KR101146607B1

KR101146607B1 - 간암에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도

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Publication number: KR101146607B1
Application number: KR1020110085651A
Authority: KR
Inventors: 송은영; 이희구; 염영일; 지나영; 이정일; 강민아; 김영주; 강윤희; 김재화
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2008-12-10
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2012-05-16
Also published as: KR101146613B1; KR20110101119A; KR20100067032A; US20110306513A1; KR101161789B1; KR20100067031A; KR101192297B1; KR101146610B1; KR20110101118A; KR20110101117A

Abstract

본 발명은 새로운 간암 진단 마커로서 작용할 수 있는 유전자의 규명 및 이를 이용한 간암의 진단 및 예후 측정에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 간암 진단 마커인 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 이용하여 간암을 진단 및 예후를 측정할 수 있는 진단 키트 및/또는 이를 이용한 간암의 진단 및 예후 측정 방법에 관한 것이다. 본 발명의 동일 간암 환자로부터 채취한 정상 간조직, 간암 조직을 이용하여 발굴된 것으로서, 간암에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다. 본 발명의 마커를 이용하면 간암을 정확하게 진단 및 예후를 할 수 있다.

Description

간암에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도{Novel Biomarkers Indicative of Liver Cancer and Their Uses}

본 발명은 간암에 특이적인 바이오마커 및 그의 용도에 관한 것이다.

간염, 간경변, 간암등을 포함한 간질환은 한국, 일본, 대만, 중국, 대부분의 동남아 국가에서 단일 질병으로는 가장 많은 환자가 발생하고 있으며 간암으로 인한 사망률은 장기별 기준으로 보면 세계적으로 네 번째 (50만 5천명)의 발병률을 보이고 있다(세계보건기구 1997년도). 또한 간암 환자는 암 발생 중 국내 3위(11.5%)를 차지하고 있다(한국 암발생통계 2002). 현재까지 간암진단의 경우 조직검사를 실시하거나 AFP와 같은 간암표지 단백질검사를 실시하여 간암여부를 진단하여 왔다.

현재 간암관련 진단, 예후판정, 또는 치료평가에 대한 바이오마커로 가장 잘 알려진 마커는 AFP 및 PIVKA-II가 존재하나 특이도, 민감도에 대해 부족한 면이 있다.

그 중, 간암 진단에 있어서 혈중 알파 태아 단백(alpha-fetoprotein, AFP)의 유용성은 잘 알려져 있다. 진행된 간암의 진단 뿐 만 아니라 간경변증 환자에서 자연경과 중 매년 3-10%에서 간암이 발병하기 때문에 조기발견을 위한 정기적인 AFP측정이 필요하다. 그러나 AFP는 간암 뿐만 아니라 알콜성 간염, 만성간염이나 간경변증과 같은 양성질환에서도 고농도로 상승하기 때문에 위양성이 많고 실제 양성율이 50-60%에 지나지 않다(민감도는 20 ng/㎖ 및 400 ng/㎖에서 각각 29.9% 및 65.8%).

또한 다른 하나의 마커로 알려진 PIVKA-Ⅱ는 DCP (des-r-carboxyprothrombin), 즉 응고작용이 없는 비정상 프로트롬빈으로 혈청 AFP와는 독립적으로 간암의 진단에서 각각 48.2% 및 95.9%의 민감도와 특이도를 보고하고 있다. 그러나 이러한 생물학적 지표들은 현재 임상적으로 이용되고 있으나 모든 간암의 생물학적 특성을 반영하지 못하여 매우 제한적인 사용에 그치고 있다. 그러므로 증가하는 간암 환자의 예방 및 치료를 위하여 현재의 AFP나 PIVKAⅡ보다 간암을 특이적이고 효과적으로 진단할 수 있는 마커를 발굴하고 이를 이용하여 간암을 조기 진단할 수 있는 검사 시약의 개발이 시급하다.

현재 혈액, 조직, 배설물로부터 종양표지자가 개발되어 있으나 많은 종류의 종양표지자는 암이 없어도 증가하거나 검출되는 경우가 있다. 종양표지자 발굴은 암을 사전에 예방하거나 혹은 조기발견, 치료중인 경우는 그 예후를 관찰하기 위한 목적으로 활용되고 있다. 최근에 지노믹스 (Genomics), 프로테오믹스 (Proteomics) 연구에 의해 몇 가지 종류의 간암 마커 후보 단백질과 유전자가 보고 되고 있다. 김난순 등에 의해 간암조직에서 정상조직과 비교하여 발현율 차이를 보이는 14종의 유전자를 발굴, 이들 유전자 발현 차이를 이용, 간암 진단으로 활용에 대한 논문과 특허가 발표된바 있다(대한민국 공개번호 10-2005-0076876, 2005: International J. of oncology, 29 :315-327(2006)). 이 특허와 논문에서는 14종 유전자에 대한 경쟁적 RT-PCR을 실시하며 간암 진단의 유용성을 밝혔으며 항체를 이용한다면 단백질 측정도 가능할 것이라는 가능성을 제시하였다. 그러나 이 유전자는 주로 조직을 대상으로 한 유전자들이며 혈액분비 여부 및 혈액으로의 진단은 밝히지 않았다. 현재 대부분의 종양 표지자 발굴은 조직의 유전자 발현차를 중심으로 찾아지고 있으나 바이오 마커의 성질상 조직에서 유전자 발현이 높다고 해서 뇨 또는 혈청으로 진단이 가능한 것은 아니다. 그러므로 진단의 편의성을 위하여 혈액이나 뇨에서 분비되는 종양표지자 발굴이 중요하며 그에 대한 분석법 및 진단법이 중요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 간암 및/또는 간암을 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 간암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 간암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 간암 마커를 검출하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 간암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트를 제공한다.

본 발명자들은 간암을 신속하고 정확하게 분자진단할 수 있는 신규한 바이오마커를 발굴하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 발굴된 바이오마커들이 간암을 조기 진단할 수 있고, 예후를 판정할 수 있는 마커임을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서 표현 “간암의 진단 또는 예후 분석용 키트”는 간암의 진단 또는 예후 분석용 조성물이 포함된 키트를 의미한다. 따라서, 상기 표현 “간암의 진단 또는 예후 분석용 키트”은 “간암의 진단 또는 예후 분석용 조성물”과 서로 교차 또는 혼용하여 사용이 가능하다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

본 발명에서 용어 "간암 (liver cancer)"이란 일반적으로 간세포에서 기원하는 암을 의미한다. 간암에는 처음부터 간에서 생기는 원발성 간암과 다른 조직에서 발생한 암이 간에 전이되어 발병하는 전이성 간암이 있다. 원인은 대부분 불분명하나, 간경변이 있는 경우가 많으며, 간경변이 있는 환자와 만성 활동성 B형 간염, 또는 B형 간염 보균자에서 간암이 잘 발생하는 것으로 밝혀지고 있다. 본 발명자들은 본 발명의 마커를 사용하면, 개체로 부터 간암의 발병여부에 대해 민감도 및 신뢰도가 높은 결과를 얻을 수 있음을 확인하였다.

본 발명에서 용어 "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 간암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 간암을 가진 세포에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 간암 진단 마커는 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성되는 군으로 부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자로서, 간암 세포에서 발현이 증가하는 유전자이다. 이러한 마커들은 어느 하나의 유전자에 대한 mRNA 또는 상기 유전자에 의해 코딩되는 어느 하나의 단백질을 사용할 수도 있으나, 바람직하게는 이들 마커들이 둘 이상 포함된 복합 마커인 것이 좋다.

S100P (S100 calcium binding protein P)는 태반에서 처음으로 추출된 S100 단백질군의 하나로 S100 유전자가 염색체 1q21에서 모여 위치하고 있는 것과는 달리 S100P는 4p16에 위치하고 있는 유전자이다. 이러한 S100P는 진뱅크(GenBank) 번호는 NM_005980인 유전자로서, 주로 단백질 결합 및 칼슘이온 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 S100P는 태반 및 식도의 상피세포에서의 발현을 포함하여 제한된 패턴으로 발현되는 것으로 알려져 있다. MIG9로 불리기도 한다. 유전자의 mRNA 서열은 NM_005980.2로 단백질 서열은 NP_005971.1로 개시되어 있다. 췌장암 및 전립선암과의 관련성에 대해서 보고되고 있으나, 간암의 마커로 사용될 수 있다는 사실은 알려진바 없다.

NK4 (natural killer transcript)는 IL-32라고도 불리며, 초기 NK4 전사체는 PHA 또는 IL-2에 의해 자극된 T-cell에서만 발현되는 것으로 보고되었으나 최근 연구결과에 의하면 T-cell이외에 상피세포에서 인터페론-γ (Interferon-γ), IL-1β, 및 TNFα에 의해 발현되는 것으로 보고되고 있다. TAIF로 불리기도 하며, 사이토카인 패밀리(cytokine family)에 속하는 유전자로서, 타이로신 설페이션(tyrosine sulfation) 부위를 포함하는 단백질을 코딩한다. IL-2에 의해 NK 세포를 활성화됨으로써 또는 세포 분열됨으로써 T 세포의 활성 후에 상기 단백질의 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다. 염색체 16번의 16p13.3에 위치하며, NC_000016.8의 서열을 가진다.

CCL20 (Chemokine ligand 20)는 케모카인 패밀리 (family)에 속하는 단백질로서 Nod2 유전자와 비슷하게 혈액의 단핵구 세포 (blood mononuclearcell)와 장 상피세포에서 발현되며 주로 미성숙 수지상 세포(dendritic cell)나 기억 T 세포(memory T cell) 및 B세포의 주화성에 관여하는 것으로 알려져 있다 (Schutyser E. et al., Cytokine Growth Factor Rev 14:40926(2003)).

CSPG2는 chondroitin sulfate proteoglycan 2의 약자로서, 베리스칸 (versican)이라고도 한다. 1000 kDa이 넘는 분자량을 가지는 프로테오글라이칸으로서, Zimmermann 및 Ruoslahti에 의해 섬유아세포 (fibroblast) CSPG2의 코어 단백질 (core protein)의 서열을 밝힘으로써 클론 되었다. CSPG2은 렉티칸 (lectican) 단백질 패밀리에 속하며 CSPG-2, PG-M 등으로도 알려져 있다. VCAN, WGN, ERVR, PG-M등으로 불리기도 하며, 유전자 전장 서열은 NC_000005.8로, mRNA는 NM_004385.2, 단백질은 NP_004376으로부터 쉽게 알 수 있다. CSPG2 유전자는 염색체 5q14.3에 위치하고 있고, 세포-매트릭스(cel-martrix) 결합의 강화를 통해 산화적 손상을 감소시키는 역할을 한다는 기작이 밝혀져 있으며, CSPG2 유전자로부터 코딩된 단백질의 일부 도메인이 혈액의 응고를 촉진시킨다는 보고가 있으나, 간암의 직접적인 마커임을 밝힌 것은 본 발명이 최초이다.

PLAU (Urokinase-type plasminogen activator)는 ECM (extracellular matrix)의 분해와 관련된 세린 프로테아제 (serine protease)를 코딩하는 유전자로서 피브린-결합 친화력 감소 및 알츠하이머와 연관되어 있는 것으로 보고되고 있다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 플라스미노젠 (plasminogen)을 플라스민 (plasmin)으로 전환시키는 역할을 하고, PLAU 유전자는 염색체 10q24의 위치에 존재하며, 전장 서열의 정보는 NC_000010.9로, mRNA는 NM_002658.2, 단백질은 NP_002649.1로 공지되어 있다.

MMP12 (matrix metallopeptidase 12)는 배아 발생, 골 형성 및 월경 중 자궁 재형성과 같은 조직 재형성에 관여하는 많은 생리적 질환 과정에 중요한 것으로 여겨지는 유전자로서, 대식세포 엘라스타제 또는 메탈로엘라스타제라고도 공지된 MMP12는 처음에 샤피로 (Shapiro) 등 [1992, Journal of Biological Chemistry 267:4664]에 의해 마우스에서 클로닝 되었고 1995년에는 동일한 연구진에 의해 인간에서 클로닝되었다. MMP-12는 활성화된 대식세포에서 우선적으로 발현되며 흡연가의 폐포 대식세포 뿐 아니라 [Shapiro et al., 1993, Journal of Biological Chemistry, 268:23824] 관절경화증 병소 내의 포말 세포에서도 [Matsumoto et al., 1998, Am J Pathol 153:109] 분비되는 것으로 밝혀진 바 있는 유전자이다. 이러한 MMP12 정상적인 생리학적 작용에서 세포외 매트릭스를 깨뜨리는데 관여하는데, 상기 유전자에 코딩되는 효소는 가용성, 불가용성 엘리스틴을 모두 분해한다. 염색체 내 11q22.3에 위치하며, 전장서열은 NC_000011.8, mRNA 서열은 NM_002426.3, 단백질은 NP_002417.2로 공지되어 있다.

ESM-1은 HGF/SF (Hepatocyte growth factor/scatter factor) 인자의 시험관 내 (in vitro) 세포 분열 활성을 촉진시킬 수 있는 분비 단백질로서 콘드로이틴/더마탄 설페이트 타입 (chondroitin/dermatan sulfate type)의 프로테오글라이칸 형태 내에서 분비되는 단백질로 알려져 있다. ESM-1 (endothelial cell-specific molecule 1)은 엔도칸 (endocan)으로도 알려져 있으며, 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 분비 단백질로서 주로 폐 및 신장 조직의 표피 세포에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 이 유전자의 발현은 사이토카인에 의해 조절되며 표피-의존적 병리 질환과 관련된 기능을 수행할 것으로 추측된다. 해당 유전자는 5q11.2에 존재하며, 전장 서열은 NC_000005.8로, mRNA서열은 NM_007036.3, 단백질은 NP_008967.1 또는 CCDS3963.1로 공지되어 있다.

AFP (Alpha-fetoprotein; α-fetoprotein)는 태아기 동안 난황(yolk sac)과 간에서 생성되는 주요한 플라즈마 단백질로서, 태아기 혈청 알부민의 한 부분이라고 여겨지며 AFP 유전자와 알부민 유전자는 4번 염색체상 나란히 존재한다. 상기 알파-페토프로틴은 다이머(monomeric) 및 트리머(trimeric) 형태뿐만 아니라 모노머(monomeric)로도 발견되며, 구리, 니켈, 지방산 및 빌리루빈(bilirubin)과 결합한다. 인간에게 있어서, AFP 단백질은 출생 후 점차 감소하고, 생후 8-12개월에 부터 성인과 동일한 단백질 수준을 형성한다. 정상 성인의 AFP 단백질 수준은 낮게 검출이 되나, 아직까지 그 기능에 대해서 알려져 있지 않다. 태아에게 있어서, AFP 단백질은 에스트라디올(estradiol) 호르몬과 결합한다. AFP 단백질은 임산부에서 모성혈 또는 양수를 이용하여 부분 발달 장애 스크리닝 테스트를 함으로써 발견되며, 개방성 신경관 결손(open neural tube defects) 및 제대 탈장(omphalocoele)에서 주로 증가되고, 다운증후군에서는 대체로 감소된다. 또한, 임산부, 성인 및 아이들에게 있어서 종양, 특히 간세포암 및 내배엽동 종양(endodermal sinus tumor)을 검출하는 바이오마커로서 작용한다. 해당 유전자는 염색체 4q11-q13에 존재하며, 전장서열은 NC_000004.10에, mRNA은 NM_001134.1에, 그리고 단백질은 NP_001125에 각각 공지되어 있다.

CRP (C-reactive protein)는 염증 반응에 있어서 혈액에서 발견되는 급성기단백질이다(acute-phase protein). CRP는 간과 지방세포에서 생산되고, 펜트락신 단백질 군에 속한다. CRP는 염증의 마커로서 주로 사용되며, 심장혈관 질환 또는 당뇨병 진단에 사용되기도 한다. 해당 유전자는 염색체 1q21-q23에 존재하며, 전장서열은 NC_000001.9에, mRNA은 NM_000567에, 그리고 단백질은 NP_000558에 각각 공지되어 있다.

ABHD7 (abhydrolase domain containing 7)은 EPHSRP, FLJ90341로도 알려져 있으며, 전장은 NC_000001.9, mRNA 서열은 NM_173567.3, 단백질 서열은 NP_775838.2, CCDS736.1로 개시되어 있는 유전자이다. 염색체 좌위 1p22.1에 존재하며 hydrolase 활성을 갖는다고 알려져 있으나 간암에 대한 마커로서는 알려진 바 없다.

HCAPG는 CAPG, CHCG, NCAPG, FLJ12450, NY-MEL-3등으로도 알려져 있는 유전자로서 염색체 4p15.33에 존재하고, 전장 서열은 NC_000004.10, mRNA는 NM_022346.3, 단백질은 NP_071741.2, CCDS3424.1로 공지되어 있다. DNMT3B, HSF2등과 상호 관련되어 있는 것으로 알려져 있으나, 간암의 진단마커로는 알려진 바 없다.

CXCL-3는 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 3 (chemokine (C-X-C motif) ligand 3)이라 지칭되는 유전자로 GRO3, SCYB3 등으로 지칭되기도 한다. 이 유전자의 발현이 감소되는 경우, ERK의 인산화를 억제하는 것으로 보고된 바 있으나, 그 밖에 사항에 대해서는 아직 많이 알려진 바가 없고, 특히 본 발명의 간암 마커와이 관련성에 대해서는 본 발명에서 최초이다. 상기 유전자는 염색체 4q21에 존재하며, 유전자 전장 서열은 NC_000004.10으로, mRNA는 NM_002090.2, 단백질은 NP_002081.2, CCDS34007.1로 알려져 있다.

Col5A2 (alpha 2 type V collagen preproprotein)는 콜라겐, 타입 V, 알파 2인 인간 유전자로서, 상기 유전자는 원섬유성 교원질(fibrillar collagens) 중의 하나로 알파 사슬을 암호화한다. 이러한 COL5A2는 원섬유성 교원질 (fibrillar collagens)의 하나에 포함되는 알파 체인을 코딩한다. 피브릴러 콜라겐 분자는 하나 또는 그 이상의 알파 체인으로 구성되는 트라이머 (trimer, 삼량체)일 수 있으며, 타입 V 콜라겐은 타입 I을 포함하는 조직에서 발견되고, 타입 I 및 타입 V 콜라겐 모두에 의해 구성되는 이형섬유 (heterotypic fibers)가 결합하는 것을 조절하는 역할을 한다. 이 유전자가 돌연변이 되는 경우, Ehler-Danlos 증후군이 유발되는 것으로 알려져 있다. COL5A2 유전자는 염색체 2q14-32에 위치하며, 전장서열은 NC_000002.10, mRNA는 NM_000393.2, 단백질은 NP_000384.2로 프리프로단백질이 생성되는 것으로 알려져 있다.

CDC2(cell division cycle 2) 유전자는 세포 분열에 관여하는 유전자로서, 이 유전자의 변이가 알츠하이머의 위험 표시가 되며, 알츠하이머 환자들의 내부 신경세포에 존재하는 CDC2가 작동하여도 정상적인 세포분열이 나타나지 않는다고 보고된 바 있다. CDK1, CDC2, CDC28A등으로도 알려져 있으며, 염색체 10q21.1에 존재한다. 전장서열은 NC_000010.9, mRNA는 NM_001786.2 또는 NM_033379.2로, 단백질은 NP_001777.1, NP_203698.1의 두 가지 아이소폼 (isoform) 형태로 생산될 수 있다는 사실이 당업계에 잘 알려져 있다.

CST1 (cystatin SN)은 다중 시스타틴-유사 서열을 포함하는 단백질을 포함하는 시스타틴 슈퍼 패밀리 중 하나로서, 상기 슈퍼 패밀리 중 일부는 활성 시스테인 프로테아제 억제제인 반면, 다른 일부는 전혀 그러한 억제 활성을 갖지 않는다. 상기 유전자는 시스타틴 좌위에 위치하며, 침, 눈물, 뇨, 및 정액에서 발견되는 시스테인 프로티네이즈 (cystein proteinase) 억제제를 코딩하는 것으로 알려져 있다. CST1 유전자는 염색체 20p11.21에 위치하며, 그 유전자 서열은 NC_000020.9로, mRNA는 NM_001898.2, 단백질은 프리커서로서 NP_001889.2, 단백질로 CCDS13160.1로 알려져 있다.

MELK (Maternal embryonic leucine zipper kinase)는 정상적인 신경계줄기세포의 증식을 조절하는 것으로 알려져 있으며, HPK38, KIAA0175라고 지칭되기도 한다. 염색체 9p13.2에 위치하고 NC_000009.10, NM_014791.2, 단백질은 NP_055606.1, CCDS6606.1로 그 서열이 공지되어 있다. 프로-아폽토시스의 억제 또는 세포 증식에 관여한다는 일부 보고가 있으나, 현재까지 MELK에 대해서 많은 연구가 이루어지고 있지는 않은 실정이다.

ATAD2 (ATPase family, AAA domain containing 2)는 ANCCA, PRO2000등으로도 알려져 있고, 염색체 8q24.13에 존재하며, 그 유전자 서열은 NC_000008.9, mRNA 서열은 NM_014109.2, 단백질 서열은 NP_054826.2, CCDS6363.1로 알려져 있다. ATPase의 패밀리로 알려져 있으며 220개의 아미노산 부위가 잘 보존되어 있어, 상기 부위가 ATP-결합 부위로 작용한다고 알려져 있다. 이 단백질은 하나 또는 두개의 AAA (ATPases Associated with diverse cellular Activities) 도메인을 갖는데, 이러한 단백질은 샤페론-유사 기능을 수행함으로써, 단백질 복합체를 분리시키거나 조절하는 것을 돕는다. 이러한 ATAD2와 관련하여 특정 암의 마커로의 사용은 공지된 바 없으며, 간암 마커로는 본 발명에서 최초이다.

FAP (fibroblast activation protein, alpha)는 FAPA, DPPIV로도 알려져 있으며 세린 프로테아제 패밀리 (serine protease family)에 속하는 유전자이다. 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 섬유아세포의 성장을 조절하는데 관여하며, 발생 동안 표피-중간엽 (epithelial-mesenchymal)의 결합에 관여하는 것으로 알려져 있다. FAP의 전장 서열은 NC_000002.10, mRNA는 NM_004460.2, 단백질은 NP_004451.2, CCDS33311.1로 그 서열이 공지되어 있으며, 염색체 2q23에 존재하는 것으로 알려져 있다.

MSN (moesin)은 ezrin 및 radixin을 포함하는 ERM 패밀리의 하나이며, 상기 EMR 패밀리는 플라스마 멤브레인 (plasma membrane) 및 액틴-기반 사이토스켈레톤 (actin-based cytoskeletons) 사이의 크로스-링커 (cross-linker)의 기능을 하는 것으로 알려져 있다. MSN은 세포-세포 인식 및 세포 이동 신호에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 간암 마커로는 알려진 바 없다. Xq11.2-q12 염색체 좌위에 존재하며, 전장 서열은 NC_000023.9, mRNA는 NM_002444.2, 단백질은 NP_002435.1, CCDS14382.1로 공지되어 있다.

본 발명의 바람직한 실시예에서는 간암 환자에서 채취된 생물학적 시료를 이용하여 상기 유전자 또는 단백질의 발현 변화를 분석한 결과, 정상 대조군과 비교할 때 2 내지 9배 이상으로 발현이 증가되는 유전자 또는 단백질임을 확인하였다.

생물학적 시료 중의 유전자 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 확인할 수 있으며, 본 발명에서 마커로 사용되는 상기 20개의 유전자 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 서열은, 이들 서열과 상동성을 갖는 염기서열 또는 그로부터 코딩되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 "서열 상동성(Sequence homology)" 은 둘 이상의 핵산, 폴리뉴클레오타이드, 단백질 또는 폴리펩타이드 사이에서 서열 관계를 기재할 때 사용되고, 문맥에서 (a) 참고 서열(reference sequence), (b) 비교 윈도우(comparison window), (c) 서열동정(sequence identity), (d) 서열 동정의 퍼센트 및 (e) 실재적 동정(substantial identity) 또는 "상동(homologous)" 을 포함하는 용어들과 함께 결부되어 이해될 수 있다.

(a) 상기 "참고 서열"은 서열 비교를 위한 기준으로 사용되는 명시된 서열이다. 참고 서열은 예를 들면, 온 길이(full length) cDNA 또는 유전자 서열, 또는 완전한 cDNA 또는 유전자 서열의 절편과 같이 특이적 서열의 작은 부분 또는 전체가 될 수 있다.

(b) "비교 윈도우"는 폴리뉴클레오타이드 서열이 연속하고 특이적인 절편에 대한 레퍼런스(reference)를 포함하고, 여기에서 폴리뉴클레오타이드 서열은 참고 서열과 비교될 수 있으며, 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부는 두 서열들의 최적 배열을 위하여 참고 서열(부가, 치환 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실(즉, 틈(gaps))을 포함할 수 있다. 일반적으로, 비교 윈도우는 20개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드 길이가 되고, 선택적으로 30, 40, 50, 100 또는 그 이상이 될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 서열에서 틈의 포함으로 인하여 참고 서열과 비교하여 오해되는 높은 유사성을 피하기 위하여 틈 벌칙(gap penalty)이 일반적으로 도입되고 다수의 조화들(matches)로부터 제거됨은 당업자에게 자명한 것이다.

비교를 위한 서열 배열 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 서열의 최적 배열은 스미스와 워터만(Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2: 482, 1981)의 국부적 상동성 알고리즘(local homology algorithm)에 의해; 니들맨과 운쉬(Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48: 443, 1970)의 상동성 배열 알고리즘에 의해; 피어손과 립맨(Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8: 2444, 1988)의 유사 방법을 위한 조사에 의해; 인텔리제네틱스(Intelligenetics)에 의한 PC/진 프로그램에서 CLUSTAL, 마운틴 뷰(Mountain View), 캘리포니아(California), GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지(Wisconsin Genetics Software Package)에서 TFASTA, 제네틱스 컴퓨터 그룹[(Genetics Computer Group; GCG), 7 Science Dr., Madison, Wisconsin, USA; Higgins and Sharp, Gene, 73: 237-244, 1988]에 의해 잘 기재되어 있는 CLUSTAL 프로그램을 포함하는 이들 알고리즘의 컴퓨터 처리된 수단들에 의해 수행될 수 있으나, 이에만 한정되는 것은 아니다. 데이터베이스 유사성 조사에 사용될 수 있는 프로그램의 BLAST 집단은 뉴클레오타이드 데이타베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 문의 서열을 위한 BLASTN; 단백질 데이타베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 문의 서열을 위한 BLASTX; 단백질 데이타 베이스 서열에 대한 단백질 문의 서열을 위한 BLASTP; 뉴클레오타이드 데이타베이스 서열에 대한 단백질 문의 서열을 위한 TBLASTN; 및 뉴클레오타이드 데이타베이스 서열에 대한 뉴클레오타이드 문의 서열을 위한 TBLASTX를 포함한다(Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, Ausubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1995 참조). 상기 프로그램 또는 새로운 프로그램의 신규 버젼들은 대체적으로 앞으로 이용가능 하게 될 것이 명백하고 본 발명과 함께 사용될 수 있다.

(c) 두 개의 핵산 또는 폴리펩타이드 상황에서 "서열 상동성" 또는 "상동성"은 특이적 비교 윈도우를 통하여 최대 일치로 조절되는 경우에 동일하고 통상적인 부가, 결실 및 치환할 수 있는 두 개의 서열들에서 잔기들에 레퍼런스를 포함한다. 서열 상동성 퍼센트가 단백질에 대한 레퍼런스로 사용될 때, 보존하는 아미노산 치환에 의하여 동일하지 않고 종종 다른 잔기 위치들을 인식하며, 이 아미노산 잔기들은 유사한 화학 특성(예를 들면, 전하 또는 소수성)을 가지는 다른 아미노산 잔기들과 치환되어 분자의 기능적 특성들을 해롭게 변화시키지 않는다. 서열들이 보존하는 치환과 다른 경우, 서열 동정 퍼센트는 치환의 보존 특성을 정정하여 상향 조절될 수 있다. 이러한 보존 치환에 의해 달라지는 서열들은 서열 유사성을 가지게 된다. 이러한 조절을 위한 접근들은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로 이것은 충분한 부조화 보다 부분적으로 보존 치환을 점수화하고 이로 인해 서열 상동성의 퍼센트를 증가시키는 것을 포함한다. 따라서 예를 들면, 동일한 아미노산에 1점을 주고 비-보존 치환에 0점을 주는 경우, 보존 치환에는 0과 1 사이의 점수가 주어진다. 보존 치환의 점수화는 알고리즘(Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11-17, 1988)에 의하여 프로그램 PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에서 제공되는 대로 산출된다.

(d) "서열 상동성의 퍼센트"는 비교 윈도우를 통하여 최적으로 조절된 두 개의 서열들을 비교하여 결정된 값을 의미하며, 여기에서, 비교 윈도우에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부분은 두 개의 서열들의 최적 배열을 위한 참고 서열(부가, 치환 및 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 부가, 치환 또는 결실(틈)을 포함할 할 수 있다. 퍼센트는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 비교 윈도우에서 다수의 총 위치에 의하여 다수의 조화된 위치들이 분리되고 서열 상동성의 퍼센트를 얻기 위하여 100으로 결과를 곱하여 다수의 조화된 위치들을 수득할 수 있는 두 개의 서열들에서 발생하는 다수의 위치에서 결정하여 산출된다.

(e) (i) 이들의 다양한 문법적 형태에서 용어 "실제 상동성" 또는 "상동"은 표준 매개변수를 사용하여 기재된 조절 프로그램 중 하나를 사용하여 참고 서열과 비교하여 요구되는 상동성, 예를 들면, 바람직하게는 약 70% 이상의 상동성을 의미하고, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 의미하며, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 의미하고, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 기술 중 하나는 이들 값들이 계측 코돈 퇴보(account codon degeneracy), 아미노산 유사성, 판독 프레임 포지션 등으로 인하여 두 개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 인코딩되는 단백질의 일치하는 상동성을 결정하기 위하여 적절하게 조절될 수 있다.

이들 목적을 위한 아미노산 서열들이 실제 상동성은 바람직하게는 약 70% 이상의 상동성을 의미하고, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 의미하며, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 의미하고, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 의미한다. 뉴클레오타이드 서열들이 실제로 동일한 다른 예시는 두 개의 분자들이 엄격한 조건 하에서 각각 서로 하이브리드화 한다. 그러나 엄격한 조건 하에서 각각 서로 하이브리드화 하지 않는 핵산들은 이들이 인코드하는 폴리펩타이드가 실제로 동일하다면 아직 실제로 동일한 것이다. 예를 들면, 핵산 사본이 유전자 코드에 의해 허용되는 최대 코돈 퇴보를 사용하여 생산되는 경우에 발생할 수 있다. 두 개의 핵산 서열이 실제로 동일한 하나의 예시는 이러한 교차-반응성이 실제로 동일하다고 여겨지기 위하여 두 개의 폴리펩타이드들에서 요구되지는 않지만, 첫 번째 핵산 인코드가 두 번째 핵산에 의해 인코드되는 폴리펩타이드와 면역 교차 반응하는 폴리펩타이드이다.

(e) (ii) 펩타이드 상태에 이들의 다양한 문법적 형태에서 용어 "실제 상동성" 또는 "상동"은 특이적 비교 윈도우를 통하여 참고 서열에 대하여 요구되는 상동성, 예를 들어, 바람직하게는 약 70% 이상의 상동성을 의미하고, 보다 바람직하게는 약 80% 이상의 상동성을 의미하며, 보다 더 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 의미하고, 가장 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 서열을 포함하는 펩타이드를 말한다.

본 발명에서 간암을 진단하기 위하여 사용되는 표현mRNA 발현수준 측정은 생물학적 시료에서 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 간암을 진단에 있어서 사용되는 표현 단백질 발현수준 측정은 생물학적 시료에서 상기 유전자들로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인하는 것을 의미한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 상기 예에 의해 본 발명의 분석방법이 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 마이크로어레이 또는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트가 마이크로어레이인 경우에는, 마이크로어레이의 고상표면에 프로브가 고정화 되어 있다. 본 발명의 키트가 유전자 증폭 키트인 경우에는 프라이머를 포함한다.

본 발명의 진단용 키트에서 이용되는 프로브 또는 프라이머는 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열에 대하여 상보적인 서열을 갖는다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그널을 직접 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트는 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전에 대하여 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 구체적으로는, 염기서열 목록의 서열번호 1 내지 40으로 표시되는 프라이머 쌍이며, 상기 프라이머 쌍은 하기 표 1과 같다.

본 명세서에서 사용된 용어 “프로브”는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타깃 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화 할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것이다. 본 발명의 프로브는 바람직하게는 단일쇄이며, 올리고디옥시리보뉴클레오타이드이다.

프로브를 이용하는 경우, 프로브를 cDNA 분자와 혼성화시킨다. 본 발명에서, 적합한 혼성화 조건은 최적화 절차에 의하여 일련의 과정으로 결정될 수 있다. 이런 절차는 연구실에서 사용을 위한 프로토콜을 수립하기 위하여 당업자에 의하여 일련의 과정으로 실시된다. 예를 들어, 온도, 성분의 농도, 혼성화 및 세척 시간, 완충액 성분 및 이들의 pH 및 이온세기 등의 조건은 프로브의 길이 및 GC 양 및 타깃 뉴클레오타이드 서열 등의 다양한 인자에 의존한다. 혼성화를 위한 상세한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001); 및 M.L.M. Anderson, Nucleic Acid Hybridization, Springer-Verlag New York Inc. N.Y.(1999)에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 상기 엄격조건 중에서 고 엄격조건은 0.5 M NaHPO₄, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate), 1 mM EDTA에서 65℃ 조건으로 혼성화하고, 0.1 x SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS에서 68℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 또는, 고 엄격조건은 6 x SSC/0.05% 소듐 파이로포스페이트에서 48℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다. 저 엄격조건은 예를 들어, 0.2 x SSC/0.1% SDS에서 42℃ 조건으로 세척하는 것을 의미한다.

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 새로운 간암 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 간암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서, 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)인 것이 바람직하다. 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)인 것이 바람직하다. 본 발명에서, 상기 항체는 상기 서술한 20개의 마커에 대한 공지의 mRNA 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 측정할 수 있는 어떠한 항체도 될 수 있으나, 바람직하게는, 상기 키트는 면역분석(immunoassay)용 키트이며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트이다.

상기 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 엘라이자 키트는 상기 20개의 유전자군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자로부터 코딩된 단백질에 대한 다클론 항체 및 단일클론 항체, 그리고 표지물질이 결합된 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 2차 항체를 포함한다.

본 발명에서 키트의 종류의 예로는 면역크로마토그래피 스트립 키트, 루미넥스 어세이 키트, 단백질 마이크로어레이 키트, 엘라이자 키트, 또는 면역학적 도트 키트등이 있으나, 상기 예에 의해 본 발명에서 사용 가능한 키트의 종류가 제한되는 것은 아니다.

상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 한다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브 (probe)를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한, 상기 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위하여 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 추가적으로 포함할 수 있다. 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 마이크로어레이 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 융합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 단백질 마이크로어레이를 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 간암 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.

루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 소량(10-20 ㎕)의 환자 시료를 전 처리하지 않은 상태에서 최대 100종류의 어낼라이트(analyte)를 동시에 측정할 수 있는 고용량(high-throughput) 정량분석방법으로서 감도가 좋고(pg단위), 빠른 시간내에 정량이 가능하여(3-4시간), 기존의 엘라이자(ELISA)나 엘리스팟(ELISPOT)을 대체할 수 있는 분석방법이다. 상기 루미넥스 어세이(Luminex Assay)는 96-웰 플레이트(well plate)에 있는 각각의 웰에서 100가지 이상의 생물학적 시료를 동시에 분석할 수 있는 멀티플렉스 형광 마이크로플레이트 (multiplexed fluorescent microplate) 분석방법으로 두 종류의 레이져 감지기(laser detector)를 사용하여 실시간으로 신호전달을 진행시킴으로 100개 이상의 다른 색깔 군의 폴리스티렌 비드(polystyrene bead)를 구별하여 정량한다. 상기 100개의 비드는 다음과 같은 방법으로 구별되도록 구성된다. 한쪽은 붉은 형광 비드(red fluorescence bead)가 열 단계 이상으로 나뉘어 있고, 다른 한 쪽은 오렌지 형광 비드(orange fluorescence bead)가 열 단계로 나뉘어 강도(intensity)의 차이를 보이며 그 사이의 비드(bead)들은 레드(red)와 오렌지(orange)의 비율(ratio)이 각각 다른 비율로 섞여 있어 전체적으로 100개의 색-코드 비드 세트(color-coded bead set)를 구성하고 있다. 또한 각각의 비드에는 분석하고자 하는 단백질의 항체가 부착되어 있어 이를 이용한 면역항체반응으로 단백질 정량이 가능하다. 이 시료는 두개의 레이저(laser)를 사용하여 분석하는데, 하나의 레이저(laser)는 비드(bead)를 감지(detection)하여 비드 고유번호를 알아내고, 다른 레이저는 비드에 붙어 있는 항체와 반응한 시료 속의 단백질을 감지하게 된다. 따라서 한 웰에서 동시에 100가지의 생체 내 단백질 분석이 가능하다. 이 분석은 15 ㎕ 정도의 적은 시료로도 감지가 가능한 장점이 있다.

본 발명의 루미넥스(Luminex) 어세이를 수행할 수 있는 루미넥스(Luminex) 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 루미넥스 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 루미넥스 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 미소입자(micro particle)와 접합된 항체(conjugated antibody)일 수 있으며, 또한 상기 미소입자는 착색된 라텍스(colored latex) 또는 콜로이드성 금 입자(colloidal gold particle)일 수 있다.

본 발명의 간암 진단 또는 예후 분석용 키트에서, 상기 간암 진단용 면역크로마토그래피 스트립을 포함하는 간암 진단 키트는, 5분내 분석결과를 알 수 있는 래피드 테스트(Rapid test)를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 상기 면역크로마토그래피 스트립은 (a) 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); (b) 시료 내의 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질과 결합하는 결합 패드(conjugate pad); (c) 상기 20개의 유전자 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대한 단일클론 항체를 포함하는 반응선(test line) 및 대조선(control line)이 처리되어 있는 반응 막(test membrane); (d) 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad); 및 (e) 지지체를 포함하는 것이 바람직하다. 또한 면역크로마토그래피 스트립 (Immunochromatographic strip)을 포함하는 래피드 테스트 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 상기 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 래피드 테스트 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 래피드 테스트 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 특이항체와 2차 항체가 고정된 나이트로셀룰로오스 멤브레인, 항체가 결합된 비드에 결합된 멤브레인, 흡수 패드와 샘플 패드 등 진단에 필요한 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, 본 발명의 간암 진단용 키트는 복합마커를 동시에 분석하기 위한 단백질 마이크로어레이를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 본 발명에서 단백질 마이크로어레이 키트는 고체상에 결합된 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단일클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 단백질 마이크로어레이 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 단백질 칩 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단, 효소(예: 항체와 접합됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 단백질 마이크로어레이는 슬라이드에 결합된 상기 단백질에 대한 다클론 항체 및 상기 단백질에 대한 단일클론 항체와 상기 다클론 항체와 단일클론 항체에 대한 효소 결합 2차 항체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 면역학적 도트 어세이에 의한 단백질 발현 수준의 측정은 (a) 막에 생물학적 시료를 점적(dotting)하는 단계; (b) 상기 20 개의 유전자로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체를 상기 점적된 막에 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응시킨 막에 표시체가 접합된 2차 항체를 첨가하고 발색시키는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 엘라이자 어세이는 (a) 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 항체 1을 고상체에 흡착시키는 단계; (b) 상기 고상체에 흡착된 항체 1과 간암 의심 환자의 생물학적 시료를 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 항체 2를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 샌드위치 엘라이자 어세이인 것이 바람직하며, 상기 단백질 마이크로어레이 어세이는 (a) 상기 20개의 마커로 구성된 유전자 군에서 선택된 1개 이상의 유전자의 단백질에 특이적인 다클론 항체를 칩에 고정시키는 단계; (b) 상기 고정된 다클론 항체 1을 간암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성하는 단계; (c) 표지물질이 결합된 상기 20개의 마커에 대한 염기서열을 갖는 유전자 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 특이적인 단일클론 항체를 처리하여 상기 복합체와 결합시키는 단계; 및 (d) 상기 표지물질을 검출하여 단백질의 농도를 측정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 간암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 간암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가 여부를 판단하여, 간암 의심 환자의 실제 간암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 간암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자 (microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4 W(CN)8 , [Os(bpy) 3 ] 2+ ,[RU(bpy) 3 ] 2+, [MO(CN) 8 ] 4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I , 186Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 간암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 간암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 간암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 간 조직 및 간암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 ㎛ 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 간암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여 간암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명에서의 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액 또는 뇨를 의미하고, 바람직하게는 혈액 또는 혈청을 의미하며, 가장 바람직하게는 혈청을 의미한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 AFP 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는 상기 키트는 AFP 및 CRP 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가적으로 포함하여 간암의 진단 또는 예후를 분석한다. 상기 키트에 AFP 및 CRP의 뉴클레오타이드 또는 이에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가하여 간암을 진단하는 경우, 간암 진단의 특이성(specificity) 및 정확성(accuracy)이 매우 높아 진다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 키트는 CRP 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 추가적으로 포함하여 간암의 진단 또는 예후를 분석할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 (i) ESM-1과 (ii) AFP 및/또는 CRP를 마커로서 복합적으로 사용하여 실시되며, 이 경우 간암에 대한 진단 정확도가 크게 개선된다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 간암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 통해 간암 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 마이크로어레이 방식, 유전자 증폭 방식, 항원-항체 반응 방식으로 실시할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 AFP 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 추가적으로 포함하며, 가장 바람직하게는 상기 바이오마커 군으로부터 선택되는 1개 이상의 마커에 AFP 및 CRP 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 추가적으로 포함하여 간암 마커를 검출할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 CRP 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 추가적으로 포함하여 간암 마커를 검출 할 수 있다.

상기 간암 마커를 검출하는 방법과 상기 간암 분석용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 간암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오타이드서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포는 인간의 간암 세포이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 본 발명의 마커의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이어, 시료가 처리된 세포에서 본 발명의 마커의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같이 실시할 수 있으며, 측정 결과, 본 발명의 마커의 뉴클레오타이드 서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 단계 (a)에서 AFP 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 단계 (b)에서 AFP 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계를 추가적으로 포함시킬 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 스크리닝 방법의 단계 (a)에서 AFP 및 CRP 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 단계 (b)에서 AFP 및 CRP 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계를 추가적으로 포함시켜 간암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 스크리닝 방법은 단계 (a)에서 CRP 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및 상기 단계 (b)에서 CRP 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계를 추가적으로 포함시켜 간암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝을 할 수 있다.

상기 간암의 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법과 상기 간암 분석용 키트는 동일한 마커를 사용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 회피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 간암에 대한 신규한 분자 마커를 제공한다.

(ⅱ) 본 발명의 동일 간암 환자로부터 채취한 정상 간조직, 간암 조직을 이용하여 발굴된 것으로서, 간암에 대한 마커로서의 정확성, 신뢰도가 크게 개선된 마커들이다.

(ⅲ) 본 발명의 마커를 이용하면 간암을 정확하게 진단 및 예후를 할 수 있다.

도 1a-1b는 간암 조직에서의 간암 진단 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 마커들의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 결과이다.
도 2a-2b는 5종의 간암 세포주에서의 간암 진단 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 마커들의 발현정도를 역전사 중합효소반응을 통하여 나타낸 그림이다.
도 3a-3b는 정상인의 혈청과 간암 환자의 혈청에서 간암 마커의 발현 여부를 웨스턴 블럿을 통하여 확인한 결과이다. N은 정상인의 혈청을 의미하고, m은 마커를 의미하며, CH는 만성 간염(chronic hepatitis: CH)을 의미하고, LC는 간경변(Liver cirrhosis: LC)을 의미하며, HCC는 간세포암(Hepatocellular carcinoma): HCC)을 의미한다.
도 4a-4e는 면역학적 도트 방법에 의해 정상 혈청과 간암 혈청 내 단백질중 각각 하나의 마커를 비교한 그림이다. Normal은 정상인의 혈청을 의미하고, Dil.fold는 희석배율을 의미하고, HCC는 간세포암을 의미하며, intensity는 강도를 의미한다.
도 5은 본 발명의 면역 크로마토그래피 스트립의 구조를 나타낸 그림이다.
도 6a-6b는 ELISA 분석에 의한 반응곡선을 나타낸 결과이다. 도 6a는 ESM-1의 ELISA 반응곡선이다.
도 7은 ESM-1 또는 CRP를 AFP와 각각 혼합했을 때의 민감도와 특이도를 비교한 ROC(receiver-operating characteristic) 곡선 그래프이다. Hepto R은 CRP를 의미하고, Hepto E는 ESM-1을 의미한다. “HCC”는 간세포암(hepatocellular carcinoma), “L.CIR”은 간경변(liver cirrhosis)을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: DNA 칩을 이용한 간암 과발현 유전자 발굴

cDNA 마이크로어레이 실험을 위하여, 강남성모병원과 전북대학교 병원으로부터 40명의 간암환자로부터 원발성 간세포암(primary hepatocellular carcinoma:HCC) 조직을 얻었다. 정상 간 조직은 강남성모병원으로부터 간암환자가 아닌 환자로부터 얻었다. 조직시료는 액체질소에서 동결시켰다. RNeasy 미드 키트(Qiagen, Hilden, 독일)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. cDNA 마이크로어레이어(cDNA microarrayer)를 이용하여 40명의 간암환자의 암조직과 인접 조직을 대상으로 유전자발현 차이를 조사하였다.

실시예 2: 조직 및 세포에서의 mRNA 분리

역전사 중합효소 반응을 위하여 20명의 간암 환자로부터 정상 간세포 조직과 간암 세포조직을 적출하여 총 40개의 조직에서 mRNA를 분리하였다.

우선, 외과적 절제술로 적출된 조직들은 적출 즉시 멸균된 인산완충 식염수에서 혈액을 제거한 후, 액화질소로 동결하였다. 이후, 구아니디움 법(Guanidinium Method)에 의하여 총 mRNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리(Single-Step RNA Isolation)를 수행하였다. 상기와 같이 분리한 총 mRNA는 스팩트로포토메터를 사용하여 정량한 후, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에 보관하였다.

간암 세포 주들은 총 5개를 선정하여(Chang, HepG2, Hep3B, SKHep1, Huh7) 대한민국 서울시 종로구 연건동 28번지 소재 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받았다.

각각의 최적 배양배지인 DMEM(Invitrogen 사) 또는 RPMI1640(Invitrogen 사) 배지에 10%의 우태아 혈청(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclon사) 및 페니실린/스트렙토마이신(1mg/ml Penicillin/ Streptomycin, Sigma사)을 첨가하고 5-6 일간 배양시킨 후, 상기의 조직에서 mRNA를 분리하는 방법과 동일한 방법으로 구아니디움(Guanidinium Method)에 의해 총 RNA를 분리, 싱글-스탭 RNA 분리를 수행하였다. 분리된 RNA는 상기와 같이 스펙트로포토미터를 사용하여 정량하였고, 사용 전까지 -70℃ 냉동고에서 보관하였다.

실시예 3: 역전사 중합효소반응을 이용한 유전자 발현 비교

상기 실시예 1의 결과 선발된 간암 특이 과발현 유전자들에 대해 역전사 중합효소 반응을 실시하였다.

프라이머의 제작을 위하여 각 유전자들의 전체 DNA 염기 서열을 NCBI의 코어 뉴클레오타이드(Core Nucleotide, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 얻었으며, 프라이머3(Primer3) 프로그램을 통하여 이들 유전자들의 프라이머 서열을 디자인 하였다. 상기와 같이 디자인된 프라이머를 이용하여, 중합효소 반응을 실시하여 각각의 유전자들의 발현정도를 확인하였다. 각각의 프라이머 서열은 상기 표 1에 기재된 바와 같다.

역전사 효소반응을 위하여 상기 실시예 2의 조직 및 세포주에서 추출한 mRNA로부터 역전사 반응을 통해 만든 cDNA를 제작하였다. cDNA제작은 cDNA 합성 키트(AccuAcript High Fielity 1st Stand cDNA Synthesis Kit, STRATAGENE)를 이용하여 제작하였다.

상기 제작된 cDNA와 프라이머들을 사용하여 역전사효소 반응(1 cycle: 94℃ 5분; 2 내지 35 cycles: 94℃ 40초, 56℃ 40초, 72도 30초; 최종 신장 (final extension): 72℃ 7분)을 수행하였다.

그 결과 정상 간 조직세포와 간암 조직세포 간의 유전자 발현의 차이를 확인할 수 있었고, 상기 실시예 1의 결과와 동일하게 마커로 예상하는 상기 20개의 유전자(S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN)가 간암 조직세포에서 정상 조직세포에 비하여 발현이 증가함을 확인할 수 있었다(도 1). 간암 세포주에서의 발현은 도 2와 같다.

실시예 4: 웨스턴 블럿을 이용한 혈청 내 단백질 발현량 비교

간암 환자와 정상인의 혈청 내 CXCL-3의 발현정도와 간암환자, 정상, 만성간염, 간경변 환자의 혈청에서 MAGEA(melanoma antigen family A) 발현 정도를 웨스턴 블랏을 이용하여 비교하였다.

*우선, 간암 또는 만성간염, 간경변 환자 및 정상인으로부터 얻은 혈액에서 혈청을 분리하고, 동량 부피의 샘플 완충용액(125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 10% 글리세롤, 0.006% 브로모페놀 블루, 1.8% BME)을 넣고 5분간 끓인 후, 12%의 전기영동(SDS-PAGE)을 이용하여 단백질을 분리하였다. 분자 크기별로 분리된 단백질이 포함된 상기 전기영동된 젤을 니트로셀룰로오스 막과 접촉하고 전류를 통하게 하여 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 이동시켰다. 이에 3% 우태아혈청 알부민이 포함된 TBST 용액(10mM Tris, 100mM 염화나트륨, 0.05% 트윈 20)에서 1시간 동안 블로킹 시킨 후 항원에 대한 다클론항체(CXCL 3; Aviva system biology, 미국, MAGEA2; Abgent, 미국)를 넣고 4℃에서 하룻밤 교반시키면서 반응시켰다. 이후 여분의 항체를 PBST로 세척하여 제거하고, 퍼옥시다아제(Horse Radish Peroxydase)가 결합된 2차 항체(Sigma, 미국)를 넣고 4℃에서 교반시키면서 1시간동안 반응하였다. 이후, 니트로셀룰로오스 막을 밀리포어(MILLIPORE)사의 ECL의 수용액 A(solution A, Luminol과 enhancer 포함)와 수용액 B(Solution B, Hydrogen peroxide 포함)를 동량으로 섞어 1분간 잘 흔들어준 다음 멤브레인(membrane)의 물기를 적당히 제거한 후 필름카세트에 잘 붙이고 암실로 가서 현상하였다. 그 결과, 정상인의 경우 MAGEA 및 CXCL-3 단백질이 검출되지 않거나 그 양이 적은 반면, 간암 환자의 경우는 MAGEA 및 CXCL-3이 과발현 되어 상기 유전자의 단백질이 간암 진단의 마커로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있었다(도 3).

실시예 5: 면역염색을 이용한 조직 검사

정상 간조직과 간암 조직에서의 단백질에 대한 면역 염색을 실시하였다.

우선, 외과적 절제술을 통하여 간암 환자들로부터 간 정상 세포 조직과 간암 세포조직을 적출하여 파라핀 포매 블록을 제조하였다. 이를 마이크로톰을 이용하여 5 ㎛의 두께로 잘라 유리슬라이드에 붙여 조직 슬라이드를 만들었다. 이들을 공지의 면역염색법(조직 절편을 탈파라핀화 시켰고, 10분 동안 시트레이트 버퍼(pH 6.0)에서 항원 검출을 실시하였다. 그 다음 내재성 조직 퍼옥시다아제 활성을 제거하기 위하여 메탄올에서 절편을 3% 과산화수소로 처리하고, 비특이적 결합을 블록킹하기 위하여 1% BSA로 인큐베이션시켰다. 절편을 4℃ 습한 챔버(chamber)에서 항체와 함께 하룻밤 반응시켰다. 표준 EnVision-HRP 키트 (Dako, Glostrup, 덴마크)로 절편을 염색하고 디아미노벤지딘으로 발색시켰다. 절편을 10% Mayer’s 헤마톡실린으로 대비 염색하였다. 동일한 이소타입의 마우스 IgG 또는 항체 희석액을 음성대조군으로 사용하였다.)으로 염색하여 현미경으로 조직 내 단백질의 존재 여부 및 위치를 확인하였다.

실시예 6: 이뮤노도트 ( immunodot ) 분석에 의한 환자 혈청 중 단백질 측정

다클론 항체를 이용하여 이뮤노도트 방법을 확립하여 정상혈청과 간암혈청에서의 S100P, NK4(IL-32), CSPG2(NG2), Col5A2, Gelsolin(GSN), MSN(Meosin)의 분비정도를 비교하였다. 나이트로 셀룰로오스 멤브레인에 5-20배 희석한 혈청시료(각 환자 당 10개체)를 2 ㎕씩 점적한 후 상온에서 건조시키고, 1% BSAT(bovine serum albumin in Tris-buffered saline) 용액으로 블로킹하였다. S100P 단백질에 대한 단일클론 항체(BD, 1:1000), NK4(IL-32) 단백질에 대한 다클론항체(1:10000), CSPG2(NG2)단백질에 대한 단일클론 항체(R&D, 1:2000), Col5A2 단백질에 대한 다클론 항체(Abcam, 1:1000), Gelsolin(GSN) 단백질에 대한 단일클론 항체(Abnova, 1:500), MSN(Meosin) 단백질에 대한 단일클론 항체(Abnova, 1:1000)를 반응시킨 후 2차 항체 접합 호스 래디쉬 퍼옥시데이즈(1:10000)를 가하고 DAB 용액(0.5 ㎎/㎖ diaminobenzidine in PBT)으로 발색시켰다(Sigma. 미국). 스캔하여 발색 정도를 비교하였다(도 4). 도 4에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 바이오마커는 간암의 경우 정상보다 이들 단백질이 과량 발현되는 것을 알 수 있었고, 이들 유전자 또는 단백질을 간암 진단 및 예후에 유용한 마커로 사용가능 함을 알 수 있었다. CCL20, PLAU, MMP12, ESM-1, abhd7, HCAPG, CXCL-3, MAGEA, MSN(Meosin), CDC2, CST1, MELK, ATAD2, 및 FAP에 대한 단백질도 같은 방법으로 수행하였고, 거의 동일한 이뮤노도트 결과를 얻었다.

실시예 7: ELISA 시스템 확립 및 이를 이용한 간암 진단

(7-1) ELISA 시스템의 확립

NK4, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN에 대한 다클론 항체(1 ㎍/㎖, NK4; 건국대, CSPG2; Chemicon, PLAU; Abgent, MMP12, ESM-1; Genetex, ABHD7, HCAPG; Abnova, CXCL-3; Genetex, Col5A2;Genetex, MAGEA:Abnova)를 0.1 M 카보네이트 버퍼(carbonate buffer, pH 9.6)를 이용하여 1 ㎍/㎖의 농도로 희석하고, 96-공 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate)에 100 ㎕씩 분주하였다. 4℃에서 오버나이트 코팅을 한 후 0.05% 트윈 20이 포함된 PBS 용액(PBS-T)을 이용하여 3번 세척하였다. 1% BSA 용액으로 상온에서 2시간 동안 블로킹 해 준 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척한다. NK4, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질을 희석하여 100 ㎕를 넣어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. NK4, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질에 대한 단일클론 항체(1:2000, NK4:건국대, CSPG2;R&D, PLAU; Genetex, MMP12;, ESM-1; R&D, ABHD7, HCAPG, CXCL-3; aviva, Col5A2; Genetex, MAGEA :Abnova)를 100 ㎕씩 희석한 후 2시간 동안 반응시키고 세척하였다. 2000배 희석된 호오스 래디시 퍼옥시다아제가 접합된 2차 항체 100 ㎕(Sigma, 미국)를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하고, 마지막으로 TMB용액을 이용하여 발색시킨다. 발색된 시료의 흡광도는 450 nm 파장에서 측정기(ELISA reader, Molecular Device, Sunnyvale, CA, 미국)를 이용하여 측정하였다(도 6). 한편, S100P(Abnova), CCL20(R&D Systems), CRP(Imunology consultants laboratory.Inc) 및 AFP(Calbiotech, Inc)에 대한 ELISA는 상업적으로 구입한 ELISA 키트를 이용하여 실시하였다.

(7-2) ELISA 시스템에 의한 환자 혈청 중 단백질의 측정

실시예 7-1에서 확립한 엘라이자 시스템(ELISA system)을 이용하여 환자의 혈청 중 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, CRP, Hyaluronan 및 AFP 단백질 농도를 측정하였다. 정상인, 간암 환자의 혈청을 5배씩 희석한 후, 혈청 중 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질 농도를 계산하였다.

도 6a-6c는 ELISA 분석결과의 대표적인 예로서, ESM-1 및 CRP 단백질 모두 간암 환자의 혈청에서 높은 수준으로 존재하며, 정상 혈청과 비교하여 약 2-6배 정도 높은 레벨로 간암 혈청에 존재하였다. 다른 본 발명의 바이오마커에 대하여도 비슷한 고발현 패턴을 나타내었다.

한편, ESM-1, CRP 및 AFP 복합마커에 대한 마커의 진단 정확도를 평가하기 위하여, ROC(receiver-operating characteristic) 커브를 작성하였다(Stuart G Baker et al., BMC Medical Research Methodology 2:4(2002); Buyse M et al., J Natl Cancer Inst 98:1183(2006)). 도 7a-7b를 볼 수 있듯이, 복합마커를 이용한 경우 간암에 대한 진단 정확도가 증가하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 8. 키트 제조 및 혈청 중 단백질의 측정

(8-1) 샌드위치형 ELISA 키트

다음의 구성요소들을 사용하여 NK4, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질 농도 측정용 키트를 제조하였다:

*A. 고상형 항체: 항체가 흡착된 마이크로타이터 플레이트로서, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질에 대한 다클론 항체 100 ㎕(NK4; 건국대, CSPG2; Chemicon, PLAU; Abgent, MMP12, ESM-1; Genetex, ABHD7, HCAPG; Abnova, CXCL-3; Genetex, Col5A2; Genetex)를 마이크로타이터 플레이트에 가하고 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후 고상체 표면의 공간에 알부민을 흡착시켜 제조하였다.

B. 검출 항체: NK4, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질에 대한 단일클론항체(NK4:건국대, CSPG2;R&D, PLAU; Genetex, MMP12;, ESM-1; R&D, ABHD7, HCAPG, CXCL-3; aviva, Col5A2; Genetex, MAGEA :Abnova)

C. 효소결합 항체: 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)가 결합된 2차 항체 용액(Sigma, 미국)

D. 혈청 희석용액

E. 기질액(TMB)

F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액(PBS-T)

G. 표준용액: NK4, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질 표준액.

한편, S100P(Abnova), CCL20(R&D Systems), AFP(Calbiotech, Inc) 및 CRP(Imunology consultants laboratory.Inc)에 대한 ELISA는 상업적으로 구입한 ELISA 키트를 이용하여 실시하였다.

상기 키트를 이용하여 암 환자 중 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP의 혈청 희석 반응을 다음과 같이 검사하였다.

상기 A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액 D (1% BSA 함유)를 사용, 적절히 희석하여 웰 당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 실시예 8-1에서 제조한 샌드위치형 엘라이자 키트를 사용하여 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질 농도를 검사하였다.

(8-2) 면역크로마토그래피 키트

8-2-1. 면역 크로마토그래피 스트립의 제조

*1) 항체-금 접합체(Ab-gold conjugate) 제조

항체를 콜로이달 골드 파티클(colloidal gold particles; BBinternational, 영국) 용액에 15 ㎍/㎖ 가한 후 실온에서 2시간 회전시키면서 반응시킨 후 10% BSA(bovine serum albumin)를 1/10 볼륨으로 가하여 1% 농도가 되도록 한 후 다시 1시간 동안 반응시켰다. 12,000 rpm에서 40분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 다시 2 mM 보레이트 버퍼(borate buffer)를 가하여 항체-금 접합체(Ab-gold conjugate) 용액을 세척하였다. 이후 반복하여 3회 세척하였다. 마지막 세척 후에 1% BSA를 함유한 2 mM 보레이트 버퍼를 골드 용액의 약 1/10 부피를 가해서 현탁시켰다. 측정기(UV spectrophotometer(Molecular Device, Sunnyvale, CA, 미국)로 530 ㎚에서 흡광도를 측정한 후 흡광도가 3.00이 되도록 희석하여 사용하였다.

2) 샘플 패드

시험하고자 하는 시료를 흡수하기 위한 부분으로서, 셀룰로오스 소재로 된 것을 사용한다. 상기 샘플 패드는 시료를 흡수 할 수 있는 어떠한 소재로 대체가능하다.

3) 글라스화이버(GF) 멤브레인

수크로오스가 포함된 20 mM 보레이트 버퍼(borate buffer)로 처리하였다.

4) 나이트로 셀룰로오스(NC) 멤브레인 및 라인 처리

나이트로 셀룰로오스 멤브레인(Millipore사)을 적당한 크기(0.7 ㎝ x 5 ㎝)로 자른 후, 플라스틱 백킹 하단에서 약 3.4 ㎝ 되는 지점에 대조 라인으로서 2차항체(Sigma, 미국)를 직선 처리하고, 2.7 ㎝ 되는 지점에 판정 라인으로서 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질에 대한 단일클론항체(S100P, CCL-20, NK4:건국대, CSPG2;R&D, PLAU; Genetex, MMP12;, ESM-1; R&D, ABHD7, HCAPG, CXCL-3; aviva, Col5A2; Genetex, MAGEA :Abnova)를 직선 처리한 다음, 건조시켜 나이트로 셀룰로오스 멤브레인을 제조하였다.

5) 흡수(absorbent) 패드

면역 반응 후 시료 내 미반응 물질들을 흡수하고, 이에 따라 분석 물질을 포함한 시료 용액이 모세관 현상에 의해 이동되도록 하는 역할을 하도록 셀룰로오스 멤브레인을 사용하였다.

6) 접착용 플라스틱 백킹

상기 실시예 8-2-1에서 제조된 면역 크로마토그래피 스트립의 접착용 플라스틱 백킹 위에 샘플 패드, GF 멤브레인, NC 멤브레인 및 흡수 패드를 순서대로 장착하되, 물질이 모세관 현상에 의해 연속적으로 이동될 수 있도록 조립하였다(도 5).

8-2-2. 결과 판정법

샘플패드에 60-70 ㎕의 시료(이때, 시료는 혈청과 용출 버퍼의 비를 1:5)가하고 3-5분 후 컨트롤 라인(control line)과 결과 라인(result line)의 발색 유무 및 발색 진하기를 관찰하였다. 양성시료의 경우 컨트롤 라인과 결과 라인에서 적색의 착색 선을 관찰할 수 있으며, 음성시료의 경우 컨트롤 라인에서만 적색의 착색 선을 관찰할 수 있었다.

(8-3) 루미넥스 키트

8-3-1. 루미넥스 키트 제조

S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질에 대한 다클론 항체(S100P, NK4; 건국대, CCL20, CSPG2; Chemicon, PLAU; Abgent, MMP12, ESM-1; Genetex, ABHD7, HCAPG; Abnova, CXCL-3; Genetex, Col5A2; Genetex, MAGEA: Abnova)를 비드(bead)에 접합하였다. 시료를 희석하여 100 ㎕를 넣어 준 후 상온에서 2시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, CRP 및 AFP 단백질에 대한 단일클론 항체((S100P, CCL-20, NK4:건국대, CSPG2;R&D, PLAU; Genetex, MMP12;, ESM-1; R&D, ABHD7, HCAPG, CXCL-3; aviva, Col5A2; Genetex, MAGEA :Abnova)를 100 ㎕씩 희석한 후 2시간 동안 반응시키고, 세척하였다. 2000배 희석된 PE(phycoerythrin)가 접합된 2차 항체(Molecular probe, 미국) 100 ㎕를 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하고, 루미넥스 기기로 측정한다. 강도(Intensity)와 농도와의 그래프를 그려 표준곡선을 산출하였다.

8-3-2. 샌드위치형 루미넥스 키트

다음의 구성요소들을 사용하여 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP및 MSN 단백질 농도 측정용 키트를 제조하였다.

A. 고상형 항체: 형광비드가 흡착된 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN에 대한 다클론항체(NK4; 건국대, CSPG2; Chemicon, PLAU; Abgent, MMP12, ESM-1; Genetex, ABHD7, HCAPG; Abnova, CXCL-3; Genetex, Col5A2; Genetex, MAGEA; Abnova)

B. 검출 항체 : S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질에 대한 단일클론항체(NK4: 건국대; CSPG2; R&D; PLAU: Genetex; MMP12, ESM-1; R&D, ABHD7, HCAPG, CXCL-3; aviva, Col5A2; Genetex, MAGEA :Abnova)

C. 효소결합 항체: PE가 결합된 2차 항체 용액 (Molecular probe, 미국)

D. 혈청 희석용액

F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액

G. 표준용액: S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP 및 MSN 단백질에 대한 표준용액

한편 CRP, Hyaluronan(Bio-Rad, Hercules, 미국) 및 AFP에 대한 Luminex는 상업적으로 구입한 키트를 이용하여 실시하였다.

상기 키트를 이용하여 암 환자의 혈청 중 단백질 검출 반응을 다음과 같이 검사한다. A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰 당 100 ㎕씩 가한 후, B, C, E의 구성요소들을 사용하여 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질을 검사하였다.

(8-4) 단백질 마이크로어레이 키트

*8-4-1. 단백질 마이크로어레이 시스템(Protein microarray system)

S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질에 대한 대한 다클론 항체(NK4; 건국대, CSPG2; Chemicon, PLAU; Abgent, MMP12, ESM-1; Genetex, ABHD7, HCAPG; Abnova, CXCL-3; Genetex, Col5A2; Genetex, MAGEA; Abnova)를 프로테아젠(Proteagen)의 웰 칩(Well chip)에 코팅하였다. BSA 용액으로 블로킹 한 후 혈청시료를 희석하여 넣어 준 후 상온에서 1시간 동안 반응한 후 PBS-T 용액을 이용하여 3번 세척하였다. S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질에 대한 단일클론 항체(S100P, CCL-20, NK4:건국대, CSPG2;R&D, PLAU; Genetex, MMP12;, ESM-1; R&D, ABHD7, HCAPG, CXCL-3; aviva, Col5A2; Genetex, MAGEA :Abnova)를 희석한 후 37도에서 1시간 동안 반응시키고 세척하였다. 2000배 희석된 Cy3가 접합된 2차 항체(Upstate, 미국) 100 ㎕를 넣어 준 후 상온에서 0.5시간 동안 반응한 후 3번 세척을 하고, 532 ㎚에서 형광물질의 발광정도를 측정하였다. 강도(Intensity)와 농도와의 그래프를 그려 표준곡선을 산출한다. 이렇게 제조된 단백질 마이크로어레이 시스템을 이용하여 환자의 혈청 중 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질 농도를 측정하였다.

8-4-2. 샌드위치형 단백질 마이크로어레이 키트

다음의 구성요소들을 사용하여 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질 농도 측정용 키트를 제조하였다.

A. 고상형 항체: 슬라이드에 결합된 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질에 대한 다클론 항체(S100P, NK4; 건국대, CCL20, CSPG2; Chemicon, PLAU; Abgent, MMP12, ESM-1; Genetex, ABHD7, HCAPG; Abnova, CXCL-3; Genetex, Col5A2; Genetex)

B. 검출 항체: S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질에 대한 단일클론항체(S100P, CCL-20, NK4:건국대, CSPG2;R&D, PLAU; Genetex, MMP12;, ESM-1; R&D, ABHD7, HCAPG, CXCL-3; aviva, Col5A2; Genetex, MAGEA :Abnova)

C. 효소결합 항체: Cy3가 결합된 2차 항체 용액(upstate, USA)

D. 혈청 희석용액

F. 세척액: 0.05% 트윈이 포함된 인산염 완충액

G. 표준용액: S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질 표준액.

상기 키트를 이용하여 암 환자 중 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질의 혈청희석 반응을 다음과 같이 검사하였다. 상기 A의 고상형 항체에 각 혈청 시료를 혈청 희석용액(D)을 사용, 적절히 희석하여 웰 당 100 ㎕씩 가한 후, 상기 B, C, 및 E의 구성요소들을 사용하여 실시예 8-4-1과 같은 샌드위치형 측정방법으로 S100P, NK4, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ESM-1, ABHD7, HCAPG, CXCL-3, Col5A2, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, MELK, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP 단백질 농도를 검사하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

CXCL-3의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이, 유전자 증폭 키트, 또는 면역분석(immunoassay)용 키트인 것을 특징으로 하는 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 2 항에 있어서, 상기 면역분석(immunoassay)용 키트는 루미넥스 분석 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 또는 ELISA 키트인 것을 특징으로 하는 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항에 있어서, 상기 키트는 히알루로난(hyaluronan)에 특이적인 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트.
제 1 항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트는 S100P, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ABHD7, HCAPG, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열, 상기 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 서열, 상기 뉴클레오타이드의 단편 또는 상기 뉴클레오타이드 서열에 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 간암의 진단 또는 예후 분석용 키트.
간암의 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여 인간의 생물학적 시료에 있는 CXCL-3의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 통해 간암 마커를 검출하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 방법은 마이크로어레이 방식, 유전자 증폭 방식, 또는 항원-항체 반응 방식으로 실시되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항에 있어서, 상기 방법은 히알루로난을 검출하는 것을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 6 항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 S100P, CCL20, CSPG2, PLAU, MMP12, ABHD7, HCAPG, MAGEA, GSN, CDC2, CST1, ATAD2, FAP, MSN, AFP 및 CRP로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 검출하는 단계를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 간암 예방 또는 치료용 물질의 스크리닝 방법:
(a) CXCL-3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오타이드서열의 고발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 간암의 예방 또는 치료용 물질로 판정된다.