JP2004512023A - 結腸癌の治療および診断のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

癌（例えば、結腸癌）の治療および診断のための組成物および方法が開示される。組成物は、１つ以上の結腸腫瘍タンパク質、その免疫原性部分、またはこのような部分をコードするポリヌクレオチドを含み得る。あるいは、治療組成物は、結腸腫瘍タンパク質を発現する抗原提示細胞、またはこのようなタンパク質を発現する細胞に特異的なＴ細胞を含み得る。このような組成物は、例えば、結腸癌のような疾患の予防および処置に用いられ得る。結腸腫瘍タンパク質、またはこのようなタンパク質をコードするｍＲＮＡをサンプル中で検出することに基づく診断方法もまた提供される。

Description

【０００１】
（発明の技術分野）
本発明は概して、癌（例えば、結腸癌）の治療および診断に関する。本発明は、より詳細には、結腸腫瘍タンパク質の少なくとも一部を含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。このようなポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、結腸悪性腫瘍の予防および処置のための、ならびにこのような癌の診断およびモニタリングのためのワクチンおよび薬学的組成物において用いられ得る。
【０００２】
（発明の背景）
癌は、世界中で、重大な健康問題である。癌の検出および治療において、進歩が成されてきたが、現在利用可能な、予防または処置のためのワクチンも他の普遍的に首尾よい方法もない。一般的に化学療法または手術および放射線療法の組み合わせに基づく現在の治療法は、多くの患者において不十分であることが証明され続けている。
【０００３】
結腸癌は、米国において二番目に高頻度に診断される悪性疾患であり、そして癌死の二番目に一般的な原因である。早期局在段階で検出された結腸直腸癌を有する患者での５年生存率は、９２％である；不幸にも、この段階で診断されるのは、結腸直腸癌の３７％に過ぎない。癌が隣接する器官またはリンパ節に伝播される場合、生存率は６４％に低下し、そして遠隔転移を有する患者では７％に低下する。
【０００４】
結腸癌の診断は、腸壁を通じた腫瘍の浸透の程度、および結節関与の存在または非存在に直接関し、結果として早期検出および処置が特に重要である。現在、診断は、便潜血検査、Ｓ状結腸鏡検査、結腸内視鏡検査、およびバリウム浣腸二重造影に関するスクリーニングアッセイの使用によって補助される。処置レジメンは、癌のタイプおよび段階によって決定され、そして手術、放射線療法、および／または化学療法を含む。手術（治療の最も一般的な形態）後の再発は、主な問題であり、そしてしばしば死亡の最終原因である。
【０００５】
これらの癌および他の癌のための治療におけるかなりの探索にもかかわらず、結腸癌は、効果的に診断および処置することが困難なままである。従って、このような癌を検出および処置するための改善された方法の必要性が当該分野において存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、さらに他の関係する利点を提供する。
【０００６】
（発明の要旨）
１つの局面において、本発明はポリヌクレオチド組成物を提供し、このポリヌクレオチド組成物は、以下：
（ａ）配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に提供される配列；
（ｂ）配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に提供される配列の相補体；
（ｃ）配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に提供される配列の少なくとも２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、７５個および１００個連続する残基からなる配列；
（ｄ）配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に提供される配列に中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
（ｅ）配列番号１〜２３４、２３６、および２４４の配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列；ならびに
（ｆ）配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に提供される配列の縮重改変体、
からなる群より選択される配列を含む。
【０００７】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチド組成物は、試験された結腸癌サンプルの少なくとも約２０％において、より好ましくは少なくとも約３０％において、そして最も好ましくは少なくとも約５０％において、正常組織のレベルの少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約５倍、そして最も好ましくは少なくとも約１０倍の高いレベルで、発現される。
【０００８】
本発明は、別の局面において、上記のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
【０００９】
本発明はさらに、配列番号２３５、２３７、および２４５に示される配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド組成物を提供する。
【００１０】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドは、本明細書中にさらに記載されるように、免疫原性である。すなわち、これらは、免疫応答（特に、体液性および／または細胞性免疫応答）を誘発し得る。
【００１１】
本発明はさらに、開示されたポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチド配列のフラグメント、改変体および／または誘導体を提供し、ここで、フラグメント、改変体および／または誘導体は、好ましくは、配列番号２３５、２３７、および２４５に示されるポリペプチド配列、または配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド配列の少なくとも約５０％免疫原性活性のレベル、好ましくは少なくとも約７０％そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性のレベルを有する。
【００１２】
本発明はさらに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチドを含む発現ベクター、およびこのような発現ベクターで形質転換されたかまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【００１３】
他の局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび生理学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００１４】
本発明の関連した局面において、薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）が、予防適用または治療適用のために提供される。このような組成物は、一般に、本発明の免疫原性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよび免疫刺激剤（例えば、アジュバント）を含む。
【００１５】
本発明はさらに、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）本発明のポリペプチドまたはそれらのフラグメントに特異的に結合する抗体もしくはその抗原結合フラグメント；および（ｂ）生理学的に受容可能なキャリア。
【００１６】
さらなる局面において、本発明は、以下を含む薬学的組成物を提供する：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤。例示的な抗原提示細胞としては、樹状細胞、マクロファージ、単球、線維芽細胞およびＢ細胞が挙げられる。
【００１７】
関連した局面において、以下を含む薬学的組成物が提供される：（ａ）上記のようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞および（ｂ）免疫刺激剤。
【００１８】
本発明はさらに、他の局面において、代表的に、生理学的に受容可能なキャリアおよび／または免疫刺激剤を含む薬学的組成物（例えば、ワクチン組成物）の形態で、上記のような少なくとも１つのポリペプチドを含む融合タンパク質、ならびにこのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。この融合タンパク質は、本明細書に記載される、複数の免疫原性ポリペプチドまたはその部分／改変体を含み得、そしてポリペプチドの発現、精製および／または免疫原性を促進する１つ以上のポリペプチドセグメントをさらに含み得る。
【００１９】
さらなる局面において、本発明は、患者における免疫応答（好ましくは、ヒト患者におけるＴ細胞応答）を刺激するための方法を提供し、この方法は、本明細書中に記載された薬学的組成物を投与する工程を包含する。患者が、結腸癌に冒され得る場合、この方法が疾患の処置を提供するか、またはこのような疾患についての危険性が考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発生を阻害するための方法を提供し、この方法は、上記のような薬学的組成物を患者に投与する工程を包含する。患者が、結腸癌に冒され得る場合、この方法が疾患の処置を提供するか、またはこのような疾患についての危険性が考えられる患者は、予防的に処置され得る。
【００２１】
本発明は、他の局面において、生物学的サンプルから腫瘍細胞を除去する方法をさらに提供する。この方法は、生物学的サンプルと、本発明のポリペプチドと特異的に反応するＴ細胞とを接触させる工程を包含し、ここで、この接触させる工程は、このサンプルからのこのタンパク質を発現する細胞の除去を可能にするための条件下および十分な時間で実施される。
【００２２】
関連する局面において、患者における癌の発達を阻害するための方法が提供される。この方法は、上記のように処理された生物学的サンプルを患者に投与する工程を包含する。
【００２３】
他の局面において、本発明のポリペプチドに特異的なＴ細胞を刺激するか、そして／または、これらを増大する方法がさらに提供される。これらの方法は、Ｔ細胞の刺激および／または増大を可能にするための条件下および十分な時間で、以下の１つ以上とＴ細胞とを接触させる工程を包含する：（ｉ）上記のようなポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および／または（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞。上記のように調製されたＴ細胞を含む単離されたＴ細胞集団がまた、提供される。
【００２４】
さらなる局面において、本発明は、患者における癌の発達を阻害する方法を提供する。この方法は、上記のように有効量のＴ細胞集団を患者に投与する工程を包含する。
【００２５】
本発明はさらに、患者における癌の発生（発達）を阻害する方法を提供する。この方法は、以下の工程を包含する：（ａ）以下の１つ以上と、患者から単離したＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞とをインキュベートする工程：（ｉ）本明細書中で開示されたポリペプチドの少なくとも１つの免疫原性部位を含むポリペプチド；（ｉｉ）このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；および（ｉｉｉ）このようなポリペプチドを発現した抗原提示細胞；ならびに（ｂ）有効量の増殖したＴ細胞を患者に投与し、それによって、患者における癌の発生を阻害する工程。増殖した細胞は、患者への投与前にクローン化され得るが、必ずしもクローン化するに及ばない。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、患者において癌（好ましくは結腸癌）の存在または非存在を決定するための方法を提供する。この方法は、以下を包含する：（ａ）患者から得た生物学的サンプルと、上に列挙したポリペプチドに結合する結合因子とを接触させる工程；（ｂ）サンプル中で、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；および（ｃ）このポリペプチドの量と事前に決定していたカットオフ値とを比較し、それによって患者における癌の存在または非存在を決定する工程。好ましい実施形態において、この結合因子は、抗体であり、より好ましくはモノクロナール抗体である。
【００２７】
他の局面において、本発明はまた、患者における癌の進行をモニタリングする方法を提供する。このような方法は、以下の工程を包含する：（ａ）最初の時点で患者から得た生物学的サンプルと上に列挙したポリペプチドプチドに結合する結合因子とを接触させる工程；（ｂ）サンプルにおいて、この結合因子に結合するポリペプチドの量を検出する工程；（ｃ）次の時点において、患者から得られた生物学的サンプルを使用し、工程（ａ）および工程（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において検出されたポリペプチドの量を工程（ｂ）において検出された量と比較し、それらによって、患者における癌の進行をモニタリングする工程。
【００２８】
他の局面において、本発明は、患者における癌の存在または非存在を決定するための方法をさらに提供する。この方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプル（例えば、腫瘍サンプル、血清サンプル）と、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触させる工程；（ｂ）そのサンプルにおいて、そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡのレベルを検出する工程；ならびに（ｃ）そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドのレベルと事前に決定されたカットオフ値とを比較して、それによって患者の癌の存在または非存在を検出する工程。特定の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、例えば、上記に列挙されるようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズする、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって検出される。他の実施形態において、ｍＲＮＡの量は、上記に列挙されるようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドまたはそのようなポリヌクレオチドの相補体とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用する、ハイブリダイゼーション技術を使用して検出される。
【００２９】
関連する局面において、患者における癌の進行をモニタリングする方法が、提供され、その方法は以下の工程を包含する：（ａ）患者から得られた生物学的サンプルと、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするオリゴヌクレオチドとを接触させる工程；（ｂ）そのサンプルにおいて、そのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を検出する工程；（ｃ）次の時点において、患者から得られた生物学的サンプルを使用し、工程（ａ）および工程（ｂ）を反復する工程；ならびに（ｄ）（ｃ）において検出されたポリヌクレオチドの量を工程（ｂ）において検出された量と比較し、それらによって、患者における癌の進行ををモニタリングする工程。
【００３０】
さらなる局面において、本発明は、上記のようなポリペプチドに結合する抗体（例えば、モノクロナール抗体）ならびにこのような抗体を含む診断キットを提供する。上記のような１つ以上のオリゴヌレクオチドプローブまたはオリゴヌレクオチドプライマーを含む診断キットがまた、提供される。
【００３１】
本発明のこれらの局面および他の局面は、以下の詳細な説明を参照することによって明らかになる。本明細書中で開示される全ての参考文献は、各々が個々に援用されるがごとく参考としてその全体が本明細書によって援用される。
【００３２】
（配列識別子の簡単な説明）
配列番号１は、５４１７２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３３】
配列番号２は、Ｘｑ２１．１染色体上のＰＡＣ　７５Ｎ１３と相同性を共有する５４１０４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３４】
配列番号３は、グルタミン：フルクトース−６リン酸アミドトランスフェラーゼと相同性を共有する５３９７８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３５】
配列番号４は、とＣｏｌｏｎ　Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子と相同性を共有する５４１８４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３６】
配列番号５は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０４６１　ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ１００１４８２と相同性を共有する５４１４９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３７】
配列番号６は、５４０３４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３８】
配列番号７は、ヒトβ２遺伝子と相同性を共有する５４０８５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００３９】
配列番号８は、ＢＡＣ　ＲＰＣｌ１１−２６７Ｊ２３と相同性を共有する５３９４８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４０】
配列番号９は、Ｘ２ｑ２１．３３−２３上のクローン１６４Ｆ３と相同性を共有する５４０２６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４１】
配列番号１０は、Ｌｙｓｙｌヒドロキシラーゼアイソフォーム２と相同性を共有する５３９０７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４２】
配列番号１１は、Ｍｕｃｉｎ１１と相同性を共有する５４０６６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４３】
配列番号１２は、Ｍｕｃｉｎ１１と相同性を共有する５４０１７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４４】
配列番号１３は、Ｍｕｃｉｎ１１と相同性を共有する５４００６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４５】
配列番号１４は、Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ（ＥＧＦファミリー）と相同性を共有する５３９６２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４６】
配列番号１５は、Ｍｕｃｉｎ１２と相同性を共有する５４０２８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４７】
配列番号１６は、Ｅ１Ａエンハンサー結合タンパク質と相同性を共有する５４１６６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４８】
配列番号１７は、７ｐ１５−ｐ２１由来のＰＡＣクローンＲＰ１−１７０Ｏ１９と相同性を共有する５４１７４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００４９】
配列番号１８は、５３９４９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５０】
配列番号１９は、５３８９８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５１】
配列番号２０は、５４０６９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５２】
配列番号２１は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ２０６７６　ｆｉｓ、クローンＫＡｌＡ４２９４と相同性を共有する５４０４８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５３】
配列番号２２は、第１７染色体、クローンｈＲＰＣ．１１７１＿ｌ＿１０と相同性を共有する５４０３１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５４】
配列番号２３は、αトポイソメラーゼ短縮型と相同性を共有する５４１５４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５５】
配列番号２４は、サイトケラチン（Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ）２０と相同性を共有する５４００９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５６】
配列番号２５は、赤芽球症（Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ）ウイルス癌遺伝子ホモログ２と相同性を共有する５４０７０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５７】
配列番号２６は、ポリアデニル結合タンパク質ＩＩと相同性を共有する５３９９８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５８】
配列番号２７は、５４０８９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００５９】
配列番号２８は、トランスフォーミング成長因子β誘導性遺伝子産物と相同性を共有する５４１８２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６０】
配列番号２９は、ＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼと相同性を共有する５３９８９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６１】
配列番号３０は、５４１８１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６２】
配列番号３１は、Ｘｑ２１．１染色体上のＰＡＣ７５Ｎ１３と相同性を共有する５４０７９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６３】
配列番号３２は、Ｍｕｓフォークヘッド（ｆｏｒｋ　ｈｅａｄ）転写因子遺伝子と相同性を共有する５４１１４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６４】
配列番号３３は、Ｘｑ２２染色体上のクローン１４６Ｈ２１と相同性を共有する５４１６０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６５】
配列番号３４は、グルタミン：フルクトース−６−リン酸アミドトランフフェラーゼと相同性を共有する５４１６８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６６】
配列番号３５は、染色体Ｘｑ２１．１上のＰＡＣ　７５Ｎ１３と相同性を共有する５４０７８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６７】
配列番号３６は、腸ペプチド関連トランスポーターＨＰＴ−１と相同性を共有する５３９００．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６８】
配列番号３７は、５４１４７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００６９】
配列番号３８は、ヒトプロテイナーゼ活性化レセプター２と相同性を共有する５４０３３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７０】
配列番号３９は、ＧａｌＮＡｃ−Ｔ３と相同性を共有する５３９０８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７１】
配列番号４０は、５４０２２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７２】
配列番号４１は、Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ　ｆｒａｇｉｌｅ（構成性脆弱）配列と相同性を共有する５４０３９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７３】
配列番号４２は、ＣＤ２４シグナルトランスデューサ遺伝子と相同性を共有する５４０３７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７４】
配列番号４３は、ヒトｃ−ｍｙｂ遺伝子と相同性を共有する５４１２９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７５】
配列番号４４は、ピロリン−ｔ−カルボキシラーゼシンターゼ長型と相同性を共有する５４０５４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７６】
配列番号４５は、ヒトジンクフィンガータンパク質ＺＮＦ−１３９と相同性を共有する５４０５５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７７】
配列番号４６は、膜補因子タンパク質の遺伝子と相同性を共有する５４０４６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７８】
配列番号４７は、Ｃｏｌｏｎ（結腸）Ｋｒｕｐｐｅｌ様因子と相同性を共有する５４０４７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００７９】
配列番号４８は、ヒトキャッピングタンパク質αサブユニットアイソフォーム１と相同性を共有する５４０４０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８０】
配列番号４９は、Ｉｇλ鎖と相同性を共有する５４０３５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８１】
配列番号５０は、タンパク質チロシンキナーゼと相同性を共有する５４１３０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８２】
配列番号５１は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０６１０ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ２００５２９３と相同性を共有する５４０４５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８３】
配列番号５２は、ヒト微小管関連タンパク質７と相同性を共有する５４０５２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８４】
配列番号５３は、ヒト網膜芽細胞腫感受性タンパク質と相同性を共有する５４０５０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８５】
配列番号５４は、ヒト細網カルビン（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃａｌｂｉｎ）と相同性を共有する５４０５１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８６】
配列番号５５は、翻訳開始因子ｅ１Ｆ３　ｐ３６サブユニットと相同性を共有する５４１７８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８７】
配列番号５６は、ヒトアプリンエンドヌクレアーゼ／アピリミジンエンドヌクレアーゼと相同性を共有する５４１４８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８８】
配列番号５７は、５４０５８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００８９】
配列番号５８は、ヒト内在性膜貫通タンパク質１（Ｈｕｍａｎ　ｉｎｔｅｇｒａｌ　ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１）と相同性を共有する５４０５９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９０】
配列番号５９は、ヒトセリンキナーゼと相同性を共有する５４１２６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９１】
配列番号６０は、ヒトＣＧ１−４４タンパク質と相同性を共有する５４１２７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９２】
配列番号６１は、ＨＡＤＨ／ＮＡＤＰＨ甲状腺オキシダーゼｐ１３８−ｔｏｘタンパク質と相同性を共有する５４０４９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９３】
配列番号６２は、ヒトペプチドトランスポーター（ＴＡＰ１）タンパク質と相同性を共有する５４０５６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９４】
配列番号６３は、１ｐ３２．１−３４．３染色体上のクローンＲＰ１−３９Ｇ２２と相同性を共有する５４０６４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９５】
配列番号６４は、クローントランスフォーミング成長因子β誘導性遺伝子産物と相同性を共有する５４１２４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９６】
配列番号６５は、５４０６３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９７】
配列番号６６は、サイトケラチン８と相同性を共有する５４１４１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９８】
配列番号６７は、ヒトコートタンパク質γ−ｃｏｐと相同性を共有する５４１１９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【００９９】
配列番号６８は、Ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ（ブメタニド感受性）Ｎａ−Ｋ−Ｃｌコトランスポーターと相同性を共有する５４１１１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１００】
配列番号６９は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０９６９　ｆｉｓ、クローンＰＬＡＣＥ１０００９０９と相同性を共有する５４１２１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０１】
配列番号７０は、ＢＡＣクローン２１５Ｏ１２と相同性を共有する５４０６５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０２】
配列番号７１は、Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ（自己抗原）カルレティキュリンと相同性を共有する５４０６０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０３】
配列番号７２は、ヒトスクアレンシンテターゼと相同性を共有する５４１２５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０４】
配列番号７３は、ヒトＲＡＤ２１ホモログと相同性を共有する５４１４３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０５】
配列番号７４は、ヒトＭＨＣクラスＩＩ　ＨＬＡ−ＤＲ−αと相同性を共有する５４１３９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０６】
配列番号７５は、ヒトＣｌａｕｄｉｎ（クラウディン）−７と相同性を共有する５４１３７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０７】
配列番号７６は、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ１と相同性を共有する５４０４４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０８】
配列番号７７は、ＣＯ−０２９腫瘍関連抗原と相同性を共有する５４０４２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１０９】
配列番号７８は、ＫＩＡＡ１０７７タンパク質と相同性を共有する５４０４３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１０】
配列番号７９は、ヒトリポコルチンＩＩと相同性を共有する５４１３６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１１】
配列番号８０は、１ｑ２４染色体上のＰＡＣ　４５４Ｇ６と相同性を共有する５４１５７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１２】
配列番号８１は、５４１４０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１３】
配列番号８２は、５４１２０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１４】
配列番号８３は、ＫＩＡＡ０１５２と相同性を共有する５４１４５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１５】
配列番号８４は、腫瘍抗原Ｌ６と相同性を共有する５４１１７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１６】
配列番号８５は、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミントランスポーターと相同性を共有する５４１１６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１７】
配列番号８６は、５４１５１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１８】
配列番号８７は、システイン／グルタミン酸トランスポーターと相同性を共有する５４１５２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１１９】
配列番号８８は、５４１１５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２０】
配列番号８９は、ＧＡＰＤＨと相同性を共有する５４１４６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２１】
配列番号９０は、ｃＤＮＡ　ＤＫＦＺｐ５８６Ｏ０１１８と相同性を共有する５４１５５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２２】
配列番号９１は、５４１５９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２３】
配列番号９２は、ニュートロフィルリポカリン（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ　ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）と相同性を共有する５４０２０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２４】
配列番号９３は、核マトリックス（Ｎｕｃｌｅａｒ　ｍａｔｒｉｘ）タンパク質ＮＲＰ／Ｂと相同性を共有する５４１６９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２５】
配列番号９４は、ＣＧ１−１５１／ＫＩＡＡ０９９２タンパク質と相同性を共有する５４１６７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２６】
配列番号９５は、５４０３０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２７】
配列番号９６は、５４１６１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２８】
配列番号９７は、ポリＡ結合タンパク質と相同性を共有する５４１６２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１２９】
配列番号９８は、リボソームタンパク質Ｌ１３と相同性を共有する５４１６３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３０】
配列番号９９は、ヒトαエノラーゼと相同性を共有する５４１６４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３１】
配列番号１００は、ヒトＥ−１酵素と相同性を共有する５４１３２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３２】
配列番号１０１は、ｃＤＮＡ　ＤＫＦＺｐ５８６１２０２２と相同性を共有する５４１１２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３３】
配列番号１０２は、ヒトＺＷ１０インタラクター（ｉｎｔｅｒａｃｔｏｒ）Ｚｗｉｎｔと相同性を共有する５４１３３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３４】
配列番号１０３は、ブメタニド感受性（Ｂｕｍｅｔａｎｉｄｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ）Ｎａ−Ｋ−Ｃｌコトランスポーターと相同性を共有する５４１６５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３５】
配列番号１０４は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０５４９　ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ２００１９７６と相同性を共有する５４１５８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３６】
配列番号１０５は、ｃＤＮＡ　ＤＫＦＺｐ４３４Ｃ０５２３と相同性を共有する５４１３１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３７】
配列番号１０６は、５４１２２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３８】
配列番号１０７は、５４０９８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１３９】
配列番号１０８は、ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼＮＤＵＦＳ２サブユニットと相同性を共有する５４１７３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４０】
配列番号１０９は、ホスホリパーゼＡ２と相同性を共有する５４１０８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４１】
配列番号１１０は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０６１０　ｆｉｓ，クローンＮＴ２ＲＰ２００５２９３と相同性を共有する５４１７５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４２】
配列番号１１１は、Ｉｇ重鎖可変領域と相同性を共有する５４１７９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４３】
配列番号１１２は、プロテインホスファターゼ２Ｃγと相同性を共有する５４１７７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４４】
配列番号１１３は、サイクリンタンパク質と相同性を共有する５４１７０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４５】
配列番号１１４は、トランスゲリン２（推定）と相同性を共有する５４１７６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４６】
配列番号１１５は、ヒトＧａｌＮＡｃ−Ｔ３遺伝子と相同性を共有する５４１８０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４７】
配列番号１１６は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０８８４　ｆｉｓ、クローン　ＮＴ２ＲＰ４００１９５０と相同性を共有する５３８９７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４８】
配列番号１１７は、５４０２７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１４９】
配列番号１１８は、αトポイソメラーゼ短縮型と相同性を共有する５４１８３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５０】
配列番号１１９は、ＫＩＡＡ　１２８９と相同性を共有する５４１０７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５１】
配列番号１２０は、ＡＤ０２２タンパク質と相同性を共有する５４１０６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５２】
配列番号１２１は、５３９０２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５３】
配列番号１２２は、第１７染色体、クローンｈＲＰＫ．６９２＿Ｅ＿１８と相同性を共有する５３９１８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５４】
配列番号１２３は、５３９０４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５５】
配列番号１２４は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０８２３　ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ４００１０８０と相同性を共有する５３９１０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５６】
配列番号１２５は、ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と相同性を共有する５３９０３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５７】
配列番号１２６は、５４１０３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５８】
配列番号１２７は、チトクロムＰ４５０　ＩＩＩＡ４と相同性を共有する５３９１７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１５９】
配列番号１２８は、ＣＥＡと相同性を共有する５４００４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６０】
配列番号１２９は、プロテインホスファターゼ（ＫＡＰ１）と相同性を共有する５３９１３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６１】
配列番号１３０は、５４１３４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６２】
配列番号１３１は、αエノラーゼと相同性を共有する５３９９９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６３】
配列番号１３２は、ヒストンデアセチラーゼＨＤ１と相同性を共有する５３９３８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６４】
配列番号１３３は、ｃｉｔｂ＿３３８＿ｆ＿２４、完全配列と相同性を共有する５３９３９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６５】
配列番号１３４は、ヒトスクアレンエポキシダーゼと相同性を共有する５３９２８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６６】
配列番号１３５は、ヒトアスパルチル−ｔＲＮＡ−シンテターゼα−２サブユニットと相同性を共有する５３９１４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６７】
配列番号１３６は、γ−アクチンと相同性を共有する５３９１５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６８】
配列番号１３７は、ヒトＡＰ−μ鎖ファミリーメンバーμ１Ｂと相同性を共有する５４１０１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１６９】
配列番号１３８は、シャペロニンのヒトＣｃｔｇ　ｍＲＮＡと相同性を共有する５３９２２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７０】
配列番号１３９は、第１９染色体と相同性を共有する５４０２３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７１】
配列番号１４０は、ヒトＭＥＧＦ７と相同性を共有する５３９３０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７２】
配列番号１４１は、コネキシン２６と相同性を共有する５３９２１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７３】
配列番号１４２は、ヒトジペプチダーゼＩＶと相同性を共有する５４００２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７４】
配列番号１４３は、第５染色体クローンＣＴＣ−４３６Ｐ１８と相同性を共有する５４００３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７５】
配列番号１４４は、ヒト２−オキソグルタラートデヒドロゲナーゼと相同性を共有する５４００５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７６】
配列番号１４５は、ＲＨＯグアニンヌクレオチド−交換因子と相同性を共有する５３９２５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７７】
配列番号１４６は、１２ｑ２４ＰＡＣ　ＲＰＣｌ１−２６１Ｐ５と相同性を共有する５３９２７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７８】
配列番号１４７は、ヒト結腸粘膜関連ｍＲＮＡと相同性を共有する５４０８３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１７９】
配列番号１４８は、５３９３７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８０】
配列番号１４９は、１ｐ１１．４−２１．３染色体上のクローンＲＰ４−６２１Ｆ１８と相同性を共有する５４０７４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８１】
配列番号１５０は、５４１０５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８２】
配列番号１５１は、ヒト胚の肺タンパク質と相同性を共有する５３９６１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８３】
配列番号１５２は、５３９１９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８４】
配列番号１５３は、ヒト白血球表面タンパク質ＣＤ３１と相同性を共有する５３９３３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８５】
配列番号１５４は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１０６７９　ｆｉｓ、クローンＮＴ２ＲＰ２００６５６５と相同性を共有する５３９７２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８６】
配列番号１５５は、５３９０６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８７】
配列番号１５６は、ポリＡ結合タンパク質と相同性を共有する５３９２４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８８】
配列番号１５７は、５４１４４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１８９】
配列番号１５８は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子と相同性を共有する５４０６８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９０】
配列番号１５９は、５３９２９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９１】
配列番号１６０は、ＫＩＡＡ１０５０と相同性を共有する５３９５９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９２】
配列番号１６１は、５３９４２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９３】
配列番号１６２は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ１１１２７　ｆｉｓ，クローンＰＬＡＣＥ　１００６２２５と相同性を共有する５３９３１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９４】
配列番号１６３は、ヒトセット（ｓｅｔ）遺伝子と相同性を共有する５３９３５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９５】
配列番号１６４は、ヒトプレックストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）２と相同性を共有する５４０９９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９６】
配列番号１６５は、ＫＩＡＡ０９６５と相同性を共有する５３９４３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９７】
配列番号１６６は、Ｔｉｓ　１１ｄと相同性を共有する５４０００．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９８】
配列番号１６７は、Ｃｙｈｔｏｋｉｎｅ（サイホトカイン）（ＧＲＯ−γ）と相同性を共有する５４１００．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０１９９】
配列番号１６８は、ヒトｐ８５Ｍｃｍ　ｍＲＮＡと相同性を共有する５３９４０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２００】
配列番号１６９は、ｃＤＮＡ　ＤＫＦＺｐ５８６Ｈ０５１９と相同性を共有する５３９４１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０１】
配列番号１７０は、ＳＯＸ９と相同性を共有する５３９５３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０２】
配列番号１７１は、ＶＡＶ様タンパク質と相同性を共有する５４００７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０３】
配列番号１７２は、ＮＦ−Ｅ２関連因子３と相同性を共有する５３９５０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０４】
配列番号１７３は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ２０１２７　ｆｉｓ、クローン　ＣＯＬ０６１７６と相同性を共有する５３９６８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０５】
配列番号１７４は、５３９４５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０６】
配列番号１７５は、５４０９１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０７】
配列番号１７６は、ヒトアルギニノコハク酸シンテターゼと相同性を共有する５４０１３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０８】
配列番号１７７は、ヒトセリンキナーゼと相同性を共有する５４０９２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２０９】
配列番号１７８は、第２０染色体上のクローンＲＰ１−１５５Ｇ６と相同性を共有する５４０９５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１０】
配列番号１７９は、ヒトホスホリパーゼＣベータ４と相同性を共有する５３９８７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１１】
配列番号１８０は、５３９６７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１２】
配列番号１８１は、ＶＡＶ−３タンパク質と相同性を共有する５３９６３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１３】
配列番号１８２は、５４０３２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１４】
配列番号１８３は、ＰＡＣ　ＲＰＣＩ−１　１３３Ｇ２１　ｍａｐ　２１ｑ１１．１領域Ｄ２１Ｓ１９０と相同性を共有する５４０６７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１５】
配列番号１８４は、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００Ｐと相同性を共有する５４０５７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１６】
配列番号１８５は、ヒトロイパキシン（ｌｅｕｐａｘｉｎ）と相同性を共有する５４１３５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１７】
配列番号１８６は、ＶＡＶ−３タンパク質と相同性を共有する５３９６９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１８】
配列番号１８７は、５３９７０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２１９】
配列番号１８８は、ｈｎＲＮＰ型Ａ／Ｂタンパク質と相同性を共有する５３９６６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２０】
配列番号１８９は、ヒト細胞周期制御遺伝子ＣＤＣ２と相同性を共有する５３９９５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２１】
配列番号１９０は、５４０７５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２２】
配列番号１９１は、５４０９４．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２３】
配列番号１９２は、５３９７７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２４】
配列番号１９３は、７ｑ２１−７ｑ２２由来のＢＡＣクローンＲＧ０８３Ｍ０５と相同性を共有する５４１２３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２５】
配列番号１９４は、ヒトＳＴＳ　ＷＩ−１４６４４と相同性を共有する５３９６０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２６】
配列番号１９５は、ヒトグルタミニル−ｔＲＮＡシンテターゼと相同性を共有する５３９７６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２７】
配列番号１９６は、ヒト２６Ｓプロテアソーム関連ｐａｄ　１ホモログと相同性を共有する５４０９６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２８】
配列番号１９７は、ヒトスクアレンエポキシダーゼと相同性を共有する５４１１０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２２９】
配列番号１９８は、ヒト核塩素イオンチャネルタンパク質と相同性を共有する５３９２０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３０】
配列番号１９９は、ＰＡＣ　ＲＰＣＩ−１　１３３Ｇ２１　ｍａｐ　２１ｑ１１．１領域Ｄ２１Ｓ１９０と相同性を共有する５３９７９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３１】
配列番号２００は、７ｑ１１．２３−ｑ２１由来のＰＡＣクローンＲＰ５−１１８５Ｉ７と相同性を共有する５４０８１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３２】
配列番号２０１は、ヒトエフェリン（Ｈｕｍａｎ　ｅｐｈｒｉｎ）と相同性を共有する５４０８２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３３】
配列番号２０２は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ２０６７３　ｆｉｓ、クローンＫＡＩＡ４４６４と相同性を共有する５３９８６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３４】
配列番号２０３は、５３９９２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３５】
配列番号２０４は、５４０１６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３６】
配列番号２０５は、ＣＤ９抗原と相同性を共有する５４０１８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３７】
配列番号２０６は、ＫＩＡＡ０７１５と相同性を共有する５３９８５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３８】
配列番号２０７は、サイクリンＢと相同性を共有する５３９７３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２３９】
配列番号２０８は、ＫＩＡＡ１２２５と相同性を共有する５４０１２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４０】
配列番号２０９は、５３９８２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４１】
配列番号２１０は、結腸粘膜関連ｍＲＮＡと相同性を共有する５３９８８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４２】
配列番号２１１は、ｃＤＮＡ　ＦＬＪ２０１７１　ｆｉｓ、クローンＣＯＬ０９７６１と相同性を共有する５３９９０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４３】
配列番号２１２は、５３９９１．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４４】
配列番号２１３は、ＣＥＡと相同性を共有する５１５１９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４５】
配列番号２１４は、腺癌関連抗原と相同性を共有する５１５０７．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４６】
配列番号２１５は、分泌タンパク質ＸＡＧと相同性を共有する５１４３５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４７】
配列番号２１６は、腺癌関連抗原と相同性を共有する５１４２５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４８】
配列番号２１７は、５１５４８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２４９】
配列番号２１８は、ＣＥＡと相同性を共有する５１４３０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５０】
配列番号２１９は、ＣＥＡと相同性を共有する５１５４９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５１】
配列番号２２０は、非特異的交差反応抗原と相同性を共有する５１４３９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５２】
配列番号２２１は、好中球ゲラチナーゼ関連リポカリンと相同性を共有する５１５３５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５３】
配列番号２２２は、トランスフォーミング増殖因子（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ）β誘導性遺伝子産物と相同性を共有する５１４８６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５４】
配列番号２２３は、ＮＣＡ　ｍＲＮＡの５’側で見出された未確認起点と相同性を共有する５１４７９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５５】
配列番号２２４は、ガレクチン−４と相同性を共有する５１４６９．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５６】
配列番号２２５は、非特異的交差反応抗原と相同性を共有する５１４７０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５７】
配列番号２２６は、分泌タンパク質ＸＡＧと相同性を共有する５１５３６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５８】
配列番号２２７は、Ｘｑ２２染色体上のクローン１４６Ｈ２１と相同性を共有する５１４８３．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２５９】
配列番号２２８は、ＧＡＰＤＨと相同性を共有する５１５２２．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６０】
配列番号２２９は、Ｍｕｃｉｎ（ムチン）１１と相同性を共有する５１４８５．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６１】
配列番号２３０は、非特異的交差反応抗原と相同性を共有する５１４６０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６２】
配列番号２３１は、ＫＩＡＡ０５１７タンパク質と相同性を共有する５１４５８．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６３】
配列番号２３２は、表面糖タンパク質ＣＤ４４と相同性を共有する５１５０６．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６４】
配列番号２３３は、２１ｑ２２．１，Ｄ２１Ｓ２２６−ＡＭＬ領域と相同性を共有する５１４４０．１について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６５】
配列番号２３４は、Ｃ９０７Ｐについて決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６６】
配列番号２３５は、Ｃ９０７Ｐのアミノ酸配列である。
【０２６７】
配列番号２３６は、Ｒａｌ２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３について決定されたｃＤＮＡ配列である。
【０２６８】
配列番号２３７は、Ｒａｌ２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３のアミノ酸配列である。
【０２６９】
配列番号２３８は、ＡＷ１５４プライマーのヌクレオチド配列である。
【０２７０】
配列番号２３９は、ＡＷ１５５プライマーのヌクレオチド配列である。
【０２７１】
配列番号２４０は、ＡＷ１５６プライマーのヌクレオチド配列である。
【０２７２】
配列番号２４１は、ＡＷ１５７プライマーのヌクレオチド配列である。
【０２７３】
配列番号２４２は、ＡＷ１５８プライマーのヌクレオチド配列である。
【０２７４】
配列番号２４３は、ＡＷ１５９プライマーのヌクレオチド配列である。
【０２７５】
配列番号２４４は、Ｃ９１５Ｐについて決定された全長ｃＤＮＡ配列である。
【０２７６】
配列番号２４５は、配列番号２４４に示されたｃＤＮＡ配列によってコードされたアミノ酸配列である。
【０２７７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一般に、癌（特に、結腸癌）の治療および診断における、組成物、ならびにその使用に関する。以下でさらに記載するように、本発明の例示的な組成物としては、以下を含むがこれらに限定されない：ポリペプチド、特に免疫原性ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、抗体および他の結合因子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ならびに免疫系細胞（例えば、Ｔ細胞）。
【０２７８】
本発明の実施は、特にそれと逆であることを示さなければ、ウイルス学、免疫学、細菌学、分子生物学、および当業者の範囲である組換えＤＮＡ技術の従来の方法（これらの多くは、例示目的で以下に記載される）を使用する。このような技術は、文献によって完全に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓおよびＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ、Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【０２７９】
本明細書中で引用される、全ての刊行物、特許および特許出願は、上記または下記にかかわらず、全体が参考して本明細書によって援用される。
【０２８０】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形、「１つの（ａ、ａｎ）」、および「この、その（ｔｈｅ）」は、文脈によって明らかに他の方法で示されていない限り、複数の参照を含む。
【０２８１】
（ポリペプチド組成物）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、その従来の意味、すなわちアミノ酸の配列として使用される。これらのポリペプチドは、特定の長さの生成物に限定されず；従って、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質は、このポリペプチドの定義に含まれ、そしてこのような用語は、別段示さない限り、本明細書中で交換可能に使用され得る。この用語はまた、このポリペプチドの発現後修飾（例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化など）ならびに天然および非天然の両方の、当該分野で公知の他の改変を称さない。すなわち、この用語は、これらを排除する。ポリペプチドは、タンパク質全体でもあり、または部分配列でもあり得る。本発明の状況において特定の目的のポリペプチドは、エピトープ、すなわち、ポリペプチドの免疫原特性の実質的に原因となり、かつ免疫応答を誘起し得る抗原決定基を含むアミノ酸部分配列である。
【０２８２】
本発明の特に例示的なポリペプチドとしては、配列番号１〜２３４、２３６、および２４４のいずれか１つに示されたポリヌクレオチド配列、あるいは中度のストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１〜２３４、２３６、および２４４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする配列によってコードされるポリペプチドを含む。特定の他の例示的な本発明のポリペプチドとしては、配列番号２３５、２３７、および２４５のいずれか１つに示されるアミノ酸配列が挙げられる。
【０２８３】
本発明のポリペプチドは、これらの同定が結腸腫瘍サンプルにおけるこれらの発現の増大したレベルに少なくとも部分的に基づくことの現れとして、本明細書中で時々、結腸腫瘍タンパク質または結腸腫瘍ポリペプチドとして参照される。従って、「結腸腫瘍ポリペプチド」または「結腸腫瘍タンパク質」は、一般に本発明のポリペプチド配列、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を示し、これらは、例えば、本明細書中で提供された代表的なアッセイを使用して決定されるように、正常組織での発現レベルより、少なくとも２倍の高いレベル、および好ましくは５倍高いレベルで、試験された結腸腫瘍サンプルの、好ましくは約２０％を超える、より好ましくは約３０％を超える、そして最も好ましくは約５０％以上を超える、結腸腫瘍サンプルの実質的な部分において発現される。本発明の結腸腫瘍ポリペプチド配列は、その腫瘍細胞での増大した発現レベルに基づき、以下にさらに記載されるように、診断マーカーならびに治療標的の両方として特定の有用性を有する。
【０２８４】
特定の好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドは免疫原性であり、すなわちこれらは、結腸癌を有する患者からの抗血清および／またはＴ細胞を用いる免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＴ細胞刺激アッセイ）で検出可能に反応する。免疫原性活性についてのスクリーニングは、当業者に周知の技術を使用して実施され得る。例えば、このようなスクリーニングは、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８に記載されるスクリーニングのような方法を使用して実施され得る。１つの例示的な例において、ポリペプチドは固体支持体に固定され得、そして患者の血清と接触され得、血清中の抗体の固定されたポリペプチドへの結合を可能にする。次いで、非結合血清は除去され、そして結合した抗体は、例えば、^１２５Ｉ標識プロテインＡを用いて検出され得る。
【０２８５】
当業者に認識されるように、本明細書中で開示されるポリペプチドの免疫原性部分もまた、本発明により包含される。本明細書中で用いられる場合、「免疫原性部分」は、それ自体が、本発明の免疫原性ポリペプチドを認識するＢ細胞および／またはＴ細胞表面抗原レセプターと免疫学的に反応性である（すなわち、特異的に結合する）、本発明の免疫原性ポリペプチドのフラグメントである。免疫原性部分は、一般に、周知の技術（例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第３版、２４３−２４７（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ，１９９３）およびこの文献で引用される参考文献に要約されている技術）を用いて同定され得る。このような技術は、抗原特異的抗体、抗血清、および／またはＴ細胞株もしくはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることを包含する。本明細書中で用いられる場合、抗血清および抗体は、これらが、抗原に特異的に結合する（すなわち、これらが、ＥＬＩＳＡまたは他の免疫アッセイにおいてこのタンパク質と反応し、そして無関係のタンパク質とは検出可能に反応しない）場合に、「抗原特異的」である。このような抗血清および抗体は、本明細書中に記載されるように、そして周知技術を用いて、調製され得る。
【０２８６】
１つの好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドの免疫原性部分は、（例えば、ＥＬＩＳＡおよび／またはＴ細胞反応性アッセイにおいて）全長ポリペプチドの反応性よりも実質的に低くないレベルで、抗血清および／またはＴ細胞と反応する部分である。好ましくは、免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドの免疫原性の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは９０％より高い。いくつかの例において、対応する全長ポリペプチドよりも大きい免疫原性活性のレベルを有する（例えば、約１００％または１５０％もしくはそれより大きい免疫原性活性を有する）好ましい免疫原性部分が同定される。
【０２８７】
特定の他の実施形態において、例示的な免疫原性部分は、Ｎ末端リーダー配列および／または膜貫通ドメインが欠失されたペプチドを含み得る。他の例示的な免疫原性部分は、成熟タンパク質に対して小さなＮ末端および／またはＣ末端の欠失（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）を含む。
【０２８８】
別の実施形態において、本発明のポリペプチド組成物また、Ｔ細胞および／または本発明のポリペプチド（特に、本明細書中に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体）に対して生成された抗体と免疫学的に反応性である１つ以上のポリペプチドを含み得る。
【０２８９】
本発明の別の実施形態において、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドによりコードされる１つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるＴ細胞および／または抗体を惹起し得る、１つ以上のポリペプチドを含むポリペプチド、または本明細書中で開示されるポリヌクレオチド配列に含まれる連続的な核酸配列、またはそれらの免疫原性フラグメントもしくは改変体、あるいは中程度から高度のストリンジェンシーの条件下で１つ以上のこれらの配列にハイブリダイズする１つ以上に核酸配列が提供される。
【０２９０】
別の局面において、本発明は、本明細書中に示されるポリペプチド組成物（例えば、配列番号２３５、２３７、および２４５に示されるポリペプチド、または配列番号１〜２３４、２３６、および２４４の配列に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド）の少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、５０、または１００連続するアミノ酸またはそれ以上（全ての中間の長さを含む）を含むポリペプチドフラグメントを提供する。
【０２９１】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載されるポリペプチド組成物の改変体を提供する。一般的に本発明により包含されるポリペプチド改変体は、代表的に、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の同一性（以下に記載するように決定された）を示す。
【０２９２】
１つの好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチドと反応する抗体および／またはＴ細胞と免疫学的に反応性である。
【０２９３】
別の好ましい実施形態において、本発明により提供されるポリペプチドフラグメントおよび改変体は、本明細書中に詳細に示される全長ポリペプチド配列により示される免疫原性活性のレベルの少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％またはそれ以上の免疫原性活性のレベルを示す。
【０２９４】
ポリペプチド「改変体」は、本明細書中でこの用語が使用される場合、代表的に、本明細書中で詳細に開示されるポリペプチドと１つ以上の置換、欠失、付加、および／または挿入において異なるポリペプチドである。このような改変体は、天然に生じるか、または例えば、本発明の１つ以上の上記のポリペプチド配列を改変し、そして本明細書中に記載されるようなそれらの免疫学的活性を評価することにより、ならびに／または当該分野で周知の多くの技術のいずれかを用いて、合成的に作製され得る。
【０２９５】
例えば、本発明のポリペプチドの特定の例示的な改変体として、１つ以上の部分（例えば、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン）が除去された改変体が挙げられる。他の例示的な改変体として、小さな部分（例えば、１〜３０アミノ酸、好ましくは５〜１５アミノ酸）が成熟タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端から除去された改変体が挙げられる。
【０２９６】
多くの例において、改変体は、保存的置換を含む。「保存的置換」は、アミノ酸が類似の特性を有する別のアミノ酸で置換され、その結果、ペプチド化学の当業者がポリペプチドの二次構造および疎水的性質が実質的に変化していないことを期待するような置換である。上記のように、改変は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造においてなされ得、そしてなお所望の特性（例えば、免疫原性特性）を有する改変体または誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子を獲得し得る。本発明のポリペプチドの等価物を（または本発明のポリペプチドの改善された免疫原性の改変体もしくは部分さえも）作製するようポリペプチドのアミノ酸配列が変更されることが所望される場合、当業者は、代表的に、表１に基づくコードＤＮＡ配列の１つ以上のコドンを変更する。
【０２９７】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域または基質分子上のの結合部位のような構造を有するタンパク質構造中の他のアミノ酸に、感知可能な相互作用的結合能の損失なしで、置換され得る。タンパク質の相互作用的な能力および性質がタンパク質の生物学的機能的活性を規定するので、特定のアミノ酸配列置換は、タンパク質配列、および当然ながら、その根底にあるＤＮＡコード配列においてなされ得、そしてそれにも関わらず、同様の特性を有するタンパク質が入手される。従って、種々の変化が、ペプチドの生物学的有用性または活性の感知可能な損失を伴わずに、開示された組成物のペプチド配列またはそのペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列においてなされ得ることが意図される。
【０２９８】
【表１】

このような変化を作製する際に、アミノ酸の疎水性親水性指標が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性親水性アミノ酸指標の重要性は、一般的に当該分野において理解されている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２、本明細書中に参考として援用される）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性的性質は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、これが次に、他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）とのそのタンパク質の相互作用を規定することが受け入れられている。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている（ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、１９８２）。これらの値は以下である：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０２９９】
特定のアミノ酸が類似の疎水性親水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換され得、そしてなお類似の生物学的活性を有するタンパク質を生じる（すなわち、生物学的に機能的に等価なタンパク質をなお入手する）ことが、当該分野において公知である。このような変化を作製する際に、その疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その疎水性親水性指標が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその疎水性親水性指標が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。同様なアミノ酸の置換が、親水性に基づいて有効になされ得ることもまた、当該分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が本明細書中に参考として詳細に援用される）は、そのタンパク質の最大局所的平均親水性が、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるので、そのタンパク質の生物学的特性と相関することを言及している。
【０３００】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられた：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸は、類似の親水性の値を有する別のアミノ酸に置換され得、そしてなお、生物学的な等価物（特に、免疫学的に等価なタンパク質）を得ることが理解される。このような変化において、その親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、その親水性値が±１以内であるアミノ酸の置換が特に好ましく、そしてその親水性値が±０．５以内であるアミノ酸の置換がなおより特に好ましい。
【０３０１】
上記で概説したように、従って、アミノ酸置換は、一般的にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性（例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさ、など）に基づく。前述の種々の特徴を考慮する典型的な置換は当業者に周知であり、そして以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。
【０３０２】
さらに、任意のポリヌクレオチドが、インビボでの安定性を増加させるためにさらに改変され得る。可能性のある改変として以下が挙げられるがこれらに限定されない：５’末端および／または３’末端での隣接配列の付加；骨格におけるホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオエートまたは２’Ｏ−メチルの使用；ならびに／あるいは従来とは異なる塩基（例えば、イノシン、キューオシン、およびワイブトシン、ならびにアデニン、シチジン、グアニン、チミン、およびウリジンのアセチル、メチル、チオ、および他の修飾形態）の含有。
【０３０３】
アミノ酸置換はさらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似性に基づいて作製され得る。例えば、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸；正に荷電したアミノ酸としては、リジンおよびアルギニン；そして類似の親水性値を有する非荷電性の極性頭部を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン（スレオニン）、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化を示し得るアミノ酸の他のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。改変体はまた、またはあるいは、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、５アミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失または付加によって、ネイティブの配列とは異なる。改変体はまた（またはあるいは）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造および疎水性親水性特性に対する最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加によって、改変され得る。
【０３０４】
上記のように、ポリペプチドは、タンパク質のＮ末端にシグナル（または、リーダー）配列を含み得、これは、翻訳と同時に、または翻訳後に、そのタンパク質の転移を指向する。このポリペプチドはまた、このポリペプチドの合成、精製または同定を容易にするために、またはこのポリペプチドの固体支持体への結合を増強するために、リンカー配列または他の配列（例えば、ポリＨｉｓ）に結合体化され得る。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域に結合体化され得る。
【０３０５】
ポリペプチド配列が比較される場合、以下に記載されるように最大の一致で整列するときに２つの配列中のアミノ酸の配列が同じである場合、２つの配列は、「同一」であるといわれる。２つの配列間の比較は、代表的には、比較ウインドウによって配列を比較して、配列類似性の局所的領域を同定および比較することによって行われる。本明細書中で使用される「比較ウインドウ」とは、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０の連続する位置のセグメントをいう。ここで、配列は、２つの配列が最適に整列された後、同じ数の連続する位置の参照配列と比較され得る。
【０３０６】
比較のための配列の最適な整列は、生命情報科学ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅスート（ｓｕｉｔｅ）におけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメータを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ　第５巻，補遺３，３４５〜３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ　Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ　６２６〜６４５頁　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　第１８３巻，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ　Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ　４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ　１１：１０５；Ｓａｉｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｉ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０。
【０３０７】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ　２：４８２の部分的同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０３０８】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを使用して使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。アミノ酸配列について、スコアリングマトリクスは、累積スコアを算出するために使用され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアリングの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。
【０３０９】
好ましい１つのアプローチにおいて、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリペプチド配列の部分は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一のアミノ酸残基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列における位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０３１０】
他の例示的実施形態において、ポリペプチドは、参照ポリペプチドとして働くヒトポリペプチド（自己抗原とも名付けられる）に対して、上記のように、実質的な配列同一性を有するポリペプチドを含む異種ポリペプチドであり得るが、その異種ポリペプチドが、異なる非ヒト種から誘導される。当業者は、「自己」抗原が、しばしば、ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔリンパ球応答の劣った刺激因子であり、従って腫瘍ポリペプチドに対する効果的な免疫治療ストラテジーには、特定の自己腫瘍ポリペプチドに対する免疫寛容に打ち勝つための方法の開発が必要であることを認識する。例えば、異種（非ヒト）起源のプロスターゼ（ｐｒｏｓｔａｓｅ）タンパク質で免疫されたヒトは、ヒトタンパク質対応物（例えば、ヒト腫瘍細胞に存在するヒトプロスターゼ腫瘍タンパク質）に対する免疫応答をマウントし（高め）得る。従って、本発明は、本明細書に示される腫瘍タンパク質（例えば、配列番号２３５、２３７、および２４５に示されるポリペプチド、または配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に示されるポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド）の異種形態を精製するための方法を提供する。
【０３１１】
従って、本発明の１つの局面は、本明細書に記載されるポリペプチド組成物の異種改変体を提供する。本発明によって一般に包含されるこのような異種改変体は、代表的に、本明細書中に示されるポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の同一性を示す。
【０３１２】
さらに詳細には、本発明は、本発明の腫瘍ポリペプチドに対する免疫応答を誘導するための、本明細書に示されたヒトポリペプチドの異種形態として用いられ得るマウス、ラット、サル、ブタ、および他の非ヒトのポリペプチドに関する。
【０３１３】
他の例示的実施形態において、ポリペプチドは、本明細書中に記載の複数のポリペプチドを含むか、または本明細書に記載の少なくとも１つのポリペプチドおよび関連しない配列（例えば、公知の腫瘍タンパク質）を含む融合ポリペプチドであり得る。例えば、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ、好ましくはヒトによって認識されるＴヘルパーエピトープを提供する際に補助し得るか（免疫学的融合パートナー）、またはネイティブの組換えタンパク質より高い収量でタンパク質を発現する際に補助し得る（発現エンハンサー）。特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーおよび発現増強融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、ポリペプチドの溶解性を増加するように、またはポリペプチドが所望の細胞内コンパートメントに標的化されることを可能にするように選択され得る。なおさらなる融合パートナーとしては、親和性タグ（これは、ポリペプチドの精製を容易にする）が挙げられる。
【０３１４】
融合ポリペプチドは、一般に、標準的な技術（化学的結合体化を含む）を使用して調製され得る。好ましくは、融合ポリペプチドは、発現系において、組換えポリペプチドとして発現され、非融合ポリペプチドと比較して、増加したレベルの産生を可能にする。手短に言うと、このポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列を、別々に組立て得、そして適切な発現ベクターに連結し得る。１つのポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の３’末端は、ペプチドリンカーを用いてまたは用いずに、第２のポリペプチド成分をコードするＤＮＡ配列の５’末端に、これらの配列のリーディングフレームが同位相にあるように連結される。このことが、両方の成分ポリペプチドの生物学的活性を保持する単一の融合ポリペプチドへの翻訳を可能にする。
【０３１５】
ペプチドリンカー配列は、各ポリペプチドがその二次構造および三次構造へと折り畳まれるのを保証するために十分な距離で第一および第二のポリペプチド成分を隔てるために用いられ得る。このようなペプチドリンカー配列は、当該分野で周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質中に組み込まれる。適切なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択され得る：（１）伸長した可変コンホメーションを取る能力；（２）第一および第二のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用し得る二次構造を取ることができないこと；ならびに（３）ポリペプチドの機能的なエピトープと反応し得る疎水性または荷電した残基の無いこと。好ましいペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含む。ＴｈｒおよびＡｌａのような中性に近い他のアミノ酸もまた、リンカー配列に用いられ得る。リンカーとして有用に用いられ得るアミノ酸配列としては、Ｍａｒａｔｅａら、Ｇｅｎｅ　４０：３９−４６、１９８５；Ｍｕｒｐｈｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８３：８２５８−８２６２、１９８６；米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号に開示されるアミノ酸配列が挙げられる。リンカー配列は、一般的に１から約５０アミノ酸長であり得る。リンカー配列は、第一および第二のポリペプチドが、機能的ドメインを分離するため、および立体的な干渉を防ぐために用いられ得る非必須Ｎ末端アミノ酸領域を有する場合、必要とされない。
【０３１６】
連結されたＤＮＡ配列は、適切な転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。ＤＮＡの発現を担う調節エレメントは、第一のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’側にのみ位置する。同様に、翻訳および転写終結シグナルを終了するために必要とされる終止コドンは、第二のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の３’側にのみ存在する。
【０３１７】
融合ポリペプチドは、関連しない免疫原性タンパク質（例えば、リコール（ｒｅｃａｌｌ）応答を惹起し得る免疫原性タンパク質）と共に、本明細書中に記載されるようなポリペプチドを含み得る。このようなタンパク質の例としては、破傷風タンパク質、結核タンパク質および肝炎タンパク質が挙げられる（例えば、Ｓｔｏｕｔｅら、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３３６：８６−９１（１９９７）を参照のこと）。
【０３１８】
１つの好ましい実施形態において、免疫学的融合パートナーは、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ由来のＲａ１２フラグメントのようにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｐ．由来である。Ｒａ１２組成物、ならびに異種ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列の発現および／または免疫原性を増強する際にＲａ１２を使用するための方法は、米国特許出願６０／１５８，５８５（この開示は、本明細書中でその全体が参考として援用される）に記載されている。簡単には、Ｒａ１２は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＭＴＢ３２Ａ核酸のサブ配列であるポリヌクレオチド領域をいう。ＭＴＢ３２Ａは、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓの毒性菌株および無毒性菌株の遺伝子によってコードされる分子量３２ＫＤのセリンプロテアーゼである。ＭＴＢ３２Ａのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、記載されている（例えば、米国特許出願６０／１５８，５８５；また、Ｓｋｅｉｋｙら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎ．（１９９９）６７：３９９８〜４００７も参照のこと。これらは、本明細書中で参考として援用される）。ＭＴＢ３２Ａコード配列のＣ末端フラグメントは高いレベルで発現し、精製プロセス全体にわたって可溶性ポリペプチドとして残存する。さらに、Ｒａ１２は、これが融合される、異種免疫原性ポリペプチドの免疫原性を増強し得る。１つの好ましいＲａ１２融合ポリペプチドは、ＭＴＢ３２Ａのアミノ酸残基１９２〜３２３に対応する１４ＫＤのＣ末端フラグメントを含む。他の好ましいＲａ１２ポリヌクレオチドは、一般的に、Ｒａ１２ポリペプチドの一部をコードする少なくとも約１５個の連続するヌクレオチド、少なくとも約３０個のヌクレオチド、少なくとも６０個のヌクレオチド、少なくとも約１００個のヌクレオチド、少なくとも約２００個のヌクレオチド、または少なくとも約３００個のヌクレオチドを含む。Ｒａ１２ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、Ｒａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードする内因性配列）を含んでもよいし、このような配列の改変体を含んでもよい。Ｒａ１２ポリヌクレオチド改変体は、１以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み得、その結果、コードされた融合ポリペプチドの生物学的活性が、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドを含む融合ポリペプチドと比較して、実質的に減少していない。好ましくは、改変体は、ネイティブなＲａ１２ポリペプチドまたはその一部をコードするポリヌクレオチド配列に、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の同一性を示す。
【０３１９】
好ましい他の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、グラム陰性の細菌Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａ　Ｂの表面タンパク質である、プロテインＤ（ＷＯ　９１／１８９２６）に由来する。好ましくは、プロテインＤ誘導体は、ほぼこのタンパク質の３分の１（例えば、最初のＮ末端１００〜１１０アミノ酸）を含み、そしてプロテインＤ誘導体は、脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｅｄ）され得る。特定の好ましい実施形態において、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基は、さらなる外因性Ｔ細胞エピトープを有するポリペプチドを提供するように、そしてＥ．ｃｏｌｉ中の発現レベルを増加するように、Ｎ末端に含まれる（従って、発現エンハンサーとして機能する）。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を保証する。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造的タンパク質、ＮＳ１（血球凝集素）を含む。代表的に、Ｎ末端の８１アミノ酸が用いられるが、Ｔヘルパーエピトープを含む異なるフラグメントが使用され得る。
【０３２０】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、ＬＹＴＡとして公知のタンパク質、またはその部分（好ましくはＣ末端部分）である。ＬＹＴＡは、アミダーゼＬＹＴＡ（ＬｙｔＡ遺伝子によりコードされる；Ｇｅｎｅ　４３：２６５〜２９２，１９８６）として公知のＮ−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼを合成するＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来である。ＬＹＴＡは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶解素である。ＬＹＴＡタンパク質のＣ末端ドメインは、コリンまたはいくつかのコリンアナログ（例えば、ＤＥＡＥ）に対する親和性を担う。この性質は、融合タンパク質の発現のために有用なＥ．ｃｏｌｉ　Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために利用されてきた。アミノ末端でＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク質の精製が、記載されている（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　１０：７９５〜７９８，１９９２を参照のこと）。好ましい実施形態において、ＬＹＴＡの反復部分は、融合ポリペプチドに組み込まれ得る。反復部分は、残基１７８で開始するＣ末端領域中に見出される。特に好ましい反復部分は、残基１８８〜３０５を組み込む。
【０３２１】
なお別の例示的な実施形態は、融合ポリペプチド、およびそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここでこの融合パートナーは、米国特許第５，６３３，２３４号に記載のようにポリペプチドをエンドソーム／リソソームコンパートメントへ指向させ得る標的シグナルを含む。本発明の免疫原性ポリペプチドは、この標的シグナルと融合する場合、より効率的にＭＨＣクラスＩＩ分子と結合し、これによってこのポリペプチドに特異的なＣＤ４^＋Ｔ細胞のインビボでの増強された刺激が提供される。
【０３２２】
本発明のポリペプチドは、周知の種々の合成技術および／または組換え技術のいずれかを使用して調製される。これらの技術の後者を以下でさらに記載する。一般的に、約１５０アミノ酸よりも少ないポリペプチド、部分および他の改変体は、一般的に当業者に周知の技術を使用して、合成手段により作製され得る。例示的な１つの実施例において、このようなポリペプチドは、市販の固相技術のいずれか（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成方法）を使用して合成され、ここでアミノ酸は、成長しているアミノ酸鎖に連続的に付加される。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１４６、１９６３を参照のこと。ポリペプチドの自動化された合成のための機器が、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などの供給業者から市販されており、そして製造者の指示に従って操作され得る。
【０３２３】
一般に、本発明のポリペプチド組成物（融合ポリペプチドを含む）が単離される。「単離された」ポリペプチドは、その元来の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質またはポリペプチドは、それが天然の系中で共存する物質のいくつかまたは全てから分離されている場合、単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドはまた、精製され、例えば、少なくとも約９０％純粋、より好ましくは少なくとも約９５％純粋、そして最も好ましくは少なくとも約９９％純粋である。
【０３２４】
（ポリヌクレオチド組成物）
他の局面において、本発明は、ポリヌクレオチド組成物を提供する。用語「ＤＮＡ」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で実質的に交換可能に使用され、特定の種の全ゲノムＤＮＡを含まない単離されたＤＮＡ分子をいう。本明細書中で使用される場合、「単離された」は、ポリヌクレオチドが、他のコード配列から実質的に分離されており、そしてＤＮＡ分子が、無関係のコードＤＮＡの大部分（例えば、大きな染色体フラグメントまたは他の機能的遺伝子またはポリペプチドコード領域）を含まないことを意味する。当然のことながら、これは、もともと単離されたＤＮＡ分子をいい、後で人工的にセグメントに付加された遺伝子またはコード領域を除外しない。
【０３２５】
当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチド組成物は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現するか、または発現し得るように適応されたゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミドにコードされる配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。このようなセグメントは、自然に単離され得るか、または人の手によって合成的に改変され得る。
【０３２６】
当業者に認識されるように、本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖（コードもしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、そしてＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、ＨｎＲＮＡ分子（これはイントロンを含み、そしてＤＮＡ分子に１対１の様式で対応する）、およびｍＲＮＡ分子（これは、イントロンを含まない）を含み得る。さらなるコード配列または非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るがその必要はなく、そしてポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材料に連結され得るがその必要はない。
【０３２７】
ポリヌクレオチドは、ネイティブの配列（すなわち、本発明のポリペプチド／タンパク質、またはその部分をコードする内因性配列）を含み得るか、あるいはこのような配列の改変体または誘導体、そして好ましくは免疫原性改変体または誘導体をコードする配列を含み得る。
【０３２８】
従って、本発明の別の局面に従い、配列番号１〜２３４、２３６、および２４４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列、配列番号１〜２３４、２３６、および２４４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の相補体、ならびに配列番号１〜２３４、２３６、および２４４のいずれか１つに示されるポリヌクレオチド配列の縮重改変体のうちいくつかまたは全てを含むポリヌクレオチド組成物が提供される。特定の好ましい実施形態において、本明細書中に示されるポリヌクレオチド配列は、上記のような免疫原性ポリペプチドをコードする。
【０３２９】
他の関連する実施形態において、本発明は、本明細書中で配列番号１〜２３４、２３６、および２４４に開示される配列に実質的な同一性を有するポリヌクレオチド改変体を提供する。例えば、これらは、本明細書中で記載の方法（例えば、以下に記載のような標準的なパラメーターを使用するＢＬＡＳＴ分析）を使用して本発明のポリヌクレオチド配列と比較して、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％より高い配列同一性を含む。当業者は、これらの値が、コドンの縮重、アミノ酸類似性、リーディングフレームの位置付けなどを考慮することによって、２つのヌクレオチド配列にコードされるタンパク質の対応する同一性を決定するように、適切に調整され得ることを理解する。
【０３３０】
代表的には、ポリヌクレオチド改変体は、１つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含み、好ましくは、その結果、改変体ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの免疫原性が、本明細書中に具体的に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドに対して実質的に減少されない。用語「改変体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含することが理解されるべきである。
【０３３１】
さらなる実施形態において、本発明は、本明細書中に開示される配列の１つ以上に同一であるかまたは相補的な配列の種々の長さの連続したストレッチを含むかまたはこれからなるポリヌクレオチドフラグメントを提供する。例えば、本明細書中に開示される配列の１つ以上の、少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００または１０００以上連続したヌクレオチド、ならびにその間の全ての中間の長さの連続したヌクレオチドを含むかまたはこれからなるポリヌクレオチドが、本発明によって提供される。この状況において、「中間の長さ」が、示された値の間の任意の長さ（例えば、１６、１７、１８、１９など；２１、２２、２３など；３０、３１、３２など；５０、５１、５２、５３など；１００、１０１、１０２、１０３など；１５０、１５１、１５２、１５３など；２００〜５００；５００〜１，０００などの間の全ての整数を含む）を意味することが容易に理解される。本明細書に記載されるようなポリヌクレオチド配列は、天然の配列には見出されないさらなるヌクレオチドによって一端または両端で伸展され得る。さらなる配列は、開示された配列のいずれかの末端、または開示された配列の両端で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドから構成され得る。
【０３３２】
本発明の別の実施形態において、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列もしくはそのフラグメントまたはその相補的な配列に対して、中程度〜高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチド組成物が提供される。ハイブリダイゼーション技術は、分子生物学の当該分野において周知である。例示の目的であるが、他のポリヌクレオチドと本発明のポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを試験するために適切な中程度にストリンジェントな条件は、５×ＳＳＣ、０．５％　ＳＤＳ、１．０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中の事前洗浄；５０℃〜６０℃、５×ＳＳＣでの、一晩のハイブリダイゼーション；続いて、０．１％ＳＤＳを含有する２×、０．５×および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた、６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。当業者は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、例えば、ハイブリダイゼーション溶液の塩含量および／またはハイブリダイゼーションが実施される温度を変更することによって、容易に操作され得ることを理解する。例えば、別の実施形態において、適切な高いストリンジェントのハイブリダイゼーション条件としては、ハイブリダイゼーションの温度が、例えば、６０〜６５℃または６５〜７０℃に増大される点を除いて、上記の条件が挙げられる。
【０３３３】
特定の好ましい実施形態において、上記のポリヌクレオチド（例えば、ポリヌクレオチド改変体、フラグメント、およびハイブリダイズする配列）は、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列と免疫学的に交差反応するポリペプチドをコードする。他の好ましい実施形態において、このようなポリヌクレオチドは、本明細書中に具体的に示されるポリペプチド配列の免疫原性活性の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７０％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の免疫原性活性レベルを有するポリペプチドをコードする。
【０３３４】
本発明のポリヌクレオチド、またはそのフラグメントは、そのコード配列自体の長さに関わらず、他のＤＮＡ配列（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、さらなる制限酵素部位、マルチクローニング部位、他のコードセグメントなど）と組合わされ得、その結果、その全体の長さは、相当変化し得る。従って、ほとんどいずれの長さの核酸フラグメントをも使用し得ることが意図され、その全長は、好ましくは意図した組換えＤＮＡプロトコルにおける調製および使用の容易さによって制限される。例えば、約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対長など（全ての中間の長さを含む）の全長を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実行において有用であることが意図される。
【０３３５】
ポリヌクレオチド配列を比較する場合、２つの配列におけるヌクレオチドの配列が、以下に記載されるように最大一致について整列されるのと同じ場合に、２つの配列が「同一」であるといわれる。２つの配列の間の比較は、代表的には、配列類似性の局部領域を同定および比較するために、比較ウインドウにわたって配列を比較することによって行われる。本明細書中で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、４０〜約５０連続した位置のセグメントをいい、ここで、２つの配列が最適に整列された後に、配列は、連続した位置の同じ数の参照配列と比較され得る。
【０３３６】
比較のための配列の最適な整列は、バイオインフォマティクス（生命情報科学）ソフトウエアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ　ｓｕｉｔｅにおけるＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、デフォルトパラメーターを用いて行われ得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載のいくつかの整列スキームを統合する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　ＤＣ　Ｖｏｌ．５，補遺３，３４５−３５８頁におけるＤａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ　ｍｏｄｅｌ　ｏｆ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ　ｄｉｓｔａｎｔ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．；Ｈｅｉｎ　Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ　Ａｐｐｒｏａｃｈ　ｔｏ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ　６２６−６４５頁　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ　５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ　Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ　４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ　１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ　Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０：７２６−７３０。
【０３３７】
あるいは、比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ　２：４８２の局部同定アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５：２４４４の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化した実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって行われ得る。
【０３３８】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するために適切なアルゴリズムの１つの好ましい例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載される。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、本発明のポリヌクレオチドについての配列同一性の割合を決定するために、例えば、本明細書中に記載のパラメータを用いて使用され得る。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｆｏｍａｔｉｏｎを通して公に利用可能である。１つの例示的な例において、累積スコアは、ヌクレオチド配列について、パラメーターＭ（一致する残基の対についての報酬スコア（ｒｅｗａｒｄ　ｓｃｏｒｅｄ）；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して算出され得る。各指示におけるワードヒットの拡大は、以下の場合に停止する：累積整列スコアが、その最大到達値から量Ｘだけ低下した場合；累積スコアが、１以上の負のスコアの残基整列の累積に起因してゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に到達した場合。このＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、ワード長さ（Ｗ）１１、および期待値（Ｅ）１０をデフォルトとして、そしてＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆおよびＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８９：１０９１５を参照のこと）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【０３３９】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたる２つの最適に整列した配列を比較することによって決定され、ここで比較ウインドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２つの配列の最適な整列について２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、両方の配列で同一の核酸塩基が生じる位置の数を決定して一致する位置の数を得、この一致する位置の数を参照配列中の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で除算し、そしてこの結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。
【０３４０】
遺伝コードの縮重の結果として、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することが、当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのうちいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの用法における差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に意図される。さらに、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、１以上の変異（例えば、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換）の結果として変化する内因性遺伝子である。得られたｍＲＮＡおよびタンパク質は、変化した構造または機能を有し得るが、有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を用いて、同定され得る。
【０３４１】
従って、本発明の別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）は、本明細書中に記載のポリペプチドの免疫原性改変体および／または誘導体の調製のために使用される。このアプローチによって、ポリペプチド配列における特定の改変が、これらをコードする、基礎となるポリヌクレオチドの変異誘発を介してなされ得る。これらの技術は、例えば、ポリヌクレオチド中に１つ以上のヌクレオチド配列変化を導入することによって先の考慮の１つ以上を組み込む、配列改変体を調製および試験するための直接的なアプローチを提供する。
【０３４２】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接ヌクレオチドの使用を介して変異体の生成を可能にし、相対する欠失連結部の両側に安定な二重鎖を形成するために、十分なサイズおよび配列複雑性のプライマー配列を提供する。変異は、ポリヌクレオチド自体の特性を改善するか、変更するか、減少させるか、改変するか、さもなくば変化させるため、そして／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性または一次配列を変更するために、選択されたポリヌクレオチド配列において使用され得る。
【０３４３】
本発明の特定の実施形態において、本発明者らは、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、ポリペプチドワクチンの免疫原性）を変更するために、開示されたポリヌクレオチド配列の変異誘発を意図する。部位特異的変異誘発の技術は、当該分野に周知であり、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの両方の改変体を作製するために広範に使用される。例えば、部位特異的変異誘発は、しばしば、ＤＮＡ分子の特定部分を変更するために使用される。このような実施形態において、代表的に約１４ヌクレオチド長〜約２５ヌクレオチド長程度の長さを含むプライマーが使用され、配列の連結部の両側にある、約５残基〜約１０残基が変更される。
【０３４４】
当業者によって理解されるように、部位特異的変異誘発技術は、しばしば、一本鎖形態および二本鎖形態の両方で存在するファージベクターを使用してきた。部位特異的変異誘発において有用である代表的なベクターとしては、Ｍ１３ファージのようなベクターが挙げられる。これらのファージは、容易に商業的に入手可能であり、そしてそれらの使用は、一般的に当業者に周知である。二本鎖プラスミドもまた、目的の遺伝子をプラスミドからファージに転移する工程を除去する部位特異的変異誘発において慣用的に使用される。
【０３４５】
一般的に、本明細書に従う部位特異的変異誘発は、所望のペプチドをコードするＤＮＡ配列をその配列中に含む一本鎖ベクターを最初に入手する工程、またはこの配列を含む二本鎖ベクターの２本の鎖を融解して分ける工程によって実行される。所望の変異配列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般的に、合成的に調製される。次いで、このプライマーは、一本鎖ベクターとともにアニーリングされ、そして変異を保有する鎖の合成を完了するために、ＤＮＡ重合酵素（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ　Ｋｌｅｎｏｗフラグメント）に供される。このようにヘテロ二重鎖が形成され、ここで一方の鎖が変異を有さないもともとの配列をコードし、そして２つめの鎖は所望の変異を保有する。次いで、このヘテロ二重鎖ベクターは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質転換するために使用され、そして、変異した配列配置を保有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【０３４６】
部位特異的変異誘発を使用する、選択されたペプチドコードＤＮＡセグメントの配列改変体の調製は、潜在的に有用な種を産生する手段を提供し、そしてこれは、限定を意味するものではない。なぜなら、ペプチドの配列改変体およびそれらをコードするＤＮＡ配列を入手し得る他の方法が存在するからである。例えば、所望のペプチド配列をコードする組換えベクターは、変異誘発剤（例えば、ヒドロキシルアミン）で処理されて、配列改変体を入手し得る。これらの方法およびプロトコルに関する具体的な詳細は、Ｍａｌｏｙら、１９９４；Ｓｅｇａｌ、１９７６；ＰｒｏｋｏｐおよびＢａｊｐａｉ、１９９１；Ｋｕｂｙ、１９９４；およびＭａｎｉａｔｉｓら、１９８２（各々がその目的のために本明細書中に参考として援用される）の教示において見出され得る。
【０３４７】
本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」とは、テンプレート（鋳型）依存的プロセスおよびベクター媒介性増殖をいい、これは、その初期の濃度と比較して、特定の核酸分子の濃度の増加を生じるか、または検出可能なシグナルの濃度の増加（例えば、増幅）を生じる。本明細書中で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド特異的変異誘発手順」は、プライマー分子の鋳型依存的な伸長を含むプロセスをいうことが意図される。用語、鋳型依存的プロセスとは、新規に合成された核酸の鎖の配列は、相補的塩基対形成の周知の規則によって指示されるＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子の核酸合成をいう（例えば、Ｗａｔｓｏｎ、１９８７を参照のこと）。代表的には、ベクター媒介性の方法論は、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターへの核酸フラグメントの導入、ベクターのクローン性増幅、および増幅した核酸フラグメントの回収を包含する。このような方法論の例は、その全体が具体的に参考として本明細書中に援用される、米国特許第４，２３７，２２４号によって提供される。
【０３４８】
本発明のポリペプチド改変体の生成のための別のアプローチにおいて、米国特許第５，８３７，４５８号に記載のような、再帰的な配列組換えが使用され得る。このアプローチにおいて、組換えおよびスクリーニングまたは選択の反復性のサイクルが実施されて、例えば、増強された免疫原性活性を有する本発明の個々のポリヌクレオチド改変体を「展開させる」。
【０３４９】
本発明の他の実施形態において、本明細書中に提供されるポリヌクレオチド配列は、核酸ハイブリダイゼーションのためのプローブまたはプライマーとして、有利に使用され得る。このように、本明細書中に開示される１５ヌクレオチド長の連続配列と同じ配列か、またはこれに相補的な配列を有する、少なくとも約１５ヌクレオチド長の連続配列の配列領域を含むかあるいはこれらからなる核酸セグメントが特定の有用性を見出すことが、意図される。例えば、約２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００（全ての中間的な長さのものを含む）およびまさに全長配列までの、より長い連続した同一配列または相補的な配列がまた、特定の実施形態において使用される。
【０３５０】
このような核酸プローブが目的の配列に特異的にハイブリダイズする能力は、所定のサンプル中の相補的配列の存在を検出する際にこれらが使用されることを可能にする。しかし、他の用途（例えば、変異種プライマーまたは他の遺伝的構築物の調製の際の使用のためのプライマーを調製するための配列情報の使用）がまた意図される。
【０３５１】
１０〜１４、１５〜２０、３０、５０、または１００〜２００ヌクレオチド程度（同様に中間的な長さを含む）の連続したヌクレオチドストレッチからなる配列領域を有し、本明細書中に開示されるポリヌクレオチド配列に同一または相補的なポリヌクレオチド分子は、例えばサザンブロッティングまたはノーザンブロッティングにおける使用のためのハイブリダイゼーションプローブとして特に意図される。これは、遺伝子産物またはそのフラグメントの、多様な細胞型およびまた種々の細菌細胞の両方における分析を可能とする。フラグメントの全サイズ、ならびに相補的ストレッチのサイズは、究極的には、特定の核酸セグメントの意図される用途または適用に依存する。より小さなフラグメントは、一般にハイブリダイゼーション実施形態における用途を見出し、ここで連続した相補領域の長さが変化され得る（例えば、約１５ヌクレオチドと約１００ヌクレオチドとの間）が、検出を望む相補配列の長さに従って、より長い連続した相補ストレッチが使用され得る。
【０３５２】
約１５〜２５ヌクレオチド長のハイブリダイゼーションプローブの使用は、安定かつ選択的な二重鎖分子の形成を可能にする。しかし、１５塩基長より長いストレッチの連続した相補配列を有する分子が、ハイブリッドの安定性および選択性を増加するために一般に好ましく、それによって、得られる特異的ハイブリッド分子の質および程度が改善される。１５〜２５の連続したヌクレオチド、または望まれる場合にはより長い遺伝子相補的ストレッチを有する核酸分子を設計するのが一般には好ましい。
【０３５３】
ハイブリダイゼーションプローブは、本明細書中に開示される配列のいずれかの、任意の部分から選択され得る。必要とされることの全ては、本明細書中に記載の配列、あるいはプローブまたはプライマーとしての利用を望む場合は、約１５〜２５ヌクレオチド長から全長配列まで、および全長配列を含む配列の任意の連続した部分までを再検討することである。プローブおよびプライマー配列の選択は、種々の要因によって支配され得る。例えば、全配列の末端に向かってプライマーを使用することが望まれ得る。
【０３５４】
小さなポリヌクレオチドセグメントまたはフラグメントは、通常は自動オリゴヌクレオチド合成機を使用して行われるので、例えば化学的手段によってフラグメントを直接合成することによって、容易に調製され得る。また、フラグメントは、核酸複製技術（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号（本明細書中に参考として援用される）のＰＣＲ^ＴＭ技術）の適用によって、組換え産生のために選択配列を組換えベクターに導入することによって、および一般に分子生物学の分野の当業者に公知の他の組換えＤＮＡ技術によって、得られ得る。
【０３５５】
本発明のヌクレオチド配列は、目的の完全遺伝子または遺伝子フラグメントの相補的ストレッチを有する、二重鎖分子を選択的に形成するその能力のために使用され得る。想定される適用に依存して、代表的には、標的配列に対するプローブの選択性の種々の程度を達成するために、ハイブリダイゼーションの種々の条件を使用することが望ましい。高い選択性を必要とする適用について、代表的には、ハイブリッドを形成するための比較的ストリンジェントな条件（例えば、比較的低濃度の塩、および／または高温の条件（例えば、約５０℃〜約７０℃の温度で、約０．０２Ｍ〜約０．１５Ｍの塩の塩濃度によって提供されるような）を使用することが望ましい。このような選択条件は、存在する場合、プローブとテンプレートまたは標的鎖との間のミスマッチにわずかに許容性であり、そして関連する配列の単離のために特に適切である。
【０３５６】
当然のことながら、いくつかの適用（例えば、潜在的なテンプレートにハイブリダイズする変異体プライマー鎖を使用する、変異体の調製が望ましい場合）について、低ストリンジェント（減少したストリンジェンシー）のハイブリダイゼーション条件は、ヘテロ二重鎖を形成するために代表的に必要とされる。これらの状況において、約２０℃〜約５５℃の温度範囲で約０．１５Ｍ〜約０．９Ｍの塩の条件のような塩条件を使用することが望ましくあり得る。これによって、交差ハイブリダイズ種は、コントロールハイブリダイゼーションに関して、陽性ハイブリダイズシグナルとして容易に同定され得る。任意の場合において、ホルムアミド（これは、増加した温度と同じ様式で、ハイブリッド二重鎖を不安定化するように作用する）の増加した量の添加によって、条件がよりストリンジェントになり得ることが一般に理解される。従って、ハイブリダイゼーション条件は、容易に操作され得、従って、一般に、所望の結果に依存する最良の方法である。
【０３５７】
本発明の別の実施形態に従って、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含むポリヌクレオチド組成物が、提供される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の効果的かつ標識化インヒビターであることが実証され、疾患が、疾患に寄与するタンパク質の合成を阻害することによって処置され得る治療的なアプローチを結果的に提供する。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、よく確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ（ｐｏｌｙｇａｌａｃｔａｕｒｏｎａｓｅ）の合成およびムスカリン２型アセチルコリンレセプターは、そのそれぞれのｍＲＮＡ配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される（米国特許第５，７３９，１１９号および米国特許第５，７５９，８２９号）。さらに、アンチセンス阻害の例が、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子（ＭＤＧ１）、ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、ＳＴＫ−１、線条体ＧＡＢＡ_ＡレセプターおよびヒトＥＧＦを用いて示されている（Ｊａｓｋｕｌｓｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９８８　Ｊｕｎ　１０；２４０（４８５８）：１５４４−６；ＶａｓａｎｔｈａｋｕｍａｒおよびＡｈｍｅｄ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｏｍｍｕｎ．１９８９；１（４）：２２５−３２；Ｐｅｒｉｓら、Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ　Ｍｏｌ　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ．１９９８　Ｊｕｎ　１５；５７（２）３１０−２０；米国特許第５，８０１，１５４号；同第５，７８９，５７３号；同第５，７１８，７０９号および同第５，６１０，２８８号）。種々の異常な細胞増殖（例えば、癌）を阻害しそして処置するために使用され得る、アンチセンス構築物もまた、記載されている（米国特許第５，７４７，４７０号；同第５，５９１，３１７号および同第５，７８３，６８３号）。
【０３５８】
従って、特定の実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド配列に特異的に結合し得る任意の配列もしくはその相補体のすべてまたは一部を含む、オリゴヌクレオチド配列を提供する。１つの実施形態において、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはその誘導体を含む。別の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはその誘導体を含む。第３の実施形態において、そのオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート改変骨格を含む、改変ＤＮＡである。第４の実施形態において、そのオリゴヌクレオチド配列は、ペプチド核酸またはその誘導体を含む。各場合において、好ましい組成物は、本明細書中に開示されるポリヌクレオチドのうちの１つ以上の部分に相補的な、より好ましくは実質的に相補的な、そしてさらにより好ましくは完全に相補的な、配列領域を含む。所定の遺伝子配列に特異的なアンチセンス組成物の選択は、選択された標的配列の分析に基き、そして二次構造、Ｔ_ｍ、結合エネルギー、および相対的安定性の決定に基く。アンチセンス組成物は、二量体、ヘアピン、または宿主細胞において標的ｍＲＮＡへの特異的結合を減少または妨げる他の二次構造をそれらが形成できない相対的能力に基づいて選択され得る。ｍＲＮＡの非常に好ましい標的領域は、ＡＵＧ翻訳開始コドンの領域またはその付近の領域、およびｍＲＮＡの５’領域と実質的に相補的な配列である。これらの二次構造分析および標的部位選択の考慮は、例えば、ＯＬＩＧＯプライマー分析ソフトウェアのｖ．４および／またはＢＬＡＳＴＮ　２．０．５アルゴリズムソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９７，２５（１７）：３３８９−４０２）を使用して実施され得る。
【０３５９】
短いペプチドベクター（ＭＰＧ（２７残基）と称する）を使用するアンチセンス送達法の使用もまた意図される。このＭＰＧペプチドは、ＨＩＶ　ｇｐ４１の融合配列由来の疎水性ドメインと、ＳＶ４０　Ｔ抗原の核局在化配列由来の親水性ドメインとを含む（Ｍｏｒｒｉｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９７　Ｊｕｌ　１５；２５（１４）：２７３０−６）。このＭＰＧペプチドのいくつかの分子がアンチセンスオリゴヌクレオチドをコートし、そして比較的高効率（９０％）で１時間未満で培養哺乳動物細胞へと送達され得ることが示された。さらに、ＭＰＧとの相互作用は、ヌクレアーゼに対するそのオリゴヌクレオチドの安定性および形質膜を横切る能力の両方を強力に増加させる。
【０３６０】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書中に記載されるポリヌクレオチド組成物は、腫瘍細胞における腫瘍ポリヌクレオチドおよび本発明のタンパク質の発現を阻害するためのリボンザイム分子の設計および調製に使用される。リボザイムは、部位特異的様式で核酸を切断するＲＮＡ−タンパク質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特定の触媒ドメインを有する（ＫｉｍおよびＣｅｃｈ、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９８７　Ｄｅｃ；８４（２４）：８７８８−９２；ＦｏｒｓｔｅｒおよびＳｙｍｏｎｓ、Ｃｅｌｌ．１９８７　Ａｐｒ　２４；４９（２）２１１−２０）。例えば、多数のリボザイムが、高い程度の特異性でホスホエステル転移反応を促進し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質中の数個のホスホエステルのうちの１つだけを切断する（Ｃｅｃｈら、Ｃｅｌｌ．１９８１　Ｄｅｃ；２７（３　Ｐｔ　２）：４８７−９６；ＭｉｃｈｅｌおよびＷｅｓｔｈｏｆ、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ．１９９０　Ｄｅｃ　５；２１６（３）：５８５−６１０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−ＨｕｒｅｋおよびＳｈｕｂ、Ｎａｔｕｒｅ．１９９２　Ｍａｙ　１４；３５７（６３７４）：１７３−６）。この特異性は、この基質が、化学反応の前にリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）との特異的塩基対形成相互作用を介して結合するという要件に帰せられている。
【０３６１】
天然に存在する酵素的ＲＮＡの６つの基本的変種が、現在公知である。各々が、生理学的条件下で、トランスで、ＲＮＡホスホジエステル結合の加水分解を触媒し得る（従って、他のＲＮＡ分子を切断し得る）。一般に、酵素的核酸は、まず、標的ＲＮＡへの結合によって作用する。このような結合は、標的ＲＮＡを切断するように作用する分子の酵素的部分に近接して保持される、酵素的核酸の標的結合部分を介して生じる。従って、その酵素的核酸はまず、標的ＲＮＡを認識し、次いで相補的塩基対形成を介してその標的ＲＮＡに結合し、そして一旦正確な部位に結合すると、その標的ＲＮＡを酵素的に切断するように作用する。このような標的ＲＮＡの戦略的切断は、コードされるタンパク質を直接合成する標的ＲＮＡの能力を破壊する。酵素的核酸がそのＲＮＡ標的に結合しそして切断した後、その酵素的核酸は、別の標的を探索するためにそのＲＮＡから離れ、そして繰り返し、新しい標的に結合しそして切断し得る。
【０３６２】
リボザイムの酵素特性は、多くの技術（例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は、翻訳を阻害するために核酸標的に簡単に結合する））に対して有利である。なぜなら、治療的処置に影響を与えるのに必要であるリボザイムの濃度は、アンチセンスオリゴヌクレオチの濃度よりも低いからである。この利点は、酵素学的に作用するリボザイムの能力を反映する。従って、単一のリボザイム分子は、標的ＲＮＡの多くの分子を切断し得る。さらに、このリボザイムは、高度に選択的なインヒビターであり、この阻害の特異性は、標的ＲＮＡに結合する塩基対形成の機構に依存するだけでなく、標的ＲＮＡの切断の機構にも依存する。切断部位付近の１個のミスマッチまたは塩基置換により、リボザイムの触媒活性が完全になくなり得る。アンチセンス分子内の同様のミスマッチでは、それらの作用は妨げられない（Ｗｏｏｌｆら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９９２　Ａｕｇ　１５；８９（１６）：７３０５−９）。従って、リボザイムの作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用の特異性よりも高い。
【０３６３】
この酵素学的核酸分子は、ハンマーヘッド（ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ）モチーフ、ヘアピンモチーフ、δ型肝炎ウイルスモチーフ、Ｉ群イントロンモチーフまたはＲＮａｓｅＰ　ＲＮＡモチーフ（ＲＮＡ誘導配列に関連する）あるいはＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡモチーフに形成され得る。ハンマーヘッドモチーフの例は、Ｒｏｓｓｉら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９２　Ｓｅｐ　１１；２０（１７）：４５５９−６５に記載される。ヘアピンモチーフの例は、Ｈａｍｐｅｌら（欧州特許出願公開番号ＥＰ　０３６０２５７）、ＨａｍｐｅｌおよびＴｒｉｔｚ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９８９　Ｊｕｎ　１３；２８（１２）：４９２９−３３）、Ｈａｍｐｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１９９０　Ｊａｎ　２５；１８（２）：２９９−３０４および米国特許第５，６３１，３５９号に記載される。δ型肝炎ウイルスモチーフの例は、ＰｅｒｒｏｔｔａおよびＢｅｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９２　Ｄｅｃ　１；３１（４７）：１１８４３−５２に記載される；ＲＮａｓｅＰモチーフの例は、Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら，Ｃｅｌｌ．１９８３　Ｄｅｃ；３５（３　Ｐｔ　２）：８４９−５７に記載される；Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ＶＳ　ＲＮＡリボザイムモチーフは、Ｃｏｌｌｉｎｓ（ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｃｅｌｌ．１９９０　Ｍａｙ　１８；６１（４）：６８５−９６；ＳａｖｉｌｌｅおよびＣｏｌｌｉｎｓ，Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　Ｕ　Ｓ　Ａ．１９９１　Ｏｃｔ　１；８８（１９）：８８２６−３０；ＣｏｌｌｉｎｓおよびＯｌｉｖｅ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９３　Ｍａｒ　２３；３２（１１）：２７９５−９）に記載される；そしてＩ群イントロンの例は、米国特許第４，９８７，０７１号に記載される。本発明の酵素学的核酸分子において重要であることは、１以上の標的遺伝子ＲＮＡ領域に相補的である特定の基質結合部位を有すること、およびこの分子にＲＮＡ切断活性を付与する、基質結合部位内のヌクレオチド配列またはこの基質結合部位の周囲のヌクレオチド配列を有することだけである。従って、リボザイム構築物は、本明細書中に記載される特定のモチーフに限定する必要はない。
【０３６４】
リボザイムは、国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／２３５６９および国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に記載されるように設計され得、そして記載されるようにインビトロおよびインビボにおいて試験するために合成され得る。このようなリボザイムはまた、送達するために最適化され得る。特定の例が提供されるが、当業者は、他の種において等価なＲＮＡ標的が、必要な場合に利用され得ることを理解する。
【０３６５】
リボザイムの活性は、リボザイムの結合アームの長さを変更することにより、または血清リボヌクレアーゼによる分解を防ぐ改変（例えば、国際特許出願番号ＷＯ　９２／０７０６５；国際特許公開番号ＷＯ　９３／１５１８７；国際特許出願公開番号ＷＯ　９１／０３１６２；欧州特許出願公開番号９２１１０２９８．４；米国特許第５，３３４，７１１号、および国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／１３６８８（これには、酵素学的ＲＮＡ分子の糖部分に対して成され得る、種々の化学的修飾が記載される）を参照のこと）、細胞中でのリボザイムの有効性を増強する改変、ならびにＲＮＡの合成時間を短縮および化学的必要性を低下させるための幹（ｓｔｅｍ）ＩＩ塩基を除去して、リボザイムを化学的に合成することによって最適化され得る。
【０３６６】
Ｓｕｌｌｉｖａｎら（国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５）は、酵素学的ＲＮＡ分子の送達のための一般的な方法を記載する。リボザイムは、当業者に公知の種々の方法によって細胞に投与され得、これらには、リポソームへのカプセル化、イオン泳動法、あるいは、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセルおよび生体接着性ミクロスフィアのような他のビヒクルへの取り込みによるもの、が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの指針（指標）のために、リボザイムは、エキソビボで細胞または組織に、上記のビヒクルを使用してか、または使用せずに直接送達され得る。あるいは、ＲＮＡ／ビヒクルの組合せは、直接的な吸入、直接的な注射、またはカテーテル、注入ポンプまたはステントの使用により、局所的に送達され得る。他の送達経路としては、血管内注射、筋内注射、皮下注射または関節注射、エアロゾル吸入、経口送達（錠形態または丸薬形態）、局所送達、全身送達、眼送達、腹腔内送達および／またはくも膜下腔内送達が挙げられるが、これらに限定されない。リボザイム送達および投与のより詳細な記載は、国際特許出願公開番号ＷＯ　９４／０２５９５および国際特許出願公開番号ＷＯ　９３／２３５６９（各々は、本明細書中で参考として詳細に援用される）に提供される。
【０３６７】
高濃度のリボザイムを細胞内に蓄積する別の手段は、リボザイムコード配列をＤＮＡ発現ベクターに組み込むことである。リボザイム配列の転写は、真核生物ＲＮＡポリメラーゼＩ（ｐｏｌ　Ｉ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩ）、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ｐｏｌ　ＩＩＩ）のためのプロモーターにより駆動される。ｐｏｌ　ＩＩプロモーターまたはｐｏｌ　ＩＩＩプロモーターからの転写物は、全ての細胞内で高レベルで発現される；所定の細胞型における所定のｐｏｌ　ＩＩプロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子調節配列（エンハンサー、サイレンサーなど）の性質に依存する。原核生物のＲＮＡポリメラーゼプロモーターもまた使用され得るが、但し、原核生物ＲＮＡポリメラーゼ酵素は、適切な細胞において発現される。このようなプロモーターから発現するリボザイムは、哺乳動物細胞において機能することが示されている。このような転写ユニットは、哺乳動物細胞内への導入のための種々のベクター（プラスミドＤＮＡベクター、ウイルスＤＮＡベクター（例えば、アデノウイルスベクターまたはアデノ随伴ベクター）、またはウイルスＲＮＡベクター（例えば、レトロウイルスベクター、セムリキ森林ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター）が挙げられるがこれらに限定されない）に組み込まれ得る。
【０３６８】
本発明の別の実施形態において、ペプチド核酸（ＰＮＡ）組成物が提供される。ＰＮＡは、ＤＮＡ模倣物であり、核酸塩基は、偽ペプチド骨格に結合される（ＧｏｏｄおよびＮｉｅｌｓｅｎ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ．１９９７　７（４）４３１〜３７）。ＰＮＡは、ＲＮＡまたはＤＮＡを伝統的に使用した多くの方法において利用され得る。しばしば、ＰＮＡ配列は、対応するＲＮＡ配列またはＤＮＡ配列よりも技術的により良く機能し、そしてＲＮＡにもＤＮＡにも固有でない有用性を有する。産生方法、特徴、および使用方法を含むＰＮＡの総説は、Ｃｏｒｅｙ（Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９９７　６月；１５（６）：２２４〜９）によって提供される。このように、特定の実施形態において、ＡＣＥ　ｍＲＮＡ配列の１以上の部分に相補的であるＰＮＡ配列を調製し得、そしてこのようなＰＮＡ組成物は、ＡＣＥ−特異的ｍＲＮＡの翻訳を調節、変更、減少、または低下させるために使用され得、これにより、このようなＰＮＡ組成物が投与された宿主細胞におけるＡＣＥ活性のレベルを変更する。
【０３６９】
ＰＮＡは、ＤＮＡの正常なホスホジエステル骨格を置換する２−アミノエチル−グリシン連結を有する（Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９９１　１２月６；２５４（５０３７）：１４９７〜５００；Ｈａｎｖｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９２　１１月　２７；２５８（５０８７）：１４８１〜５；ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．１９９６　１月；４（１）：５〜２３）。この化学は、３つの重要な結果を有する。第１に、ＤＮＡまたはホスホロチオエートオリゴヌクレオチドとは対照的に、ＰＮＡは、中性の分子であり；第２に、ＰＮＡは、アキラル（立体選択的な合成を開発する必要を避ける）であり；そして第３に、ＰＮＡ合成は、標準的なＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルを、固相ペプチド合成に使用する。一方、改良型Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ法を含む他の方法が使用されている。
【０３７０】
ＰＮＡモノマーまたは既製のオリゴマーは、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）から市販されている。ＢｏｃプロトコルまたはＦｍｏｃプロトコルのいずれかによるＰＮＡの合成は、手動プロトコルまたは自動プロトコルを使用して簡単に実施される（Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．１９９５　４月；３（４）：４３７〜４５）。この手動（マニュアル）プロトコルは、それ自体で、化学的に修飾されたＰＮＡの産生または密接に関係するＰＮＡのファミリーの同時合成を導く。
【０３７１】
ペプチドの合成に関して、特定のＰＮＡ合成の成功は、選択した配列の特性に依存する。例えば、理論上、ＰＮＡは、ヌクレオチド塩基の任意の組合せを取り込み得るが、隣接するプリンの存在は、産物中に１以上の残基の欠失を導き得る。この困難性の見込みにおいて、隣接するプリンを有するＰＮＡを産生する際に、付加されているようである残基の連結を非効率的に繰り返すべきであることが示唆される。この後、ペプチド合成の間に観測されるのと類似する産物の収率および純度を提供する逆相高圧液体クロマトグラフィーによってＰＮＡを精製するべきである。
【０３７２】
所与の適用のためのＰＮＡの修飾が、固相合成の間にアミノ酸を連結することによって、または露出されたＮ末端アミンにカルボン酸基を含む化合物を付加することによって達成され得る。あるいは、ＰＮＡは、導入されたリジンまたはシステインに連結することによって合成した後に修飾され得る。ＰＮＡが修飾され得る簡便さにより、より良い溶解度または特定の機能的必要条件の最適化を容易にする。一旦合成されると、ＰＮＡおよびそれらの誘導体の同定は、質量分析法によって確認され得る。いくつかの研究が、ＰＮＡの修飾物を作製および利用した（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら、Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ．１９９５　４月；３（４）：４３７〜４５；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｊ　Ｐｅｐｔ　Ｓｃｉ．１９９５　５〜６月；１（３）１７５〜８３；Ｏｒｕｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１９９５　９月；１９（３）：４７２〜８０；Ｆｏｏｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１９９６　８月　２０；３５（３３）：１０６７３〜９；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓ．１９９５　８月　１１；２３（１５）：３００３〜８；Ｐａｒｄｒｉｄｇｅら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１９９５　６月　６；９２（１２）：５５９２〜６；Ｂｏｆｆａら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　１９９５　３月　１４；９２（６）：１９０１〜５；Ｇａｍｂａｃｏｒｔｉ−Ｐａｓｓｅｒｉｎｉら、Ｂｌｏｏｄ、１９９６　８月　１５；８８（４）：１４１１〜７；Ａｒｍｉｔａｇｅら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、１９９７　１１月　１１；９４（２３）：１２３２０〜５；Ｓｅｅｇｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９９７　９月；２３（３）：５１２〜７）。米国特許第５，７００，９２２号は、ＰＮＡ−ＤＮＡ−ＰＮＡキメラ分子および診断におけるその分子の使用、生物体におけるタンパク質の調節、ならびに治療に対して影響を受け易い状態の処置について議論する。
【０３７３】
ＰＮＡのアンチセンス結合特性を特徴づけする方法は、Ｒｏｓｅ（Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ、１９９３　１２月　１５；６５（２４）：３５４５〜９）およびＪｅｎｓｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９７　４月　２２；３６（１６）：５０７２〜７）において議論される。Ｒｏｓｅは、キャピラリーゲル電気泳動を使用して、相対的な結合速度論および化学量論を測定することで、ＰＮＡのそれらの相補的オリゴヌクレオチドに対する結合を決定する。同様のタイプの測定が、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ　技術を使用してＪｅｎｓｅｎらによって成された。
【０３７４】
記載され、そして当業者に明らかであるＰＮＡの他の適用には、ＤＮＡ鎖の侵入、アンチセンス阻害、変異分析、転写のエンハンサー、核酸の精製、転写活性遺伝子の単離、転写因子結合の阻害、ゲノムの切断、バイオセンサー、インサイチュハイブリダイゼーションなどにおける使用が挙げられる。
【０３７５】
（ポリヌクレオチドの同定、特徴づけおよび発現）
本発明のポリヌクレオチド組成物は、種々の十分に確立された技術のいずれかを使用して、同定、調製および／または操作され得る（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９、および他の類似の参考文献を参照のこと）。例えば、ポリヌクレオチドは、ｃＤＮＡのマイクロアレイを腫瘍に関連する発現（すなわち、本明細書中で提供される代表的なアッセイを使用して決定する場合、正常な組織における発現よりも、少なくとも２倍高い腫瘍での発現）についてスクリーニングすることによって、以下にさらに詳細に記載されるように、同定され得る。このようなスクリーニングは、例えば、製造者の指示に従って、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ、ＣＡ）のマイクロアレイ技術を使用して、（そして本質的にＳｃｈｅｎａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９３：１０６１４〜１０６１９，１９９６およびＨｅｌｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９４：２１５０〜２１５５，１９９７に記載されるように）、行われ得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、本明細書中に記載されるタンパク質を発現する細胞（例えば、腫瘍細胞）から調製されるｃＤＮＡから増幅され得る。
【０３７６】
多数の鋳型（テンプレート）依存性プロセスが、サンプル中に存在する目的の標的配列を増幅するために利用可能である。最もよく知られた増幅方法の１つは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ^ＴＭ）であり、これは、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号に詳細に記載され、これらの各々はその全体が本明細書中に参考として援用される。手短に言えば、ＰＣＲ^ＴＭにおいては、標的配列の向かい合った相補鎖上の領域に対して相補的な２つのプライマー配列が調製される。過剰のデオキシヌクレオシド三リン酸を、ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼ）とともに反応混合液に添加する。標的配列がサンプル中に存在する場合、プライマーはその標的に結合し、そしてポリメラーゼは、ヌクレオチドを付加することによって標的配列に沿ってプライマーを伸長させる。反応混合液の温度を上昇および下降させることによって、伸長したプライマーは、標的から解離して反応生成物を形成し、過剰のプライマーは標的および反応生成物に結合し、そしてこのプロセスが反復される。好ましくは、逆転写およびＰＣＲ^ＴＭ増幅手順が、増幅されたｍＲＮＡの量を定量するために実行され得る。ポリメラーゼ連鎖反応方法論は、当該分野で周知である。
【０３７７】
多くの他の鋳型依存性プロセスのいずれか（この多くは、ＰＣＲ^ＴＭ増幅技術のバリエーションである）は、当該分野で容易に知られており、利用可能である。例示として、いくつかのこのような方法としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲともいわれる）（例えば、欧州特許出願公開番号３２０，３０８号、米国特許第４，８８３，７５０号において記載される）；Ｑβレプリカーゼ（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８７／００８８０に記載される）；鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ　Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）および修復鎖反応（Ｒｅｐａｉｒ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＲＣＲ）が挙げられる。なお他の増幅法は、英国特許出願番号２　２０２　３２８号およびＰＣＴ国際特許出願公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８９／０１０２５において記載される。他の核酸増幅手順には、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）（ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ　８８／１０３１５）が挙げられ、これには、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）および３ＳＲが含まれる。欧州特許出願公開番号３２９，８２２は、一本鎖ＲＮＡ（「ｓｓＲＮＡ」）、ｓｓＤＮＡ、および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）をサイクル的に合成する工程を包含する核酸増殖プロセスを記載する。ＰＣＴ国際特許出願公開番号ＷＯ　８９／０６７００は、プロモーター／プライマー配列の標的一本鎖ＤＮＡ（「ｓｓＤＮＡ」）へのハイブリダイゼーションに基づく核酸配列増幅スキーム、引き続くこの配列の多くのＲＮＡコピーの転写を記載する。「ＲＡＣＥ」（Ｆｒｏｈｍａｎ、１９９０）および「片側（ｏｎｅ−ｓｉｄｅｄ）ＰＣＲ」（Ｏｈａｒａ、１９８９）のような他の増幅方法がまた、当業者に周知である。
【０３７８】
本発明のポリヌクレオチドの増幅した部分を使用して、適切なライブラリー（例えば、腫瘍ｃＤＮＡライブラリー）から周知の技術を使用して全長遺伝子を単離し得る。このような技術において、増幅に適した１以上のポリヌクレオチドプローブまたはプライマーを使用して、ライブラリー（ｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー）をスクリーニングする。好ましくは、ライブラリーはより大きな分子を含むようにサイズが選択される。ランダプライムしたライブラリー（ｒａｎｄｏｍ　ｐｒｉｍｅｄ　ｌｉｂｒａｒｙ）もまた、遺伝子の５’領域および上流領域の同定ために好ましくあり得る。ゲノムライブラリーは、イントロンを入手することおよび５’配列を伸長させることについて好ましい。
【０３７９】
ハイブリダイゼーション技術に関して、部分配列は、周知の技術を使用して標識（例えば、ニックトランスレーションまたは^３２Ｐでの末端標識）され得る。次いで、細菌ライブラリーまたはバクテリオファージライブラリーは、一般に、標識プローブと、変性した細菌コロニー（またはファージプラークを含む菌叢）を含むフィルターとをハイブリダイズすることによってスクリーニングされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。ハイブリダイズするコロニーまたはプラークを選択し、そして増殖させる。そしてそのＤＮＡをさらなる分析のために単離する。ｃＤＮＡクローンを、付加配列の量を決定するために、例えば、部分配列由来のプライマーおよびそのベクター由来のプライマーを使用するＰＣＲによって分析し得る。制限酵素地図および部分配列を作成して、１以上の重複クローンを同定し得る。次いで、標準的な技術（これは、一連の欠失クローンを作製することを包含し得る）を使用して完全配列を決定し得る。次いで、得られた重複配列を１つの連続配列中に構築し得る。周知の技術を使用して、適切なフラグメントを連結することにより全長ｃＤＮＡ分子を生成し得る。
【０３８０】
あるいは、上記のような増幅技術は、部分的なｃＤＮＡ配列から全長コード配列を得るために有用であり得る。このような増幅技術の１つは、逆（インバース）ＰＣＲである（Ｔｒｉｇｌｉａら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．１６：８１８６，１９８８を参照のこと）。この技術は、制限酵素を使用して、その遺伝子の既知の領域内にフラグメントを生成する。次いで、このフラグメントを分子内連結により環化し、そして既知の領域に由来する多岐したプライマーを用いたＰＣＲのためのテンプレート（鋳型）として使用する。代替のアプローチにおいて、部分配列に隣接した配列を、リンカー配列に対するプライマーおよび既知の領域に特異的なプライマーを使用する増幅により取り出し得る。この増幅した配列を、代表的に、同じリンカープライマーおよび既知の領域に特異的な第２のプライマーを使用する２回目の増幅に供する。既知の配列から反対方向に伸長を開始する２つのプライマーを使用するこの手順についての改変は、ＷＯ　９６／３８５９１に記載される。そのような別の技術は、「迅速なｃＤＮＡ末端の増幅」またはＲＡＣＥとして公知である。この技術は、公知配列の５’および３’である配列を同定するために、内部プライマーおよび外部プライマー（これらは、ポリＡ領域またはベクター配列にハイブリダイズする）の使用を含む。さらなる技術としては、キャプチャーＰＣＲ（Ｌａｎｇｅｒｓｔｒｏｍら，ＰＣＲ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ａｐｐｌｉｃ．１：１１１−１９，１９９１）およびウォーキングＰＣＲ（Ｐａｒｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９：３０５５−６０，１９９１）が挙げられる。増幅を利用する他の方法もまた使用して、全長ｃＤＮＡ配列を入手し得る。
【０３８１】
特定の場合において、発現配列タグ（ＥＳＴ）データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋより利用可能のもの）に提供される配列の分析により、全長ｃＤＮＡ配列を入手することが可能である。重複ＥＳＴの検索は、一般に、周知のプログラム（例えば、ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ検索）を使用して行われ得、そしてこのようなＥＳＴを使用して連続した全長配列を生成し得る。全長ＤＮＡ配列はまた、ゲノムフラグメントの分析により入手され得る。
【０３８２】
本発明の他の実施形態において、本発明のポリペプチドまたはその融合タンパク質もしくは機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列またはそのフラグメントは、適切な宿主細胞におけるポリペプチドの発現を指向するように組換えＤＮＡ分子において使用され得る。遺伝コードの固有の縮重に起因して、実質的に同じか、または機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列が産生され得、そしてこれらの配列を使用して所定のポリペプチドをクローン化し、そして発現させ得る。
【０３８３】
当業者によって理解されるように、いくつかの場合において、天然に存在しないコドンを所有するポリペプチドコードヌクレオチド配列を作製することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主または真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度を増加させるためか、または所望の特性（例えば、天然に存在する配列から生成される転写物の半減期よりも長い半減期）を有する組換えＲＮＡ転写物を産生するように選択され得る。
【０３８４】
さらに、本発明のポリヌクレオチド配列は、種々の理由（遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を変更する改変が挙げられるが、それらに限定されない）のためにポリペプチドコード配列を変更するために、当該分野において一般的に公知の方法を使用して操作され得る。例えば、無作為断片化によるＤＮＡシャッフリングならびに遺伝子フラグメントおよび合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリを使用して、ヌクレオチド配列を操作し得る。さらに、部位特異的変異誘発（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を使用して、新たな制限部位を挿入し得るか、グリコシル化パターンを改変し得るか、コドンの優先度（ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を変化させ得るか、スプライス改変体を作製し得るか、または変異の導入などを行い得る。
【０３８５】
本発明の別の実施形態において、天然の核酸配列、改変された核酸配列、または組換え核酸配列は、融合タンパク質をコードする異種配列に連結され得る。例えば、ポリペプチド活性のインヒビターについてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識され得るキメラタンパク質をコードすることが有用であり得る。融合タンパク質はまた、ポリペプチドコード配列と異種タンパク質配列との間に位置する切断部位を含むように操作され得、その結果そのポリペプチドは、切断されて、そして異種部分から精製されて取り出され得る。
【０３８６】
所望のポリペプチドをコードする配列が、当該分野において周知の化学的方法を使用して、全体または部分的に合成され得る（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｍ．Ｈ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１５〜２２３、Ｈｏｒｎ，Ｔ．ら、（１９８０）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２２５〜２３２を参照のこと）。あるいは、タンパク質自体は、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその一部を合成するための化学的方法を使用して産生され得る。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術を使用して実施され得（Ｒｏｂｅｒｇｅ，Ｊ．Ｙ．ら、（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２６９：２０２〜２０４）、そして自動化合成は、例えば、ＡＢＩ　４３１Ａ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ，Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して達成され得る。
【０３８７】
新たに合成されたペプチドは、分取用高速液体クロマトグラフィー（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ａｎｄ　Ｍｏｌｃｕｌａｒ　Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ＷＨ　Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）または当該分野において利用可能な他の同等技術により実質的に精製され得る。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定（例えば、エドマン分解手順）により確認され得る。さらに、ポリペプチドのアミノ酸配列またはその任意の部分は、直接合成の間改変されて、そして／または化学的方法を使用して、他のタンパク質もしくはその任意の部分に由来する配列と組み合わせられて、改変体ポリペプチドを産生し得る。
【０３８８】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列または機能的等価物は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含むベクター）内に挿入され得る。当業者に周知である方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列および適切な転写制御エレメントおよび翻訳制御エレメントを含む発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。そのような技術は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ．Ｎ．Ｙ．に記載される。
【０３８９】
種々の発現ベクター／宿主系が、ポリヌクレオチド配列を含み、そして発現させるように利用され得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：微生物（例えば、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌）；酵母発現ベクターで形質転換した酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染させた昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）または細菌発現ベクター（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系；あるいは動物細胞系。
【０３９０】
発現ベクター内に存在する「制御エレメント」または「調節配列」は、転写および翻訳を実行するように宿主細胞タンパク質と相互作用する、それらのベクターの非翻訳領域（エンハンサー、プロモーター、５’および３’非翻訳領域）である。そのようなエレメントは、その長さおよび特異性を変更し得る。利用されるベクター系および宿主に依存して、多数の適切な転写エレメントおよび翻訳エレメント（構成的プロモーターおよび誘導性プロモーターを含む）が使用され得る。例えば、細菌系においてクローニングする場合、誘導性プロモーター（例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ　Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）またはｐＳＰＯＲＴ１プラスミド（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーター）が使用され得る。哺乳動物細胞系において、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターが、一般的に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を生成することが必要とされる場合、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターが、適切な選択マーカーと共に有利に使用され得る。
【０３９１】
細菌系において、多数の発現ベクターのいずれかが、発現されるポリペプチドに対して意図される使用に依存して選択され得る。例えば、大量に必要とされる場合（例えば、抗体の誘導のために）、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターが使用され得る。そのようなベクターとしては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：多機能性Ｅ．ｃｏｌｉクローニングベクターおよび発現ベクター（例えば、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ここでは目的のポリペプチドをコードする配列が、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端Ｍｅｔおよびそれに引続く７残基についての配列とインフレームでベクター内に連結され得、その結果、ハイブリッドタンパク質が産生される）；ｐＩＮベクター（Ｖａｎ　Ｈｅｅｋｅ，Ｇ．およびＳ．Ｍ．Ｓｃｈｕｓｔｅｒ（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５５０３−５５０９）など。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）もまた、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、そしてグルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次に遊離のグルタチオンの存在下において溶出させることによって、溶解した細胞から容易に精製され得る。そのような系において作製されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第ＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され得、その結果、クローニングされた目的のポリペプチドが、随意にＧＳＴ部分から放出され得る。
【０３９２】
酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーター（例えば、α因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨ）を含む多数のベクターが使用され得る。概説については、Ａｕｓｕｂｅｌら、（前出）およびＧｒａｎｔら、（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照のこと。
【０３９３】
植物発現ベクターを使用する場合において、ポリペプチドをコードする配列の発現は、任意の多数のプロモーターにより駆動され得る。例えば、ウイルスプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーター）は、単独でか、またはＴＭＶに由来するωリーダー配列と組み合わせて使用され得る（Ｔａｋａｍａｔｓｕ，Ｎ．（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．６：３０７−３１１）。あるいは、植物プロモーター（例えば、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットまたは熱ショックプロモーター）を使用し得る（Ｃｏｒｕｚｚｉ，Ｇ．ら、（１９８４）ＥＭＢＯ　Ｊ．３：１６７１−１６８０；Ｂｒｏｇｌｉｅ，Ｒ．ら、（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２４：８３８−８４３；およびＷｉｎｔｅｒ，Ｊら、（１９９１）Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．１７：８５−１０５）。これらの構築物は、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞内に導入され得る。そのような技術は、多数の一般的に入手可能な概説に記載されている（例えば、Ｈｏｂｂｓ，Ｓ．またはＭｕｒｒｙ，Ｌ．Ｅ．，ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ　Ｙｅａｒｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９２）ＭｃＧｒａｗ　Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；１９１−１９６頁を参照のこと）。
【０３９４】
昆虫系はまた、目的のポリペプチドを発現させるために使用され得る。例えば、そのような１つの系において、オートグラファカリフォルニア核発汗病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＮＰＶ）は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅにおいて外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。ポリペプチドをコードする配列は、ウイルスの非必須領域内（例えば、ポリへドリン（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）遺伝子）にクローニングされ得て、ポリへドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ポリペプチドコード配列の首尾良い挿入は、ポリへドリン遺伝子を不活性化し、そしてコートタンパク質を欠損している組換えウイルスを産生する。次いで、この組換えウイルスを使用して、例えば、目的のポリペプチドが発現され得る、Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞またはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｌａｒｖａｅに感染させ得る（Ｅｎｇｅｌｈａｒｄ，Ｅ．Ｋ．ら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：３２２４−３２２７）。
【０３９５】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系が一般的に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合において、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３部からなるリーダー配列から構成されるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に連結され得る。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を使用して、感染した宿主細胞においてポリペプチドを発現し得る、生存可能ウイルスを入手し得る（Ｌｏｇａｎ，Ｊ．およびＳｈｅｎｋ，Ｔ．（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１：３６５５−３６５９）。さらに、転写エンハンサー（例えば、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサー）を使用して、哺乳動物宿主細胞における発現を増加させ得る。
【０３９６】
特定の開始シグナルはまた、目的のポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成するために使用され得る。そのようなシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が挙げられる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドンおよび上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合において、さらなる転写制御シグナルまたは翻訳制御シグナルは必要とされなくとも良い。しかし、コード配列のみ、またはその一部のみが挿入される場合、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されるべきである。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源（天然および合成の両方）に由来し得る。発現の効率は、使用される特定の細胞系に適切なエンハンサー（例えば、文献（Ｓｃｈａｒｆ，Ｄ．ら、（１９９４）Ｒｅｓｕｌｔｓ　Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ　Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１２５−１６２）に記載されるエンハンサー）の封入によって増大され得る。
【０３９７】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の様式において発現されたタンパク質をプロセシングするその能力について選択され得る。ポリペプチドのそのような改変としては、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、リピデーション（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）およびアシル化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の「プレプロ」形態を切断する翻訳後プロセシングはまた、正確な挿入、折り畳みおよび／または機能を促進させるために使用され得る。異なる宿主細胞（例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３およびＷＩ３８）（これらは、そのような翻訳後活性についての特定の細胞機構（ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）および特徴的機構（ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）を有する）は、正確な改変および外来タンパク質のプロセシングを確実にするように選択され得る。
【０３９８】
長期間の組換えタンパク質の高収率の産生のために、安定な発現が一般的に好ましい。例えば、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株が、ウイルス複製起点および／または内因性発現エレメントならびに同じかもしくは別個のベクター上の選択マーカー遺伝子を含み得る、発現ベクターを使用して形質転換され得る。そのベクターの導入後、細胞は、それらが選択培地に切換えられる前に、富化（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）培地において１〜２日間の増殖が可能とされ得る。選択マーカーの目的は、選択に対する耐性を与えることであり、そしてその存在は、導入された配列を首尾良く発現する細胞の増殖および回収を可能とする。安定に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞型に適切な組織培養技術を使用して、増殖され得る。
【０３９９】
多数の選択系を使用して、形質転換細胞株を回収し得る。これらの選択系としては、それぞれ、ｔｋ．ｓｕｐ．−細胞またはａｐｒｔ．ｓｕｐ−細胞において使用され得る、単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９７７）Ｃｅｌｌ　１１：２２３−３２）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ，Ｉ．ら、（１９９０）Ｃｅｌｌ　２２：８１７−２３）遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性、抗生物質耐性または除草剤耐性は、選択のための基礎として使用され得る；例えば、ｄｈｆｒ（これは、メトトレキセートに対する耐性を与える（Ｗｉｇｌｅｒ，Ｍ．ら、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７：３５６７−７０））；ｎｐｔ（これは、アミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を与える（Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ，Ｆ．ら、（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１−１４））；ならびにａｌｓまたはｐａｔ（これらは、それぞれ、クロルスルフロンおよびホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を与える（Ｍｕｒｒｙ、前出））。さらなる選択遺伝子が記載されている。例えば、ｔｒｐＢ（これは、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用することを可能にする）またはｈｉｓＤ（これは、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用することを可能にする）（Ｈａｒｔｍａｎ，Ｓ．Ｃ．およびＲ．Ｃ．Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：８０４７−５１）。アントシアニン、β−グルクロニダーゼおよびその基質のＧＵＳ、ならびにルシフェラーゼおよびその基質のルシフェリンのようなマーカーを用いる、可視マーカーの使用の人気が高くなっており、形質転換体を同定するためのみならず、特定のベクター系に起因し得る一過性のタンパク質発現または安定なタンパク質発現の量を定量するためにもまた広範に使用されている（Ｒｈｏｄｅｓ，Ｃ．Ａ．ら、（１９９５）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：１２１−１３１）。
【０４００】
マーカー遺伝子発現の存在／非存在は、目的の遺伝子もまた存在するということを示唆しているが、その存在および発現は、確認されることを必要とし得る。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列内に挿入される場合、配列を含む組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいは、マーカー遺伝子は、１つのプロモーターの制御下にポリペプチドコード配列と直列に配置され得る。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常、その直列遺伝子の発現も同様に示す。
【０４０１】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含み、かつ発現する宿主細胞は、当業者に公知の種々の手順によって同定され得る。これらの手順としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための、例えば、膜ベースの技術、溶液ベースの技術、またはチップベースの技術を含む、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション技術もしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション技術およびタンパク質バイオアッセイ技術またはイムノアッセイ技術。
【０４０２】
ポリヌクレオチドコード化産物に特異的なポリクローナル抗体もしくはモノクローナル抗体のいずれかを使用して、ポリヌクレオチドコード化産物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルは、当該分野において公知である。例としては、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。所定のポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応性であるモノクローナル抗体を利用する２つの部位の、モノクローナルベースのイムノアッセイが、いくつかの適用のために好まれ得るが、競合的結合アッセイもまた、利用され得る。これらのアッセイおよび他のアッセイは、とりわけＨａｍｐｔｏｎ，Ｒ．ら、（１９９０；Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，ＡＰＳ　Ｐｒｅｓｓ，Ｓｔ　Ｐａｕｌ．Ｍｉｎｎ．）およびＭａｄｄｏｘ，Ｄ．Ｅ．ら、（１９８３；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１−１２１６）に記載される。
【０４０３】
広範に種々の標識技術および結合技術は、当業者に公知であり、そして種々の核酸アッセイおよびアミノ酸アッセイにおいて使用され得る。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを作製するための手段としては、オリゴ標識（ｏｌｉｇｏｌａｂｅｌｉｎｇ）、ニックトランスレーション、末端標識または標識されたヌクレオチドを使用するＰＣＲ増幅が挙げられる。あるいは、ｍＲＮＡプローブの産生のために、配列またはその任意の部分が、ベクター内にクローニングされ得る。そのようなベクターは、当該分野において公知であり、市販されており、そして適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６）および標識されたヌクレオチドを添加することにより、ＲＮＡプローブをインビトロで合成するために使用され得る。これらの手順は、種々の市販キットを使用して実施され得る。使用され得る適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光、または色素形成剤ならびに基質、コファクター（補助因子）、インヒビター、磁気粒子などが挙げられる。
【０４０４】
目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、タンパク質の発現および細胞培養物からの回収に適した条件下において培養され得る。組換え細胞により産生されたタンパク質は、使用された配列および／またはベクターに依存して、細胞内に分泌され得るかまたは含まれ得る。当業者によって理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を介して、コードされたポリペプチドの分泌を指向するシグナル配列を含むように設計され得る。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合させ得る。そのような精製促進ドメインとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：固定された金属上での精製を可能にする金属キレート化ペプチド（例えば、ヒスチジン−トリプトファンモジュール）、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、およびＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ　Ｃｏｒｐ．，Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．）において利用されるドメイン。精製ドメインとコードされるポリペプチドとの間への、切断可能なリンカー配列（例えば、第ＸＡ因子またはエンテロキナーゼに対して特異的な配列（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．））の封入を使用して、精製を促進させ得る。そのような発現ベクターの１つは、目的のポリペプチドを含む融合タンパク質およびチオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位の前に６つのヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。ヒスチジン残基は、Ｐｏｒａｔｈ，Ｊ．ら、（１９９２、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．３：２６３−２８１）に記載されるように、ＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー）上での精製を促進する一方で、エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質から所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。融合タンパク質を含むベクターの考察は、Ｋｒｏｌｌ，Ｄ．Ｊ．ら、（１９９３；ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｏｉｌ．１２：４４１−４５３）において提供される。
【０４０５】
組換え産生方法に加えて、本発明のポリペプチドおよびそのフラグメントは、固相技術（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　Ｊ．（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４）を使用する、直接的ペプチド合成によって産生され得る。タンパク質合成は、手動技術を使用してか、または自動化によって実施され得る。自動化合成は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４３１Ａペプチド合成装置（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ）を使用して、達成され得る。あるいは、種々のフラグメントは、別々に化学的に合成されて、そして全長分子を産生するために化学的方法を使用して組み合わせられ得る。
【０４０６】
（抗体組成物、そのフラグメントおよび他の結合因子）
別の局面によると、本発明はさらに、本明細書中で開示される腫瘍ポリペプチドに対して、またはその一部の改変体または誘導体に対して免疫学的結合を示す結合因子（例えば、抗体およびその抗原結合フラグメント）を提供する。抗体、またはその抗原結合フラグメントとは、本発明のポリペプチドに対して、「特異的に結合する」こと、「免疫学的に結合する」ことを言い、そして／または、それが（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて）検出可能なレベルでそのポリペプチドと反応し、かつ類似の条件下で非関連ポリペプチドと検出可能に反応しない場合、「免疫学的に反応性」であると言う。
【０４０７】
この文脈で使用される場合、免疫学的結合は、一般に、免疫グロブリン分子と、この免疫グロブリンが特異的な抗原との間で起こるタイプの非共有結合的な相互作用をいう。免疫学的結合相互作用のの強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋ_ｄ）の観点から表現され得、ここで、より小さいＫ_ｄは、より大きな親和性を示す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して、定量され得る。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成および解離の速度を測定する工程を必要とし、ここで、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方の方向における速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。従って、両方の「会合速度定数（ｏｎ　ｒａｔｅ　ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋ_ｏｎ）および「解離速度定数（ｏｆｆ　ｒａｔｅ　ｃｏｎｓｔａｎｔ）」（Ｋ_ｏｆｆ）の両方が、濃度ならびに会合および解離の実際の速度を計算することによって決定され得る。Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメータの排除を可能にし、そして従って、解離定数Ｋ_ｄに等しい。一般的には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）　Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照のこと。
【０４０８】
抗体の「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関係する免疫グロブリン分子の部分をいう。この抗原結合部位は、重鎖（「Ｈ」）および軽鎖（「Ｌ」）のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチが、「超可変領域」といわれ、これは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知のより保存された隣接ストレッチの間に挿入される。従って、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間で、それに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列をいう。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域が、３次元空間において互いに相対的に配置されて、抗原結合表面を形成する。この抗原結合表面は、結合した抗原の３次元表面に相補的であり、そして重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」またたは「ＣＤＲ」といわれる。
【０４０９】
結合剤は、本明細書中に提供される代表的なアッセイを使用して、癌（例えば、結腸癌）を有する患者と有さない患者との間をさらに区別し得る。例えば、腫瘍タンパク質に結合する抗体または他の結合剤は、好ましくは、この疾患を有する患者の少なくとも約２０％、より好ましくは患者の少なくとも約３０％において、癌の存在を示すシグナルを生成する。あるいは、または加えて、この抗体は、癌を有さない個体の少なくとも約９０％において、この疾患の非存在を示す陰性シグナルを生成する。結合剤が、この要求を満たすか否かを決定するために、癌（標準的な臨床試験によって決定されるような）を有する患者および有さない患者からの生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿および／または腫瘍生検）が、この結合剤に結合するポリペプチドの存在について、本明細書に記載されるようにアッセイされ得る。好ましくは、疾患を有するサンプルおよび有さないサンプルの統計的に有意な数が、アッセイされる。各結合剤は、上記の基準を満足すべきである；しかし、当業者は、結合剤が、組合せて使用されて、感度を改善し得ることを認識する。
【０４１０】
上記の要求を満足する任意の薬剤は、結合剤であり得る。例えば、結合剤は、ペプチド成分を含むか含まないリボソーム、ＲＮＡ分子またはポリペプチドであり得る。好ましい実施形態において、結合剤は、抗体またはその抗原結合フラグメントである。抗体は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、調製され得る。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般に、抗体は、細胞培養技術（本明細書に記載されるようなモノクローナル抗体の生成を含む）によって、または組換え抗体の生成を可能にするために、適切な細菌細胞宿主または哺乳動物細胞宿主への抗体遺伝子のトランスフェクションを介して、生成され得る。１つの技術において、このポリペプチドを含む免疫原が、最初に、広範な種々の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジまたはヤギ）のいずれかに注射される。この工程において、本発明のポリペプチドは、改変を有さない免疫原として機能し得る。あるいは、特に、比較的短いポリペプチドについて、優れた免疫応答が、このポリペプチドがキャリアタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン）に結合される場合に、惹起され得る。この免疫原は、好ましくは、１回以上のブースト免疫を組み込む所定のスケジュールに従って、動物宿主に注射され、そしてこれらの動物が、定期的に採血される。このポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体は、次いで、例えば、適切な固体支持体に結合されたポリペプチドを使用するアフィニティークロマトグラフィーによって、このような抗血清から精製され得る。
【０４１１】
目的の抗原性ポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体が、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９，１９７６の技術およびその改善物を使用して、調製され得る。簡潔には、これらの方法は、所望の特異性（すなわち、目的のポリペプチドとの反応性）を有する抗体を生成し得る不死細胞株の調製を含む。このような細胞株は、例えば、上記のように免疫された動物から得られる脾臓細胞から生成され得る。次いで、この脾臓細胞が、例えば、骨髄腫細胞融合パートナー、好ましくは、免疫された動物と同系であるものとの融合によって不死化される。種々の融合技術が使用され得る。例えば、脾臓細胞および骨髄腫細胞は、数分間、非イオン性界面活性剤と組合され、次いで、ハイブリッド細胞の増殖は支持するが、骨髄腫細胞の増殖は支持しない選択培地に低密度でプレートされ得る。好ましい選択技術は、ＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン）選択を使用する。十分な時間の後、通常、約１〜２週間の後、ハイブリッドのコロニーが観察される。単一コロニーを選択し、そしてそれらの培養上清を、このポリペプチドに対する結合活性について試験する。高い反応性および特異性を有するハイブリドーマが好ましい。
【０４１２】
モノクローナル抗体は、増殖ハイブリドーマコロニーの上清から単離され得る。さらに、種々の技術が、収量を増加させるために使用され得、この技術は、例えば、適切な脊椎動物宿主（例えば、マウス）の腹腔へのハイブリドーマ細胞株の注入である。次いで、モノクローナル抗体が、腹水または血液から回収され得る。混入物が、従来の技術（例えば、クロマトグラフィー、ゲル濾過、沈澱、および抽出）によって抗体から除去され得る。本発明のポリペプチドは、例えば、アフィニティートクロマトグラフィー工程における精製プロセスにおいて使用され得る。
【０４１３】
抗体分子の免疫学的結合特性を示し得る抗原結合部位を含む多くの治療的に有効な分子が、当該分野で公知である。このタンパク質分解性酵素パパインは、優先的に、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメントを生じさせ、これら（「Ｆ（ａｂ）フラグメント」）のうちの２つの各々は、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合ヘテロダイマーを含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、いくつかのフラグメント（両方の抗原結合部位を含む「Ｆ（ａｂ’）_２」フラグメントを含む）を提供し得る。「Ｆｖ」フラグメントは、ＩｇＭ、および稀有な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的なタンパク質分解的切断によって生成され得る。しかし、Ｆｖフラグメントは、当該分野で公知の組換え技術を使用して、より一般的に誘導される。Ｆｖフラグメントは、非共有結合的なＶ_Ｈ：：Ｖ_Ｌヘテロダイマーを含み、このへテロダイマーは、ネイティブな抗体分子の抗原認識および結合能力のほとんどを保持する抗原結合部位を含む。Ｉｎｂａｒら（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎら（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ　１５：２７０６−２７１０；およびＥｈｒｌｉｃｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ　１９：４０９１−４０９６。
【０４１４】
単鎖Ｆｖ（「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、共有結合されたＶ_Ｈ：：Ｖ_Ｌヘテロダイマーであり、このヘテロダイマーは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたＶ_Ｈをコードする遺伝子およびＶ_Ｌをコードする遺伝子を含む遺伝子融合物から発現される。Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの自然に凝集する（化学的には分離された）ポリペプチド軽鎖および重鎖を、ｓＦｖ分子に転換するための化学構造を識別するための多くの方法が記述され、このｓＦｖは、抗原結合部位の構造に実質的に類似する３次元構造に折り畳まれる。例えば、米国特許第５，０９１，５１３号および同第５，１３２，４０５号（Ｈｕｓｔｏｎら）；ならびに米国特許第４，９４６，７７８号（Ｌａｄｎｅｒら）を参照のこと。
【０４１５】
上記分子の各々は、重鎖および軽鎖ＣＤＲセットを含み、各々は、ＣＤＲＳへの支持を提供し、そして互いに対してＣＤＲの空間的関係を規定する重鎖および軽鎖ＦＲセットの間に挿入される。本明細書中で使用される場合、用語「ＣＤＲセット」は、重鎖または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域をいう。重鎖または軽鎖のＮ末端から進んで、これらの領域は、各々、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」および「ＣＤＲ３」と表記される。従って、抗原結合部位は、６つのＣＤＲを含み、この６つのＣＤＲは、重鎖および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。単一ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書中で「分子認識ユニット」といわれる。多くの抗原−抗体複合体の結晶学的分析により、ＣＤＲのアミノ酸残基は、結合した抗原との広範な接触を形成することが立証され、ここで、最も広範な抗原接触は、重鎖ＣＤＲ３とである。従って、分子認識ユニットは、主に、抗原結合部位の特異性の原因である。
【０４１６】
本明細書中で使用される場合、用語「ＦＲセット」は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲを構成する、４つの隣接アミノ酸配列をいう。いくつかのＦＲ残基は、結合抗原と接触し得る；しかし、ＦＲは、主に、Ｖ領域を抗原結合部位、特にＣＤＲＳに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む原因である。ＦＲにおいて、特定のアミノ酸残基および特定の構造特徴が、非常に高度に保存される。この点において、全てのＶ領域配列は、約９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が、結合部位に折り畳まれる場合、このＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして表示される。正確なＣＤＲアミノ酸配列に関わらず、特定の「正準」構造に折り畳まれたＣＤＲループの形状に影響するＦＲの保存された構造領域が存在することが一般的に認識される。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体重鎖および軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関係することが知られている。
【０４１７】
非ヒト免疫ブログリン由来の抗原結合部位を含む、多くの「ヒト化」抗体分子が記載され、この抗体分子には、げっ歯類Ｖ領域およびヒト定常領域に融合されたそれらの会合ＣＤＲ（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ　３４９：２９３−２９９；Ｌｏｂｕｇｌｉｏら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：４２２０−４２２４；Ｓｈａｗら（１９８７）Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：４５３４−４５３８；およびＢｒｏｗｎら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．４７：３５７７−３５８３）、適切なヒト抗体定常ドメインとの融合の前に、ヒト支持ＦＲにグラフトされたげっ歯類ＣＤＲ（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ　３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３９：１５３４−１５３６；およびＪｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ　３２１：５２２−５２５）、ならびに組換えベニアリングされた（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｌｙ　ｖｅｎｅｅｒｅｄ）げっ歯類ＦＲによって支持されるげっ歯類ＣＤＲ（欧州特許公開番号５１９，５９６（１９９２年１２月２３日公開）を含むキメラ抗体が挙げられる。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントにおけるこれらの部分の治療的適用の持続期間および有効性を制限するげっ歯類抗ヒト抗体分子に対する所望されない免疫学的応答を最小化するように設計される。
【０４１８】
本明細書中で使用される場合、用語「ベニアリングされたＦＲ」および「組換えベニアリングされたＦＲ」は、ネイティブのＦＲポリペプチド折り畳み構造の実質的に全てを保持する抗原結合部位を含む異種分子を提供するために、例えば、げっ歯類重鎖または軽鎖のＶ領域からのＦＲ残基のヒトＦＲ残基での選択的置換をいう。ベニアリング技術は、抗原結合部位のリガンド結合特徴が、主に抗原結合表面内の重鎖および軽鎖のＣＤＲセットの構造および相対的な配置によって決定されるという理解に基づく。Ｄａｖｉｅｓら（１９９０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３。従って、抗原結合特異性は、ＣＤＲ構造、互いとのそれらの相互作用、およびＶ領域ドメインの残りとのそれらの相互作用が注意深く維持されるヒト化抗体のみにおいて保存され得る。ベニアリング技術を使用することによって、外部（例えば、溶媒がアクセス可能な）ＦＲ残基（これは、免疫系に容易に遭遇する）は、ヒト残基と選択的に置換されて、弱い免疫原性ベニアリング表面または実質的に非免疫原性のベニアリング表面のいずれかを含むハイブリッド分子を提供する。
【０４１９】
ベニアリングのプロセスは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第４版（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　Ｏｆｆｉｃｅ，１９８７）において、Ｋａｂａｔらによって編集されたヒト抗体可変ドメインについての利用可能な配列データを使用し、Ｋａｂａｔデータベースに更新され、そして他の米国および海外のアクセス可能なデータベース（核酸およびタンパク質の両方）を使用する。Ｖ領域アミノ酸の溶媒アクセス可能性は、ヒトおよびマウス抗体フラグメントについての既知の３次元構造から推定され得る。マウス抗原結合部位をベニアリングする際に２つの一般的な工程が存在する。最初に、目的の抗体分子の可変ドメインのＦＲが、上記の供給源から得られたヒト可変ドメインの対応するＦＲ配列と比較される。次いで、最も相同的なヒトＶ領域が、対応するマウスアミノ酸と、残基ごとに比較される。ヒト対応物とは異なるマウスＦＲにおける残基は、当該分野において周知の組換え技術を使用して、ヒト部分に存在する残基によって置換される。残基スイッチングは、少なくとも部分的に露出した（溶媒アクセス可能である）部分を用いて実施されるのみであり、そしてＶ領域ドメインの三次構造に対する有意な効果を有し得るアミノ酸残基（例えば、プロリン、グリシンおよび荷電したアミノ酸）の置換において、注意がなされる。
【０４２０】
この様式において、得られた「ベニアリングされた」マウス抗原結合部位は、従って、マウスＣＤＲ残基、ＣＤＲに実質的に隣接する残基、埋没したかほとんど埋没した（溶媒のアクセスが不可能）として同定された残基、重鎖ドメインと軽鎖ドメインとの間の非共有結合的な（例えば、静電的および疎水的）接触に関係すると考えられる残基、およびＣＤＲループの「正準」三次構造に影響を与えると考えられるＦＲの保存された構造領域からの残基を保持するように設計される。次いで、これらの設計基準は、ヒト様ＦＲへのマウス抗原結合部位の軽鎖および重鎖の両方のＣＤＲを組合せる組換えヌクレオチド配列を調製するために使用され、このヒト様ＦＲは、マウス抗体分子の抗原特異性を示す組換えヒト抗体の発現のために哺乳動物細胞をトランスフェクトするために使用され得る。
【０４２１】
本発明の別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、１つ以上の治療剤に結合され得る。この点に関して、適切な薬剤としては、放射性核種、分化インデューサー、薬物、毒素、およびそれの誘導体が挙げられる。好ましい放射性核種としては、^９０Ｙ、^１２３Ｉ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、^１８６Ｒｅ、^１８８Ｒｅ、^２１１Ａｔおよび^２１２Ｂｉが挙げられる。好ましい薬物としては、メトトレキサート、ならびにピリミジンおよびプリンアナログが挙げられる。好ましい分化インデューサーとしては、ホルボールエステルおよび酪酸が挙げられる。好ましい毒素としては、リシン、アブリン、ジフテリア毒素、コレラ毒素、ゲロニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、Ｓｈｉｇｅｌｌａ毒素、およびアメリカヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質が挙げられる。
【０４２２】
治療剤は、適切なモノクローナル抗体に直接的または間接的に（例えば、リンカー基を介して）のいずれかで結合（例えば、共有結合）され得る。薬剤と抗体との間の直接的な反応は、各々が他のものと反応し得る置換基を有する場合に可能である。例えば、一方の上の求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基）は、他方のカルボニル含有基（例えば、酸無水物または酸ハロゲン化物）または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含むアルキル基と反応し得る。
【０４２３】
あるいは、リンカー基を介して治療剤と抗体とを結合させることが所望され得る。リンカー基は、結合の可能性を妨げることを回避するために、抗体を薬剤から隔てるためのスペーサーとして機能し得る。リンカー基はまた、薬剤または抗体上の置換基の化学的反応性を増加させるためにはたらき得、従って結合効率を増大させる。化学的反応性の増大はまた、薬剤または薬剤上の官能基の使用を促進し得る（さもなければ、可能ではない）。
【０４２４】
種々の二官能性または多官能性試薬、ホモ官能性とヘテロ官能性との両方（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬのカタログ中に記載されるもの）が、リンカー基として使用され得ることが当業者には明らかである。結合は、例えば、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、または酸化された炭水化物残基を介してもたらされ得る。このような方法論を記載する多数の参考文献（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらに対する米国特許第４，６７１，９５８号）が存在する。
【０４２５】
本発明の免疫結合体の抗体部分がないときに治療剤がより強力である場合、細胞中へのインターナリゼーションの間に、またはその際に切断可能なリンカー基を使用することが望ましくあり得る。多数の異なる切断可能なリンカー基が記載されている。これらのリンカー基からの薬剤の細胞内放出についての機構は、ジスルフィド結合の還元（例えば、Ｓｐｉｔｌｅｒへの米国特許第４，４８９，７１０号）、感光性結合の照射（例えば、Ｓｅｎｔｅｒらへの米国特許第４，６２５，０１４号）、誘導体化されたアミノ酸側鎖の加水分解（例えば、Ｋｏｈｎらへの米国特許第４，６３８，０４５号）、血清補体媒介性加水分解（例えば、Ｒｏｄｗｅｌｌらへの米国特許第４，６７１，９５８号）、および酸触媒加水分解（例えば、Ｂｌａｔｔｌｅｒらへの米国特許第４，５６９，７８９号）による切断を含む。
【０４２６】
１つより多い薬剤を抗体に結合させることが望ましくあり得る。１つの実施形態において、薬剤の複数の分子が１つの抗体分子に結合される。別の実施形態において、１つより多い型の薬剤が１つの抗体に結合され得る。特定の実施形態に関わらず、１つより多い薬剤を有する免疫結合体は、種々の方法で調製され得る。例えば、１つより多い薬剤が、抗体分子に直接的に結合され得るか、または付着のための複数の部位を提供するリンカーが使用され得る。あるいは、キャリアが使用され得る。
【０４２７】
キャリアは、種々の方法（直接的にかまたはリンカー基を介するかのいずれかの共有結合を含む）で薬剤を保有し得る。適切なキャリアとしては、アルブミンのようなタンパク質（例えば、Ｋａｔｏらへの米国特許第４，５０７，２３４号）、ペプチド、およびアミノデキストランのような多糖類（例えば、Ｓｈｉｈらへの米国特許第４，６９９，７８４号）が挙げられる。キャリアはまた、例えばリポソーム小胞内に、非共有結合によってかまたはカプセル化によって、薬剤を保有し得る（例えば、米国特許第４，４２９，００８号および同第４，８７３、０８８号）。放射性核種薬剤に特異的なキャリアは、放射性ハロゲン化低分子およびキレート化合物を含む。例えば、米国特許第４，７３５，７９２号は、代表的な放射性ハロゲン化低分子およびそれらの合成を開示する。放射性核種キレートは、金属、または金属酸化物、放射性核種を結合するためのドナー原子として窒素原子および硫黄原子を含むものを含む、キレート化合物から形成され得る。例えば、Ｄａｖｉｓｏｎらへの米国特許第４，６７３，５６２号は、代表的なキレート化合物およびそれらの合成を開示する。
【０４２８】
（Ｔ細胞組成物）
別の局面において、本発明は、本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞、または本明細書中に開示される腫瘍ポリペプチドの改変体もしくは誘導体に特異的なＴ細胞を提供する。このような細胞は、一般的に標準的手順を使用して、インビトロまたはエキソビボで調製され得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システム（例えば、Ｉｓｏｌｅｘ^ＴＭシステム（Ｎｅｘｅｌｌ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ；米国特許第５，２４０，８５６号；米国特許第５，２１５，９２６号；ＷＯ８９／０６２８０；ＷＯ９１／１６１１６およびＷＯ９２／０７２４３もまた参照のこと）から入手可能）を使用して、患者の骨髄、末梢血あるいは骨髄または末梢血の画分中から単離され得る。あるいは、Ｔ細胞は、関連または無関連のヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物から誘導され得る。
【０４２９】
Ｔ細胞は、ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはそのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）を用いて刺激され得る。このような刺激は、目的のポリペプチドに特異的であるＴ細胞の生成を可能にする条件下および十分な時間、行われる。好ましくは、本発明の腫瘍ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、送達ビヒクル（例えば、ミクロスフェア）中に存在して、特定のＴ細胞の生成を容易にする。
【０４３０】
Ｔ細胞は、このＴ細胞が、特異的に増殖するか、サイトカインを分泌するか、または本発明のポリペプチドで被覆されるか、もしくはこのポリペプチドをコードする遺伝子を発現する標的細胞を殺傷する場合に、本発明のポリペプチドに特異的であるとみなされる。Ｔ細胞特異性は、種々の標準的技術のいずれかを使用して評価され得る。例えば、クロム放出アッセイまたは増殖アッセイにおいて、ネガティブコントロールと比較して、溶解および／または増殖における２倍を超える増加の刺激指標は、Ｔ細胞特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Ｃｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ．５４：１０６５−１０７０，１９９４に記載されるように、実行され得る。あるいは、Ｔ細胞の増殖の検出は、種々の公知の技術によって達成され得る。例えば、Ｔ細胞増殖は、ＤＮＡ合成の速度の増加を測定することによって検出され得る（例えば、トリチウム化チミジンでＴ細胞の培養物をパルス標識し、そしてＤＮＡに取り込まれたトリチウム化チミジンの量を測定することによって）。３〜７日間の腫瘍ポリペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌ、好ましくは、２００ｎｇ／ｍｌ〜２５μｇ／ｍｌ）との接触は、代表的に、Ｔ細胞の増殖において少なくとも２倍の増加を生じる。２〜３時間の上記のような接触は、標準的なサイトカインアッセイを使用して測定されるように（ここで、サイトカイン（例えば、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ）放出のレベルの２倍の増加が、Ｔ細胞の活性化を示す）、Ｔ細胞の活性化を生じるはずである（Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第１巻、Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（Ｇｒｅｅｎｅ　１９９８）を参照のこと）。腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現ＡＰＣに応答して活性化されたＴ細胞は、ＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋であり得る。腫瘍ポリペプチド特異的Ｔ細胞は、標準的な技術を使用して拡大され得る。好ましい実施形態において、Ｔ細胞は、患者、関連するドナーまたは無関連のドナーに由来し、そして刺激および拡大後にその患者に投与される。
【０４３１】
治療目的で、腫瘍ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはＡＰＣに応答して増殖するＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボのいずれかで大量に拡大され得る。このようなＴ細胞のインビトロでの増殖は、種々の方法で達成され得る。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞増殖因子（例えば、インターロイキン−２）の添加を伴うか、または伴わずに、腫瘍ポリペプチド、またはこのようなポリペプチドの免疫原性部分に対応する短いペプチドに対して再曝露され得、そして／または腫瘍ポリペプチドを合成する刺激細胞に対して再曝露され得る。あるいは、腫瘍ポリペプチドの存在下で増殖する１つ以上のＴ細胞は、クローニングによって数の上で拡大され得る。細胞をクローニングするための方法は、当該分野で周知であり、そしてこれらとしては、限界希釈が挙げられる。
【０４３２】
（Ｔ細胞レセプター組成物）
Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ジスルフィド結合によって連結されている、２つの異なる、非常に可変性のポリペプチド鎖（Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖と呼ばれる）からなる（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、１４８〜１５９．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。このα／βヘテロダイマー（異種二量体）は、細胞膜で不変のＣＤ３鎖と複合体化する。この複合体は、ＭＨＣ分子に結合した特定の抗原性ペプチドを認識する。ＴＣＲ特異性の膨大な多様性は、体細胞遺伝子再配列により、まるで免疫グロブリンの多様性のように生成される。このβ鎖遺伝子は、５０を超える可変性領域（Ｖ）、２つの多様性領域（Ｄ）、１０を超える連結セグメント（Ｊ）、および２つの定常領域セグメント（Ｃ）を含む。α鎖遺伝子は、７０を超えるＶセグメント、および６０を超えるＪセグメントを含むが、Ｄセグメントを含まず、そして１つのＣセグメントを含む。胸腺におけるＴ細胞発達の間、β鎖のＤ〜Ｊ遺伝子再配列が生じ、続いて、Ｖ遺伝子セグメントのＤＪへの再配列が生じる。この機能的ＶＤＪ_βエキソンは、転写され、そしてスプライシングされてＣ_βに連結される。α鎖に関しては、Ｖ_α遺伝子セグメントは、Ｊ_α遺伝子セグメントに再配列して、機能的エキソンを形成し、これが次に転写され、Ｃ_αにスプライシングされてる。多様性は、さらにβ鎖のＶセグメントと、Ｄセグメントと、Ｊセグメントとの間、そしてα鎖のＶセグメントと、Ｊセグメントとの間のＰおよびＮ−ヌクレオチドの無作為な付加によって、組み換えプロセスの間にさらに増大する（Ｊａｎｅｗａｙ，Ｔｒａｖｅｒｓ，Ｗａｌｐｏｒｔ．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．第４版、９８および１５０．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｌｔｄ／Ｇａｒｌａｎｄ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．１９９９）。
【０４３３】
本発明は、別の局面において、本明細書に開示の結腸腫瘍ポリペプチド、またはその改変体もしくは誘導体に特異的なＴＣＲを提供する。本発明に従って、本明細書に記載の腫瘍ポリペプチドを認識する、Ｔ細胞レセプターのα鎖およびβ鎖について、Ｖ−ＪもしくはＶ−Ｄ−Ｊ接合領域、またはその部分について、ポリヌクレオチドおよびアミノ酸の配列が提供される。一般に、本発明のこの局面は、ＭＨＣの文脈において提示される腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合するＴ細胞レセプターに関する。好ましい実施形態において、Ｔ細胞レセプターによって認識される腫瘍抗原は、本発明のポリペプチドを含む。例えば、結腸腫瘍ペプチドに特異的なＴＣＲをコードするｃＤＮＡは、標準的な分子生物学技術および組み換えＤＮＡ技術を用いて、腫瘍ポリペプチドに特異的なＴ細胞から単離され得る。
【０４３４】
本発明はさらに、腫瘍ポリペプチドを認識するか、またはそれに結合する、本発明のＴ細胞レセプターと実質的に同じ機能または活性を有する、Ｔ細胞レセプターまたはそのアナログを包含する。このようなレセプターとしては、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターの、レセプターフラグメント、または本明細書に提供されるＴ細胞レセプターの、置換、付加、もしくは欠失の変異体が挙げられるがこれらに限定されない。本発明はまた、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターに実質的に相同であるか、または実質的に同じ活性を保持する、ポリペプチドまたはペプチドを包含する。用語「アナログ」とは、本明細書に提供されるＴ細胞レセプターと実質的に同一のアミノ酸残基配列（ここで、１つ以上の残基、好ましくは５残基以下、より好ましくは、２５残基以下が、機能的に類似の残基で保存的に置換されている）を有し、そして本明細書に記載のようなＴ細胞レセプターの機能的局面を示す、任意のタンパク質またはポリペプチドを含む。
【０４３５】
本発明はさらに、適切な哺乳動物宿主細胞であって、本明細書に記載のポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされている（これによって、この宿主細胞はこのポリペプチドに特異的にされる）、適切な哺乳動物宿主細胞、例えば、非特異的Ｔ細胞を提供する。ＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、別々の発現ベクターに含まれ得るか、または単一の発現ベクター（これはまた、リボソーム内侵入部位（ＩＲＥＳ）の下流の遺伝子のｃａｐ依存性翻訳のためのＩＲＥＳを含む）に含まれ得る。このポリペプチドに特異的なＴＣＲを発現するこの宿主細胞は、例えば、以下にさらに考察されるような結腸癌の養子免疫療法のために、用いられ得る。
【０４３６】
本発明のさらなる局面において、本明細書に挙げたポリペプチドに特異的なクローニングされたＴＣＲは、結腸癌の診断のためのキットに用いられ得る。例えば、結腸腫瘍特異的ＴＣＲの核酸配列またはその一部は、生物学的サンプル中で、特定のＴＣＲをコードする再配列された遺伝子の発現を検出するためのプローブまたはプライマーとして用いられ得る。従って、本発明はさらに、ポリペプチドに特異的なＴＣＲをコードするメッセンジャーＲＮＡまたはＤＮＡを検出するためのアッセイを提供する。
【０４３７】
（薬学的組成物）
さらなる実施形態において、本発明は、細胞または動物への投与のための、単独でかまたは治療の１つ以上の他の様相と組合わせてかのいずれかでの、薬学的に受容可能なキャリア中の本明細書中に開示される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、Ｔ細胞ＴＣＲおよび／または抗体組成物の処方物に関する。
【０４３８】
所望される場合、本明細書中に開示される組成物が、他の薬剤（例えば、他のタンパク質もしくはポリペプチドまたは種々の薬学的に活性な薬剤など）と組合わせても同様に投与され得ることが、理解される。事実、さらなる薬剤が標的細胞または宿主細胞と接触した際に有意な有害な影響をもたらさないとすれば、さらに含まれ得る他の成分に実質的に制限はない。従って、この組成物は、特定の例において必要とされる種々の他の薬剤と共に送達され得る。このような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、あるいは、本明細書中に記載されるように化学的合成され得る。同様に、このような組成物はさらに、置換または誘導体化されたＲＮＡ組成物またはＤＮＡ組成物を含み得る。
【０４３９】
従って、本発明の別の局面において、生理学的に受容可能なキャリアと組合わせた、本明細書中に記載される１つ以上のポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体ＴＣＲ、および／またはＴ細胞組成物を含む薬学的組成物が、提供される。特定の好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、予防ワクチン適用および治療ワクチン適用における使用のための、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド組成物および／または免疫原性ポリペプチド組成物を含む。ワクチン調製物は、一般的に、例えば、Ｍ．Ｆ．ＰｏｗｅｌｌおよびＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、「Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｄｅｓｉｇｎ（ｔｈｅ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ａｎｄ　ａｄｊｕｖａｎｔ　ａｐｐｒｏａｃｈ）」、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ（ＮＹ，１９９５）に記載される。一般的にこのような組成物は、１つ以上の免疫刺激剤と組合わせた、本発明のポリヌクレオチド組成物および／またはポリペプチド組成物の１つ以上を含む。
【０４４０】
本明細書中に記載される任意の薬学的組成物が、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの薬学的に受容可能な塩を含み得ることは、明らかである。このような塩は、例えば、薬学的に受容可能な非毒性の塩基（有機塩基（例えば、一級アミン、二級アミンおよび三級アミンならびに塩基性アミノ酸の塩）および無機塩基（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩）を含む）から調製され得る。
【０４４１】
別の実施形態において、本発明の例示的な免疫原性組成物（例えば、ワクチン組成物）は、上記のようなポリペプチドの１つ以上をコードするＤＮＡを含み、その結果このポリペプチドは、インサイチュで生成される。上記のように、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の種々の送達系の内のいずれかで投与され得る。実際、多数の遺伝子送達技術（例えば、Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒａｐ．Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　１５：１４３−１９８，１９９８およびこの中に引用される参考文献に記載される遺伝子送達技術）が、当該分野で周知である。当然、適切なポリヌクレオチド発現系は、患者における発現のための必要な調節性のＤＮＡ調節配列（例えば、適切なプロモーターおよび終結シグナル）を含む。あるいは、細菌送達系は、その細胞表面上にポリペプチドの免疫原性部分を発現するか、またはエピトープなどを分泌する細菌（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ−Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｒｉｎ）の投与を含み得る。
【０４４２】
従って、特定の実施形態において、本明細書中に記載される免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、多数の公知のウイルスに基づく系のうちのいずれかを用いて、発現のための適切な哺乳動物宿主細胞に導入される。１つの例示的な実施形態において、レトロウイルスが、遺伝子送達系のための簡便かつ有効な基盤を提供する。本発明のポリペプチドをコードする選択されたヌクレオチド配列は、当該分野で公知の技術を用いて、ベクターに挿入され得、そしてレトロウイルス粒子にパッケージングされ得る。次いで、組換えウイルスが、単離され、そして被験体に送達され得る。多数の例示的なレトロウイルス系が、記載されている（例えば、米国特許第５，２１９，７４０号；ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｓｍａｎ（１９８９）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：９８０−９９０；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５−１４；Ｓｃａｒｐａら（１９９１）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１８０：８４９−８５２；Ｂｕｒｎｓら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：８０３３−８０３７；ならびにＢｏｒｉｓ−ＬａｗｒｉｅおよびＴｅｍｉｎ（１９９３）Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖｅｌｏｐ．３：１０２−１０９）。
【０４４３】
さらに、多数の例示的なアデノウイルスに基づく系もまた、記載されている。宿主ゲノムに組込むレトロウイルスとは異なり、アデノウイルスは、染色体外に残り、このようにして、挿入変異誘発に関連する危険性を最小化する（Ｈａｊ−ＡｈｍａｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７−２７４；Ｂｅｔｔら（１９９３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：５９１１−５９２１；Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒら（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：７１７−７２９；Ｓｅｔｈら（１９９４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：９３３−９４０；Ｂａｒｒら（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：５１−５８；Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｋ．Ｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６−６２９；ならびにＲｉｃｈら（１９９３）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　４：４６１−４７６）。
【０４４４】
種々のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター系もまた、ポリヌクレオチド送達に関して開発されている。ＡＡＶベクターは、当該分野で周知の技術を用いて容易に構築され得る。例えば、米国特許第５，１７３，４１４号および同第５，１３９，９４１号；国際公開番号ＷＯ　９２／０１０７０およびＷＯ　９３／０３７６９；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら（１９８８）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：３９８８−３９９６；Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅｓ　９０（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂ．Ｊ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｏｐｉｎｉｏｎ　ｉｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　３：５３３−５３９；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｎ．（１９９２）Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７−１２９；Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．（１９９４）Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　５：７９３−８０１；ＳｈｅｌｌｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ（１９９４）Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ　１：１６５−１６９；ならびにＺｈｏｕら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：１８６７−１８７５を参照のこと。
【０４４５】
遺伝子移入による、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを送達するのに有用なさらなるウイルスベクターとしては、ポックスウイルスのファミリー（例えば、ワクシニアウイルスおよび鳥類ポックスウイルス）から誘導されるものが挙げられる。例として、新規分子を発現するワクシニアウイルスの組換え体は、以下のように構築され得る。ポリペプチドをコードするＤＮＡを最初に、ワクシニアプロモーターおよび隣接ワクシニアＤＮＡ配列（例えば、チミジンキナーゼ（ＴＫ）をコードする配列）に隣接するように、適切なベクターに挿入する。次いで、このベクターを使用して、ワクシニアで同時に感染させる細胞にトランスフェクトする。相同組換えによって、ワクシニアプロモーターおよび目的のポリペプチドをコードする遺伝子を、ウイルスゲノムに挿入する。生じるＴＫ．ｓｕｐ．（−）組換え体を、５−ブロモデオキシウリジンの存在下でこの細胞を培養し、そして５−ブロモデオキシウリジンに耐性のウイルスプラークをピックアップすることによって、選択し得る。
【０４４６】
ワクシニアに基づく感染／トランスフェクション系は、生物の宿主細胞における、本明細書中に記載される１つ以上のポリペプチドの誘導可能な一過性発現または同時発現を提供するために、好都合に使用され得る。この特定の系において、細胞を最初に、インビトロで、バクテリオファージＴ７　ＲＮＡポリメラーゼをコードするワクシニアウイルスの組換え体で感染させる。このポリメラーゼは、それがＴ７プロモーターを保有する鋳型のみを転写する点で、鋭敏な特異性を示す。感染後、細胞を、Ｔ７プロモーターによって駆動される目的のポリヌクレオチドでトランスフェクトさせる。ワクシニアウイルスの組換え体から細胞質中で発現されるポリメラーゼは、トランスフェクトされたＤＮＡをＲＮＡに転写し、このＲＮＡは次いで、宿主翻訳機構によってポリペプチドに翻訳される。この方法は、大量のＲＮＡおよびその翻訳産物の、高レベルで一過性の細胞質産生を提供する。例えば、Ｅｌｒｏｙ−ＳｔｅｉｎおよびＭｏｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：６７４３−６７４７；Ｆｕｅｒｓｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８６）８３：８１２２−８１２６を参照のこと。
【０４４７】
あるいは、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、鶏痘ウイルスおよびカナリア痘ウイルス）もまた使用されて、目的のコード配列を送達し得る。哺乳動物病原体由来の免疫原を発現する組換えアビポックスウイルスは、非鳥類種に投与された場合に、防御免疫を与えることが公知である。アビポックスベクターの使用は、ヒトおよび他の哺乳動物種において特に望ましい。なぜなら、アビポックス属のメンバーは、感受性の鳥類種においてのみ生産的に複製し得、故に、哺乳動物細胞において感染性ではないからである。組換えアビポックスウイルスを産生するための方法は、当該分野で公知であり、そしてワクシニアウイルスの産生に関して上記に記載されるように、遺伝子組換えを使用する。例えば、ＷＯ　９１／１２８８２；ＷＯ　８９／０３４２９；およびＷＯ　９２／０３５４５を参照のこと。
【０４４８】
任意の多数のアルファウイルスベクターもまた、本発明のポリヌクレオチド組成物の送達のために使用され得、これらとしては、米国特許第５，８４３，７２３号；同第６，０１５，６８６号；同第６，００８，０３５号および同第６，０１５，６９４号に記載されるベクターが挙げられる。ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＶＥＥ）に基づく特定のベクターもまた、使用され得、この例示的な例は、米国特許第５，５０５，９４７号および同第５，６４３，５７６号に見出され得る。
【０４４９】
さらに、分子結合体化ベクター（例えば、Ｍｉｃｈａｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９３）２６８：６８６６〜６８６９およびＷａｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９２）８９：６０９９〜６１０３に記載のアデノウイルスキメラベクター）がまた、本発明における遺伝子送達に用いられ得る。
【０４５０】
これらおよび他の公知のウイルスベースの送達系に対するさらなる例示的情報は、例えば、以下に見出され得る：Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８６：３１７〜３２１、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６〜１０３、１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ　８：１７〜２１、１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号および同第５，０１７，４８７号；ＷＯ８９／０１９７３；米国特許第４，７７７，１２７号；ＧＢ　２，２００，６５１：ＥＰ　０，３４５，２４２号；ＷＯ　９１／０２８０５；Ｂｅｒｋｎｅｒ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　６：６１６〜６２７、１９８８；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２：４３１〜４３４、１９９１；Ｋｏｌｌｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９１：２１５〜２１９、１９９４；Ｋａｓｓ−Ｅｉｓｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　９０：１１４９８〜１１５０２、１９９３；Ｇｕｚｍａｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　８８：２８３８〜２８４８、１９９３；ならびにＧｕｚｍａｎら、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．７３：１２０２〜１２０７、１９９３。
【０４５１】
特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込み得る。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して特定の位置および方向であり得るか、または無作為な非特異的位置に組み込まれ得る（遺伝子増大）。なおさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドはＤＮＡの別のエピソームセグメントとして細胞において安定に維持され得る。このようなポリヌクレオチドセグメントすなわち「エピソーム」は、宿主細胞の周期に独立してまたは同調して維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。発現構築物が細胞に送達され、そしてこの細胞中にこのポリヌクレオチドが残る様式は、使用される発現構築物のタイプに依存する。
【０４５２】
本発明の別の実施形態において、例えば、Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１７４５〜１７４９、１９９３に記載され、そしてＣｏｈｅｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５９：１６９１〜１６９２、１９９３によって概説されるように、ポリヌクレオチドは、「裸の」ＤＮＡとして投与／送達される。裸のＤＮＡの取り込みは、生分解性ビーズ（これは、細胞に効率的に輸送される）上にそのＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【０４５３】
なお別の実施形態において、本発明の組成物は、微粒子銃アプローチ（その多くが記載されている）を介して送達され得る。１つの代表的な例において、ガス駆動粒子加速（ｇａｓ−ｄｒｉｖｅｎ　ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｏｎ）は、Ｐｏｗｄｅｒｊｅｃｔ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ＰＬＣ（Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）およびＰｏｗｄｅｒｊｅｃｔ　Ｖａｃｃｉｎｅｓ　Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって製造されたデバイスのようなデバイスで達成され得る。そのいくつかの例は、米国特許第５，８４６，７９６号；同第６，０１０，４７８号；同第５，８６５，７９６号；同第５，５８４，８０７号；および欧州特許番号第０５００７９９号に記載されている。このアプローチは、注射針のない（無注射針）（ニードルフリー）送達アプローチを提供する。ここでは、微視的な粒子（例えば、ポリヌクレオチド粒子、またはポリペプチド粒子）の乾燥粉末処方物を、手持ちデバイスによって生成されたヘリウムガスジェット内で高速に加速し、目的の標的組織内へ粒子を噴射する。
【０４５４】
関連の実施形態において、本発明の組成物のガス駆動注射針なし注入に有用であり得る他のデバイスおよび方法は、Ｂｉｏｊｅｃｔ，Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）によって提供されるものが挙げられ、そのいくつかの例は、米国特許第４，７９０，８２４号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；同第５，３９９，１６３号；同第５，５２０，６３９号；および同第５，９９３，４１２号に記載されている。
【０４５５】
別の実施形態に従って、本明細書に記載される薬学的組成物は、本発明の免疫原性ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、Ｔ細胞および／またはＡＰＣ組成物に加えて、１つ以上の免疫賦活剤（免疫刺激因子）を含む。免疫賦活剤とは、本質的に、外因性抗原に対する免疫応答（抗原および／または細胞媒介）を増大または増強する任意の物質をいう。免疫賦活剤の１つの好ましい型は、アジュバントを含む。多くのアジュバントは、迅速な異化作用から抗原を保護するように設計された物質（例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油）および免疫応答の刺激物質（例えば、脂質Ａ、Ｂｏｒｔａｄｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓまたはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ誘導化タンパク質）を含む。特定のアジュバント、例えば、フロイント不完全アジュバントおよびフロイント完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；Ｍｅｒｃｋ　Ａｄｊｕｖａｎｔ　６５（Ｍｅｒｃｋ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｒａｈｗａｙ，ＮＪ）；ＡＳ−２（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）；アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはリン酸アルミニウム）；カルシウム，鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アセチル化糖；カチオンの誘導化多糖またはアニオンの誘導化多糖；ポリフォスファーゼン（ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｚｅｎｅ）；生分解性ミクロスフェア：モノホスホリル脂質Ａおよびモノホスホリルクイル（ｑｕｉｌ）Ａとして、市販されている。サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン−２、インターロイキン−７、インターロイキン−１２および成長因子のような他のもの）はまた、アジュバントとして使用され得る。
【０４５６】
本発明の特定の実施形態において、アジュバント組成物は、Ｔｈ１型の免疫応答を優勢に誘導するものが好ましい。高レベルのＴｈ１型サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦα、ＩＬ−２およびＩＬ−１２）は、投与される抗原に対する細胞媒介性応答の誘導を支持する傾向がある。対照的に、高レベルのＴｈ２型サイトカイン（例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）は、体液性免疫応答の誘導を支持する傾向がある。本明細書中に提供されるようなワクチンの適用の後、患者は、Ｔｈ１型応答およびＴｈ２型応答を含む免疫応答を支持する。応答が優勢にＴｈ１型である好ましい実施形態において、Ｔｈ１型サイトカインのレベルは、Ｔｈ２型サイトカインのレベルより高い程度まで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価され得る。サイトカインのファミリーの概説については、ＭｏｓｍａｎｎおよびＣｏｆｆｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１４５〜１７３、１９８９を参照のこと。
【０４５７】
Ｔｈ１型優勢の応答を誘発するための特定の好ましいアジュバントは、例えば、モノホスホリルリピドＡ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡとアルミニウム塩との組み合わせを含む。ＭＰＬ（登録商標）アジュバントは、Ｃｏｒｉｘａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ；例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；同第４，８７７，６１１号；同第４，８６６，０３４号および同第４，９１２，０９４号を参照のこと）から入手可能である。ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド（ここで、ＣｐＧジヌクレオチドはメチル化されていない）はまた、Ｔｈ１優勢の応答を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、そして例えばＷＯ９６／０２５５５、ＷＯ９９／３３４８８ならびに米国特許第６，００８，２００号および同第５，８５６，４６２号に記載される。免疫賦活剤ＤＮＡ配列がまた、例えば、Ｓａｔｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７３：３５２，１９９６によって記載される。別の好ましいアジュバントは、サポニン（例えば、Ｑｕｉｌ　Ａ）、またはその誘導体（ＱＳ２１およびＱＳ７（Ａｑｕｉｌａ　Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　Ｉｎｃ．，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を含む）；Ｅｓｃｉｎ；Ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ（ジキトニン）；またはＧｙｐｓｏｐｈｉｌａもしくはＣｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ　ｑｕｉｎｏａサポニンを含む。他の好ましい処方物としては、本発明のアジュバントの組み合わせ、例えば、ＱＳ２１、ＱＳ７、Ｑｕｉｌ　Ａ、β−エスシン、またはジギトニンを含む以下の群のうち少なくとも２つの組み合わせ、において１つより多いサポニンを含む。
【０４５８】
あるいは、このサポニン処方物は、キトサン、または他のポリカチオン性ポリマーからなるワクチンビヒクル、ポリラクチドおよびポリラクチド−ｃｏ−グリコリド粒子、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミンベースのポリマーマトリックス、ポリサッカライドまたは化学的に改変されたポリサッカライドからなる粒子、リポソームおよび脂質ベースの粒子、グリセロールモノエステルからなる粒子、などと組み合わせられ得る。サポニンはまた、コレステロールの存在下で処方されて、リポソームまたはＩＳＣＯＭのような粒子構造を形成し得る。さらに、サポニンは、非粒子的溶液もしくは懸濁液で、または小数層リポソームもしくはＩＳＣＯＭのような粒子状構造で、ポリオキシエチレンエーテルまたはエステルと一緒に処方され得る。サポニンはまた、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（登録商標）のような賦形剤と一緒に処方されて、粘度を増大され得るか、またはラクトースのような粉末賦形剤とともに乾燥粉末形態に処方され得る。
【０４５９】
１つの好ましい実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドＡとサポニン誘導体との組み合わせ（例えば、ＷＯ９４／００１５３に記載されるような、ＱＳ２１と３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントとの組み合わせ、またはＷＯ９６／３３７３９に記載されるような、ＱＳ２１がコレステロールでクエンチ（ｑｕｅｎｃｈ）される、あまり反応発生的（ｒｅａｃｔｏｇｅｎｉｃ）でない組成物）を含む。他の好ましい処方物は、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールを含む。水中油型エマルジョン中のＱＳ２１、３Ｄ−ＭＰＬ（登録商標）アジュバントおよびトコフェロールを使用する、別の特に好ましいアジュバント処方物は、ＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【０４６０】
別の強化されたアジュバント系は、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドとサポニン誘導体の組み合わせを含み、特にＣｐＧとＱＳ２１の組み合わせがＷＯ００／０９１５９に開示されている。好ましくは、この処方物は、さらに、水中油型エマルジョンおよびトコフェノールを含む。
【０４６１】
本発明の薬学的組成物における使用のためのさらなる代表的アジュバントとしては、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ　ＩＳＡ　７２０（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＡＦ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ）、ＩＳＣＯＭＳ（ＣＳＬ）、ＭＦ−５９（Ｃｈｉｒｏｎ）、アジュバントのＳＢＡＳシリーズ（例えば、ＳＢＡＳ−２またはＳＢＡＳ−４（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ、Ｒｉｘｅｎｓａｒｔ、Ｂｅｌｇｉｕｍから入手可能）、Ｄｅｔｏｘ（Ｅｎｈａｎｚｙｎ（登録商標））（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）、ＲＣ−５２９（Ｃｏｒｉｘａ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ＭＴ）および他のアミノアルキルグルコサミニド４−ホスフェート（ＡＧＰ）（例えば、係属中の米国出願登録番号０８／８５３，８２６および０９／０７４，７２０（これらの開示は、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載されるアジュバント）、ならびにＷＯ　９９／５２５４９Ａ１に記載のポリオキシエチレンエーテルアジュバントのようなアジュバントが挙げられる。
【０４６２】
他の好ましいアジュバントは、一般式（Ｉ）：ＨＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ−Ａ−Ｒのアジュバント分子を含み、
ここで、ｎは、１〜５０であり、Ａは、結合または−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒは、Ｃ_１〜５０アルキルまたはフェニルＣ_１〜５０アルキルである。
【０４６３】
本発明の１つの実施形態は、一般式（Ｉ）のポリオキシエチレンエーテルを含むワクチン処方物からなり、ここで、ｎは、１と５０との間、好ましくは４〜２４、最も好もしくは９であり、このＲ成分は、Ｃ_１〜５０、好ましくはＣ_４〜Ｃ_２０アルキル、そして最も好ましくはＣ_１２アルキルであり、そしてＡは、結合である。ポリオキシエチレンエーテルの濃度は、０．１〜２０％の範囲、好ましくは０．１〜１０％、そして最も好ましくは０．１〜１％の範囲にあるべきである。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウロイルエーテル、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−８−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウロイルエーテルおよびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。ポリオキシエチレンラウリルエーテルのようなポリオキシエチレンエーテルは、Ｍｅｒｃｋインデックス（第１２版、７７１７項目）に記載される。これらのアジュバント分子は、ＷＯ９９／５２５４９に記載される。
【０４６４】
上記の一般式（Ｉ）に従うポリオキシエチレンエーテルは、所望の場合、別のアジュバントと組み合わせられ得る。例えば、好ましいアジュバントの組み合わせは、好ましくは、係属中の英国特許出願第ＧＢ９８２０９５６．２号に記載されるようなＣｐＧとの組み合わせである。
【０４６５】
本発明の別の実施形態に従って、本明細書に記載される免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、単球、および有効なＡＰＣであるように操作され得る他の細胞）を介して宿主に送達される。このような細胞は、抗原を提示する能力を増大するように、Ｔ細胞応答の活性化および／または維持を改良するように、それ自体で抗腫瘍効果を有するように、そして／あるいは受け手と免疫学的に適合性（すなわち、一致するＨＬＡハプロタイプ）であるように遺伝学的に改変されてもよいが、改変される必要はない。ＡＰＣは、一般に、種々の生物学的な流体および器官（腫瘍および腫瘍周辺組織を含む）のいずれかから単離されてもよいし、そして自己細胞、同種異系細胞、同系細胞、または異種細胞であってもよい。
【０４６６】
本発明の特定の好ましい実施形態は、抗原提示細胞として、樹状細胞またはその前駆細胞を使用する。樹状細胞は、高度に強力なＡＰＣであり（ＢａｎｃｈｅｒｅａｕおよびＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｎａｔｕｒｅ　３９２：２４５−２５１、１９９８）、そして予防的または治療的な抗腫瘍免疫性を誘発するための生理学的アジュバントとして有効であることが示されてきた（ＴｉｍｍｅｒｍａｎおよびＬｅｖｙ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．５０：５０７−５２９、１９９９を参照のこと）。一般に、樹状細胞は、それらの代表的な形状（インサイチュでは星状、インビトロでは目に見える顕著な細胞質プロセス（樹状突起）を有する）、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、そして提示するそれらの能力、およびナイーブな（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞応答を活性化するそれらの能力に基づいて同定され得る。もちろん樹状細胞は、インビボまたはエキソビボで樹状細胞上に通常見出されない特定の細胞表面レセプターまたはリガンドを発現するように操作され得、このような改変樹状細胞は本発明によって意図される。樹状細胞の代替として、分泌小胞抗原装荷樹状細胞（ｓｅｃｒｅｔｅｄ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　ａｎｔｉｇｅｎ−ｌｏａｄｅｄ　ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ　ｃｅｌｌ）（エキソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）と呼ばれる）がワクチン内で使用され得る（Ｚｉｔｖｏｇｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ　Ｍｅｄ．４：５９４−６００，１９９８を参照のこと）。
【０４６７】
樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周辺組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または任意の他の適切な組織もしくは流体から得られ得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から収集された単球の培養物に、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦαのようなサイトカインの組み合わせを添加することによってエキソビボで分化され得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたＣＤ３４陽性細胞は、培養培地にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドおよび／または樹状細胞の分化、成熟、および増殖を誘導する他の化合物の組み合わせを添加することによって、樹状細胞に分化され得る。
【０４６８】
樹状細胞は、「未熟」細胞および「成熟」細胞として都合良く分類され、このことは、２つの充分に特徴付けられた表現型の間を単純な方法で区別することを可能にする。しかしこの命名は、あらゆる可能な分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未熟な樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するＡＰＣとして特徴付けられ、この能力は、Ｆｃγレセプターおよびマンノースレセプターの高度な発現と相関する。成熟表現型は、代表的に、クラスＩおよびクラスＩＩ　ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに同時刺激性分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１ＢＢ）のようなＴ細胞活性化を担う細胞表面分子の高度な発現ではなく、これらのマーカーのより低い発現によって特徴付けられる。
【０４６９】
ＡＰＣは、一般に、本発明のポリヌクレオチド（またはその部分もしくは他の改変体）を用いてトランスフェクトされ得、その結果、このコードされたポリペプチドまたはその免疫原性部分が細胞表面上に発現される。このようなトランスフェクションはエキソビボで生じ得、次いでこのようなトランスフェクトされた細胞を含む薬学的組成物は、本明細書中に記載されるように、治療目的のために使用され得る。あるいは、樹状細胞または他の抗原提示細胞を標的とする遺伝子送達ビヒクルが、患者に投与され得、インビボで起こるトランスフェクションを生じる。樹状細胞のインビボおよびエキソビボでのトランスフェクションは、例えば、ＷＯ９７／２４４４７に記載される方法、またはＭａｈｖｉら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　７５：４５６−４６０、１９９７によって記載される遺伝子銃アプローチのような当該分野で公知の任意の方法を使用して一般に実施され得る。樹状細胞の抗原ローディングは、樹状細胞または前駆細胞を、腫瘍ポリペプチド、ＤＮＡ（裸のもしくはプラスミドベクター中の）またはＲＮＡ；あるいは抗原発現性組換え細菌またはウイルス（例えば、牛痘、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスのベクター）とインキュベートすることによって達成され得る。ローディングの前に、ポリペプチドは、Ｔ細胞補助を提供する免疫学的パートナー（例えば、キャリア分子）に共有結合され得る。あるいは、樹状細胞は、別々にまたはポリペプチドの存在下で、結合していない免疫学的パートナーでパルスされ得る。
【０４７０】
当業者に公知の任意の適切なキャリアが、本発明の薬学的組成物において使用され得るが、このタイプのキャリアは、代表的に投与の様式に依存して変化する。本発明の組成物は、投与の任意の適切な様式、例えば、局所投与、経口投与、経鼻投与、粘膜投与、静脈投与、頭蓋内投与、腹腔内投与、皮下投与、および筋肉内投与を含む様式のために処方され得る。
【０４７１】
このような薬学的組成物内での使用のためのキャリアは、生体適合性であり、そしてまた生分解性であり得る。特定の実施形態において、好ましくは、この処方物は比較的一定レベルの活性成分の放出を提供する。しかし、他の実施形態において、投与直後のより迅速な放出速度が所望され得る。このような組成物の処方は十分に、公知の技術を使用する当業者のレベル内である。この点に関して有用な例示的なキャリアとしては、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が挙げられる。他の例示的な徐放性キャリアとしては、非液性（ｎｏｎ−ｌｉｑｕｉｄ）親水性コア（例えば、架橋ポリサッカリドまたはオリゴサッカリド）を含む超分子バイオベクター、ならびに必要に応じて、両親媒性化合物を含む外部層（例えば、リン脂質）（例えば、米国特許第５，１５１，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４／２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）を含む超分子バイオベクターが挙げられる。徐放性処方物内に含まれる活性な化合物の量は、移植の部位、放出の速度および予期される持続期間、ならびに処置または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０４７２】
別の例示的な実施形態において、生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）は、本発明の組成物のためのキャリアとして使用される。適切な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に開示される。改変Ｂ型肝炎コアタンパク質キャリア系（例えば、ＷＯ／９９　４０９３４およびそこで引用される参考文献に記載されるような系）もまた、多くの用途に有用である。別の例示的なキャリア送達系（システム）は、キャリア含有粒子−タンパク質複合体（例えば、米国特許第５，９２８，６４７号に記載される複合体）を使用し、これは、宿主においてクラスＩ拘束細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導し得る。
【０４７３】
別の例示的実施形態において、リン酸カルシウムコア粒子が、キャリア、ワクチンアジュバントとして、または本発明の組成物のための徐放性マトリクスとして使用される。例示的なリン酸カルシウム粒子は、例えば、公開特許出願ＷＯ／００４６１４７に開示されている。
【０４７４】
本発明の薬学的組成物はしばしば、１つ以上の、緩衝剤（例えば、中性の緩衝化生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水）；糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）；マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸（例えば、グリシン）；抗酸化剤；静菌剤；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；処方物をレシピエントの血液に対して等張性、低張性または弱く高張性にする溶質；懸濁剤；濃化剤および／または保存剤をさらに含む。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥物として処方され得る。
【０４７５】
本明細書中に記載される薬学的組成物は、単回用量容器または多用量容器（例えば、密閉アンプルまたはバイアル）中に存在し得る。このような容器は、代表的に、使用まで処方物の無菌性および安定性を維持するような様式で、密封される。一般に、処方物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクル中の、懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存され得る。あるいは、薬学的組成物は、使用の直前に無菌水性キャリアの添加のみを必要とする、凍結乾燥状態で保存され得る。
【０４７６】
様々な処置レジメンにおいて本明細書中で記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメンおよび処置レジメン（例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、および筋肉内の投与および処方を含む）の開発は、当該分野で周知であり、これらのいくつかは、一般的な例示目的のために以下で簡単に考察される。
【０４７７】
特定の用途において、本明細書中で開示される薬学的組成物は、経口投与によって動物に送達され得る。このように、これらの組成物は、不活性希釈剤と共にかまたは同化可能食用キャリアと共に処方され得るか、あるいはこれらの組成物は、硬質または軟質殻ゼラチンカプセルに入れられ得るか、あるいはこれらの組成物は錠剤に圧縮され得るか、あるいはこれらの組成物は食餌の食品に直接組み込まれ得る。
【０４７８】
活性化合物は、さらに賦形剤と共に組み込まれ得、そして経口摂取錠剤、経頬粘膜錠剤、トローチ、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウェハ剤などの形態で使用される（例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら、Ｎａｔｕｒｅ　１９９７　Ｍａｒ　２７；３８６（６６２３）：４１０−４；Ｈｗａｎｇら、Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｔｈｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ　１９９８；１５（３）：２４３−８４；米国特許第５，６４１，５１５号；米国特許第５，５８０，５７９号および米国特許第５，７９２，４５１号を参照のこと）。錠剤、トローチ、丸剤、カプセル剤などはまた、任意の種々のさらなる成分を含み得、例えば、結合剤（例えば、トラガカントゴム、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン）；賦形剤（例えば、リン酸二カルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンスターチ、ポテトデンプン、アルギン酸など）；潤沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム）；および甘味料（例えば、スクロース、ラクトースまたはサッカリン）または香料（例えば、ペパーミント、ウインターグリーン油、またはチェリー香料）が添加され得る。投薬量単位形態がカプセル剤である場合、これは上記のタイプの材料に加えて液体キャリアを含み得る。様々な他の材料が、コーティングとして存在し得るか、またはそうでなければ投薬単位の物理的形態を改変し得る。例えば、錠剤、丸剤またはカプセル剤は、セラック、糖またはその両方でコーティングされ得る。もちろん、任意の投薬単位形態を調製する際に使用される任意の材料は、薬学的に純粋でありかつ用いられる量で実質的に非毒性でなければならない。さらに、活性化合物が、持続性放出調製物および処方物に組み込まれ得る。
【０４７９】
代表的に、これらの処方物は、少なくとも約０．１％またはそれよりも多い活性化合物を含み得るが、活性成分の割合は、もちろん、変化し得、そして好都合に、全処方物の重量または体積の約１または２％と、約６０％または７０％以上のとの間であり得る。当然、治療的に有用な組成物の各々の中の活性化合物の量は、適切な投薬量が、化合物の任意の所定の単位用量において得られるような様式で、調製され得る。溶解度、バイオアベイラビリティー、生物学的半減期、投与の経路、製品の有効期限のような因子、および他の薬理学的考慮が、このような薬学的処方物を調製する分野の当業者によって意図され、そして、種々の投薬量および処置レジメンはそれ自体が、所望され得る。
【０４８０】
あるいは、経口投与について、本発明の組成物は、うがい薬、歯みがき剤、バッカル錠、経口スプレー、または舌下経口投与処方物の形態で、１つ以上の賦形剤と混合され得る。あるいは、活性成分は、経口溶液（例えば、ホウ酸ナトリウム、グリセリンおよび炭酸水素カリウムを含む溶液）に組み込まれ得るか、または歯みがき剤に分散され得るか、または治療的有効量で、水、結合剤、研磨剤、香料、発泡剤、および湿潤剤を含み得る組成物に添加され得る。あるいは、これらの組成物は、舌下に置かれ得るか、そうでなければ口の中で溶解され得る錠剤形態または溶液形態に成形され得る。
【０４８１】
特定の状況において、本明細書中で開示される薬学的組成物を、非経口送達、静脈内送達、筋肉内送達またはさらに腹腔内送達することが所望される。このようなアプローチは、当業者に周知であり、これらのいくつかは例えば、例えば、米国特許第５，５４３，１５８号；米国特許第５，６４１，５１５号および米国特許第５，３９９，３６３号にさらに記載される。特定の実施形態において、遊離塩基または薬学的に受容可能な塩としての活性化合物の溶液は、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と適切に混合された水中で調製され得る。分散物もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびにオイル中で調製され得る。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は一般に、微生物の増殖を防止するために、防腐剤を含む。
【０４８２】
注入用途のために適切な例示的な薬学的形態として、滅菌水性液剤または分散物および滅菌注射用液剤または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる（例えば、米国特許第５，４６６，４６８号を参照のこと）。全ての場合において、その形態は、滅菌でなけらばならず、そして容易に注射することができる程度に、流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保存されなければならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および／もしくは植物油を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、そして／または界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン（ｐａｒａｂｅｎ）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）によって促進され得る。多くの場合において、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含めることが、望ましい。注射可能な組成物の長期にわたる吸収は、組成物中での吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって、もたらされ得る。
【０４８３】
一実施形態において、水溶液の非経口投与のために、必要ならばその溶液は、適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤が、最初に、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、および腹腔内投与に適切である。これに関連して、使用され得る滅菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に公知である。例えば、一投与量は、１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解され得、そして１０００ｍｌの皮下注入流体に添加され得るか、または注入予定部位で注入され得るかのいずれかである（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照のこと）。投薬量におけるいくらかの変化が、処置される被験体の状態に依存して必然的に生じる。さらに、ヒト投与について、調製物は、もちろん、ＦＤＡ　Ｏｆｆｉｃｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ　ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求されるような、無菌性、発熱性、ならびに一般的な安全性標準および純度標準を好ましく満たす。
【０４８４】
本発明の別の実施形態において、本明細書中で開示される組成物は、中性形態または塩形態で処方され得る。例示的な薬学的に受容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基とともに形成される）が挙げられ、そしてこれらの塩は、無機酸（例えば、塩酸またはリン酸）、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸とともに形成される。遊離カルボキシル基とともに形成される塩もまた、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化鉄）、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から誘導され得る。処方の際に、溶液は、投薬処方物と適合する様式でかつ治療的に有効な量で投与される。
【０４８５】
キャリアは、任意および全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収を遅延させる薬剤、緩衝液、キャリア溶液、懸濁液、コロイドなどをさらに含み得る。薬学的活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が、活性成分と不適合である場合を除いては、治療組成物におけるその使用が、企図される。補助的活性成分もまた、これらの組成物に組み込まれ得る。句「薬学的に受容可能な」とは、ヒトに投与される場合に、アレルギー反応または類似の厄介な反応を生じない分子実体および組成物をいう。
【０４８６】
特定の実施形態において、薬学的組成物は、鼻腔内スプレー、吸入、および／または他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達され得る。遺伝子、核酸およびペプチド組成物を、経鼻エアロゾルスプレーを介して肺に直接送達するための方法は、例えば、米国特許第５，７５６，３５３号および米国特許第５，８０４，２１２号に記載されている。同様に、鼻腔内微粒子樹脂（Ｔａｋｅｎａｇａら、Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ　１９９８　Ｍａｒ　２；５２（１−２）：８１−７）およびリゾホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号）を使用する薬物の送達はまた、薬学分野で周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態での例示的な経粘膜薬物送達は、米国特許第５，７８０，０４５号に記載される。
【０４８７】
特定の実施形態において、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、脂質粒子、小胞などを、適切な宿主細胞／生物への本発明の組成物の導入のために使用する。特に、本発明の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフィア、またはナノ粒子などのいずれかにカプセル化して送達するために処方され得る。あるいは、本発明の組成物は、このようなキャリアビヒクルの表面に、共有結合的または非共有結合的のいずれかで結合され得る。
【０４８８】
潜在的な薬物キャリアとしてのリポソームおよびリポソーム様調製物の形成および使用は一般に、当業者に公知である（例えば、Ｌａｓｉｃ，Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　１９９８　Ｊｕｌ；１６（７）：３０７−２１；Ｔａｋａｋｕｒａ，Ｎｉｐｐｏｎ　Ｒｉｎｓｈｏ　１９９８　Ｍａｒ；５６（３）：６９１−５；Ｃｈａｎｄｒａｎら、Ｉｎｄｉａｎ　Ｊ　Ｅｘｐ　Ｂｉｏｌ．１９９７　Ａｕｇ；３５（８）：８０１−９；Ｍａｒｇａｌｉｔ，Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｔｈｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ．１９９５；１２（２−３）：２３３−６１；米国特許第５，５６７，４３４号；米国特許第５，５５２，１５７号；米国特許第５，５６５，２１３号；米国特許第５，７３８，８６８号および米国特許第５，７９５，５８７号（これらの各々は、その全体が本明細書中で参考として詳細に援用される）を参照のこと）。
【０４８９】
リポソームは、Ｔ細胞懸濁液、初代肝細胞培養物およびＰＣ１２細胞を含む他の手順によるトランスフェクションが通常困難である多くの細胞型とともに、首尾よく使用されている（Ｒｅｎｎｅｉｓｅｎら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ．１９９０　Ｓｅｐ　２５；２６５（２７）：１６３３７−４２；Ｍｕｌｌｅｒら、ＤＮＡ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．１９９０　Ａｐｒ；９（３）：２２１−９）。さらに、リポソームは、ウイルスベースの送達系に典型的なＤＮＡ長の制限がない。リポソームは、遺伝子、種々の薬物、放射線治療剤、酵素、ウイルス、転写因子およびアロステリックエフェクターなどを、種々の培養細胞株および動物に導入するために効果的に使用されている。さらに、リポソームの使用は、全身送達後の、自己免疫応答にも受容不可能な毒性にも関連しないようである。
【０４９０】
特定の実施形態において、リポソームは、水性媒体中に分散したリン脂質から形成され、そして多層同心性二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ばれる）を自発的に形成する。
【０４９１】
あるいは、他の実施形態において、本発明は、本発明の組成物の薬学的に受容可能なナノカプセル処方物を提供する。ナノカプセルは一般に、化合物を安定かつ再現可能な様式で捕獲し得る（例えば、Ｑｕｉｎｔａｎａｒ−Ｇｕｅｒｒｅｒｏら、Ｄｒｕｇ　Ｄｅｖ　Ｉｎｄ　Ｐｈａｒｍ．１９９８　Ｄｅｃ；２４（１２）：１１１３−２８を参照のこと）。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を回避するために、このような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は、インビボで分解され得るポリマーを使用して設計され得る。このような粒子は、例えば、Ｃｏｕｖｒｅｕｒら、Ｃｒｉｔ　Ｒｅｖ　Ｔｈｅｒ　Ｄｒｕｇ　Ｃａｒｒｉｅｒ　Ｓｙｓｔ．１９８８；５（１）：１−２０；ｚｕｒ　Ｍｕｈｌｅｎら、Ｅｕｒ　Ｊ　Ｐｈａｒｍ　Ｂｉｏｐｈａｒｍ．１９９８　Ｍａｒ；４５（２）：１４９−５５；Ｚａｍｂａｕｘら、Ｊ　Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　Ｒｅｌｅａｓｅ．１９９８　Ｊａｎ　２；５０（１−３）：３１−４０；および米国特許第５，１４５，６８４号に記載されるようにして作製され得る。
【０４９２】
（癌治療法）
癌治療への免疫学的アプローチは、癌細胞が、異常な細胞および分子または外来の細胞および分子に対する人体の防御をしばしば回避し得、そしてこれらの防御が、失った基盤（ｇｒｏｕｎｄ）を取り戻すために免疫的に刺激され得るという認識に基づく（例えば、Ｋｌｅｉｎ、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８２）、６２３〜６４８頁）。種々の免疫エフェクターが腫瘍の増殖を直接的または間接的に阻害し得るという多数の最近の知見は、癌治療に対するアプローチにおける更新された関心を導いた（例えば、Ｊａｇｅｒら、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　２００１；６０（１）：１−７；Ｒｅｎｎｅｒら、Ａｎｎ　Ｈｅｍａｔｏｌ　２０００　Ｄｅｃ；７９（１２）：６５１−９）。
【０４９３】
抗腫瘍細胞の免疫および人体からの腫瘍細胞の除去に関連する機能を有する４つの基本的な細胞型は、以下の通りである：ｉ）非自己侵入細胞を認識および標識するために免疫グロブリンを血漿に分泌するＢ−リンパ球；ｉｉ）免疫グロブリンでコーティングされた標的侵入細胞の溶解および処理を担う補体タンパク質を分泌する単球；ｉｉｉ）腫瘍細胞の破壊、抗体依存性細胞傷害およびナチュラルキリング（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｉｎｇ）のための２種類の機構を有するナチュラルキラーリンパ球；ならびにｉｖ）抗原特異的レセプターを保持し、そして相補的マーカー分子を保有する腫瘍細胞を認識する能力を有するＴ−リンパ球（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，Ｈ．、１９８９、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編）、Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ、９２３〜９５５頁）。
【０４９４】
癌の免疫治療は、一般に、体液性免疫応答、細胞性免疫応答、またはそれらの両方を誘導することに焦点が当てられている。さらに、ＣＤ４^＋Ｔヘルパー細胞の誘導は、抗体または細胞傷害性ＣＤ８^＋Ｔ細胞のいずれかを二次的に誘導するために必要であることが十分に確立されている。癌細胞、特に、結腸癌細胞に対して選択的であるか、または理想的には特異的であるポリペプチド抗原は、結腸癌に対する免疫応答を誘導するための強力なアプローチを提供し、そして本発明の重要な局面である。
【０４９５】
従って、本発明のさらなる局面において、本明細書に記載される薬学的組成物は、癌に対する免疫応答を刺激するため、特に、結腸癌の免疫治療のために使用され得る。このような方法において、本明細書中に記載される薬学的組成物は、患者、代表的には、温血動物、好ましくはヒトに投与される。患者は、癌に罹患していてもしていなくてもよい。薬学的組成物およびワクチンは、原発性腫瘍の外科的除去および／または放射線治療剤もしくは従来の化学療法剤の投与のような処置の前、あるいはその後のいずれかに投与され得る。上記のように、薬学的組成物の投与は、任意の適切な方法（静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、皮内、肛門、膣、局所的および経口経路による投与を含む）によってであり得る。
【０４９６】
特定の実施形態において、免疫療法は、能動的免疫療法であり得、この療法にける処置は、免疫応答改変剤（例えば、本明細書中で提供されるポリペプチドおよびポリヌクレオチド）の投与を用いる、腫瘍に対して反応する内因性宿主免疫系のインビボ刺激に依存する。
【０４９７】
他の実施形態において、免疫療法は、受動的免疫療法であり得、この療法における処置は、確立された腫瘍免疫反応性を有する因子（例えば、エフェクター細胞または抗体）（これらは、抗腫瘍効果を直接的または間接的に媒介し得、そして必ずしもインタクトな宿主免疫系に依存しない）の送達を含む。エフェクター細胞の例としては、上記のようなＴ細胞、本明細書中に提供されるポリペプチドを発現するＴリンパ球（例えば、ＣＤ８^＋細胞傷害性Ｔリンパ球およびＣＤ４^＋Ｔヘルパー腫瘍浸潤性リンパ球）、キラー細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞）、Ｂ細胞および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞およびマクロファージ）が挙げられる。本明細書中に列挙されるポリペプチドに特異的なＴ細胞レセプターおよび抗体レセプターは、養子免疫療法のために他のベクターまたはエフェクター細胞中にクローニングされ、発現され、そして移入され得る。本明細書に提供されるポリペプチドはまた、受動免疫療法のための抗体または抗イディオタイプ抗体（上記および米国特許第４，９１８，１６４号に記載される）を生成するために用いられ得る。
【０４９８】
モノクローナル抗体は、検出、診断アッセイまたは治療適用において、所望される選択的な利用のために、任意の種々の標識で標識され得る（米国特許第６，０９０，３６５号；同第６，０１５，５４２号；同第５，８４３，３９８号；同第５，５９５，７２１号；および同第４，７０８，９３０号（各々が個々に援用されるかのように、本明細書中でこれらの全体が参考として援用されている）に記載されている）。各々の場合において、抗原の決定部位への標識されたモノクローナル抗体の結合は、特定の治療剤の検出または異常な細胞上の抗原決定部位への特定の治療剤の送達を示す。本発明のさらなる目的は、このようなモノクローナル抗体の所望される選択的な利用を達成するために適切に標識される、特定のモノクローナル抗体を提供することである。
【０４９９】
エフェクター細胞は、一般に、本明細書中に記載されるように、インビトロでの増殖により養子免疫治療のために十分な量で得られ得る。単一の抗原特異的エフェクター細胞を、インビボでの抗原認識を保持しながら数十億まで増殖させるための培養条件は当該分野で周知である。このようなインビトロの培養条件は代表的に、しばしばサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）および分裂しない支持細胞の存在下で、抗原での間欠刺激を用いる。上で述べたように、本明細書中で提供される免疫反応性ポリペプチドは、抗原特異的Ｔ細胞培養物を急速に増殖するために用いられ、免疫治療に十分な数の細胞を生成し得る。詳細には、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞、マクロファージ、単球、繊維芽細胞、および／またはＢ細胞）は、当該分野で周知の標準的技術を用いて、免疫反応性ポリペプチドでパルスされ得るか、または１つ以上のポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。例えば、抗原提示細胞は、組換えウイルスまたは他の発現系における発現を増大するのに適切なプロモーターを有するポリヌクレオチドでトランスフェクトされ得る。治療において使用するための培養されたエフェクター細胞は、インビボで増殖されかつ広範に分散され得、そして長期間生存し得なければならない。培養されたエフェクター細胞が、インビボで増殖し、そしてＩＬ−２を補充された抗原での反復刺激によって、長期間、多数生存するように誘導され得ることが研究で示されている（例えば、Ｃｈｅｅｖｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅｖｉｅｗｓ　１５７：１７７、１９９７を参照のこと）。
【０５００】
あるいは、本明細書において列挙されるポリペプチドを発現するベクターは、患者から得られた抗原提示細胞に導入され得、そして同じ患者に戻す移植のためにエキソビボでクローン的に増殖され得る。トランスフェクトされた細胞は、当該分野で公知の任意の手段（好ましくは、静脈投与、腔内投与、腹腔内投与、または腫瘍内投与による滅菌形態）を用いて患者に再導入され得る。
【０５０１】
本明細書中に記載される治療的組成物の投与の経路および頻度、ならびに投薬量は、個々人で異なり、そして標準的技術を用いて容易に確立され得る。概して、薬学的組成物およびワクチンは、注射（例えば、皮内、筋肉内、静脈内、または皮下）により、経鼻的に（例えば、吸引により）または経口的に、投与され得る。好ましくは、５２週間にわたって１〜１０用量の間が投与され得る。好ましくは、１ヶ月の間隔で６用量が投与され、そしてブースター（追加）ワクチン接種がその後定期的に与えられ得る。交互のプロトコールが個々の患者に適切であり得る。適切な用量は、上記のように投与された場合、抗腫瘍免疫応答を促進し得、そして基底（すなわち、未処置）レベルより少なくとも１０〜５０％上である、化合物の量である。このような応答は、患者内の抗腫瘍抗体を測定することによってか、または患者の腫瘍細胞をインビトロで殺傷し得る細胞溶解性エフェクター細胞のワクチン依存性の生成によってモニターされ得る。このようなワクチンはまた、ワクチン接種されていない患者と比較すると、ワクチン接種された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全もしくは部分的に疾患を有さないか、またはより長く疾患を有さない生存）を導く免疫応答を生じ得るはずである。一般に、１つ以上のポリペプチドを含む薬学的組成物およびワクチンについて、用量中に存在する各ポリペプチドの量は、宿主の体重（ｋｇ）あたり、約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適切な用量サイズは、患者の大きさで変化するが、代表的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲である。
【０５０２】
一般に、適切な投薬量および処置レジメンは、治療的および／または予防的利点を提供するのに十分な量の活性化合物を提供する。このような応答は、処置されていない患者と比較して、処置された患者において、改善された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全なまたは部分的な、あるいはより長い疾患なしでの生存）を確立することによってモニターされ得る。腫瘍タンパク質に対する既存の免疫応答における増加は、一般的に、改善された臨床的結果と関連する。このような免疫応答は、一般的に、標準的な増殖アッセイ、細胞障害性アッセイまたはサイトカインアッセイを使用して評価され得、これは、処置の前または後に患者から得られるサンプルを使用して行われ得る。
【０５０３】
（癌の検出および診断組成物、方法およびキット）
一般的に、癌は、患者から得られた生物学的サンプル（例えば、血液、血清、痰、尿、および／または腫瘍生検）における１つ以上の結腸腫瘍タンパク質および／またはこのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在に基づいて患者において検出され得る。言い換えると、このようなタンパク質は、結腸癌のような癌の存在または非存在を示すためのマーカーとして使用され得る。さらに、このようなタンパク質は、他の癌の検出のために有用であり得る。本明細書中で提供される結合剤は、一般に、生物学的サンプル中で、この薬剤に結合する抗原のレベルの検出を可能にする。
【０５０４】
ポリヌクレオチドプライマーおよびプローブは、癌の存在または非存在もまた示す、腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルを検出するために使用され得る。一般に、腫瘍の配列は、腫瘍が発生するのと同一の型の正常な組織よりも、腫瘍組織において、少なくとも２倍、好ましくは３倍、そしてより好ましくは５倍以上のレベルで存在するはずである。この腫瘍が発生するのとは異なる細胞型の特定の腫瘍配列の発現レベルは、特定の診断実施形態において不適切である。なぜならば、この腫瘍細胞の存在は、同一の型の正常組織における発現レベルに対する、腫瘍組織において予め決定された異なる発現レベル（例えば、２倍、５倍など）の観測により確認され得るからである。
【０５０５】
他の異なる発現パターンは、診断目的のために有利に利用され得る。例えば、本発明の１つの局面において、同一の型だが他の正常組織の型ではない、腫瘍組織および正常組織（例えば、ＰＢＭＣ）における腫瘍配列の過剰発現は、診断的に開発され得る。この場合において、例えば、循環組織部位または腫瘍が発生する組織部位とは異なるいくつかの組織部位から採取されたサンプル中における転移性腫瘍細胞の存在は、例えば、ＰＴ−ＰＣＲ分析を使用して、このサンプル中の腫瘍配列の発現を検出することによって同定および／または確認され得る。多くの場合において、目的のサンプル中の腫瘍細胞（例えば、ＰＢＭＣ）を、細胞捕獲（ｃｅｌｌ　ｃａｐｔｕｒｅ）技術または他の類似の技術を使用して、富化することが所望される。
【０５０６】
サンプル中のポリペプチドマーカーを検出するために結合剤を使用するための、当業者に公知の種々のアッセイ型式が存在する。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照のこと。一般的に、患者における癌の存在または非存在は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプルを結合剤と接触させる工程；（ｂ）結合剤に結合するポリペプチドのレベルをサンプルにおいて検出する工程；および（ｃ）ポリペプチドのレベルと所定のカットオフ値とを比較する工程によって決定され得る。
【０５０７】
好ましい実施形態において、このアッセイは、ポリペプチドに結合するためおよびサンプルの残りからポリペプチドを除くために固体支持体上に固定された結合剤の使用を含む。次いで、結合されたポリペプチドは、レポーター基を含み、結合剤／ポリペプチド複合体に特異的に結合する検出試薬を使用して検出され得る。このような検出試薬は、例えば、ポリペプチドまたは抗体に特異的に結合する結合剤あるいは結合剤に特異的に結合する他の薬剤（例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチン）を含み得る。あるいは、競合アッセイが、使用され得、ここで、ポリペプチドは、レポーター基で標識され、そしてサンプルと結合剤のインキュベーション後にその固定された結合剤に結合される。サンプルの成分が、標識ポリペプチドの結合剤への結合を阻害する程度は、サンプルの固定された結合剤との反応性を示す。このようなアッセイにおける使用に適切なポリペプチドは、上記のような、全長結腸腫瘍タンパク質および結合剤が結合するそのポリペプチド部分を含む。
【０５０８】
固体支持体は、腫瘍タンパク質が付着され得る当業者に公知の任意の材料であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートにおける試験ウェルあるいはニトロセルロースまたは他の適切な膜であり得る。あるいは、その支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス）、ファイバーグラス、ラテックス、またはプラスチック物質（例えば、ポリスチレン、またはポリ塩化ビニル）であり得る。その支持体はまた、磁気粒子または光ファイバーセンサー（例えば、米国特許第５，３５９，６８１号に記載のような）であり得る。この結合剤は、当業者に公知の種々の技術を使用して固体支持体上に固定され得、これらは特許および科学文献に十分に記載されている。本発明の状況において、用語「固定化」とは、非共有結合的な会合（例えば、吸着）および共有結合的な付着（これは、薬剤と支持体上の官能基との間で直接結合され得るかまたは架橋剤を用いる結合であり得る）の両方をいう。マイクロタイタープレートのウェル、または膜への吸着による固定化は好ましい。このような場合、吸着は、適切な緩衝液中で固体支持体を用いて適切な時間量で結合剤に接触させることによって達成され得る。接触時間は、温度によって変化するが、代表的には、約１時間から約１日の間である。一般的には、約１０ｎｇ〜約１０μｇ、そして好ましくは約１００ｎｇ〜約１μｇの範囲の量の結合剤とプラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルを接触させることは、適切な量の結合剤を固定化するのに十分である。
【０５０９】
固体支持体への結合剤の共有結合的付着は、一般に、支持体および結合剤上の官能基（例えば、水酸基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と支持体を最初に反応させることによって達成され得る。例えば、この結合剤は、ベンゾキノンを用いるかまたは結合パートナー上のアミンおよび活性水素と支持体上のアルデヒド基との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に、共有結合的に付着され得る（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ　Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｃａｔａｌｏｇ　ａｎｄ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、１９９１、Ａ１２−Ａ１３を参照のこと）。
【０５１０】
特定の実施形態において、このアッセイは、２抗体サンドイッチアッセイである。本アッセイは、最初に、固体支持体（一般に、マイクロタイタープレートのウェル）上で固定されている抗体をサンプルに接触させて、その結果、サンプル内のポリペプチドを固定された抗体に結合させることによって実施され得る。次いで、非結合サンプルは固定されたポリペプチド−抗体複合体から除去され、そして検出試薬（好ましくは、そのポリペプチド上の異なる部位に結合し得る第２の抗体（レポーター基を含む））が添加される。次いで、固体支持体に結合したままである検出試薬の量が、特定のレポーター基に関して適切な方法を用いて決定される。
【０５１１】
より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は、典型的にはブロックされる。任意の適切なブロック剤（例えば、ウシ血清アルブミンまたはＴｗｅｅｎ２０^ＴＭ（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））は、当業者に公知である。固定された抗体は次いで、サンプルとインキュベートされ、そしてポリペプチドをこの抗体に結合させる。インキュベーションの前に、このサンプルは適切な希釈液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））で希釈され得る。概して、適切な接触時間（すなわち、インキュベーション時間）は、結合ポリペプチドと非結合ポリペプチドとの間の平衡で達成されるものの少なくとも約９５％で、結腸癌を有する個体から得られたサンプル内のポリペプチドの存在を検出するのに十分な時間である。当業者は、ある時間にわたって起こる結合レベルをアッセイすることによって、平衡に達するまでに必要な時間が容易に決定され得ることを認識する。室温では、一般に、約３０分間のインキュベーション時間で十分である。
【０５１２】
次いで、非結合サンプルが、適切な緩衝液（例えば、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０^ＴＭを含むＰＢＳ）を用いて固体支持体を洗浄することによって除去される。レポーター基を含む第２の抗体が次いで、固体支持体に添加され得る。好ましいレポーター基は、上記の基を含む。
【０５１３】
次いで、検出試薬が、結合されたポリペプチドを検出するのに十分な量の時間、固定された抗体−ポリペプチド複合体とインキュベートされる。適切な量の時間は、一般に、ある時間にわたって起こる結合のレベルをアッセイすることによって決定され得る。次いで、非結合の検出試薬は除去され、そして結合した検出試薬は、レポーター基を用いて検出される。レポーター基を検出するために使用される方法は、レポーター基の性質に依存する。放射性基について、一般的には、シンチレーション計数法またはオートラジオグラフィー法が適切である。分光法は、色素、発光基および蛍光基を検出するために使用され得る。ビチオンは、異なるレポーター基（一般に、放射性もしくは蛍光基または酵素）に結合されたアビジンを使用して検出され得る。酵素レポーター基は、一般に、基質の添加（一般には、特定の時間の間）、続いて反応産物の分光分析または他の分析により検出され得る。
【０５１４】
癌（例えば、結腸癌）の存在または非存在を決定するために、固体支持体に結合したままのレポーター基から検出されるシグナルが、一般に、所定のカットオフ値と対応するシグナルと比較される。１つの好ましい実施形態において、癌の検出のためのカットオフ値は、固定された抗体を、癌を有さない患者由来のサンプルとインキュベートした際に得られる平均シグナル値である。概して、所定のカットオフ値を３標準偏差上回るシグナルを生じるサンプルが、癌に対して陽性とみなされる。代替の好ましい実施形態において、このカットオフ値は、Ｓａｃｋｅｔｔら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ：Ａ　Ｂａｓｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｆｏｒ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｌｉｔｔｌｅ　Ｂｒｏｗｎ　ａｎｄ　Ｃｏ．，１９８５，１０６〜７頁の方法に従って、レシーバーオペレーターカーブ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ　Ｏｐｅｒａｔｏｒ　Ｃａｒｖｅ）を使用して決定される。簡単に言うと、本実施形態において、このカットオフ値は、診断試験結果についての各可能なカットオフ値に対応する真の陽性割合（すなわち、感度）および偽陽性割合（１００％−特異性）の対のプロットから決定され得る。プロット上の上方左手角に最も近いカットオフ値（すなわち、最大領域を囲む値）が、最も正確なカットオフ値であり、そして本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが陽性と見なされ得る。あるいは、カットオフ値は、偽陽性割合を最小にするためにプロットに沿って左へシフトされ得るか、または偽陰性割合を最小にするために右へシフトされ得る。概して、本方法によって決定されたカットオフ値より高いシグナルを生ずるサンプルが、癌に対して陽性と見なされる。
【０５１５】
関連の実施形態において、このアッセイは、フロースルー試験形式またはストリップ試験形式で実行される（ここで、結合剤は、ニトロセルロースのような膜上で固定化される）。フロースルー試験では、サンプル内のポリペプチドは、サンプルが膜を通過するにつれて固定された結合剤に結合する。次いで、第２の標識化された結合剤が、この第２の結合剤を含む溶液がその膜を介して流れるにつれて、結合剤−ポリペプチド複合体と結合する。次いで、結合した第２の結合剤の検出は、上記のように実行され得る。ストリップ試験形式では、結合剤が結合される膜の一端を、サンプルを含む溶液中に浸す。このサンプルは、膜に沿って、第２の結合剤を含む領域を通って、そして固定された結合剤の領域まで移動する。固定された抗体の領域での第２の結合剤の濃度が、癌の存在を示す。代表的には、その部位での第２の結合剤の濃度は、視覚的に読みとられ得るパターン（例えば、線）を生成する。このようなパターンを示さないことは陰性の結果を示す。概して、この膜上に固定化される結合剤の量は、生物学的サンプルが、上記の形式において、２抗体サンドイッチアッセイにおいて陽性シグナルを生じるのに十分であるレベルのポリペプチドを含む場合、視覚的に識別可能なパターンを生じるように選択される。このようなアッセイにおける使用に好ましい結合剤は、抗体およびその抗原結合フラグメントである。好ましくは、膜上に固定化される抗体の量は、約２５ｎｇ〜約１μｇの範囲であり、そしてより好ましくは、約５０ｎｇ〜約５００ｎｇの範囲である。このような試験は、代表的には、非常に少ない量の生物学的サンプルを用いて実行され得る。
【０５１６】
もちろん、本発明の腫瘍タンパク質または結合剤との使用に適する多数の他のアッセイプロトコールが存在する。上記の記載は、例示であることを意図するにすぎない。例えば、上記プロトコールが、腫瘍ポリペプチドを使用するために容易に改変され得て、生物学的サンプル内でこのようなポリペプチドに結合する抗体を検出し得ることが当業者に明かである。このような腫瘍タンパク質特異的抗体の検出は、癌の存在と相関し得る。
【０５１７】
癌もまた、あるいは癌が、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質と特異的に反応するＴ細胞の存在に基づいて検出され得る。特定の方法では、患者から単離されたＣＤ４^＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を含む生物学的サンプルは、腫瘍ポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよび／またはこのようなポリペプチドの少なくとも免疫原性部分を発現するＡＰＣとともにインキュベートされ、そしてＴ細胞の特異的活性化の存在または非存在が検出される。適切な生物学的サンプルとしては、単離されたＴ細胞が挙げられるがこれらに限定されない。例えば、Ｔ細胞は、慣用技術によって（例えば、末梢血リンパ球のＦｉｃｏｌｌ／Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離法によって）患者から単離され得る。Ｔ細胞は、２〜９日間（代表的に４日間）、３７℃にてポリペプチド（例えば、５〜２５μｇ／ｍｌ）とともにインビトロでインキュベートされ得る。Ｔ細胞サンプルの別のアリコートを、コントロールとして役立てるために、腫瘍ポリペプチドの非存在下でインキュベートすることが所望され得る。ＣＤ４^＋Ｔ細胞に関して、活性化は好ましくは、Ｔ細胞の増殖を評価することによって検出される。ＣＤ８^＋Ｔ細胞に関しては、活性化は好ましくは、細胞溶解活性を評価することによって検出される。疾患のない患者におけるよりも少なくとも２倍高い増殖レベルおよび／または少なくとも２０％高い細胞溶解活性レベルは、患者における癌の存在を示す。
【０５１８】
上記のように、癌もまた、あるいは癌が、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルに基づいて検出され得る。例えば、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づくアッセイにおいて用いて、生物学的サンプルに由来する腫瘍ｃＤＮＡの一部を増幅し得、ここで、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの少なくとも１つは、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的である（すなわち、ハイブリダイズする）。次いで、増幅されたｃＤＮＡが、当該分野で周知の技術（例えば、ゲル電気泳動）を用いて分離され、そして検出される。
【０５１９】
同様に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブをハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いて、生物学的サンプル中でこの腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在を検出し得る。
【０５２０】
アッセイ条件下でのハイブリダイゼーションを可能にするために、オリゴヌクレオチドのプライマーおよびプローブは、少なくとも１０ヌクレオチド、そして好ましくは少なくとも２０ヌクレオチドの長さの、本発明の腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの一部に対して少なくとも約６０％、好ましくは少なくとも約７５％、そしてより好ましくは少なくとも約９０％の同一性を有するオリゴヌクレオチド配列を含むべきである。好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーおよび／またはプローブは、上記に規定されるような、中程度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。本明細書中に記載される診断方法において有用に用いられ得るオリゴヌクレオチドのプライマーおよび／またはプローブは、好ましくは、少なくとも１０〜４０ヌクレオチドの長さである。好ましい実施形態において、オリゴヌクレオチドプライマーは、本明細書中に開示される配列を有するＤＮＡ分子の少なくとも１０の連続するヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１５の連続するヌクレオチドを含む。ＰＣＲに基づくアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイの両方についての技術は、当該分野で周知である（例えば、Ｍｕｌｌｉｓら，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５１：２６３，１９８７；Ｅｒｌｉｃｈ編，ＰＣＲ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，１９８９を参照のこと）。
【０５２１】
１つの好ましいアッセイは、ＲＴ−ＰＣＲを用い、ＲＴ−ＰＣＲでは、ＰＣＲは、逆転写と組み合わせて適用される。代表的に、ＲＮＡは生物学的サンプル（例えば、生検組織）から抽出され、そして逆転写されてｃＤＮＡ分子を生成する。少なくとも１つの特異的プライマーを用いるＰＣＲ増幅は、ｃＤＮＡ分子を生成し、このｃＤＮＡ分子は、例えば、ゲル電気泳動を用いて分離および可視化され得る。増幅は、試験患者および癌に罹患していない個体から採取された生物学的サンプルについて行われ得る。増幅反応は、２桁の大きさに及ぶいくつかのｃＤＮＡ希釈物について行われ得る。試験患者サンプルのいくつかの希釈物における発現の増加が、癌のないサンプルの同一希釈の物と比較して２倍以上である場合、これは、代表的に、陽性とみなされる。
【０５２２】
本発明の別の局面において、細胞捕獲技術は、例えば、リアルタイムＰＣＲと組み合わせて使用されて、結腸腫瘍抗原を発現する転移細胞の検出のためのより感度の高いツールを提供し得る。生物学的サンプル（例えば、骨髄サンプル、末梢血、および小針吸引サンプル）における結腸癌細胞の検出は、結腸癌患者の診断および予後判定に望ましい。
【０５２３】
細胞表面マーカーに対する特異的モノクローナル抗体または４量体抗体複合体でコーティングされた免疫磁性ビーズを用いて、サンプル中の癌細胞を最初に富化し得るか、またはサンプル中の癌細胞をポジティブに選択し得る。種々の市販のキットが用いられ得る。これらのキットとしては、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈ（Ｄｙｎａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）、ＳｔｅｍＳｅｐ^ＴＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ）、およびＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。当業者は、他の方法論およびキットが用いられて、所望の細胞集団が富化またはポジティブに選択され得ることを認識する。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｅｎｒｉｃｈは、正常上皮組織および新生物上皮組織上で発現された２つの糖タンパク質膜抗原に特異的なｍＡｂでコーティングされた磁性ビーズを含む。このコーティングされたビーズをサンプルに添加し得、次いで、このサンプルを磁石に接触させ得、それによりこのビーズに結合した細胞を捕獲し得る。所望でない細胞は洗い流され、磁石により単離された細胞は、ビーズから溶出され、さらなる分析において用いられる。
【０５２４】
ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐは、血液サンプルから直接細胞を富化するために用いられ得、そして種々の所望でない細胞を標的とし、サンプル中に存在する赤血球（ＲＢＣ）上のグリコホリンＡにそれらを架橋して、ロゼットを形成する４量体の抗体のカクテルからなる。Ｆｉｃｏｌｌ上で遠心分離すると、標的とした細胞は、遊離のＲＢＣとともにペレットを形成する。枯渇カクテルにおける抗体の組み合わせは、どの細胞が除去され、そして結果的にどの細胞が回収されるかを決定する。利用可能な抗体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ３８、ＣＤ４１、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ５６、ＣＤ６６Ｂ、ＣＤ６６ｅ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＩｇＥ、およびＴＣＲαβ。
【０５２５】
さらに、本発明において、結腸腫瘍抗原に特異的なｍＡｂが生成され得、そして同様な様式で用いられ得ることが意図される。例えば、腫瘍特異的細胞表面抗原に結合するｍＡｂは、磁性ビーズに結合体化され得るか、または４量体抗体複合体に処方され得、そしてサンプルから転移性の結腸腫瘍細胞を富化するか、またはポジティブに選択するために用いられ得る。一旦サンプルが富化されるか、またはポジティブに選択されると、細胞は溶解され得、そしてＲＮＡが単離され得る。次いで、ＲＮＡは、本明細書中に記載のようにリアルタイムＰＣＲアッセイにおいて結腸腫瘍特異的プライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲ分析に供され得る。当業者は、富化されたかまたは選択された集団の細胞が他の方法（例えば、インサイチュハイブリダイゼーションまたはフローサイトメトリー）によって分析され得ることを認識する。
【０５２６】
別の実施形態において、本明細書中に記載された組成物は、癌の進行についてのマーカーとして使用され得る。この実施形態において、癌の診断について上記に記載されるようなアッセイは、経時的に実行され得、そして反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルの変化を評価し得る。例えば、このアッセイは、６ケ月〜１年の期間、２４〜７２時間毎に実行され得、そしてその後、必要に応じて実行され得る。一般に、癌は、検出されるこのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが経時的に増大する患者において進行している。対照的に、癌は、反応性ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが一定のままであるか、または時間とともに減少するかのいずれかである場合、進行していない。
【０５２７】
特定のインビボ診断アッセイは、腫瘍上で直接実施され得る。１つのこのようなアッセイは、腫瘍細胞を結合剤と接触させる工程を包含する。次いで、結合された結合剤は、レポーター基によって直接的または間接的に検出され得る。このような結合剤はまた、組織学的な用途において使用され得る。あるいは、ポリヌクレオチドプローブは、このような用途において使用され得る。
【０５２８】
上記のように、感度を改善するために、複数の腫瘍タンパク質マーカーは、所定のサンプル内でアッセイされ得る。本明細書中に提供される異なるタンパク質に特異的な結合剤が単一のアッセイにおいて組み合わせられ得ることは明かである。さらに、複数のプライマーまたはプローブが同時に用いられ得る。腫瘍タンパク質マーカーの選択は、最適な感度をもたらす組み合わせを決定する慣用実験に基づき得る。さらに、または代替として、本明細書中に提供される腫瘍タンパク質のアッセイは、他の公知の腫瘍抗原に対するアッセイと組み合わせられ得る。
【０５２９】
本発明はさらに、上記の診断方法のうちのいずれかにおいて使用するためのキットを提供する。このようなキットは代表的に、診断アッセイを行うのに必要な２以上の構成要素を備える。構成要素は、化合物、試薬、容器および／または器具であり得る。例えば、キット内の１つの容器は、腫瘍タンパク質に特異的に結合するモノクローナル抗体またはそのフラグメントを含み得る。このような抗体またはフラグメントは、上記のように支持体材料に付着されて提供され得る。１以上のさらなる容器は、アッセイにおいて使用される要素（例えば、試薬または緩衝液）を封入し得る。このようなキットもまた、あるいはこのようなキットは、抗体結合の直接的または間接的な検出に適切なレポーター基を含む上記のような検出試薬を備え得る。
【０５３０】
あるいは、キットは、生物学的サンプル中の腫瘍タンパク質をコードするｍＲＮＡレベルを検出するように設計され得る。このようなキットは一般に、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする、上記のような、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドのプローブまたはプライマーを備える。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーションアッセイにおいて用いられ得る。このようなキット内に存在し得るさらなる構成要素としては、腫瘍タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出を容易にする、第２のオリゴヌクレオチドおよび／または診断試薬もしくは容器が挙げられる。
【０５３１】
以下の実施例は、例示のために提供され、そして限定のためではない。
【０５３２】
（実施例１）
（結腸腫瘍タンパク質ｃＤＮＡの同定）
本実施例は、ＰＣＲに基づくｃＤＮＡサブトラクション方法を用いた、結腸腫瘍タンパク質をコードするｃＤＮＡ分子の同定を例示する。
【０５３３】
Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ，ＣＡ）ＰＣＲ−Ｓｅｌｅｃｔ^ＴＭｃＤＮＡサブトラクション方法の改変を使用して、結腸腫瘍サンプルにおいて示差的に発現された転写物由来のｃＤＮＡ中で富化されているｃＤＮＡ集団を得た。この方法論によって、ｍＲＮＡ集団を結腸腫瘍および転移性腫瘍のサンプル（「テスター」ｍＲＮＡ）から、そして正常組織（例えば、脳、膵臓、骨髄、肝臓、心臓、肺、胃、および小腸）（「ドライバー」ｍＲＮＡ）から単離した。テスターｍＲＮＡおよびドライバーｍＲＮＡの集団から、標準的方法によってｃＤＮＡを合成した。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｆ．Ｍ．ら、Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（第４版、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９）を参照のこと。
【０５３４】
サブトラクション工程は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの方法によって誘導されるよりも大きいフラグメントを生成するように改変した、ＰＣＲに基づくプロトコールを用いて実施した。この改変プロトコールによって、このテスターｃＤＮＡおよびドライバーｃＤＮＡを、それぞれが特有の６塩基対ヌクレオチド配列を認識する５つの制限エンドヌクレアーゼ（Ｍｌｕ　Ｉ、Ｍｓｃ　Ｉ、Ｐｖｕ　ＩＩ、Ｓａｌ　ＩおよびＳｔｕ　Ｉ）を用いて別々に消化した。この消化によって、Ｃｌｏｎｔｅｃｈの方法に従うＲｓａ　Ｉでの消化から生じる平均サイズ３００ｂｐではなく、６００ｂｐの平均ｃＤＮＡサイズを得た。この改変は、最終的なサブトラクション効率に影響しなかった。
【０５３５】
制限消化後、特有のヌクレオチド配列を有するアダプターオリゴヌクレオチドを、テスターｃＤＮＡの５’末端上に連結した；アダプターオリゴヌクレオチドをドライバーｃＤＮＡ上に連結しなかった。このテスターｃＤＮＡおよびドライバーｃＤＮＡを、引き続き、過剰のドライバーｃＤＮＡを用いて互いにハイブリダイズさせた。このハイブリダイゼーション工程によって、（ａ）ハイブリダイズしてないテスターｃＤＮＡ、（ｂ）他のテスターｃＤＮＡに対してハイブリダイズしたテスターｃＤＮＡ、（ｃ）ドライバーｃＤＮＡに対してハイブリダイズしたテスターｃＤＮＡ、（ｄ）ハイブリダイズしていないドライバーｃＤＮＡ、および（ｅ）ドライバーｃＤＮＡにハイブリダイズしたドライバーｃＤＮＡの集団を得た。
【０５３６】
他のテスターｃＤＮＡにハイブリダイズしたテスターｃＤＮＡを、連結したアダプターに相補的なプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって選択的に増幅した。テスターｃＤＮＡのみがアダプター配列に連結され、ハイブリダイズしていないテスターｃＤＮＡにもドライバーｃＤＮＡにも連結されなかったので、ドライバーｃＤＮＡにハイブリダイズしたテスターｃＤＮＡも、ドライバーｃＤＮＡにハイブリダイズしたドライバーｃＤＮＡも、アダプター特異的オリゴヌクレオチドを用いて増幅されなかった。ＰＣＲ増幅したテスターｃＤＮＡを、ｐＣＲ２．１プラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でクローニングして、示差的に発現された結腸腫瘍抗原および結腸転移性腫瘍抗原に特異的ｃＤＮＡに富んだライブラリーを作成した。
【０５３７】
ｐＣＲ２．１腫瘍抗原ｃＤＮＡライブラリー由来の３０００クローンを、無作為に選択して、マイクロアレイ分析（Ｒｏｓｅｔｔａ；Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡによって実施）およびヌクレオチド配列決定のためのクローンを得るために用いた。各ｐＣＲ２．１クローンからのｃＤＮＡインサートを以下のようにＰＣＲ増幅した。要するに、０．５μｌのグリセロールストック溶液を、９９．５μｌのＰＣＲ混合液に添加した。このＰＣＲ混合液は、８０μｌ　Ｈ２Ｏ、１０μｌ　１０×ＰＣＲ緩衝液、６μｌ　ＭｇＣｌ_２、１μｌ　１０ｍＭ　ｄＮＴＰ、１μｌ　１００ｍＭ　Ｍ１３フォワードプライマー（ＣＡＣＧＡＣＧＴＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧ）、１μｌ　１００ｍＭ　Ｍ１３　リバースプライマー（ＣＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ）、および０．５μｌ　５ｕ／ｍｌ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含有する。本明細書において用いられるＭ１３のフォワードプライマー、およびリバースプライマーは、Ｏｐｅｒｏｎ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）から入手した。以下の条件下でＰＣＲ増幅を３０サイクル実施した：９５℃５分間、９２℃３０秒間、５７℃４０秒間、７５℃２分間、および７５℃５分間。
【０５３８】
結腸腫瘍組織（ｎ＝２５）、正常結腸組織（ｎ＝６）、腎臓、肺、肝臓、脳、心臓、食道、小腸、胃、膵臓、副腎、唾液腺、休止ＰＢＭＣ、活性化ＰＢＭＣ、骨髄、樹状細胞、脊髄、血管、骨格筋、皮膚、胸部（乳房）および胎児組織において、マイクロアレイ技術を用いて、代表的なクローンのためのｍＲＮＡ発現レベルを決定した。マイクロアレイ分析を実施するための例示的方法は、Ｓｃｈｅｎａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ　２７０：４６７〜４７０に記載されている。それぞれの場合において試験した組織サンプルの数は、上記で特に注記したところを除けば１つ（ｎ＝１）であった；さらに、上述の組織の全てはヒト由来であった。
【０５３９】
ＰＣＲ増幅産物をアレイフォーマット中のスライド上にドットしているが、この各産物は、アレイ中で特有の位置を占める。ｍＲＮＡを、試験されるべき組織サンプルから抽出し、そして蛍光ヌクレオチドであるΨ５およびΨ３の存在下で、標準的方法を用いて、逆転写によって、蛍光標識したｃＤＮＡプローブを生成した。例えば、逆転写反応を実施するための例示的反応条件については、Ａｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと；Ψ５およびΨ３蛍光標識されたヌクレオチドは、例えば、Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、またはＮＥＮ（登録商標）Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から入手可能である。マイクロアレイを、蛍光標識したｃＤＮＡでプローブし、スライドをスキャン（走査）し、そして蛍光強度を測定した。ｃＤＮＡマイクロアレイを調製するための、および蛍光強度を測定するためのＧｅｎｅｔｉｃ　ＭｉｃｒｏＳｙｓｔｅｍｓ計測器が、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ）から入手可能である。
【０５４０】
正常組織から得たｃＤＮＡプローブでプローブした同じセクターにおける蛍光強度と比べた、結腸腫瘍または結腸転移性腫瘍組織から得たｃＤＮＡプローブでプローブしたマイクロアレイセクターにおける蛍光強度の上昇によって、結腸腫瘍または結腸転移性腫瘍組織において示差的に発現される腫瘍抗原遺伝子が示される。
【０５４１】
マイクロアレイベースの方法によって、ＰＣＲサブトラクトした、示差的な結腸腫瘍および結腸転移性腫瘍ｃＤＮＡライブラリーから、配列番号１〜２３４として本明細書に開示されたクローン、および表２〜４に記載されたクローンを同定した。これらの２３４のクローンのうち、配列番号１、６、１８〜２０、２７、３０、３７、４０、５７、６５、８１、８２、８６、８８、９１、９５、９６、１０６、１０７、１１７、１２１、１２３、１２６、１３０、１４８、１５０、１５２、１５５、１５７、１５９、１６１、１７４、１７５、１８０、１８２、１８７、１９０、１９１、１９２、２０３、２０４、および２０９に対応するクローンは、Ｇｅｎｂａｎｋにおける公知の配列に対して有意な類似性を示さなかった。
【０５４２】
表２
Ｇｅｎｂａｎｋ中の配列に対して有意な類似性を示さないｃＤＮＡ配列
【０５４３】
【表２】

。
【０５４４】
表３
公知の機能を有さない、Ｇｅｎｂａｎｋ中の配列に対して同程度の類似性を有する配列
【０５４５】
【表３】

。
【０５４６】
表４
Ｇｅｎｂａｎｋ中の公知の配列に対して同程度の類似性を有するｃＤＮＡ配列
【０５４７】
【表４】

。
【０５４８】
（実施例２）
Ｃ９０７Ｐは、結腸腫瘍において過剰発現される
上記で考察したサブトラクトしたｃＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡマイクロアレイから発見されたＣ９０７Ｐ　ｃＤＮＡ配列を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを検索した。Ｃ９０７Ｐは、Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎ（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｄ３０７８３）と名付けられた公知の遺伝子とマッチする。２つの遺伝子特異的プライマーを合成して、ＰＣＲ増幅に用い、結腸ｃＤＮＡからこの遺伝子をクローニングした。増幅したＰＣＲ産物を配列決定して、その同一性を確認した。このように、Ｃ９０７Ｐ−Ｅｐｉｒｅｇｕｌｉｎは、結腸癌で上方制御された遺伝子である。９４℃で１分間でｃＤＮＡを変性させ、次いで、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃２分間の３５サイクルの条件下で、ＰＣＲを実施した。プルーフリーディングポリメラーゼを増幅に用いた。ＰＣＲに用いたｃＤＮＡテンプレートを、結腸腫瘍ｍＲＮＡから合成した。増幅した産物をＴＡクローニングベクター中でクローニングし、そして配列を決定した。Ｃ９０７Ｐ　ＤＮＡ配列は、配列番号２３４中で示しており、そしてこのアミノ酸配列を配列番号２３５に示す。
【０５４９】
（実施例３）
（Ｃ９１５Ｐ結腸腫瘍抗原の全長ＰＣＲ増幅およびｃＤＮＡクローニング）
サブトラクトしたｃＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡマイクロアレイ（実施例１に考察）から発見したＣ９１５Ｐ　ｃＤＮＡ配列（配列番号３３；クローン識別番号５４１６０とも呼ばれる）を用いて、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースを検索した。Ｃ９１５Ｐは、スーパーオキシド生成オキシダーゼＭｏｘ１と名付けられた公知の遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＦ１２７７６３）に対して同程度の類似性を有することが見出された。全長ｃＤＮＡを増幅するために、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託された配列に従って、２つの遺伝子特異的プライマーを設計した。９４℃で１分間でｃＤＮＡを変性させ、次いで、９４℃３０秒間、６０℃３０秒間、７２℃２分間の３５サイクルの条件下で、ＰＣＲを実施した。プルーフリーディングポリメラーゼを増幅に用いた。ＰＣＲに用いたｃＤＮＡテンプレートを、結腸腫瘍ｍＲＮＡから合成した。増幅した産物をＴＡクローニングベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中でクローニングし、そして自動ＤＮＡ配列決定によってランダムクローンを配列決定して、同一性を確認した。Ｃ９１５Ｐの全長ｃＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ、配列番号２４４および２４５に示す。
【０５５０】
Ｃ９１５Ｐ　ｃＤＮＡの発現レベルをリアルタイム（実時間）ＰＣＲによってさらに分析した。この分析を用いて、Ｃ９１５Ｐが、正常組織のパネルに比べて結腸腫瘍において過剰発現されることを確認した。正常な結腸組織において、中度のレベルの発現が観察された。リアルタイムＰＣＲ（Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９９５〜１００１，１９９６；Ｈｅｉｄら、Ｇｅｎｏｍｅ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　６：９８６〜９９４，１９９６を参照のこと）は、増幅の間のＰＣＲ産物の蓄積のレベルを評価する技術である。この技術によって、複数のサンプルにおけるｍＲＮＡレベルの定量的評価が可能になる。手短に言うと、ｍＲＮＡを結腸腫瘍組織および正常組織から抽出し、そして標準的技術を使用してｃＤＮＡを調製した。リアルタイムＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）７７００　Ｐｒｉｓｍ機器を使用して実施した。一致するプライマーおよび蛍光プローブを、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ／Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）によって提供されたプライマー発現プログラムを用いてＣ９１５Ｐのために設計した。プライマーおよびプローブの至適濃度を最初に決定し、そしてコントロール（例えば、βアクチン）プライマーおよびプローブは市販されていた。サンプル中の特定のＲＮＡの量を定量するために、Ｃ９１５Ｐ　ｃＤＮＡを含有するプラスミドを用いて標準曲線を作成した。アッセイ中で用いた最初のｃＤＮＡ濃度に関係する、リアルタイムＰＣＲで決定したＣｔ値を用いて標準曲線を作成した。１０〜１０^６コピーのＣ９１５Ｐの範囲にわたる標準希釈が一般に十分であった。さらに、標準曲線をコントロール配列について作成した。これによって、比較の目的のため、コントロールの量に対する組織サンプルの初期ＲＮＡ含量の標準化が可能になった。
【０５５１】
（実施例４）
（Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＲａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３組み換えタンパク質の産生）
Ｃ９１５Ｐ（これはまた、クローン識別子５４１６０と呼ばれ、そして配列番号３３および２４４（ｃＤＮＡ）、および配列番号２４５（アミノ酸）に示される）は、３つの細胞外ループ（ＥＤ１、ＥＤ２、およびＥＤ３）を有する６つの膜貫通ドメイン（ＴＭ）を有する。欠失組み換えタンパク質である、Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３（配列番号２３６（ｃＤＮＡ）および配列番号２３７（アミノ酸）に示す）は、ｐＣＲＸ１ベクター（ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ　Ｉ）中の組み換えの改変されたＣ９１５ＰのＮ末端Ｒａ１２融合物である。
【０５５２】
（Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３のクローニングストラテジー）
３セットのプライマーを設計し、引き続いて、これを用いて、２つの内部膜貫通ドメインを欠失し、そしてＣ９１５Ｐの組み換えられた内部領域（ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断され、そしてｐＣＲＸ１ベクター中のＲａ１２とインフレームで連結された）を増幅させた。
【０５５３】
１回目のＰＣＲでは、構築物全体（ＴＭ４−ＩＤ３−ＴＭ５を欠く）を増幅するために、プライマーＡＷ１５７およびプライマーＡＷ１５６（それぞれ、配列番号２４１および２４０）を用いた。ＰＣＲ産物（Ｃ９１５Ｐ（マイナスＴＭ４−ＩＤ３−ＴＭ５）ＰＣＲ　Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ　ＴＯＰＯバックボーン）を、アガロースゲルから精製し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで連結し、以下の標準的プロトコールでＮｏｖａＢｌｕｅ　Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した：コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞を氷上で解凍し、ＤＮＡ（または連結混合液）を添加し、この反応物を混合して氷上で５分間インキュベートした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を４２℃で３０秒間熱ショックし、そして２分間氷上においた。富化した増殖培地をＥ．ｃｏｌｉに添加し、そして３７℃で１時間増殖させた。培養物をＬＢ（適切な抗生物質添加）上にプレートし、そして３７℃で一晩増殖させた。翌日、いくつかのコロニーをミニプレップ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）用に無作為に選択し、そして正確に欠失した領域についてＤＮＡ配列決定によって確認した。次いで、下記のように、Ｃ９１５Ｐの第二領域においてこの工程を繰り返した。
【０５５４】
２回目のＰＣＲでは、テンプレートとして、１回目のＰＣＲ由来の確認したクローンを用いて、ＴＭ２を欠失させるために、プライマーＡＷ１５５およびプライマーＡＷ１５４（それぞれ、配列番号２３９、および２３８）を用いた。ＰＣＲ産物（Ｃ９１５Ｐ（マイナスＴＭ２／ＴＭ４−ＩＤ３−ＴＭ５）ＰＣＲ　Ｂｌｕｎｔ　ＩＩ　ＴＯＰＯバックボーン）を精製し、連結して、ＮｏｖａＢｌｕｅ細胞中に、標準的なプロトコールを用いて形質転換して、クローンを得、これを正確な欠失についての配列決定によって確認した。
【０５５５】
３回目のＰＣＲでは、テンプレートとして、確認した２回目のＰＣＲのクローンを用いて、Ｃ９１５Ｐの欠失した、組み換えた３部分融合タンパク質である、ＥＤ１−ＩＤ２−ＴＭ３−ＥＤ２−ＥＤ３を増幅するために、プライマーＡＷ１５８およびプライマーＡＷ１５９（それぞれ、配列番号２４２および２４３）を用いた。３回目のＰＣＲ由来のＰＣＲ産物を精製し、ｐＣＲＸ１ベクターへの連結のためにＲｃｏＲ　ＩおよびＸｈｏ　Ｉ（ＥｃｏＲ　Ｉ、ＸｈｏＩ）を用いて消化した。連結混合液を、標準的プロトコールによってＮｏｖａＢｌｕｅ細胞に形質転換し、そして、いくつかのコロニーをミニプレップおよび配列決定用に選択した。ＤＮＡ配列決定によってＵＩ＃７０５２６が、正確なｐＣＲＸ１　Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３構築物であることを確認した。
【０５５６】
クローニング　プライマー：
Ｃ９１５Ｐ−ＡＷ１５４（配列番号２３８）：ＴＭ２，５’Ｐ−プライマーＩｄ９６８２：５’Ｐ−ＴＴＴＴＣＴＴＧＴＧＴＡＧＴＡＧＴＡＴＴＴＧＴＣＧを欠失するためのアンチセンスクローニングプライマー。
【０５５７】
Ｃ９１５Ｐ−ＡＷ１５５（配列番号２３９）：ＴＭ２，５’Ｐ−Ｉｄ９６８３：５’Ｐ−ＴＧＴＣＧＣＡＡＴＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣを欠失するためのセンスクローニングプライマー。
【０５５８】
Ｃ９１５Ｐ−ＡＷ１５６（配列番号２４０）：ＴＭ４−ＴＭ５領域，５’−Ｐ，−−プライマーＩｄ９６８４：５’Ｐ−ＧＣＴＧＧＴＧＡＡＴＧＴＣＡＣＡＴＡＣＴＣＣを欠失するためのアンチセンスクローニングプライマー。
【０５５９】
Ｃ９１５Ｐ−ＡＷ１５７（配列番号２４１）：ＴＭ４−ＴＭ５領域，５’−Ｐ−Ｉｄ９６８５：５’Ｐ−ＣＧＧＧＧＴＣＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧを欠失するためのセンスクローニングプライマー。
【０５６０】
Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−Ｆ３−ＡＷ１５８（配列番号２４２）：ＥｃｏＲ　Ｉ部位プライマーＩｄ９６８６：５’ｇｔｃｇａａｔｔｃＧＡＴＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＡＡＴＡＴＧＡＧＡＡＧとの融合タンパク質のためのセンスクローニングプライマー。
【０５６１】
Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−Ｆ３−ＡＷ１５９（配列番号２４３）：終止部位およびＸｈｏ　Ｉ部位−プライマーＩｄ９６８７：５’ｃａｃｃｔｃｇａｇｔｔａＡＧＡＣＴＣＡＧＧＧＧＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣとの融合タンパク質のためのアンチセンスクローニングプライマー。
【０５６２】
（Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３についてのタンパク質情報：）
分子量３２４２９．４５ダルトン
２９７アミノ酸
２８の強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ）
２７の強酸性（−）アミノ酸（Ｄ、Ｅ）
９３の疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）
８６の極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ，Ｓ、Ｔ、Ｙ）
等電点７．７７６
電荷３．７１１（ｐＨ７．０）。
【０５６３】
（タンパク質発現：）
ミニ発現スクリーニングを実施して、Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３についての最適誘導条件を決定した。異なる宿主へ発現構築物を形質転換すること、次いで誘導因子ＩＰＴＧを対数増殖中期の培養物に添加した後の温度、培養培地、および／またはＩＰＴＧ濃度を変化することによって最高のＥ．ｃｏｌｉ株／培養条件をスクリーニングした。次いで、組み換えタンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび／またはウエスタンブロットによって分析した。Ｅ．ｃｏｌｉ発現宿主ＢＬＲ（ＤＥ３）およびＨＭＳ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を種々の培養条件で試験し、これにはわずかな全長Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３発現の検出、および予期せぬ分子量のいくつかのバンドを示すウエスタンブロットを伴った。次いで、Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を、種々のＩＰＴＧ濃度でヘルパープラスミドを用いて試験した。クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、バンドの誘導は示されなかったが、ウエスタンブロットによって、抗６ｘｈｉｓタグ抗体を用いた３２ｋＤプローブ化で強力なＲａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３シグナルが確認された。ｐＣＲＸ１　Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３の最適の発現は、３７℃で３時間１．０ｍＭ　ＩＰＴＧで誘導した、３７℃のＳｏｙ　Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地中で増殖したヘルパープラスミドを有する宿主株Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）中であることが見出された。
【０５６４】
（実施例５）
Ｅ．ｃｏｌｉからのＲａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３組み換え融合タンパク質の精製
クローンＣ９１５Ｐは、結腸癌組織のほとんどにおいて過剰発現されることが見出された。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために、構築物Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３（配列番号２３６）を、実施例４に記載のように作製した。この構築物は、Ｎ末端の６×ヒスチジンタグ、続いてＲａ１２および改変Ｃ９１５Ｐ（６つの膜貫通ドメインのうち５つを除く）（配列番号２３７）からなる融合タンパク質をコードする。１ＬのＳｏｙ　Ｔｅｒｒｉｆｉｃ　Ｂｒｏｔｈ培地を含有する複数の大型バッフル付シェーカー（振盪器）中で、３２．４ｋＤタンパク質を発現した。この培養物をスピンし、そして細胞ペレットを洗浄して、再スピンして、精製用に凍結した。細胞溶解後、組み換えタンパク質を、可溶性の封入体画分において見出した。この封入体を緩衝化した界面活性剤で何度も徹底的に洗浄し、次いでこのタンパク質ペレットを変性させ、還元し、そして緩衝化した８Ｍ尿素中に可溶化し、そしてＲａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３タンパク質をＮｉ−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーマトリックスに結合させた。このマトリックスを洗浄し、混入しているＥ．ｃｏｌｉタンパク質をリンスしてとり、そしてＲａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３を高濃度イミダゾールを用いて引き続き溶出した。Ｒａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３を含有する画分をプールして、ゆっくり透析し、タンパク質を再生させた。次いで精製したＲａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３を濾過して定量した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって、約３２ｋＤの予想分子量で泳動する主なバンドを有するニッケルカラムの溶出パターンが示された。抗６Ｘ　Ｈｉｓタグ抗体を用いたウエスタンブロットによって、これをさらに確認した。ウエスタンブロットによって、また組み換えの二量体および四量体の証拠が明らかになった。Ｎ末端配列決定によって、約９０％の純度が確認された。精製収率は約２．５ｍｇ／Ｌ誘導であった。
【０５６５】
以下は、精製したＲａ１２−Ｃ９１５Ｐ−ｆ３の生成の詳細なプロトコールである。
【０５６６】
（凍結した細菌細胞ペレットについて：）
１．氷上で１Ｌの誘導物から細菌細胞ペレットを解凍する
２．誘導培養物の１Ｌあたり２５ｍｌの超音波処理緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，５００ｍＭ　ＮａＣｌ）を添加する
３．超音波緩衝液／ペレット混合物に対して１の完全プロテアーゼインヒビター錠剤および２ｍＭ　ＰＭＳＦ（Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｆｌｕｏｒｉｄｅ）を添加する
４．ピペットを用いてペレットを完全に再懸濁する
５．０．５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（−２０℃で保管した凍結乾燥リゾチームから新鮮に作製した）を添加する
６．ガラスビーカー＋攪拌バー中にデカントし、４℃で３０分穏やかに攪拌する７．２×１１００ｐｓｉでフレンチプレスし、氷上で保持する
８．一旦、溶解溶液^＊＊が低粘性になれば、１１０００ＲＰＭで、３０分間４℃でスピンする
９．上清^＊＊およびペレットをとっておく
（上記工程９由来のペレットについて：）
１．ペレットを２５ｍｌ　０．５％　ＣＨＡＰＳ（３−（［３−クロラミドプロピル］ジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート）洗浄液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（８．０），５００ｍＭ　ＮａＣｌ）^＊＊を用いて、２×１５秒、１５ワットでの超音波処理によって、ペレットを洗浄する
２．１１０００ＲＰＭで２５分間スピンし、５×^＊＊繰り返す
３．０．５％ＤＯＣ（デオキシコール酸）洗浄液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（８．０），５００ｍＭ　ＮａＣｌ）を用いて、上記工程を３回繰り返す
４．超音波処理を用いて、ペレット結合緩衝液（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（８．０），５００ｍＭ　ＮａＣｌ，８Ｍ　尿素、２０ｍＭ　イミダゾール、１０ｍＭ　β−メルカプトエタノール）中でペレットを再懸濁する
５．ペレット結合緩衝液を用いてＮｉ＋＋ＮＴＡ（ニトリロ三酢酸）樹脂（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を平衡化し、スピンダウンして、洗浄液をデカントする（４ｍｌ樹脂を使用する）
６．再懸濁したペレットに樹脂を添加し、室温で４５分間攪拌する
７．カラムおよび緩衝液を準備し、ペレット結合緩衝液でカラムをリンスする
８．カラム中にペレット／Ｎｉ樹脂を注ぎ、（ＦＴ）^＊＊を通してフローを収集する
９．３０ｍｌのペレット結合緩衝液^＊＊でカラムを洗浄する。
１０．０．５％ＤＯＣ（デオキシコール酸）^＊＊を含む３０ｍｌのペレット結合緩衝でカラムを洗浄する
１１．３０ｍｌのペレット結合緩衝液でカラムを洗浄する
１２．５×５ｍｌ画分のペレット結合緩衝液＃１（結合緩衝液＋３００ｍＭイミダゾール）^＊＊で溶出する
１３．２×５ｍｌ画分のペレット溶出緩衝液＃２（結合緩衝液＋３００ｍＭイミダゾール，ｐＨ４．５）^＊＊で溶出する
１４．精製工程（ウエスタンおよびクマシー染色）を選別するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥにかける
^＊＊ＳＤＳ−ＰＡＧＥでチェックするために各精製工程について４℃でアリコートを保存する。
【０５６７】
（実施例６）
結腸腫瘍候補遺伝子のリアルタイムＰＣＲ分析
Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（ＲＴ）（Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＤＮａｓｅＩ（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｇｒａｄｅ，Ｇｉｂｃｏ　ＢＲＬ　Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤ）で処理した２０μｇの総ＲＮＡから、定量的リアルタイムＰＣＲにおいて用いるべき第一鎖ｃＤＮＡを合成した。ＧｅｎｅＡｍｐ^ＴＭ５７００配列決定システム（ＰＥ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてリアルタイムＰＣＲを実施した。５７００システムは、ＳＹＢＲ^ＴＭグリーン（二本鎖ＤＮＡ中にのみインターカレートする蛍光色素）、ならびに１セットの遺伝子特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用する。蛍光の増大を増幅プロセス全体の間モニターする。プライマーの至適濃度をチェッカーボードアプローチを用いて決定し、そして乳房腫瘍由来のｃＤＮＡのプールをこのプロセスで用いた。２．５μｌのＳＹＢＲグリーン緩衝液、２μｌのｃＤＮＡテンプレート、および各々２．５μｌのフォワードプライマーおよびリバースプライマー（目的の遺伝子用）を含む、２５μｌの容積中でＰＣＲ反応を実施した。ＲＴ反応に用いたｃＤＮＡは、目的の各遺伝子について１：１０に、そしてβアクチンコントロールについて１：１００に希釈した。サンプル中の特定のｃＤＮＡ（従って最初のｍＲＮＡ）の量を定量するために、目的の遺伝子を含有するプラスミドＤＮＡを用いて各実行について標準曲線を作成する。このアッセイ中で用いた最初のｃＤＮＡ濃度に関連した、リアルタイムＰＣＲで決定したＣｔ値を用いて標準曲線を作成した。目的の遺伝子の２０〜２×１０^６コピーの範囲の標準希釈液をこの目的に用いた。さらに、２００ｆｇ〜２０００ｆｇの範囲のβアクチンについて標準曲線を作成する。これによって、比較目的のためのβアクチンの量に対する組織サンプルの初期ＲＮＡ含量の標準化が可能になった。試験した組織の各群に対する平均コピー数を、一定量のβアクチンに対して正規化し、これによって各々の遺伝子でみられる過剰発現レベルの評価が可能になった。
【０５６８】
結腸腫瘍候補遺伝子である、Ｃ９０６Ｐ（配列番号５）、Ｃ９０７Ｐ（配列番号２３４（ｃＤＮＡ）および配列番号２３５（アミノ酸）、Ｃ９１１Ｐ（配列番号２１）、Ｃ９１５Ｐ（配列番号２４４（ｃＤＮＡ）および配列番号２４５（アミノ酸））、Ｃ９４３Ｐ（配列番号１４０）、およびＣ９６１Ｐ（配列番号２００）を、短い結腸パネルおよび伸長した結腸パネルを用いて、上記のように、リアルタイムＰＣＲによって分析した。これらの遺伝子、結腸腫瘍の３０〜５０％においてｍＲＮＡ発現を増大させたことが見出された。Ｃ９０６Ｐについて、正常気管、心臓および正常結腸において、わずかな発現の上昇がまた観察された。Ｃ９０７Ｐについては、活性化ＰＢＭＣにおいて発現の上昇がまた観察され、そして心臓および正常結腸においてわずかな発現の上昇が観察された。Ｃ９１１Ｐについては、わずかな発現の上昇が膵臓において観察された。Ｃ９１５Ｐについては、正常結腸以外の正常組織においては発現が観察されなかった。Ｃ９４３Ｐについては、正常結腸以外の正常組織においては発現は観察されなかった。Ｃ９６１Ｐについては、気管および正常結腸においてある程度の発現が観察された。まとめると、このデータは、これらの結腸腫瘍候補物遺伝子が、免疫療法および癌診断についての潜在的な標的であり得ることを示す。
【０５６９】
（実施例７）
（Ｔヘルパー株のペプチドプライミング）
ＣＤ４^＋Ｔヘルパー株の生成、およびＨＬＡクラスＩＩ分子の状況でＣＤ４^＋Ｔ細胞によって認識され得る腫瘍特異的抗原由来のペプチドエピトープの同定を、以下のように実施する：
１０アミノ酸ずつ重複する１５マーのペプチド（腫瘍特異的抗原由来）を、標準的な手順を用いて生成する。樹状細胞（ＤＣ）は、標準的プロトコールによってＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を用いて正常ドナーのＰＢＭＣから誘導される。ＭＡＣＳビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）およびデガティブ選択を用いて、ＤＣとして同じドナーからＣＤ４^＋Ｔ細胞を生成する。１５マーペプチドのプールを用いてＤＣを一晩パルスする（ここで各ペプチドは０．２５μｇ／ｍｌの最終濃度）。パルスしたＤＣを洗浄し、そして９６ウェルＶ底プレートで１×１０^４細胞／ウェルにプレートし、そして精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞を１×１０^５／ウェルで添加した。培養物に６０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−６および１０ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−１２を補充し、そして３７℃でインキュベートする。培養物を、抗原提示細胞として上記のように生成してパルスしたＤＣを用いて週に１回の頻度で、上記のように再刺激し、５ｎｇ／ｍｌ　ＩＬ−７および１０　Ｕ／ｍｌ　ＩＬ−２を補充する。４回のインビトロ刺激サイクル後、得られたＣＤ４^＋Ｔ細胞株（各株は１つのウェルに対応する）を、特定の増殖について試験し、そしてペプチドの無関係のプールを用いたペプチドの、プール刺激に応答するサイトカインの産生をコントロールとして用いる。
【０５７０】
（実施例８）
（インビトロ全遺伝子プライミングを用いる腫瘍特異的ＣＴＬ株の生成）
腫瘍抗原−ワクシニア感染ＤＣを用いたインビトロの全遺伝子プライミング（例えば、Ｙｅｅら、Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７（９）：４０７９〜８６，１９９６を参照のこと）を用いて、インターフェロンγ　ＥＬＩＳＰＯＴ分析で決定されるように、特定の腫瘍抗原で形質導入された自系の線維芽細胞を特異的に認識するヒトＣＴＬ株を誘導する。詳細には、樹状細胞（ＤＣ）は、１０％ヒト血清、５０ｎｇ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦおよび３０ｎｇ／ｍｌヒトＩＬ−４を含有するＲＰＭＩ培地中での５日間の増殖によって、正常ヒトドナーのＰＢＭＣに由来する単球培養物から分化する。培養後、５の感染効率（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）で腫瘍抗原組換えワクシニアウイルスを用いてＤＣを一晩感染させ、そして３μｇ／ｍｌのＣＤ４０リガンドの添加によって一晩成熟させる。次いで、ウイルスをＵＶ照射によって不活化する。磁気ビーズ系を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、そして標準的培養技術を用いてプライミング培養を開始する。以前に同定した腫瘍抗原でレトロウイルスで形質導入した自系初代線維芽細胞を用いて、培養物を７〜１０日ごとに再刺激する。４回の刺激サイクル後、腫瘍抗原を形質導入された自系線維芽細胞で刺激した場合、インターフェロンγを特異的に生成するＣＤ８＋Ｔ細胞株を同定する。腫瘍抗原を発現するベクターを形質導入したＨＬＡ不適合Ｂ−ＬＣＬ株のパネルを用い、そしてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいてＣＴＬ株によるインターフェロンγ生成を測定して、ＣＴＬ株のＨＬＡ拘束を決定する。
【０５７１】
（実施例９）
（抗腫瘍抗原モノクローナル抗体の生成および特徴づけ）
マウスモノクローナル抗体を以下のように、Ｅ．ｃｏｌｉ由来腫瘍抗原タンパク質に対して惹起させた：５０μｇの組換え腫瘍タンパク質を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、続いて１０μｇの組換えタンパク質を含有する不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）での引き続く腹腔内ブーストによってマウスを免疫する。脾臓の摘出の３日前、約５０μｇの可溶性組換えタンパク質を用いてマウスを静脈内免疫する。腫瘍抗原に対して正の力価を有するマウスの脾臓を取り出し、そして単一細胞懸濁液を作成して、ＳＰ２／Ｏミエローマ細胞への融合に用いてＢ細胞ハイブリドーマを生成する。ハイブリッドクローンからの上清を、組換え腫瘍タンパク質に対する特異性についてＥＬＩＳＡによって試験し、そして腫瘍タンパク質配列全体にまたがるペプチドを用いてエピトープをマッピングした。腫瘍タンパク質をコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクトした細胞の表面上で、ｍＡｂが腫瘍タンパク質を検出する能力について、ｍＡｂをまたフローサイトメトリーによって試験する。
【０５７２】
前述の内容から、本発明の特定の実施形態が例示の目的で本明細書に記載されているが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、種々の改変がなされ得ることが理解される。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲による以外には限定されない。

Claims (17)

1. 患者における免疫応答を刺激するための薬学的組成物であって、第一の成分および第二の成分を含み、該第一の成分は、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫刺激剤からなる群より選択され、そして該第二の成分は、以下：
   （ａ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つに記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
   （ｂ）配列番号２４５および２３５のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
   （ｃ）配列番号２４５および２３５のいずれか１つに記載される配列に少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
   からなる群より選択されるポリペプチドを含む、薬学的組成物。
2. 患者における癌の処置のための薬学的組成物であって、第一の成分および第二の成分を含み、該第一の成分は、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫刺激剤からなる群より選択され、そして該第二の成分は、以下：
   （ａ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つに記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
   （ｂ）配列番号２４５および２３５のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むポリペプチド；ならびに
   （ｃ）配列番号２４５および２３５のいずれか１つに記載される配列に少なくとも９０％同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
   からなる群より選択されるポリペプチドを含む、薬学的組成物。
3. 単離されたポリヌクレオチドであって、該ポリヌクレオチドは、以下：
   （ａ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つに提供される配列；
   （ｂ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つに提供される配列の相補体；
   （ｃ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つに提供される配列の少なくとも２０連続する残基からなる配列；
   （ｄ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つに提供される配列に、中度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列；
   （ｅ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つの配列に、少なくとも７５％の同一性を有する配列；
   （ｆ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つの配列に、少なくとも９０％の同一性を有する配列；ならびに
   （ｇ）配列番号２４４および２３４のいずれか１つに提供される配列の縮重改変体；
   からなる群より選択される配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
4. 単離されたポリペプチドであって、以下：
   （ａ）請求項３のポリヌクレオチドによってコードされる配列；
   （ｂ）請求項３に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に少なくとも７０％の同一性を有する配列；
   （ｃ）請求項３に記載のポリヌクレオチドによってコードされる配列に少なくとも９０％の同一性を有する配列；ならびに
   （ｄ）配列番号２４５および２３５のいずれか１つに提供されるアミノ酸配列；
   からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
5. 発現制御配列に作動可能に連結された請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
6. 請求項５に記載の発現べクターで形質転換またはトランスフェクトされた、宿主細胞。
7. 請求項４に記載のポリペプチドに特異的に結合する、単離された抗体またはその抗原結合フラグメント。
8. 患者における癌の存在を検出するためのキットであって、該キットは、以下：
   （ａ）請求項４に記載のポリペプチドに結合する結合因子；
   （ｂ）該結合因子に結合するポリペプチドの量を生物学的サンプル中で検出するための説明書；および
   （ｃ）該ポリペプチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そして、それから、該患者における癌の存在を決定するための説明書、
   を備える、キット。
9. 請求項４に記載の少なくとも１つのポリペプチドを含む、融合タンパク質。
10. 配列番号２４４、および２３４のいずれか１つに記載される配列に中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、オリゴヌクレオチド。
11. 腫瘍タンパク質に特異的なＴ細胞とを刺激および／または拡大するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）請求項４に記載のポリペプチド；
    （ｂ）請求項３に記載のポリヌクレオチド；および
    （ｃ）請求項３に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
    からなる群より選択される少なくとも１つの成分と、Ｔ細胞を、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を可能にするのに十分な条件下および時間で接触させる工程、を包含する、方法。
12. 請求項１１に記載の方法に従って調製されたＴ細胞を含む、単離されたＴ細胞集団。
13. 第１の成分および第２の成分を含む組成物であって、該第１の成分は、生理学的に受容可能なキャリアおよび免疫刺激剤からなる群より選択され、そして該第２の成分は、以下：
    （ａ）請求項４に記載のポリペプチド；
    （ｂ）請求項３に記載のポリヌクレオチド；
    （ｃ）請求項７に記載の抗体；
    （ｄ）請求項９に記載の融合タンパク質；
    （ｅ）請求項１２に記載のＴ細胞集団；および
    （ｆ）請求項４に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
    からなる群より選択される、組成物。
14. 患者における癌の存在を決定するためのキットであって、該キットは、以下：
    （ａ）請求項１０に記載のオリゴヌクレオチド；
    （ｂ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を生物学的サンプル中で検出するための説明書；および
    （ｃ）該オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドの量を、所定のカットオフ値と比較し、そして、それから、該患者における癌の存在を決定するための説明書、
    を備える、キット。
15. 請求項１０に記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを備える、診断キット。
16. 請求項７に記載の少なくとも１つの抗体および検出試薬を備える診断キットであって、該検出試薬がレポーター基を含む、診断キット。
17. 患者における癌の発生を阻害するためのキットであって、該キットは、以下：
    （ａ）以下：
    （ｉ）請求項４に記載のポリペプチド；
    （ｉｉ）請求項３に記載のポリヌクレオチド；および
    （ｉｉｉ）請求項４に記載のポリペプチドを発現する抗原提示細胞、
    からなる群より選択される、少なくとも１つの成分；
    （ｂ）Ｔ細胞が増殖するように、該成分とＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞をインキュベートするための説明書；
    （ｃ）有効量の該増殖したＴ細胞を該患者に投与するための説明書、
    を備える、キット。