KR20230137242A - 아포지단백 b100에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 상기 dna 앱타머의 용도 - Google Patents

아포지단백 b100에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 상기 dna 앱타머의 용도 Download PDF

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박가영
조희영
이승재
안지영
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Abstract

본 발명은 ApoB100에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 상기 DNA 앱타머의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 DNA 앱타머는 ApoB100에 특이적으로 높은 친화도록 결합하고, 콜레스테롤을 저감시킴으로써 ApoB100을 검출하거나, 이상지질혈증 및 혈관질환 등과 같은 질환의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아포지단백 B100에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 상기 DNA 앱타머의 용도{DNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO APOLIPOPROTEIN B100 AND USING THE SAME}
본 발명은 아포지단백(apolipoprotein B100, ApoB100)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 상기 DNA 앱타머의 용도에 관한 것이다.
이상지질혈증(dyslipidemia)이란 혈중에 총 콜레스테롤, LDL(low density lipoprotein) 콜레스테롤, 중성지방이 증가된 상태이거나, HDL(high density lipoprotein) 콜레스테롤이 감소된 상태를 말한다. 이상지질혈증의 대부분은 비만, 당뇨병, 음주와 같은 원인에 의해 발생하나, 유전적 요인으로 혈액 내 특정 지질이 증가하여 발생하는 경우도 있다.
이상지질혈증은 특별한 증세를 보이지 않는 경우가 대부분이나 이를 조절하지 않고 장기간 방치하면 콜레스테롤이 혈관 벽에 쌓여 혈관을 좁히거나 막아 협심증, 심근경색, 뇌졸중(뇌경색)과 같은 심뇌혈관질환을 일으킬 수 있다.
이상지질혈증은 1차성과 2차성으로 그 원인을 크게 나눌 수 있다. 1차성 원인은 지방 위주의 식생활, 운동 부족, 유전적인 요인 등에 의해 발생하는 원발성 이상지질혈증을 의미하고, 2차성 원인은 갑상성기능저하증, 만성 간질환, 신증후군 등의 기저질환 또는 임산, 약물 복용 등에 의해 유발되는 이상지질혈증을 나타낸다. 가족성 고콜레스테롤혈증이나 가족성 고중성지방혈증 등 유전적 소인에 의한 경우 황색종, 황색판종, 간비대, 신장비대 등이 나타날 수 있지만, 대개 무증상으로 대부분 혈액검사로 발견된다.
이에, 이상지질혈증을 경제적으로 진단할 수 있는 연구가 진행되고 있으며, 대한민국 등록특허 제10-2155306호는 유전자의 변이를 검출하여 고밀도지질단백질콜레스테롤의 수준을 예측하기 위한 조성물 및 키트, 및 이를 이용한 개체의 고밀도지질단백질콜레스테롤 수준을 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 개시한다. 상기 문헌은 개체의 고밀도지질단백질(HDL) 수준을 조기에 예측하여 심혈관 질환의 발병을 예방하거나 개인 맞춤의학적 치료에 적용할 수 있다.
대한민국 등록특허 제10-2155306호
본 발명의 목적은 특정 염기서열로 구성된 아포지단백(apolipoprotein B100, ApoB100)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 DNA 앱타머를 포함하는 ApoB100 검출용 조성물 및 키트, 및 상기 DNA 앱타머를 이용하여 ApoB100을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 DNA 앱타머를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 DNA 앱타머를 이용하여 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 16으로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 아포지단백(apolipoprotein B100, ApoB100)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 ApoB100 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 ApoB100 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 ApoB100에 특이적으로 높은 친화도록 결합하고, 콜레스테롤을 저감시킴으로써 ApoB100을 검출하거나, 이상지질혈증 및 혈관질환 등과 같은 질환의 진단 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 SELEX 횟수에 따른 ApoB100에 대한 결합력을 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 DNA 앱타머의 세포독성을 확인한 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 DNA 앱타머의 콜레스테롤 저감 효과를 확인한 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 DNA 앱타머 및 레시틴의 병용처리에 의한 콜레스테롤 저감 효과를 확인한 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 내지 16으로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 ApoB100(apolipoprotein B100)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "아포지단백(apolipoprotein B100, ApoB100)"은 간이나 장의 콜레스테롤을 조직으로 운반하는 지단백질 중의 하나로서, 다양한 종류의 세포에서 LDL 수용체에 인식된다. ApoB100은 4,563개의 아미노산으로 구성된 가장 큰 ApoB 그룹에 포함되는 단백질로 혈장에서 ApoB100 및 ApoB48의 두가지 아형(isoform)으로 존재한다. ApoB100의 수준은 콜레스테롤에 의해 발생하는 혈관질환과 관련있으며, LDL-C보다 더 나은 예측인자로서 알려져 있다.
상기 ApoB100은 통상의 기술분야에 ApoB100이라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 DNA 앱타머는 ApoB100에 특이적으로 결합하는 특성을 유지하는 한, 상기 서열번호 1 내지 16으로 각각 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 가질 수 있다.
상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 DNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 ApoB100 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 ApoB100 검출용 조성물 및 키트에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 ApoB100 검출용 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 DNA 앱타머는 상기 DNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 DNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 ApoB100 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 ApoB100 검출방법에 사용되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
상기 시료는 ApoB100을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 조성물 및 키트 또한 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "이상지질혈증(dyslipidemia)"은 혈중에 총콜레스테롤, LDL 콜레스테롤 및 중성지방이 증가된 상태이거나 HDL 콜레스테롤이 감소된 상태를 의미하며, 심혈관계질환이 발생할 수 있는 위험요인 중 하나로 알려져 있다. 상기 이상지질혈증은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 이상지질혈증을 포함할 수 있다. 일례로, 상기 이상지질혈증은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 고중성지방혈증을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "혈관질환(vascular disease)"은 혈전 등의 혈액응고 덩어리 또는 지방의 축적으로 혈관이 좁아져 발생하는 질환을 의미한다. 상기 혈관질환은 통상의 기술분야에 알려진 모든 종류의 혈관질환을 포함할 수 있다. 또한, 상기 혈관질환은 혈관이 좁아져 발생하는 질환뿐 아니라, 혈관이 터져서 발생하는 질환도 포함할 수 있다. 일례로, 상기 혈관질환은 동맥경화, 죽상경화증, 죽상동맥경화증, 뇌경색, 협심증, 말초혈관 폐색성 질환, 심근경색, 당뇨성 망막증 또는 고혈압성 망막증을 포함할 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단의 정보를 제공하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단의 정보를 제공하기 위한 방법에 사용되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 이상지질혈증 또는 혈관질환은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 시료는 이상지질혈증 또는 혈관질환을 진단하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 포유동물 유래 시료일 수 있고, 구체적으로 인간 유래 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 또한, 상기 시료는 본 발명에 따른 방법에 사용되기 전에 상술한 바와 같은 방법으로 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 이상지질혈증 또는 혈관질환은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 DNA 앱타머를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 포함되는 DNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 DNA 앱타머는 서열번호 1 내지 16으로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 또한, 상기 이상지질혈증 또는 혈관질환은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명의 DNA 앱타머는 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. DNA 앱타머의 제작
ApoB100(apolipoprotein B100)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머를 제작하기 위해, 먼저 하기 기재된 바와 같이 DNA 라이브러리를 제작하였다.
1-1. 랜덤 DNA의 증폭
먼저, 40개의 랜덤 염기서열을 포함하는 76 bp 크기의 주형 DNA(서열번호 17: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-N40-AGATAGTAAGTGCAATCT-3')와 이에 대한 정방향 프라이머(서열번호 18: 5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 19: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 코스모진텍 사(한국)에 주문제작하였다. 이후, 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 dNTP 혼합물, 2 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머, 0.3 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕), 및 35.7 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
초기 변성 단계 94℃, 5분 1회
변성 단계 94℃, 30초 5회
어닐링(annealing) 단계 52℃, 30초
연신(elongation) 단계 72℃, 30초
후기 연신 단계 72℃, 5분 1회
수득된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 상기 PCR 산물을 PCR 정제키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 50 ㎕의 증류수를 사용하여 수득하였다. 수득된 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 확인하였다.
1-2. ssDNA 증폭
실시예 1-1에서 수득된 PCR 산물을 주형으로 비대칭(assymetric) PCR을 수행하여 dsDNA를 ssDNA로 증폭시켰다.
구체적으로, 1 ㎕의 PCR 산물, 10 ㎕의 10x 완충용액, 8 ㎕의 dNTP 혼합물, 2 ㎕의 10 μM 정방향 프라이머(서열번호 17), 2 ㎕의 10 μM 역방향 프라이머(서열번호 18), 0.5 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕), 및 76.5 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 이때, 역방향 프라이머는 비오틴이 결합된 프라이머를 사용하였다. 준비된 반응물을 변성, 어닐링 및 연신 단계를 5회 반복하는 대신 15회 반복하는 것을 제외하고는 상기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다. 수득된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하였다. 이후, PCR 산물에 이에 3배 부피의 100% 에탄올과, 1/1000배 부피의 tRNA를 첨가하여 -70℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 4℃에서 13,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하여 ssDNA만을 수득하였다.
1-3. ssDNA의 선별 및 회수
상기 확보된 ssDNA 산물 중 비오틴(Biotin)이 결합되어 있는 ssDNA를 제거하기 위하여, 상기 실시예에서 획득한 100 ㎕의 PCR 산물을 85℃에서 5분 동안 가열하였다. 이를 5분 동안 얼음에 넣어 식히고, 50 ㎕의 스트렙트아비딘(streptavidin, Pierce, USA)을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응액을 4℃, 13,000 rpm의 조건 하에서 10분간 원심분리한 후, 상층액만을 회수하여 상기 서술한 바와 같이 100% 에탄올 및 tRNA를 이용하여 ssDNA만을 수득하였다.
1-4. 3차원 구조의 DNA 앱타머 제작
50 ㎕의 ssDNA 앱타머에 50 ㎕의 2× TBS 완충액을 첨가하고, 85℃에서 5분동안 끓여 변성시킨 후, 상온에서 1시간 이상 서서히 식혀 ssDNA 앱타머의 안정한 3차원 구조를 형성시켰다.
실시예 2. ApoB100에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 선별
ApoB100에 특이적으로 결합하는 ssDNA 앱타머를 SELEX 방법으로 선별하였다.
먼저, 200 ㎕의 Ni-NTA 아가로즈에 200 ㎕의 1× 앱타머 선별용액(500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl 및 5 mM 이미다졸)을 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 교반하여 반응시켰다. 이후, 이를 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 이를 2회 반복함으로써 활성화된 Ni-NTA 아가로즈를 수득하였다. 활성화된 Ni-NTA 아가로즈에 ApoB100 및 DNA 앱타머를 혼합하여 첨가하고, 이를 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 반응물을 4℃에서 13,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 1 ㎖의 세척용액(500 mM NaCl, 60 mM 이미다졸 및 20 mM Tris-HCl)을 첨가하여 세척하는 과정을 5회 반복하였다. 상층액을 모두 제거하여 ApoB100과 결합하지 못한 DNA 앱타머를 제거하고, 200 ㎕의 DNA 앱타머 용출용액(300 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl 및 250 mM 이미다졸)을 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 이후, 상기 반응액을 ℃에서 30분 동안 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액으로부터 상기 서술한 바와 같이 100% 에탄올 및 tRNA를 이용하여 ssDNA만을 수득하였다. 수득된 펠렛은 건조시킨 후, 50 ㎕의 핵산분해효소(nuclease)가 포함되지 않은 증류수에 희석하였다. 수득된 ssDNA를 주형으로 사용하여 SELEX를 7회 반복수행하였다. 이후, ApoB100 없이 Ni-NTA 아가로즈만 사용하여 네가티브 SELEX를 수행한 후, 다시 SELEX를 3회 수행하였다. SELEX를 반복수행하는 과정에서 수득된 각 풀(pool)에 포함된 DNA 앱타머의 ApoB100에 대한 친화성을 통상적인 나노드롭(nano drop) 방법으로 분광광도계를 사용하여 확인하고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, SELEX를 9 및 10회 반복하여 수득된 풀이 ApoB100에 가장 특이적으로 결합하는 것을 확인하였다.
실시예 3. ApoB100에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머의 서열 확인
상기에서 나노드랍 방법으로 ApoB100에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 풀로부터 DNA 앱타머 후보군의 서열을 다음과 같이 확인하였다.
구체적으로, 선별된 DNA 앱타머 풀을 주형으로 상기 서술한 바와 같이 프라이머(서열번호 17 및 18)를 사용하여 PCR을 수행하고, 수득된 PCR 산물은 솔젠트사의 T-블런트 PCR 클로닝 키트를 이용하여 T-벡터 클로닝에 사용되었다. T-벡터 클로닝은 1㎕의 T-블런트 벡터(10 ng/㎕), 4 ㎕의 PCR 산물 및 1 ㎕의 6× T-블런트 버퍼를 혼합하여 25℃에서 5분 동안 반응시켜 수행하였다. 상기 반응액을 100 ㎕의 DH5α 수용성 균주(competent cell)와 섞은 후 42℃에서 30초 동안 열 충격(heat shock)을 가한 후 얼음에서 2분 동안 방치하였다. 반응액에 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 글루코즈)를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 이후, 200 ㎕의 배양액을 취하여 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/㎖), 카나마이신(kanamycin, 50 ㎍/㎖), X-gal(50 ㎍/㎖) 및 IPTG(5 ㎍/㎖)가 포함되어 있는 LB 배양 플레이트(LB plate)에 도말하고, 37℃에서 15시간 동안 배양시킨 후, 24개의 흰색 콜로니만을 선별하여 확인된 16개의 각각 다른 DNA 앱타머 염기서열(Solgent, Korea)을 하기 표 2에 나타내었다.
이름 서열 서열번호
AB100_1-12 ATACCAGCTTATTCAATTCCGTGAGGTG GCGTATCAAC GGATATTAGG GAGAGGGGGGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 1
AB100_2-1 ATACCAGCTTATTCAATTGTGACTGGCC ATCGATTTTA ACCCTTTTTC CTTGTGCCACAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 2
AB100_3-1 ATACCAGCTTATTCAATTGCGGTAGCAG GGCGCATTCG GATGAACATC GCCGGTGACGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 3
AB100_3-2 ATACCAGCTTATTCAATTCCTATTCCTTATTATATTTTCTTTTTTTGTAATTTGGTCGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 4
AB100_3-3 ATACCAGCTTATTCAATTCACGCTATCG GCCTTGAGAG GGTCTAAGCA ACGTATCCCAAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 5
AB100_3-8 ATACCAGCTTATTCAATTTGGGCTGGCC GAGAGTTGAC GATTTGTGCA GTCGTTAGGCAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 6
AB100_3-10 ATACCAGCTTATTCAATTCGTGAAAGGC GAACGACCAA CGGTGGAGTC TGGTTGGTGGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 7
AB100_3-11 ATACCAGCTTATTCAATTCGCCGAAAGACAGTTAGTGTTCACTCTCGTGATGATGGCAAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 8
AB100_3-13 ATACCAGCTTATTCAATTGGCGAGGGAG TATGTACGAC TACGTTGTAG GGTTGCTCTAAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 9
AB100_3-18 ATACCAGCTTATTCAATTGGGCGCCTGC GCTATTTGTG ATTGAAGTAA TTGAAGTGCGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 10
AB100_3-19 ATACCAGCTTATTCAATTTGTCGTACGT GTACAGGGTA CAAATCTCCA ATCTTGGTTAAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 11
AB100_3-20 ATACCAGCTTATTCAATTCGGAAGGGGC ATGTAAGGAC CCTGTCTGAG TGAGAACATGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 12
AB100_4-3 ATACCAGCTTATTCAATTCGGGCGAGGA GATTGAAATC GGTAGGACCT CCTGGCCTGC GAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 13
AB100_4-4 ATACCAGCTTATTCAATTCTAAAAAGTT TCGCTCTCTC GCTCTTTATG TATGGTTTCAAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 14
AB100_4-5 ATACCAGCTTATTCAATTCCTATTCCTT ATTATATTTT CTTTTTTTGT AATTTGGTCGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 15
AB100_4-20 ATACCAGCTTATTCAATTCTATTCCTTA TTATATTTTC TTTTTTTGTA ATTTGGTCGAGATAGTAAGTGCAATCT 서열번호 16
실시예 4. ApoB100에 대한 결합력의 정량분석
상기에서 선별된 16종류의 앱타머의 ApoB100에 대한 친화력을 통상적인 표면 플라즈몬 공명(Surface Plasmon Resonance, SPR) 방법으로 확인하였다.
먼저, 16종류의 DNA 앱타머를 HBS-EP 완충액(GE Healthcare, BR-1001-88)에 0, 100, 200 또는 500 nM의 농도가 되도록 희석하여 준비하였다. 이때, 200 nM 농도인 경우를 2회 실험하여 결과에 대한 오차를 줄일 수 있도록 준비하였다. 준비된 DNA 앱타머와 BIAcore T200을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였으며, ApoB100이 코팅된 센서칩 CM5에 대한 DNA 앱타머의 결합력과 아무것도 코팅되지 않은 센서칩 CM5에 대한 DNA 앱타머의 결합력 차이를 확인하였다. 이때, 속도변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)을 이용하여 수득 및 정량하였고, 각 실험 후, 센서칩은 0.5% SDS를 이용하여 재생시켰다. 그 결과, DNA 앱타머의 ApoB100에 대한 친화력을 표 3에 나타내었다. 최종 결합력은 DNA 앱타머가 처리된 각각의 농도에 대한 친화도 값으로부터 평균 및 표준편차를 계산하여 산출하였다.
100 nM 200 nM
(1)		 500 nM 200 nM
(2)		 평균 결합력
(nM)
AB100_1-12 3.79E-09 1.23E-08 5.21E-09 4.37E-09 6.42E-09 6.42±1.72
AB100_2-1 1.68E-10 1.10E-10 1.33E-09 1.38E-09 7.47E-10 0.747±0.304
AB100_3-1 2.18E-10 1.70E-09 7.09E-09 4.40E-08 1.32E-08 13.2±8.95
AB100_3-2 1.29E-08 2.51E-07 2.10E-09 1.54E-07 1.05E-07 105±51.6
AB100_3-3 1.28E-07 4.03E-08 6.76E-09 1.09E-08 4.65E-08 46.5±24.4
AB100_3-8 4.27E-10 3.15E-10 3.05E-10 2.01E-10 3.12E-10 0.312±0.0399
AB100_3-10 3.97E-10 1.10E-10 4.06E-10 4.01E-10 3.28E-10 0.328±0.0632
AB100_3-11 3.24E-10 3.24E-10 1.31E-10 2.67E-10 2.62E-10 0.262±0.0395
AB100_3-13 8.89E-08 9.06E-11 1.15E-09 1.38E-09 2.29E-08 22.9±19.05
AB100_3-18 4.18E-09 2.24E-08 1.85E-08 1.99E-11 1.13E-08 13.8±4.70
AB100_3-19 3.93E-09 3.43E-09 1.41E-08 1.23E-08 8.43E-09 8.43±2.40
AB100_3-20 6.47E-07 6.73E-09 7.85E-09 8.19E-09 1.67E-07 167±138
AB100_4-3 1.03E-08 1.02E-08 1.03E-08 1.04E-08 1.03E-08 10.3±0.0376
AB100_4-4 5.20E-09 9.35E-09 4.41E-09 2.06E-09 5.25E-09 5.25±1.31
AB100_4-5 3.48E-09 5.03E-09 5.36E-09 4.60E-09 4.62E-09 4.62±0.356
AB100_4-20 1.12E-08 1.06E-08 1.05E-08 1.05E-08 1.07E-08 10.7±0.146
표 3에 나타난 바와 같이, 선별된 16종류의 DNA 앱타머는 모두 ApoB100에 특이적으로 결합하였다.
실시예 5. DNA 앱타머의 세포독성 확인
상기에서 선별된 DNA 앱타머 중 9개를 선별하여 LDH 분석방법으로 세포독성을 확인하였다.
먼저, 인간유래 단핵구 세포인 THP-1(KCLB 40202, 한국) 세포주를 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함된 RPMI 1640 배양배지를 사용하여 배양하였다. 배양된 세포를 96웰 플레이트에 웰당 4×104개가 되도록 분주하고, 37℃ 및 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양된 세포에 DNA 앱타머를 0.32, 1.6, 8, 40, 200, 1,000 또는 5,000 nM의 농도가 되도록 10 ㎕ 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포 배양액을 사용하여 CyQUANT™ LDH 세포독성 분석 키트(Invitrogen, 미국)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었다. 이때, 음성 대조군은 PBS 완충액을 사용하였다. 그 결과, 수득된 값으로부터 세포독성(%)을 계산하여 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, 9종류의 DNA 앱타머는 모두 세포독성을 나타내지 않았다. 다만, AB100_3-2 앱타머는 2.5~5 μM의 고농도에서만 약 6~9%의 세포독성을 보였다.
실시예 6. 콜레스테롤 저감
상기에서 선별된 9종의 DNA 앱타머의 콜레스테롤 저감 활성을 콜레스테롤 어세이 키트(cholesterol assay kit, Abcam, 영국)를 사용하여 다음과 같이 확인하였다.
먼저, 50 ㎕의 LDL(low-density lipoprotien, Sigma aldrich, 미국)과 동량의 ApoB100에 대한 앱타머를 혼합하고, 100 ㎕의 2× 침전 완충액을 첨가하고 실온에서 10분 동안 반응시켰다. 이때, 앱타머는 AB100_1-12, AB100_2-1, AB100_3-1, AB100_3-2, AB100_3-8, AB100_3-10, AB100_3-11, AB100_3-19 또는 AB100_3-20을 사용하였고, 1.14, 3.08 및 5.03 ㎍의 세 농도로 실험하였다. 이때, 대조군으로서 앱타머를 첨가하지 않은 샘플을 사용하였다. 반응이 끝난 후, 상기 혼합물을 5,000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 회수된 펠렛을 200 ㎕의 1× PBS에 현탁하였다. 상기 현탁액을 96웰 플레이트에 50 ㎕씩 분주하고, 45.6 ㎕의 콜레스테롤 어세이 완충액, 0.4 ㎕의 콜레스테롤 프로브, 2 ㎕의 효소 혼합물, 2 ㎕의 콜레스테롤 에스테라제(cholesterol esterase)를 첨가하였다. 이를 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, Ex/Em=535/587 ㎚ 조건에서 형광세기를 측정하여 샘플 내 LDL/vLDL 농도를 제조사의 프로토콜에 따라 확인하였다. 그 결과, 앱타머를 첨가하지 않은 샘플의 LDL/vLDL 농도를 기준으로 앱타머를 처리한 경우의 LDL/vLDL 농도를 상대적인 값으로 나타낸 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, ApB100에 대한 앱타머는 모두 콜레스테롤 저감 효과를 나타내었다. 특히, AB100_1-12, AB100_2-1, AB100_3-1 및 AB100_3-8 앱타머는 1.14 ㎍의 낮은 농도에서도 유의적으로 콜레스테롤을 저감시켰다.
실시예 7. 병용 처리에 의한 콜레스테롤 저감
상기에서 가장 유의적인 활성을 나타낸 AB100_1-12 앱타머를 콜레스테롤 저감용 치료제인 레시틴(lecithin)과 병용처리한 경우의 콜레스테롤 저감 효과를 확인하였다. 구체적으로, 실험은 실시예 6에 기재된 바와 동일한 방법으로 수행되었고, 1 ㎎의 레시틴에 다양한 농도(0.1, 0.5, 1, 5, 10 또는 50 μM)의 AB100_1-12 앱타머를 첨가하여 실험을 수행하였다. 그 결과, LDL/vLDL 농도를 확인한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 레시틴을 단독으로 처리한 경우, LDL 콜레스테롤의 농도가 약물 미처리군과 비교하여 약 63% 감소하였으며, 여기에 AB100_1-12 앱타머를 병용처리한 경우에는 73 내지 78%까지 콜레스테롤 농도가 감소하였다.
따라서, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 DNA 앱타머가 세포독성을 보이지 않으면서 ApoB100에 특이적으로 결합하여 콜레스테롤을 저감시킴으로써, 고콜레스테롤에 의해 발생할 수 있는 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (13)

  1. 서열번호 1 내지 16으로 각각 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 아포지단백(apolipoprotein B100, ApoB100)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머.
  2. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 ApoB100 검출용 조성물.
  3. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 ApoB100 검출용 키트.
  4. 제1항의 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 ApoB100 검출방법.
  5. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이상지질혈증은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 고중성지방혈증인, 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 혈관질환은 동맥경화, 죽상경화증, 죽상동맥경화증, 뇌경색, 협심증, 말초혈관 폐색성 질환, 심근경색, 당뇨성 망막증 또는 고혈압성 망막증인, 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 조성물.
  8. 제1항의 DNA 앱타머를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단용 키트.
  9. 제1항의 DNA 앱타머를 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환 진단의 정보를 제공하기 위한 방법.
  10. 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 이상지질혈증은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 또는 고중성지방혈증인, 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제10항에 있어서, 상기 혈관질환은 동맥경화, 죽상경화증, 죽상동맥경화증, 뇌경색, 협심증, 말초혈관 폐색성 질환, 심근경색, 당뇨성 망막증 또는 고혈압성 망막증인, 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제1항의 DNA 앱타머를 유효성분으로 포함하는 이상지질혈증 또는 혈관질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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