BRPI1015018B1 - Métodos para selecionar oócitos e embriões competentes com alto potencial de êxito de gravidez - Google Patents
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Abstract
métodos para selecionar oócitos e embriões competentes com alto potencial de êxito de gravidez. a presente invenção se refere a métodos para selecionar oócitos competentes ou embriões competentes.
Description
[0001] A presente invenção está relacionada a um método para selecionar um oócito competente ou um embrião competente.
[0002] Na tecnologia de reprodução assistida (TRA), as taxas de gravidez e de nascimentos após tentativas de fertilização in vitro (FIV) continuam baixas. De fato, 2 de 3 ciclos de FIV falham em resultar em gravidez (SART 2004) e mais de 8 em 10 embriões transferidos falham em se implantar (Kovalevsky e Patrizio, 2005). Além disso, mais de 50% dos bebês nascidos por FIV são de gestações múltiplas (Reddy e col., 2007). Partos prematuros que resultam de gestações múltiplas causadas por TRA são estimados em contabilizar aproximadamente US$ 890 milhões em custos de cuidados com saúde nos EUA anualmente (Bromer e Seli, 2008).
[0003] Parâmetros morfológicos subjetivos ainda são um critério primário para selecionar embriões saudáveis usados para os programas de FIV e ICSI. Contudo, tais critérios não prevêem verdadeiramente a competência de um embrião. Vários estudos mostraram que uma combinação de diversos critérios morfológicos diferentes leva a uma seleção de embrião mais precisa (Balaban e Urman, 2006; La Sala e col., 2008; Scott e col., 2000). Critérios morfológicos para seleção de embrião são avaliados no dia da transferência, e baseiam-se principalmente na clivagem embrionária inicial (25-27 h pós-inseminação), no número e tamanho dos blastômeros no dia dois ou dia três, na porcentagem de fragmentação e na presença de multinucleação no estágio de 4 ou 8 células (Fenwick e col., 2002).
[0004] Contudo, um estudo recente mostrou que a seleção de oócitos para inseminação não melhora o êxito da TRA se comparado à transferência de todos os embriões disponíveis, sem levar em consideração sua qualidade (La Sala e col., 2008). Existe uma necessidade de se identificar embriões viáveis com o mais alto potencial de implantação para aumentar as taxas de sucesso da FIV, reduzir o número de embriões para substituição a fresco e diminuir as taxas de gravidez múltipla.
[0005] Por todas essas razões, diversos biomarcadores para seleção de embrião estão sendo atualmente investigados (Haouzi e col., 2008; Pearson, 2006). Como os embriões que resultam em gravidez diferem em seus perfis metabólicos comparado a embriões que não resultam em gravidez, alguns estudos estão tentando identificar uma assinatura molecular que possa ser detectada por avaliação não invasiva do meio de cultura do embrião (Brison e col., 2004; Gardner e col., 2001; Sakkas e Gardner, 2005; Seli e col., 2007; Zhu e col., 2007).
[0006] A genômica também está fornecendo conhecimento vital da função genética e celular durante o desenvolvimento embrionário. (McKenzie e col., 2004) e (Feuerstein e col., 2007) relataram que a expressão de diversos genes em células do cumulus, tais como ciclooxigenase 2 (COX2), foi indicativo da qualidade do oócito e do embrião. Gremlin 1 (GREM1), ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), proteína reguladora aguda esteroidogênica (STAR), estearoil-coenzima A desaturase 1 e 5 (SCD1 e 5), anfiregulina (AREG) e pentraxina 3 (PTX3) também mostraram estar positivamente correlacionados com a qualidade do embrião (Zhang e col., 2005). Mais recentemente, a expressão de glutationa peroxidase 3 (GPX3), receptor de quimiocina 4 (CXCR4), ciclina D2 (CCND2) e catenina delta 1 (CTNND1) em células do cumulus humanas mostraram estar inversamente correlacionadas com a qualidade do embrião, baseado nas taxas de clivagem inicial durante o desenvolvimento embrionário (van Montfoort e col., 2008). Mas, apesar do fato da clivagem inicial ter mostrado ser um biomarcador confiável para prever a gravidez (Lundin e col., 2001; Van Montfoort e col., 2004; Yang e col., 2007), os perfis de expressão gênica das células do cumulus não haviam sido estudados em relação ao êxito de gravidez.
[0007] A presente invenção se refere a um método para selecionar um oócito competente, compreendendo uma etapa de medir o nível de expressão de 45 genes em uma célula do cumulus ao redor do dito oócito, em que os referidos genes são WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, BCL2L11, PCK1, TCF20, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRP1, PECAM1, NOS1, ATF3, KRTAP8, GRIK5, SLC24A3, SLC5A12, SLCA10A2, SLCO1A2, SLC25A5, MG29, NLGN2, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMS1, G0S2, FAT3, SLC40A1, GPC6 e IGF1R.
[0008] A presente invenção também se refere a um método para selecionar um embrião competente, compreendendo uma etapa de medir o nivel de expressão de 45 genes em uma célula do cumulus ao redor do embrião, em que os referidos genes são WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, BCL2L11, PCK1, TCF20, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRP1, PECAM1, NOS1, ATF3, KRTAP8, GRIK5, SLC24A3, SLC5A12, SLCA10A2, SLCO1A2, SLC25A5, MG29, NLGN2, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMS1, G0S2, FAT3, SLC40A1, GPC6 e IGF1R.
[0009] A presente invenção também se refere a um método para selecionar um oócito competente ou um embrião competente, compreendendo uma etapa de medir em uma célula do cumulus ao redor do dito oócito ou do dito embrião o nivel de expressão de um ou mais genes selecionados dos grupos A, B ou C, em que o grupo A consiste de PCK1, ADPRH, CABP4, SLAMF6, CAMTA1, CSPG2, e PRF1; o grupo B consiste de FOSB, NLGN2, PDE5A, PLA2G5, GPC6, e EGR3; e o grupo C consiste de NFIB, NFIC, IGF1R, G0S2, GRIK5 e RBMS1.
[0010] A superexpressão de um ou mais genes selecionados do grupo A é preditiva de um oócito ou embrião competente que leva à gravidez. A superexpressão de um ou mais genes selecionados do grupo B é preditiva de um oócito ou embrião não competente, o embrião sendo incapaz de se implantar. A superexpressão de um ou mais genes selecionados do grupo C é preditiva de um oócito ou embrião não competente devido à captura inicial do embrião.
[0011] Os inventores determinaram como grupo de genes expressos em células do cumulus que são biomarcadores para o potencial do embrião e êxito de gravidez. Eles demonstraram que o perfil de expressão de genes de células do cumulus que circundam o oócito se correlacionam a diferentes êxitos de gravidez, permitindo a identificação de uma assinatura de expressão específica de embriões que se desenvolvem para a gravidez. Seus resultados indicam que a análise de células do cumulus ao redor do oócito é uma abordagem não invasiva para a seleção de embrião.
[0012] Todos os genes que pertencem à invenção são conhecidos per si, e são listados nas Tabelas A e B abaixo. As Tabelas A e B apresentam o grupo de genes cujo perfil de expressão combinada mostrou ser informativo para selecionar um oócito competente ou para selecionar um embrião competente com um alto potencial de implantação levando à gravidez.
Tabela A: grupo de genes preditivos.
Tabela A: grupo de genes preditivos.
[0013] Um objeto da invenção se refere a um método para selecionar um oócito competente, compreendendo uma etapa de medir o nível de expressão de 45 genes e uma célula do cumulus ao redor do dito oócito, em que os referidos genes são WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, BCL2L11, PCK1, TCF20, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRP1, PECAM1, NOS1, ATF3, KRTAP8, GRIK5, SLC24A3, SLC5A12, SLCA10A2, SLCO1A2, SLC25A5, MG29, NLGN2, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMS1, G0S2, FAT3, SLC40A1, GPC6 e IGF1R.
[0014] Como aqui usado, o termo "oócito competente” se refere a um gameta feminino ou óvulo que, quando fertilizado, produz um embrião viável com uma alta taxa de implantação, levando à gravidez.
[0015] De acordo com a invenção, o oócito pode resultar de um ciclo natural, um ciclo natural modificado ou um ciclo estimulado por FIVc ou ICSI. O termo "ciclo natural" se refere ao ciclo natural pelo qual a fêmea ou mulher produz um oócito. O termo "ciclo natural modificado" se refere ao processo pelo qual a fêmea ou mulher produz um oócito ou dois sob uma estimulação ovariana suave com antagonistas de GnRH associados com FSH ou hMG recombinantes. O termo "ciclo estimulado" se refere ao processo pelo qual uma fêmea ou mulher produz um ou mais oócitos sob estimulação com agonistas ou antagonistas de GnRH associados com FSH ou hMG recombinantes.
[0016] O termo ''célula do cumulus” se refere a uma célula compreendida em uma massa de células que circunda um oócito. Acredita-se que essas células estejam envolvidas em fornecer a um oócito alguns de seus requisitos nutricionais, energia e ou outros requisitos que são necessários para produzir um embrião viável com a fertilização.
[0017] Os métodos da invenção ainda podem compreender uma etapa consistindo em comparar o nível de expressão dos genes na amostra com um controle, em que a detecção de diferenças no nível de expressão dos genes entre a amostra e o controle é indicativa do oócito ser competente. O controle pode consistir em uma amostra compreendendo células do cumulus associadas com um oócito competente ou em uma amostra compreendendo células do cumulus associadas com um oócito não fertilizado.
[0018] Os métodos da invenção são preferencialmente aplicáveis a mulheres, mas podem ser aplicáveis a outros mamíferos (por exemplo, primatas, cachorros, gatos, porcos, vacas,...).
[0019] Os métodos da invenção são particularmente adequados para avaliar a eficácia de um tratamento de fertilização in vitro. Consequentemente, a invenção também se refere a um método para avaliar a eficácia de um protocolo de hiperestimulação ovariana controlada (COS) em indivíduo do sexo feminino, compreendendo:
- i) fornecer ao referido indivíduo do sexo feminino pelo menos um oócito com suas células do cumulus;
- ii) determinar por um método da invenção se o referido oócito é um oócito competente.
[0020] Assim, após tal método, o embriologista pode selecionar os oócitos competentes e fertilizá-los in vitro através de um protocolo de fertilização in vitro clássico (FIVc) ou sob um protocolo de injeção intracitoplasmática de espermatozoide (ICSI).
[0021] Um objeto adicional da invenção está relacionado a um método para monitorar a eficácia de um protocolo de hiperestimulação ovariana controlada (COS) compreendendo:
- i) isolar da referida mulher pelo menos um oócito com suas células do cumulus sob ciclos naturais, modificados ou estimulados;
- ii) determinar por um método da invenção se o referido oócito é um oócito competente;
- iii) e monitorar a eficácia do tratamento COS baseado se ele resulta em um oócito competente.
[0022] O tratamento COS pode ser baseado em pelo menos um ingrediente ativo selecionado do grupo consistindo de agonistas ou antagonistas de GnRH associado com FSH ou hMG recombinante.
[0023] A presente invenção também se refere a um método para selecionar um embrião competente, compreendendo uma etapa de medição do nível de expressão de 45 genes em uma célula do cumulus ao redor do embrião, em que os referidos genes são WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, BCL2L11, PCK1, TCF20, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRP1, PECAM1, NOS1, ATF3, KRTAP8, GRIK5, SLC24A3, SLC5A12, SLCA10A2, SLCO1A2, SLC25A5, MG29, NLGN2, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMS1, G0S2, FAT3, SLC40A1, GPC6 e IGF1R.
[0024] O termo "embrião" se refere a um oócito fertilizado ou zigoto. A referida fertilização pode ocorrer sob uma fertilização in vitro clássica (FIVc) ou sob um protocolo de injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
[0025] O termo "fertilização in vitro clássica" ou "FIVc" se refere a um processo pelo qual oócitos são fertilizados por espermatozóides fora do corpo, in vitro. FIV é um importante tratamento na infertilidade quando a concepção in vivo tenha falhado. O termo "injeção intracitoplasmática de espermatozóides" ou "ICSI” se refere a um procedimento de fertilização in vitro no qual um único espermatozóide é injetado diretamente em um oócito. Esse procedimento é mais comumente usado para superar os fatores de infertilidade masculina, apesar de que ele também pode ser usado quando os oócitos não podem ser facilmente penetrados pelo espermatozóide e, ocasionalmente, como um método de fertilização in vitro, especialmente aquele associado com a doação de espermatozóides.
[0026] O termo "embrião competente" se refere a um embrião com uma alta taxa de implantação, que leva à gravidez. O termo "alta taxa de implantação" significa o potencial do embrião quando transferido no útero, a ser implantado no ambiente uterino e resultar em um feto viável, o qual, por sua vez, se desenvolve em uma prole viável na ausência de um procedimento ou evento que encerre a dita gravidez.
[0027] Os métodos da invenção podem ainda compreender uma etapa que consiste em comparar o nivel de expressão dos genes na amostra com um controle, em que a detecção de diferenças no nivel de expressão dos genes entre a amostra e o controle é indicativa se o embrião é competente. O controle pode consistir de amostra compreendendo células do cumulus associadas com um embrião que resulta em um feto viável ou em uma amostra compreendendo células do cumulus associadas com um embrião que não resulta em um feto viável.
[0028] Deve-se notar que os métodos da invenção levam a uma independência das considerações morfológicas do embrião. Dois embriões podem ter os mesmos aspectos morfológicos, mas por um método da invenção pode apresentar uma diferente taxa de implantação, levando à gravidez.
[0029] Os métodos da invenção são preferencialmente aplicáveis a mulheres, mas podem ser aplicáveis a outros mamíferos (por exemplo, primatas, cachorros, gatos, porcos, vacas,...).
[0030] A presente invenção também está relacionada a um método para determinar se um embrião é um embrião competente, compreendendo uma etapa que consiste em medir o nivel de expressão de 45 genes em uma célula do cumulus ao redor do embrião, em que os referidos genes são WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, BCL2L11, PCK1, TCF20, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRP1, PECAM1, NOS1, ATF3, KRTAP8, GRIK5, SLC24A3, SLC5A12, SLCA10A2, SLCO1A2, SLC25A5, MG29, NLGN2, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMS1, G0S2, FAT3, SLC40A1, GPC6 e IGF1R.
[0031] A presente invenção também está relacionada a um método para determinar se um embrião é um embrião competente, compreendendo:
- i) prover um oócito com suas células do cumulus
- ii) fertilizar dito oócito in vitro
- iii) determinar se o embrião que resulta da etapa ii) é competente determinando-se, por um método da invenção, se dito oócito da etapa i) é um oócito competente.
[0032] A presente invenção também está relacionada a um método para selecionar um oócito competente ou um embrião competente, compreendendo uma etapa de medir em uma célula do cumulus ao redor do dito oócito ou do dito embrião o nível de expressão de um ou mais genes selecionados dos grupos A, B ou C, em que o grupo A consiste de PCK1, ADPRH, CABP4, SLAMF6, CAMTA1, CSPG2, e PRF1; o grupo B consiste de FOSB, NLGN2, PDE5A, PLA2G5, GPC6, e EGR3; e o grupo C consiste de NFIB, NFIC, IGF1R, G0S2, GRIK5 e RBMS1.
[0033] A superexpressão de um ou mais genes selecionados do grupo A é preditiva de um oócito ou embrião competente, levando à gravidez. A superexpressão de um ou mais genes selecionados do grupo B é preditiva de um oócito ou embrião não competente, o embrião sendo incapaz de se implantar. A superexpressão de um ou mais genes selecionados do grupo C é preditiva de um oócito ou embrião não competente devido à captura inicial do embrião.
[0034] Dito um ou mais genes podem ser selecionados, por exemplo, do grupo A sozinho, grupo B sozinho ou grupo C sozinho.
[0035] Tipicamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 genes podem ser selecionados do grupo A.
[0036] Tipicamente, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo B.
[0037] Tipicamente, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo C.
[0038] Alternativamente, os ditos genes podem ser selecionados, por exemplo, dos grupos A e B, dos grupos A e C, dos grupos B e C, ou dos grupos A, B e C.
[0039] Tipicamente, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 genes podem ser selecionados do grupo A, e 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo B e 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo C.
[0040] Tipicamente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 genes podem ser selecionados do grupo A, e 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo B e 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo C.
[0041] Tipicamente, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 genes podem ser selecionados do grupo A, e 0, 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo B e 1, 2, 3, 4, 5, ou 6 genes podem ser selecionados do grupo C.
[0042] Os métodos da invenção são particularmente adequados para intensificar o êxito de gravidez de uma fêmea. Consequentemente, a invenção também está relacionada a um método para intensificar o êxito de gravidez de uma fêmea, compreendendo:
- i) selecionar um embrião competente pela realização de um método da invenção
- ii) implantar o embrião selecionado na etapa i) no útero de dita fêmea.
[0043] O método, como acima descrito, irá, dessa forma, ajudar o embriologista a evitar a transferência no útero de embriões com um baixo potencial para êxito na gravidez.
[0044] O método, como acima descrito, é também particularmente adequado para evitar gestações múltiplas, através da seleção do embrião competente capaz de levar a uma implantação e uma gravidez.
[0045] Em todos os casos acima, os métodos descreveram a relação entre o perfil de expressão gênica de células do cumulus e embrião e êxito de gravidez.
[0046] A determinação do nível de expressão dos genes, como acima descrito nas Tabelas A e B, pode ser realizada por uma variedade de técnicas. Geralmente, o nível de expressão, como determinado, é um nível de expressão relativo.
[0047] Mais preferencialmente, a determinação compreende promover o contato da amostra com reagentes seletivos, tais como sondas, iniciadores ou ligantes, e, dessa forma, detectar a presença, ou medir a quantidade dos polipeptídeos ou ácidos nucleicos de interesse originalmente na amostra. O contato pode ser realizado em qualquer dispositivo adequado, tal como uma lâmina, placa de microtitulação, tubo teste, poço, vidro, coluna, e assim por diante. Em concretizações específicas, o contato é realizado sobre um substrato revestido com o reagente, tal como um arranjo de ácido nucleico ou um arranjo de um ligante específico. O substrato pode ser um substrato sólido ou semi-sólido, tal como qualquer suporte adequado compreendendo vidro, plástico, náilon, papel, metal, polimeros e similares. O substrato pode ser de várias formas e tamanhos, tais como uma lâmina, uma membrana, uma gota, uma coluna, um gel, etc. O contato pode ser feito sob qualquer condição adequada para um complexo detectável, tal como um hibrido de ácido nucleico ou um complexo anticorpo-antigeno, a ser formado entre o reagente e os ácidos nucleicos ou polipeptídeos da amostra.
[0048] Em uma concretização preferida, o nivel de expressão pode ser determinado através da quantificação de RNAm.
[0049] Métodos para determinar a quantidade de RNAm são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, o ácido nucleico contido nas amostras (por exemplo, célula ou tecido preparado a partir do paciente) é primeiro extraído de acordo com métodos padrão, por exemplo, usando enzimas liticas ou soluções químicas ou extraído por resinas de ligação a ácidos nucleicos de acordo com as instruções do fabricante. O RNAm extraído é, então, detectado por hibridização (por exemplo, análise de Northern blot) e/ou amplificação (por exemplo, RT-PCR). Preferencialmente, RT-PCR quantitativo ou semiquantitativo é preferido. RT-PCR em tempo real quantitativo ou semi-quantitativo é particularmente vantajoso.
[0050] Outros métodos de amplificação incluem reação em cadeia de ligase (LCR), amplificação mediada por transcrição (TMA), amplificação por deslocamento de fita (SDA) e amplificação baseada em sequência de ácidos nucleicos (NASBA).
[0051] Ácidos nucleicos tendo ao menos 10 nucleotídeos e exibindo complementaridade ou homologia de sequência ao RNAm de interesse aqui encontram utilidade como sondas de hibridização ou iniciadores de amplificação. É entendido que tais ácidos nucleicos não precisam ser idênticos, mas são tipicamente ao menos cerca de 80% idênticos à região homóloga de tamanho comparável, mais preferencialmente 85% idênticos e ainda mais preferencialmente 90-95% idênticos. Em certas concretizações, será vantajoso usar ácidos nucleicos em combinação com meios apropriados, tais como um marcador detectável, para detectar a hibridização. Uma ampla variedade de indicadores apropriados é conhecida na técnica, incluindo ligantes fluorescentes, radioativos, enzimáticos ou outros ligantes (por exemplo, avidina/biotina).
[0052] As sondas tipicamente compreendem ácidos nucleicos de fita simples entre 10 a 1000 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, entre 10 e 800, mais preferencialmente entre 15 e 700, tipicamente entre 20 e 500. Iniciadores tipicamente são ácidos nucleicos de fita simples mais curtos, entre 10 a 25 nucleotídeos em comprimento, desenhados para emparelhar perfeitamente ou quase perfeitamente um ácido nucleico de interesse, a ser amplificado. As sondas e iniciadores são "específicos" para os ácidos nucleicos aos quais hibridizam, isto é, eles preferencialmente hibridizam sob condições de hibridização de alta estringência (correspondendo à temperatura de fusão Tm mais alta, por exemplo, 50% de formamida, 5x ou 6x SCC. SCC é um NaCl 0,15 M, citrato de sódio 0,015 M).
[0053] Os iniciadores ou sondas de ácidos nucleicos usados no método de amplificação e detecção acima podem ser montados como um kit. Tal kit inclui iniciadores consenso e sondas moleculares. Um kit preferido também inclui os componentes necessários para determinar se a amplificação ocorreu. O kit pode também incluir, por exemplo, tampões e enzimas de PCR; sequências de controle positivo, iniciadores de controle de reação; e instruções para amplificar e detectar as sequências específicas.
[0054] Em uma concretização particular, os métodos da invenção compreendem as etapas de fornecer os RNAs totais extraídos a partir de células do cumulus e submeter os RNAs à amplificação e hibridização a sondas específicas, mais particularmente por meio de uma RT-PCR quantitativa ou semiquantitativa.
[0055] Em outra concretização preferida, o nível de expressão é determinado por análise de chip de DNA. Tal chip de DNA ou microarranjo de ácido nucleico consiste de diferentes sondas de ácido nucleico que são quimicamente anexadas a um substrato, que pode ser um microchip, uma lâmina de vidro ou uma pérola em forma de microesfera. Um microchip pode ser constituído de polímeros, plásticos, resinas, polissacarídeos, sílica ou materiais com base em sílica, carbono, metais, vidros inorgânicos, ou nitrocelulose. As sondas compreendem ácidos nucleicos, tais como cDNAs ou oligonucleotídeos que podem ser de cerca de 10 a cerca de 60 pares de base. Para determinar o nível de expressão, uma amostra de um indivíduo teste, opcionalmente primeiro submetido à transcrição reversa, é marcada e colocada em contato com o microarranjo em condições de hibridização, levando à formação de complexos entre ácidos nucleicos alvo que são complementares às sequências de sonda anexadas à superfície do microarranjo. Os complexos hibridizados marcados são, então, detectados e podem ser quantificados ou semi-quantificados. A marcação pode ser alcançada por vários métodos, por exemplo, usando marcação radioativa ou fluorescente. Muitas variantes da tecnologia de hibridização com microarranjo estão disponíveis às pessoas versadas na técnica (ver, por exemplo, a revisão de Hoheisel, Nature Reviews, Genetics, 2006, 7:200-210).
[0056] Nesse contexto, a invenção fornece, ainda, um chip de DNA compreendendo um suporte sólido que carrega ácidos nucleicos que são específicos para os genes listados nas Tabelas A ou B.
[0057] Outros métodos para determinação do nível de expressão dos referidos genes incluem a determinação da quantidade de proteínas codificadas pelos referidos genes.
[0058] Tais métodos compreendem promover o contato da amostra com um parceiro de ligação capaz de interagir seletivamente com uma proteína marcadora presente na amostra. O parceiro de ligação é geralmente um anticorpo que pode ser policlonal ou monoclonal, preferencialmente monoclonal.
[0059] A presença da proteína pode ser detectada usando técnicas eletroforéticas e imunodiagnósticas padrão, incluindo imunoensaios, tais como competição, reação direta, ou ensaios tipo sanduíche. Tais ensaios incluem, mas não estão limitados a, Western blots; testes de aglutinação; imunoensaios mediados e marcados por enzima, tais como ELISAs; ensaios tipo biotina/avidina; radioimunoensaios; imunoeletroforese; imunoprecipitação, etc. As reações geralmente incluem revelar os marcadores, tais como marcadores fluorescentes, quimioluminescentes, radioativos, enzimáticos ou moléculas corantes, ou outros métodos para detectar a formação de um complexo entre o antígeno e o anticorpo ou anticorpos que reagem com os mesmos.
[0060] Os ensaios acima mencionados geralmente envolvem a separação de proteína não ligada em uma fase líquida a partir de um suporte de fase sólida, ao qual os complexos antígeno-anticorpo são ligados. Suportes sólidos que podem ser usados na prática da invenção incluem substratos, tais como nitrocelulose (por exemplo, em forma de membrana ou poço de microtitulação); cloreto de polivinila (por exemplo, lâminas ou poços de microtitulação); látex de poliestireno (por exemplo, pérolas ou placas de microtitulação); fluoreto de polivinilidina; papel diazotizado; membranas de náilon; pérolas ativadas, pérolas magneticamente responsivas, e similares.
[0061] Mais particularmente, um método ELISA pode ser usado, em que os poços de uma placa de microtitulação são revestidos com um anticorpo contra a proteína a ser testada. Uma amostra biológica contendo ou suspeita de conter a proteína marcadora é, então, adicionada aos poços revestidos. Após um período de incubação suficiente para permitir a formação de complexos antígeno-anticorpo, a(s) placa(s) pode(m) ser lavada(s) para remover porções não ligadas e uma molécula de ligação secundária detectavelmente rotulada adicionada. A molécula de ligação secundária é deixada reagir com qualquer proteína marcadora da amostra capturada, a placa é lavada e a presença da molécula de ligação secundária é detectada usando métodos bem conhecidos na técnica.
[0062] Alternativamente, um método de imunohistoquímica (IHC) pode ser preferido. IHC especificamente fornece um método de detectar alvos em um espécime de amostra ou tecido in situ. A integridade celular total da amostra é mantida em IHC, permitindo, assim, a detecção tanto da presença quanto da localização dos alvos de interesse. Tipicamente, uma amostra é fixada com formalina, incorporada em parafina e cortada em seções para coloração e subsequente inspeção por microscopia ótica. Métodos atuais de IHC usam tanto marcação direta ou marcação secundária baseada em anticorpo ou baseada em hapteno. Exemplos de sistemas de IHC conhecidos incluem, por exemplo, EnVision(TM) (DakoCytomation), Powervision(R) (Immunovision, Springdale, AZ), o kit NBA(TM) (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA), HistoFine(R) (Nichirei Corp, Tokyo, Japan).
[0063] Em uma concretização particular, uma seção de tecido (por exemplo, uma amostra compreendendo células do cumulus) pode ser montada em uma lâmina ou outro suporte após a incubação com anticorpos direcionados contra as proteínas codificadas pelos genes de interesse. Então, inspeções microscópicas na amostra montada em um suporte sólido adequado podem ser realizadas. Para a produção de fotomicrógrafos, as seções compreendendo amostras podem ser montadas em uma lâmina de vidro ou outro suporte plano, para destacar a presença das proteínas de interesse por coloração seletiva.
[0064] Portanto, amostras de IHC podem incluir, por exemplo: (a) preparações compreendendo células do cumulus (b) ditas células fixadas e incorporadas e (c) detectar as proteínas de interesse nas ditas amostras de células. Em algumas concretizações, um procedimento de coloração IHC pode compreender etapas, tais como: corte e apara do tecido, fixação, desidratação, infiltração em parafina, corte em seções finas, montagem em lâminas de vidro, cozimento, desparafinação, re-hidratação, recuperação de antígeno, etapas de bloqueio, aplicação de anticorpos primários, lavagem, aplicação de anticorpos secundários (opcionalmente combinados a um marcador detectável adequado), lavagem, contra-coloração, e exame microscópico.
[0065] A invenção também está relacionada a um kit para realizar os métodos como acima descritos, em que dito kit compreende meios para medir os níveis de expressão dos genes das Tabelas A ou B que são indicativos se o oócito ou o embrião são competentes.
[0066] A invenção será adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos. Contudo, esses exemplos não devem ser interpretados de qualquer forma como limitantes do escopo da presente invenção.
[0067] Pacientes e tratamento de FIV: Neste estudo de retrospectiva, pacientes normo-responsivos (n=30) com idade de 30,9 anos ± 2,5 e referidos ao nosso centro para ICSI (Injeção intracitoplasmática de espermatozóides) por fator de infertilidade masculina foram estudados. Os pacientes foram estimulados com uma combinação de agonista ou antagonista de GnRH com FSH recombinante (GonalF, Puregon; respectivamente da Merck-Serono e Organon) ou com hMG (Menopur, Ferring). A resposta ovariana foi avaliada pelo nível de estradiol sérico e examine de ultrassom para monitorar o desenvolvimento do folículo. A recuperação de oócitos foi realizada 36 horas após a administração de hCG (5000 UI), sob orientação por ultrassom.
[0068] Avaliação da qualidade do embrião: Nos dias 2 e 3 pós-microinjeção, os parâmetros de qualidade de embriões individualmente cultivados foram avaliados usando o número de blastômeros e o grau de fragmentação como critérios (grau 1-2: blastômeros de tamanho igual e 0-20% de fragmentação, grau 3-4: sem blastômeros de tamanho igual e mais de 20% de fragmentação. Um embrião de qualidade superior foi definido no dia 3 como 6-8 células, blastômeros de tamanho igual e nenhuma fragmentação. Um ou dois embriões foram transferidos no dia 3 após a recuperação do oócito. A gravidez clínica foi avaliada duas e seis semanas após a transferência do embrião baseado respectivamente em Beta-hCG sérico e exame de ultrassom (presença de saco gestacional com batimento cardíaco).
[0069] Células do cumulus: Todas as amostras de células do cumulus (CC) foram congeladas no dia da coleta de óvulo. Então, uma a 3 amostras CC por paciente foram aleatoriamente selecionadas para análise de microarranjo. Um total de 50 amostras CC foram coletadas a partir de 50 oócitos simples e analisadas individualmente: 34 CC de embriões de grau 1-2 (n= 20 pacientes), 11 CC de embriões de grau 3 (n= 10 pacientes) e 5 CC de oócitos não fertilizados (n= 5 pacientes) (Tabela 1).
Tabela 1: As características das amostras de células do cumulus neste estudo
CC: células do cumulus, P+: células do cumulus de embriões com resultado positivo de gravidez, P-: células do cumulus de embriões sem resultado de gravidez, G1/2: células do cumulus de embriões dos graus 1-2, G3/4: células do cumulus de embriões dos graus 3-4, NT: sem transferência.
Tabela 1: As características das amostras de células do cumulus neste estudo
[0070] A análise de dados foi realizada sob condições de duplo-cego em que o resultado de gravidez foi descrito apenas após os microarranjos serem hibridizados. Em relação ao resultado de gravidez, as 45 CC dos oócitos fertilizados incluíram 16 CC de embriões de grau 1-2 que não resultaram em gravidez (n=9 pacientes), 18 CC associadas com um resultado positivo de gravidez (n=11 pacientes) e 11 CC de embriões dos graus 3-4 que não foram transferidas. Células do cumulus foram privadas imediatamente após a recuperação de oócito (<40 h após a administração de hCG) . Células do cumulus foram mecanicamente removidas e lavadas em meio de cultura e imediatamente congeladas a -80°C em tampão de extração RLT RNA (RNeasy kit, Qiagen, Valencia, CA, EUA) antes da extração de RNA.
[0071] Células da Granulosa: Um grupo independente de pacientes normo-responsivos (n=8) (idade 34,8 anos ± 3,2) referidos para o programa ICSI por fator de infertilidade masculina foi selecionado para coleta de células da granulosa (8 amostras). Imediatamente após a recuperação de oócito, fluidos foliculares de folículos maduros (> 17 mm) do mesmo paciente foram retirados, após a remoção do complexo cumulus oócito e diluídos em 1/3 volume de solução HBSS (BioWhittaker) em lotes de 50 ml, representando uma amostra. A purificação de células da granulosa foi adaptada a partir do protocolo de (Kolena e col., 1983). Após uma centrifugação de 20 min. a 500 g em recipientes móveis, as células da granulosa foram coletadas em um amortecedor Ficoll (12 ml de meio de separação de linfócito, BioWhittaker). Elas foram sucessivamente lavadas em HBSS e PBS, incubadas por 5 min. em tampão de lise de sangue (KHCO3 10 mM, NH4Cl 150 mM, EDTA 0,1 mM) para remover as células vermelhas do sangue, contadas e peletizadas em PBS antes da lise em tampão RLT (Quiagen) e armazenadas a -80°C. O número da punção folicular e o número de células da granulosa purificadas variaram de 6 a 12 e de 2x106 a 9x106 respectivamente.
[0072] Preparação de RNA complementar (cRNA) e hibridização de microarranjo: O RNA de CC e de células da granulosa foi extraído usando o kit micro RNeasy (Qiagen). A quantidade de RNA total foi medida com um espetrofotômetro Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Technologies Inc., DE, EUA) e a integridade do RNA foi avaliada com um Bioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Palo Alto, CA, EUA). O cRNA foi preparado com duas rodadas de amplificação de acordo com o protocolo de "amplificação dupla" do fabricante (Two-Cycle cDNA Synthesis Kit, Invitrogen) iniciando a partir do RNA total (variando de 70 ng a 100 ng). O cRNA obtido após a primeira amplificação variou de 0,1 μg/μl a 1,9 μg/μl e após a segunda amplificação variou de 1,6 μg/μl a 4,5 μg/μl.
[0073] O cRNA fragmentado marcado (12 μg) foi hibridizado a sondas de oligonucleotídeos sobre um arranjo Affymetrix HG-U133 Plus 2.0 contendo 54 675 grupos de sondas de oligonucleotídeos ("grupo de sondas") que correspondem a ≈ 30000 genes humanos únicos ou genes previstos. Cada amostra de cumulus e granulosa foi colocada individualmente em um chip de microarranjo.
[0074] Processamento de dados: Imagens de GeneChip escaneadas foram processadas usando o programa Affymetrix GCOS 1.4 para obter um valor de intensidade e uma chamada de detecção (presente, marginal ou ausente) para cada grupo de sondas, usando os ajustes de análise padrão e escala global como primeiro método de normalização, com um valor médio de intensidade de alvo aparado (TGT) de cada arranjo arbitrariamente ajustado para 100. As intensidades de sonda foram derivadas usando o algoritmo MAS5.0. Esse algoritmo também determina se um gene é expresso com um nível de confiança definido ou não ("chamada de detecção"). Essa "chamada" pode tanto estar "presente" (quando as sondas de perfeita correspondência são significativamente mais hibridizadas do que as sondas com falta de correspondência, valor de p < 0,04), "marginal" (para valores de p > 0,04 e <0,06) ou "ausente" (valor de p > 0,06). Os dados do microarranjo foram obtidos em nosso laboratório em concordância com as recomendações do Minimal Information about a Microarray Experiment MIAME (Brazma e col. 2001).
[0075] Análise de dados e visualização: Análise de Significância de Microarranjos (SAM) (Tusher e col., 2001) (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/SAM/) foi usada para identificar genes cuja expressão variou significativamente entre os grupos de amostras. SAM fornece valores de alteração média ou mediana (FC) e uma falsa taxa de descoberta (FDR) porcentagem de confiança baseada em permutação de dados (alteração vezes média > 2 e FDR < 5 %). A análise de arranjo que permite a comparação do perfil de expressão gênica entre as amostras de célula do cumulus e amostras de células da granulosa é primeiro baseada na detecção de RNA significante (chamada de detecção "presente" ou "ausente") e então, submetida a uma SAM (Análise de significância de microarranjos) para identificar genes cuja expressão variou significativamente entre grupos de amostras. Para realizar a comparação de perfil de expressão gênica entre amostras de células do cumulus de acordo com qualidade embrionária e/ou resultado de gravidez, uma seleção não supervisionada de grupos de sondas usando um coeficiente de variação (CV ≥40%) e um filtro de "chamada de detecção" presente/ausente foi realizada antes da SAM. Para comparar o perfil de expressão de células do cumulus de desenvolvimento embrionário alterado (grau 3-4) e bom (grau 1-2), ou de embriões levando, ou não, a uma gravidez, nós realizamos uma classificação não supervisionada tanto com a análise de componentes principais (PCA) e agrupamento hierárquico (de Hoon e col., 2004; Eisen e col., 1998). A PCA envolveu roteiros originais baseados no programa R statistics através da interface de internet RAGE (http://rage.montp.inserm.fr) (Reme e col., 2008). Análises de agrupamento hierárquico baseadas nos níveis de expressão de sondas variáveis foram realizadas com os pacotes de programa CLUSTER e TREEVIEW. Para descobrir redes biológicas funcionais e as principais vias canônicas, nós importamos as assinaturas de expressão de genes no programa Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, CA, EUA).
[0076] Análises de RT-PCR Quantitativa: Para análise de RT-PCR, 10 amostras de CC usadas nos experimentos de microarranjo foram selecionadas de acordo com seu resultado de gravidez (5 amostras de CC associadas a um resultado negativo e 5 a um resultado positivo, correspondendo a 10 pacientes). cRNA marcado (1 μg) do paciente foi usado para gerar a primeira fita de cDNA. Esses cDNAs (5μ1 de uma diluição 1/10) foram usados para reações de PCR quantitativa em tempo real de acordo com as recomendações do fabricante (Applied Biosytems). A mistura de reação de 20 μl consistiu de cDNA (5μ1) , 1 μΜ de iniciadores e 10 μl de Taqman Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem). A amplificação foi medida durante 40 ciclos com uma temperatura de anelamento de 60°C. A quantidade de produto de PCR produzido em cada etapa do ciclo da reação de PCR é monitorada pela sonda TaqMan. Um limite é ajustado na fase exponencial da curva de amplificação, a partir do qual o número de ciclos ("Ct" para "Limite de Ciclo") é lido. O valor Ct é usado no cálculo dos níveis relativos de RNAm transcrito. A efetividade (E) do PCR foi medida. Essa efetividade é obtida por uma curva padrão correspondendo aos iniciadores usados. A reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa (QRT-PCR) foi realizada usando o sistema de detecção de sequência ABI Prism 7000 (Applied Biosystems) e normalizada a PGK1 para cada amostra usando a seguinte fórmula: Einiciador testado ΔCt/EPGK1 ΔCt (E =10-1/declive), ΔCt = Ct controle - Ct desconhecido, controle = uma amostra CC do grupo não grávido). Cada amostra foi analisada em duplicata, e múltiplos brancos de água foram incluídos com a análise.
[0077] Perfil de expressão gênica de CC de acordo com resultado de embrião: Para identificar um perfil de expressão gênica em CC que estão correlacionadas com resultado de embrião, nós estabelecemos uma assinatura de expressão gênica para cada categoria de resultado: CC de oócitos não fertilizados, CC de oócitos que resultaram no desenvolvimento de embrião, mas com fragmentação extensiva (grau 3-4), e CC de oócitos que resultaram no desenvolvimento de embrião com nenhuma ou fragmentação limitada (grau 1-2). Amostras de células da granulosa foram tomadas como um tecido de referência (controle). De fato, células da granulosa são as células proximamente relacionadas às CC, como o oposto a outros tecidos adultos. O uso desse tecido de referência diminuiu o número de genes diferencialmente expressos relacionados a diferenças na linhagem bruta, facilitando, assim, a identificação de variação sutil na interação CC/oócito. Uma análise SAM mostrou que 2605 genes foram super-regulados no grupo não fertilizado, 2739 no grupo de grau 3/4 e 2482 no grupo de grau 1-2 com um FDR < 5%. Ao contrário, 4270, 4349 e 4483 genes, foram regulados para menos, respectivamente. Essas listas de genes foram, então, intersecionadas para determinar sua sobreposição. Enquanto 449 genes superexpressos e 890 genes infraexpressos estavam em comum em todos os três grupos, cada categoria apresentou um perfil de expressão gênica específico. De forma interessante, 860 genes super-regulados, incluindo, por exemplo, Galanina e junção Gap A5 (GJA5), e 1416 genes infra-regulados, incluindo HLA-G e EGR1, foram especificamente modulados em células do cumulus associadas a uma boa qualidade morfológica embrionária. Deve ser notado que, apesar do grupo de grau 1-2 ter apresentado um forte perfil de expressão gênica, esse grupo foi heterogêneo em relação ao resultado de gravidez e incluiu 18 amostras CC associadas com embriões que resultaram em gravidez (incluindo 4 gestações de gêmeos), mas também 16 amostras CC associadas com embriões que falharam em resultar em gravidez.
[0078] Perfil de expressão gênica de CC de acordo com resultado de gravidez: amostras de CC foram, portanto, comparadas de acordo com o resultado de gravidez. Uma análise SAM delineou uma lista de "resultado de gravidez" de 630 genes que variaram significativamente (FDR < 5%) entre os dois grupos de pacientes (gravidez versus ausência de gravidez). PCA e agrupamento hierárquico confirmaram que essa lista de 630 genes, de fato, segregou uma maioria de amostras de CC associadas com gravidez daquelas associadas com ausência de gravidez. Como observação, os genes da lista de "resultado de gravidez" foram predominantemente super-regulados em amostras associadas com um bom resultado. A assinatura de expressão de "resultado de gravidez" foi particularmente acentuada em um subgrupo de 10 amostras de CC de embriões associados ao grupo de "gravidez".
[0079] Anotação funcional da lista de genes de resultado de gravidez: Para investigar os processos biológicos correlacionados a embrião que alcança gravidez, as bases de dados Ingenuity e Pubmed foram usadas para anotar os 630 genes da lista de genes do "resultado de gravidez". Dentre os genes cuja super-expressão está associada com gravidez, as vias mais significativamente super-representadas foram "estresse oxidativo", "ativação de TR/RXR", "transição de ciclo celular G2/M", "metabolismo xenobiótico" e sinalização de "NFKappaB". Dentre essas vias, os genes mais representativos foram interleucinas, quimiocinas, proteínas adaptadoras e quinases: IL1Beta (x4,5 em amostras de gravidez versus ausência de gravidez, P=0,001), IL16 (x4,8, P=0,001), IL8 (x2,6, P=0,007), IL1RN (x2,1, P=0,0051), IL17RC (x3,6, P=0,001), TIRAP (x8,0, P=0,001), CXCL12 (x3,1, P=0,001), CCR5 (x2,6, P=0,0051), e PCK1 (x3,4, P=0,001). Surpreendentemente, numerosos genes envolvidos na regulação de apoptose foram significativamente modulados em amostras de CC de oócitos resultando em uma gravidez. Esses genes foram BCL2L11 (x6,9, P<0,001), CRADD (x2, P=0,0036), NEMO (x4,6, P<0,001), BCL10 (x3,1, P=<0,001), SERPINB8 (x9.1, P<0,001) e TNFSF13 (x2,5, P=0,0038).
[0080] Po outro lado, genes associados com ausência de gravidez foram correlacionados com as seguintes vias: Dano de DNA G2/M e regulação do ponto de regulação do ciclo celular, "Sonic hedgehog", "IGF-1", "sistema complemento" e sinalização de "Wnt/Beta-catenina". Genes representativos correlacionados com ausência de gravidez incluíram NFIB (x0,3, P<0,001), MAD2L1 (x0,4, P<0,001) e IGF1R (x0,4, P<0,001).
[0081] Genes candidatos expressos em CC para potencial de embrião: A análise SAM de CC de acordo com o resultado de gravidez identificou os 45 genes da Tabela A que são biomarcadores para potencial de embrião que se diferenciariam entre oócitos que produziram embriões resultando em uma gravidez versus aqueles que não resultaram em gravidez, baseado na expressão gênica de análise de CC. QRT-PCR foi usada para confirmar independentemente os dados de microarranjos. Nós analisamos a expressão diferencial de 36 genes super-regulados e 9 genes infra-regulados entre CC de embriões de grau 1-2 que não alcançaram gravidez e CC de embriões de grau 1-2 que alcançaram gravidez.
[0082] Na maioria das espécies de mamíferos incluindo humanos, as células do cumulus que envolvem o oócito estão ainda presentes no momento da fertilização no oviduto e permanecem até a implantação embrionária. A remodelação da matriz extracelular dentro e ao redor do cumulus provavelmente desempenha um papel chave em ambas dessas etapas. A esse respeito, nós identificamos 45 genes expressos em células do cumulus que são biomarcadoras para potencial de embrião e resultado de gravidez. Em nosso estudo, nós demonstramos que o perfil de expressão gênica de CC que envolvem o oócito se correlacionou a diferentes resultados, permitindo a identificação de uma assinatura de expressão específica de embriões se desenvolvendo em direção à gravidez. Em conclusão, nós encontramos uma expressão gênica diferencial entre células do cumulus humanas de oócitos que resultam em diferentes resultados de gravidez de pacientes referidos para ICSI ou FIV. Nossos resultados indicam que a análise de células do cumulus ao redor do oócito é uma abordagem não invasiva para seleção de embrião. Tipicamente, CC podem ser coletadas imediatamente após a captura do oócito, as CC podem ser analisadas com um teste genômico (G-teste) para avaliar o potencial do embrião, e o embrião pode ser, então, selecionado para substituição a fresco baseada nos resultados do G-teste.
[0083] Para testar a confiabilidade da lista de 45 genes, nós conduzimos um estudo prospectivo incluindo pacientes jovens (<36 anos) normo responsivos, referidos ao nosso centro para ICSI por infertilidade masculina. A seleção de embrião ocorreu tanto de acordo com o perfil de expressão gênica em CCs (grupo 1) ou com aspectos morfológicos (grupo 2 usado como controle). Para cada grupo, dois embriões foram substituídos. Para os primeiros 60 pacientes (30 pacientes/grupo), no dia da coleta do óvulo, no grupo 1, cada amostra de CC foi coletada individualmente e processada para análise de expressão gênica. Amostras de CC (n=267) foram analisadas. Análise de RT-PCR quantitativa foi realizada para medir a abundância relativa dos genes transcritos de interesse em CCs, e dados de expressão para todos os biomarcadores foram obtidos a partir de todas as amostras. Todos os pacientes em ambos os grupos tiveram uma transferência de embrião a fresco no dia 3. A comparação entre os 2 grupos revela significantes diferenças para implantação e taxas/captura de gravidez em progresso (40,0% vs. 26,7% e 70,0% vs. 46,7; p<0,05, respectivamente). Nós notamos 5 gestações de gêmeos no grupo 1 versus 0 no grupo 2 usado como controle. Além disso, nós observamos que não houve relação entre aspectos morfológicos e o perfil de experssão gênica em CC. Com base na análise de 267 amostras de CC, nós notamos que 27% das CCs expressam genes que predizem embriões capazes de alcançar a gravidez, 42% das CCs não, 31% das CCs apresentando expressão gênica para captura inicial de desenvolvimento de embrião.
[0084] Biomarcadores candidatos selecionados estão listados na Tabela B abaixo. A Tabela B apresenta o grupo de genes em células do cumulus que foram capazes de prever diferentes condições clínicas: (A) gravidez, (B) ausência de gravidez e (C) captura inicial de embrião.
Tabela B: Grupo de genes preditivos
Tabela B: Grupo de genes preditivos
[0085] Através deste pedido, várias referências descrevem o estado da técnica a qual esta invenção pertence. As descrições dessas referências são aqui incorporadas por referência na presente descrição.
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Claims (3)
- Método para selecionar um oócito ou um embrião caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
a) medir, em uma célula do cumulus adjacente ao referido oócito ou ao referido embrião, o nível de expressão dos genes dos grupos A, B e C, em que:- - o grupo A consiste em fosfoenolpiruvatocarboxiquinase 1 (PCK-1), ADP-ribosilarginina hidrolase (ADPRH), proteína de ligação a cálcio 4 (CABP4), Membro 6 da família SLAM (SLAMF6), Ativador de transcrição de ligação à calmodulina 1 (CAMTA1), Proteoglicana 2 de condroitina sulfato (CSPG2) e Perforina 1 (PRF1);
- - o grupo B consiste em Homólogo B do oncogene viral de osteosarcoma murino FBJ (FOSB), Neuroligina 2 (NLGN2), Fosfodiesterase 5A, cGMP-específica (PDE5A), Fosfolipase A2, grupo V (PLA2G5), Glipican 6 (GPC6) e Resposta de crescimento inicial 3 (EGR3); e
- - o grupo C consiste em Fator nuclear I/B (NFIB), Fator nuclear I/C (NFIC), Receptor de fator de crescimento insulina-like 1 (IGF1R), G0/G1 comutador 2 (G0S2), Receptor de glutamato, ionotrópico, cainato 5 (GRIK5) e Motivo de ligação de RNA, proteína de interação de fita simples 1 (RBMS1);
b) comparar o nível de expressão medido na etapa a) com o nível de expressão dos referentes genes medidos nas células da granulosa;
c) selecionar embriões com uma alta taxa de implantação levando à gravidez ou de oócitos que quando fertilizados produzirão um embrião viável com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez; em que- - a super expressão de um ou mais genes selecionados do grupo A é preditivo de um embrião com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez ou de um oócito que quando fertilizado produz um embrião viável com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez;
- - a super expressão de um ou mais genes selecionados do grupo B é preditivo de um embrião que não possui uma elevada taxa de implantação levando à gravidez ou de um oócito que quando fertilizado não produz um embrião viável com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez, em que o embrião não é capaz de implantação;
- - a super expressão de um ou mais genes selecionados do grupo C é preditivo de um embrião que não possui uma elevada taxa de implantação levando à gravidez ou de um oócito que quando fertilizado não produz um embrião viável com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez devido à inibição precoce do crescimento do embrião.
- Método para selecionar um oócito caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
- a) medir o nível de expressão de 45 genes em uma célula do cumulus adjacente ao referido oócito, onde os referidos 45 genes são Membro 6 da família do sítio de integração MMTV tipo sem alça (WNT6), Domínio contendo repetições ricas em leucina e homologia à calponina (CH) LRCH4), box pareado 8 (PAX8), Proteína de ligação de cálcio 4 (CABP4), fosfodiesterase 5A, cGMP-específica (PDE5A), BCL2-tipo 11 (facilitador de apoptose) (BCL2L11), fosfoenolpiruvato carboxiquinase 1 (PCK1), Fator de transcrição 20 (AR1) (TCF20), Membro 6 da família SLAM (SLAMF6), receptor de eritropoietina (EPOR), Subunidade gama 6 do canal de cálcio dependente de voltagem (CACNG6), Domínio 1 contendo pirina da família NLR (NLRP1), Molécula de adesão celular a plaqueta/endotélio (PECAM1), Óxido nítrico sintase 1 (NOS1), Fator de ativação de transcrição 3 (ATF3), Proteína associada à queratina 8-1 (KRTAP8), Receptor de glutamato, ionotrópico, cainato 5 (GRIK5), Membro 3 da família de carreador de soluto 24 (SLC24A3), Membro 12 da família de carreador de soluto 5 (SLC5A12), Membro 2 da família de carreador de soluto 10 (SLCA10A2), Membro 1A2 da família de transportador de ânions orgânicos carreadores de soluto (SLCO1A2), Membro 5 da família de carreador de soluto 25 (SLC25A5), Sinaptofisina tipo 2 (MG29), Neuroligina 2 (NLGN2), Proteína quinase, dependente de cAMP, catalítica, alfa (PRKACA), Homólogo B do oncogene viral de osteosarcoma murino FBJ (FOSB), ST3 beta-galactosida alfa-2,3-sialil transferase 3 (SIAT6), Lisil oxidase tipo 2 (LOXL2), Perforina 1 (PRF1), ADP-ribosilarginina hidrolase (ADPRH), Membro 3, família B da proteína de ligação ao precursor beta-amilóide (A4) (APBB3), Resposta de crescimento inicial 3 (EGR3), Receptor de canabinóide 2 (macrófago) (CNR2), Proteína 1 transmembrana induzida por interferon (IFITM1), Fosfolipase A2, grupo V (PLA2G5), Ativador de transcrição de ligação à calmodulina 1 (CAMTA1), SRY (região de determinação de sexo Y)-box 4 (SOX4), Fator nuclear I/B (NFIB), Fator nuclear I/C (NFIC), Motivo de ligação de RNA, proteína de interação de fita simples 1(RBMS1), G0/G1 comutador 2 (G0S2), Homólogo 3 supressor de tumor FAT (FAT3), Membro 1 da família de carreador de soluto 40 (SLC40A1), glipican 6 (GPC6) e Receptor de fator de crescimento insulina-like 1 (IGF1R);
- b) comparar o referido nível de expressão medido na etapa a) com aquele medido em um controle, em que o referido controle é uma célula cumulus adjacente a um oócito que, uma vez fertilizado, produziu um embrião viável associado com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez; e
- c) concluir que o referido oócito, uma vez fertilizado não irá produzir um embrião viável associado com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez, se uma expressão diferencial entre o referido oócito e o referido controle é medida na etapa b), e selecionar oócitos que possuem o nível de expressão medido em a) estatisticamente similar ao nível de expressão observado no controle como sendo oócitos que quando fertilizados produzirão embriões viáveis associados com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez.
- Método para selecionar embriões caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:
- a) medir o nível de expressão de 45 genes em uma célula do cumulus adjacente ao embrião, onde os referidos 45 genes são WNT6, LRCH4, PAX8, CABP4, PDE5A, BCL2L11, PCK1, TCF20, SLAMF6, EPOR, CACNG6, NLRP1, PECAM1, NOSI, ATF3, KRTAP8, GRIK5, SLC24A3, SLC5A12, SLCA10A2, SLCO1A2, SLC25A5, MG29, NLGN2, PRKACA, FOSB, SIAT6, LOXL2, PRF1, ADPRH, APBB3, EGR3, CNR2, IFITM1, PLA2G5, CAMTA1, SOX4, NFIB, NFIC, RBMS1, G0S2, FAT3, SLC40A1, GPC6 e IGF1R;
- b) comparar o referido nível de expressão medido na etapa a) com aquele medido em um controle, em que o referido controle é uma célula cumulus adjacente a um embrião que deu origem a um feto viável; e
- c) concluir que o referido embrião não dará origem a um feto viável se uma expressão diferencial entre o referido oócito e o referido controle é medida na etapa b), e selecionar embriões que possuem o nível de expressão medido em a) estatisticamente similar ao nível de expressão observado no controle como sendo oócitos com uma elevada taxa de implantação levando à gravidez.
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