CN108138240A - 用于评估多能干细胞的遗传完整性的无创方法 - Google Patents

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S·阿苏
N·吉劳
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Universite de Montpellier I
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Universite de Montpellier
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National Medical And Health Research Institute
Universite de Montpellier I
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Abstract

本发明涉及一种用于评估培养物中多能干细胞质量的新颖的无创方法。更具体地，本发明涉及用于评估培养物中多能干细胞的遗传完整性的无创方法。

Description

用于评估多能干细胞的遗传完整性的无创方法
技术领域
本发明总体涉及再生医学领域。更具体地，本发明涉及用于测定多能干细胞的质量的无创方法和试剂盒。更具体地，本发明涉及用于评估培养物中多能干细胞的遗传完整性的无创方法和试剂盒。
背景技术
人多能干细胞(hPSC)研究通过产生用于移植的人细胞或启动药物发现为帮助理解和治疗影响体内不同细胞类型的疾病提供了新的工具。PSC(从废弃胚胎分离的内细胞团，即人胚胎干细胞(hESC)，或源自分化细胞，即诱导的多能干细胞(iPSC))具有迅速扩增的非凡能力。在实际水平，这意味着可以从一个细胞系产生制备数千、甚至成数十万的治疗学细胞剂量的足够细胞。已经进行或目前正在进行使用hESC的分化衍生物的若干临床试验：Geron公司(NCT01217008)测试了hESC衍生的少突细胞在脊髓损伤患者中的安全性。Advanced Cell Technology(ACT)测试了hESC衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞疗法对于Stargardt黄斑营养不良(SMD)(美国试验:NCT01345006；英国试验:NCT01469832；韩国试验:NCT01625559)和干性年龄相关的黄斑变性(美国试验:NCT01344993；韩国试验:NCT01674829)的安全性。Viacyte正在测试胰岛素产生细胞在患有I型糖尿病的受试者中的安全性和功效(美国试验：NCT02239354)。Philippe Ménasché开始测试(NCT02057900)在严重的心力衰竭中移植人胚胎干细胞衍生的祖细胞。Pfizer(NCT01691261)研究利用源自hESC的移植的视网膜细胞治疗患有晚期Stargardt病的患者的安全性。最后，一项由来自RIKEN研究所的Masayo Takahashi进行的研究最近在日本开始，其测试在患有渗出型(湿型)年龄相关的黄斑变性(AMD)的患者中移植自体诱导的多能干细胞(iPSC)衍生的视网膜色素上皮(RPE)细胞片的安全性。
所有这些临床试验表明生物医学潜力是巨大的，但若干实际问题仍待解决。最大问题之一是遗传异常。
遗传异常是hPSC用于再生医学的严重问题。如果hPSC克隆显示遗传异常，这些细胞及其分化的子代可能不能可靠地复制正常成人的组织生理，在临床场景中使用这些细胞甚至可能是威胁。因此，必须测定这种细胞中遗传异常的起因和程度。遗传畸变可以分成两种类型，通过细胞培养诱导的那些和通过细胞重编程过程诱导的那些。
人ESC在起源时是核型正常的；然而，在细胞培养期间可能出现非整倍的hESC克隆。自2004年以来，若干研究报道用于扩增未分化hPSC的培养条件对染色体稳定性具有重要影响。这种染色体异常经常再现。利用标准的细胞遗传学程序(G-分带)常常检测到染色体12(最常见12p)、17(尤其是17q)、20或X增多(Draper等,2004)。40个hESC系的大规模研究(其中分析了1163个核型)总结，12.9％的hESC培养物显示染色体畸变(Taapken等,2011)。在过去的五年中，用基于阵列的技术(也称为虚拟核型)改进了基因组变化检测的分辨率。基于阵列的比较基因组杂交(aCGH)或单核苷酸多态性(SNP)阵列允许鉴定小型基因组畸变，并表明hPSC中DNA改变的频率甚至可能远高于之前所认为的(Laurent等,2011；Narva等,2010)。这些小型染色体变化中，已经鉴定了位于染色体20q11.21处的经常出现的拷贝数变异(CNV)(Lefort等,2008；Spits等,2008)。20q11.21区也在各种癌症中扩增。此外，已经表明20q11.2的获得发生于早期子宫颈癌。点突变还有助于适应过程。近年来，完整的外显子组或完整的基因组再测序为鉴定hPSC中单个碱基对突变提供了空前的分辨率(Cheng等,2012；Funk等,2012；Gore等,2011)。通过细胞重编程产生iPS为其他可能的突变源开辟了道路。通过利用CGH微阵列(Martins-Taylor和Xu,2010；Pasi等,2011)、SNP微阵列(Hussein等,2011；Laurent等,2011)或下一代测序技术(Gore等,2011；Ji等,2012)的详细分析表明，更微妙的异常例如拷贝数变异(CNV)和突变在iPS细胞中的发生频率比之前所认为的高得多。然而，通过细胞重编程诱导的突变的准确载荷具有很大争论(Bai等,2013)。尽管如此，hiPS也可以在细胞培养期间积累遗传变化。
这些遗传异常是很大的问题，因为任何DNA突变都可能是恶性转化过程中的步骤。此外，一些异常高度再现，表明由细胞存活、细胞增殖或阻断分化介导的强大选择压力。这些功能性改变可以增加PSC恶性转化的易感性并改变它们预期的治疗学性质。
多能干细胞DNA完整性主要通过核型分析评估。已经测试了其他方法来克服经典核型分析技术例如CGH阵列或SNP微阵列的明显的分辨率限制；然而，没有统一的方法以用于区分实际令人担心的、可能致癌的突变和对PSC的生物学性能没有或几乎没有任何影响的DNA修饰，或简单的多态性。由于DNA测序技术及其分辨率(单碱基分辨率的全基因组地图)正在快速提高且其价格快速降低，我们可以预期有一天PSC的常规分析将依赖于全基因组测序。然而，这些技术都有很强的局限性。例如，经典核型分析技术耗时，需要细胞遗传学家的专业知识，且不能检测长度小于5Mb的异常。基于微阵列的方法需要核心设备和致力于分析的生物信息专家。最后，高通量测序技术例如NGS尚未优化此用途，且处理数据所需的时间很长，而且也需要生物信息专家。
因此，强烈需要能够检测hPSC中最经常再现的异常的快速、廉价和无创(不破坏细胞)的方法。
发明简述
本发明涉及用于测定多能干细胞的质量的无创方法和试剂盒。
本发明还涉及用于评估培养物中多能干细胞的遗传完整性的无创方法和试剂盒。
发明详述
通过自我更新永存但能够分化成特定组织的成熟细胞的多能干细胞(PSC)是再生医学的关键工具。再生医学是使机体修复、替换、恢复和再生受损或有病细胞、组织和器官的创新的医学疗法的广泛定义。然而，细胞培养可能导致可以改变干细胞性质或使它们倾向于肿瘤形成的表观和遗传的异常。随着PSC在临床使用中的快速扩张，改进细胞扩增期间和批次释放之前表征多能干细胞(PSC)的工具是适时的。
发明人测定了人多能干细胞(hPSC)中的一组“超再现序列(hyper-recurrentsequences)”，其是培养物中hPSC不稳定性的生物标志物(表1)，并提出了可用于在培养期间和临床使用之前常规评估干细胞的快速且容易进行的测试。
表1：40个超再现序列的列表。
位置表示基于人基因组结构37(GRCh37/hg19)的扩增的5'端。
序列 名称 染色体 开始 结束 大小
S1 Chr12:37868436-38954035 chr12 37868436 38954035 1085599
S2 Chr12:31248370-33127685 chr12 31248370 33127685 1879315
S3 Chr12:103681877-104694741 chr12 103681877 104694741 1012864
S4 Chr17:56720571-58041412 chr17 56720571 58041412 1320841
S5 Chr17:18387206-20281117 chr17 18387206 21243600 2856394
S6 Chr17:6500001-10700000 chr17 6500001 10700000 4199999
S7 ChrX:6451571-7623882 chrX 6451571 7623882 1172311
S8 Chr20:29846339-31316340 chr20 29846339 31316340 1470001
S9 chr20:29267955-30375868 chr20 29267955 62166322 32898367
S10 Chr1:201725542-203350641 chr1 201725542 203350641 1625099
S11 Chr1:144045189-145290292 chr1 144045189 145290292 1245103
S12 Chr1:55908317-57681060 chr1 55908317 57681060 1772743
S13 Chr7:135120003-136737366 chr7 135120003 136737366 1617363
S14 Chr7:1-2800000 chr1 1 28000000 27999999
S15 Chr7:69817651-70852210 chr7 69817651 70852210 1034559
S16 Chr5:69342002-70409630 chr5 69342002 70496687 1154685
S17 Chr5:133166096-135117724 chr5 133166096 135117724 1951628
S18 Chr6:162765665-164166909 chr6 162765665 164166909 1401244
S19 Chr6:119517636-121231501 chr6 119517636 121231501 1713865
S20 Chr8:23538410-24752559 chr8 23538410 24752559 1214149
S21 Chr8:144247611-145708651 chr8 144247611 145708651 1461040
S22 Chr9:44391266-46306410 chr9 44391266 46306410 1915144
S23 Chr9:68317831-69630327 chr9 68317831 69978010 1660179
S24 chr10:46388145-47479792 chr10 46388145 47484886 1096741
S25 chr10:64199868-65487432 chr10 64199868 65487432 1287564
S26 Chr11:48970262-51052887 chr11 48970262 51052887 2082625
S27 Chr13:108583470-110381343 chr13 108583470 110381343 1797873
S28 Chr14:19377573-20399480 chr14 19377573 20399480 1021907
S29 Chr16:32049230-33693642 chr16 32049230 34079200 2029970
S30 Chr16:32000261-33537523 chr16 32000261 33736180 1735919
S31 Chr15:18828463-19840461 chr15 18828463 20095423 1266960
S32 chr15:20935078-22210804 chr15 20935078 22210804 1275726
S33 Chr18:57994812-59707736 chr18 57994812 59707736 1712924
S34 Chr2:90134268-91622003 chr2 90134268 91622003 1487735
S35 Chr2:89133113-90135873 chr2 89133113 90211593 1078480
S36 Chr4:123413720-124418903 chr4 123413720 124418903 1005183
S37 Chr4:93113276-94193881 chr4 93113276 94193881 1080605
S38 Chr19:45074171-46122773 chr19 45074171 46122773 1048602
S39 Chr3:36600001-38600000 chr3 36600001 38600000 1999999
S40 Chr21:11084669-14603577 chr21 11084669 14642464 3557795
因此，本发明涉及用于测定多能干细胞的质量的体外无创方法，包括步骤：i)提供培养多能干细胞的培养样品，ii)从样品提取核酸和iii)测定核酸提取物中至少一种遗传异常的存在和/或水平。
如本文所使用，术语“多能干细胞”或“PSC”具有其在本领域的一般含义，是指多能细胞例如胚胎干细胞(ESC)和诱导的多能干细胞(iPSC)，其能够分化成人体中的任何细胞类型。术语“多能”是指能够分化成多种不同细胞类型之一的细胞，尽管不一定是所有细胞类型。用于本发明的细胞包括但不限于心肌细胞及其祖细胞；神经祖细胞；胰岛细胞，特别是胰腺β细胞；造血干细胞和祖细胞；间质干细胞；和肌肉卫星细胞。本发明方法适用于多能干细胞，但也适用于其他干细胞、生殖细胞或体细胞(例如，间质干细胞(MSC)、卵母细胞、胚胎、成纤维细胞…)。
“测定多能干细胞的质量”是指本发明方法旨在测定多能干细胞是否携带再生医学范围内的遗传异常或特定序列。本发明方法允许评估培养物中多能干细胞的遗传完整性和遗传稳定性。
如本文所使用，术语“遗传异常”是指可以存在于个体和多能干细胞的基因组中的可以引起表型疾病和致死性的任何事件。遗传异常包括但不限于：三体、易位、四体、非整倍体、部分非整倍体、单染色体、核型异常、具同形双着丝粒的染色体、等臂染色体、倒置、插入、复制、缺失、拷贝数变异(CNV)、染色体易位、单核苷酸变异(SNV)和杂合性缺失(LOH)。通常，术语“遗传异常”是指如表1所描述的超再现序列。
术语“培养样品”是指培养上清液、培养基和培养物中悬浮的细胞。
如本文所使用，术语“核酸”具有其在本领域的一般含义，是指编码或非编码核酸序列。核酸包括DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)。因此，核酸的实例包括但不限于DNA、mRNA、tRNA、rRNA、tmRNA、miRNA、piRNA、snoRNA和snRNA。术语“核酸”还涉及游离核酸(fNA)(来源于细胞核或来源于细胞的线粒体室)，例如细胞游离DNA、游离RNA分子、microRNA和长的非编码RNA。“游离核酸”是指由多能干细胞释放并存在于其中生长多能干细胞的培养基中的核酸。
本领域技术人员可使用本领域熟知的任何方法从制备的样品提取游离的细胞核酸。例如，可以使用实施例中描述的方法。
在具体的实施方式中，本发明方法包括步骤i)测定核酸提取物中至少一个超再现序列的存在，和ii)当检测到至少一个超再现序列时，断定所述多能干细胞携带遗传异常。
通常，可从表1选择2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个超再现序列。
可以通过本领域熟知的各种技术来测定核酸提取物中超再现序列的存在和水平。在具体的实施方式中，可进行液滴数字PCR“ddPCR”来测定核酸提取物中超再现序列的存在和水平。ddPCR是指本文使用的允许定量上清液或培养基中的DNA序列的方法或装置。
也可以通过技术例如Fluidigm、定量PCR、高通量双端测序、下一代测序和毛细管电泳来测定核酸提取物中超再现序列的存在和水平。
用于检测核酸尤其是DNA或mRNA中超再现序列的典型技术包括但不限于限制性片段长度多态性、杂交技术、测序、核酸外切酶抗性、微量测序、利用ddNTP的固相延伸、利用ddNTP的溶液中延伸、寡核苷酸分析、检测单核苷酸多形性的方法例如动态等位基因特异性杂交、连接链反应、微测序、DNA“芯片”、使用单或双标记探针的等位基因特异性寡核苷酸杂交与PCR结合，或与分子信标结合，等等。
通常，在扩增后检测超再现序列。例如，可以将分离的RNA进行偶联的反转录和扩增，例如利用对于超再现序列特异的或能够扩增包含超再现序列的区域的特异性寡核苷酸引物，通过聚合酶链反应(RT-PCR)的反转录和扩增。根据第一个选择，可以选择引物的退火条件以确保特异性的反转录(当适当时)和扩增；使得扩增产物的出现诊断出特异性超再现序列的存在。或者，可以反转录和扩增RNA，或扩增DNA，然后通过与合适的探针杂交或通过直接测序或本领域已知的任何其他合适的方法在扩增序列中检测超再现序列。例如，可以克隆并测序从RNA获得的cDNA以鉴定超再现序列。
尤其是，测序是可用于本发明上下文的理想技术。本领域技术人员熟悉测序多核苷酸的若干方法。这些包括但不限于Sanger测序(也称为双脱氧测序)和Metzger综述的各种边合成边测序(SBS)方法(Metzger ML 2005,Genome Research 1767)；通过杂交、通过连接(例如WO 2005/021786)、通过降解(例如美国专利号5,622,824和6,140,053)测序；纳米孔测序。优选地，多重分析深度测序是优选的。术语“深度测序”是指同时测序多个核酸的方法。例如参见Bentley等,Nature 2008,456:53-59。由Roche/454(Margulies等,2005a)、Illumina/Solexa(Bentley等,2008)、Life/APG(SOLiD)(McKernan等,2009)和PacificBiosciences(Eid等,2009)制备的主要的可商购平台可用于深度测序。例如，在454方法中，将待测序DNA分馏并与适配子一起提供，或利用包含适配子的引物PCR扩增DNA片断。适配子是结合DNA捕获珠和与乳剂PCR扩增引物和测序引物退火所需的核苷酸25聚体。将DNA片段制成单链，并以仅允许一个DNA片段与一个珠子连接的方式将其与DNA捕获珠连接。接着，将包含珠子的DNA在油包水混合物中乳化，产生仅包含一个珠子的微型反应器。在微型反应器内，将片段PCR扩增，每个珠子产生几百万的拷贝数。PCR后，破坏乳剂并将珠子装载在微滴定板上。微滴定板的各孔可以仅包含一个珠子。将测序酶添加至孔，并以固定顺序使核苷酸流过孔。核苷酸的加入导致释放焦磷酸盐，其催化产生化学发光信号的反应。通过CCD照相机记录该信号，并用软件将信号翻译成DNA序列。在lllumina方法(Bentley(2008))中，将单链、适配子供应的片段附着于光学透明的表面并进行“桥扩增”。该过程导致几百万的簇，其各自包含独特DNA片段的拷贝。添加DNA聚合酶、引物和四个标记的可逆的终止子核苷酸，并通过激光荧光使表面成像以测定标记的位置和性质。然后去除保护基，并将过程重复若干循环。SOLiD法(Shendure(2005))类似于454测序，DNA片段在珠子表面上扩增。测序包括连接和检测标记探针的循环。目前正在开发用于高通量测序的若干其他技术。这些的实例是Helicos system(Harris(2008))、Complete Genomics(Drmanac(2010))和PacificBiosciences(Lundquist(2008))。由于这是一个发展非常快速的技术领域，高通量测序方法对本发明的适用性对于本领域技术人员将是显而易见的。
可通过多种熟知方法的任一种来测定核酸(特别是基因、miRNA、snRNA和snoRNA)的表达水平。通常，制备的核酸可用于杂交或扩增分析，包括但不限于，Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析例如定量PCR(TaqMan)和探针阵列例如GeneChip(TM)DNA阵列(AFFYMETRIX)。有利地，核酸表达水平的分析包括核酸扩增过程，例如通过RT-PCR(实验性实施方式显示于美国专利号4,683,202)、连接酶链式反应(BARANY,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.88,p:189-193,1991)、自持序列复制(GUATELLI等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.57,p:1874-1878,1990)、转录扩增系统(KWOH等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.86,p:1173-1177,1989)、Q-β复制酶(LIZARDI等,Biol.Technology,vol.6,p:1197,1988)、滚环复制(美国专利号5,854,033)或任何其他的核酸扩增方法，然后利用本领域技术人员熟知的技术检测扩增分子。优选实时定量或半定量RT-PCR。在具体的实施方式中，测定包含将样品与选择试剂例如探针或引物杂交，从而检测核酸的存在或测量核酸的含量。可以通过任何适合的装置例如板、微量滴定皿、试管、孔、玻璃、柱等进行杂交。与本文目标核酸显示序列互补性或同源性的核酸作为杂交探针或扩增引物。应理解，这种核酸不需要相同，但通常与大小相当的同源区域具有至少约80％同一性，更优选85％同一性并且甚至更优选90-95％同一性。在某些实施方式中，使用核酸与适当手段(例如可检测标记)的组合来检测杂交将是有利的。多种适当的指示剂是本领域已知的，包括荧光、放射性、酶促或其他的配体(例如抗生物素蛋白/生物素)。探针和引物对它们杂交的核酸而言是“特异性的”，即它们在严格杂交条件(相当于最高熔化温度-Tm-，例如，50％甲酰胺、5x或6x SCC。1x SCC是0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠)下优选杂交。许多定量分析可从Qiagen(S.A.Courtaboeuf,France)或Applied Biosystems(Foster City,USA)商购。核酸的表达水平可表示为绝对表达谱或标准化表达谱。通常，通过将其表达与非相关的核酸(例如组成型表达的管家mRNA)的表达相比较，通过校正目标核酸的绝对表达谱来标准化表达谱。用于标准化的适合的mRNA包括管家mRNA例如U6、U24、U48和S18。该标准化允许将一个样品例如患者样品中的表达谱与另一个样品比较，或来自不同来源的样品之间的比较。
探针和或引物通常用可检测分子或物质例如荧光分子、放射性分子或本领域已知的任何其他标记来标记。标记是本领域已知的，其通常提供(直接或间接)信号。术语“标记”旨在涵盖通过偶联(即物理连接)可检测物质的探针和引物的直接标记，以及通过与直接标记的另一个试剂反应的间接标记。可检测物质的实例包括但不限于放射性试剂或荧光基团(例如异硫氰酸荧光素(FITC)或藻红蛋白(PE)或吲哚菁(Cy5))。
本发明方法特别适用于测定多能干细胞培养物的质量，然后分离不含遗传异常的多能干细胞。如上描述的方法特别适用于避免破坏包含可以分离和培养的不含遗传异常的多能干细胞的多能干细胞培养物。
因此，本发明涉及分离不含遗传异常的多能干细胞的方法，包括步骤：
i)通过实施根据本发明的方法测定多能干细胞培养物中超再现序列的水平，
ii)将步骤i)测定的水平与参考值比较，
iii)当步骤i)测定的水平与参考值不同时，断定多能干细胞培养物包含不含遗传异常的多能干细胞，
iv)和分离所述不含遗传异常的多能干细胞。
分离多能干细胞的步骤可以通过本领域熟知的各种技术例如fluidigm技术来进行。
在具体的实施方式中，参考值是可以用实验方法、用经验或理论确定的阈值或截止值。阈值也可以基于现有实验条件任意选择，如本领域技术人员所认可的。必须测定阈值以获得基于测试的功能和效益/风险平衡(假阳性和假阴性的临床后果)的最佳灵敏度和特异性。通常，最佳灵敏度和特异性(以及阈值)可以使用基于实验数据的受试者工作特征(ROC)曲线来测定。优选地，本领域技术人员可以将(根据本发明方法获得的)核酸水平与限定的阈值进行比较。在本发明的一个实施方式中，阈值源自在携带遗传异常的多能干细胞培养物中测定的核酸水平(或比率、或得分)。此外，妥善储存的历史多能干细胞培养物中核酸水平(或比率、或得分)的回顾性测量可用于确定这些阈值。
本发明方法尤其适于获得临床决策。如本文所使用，术语“临床决策”是指采取或不采取行动的任何决策，其结果影响受试者的健康或生存。尤其是，在本发明的上下文中，临床决策是指是否将多能干细胞转移、移植、移植给受试者的决策。临床决策也可以是指进行进一步测试、采取行动减轻不期望的表型的决策。尤其是，如上描述的方法将因此帮助临床医生避免将携带遗传异常的多能干细胞转移到受试者。如上描述的方法还特别适于避免受试者被携带遗传异常的多能干细胞污染、避免由携带遗传异常的多能干细胞转移到受试者而引起的疾病例如恶性肿瘤的发展。如上描述的方法还特别适于通过施用多能干细胞而没有副作用地治疗需要的受试者。
如本文所使用，术语“受试者”是指哺乳动物。通常，根据本发明的受试者是指需要利用多能干细胞移植的再生治疗的任何受试者(优选人)。术语“受试者”也指其他哺乳动物例如灵长类动物、狗、猫、猪、母牛或小鼠。在具体的实施方式中，术语“受试者”是指患有或易患需要利用多能干细胞移植的再生治疗的疾病的受试者，例如脊髓损伤、Stargardt黄斑营养不良(SMD)、干性年龄相关性黄斑变性、I型糖尿病、心血管疾病例如心脏衰竭、晚期Stargardt病、渗出型(湿型)年龄相关性黄斑变性(AMD)、肌营养不良、神经病和视网膜病、肝病和糖尿病。
因此，本发明方法允许评估多能干细胞进行健康转移、接枝或移植到受试者的能力。本发明方法允许能被转移、接枝或移植到受试者的多能干细胞的遗传测试和选择。
通过实施本发明方法选择的多能干细胞和由其衍生的分化细胞在再生医学中获得应用。术语“再生医学”具有其在本领域的一般含义，是指与产生活的功能性细胞和组织以修复或代替由于年龄、疾病、损伤或先天性缺陷而丧失功能的细胞、组织或器官的过程有关的再生治疗。
因此，本发明还涉及用于将多能干细胞或由其衍生的分化细胞移植到需要再生治疗的受试者的方法，包括步骤：i)实施根据本发明的方法，ii)选择不含遗传异常的多能干细胞，和iii)向所述受试者施用步骤ii)选择的多能干细胞或由其衍生的分化细胞。
在进一步的方面，本发明方法特别适于利用多能干细胞移植以遗传异常转移的最低风险治疗需要再生治疗的受试者。本发明方法也适于利用多能干细胞移植以发展由转移携带遗传异常的多能干细胞引起的疾病例如恶性肿瘤的最低风险治疗需要再生治疗的受试者。
因此，本发明还涉及用于治疗需要再生治疗的受试者的疾病的方法，包括步骤：i)实施根据本发明的方法，ii)选择不含遗传异常的多能干细胞，和iii)向所述受试者施用步骤ii)选择的多能干细胞或由其衍生的分化细胞。
在进一步的方面，本发明涉及增强需要的受试者对再生治疗的反应的方法，包括步骤：i)实施根据本发明的方法，ii)选择不含遗传异常的多能干细胞，和iii)向所述受试者施用步骤ii)选择的多能干细胞或由其衍生的分化细胞。
本发明还涉及进行如上描述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于测定核酸提取物中至少一种遗传异常的存在和/或水平的工具。通常，所述试剂盒包括如上描述的探针、引物、巨阵列或微阵列。例如，试剂盒可以包含如上限定的一组探针，且其可以是预先标记的。或者，探针可以是无标记的，且用于标记的成分可以包括于试剂盒的单独的容器中。试剂盒可以进一步包含杂交试剂或具体的杂交方案所需的其他适当包装的试剂和材料，包括固相基质(如果适用)和标准。或者，本发明试剂盒可以包含可以预先标记或可以包含亲和纯化或附着部分的扩增引物(例如茎环引物)。试剂盒可以进一步包含扩增试剂以及具体的扩增方案所需的其他适当包装的试剂和材料。试剂盒可以进一步包含测定扩增是否发生所必需的工具。试剂盒还可以包含，例如，PCR缓冲液和酶；阳性对照序列、反应对照引物；和用于扩增和检测特定序列的说明书。
本发明将进一步通过以下附图和实施例来阐明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：工艺流程的示意图。预期使用上清液的基因组分析使培养物中的hPSC合格。收集hPSC上清液并提取总cfDNA。然后进行PCR。然后通过生物信息学分析结果以检测cfDNA中的生物标志物。
图2：SEAdb中收集的hPSC遗传异常的再现。颜色梯度：#研究；气泡大小：基因组区域的长度；Y：再现得分；X：染色体。
图3：对21条具有大多数遗传变化>1Mb的染色体，表1的40组序列(Sondes:S1-S40)覆盖了93.5％的染色体异常。
图4：检测和定量hPSC-上清液样品中的cfNA。在两种hPSC-上清液中，使用五个浓度(330pg、110pg、13pg、3.3pg和0.33pg)的来自人包皮成纤维细胞的DNA作为对照，评估人ALU-重复序列扩增。在Roche LC480上进行QPCR实验。在各循环获得荧光并相对于循环数作图。所测量的荧光的增加量与反应期间产生的PCR产物量成正比。hPSC中测量的cfNA浓度为(330pg-110pg)。
图5：三体20的基于上清液的检测。A.两个hPSC细胞系中代表性的异常核型：HD291(47,XY,+12)(左图)和HD129(47,XY,+20)(右图)。B.两个hPSC细胞系及其上清液中的ddPCR定量，其中使用仅对于三体20具有特异性的超再现序列。使用精确的重复三次的孔的拷贝数图表明，三体20仅存在于异常的hPSC细胞HD129及其上清液中，而不存在于HD291中。QuantaSoftTM软件产生的所有的误差条代表95％置信区间。
图6：QX200系统的高灵敏度允许使用特异性超再现序列定量hPSC上清液中的三体20。样品浓度作图表示为拷贝/μl。
具体实施方式
实施例1
方法：
HPSC培养和上清液收集
在无异种蛋白和完全确定成分的培养基(必要的8TM培养基)存在下，在GeltrexTM上的35mm孔中培养人PSC(hESC或iPSC)。将细胞机械分离并在大批培养物中生长，或酶促解离并适应单细胞传代。每天更新培养基。孵育不含hPSC的培养基作为对照。就在常规PSC传代之前从各孔收集1ml上清液(hPSC-调节的培养基)，并立即冷冻入无菌的不含DNA-、DNase-、RNase-、聚合酶链反应(PCR)抑制剂的管，在-80℃储存直到核酸纯化。采取适当的预防措施以预防样品被外来DNA污染。
核酸纯化
根据制造方案，使用QIAmp DNA Mini Blood Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从200μl上清液提取核酸。简言之，将20μl蛋白酶K和200μl缓冲液AL添加到各上清液。脉冲涡流15s后，将裂解混合物在eppendorf管(1.5ml)中于56℃孵育10min。高温下高度变质条件有利于核酸从任何结合的蛋白质中完全释放。向裂解液添加200μl冷乙醇(100％)后，将样品转移到QIAamp微型柱上。随着用6000g离心1min使裂解液通过，游离核酸吸附在膜上。两个洗涤步骤(在缓冲液AW1和缓冲液AW2)期间有效洗掉污染物。最后，将游离核酸洗脱在30μl缓冲液AE中并储存于-20℃。
游离核酸(cfNA)的定量
相对于通过定量PCR法(LC480,Roche)测定的ALU-115PCR产物的相应浓度评估各上清液中cfNA的浓度。为此目的，将1μl各cfNA洗脱样品添加到包含可商购2XLightCycler480SYBR Green I反应混合物(Roche Applied Science,Germany)和0.25μMUmetani等(2006)所描述的正向和反向ALU-引物的总体积为10μL的反应混合物中。通过EpMotion 5070液体操作工作站(Eppendorf)，在96孔白色板(Eppendorf)中设置反应。所有反应重复三次进行。在每次运行中包括阴性对照(不含RNAse/DNAse的水)。利用通过连续稀释从hPSC直接提取的基因组核酸获得的标准曲线测定上清液中cfNA浓度。
利用数字液滴PCR系统(ddPCR)检测cfNA中的CNV
如之前所描述(Abyzov等，2002)进行ddPCR分析。简言之，ddPCR工艺流程在于建立反应、制备液滴、热循环和根据Bio-Rad说明书(Bio-Rad QX200system)在液滴阅读器上运行。ddPCR使用荧光标记的内部杂交探针(TaqMan探针)来检测cfNA中的CNV。通常使用靶向目标区域(例如：CNV-ID1,dHsaCP2506319)的一对引物和靶向任何标准参考基因(例如：RPP30,dHsaCP2500350)的第二对引物设置反应。用不同的荧光基团(FAM和HEX)标记两种引物(靶标和参考)。将来自各上清液的cfNA进料添加到TaqMan PCR反应混合物。这种反应混合物包括最终体积为20μl的ddPCR Supermix No dUTP(Bio-Rad,Ref:1863023)和引物。然后将各装配的ddPCR反应混合物装载入八通道一次性液滴发生器盒(Bio-Rad,Ref:1864008)的样品孔中。将60μL体积的液滴产生油(Bio-Rad,Ref:1863005)装载入各通道的油孔中。将盒放入液滴发生器(Bio-Rad)。从液滴发生器去除盒，然后用多通道移液管将液滴孔中收集的液滴人工转移到96孔PCR板。用箔封条热密封板，然后置于常规热循环仪并扩增到端点(40–50个循环)。利用微流体技术，将反应混合物分为由油表面和包含PCR反应混合物的水性核组成的球形液滴。使液滴进行热循环。扩增后，通过液滴读数器连续读出各液滴的荧光。包含目标靶标区域或参考的液滴将在相应通道发荧光(阳性液滴)，而不含靶标的那些不会发荧光(阴性液滴)。各靶标的阳性和阴性液滴的计数通过泊松分布与样品中靶标的浓度有关。
结果
通过自我更新永存但能够分化成特定组织的成熟细胞的多能干细胞(PSC)是再生医学的关键工具。再生医学是使机体修复、替换、恢复和再生受损或有病细胞、组织和器官的创新的医学疗法的广泛定义。然而，细胞培养可能导致可以改变干细胞性质或使它们倾向于肿瘤形成的表观和遗传的异常。随着PSC在临床使用中的快速扩张，改进细胞扩增期间和批次释放之前表征多能干细胞(PSC)的工具是适时的。
目前，没有可靠的可商购的用于评估培养物中多能干细胞的遗传完整性的遗传且无创的程序。本发明涉及评估培养物中hPSC的基因组完整性的方法，包括检测培养物中PSC繁殖期间收集的上清液中存在的DNA中的遗传异常的步骤。
发明人已经测定了作为培养物中hPSC不稳定性的生物标志物的一组hPSC的“超再现序列”(表1)，并提出了一种可用于在培养期间和临床使用之前常规评估干细胞的快速且易于进行的测试(图1)。
hPSC培养期间发生的再现的遗传改变。
发明人已经开发了致力于使通过核型、FISH、微阵列分析(SNP、aCGH)或NGS获得的所有类型的基因组异常可视化的数据库“SEAdb”。SEAdb可以经由以下连接访问：seadb.org(登录:seadb和pwd:SEAdb)。发明人收集了超过400000种异常和变体。
发明人表明，hPSC培养期间最经常再现的遗传变化是核型异常和拷贝数变异(CNV)>1Mb(图2)。
相反，较小的遗传异常例如突变和indel几乎没有再现。SEAdb中存在1171种遗传变化>1Mb。发明人指定了再现得分，其帮助我们鉴定最容易被PSC培养诱导基因组修饰的基因组上的位置。例如，对于携带大多数遗传变化>1Mb的21条染色体，发明人表明，表1的40组序列(Sondes:S1-S40)覆盖93.5％的染色体异常(图3)。
细胞培养上清液作为DNA来源以检测致病序列
评估培养物中干细胞的基因组完整性的主要限制是需要破坏培养样品以进行测试。因此，发明人提出，基因组完整性可以在细胞培养上清液上进行。
事实上，细胞培养上清液包含游离DNA(cfDNA)，其是分子量低于基因组DNA的双链分子，为短片段(长度为70-200个碱基对)或高达21kb的长片段形式。cfDNA释放的机制尚且未知，但已经表明坏死、细胞程序死亡、噬菌作用或主动释放可能起作用(Choi等,2005；Gahan等,2008；Stroun等,2001)。
CfDNA存在于血清或血浆中，并且用于无创测试来检测染色体异常(Hui和Bianchi,2013)。已经证实，可以在来自母体血清样品的游离胎儿DNA中检测到特定的胎儿非整倍体，例如三体13、18或21(Dan等,2012；Fairbrother等,2013；Nicolaides等,2014)。此外，利用靶标区域捕获测序，母体血浆中的胎儿cfDNA也用于检测致病拷贝数变异(CNV)(Ge等,2013)。
基于cfDNA在不同的流体(血清、血浆)中释放并可用于检测致病CNV这一发现，发明人提出，使用上清液中存在的DNA作为来源来检测致病CNV并在避免细胞破坏的情况下进行hPSC的无创分析。
为了评估干细胞上清液中DNA的可能的外部来源，发明人使用ALU重复序列的定量实时PCR(Umetani等,2006)。来自两种hESC的两个上清液中总cfDNA的ALU-qPCR(重复三次)定量明确表明，cfDNA在所有测试样品中检测到，且测量的cfDNA浓度为(330pg-110pg)(图4)。
这些结果表明，hPSC-上清液包含游离DNA(cfDNA)，可能来自死细胞和漂浮的活细胞的遗传物质的释放。在hPSC上清液中检测到释放的cfDNA代表利用序列生物标志物促进遗传异常评估的仍未研究的工具。
术语“培养基”涉及用于细胞培养、生长或增殖的营养液。术语“细胞培养物”是指在人造体外环境中保持、培养或生长的细胞。
术语“CNV”涉及基因组DNA的变化，其导致细胞的DNA的一个或多个部分的拷贝数的异常，或对某些基因而言，正常变异。CNV是某些染色体上已经缺失(少于正常数)或复制(大于正常数)的基因组的相对大的区域。
实施例2
方法
核型分析
用TryPLE Select(Life Technologies)解离人多能干细胞，并将其生长3天以到达指数生长中期。然后，用1/10,000ColcemidTM(Life Technologies)孵育单个细胞90min以使其中期停滞，然后用0.075M KCl溶液在37℃低渗溶胀20min，并在冰冷的甲醇/冰醋酸(3:1,vol/vol)中连续固定三次。在载玻片上滴二十微升核悬液，在18.4℃和60％湿度下风干，并在水中再水化5min，然后在EARLE橙或10×EBSS中于87℃变性55min。然后在冷水中冲洗载玻片并用3％GIEMSA染色3min，冲洗五次并风干。利用Metafer SlideScanning Platform(MetaSystem)进行光谱显微术和分析。
ddPCR数据分析和统计学
将记录靶标特异性分析(dHsaCP2506319)的荧光的液滴数与参考特异性分析(dHsaCP2500350)获得的计数相比较。使用制造商的QuantaSoft软件(Bio-Rad,CA,USA)，通过应用泊松统计计算最终拷贝数：
λ＝-ln(1-p)
其中“λ”是每个液滴的拷贝平均数，“p”是阳性液滴与液滴总数之比。
结果
利用ddPCR方法评估hPSC-上清液中的遗传完整性：常规筛选中的应用
通过测试hPSC上清液中的cfDNA评估遗传完整性筛选是可能的。我们使用两个非整倍体人多能干细胞(hPSC)系HD129和HD291以证实测试的可行性。如常规R带核型分析所测定，HD129显示三体20(47,XY,+20)，而HD291显示三体12(47,XY,+12)。分别收集相应的细胞和上清液以用于利用我们的特异性超再现序列和ddPCR方法进行三体20的分析。如图5所示，(i)在hPSC-上清液中利用ddPCR方法检测到HD129hPSC系的基因组畸变(在这种情况下是三体20)，但在证实核型结果的HD291系中没有检测到，(ii)在上清液的遗传异常筛选结果和相应核型之间发现相关性，表明上清液中存在的cfNA可用于评估多能干细胞的遗传完整性这一概念的证据。通过使用上清液筛选干细胞的优点将是能够在无破坏的情况下评估干细胞遗传完整性。此外，使用该简单的方法论，基于液滴数字聚合酶链反应(ddPCR)，可以快速、有效和容易地从少量材料(包括培养物上清液)筛选hPSC系。这些益处可以使该方法更具吸引力，导致可能的常规应用。最后，我们的方法可用于需要准确分析基因组的遗传完整性测试的任何其他实验(例如：多能干细胞包括间质干细胞(MSC)、生殖细胞、淋巴细胞、胚胎或体细胞)。
稳健性测试的核酸最低浓度
通过测试从hPSC系HD129收集的上清液提取的不同浓度的核酸(1,1ng/μL、0,4ng/μL、0,1ng/μL、3,7pg/μL、1,1pg/μL、0,4pg/μL)，评估使用ddPCR检测三体20序列的敏感性。如图6所示，在从非常低浓度(低至0.1ng/μL)获得的信号之间检测到三体20信号，但它对于可靠的筛选结果仍然足够。
参考文献
贯穿本申请，各种参考文献描述了本发明所属技术领域的技术水平。这些参考文献的公开内容通过引用并入本公开。
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Claims (5)

1.一种用于测定多能干细胞的质量的体外无创方法，包括步骤：i)提供培养多能干细胞的培养样品，ii)从所述样品提取核酸，和iii)测定核酸提取物中至少一种遗传异常的存在和/或水平。
2.权利要求1所述的方法，包括步骤i)测定核酸提取物中至少一个选自表1的超再现序列的存在，和ii)当检测到至少一个超再现序列时，断定所述多能干细胞携带遗传异常。
3.一种分离不含遗传异常的多能干细胞的方法，包括步骤：
i)通过实施权利要求2所述的方法测定多能干细胞培养物中超再现序列的水平，
ii)将步骤i)测定的水平与参考值比较，
iii)当步骤i)测定的水平与参考值不同时，断定多能干细胞培养物包含不含遗传异常的多能干细胞，
iv)和分离所述不含遗传异常的多能干细胞。
4.一种用于将多能干细胞或由其衍生的分化细胞移植到需要再生治疗的受试者的方法，包括步骤：i)实施权利要求1-3任一项所述的方法，ii)选择不含遗传异常的多能干细胞，和iii)向所述受试者施用步骤ii)选择的多能干细胞或由其衍生的分化细胞。
5.一种用于治疗需要再生治疗的受试者的疾病的方法，包括步骤：i)实施权利要求1-3任一项所述的方法，ii)选择不含遗传异常的多能干细胞，和iii)向所述受试者施用步骤ii)选择的多能干细胞或由其衍生的分化细胞。
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