KR102612990B1 - Esm-1 단백질에 특이적으로 결합하는 rna 앱타머 및 상기 rna 앱타머의 용도 - Google Patents
Esm-1 단백질에 특이적으로 결합하는 rna 앱타머 및 상기 rna 앱타머의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 상기 RNA 앱타머의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 RNA 앱타머는 ESM-1 단백질에 특이적으로 강하게 결합하고 신생혈관의 생성에 관여하는 신호전달 기전을 억제함으로써 ESM-1 단백질 검출 용도, 신생혈관 관련 질환의 치료 및 진단 등에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 상기 RNA 앱타머의 용도에 관한 것이다.
혈관신생(angiogenesis)은 새로운 혈관을 생성하는 기본적인 과정으로 배아의 발생, 성장, 생식계통의 발생, 조직재생 및 상처 치료 등에 관여하며, 짧은 기간 내에 작동하고 종료시 완전히 억제된다. 이 과정은 혈관신생 자극인자(성장인자), 세포 밖의 세포간극분자, 효소 및 다양한 세포유형를 광범위하게 포함하는 작용이다.
일반적으로, 혈관신생은 혈관신생 촉진인자의 자극에 의한 프로테아제의 분비 및 혈관 기저막의 분해가 일어나면서 시작된다. 이후, 혈관내피세포가 이동하여 세포간 장벽인 세포외기질(ECM)에 부착되고, 침윤, 증식, 분화 등 일련의 과정을 거쳐 새로운 혈관을 형성한다. 정상적인 상태의 생체에서는 혈관신생을 유도하는 인자들과 억제하는 인자들이 상호작용하여 성장, 발생 및 재생과정을 엄격히 조절한다. 그러나, 이러한 조절에 이상이 발생하는 경우에 질병이 발생하는데, 암, 관절염, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 혈관신생으로 인한 각막질환, 망막변성, 각막이식 거부, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름과 같은 질병이 발생할 수 있다.
또한, 암의 성장과 전이에도 혈관신생이 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 보통 종양은 1 내지 3 ㎜의 크기까지는 스스로 성장할 수 있으나, 더 성장하기 위해서는 외부에서 영양분을 필요로 하면서 모세혈관의 성장을 자극한다. 새로운 모세혈관이 생성되면 암세포 사이에 혈관을 생성시킴으로써 산소 및 영양분을 공급하는 통로를 제공할뿐 아니라, 혈관을 따라 암세포가 다른 장기로 전이될 수도 있다. 이에, 혈관신생을 억제하여 암을 비롯한 다양한 질병을 치료하기 위한 치료제의 개발이 활발히 진행되고 있으며, 대한민국 특허공개 제10-2020-0132194호는 혈관내피세포의 생존에는 영향을 미치지 않으면서 그 증식, 이동 및 침윤을 억제하고, 맥관 및 미세혈관의 형성을 억제하는 브루소닌 A 및 B의 혈관신생 억제용도를 개시하고 있다.
한편, 혈관신생에 관여하는 조절인자 중 하나로 알려진 ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질은 특히 폐와 신장조직의 내피세포(endothelial cell)에서 주로 발현된다. ESM-1 단백질은 약 20 kD 크기의 분비성 단백질로 세포성장 및 증식을 촉진한다.
본 발명의 목적은, ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하고 특정 염기서열로 구성되는 RNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 본 발명에 따른 RNA 앱타머를 포함하는 ESM-1 단백질 검출용 조성물 및 키트, 및 상기 RNA 앱타머를 이용하여 ESM-1 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 RNA 앱타머의 혈관신생 억제용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 RNA 앱타머의 혈관신생 관련 질환 치료 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 RNA 앱타머를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 RNA 앱타머를 이용하여 혈관신생 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 ESM-1 단백질 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 ESM-1 단백질 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 앱타머는 ESM-1 단백질에 특이적으로 강하게 결합하고 신생혈관의 생성에 관여하는 신호전달 기전을 억제함으로써 ESM-1 단백질 검출 용도, 신생혈관 관련 질환의 치료 및 진단 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 랜덤 RNA 증폭 후 증폭된 PCR 산물(A)과 제작된 RNA 라이브러리(B)를 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 RNA 앱타머와 ESM-1 단백질의 결합력을 SELEX 수행 횟수에 따라 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 RNA 앱타머가 신생혈관 생성에 관여하는 인자들의 인산화를 억제함을 확인한 결과 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 RNA 앱타머와 ESM-1 단백질의 결합력을 SELEX 수행 횟수에 따라 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 RNA 앱타머가 신생혈관 생성에 관여하는 인자들의 인산화를 억제함을 확인한 결과 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질"은 인체 내에서 ESM1 유전자에 의해 암호화되는 단백질 중 하나로 폐와 신장조직의 내피세포에서 주로 발현되는 단백질을 의미한다. 상기 단백질은 20 kDa 크기의 분비성 단백질로서 세포성장 및 증식을 촉진하여 신생혈관 생성에 관여함이 알려져 있다.
상기 ESM-1 단백질은 통상의 기술분야에 ESM-1 단백질이라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 ESM-1 단백질은 서열번호 30으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 RNA 앱타머는 ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 RNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 RNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 RNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 RNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 ESM-1 단백질 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 ESM-1 단백질 검출용 조성물 및 키트에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 ESM-1 단백질 검출용 조성물에 포함되는 RNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 RNA 앱타머는 상기 RNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 RNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 ESM-1 단백질 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 ESM-1 단백질 검출방법에 사용되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 시료는 ESM-1 단백질을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 혈관신생 억제용 약학적 조성물에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 RNA 앱타머를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 ~ 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 g ~ 5 g/kg 일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 혈관신생 억제용 건강기능식품에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 RNA 앱타머는 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 혈관신생 관련 질환은 통상의 기술분야에 혈관신생에 의해 유발되거나 악화될 수 있는 질환이라고 알려진 모든 질환을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 관절염, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 혈관신생으로 인한 각막질환, 망막변성, 각막이식 거부, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 또는 여드름일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 혈관신생 관련 질환은 통상의 기술분야에 혈관신생에 의해 유발되거나 악화될 수 있는 질환이라고 알려진 모든 질환을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 관절염, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 혈관신생으로 인한 각막질환, 망막변성, 각막이식 거부, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 또는 여드름일 수 있다.
상기 건강기능식품은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 혈관신생 관련 질환의 진단용 조성물 및 키트에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
또한, 상기 혈관신생 관련 질환의 진단용 조성물 및 키트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 혈관신생 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 사용되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 26으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 시료는 혈관신생 관련 질환을 진단하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 포유동물 유래 시료일 수 있고, 구체적으로 인간 유래 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 시료는 본 발명에 따른 방법에 사용되기 전에 상술한 바와 같은 방법으로 전처리될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. RNA 앱타머의 제작
ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제작하기 위해, 먼저 하기 기재된 바와 같이 RNA 라이브러리를 제작하였다.
1-1. 랜덤 RNA의 증폭
먼저, dA:dG:dC:dT가 1.5:1.15:1.25:1의 비율로 포함된 40개의 랜덤 염기서열을 포함하는 100 bp 크기의 주형 DNA(서열번호 27: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')와 이에 대한 정방향 프라이머(서열번호 28: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 29: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 바이오니아 사(한국)에 주문제작하였다. 이때, 정방향 프라이머에는 DNA 서열을 RNA 서열로 전환하기 위한 T7 프로모터 서열을 포함시켰다. 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 dNTP 혼합물, 2 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머, 0.3 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕), 및 35.7 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
| 초기 변성 단계 | 94℃, 5분 | 1회 |
| 변성 단계 | 94℃, 30초 | 5회 |
| 어닐링(annealing) 단계 | 52℃, 30초 | |
| 연신(elongation) 단계 | 72℃, 30초 | |
| 후기 연신 단계 | 72℃, 5분 | 1회 |
수득된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 상기 PCR 산물을 PCR 정제키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 수득한 뒤, 이를 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과를 도 1A에 나타내었다.
그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, 100 bp 크기의 PCR 산물이 증폭 및 정제된 것을 확인하였다.
1-2. RNA 라이브러리의 제작
실시예 1-1에서 수득된 PCR 산물을 주형으로, MEGAshortscript™ T7 키트(Ambion, 미국)를 이용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 수행하였다.
구체적으로, 8 ㎕의 PCR 산물, 2 ㎕의 10x 완충용액, 2 ㎕의 75 mM ATP, 2 ㎕의 75 mM UTP, 2 ㎕의 75 mM GTP, 2 ㎕의 75 mM CTP, 2 ㎕의 T7 효소 혼합물(enzyme mix)을 혼합하여 반응물을 제조하고, 이를 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 시험관 내 전사를 수행하였다. 이후, 여기에 1 ㎕의 TURBO DNase를 첨가하여 37℃에서 15분 동안 반응시킴으로써, 주형으로 사용된 PCR 산물을 제거하였다. PCR 산물이 제거된 반응물에 160 ㎕의 뉴클레아제(nuclease)가 포함되지 않은 증류수 및 20 ㎕의 반응 종료 완충용액을 첨가하여 최종 부피를 200 ㎕로 조절하였다. 여기에 동일 부피의 PCI(페놀:클로로폼:이소아밀알콜=25:24:1) 용액을 첨가하고, 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 취하여, 상층액의 1/100 부피에 해당하는 tRNA(sigma aldrich, 미국), 1/10 부피의 3M NaOAc(sodium acetate, pH 4.5) 및 상층액의 3배 부피에 해당하는 100% 에탄올을 첨가하였다. 이를 -70℃에서 1시간 동안 반응시키고, 다시 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠렛을 65℃에서 건조시키고, 건조된 펠렛에 50 ㎕의 증류수를 첨가하여 RNA를 수득하였다. 수득된 RNA는 2% 아크릴아마이드 겔에 전기영동하여 확인하였다.
그 결과, 도 1B에 나타난 바와 같이, 100 bp 크기의 RNA가 수득되었다.
1-3. 3차원 구조의 RNA 앱타머 제작
50 ㎕의 실시예 1-2에서 수득된 RNA에 50 ㎕의 2× PBS 완충액을 첨가하였다. 상기 혼합물을 85℃에서 5분 동안 끓여 변성시킨 후, 상온에서 1시간 이상 방치하여 서서히 식힘으로써, 3차원 구조의 RNA 앱타머를 제작하였다.
실시예 2. ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 선별
2-1. ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 선별
ESM-1 단백질과 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 SELEX 기법을 이용하여 선별하였다.
구체적으로, 실시예 1-3에서 제작된 RNA 앱타머(840 pmol)에 84 pmol의 ESM-1 단백질을 첨가하고, 1× PBS 완충액을 첨가하여 전체 부피를 200 ㎕로 조절하였다. 이를 4℃에서 12시간 이상 반응시켜 준비하였다. 한편, 200 ㎕의 니켈-나이트릴로트라이아세트산 아가로즈 비드(Ni-NTA agarose bead, Qiagen, 미국)에 500 ㎕의 1× 앱타머 선별용액(500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl 및 5 mM 이미다졸)을 첨가하고 4℃에서 10분 동안 교반하여 상기 비드를 활성화시켰다. 활성화된 비드를 4℃ 및 13,000 rpm의 조건으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 이를 2회 반복하고, 활성화된 Ni-NTA 아가로즈 비드에 상기 준비된 혼합물을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응물을 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 남은 비드는 500 ㎕의 1× 세척 용액(500 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl 및 20 mM 이미다졸)을 첨가하여 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 10분 동안 원심분리함으로써 세척하였다. 3회 세척 후, 200 ㎕의 1×PBS를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 교반하여 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응물을 4℃에서 13,000 rpm의 조건 하에서 10분 동안 원심분리하여 RNA 앱타머가 포함된 상층액를 수득하였고, 이는 2회 수행되었다. 수득된 상층액에 PCI 용액 및 에탄올 침전법을 수행하여 다시 상층액을 회수하고, 여기에 1/10 부피의 3 M NaOAc(pH 4.5) 및 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 -70℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 20분 동안 원심분리하여 RNA 앱타머만을 회수하였다. 회수된 RNA 앱타머는 공기중에서 건조시킨 후, 건조된 펠렛에 50 ㎕의 뉴클레아제가 포함되지 않은 증류수를 첨가하여 RNA를 수득하였다.
2-2. RNA 앱타머의 역전사 반응 수행
실시예 2-1에서 수득된 RNA 앱타머를 다음 라운드의 SELEX에 사용하기 위해 cDNA로 제작하였다.
구체적으로, 9 ㎕의 RNA 앱타머 및 1 ㎕의 역방향 프라이머(서열번호 29)를 혼합하고, 65℃에서 5분 동안 가열한 뒤 얼음에 냉각시켰다. 냉각된 반응물에 4 ㎕의 5x 역전사 완충용액, 2 ㎕의 dNTP 혼합물, 1 ㎕의 1M DTT, 1 ㎕의 RNase 억제제, 1 ㎕의 역전사 효소 및 1 ㎕의 DEPC-DW를 첨가하고 혼합하였다. 상기 혼합액을 42℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, 85℃에서 5분 동안 반응시켜 역전사 효소를 비활성화시킴으로써, 선별된 RNA 앱타머의 cDNA를 수득하였다.
2-3. 비특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 제거
ESM-1 단백질이 아닌 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하는 비특이적 RNA 앱타머를 제거하는 동시에 ESM-1 단백질에 결합하는 RNA 앱타머의 특이성을 향상시키기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 실시예 2-2에서 수득된 cDNA를 이용하여, 상술한 바와 같이 RNA 앱타머를 제조하고, 실시예 2-1의 과정을 6회 반복하여 특이성이 향상된 RNA 앱타머를 선별하였다. 선별된 RNA 앱타머를 이용하여 ESM-1 단백질 없이 히스티딘 아미노산만 고정된 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하는 네가티브 SELEX(negative SELEX)을 수행하였다. 실험은 ESM-1 단백질 및 Ni-NTA 아가로즈 레진을 함께 첨가하는 대신 히스티딘 아미노산만 고정된 Ni-NTA 아가로즈 레진만을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 이때, RNA 앱타머는 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하지 않는 앱타머만을 수득하였다. 수득된 앱타머를 이용하여, 실시예 2-1의 과정을 4회 더 반복하여 총 10회의 SELEX를 수행함으로써 최종적으로 ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 수득하였다.
실시예 3. 친화성이 높은 RNA 앱타머 풀의 선별
3-1. 나노드랍 분석
10회의 SELEX를 통해 각 라운드에서 수득된 RNA 앱타머의 ESM-1 단백질에 대한 친화성을 나노드랍 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 각 회별로 수득된 RNA 앱타머 샘플의 농도를 나노드롭(Nanodrop 2000 Micro spectrophotometer, Thermo scientific)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 9회에 수득된 RNA 앱타머의 농도가 1067.3 ng/㎕로 가장 높았다. 따라서, 상기로부터 SELEX를 9회 수행한 뒤 수득된 RNA 앱타머 풀(pool)이 ESM-1 단백질과 가장 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
3-2. 실시간 PCR
8 내지 10회의 SELEX를 통해 수득된 RNA 앱타머의 ESM-1 단백질에 대한 친화성을 실시간 PCR 방법으로 확인하였다.
구체적으로, SELEX를 8 내지 10회 수행한 후 수득된 cDNA 앱타머를 단계희석으로 희석하여 주형을 준비하였다. 상기 준비된 주형 cDNA 및 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, USA)를 이용하여 통상적인 방법으로 실시간 PCR을 수행하였다. 이때, 실시간 PCR은 94℃에서 5분간 변성시키고, 94℃에서 20초, 52℃에서 20초, 그리고 72℃에서 20 초간 반응을 40 주기 반복한 후, 72℃에서 5분간 연장시키는 조건으로 수행하였다. 실시간 PCR 결과 수득된 Ct 값을 하기 표 2에 나타내었다.
| SELEX 횟수 | Ct 값 | |
| 10-2 | 10-3 | |
| 8R | 8.75 | 10.82 |
| 9R | 7.25 | 9.25 |
| 10R | 7.95 | 11.1 |
표 2에 나타난 바와 같이, 8회 및 10회 SELEX를 수행한 후 수득된 RNA 앱타머를 이용한 실시간 PCR의 Ct 값이 각각 8.75 및 7.95로 9회 SELEX를 수득한 후 수득된 RNA 앱타머에 의한 결과보다 높았다. 이로부터 SELEX를 9회 수행하여 수득된 RNA 앱타머 풀이 ESM-1 단백질에 대한 결합력이 가장 높고, 더 이상 SELEX를 수행하지 않아도 됨을 확인하였다. 이는 상기 실시예 3-1에서 수행된 나노드랍 결과와도 일치하였다.
실시예 4. RNA 앱타머의 서열 확인
실시예 3에서 ESM-1 단백질과 가장 특이적으로 결합하는 것으로 확인된 RNA 앱타머 풀에 존재하는 RNA 앱타머의 서열을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 선별된 RNA 앱타머 풀에 존재하는 RNA 앱타머를 실시예 2-2에 기재된 바와 같은 조건 및 방법으로 cDNA로 제작하였고, 제작된 cDNA를 주형으로 상술한 바와 같은 방법으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물은 T-블런트 클로닝 키트(SolGent, 한국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 T-벡터에 클로닝되었다.
구체적으로, 1 ㎕의 T-벡터(10 ng/㎕), 4 ㎕의 PCR 산물(20 ng/㎕) 및 1 ㎕의 6x T-블런트 완충액을 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응물을 100 ㎕의 DH5α 수용성 균주와 혼합하고, 42℃에서 30초 동안 열충격을 가해 형질전환시켰다. 이를 2분 동안 얼음에 방치하고, 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 및 20 mM 글루코스)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 200 ㎕의 배양액을 50 ㎍/㎖의 암피실린(Sigma Aldrich, 미국), 50 ㎍/㎖의 카나마이신(Sigma Aldrich, 미국), 50 ㎍/㎖의 X-갈(X-gal, Sigma Aldrich, 미국) 및 5 ㎍/㎖의 IPTG(Thermo Scientific, 미국)가 포함된 LB 배양 플레이트에 스프레딩하였다. 이를 37℃에서 15시간 배양한 뒤, 생성된 콜로니 중 흰색 콜로니만 선별하여 통상적인 방법으로 DNA를 추출하고, 그 염기서열을 Solgent(한국) 사에 의뢰하여 확인하였다.
| 이름 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| ESM-1_5 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGUAGAGCCGCAAUGCGGUUAGUCAAGUAAGACCUGCAGUGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 1 |
| ESM-1_13 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUAAGAAGGCAGCGAGCCUCUGGUGACCCUCCGUGUGCGCAAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 2 |
| ESM-1_16 | GGUAAUACGACAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGGUAGUCCGCUUGAGGACGUCUCUCAAAUGUAACUUGCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 3 |
| ESM-1_1 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUGGAAGCCAGUUGUGGCAAUAAGUUGGUUACUGCGCUGCAAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 4 |
| ESM-1_2 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGAGCUGGGCAGGCCAACUCUGGUCUCGCCGUAUUUCUUUGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 5 |
| ESM-1_3 | UAGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUAAGAGGGCUUAAGCCCCUGGUGUCUCGUUAUGGUGGCUUCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 6 |
| ESM-1_4 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUCGCAAAUUUGCGGAACCUAGUUACGGGCUGGUUGUCACGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 7 |
| ESM-1_6 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUGAUUAAGGCCUGAGCACGUGUGCGUAUAUUCCUGACUGCAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 8 |
| ESM-1_7 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUCGGAAGCCUCACGGCGAUAUGCUGUACACCAUGAUCGCUUAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 9 |
| ESM-1_8 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUGAUCUUUAUUGACGGAUCUAAGGAAAUCUGAUUUUAUGCAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 10 |
| ESM-1_9 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUAGAUUGUUUGACACGAGUACGUGAGGCUGGACUCCCGAGCAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 11 |
| ESM-1_10 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGUAGAGCCGCAAUGCGGUUAGUCAAAUAAGACCUGCAGUGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 12 |
| ESM-1_11 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGUAGAGCCGCAAUGCGGUUAGUCAAGUAAGACCUGCAGUGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 13 |
| ESM-1_12 | GGUAAUACACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUAAGAGGGCCUAAGCCCCUGGUGUCUCGUUAUGGUGGCUUCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 14 |
| ESM-1_14 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUCCCCUUUAGCCUGGUUGGCAGCCAUGGUGUGCCGUCUCUCAGUUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 15 |
| ESM-1_15 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUCGUUGGCUAGGGAAAGCUCGGCCGCACAAUUUGUGUACGGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 16 |
| ESM-1_17 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUGGCUCGGUUCUUUGUCUGUAACUUUGAUCUUCCCUUUGCAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 17 |
| ESM-1_18 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGAAUGACAGGCUGCACUAGCGAACGUUCGGUACUAUUUAUAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 18 |
| ESM-1_19 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUAGGCUAGACUUCGGGUCGGUAUGCUCCAGCACAGCUUGUAGAUAGUAAGCGCAAUCU | 서열번호 19 |
| ESM-1_20 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUAUUGAUUGACUACUUCGUGAGAGGCGUGGUGUUGUGUGCAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 20 |
| ESM-1_21 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUAAAGUAUAGGCGGUGUUUAAGCAGAAGUUGCACCUGGCCCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 21 |
| ESM-1_22 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUAAGAAGGCAGCGAGCCUCUGGUGACCCUCCGUGUGCGCAAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 22 |
| ESM-1_23 | GGUAAUACGACAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGGUAGUCCGCUUGAGGACGUCUCUCAAAUGUAACUUGCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 23 |
| ESM-1_24 | GGUAAUACGACUACUAUAGGGAGAUACCAGCUAUUCAAUUAAGUUAUCUAGCCUCUGGUUAGUUGAGGGUCUCACGUUGCAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 24 |
| ESM-1_25 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUCUUAUUGUUUGUAGACCGGGAGUCUAGGCUGGGUACUCGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 25 |
| ESM-1_26 | GGUAAUACGACUCACUAUAGGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUUGCUAGCCCAUAGGGCGGUUUUUCCCCGCGUUCUUACUCAGAGAUAGUAAGUGCAAUCU | 서열번호 26 |
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 중복되지 않은 26개의 RNA 앱타머를 수득하였다.
실험예 1. ESM-1 단백질 및 RNA 앱타머 친화력의 정량적 확인
1-1. ESM-1 단백질 코팅 센서 칩의 제작
표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 실험을 통해, 상기에서 수득된 26개 RNA 앱타머의 ESM-1 단백질에의 결합력을 정량적으로 확인하였다.
먼저, 카르복실기로 표면이 코팅된 센서 칩 CM5(GE healthcare, 영국)에 0.1 M NHS(Nhydroxysuccinimide) 및 0.4 M EDC(N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl) carbodiimide)가 혼합된 혼합액을 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주어 표면의 카르복실기를 활성화시켰다. 카르복실기가 활성화된 센서 칩 CM5의 표면에, 44 ng/㎕ 농도의 ESM-1 단백질을 포함하는 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5) 용액을 1/10로 희석하여 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하였다. 이를 3회 반복한 뒤, ESM-1 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 5 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주어 표면의 활성화된 카르복실기를 불활성화시켰다. 그 결과, 표면에 ESM-1 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5를 제작하였다.
1-2. RNA 앱타머의 친화력 확인
상기 선별된 RNA 앱타머의 ESM-1 단백질에 대한 친화력을 SPR 방법을 이용하여 정량적으로 확인하였다.
먼저, 실시예 4에서 확인된 26개의 RNA 앱타머를 HBS-EP 완충액(GE Healthcare, BR-1001-88)에 300, 500, 700 또는 1,000 nM의 농도가 되도록 희석하여 준비하였다. 실험은 BIAcore 3000(BIACORE)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었으며, 실험예 1-1에서 제작된 ESM-1 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5에 대한 RNA 앱타머의 결합력과 아무것도 코팅되지 않은 센서 칩 CM5에 대한 RNA 앱타머의 결합력 차이를 확인하였다. 이때, 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)을 이용하여 수득 및 정량하였고, 각 실험 후, 센서 칩은 1 M NaCl 및 50 mM NaOH 완충액을 이용하여 재생시켰다. 그 결과, RNA 앱타머의 ESM-1 단백질에 대한 친화력을 하기 표 4에 해리 상수(KD) 값으로 나타내었다.
| 이름 | KD(M) |
| ESM-1_5 | 5.68×10-12 |
| ESM-1_13 | 2.38×10-13 |
| ESM-1_16 | 1.99×10-11 |
| ESM-1_1 | 1.49×10-8 |
| ESM-1_2 | 3.51×10-8 |
| ESM-1_3 | 2.06×10-10 |
| ESM-1_4 | 1.81×10-8 |
| ESM-1_6 | 1.08×10-9 |
| ESM-1_7 | 1.77×10-7 |
| ESM-1_8 | 1.45×10-8 |
| ESM-1_9 | 1.32×10-8 |
| ESM-1_10 | 3.97×10-8 |
| ESM-1_11 | 5.84×10-8 |
| ESM-1_12 | 6.87×10-9 |
| ESM-1_14 | 8.70×10-8 |
| ESM-1_15 | 1.31×10-8 |
| ESM-1_17 | 6.18×10-8 |
| ESM-1_18 | 1.76×10-8 |
| ESM-1_19 | 1.16×10-8 |
| ESM-1_20 | 2.31×10-10 |
| ESM-1_21 | 9.97×10-9 |
| ESM-1_22 | 1.33×10-8 |
| ESM-1_23 | 1.06×10-8 |
| ESM-1_24 | 3.52×10-8 |
| ESM-1_25 | 5.49×10-8 |
| ESM-1_26 | 4.72×10-8 |
표 4에 나타난 바와 같이, 선별된 RNA 앱타머는 ESM-1 단백질에 높은 친화력을 나타내었다. 특히, ESM-1_5, ESM-1_13 및 ESM-1_16 앱타머가 더 높은 친화력으로 ESM-1 단백질과 결합하였다.
실험예 2. RNA 앱타머에 의한 혈관세포 성장 억제 확인
실험예 1에서 ESM-1 단백질에 높은 친화력을 나타내는 ESM-1_5, ESM-1_13 및 ESM-1_16 앱타머를 이용하여 혈관세포의 성장억제 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, HUVEC(ATCC CRL-1730) 세포주를 100 ㎜ 배양접시에 105개가 되도록 분주하였다. 분주된 세포는 EGM-2 내피세포 성장배지-2 불렛 키트(EGM-2 endothelial cell growth medium-2 bullet kit, Lonza, 스위스)를 사용하여 배양하였고, 이때, ESM-1_5, ESM-1_13 및 ESM-1_16 앱타머를 3 μM의 농도로 첨가하였다. 양성대조군으로서 RNA 앱타머가 포함되지 않은 배지를, 음성대조군으로서 RNA 앱타머 및 VEGF가 포함되지 않은 배지를 사용하였다. 상기 HUVEC 세포가 배양접시에 80% 이상 배양되도록 37℃ CO2 배양기에서 배양하였다. 2일 후, 세포를 1×DPBS 완충액으로 2회 세척하여 배양배지를 제거하고, 단백질 분해효소 억제제 칵테일 및 인산가수분해효소 억제제 칵테일을 첨가한 RIPA 완충액(Thermo scientific, 미국)을 첨가하였다. 이를 4℃에서 반응시켜 세포를 용해시킨 후, 원심분리하여 세포 용해물(lysate)를 수득하였다. 수득된 세포 용해물 내 단백질의 함량을 BCA 어세이 키트(BCA assay kit, Thermo scientific, 미국)를 이용하여 확인하였다. 20 ㎍의 정량한 단백질을 10% 아크릴아미드 겔에 전기영동하고, 0.2 ㎛의 니트로셀룰로오스 막(GE healthcare, 스위스)에 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막을 폰소 S 용액(ponceau S solution, Sigma aldrich, 미국)으로 염색하여 표적 단백질에 해당되는 부분의 막을 잘라 웨스턴블롯을 수행하였다.
잘라서 준비한 니트로셀룰로오스 막을 블로킹 완충액(5% BSA 및 0.05%(v/v) 트윈-2가 포함된 1×PBST)에 넣어 1시간 동안 실온에서 교반하여 전처리하였다. 전처리된 막을 세척 완충액(0.05%(v/v) 트윈-2가 포함된 1×PBST)으로 3번 세척하고, 1차 항체로 Akt 항체(Cell Signaling Technology, 미국), pAkt 항체(Cell Signaling Technology, 미국), MEK 항체(Cell Signaling Technology, 미국), pMEK 항체(Cell Signaling Technology, 미국), ERK 항체(Cell Signaling Technology, 미국), pERK 항체(Cell Signaling Technology, 미국) 또는 GAPDH 항체(Thermo scientific, 미국)를 처리하여 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 반응이 끝난 막을 다시 세척 완충액을 이용하여 3회 세척하고, 2차 항체로서 항-토끼 IgG 항체(Thermo scientific, 미국) 또는 항-마우스 IgG 항체(Sigma Aldrich, 미국)를 처리하였다. 이를 실온에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, 다시 세척 완충액으로 3회 세척하고 피코 그레이드 ECL 기질(pico grade ECL substrate, Thermo scientific, 미국)을 이용하여 밴드를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, RNA 앱타머가 ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하여 신생혈관 생성에 관여하는 신호전달 기전을 억제하였다. 구체적으로, ESM-1 단백질에 대한 RNA 앱타머 처리군에서 Akt, MEK 및 ERK 단백질의 인산화가 억제되었다. 특히 이들 RNA 앱타머는 Akt, MEK 및 ERK 단백질 자체의 발현량에는 변화를 주지 않으면서 신호전달 기전만을 억제하였다.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머가 혈관신생을 억제함으로써, 혈관신생에 기인한 질환들을 치료하는데 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
<110> HPBIO Inc.
<120> RNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO ESM-1 PROTEIN AND USING THE
SAME
<130> DP-2020-0298-KR
<160> 30
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_5
<400> 1
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuguagagcc gcaaugcggu 60
uagucaagua agaccugcag ugagauagua agugcaaucu 100
<210> 2
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_13
<400> 2
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuuaagaagg cagcgagccu 60
cuggugaccc uccgugugcg caagauagua agugcaaucu 100
<210> 3
<211> 94
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_16
<400> 3
gguaauacga cauagggaga uaccagcuua uucaauuggu aguccgcuug aggacgucuc 60
ucaaauguaa cuugcgagau aguaagugca aucu 94
<210> 4
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_1
<400> 4
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuuggaagcc aguuguggca 60
auaaguuggu uacugcgcug caagauagua agugcaaucu 100
<210> 5
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_2
<400> 5
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uugagcuggg caggccaacu 60
cuggucucgc cguauuucuu ugagauagua agugcaaucu 100
<210> 6
<211> 103
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_3
<400> 6
uaguaauacg acucacuaua gggagauacc agcuuauuca auuuaagagg gcuuaagccc 60
cuggugucuc guuauggugg cuucgagaua guaagugcaa ucu 103
<210> 7
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_4
<400> 7
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuucgcaaau uugcggaacc 60
uaguuacggg cugguuguca cgagauagua agugcaaucu 100
<210> 8
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_6
<400> 8
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuugauuaag gccugagcac 60
gugugcguau auuccugacu gcagauagua agugcaaucu 100
<210> 9
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_7
<400> 9
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uucggaagcc ucacggcgau 60
augcuguaca ccaugaucgc uuagauagua agugcaaucu 100
<210> 10
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_8
<400> 10
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuugaucuuu auugacggau 60
cuaaggaaau cugauuuuau gcagauagua agugcaaucu 100
<210> 11
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_9
<400> 11
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuagauuguu ugacacgagu 60
acgugaggcu ggacucccga gcagauagua agugcaaucu 100
<210> 12
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_10
<400> 12
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuguagagcc gcaaugcggu 60
uagucaaaua agaccugcag ugagauagua agugcaaucu 100
<210> 13
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_11
<400> 13
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuguagagcc gcaaugcggu 60
uagucaagua agaccugcag ugagauagua agugcaaucu 100
<210> 14
<211> 101
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_12
<400> 14
gguaauacac ucacuauagg gagauaccag cuuauucaau uuaagagggc cuaagccccu 60
ggugucucgu uaugguggcu ucgagauagu aagugcaauc u 101
<210> 15
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_14
<400> 15
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuccccuuua gccugguugg 60
cagccauggu gugccgucuc ucaguuagua agugcaaucu 100
<210> 16
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_15
<400> 16
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uucguuggcu agggaaagcu 60
cggccgcaca auuuguguac ggagauagua agugcaaucu 100
<210> 17
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_17
<400> 17
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuuggcucgg uucuuugucu 60
guaacuuuga ucuucccuuu gcagauagua agugcaaucu 100
<210> 18
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_18
<400> 18
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uugaaugaca ggcugcacua 60
gcgaacguuc gguacuauuu auagauagua agugcaaucu 100
<210> 19
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_19
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gguaugcucc agcacagcuu guagauagua agcgcaaucu 100
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_20
<400> 20
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuuauugauu gacuacuucg 60
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_21
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aagcagaagu ugcaccuggc ccgagauagu aagugcaauc u 101
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_22
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gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuuaagaagg cagcgagccu 60
cuggugaccc uccgugugcg caagauagua agugcaaucu 100
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ucaaauguaa cuugcgagau aguaagugca aucu 94
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_24
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gguaauacga cuacuauagg gagauaccag cuauucaauu aaguuaucua gccucugguu 60
aguugagggu cucacguugc agauaguaag ugcaaucu 98
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_25
<400> 25
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuucuuauug uuuguagacc 60
gggagucuag gcuggguacu cgagauagua agugcaaucu 100
<210> 26
<211> 101
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1_26
<400> 26
gguaauacga cucacuauag ggagauacca gcuuauucaa uuugcuagcc cauagggcgg 60
uuuuuccccg cguucuuacu cagagauagu aagugcaauc u 101
<210> 27
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> template DNA
<400> 27
ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa ttnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnagatagta agtgcaatct 100
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer
<400> 28
ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer
<400> 29
agattgcact tactatct 18
<210> 30
<211> 188
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ESM-1 protein
<400> 30
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Gly Ser Trp Ser Asn Asn Tyr Ala Val Asp Cys
20 25 30
Pro Gln His Cys Asp Ser Ser Glu Cys Lys Ser Ser Pro Arg Cys Lys
35 40 45
Arg Thr Val Leu Asp Asp Cys Gly Cys Cys Arg Val Cys Ala Ala Gly
50 55 60
Arg Gly Glu Thr Cys Tyr Arg Thr Val Ser Gly Met Asp Gly Met Lys
65 70 75 80
Cys Gly Pro Gly Leu Arg Cys Gln Pro Ser Asn Gly Glu Asp Pro Phe
85 90 95
Gly Glu Glu Phe Gly Ile Cys Lys Asp Cys Pro Tyr Gly Thr Phe Gly
100 105 110
Met Asp Cys Arg Glu Thr Cys Asn Cys Gln Ser Gly Ile Cys Asp Arg
115 120 125
Gly Thr Gly Lys Cys Leu Lys Phe Pro Phe Phe Gln Tyr Ser Val Thr
130 135 140
Lys Ser Ser Asn Arg Phe Val Ser Leu Thr Glu His Asp Met Ala Ser
145 150 155 160
Gly Asp Gly Asn Ile Val Arg Glu Glu Val Val Lys Glu Asn Ala Ala
165 170 175
Gly Ser Pro Val Met Arg Lys Trp Leu Asn Pro Arg
180 185
Claims (13)
- 서열번호 3으로 기재된 염기서열로 구성되는 ESM-1(endothelial cell specific molecules-1) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
- 제1항에 있어서, 상기 ESM-1 단백질은 서열번호 30으로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인, ESM-1 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
- 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 ESM-1 단백질 검출용 조성물.
- 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 ESM-1 단백질 검출용 키트.
- 제1항의 RNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 ESM-1 단백질 검출방법.
- 제1항의 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 약학적 조성물.
- 제1항의 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 억제용 건강기능식품.
- 제1항의 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 관절염, 당뇨병성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 혈관신생으로 인한 각막질환, 망막변성, 각막이식 거부, 과립성 결막염, 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염 또는 여드름인, 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항의 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
- 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단용 조성물.
- 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단용 키트.
- 제1항의 RNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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|---|---|---|---|
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| KR101192297B1 (ko) * | 2008-12-10 | 2012-10-17 | 한국생명공학연구원 | 간암에 대한 신규 바이오마커 및 그의 용도 |
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Park 등, 한국생물공학회 학술대회 초록집, 564면 (2015.04.) |
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