CN102459635A - 用于选择对于妊娠结果具有高潜能的感受态卵母细胞和感受态胚胎的方法 - Google Patents

用于选择对于妊娠结果具有高潜能的感受态卵母细胞和感受态胚胎的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于选择感受态卵母细胞或感受态胚胎的方法。

Description

用于选择对于妊娠结果具有高潜能的感受态卵母细胞和感受态胚胎的方法
技术领域
本发明涉及用于选择感受态(competent)卵母细胞或感受态胚胎的方法。
背景技术
在辅助生殖技术(ART)中，体外受精(IVF)后的怀孕和出生率仍然低下。事实上三分之二的IVF周期未能导致怀孕(SART 2004)，且超过十分之八的移植胚胎未能植入(Kovalevsky和Patrizio，2005)。另外，超过50％的IVF-出生的婴儿来自于多胎妊娠(Reddy等人，2007)。据估计来自ART的多胎妊娠导致的早产是导致每年约$8.9亿的美国健康护理成本的原因(Bromer和Seli，2008)。
主观的形态学参数仍然是选择用于IVF和ICSI过程的健康胚胎的主要标准。然而，这种标准没有真实预测胚胎的感受性。许多研究表明，若干不同的形态学标准的组合导致更准确的胚胎选择(Balaban和Urman，2006；La Sala等人，2008；Scott等人，2000)。用于胚胎选择的形态学标准在移植当天评估，并主要基于早期胚胎分裂(受精后25-27小时)、第二天或第三天卵裂球的数目和大小、分裂百分比和第4或第8细胞分裂期中多晶核形成的存在(Fenwick等人，2002)。
然而，最新研究表明，与所有可用胚胎的移植相比(不管其质量)，用于受精的卵母细胞的选择不能改善ART结果(La Sala等人，2008)。需要识别具有最高移植潜能的存活胚胎以增加IVF成功率，减少用于新替换的胚胎的数目并降低多胎妊娠率。
为了所有这些理由，目前正在研究用于胚胎选择的若干生物标记物(Haouzi等人，2008；Pearson，2006)。由于导致妊娠的胚胎在其代谢特征方面不同于不导致妊娠的胚胎，一些研究试图识别可被胚胎培养基的非侵入性评估检测到的分子信迹(signature)(Brison等人，2004；Gardner等人，2001；Sakkas and Gardner，2005；Seli等人，2007；Zhu等人，2007)。
基因组也提供胚胎发育期间的遗传和细胞功能的重要认知。(McKenzie等人，2004)和(Feuerstein等人，2007)报道，卵丘细胞中若干基因例如环加氧酶2(COX2)的表达指示卵母细胞和胚胎的质量。Gremlin 1(GREM1)、透明质酸合酶2(HAS2)、类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)、硬脂酰-辅酶A脱氢酶1和5(SCD1和5)、双调蛋白(AREG)和正五聚蛋白(pentraxin)3(PTX3)也被证实与胚胎质量正性相关(Zhang等人，2005)。近年来，基于胚胎发育期间的早期分裂速度，人卵丘细胞中的谷胱甘肽过氧化物酶3(GPX3)、趋化因子受体4(CXCR4)、细胞周期蛋白D2、(CCND2)和连环蛋白Δ1(CTNND1)的表达已被证实与胚胎质量负性相关(van Montfoort等人，2008)。然而，尽管早期分裂已被证实为用于预测妊娠的可靠生物标记物(Lundin等人，2001；Van Montfoort等人，2004；Yang等人，2007)，但没有研究卵丘细胞对于妊娠结果的基因表达谱。
发明简述
本发明涉及用于选择感受态卵母细胞的方法，包括测定围绕所述卵母细胞周围的卵丘细胞中45个基因的表达水平的步骤，其中所述基因是WNT6、LRCH4、PAX8、CABP4、PDE5A、BCL2L11、PCK1、TCF20、SLAMF6、EPOR、CACNG6、NLRP1、PECAM1、NOS1、ATF3、KRTAP8、GRIK5、SLC24A3、SLC5A12、SLCA10A2、SLCO1A2、SLC25A5、MG29、NLGN2、PRKACA、FOSB、SIAT6、LOXL2、PRF1、ADPRH、APBB3、EGR3、CNR2、IFITM1、PLA2G5、CAMTA1、SOX4、NFIB、NFIC、RBMS1、G0S2、FAT3、SLC40A1、GPC6和IGF1R。
本发明也涉及用于选择感受态胚胎的方法，包括测定围绕所述胚胎周围的卵丘细胞中45个基因的表达水平的步骤，其中所述基因是WNT6、LRCH4、PAX8、CABP4、PDE5A、BCL2L11、PCK1、TCF20、SLAMF6、EPOR、CACNG6、NLRP1、PECAM1、NOS1、ATF3、KRTAP8、GRIK5、SLC24A3、SLC5A12、SLCA10A2、SLCO1A2、SLC25A5、MG29、NLGN2、PRKACA、FOSB、SIAT6、LOXL2、PRF1、ADPRH、APBB3、EGR3、CNR2、IFITM1、PLA2G5、CAMTA1、SOX4、NFIB、NFIC、RBMS1、G0S2、FAT3、SLC40A1、GPC6和IGF1R。
本发明也涉及用于选择感受态卵母细胞或感受态胚胎的方法，包括在围绕所述卵母细胞或所述胚胎周围的卵丘细胞中测定选自组A、组B或组C的一个或多个基因的表达水平的步骤，其中组A由PCK1、ADPRH、CABP4、SLAMF6、CAMTA1、CSPG2和PRF1组成；组B由FOSB、NLGN2、PDE5A、PLA2G5、GPC6和EGR3组成；以及组C由NFIB、NFIC、IGF1R、G0S2、GIRK5和RBMS1组成。
选自组A的一个或多个基因的过度表达预测导致妊娠的感受态卵母细胞或胚胎。选自组B的一个或多个基因的过度表达预测非感受态卵母细胞或胚胎，所述胚胎不能移植。选自组C的一个或多个基因的过度表达预测由于早期胚胎停止发育的非感受态卵母细胞或胚胎。
发明详述
本发明人已经测定在卵丘细胞中表达的一组基因，其是用于胚胎潜能和妊娠结果的生物标记物。他们证实围绕卵母细胞周围的卵丘细胞的基因表达谱与不同的妊娠结果相关，从而识别妊娠胚胎发育的特定表达信迹。他们的结果表明分析围绕卵母细胞周围的卵丘细胞是用于胚胎选择的非侵入性方法。
预测性基因群
与本发明有关的所有基因本身是已知的，并列于下表A和B中。表A和B显示基因组，其联合表达谱已被证实可为选择具有导致妊娠的高移植潜能的感受态卵母细胞或感受态胚胎而提供信息。
Figure BPA00001480516600041
表A：预测性基因群
本发明的一个目的涉及用于选择感受态卵母细胞的方法，包括测定围绕所述卵母细胞周围的卵丘细胞中45个基因的表达水平的步骤，其中所述基因是WNT6、LRCH4、PAX8、CABP4、PDE5A、BCL2L11、PCK1、TCF20、SLAMF6、EPOR、CACNG6、NLRP1、PECAM1、NOS1、ATF3、KRTAP8、GRIK5、SLC24A3、SLC5A12、SLCA10A2、SLCO1A2、SLC25A5、MG29、NLGN2、PRKACA、FOSB、SIAT6、LOXL2、PRF1、ADPRH、APBB3、EGR3、CNR2、IFITM1、PLA2G5、CAMTA1、SOX4、NFIB、NFIC、RBMS1、G0S2、FAT3、SLC40A1、GPC6和IGF1R。
如本发明所使用，术语“感受态卵母细胞”是指受精时生成具有导致妊娠的高移植率的存活胚胎的雌配子或卵。
根据本发明，所述卵母细胞可由自然周期、改变的自然周期或用于cIVF或ICSI的刺激周期而产生。术语“自然周期”是指雌性或女性产生卵母细胞的自然周期。术语“改变的自然周期”是指在用与重组FSH或hMG有关的GnRH拮抗剂的温和卵巢刺激下雌性或女性产生一个卵母细胞或两个卵母细胞的过程。术语“刺激周期”是指用与重组FSH或hMG有关的GnRH激动剂或拮抗剂的刺激下雌性或女性产生一个或更多个卵母细胞的过程。
术语“卵丘细胞”是指在围绕卵母细胞周围的大量细胞中所包含的细胞。据信这些细胞参与为受精的卵母细胞提供产生存活胚胎所必需的某些营养、能量和/或其他需求。
本发明方法还包括比较样品基因与对照基因的表达水平的步骤，其中检测到样品和对照基因之间的表达水平差异指示卵母细胞是否是感受态的。所述对照可以由含有与感受态卵母细胞有关的卵丘细胞的样品组成，或者由含有与未受精卵母细胞有关的卵丘细胞的样品组成。
本发明方法优选应用于女性，但也可以应用于其他哺乳动物(例如，灵长类、狗、猫、猪、母牛…)。
本发明方法特别适用于评估体外受精治疗的功效。因此本发明也涉及用于评估雌性受试者的受控卵巢过度刺激(COS)方案的功效的方法，包括：
i)提供来自所述雌性受试者的至少一个带有其卵丘细胞的卵母细胞；
ii)通过本发明方法测定所述卵母细胞是否是感受态卵母细胞。
然后，这种方法之后，胚胎学家可以选择感受态卵母细胞并通过常规体外受精(cIVF)方案或通过胞浆内精子注射(ICSI)方案使所述卵母细胞受精。
本发明的另一个目的涉及用于监控受控卵巢过度刺激(COS)方案的功效的方法，包括：
i)在自然周期、改变的周期或刺激周期下从所述女性中分离至少一个带有其卵丘细胞的卵母细胞；
ii)通过本发明方法测定所述卵母细胞是否是感受态卵母细胞；
iii)并基于其是否导致感受态卵母细胞来监控COS治疗的功效。
COS治疗可以基于选自与重组FSH或hMG有关的GnRH激动剂或拮抗剂的至少一种活性成分。
本发明也涉及用于选择感受态胚胎的方法，包括测定围绕所述胚胎周围的卵丘细胞中45个基因的表达水平的步骤，其中所述基因是WNT6、LRCH4、PAX8、CABP4、PDE5A、BCL2L11、PCK1、TCF20、SLAMF6、EPOR、CACNG6、NLRP1、PECAM1、NOS1、ATF3、KRTAP8、GRIK5、SLC24A3、SLC5A12、SLCA10A2、SLCO1A2、SLC25A5、MG29、NLGN2、PRKACA、FOSB、SIAT6、LOXL2、PRF1、ADPRH、APBB3、EGR3、CNR2、IFITM1、PLA2G5、CAMTA1、SOX4、NFIB、NFIC、RBMS1、G0S2、FAT3、SLC40A1、GPC6和IGF1R。
术语“胚胎”是指受精的卵母细胞或受精卵。所述受精可由常规体外受精(cIVF)或胞浆内精子注射(ICSI)方案干预。
术语“常规体外受精”或“cIVF”是指卵母细胞在身体外即体外由精子受精的过程。当体内受孕失败时，IVF是不育症的主要治疗法。术语“胞浆内精子注射”或“ICSI”是指将单个精子直接注射入卵母细胞的体外受精过程。该过程最常用于解决男性不育症因素，虽然当卵母细胞不能容易地被精子穿透时，也可以使用该过程，且其偶尔作为体外受精方法，特别是与捐精有关的那些。
术语“感受态胚胎”是指具有导致妊娠的高移植率的胚胎。术语“高移植率”是指当转移入子宫时，胚胎移植在子宫环境中并产生存活胎儿，其又发展成存活后代，而不存在终止所述妊娠的过程或事件的胚胎潜能。
本发明方法还包括将样品基因的表达水平与对照基因的表达水平比较的步骤，其中检测到样品和对照基因之间的表达水平差异指示胚胎是否是感受态的。所述对照可以由含有与产生存活胎儿的胚胎有关的卵丘细胞的样品组成，或者由含有与不产生存活胎儿的胚胎有关的卵丘细胞的样品组成。
应注意本发明方法与胚胎的形态学考虑无关。两个胚胎可以具有相同的形态状况，但通过本发明方法可以显示导致妊娠的不同移植率。
本发明方法优选应用于女性，但也可以应用于其他哺乳动物(例如，灵长类、狗、猫、猪、母牛…)。
本发明还涉及用于测定胚胎是否是感受态胚胎的方法，包括测定围绕所述胚胎周围的卵丘细胞中45个基因的表达水平的步骤，其中所述基因是WNT6、LRCH4、PAX8、CABP4、PDE5A、BCL2L11、PCK1、TCF20、SLAMF6、EPOR、CACNG6、NLRP1、PECAM1、NOS1、ATF3、KRTAP8、GRIK5、SLC24A3、SLC5A12、SLCA10A2、SLCO1A2、SLC25A5、MG29、NLGN2、PRKACA、FOSB、SIAT6、LOXL2、PRF1、ADPRH、APBB3、EGR3、CNR2、IFITM1、PLA2G5、CAMTA1、SOX4、NFIB、NFIC、RBMS1、G0S2、FAT3、SLC40A1、GPC6和IGF1R。
本发明也涉及用于测定胚胎是否是感受态胚胎的方法，包括：
i)提供具有其卵丘细胞的卵母细胞；
ii)使所述卵母细胞体外受精；
iii)通过本发明方法测定步骤i)所述卵母细胞是否是感受态的卵母细胞来测定步骤ii)所得胚胎是否是感受态的。
本发明也涉及用于选择感受态卵母细胞或感受态胚胎的方法，包括在围绕所述卵母细胞或所述胚胎周围的卵丘细胞中测定选自组A、组B或组C的一个或多个基因的表达水平的步骤，其中组A由PCK1、ADPRH、CABP4、SLAMF6、CAMTA1、CSPG2和PRF1组成；组B由FOSB、NLGN2、PDE5A、PLA2G5、GPC6和EGR3组成；以及组C由NFIB、NFIC、IGF1R、G0S2、GIRK5和RBMS1组成。
选自组A的一个或多个基因的过度表达预测导致妊娠的感受态卵母细胞或胚胎。选自组B的一个或多个基因的过度表达预测非感受态卵母细胞或胚胎，所述胚胎没有移植能力。选自组C的一个或多个基因的过度表达预测由于早期胚胎停止发育的非感受态卵母细胞或胚胎。
所述一个或多个基因例如可以仅选自组A、仅选自组B或仅选自组C。
通常，1、2、3、4、5、6或7个基因可以选自组A。
通常，1、2、3、4、5或6个基因可以选自组B。
通常，1、2、3、4、5或6个基因可以选自组C。
或者，所述基因例如可以选自组A和B、选自组A和C、选自组B和C，或选自组A、B和C。
通常，1、2、3、4、5、6或7个基因可以选自组A，且1、2、3、4、5或6个基因可以选自组B，0、1、2、3、4、5或6个基因可以选自组C。
通常，0、1、2、3、4、5、6或7个基因可以选自组A，且0、1、2、3、4、5或6个基因可以选自组B，0、1、2、3、4、5或6个基因可以选自组C。
通常，0、1、2、3、4、5、6或7个基因可以选自组A，且0、1、2、3、4、5或6个基因可以选自组B，1、2、3、4、5或6个基因可以选自组C。
本发明方法特别适用于增强雌性的妊娠结果。因此本发明也涉及用于增强雌性的妊娠结果的方法，包括：
i)通过进行本发明方法选择感受态胚胎；
iii)将步骤i)所选胚胎植入所述雌性的子宫。
因此如上所述方法将帮助胚胎学家避免将对于妊娠结果具有差的潜能的胚胎转移入子宫。
如上所述方法也特别适用于通过选择能够导致移植和妊娠的感受态胚胎从而避免多胎妊娠。
在所有上述情况中，所述方法描述了卵丘细胞的基因表达谱与胚胎和妊娠结果之间的关系。
测定本发明基因的表达水平的方法：
表A和B描述的上述基因的表达水平的测定可通过多种技术进行。通常，所测定的表达水平是相对表达水平。
更优选地，所述测定包括使样品与选择性试剂例如探针、引物或配体接触，从而检测在样品中原始存在的目标多肽或核酸的存在，或测定在样品中原始存在的目标多肽或核酸的量。接触可在任何适当装置中进行，例如平板、微量滴定皿、试管、孔、玻璃器皿、柱等。在具体的实施方式中，所述接触在涂有试剂(例如核酸阵列或特定配体阵列)的基底上进行。所述基底可以是固体或半固体基底，例如任何适当的支持物，包括玻璃、塑料、尼龙、纸、金属、聚合物等。所述基底可以呈多种形状和大小，例如载片、膜、珠、柱、凝胶等。所述接触可以在适用于可检测复合物的任何条件下进行，所述复合物例如是试剂和样品核酸或多肽之间形成的核酸杂交体或抗体-抗原复合物。
在一个优选的实施方式中，可通过测定mRNA的量来测定所述表达水平。
测定mRNA的量的方法是本领域所熟知的。例如，首先根据标准方法例如使用溶解酶或化学溶液提取样品(例如，由患者制备的细胞或组织)所含的核酸，或根据供应商说明书通过核酸-结合树脂提取样品所含的核酸。然后通过杂交(例如Northern印迹分析)和/或扩增(例如，RT-PCR)检测提取的mRNA。优选定量或半定量RT-PCR。实时定量或半定量RT-PCR是特别有利的。
扩增的其他方法包括连接酶链式反应(LCR)、转录-介导的扩增(TMA)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
具有至少10个核苷酸并与本发明目的mRNA具有序列互补性或同源性的核酸可用作杂交探针或扩增引物。应理解这种核酸不必与可比较大小的同源区域相同，但通常与可比较大小的同源区域具有至少约80％的同源性，优选85％的同一性，更优选90-95％的同一性。在某些实施方式中，有利地使用与适当方式(例如可检测标记)结合的核酸，以检测杂交。本领域已知大量适当的指示剂，包括荧光指示剂、放射性指示剂、酶指示剂或其他配体(例如抗生物素蛋白/生物素)。
探针通常包含长度为10到1000个核苷酸的单链核酸，例如10到800个，更优选15到700个，通常20到500个。引物通常是长度为10到25个核苷酸的较短单链核酸，设计成完全或几乎完全与待扩增的目的核酸匹配。探针和引物对于与它们杂交的核酸而言是“特异性的”，即，它们优选在高度严格的杂交条件(相当于最高熔融温度Tm，例如，50％甲酰胺、5x或6x SCC。SCC是0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠)下杂交。
用于上述扩增和检测方法中的核酸引物或探针可装配成试剂盒。这种试剂盒包括通用引物和分子探针。优选的试剂盒还包括测定是否发生扩增所必需的组件。所述试剂盒还可以包括例如PCR缓冲液和酶；阳性对照序列；反应控制引物；以及用于扩增并检测特异性序列的说明书。
在一个具体的实施方式中，本发明方法包括提供从卵丘细胞中提取的总RNA并(更优选通过定量或半定量RT-PCR)使所述RNA扩增并与特异性探针杂交的步骤。
在另一个优选的实施方式中，所述表达水平通过DNA芯片分析测定。这种DNA芯片或核酸微阵列由通过化学方法附着于基底的不同核酸探针组成，该基底可以是微芯片、载玻片或微球-大小的珠。微芯片可由聚合物、塑料制品、树脂、多糖、二氧化硅或二氧化硅基材料、碳、金属、无机玻璃或硝酸纤维素组成。探针包含核酸，例如可以为约10到约60个碱基对的cDNA或寡核苷酸。为测定表达水平，任选首先进行反转录的来自测试受试者的样品被标记，并在杂交条件下与微阵列接触，导致在与附着于微阵列表面的探针序列互补的靶核酸之间形成复合物。然后检测标记的杂交复合物并可进行定量或半定量。标记可通过多种方法实现，例如使用放射性或荧光标记。本领域技术人员可采用微阵列杂交技术的许多变化形式(例如参见Hoheisel的综述，Nature Reviews，Genetics，2006，7：200-210)。
在上下文中，本发明还提供DNA芯片，其包含携带对表A或B所列基因而言具有特异性的核酸的固体支持物。
用于测定所述基因的表达水平的其他方法包括测定由所述基因编码的蛋白的量。
这种方法包括使样品与能够和存在于样品中的标记物蛋白选择性相互作用的结合配偶体(binding partner)接触。所述结合配偶体通常是多克隆或单克隆抗体，优选单克隆抗体。
蛋白的存在可使用标准电泳和免疫诊断技术检测，该免疫诊断技术包括免疫测定，例如竞争作用、直接反应或夹层型测定。这种测定包括但不局于：蛋白质印迹；凝集试验；酶-标记并介导的免疫测定，例如ELISA；生物素/抗生物素蛋白型测定；放射免疫测定；免疫电泳法；免疫沉淀反应等。所述反应通常包括显示标签，例如荧光、化学发光、放射性、酶标签或染料分子，或用于检测抗原和与其反应的一种或多种抗体之间形成复合物的其他方法。
上述测定通常包括将液相中的未结合蛋白从抗原-抗体复合物结合的固相支持物中分离。可用于实施本发明的固体支持物包括基底，例如硝酸纤维素(例如，以膜或微量滴定孔形式)；聚氯乙烯(例如，薄板或微量滴定孔)；聚苯乙烯乳胶(例如，珠或微量滴定板)；聚偏氟乙烯；重氮化纸；尼龙膜；活化珠；磁性应答珠等。
更优选地，可使用其中微量滴定板的孔涂有对抗待测定蛋白的抗体的ELISA方法。然后将含有或怀疑含有标记物蛋白的生物样品加入涂层孔中。培养足以形成抗体-抗原复合物的一段时间后，可以洗涤平板以去除未结合部分，并加入可检测地标记的次级结合分子。所述次级结合分子能与任何捕获的样品标记物蛋白反应，洗涤平板并使用本领域熟知的方法检测次级结合分子的存在。
或者优选免疫组织化学(IHC)方法。IHC具体提供了原位检测样品或组织样品中的靶标的方法。IHC保持样品的总体细胞完整性，因此可以同时检测目标靶标的存在和位置。通常样品用福尔马林固定，埋入石蜡并切片，用于染色以及随后通过光学显微镜检查。IHC的目前方法使用直接标记或基于二级抗体的标记或基于半抗原的标记。已知IHC体系的实例例如包括，EnVision(TM)(DakoCytomation)、Powervision(R)(Immunovision，Springdale，AZ)、NBA(TM)试剂盒(Zymed LaboratoriesInc.，South San Francisco，CA)、HistoFine(R)(Nichirei Corp，Tokyo，Japan)。
在具体实施方式中，用针对由目标基因编码的蛋白的抗体培养后，可以将组织切片(例如含有卵丘细胞的样品)固定在载片或其他支持物上。然后，对固定在适当的固体支持物上的样品进行显微检验。为形成显微照片，含有样品的切片可以固定在载玻片或其他平面支持物上，通过选择性染色突出目标蛋白的存在。
因此IHC样品例如可以包括：(a)含有卵丘细胞的制品；(b)固定并埋入所述细胞；(c)检测所述细胞样品中的目标蛋白。在一些实施方式中，IHC染色过程例如可以包含以下步骤：切割并修整组织、固定、脱水、石蜡浸润、切成薄片、固定在载玻片上、烘干、脱蜡、再水合、抗原修复(retrieval)、封闭步骤、施加初级抗体、洗涤、施加二级抗体(任选与适当的可检测标签偶联的)、洗涤、复染和显微镜检查。
本发明也涉及用于进行上述方法的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于测量指示所述卵母细胞或胚胎是否是感受态的表A或B基因的表达水平的方式。
本发明通过以下附图和实施例进一步说明。然而，这些实施例和附图不应以任何方式解释为对本发明范围的限制。
具体实施方式
用于通过人卵丘细胞的基因表达谱评估胚胎潜能的非侵入性试验
实施例1：
材料和方法：
患者和IVF治疗：在该回顾性研究中，研究了年龄为30.9岁±2.5、并求助于我们的ICSI(胞浆内精子注射)中心治疗男性不育症因素的正常应答者患者(n＝30)。用GnRH激动剂或拮抗剂与重组FSH(GonalF，Puregon；分别为Merck-Serono和Organon)或hMG(Menopur，Ferring)联合刺激患者。通过血浆雌二醇含量和超声检测评估卵巢应答，以监控卵泡生长。给予hCG(5000IU)后36小时在超声引导下进行卵母细胞的提取。
胚胎质量的评估：微注射后第2天和第3天，用卵裂球数目和分裂程度作为标准评估单独培养的胚胎的质量参数(第1-2级：相同大小的卵裂球和0-20％的分裂；第3-4级：没有相同大小的卵裂球和大于20％的分裂)。第3天，6-8个细胞(相同大小的卵裂球且没有分裂)被定义为质量最佳的胚胎。卵母细胞修复后的第3天移植一个或两个胚胎。胚胎移植六周后分别基于血浆β-hCG和超声检测(存在带心跳的孕囊)评估临床妊娠。
卵丘细胞：在取卵当天冷冻所有的卵丘细胞(CC)样品。然后，每个患者随机选择一到三个CC样品用于微阵列测定。总共从50个单个卵母细胞中收集50个CC样品，并单独分析：来自1-2级胚胎的34个CC(n＝20名患者)，来自第3-4级胚胎的11个CC(n＝10名患者)和来自未受精卵母细胞的5个CC(n＝5名患者)(表1)。
表1：该研究中卵丘细胞样品的特征
Figure BPA00001480516600141
CC：卵丘细胞，P+：来自具有阳性妊娠结果的胚胎的卵丘细胞，P-：来自无妊娠结果的胚胎的卵丘细胞，G1/2：来自第1-2级胚胎的卵丘细胞，G3/4：来自第3-4级胚胎的卵丘细胞，NT：没有移植。
在仅在微阵列杂交后才揭示妊娠结果的双盲条件下进行数据分析。关于妊娠结果，来自受精卵母细胞的45个CC包括来自没有导致妊娠的第1-2级胚胎的16个CC(n＝9名患者)、与阳性妊娠结果有关的18个CC(n＝11名患者)和来自没有移植的第3-4级胚胎的11个CC。在卵母细胞恢复(使用hCG后＜40小时)后，立即剥离卵丘细胞。在RNA提取之前，机械除去卵丘细胞，在培养基中进行洗涤，并立即在-80℃下冷冻在RLT RNA提取缓冲液(Rneasy试剂盒，Qiagen，Valencia，CA，USA)中。
颗粒细胞：选择求助于ICSI方案治疗男性不育症因素的正常应答者患者(n＝8)(年龄34.8岁±3.2)的独立组来收集颗粒细胞(8个样品)。卵母细胞恢复后，立即收集来自同一个患者的成熟卵泡(＞17mm)的卵泡液，去除卵丘卵母细胞复合物后，以1/3体积稀释在HBSS溶液(BioWhittaker)中(每批50ml)，代表一个样品。使用(Kolena等人，1983)的方案纯化颗粒细胞。500g在摇摆斗中离心20min后，颗粒细胞收集在聚蔗糖缓冲液(Ficoll cushion)(12ml淋巴细胞分离介质，BioWhittaker)中。它们在HBSS和PBS中连续洗涤，在血细胞溶解缓冲液(KHCO3 10mM、NH4Cl 150mM、EDTA 0.1mM)中培养5min以去除红细胞，计数并在PBS中形成小球，然后溶解在RLT缓冲液(Quiagen)中并贮存在-80℃。卵泡穿刺数和纯化的颗粒细胞数分别为6到12个和2106到9106个。
互补RNA(cRNA)制备和微阵列杂交：用微RNeasy试剂盒(Qiagen)提取CC和颗粒细胞RNA。用Nanodrop ND-1000分光光度计(NanodropTechnologies Inc.，DE，USA)测定RNA总量，并用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent，Palo Alto，CA，USA)评估RNA完整性。按照制造商方案“两次扩增”(二次循环cDNA合成试剂盒，Invitrogen)由总RNA(70ng到100ng)的两轮扩增制备cRNA。第一次扩增后获得的cRNA为0.1μg/μl到1.9μg/μl，且第二次扩增后为1.6μg/μl到4.5μg/μl。
在含有对应于≈30000个独特人基因或预测基因的54675组寡核苷酸探针(“探针组”)的Affymetrix HG-U133 Plus 2.0阵列上使标记的碎片cRNA(12μg)与寡核苷酸探针杂交。各卵丘和颗粒细胞样品单独放在微阵列芯片上。
数据处理：用Affymetrix GCOS 1.4处理扫描的基因芯片图像，以获得各探针组的强度值和检测呼叫(存在、少量或不存在)，使用默认分析设置和总缩放性作为第一归一化法，各阵列的修整平均目标强度值(TGT)任意设置为100。用MAS5.0运算法则导出探针强度。该运算法则也确定基因是否以规定的置信水平表达(“检测呼叫”)。该“呼叫”也可以是“存在”(当完美匹配探针的杂交明显多于错配探针，p值＜0.04)、“少量”(p值＞0.04并＜0.06)或“不存在”(p值＞0.06)。我们实验室获得的微阵列数据与有关微阵列实验的最小化信息MIAME建议(Brazma等人2001)一致。
数据分析和显像：微阵列的显著性分析(SAM)(Tusher等人，2001)(http://www-stat.stanford.edu/～tibs/SAM/)用于识别其表达在样品组之间明显改变的基因。SAM提供平均值或倍数变化中值(FC)和基于数据排列的假性发现率(FDR)置信百分数(倍数变化中值＞2且FDR＜5％)。能够比较卵丘细胞样品和颗粒细胞样品之间的基因表达谱的阵列分析首先基于显著的RNA检测(检测呼叫“存在”或“不存在”)，然后送到SAM(微阵列的显著性分析)以识别其表达在样品组之间明显改变的基因。为了根据胚胎质量和/或妊娠结果进行卵丘细胞样品之间基因表达谱的比较，在SAM之前使用差异系数(CV≥40％)和不存在/存在“检测呼叫”过滤器进行探针组的非监控选择。为了比较来自改变的(第3-4级)和良好(第1-2级)的胚胎发育或来自导致或不导致妊娠的胚胎的卵丘细胞的表达谱，我们用主成分分析(PCA)和分级群聚(de Hoon等人，2004；Eisen等人，1998)进行非监控分类。PCA包括基于通过RAGE网络界面(<http://rage.montp.inserm.fr)的R统计学软件的原序(Reme等人，2008)。用CLUSTER和TREEVIEW软件包进行基于改变探针的表达水平的分级群聚分析。为揭示功能生物学网络和最高经典通路，我们将基因表达信迹引入Ingenuity Pathway Analysis(IPA)软件(Ingenuity Systems，Redwood City，CA，USA)。
定量RT-PCR分析：对于qRT-PCR分析，根据其妊娠结果选择用于微阵列实验的10个CC样品(对应于10名患者，5个CC样品与阴性结果相关，5个CC与阳性结果相关)。来自患者的标记的cRNA(1μg)用于生产第一条cDNA链。这些cDNAs(5μl，1/10稀释度)用于根据制造商(Applied Biosytems)建议的实时定量PCR反应。20μl反应混合物由cDNA(5μl)、1μM引物和10μl Taqman通用PCR扩增混合物(TaqmanUniversal PCR Master Mix)(Applied Biosystem)组成。在40个循环期间用60℃的退火温度测定扩增。由TaqMan探针监控PCR反应的每循环步骤产生的PCR产物量。设置扩增曲线的指数生长期阈值，从中读出循环数(“Ct”代表“循环阈值”)。Ct值用于计算相对mRNA转录水平。测定PCR的有效性(E)。所述有效性通过对应于所用引物的标准曲线获得。使用ABI Prism 7000序列检测系统(Applied Biosystems)进行定量逆转录酶聚合酶链反应(QRT-PCR)，并使用以下公式使各样品标准化到PGK 1：E测试引物 ΔCt/EPGK1 ΔCt(E＝10-1/斜率)，ΔCt＝Ct对照-Ct未知，对照＝非妊娠组的一个CC样品。各样品的分析重复两次，该分析包括多个水空白。
结果
根据胚胎结果的CC的基因表达谱：为识别与胚胎结果有关的CC的基因表达谱，我们建立了各结果类别的基因表达信迹：未受精卵母细胞的CC、来自导致胚胎生长但大量分裂(第3-4级)的卵母细胞的CC以及来自导致胚胎生长而没有或有限分裂(第1-2级)的卵母细胞的CC。颗粒细胞样品作为参照组织(对照)。事实上，颗粒细胞是与CC紧密相关而与其他成人组织相反的细胞。该参照组织的使用降低了与粗谱系差异有关的差异表达基因数，因此促进CC/卵母细胞相关作用中的细微差异的识别。SAM分析显示未受精组中2605个基因、第3/4级组中2739个基因和第1-2级组中2482个基因上调，FDR＜5％。相反，分别有4270、4349和4483个基因下调。然后使这些列的基因交叉以测定其重叠。当449个上调表达基因和890个下调表达基因在所有三组中共有时，各类别显示特定的基因表达谱。有趣的是，860个上调基因(例如包括Galanin和Gap Junction A5(GJA5))以及1416个下调基因(包括HLA-G和EGR1)在与良好形态学胚胎质量有关的卵丘细胞中特异性调节。必须注意，尽管第1-2级的组显示强烈的基因表达谱，该组的妊娠结果各不相同，包括与导致妊娠(包括4个双胎妊娠)的胚胎有关的18个CC样品，以及与未能产生妊的娠胚胎有关的16个CC样品。
根据妊娠结果的CC的基因表达谱：因此CC样品与妊娠结果比较。SAM分析描述了在两组患者(妊娠对比未妊娠)之间明显改变(FDR＜5％)的630个基因的“妊娠结果”列表。PCA和分级群聚证实，该630个基因列表事实上将与妊娠有关的大部分CC样品从与未妊娠有关的样品中分离。值得注意的是，来自“妊娠结果”列表的基因在与良好结果有关的样品中明显上调。在来自与“妊娠”组有关的胚胎的10个CC样品的亚组中“妊娠结果”表达信迹特别显著。
妊娠结果基因列表的功能注释：为了研究与实现妊娠的胚胎有关的生物学方法，使用Ingenuity和Pubmed数据库来注释来自“妊娠结果”基因列表的630个基因。在过度表达与妊娠有关的基因中，最明显过度表达的通路是“氧化应激”、“TR/RXR激活”、“细胞周期的G2/M过渡期”、“生物体内异物代谢”和“NFKappaB”信号传导。这些通路中，最典型的基因是白细胞介素、趋化因子、衔接蛋白和激酶：IL1β(x4.5，在妊娠样品对比未妊娠样品，P＝0.001)、IL16(x4.8，P＝0.001)、IL8(x2.6，P＝0.007)、IL1RN(x2.1，P＝0.0051)、IL17RC(x3.6，P＝0.001)、TIRAP(x8.0，P＝0.001)、CXCL12(x3.1，P＝0.001)、CCR5(x2.6，P＝0.0051)和PCK1(x3.4，P＝0.001)。值得注意地，涉及细胞凋亡调节的许多基因在来自导致妊娠的卵母细胞的CC样品中明显调节。这些基因是BCL2L11(x6，9，P＜0.001)、CRADD(x2，P＝0.0036)、NEMO(x4.6，P＜0.001)、BCL10(x3.1，P＝＜0.001)、SERPINB8(x9.1，P＜0.001)和TNFSF13(x2.5，P＝0.0038)。
另一方面，同未妊娠有关的基因与以下通路相关：G2/M DNA损伤和细胞周期的检查点调节、“音猬蛋白(Sonic hedgehog)”、“IGF-1”、“补体系统”和“Wnt/β-连环蛋白”信号传导。与未妊娠有关的典型基因包括NFIB(x0.3，P＜0.001)、MAD2L1(x0.4，P＜0.001)和IGF1R(x0.4，P＜0.001)。
用于胚胎潜能的在CC中表达的候选基因：根据妊娠结果的CC的SAM分析识别表A的45个基因，所述基因是用于胚胎潜能的生物标记物，其能基于CC分析的基因表达将产生导致妊娠的胚胎的卵母细胞和产生不导致妊娠的胚胎的卵母细胞区分开。QRT-PCR用于独立证实微阵列数据。我们分析了来自未实现妊娠的第1-2级胚胎的CC和来自实现妊娠的第1-2级胚胎的CC中的36个上调基因和9个下调基因的差异表达。
结论
在大多数哺乳动物物种包括人类中，围绕卵母细胞周围的卵丘细胞在受精时仍然存在于输卵管中并保留直到胚胎移植。卵丘内部和周围的胞外基质重塑可能在所有这些步骤中起着关键作用。关于这点，我们识别了在卵丘细胞中表达的45个基因，其是用于胚胎潜能和妊娠结果的生物标记物。在我们的研究中，我们证明了围绕卵母细胞周围的CC的基因表达谱与不同的结果有关，从而识别相对于妊娠的胚胎生长的特定表达信迹。总之，我们发现了来自求助于ICSI或IVF患者的、导致不同妊娠结果的卵母细胞的人卵丘细胞之间的差异基因表达。我们的结果显示分析围绕卵母细胞周围的卵丘细胞是用于胚胎选择的非侵入性方法。通常可在采集卵母细胞后立即收集CC，可用基因组试验(G-试验)分析CC以评估胚胎潜能，然后可以基于G-试验结果选择用于新替换的胚胎。
实施例2：
为了测试45个基因列表的可靠性，我们进行了包括求助于我们的ICSI中心治疗男性不育症的年轻的(＜36岁)正常应答者患者的前瞻性调查。根据CC(第1组)的基因表达谱或根据形态学方面(用作对照的第2组)进行胚胎选择。对于各组，替换两个胚胎。对于第一批60名患者(30名患者/组)，在取卵当天，在第1组，各CC样品单独收集并处理，用于基因表达分析。分析CC样品(n＝267)。进行定量RT-PCR分析以测定CC中目标基因转录物的相对丰度，并从所有样品中获得用于所有生物标记物的表达数据。两组中的所有患者在第3天进行新胚胎移植。2组之间的比较显示移植和发展妊娠率/采集的显著差异(分别为40.0％vs.26.7％和70.0％vs.46.7；p＜0.05)。我们注意到第1组有5个双胎妊娠，而作为对照的第2组为0。另外，我们观察到形态学方面和CC基因表达谱之间没有关联。基于267个CC样品的分析，我们注意到27％的CC表达被预测能实现妊娠的胚胎的基因，42％的CC没有表达，31％的CC显示早期胚胎停止发育的基因表达。
选定的候选生物标记物列于下表B中。表B显示卵丘细胞中的基因组能预测不同的临床情况：(A)妊娠，(B)没有妊娠和(C)早期胚胎停止发育。
表B：预测性基因群
Figure BPA00001480516600191
Figure BPA00001480516600201
参考文献：
在本申请中，多个参考文献描述了本发明从属领域的现有状况。因此这些参考文献的公开以引用方式合并入本发明中。
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Claims (4)

1.用于选择感受态卵母细胞或感受态胚胎的方法，包括在围绕所述卵母细胞或所述胚胎周围的卵丘细胞中测定选自组A、组B或组C的一个或多个基因的表达水平的步骤，其中组A由PCK1、ADPRH、CABP4、SLAMF6、CAMTA1、CSPG2和PRF1组成；组B由FOSB、NLGN2、PDE5A、PLA2G5、GPC6和EGR3组成；以及组C由NFIB、NFIC、IGF1R、G0S2、GIRK5和RBMS 1组成。
2.用于选择感受态卵母细胞的方法，包括测定围绕所述卵母细胞周围的卵丘细胞中45个基因的表达水平的步骤，其中所述基因是WNT6、LRCH4、PAX8、CABP4、PDE5A、BCL2L11、PCK1、TCF20、SLAMF6、EPOR、CACNG6、NLRP1、PECAM1、NOS1、ATF3、KRTAP8、GRIK5、SLC24A3、SLC5A12、SLCA10A2、SLCO1A2、SLC25A5、MG29、NLGN2、PRKACA、FOSB、SIAT6、LOXL2、PRF1、ADPRH、APBB3、EGR3、CNR2、IFITM1、PLA2G5、CAMTA1、SOX4、NFIB、NFIC、RBMS1、G0S2、FAT3、SLC40A1、GPC6和IGF1R。
3.用于选择感受态胚胎的方法，包括测定围绕所述胚胎周围的卵丘细胞中45个基因的表达水平的步骤，其中所述基因是WNT6、LRCH4、PAX8、CABP4、PDE5A、BCL2L11、PCK1、TCF20、SLAMF6、EPOR、CACNG6、NLRP1、PECAM1、NOS1、ATF3、KRTAP8、GRIK5、SLC24A3、SLC5A12、SLCA10A2、SLCO1A2、SLC25A5、MG29、NLGN2、PRKACA、FOSB、SIAT6、LOXL2、PRF1、ADPRH、APBB3、EGR3、CNR2、IFITM1、PLA2G5、CAMTA1、SOX4、NFIB、NFIC、RBMS1、G0S2、FAT3、SLC40A1、GPC6和IGF1R。
4.权利要求1至3任一所述的方法，其还包括比较样品基因与对照基因的表达水平的步骤，其中检测到样品基因和对照基因之间的表达水平差异指示所述卵母细胞或胚胎是否是感受态的。
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