이 때문에, 본 절차에서는 렉틴(L₁)과 당쇄 구조(G₁)가 특이적인 결합에 의해서, 배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커를 특이적으로 고상 표면(S) 상에 포착할 수 있다.

본 절차에 있어서, 렉틴(L₁)으로서 당쇄를 갖지 않는 rBC2LCN을 사용함으로써, 다음에 설명하는 제2 절차에 있어서, 렉틴(L₁)과 렉틴(L₂)의 복합체가 생성되는 것을 방지할 수 있다.

(가) 복합체 형성 절차의 제2 절차

다음으로, 고상 표면(S)에 형성된 복합체 1에, 형광 물질 등에 의해 표지된 유리의 렉틴(L₂)을 접촉시켜, 반응을 행한다. 전단계 절차로서, 고상 표면(S)에 존재하는 협잡물을 제거하기 위한 세정을 행할 수도 있다.

렉틴(L₂)에는 미분화 당쇄 마커에 결합성을 갖는 것이 분명해진 SRL, CGL2, ABA, XCL이 사용된다(실시예 6 참조). 서열 번호 2 내지 5에 이들 렉틴의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열 목록에 있어서, 서열 번호 2는 ABA의 아미노산 서열, 서열 번호 3은 XCL의 아미노산 서열, 서열 번호 4는 SRL의 아미노산 서열, 서열 번호 5는 CGL2의 아미노산 서열을 각각 나타낸다. 이들 렉틴은 2개 이상을 조합하여 사용할 수도 있다. 도면에서는 미분화 당쇄 마커가 갖는 당쇄 구조 중, 이들 렉틴이 결합하는 당쇄 구조를 부호 G₂로 나타내었다.

또한, SRL, CGL2, ABA 및 XCL은 미분화 당쇄 마커를 특이적으로 인식하는 특성을 유지하고 있으면, 서열 번호 2 내지 5에 대응하는 전장은 필요로 하지 않고, 또한 서열 번호 2 내지 5에서 부분적으로 일부의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 부가되어 있을 수도 있다.

본 절차에 의해, 고상 표면(S)에는 렉틴(L₁)이 당쇄 구조(G₁)를 통해 검출 대상 물질(T)과 결합한 복합체 1에, 이어서 당쇄 구조(G₂)를 통해 렉틴(L₂)이 결합한 복합체 2가 형성된다(도C 참조).

상기한 제1 절차에 있어서, 렉틴(L₁)으로서 당쇄를 갖지 않는 rBC2LCN을 사용함으로써 본 절차에서는, 렉틴(L₂)이 렉틴(L₁)의 당쇄에 결합하여 복합체를 형성하는 것을 방지할 수 있고, 고상 표면(S) 상에 rBC2LCN과 미분화 당쇄 마커와 렉틴(L₂)을 포함하는 복합체 2만을 선택적으로 형성시킬 수 있다.

또한, 렉틴(L₂)에도, 당쇄를 갖지 않는 rSRL, rCGL2, rABA, rXCL을 사용함으로써 렉틴(L₁)이 렉틴(L₂)의 당쇄에 결합하여 복합체를 형성하거나, 렉틴(L₂)끼리 복합체를 형성하기도 하는 것을 방지할 수 있다.

(다) 검출 절차

마지막으로, 형광 검출 등의 표지 물질의 성질에 따른 검출 방법에 의하여 렉틴(L₂)에 표지된 표지 물질을 검출함으로써, 고상 표면(S) 상에 형성된 복합체 2를 검출한다. 복합체 형성 절차에 있어서, 렉틴(L₁) 및 렉틴(L₂)의 양쪽에 당쇄를 갖지 않는 조환형 렉틴을 사용함으로써 본 절차에서는 복합체 2만을 고감도로 검출할 수 있다.

또한, 형광 강도의 측정 등에 의하여 표지 물질량을 측정하고, 얻어진 표지 물질량에 기초하여, 배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커의 양을 측정할 수도 있다. 전단계 절차로서, 고상 표면(S)에 존재하는 협잡물이나 미반응된 렉틴(L₂)을 제거하기 위한 세정을 행할 수도 있다.

본 구체예에서는 다른 당쇄 구조에 결합하는 rBC2LCN(렉틴L₁)과, rSRL, rCGL2, rABA 및/또는 rXCL(렉틴L₂)을 조합 사용하여 샌드위치법을 행함으로써 rBC2LCN만을 사용하여 검출하는 경우에 비해, 미분화 당쇄 마커의 검출 특이성을 향상시킬 수 있다.

또한, 본 구체예에 따르면, 표지된 rSRL, rCGL2, rABA 및/또는 rXCL(렉틴L₂)을 사용하여 샌드위치법을 행함으로써 표지된 rBC2LCN(렉틴L₁)만을 사용하여 검출하는 경우나, 표지된 시료를 rBC2LCN만을 사용하여 검출하는 경우에 비하여, 높은 검출 시그널을 얻을 수 있다. 이 때문에, 본 구체예에 따르면, 검출 시그널의 강도에 기초하여 미분화 당쇄 마커를 정량적으로 검출할 때에, 보다 고정밀도인 정량이 가능해진다(실시예 7 참조).

[키트]

본 발명에 따른 당쇄를 갖는 검출 대상 물질의 검출에 이용되는 키트는 상기 당쇄에 대하여 결합성을 갖는 렉틴 1 및 렉틴 2를 포함함으로써 렉틴 1 및 렉틴 2의 적어도 하나는 당쇄를 갖지 않는 렉틴이 된다.

키트의 구성 요건의 바람직한 양태와 구체예는 상기한 렉틴-렉틴 샌드위치법에 관한 설명에서 기재한 바와 같다. 또한, 이들 시약의 농도 등의 바람직한 양태도, 통상 이 분야에서 통상 사용되는 농도 범위에서 적절하게 선택할 수 있다.

또한, 키트에 포함되는 시약 중에는 통상 이 분야에서 사용되는 시약류, 예를 들면 완충제, 반응 촉진제, 당류, 단백질, 염류, 계면활성제 등의 안정화제, 방부제 등으로, 공존하는 시약 등의 안정성을 저해하거나 하지 않고, 검출 대상 물질과 렉틴 1 및 렉틴 2의 반응을 저해하지 않는 것이 포함되어 있을 수도 있다. 또한, 그의 농도도, 통상 이 분야에서 통상 이용되는 농도 범위에서 적절하게 선택할 수도 있다.

또한, 키트는 검출 대상 물질에 대하여 검량선을 작성하기 위해 사용되는 표준품을 포함할 수도 있다. 표준품은 시판되고 있는 물질을 사용할 수도 있고, 공지된 방법에 따라서 제조된 물질을 사용할 수도 있다.

본 발명에서의 용어나 개념은 당해 분야에서 관용적으로 사용되는 용어의 의미에 기초하는 것으로, 본 발명을 실시하기 위해 사용하는 여러 가지 기술은 특히 그의 출전을 명시한 기술을 제외하고는, 공지된 문헌 등에 기초하여 당업자라면 용이하고, 또한 확실하게 실시 가능하다.

또한, 각종 분석 등은 사용한 분석 기기 또는 시약, 키트의 취급 설명서, 카탈로그 등에 기재된 방법을 준용하여 행하였다.

또한, 본 명세서 중에 인용한 기술 문헌, 특허 공보 및 특허 출원 명세서 중의 기재 내용은 본 발명의 기재 내용으로서 참조되는 것으로 한다.

실시예

이하에 실시예를 나타내고, 본 발명을 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 각 실시예에서 매일 신선한 배양액으로 배지 교환하면서, 세포를 배양하였다. 또한, 배지 교환했을 때에 얻어진 폐기용 배양액을 사용하여, 즉 신선 배양액으로 배지 교환한 후 약 24시간 경과한 배양액의 배양 상청을 사용하여, 각 검출을 행하였다.

(실시예 1) ES 세포의 세포 염색

본 실시예에서 사용하는 ES 세포(KhES1주)는 교토 대학 재생의과학연구소 줄기세포 의학연구센터에서 분양을 받았다. 스에모리(Suemori) 등의 방법(비특허문헌 4 참조)에 의해 배양하였다. 세포는 4％ 파라 포름알데히드로 고정하여, PBS로 세정한 후, 형광 라벨화(Cy3을 결합)한 rBC2LCN을 가하여 실온에서 1시간 반응시켰다 (도 2, 중단 좌측. 우측은 동일 세포의 핵을 염색한 것).

비교 대상으로서, ES 세포나 iPS 세포를 특이적으로 인식하는 Tra1-60 항체를 KhES1 세포 콜로니와 반응시킨 후, 2차 항체인 anti-mouse IgM-Alexa 488을 또한 반응시킨 콜로니의 염색상을 도2 상단 좌측에 나타낸다. 같은 상단 우측은 동일 세포의 핵을 DAPI로 염색한 것이다.

형광 라벨화된 rBC2LCN은 Tra1-60 항체와 같이, ES 세포를 강하게 염색한다(도 2 중단 좌측, 우측은 동일하게 조직의 핵을 염색한 것.). 네가티브 컨트롤로서 BSA를 형광 라벨화한 것을 사용한 경우에는 형광이 관찰되지 않는 점에서(도2 하단 좌측. 우측은 동일 세포의 핵을 염색한 것.), rBC2LCN은 Tra1-60 항체와 같은 정도 또는 그 이상으로 ES 세포를 강하게 검출하는 것을 알 수 있다.

상기 실험에서는 세포를 파쇄하지 않고서 행하고 있기 때문에, Tra1-60 항체가 세포 표면의 당단백질 항원을 인식하고 있는 것과 마찬가지로, rBC2LCN이 인식하고 있는 당쇄 구조의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」는 미분화 상태의 줄기 세포 표면에서 대량으로 발현하고 있는 당단백질 및 당지질의 구성 당으로서, 세포 표면을 덮도록 존재하고 있는 것이 엿보인다.

(실시예 2) ES 세포의 분화 유도시의 세포 염색

실험예 1과 같은 방법으로 제조한 ES 세포(KhES1주) 배양액 내에, 드레이퍼(Draper) 등의 방법(비특허문헌 5 참조)에 따라서, 최종 농도 10^-5M이 되도록 레티노산을 첨가하여 배양함으로써, ES 세포의 분화 유도를 행하였다. 8일간 배양한 바, 세포의 형태로 보아 충분히 분화가 진행한 것을 확인하여, 형광 표지한 rBC2LCN을 각 세포와 반응시켰다(도 3). 비교 대상으로서, Tra1-60 항체를 반응시킨 후, 2차 항체인 anti-mouse IgM-Alexa 488을 또한 반응시켰다. 도면 중, 「+RA」의 단은 레티노산 처리를 하여 신경 방향으로 분화시킨 경우를 나타내고, 「-RA」의 단은 미처리 경우를 나타낸다. 또한, 도 3 우측의 「DAPI」는 동일 세포의 핵을 DAPI로 염색한 결과를 나타낸다.

신경 세포로 분화한 KhES1주에서는 rBC2LCN의 형광은 거의 검출되지 않았다. 이에 비하여, Tra1-60 항체의 형광 강도는 충분히 관찰 가능한 강도를 유지한 채이다. 이 실험 결과는 공지된 미분화 마커로서 이용되고 있는 Tra1-60 항체가 인식하는 당단백질 항원에서는 분화가 진행한 상태에서도 여전히 세포 표면에서 상당한 발현량을 유지하고 있는 데 대하여, rBC2LCN이 인식하고 있는 당쇄 구조의 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」의 경우에는 미분화 상태에서는 세포 표면을 덮도록 발현했지만, 분화가 진행하면 거의 발현하지 않게 되는 것을 나타내고 있다.

이상의 점에서, 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」의 당쇄 구조는 분화, 미분화를 판정하기 위한 미분화 당쇄 마커로서 매우 우수한 마커인 것이 분명해졌다. 또한, rBC2LCN 고정화 기판이 미분화성을 가진 ES 세포, iPS 세포 등 줄기 세포를 특이적으로 인식하는 우수한 분화, 미분화 판정용 키트로서 높은 유용성을 가지고 있는 것을 알았다.

(실시예 3) 형광 라벨화한 배양 상청의 직접 해석

이 실험에서 사용한 iPS 세포(201B7주, 253G1주)는 이화학연구소 바이오리소스센터에서 분양을 받았다. 동 TIGMKOS #19주는 (독)산업기술종합연구소 줄기세포공학연구센터에서 수립되었다(논문 미발표). 다테노(Tateno) 등의 방법(비특허문헌 1 참조)에 의해 배양하였다. 약 24시간 배양한 배양액을 회수하고, 원심 분리에 의해 액성 성분만을 분리하여, 배양 상청을 얻었다.

배양 상청 중에 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」의 당쇄 구조가 존재하고 있는지의 여부를 고정화한 rBC2LCN을 이용하여 조사하였다. 구체적으로는, 실시예 2와 같은 방법으로 iPS 세포의 201B7주 및 253G1주를 8일간 배양하여 분화 유도하였다. 컨트롤로서, 레티노산(RA) 없이 동일 iPS 세포의 201B7주 및 253G1주에 대해서도 동일간 배양하였다. 또한, TIGMKOS #19주에 대해서도 레티노산(RA) 없이 4일간 배양하였다. 배양액은 매일, 신선한 배양액과 배지 교환하고, 얻어진 폐기용 배양 상청을 이하의 측정 공정에 제공하였다. 각 iPS 세포의 배양 상청을 형광 라벨화하여, 슬라이드 글라스 상에 고정화한 rBC2LCN과 20℃에서 밤새 반응시켜, 세정한 후에, 소멸파 여기 형광형 스캐너로 그 결합을 검출하였다(도 4).

그 결과, rBC2LCN은 레티노산 없이 배양한 미분화를 유지한 iPS 세포(201B7주, 253G1주, TIGMKOS #19주)의 배양 상청과는 반응했지만, 레티노산 존재 하에서 배양한 분화한 iPS 세포(201B7주, 253G1주)나 컨트롤 배지와는 반응성을 나타내지 않았다. 이것은 「Fucα1-2Galβ1-3GlcNAc/GalNAc」의 당쇄 구조가 배양 상청 중의 분화, 미분화를 판정하기 위한 미분화 당쇄 마커로서 유효하게 기능하는 것을 실증하는 것이다.

본 성질을 이용하여, 세포를 채취하는 일 없이, 배양 상청을 이용하여 ES 세포, iPS 세포가 수립된 것이 검증 가능하다. 또한, 이들 줄기 세포를 보존할 때나 미분화성을 가진 채로 증식시키고자 할 때에, 분화 세포가 혼입하지 않은 것을 검증하는 것도 가능하다. 또한, 본 성질을 이용하여, 각종 장기 세포(심근 세포, 간장 세포, 신경 세포, 랑게르한스섬 세포, 연골 세포, 뼈 세포 등)를 ES 세포, iPS 세포 등의 줄기 세포로부터 제작했을 때, 미분화성을 가진 채로 잔류하고 있는 세포를, 배양 상청을 검사하는 것만으로 간편하고, 또한 신속히 검출하는 것이 가능하다.

또한, 종래 미분화 세포의 마커로서 Nanog, POU5F1, DNMT3B, TERT, UTF1 (undifferentiated embryonic cell transcription factor 1), FOXD3, LIN28, BRIX 등의 단백질이 공지인데, 이들 단백질의 대부분은 핵 내에 국재해 있고, 배양 상청 중에서의 검출은 불가능이라고 생각된다.

(실시예 4) 렉틴 오버레이에 의한 배양 상청의 해석

배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커를 보다 고감도로 검출하기 위해서, 슬라이드 글라스 상의 rBC2LCN(렉틴 1)에 포착된 미분화 당쇄 마커에 대하여 검출용 렉틴(렉틴 2)을 결합시키고, 렉틴렉틴 샌드위치법에 의한 검출을 시도하였다. 검출용 렉틴에는 비오틴화 rAAL을 사용하였다.

즉, 실시예 3에 있어서, 레티노산(RA) 없는 iPS 세포(TIGMKOS #19주)와, 배지만(컨트롤 배지)을 4일 배양한 배양 상청을 채취하여, rBC2LCN을 고정화한 슬라이드 글라스에 20℃에서 밤새 반응시켰다. 세정한 후에 비오틴화 rAAL을 20℃에서 밤새 반응시킨 후, 1μg/mL의 Cy3 라벨화한 스트렙토아비딘을 20℃에서 30분 반응시킨 후, 소멸파 여기 형광형 스캐너로 결합을 검출하였다(도 5). 컨트롤 배지에 대해서도 같은 처리 및 측정을 행하였다.

본 실시예의 결과로부터, 슬라이드 글라스에 고정화한 rBC2LCN과 비오틴으로 표지한 AAL을 이용한 본 발명의 렉틴-렉틴 샌드위치법에 의해서, 배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커를 검출할 수 있는 것이 분명해졌다.

(실시예 5) 오버레이 렉틴의 스크리닝

본 실시예에서는 미분화 당쇄 마커를 렉틴렉틴 샌드위치법에 의해 검출하기 위해서, 포착용 렉틴인 rBC2LCN과 함께 검출용 렉틴(오버레이 렉틴)으로서 사용 가능한 렉틴의 스크리닝을 행하였다. 스크리닝 대상으로 한 조환형 렉틴을 이하의 「표 1」에 나타내었다.

에폭시 활성화 슬라이드 글라스(#1066643, SCHOTT) 상에 고정화한 rBC2LCN과, 컨트롤 배지 또는 iPS 세포(TIG/MKOS)를 매일 배지 교환하면서 3일간 배양하고, 배양 3일째의 배양 상청(배지 교환 후 약 24시간 경과한 것)을 20℃에서 밤새 반응시켰다. 다음으로, 용액 (25 mM Tris-HCl pH 7.5, 140 mM NaCl(TBS), 2.7 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MnCl₂, and 1％ Triton X-100)으로 1회 세정하였다. 그 후, Cy3 라벨화 조환형 렉틴을 가하여, 20℃에서 3시간 인큐베이팅하였다. GlycoStation^TM Reader 1200(GP BioSciences)으로 형광 강도를 측정한 결과를 도 6에 나타내었다. 도면의 종축에는 배양 상청에서 얻어진 형광 강도값에서 컨트롤 배지에서 얻어진 형광 강도값을 뺀 값을 표시하였다.

도 6에 도시된 바와 같이, 실시예 4에서 사용한 AAL 외에, SRL, CGL2, ABA, XCL의 4개의 조환형 렉틴으로 특히 우위인 형광 강도값이 관찰되었다. 이로부터, 이들 4개의 렉틴이 렉틴렉틴 샌드위치법에 의해 미분화 당쇄 마커를 검출할 때의 검출용 렉틴으로서 유용한 것이 분명해졌다.

(실시예 6) 렉틴렉틴 샌드위치법(재조합 렉틴)

본 실시예에서는 실시예 5에서 특정된 rSRL, rCGL2, rABA, rXCL을 렉틴 2(검출용 렉틴)에 사용하고, rBC2LCN을 렉틴 1(포착용 렉틴)에 사용하여, 렉틴렉틴 샌드위치법에 의한 미분화 당쇄 마커의 검출을 행하였다.

스트렙토아비딘 플레이트(Nunc, #436020) 상에 비오틴화 rBC2LCN을 고정화하였다. 세정 후의 플레이트에, 레티노산(RA) 존재 하 또는 비존재 하에서 iPS 세포를 매일 배지 교환하면서 8일간 배양하고, 배양 8일째의 배양 상청(배지 교환 후 약 24시간 경과한 것)을 회수하여 얻어진 배양 상청을 적하하고, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 재차 세정을 행한 플레이트에, HRP 라벨화한 상술한 조환형 렉틴을 가하여, 37℃에서 1시간 반응시켰다. 세정 후, 1-step ULTRA TMB-ELISA (Thermo, #34028)를 적하하고, 실온에서 30분 반응 후, 1M 황산을 가하여 반응 정지하고, 450 nm의 흡광도를 측정하였다.

결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에는 배양 상청에서 얻어진 흡광도값을 컨트롤 배지에서 얻은 흡광도값으로 나눈 값을 S/N으로서 표시하였다. 모든 렉틴을 반응시킨 경우에도, 미분화의 iPS 세포의 배양 상청(253G1(RA-))은 높은 S/N치를 나타낸 데 비하여, 분화시킨 iPS 세포의 배양 상청(253G1(RA+))은 보다 낮은 S/N치를 나타내었다. 4종의 오버레이 렉틴 중, rABA는 가장 높은 S/N치를 나타내었다. 한편, 피더 세포(MEF)의 배양 상청은 레티노산(RA)의 첨가에 관계없이, 컨트롤 배지와 거의 같은 정도의 반응성을 나타내었다.

(실시예 7) 렉틴렉틴 샌드위치법에서의 검량선 작성

본 실시예에서는 실시예 6에서 구축한 렉틴렉틴 샌드위치법에 의한 미분화 당쇄 마커의 검출계에서, 배양 상청 중의 미분화 세포수를 정량하기 위한 검량선을 작성하였다.

iPS 세포(201B7 또는 253G4)를 24시간 배양 후, 배지(Medium WakoB, Nutristem, ReproFF 또는 MEF-CM)를 회수하고, 배지 중의 iPS 세포의 세포수를 카운트하였다.

iPS 세포의 배양 상청을 단계 희석하여, 실시예 6과 같은 방법으로 해석을 행하여, 얻어진 흡광도값과 세포수의 관계를 나타내는 회귀 직선을 검량선으로서 얻었다. 검출용 렉틴으로서 rABA를 이용하여 얻어진 검량선을 도 8, 도 9에, rSRL을 이용하여 얻어진 검량선을 도 10, 도 11에 나타내었다. 도 8 내지 도 11에 나타내는 검량선은 모두 0.961 이상의 높은 상관 계수를 나타내었다.

본 실시예의 결과로부터, 특정한 렉틴의 조합으로 배양 상청 중의 미분화 당쇄 마커의 측정을 행하면, 미분화 세포를 정량적으로 검출하여, 미분화 세포수가 0으로 되었는지의 여부를 판정하여 얻는 것을 알 수 있다.

(실시예 8) 미분화 당쇄 마커의 동정

본 실시예에서는 미분화 당쇄 마커의 동정을 행하였다.

매일 배지 교환하면서 3일간 배양하여 얻어진 ES 세포의 배양 상청(KhES1 sup), 3일간 배양하여 얻어진 iPS 세포의 배양 상청(253G1 sup)(배지 교환 후 약 24시간 경과한 것) 및 각각의 컨트롤 배지를 1 mL씩 취하고, rBC2LCN 고정화 비드와 혼합하고, 실온에서 3시간 반응시켰다. 반응 후 비드를 0.2％ SDS 100 μL에서 95℃ 5분간 가열하여, 결합 분획을 용출시켰다. 결합 분획 10 μL를 아크리아미드겔로 전기 영동하고, 은 염색과, HRP-rABA 또는 HRP-rSRL에 의한 블롯을 행하였다.

결과를 도 12의 A 내지 C에 나타내었다. HRP-rABA 및 HRP-rSRL에 의한 블롯으로서는 240 kDa 이상의 분자량을 갖는 분자가 시그널을 나타내었다 (B, C 참조).

또한, 항포도칼릭신 항체로 블로팅한 결과를 도 12D에 나타내었다. 240 kDa 이상의 분자량을 나타내는 분자로 시그널이 인정되고, 이 분자가 포도칼리신 단백질 또는 포도칼리신 단백질의 일부인 것이 명백하였다.

이 결과로부터, 미분화 당쇄 마커의 하나로서, 포도칼릭신이 동정되었다. 포도칼릭신은 1형 막관통형 당단백질로, 발 세포로서 알려진 상피성 사구체 세포로부터 동정되고, 사구체의 기능·형태의 유지에 있어서 중요한 역할을 하고 있는 외에, 여러 가지 암의 발달에도 관계하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 8 참조).

또한, 본 실시예의 결과 및 포도칼릭신의 알칼리 소화를 행한 실험의 결과로부터, 포도칼릭신은 수식 당쇄의 구조 중에 「Fucα1-2Galβ1-3GalNAc(H타입3당쇄)」를 포함하는 것으로 예상되었다. 또한, H타입1당쇄가 포도칼릭신에 존재하고 있는지의 여부는 불분명하다.

본 실시예에 있어서, H타입3당쇄를 갖는 포도칼릭신이 동정된 것은 미분화 세포를 검출하기 위한 프로브로서, 항포도칼릭신 항체이며, 포도칼릭신의 H타입3당쇄의 수식 부위를 특이적으로 인식하는 항체를 이용할 수 있는 가능성을 보이고 있다.

(실시예 9) rBC2LCN의 결합 특성의 해석

본 실시예에서는 rBC2LCN이 인식하는 당쇄 구조의 해석을 행하였다.

다테노(Tateno) 등의 방법(비특허문헌 7 참조)에 따라서, rBC2LCN을 NHS-activated Sepharose 4FF(GE)에 고정화하고, 미니 칼럼(내부 직경, 2mm; 길이 10 mm, 베드 볼륨, 31.4 μl)에 채운 후, 고속 액체 크로마토그래피에 접속하였다. 인간 iPS 세포(201B7)로부터 단리한 피리딜아미노화 당쇄를 칼럼에 주입하고, 여기285 nm, 형광 350 nm에서 형광 검출하였다. 해석 결과, rBC2LCN은 iPS 세포로부터 단리한 H타입3을 포함하는 O형 당쇄에 대하여 Ka=2.5 x 10⁴ M^-1의 친화성으로 결합하는 것을 알 수 있었다 (도 13 참조).

도 13(A)에서, 점선은 컨트롤 PA화 당쇄인 Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4 GlcNAcβ1-4GlcNAc-PA의 용출 프로파일을 나타낸다. 실선은 iPS 세포로부터 단리한 PA화 당쇄인 Fucα1-2Galβ1-3(Galβ1-3GlcNAcβ1-6)GalNAc-PA의 용출 프로파일을 나타낸다. 또한, 도 13(B)는 Fucα1-2Galβ1-3(Galβ1-3GlcNAcβ1-6)GalNAc-PA(H타입3을 포함하는 O형 당쇄)의 모식도이다. 원은 갈락토스, 흰 사각은 N-아세틸갈락토사민, 검은 사각은 N-아세틸글루코사민, 삼각은 푸코스를 나타낸다. 또한, 갈락토스와 N-아세틸글루코사민, 갈락토스와 N-아세틸갈락토사민 사이의 굵은 선은 β결합, 갈락토스와 푸코스 사이의 가는 선은 α결합을 나타낸다.

(참고 실시예 10) 천연형 렉틴을 사용한 비교 실험

본 참고 실시예에서는 렉틴렉틴 샌드위치법에 있어서, 당쇄를 갖는 렉틴을 사용한 경우의 문제점을 검증하였다.

96종류의 렉틴이 슬라이드 글라스 상에 고정화된 고밀도 천연형 렉틴 어레이(비특허문헌 1 참조)에 PNGaseF를 적하하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 후 1회 세정을 행하여, Cy3 라벨화 조환형 렉틴(rOrysata)을 적하하고, 20℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 후 2회 세정을 행하여, GlycoStation^TM Reader 1200(GP BioSciences)으로 형광 강도를 측정하였다. 또한, 비교로서 PNGase 처리를 행하지 않은 고밀도 천연형 렉틴 어레이를 사용하여 같은 조작을 행하였다.

그 결과, PNGaseF 처리를 행하지 않은 렉틴 어레이에서는 SSA, SNA, RCA120, MCA에서 시그널이 검출되고, rOrysata가 이들 4개의 렉틴에 결합하고 있었다. 한편, PNGaseF 처리를 행한 렉틴 어레이에서는 SSA, SNA, RCA120, MCA로부터의 시그널이 소실하였다. 이것은 렉틴렉틴 샌드위치법에 있어서 당쇄를 갖는 렉틴을 사용한 경우에는 렉틴끼리 검출 대상 물질을 통하는 일없이, 당해 렉틴 자신이 갖는 당쇄를 통해 결합하여 목적으로 하지 않는 복합체를 형성해 버리는 것을 나타내는 것이다. 즉, 렉틴렉틴 샌드위치법에 있어서 천연형 렉틴을 사용하면, 당쇄 검출에서 의양성이 생길 가능성이 높아 지는 것이 분명했다.

(실시예 11) 렉틴 샌드위치법(당쇄 제거 천연형 렉틴)

본 참고 실시예에서는 천연형 렉틴 어레이를 당 분해 효소로 처리하여 얻은 개변형 렉틴 어레이를 사용하여, 렉틴렉틴 샌드위치법에 의한 당단백질의 검출을 행하였다.

참고 실시예 10에서 사용한 천연형 렉틴 어레이에 PNGaseF를 적하하고, 37℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 인큐베이션 후, 2회 세정을 행하여, 티로글로불린(10 μg/mL)을 적하하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 반응 후 2회 세정을 행하여, Cy3 라벨화 조환형 렉틴(rOrysata)을 적하하고, 20℃에서 3시간 반응시켰다. 반응후 2회 세정을 행하여, GlycoStation^TM Reader 1200(GP BioSciences)으로 형광 강도를 측정하였다. 또한, 비교로서 티로글로불린을 적하하지 않고서 같은 조작을 행하여, 티로글로불린을 적하한 어레이로 얻어진 형광 강도값(Signal)과 적하하지 않은 어레이로 얻어진 형광 강도값(Noise)의 비(S/N 비)를 산출하였다. 또한, 티로글로빈의 당쇄 구조로부터, SSA, SNA, RCA120, MCA 및 rOrysata는 모두 티로글로 빈에 대하여 결합성을 갖는다고 예상되었다.

결과를 「표 2」에 나타내었다.

PNGaseF 처리를 행하지 않은 렉틴 어레이의 SSA(천연형 렉틴)에서의 S/N비는 약 1.9였다. 이에 비하여, PNGaseF 처리를 행한 렉틴 어레이의 SSA(당쇄 제거 천연형 렉틴)에서 S/N비는 약 8.0으로 현저히 개선되었다. 마찬가지로, SNA, RCA120, MCA에 대해서도, PNGaseF 처리를 행한 렉틴 어레이에서는 PNGaseF 처리를 행하지 않은 렉틴 어레이에 비하여, 티로글로불린 검출의 S/N비가 현저히 개선되었다.

이 결과 및 실시예 10의 결과로부터, PNGaseF 처리를 행하지 않은 어레이에서는 rOrysata(검출용 렉틴)가 티로글로불린(검출 대상 물질)을 통하는 일없이 SSA, SNA, RCA120, MCA(포착용 렉틴)에 직접 결합하여, 노이즈가 발생하고 있는 것을 생각할 수 있다. 이에 비하여, PNGaseF 처리를 행한 어레이에서는 포착용 렉틴의 당쇄 제거에 의해서, 검출용 렉틴과 포착용 렉틴의 직접 결합이 방지되고, 포착용 렉틴과 검출 대상 물질과 검출용 렉틴의 복합체로부터 생기는 시그널을 고감도로 검출할 수 있었다.

본 실시예의 결과로부터, 렉틴-렉틴 샌드위치 어세이를 행하는 경우에는, 렉틴의 당쇄의 영향을 배제함으로써, 사용하는 렉틴의 당쇄에 다른 렉틴이 결합해 버리는 것을 방지하여, 측정의 백그라운드를 낮게 억제하고, 고감도로 검출 대상 물질을 측정할 수 있는 것이 분명해졌다.

1: 복합체 1(렉틴(L₁)과 검출 대상 물질(T)의 복합체)
2: 복합체 2(렉틴(L₁)과 검출 대상 물질(T)과 렉틴(L₂)의 복합체)
L₁: 렉틴 1,
L₂: 렉틴 2
G₁, G₂: 당쇄 구조
S: 고상 표면
T: 검출 대상 물질

SEQUENCE LISTING <110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) <120> THE METHODS FOR DETECTION OF UNDIFFERENTIATED CELLS AND FOR DETECTION OF GLYCOCONJUGATES <130> PSK-9020WO <150> JP2011-239919 <151> 2011-11-01 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 156 <212> PRT <213> Burkholderia cenocepacia <400> 1 Met Pro Leu Leu Ser Ala Ser Ile Val Ser Ala Pro Val Val Thr Ser 1 5 10 15 Glu Thr Tyr Val Asp Ile Pro Gly Leu Tyr Leu Asp Val Ala Lys Ala 20 25 30 Gly Ile Arg Asp Gly Lys Leu Gln Val Ile Leu Asn Val Pro Thr Pro 35 40 45 Tyr Ala Thr Gly Asn Asn Phe Pro Gly Ile Tyr Phe Ala Ile Ala Thr 50 55 60 Asn Gln Gly Val Val Ala Asp Gly Cys Phe Thr Tyr Ser Ser Lys Val 65 70 75 80 Pro Glu Ser Thr Gly Arg Met Pro Phe Thr Leu Val Ala Thr Ile Asp 85 90 95 Val Gly Ser Gly Val Thr Phe Val Lys Gly Gln Trp Lys Ser Val Arg 100 105 110 Gly Ser Ala Met His Ile Asp Ser Tyr Ala Ser Leu Ser Ala Ile Trp 115 120 125 Gly Thr Ala Ala Pro Ser Ser Gln Gly Ser Gly Asn Gln Gly Ala Glu 130 135 140 Thr Gly Gly Thr Gly Ala Gly Asn Ile Gly Gly Gly 145 150 155 <210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Agaricus bisporus <400> 2 Met Thr Tyr Thr Ile Ser Ile Arg Val Tyr Gln Thr Thr Pro Lys Gly 1 5 10 15 Phe Phe Arg Pro Val Glu Arg Thr Asn Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly 20 25 30 Thr Trp Asp Glu Val Arg Gly Glu Tyr Val Leu Thr Met Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Ser Gly Ser Leu Arg Phe Val Ser Ser Asp Thr Asp Glu Ser 50 55 60 Phe Val Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile 65 70 75 80 Val Thr Asn Leu Thr Asn Glu Gln Thr Ala Leu Val Ile Asn Gln Glu 85 90 95 Tyr Tyr Gly Val Pro Ile Arg Asp Gln Ala Arg Glu Asn Gln Leu Thr 100 105 110 Ser Tyr Asn Val Ala Asn Ala Lys Gly Arg Arg Phe Ala Ile Glu Tyr 115 120 125 Thr Val Thr Glu Gly Asp Asn Leu Lys Ala Asn Leu Ile Ile Gly 130 135 140 <210> 3 <211> 146 <212> PRT <213> Xerocomus chrysenteron <400> 3 Met Gly His Met Ser Tyr Ser Ile Thr Leu Arg Val Tyr Gln Thr Asn 1 5 10 15 Arg Asp Arg Gly Tyr Phe Ser Ile Val Glu Lys Thr Val Trp His Phe 20 25 30 Ala Asn Gly Gly Thr Trp Ser Glu Ala Asn Gly Ala His Thr Leu Thr 35 40 45 Gln Gly Gly Ser Gly Thr Ser Gly Val Leu Arg Phe Leu Ser Thr Lys 50 55 60 Gly Glu Arg Ile Thr Val Ala Val Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp 65 70 75 80 Cys Asp Val Val Thr Gly Leu Lys Pro Asp Glu Thr Ala Leu Val Ile 85 90 95 Asn Pro Gln Tyr Tyr Asn Asn Gly Gly Arg Asp Tyr Val Arg Glu Lys 100 105 110 Gln Leu Ala Glu Tyr Ser Val Thr Ser Ala Ile Gly Thr Lys Val Glu 115 120 125 Val Val Tyr Thr Val Ala Glu Gly Asn Asn Leu Glu Ala Asn Val Ile 130 135 140 Phe Ser 145 <210> 4 <211> 142 <212> PRT <213> Sclerotium rolfsii <400> 4 Met Thr Tyr Lys Ile Thr Val Arg Val Tyr Gln Thr Asn Pro Asn Ala 1 5 10 15 Phe Phe His Pro Val Glu Lys Thr Val Trp Lys Tyr Ala Asn Gly Gly 20 25 30 Thr Trp Thr Ile Thr Asp Asp Gln His Val Leu Thr Met Gly Gly Ser 35 40 45 Gly Thr Ser Gly Thr Leu Arg Phe His Ala Asp Asn Gly Glu Ser Phe 50 55 60 Thr Ala Thr Phe Gly Val His Asn Tyr Lys Arg Trp Cys Asp Ile Val 65 70 75 80 Thr Asn Leu Ala Ala Asp Glu Thr Gly Met Val Ile Asn Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Ser Gln Lys Asn Arg Glu Glu Ala Arg Glu Arg Gln Leu Ser Asn 100 105 110 Tyr Glu Val Lys Asn Ala Lys Gly Arg Asn Phe Glu Ile Val Tyr Thr 115 120 125 Glu Ala Glu Gly Asn Asp Leu His Ala Asn Leu Ile Ile Gly 130 135 140 <210> 5 <211> 150 <212> PRT <213> Coprinopsis cinerea <400> 5 Met Leu Tyr His Leu Phe Val Asn Asn Gln Val Lys Leu Gln Asn Asp 1 5 10 15 Phe Lys Pro Glu Ser Val Ala Ala Ile Arg Ser Ser Ala Phe Asn Ser 20 25 30 Lys Gly Gly Thr Thr Val Phe Asn Phe Leu Ser Ala Gly Glu Asn Ile 35 40 45 Leu Leu His Ile Ser Ile Arg Pro Gly Glu Asn Val Ile Val Phe Asn 50 55 60 Ser Arg Leu Lys Asn Gly Ala Trp Gly Pro Glu Glu Arg Ile Pro Tyr 65 70 75 80 Ala Glu Lys Phe Arg Pro Pro Asn Pro Ser Ile Thr Val Ile Asp His 85 90 95 Gly Asp Arg Phe Gln Ile Arg Phe Asp Tyr Gly Thr Ser Ile Tyr Tyr 100 105 110 Asn Lys Arg Ile Lys Glu Asn Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Asn Ala Glu 115 120 125 Asn Ser Leu Phe Ser Ser Pro Val Thr Val Asp Val His Gly Leu Leu 130 135 140 Pro Pro Leu Pro Pro Ala 145 150

Claims

줄기 세포의 배양 상청 중의 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 미분화 당쇄 마커의 존재 유무 또는 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 줄기 세포의 분화 상태를 판별하는 방법.
[화학식 1]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타냄)
[화학식 2]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타냄)
제1항에 있어서, 상기 미분화 당쇄 마커의 유무 또는 존재량을 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질을 이용하여 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제2항에 있어서, 상기 단백질이 하기의 단백질인 방법.
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포의 배양 상청이 당해 줄기 세포에 대하여 분화 유도 처리를 실시한 후의 배양 상청인 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 포도칼릭신(podocalyxin)에서 유래되는 상기 화학식 1 또는/및 화학식 2로 표시되는 상기 미분화 당쇄 마커의 존재 유무 또는 존재량을 측정하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화 당쇄 마커를,
상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하고,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 당쇄를 갖지 않는,
단백질을 이용한 렉틴렉틴 샌드위치법에 의해 검출하는 것을 특징으로 하는, 방법.
분화 유도 처리를 실시한 줄기 세포의 배양 상청 중의 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 미분화 당쇄 마커가 존재하지 않는 것을 확인하여 채취하는 것을 특징으로 하는, 미분화 세포가 혼입하지 않은 분화 세포의 취득 방법.
[화학식 1]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타냄)
[화학식 2]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타냄)
제7항에 있어서, 상기 미분화 당쇄 마커가 존재하지 않는 것의 확인을, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질을 이용하여 행하는 것을 특징으로 하는, 방법.
줄기 세포의 분화 상태를 판별하는 방법에 이용하기 위한 키트로서, 하기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
[화학식 1]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타냄)
[화학식 2]

(화학식 중, R1은 OH기, 또는 임의의 당쇄를 나타내고, R2는 OH기, 또는 임의의 당쇄, 단백질, 지질, 또는 다른 분자를 나타냄)
제9항에 있어서, 상기 단백질이 하기의 단백질인 키트.
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열, 또는 당해 아미노산 서열의 1 또는 수개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 당쇄 구조를 특이적으로 인식하는 단백질
당쇄를 갖는 검출 대상 물질과 상기 당쇄에 대하여 결합성을 갖는 렉틴 1 및 렉틴 2를 접촉시켜, 상기 렉틴 1과, 상기 검출 대상 물질과 상기 렉틴 2로 구성되는 복합체를 형성시키고, 상기 복합체를 검출함으로써 행하는 상기 검출 대상 물질의 검출 방법으로서,
상기 렉틴 1 및 상기 렉틴 2의 적어도 한쪽은 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 검출 방법.
제11항에 있어서, 상기 검출 대상 물질이 당단백질, 당지질, 프로테오글리칸, 글리코펩타이드, 리포다당, 펩타이드글리칸 및 스테로이드 화합물에 당쇄가 결합한 배당체로 이루어지는 군에서 선택되는 복합 당질인 검출 방법.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 렉틴 1과 상기 렉틴 2가 서로 다른 당쇄 구조에 대한 결합성을 갖는 것인 검출 방법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 당쇄를 갖지 않는 렉틴이 원핵 세포로 발현한 조환형 렉틴, 또는 천연형 단백질의 당쇄 구조를 개변하여 얻은 개변형 렉틴인 검출 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 대상 물질과, 불용성 담체에 결합한, 당쇄를 갖지 않는 상기 렉틴 1과, 불용성 담체에 결합하지 않은 상기 렉틴 2를 접촉시켜 상기 복합체를 형성시키고, 상기 복합체를 검출함으로써 행하는 검출 방법.
제15항에 있어서, 상기 검출 대상 물질과, 불용성 담체에 결합한, 당쇄를 갖지 않는 상기 렉틴 1을 접촉시켜, 상기 렉틴 1과 상기 검출 대상 물질로 구성되는 복합체 1을 얻는 제1 절차와,
상기 복합체 1과 상기 렉틴 2를 접촉시켜, 상기 렉틴 1과, 상기 검출 대상 물질과 상기 렉틴 2로 구성되는 복합체 2를 얻는 제2 절차를 포함하는 검출 방법.
제11항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 렉틴 1과 상기 렉틴 2의 둘다가 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 검출 방법.
당쇄를 갖는 검출 대상 물질의 검출에 이용되는 키트로서, 상기 당쇄에 대하여 결합성을 갖는 렉틴 1 및 렉틴 2를 포함하고, 상기 렉틴 1 및 상기 렉틴 2의 적어도 한쪽은 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 키트.
제18항에 있어서, 불용성 담체와,
상기 불용성 담체에 결합한, 당쇄를 갖지 않는 상기 렉틴 1과,
상기 불용성 담체에 결합하지 않은 렉틴 2
를 포함하는 키트.
제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 렉틴 1과 상기 렉틴 2의 둘다가 당쇄를 갖지 않는 렉틴인 키트.