CN116134314A - 胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤中的新型癌症生物标志物 - Google Patents

胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤中的新型癌症生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明明确了岩藻糖基化α1－酸性糖蛋白(fAGP)对胰腺癌和恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的诊断是有用的，结果发现了新的胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的生物标志物，特别是通过进行胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMN)中的良性肿瘤或恶性肿瘤的适当的术前诊断来提高恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的正确诊断率并辅助现有的图像诊断的、对IPMC的迅速诊断有用的新的生物标志物。

Description

胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤中的新型癌症生物标志物
技术领域
本发明涉及胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤中的新型癌症生物标志物。
背景技术
胰腺癌在日本显示出次于肺癌、胃癌、大肠癌的死亡数，早期发现困难且预后也差，因此虽然观察到许多癌症近年来死亡数的减少，但确认到胰腺癌中死亡率的增加倾向。因此，强烈期望开发新的治疗方法并且能够进行早期诊断的新型生物标志物。
另一方面，胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(以下也称为IPMN)是在胰腺中最常见的囊肿性肿瘤，是可能发生癌变的疾病。在IPMN中，已知从腺瘤(良性IPMN，以下也称为IPMA)向癌症(恶性IPMN，以下也称为IPMC)发展。随着检查方法的发展，虽然IPMN的诊断变得比较容易，但关于作为治疗的基本的病变切除仍存在问题。即，IPMN患者通常基于IPMN国际共识指南，根据各自的图像所见研究有无致癌风险来决定手术指征，但其中除了癌变的IPMC以外，有时还包括原本不是手术指征的IPMA，报告了其正确诊断率为64.3％(非专利文献1)。
而且，以往利用的、以胰腺癌为目标的血清的基于癌症标志物的术前诊断也因其阳性率低，难以应用于诊断。因此，还考虑到伴随胰腺切除的风险，在IPMN中的癌变的早期诊断和对提高IPMC的正确诊断率有用的新的生物标志物的确立是当务之急。
此外，α1－酸性糖蛋白(以下，也称为AGP)是炎症时血药浓度亢进的炎症标志物，但本发明人等目前为止阐明了与AGP分子的糖链相关的癌性变化，明确了岩藻糖基化AGP(以下，也称为fAGP)的量的变化不仅对癌症的恶性度是有用的，而且对癌症的预后预测、治疗效果的判定也是有用的(专利文献1、非专利文献2)。而且，本发明人等还明确了：在各种化学疗法实施例中，在复发/转移的早期检测、治疗效果判定中的应用的可能性(非专利文献3)；以及近年来划时代的提高治疗效果的免疫疗法在其效果判定中的应用的可能性(非专利文献4)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2019－11978号公报
非专利文献
非专利文献1：Dig.Dis.Sci.,63:860-867,2018
非专利文献2：Cancer,101:2825-2836,2004
非专利文献3：PLoS ONE,11(6)e0156277,2016
非专利文献4：Sci.Reports,doi.org:10.1038,2019
非专利文献5：BioMed.Res.Inter.,Vol 2013,Article ID 834790,2013
非专利文献6：Clinica Chimica Acta,478:120-128,2018
非专利文献7：Jpn.J.Cancer Res.(Gann),79:538-543,1988
非专利文献8：Cancer Res.,55:1473-1478,1995
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的技术问题在于提供新的胰腺癌或IPMC的生物标志物，特别是通过进行IPMN中的良性肿瘤或恶性肿瘤的适当的术前诊断来提高IPMC的正确诊断率并辅助现有的图像诊断的、对IPMC的迅速诊断有用的新的生物标志物。
用于解决问题的方案
本发明人等为了解决上述技术问题进行了深入研究，结果发现fAGP成为对胰腺癌或IPMC的诊断有用的生物标志物，从而完成了本发明。
即，本发明如下所述。
[1]一种用于胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的诊断的数据获取方法，其包括：测定样品中的岩藻糖基化α1－酸性糖蛋白(fAGP)的量。
[2]根据[1]所述的方法，其中，所述样品为血浆或血清。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，所述测定为测定α1－酸性糖蛋白(AGP)中的岩藻糖基糖链的量，所述测定包括以下工序：将样品中的AGP脱唾液酸化；以及使用固定于基材且糖链被脱岩藻糖基化的抗AGP抗体和对所述经脱唾液酸化的AGP的岩藻糖基进行识别的凝集素，利用酶免疫测定法(EIA法)测定岩藻糖基糖链的量。
[4]根据[3]所述的方法，其中，所述脱唾液酸化通过唾液酸酶处理来进行，所述脱岩藻糖基化通过过碘酸氧化来进行。
[5]根据[3]或[4]所述的方法，其中，所述凝集素为橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)。
[6]根据[3]～[5]中任一项所述的方法，其中，还包括以下工序：对所述样品中的AGP进行定量；以及以所述AGP量将所述岩藻糖基糖链的量标准化。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，所述诊断基于如下基准：在样品中的fAGP的量比基准值多或比从健全人或良性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMA)患者采集的样品中的fAGP的量多的情况下，为胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)。
[8]根据[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，所述诊断是癌症治疗的预后的诊断。
[9]一种试剂盒，其是胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的诊断用试剂盒，所述试剂盒包括：(A)脱唾液酸化用试剂；(B)固定有抗AGP抗体的EIA用基材；以及(C)用于将固定于EIA用基材的抗AGP抗体脱岩藻糖基化的试剂。
[10]根据[9]所述的试剂盒，其中，还包括(D)标记凝集素和/或(E)抗生物素蛋白标记酶。
[11]根据[9]或[10]所述的试剂盒，其中，还包括：(F)用于对样品中的AGP进行定量的、固定有抗AGP抗体的夹心ELISA用基材；以及(G)包含酶标记抗AGP抗体的溶液。
发明效果
根据本发明，能通过测定样品中的fAGP的量来提供对胰腺癌或IPMC的诊断有用的新型生物标志物。通过以本生物标志物为指标，能将IPMC判别为IPMA，对IPMN的预后的预测也是有用的。
附图说明
图1表示胰腺癌患者和IPMN患者的血清中的fAGP量的测定结果。图中的各横线表示各个组的平均值。
具体实施方式
本发明的一个实施方案是包括测定样品中的fAGP的量的用于胰腺癌或IPMC的诊断的数据获取方法。
本实施方案的数据获取方法用于辅助胰腺癌或IPMC的诊断。本方法对于IPMC和IPMA的判别是有用的，对于IPMN的预后的预测、特别是IPMN中的胰腺癌发生的诊断是有用的。需要说明的是，在本发明中，作为恶性肿瘤的IPMC有时包含在胰腺癌中，但作为良性肿瘤的IPMA不包含在胰腺癌中。
样品的来源动物优选为人、大鼠等哺乳动物，更优选为人。作为样品，优选源自人的体液，例如可列举出血液、淋巴液、脑脊髓液、尿、腹水等。采集、保存可以按照常规方法。此外，在血液的情况下，优选血浆或血清，其制备、保存可以按照常规方法。
本发明也可以包括从诊断对象的动物中采集样品的工序。
fAGP量的测定没有特别限制，可以通过测定AGP中的岩藻糖基糖链的量来进行。例如，如以下所示，可以基于专利文献1所记载的方法进行测定，根据该测定方法，可以简便且由极少量的血清试样(例如1滴，25μl)来测定fAGP量。
[将样品中的AGP脱唾液酸化的工序]
该测定方法也可以包括将样品中的AGP脱唾液酸化的工序。若样品中的AGP的糖链保持被高唾液酸化的状态，则会阻碍后续工序中的EIA法中的利用抗AGP抗体对AGP的捕捉和利用凝集素对岩藻糖基的检测。
(脱唾液酸化)
脱唾液酸化只要能使作为AGP糖链的非还原末端的唾液酸键的α2，3和α2，6的唾液酸残基游离，就没有特别限制。优选使用脱唾液酸化酶来进行，例如可列举出唾液酸酶(别名：神经氨糖酸苷酶)。
作为唾液酸酶，只要是对在AGP糖链中存在于非还原末端的α2，3和α2，6的唾液酸基具有特异性的外型的唾液酸酶就没有特别限制。此外，也可以使用源自各种生物的唾液酸酶。唾液酸酶可以单独使用一种，也可以组合两种以上使用，优选使用源自高效水解两唾液键的产脲节杆菌(Arthrobacter ureafaciens)的唾液酸酶。
在利用唾液酸酶进行的脱唾液酸化处理中的唾液酸酶的使用量只要能够使唾液酸残基从糖链的非还原末端充分地游离就没有特别限制，每1μg的AGP优选为0.005mU以上，更优选为0.01mU以上，进一步优选为0.02mU以上。另一方面，优选为2mU以下，更优选为1.5mU以下，进一步优选为1mU以下。
需要说明的是，使用唾液酸乳糖作为底物，将在pH5.0、37℃下分解1μmol的唾液酸1分钟所需的酶量设为1U(单位)。
此外，利用唾液酸酶进行的脱唾液酸化的处理时间只要能够使唾液酸残基从糖链的非还原末端充分游离就没有特别限制，优选为20分钟以上，更优选为30分钟以上，进一步优选为1小时以上。另一方面，上限没有特别限制，例如也可以设为2小时以下。
此外，利用唾液酸酶进行的脱唾液酸化中的处理温度只要能够使唾液酸残基从糖链的非还原末端充分游离就没有特别限制，优选为室温(例如25℃)以上，更优选为30℃以上，进一步优选为35℃以上。另一方面，上限为唾液酸酶保持活性的温度，优选为38℃以下，特别优选为37℃。
此外，作为利用唾液酸酶进行的脱唾液酸化中的缓冲液，可以使用利用生物化学方法的情况下的通常的缓冲液。例如可列举出：醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。缓冲液的浓度也可以使用利用生物化学方法的情况下的通常的浓度。
缓冲液的pH只要使脱唾液酸化进行就没有特别限制，优选为6.0以上，更优选为6.5以上，进一步优选为6.8以上。另一方面，优选为8.0以下，更优选为7.5以下，进一步优选为7.2以下。
优选的是，在利用唾液酸酶进行的脱唾液酸化后使唾液酸酶失活。失活可以按照常规方法。例如，可列举出在每10μl的血清用490μl的PBS稀释的状态下，在90℃下进行5分钟的处理等。
即，脱唾液酸化的工序可以包括以下工序：将样品与唾液酸酶混合；将样品与唾液酸酶混合而成的混合溶液在唾液酸酶保持活性的温度下处理任意时间；以及使唾液酸酶失活。
[利用EIA法测定岩藻糖基糖链的量的工序]
该测定方法包括如下工序：在将上述样品中的AGP脱唾液酸化的工序之后，使用固定于基材且糖链被脱岩藻糖基化的抗AGP抗体和对所述经脱唾液酸化的AGP的岩藻糖基进行识别的凝集素，利用酶免疫测定法(EIA法)测定岩藻糖基糖链的量。与在将AGP脱唾液酸化的工序之前使基材上的糖链与经脱岩藻糖基化的抗AGP抗体反应的情况相比，通过在将AGP脱唾液酸化的工序之后使基材上的糖链与经脱岩藻糖基化的抗AGP抗体反应，能测定样品中的包含各种岩藻糖基糖链的、更多的AGP。
本工序例如可以包括以下工序：将抗AGP抗体的糖链脱岩藻糖基化；将使糖链脱岩藻糖基化的抗AGP抗体固定于基材上；通过在基材中添加样品，使固定于该基材上的使糖链脱岩藻糖基化的抗AGP抗体与样品中的AGP结合；使抗AGP抗体与对结合后的AGP所具有的岩藻糖基进行识别的凝集素结合；通过利用EIA法测定凝集素来测定岩藻糖基糖链的量。
在本工序中，在该EIA法中使用的固定于基材的抗AGP抗体是其糖链经脱岩藻糖基化的抗AGP抗体。
若抗AGP抗体(Fc区域)的糖链保持被岩藻糖基化的状态，则在进行EIA时，对所述经脱唾液酸化的AGP的岩藻糖基进行识别的凝集素不仅与该AGP的岩藻糖基结合，还会与固定于基材的抗AGP抗体的岩藻糖基结合，无法准确地测定该AGP糖链的岩藻糖基的量。
作为该基材，例如可列举出设于板的凹下部、珠等。EIA中使用的、固定于基材且糖链被脱岩藻糖基化的抗AGP抗体可以是将脱岩藻糖基化前的抗AGP抗体固定于基材后在该基材上进行了脱岩藻糖基化的抗AGP抗体，也可以是在固定于基材的阶段预先将糖链脱岩藻糖基化的抗AGP抗体。无论是脱岩藻糖基化前的抗AGP抗体，还是预先将糖链脱岩藻糖基化的抗AGP抗体，固定于基材的方法均可以使用现有的EIA法中使用的方法。
(脱岩藻糖基化)
在对EIA中使用的固定于基材的脱岩藻糖基化前的抗AGP抗体进行脱岩藻糖基化的情况下，其方法没有特别限制，优选进行使用了脱岩藻糖基化用溶液的处理，例如可列举出使用了过碘酸钠溶液的过碘酸氧化。
使用过碘酸的情况的其浓度只要充分进行脱岩藻糖基化就没有特别限制，优选为5mM以上，更优选为7mM以上，进一步优选为8mM以上。另一方面，优选为20mM以下，更优选为15mM以下，进一步优选为12mM以下。
此外，使用过碘酸的脱岩藻糖基化的处理时间只要充分进行脱岩藻糖基化就没有特别限制，优选为20分钟以上，更优选为30分钟以上，进一步优选为50分钟以上。另一方面，为了将所使用的抗体因脱岩藻糖基化处理而受到的损伤抑制得低，上限优选为2小时以下。
此外，使用过碘酸的脱岩藻糖基化的处理温度只要充分进行脱岩藻糖基化就没有特别限制，优选为15℃以上，更优选为20℃以上，进一步优选为25℃以上。另一方面，优选为40℃以下，更优选为35℃以下，进一步优选为30℃以下。
此外，作为使用过碘酸的情况的缓冲液，可以使用利用生物化学方法的情况下的通常的缓冲液。例如可列举出：醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、Tris缓冲液、磷酸缓冲生理盐水(PBS)等。此外，该缓冲液也可以适当地包含Tween20、Tween80等表面活性剂。作为缓冲液和表面活性剂的浓度，可以使用利用生物化学方法的情况下的通常的浓度。
缓冲液的pH只要使脱岩藻糖基化进行就没有特别限制，优选为6.0以上，更优选为6.5以上，进一步优选为6.8以上。另一方面，优选为8.0以下，更优选为7.5以下，进一步优选为7.2以下。
优选的是，使用过碘酸的脱岩藻糖基化在遮光下进行。
此外，在使用过碘酸的脱岩藻糖基化之后，可以进行如下的与现有的EIA中使用的基材的制备同样的制备：用缓冲液清洗基材，用含有1％BSA的PBS在室温下保温2小时或在4℃下保温一夜，用清洗液(例如含有0.05％Tween20的PBS)清洗后进行EIA等。
此外，通常，有时通过在使用过碘酸的脱岩藻糖基化后进行还原处理来保护抗体的活性，但在本发明的测定方法中，无论是否进行该还原处理，AGP中的岩藻糖基糖链的定量结果都没有显著差异，因此优选在脱岩藻糖基化后不包括还原处理工序。
将抗AGP抗体的糖链脱岩藻糖基化的工序可以包括以下工序：在将抗AGP抗体固定于基材后，使脱岩藻糖基化用溶液与基材上的抗AGP抗体接触；为了使固定于基材上的抗AGP抗体的糖链脱岩藻糖基化，在任意的温度下处理任意的时间；以及清洗基材。
将使糖链脱岩藻糖基化的抗AGP抗体固定于基材上的工序可以通过本领域技术人员已知的方法进行，可以包括以下工序：使基材与抗AGP抗体接触；为了使抗AGP抗体固定于基材上而在任意温度下处理任意的时间；以及清洗基材。
就通过在基材中添加样品，使固定于该基材上的使糖链脱岩藻糖基化的抗AGP抗体与样品中的AGP结合的工序而言，只要充分进行AGP与抗AGP抗体之间的抗原抗体反应，就没有特别限定，可以在任意的时间和温度下进行。
就使抗AGP抗体与对结合后的AGP所具有的岩藻糖基进行识别的凝集素结合的工序而言，只要凝集素能够识别AGP上的岩藻糖基，就没有特别限定，可以在任意的时间和温度下进行。此外，还可以包括预先对凝集素进行生物素标记的工序。
(对经脱唾液酸化的AGP的岩藻糖基进行识别的凝集素)
该凝集素只要是与存在于AGP糖链中的Fucα1，3GlcNAc糖链结合的凝集素即可，优选为橙黄网胞盘菌凝集素(AAL)。它们可以是天然的，也可以是人工制作的。此外，也可以是与天然的AAL同源性高的重组蛋白，同源性高是指例如为80％以上的同源性。该AAL也可以进行现有的EIA法中使用的标记、修饰。
(检测)
作为检测对经脱唾液酸化的AGP的岩藻糖基进行识别的凝集素识别该岩藻糖基并与AGP结合的方法，可以使用现有的EIA。可以对凝集素本身进行标记而使用，或者，例如也可以预先对凝集素进行生物素标记，使AGP的岩藻糖基与该生物素标记凝集素结合后，使经抗生物素蛋白标记的酶结合，使用由该酶的反应引起的显色或发光进行检测。
作为上述酶，在任何情况下都可以使用在现有的EIA法中使用的通常的酶。例如可列举出：辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP)等。
作为底物，只要是与使用的酶对应的底物即可，例如，若是HRP的底物，则可列举出3，3’，5，5’－四甲基联苯胺(TMB)、2，2’－联氮双(3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸)二铵盐(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)等。若是ALP的底物，则可列举出对硝基苯磷酸盐(PNPP)等。
(EIA法)
本工序中的EIA法可以与现有方法同样地进行。除了反应温度、反应时间以外，试剂的种类、试剂的浓度、荧光、显色的检测方法等均可以按照常规方法。
作为一个例子，记载有如下情况：将对经脱唾液酸化的AGP的岩藻糖基进行识别并结合的凝集素作为生物素标记AAL，加入抗生物素蛋白标记酶HRP，通过对底物TMB的显色来检测该结合。
首先，如上所述，准备固定有通过过碘酸氧化而脱岩藻糖基化的抗AGP抗体的EIA用基材。为了防止对基材的非特异性吸附，也可以通过常规方法中使用的阻断用缓冲液，例如包含10％山梨醇加1％BlockAce的PBS或包含2％牛血清白蛋白(BSA)的PBS，优选通过包含10％山梨醇加1％BlockAce的PBS来进行阻断。
接着，使用包含经脱唾液酸化的AGP的试样，使固定于基材并经脱岩藻糖基化的抗AGP抗体与该经脱唾液酸化的AGP结合后，用清洗液(例如，含有0.05％Tween20的PBS)清洗并去除未结合的成分。
接着，使用生物素标记AAL，使与该抗AGP抗体结合的脱唾液酸化AGP中的岩藻糖基糖链与该生物素标记AAL结合，通过清洗液的清洗来去除未结合的生物素标记AAL。生物素标记AAL的浓度调整可以使用不含BlockAce的PBS，其他抗体的浓度调整可以使用0.4％BlockAce加PBS。
接着，使用抗生物素蛋白标记酶HRP，使该生物素标记AAL与抗生物素蛋白标记酶HRP结合，用清洗液清洗并去除未结合的抗生物素蛋白标记酶HRP。
接着，加入该酶HRP的底物TMB，与现有的抗体－凝集素EIA法同样地检测显色。
在本发明的测定方法中，优选还包括由所述显色量换算岩藻糖基化AGP的量的工序。
作为本工序中使用的方法，可列举出如下方法：使用校正曲线，由上述EIA中测定出的显色量或发光量换算样品中的岩藻糖基化AGP量。
就校正曲线而言，优选的是，例如，根据对通过非专利文献5中记载的方法由血清或腹水得到的高岩藻糖基化AGP进行脱唾液酸化，并对此通过同样的EIA法得到的岩藻糖基化AGP量与显色量或发光量(U/ml)的关系来制作。
也可以包括将像这样得到的样品中的α1－酸性糖蛋白(AGP)中的岩藻糖基糖链的量或换算出的岩藻糖基化AGP量作为胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的指标来建立关联的工序。
优选的是，该测定方法还包括以下工序：对所述样品中的AGP进行定量；以及以所述AGP量将岩藻糖基糖链的量标准化。
[对样品中的AGP进行定量的工序]
优选的是，该测定方法包括对样品中的AGP进行定量的工序。
对样品中的AGP进行定量的方法没有限制，例如可列举出以下方法等：在将样品中的AGP脱唾液酸化后，使用将其稀释而得到的溶液，进行使用了固定于基材的抗AGP抗体和酶标记的抗AGP抗体的夹心ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay：酶联免疫吸附测定)法，使用校正曲线，由基于酶反应的显色量或发光量换算为样品中的AGP的浓度。
就校正曲线而言，优选的是，例如，对作为标准试样的市售的人血浆AGP(具体而言为Sigma－Aldrich)(浓度已知)进行脱唾液酸化，并使用其来进行使用了固定于基材的抗AGP抗体和酶标记的抗AGP抗体的夹心ELISA法，根据AGP量(浓度)与显色量或发光量(μg/ml)的关系来制作。
[以AGP量将岩藻糖基糖链的量标准化的工序]
优选的是，该测定方法还包括以上述“对样品中的AGP进行定量的工序”中得到的AGP量(U/μg)将上述得到的样品中的岩藻糖基糖链的量标准化的工序。
在现有方法中，通过CAIE法、MALDI－TOF－MS能够进行加成于N型糖链的岩藻糖的分析，但其操作繁琐，无法迅速地得到结果，其定量化困难，与此相对，通过本工序，能够简便且迅速地计算出样品中的AGP的每单位量的岩藻糖基糖链的量。
[胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的诊断基准]
在本实施方案中，是否具有胰腺癌或IPMC的诊断基准没有特别限制，例如，在样品中的fAGP的量比基准值多或比从健全人或IPMA患者采集的样品中的fAGP的量多的情况下，可以是具有胰腺癌或IPMC的诊断基准，此外，在样品中的fAGP的量比基准值多或比从IPMA患者采集到的样品中的fAGP的量多的情况下，可以是具有胰腺癌或IPMC的诊断基准。
需要说明的是，基准值可以是指根据本领域技术人员已知的方法，基于健全人的测定值和/或IPMA患者的测定值而预先确定的临界(cut-off)值，例如，临界值也可以设为健全人的测定值的平均值(mean)+3×标准偏差(S.D.)。
此外，在本发明中，健全人是指不具有癌症、伴有急性期炎症或慢性炎症的疾病的人。
在本发明中，诊断也可以是胰腺癌或IPMC的治疗预后的诊断。
作为胰腺癌的治疗，可列举出选自由手术、化学疗法、放射线疗法、抗体疗法以及免疫疗法构成的组中的一种以上。优选的是，选自由手术、化学疗法以及放射线疗法构成的组中的一种以上。作为免疫疗法，可列举出使用了抗体药物、分子靶向药的免疫疗法。此外，作为IPMC的治疗，可列举出手术。
虽然没有特别限定，但例如也可以根据上述的胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤(IPMC)的诊断基准的项目中记载的基准，测定从治疗后的患者采集到的样品，在判断为具有胰腺癌或IPMC的情况下，判断为未观察到治疗效果或预后不良。
本发明的另一实施方案是胰腺癌或IPMC的诊断用试剂盒。
本发明的另一实施方案是包括下述要素(A)～(C)、优选包括(A)～(D)、更优选包括(A)～(E)的试剂盒。
(A)脱唾液酸化用试剂；
(B)固定有抗AGP抗体的EIA用基材；
(C)用于将固定于EIA用基材的抗AGP抗体脱岩藻糖基化的试剂；
(D)生物素标记凝集素等标记凝集素(例如AAL)；以及
(E)抗生物素蛋白标记酶(例如HRP)。
优选的是，该试剂盒还包括：(F)用于对样品中的AGP进行定量的、固定有抗AGP抗体的夹心ELISA用基材；以及(G)包含酶(例如HRP)标记抗AGP抗体的溶液。
此外，优选的是，该试剂盒还包括稀释用缓冲液、阻断用缓冲液、fAGP标准品。作为fAGP标准品，例如，可以使用从源自人癌患者的腹水、血清中部分纯化而得到的物质，此外，也可以使用源自人的培养细胞、例如肝癌细胞系(hepatoma cell line)等的培养液。
作为所述(A)、(C)至(E)、(G)的优选的种类、浓度、标记、使用时的条件等，援引了上述的本发明的数据获取方法中所包括的关于fAGP的量的测定的记载。此外，对于各溶液，可以在使用前适当浓缩，也可以在即将使用前用水等适当稀释。
此外，在所述(A)、(C)至(E)、(G)均包含多种溶剂、溶液的情况下，它们可以混合并容纳于一个容器中，也可以容纳于不同的容器中。
此外，作为所述(B)和(F)的优选的方案，可列举出上述的本发明的测定方法的说明中记载的方案。
该试剂盒用于胰腺癌或IPMN的诊断，关于是否具有胰腺癌或IPMN的诊断基准，可以使用上述的本发明的数据获取方法中记载的基准。
此外，该试剂盒也可以还包括记载了上述的本发明的数据获取方法中所包括的fAGP的量的测定方法的说明书等。
实施例
以下，使用实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
＜实施例1＞
[IPMN患者、胰腺癌患者以及健全人的血清中的fAGP量的比较]
使用本发明人等已经确立的AGP分子上的岩藻糖基糖链的特异性测定法(专利文献1和非专利文献6)，测定了IPMN患者和胰腺癌患者的术前血清以及作为阴性对照的健全人血清的fAGP量。在各样品中使用的血清试样为极少量(1滴，25μl)。此外，对于IPMN患者，通过作为本领域技术人员已知的方法的术后病变组织检查来进行IPMC或IPMA的分类。
血清中的fAGP量的测定通过以下方式进行：首先，为了标准化，通过使用了抗AGP抗体的夹心ELISA法来测定血清中的AGP量，接着，通过使用了抗AGP抗体/岩藻糖结合凝集素(AAL)的EIA法来测定血清中的fAGP量，根据这些测定结果计算出血清中的每单位量AGP的岩藻糖基糖链的量。IPMN患者被分为IPMC和IPMA来表示，与胰腺癌患者和作为阴性对照的健全人进行比较(图1)。
IPMC(n＝14)和IPMA(n＝7)的血清中的fAGP量分别为118.15±113.01和11.63±8.47U/μg，在IPMC中显著高于IPMA(P＜0.05)。此外，IPMA显著高于健全人(图中示为健康对照，n＝53)(4.07±3.49U/μg)(P＜0.05)，在胰腺癌患者(图中示为胰腺癌，n＝40)(904.37±1708.32U/μg)中显著高于IPMC(P＜0.05)。
此外，根据健全人的fAGP量的测定值求出临界值(mean+3S.D.＝14.54U/μg)，确认各个样品组中的阳性率。其结果是，胰腺癌患者：97.5％(39/40)、IPMC患者：92.86％(13/14)、IPMA患者：28.6％(2/7)、健全人：1.9％(1/53)。此外，若基于该临界值求出IPMC的正确诊断率，则在IPMC中为85.7％，与现有的基于图像诊断的正确诊断率(58.8％)相比，确认到显著的高值。此外，显示出胰腺癌中的阳性率极高。
＜实施例2＞
[IPMN患者的fAGP和其他胰腺癌的癌症标志物的术前血药浓度的比较]
将通过实施例1测定出的每位IPMN患者的血清中的fAGP量示于表1。此外，通过本领域技术人员已知的方法，使用与实施例1中使用的试样相同的源自患者的血清试样来测定用作现有的胰腺癌的标志物的四种抗原(CEA、CA19－9、SPan－1、DUPAN－2)，将其结果也示于表1。
对于一直以来用作胰腺癌的癌症标志物的CEA、CA19－9、SPan－1以及DUPAN－2，在IPMC14症例的术前血清中观察各自的阳性率时，为CEA(1/14＝7.1％)、CA19－9(5/14＝35.7％)、SPan－1(1/14＝7.1％)、DUPAN－2(1/14＝7.1％)，除了CA19－9以外的标志物均为低阳性率(表1)。
在此，CA19－9的抗原决定基是唾液酸Lea(NANAα2，3Galβ1，3[Fucα1，4]GlcNAc)，与作为人Lewis式血型抗原的共同抗原的Lea(Galβ1，3[Fucα1，4]GlcNAc)抗原具有共同结构，均存在与相同的Fucα1，4糖链合成相关的关键酶。在日本，大约不到20％的人的Lewis式血型抗原为阴性，未合成Fucα1，4糖链，因此，唾液酸Lea也未遗传性地合成，因此，在这些情况下，CA19－9无法成为癌症标志物。发明人等已经明确了Lewis式血型的鉴定难以用通常的血清学方法进行，与癌症相关而经常发生血型转换，无法进行正确的血型判定(非专利文献7)。在Lewis式血型的正确的血型判定中，FUT6酶活性测定或FUT6基因鉴定是必须的(非专利文献8)。除了CA19－9所具有的这样的限制以外，根据表1的结果，对于基于CA19－9的测定的IPMC的诊断的灵敏度低，关于基于fAGP的测定的IPMN诊断和IPMC的判别的优越性明显。
[表1]
表1.IPMN患者的fAGP和肿瘤标志物的术前血药浓度
Figure BDA0004113632190000151
带下划线的数字为阳性例(>各临界值)
综上所述，使用本发明人等已经确立的AGP分子上的岩藻糖基糖链的特异性测定法测定出的血清中的fAGP值在胰腺癌中显著上升，除此以外，在IPMN患者的术前诊断中，与现有的癌症标志物相比，均能以高的阳性率判别IPMC。由此，对于IPMN患者的手术适应症例(IPMC)，示出了使基于此前的图像诊断的正确诊断率大幅提高的可能性。此外，IPMC患者中胰腺癌的发生率显著上升，因此也有望应用于IPMN患者的胰腺癌发生的诊断。因此，可认为能够成为与IPMN患者的恶性肿瘤相关的有用的生物标志物。

Claims (11)

1.一种用于胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤即IPMC的诊断的数据获取方法，其包括：测定样品中的岩藻糖基化α1－酸性糖蛋白即fAGP的量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述样品为血浆或血清。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
所述测定为测定α1－酸性糖蛋白即AGP中的岩藻糖基糖链的量，
所述测定包括以下工序：将样品中的AGP脱唾液酸化；以及
使用固定于基材且糖链被脱岩藻糖基化的抗AGP抗体和对所述经脱唾液酸化的AGP的岩藻糖基进行识别的凝集素，利用酶免疫测定法即EIA法测定岩藻糖基糖链的量。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，
所述脱唾液酸化通过唾液酸酶处理来进行，所述脱岩藻糖基化通过过碘酸氧化来进行。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其中，
所述凝集素为橙黄网胞盘菌凝集素即AAL。
6.根据权利要求3～5中任一项所述的方法，其中，
还包括以下工序：对所述样品中的AGP进行定量；以及
以所述AGP量将所述岩藻糖基糖链的量标准化。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其中，
所述诊断基于如下基准：在样品中的fAGP的量比基准值多或比从健全人或良性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤即IPMA患者采集的样品中的fAGP的量多的情况下，为胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤即IPMC。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的方法，其中，
所述诊断是癌症治疗的预后的诊断。
9.一种试剂盒，其是胰腺癌或恶性胰腺导管内乳头状粘液性肿瘤即IPMC的诊断用试剂盒，所述试剂盒包括：
(A)脱唾液酸化用试剂；
(B)固定有抗AGP抗体的EIA用基材；以及
(C)用于将固定于EIA用基材的抗AGP抗体脱岩藻糖基化的试剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其中，
还包括(D)标记凝集素和/或(E)抗生物素蛋白标记酶。
11.根据权利要求9或10所述的试剂盒，其中，
还包括：(F)用于对样品中的AGP进行定量的、固定有抗AGP抗体的夹心ELISA用基材；以及
(G)包含酶标记抗AGP抗体的溶液。
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