TR201815478T4 - Hamilelik sonucu için yüksek potansiyele sahip kompetent oositler ve kompetent embriyoların seçim yöntemi. - Google Patents

Abstract

Başvuru konusu buluş, uyumlu bir oosit veya uyumlu bir embriyonun seçim yöntemine ilişkindir.

Description

TEKNIK ALAN Basvuru konusu bulus, uyumlu bir oosit veya uyumlu bir embriyonun seçim yöntemine iliskindir. ÖNCEKI TEKNIK Yardila üreme teknolojisinde (ART) yapay ortamda dölleme (IVF) girisimlerini izleyen gebelik ve dogum oranlarlîdüsük kalmaktadlEl Gerçekten 3 IVF döngüsünden 2'si gebelik saglamada basarlglîlilîla sonuçlanIBken (SART 2004) transfer edilen 10 embriyonun 8'inden fazlasEl asllânamamaktadIEl(Kovalevsky ve Patrizio, gebelikten kaynaklanan erken dogumlarIA.B.D. saglilîlyardlülnaliyetlerinin yiIDEyaklasiEl890 milyon USD'sini olusturdugu tahmin edilmektedir (Bromer ve Seli, 2008).

Subjektif morfolojik parametreler, Tüp Bebek (IVF) ve intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu için kullanllâcak saglDZIEémbriyolarI seçiminde hala birincil kriterdir. Bununla birlikte bu tür kriterler embriyonun gücünü dogru olarak tahmin etmezler. Birçok çalisma; çesitli farklEI morfolojik kriterlerin daha dogru embriyo seçimini sagladiglElElgöstermistir (Balaban ve kriterleri transfer gününde degerlendirilir ve esas olarak erken embriyonik bölünme (tohumlamayülzleyen 25-27saat), ikinci veya üçüncü günde blastomerlerin saylEEle boyutunu esas aIlB Bununla birlikte son zamanlarda yapliân bir çalismada tohumlamaya yönelik oositlerin seçiminin, kaliteleri önemli olmaks- mevcut tüm embriyolarI transferine klýhsla ART'nin sonucunu artlüligllîgliösterilmistir (La Sala ve ark., 2008). Tüp bebek dölleme basarlîoranlarIEl artHnaK, yenisiyle degistirilmesi gereken embriyolarliîl say-Elazaltmak ve çogul gebelik oranlarIEUüsürmek Için en yüksek asllânma potansiyeline sahip yasayabilir embriyolarI tanIilanmasI gereke bulunmaktadlü Tüm bu nedenlerle halihazlîclla embriyo seçimi için çesitli biyolojik belirteçler arastlElIhaktadlEl (Haouzi ve ark.., 2008; Pearson, 2006). Hamilelikle sonuçlanan embriyolar hamilelikle sonuçlanmayan embriyolara klýiasla metabolomik profilleri bakIiIdan farkliIiIZi gösterdikleri için bazEçaIIginalar, girisimsel olmayan embriyo kültür ortamlllegerlendirmesi yoluyla tespit edilebilen bir moleküler imza tanIllama çabasEiçindedir (Brison ve ark.., 2004; Gardner ve Embriyonik gelisme sßsia genomik de genetik ve hücresel fonksiyonlar konusunda hayati önemde bilgi saglar. (McKenzie ve ark.., 2004) ve (Feuerstein ve ark.., 2007) siklooksijenaz 2 (COX2) gibi yigiI hücrelerdeki çesitli genlerin ekspresyonunun, oosit ve embriyo kalitesinin göstergesi oldugunu bildirmistir. Gremlin 1 (GREMl) hiyalüronik asit sentaz 2 (HASZ), steroidojenik akut düzenleyici protein (STAR), stearoiI-koenzim pozitif A desatüraz 1 ve 5 (SCDl, 5), amfiregulin (AREG) ve 3 pentraksininde (PTX3) embriyo kalitesiyle pozitif iliskili oldugu gösterilmistir (Zhang ve ark.., 2005). Daha yaklEl zamanda, embriyo gelisimi süsia erken bölünme oranlar. göre, insan kümülüs hücrelerinde bulunan glutasyon peroksidaz 3 (GPX3) kemokin reseptörü 4 (CXCR4), siklin DZ (CCNDZ) katenin delta 1 (CT NND1) elGpresyonunun embriyo kalitesiyle ters orantIIIJEJldugu gösterilmistir (Van Montfoort ve ark., 2008). Erken bölünme hamilelik testi için güvenilir bir biyolojik belirteç oldugu (Lundin ve hücrelerinde yalniîta birkaç gebelik sonucu genetik belirteçleri tanIiIamlStlE (Assou S ve BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulus, döllendiginde hamilelige neden olan yüksek hamilelik oran. sahip canliZI embriyonun üretilmesine yönelik bir oositin seçilmesi için bir yöntemle ilgilidir, ve su adIiIarEI içermektedir: a) söz konusu oositi kusatan kümülüs hücresi içerisinde 45 genin ekspresyon seviyesinin ölçülmesi, burada söz konusu genler WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, SIAT6, LOXL2, PRFl, ADPRH, APBB3, EGR3, CNRZ, IFITM1, PLA2G5, CAMTAl, SOX4, NFIB, NFIC, RBMSl, GOS2, FAT3, SLC kontrol içerisinde ölçülen seviyenin adli a)'da ölçülen söz konusu ekspresyon seviyesiyle klýhslanmasüsöz konusu kontrol, döllendiginde hamilelige neden olan yüksek implantasyon oranEile iliskili olarak bir canllZlembriyonun üretilmesini saglayan bir oositi kusatan bir kümülüs hücresidir; ve c) döllendiginde, adli b)'de söz konusu kontrol ve oositin araletlaki diferansiyel ekspresyon ölçüldügünde hamilelige yol açan yüksek implantasyon oranEile iliskili canlßmbriyonun oosit taraflEUan üretilmeyeceginin degerlendirilmesi. Mevcut bulus aynüamanda hamilelige neden olan yüksek implantasyon oranlEla sahip bir embriyonun seçilmesine yönelik bir yöntemle ilgili olup, su adIiIarEiçermektedir: a) embriyoyu kusatan kümülüs hücreleri içerisinde 45 genin ekspresyon seviyesinin ölçülmesi, burada söz konusu genler WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, BCL2L11, PCK1, TCFZO, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRP1, PECAMi, NOSl, ATF3, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRFl, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMSl, GOSZ, FAT3, SLC bir kontrolde ölçülen seviye ile adli a)'daki ölçülmüs olan ekspresyon seviyesinin klýlaslanmasü burada söz konusu kontrol canIIIlfetüse neden olan bir embriyoyu kusatan bir kümülüs hücredir ve c) ad! b)'de söz konusu oosit ve söz konusu kontrol arasIaki diferansiyel ekspresyonu ölçüldügünde canlEbir fetüse söz konusu embriyonun neden olmayacagi.. degerlendirilmesi. Mevcut tarifname (bulusun bir parçasütlegil) aynllamanda kompetent bir oosit veya kompetent bir embriyonun seçilmesine iliskin yöntemle ilgilidir, ve bu yöntem söz konusu embriyo veya söz konusu oositi kusatan kümülüs hücresi içerisinde A, B veya C gruplarIan seçilen bir veya daha fazla genin ekspresyon seviyesinin ölçülmesi admIEl içermektedir, burada grup A PCK1, ADPRH, CABP4, SLAMF6, CAMTA1, CSPGZ ve PRF1'den; grup B ise FOSB, NLGN2, PDE5A, PLA2G5, GPC6, ve EGR3'ten; ve grup C NFIB, NFIC, IGF1R, GOSZ, GRIK5 ve RBMSl'den meydana gelmektedir.

A grubundan seçilen bir genin daha çok ekspresyonu gebeligi saglayacak güçlü bir oosit veya embriyonun öngörücüsüdür. A grubundan seçilen bir genin daha çok ekspresyonu gebeligi saglayacak güçlü bir oosit veya embriyonun öngörücüsüdür.. C grubundan seçilen bir genin daha çok ekspresyonu erken embriyo durmasünedeniyle güçsüz oosit veya embriyonun öngörücüsüdür.

BULUSUN AYRINTILI AÇIKLAMASI Bulus sahipleri kümülüs hücrelerinde, embriyo potansiyeli ve gebelik sonucu için biyolojik belirteçler olan bir takIi genler belirlemislerdir. Bulus sahipleri oositi çevreleyen kümülüs hücrelerinin gen ekspresyon profilinin farkllgebelik sonuçlarüla orantllIbldugunu göstererek gebelige yönelik olarak embriyolarI belirli ekspresyon imzasII tanllanmasIEl saglamlglardlü UlasthlarEtonuçlar, oositi çevreleyen kümülüs hücrelerinin analizinin embriyo seçimi için girisimsel olmayan bir yaklasIi oldugunu göstermektedir. Önaörûcû seriler/h kümesi.' Bulusa ait tüm genler halihazlîrtla bilinmekte olup asagi Table ve B'de gösterilmektedir.

Tablolar A ve B; kombine ekspresyonu gebelige yol açacak derecede yüksek tohumlanma potansiyeline sahip güçlü bir oositin seçimi veya güçlü bir embriyonun seçimi için bilgi verici nitelikte oldugu gösterilmis olan gen gruplarlügösterir.

Gen Simgesi Gen adi] Gen WNT6 kanatslîltip MMTV (fare memeli tümör virüsü) entegrasyon bölgesi ailesi, üye alanEl 4034 PAX8 eslesmis kutu 8 7849 CABP4 kalsiyum baglayIEIIiîirotein 4 57010 PDESA fosfodiesteraz 5A, cGMPspesifik 8654 SLAMF6 SLAM aile üyesi 6 114836 EPOR eritropoietin reseptörü 2057 CACNG6 kalsiyum kanalD/oltaj bagIiILIlgama alt-birimi ailesi prin alanEl 22861 PECAM1 trombosit/ endotelyal hücre yapIStna molekülü 4842 ATF3 aktive edici transkripsiyon faktörü 3 467 KRTAP8 keratin iliskili protein 8-1 337879 GRIKS glutamat reseptörü, iyonotropik, kainat , üye 3 57419 SLC5A12 çözünen tasElEEilesi 5 (sodyum / glukoz ortak taslîLlEDJ üye , Üyesi 2 6555 SLCOIAZ çözünen tasmrganik anyon taslýlîßilesi, üyesi 1A, 292 MG29 veya SYPL2 Sinaptofizin benzeri 2 284612 NLGN2 nörolijin 2 57555 PRKACA proteinkinaz, cAMP bagnlEkataIitik, alfa 5566 FOSB FB] slglangilosteosarkoma viral onkogenhomologu B 2354 SIAT6 ST3 beta-galaktozid alfa-2,3-sialil-transferazB 6487 LOXLZ lisiloksidaz benzeri 5551 ADPRH ADP-ribozilarjininhidrolaz öncül protein baglayEüailesi B, üyesi 3 10307 EGR3 Erken büyüme yaniÜB 8519 PLA2G5 fosfolipaz A2 Grup V 5322 CAMTAl kalmodülin baglayIEEEranskripsiyon aktivatörü -kutusu 4 6659 NFIB nükleer faktör I / B 4782 RBMSl RNA baglaylîlînotifi, tek dizili protein 1 etkilesen mahsur 5937 GPC6 glipikan 6 10082 Bulusun amacügüçlü bir oositin seçimine yönelik bir yönteme iliskin olup yöntem sözü edilen oositin etraf-aran bir kümülüs hücresindeki 45 genin ekspresyon seviyelerinin ölçümü adl- Bu tarifnamede kullan ilân "güçlü oosit" terimi, döllendigi zaman gebelige yol açacak derecede yüksek asliânma oran. sahip yasayabilîr bir embriyo üreten disi gamet veya yumurtasü anlam. gelir.

Bulusa göre, oosit dogal bir döngüden, modifiye bir dogal döngüden veya cIVF (klasik tüp dölleme) veya ICSI (Intrastoplazmik sperm enjeksiyonu). "Dogal döngü" terimi, bir disi veya kad- bir oosit ürettigi dogal döngüyü ifade eder "Modifiye dogal döngü" terimi, rekombinan FSH veya hMG ile iliskili GnRHantagonistleriyle yapilan hafif bir yumurtalllîluyarlüaltia bir disinin veya kad_ bir veya iki oosit ürettigi prosesi isaret eder. "UyarllBiIgl döngü" terimi, GnRH agonistleri veya rekombinant FSH ya da hMG ile iliskili antagonistleriyle yapilan yumurtalllguyarli ßItIa bir disinin veya kad_ bir veya iki oosit ürettigi prosesi isaret eder.

Bu hücrelerin oosite; beslenme, enerji veya döllenme sonrasIa yasayabilir bir embriyo üretmeleri için gerekli diger gereksinimlerin bazllârII saglanmasi dahil olduguna inanilBiaktadlEl Bulusa ait yöntemler ilave olarak örnekteki genlerin ekspresyon seviyelerinin kontrol faktörüyle karsllâstülüiasßdan olusan bir acIIi içermekte olup bu adnda örnek ve kontrol faktörü arasIa tespit edilen gen ekspresyon oositin güçlü olup olmadlgIII göstergesidir. Kontrol faktörü güçlü bir oositle iliskili kümülüs hücreleri içeren bir örnekten veya döllenmemis bir oositle iliskili kümülüs hücreleri içeren bir örnekten olusabilir.

Bulusa ait yöntemler tercihen kadIara uygulanabilir ancak diger memelilere de (örn.. primatlar, köpekler, kediler, domuzlar, inekler...) uygulanabilir.

Bulusa ait yöntemler özellikle yapay ortamda dölleme tedavisinin etkililigini degerlemek için uygundur. Bu dogrultuda bulusta aynüamanda bir disi denekte kontrollü yumurtalllZJ hiper uyariEKCOS) protokolünün etkinligini degerleme amaçlEbir yöntem tarif edilmekte olup yöntem asaglîilaki adnlarElkapsamaktadIB i) sözü edilen disi denekten kümülüs hücreleriyle birlikte asgari bir oositin elde edilmesi, ii) bulusa ait bir yöntemle sözü edilen oositin güçlü bir oosit olup olmadlgill belirlenmesi.

Bu yöntemden sonra embriyolog güçlü oositleri seçebilir ve bu oositleri klasik in vitro dölleme (CMF) protokolü veya bir intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu (ICSI) protokolü yoluyla yapay ortamda dölleyebilmektedir.

Bulusun ilave bir amacEkontrollü yumurtallEJ hiper uyarnEKCOS) protokolünün etkinligini izleme amaçllîlbir yöntem tarif edilmekte olup yöntem asaglEllaki adIilarERapsar: i) Sözü edilen kadIan dogal, modifiye veya uyarllÜilgl döngüler altIa, kümülüs hücreleriyle birlikte asgari olarak bir oositin izole edilmesi, ii) bulusa ait bir yöntemle sözü edilen oositin güçlü bir oosit olup olmadiglII belirlenmesi. iii) Güçlü bir oosit üretip üretmedigine göre COS tedavisinin etkinliginin izlenmesi.

COS tedavisi GnRH agonistleri veya rekombinan FSH ya da hMG iliskili GnRHantagonistlerinden olusan gruptan seçilen asgari olarak bir etken bilesene dayandlülâbilir.

Basvuru konusu bulus aynElzamanda, güçlü bir embriyonun seçimine yönelik bir yönteme iliskin olup yöntem sözü edilen embriyoyu çevreleyen bir kümülüs hücresindeki 45 genin ekspresyon seviyelerinin ölçümü adnIEiçerirken sözü edilen genler; WNT6, LRCH4, PAX8, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4'ün, NFIB, NFIC, RBMSl, GOSZ, FAT3, SLC40A1, GPC6 ve IGFlR'dir. klasik yapay ortamda döllenme (cIVF) veya intrasitoplazmik spremenjeksiyonu (ICSI) protokolü altIa müdahale yapllâbilir. spermlerle döllendigi bir prosesi ifade eder. IVF dogal ortamda gebelik basarlîlîl oldugu durumda kullanllân basIlEb tedavi yöntemidir. "intrasitoplazmik sperm enjeksiyonu" ya da islemini ifade eder. Bu islem en yaygI olarak erkek kEIElilEl faktörlerinin üstesinden gelmek için kullanllBiasI karsI spermlerin oositlere kolayca nüfuz edemedigi durumlarda ve nadiren, özellikle sperm bagEElIe baglant[[[l])ir yapay ortamda dölleme yöntemi olarak da kullanillEl embriyoyu ifade eder. "Yüksek asllânma oranlII terimi rahim ortam- aktarIIglia embriyonun rahim ortam a asllânma ve yasayabilir bir fetüs olusumu saglama ve dolaylîlîila sözü edilen gebeligi sonlandlüicak bir islem veya olay olmaks- yasayabilir bir yavru gelistirme potansiyelini ifade eder.

Bu bulusta tarif edilen yöntemler ayrlîla, örnekteki genlerin ekspresyon seviyelerinin kontrol faktörüyle karsllâstlüllîhasian olusan bir ad! içerebilirken bu adlda örnek ve kontrol faktörü aras-a tespit edilen gen ekspresyon farkDembriyonun güçlü olup olmadig1II göstergesidir. Kontrol faktörü güçlü bir yasayabilir bir fetüs meydana getiren bir embriyoyla iliskili kümülüs hücrelerini içeren bir örnekten veya yasayabilir bir fetüs meydana getirmeyen bir embriyoyla iliskili kümülüs hücrelerini içeren bir örnekten olusabilir.

Bulusa ait yöntemlerin embriyo morfolojik konulardan bagnslîlllîl saglad[gll:bilinmelidir. Iki embriyo aynElmorfolojik özelliklere sahip olabilir ancak bulusa ait bir yöntemle gebelik saglayan farkIElîbir asllânma oranlîgiösterebilir.

Bulusa ait yöntemler tercihen kadIara uygulanabilir ancak diger memelilere de (örn.. primatlar, köpekler, kediler, domuzlar, inekler...) uygulanabilir.

Basvuru konusu bulus aynüamanda, bir embriyonun güçlü olup olmadiglll belirlenmesine yönelik bir yönteme de iliskin olup yöntem sözü edilen embriyoyu çevreleyen bir kümülüs hücresindeki 45 genin ekspresyon seviyelerinin ölçümünden olusan bir adnEiçerirken sözü GPC6 ve IGF1R'dir.

Basvuru konusu bulus ayri& bir embriyonun güçlü bir embriyo olup olmadiglIEbelirleme amaçlEbir yönteme iliskin olup yöntem asaglîilaki ad Iarüçerir: i) kümülüs hücreleriyle birlikte bir oositin elde edilmesi, ii) sözü edilen oositin yapay ortamda döllenmesi iii) bulusa ait yöntem yoluyla adli (i)de elde edilen sözü edilen oositin güçlü bir oosit olup olmad [glEl belirlenerek adIi (ii)'den saglanan embriyonun güçlü olup olmad [glll belirlenmesi.

Mevcut bulus aynElzamanda A, B veya C gruplarlEdan seçilen bir veya daha gazla genin elGpresyon seviyesinin söz konusu oosit ve söz konusu embriyonun etraflükusatan kümülüs hücre içerisinde ölçülmesi adIIElçeren bir kompetent oosit veya kompetent embriyonun seçilmesi için yöntemle ilgilidir, burada A grubu PCK1, ADPRH, CABP4, SLAMF6, CAMTA1, CSPG2 ve PRFl genlerinden, B grubu FOSB, NLGNZ, PDESA, PLA2G5, GPC6, ve EGR3 genlerinden ve C grubu NFIB, NFIC, IGFlR, GOSZ, GRIKS ve RBMSl genlerinden olusmaktadlî.! A grubundan seçilen bir genin daha çok ekspresyonu gebeligi saglayacak güçlü bir oosit veya embriyonun öngörücüsüdür. B grubundan seçilen bir genin daha çok ekspresyonu güçlü olmayan bir embriyonun öngörücüsü olup embriyo asllânma yeterligine sahip degildir. C grubundan seçilen bir genin daha çok ekspresyonu erken embriyo durmasüliedeniyle güçsüz oosit veya embriyonun öngörücüsüdür.

Sözü edilen bir veya daha fazla gen örnegin yalnlîta A grubu, yalnlîi:a B grubu veya yalnlîta Tipik olarak 1, 2, 3, 4, 5, 6 veya 7 genleri A grubundan seçilebilmektedir.

Tipik olarak 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 genleri B grubundan seçilebilmektedir.

Tipik olarak 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 genleri B grubundan seçilebilmektedir.

Alternatif olarak sözü edilen genler örnegin A ve B gruplarlEUan, A ve C gruplarlîidan, B ve C gruplarIan veya A, B ve C gruplarlEtlan seçilebilmektedir. grubundan ve 0, 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 genleri C grubundan seçilebilmektedir. grubundan ve 0, 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 genleri C grubundan seçilebilmektedir. grubundan ve 1, 2, 3, 4, 5 veya 6 genleri C grubundan seçilebilmektedir.

Bulusa ait yöntemler özellikle bir disinin gebelik sonucunu iyilestirmek için uygundur. Bu dogrultuda bulus aynDzamanda asaglöhkileri içeren bir disinin gebelik sonucunu iyilestirme amaçIEliiir yöntem tarif edilmekte olup yöntem asaglki ad IarEiÇermektedir: i) bulusa ait bir yöntem uygulanarak güçlü bir embriyo seçimi, ii) adli (i)'de seçilen embriyo sözü edilen disinin rahmine asüânmasü Yukarlîilla tarif edildigi gibi yöntem bu sayede yetersiz gebelik sonucu potansiyeline sahip embriyolarI rahme transferini önlemesi konusunda embriyologa yardIicüilacaktE Yukari tarif edildigi gibi yöntem ayrlîa, asiiânma ve gebeligi saglayabilen güçlü bir embriyonun seçimi yoluyla çoklu gebeligin önüne geçmek için özellikle uygundur.

Yukarlki tüm durumlarda yöntemler, kümülüs hücrelerinin gen ekspresyou ile embriyo ve gebelik sonuçlarüirasiaki iliskiyi tarif etmistir.

Gen/erin ekspresyon seviyeler/77177 belirlenmesi yöntem/eri' Yukari yer verilen Tablolar A ve B'de tarif edilen genlerin ekspresyon seviyelerinin belirlenmesi, çesitli tekniklerle gerçeklestirilebilir. Genel olarak belirlendigi gibi ekspresyon seviyesi göreli bir ekspresyon seviyesidir.

Daha tercihen belirleme örnegin sondalar, primerler veya Iigandlar gibi seçici belirteçlerle temas ettirilip bu sayede örnekte ilgi konusu polipeptit veya nükleik asitlerin orijinal olarak varligiII tespiti veya miktarII ölçümünü içerir. Temas plaka, mikrotitre tabak, deney tüpü, kanal, cam, kolon ve benzeri her türlü uygun cihazda gerçeklestirilebilir. Özel yapllând iEinalarda temas, bir nükleik asit dizisi veya belirli bir Iigand dizisi gibi belirteçle kapllZl bir substrat üstünde gerçeklestirilir. Substrat cam, plastik, naylon, kaglt] metal, polimerler ve benzerini içeren her türlü uygun destek gibi katü/eya yarEkatElbir substrat olabilir. Substrat bir cam plaka, bir membran, kolon, jel vb. gibi çesitli biçim ve boyutlarda olabilir. Temas, belirteç ile örnegin nükleik asitleri veya polipeptitleri arasIa olusacak, bir nükleik asit hibrid veya bir antikor-antijen kompleksi gibi tespit edilebilir bir kompleks için uygun her türlü kosul altIa gerçeklestirilebilir.

Tercih edilen bir yapüândünada ekspresyon seviyesi mRNA miktarEIbelirlenerek tayin edilebilir. mRNA miktar tayini yöntemleri teknikte iyi bilinmektedir. Mesela örneklerin içerdigi nükleik asit (örn. hastadan hazlîlianan hücre veya doku) önce standart yöntemlere göre, örnegin Iitik enzimler ya da kimyasal çözeltiler kullanllârak özütlenir veya imaIatçEtaIimatIarElzlenerek nükleik asit baglaylEElreçinelerle özütlenir. SonrasIa özütlenenmRNA melezleme (örn.

Northernblot analizi) ve/veya çogaltma (örn. RT-PCR) yoluyla tespit edilir. Tercihen nicel veya yarlîiiicel RT-PCR yeglenir. Gerçek zamanlüiiicel veya yarüiiicel RT-PCR özellikle avantajIIE Diger Çogaltma yöntemleri; Iigaz zincir reaksiyonu (LCR), transkripsiyon aracHIDçogaltma (TMA), dizi yer degistirme çogaltmasHSDA) ve nükleik asit sekansElbazlEogaltmayEiNASBA) Asgari 10 nükleotidi bulunan ve bu tarifnamede ilgi konusu olan mRNA'ya sekans tamamlaylEiHKJ veya homoloji gösteren nükleik asitler melezleme sondalar veya çogaltma primerleri olarak kullanIi alanElbulur. Bu tür nükleik asitlerin tamamen aynEioImasEl gerekmedigi ancak tipik olarak klýlaslanabilir boyutta homolog bölgeyle asgari % 80, daha tercihen % 85 ve hatta daha da tercihen % 90-95 aynEioldugu anlasilBiaktadlEl Belirli yapliândiîrlnalarda melezleme taramasüçin nükleik asitlerin taranabilir etiketler gibi uygun araçlarla bir arada kullanHfhasüvantajlüilacaktlü Flüoresan, radyoaktif, enzimatik veya diger Primeler tipik olarak 10 ila 25 arallglEtlanükleotit uzunlugunda daha ki& dizili, çogaltilâcak ilgi konusu nükleik asitle mükemmel biçimde uymak veya hemen hemen mükemmel biçimde uymak Üzere tasarlanan nükleik asitlerdir. Sondalar ve primerler melezlenecekleri nükleik asitlere "özel"dir yani tercihen yüksek hassasiyette melezleme kosullarEialtIa (en yüksek erime sükllglüa karsililîi gelen, örnegin,% 50 formamid, 5x veya 6x SCC. SCC 0.15 M,NaCI, 0.015 M Na-sitrat) melezlenirler.

Yukarüia belirtilen çogaltma ve taramada kullanliân primerler ve sondalar bir kit olarak bir araya getirilebilir. Bu tür bir kit konsensüsprimerleri ve moleküler sondalarEiçerir. Tercih edilen bir kit ayrlEla, çogaltmanl olusup olusmadlgillîbelirlemek için gerekli bilesenleri de içerir. Kit ayrüa, örnegin PCR tampon ve enzimlerini, pozitif kontrol sekanslarIÇireaksiyon kontrol primerlerini ve belirli sekanslarlîç'ogaltma ve taramaya yönelik talimatlarüçerebilir. Özel bir yapilândiülnada bulusa ait yöntemler; kümülüs hücrelerden özütlenen toplam RNA'IarI eldesi ile RNA'IarlEi özellikle nicel veya yarüîicel RT-PCR yoluyla çogaltmaya tabi tutulmasEi/e belirli sondalara melezlenmesi adllarEJberir.

Bir diger tercih edilen yapilândlElnada ekspresyon seviyesi DNA çip analiziyle belirlenir. Bu tür DNA çipi veya nükleik asit mikro dizisi, kimyasal olarak substrata baglanan farkllîihükleik asit sondalardan olusabilmekte olup bu bir mikro çip, cam plaka veya mikroküre boyutunda boncuk olabilir. Bir mikroçip polimerler, plastikler, reçineler, polisakaritler, silika ya da silika- tabanlüinalzemeler, karbonlar, metaller, inorganik camlar veya nitroselülozdan olusturulabilir.

Sondalar 10 ila 60 aral[glEüa baz çifte sahip cDNA'Iar veya oligonükleotitleri içerebilir.

Ekspresyon seviyesini belirlemek için bir test deneginden aIiEian ve istege baglEblarak önce ters transkripsiyona tabi tutulan bir örnek etiketlenerek melezleme kosullarEI alta mikrodiziyle temas ettirilip, mikrodizi yüzeyine baglanan sonda sekanslar. tamamlaylüjblan hedef nükleik asitler aras-a komplekslerin olusumu saglaniü Etiketlenen melezlenmis kompleksler sonrasiEUa taranarak nicelenebilir veya yarEliicelenebilir. Etiketleme çesitli yöntemlerle, örnegin radyoaktif veya flüoresan etiketleme yoluyla saglanabilir. Teknikte uzman kisiler için mikrodizi melezleme teknolojisinin pek çok çesitlemesi mevcuttur (bkz. örn.

Bu baglamda ayriEla, tablo A veya B'de listelenen genlere özel nükleik asitleri tasiyan bir katEi destek içeren bir DNA çipi tarif edilmektedir.

Sözü edilen genlerin ekspresyon seviyesini belirleme amaçlEUiger yöntemler, sözü edilen genlerce kodlanan protetinlerin miktarII tayinini içerir.

Bu tür yöntemler, örnegin, örnekte mevcut bir gösterge protein ile seçici olarak etkilesme yetisine sahip bir baglaylEEbrtak ile temas ettirilmesini içerebilir. BaglayIEEbrtak genellikle, poliklonal veya monoklonal, tercihen monoklonal olabilen bir antikordur.

Proteinin varltglîl standart elektroforetik ve rekabet, dogrudan reaksiyon veya sandviç tipi deneyler gibi baglSIEliKl deneyleri deneyleri içeren baglgEliEl tanilâma teknikleri kullanlErak taranabilir. Bu tür deneyler sayiiânlarla sIlEilZblmamamk üzere Western blot, aglütinasyon testleri, ve ELISA'lar ; biotin / avidin tip deneyleri; radyoimmünoanalizler; immünoelektrofez; immünopresipitasyon vb. gibi enzim etiketli ve aracHJIbaglglKlllZl testlerini içerir. Reaksiyonlar genel olarak floresan, kemiluminesen radyoaktif, enzimatik etiketler gibi açlgh vurma etiketlerini veya boya molekülleri ya da antijen ve antikor arasIa bir kompleks olusumunu veya bununla birlikte reaksiyona ugrayan antikorlarßaptama amaçllîlliger yöntemleri içerir.

Yukar- belirtilen deneyler genel olarak, likit fazdaki baglanmamlgl proteinin, antijen-antikor komplekslerinin bagland[glîkatEllabanllJlestekten ayrlgtlîllüiasüüçerir. Bulusun uygulamasIa kullanllâbilecek katIZldestekler; nitroselüloz, (. Örn., zar veya mikrotitre hazne formunda), polivinilklorür (örn., yaprak ya da mikrotiter ); polistiren Iateksler (örnegin boncuk veya mikrotitre plakalar); polivinilidin flüorür; diazotize kaglEl naylon zarlar; aktive boncuklar, manyetik duyarllîboncuklar ve benzerlerini içerir.

Daha özel olarak bir ELISA yöntemi kullanllâbilmekte olup yöntemde mikrotiter plaka hazneleri test edilecek proteine karsEbir antikorla kaplanIEl SonrasIa gösterge proteini içeren veya içerdiginden süphelenilen biyolojik bir örnek kaplanmgl haznelere eklenir.

Antikor-antijen komplekslerinin olusumuna izin verecek kadar yeterli bir kuluçkalama süresinden sonra plaka(lar) yllZlanarak baglanmamlSl klîlEiilar alIlE ve algllânabilir etiketli ikincil baglaylEElbir molekül eklenir. Ikincil baglaylîlîlmolekülün tutulan her türlü örnek gösterge proteini ile reakte olmasESaglanB plaka ylElanlElve teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilârak ikincil baglaylîlînolekülün varl[glEliaranlEl Alternatif olarak bir immünohistokimya (IHC) yöntemi tercih edilebilir. IHC özellikle, bir örnek veya doku numunesinde yerinde hedefleri taramaya yönelik bir yöntem sunar. IHC'de örnegin genel hücresel bütünlügü korunarak bu sayede ilgi konusu hedeflerin hem varl[g]ü hem de yerinin tespiti saglanE Tipik olarak bir örnek formalin ile sabitlenir, parafin içine gömülür ve lekeleme için bölümler halinde kesilir ve sonraleda EllZlmikroskopisi ile incelenir.

Güncel IHC yöntemleri hem dogrudan etiketleme, hem ikincil antikor bazlljwem de hapten bazlü etiketlemeyi kullanlB Bilinen IHC sistemlerinin örnekleri; EnVision(TM) (DakoCytomation), Powervision(R) (Immunovision, Springdale, AZ), NBA (TM) kit (ZymedLaboratoriesInc., Güney San Francisco, CA), HistoFine(R) (NichireiCorp, Tokyo, Japonya) Özel bir yapllândlElnada bir doku kesiti (örn. kümülüs hücreleri içeren bir örnek), ilgi konusu genlerin kodladlglîproteinlere karsEkuIlanllân bir antikorla kuluçkalamadan sonra bir cam plaka veya baska bir destek üzerine konur. Sonrasia, uygun bir katülestege konan örnek üstünde mikroskopik incelemeler gerçeklestirilebilir. Fotomikrograf üretimi için örnekleri içeren kesitler, seçici Iekeleme yoluyla ilgi konusu proteinleri vurgulamak üzere cam bir tabaka veya diger düzlemsel bir destek üzerine konabilir.

Bu nedenle IHC numuneleri örnek olarak: (a) kümülüs hücreler içeren preparatlarllb) sözü edilen sabit ve gömülü hücreleri ve (c) sözü edilen hücre örneklerinde ilgi konusu proteinlerin taranmaslü içerebilir. BazEIyapilândlîiinalarda IHC Iekeleme islemi; doku kesme ve düzenleme, dehidrasyon, parafin süzdürme, ince kesitlere bölme, cam plakalar üstüne koyma, f-ama, parafinden arIHna, rehidrasyon, antijen dönüsü, blokaj adllarübirincil antikorlarI uygulanmasÇi (istege baglljblarak uygun taranabilir bir etikete baglanmlsb ikincil antikorlarI uygulanmaslZI yilZlama, kars[El Iekeleme ve mikroskopik inceleme adnlarIEl içerebilir.

Bulus aynEtamanda yukari bahsedildigi sekilde yöntemlerin gerçeklestirilmesini saglayan kitle ilgilidir, burada söz konusu kit, ekspresyon seviyelerini ölçmeye yarayan elemanlarIZI içermekte olup burada tablo A veya B'deki genlerin seviyeleri oosit veya embriyonun kompetent olup olmad [gilügiöstermektedin Bulus aynüamanda Istem 1 veya 2'ye göre yöntemin gerçeklestirilmesi için bir oosit veya embriyoyu kusatan bir kümülüs hücresi içerisinde 45 genin ekspresyon seviyesini spesifik olarak ölçmeye yönelik elemanlarElçeren bir kitin kullanIilIiIe ilgilidir, burada: söz konusu GPC6 ve IGF1R'dir. Bulus ilave olarak asag-ki sekiller ve örneklerle açlElanmaktadlEI Fakat bu örnekler ve sekillerin mevcut bulusu hiçbir sekilde sIlBiandlîilnak amaclsîla verilmedikleri göz önünde bulundurulmalIE Bulus asagüia yer alan sekiller ve örneklerle daha ayrIEtEIJII olarak gösterilecektir. Bununla birlikte bu örnekler ve sekiller hiçbir sekilde, basvuru konusu bulusun kapsam lElBIEIlaylEElbir sekilde yorumlanmamalIlB ÖRNEKLER: INSAN KÜMÜLÜS HÜCRELERININ GEN EKSPRESYON PROFILLERI YOLUYLA EMBRIYO POTANSIYELINI DEGERLEME AMAÇLI GIRISIMSEL OLMAYAN TEST ÖRNEK i Mategal ve Metot: Hastalar ve IVF tedavisi: Bu geriye dönük çalismada 30,9 yaslaria ± 2,5 olan ve merkezimize ICSI (IntraSitoplazmik Sperm Enjeksiyonu) için basvuran hastalar normo yanthylEEhastalar (n=30) üzerinde çallgllß'ilgtlü Hastalar rekombinan GnRH agonisti veya antagonisti ile FSH (Sßslýla Merck-Serono ve Organon'a ait GonaIF, Puregon olan) veya hMG (Menopur, Ferring) kombinasyonu ile uyarllüilgtlîl YumurtalllZJ yanlîllîberum östradiol seviyesi ve folikül gelisimini izlemek üzere ultrason muayenesi ile degerlendirilmistir.

Oositlerin dönüsü hCG uygulamasIdan ( 36 saat sonra, ultrason yönlendirmesiyle yapilîilâtlîl Embriyo kalitesinin belirlenmesi: Mikro enjeksiyonu izleyen 2. ve 3. günlerde ferdi olarak kültürlenen embriyonun kalite parametreleri, blastomer saylgü/e parçalanma derecesi kriter olarak kullanllöiak yokuyla degerlendirilmistiR (seviye 1-2 esit boyutlu blastomerler ve % 0-20 parçalanma, seviye 3-4: esit boyutlu olmayan blastomerler ve % 20'den fazla parçalanma). En üst kalite olan bir embriyo 3. günde esit boyutlu blastomerler ve parçalanma olmayan durumda 6-8 hücre olarak tanIilanmlgtlEl Bir veya iki embriyo oosit dönüsünden 3 gün sonra transfer edilmistir. Klinik gebelik embriyo transferinden iki ve altEhafta sonra, süsü-da Beta-hCG ve ultrason muayenesi (kalp atlSJEgebeIik kesesi varllglD] esas aI-rak degerlendirilmistir.

Kümülüs hücreleri: Tüm kümülüs hücre örnekleri (CC) yumurta toplama gününde dondurulmustur. Sonrasßda hasta bas. bir ila 3 adet CC örnegi mikro dizi analizi için rassal olarak seçilmistir. Tek tek 50 oositten toplam 50 CC örnegi toplanarak tek tek analiz edilmistir: ve döllenmemis oositlerden 5 CC (n= 5 hasta) (Tablo 1).

Tablo 1: Bu çallgi'nadaki kümülüs hücre örneklerinin özellikleri hasta 5 Hasta 45 CC 5 CC 61/2 (34 CC) G3/4 (11 CC) Döllenmemis oositlerden alIn kümülüs hücreleri çip saylîEl 18 16 11 5 hasta saylîü 11 9 10 5 CC saylîEl 18 16 11 5 CC: kümülüs hücreleri, P +: pozitif gebelik sonuçlu embriyolardan aI-n kümülüs hücreleri, P-: gebelik sonucu olmayan embriyolardan alln kümülüs hücreleri, Gl/2: seviye 1-2 embriyolardan allBhn kümülüs hücreleri, G3/4: seviye 3-4 embriyolardan alin kümülüs hücreleri, NT: transfer yok.

Veri analizi, çift bilmezlik kosullarüaltlEUa gerçeklestirilmis olup gebelik sonucu ancak mikro diziler melezlendikten sonra açllZlanmlStlEl Gebelik sonucuna iliskin olarak döllenmis oositlerden alin 45 CC; gebelik sonucu vermeyen seviye 1-2 embriyolardan alin 16 CC (n=9 hasta), pozitif gebelik sonucuyla iliskili 18 CC (n: 11 hasta) ve transfer edilmeyen seviye 3-4 embriyolardan alin 11 CC'yi içermistir. Kümülüs hücreleri oosit geri kazanIilEtlan hemen sonra slýtllBiIStlEImCG uygulamaslüzleyen <40 saat olan bir sürede) Kümülüs hücreler mekanik olarak çllaarllIEl kültür ortamlEUa yllZlanmlgl ve hemen RLT RNA ekstraksiyon tamponunda (RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA, ABD) -80°C'de dondurulmus ve sonrasIda RNA ekstraksiyonu yapIJBilîstlB Granüloz hücreleri: Granülöz hücre toplamasE[8 örnek) için erkek klglîllüîl faktörü nedeniyle bagIislîI bir grup seçilmistir. Oosit geri kazanIiIdan hemen sonra aynEIhastaya ait olgunlasmlgl foliküllerden al-n foliküler slîllâr (> 17 mm) kümülüs oosit kompleksinin çllêrllüîaslülakiben havuzlanmlgve bir örnegi temsil eden 50 ml gruplar halinde 1/3 hacimli HBSS çözeltisi (BioWhittaker) içinde sulandlEllB1lStlEl Granülöz hücre saflastülna, (Kolena ve ark.., 1983)'a ait protokoldan uyarlanmlstE SaIlEtak kovada 500 g içinde 20 dakika santrifüjden sonra granüloz hücreleri bir Ficoll tamponu (12 ml Lenfosit ayrlStlEina ortamü BioWhittaker) üstünde toplanmlStlEl Granüloz hücreler HBSS ve PBS'de basarlsîla yilîlanmlgl kan liziztampounda (KHCO 5 dakika kuluçkalanarak külnlZZI kan hücreleri çilZlarllJ-:hlgl sayEIIEl PBS'depeIetIendikten sonra RLT tamponunda (Quiagen) Iizizlenmis ve -80°C'de depolanmlgtlü Foliküler ponksiyonun saylîüle saflastlEllIhlSl degismistir.

TamamlayIElRBA (cRNA) hazlîlama ve mikrodizi melezlemesi: CC ve granüloz hücreler, mikro RNeasy Kit (Qiagen) kullanllârak özütlenmistir. Toplam RNA miktarÜNanodrop ND- ile ölçülmüs ve RNA bütünlügü bir Agilent ile degerlendirilmistir. cRNA ImalatçII protokolüne göre iki çogaltma döngüsüyle hazlElbnmlSolup toplam RNA (70 ng ila 100 ng)'dan baslanmlStLEl Birinci çogaltmadan sonra elde edilen cRNA 0,1 ug/ul ila 1,9 ug/ul aral[g].a gerçeklesmis olup ikinci çogaltma ise 1,6 ug/ul ila 4,5 ug/ul araliglIa gerçeklesmistir.

Etiketli parçalanmlgcRNA (12 ug), z 30 000 benzersiz insan geni veya tahmin edilen gene dizisi üstünde oligonükleotit sondalar- melezlenmistir. Her bri kümülüs ve granüloz örnegi tek tek bir mikro dizi çipine eklenmistir.

Veri isleme: Taranan GeneChip görüntüleri; her bir sonda seti için yogunluk degeri ve algilâma çagrEllvar, marjinal veya yok) elde etmek üzere Affymetrix (GCOS) 1.4 yaziülîliü yoluyla islenmis olup islemde, varsayliân analiz ayarlarÜ/e her bir dizi için istege göre 100'e ayarlanan düzeltilmis ortalama hedef yogunluk degerli (TGT) birinci normalizasyon yöntemi global ölçekleme olarak kullanüîhlgtß Sonda yogunluklarEMASS.0 algroritmasEkuIlanilârak elde edilmistir. Bu algoritma aynIZzamanda bir genin tanlanmlg bir güvenilirlik düzeyiyle ekspresyon gerçeklestirip gerçeklestirmedigini de ("algilâma çagrlgî) belirler. Bu "çagrlîl(tam uyan sondalar, uyumsuz sondalardan önemli ölçüde fazla melezlendigi ve p degeri <0.04 oldugu durumda) var, (>0,04 ila <0,06 arasIaki p degerleri için) "marjinal" veya (p degeri >0,06 için) yok olabilir. Mikrodizi verileri IaboratuvarIilîda, Mikrodizi Deney MIAME tavsiyeleri (Brazma ve ark.. 2001) konusundaki Minimal Bilgilere uygun olarak elde edilmistir.

Veri analizi ve görsellestirme: Örnek gruplarEIarasIda ekspresyonu önemli ölçüde degisen genleri tanIiIamak için mikro dizilerin Önemlilik Analizi (SAM) Tusher ve ark.., 2001) (http://www-stat.stanford.edu/-tibs/SAM/) kullanilBilgtE SAM veri permütasyonu esas- göre ortalama veya medyan oran degisiklik degerlerini ve yanllg ç[IZl'na oranEl(FDR) güvenilirlik yüzdesini verir (FC) (ortalama oran degisikligi > 2 ve FDR< °/0 5). Kümülüs hücre örnekleriyle granüloz hücre örneklerinin gen ekpresyon profilleri araleda karsllâstlünaya imkan veren dizi analizi önce önemli RNA tespitine (algilâma çagrlîü'Var" veya "yok") dayandlEIIlBilSl ve ekspresyonu örnek gruplarDarasIa önemli düzeyde degisiklik gösteren genleri tanIiIamak üzere SAM (Mikro dizi Önemlilik Analizi)'e aktarlEhlSIlEl Embriyo kalitesi ve/veya gebelik sonucuna göre kümülüs hücreleri arasIaki gen ekspresyonu profili karsüâstülnasIEgerçeklestirmek için SAM'den önce bir degiskenlik katsaylîIZKCV 2 %40) kullanlßrak sonda setleri seçimi ve Yok/Var "alglEma çagrlîlîl filtresi gerçeklestirilmistir.

Degismis (seviye 3-4) ve iyi (seviye 1-2) embriyo gelismesinden alin veya gebelik saglayan ya da saglamayan embriyolardan alin kümülüs hücrelerinin ekspresyon profilini karsllâstlElnak için hem temel bilesen analizi (PCA) hem de hiyerarsik kümeleme (de hoon ve ark. 2004, Eisen ve ark. 1998) gerçeklestirilmistir. PCA RAGE web arayüzü (http://rage.montp.inserm.fr) (Reme ve ark.., 2008) yoluyla R istatistik yaziliiîiilüasas alarak orijinal kodlarElçermistir. Degiskenlik gösteren sondalarI ekspresyon seviyelerini baz alan Hiyerarsik kümeleme CLUSTER VE TREEVIEW yazlIIEli paketleri ile gerçeklestirilmistir.

Biyolojik aglarü/e en üst düzey kanonik yollarübrtaya ç[Elarmak için gen ekspresyon imzalarlîl aktarilIhlStE Nicel RT-PCR analizleri: qRT-PCR analizi için mikro dizi deneylerinde kullanllân 10 CC örnekleri gebelik sonuçlar. (negatif sonuçla iliskili 5 CC örnegi ve 5 pozitif sonuçla iliskili 5 örnek olmak üzere 10 hasta) göre seçilmistir. Hastadan al-n etiketlenmis cRNA (1 ug) birinci dizi cDNA'yEqusturmak için kullanllîhlStEl Bu cDNAIar (1/1 dilüsyonun Spl'si) üretici önerilerine (Applied Biosystem) göre gerçek zamanlEJkantitafi PC reaksiyonlarlZl için kullanliîhlgtlü Bu cDNA'lar 20 ul reaksiyon karElEiiEtDNA'dan (5 pl), 1 um primer ve 10 ul Taqman Universal PCR Master Mix'den (Applied Biosystem) olusturulmustur. Çogalma 60°C tavlama slîlakl[g]l1la 40 döngü sßslüda ölçülmüstür. PCR reaksiyonunun her döngü adIilEda üretilen PCR ürününün miktarEl TaqMan sondaslsîla izlenmistir. Çogalma egrisinin eksponansiyel fazIda, döngü numarasIlEl ("Ct" "Döngü Esigi“) okundugu bir esik ayarlanmIStB Ct-degeri göreli mRNA transkript seviyelerinin hesaplanmaleUa kullanHJB PCR'nin etkinligi (E) ölçülmüstür. Bu etkinlik, kullanllân primerlere karsEIJIZl gelen standart bir egri ile elde edilmistir. ABI Prism 7000 sekans algüâma sistemi (Applied Biosystems) kullanllârak nicel ters transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (QRT-PCR) gerçeklestirilmis ve asagßhki formül kullanüârak her bir örnek için PGKl'e normalize edilmistir: EtestedprimerACt/ EPGK1 “7 (E :10 '”egim), ACt = Ct kontrol - Ct bilinmeyen, kontrol = gebe olmayan gruba ait bir CC örnegi). Her bir örnek iki defa analiz edilmis ve analizde çoklu su bosluklar. yer verilmistir.

Embriyo sonucuna göre CC'nin gen ekspresyon profili: Embriyo sonucuyla iliskili CC'nin gen ekspresyon profilini tanIiIamak için her bir sonuç kategorisine göre bir gen ekspresyon ImzaslZblusturulmustur: Döllenmemis oositlere ait CC; embriyo gelismesi ve fakat kapsamllZl parçalanmayla sonuçlanan oositlerden alin CC (seviye 3-4), embriyo gelisimi ve sEEIElya da sIlîlllIibarçalanmayla sonuçlanan oositlerden alin CC (seviye 1-2). Granüloz hücre örnekleri referans doku (kontrol) olarak allElnlStlEl Gerçekten de granüloz hücreleri diger yetiskin dokular. aksine, CC ile yakIEUan iliskili hücrelerdir. Bu referans dokunun kullanIiDwam SM farkllüKlarlýIa iliskili farklüiçgla çllZlan genlerin say-üsürerek, CC/oosit etkilesimindeki ince regüle olmustur. SonrasIa genlerin listeleri çaklglnaylîlbelirlemek için kesistirilmistir. Üç grubun tümünde 449 adet yukarüle 890 adet asaglîcliogru açlgla çllZlan genler yaygI olup her bir kategori spesifik bir gen ekspresyon profiliyle gösterilmistir. Ilginçtir ki, örnegin Galanin ve Ara Baglantüß (GJA5)'i içeren 860 adet yukarüegüle olan genler ile HLA-G ve EGRl'i içeren 1416 adet asaglîilegüle genler özel olarak, iyi bir morfolojik embriyo kalitesiyle iliskili kümülüs hücrelerinde modüle olmustur Seviye 1-2 grubu güçlü bir gen ekspresyon profili göstermesine karslIlKl bu grubun gebelik sonuçlarßç-an heterojen bir yapldla olup gebelikle (4 adet ikiz gebelik dahil) sonuçlanan embriyolarla iliskili 18 CC örnegini içermekle birlikte gebelik saglayamayan embriyolarla iliskili 16 CC örnegi içerdigi bilinmelidir.

Gebelik sonucuna göre CC'nin gen ekspresyon profili: Bu nedenle CC örnekleri gebelik sonucuna göre kübslanmlgtlü Bir SAM analizi, iki hasta grubu (gebelik ve gebelik olmayan) araslîibla önemli düzeyde (FDR < %5) degiskenlik gösteren 630 genden olusan bir "gebelik sonucu" listesi çHZlarmlStlÜ PCA ve hireyarsik kümelemek bu 630 genlik listenin hakikaten, gebe kalmamayla iliskili olanlara göre çogunlukla gebelikle iliskli CC örnekler salgllâdfglllîl dogrulamlgtlü "Gebelik sonucu" listesinden alin genlerin, iyi sonuça iliskili örneklerde aglElliElElolarak yukarEldogru regüle olmasEldikkat çekicidir. "Gebelik sonucu" ekspresyon imzasEl'gebelik" grubu ile ilgili embriyolardan alin 10 CC örnekten olusan bir alt grupta özellikle Isaretlenmistir.

Gebelik Sonuç listesinin islevsel açilillamaslîlGebelik saglayan embriyoyla dogru orantll]]Il biyolojik prosesleri arastlElnak üzere, "gebelik sonucu" listesinden 630 geni açllîlamak için olan genle aras-a en önemli düzeyde fazla temsil edilen yollar "oksidatif stres", "TR/RXR aktivasyonu", "Hücre döngüsünün G2/M geçisi", "zenobiyotikmetabolizm" ve "NFKappaB" sinyali olmustur. Bu yollar arasIa en çok temsil edici nitelikteki genler interlökinler, kemokinler, adptator proteinler ve kinazlar olmustur. IL1Beta (gebelik var gebelik yok CCR5 (X. Apoptozisin düzenlenmesinde rol alan çok saylöh genin gebelikle sonuçlanan oositlerden aIlEhn CC örneklerinde önemli ölçüde modüle olmasEarp-IEI Bu genler BCL, NEMO (x4,6, P< ve TNFSF13 (x2,5, Diger yandan gebelik yok sonucuyla iliskili genler asaglki yollarla dogru 0rant[l]]]3lmustur: G2/M DNA hasarEi/e hücre döngüsü kontrol n0ktasl:l"Sonic kirpi" , "IGF-1", "kompleman sistemi" ve "Wnt/Beta-katenin" sinyali. Gebelik yok sonucuyla dogru orantUJJIitemsiI edici genler arasiila NFIB (x yer almlStIE CC'de açEga çüilan embriyo potansiyeli için aday genler: Gebelik sonucuna göre CC SAM analizi, Tablo A'da yer alan 45 genin, CC analizi gen ekspresyonunu esas alarak, gebelikle sonuçlanan embriyolar üreten oositlere karsiIJKIgebelikIe sonuçlanmayanlar arasIa farkliIJEgösterem embriyo potansiyeli için biyolojik isaretler oldugunu tan lamlgtiEl Mikro dizi verilerini bagIislZl olarak dogrulamak için QRT-PCR kullanüßîlStB Gebelik saglamayan seviye 1-2 embriyolardan allEian CC ile gebelik saglayan seviye 1-2 embriyolardan allElan CC arasIaki 36 yukarIZregüle gen ile 9 asagEregüle genin diferansiyel ekspresyonu analiz edilmistir.

Insan dahil memeli türlerinin çogunlugunda döllenme zaman-a oositi çevreleyen kümülüs hücreleri hala yumurta kanalli-nba mevcuttur ve embriyo asilânmas- kadar da burada bulunur. Kümülüs içerisinde ve çevresinde hücreler araslînatris modellemesi muhtemelen, bu adIiIIar her ikisinde de rol oynar. Bu açin kümülüs hücrelerindeki 45 gen, embriyo potansiyeli ve gebelik sonucu için biyolojik isaretler olarak tanIiIanmlStlEI Çallginamlîtia, farklßonuçlarla dogru orantlDIibosit çevreleyen CC gen ekspresyon profilinin gebelige yönelik olarak gelisen embriyolar. spesifik ekspresyon imzasII tanlllanmas imkan verdigi gösterilmistir. Sonuç olarak, ICSI merkezine IVF için basvuran hastalardan farkIEgebelik sonucu alin oositlerden elde edilen kümülüs hücreleri araleUa diferansiyel bir gen ekspresyonu bulunmustur. UlastigillZl sonuçlar, oositi çevreleyen kümülüs hücrelerinin analizinin embriyo seçimi için girisimsel olmayan bir yaklasn oldugunu göstermektedir. Tipik olarak CC oosit seçiminden hemen sonra toplanabilir, CC embriyonun potansiyelini degerlemek üzere genomik testi (G test) analiz edilebilir ve sonrasIa G test sonuçlarllsas allElarak yenisiyle degistirme için embriyo seçilebilmektedir. 45 genlik listenin güvenilirligini test etmek için erkek klgEJIgiEhedeniyle ICSI merkezimize basvuran normal cevaplaylElZlgenç (<36 yas) hastalarüiçeren ileriye yönelik bir çallglna yürütülmüstür. Embriyo seçimi hem CC'lerdeki (grup 1) gen ekspresyon profiline göre hem de morfolojik özelliklere göre (grup 2 kontrol olarak kullanHBiLgtE) yapilihlgtE Her bir grup için iki embriyo degistirilmistir. Ilk 60 hasta Için (30 hasta/grup) grup 1'de yumurta toplama gününde her CC örnegi teker teker toplanmlgl ve gen ekspresyon analizi için islenmistir. CC örnekleri (n=267) analiz edilmistir. CC'lerde ilgi konusu genlerin transkriptlerinin göreli bollugunu ölçmek için nicel RT-PCR analizi gerçeklestirilmis olup tüm örneklerden tüm biyolojik isaretleyiciler için ekspresyon verileri elde edilmistir. Her iki gruptaki tüm hastalara 3.günde taze embriyo transferi yapllIhlStE 2 grup arasIaki karsllâstlElna, seçim bas_ asllânma ve Birinci grupta 5 ikiz gebelige karsUJIZl kontrol olarak kullanllân 2. grupta hiç ikiz gebelik olmamiStlE Ayrlîla, morfolojik özellikler ile CC gen ekspresyon profili arasIEtla hiçbir iliskinin bulunmadiglîlgözlemlenmistir. 267 CC örneginin analizi esas aIIrak CC'lerin % 27'sinin gebelik saglayabilen embriyolarEl öngören genleri açlgb çlElardlglü % 42'sinin gebelik saglayabilen embriyolarEöngören genleri açlgla çuaarmad[gll,__l% 31'inin ise embriyo gelisiminin erken durmasMa baglantlmgen ekspresyonu gösterdigi tespit edilmistir.

Seçilen aday biyolojik isaretler asagi Tablo B'de Iistelenmistir. Tablo B, farledinik kosullarEl öngörebilen kümülüs hücrelerindeki gen setlerini temsil eder: (A) gebelik, (B) gebelik yok ve (C) erken embriyo durmasEI Gen Simgesi Gen adEl Gen Kimligi A: daha çok ekspresyonu gebeligin öngörücüsü olan genler PCK1 fosfoenolpiruvatkarboksikinaz 1 (çözünür) 5105 ADPRH ADP-ribozilarjininhidrolaz 141 CABP4 kalsiyum baglayürotein 4 57010 SLAMF6 SLAM aile üyesi 6 114836 CAMTAl kalmodülin baglaylaîliranskripsiyon aktivatörü 1462 PRF1 perforin 1 (gözenek Olusturucu protein) 5551 B: daha çok ekspresyonu asüâma yapamayan embriyolarIöngörücüsü olan genler FOSB FBJ slgangilosteosarkoma viral onkogenhomologu B 2354 NLGNZ nörolijin 2 57555 PDE5A fosfodiesteraz 5A, cGMPspesink 8654 PLA2G5 fosfolipaz A2 Grup V 5322 GPC6 glipikan 6 10082 EGR3 Erken büyüme yanlle 1960 C: daha çok ekspresyonu erken embriyo durmas- öngörücüsü olan genler NFIB nükleer faktör I/B 4781 NFIC nükleer faktör I/C (CCAAT baglayIED transkripsiyon 4782 faktörü) GRIKS glutamat reseptörü, iyonotropik, kainat 5 2901 RBMSl RNA baglayEIîIiotifi, tek dizili protein etkilesen 1 5937 KAYNAKLAR: Bu basvuru genelinde, bulusun ait oldugu teknigin mevcut durumunu tarif eden çesitli referanslar aIlEtllânmlStlEl Assou, S., Anahory, T., Pantesco, V., Le Carrour, T., Pellestor, F., Klein, B., Reyftmann, L., Dechaud, H., De Vos, J., Hamamah, S. (2006) The human cumulus-- oocyte complex gene-expression profile. Hum Reprod, 21, 1705-19. Balaban, B., Urman, B. (2006) Effect of oocyte morphology on embryo development and implantation. Reprod Biomed Online, 12, 608-15.

Brison, D.R., Houghton, F.D., Falconer, D., Roberts, S.A., Hawkhead, J., Humpherson, P.G., Lieberman, B.A., Leese, H.J. (2004) Identification of viable embryos in IVF by non-invasive measurement of amino acid turnover. Hum Reprod, 19, 2319-24.

Bromer, J.G., Seli, E. (2008) Assessment of embryo viability in assisted reproductive technology: shortcomings of current approaches and the emerging role of metabolomics. Curr Opin Obstet Gynecol, 20, 234-41.

Courtois, G., Smahi, A. (2006) NF-kappaB-related genetic diseases. Cell Death Differ, 13, 843-51. de Hoon, M.J., Imoto, S., Nolan, J., Miyano, S. (2004) Open source clustering software.

Bioinformatics, 20, 1453-4. Eisen, M.B., Spellman, P.T., Brown, P.O., Botstein, D. (1998) Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA, 95, 14863-8.

Fenwick, J., Platteau, P., Murdoch, A.P., Herbert, M. (2002) Time from insemination to first cleavage predicts developmental competence of human preimplantation embryos in vitro. Hum Reprod, 17, 407-12.

Feuerstein, P., Cadoret, V., Dalbies-Tran, R., Guerif, F., Bidault, R., Royere, D. (2007) Gene expression in human cumulus cells: one approach to oocyte competence. Hum Reprod, 22, 3069-77.

Gardner, D.K., Lane, M., Stevens, J., Schoolcraft, W.B. (2001) Noninvasive assessment of human embryo nutrientconsumption as a measure of developmental potential.

Fertil Steril, 76, 1175-80.

Gasca, S., Pellestor, F., Assou, S., Loup, V., Anahory, T., Dechaud, H., De Vos, J., Hamamah, S. (2007) Identifying new human oocyte marker genes: a microarray approach. Reprod Biomed Online, 14, 175-83.

Hamel, M., Dufort, 1., Robert, C., Gravel, C., Leveille, M.C., Leader, A., Sirard, M.A. (2008) Identification of differentially expressed markers in human follicular cells associated with competent oocytes. Hum Reprod, 23, 1118-27.

Haouzi, D., De Vos, J., Loup, V., Assou, S., Gasca, S., Reyftmann, L., Klein, B., Hamamah, S. (2008) [Oocyte and embryo quality: Do the apoptotic markers have a place in the preimplantation genetic diagnostic?]. Gynecol Obstet Fertil, 36, 730-742.

He, B., Chadburn, A., Jou, E., Schattner, E.J., Knowles, D.M., Cerutti, A. (2004) Lymphoma B cells evade apoptosis through the TNF family members BAFF/BLyS ancl APRIL. J Immunol, 172, 3268-79.

Kolena, J., Kiss, A., Channing, CP. (1983) Purification of porcine granulosa cells by continuous Percoll gradient. Experientia, 39, 908-9.

Kovalevsky, G., Patrizio, P. (2005) High rates of embryo wastage with use of assisted reproductive technology: a look at the trends between 1995 and 2001 In the United La Sala, G.B., Nicoli, A., Villani, M.T., Di Girolamo, R., Capodanno, F., Blickstein, I. (2008) The effect of selecting oocytes for insemination and transferring all resultant embryos without selection on outcomes of assisted reproduction. Fertil Steril.

Lee, K.S., Joo, B.S., Na, Y.J., Yoon, M.S., Choi, O.H., Kim, W.W. (2001) Cumulus cells apoptosis as an Indicator to predict the quality of oocytes and the outcome of IVF-ET.

J Assist Reprod Genet, 18, 490-8.

Lundin, K., Bergh, C., Hardarson, T. (2001) Early embryo cleavage is a strong indicator of embryo quality in human IVF. Hum Reprod, 16, 2652-7.

McKenzie, L.J., Pangas, S.A., Carson, S.A., Kovanci, E., Cisneros, P., Buster, J.E., Amato, P., Malzuk, M.M. (2004) Human cumulus granulosa cell gene expression: a predictor of fertilization and embryo selection in women undergoing IVF. Hum Reprod, 19, 2869- Pearson, H. (2006) Safer embryo tests could boost IVF pregnancy rates. Nature, 444, 12-3.

Perlman, S., Bouquin, T., van den Hazel, B., Jensen, T.H., Schambye, H.T., Knudsen, S., Okkels, J.S. (2006) Transcriptome analysis of FSH and FSH variant stimulation in granulosa cells from IVM patients reveals novel regulated genes. Mol Hum Reprod, 12, 135-44.

Reddy, U.M., Wapner, R.J., Rebar, R.W., Tasca, R.J. (2007) Infertility, assisted reproductive technology, and adverse pregnancy outcomes: executive summary of a National Institute of Child Health and Human Dvelopment workshop. Obstet Gynecol, 109, 967-77.

Reme, T., Hose, D., De Vos, J., Vassal, A., Poulain, P.O., Pantesco, V., Goldschmidt, H., Klein, B. (2008) A new method for class prediction based on signed-rank algorithms applied to Affymetrix microarray experiments. BMC Bioinformatics, 9, 16.

Sakkas, D., Gardner, D.K. (2005) Noninvasive methods to assess embryo quality. Curr Opin Obstet Gynecol, 17, 283-8.

Sasson, R., Dantes, A., Tajima, K., Amsterdam, A. (2003) Novel genes modulated by FSH iri normal and immortalized FSH-responsive cells: new insights into the mechanism of FSH action. Faseb J, 17, 1256-66.

Sasson, R., Rimon, E., Dantes, A., Cohen, T., Shinder, V., Land-Bracha, A., Amsterdam, A. (2004) Gonadotrophin-induced gene regulation in human granulosa cells obtained from IVF patients. Modulation of steroidogenic genes, cytoskeletal genes and genes coding for apoptotic signalling and protein kinases. MoI Hum Reprod, 10, 299-311.

Scott, L., Alvero, R., Leondires, M., Miller, B. (2000) The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation.

Hum Reprod, 15, 2394-403.

Seli, E., Sakkas, D., Scott, R., Kwok, S.C., Rosendahl, S.M., Burns, D.H. (2007) Noninvasive metabolomic profiling of embryo culture media using Raman and near- Infrared spectroscopy correlates with reproductive potential of embryos in women undergoing In vitro fertilization. Fertil Steril, 88, 1350-7.

SteeIe-Perkins, G., Plachez, C., Butz, K.G., Yang, G., Bachurski, C.J., Kinsman, S.L., Litwack, E.D., Richards, L.J., Gronostajski, R.M. (2005) The transcription factor gene Nfib is essential for both lung maturation and brain development. Mol Cell Biol, 25, 685-98.

Stein, J.V., Lopez-Fraga, M., Elustondo, F.A., Carvalho-Pinto, C.E., Rodriguez, D., Gomez-Caro, R., De Jong, J., Martinez, A.C., Medema, J.P., Hahne, M. (2002) APRIL modulates B and T cell immunity. J Clin Invest, 109, 1587-98. Su, Y.Q., Sugiura, K., Wigglesworth, K., O'Brien, M.J., Affourtit, J.P., Pangas, S.A., Matzuk, M.M., Eppig, 11 (2008) Oocyte regulation of metabolic cooperativity between mouse cumulus cells and oocytes: BMP15 and GDF9 control cholesterol biosynthesis in cumulus cells.

Development, 135, 111-21.

Sugiura, K., Su, Y.Q., Diaz, F.J., Pangas, S.A., Sharma, S., Wigglesworth, K., O'Brien, M.J., Matzuk, M.M., Shima-saki, S., Eppig, J.J. (2007) Oocyte-derived BMP15 and Tusher, V.G., Tibshirani, R., Chu, G. (2001) Significance analysis of microarrays applied to the Ionizing radiation response. Proc Natl Acad Sci USA, 98,5116-21.

Van Montfoort, A.P., Dumoulin, J.C., Kester, A.D., Evers, J.L. (2004) Early cleavage is a valuable addition to existingembryo selection parameters: a study using single embryo transfers. Hum Reprod, 19, 2103-8.

Van Montfoort, A.P., Geraedts, J.P., Dumoulin, J.C., Stassen, A.P., Evers, J.L., Ayoubi, T.A. (2008) Differential geneexpression in cumulus cells as a prognostic indicator of embryo viability: a microarray analysis. Mol Hum Reprod,14, 157-68.

Yang, W.J., Hwu, Y.M., Lee, R.K., Li, S.H., Lin, S.Y., Fleming, S. (2007) Early cleavage does not predict treatmentoutcome following the use of GnRH antagonists in women older than 35. Fertil Steril, 88, 1573-8.

Zhang, X., Jafari, N., Barnes, R.B., Confino, E., Milad, M., Kazer, R.R. (2005) Studies of gene expression iri humancumulus cells indicate pentraxin 3 as a possible marker for oocyte quality. Fertil Steril, 83 Suppl 1, 1169-79.

Zhu, X.M., Zhu, Y.M., Xu, C.M., Qian, Y.L., Jin, F., Huang, H.F. (2007) Autologous mature follicular fluid: its role inin vitro maturation of human cumulus-removed oocytes. Fertil Steril.

Claims (3)

ISTEMLER

1. Döllendiginde hamilelige neden olan yüksek implantasyon oran. sahip canlElbir embriyonun üretilmesini saglayan oositin seçilmesine iliskin yöntem olup, asaglElhki adIilarlZiçermektedir: a) söz konusu oositi kusatan kümülüs hücresi içerisinde 45 genin ekspresyon seviyesinin ölçülmesi, burada söz konusu 45 gen MMTV entegrasyon ailesinden kanatslîltip, üye 6 (WNT6), lösin olarak zengin tekrarlaylEJJe kalponin homoloji (CH) alan içeren (LRCH4), eslestirilmis kutu 8 (PAX8), kalsiyum baglayElZlprotein 4 (CABP4), fosfodiesteraz (5A), cGMP-ye özgü (PDESA), BCL2-benzeri 11 (BCL2L11), fosfoenolpiruvat karboksikinaz 1 (PCK1), transkripsiyon faktörü 20 (TCFZO), SLAM aile üyesi 6 (SLAMF6), eritropoietin reseptörü (EPOR), kalsiyum kanalüvoltaja baglü gama alt birim 6 (CACNG6), NLR ailesi pirin alanEI içeren 1 (NLRPl), platelet/endotelyal hücre yaplStlîlEEiriolekül (PECAMi), nitrik oksit sintazlîll (NOSl), aktive edici transkripsiyon faktörü 3 (ATF3), keratinle iliskili protein , glutamat reseptörü, iyonotropik, kainat 5 (GRIKS), çözünen taslîlEElaile 24 üye 3 (SLC, çözünen taslýlîlîaile 10 üye 2 (NLGN2), protein kinazl,`_l cAMP'a baglü katalitik, alfa (PRKACA), FBJ murin osteosarkom viral onkojen homolog B (FOSB), ST3 beta-galaktosit alfa-2,3- siyaliltransferaz 3 (SIAT6), lisil oksidaz-benzeri 2 (LOXL2), perforin 1 (PRFl), ADPribosilarjinin hidrolaz (ADPRH), amiloid beta (A4) öncü protein-baglaylEÇIaiIe B, üye 3 (APBB3), erken büyüme cevablZB (EGR3), kannabinoid reseptör 2 (CNR2), enterferonun neden oldugu transmembran protein 1 (IFITMl), fosfolipaz A2, grup V (PLA, SRY (cinsiyeti belirleyen bölge Y)-kutu 4 (SOX4), nükleer faktörü I/B (NFIB), nükleer faktörü I/C (NFIC), RNA baglaylîülnotif, tek sarmallßtkilesim protein 1 (RBMSl), GO/Gl degisim 2 (GOSZ), FAT tümör baskllâylîlîhomolog 3 (FAT3), çözünen taslîlEEaile 40 üye 1 (SLC4OA1), glipikan 6 (GPC6) ve insülin-benzeri büyüme faktörü 1 reseptörü (IGFlR), b) kontrol içerisinde ölçülen seviyenin adli a)'da ölçülen söz konusu ekspresyon seviyesiyle kMaslanmasÇl söz konusu kontrol, döllendiginde hamilelige neden olan yüksek implantasyon oranEille iliskili olarak bir canlllmbriyonun üretilmesini saglayan bir oositi kusatan bir kümülüs hücresidir; ve c) döllendiginde, adli b)'de söz konusu kontrol ve oositin araleUaki diferansiyel ekspresyon ölçüldügünde hamilelige yol açan yüksek implantasyon oranEIIe Iliskili canllîmbriyonun oosit tarafimdan üretilmeyeceginin degerlendirilmesi.

2. Hamilelige neden olan yüksek implantasyon oran. sahip bir embriyonun seçilmesine yönelik yöntem olup asag ki ad larlîilçermektedir: a) embriyonun etrafIElkusatan kümülüs hücre içerisinde 45 genin ekspresyon seviyesinin ölçülmesi, burada söz konusu 45 gen WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDESA, BCL2L11, PCKl, TCFZO, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRPl, PECAMl, NOS1, NLGN2, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMSl, GOSZ, FAT3, SLC4OA1, GPC6 ve b) bir kontrol içerisinde ölçülen seviye ile adl a)'da ölçülen ekspresyon seviyesinin klýaslanmasü burada söz konusu kontrol canIEIbir fetüse neden olan embriyoyu kusatan bir kümülüs hücredir ve c) adli b)'de söz konusu oosit ve söz konusu kontrol arasIa diferansiyel ekspresyon ölçüldügünde embriyonun canIEl fetüsü saglamayacagII degerlendirilmesi.

3. Istemler 1 veya 2'ye göre yöntemin gerçeklestirilmesi için bir oosit veya bir embriyoyu kusatan kümülüs hücresi içerisindeki 45 genin ekspresyon seviyesinin spesifik olarak ölçülmesine yönelik elemanlarüçeren bir kitin kullanlimlup, ADPRH, APBBS, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMSl, GOSZ, FAT3, SLC40A1, GPC6 ve IGFlR'dir.