JP6754932B2 - 幹細胞を検出するための方法及びキット - Google Patents
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Description
[1]細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
前記培養上清又は溶解物と、下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。
[2]前記抗体が、低硫酸化ケラタン硫酸に結合性を有する抗体である、[1]の方法。[3]前記抗体が、Gal−GlcNAc(6S)又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、[1]又は[2]の方法。
[4]前記抗体が、ハイブリドーマR−10G(寄託番号:FERM BP−11301)が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体である、[1]〜[3]のいずれかの方法。[5]前記細胞が、血清含有培地で培養された細胞である、[1]〜[4]のいずれかの方法。
[6]前記レクチンが、
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は
当該アミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、前記(式1)又は(式2)で表される糖鎖に結合性を有するタンパク質である、[1]〜[5]のいずれかの方法。
[7]前記培養上清又は溶解物と前記レクチンとを接触させて、該レクチンと前記培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンとから構成される第一の複合体を形成させる手順と、
第一の複合体と前記抗体とを接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと該抗体とから構成される第二の複合体を形成させる手順と、を含む、[1]〜[6]の方法。
[8]前記レクチンが不溶性担体に結合される、[7]の方法。
[9]細胞の培養上清又は溶解物に含まれる下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖を検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
前記培養上清又は溶解物と、前記糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンと前記糖鎖と前記抗体とを含んでなる複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。
[11]前記複合体の有無又は検出量に基づいて前記細胞の分化状態を判定する手順をさらに含む、[1]〜[9]のいずれかの方法。
又は下記(式2):
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。
下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、
ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を含むキット。
[14]前記抗体が、低硫酸化ケラタン硫酸に結合性を有する抗体である、[13]のキット。
[15]前記抗体が、Gal−GlcNAc(6S)又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、[13]又は[14]のキット。
[16]前記抗体が、ハイブリドーマR−10G(寄託番号:FERM BP−11301)が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体である、[13]〜[15]のいずれかのキット。
[17]前記レクチンが不溶性担体に結合されている、[13]〜[16]のいずれかのキット。
本発明に係る幹細胞の検出方法は、細胞の培養上清又は溶解物に含まれる下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖を検出することにより、幹細胞の検出を行うものである。
具体的には、前記培養上清又は溶解物と、前記糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を接触させて、前記レクチンと前記糖鎖と前記抗体とを含んでなる複合体を形成させる手順と、前記複合体を検出する手順と、により、幹細胞の検出を行う。
上記(式1)は、「Fucα1−2Galβ1−3GlcNAc」の糖鎖構造を表す。GlcNAcの4位の位置の水酸基は、単糖(好ましくはフコース)又は分岐した若しくは分岐していないオリゴ糖鎖(好ましくは2〜5の糖からなる糖鎖)で置換されていてもよい。また、当該糖鎖構造は、幹細胞表面では、膜構成成分として、GlcNAcの1位の位置で糖タンパク質、糖脂質及び糖類などの非還元末端に結合している糖鎖であるから、GlcNAcの1位の位置に、OH基、又は他の糖類、タンパク質、脂質、若しくはその他の分子の非還元末端が結合していてもよい。
(式1)又は(式2)で表される糖鎖に結合性を有するレクチンには、BC2LCNレクチン又はその改変体が好ましく用いられる。BC2LCNレクチンのアミノ酸配列を配列番号1に示す。レクチンには、配列番号1に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質に加えて、当該アミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、(式1)又は(式2)で表される糖鎖に結合性を有するタンパク質(BC2LCNレクチン改変体)も好ましく用いられる。さらに、これらのレクチンに加えて、(式1)及び/又は(式2)で表される糖鎖を認識するレクチンであれば特に限定されることなく用いられ得る。
ケラタン硫酸に結合性を有する抗体には、ハイブリドーマR−10G(寄託番号:FERM BP−11301)が産生するIgG抗体が好ましく用いられる。ハイブリドーマR−10Gが産生する抗体(以下、「R−10G抗体」とも称する)は、特許文献3に記載されている。R−10G抗体は、ヒトiPS細胞を免疫原として作製したハイブリドーマを、ヒトiPS細胞陽性かつヒト胎児性癌細胞陰性を指標としてスクリーニングして得られたモノクロナール抗体である。R−10G抗体のエピトープは、硫酸化度の低いケラタン硫酸であり(硫酸化度の高いケラタン硫酸には反応しない)、当該エピトープのポリペプチド部分は、ポドカリキシンであることが明らかにされている(非特許文献3参照)。また、非特許文献3によれば、R−10G抗体のエピトープには、「Gal−GlcNAc(6S)」又はそのタンデムリピートが含まれるとされている。R−10G抗体は、特許文献3に記載の方法に従って調製することもできるが、市販のもの(例えば、コスモ・バイオ株式会社、RIT−M001)を用いてもよい。
「幹細胞」は、一般に、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と、三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞と定義されている。本発明に係る検出方法が検出の対象とする幹細胞(多分化能幹細胞)は、自己再生能及び分化多能性を有する未分化細胞であって、少なくとも多能性幹細胞(pluripotent stem cell)及び複能性幹細胞(multipotent stem cell)を包含する。幹細胞としては、特に、胚性幹細胞(Embryonic stem cell:ES細胞)及び体細胞に初期化因子を導入して得られる誘導性多能性幹細胞(induced pluripotent cell:iPS細胞)等の多能性幹細胞が挙げられる。なお、複能性幹細胞は、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神経系幹細胞、骨髄幹細胞及び生殖幹細胞等の体性幹細胞等を含む。本発明において、単に「細胞」と記載する場合は、幹細胞と分化細胞(体細胞)の両方を含む意味で用いるものとする。
(式1)及び/又は(式2)で表される糖鎖構造は、未分化細胞の細胞表面及び培養上清中に特異的に存在することが明らかとなっているため(特許文献1,2参照)、本発明に係る幹細胞の検出方法において、幹細胞の検出のために用いられるサンプルは、細胞の溶解物であっても培養上清であってもよい。
本発明に係る幹細胞の検出方法の手順には、培養上清又は溶解物(以下「培養上清等」とも称する)とレクチンとケラタン硫酸に結合性を有する抗体とを接触させてレクチンとポドカリキシンと抗体とから構成される複合体を形成させる複合体形成手順と、複合体を検出する検出手順と、が含まれる。以下、rBC2LCNレクチン及びR−10G抗体を用いる場合を例に具体的に説明する。
(式1)及び(式2)で表される糖鎖構造は、未分化細胞の細胞表面及び培養上清中に特異的に存在することから、本発明に係る検出方法により、細胞の培養上清等に含まれるポドカリキシン上の当該糖鎖を検出することで、細胞中に存在する幹細胞の有無を検出することができる。また、当該糖鎖を定量的に検出すれば、細胞中の幹細胞の存在量を判定することもできる。
本発明に係る幹細胞の検出キットは、上記の幹細胞検出方法に用いられるものであって、下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ケラタン硫酸に結合性を有する抗体と、を含む。
また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。
本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を評価するため、iPS細胞の培養上清の希釈溶液を用いてポドカリキシンの定量的な測定を行った。測定は、マイクロプレートを用いたELISA検出系で行った。
(2)rABAレクチン:アミノ酸配列を配列番号2に示す(RCSB Protein Data Bank Accession No. 1Y2Vも参照)。
(3)抗SSEA3抗体:ラットモノクローナルIgM抗体(Millipore、MAB4303)。ヒトEC細胞(Tetracarcinoma stem cell)、ヒトEG細胞(Embryonic germ cell)及びヒトES細胞の表面に発現するSSEA3抗原(Stage-specific embryonic antigen 3)を認識する。
(4)抗SSEA4抗体:マウスモノクローナルIgG抗体(Millipore、MAB4304)。ヒトEC細胞、ヒトEG細胞及びヒトES細胞の表面に発現するSSEA4抗原(Stage-specific embryonic antigen 4)を認識する。
(5)抗Tra−1−60抗体:マウスモノクローナルIgM抗体(Millipore、MAB4360)。ポドカリキシン上のケラタン硫酸を認識する(非特許文献5,6参照)。
(6)抗Tra−1−81抗体:マウスモノクローナルIgM抗体(Millipore、MAB4381)。ポドカリキシン上のケラタン硫酸を認識する(非特許文献5,6参照)。
(7)抗ポドカリキシン抗体:ヤギポリクローナルIgG抗体(R&D System。AF1658)。ヒトポドカリキシンを認識する。
抗Tra−1−60抗体及び抗Tra−1−81抗体は、いずれもポドカリキシン上のケラタン硫酸をエピトープとする抗体であるが、「Galβ1−3GlcNAcβ1−3Galβ1−4GlcNAc」をエピトープに含むとされており(非特許文献7参照)、「Gal−GlcNAc(6S)」又はそのタンデムリピートをエピトープに含むとされるR−10G抗体とはエピトープが異なる。
抗Tra−1−60抗体及び抗Tra−1−81抗体は、高硫酸化ケラタン硫酸をエピトープとするとされており、低硫酸化ケラタン硫酸をエピトープとするR−10G抗体とはエピトープが異なる。
抗Tra−1−60抗体及び抗Tra−1−81抗体は、IgG抗体であるR−10G抗体とは異なり、IgM抗体である。
異なる種類の培地で培養したiPS細胞(201B7株)の培養上清の希釈溶液を用いてポドカリキシンの定量的な測定を行った。培地には以下の4種類を用いた。各培地でiPS細胞(201B7株)を24時間培養後、回収した培養上清をそれぞれの培地で希釈し、希釈溶液を得た。
StemSure hPSC培地Δ(和光純薬工業株式会社)
mTeSR1培地(STEMCELL Technologies)
MEF−CM(Mouse Embryonic Fibroblast−conditioned Medium、マウス胚性繊維芽細胞を培養した培養上清)
TeSR−E8培地(STEMCELL Technologies)
本発明に係るレクチン−抗体サンドイッチ法による幹細胞の検出方法を評価するため、iPS細胞の培養上清の希釈溶液を用いてポドカリキシンの定量的な測定を行った。測定は、スライドガラスを用いたアレイ検出系で行った。
配列番号2:ABAレクチンのアミノ酸配列
Claims (12)
- 細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
血清成分を含む、培養上清又は溶解物と、下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ハイブリドーマR−10G(寄託番号:FERM BP−11301)が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。 - 前記抗体が、Gal−GlcNAc(6S)又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記レクチンが、
配列番号1に示されるアミノ酸配列を含んでなるタンパク質、又は
当該アミノ酸配列の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、もしくは付加されたアミノ酸配列を含んでなり、前記(式1)又は(式2)で表される糖鎖に結合性を有するタンパク質である、請求項1又は2に記載の方法。 - 前記培養上清又は溶解物と前記レクチンとを接触させて、該レクチンと前記培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンとから構成される第一の複合体を形成させる手順と、
第一の複合体と前記抗体とを接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと該抗体とから構成される第二の複合体を形成させる手順と、を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。 - 前記レクチンが不溶性担体に結合される、請求項4記載の方法。
- 細胞の培養上清又は溶解物に含まれる下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖を検出することにより、幹細胞を検出する方法であって、
血清成分を含む、培養上清又は溶解物と、前記糖鎖に結合性を有するレクチンと、ハイブリドーマR−10G(寄託番号:FERM BP−11301)が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体と、を接触させて、前記レクチンと前記糖鎖と前記抗体とを含んでなる複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。 - 前記複合体の有無又は検出量に基づいて前記細胞に含まれる幹細胞の有無又は存在量を判定する手順をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複合体の有無又は検出量に基づいて前記細胞の分化状態を判定する手順をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出する方法であって、
血清成分を含む、培養上清又は溶解物と、下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ハイブリドーマR−10G(寄託番号:FERM BP−11301)が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体と、を接触させて、前記レクチンとポドカリキシンと前記抗体とから構成される複合体を形成させる手順と、
前記複合体を検出する手順と、を含む方法。 - 血清成分を含む、細胞の培養上清又は溶解物に含まれるポドカリキシンを検出することにより、幹細胞を検出するためのキットであって、
下記(式1):
又は下記(式2):
で表される糖鎖に結合性を有するレクチンと、ハイブリドーマR−10G(寄託番号:FERM BP−11301)が産生する抗体又は該抗体と競合する抗体と、を含むキット。 - 前記抗体が、Gal−GlcNAc(6S)又はそのタンデムリピートをエピトープに含む、請求項10に記載のキット。
- 前記レクチンが不溶性担体に結合されている、請求項10又は11に記載のキット。
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