JP2012506253A - 大腸癌関連マーカーを用いた大腸癌の診断キット、及びそれを用いた大腸癌の診断方法 - Google Patents
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Abstract
Description
microparticle-conjugated antibody)であることが好ましい。また前記微小粒子は、有色のラテックスまたは金コロイド粒子であることが好ましい。
1)大腸癌が疑われる患者から獲得された生物学的試料で配列番号1〜配列番号9の塩基配列を有する遺伝子群から選択される一つ以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程、及び
2)前記測定された発現レベルが、特に大腸癌の危険性の指標として増加したレベルであり、正常対照群試料のレベルより高い発現を示す患者を選別する工程。
正常な大腸上皮細胞と比較して大腸癌細胞でのみ特異的に過剰発現する遺伝子を1次的に抽出するためDNAチップ(イルミナ社が販売する48Kヒトマイクロアレイ)を用いて、2,230個の遺伝子に対してその発現度を調査した。
RT−PCRのために、20人の大腸癌患者由来の大腸正常上皮細胞組織と大腸癌細胞組織からなる合計40の組織から、mRNAを単離した。
前記実施例1の結果選抜された大腸癌特異的過剰発現遺伝子に対して、RT−PCRを実施した。
大腸癌患者と正常な人の血清中のタンパク質レベルをウエスタンブロットを用いて比較した。
その結果、正常な人の場合(1〜3番レーン)ではAGT、EGFL−6、及びCXCL−3タンパク質が検出されないかその量が少ない一方、大腸癌患者の場合(4〜7番レーン)にはAGT、EGFL−6、及びCXCL−3が過剰発現されて前記遺伝子のタンパク質が大腸癌診断のマーカーとして有用に使用できることが実証された(図4)。
正常な大腸上皮組織と大腸癌組織でのタンパク質存在の有無及び発現位置を確認するため、組織スライドを対象に免疫染色を実施した。
ポリクローナル抗体でのイムノドット方法を用いて、正常な人及び大腸癌患者由来の血清で、AGT、EFGL6、CXCL3、COL5A2、CTHRC1、及びFCGR3Aタンパク質の分泌レベルを比較した。ニトロセルロースメンブレンに、5〜10倍希釈の血清試料(各患者当たり10試料)を2μlずつドットした後、室温で乾燥させて、1%BSAT(bovine serum albumin in Tris-buffered saline)溶液でブロッキングした。AGTタンパク質に対するポリクローナル抗体(R&D, 1:5000)、EFGL6タンパク質に対するポリクローナル抗体(Santa Cruz, 1:5000)、CXCL3タンパク質に対するポリクローナル抗体(Aviva, 1:5000)、Col5A2タンパク質に対するポリクローナル抗体(1:5000)、CTHRC1タンパク質に対するポリクローナル抗体(SantaCruz, 1:1000)、FCGR3Aタンパク質に対するポリクローナル抗体(1:5000)を処理した後、2次抗体接合ホースラディッシュペルオキシダーゼ(1:10000)を加えてDAB溶液(0.5mg/ml, diaminobenzidine in PBT)で発色させた。スキャンして得られた蛍光データを分析した(図9、図10)。正常な血清より大腸癌の血清において、より多量に発現していることが分かり、それら遺伝子を大腸癌診断及び予後診断に有用なマーカーとして使用可能であることを実証している。
7−1.エライザシステム(ELISA system)の確立
AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するモノクローナル抗体(1μg/ml)を、0.1M炭酸塩緩衝液(pH9.6)を用いて1μg/mlの濃度に希釈して、96穴マイクロタイタープレートに100μlずつ分注した。4℃でオーバーナイトのインキュベーションをした後、モノクローナル抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを、0.05%ツイーン20を含んだPBS溶液(PBS−T)を用いて3回洗浄した。1%BSA溶液で室温で2時間ブロッキングし後、PBS−T溶液を用いて3回洗浄した。配列番号1〜配列番号9のタンパク質を希釈して100μlをそれぞれ入れ、室温で2時間インキュベートした後、PBS−T溶液を用いて3回洗浄した。AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するポリクローナル抗体(1:2000希釈)を100μlずつ希釈した後、2時間インキュベートさせて洗浄した。2000倍に希釈したホースラディッシュペルオキシアーゼが接合した2次抗体100μlを入れた後、室温で1時間インキュベートさせ後、3回洗浄して、最後にTMB溶液を用いて発色させる。発色した試料の吸光度は、450nm波長でELISA reader(Molecular Device,Sunnyvale, CA,米国)を用いて測定した(図11)。
実施例7−1で確立したエライザシステムを用いて、患者の血清中のAZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質濃度を測定した。正常な人および大腸癌患者の血清を5倍ずつ希釈した後、血清中のAZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質の濃度を計算した。
8−1.サンドイッチ型エライザキット
次の構成要素を用いて、AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質濃度測定用キットを製造した;
A.固相型抗体:抗体が吸着したマイクロタイタープレートとして、AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するポリクローナル抗体100μlをマイクロタイタープレートに加えた後、4℃でオーバーナイトでインキュベーションし、固相体表面にアルブミンを吸着させた。
B.検出抗体:AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するモノクローナル抗体
C.酵素結合抗体:ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)が結合した2次抗体溶液
D.血清希釈溶液
E.基質液(TMB)
F.洗浄液:0.05%ツイーンを含んだリン酸塩緩衝液(PBS−T)
G.標準溶液:AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質標準液。
8−2−1.免疫クロマトグラフィーストリップの製造
1)抗体−金接合体(Ab-gold conjugate)製造
抗体を金コロイド粒子(colloidal gold particles)溶液に15μg/ml加えた後、室温で2時間攪拌させながらインキュベートした。10%BSAを1/10vol.加えて1%濃度になるようにした後、再び1時間インキュベートさせた。12,000rpmで40分間遠心分離して上澄み液を捨て、再び2mM ホウ酸緩衝液を加えて抗体−金接合体(Ab-gold conjugate)溶液を洗浄した。この洗浄工程は、3回繰り返された。その後、1%BSAを含んだ2mMホウ酸緩衝液を金の溶液約1/10体積を加えて懸濁させた。紫外分光光度計を用いて、530nmで吸光度を測定した後、吸光度が3.00になるように希釈した。
試験しようとする試料を吸収するための部分として、セルロース素材のものを使用する。前記サンプルパッドは、試料を吸収することができるどのような素材でも代替可能である。
スクロースを含んだ20mMホウ酸緩衝液で前処理する。
ニトロセルロースメンブレン(Millipore社)を適当な大きさ(0.7cm×5cm)にカットした。プラスチックバックキング(plastic backing)下端から約3.4cmになる地点に実質的な対照ラインとしてヤギ抗−ヒツジIgG(goat anti-sheep IgG)を適用し、2.7cmになる地点に実質的な検出ラインとしてAZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するモノクローナル抗体を適用した。
免疫反応後、未処理の物質を吸収して、それによって分析物質を含んだ試料溶液が毛細管現象によって移動するようにするセルロースメンブレンを使用する。
図12に示すように、接着用プラスチックバックキング上に、サンプルパッド、GFメンブレン、NCメンブレン及び吸収パッドを、物質が毛細管現象によって連続的に移動することができるように重ね合わせ、免疫クロマトグラフィーストリップを提供する。
サンプルパッドに60〜70μlの試料(例えば、試料は血清と溶出バッファーの比を1:5)を加えて、3〜5分後に対照ラインと結果ラインの発色の有無及び発色濃度を観察した。陽性試料の場合、対照ラインと結果ラインで赤色の着色ラインを観察することができ、陰性試料の場合は対照ラインでのみ赤色の着色ラインを見ることができた。
8−3−1.ルミネックスキット構築
AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するポリクローナル抗体をビーズに接合した。試料を希釈して100μlを入れ、室温で2時間の間インキュベートした後、PBS−T溶液を用いて3回洗浄した。配列番号1〜配列番号9のタンパク質に対応するモノクローナル抗体を100μlずつ希釈した後、2時間インキュベートした。2000倍希釈されたPE(phycoerythrin)が接合した2次抗体100μlを入れた後、室温で1時間インキュベートした。ルミネックス機器で測定する前に、3回洗浄した。標準曲線を得るために、蛍光強度は、濃度に対してプロットした。
次の構成要素を用いて、AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質濃度測定用キットを構築した。
B.検出抗体:AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するモノクローナル抗体
C.酵素結合抗体:ペルオキシダーゼが結合した2次抗体
D.血清希釈溶液
F.洗浄液:0.05%ツイーン含有リン酸緩衝液(PBS−T)
G.標準溶液:AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質の標準溶液
8−4−1.タンパク質マイクロアレイシステム
AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するモノクローナル抗体で、Proteagenのウェルチップ(Well chip)をコーティングした。チップをBSA緩衝液でブロッキングした後、血清試料を希釈して100μlとともに、室温で1時間の間インキュベートした後、PBS−T溶液を用いて3回洗浄した。100μlのAZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対する希釈モノクローナル抗体を、37℃で1時間インキュベートさせて洗浄した。2000倍に希釈したCy3が接合した2次抗体100μlをとともに、室温で0.5時間インキュベートした後、532nmで蛍光物質の発光レベルを測定する前に、3回洗浄した。標準曲線を得るために、蛍光強度は、濃度に対してプロットした。このように確立したタンパク質マイクロアレイシステムを用いて、患者の血清中のAZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2またはS100Pタンパク質濃度の決定に使用された。
次の構成要素を用いて、AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質濃度測定用キットを構築した。
B.検出抗体:AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質に対するモノクローナル抗体
C.酵素結合抗体:Cy3が結合した2次抗体
D.血清希釈緩衝液
F.洗浄液:0.05%ツイーン含有リン酸塩緩衝液(PBS−T)
G.標準溶液:AZGP1、EGFL6、CTHRC1、CXCL3、CXCL−6、AGT、FCGR3A、Col5A2及びS100Pタンパク質の標準溶液。
Claims (17)
- 配列番号1〜配列番号9の塩基配列を有する遺伝子のmRNAの発現レベルを測定するマーカーを、単独または組み合わせて含む、大腸癌診断用組成物。
- マーカーが、配列番号1〜配列番号9の塩基配列に特異的に結合するプライマーセットである、請求項1に記載の大腸癌診断用組成物。
- プライマーが15bp〜50bpの長さである、請求項2に記載の大腸癌診断用組成物。
- プライマーセットが、配列番号1〜配列番号9で示される塩基配列の一つに同時におよび相補的に結合して、下記1)〜9)からなる群から選択される一つである、請求項2に記載の大腸癌診断用組成物:
1)正方向である配列番号10及び逆方向である配列番号11;
2)正方向である配列番号12及び逆方向である配列番号13;
3)正方向である配列番号14及び逆方向である配列番号15;
4)正方向である配列番号16及び逆方向である配列番号17;
5)正方向である配列番号18及び逆方向である配列番号19;
6)正方向である配列番号20及び逆方向である配列番号21;
7)正方向である配列番号22及び逆方向である配列番号23;
8)正方向である配列番号24及び逆方向である配列番号25;及び
9)正方向である配列番号26及び逆方向である配列番号27。 - 配列番号1〜配列番号9の塩基配列を有する遺伝子によってそれぞれコードされるタンパク質の発現レベルを決定するマーカーを、単独または組み合わせて含む、大腸癌診断用組成物。
- マーカーが、配列番号1〜配列番号9の塩基配列を有する遺伝子によってコードされるタンパク質に特異的な抗体である、請求項5に記載の大腸癌診断用組成物。
- タンパク質に特異的な抗体が、微小粒子と接合した抗体である、請求項6に記載の大腸癌診断用組成物。
- 微小粒子が、有色のラテックスまたは金コロイド粒子である、請求項7に記載の大腸癌診断用組成物。
- タンパク質に特異的な抗体が、免疫クロマトグラフィーストリップキット、ルミネックスアッセイキット、タンパク質マイクロアレイキット、エライザキット、または免疫学的ドットキットに適用することができる、請求項6に記載の大腸癌診断用組成物。
- 請求項1〜9のいずれか一項に記載の組成物を含む、大腸癌の診断用キット。
- 下記の工程を含む、大腸癌の高い危険性を有する患者における大腸癌の診断方法:
1)患者から得られた生物学的試料における配列番号1〜配列番号9の塩基配列を有する遺伝子群から選択される1または2以上の遺伝子の発現レベルを測定する工程;及び
2)前記測定された発現レベル、特に増加したレベルを、大腸癌の危険性の指標として、正常な人より高い発現レベルを示す患者を選別する工程。 - 生物学的試料が、組織、細胞、全血、血清、血漿、唾液、痰、脳脊髄液及び尿からなる群から選択される生物学的試料である、請求項11に記載の方法。
- 発現レベルが、下記によって測定されることを特徴とする、請求項11に記載の方法:
(a)配列番号1〜配列番号9によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる群から選択される1または2以上の遺伝子のmRNAレベルを測定すること;または
(b)配列番号1〜配列番号9によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる群から選択される1または2以上の遺伝子によって発現するタンパク質レベルを測定すること。 - 配列番号1〜配列番号9によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される特定の遺伝子のmRNAの発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用組成物の製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
- 配列番号1〜配列番号9によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用組成物の製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
- 配列番号1〜配列番号9によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される特定の遺伝子のmRNAの発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用キットの製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
- 配列番号1〜配列番号9によって示されるヌクレオチド配列を有する遺伝子からなる遺伝子群から選択される遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルの測定が可能であるマーカーの使用、または大腸癌診断用キットの製造のための、少なくとも二つの前記マーカーを含む複合マーカーの使用。
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