ES2886472T3 - Métodos para la determinación de la etapa de desarrollo de células del cúmulo humanas - Google Patents

Abstract

Un método para determinar in vitro si una célula de cúmulo es madura, que comprende una etapa de medición, en dicha célula de cúmulo, del nivel de expresión de: - al menos un gen seleccionado de la Tabla A en donde dicho al menos un gen seleccionado de la Tabla A comprende C14orf4 y en donde la sobreexpresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos para la determinación de la etapa de desarrollo de células del cúmulo humanas

Sector de la técnica

La presente invención se refiere, en general, al campo de la medicina reproductiva. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para determinar la etapa de desarrollo de células del cúmulo humanas emitidas a partir del ovocito MII.

Estado de la técnica

Los intercambios bidireccionales entre ovocito y células del cúmulo (CC) contiguas son importantes para la adquisición de competencias del ovocito, desarrollo embrionario temprano y expansión de CC (Cha y Chian, 1998; Goud et al., 1998; Salustri et al., 1989). La maduración del ovocito comienza con la reanudación del proceso de la primera meiosis y se divide en la maduración nuclear y citoplasmática. Durante la maduración nuclear, hay una progresión de la profase I, caracterizada por la rotura de la vesícula germinal (GVBD; del inglés, germinal vesicle breakdown), a la metafase II (MII) de la segunda meiosis (Cha y Chian, 1998; Wang y Sun, 2007). Al final de este proceso, el ovocito debe considerarse como maduro y que se puede fecundar.

Sin embargo, el principal problema, que impide la fecundación in vitro (FIV; en inglés, IVF) y el éxito de la inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI; del inglés, intracytoplasmic sperm injection), es cómo seleccionar ovocitos competentes para el desarrollo y la implantación embrionaria. Se ha sugerido el perfil de expresión génica de las CC para predecir el resultado del desarrollo del embrión y del embarazo (Adriaenssens et al., 2010; Assou et al., 2008; Assou et al., 2010; Feuerstein et al., 2007; Hamel et al., 2008; Van Montfoort et al., 2008; Zhang et al., 2005). Sin embargo, en la mayoría de estos estudios, los investigadores no consideraron la posibilidad de que el perfil de expresión génica de las CC pudiera variar de acuerdo con las etapas de la maduración nuclear del ovocito y por tanto, los presentes inventores se centraron principalmente en una fase específica individual de la maduración del ovocito, tal como la etapa MII (Feuerstein et al., 2007).

La FIV es una técnica potente y ampliamente utilizada para el tratamiento de la infertilidad. En este procedimiento, los huevos humanos se recuperan y mezclan con esperma en una placa de cultivo para permitir el proceso de fecundación. A continuación, los embriones se transfieren al útero el día 2/3, cuando tienen entre 4 y 6-8 células respectivamente o el día 5 o 6 en estadio de blastocisto. Esta técnica se utiliza para mujeres con, por ejemplo, trompas de Falopio dañadas o ausentes, endometriosis, infertilidad de factor masculino e infertilidad inexplicable. Sin embargo, la tasa de blastulación varía según las indicaciones y el impacto del factor masculino y esto explica por qué la tasa de implantación varía entre un 5 % y un 30 %.

En la concepción in vivo, el embrión alcanza el útero en un estadio de desarrollo de blastocisto. Por consiguiente, las técnicas de cocultivo del embrión, utilizadas satisfactoriamente en animales, representan un esfuerzo para mejorar los medios de cultivo para los embriones, de modo que una proporción de embriones mayor alcanzará el estadio de blastocisto para mejorar las tasas de implantación y embarazo. Además, si el cocultivo da como resultado una tasa de implantación mayor, podrían transferirse menos embriones en cada ciclo, lo que da como resultado una menor incidencia de gestaciones múltiples. Se han investigado por tanto una variedad de técnicas de cocultivo, que implican el uso de capas de células alimentadoras derivadas de una gama de tejidos, incluyendo el uso de tejidos reproductivos humanos (es decir, endometrio) y el cocultivo con células del cúmulo (OMAR Farouk y Vlad, 2008; Quinn y Margalit, 1996 y documento EP0340934). Sin embargo, no ha surgido ningún método estandarizado para cultivar un embrión hasta un estadio de desarrollo de blastocisto ni ningún método estandarizado para el cocultivo del embrión con células del cúmulo para aumentar la tasa de blastulación y no se ha determinado todavía el sistema óptimo para la preimplantación del cultivo de embriones humanos. El documento WO2010/118991 desvela métodos en donde la competencia de un ovocito se determina midiendo el nivel de expresión de 45 genes en las células del cúmulo que rodean dicho ovocito. Ouandaogo et al. (Human reproduction, vol.45, n.° supl. 1, 30 de junio de 2010, página 1204) desvelan las diferencias del perfil de expresión génica de células del cúmulo entre ovocitos de diferentes estadios de maduración.

Objeto de la invención

La invención se define por las reivindicaciones.

La presente invención se refiere a un método para determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura o inmadura.

La presente divulgación se refiere también a células del cúmulo maduras, células del cúmulo maduras inmortalizadas, poblaciones de células del cúmulo maduras y líneas celulares de cúmulo maduras.

La presente invención se refiere también a un sistema de cocultivo de embriones humanos novedoso para mejorar el crecimiento de embriones humanos in vitro y por consiguiente, aumentar las tasas de embarazo en mujeres infértiles sometidas a tratamiento de FIV o de ISCI.

Descripción detallada de la invención

Los inventores han determinado un conjunto de 25 genes que se expresan diferencialmente en células del cúmulo maduras e inmaduras humanas.

De hecho, los inventores demostraron que el perfil de expresión génica de las células del cúmulo que rodean el ovocito se correlaciona con sus estadios de desarrollo y que el estadio de desarrollo de las células del cúmulo se correlaciona en sí con la tasa de blastulación, permitiendo la identificación de una firma de expresión específica de desarrollo del ovocito hacia el estadio de blastocisto. Sus resultados indican que el análisis de las células del cúmulo que rodean el ovocito es un enfoque no invasivo que predice la tasa de blastulación para la selección de embriones.

Todos los genes que pertenecen a la invención son conocidos de por sí y se enumeran en la Tabla A más adelante. La Tabla A presenta el conjunto de genes cuyo perfil de expresión se ha demostrado que es informativo para determinar si una célula de cúmulo humana es madura o inmadura.

Tabla A: conjunto de genes predictivos cuyas sobreexpresiones son indicativas de una célula de cúmulo m r

Tabla B: conjunto de genes predictivos cuyas sobreexpresiones son indicativas de una célula de cúmulo inm r

Un objeto de la invención se refiere a un método para determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura o inmadura, que comprende una etapa de medición en dicha célula de cúmulo del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A y al menos un gen seleccionado de la Tabla B, en donde la sobreexpresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura y la sobreexpresión de al menos un gen de la Tabla B es indicativa de que la célula de cúmulo es una célula de cúmulo inmadura.

La expresión "célula de cúmulo" se refiere a una célula comprendida en una masa de células que rodea un ovocito. Se cree que estas células están implicadas en proporcionar a un ovocito algo de su nutrición, energía y u otros requisitos que son necesarios para producir un embrión viable tras la fecundación. Las células del cúmulo humanas (CCh) son células somáticas encontradas estrechamente asociadas al ovocito en desarrollo en el folículo ovárico. Las CCh se estimulan para crecer, diferenciarse y luteinizarse mediante factores endocrinos, paracrinos y autocrinos. Las funciones principales de las CCh incluyen la producción de esteroides, así como una miríada de factores de crecimiento para interaccionar con el ovocito durante su desarrollo dentro del folículo ovárico. Sin embargo, después de la ovulación, las CCh producen progesterona que puede mantener un embarazo potencial.

En el presente documento, los ovocitos se clasifican en tres categorías basándose en el estado nuclear, como se divulga en Feuerstein et al., 2007:

(i) ovocito inmaduro en el estadio de vesícula germinal (VG; en inglés, GV),

(ii) ovocito inmaduro sin un primer cuerpo polar o VG, denominado arbitrariamente metafase I (MI) y

(iii) ovocito maduro con el primer cuerpo polar (metafase II, MII).

Estas categorías se corresponden con tres etapas de desarrollo diferentes de los ovocitos.

Los inventores han estudiado el perfil de expresión génica de las células del cúmulo que rodean los ovocitos de estas tres categorías.

En primer lugar, los inventores han estudiado el perfil de expresión génica de una población grande de células del cúmulo que rodean los ovocitos MII. Entre esta población grande, se ha demostrado que una mayoría de células del cúmulo que rodea los ovocitos MII presenta un perfil de expresión génica específica. Estas células del cúmulo se denominan en el presente documento células del cúmulo MII (CC^mii) o células del cúmulo maduras o células del cúmulo "competentes".

A continuación, de la misma manera, los inventores han estudiado el perfil de expresión génica de una población grande de células del cúmulo que rodean ovocitos MI y ovocitos normales VG. Para cada una de estas dos categorías de células del cúmulo, hay una mayoría de células del cúmulo que presenta un perfil de expresión génica.

Las células del cúmulo que presentan el perfil de expresión génica mayoritario de las CC que rodean ovocitos MI se denominan en el presente documento células del cúmulo MI (CC^mi) y las células del cúmulo que presentan el perfil de expresión génica mayoritario de las CC que rodean ovocitos VG se denominan en el presente documento células del cúmulo VG (CC^vg). Las células del cúmulo que son CC^mi o CC^vg se denominan en el presente documento células del cúmulo inmaduras o células del cúmulo no competentes.

Además, los inventores han estudiado el perfil de expresión génica de las células del cúmulo individuales que rodean diferentes ovocitos MII.

Los presentes inventores encontraron que los ovocitos MII pueden estar rodeados por CC^mii, CC^mi o CC^vg y que los ovocitos MII rodeados por cúmulo maduro (CC^mii) (es decir, la población mayoritaria) presentan, tras la fecundación, una tasa mayor de blastulación que los ovocitos MII que rodean células del cúmulo inmaduras, es decir, CC^mi o CC^vg.

Por tanto, incluso si un ovocito está en la etapa de desarrollo necesaria para desarrollarse, tras la fecundación, en un blastocisto, si está rodeado de células del cúmulo inmaduras, la tasa de blastulación será baja.

En un estudio previo desvelado en el documento WO2010/118991, los inventores han demostrado que, debido a los intercambios bidireccionales entre las células del cúmulo y los ovocitos, las células del cúmulo son un indicador de la competencia del ovocito. Por tanto, un ovocito competente (es decir, un ovocito que sea capaz de producir, tras la fecundación, un embrión viable con una tasa de implantación que conduzca al embarazo) puede seleccionarse mediante la medición del perfil de expresión génica de las células del cúmulo que rodean dicho ovocito.

En la presente invención, los inventores han demostrado que, además de la competencia del ovocito de por sí y de su etapa de desarrollo, la etapa de desarrollo de las células del cúmulo que rodean el ovocito es un factor adicional para el desarrollo de un ovocito fecundado en un embrión.

Por tanto, las células del cúmulo maduras son una categoría de CC, por oposición a las células del cúmulo inmaduras, que están en una etapa de desarrollo específica. Tales CC maduras, cuando rodean un ovocito MII, aumentan la probabilidad de que dicho ovocito dé lugar a un embrión que alcanzará la etapa de blastocisto tras la fecundación. Por tanto, las células del cúmulo maduras, también denominadas en el presente documento CC^mii, son células del cúmulo en una etapa de desarrollo que aumentan la probabilidad de que dicho ovocito dé lugar a un embrión que alcanzará la etapa de blastocisto tras la fecundación.

El término "embrión" se refiere a un ovocito fecundado o zigoto. Dicha fecundación puede surgir en una fecundación in vitro clásica (FlVc) o en un procedimiento de inyección de esperma intracitoplasmática (ISCI). La expresión "fecundación in vitro clásica" o "FIVc" se refiere a un proceso mediante el cual los ovocitos se fecundan por espermatozoides fuera del cuerpo, in vitro. La FIV es un tratamiento importante en la infertilidad cuando ha fallado la concepción in vivo. La expresión "inyección intracitoplasmática de espermatozoides" o "MCE" se refiere a un procedimiento de fecundación in vitro en el que se inyecta un único espermatozoide directamente en un ovocito. Este procedimiento se usa más comúnmente para superar los factores de infertilidad masculina, aunque también se puede usar cuando los ovocitos no pueden penetrarse fácilmente por los espermatozoides y ocasionalmente como un método de fecundación in vitro, especialmente el asociado con la donación de esperma.

Como se utiliza en el presente documento, el término "blastocisto" se refiere a la estructura formada en la embriogénesis temprana de los mamíferos, después de la formación de la mórula. Posee una masa celular interna (MCI; en inglés, ICM) o embrioblasto, que posteriormente forma el embrión y una capa externa de células o trofoblasto, que después forma la placenta. El trofoblasto rodea la masa celular interna y una cavidad del blastocisto llena de líquido conocida como blastocele. El blastocisto humano comprende 70-100 células. La formación del blastocisto comienza el día 5 después de la fecundación en seres humanos cuando se abre el blastocele en la mórula.

De acuerdo con la invención, el ovocito puede ser el resultado de un ciclo natural, un ciclo natural modificado o un ciclo estimulado para FIVc o IICE. La expresión "ciclo natural" se refiere al ciclo natural por el cual la hembra o mujer produce un ovocito. La expresión "ciclo natural modificado" se refiere al proceso por el cual, la hembra o mujer produce un ovocito o dos bajo una estimulación ovárica leve con antagonistas de GnRH asociados con FSH o hMG recombinantes. La expresión "ciclo estimulado" se refiere al proceso por el cual una hembra o una mujer produce uno o más ovocitos tras la estimulación con agonistas o antagonistas de GnRH asociados con FSH o hMG recombinante.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "sobreexpresión de un gen" tiene su significado general en la técnica y se refiere a un nivel mayor de expresión de un ácido nucleico (por ejemplo, ARNm) o de una proteína respecto a un nivel de referencia.

De acuerdo con la invención los niveles de referencia pueden ser los niveles de expresión que se han determinado previamente para las células del cúmulo VG, MI o MII. El término sobreexpresión se refiere a al menos 2 x superior el nivel de expresión génica que el nivel de referencia, preferentemente al menos 5 x superior que el nivel de referencia y preferentemente al menos 10 x superior que el nivel de referencia. Normalmente, para determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo MII los niveles de expresión de los genes de la Tabla A se comparan con los niveles de referencia que se han determinado previamente para una célula de cúmulo GV o MI. Por el contrario, para determinar si una célula de cúmulo es GV o MI los niveles de expresión de los genes de la Tabla B se comparan con los niveles de referencia que se han determinado previamente para una célula de cúmulo MII.

La presente invención se refiere también a un método para determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura o un cúmulo inmaduro, que comprende una etapa de medición en dicha célula de cúmulo del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A o al menos un gen seleccionado de la Tabla B, en donde la sobreexpresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura y la sobreexpresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla B es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo inmadura.

La presente invención se refiere también a un método para determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura o una célula de cúmulo inmadura, que comprende una etapa de medición en dicha célula de cúmulo del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A, en donde la sobreexpresión del gen seleccionado de la Tabla A es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura y en donde dicho al menos un gen seleccionado de la Tabla A comprende C14orf4.

La presente invención se refiere también a un método para determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura o una célula de cúmulo inmadura, que comprende una etapa adicional de medición en dicha célula de cúmulo del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla B, en donde la sobreexpresión del gen seleccionado de la Tabla B es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo inmadura.

La sobreexpresión de uno o más genes seleccionados de la Tabla A es indicativa de que dicha célula de cúmulo es madura. La sobreexpresión de uno o más genes seleccionados de la Tabla B es indicativa de que dicha célula de cúmulo es inmadura.

Dichos uno o más genes pueden seleccionarse, por ejemplo, de la Tabla A solo o de la Tabla B solo.

Normalmente, pueden seleccionarse 1 a 11 genes de la Tabla A.

Normalmente, pueden seleccionarse 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 genes de la Tabla A.

Normalmente, pueden seleccionarse 1 a 14 genes de la Tabla B.

Normalmente, pueden seleccionarse 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 genes de la Tabla B. Como alternativa, dichos genes pueden seleccionarse, por ejemplo, de la Tabla A y B.

Normalmente, pueden seleccionarse 1 a 11 genes de la Tabla A y pueden seleccionarse 0 a genes de la Tabla B. Normalmente, pueden seleccionarse 0 a 11 genes de la Tabla A y pueden seleccionarse 1 a genes de la Tabla B.

En una realización particular, la presente invención se refiere a un método para determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura o una célula de cúmulo inmadura, que comprende una etapa de medición en dicha célula de cúmulo del nivel de expresión de 25 genes de la Tabla A y la Tabla B, en donde la sobreexpresión de los genes de la Tabla A es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura y la sobreexpresión de los genes de la Tabla B es indicativa de que la célula de cúmulo es una célula de cúmulo inmadura.

Los métodos de la invención son aplicables preferentemente a mujeres pero puede ser aplicables a otros mamíferos (por ejemplo, primates, perros, gatos, cerdos, vacas, ratones...).

Los métodos de la invención son particularmente adecuados para evaluar la eficacia de un tratamiento de fecundación in vitro. Por consiguiente, los métodos de la invención pueden utilizarse para evaluar la eficacia de un protocolo de hiperestimulación ovárica controlada (HOC; en inglés, COS) en un sujeto hembra que comprende:

i) proporcionar a partir de dicho sujeto femenino al menos un ovocito con sus células del cúmulo;

ii) determinar mediante el método de la invención si dichas células del cúmulo son células del cúmulo maduras.

A continuación, después de tal método, el embriólogo puede seleccionar los ovocitos rodeados con células del cúmulo maduras y fecundarlos in vitro a través de un protocolo de fecundación in vitro clásica (FIVc) o bajo un protocolo de inyección de esperma intracitoplasmática (ISCI).

El método de la invención puede utilizarse además para controlar la eficacia de un protocolo de hiperestimulación ovárica controlada (HOC) que comprende:

i) aislar de dicha mujer al menos un ovocito con sus células del cúmulo en ciclos naturales, modificados o estimulados;

ii) determinar mediante el método de la invención si dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura; iii) y controlar la eficacia del tratamiento de HOC basándose en si da como resultado un ovocito que está rodeado de células del cúmulo maduras.

El tratamiento de HOC puede basarse en al menos un principio activo seleccionado del grupo que consiste en antagonistas de GnRH o antagonistas asociados con FSH o hMG recombinantes.

La presente divulgación se refiere también a un método para seleccionar un ovocito que tiene una alta probabilidad de dar lugar tras la fecundación a un embrión que alcanzará la etapa de blastocisto, que comprende las etapas que consisten en i) proporcionar una pluralidad de ovocitos, ii) aislar al menos una célula de cúmulo que rodea dichos ovocitos, iii) determinar si dicha al menos una célula de cúmulo de la etapa ii) es madura de acuerdo con el método de la invención y iv) seleccionar los ovocitos que están rodeados de células del cúmulo maduras.

La determinación del nivel de expresión de los genes como se ha descrito anteriormente en la Tablas A y la Tabla B puede realizarse mediante una variedad de técnicas. En general, el nivel de expresión como se ha determinado es un nivel de expresión relativo.

Más preferentemente, la determinación comprende poner en contacto la muestra con reactivos selectivos, tales como sondas, cebadores o ligandos y de este modo detectar la presencia o medir la cantidad, de polipéptido o ácidos nucleicos de interés originariamente en la muestra. La puesta en contacto puede realizarse en cualquier dispositivo adecuado, tal como una placa, plato de microvaloración, tubo de ensayo, pocillo, vidrio, columna, etc. En realizaciones específicas, la puesta en contacto se realiza sobre un sustrato revestido con el reactivo, tal como una matriz de ácidos nucleicos o una matriz de ligandos específicos. El sustrato puede ser un sustrato sólido o semisólido, tal como cualquier sustrato adecuado que comprende vidrio, plástico, nailon, papel, metal, polímeros y similares. El sustrato puede ser de diversas formas y tamaños, tales como un portaobjetos, una membrana, una perla, una columna, un gel, etc. La puesta en contacto puede hacerse en cualquier condición adecuada para un complejo detectable, tal como un híbrido de ácidos nucleicos o un complejo de anticuerpo-antígeno, para que se forme entre el reactivo y los ácidos nucleicos o polipéptidos de la muestra.

En una realización preferida, el nivel de expresión puede determinarse mediante la determinación de la cantidad de ARNm.

Los métodos para determinar la cantidad de ARNm son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el ácido nucleico contenido en las muestras (por ejemplo, célula o tejido preparado del paciente) se extrae primero de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, usando enzimas líticas o soluciones químicas o se extrae mediante resinas de unión a ácido nucleico siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, el ARNm extraído se detecta mediante hibridación (por ejemplo, análisis de transferencia Northern) y/o amplificación (por ejemplo, RT-PCR). Preferentemente, se prefiere la RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa. La RT-PCR en tiempo real cuantitativa o semicuantitativa es particularmente ventajosa.

Otros métodos de amplificación incluyen la reacción en cadena de la ligasa (LCR; del inglés, ligase chain reaction), amplificación mediada por transcripción (TMA, del inglés, transcription-mediated amplification), amplificación de desplazamiento de cadena (SDA; del inglés, strand displacement amplification) y amplificación basada en secuencia de ácidos nucleicos (NASBA; del inglés, nucleic acid sequence based amplification).

Los ácidos nucleicos que tienen al menos 10 nucleótidos y que presentan complementariedad de secuencia u homología con el ARNm de interés en el presente documento tienen utilidad como sondas de hibridación o cebadores de amplificación. Se entiende que tales ácidos nucleicos necesitan ser idénticos, pero normalmente son al menos aproximadamente un 80 % idénticos con la región homóloga de tamaño comparable, más preferentemente un 85 % idénticos e incluso más preferentemente un 90-95 % idénticos. En determinadas realizaciones, será ventajoso utilizar ácidos nucleicos junto con medios adecuados, tales como un marcador detectable, para detectar la hibridación. En la técnica se conoce una amplia diversidad de indicadores adecuados que incluyen, ligandos fluorescente, radioactivos, enzimáticos u otros (por ejemplo, avidina/biotina).

Las sondas comprenden normalmente ácidos nucleicos monocatenarios de entre 10 a 1000 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de entre 10 y 800, más preferentemente de entre 15 y 700, normalmente de entre 20 y 500. Los cebadores normalmente son ácidos nucleicos monocatenarios más cortos, de entre 10 a 25 nucleótidos de longitud, diseñados para coincidir perfectamente o casi perfectamente con un ácido nucleico de interés a amplificar. Las sondas y los cebadores son "específicos" de los ácidos nucleicos con los que hibridan, es decir, hibridan preferentemente en condiciones de hibridación rigurosas (que se corresponden con la más alta temperatura de fusión Tm, por ejemplo, formamida al 50 %, 5x o 6x SCC. Sc C es un NaCl 0,15 M, citrato de Na 0,015 M).

Los cebadores o sondas de ácidos nucleicos utilizados en la amplificación anterior y el método de detección pueden ensamblarse como un kit. Tal kit incluye cebadores consenso y sondas moleculares. Un kit preferido también incluye los componentes necesarios para determinar si ha ocurrido la amplificación. El kit puede incluir también, por ejemplo, tampones y enzimas de PCR; secuencias de control positivo, cebadores de control de reacción; e instrucciones para amplificar y detectar las secuencias específicas.

En una realización particular, los métodos de la invención comprenden las etapas de proporcionar los ARN totales extraídos de las células del cúmulo y someter a los ARN a amplificación e hibridación de sondas específicas, más particularmente mediante una RT-PCR cuantitativa o semicuantitativa.

En otra realización preferida, el nivel de expresión se determina mediante análisis de microplaca de ADN. Tal microplaca de ADN o micromatriz de ácido nucleico consiste en distintas sondas de ácido nucleico que se unen químicamente a un sustrato, que puede ser un microchip, un portaobjetos de vidrio o una perla de tamaño de microesfera. Un microchip puede estar constituido de polímeros, plásticos, resinas, polisacáridos, sílice o materiales a base de sílice, carbono, metales, cristales inorgánicos o nitrocelulosa. Las sondas comprenden ácidos nucleicos tales como ADNc u oligonucleótidos que pueden ser aproximadamente 10 a 60 pares de bases. Para determinar el nivel de expresión, una muestra de un sujeto de prueba, opcionalmente sometida primero a una transcripción inversa, se marca y se pone en contacto con la micromatriz en condiciones de hibridación, conduciendo a la formación de complejos entre los ácidos nucleicos diana que son complementarios con las secuencias de sondas unidas a la superficie de la micromatriz. A continuación, los complejos hibridados marcados se detectan y pueden cuantificarse o semicuantificarse. El marcaje puede lograrse mediante numerosos métodos, por ejemplo, utilizando marcaje radiactivo o fluorescente. Muchas variantes de la tecnología de hibridación de micromatrices están disponibles para el experto en la materia (Hoheisel, 2006).

En este contexto, la invención proporciona adicionalmente una microplaca de ADN que comprende un soporte sólido que lleva ácidos nucleicos que son específicos de los genes enumerados en la Tabla A.

Otros métodos para determinar el nivel de expresión de dichos genes incluyen la determinación de la cantidad de proteínas codificadas por dichos genes.

Tales métodos comprenden poner en contacto la muestra con una pareja de enlace capaz de interactuar selectivamente con una proteína marcadora presente en la muestra. La pareja de enlace generalmente es un anticuerpo que puede ser policlonal o monoclonal, preferentemente monoclonal.

La presencia de la proteína puede detectase utilizando técnicas electroforéticas y de inmunodiagnóstico convencionales, incluyendo inmunoensayos tales como competición, reacción directa o ensayos de tipo sándwich. Tales ensayos incluyen, pero sin limitación, transferencias Western; pruebas de aglutinación; inmunoensayos marcados con enzimas y mediados, tales como ELISA; ensayos de tipo biotina/avidina; radioinmunoensayos; inmunoelectroforesis; inmunoprecipitación, etc. Las reacciones generalmente incluyen marcadores reveladores tales como marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivos, enzimáticos o moléculas colorantes u otros métodos para detectar la formación de un complejo entre el antígeno y el anticuerpo o los anticuerpos con los que reacciona.

Los ensayos mencionados anteriormente en general implican la separación de la proteína sin unir en una fase líquida de un soporte de fase sólida al que se unen los complejos antígeno-anticuerpo. Los soportes sólidos que pueden utilizarse en la práctica de la invención incluyen sustratos tales como nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o de pocilio de microvaloración); cloruro de polivinilo (por ejemplo, hojas o pocilios de microvaloración); látex de poliestireno (por ejemplo, perlas o placas de microvaloración); fluoruro de polivinilidina; papel diazotado; membranas de nailon; perlas activadas, perlas magnéticamente sensibles y similares.

Más particularmente, puede utilizarse un método ELISA, en donde los pocillos de una placa de microvaloración se revisten con un anticuerpo contra la proteína a analizar. A continuación, se añade a los pocillos revestidos una muestra biológica que contiene o se sospecha que contiene la proteína marcadora. Después de un periodo de incubación suficiente para permitir la formación de complejos anticuerpo-antígeno, la(s) placa(s) se puede(n) lavar para eliminar las fracciones no unidas y se añade una molécula de unión secundaria marcada de forma detectable. Se deja que la molécula de unión secundara reaccione con cualquier proteína marcadora capturada en la muestra, se lava la placa y se detecta la presencia de la molécula de unión secundaria utilizando métodos bien conocidos en la técnica.

Como alternativa, puede preferirse un método de inmunohistoquímica (IHC; del inglés, immunohistochemistry). La IHC proporciona un procedimiento para detectar específicamente dianas en una muestra o espécimen de tejido in situ. La integridad celular global de la muestra se mantiene en la IHC, permitiendo por tanto la detección tanto de la presencia como de la localización de las dianas de interés. Normalmente, una muestra se fija con formalina, se embebe en parafina y se corta en secciones para la tinción y la inspección posterior mediante microscopía óptica. Los métodos actuales de IHC utilizan un marcaje directo o un marcaje secundario basado en anticuerpos o basado en hapteno. Entre los ejemplos de sistemas de IHC conocidos se incluyen, por ejemplo, EnVision(TM) (DakoCytomation), Powervision(R) (Immunovision, Springdale, Arizona), el kit de n Ba (TM) (Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, California), HistoFine(R) (Nichirei Corp, Tokio, Japón).

En una realización particular, una sección de tejido (por ejemplo, una muestra que comprende células del cúmulo) puede montarse en un portaobjetos u otro soporte después de una incubación con anticuerpos dirigidos contra las proteínas codificadas por los genes de interés. A continuación, pueden realizarse inspecciones microscópicas en la muestra montada en un soporte sólido adecuado. Para la producción de fotomicrografías, pueden montarse muestras que comprenden secciones sobre un portaobjetos de vidrio u otro soporte planar, para destacar mediante tinción selectiva la presencia de las proteínas de interés.

Por tanto, las muestras de IHC puede incluir, por ejemplo: (a) proteínas que comprenden células del cúmulo, (b) dichas células fijadas y embebidas y (c) la detección de proteínas de interés en dichas muestras de células. En algunas realizaciones, un procedimiento de tinción de IHC puede comprender etapas tales como: cortar y recortar tejido, fijación, deshidratación, infiltración de parafina, corte en secciones finas, montaje en portaobjetos de vidrio, cocción, desparafinado, rehidratación, recuperación de antígenos, etapas de bloqueo, aplicar anticuerpos primarios, lavado, aplicar anticuerpos secundarios (opcionalmente acoplados a un marcador detectable adecuado), lavado, tinción de contraste y examen microscópico.

La invención se refiere también al uso de un kit para realizar los métodos descritos anteriormente, en donde dicho kit comprende medios para medir el nivel de expresión de los genes de la Tabla A y opcionalmente el nivel de expresión de los genes de la Tabla B.

La presente divulgación se refiere también a una célula de cúmulo que se ha determinado como una célula de cúmulo madura mediante el método de la presente invención. Por consiguiente, dicha célula de cúmulo sobreexpresa al menos un gen de la Tabla A y preferentemente no expresa un gen de la Tabla B y aún más preferentemente, sobreexpresa todos los genes de la Tabla A.

La presente divulgación se refiere también a una población de células del cúmulo que comprende al menos un 70 % de las células del cúmulo maduras determinadas mediante el método de la presente invención.

Por consiguiente, al menos un 70 % de las células del cúmulo de tal población sobreexpresa al menos un gen de la Tabla A y preferentemente no expresa un gen de la Tabla B y aún más preferentemente, sobreexpresa todos los genes de la Tabla A.

Normalmente, la población de células del cúmulo de la divulgación puede comprender un 70 %, un 80 %, un 90 %, un 95 % o un 99 % de las células del cúmulo maduras.

En una realización particular, la presente divulgación se refiere a una célula de cúmulo madura inmortalizada o a una población de células del cúmulo de la divulgación. Los métodos para inmortalizar células son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la inmortalización de células del cúmulo humanas puede realizarse a través de la transducción lentivírica de hTERT y del antígeno T grande del SV40 en un cultivo primario de células del cúmulo humanas (Jiang et al., 2010; Liu et al., 2010; Voglauer et al., 2005).

En una realización particular, la presente divulgación se refiere a una línea de células del cúmulo maduras.

Las células del cúmulo maduras ("CCM") pueden ser útiles en los métodos para cultivar embriones. La idea es que estas células estimulen el desarrollo de embriones tempranos mediante la adición de factores de crecimiento o algún otro efecto beneficioso. Por tanto, el uso de CCM en un programa de FIV, es el de cultivar embriones hasta la etapa de blastocisto y a continuación, realizar la transferencia de blastocisto el día 5 o el día 6. Esto permite el aumento de la tasa de blastulación y la selección del mejor embrión que será capaz de sobrevivir a través de las etapas de escisión tempranas de la primera semana de desarrollo. Generalmente es muy difícil conseguir buenas cifras de blastocistos de alta calidad cuando se cultivan en medios de cultivo simples. Por consiguiente, la presente invención se refiere a un método para el cocultivo in vitro de un embrión humano en células del cúmulo maduras (CCM).

Por consiguiente, un aspecto adicional de la presente invención se refiere al uso de una población de células del cúmulo humanas en un método de fecundación in vitro. De acuerdo con este aspecto, un embrión se cultiva hasta una etapa de desarrollo de blastocisto mediante el cocultivo de dicho embrión en presencia de una población de células del cúmulo, que se ha identificado como que es madura mediante el método de acuerdo con la invención.

El embrión se cultiva hasta una etapa de blastocisto antes de la implantación.

En una realización particular, las células del cúmulo maduras se derivan de una línea de células del cúmulo maduras.

Normalmente, el embrión puede ser el resultado de un ovocito que estuvo rodeado o no por células del cúmulo maduras. El método puede implementarse por tanto con cualquier fuente de ovocitos.

La presente invención se refiere también a un método de acuerdo con la presente invención en donde dicho embrión se generó in vitro mediante cualquiera de las técnicas seleccionadas del grupo que consiste en la fecundación in vitro (FIV), incluyendo la FIV realizada mediante mezcla simple de ovocito y esperma o mediante la inyección intracitoplasmática de esperma en un ovocito.

En una realización preferida el embrión se cultiva en una superficie de cultivo celular revestida con una capa de células del cúmulo maduras de acuerdo con la invención.

La expresión "superficie de cultivo celular" o "matriz de cultivo celular" se refiere a cada tipo de superficie o matriz adecuada para el cultivo celular. La expresión "superficie de cultivo celular" incluye pero no se limita a una placa, plato, pocillo o botella de cultivo tisular. En una realización particular, la superficie de cultivo es una superficie de plástico de la placa, plato, pocillo o botella de cultivo. La superficie de cultivo celular debe ser compatible con el revestimiento de células del cúmulo maduras. De acuerdo con una realización de la invención, la superficie de cultivo celular se selecciona de manera que las células del cúmulo maduras puedan adherirse de forma natural sobre ella. Pueden seleccionarse diversos materiales de superficie de cultivo celular. Entre los ejemplos de tales materiales se incluyen, pero sin limitación, placas de cultivo tisular o placas revestidas con colágeno.

Normalmente, para obtener una capa de células del cúmulo maduras sobre una superficie de cultivo celular, las células del cúmulo maduras primero se revisten sobre la superficie de cultivo celular con un medio de cultivo que contiene colágeno. Dejando el tiempo suficiente para permitir la adhesión de las células del cúmulo maduras sobre la superficie de cultivo celular, el medio de cultivo que contiene colágeno se elimina y se reemplaza por un medio que permite la expansión de dicha célula de cúmulo madura.

La presente invención se refiere también a un método de acuerdo con la invención en donde las células del cúmulo maduras se tratan previamente para detener su proliferación antes de estar en contacto con el embrión. Por tanto, las células del cúmulo maduras se inactivan mediante irradiación gamma o con un agente de bloqueo del ciclo celular.

De acuerdo con la presente invención, las condiciones de cultivo también son importantes para cultivar el embrión hasta una etapa de desarrollo de blastocisto. Durante el cultivo, variables tales como temperatura y niveles de CO2 pueden controlarse para maximizar el crecimiento del embrión. Por ejemplo, la temperatura óptima para el desarrollo de un embrión es de aproximadamente 32 °C y aproximadamente 40 °C, preferentemente de aproximadamente 35 °C y 39 °C, con una temperatura de 37 °C siendo incluso más preferida. Los niveles óptimos de CO2 en el entorno de cultivo para el desarrollo de un embrión es de aproximadamente CO2 al 1 % a aproximadamente CO2 al 10 %, más preferentemente de aproximadamente CO2 al 3 % a aproximadamente CO2 al 8 % e incluso más preferentemente aproximadamente CO2 al 5 %.

Los medios adecuados para cultivar embriones son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los medios de cultivo que están ahora disponibles permiten progresar a blastocistos en tasas comparables con las que se producen dentro del útero (Summers y Biggers, 2003), aumentando la esperanza de que tales embriones no tendrán las marcas epigenéticas introducidas como un resultado del estrés del cultivo in vitro. Muchos de estos medios se basan vagamente en las concentraciones de iones, aminoácidos y azúcares encontrados en el tracto reproductivo de la hembra en el momento de la liberación del huevo, fecundación y desarrollo (Gardner y Lane, 1998). Normalmente, los medios de cultivo que contienen un tampón de fosfato o un tampón orgánico Hepes se utilizan para procedimientos que implican la manipulación de gametos fuera de la incubadora, lavado de folículos y micromanipulación. La mayoría de medios de cultivo utilizan un sistema tamponante de bicarbonato/CO2 para mantener el pH en el intervalo de 7,2­ 7,4. La osmolaridad del medio de cultivo debe estar en el intervalo de 275-290 mOsmol/kg. Los embriones podrían cultivarse también en aceite de parafina, que evita la evaporación del medio conservando una osmolaridad constante. El aceite también minimiza las fluctuaciones de pH y de temperatura cuando los embriones se sacan de la incubadora para la evaluación microscópica. El aceite de parafina puede ser tóxico para los gametos y embriones; por tanto, los lotes de aceite deben controlarse y ensayarse en embriones de ratón antes de utilizarse en el cultivo de embriones humanos.

El medio se compone de un 99 % de agua. La pureza del agua es crucial y se logra mediante ultrafiltración.

El medio de cultivo también contiene una fuente de proteínas, tales como albúmina o suero sintético que se añade en concentraciones de un 5 a un 20 % (p/v o v/v, respectivamente). Se añade también al medio una fuente de sal, tal como NaCI, KCl, KH2PO4, CaCh2H2O, MgSO47H2O o NaHCO3. El medio de cultivo también contiene una fuente de carbohidratos, dado que los carbohidratos están presentes en el tracto reproductivo femenino. Junto con los aminoácidos, son la fuente de energía principal para el embrión. Los medios de cultivo que mantienen el desarrollo de los zigotos de hasta 8 células contienen piruvato y lactato. Algunos medios comerciales son sin glucosa, mientras que otros añaden una concentración muy baja de glucosa para suministrar las necesidades del esperma durante la inseminación convencional. Los medios que mantienen el desarrollo de embriones de 8 células hasta la etapa de blastocisto contienen piruvato y lactato en concentraciones bajas y una concentración alta de glucosa. El complemento del medio de cultivo con aminoácidos también es necesario para el desarrollo embrionario. Los medios que mantienen el desarrollo de zigotos de hasta 8 células se complementan con aminoácidos no esenciales, tales como prolina, serina, alanina, asparagina, aspartato, glicina y glutamato. Los medios que mantienen el desarrollo de embriones de 8 células hasta la etapa de blastocisto se complementan con aminoácidos esenciales, tales como cistina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, valina, argentine, glutamina, fenilalanina, treonina, triptófano. El medio de cultivo puede contener también vitaminas.

El medio de cultivo puede contener también antibióticos. La mayoría de laboratorios de TRA (en inglés, ART) utilizan, de hecho, medios que contienen antibióticos para minimizar los riesgos del crecimiento microbiano. Los antibióticos usados más habitualmente son la penicilina (p-lactámico, la bacteria Gram positiva altera la integridad de la pared celular) y estreptomicina (aminoglucósido, la bacteria Gram negativa altera la síntesis de proteínas).

Tres ejemplos de medios secuenciales para el desarrollo embrionario son: G1/G2 (Gardner et al., 1998), Universal IVF Medium/MS y PI/Blastocyst Medium. Cabe destacar que, el medium M3 es una modificación de F-10 y F-12 de Ham, si bien el Blastocyst Medium es una modificación del F-10 de Ham). Los medios para cultivar embriones se comercializan por Origio (Dinamarca), Vitrolife (Suecia), Sage Biopharma (Estados Unidos), Irvine Scientific (Estados Unidos).

También se proporciona de acuerdo con determinadas realizaciones de la presente divulgación un método para aumentar el potencial de implantación in vivo de un embrión de fecundación in vitro. El "potencial de implantación" es la capacidad de los embriones para implantarse en el útero. Este método incluye llevar a cabo una de las realizaciones descritas anteriormente para cultivar un embrión hasta una etapa de desarrollo de blastocisto, de modo que se logra una incubación completa del embrión en el cultivo o se mejora la incubación, en comparación con otros métodos de FIV. De acuerdo con determinadas realizaciones de este método, a continuación, el blastocisto se introduce en el útero de una hospedadora de mamífero, de modo que se logra una implantación mejorada del embrión. En algunas realizaciones, la incubación completa del embrión in vitro se correlaciona con el establecimiento de un embarazo viable.

En algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método para aumentar el potencial de nacimiento vivo de un embrión de mamífero fecundado in vitro. El "potencial de nacimiento vivo" se refiere a la capacidad de un embrión para producir un nacimiento vivo. El método comprende cultivar un embrión hasta una etapa de desarrollo de blastocisto, como se ha descrito anteriormente, de modo que se logra un potencial de incubación mejorado o una incubación completa de los embriones en cultivo. A continuación, el blastocisto se transfiere al útero de una hospedadora de mamífero; y se permite que el embrión se implante y crezca in vivo, de modo que la capacidad del embrión para producir un nacimiento vivo se mejora respecto a un embrión que no se cultiva de acuerdo con la invención.

El método de la invención es también particularmente adecuado para limitar los embarazos múltiples, porque puede proporcionar una tasa de implantación mayor, como se ha descrito anteriormente y por tanto, pueden transferirse menos embriones en cada ciclo, lo que da como resultado una menor incidencia de gestaciones múltiples.

Un aspecto adicional de la divulgación se refiere a un método para mantener el estado indiferenciado en el cultivo de una población de células madre pluripotentes que comprende la etapa de cocultivar dicha población de células madre pluripotentes en presencia de una población de células del cúmulo maduras, de acuerdo con la invención.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "célula madre pluripotente humana" se refiere a cualquier célula precursora humana que tiene la capacidad para formar cualquier célula adulta. En una realización particular, las células madre pluripotentes humanas incluyen aunque no de forma limitativa células madre embrionarias (células ESh) o células madre pluripotentes inducidas humanas (células PSi humanas).

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "células madre embrionarias humanas" o "células ESh" o "ESCh" se refiere a células precursoras humanas que tienen la capacidad de formar cualquier célula adulta. Las células ESh pueden derivarse de embriones fecundados que tienen menos de una semana de edad. Las células ESh de acuerdo con la presente divulgación no se obtienen mediante un método que implique la destrucción de embriones humanos. De acuerdo con la divulgación, las células ESh no se cultivan previamente en presencia de LIF como se describe en la solicitud de patente internacional WO2002/097068. Además, de acuerdo con la divulgación debe entenderse que las células ESh no están diferenciadas previamente en cuerpos embrioides.

Como se utiliza en el presente documento, la expresión "células madre pluripotentes inducidas humanas" o "células PSi humanas " o "PSCi humanas" se refiere a un tipo de células madre pluripotentes humanas derivadas artificialmente de una célula no pluripotente humana (por ejemplo, una célula somática adulta). Las células madre pluripotentes inducidas humanas son idénticas a las células madre embrionarias humanas en la capacidad de formar cualquier célula adulta, pero no se derivan de un embrión. Normalmente, una célula madre pluripotente inducida humana puede obtenerse a través de la expresión inducida los genes Oct3/4, Sox2, Klf4 y c-Myc en cualquier célula somática adulta (por ejemplo, fibroblasto). Por ejemplo, las células madre pluripotentes inducidas pueden obtenerse de acuerdo con el protocolo como se describe por Takahashi et al. (2007), por Yu et al. (2007) o por cualquier otro protocolo en el que uno o los otros agentes utilizados para reprogramar células en estos protocolos originales se reemplazan por cualquier gen o proteína que actúa sobre o se transfiere a las células somáticas en el origen de las líneas PSi.

La divulgación se refiere a un método para mantener el estado indiferenciado en el cultivo de una población de células madre pluripotentes, comprendiendo dicho método una etapa de cultivo de dicha población de células madre pluripotentes en una superficie de cultivo celular revestida con una capa de células del cúmulo maduras.

Dicha capa de células del cúmulo maduras puede obtenerse como se describe para el método de cultivo de un embrión hasta una etapa de desarrollo de blastocisto (véase lo citado anteriormente).

Las condiciones de cultivo son importantes también en el manteniendo del estado indiferenciado en el cultivo de una población de células madre pluripotentes. Durante el cultivo, las variables tales como la densidad celular, temperatura y niveles de CO2 pueden controlarse para maximizar el desarrollo de poblaciones de células madre pluripotentes. Por ejemplo, la densidad de células en un cultivo de células madre pluripotentes puede afectar a la diferenciación espontánea de dicha población. Como tal, la densidad de células óptima para el crecimiento de una población de células madre pluripotentes es de aproximadamente 1 célula madre pluripotente a aproximadamente 10.000 células madre pluripotentes por cm2, más preferentemente de aproximadamente 1 célula madre pluripotente a aproximadamente 2000 células madre pluripotentes por cm2 e incluso más preferentemente de aproximadamente 100 a aproximadamente 1000 células madre pluripotentes por cm2. En una realización, las células madre pluripotentes se cultivan como una suspensión de células individuales. La temperatura óptima para el desarrollo de una población de células madre pluripotentes es de aproximadamente 32 °C y aproximadamente 40 °C, preferentemente de aproximadamente 35 °C y 39 °C, con una temperatura de 37 °C siendo incluso más preferida. Los niveles óptimos de CO2 en el entorno de cultivo para el desarrollo de poblaciones de células madre pluripotentes es de aproximadamente CO2 al 1 % a aproximadamente CO2 al 10 %, más preferentemente de aproximadamente CO2 al 3 % a aproximadamente CO2 al 8 % e incluso más preferentemente aproximadamente CO2 al 5 %.

Los medios adecuados para cultivar células madre pluripotentes incluyen los medios de Eagle modificados por Dulbecco (Invitrogen, Carlsbad, California). El técnico experto apreciará que está disponible una amplia gama de medios adecuados para cultivar células madre pluripotentes in vitro, por ejemplo, Specialty Media (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts); ResgroTM (Millipore Corporation, Billerica, Massachusetts); StemXvivo (R&D Systems, Mineápolis, Minnesota). Los medios pueden complementarse con suero, por ejemplo, suero fetal bovino, ES qualified serum (Invitrogen, Carlsbad, California), antibióticos, por ejemplo, Pen Strep (Invitrogen, Carlsbad, California), aminoácidos no esenciales (Invitrogen, Carlsbad, California) y glutamina, por ejemplo, Glutamax-1® (Invitrogen, Carlsbad, California). Algunos cultivos de ESC pueden complementarse adicionalmente con factor inhibidor de la leucemia (LIF), por ejemplo, Esgro® (Millipore Corporation, Billerida, Massachusetts).

La invención se ilustrará adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos. Sin embargo, estos ejemplos y figuras no deben interpretarse de ninguna manera como limitantes del alcance de la presente invención.

Figuras:

Figura 1: Confirmación de RT-PCR cuantitativa de los datos de micromatrices. Cuantificación de los genes que se expresaron diferencialmente en las CC derivadas de ovocitos en diferentes etapas de maduración nuclear. La intensidad de la señal para cada gen se muestra en el eje y en unidades arbitrarias determinadas mediante el análisis de RT-qPCR. Indica una diferencia significativa de la expresión génica entre los grupos de CC (**p < 0,01, *p < 0,05). Los resultados se presentaron como la media ± ETM de los niveles de ARNm en cada grupo de Cc .

EJEMPLO 1: UNA PRUEBA NO INVASIVA PARA LA PREDICCIÓN DE LA TASA DE BLASTULACIÓN MEDIANTE EL PERFIL DE EXPRESIÓN GÉNICA DE CÉLULAS DEL CÚMULO MADURAS E INMADURAS.

Métodos:

Procesamiento de células del cúmulo:

Los pacientes respondedores normales (edad<36) referidos al centro de los presentes inventores para la inyección de esperma intracitoplasmático (ICSI) se incluyeron en este estudio. Los pacientes se incluyeron después de un consentimiento informado por escrito y el proyecto se aprobó por el comité ético de investigación clínica (CEIC; en inglés, IRB). Los pacientes se estimularon con una combinación de protocolos de agonistas o antagonistas de GnRH con FSH o HP hMG recombinante. Las COC se recuperaron bajo ecoguía de ultrasonido 36h después de la administración de gonadotrofina coriónica humana (CGh, 5000 IU). Las CC se separaron mecánicamente del ovocito correspondiente como se ha descrito anteriormente (Hamel et al., 2008). Se seleccionó(aron) aleatoriamente una a 3 muestras de CC por paciente de la misma cohorte de CC. Se utilizaron en este estudio un total de 111 muestras de CC obtenidas de 40 pacientes.

Para los análisis de micromatrices, se dividieron 24 muestras individuales de CC obtenidas de 16 pacientes en tres grupos distintos de acuerdo con la etapa de maduración nuclear del ovocito: muestras derivadas de COC (i) en etapa de vesícula germinal (CC^vg), (ii) etapa de metafase I (CC^mi) y (iii) etapa de metafase II (CC^mii). Se investigó el perfil de expresión génica diferencial en los tres grupos de CC. Para la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR), se utilizaron 24 muestras de CC (8 muestras para cada etapa de maduración nuclear) obtenidas de 19 pacientes. Para ensayar la fiabilidad de los genes candidatos, se analizaron 63 muestras de CC derivadas de ovocitos maduros (MII) y obtenidas de 5 pacientes mediante micromatrices.

Preparación de ARN complementario e hibridación de micromatrices:

El ARN total de las muestras de CC se extrajo usando el kit RNeasy Micro Kit RNeasy (Qiagen). El ARN se cuantificó utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, Delaware, Estados Unidos). La integridad y calidad del ARN se evaluaron en un Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, California, Estados Unidos). Las muestras de ARN se almacenaron a -80 °C hasta el análisis de micromatrices. El protocolo de Affymetrix 3' IVT express (ref. 901229) se utilizó para preparar ARNc (amplificación de un ciclo) con una concentración inicial de 100 ng de ARN total. El ADN de primera cadena se sintetizó utilizando un cebador de oligo dT que incorpora una secuencia promotora T7. A continuación, el ADNc se amplificó mediante transcripción in vitro (IVT; del inglés, in vitro transcription) con ARN polimerasa T7. Durante la amplificación de ARN (ARNa) se incorporó un análogo nucleotídico biotinilado para utilizarse como un marcador para el mensaje. Tras la fragmentación, el ARNa antisentido marcado se hibridó con matrices de HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix™) como se ha descrito anteriormente (Tusher et al., 2001).

Procesamiento de datos:

Las imágenes escaneadas de GeneChip se procesaron utilizando el software GCOS 1.4 de Affymetrix. Los datos de micromatrices se analizaron utilizando el software Expression Console™ de Affymetrix y la normalización se realizó usando el algoritmo MAS5.0 para obtener la intensidad de la señal y la interpretación de detección (presente, marginal o ausente) para cada conjunto de sondas. Este algoritmo determina si un gen se expresa con un nivel de confianza definido o no ("interpretación de detección"; en inglés, "detection call"). Esta "interpretación" puede ser "presente" (cuando las sondas de coincidencia perfecta están significativamente más hibridadas que las sondas no coincidentes, FDR < 0,04), "marginal" (para FDR > 0,04 y < 0,06) o "ausente" (FDR > 0,06). FDR, tasa de descubrimiento falso (del inglés, false discovery rate).

Análisis de datos de micromatrices:

Para comparar el perfil de expresión génica de las 24 muestras de CC de acuerdo con la etapa de maduración del ovocito, los presentes inventores filtraron las muestras basándose en la "interpretación de detección" (es decir, ausente/presente). Los conjuntos de sondas se utilizaron cuando estuvieron presentes en al menos 7 muestras de 24. Se aplicó también un segundo filtro que utiliza el coeficiente de variación (40 %) entre todas las muestras. El coeficiente de variación es la proporción, expresada en porcentaje, entre la desviación típica (DT) y la media de la intensidad de la señal de cada conjunto de sondas. Para comparar el perfil de expresión génica de las 24 muestras de CC de acuerdo con la etapa de maduración del ovocito, los presentes inventores filtraron las muestras basándose en la "interpretación de detección" (es decir, ausente/presente). Los conjuntos de sondas se utilizaron cuando estuvieron presentes en al menos 7 muestras de 24. Se aplicó también un segundo filtro que utiliza el coeficiente de variación (40 %) entre todas las muestras. El coeficiente de variación es la proporción, expresada en porcentaje, entre la desviación típica (DT) y la media de la intensidad de la señal de cada conjunto de sondas. Para grupos de CC en diferentes etapas de maduración nuclear del ovocito, se realizó un análisis de significación de micromatrices multiclase (Significance Analysis of Microarrays-Multi-class) (SAM-M) (Eisen et al., 1998). Este algoritmo proporciona los valores de puntuación y un porcentaje de confianza de una tasa de descubrimiento falso (FDR) basados en la permutación de datos. SAM-M permitió la identificación de genes cuya expresión varió significativamente entre los grupos de CC^vg, CC^mi y CC^mii.

Los resultados de SAM-M se utilizaron para realizar un agrupamiento jerárquico supervisado, basado en el nivel de expresión de los conjuntos de sondas (conjunto de genes multiclase) y el agrupamiento se visualizó utilizando el software Tree View (Adriaenssens et al., 2009). El sistema de Ingenuity Pathways Analysis (IPA) (Ingenuity Systems, Redwood City, California, Estados Unidos) se utilizó para identificar redes relacionadas con los 25 genes que se expresaron diferencialmente entre los grupos de CC.

Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR):

Los presentes inventores realizaron RT-qPCR para validar la expresión de los genes candidatos utilizando el Superscript First Strand Synthesis System (Invitrogen) de acuerdo con la recomendación del fabricante. Se utilizó una cohorte independiente de muestras de CC para la validación. Se generó ADNc de primera cadena empezando desde 300 ng de ARN total de cada muestra (dilución 1:10) y se utilizó para evaluar la expresión génica mediante qPCR en placas de 384 pocillos en un Light Cycler 480 (Roche). Cada pocillo contuvo un total de 8pl de mezcla de Master SYBR green (Roche) y 2pl de ADN diluido con una concentración final de 1,625 pM de cada cebador (Sigma). Para examinar la reproducibilidad, cada reacción de RT-qPCR se llevó a cabo por duplicado y se usó agua como control negativo. La amplificación fue una ejecución de 45 ciclos con una temperatura de hibridación de 60 °C. Los productos de PCR se controlaron con la sonda de SYBR green. Los detalles de los cebadores utilizados se notifican en la Tabla complementaria 1. Para normalizar el nivel de expresión entre las muestras, los presentes inventores utilizaron gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), debido a que su expresión fue estable en los tres grupos de CC. La eficacia de la PCR se evaluó utilizando diluciones seriadas de una escala convencional de ADNc. El valor del número de ciclos ("Ct" para el umbral de ciclos) se utilizó para calcular la cantidad relativa de transcritos de ARNm. Los presentes inventores utilizaron la siguiente fórmula para analizar los datos de qRT-PCR: Eensayado cebadorñCt /EGAPDHñCt (E =i0-1/pendiente), en donde ACt = Ct Control-Ct desconocido y control= una muestra de CC. Como control interno de los tres grupos se eligió una muestra de CC^vg.

Análisis estadístico:

Los datos obtenidos mediante RT-qPCR se analizaron con el software GraphPad Instat (http://www.graphpad.com/instat/instat.htm) y la prueba no paramétrica de Kruskal-Wallis. La diferencia entre los tres grupos se consideró significativa cuando el valor p fue <0,05.

Resultados

Identificación de conjuntos de genes sobreexpresados en CC de acuerdo con cada etapa de madurez nuclear del ovocito:

Utilizando SAM-M, los presentes inventores identificaron un total de 25 genes (conjunto de genes multiclase) con una FDR < 3,30 que distinguió significativamente los tres grupos. Estos 25 genes se sobreexpresaron diferencialmente de acuerdo con la etapa de madurez nuclear del ovocito asociado. De manera más precisa, se sobreexpresaron 10, 4 y 11 genes específicamente en los grupos de CC^vg, CC^mi y CC^mii respectivamente (Tabla I). El número de tenes que son específicos para un grupo dado de CC indica que existe una variación significativa entre los tres grupos de Cc , como se demuestra también por el agrupamiento jerárquico supervisado que muestra una segregación clara de las muestras de CC basándose en esta lista de 25 genes.

Tabla I: enes es ecíficamente sobreex resados en los ru os de CC^v CC^mi CC^mii

continuación

Se sobreexpresaron diez genes en el grupo de CC^vg: un receptor de prostaglandina (PTGER2), un receptor acoplado de proteína G (F2RL1), una proteína de unión estructural (RAI14), dos componentes nucleares (CBX3 y QKI), genes implicados en adhesión (THBS1, LIMS1), interacción proteína-proteína (ANKRD57) o asociados con la biosíntesis de heparán sulfato, un miembro de la familia TET (TET3) y EXT1. Se encontró que se sobreexpresaron cuatro genes en el grupo de CC^mi: un transportador de aminoácidos (SLC38A2) un transductor de señales (YTHDF1) que contiene un dominio rico en Alu, un activador de sulfatasa (SUMF1) y un factor de elongación (EEF1A1). En las muestras de CC^mii, los presentes inventores encontraron 11 genes sobreexpresados: cuatro factores de transcripción (ID2, CHCHD1, UBR3, BRD3), dos genes implicados en la regulación de la transcripción (C14orf4 y AOC2), así como PLEKHA5, PTGES y COX17 (implicados en la biosíntesis de prostaglandina), PWWP2A y C5orf25.

Los 25 genes se cribaron mediante RT-PCR utilizando una cohorte independiente de muestras de CC para validar fuertemente los resultados de micromatrices. Se validaron estadísticamente quince genes como diferencialmente expresados en los tres grupos (Figura 1A, 1B y 1C).

Los ovocitos MII maduros tienen patrones de expresión distintos en sus CC circundantes:

El análisis de micromatrices se realizó en una cohorte independiente de 63 muestras de CC de ovocitos MII maduros obtenidos de 5 pacientes para medir la abundancia relativa de los transcritos de genes de interés en CC. Al comprobar el perfil de expresión de los 15 genes de CC validados (Figura 1A, 1B y 1C) utilizando el agrupamiento jerárquico sin supervisión, los presentes inventores encontraron que un 31, un 24 y un 45 % de los ovocitos maduros fecundados expresan firmas moleculares de CC^vg, CC^mi y CC^mii respectivamente.

Este resultado demostró que un ovocito MII maduro puede estar rodeado de CC que se corresponden a etapas de CC^vg o CC^mi o CC^mii respectivamente. De hecho, los ovocitos MII maduros pueden estar rodeados de patrones de expresión distintos. Aunque la noción de maduración sincronizada durante la foliculogénesis entre el ovocito y las CC está bien documentada en modelos animales, no se ha demostrado claramente todavía en seres humanos (Russell y Robker, 2007). En el presente estudio, los presentes inventores observaron que menos de un 50 % de ovocitos maduros estuvieron rodeados de CC^mii.

Ovocitos maduros rodeados de CC "maduras" o "inmaduras":

Entre las 63 muestras de CC derivadas de ovocitos maduros (MII), 53 se fecundaron y se incluyeron para evaluar el resultado del embrión. Con el fin de ensayar la fiabilidad de la lista de 15 genes validados, los presentes inventores evaluaron la tasa de fecundación, escisión del embrión el día 3 y la tasa de formación de blastocistos. Se generaron dos grupos de acuerdo con la firma molecular específica de CC^mii o las firmas moleculares de CC^vg y CC^mi. Los grupos I y II se denominan firmas de "CC^mii" y de "CC^vg-^mi", respectivamente. La comparación entre los 2 grupos no reveló una diferencia significativa en la tasa de fecundación y la escisión del embrión el día 3 (Tabla II). Cabe destacar que, la prueba t reveló una diferencia significativa (p=0,04) para la formación de blastocistos entre el grupo I y el grupo II. La tasa de formación de blastocistos fue mayor (70,8 %) en el grupo I en comparación con el grupo II (17,2 %). Por tanto, los ovocitos maduros tuvieron CC maduras con una expresión génica madura aumentada (CC^mii) y CC inmaduras con una expresión génica inmadura aumentada (CC^vg-^mi).

Estos resultados proporcionan la validación del nuevo modelo de los presentes inventores de acuerdo con el cual un ovocito maduro puede estar rodeado de células del cúmulo maduras o inmaduras. En una perspectiva clínica, los presentes inventores sugieren que el cribado de CC en la etapa de ovocito maduro, utilizando una micromatriz o q-RT-PCR o inmunofluorescencia, es probable que sea una herramienta exacta para detectar CC maduras y puede asistir en la identificación del potencial de los embriones durante los ciclos de FIV (preferentemente transfiriendo embriones obtenidos de ovocitos maduros con CC maduras).

EJEMPLO 2: AISLAMIENTO DE CELULAS DEL CUMULO HUMANAS:

Las células del cúmulo se obtienen de pacientes consecutivos con su consentimiento informado. Después del examen de la apariencia de la masa de cúmulo, las células del cúmulo humanas (CCh) se separan mecánicamente del ovocito utilizando dos agujas. Una aguja se situó en la capa de CCh para mantener el ovocito en su lugar y la otra aguja, se utiliza para retirar rápidamente lo máximo posible de la capa de células, sin tocar el ovocito. Aspirar la célula con tan poco medio como sea posible y transferir estas células al medio preparado.

EJEMPLO 3: CULTIVO Y AMPLIFICACIÓN DE CÉLULAS DEL CÚMULO MADURAS HUMANAS (CCMH):

En un experimento inicial, las CCMh se cultivan en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero fetal bovino (FCS) al 10 % y 10ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF) y con placas revestidas de gelatina (0,1 %). Utilizando este protocolo de cultivo, las CCMh se adhieren a la superficie en 4 h después de la inoculación. El medio se reemplaza tres veces a la semana hasta que la confluencia alcanza un 80 %. Las células se pasan cada 5-7 días enzimáticamente con tripsina/EDTA al 0,25 %. La línea de CCM se adapta al crecimiento en esta condición (>12 pases).

El suero (FCS) es una sustancia indefinida con múltiples factores que podrían influir en la función celular y la dependencia de productos animales limita la aplicación clínica. Por esta razón, los protocolos de cultivo se optimizan para el cultivo a largo plazo de CCMh en una condición sin componentes animales. Los presentes inventores revistieron placas de cultivo con medio HP01 que contiene colágeno humano I-III a 10|jg/cm2 durante dos horas. Los presentes inventores eliminaron cuidadosamente la solución de adhesión y la reemplazaron por medio de expansión SPE-IV definido (albúmina humana de grado clínico, portador de hierro sintético, rh-insulina, nucleósidos, L-glutamina, -monotioglicerol, lípidos sintéticos, alfa-MEM). Este medio de cultivo contiene factores de crecimiento (rhIGF-I: 25ng/ml y rh-b-FGF: 0,33ng/ml). La concentración de células se fija en 1,000 células/cm2. Los presentes inventores cambiaron completamente el medio cuatro veces a la semana hasta que la confluencia alcanzara un 70-80 %.

Los inventores han desarrollado y analizado una nueva línea de CCMh que contiene estabilidad cromosómica. Esta línea de CCMh está adaptada al crecimiento en un sustrato de colágeno humano en medio definido sin componentes animales (>10 pases). Este sistema de crecimiento reduce la exposición de CCMh a ingredientes animales, limitando de este modo el riesgo de contaminación patogénica.

EJEMPLO 4: PREPARACIÓN DE LA CAPA ALIMENTADORA DE CCM

Se cultivaron monocapas de CCMh (pase 5) hasta la confluencia y se trataron con 10 jg/m l de mitomicina C durante 2 h o mediante irradiación. Después de los tratamientos, las células se separaron con T ryple y se sembraron en placas de cultivo.

EJEMPLO 5: LAS CÉLULAS MADRE EMBRIONARIAS HUMANAS (ESCH) CRECIERON SOBRE LA CAPA ALIMENTADORA DE CCMH

La propagación y las características pluripotentes de una línea de células madre embrionarias humanas (ESCh) se estudian en cultivo prolongado en CCMh. Los presentes inventores notificaron que las ESCh cultivadas en CCMh fueron indistinguibles mediante criterios múltiples (morfología, marcadores de pluripotencia) a partir de ESCh cultivadas en una capa alimentadora de fibroblastos. Los presentes inventores mostraron que las ESCh cultivadas en CCh mantienen marcadores de pluripotencia, incluyendo las proteínas de superficie celular (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81). La morfología y las características moleculares de las células son similares, en comparación con las ESCh cultivadas en células alimentadoras de fibroblastos.

En conclusión, las CCMh mantienen el crecimiento de ESCh indiferenciadas. Las líneas de ESCh se adaptan fácilmente a estas alimentadoras y mantienen la morfología típica de los cultivos de ESCh indiferenciados. Las ESCh continúan expresando también marcadores pluripotentes, incluyendo TRA-1-60, SSEA3, SSEA-4, Tra-1-81 y CD24.

EJEMPLO 6: EL ANÁLISIS DE EXPRESIÓN GÉNICA GLOBAL VALIDA LAS CCMH PARA LA PROPAGACIÓN DE "EMBRIONES"

Los perfiles de expresión génica amplios del genoma de las células alimentadoras de HFF y de las CCMh expresan un 62 % de la similitud de expresión génica. Los coeficientes de correlación entre las dos muestras son elevados, con solo un número de genes pequeño que muestra una expresión diferencial estadísticamente significativa.

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Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar in vitro si una célula de cúmulo es madura, que comprende una etapa de medición, en dicha célula de cúmulo, del nivel de expresión de:

- al menos un gen seleccionado de la Tabla A

en donde dicho al menos un gen seleccionado de la Tabla A comprende C14orf4 y

en donde la sobreexpresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho método comprende adicionalmente una etapa de medición, en dicha célula de cúmulo, del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla B y en donde la sobreexpresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla B es indicativa de que dicha célula de cúmulo es una célula de cúmulo inmadura.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde se mide el nivel de expresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11 genes seleccionados de la Tabla A.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde se mide el nivel de expresión de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 genes seleccionados de la Tabla B.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde se mide el nivel de expresión de los 25 genes de la Tabla A y la Tabla B.

6. Uso de una población de células del cúmulo humanas en un método in vitro de cultivo de un embrión adecuado para la fecundación in vitro (FIV), en donde dicho método comprende las etapas de:

i) determinar si una célula de cúmulo es una célula de cúmulo madura mediante

- la medición, en dicha célula de cúmulo, del nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla A y opcionalmente al menos un gen seleccionado de la Tabla B, en donde dicho al menos un gen seleccionado de la Tabla A comprende C14orf4;

- la identificación de dicha célula de cúmulo como que es madura si sobreexpresa dicho al menos un gen seleccionado de la Tabla A o como que es inmadura si sobreexpresa al menos un gen seleccionado de la Tabla B;

ii) cultivar un embrión hasta la etapa de desarrollo de blastocisto mediante el cocultivo de dicho embrión en presencia de una población de células del cúmulo humanas identificadas como maduras en la etapa i).

7. Uso de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicho embrión se cultiva en una superficie de cultivo celular revestida con una capa de células del cúmulo maduras o una línea de células del cúmulo maduras.

8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 o 7 en donde las células del cúmulo maduras se tratan previamente para detener su proliferación antes de estar en contacto con el embrión.

9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 en donde dicho embrión se generó in vitro mediante la mezcla simple de ovocito y esperma o mediante inyección intracitoplasmática de esperma en un ovocito.

10. Uso de un kit para realizar el método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho kit comprende medios para medir el nivel de expresión de dicho al menos un gen seleccionado de la Tabla A y opcionalmente el nivel de expresión de al menos un gen seleccionado de la Tabla B.