KR102221850B1 - PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 상기 RNA 앱타머의 용도 - Google Patents

PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 상기 RNA 앱타머의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 상기 RNA 앱타머의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 RNA 앱타머는 PPARγ 단백질에 특이적으로 강하게 결합하여 지방 분화를 억제하고, 지방 분화와 관련된 유전자 및 단백질의 발현을 억제하며, 고지방식이를 섭취한 동물모델에서도 동일한 효과를 나타냄으로써, PPARγ 단백질 검출용 및 비만 진단 용도뿐만 아니라 비만의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 상기 RNA 앱타머의 용도{RNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO PPARγ PROTEIN AND USING THE SAME}
본 발명은 PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머 및 상기 RNA 앱타머의 용도에 관한 것이다.
비만은 체내에 지방조직이 과다하게 축적된 상태로서, 체중을 신장의 제곱으로 나눈 값인 신체비만지수(BMI)가 25 이상일 경우 비만으로 정의하는데, 이는 혈장으로부터 지방세포로 유입된 지방산과 포도당이 에스테르화하여 주로 중성지방의 형태로 체내에 축적된다. 일반적으로 비만은 오랜 기간에 걸쳐 에너지 소비량에 비해 영양소를 과다 섭취하는 경우에 오는 에너지 불균형에서 유발된다. 또한, 비만은 고혈압, 당뇨, 이상고지혈증, 동맥경화 등과 같은 대사성 질환을 유발하는 가장 큰 원인 중 하나이다.
국가 통계포털에 따르면 2016년을 기준으로 만 19세 이상의 비만 유병률은 34.8%였고, 이중 남성은 42.3%, 여성은 26.4%로 확인되었다. 2007년부터 전체적으로 비만 유병률이 증가하는 추세에 있으며 특히 여성에 비해 남성의 비만 유병률이 급증하였다. 이와 같이, 비만 인구뿐만 아니라, 비만으로 인한 합병증 환자 발생률 또한 증가하고 있어, 전 세계적으로 비만 인구 및 관련 질환자의 수가 급증하고 있다.
비만을 더 이상 단순한 과체중이 아닌 하나의 치료가 필요한 질환으로 인식하기 시작하면서 2013년에 WHO는 비만을 새로운 전염병으로 명시하였다. 이에, 선진국에서는 일찍이 비만 예방제 또는 치료제를 개발하기 위한 연구 및 투자가 활발히 이루어지고 있다. 이러한 노력으로 현재 전 세계에는 비만을 억제하기 위한 수백개의 비만 억제제가 개발 및 시판되었으며, 국내에서도 60여종의 비만 억제제가 판매되고 있다. 이와 같은, 비만 억제제는 포만감 항진제, 지방흡수억제제 또는 항정신성 식욕억제제 등을 포함하는데, 이들 약물 중에서 항정신성 식욕억제제는 마약류로 분류되고 있으며 심각한 부작용을 유발할 수 있어 사용에 주의가 필요하다. 이외에도 다른 약물들 또한 심각한 부작용을 유발하여 판매가 금지되거나 장기간 복용할 수 없다는 문제가 있다.
한편, PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 단백질은 지방세포 분화의 중추적인 역할을 하는 단백질로서, 혈관평활근세포, 내피세포, 외막섬유아세포, 대식세포, 지방세포 등에서 주로 발현된다. PPARγ 단백질은 레니토인산 수용체인 RXR(retinoid X receptor)과 결합한 형태로 리간드에 의하여 체내 지방대사물의 합성에 관여하는 표적 유전자의 발현을 증가시킨다. 뿐만 아니라, PPARγ 단백질은 지질대사, 지방산 및 혈당을 조절하는 조절인자로서도 알려져 있다. 일반적으로, 식사 후 분비되는 인슐린에 의해 PPARγ 단백질의 발현량이 증가되면서 지방산의 합성도 증가하는 것으로 알려져 있어, PPARγ 단백질의 발현을 억제하는 물질이 대사질환 치료제로서 각광받았으나, 상기 물질에 의한 다양한 부작용이 알려지면서 부작용이 적은 새로운 약물에 대한 필요성이 대두되고 있다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-1677168호는 펠로프테린(phellopterin)이 PPARγ 단백질의 리간드로 작용하여 PPARγ 단백질의 발현을 유도하는 효능이 탁월함으로써, 상기 펠로프테린이 인슐린 저항증 또는 당뇨병의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-1677168호
본 발명의 목적은 PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하고 특정 염기서열로 구성되는 RNA 앱타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 RNA 앱타머를 포함하는 PPARγ 단백질 검출용 조성물 및 키트, 및 상기 조성물을 이용하여 PPARγ 단백질을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 RNA 앱타머를 포함하는 비만 진단용 조성물 및 키트, 및 상기 조성물을 이용하여 비만의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함하는 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 PPARγ 단백질 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 PPARγ 단백질 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 PPARγ 단백질 검출방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 비만 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 비만 진단용 키트를 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 비만의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 RNA 앱타머는 PPARγ 단백질에 특이적으로 강하게 결합하여 지방 분화를 억제하고, 지방 분화와 관련된 유전자 및 단백질의 발현을 억제하며, 고지방식이를 섭취한 동물모델에서도 동일한 효과를 나타냄으로써, PPARγ 단백질 검출용 및 비만 진단 용도뿐만 아니라 비만의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 RNA 앱타머와 PPARγ 단백질의 결합력을 나노드롭(A) 또는 실시간 PCR(B) 방법으로 확인한 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 수득된 PPAR-11 RNA 앱타머와 PPARγ 단백질의 결합 구조를 예측하여 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에서 수득된 PPAR-15 RNA 앱타머와 PPARγ 단백질의 결합 구조를 예측하여 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에서 PPAR-11 및 PPAR-15 RNA 앱타머의 서열최적화 결과를 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에서 RNA 앱타머의 안정성을 향상시키기 위해 3WJ를 도입한 원리(A), 3WJ를 도입한 RNA 앱타머의 구조(B) 및 3WJ 도입여부 확인 결과(C)를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에서 RNA 앱타머에 TAT 펩티드를 결합시킨 결과를 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에서 T3PP-11 및 T3PP-15 RNA 펩티드의 세포투과능을 확인한 결과 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에서 T3PP-11(A) 및 T3PP-15(B) RNA 펩티드의 세포생존율 및 세포독성을 확인한 결과 도면이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 RNA 앱타머에 의한 지방세포 분화 억제를 확인한 결과 도면이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 RNA 앱타머에 의한 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 RNA 앱타머에 의한 지방세포 분화와 관련된 단백질의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에서, T3PP-15 RNA 앱타머에 의한 체중증가 억제(A), 복부 지방 축적 억제(B), 체중증가량 및 사료섭취 효율 감소(C), 간, 및 부고환 지방조직 및 신장 지방조직의 무게 감소(D 및 E)를 동물모델에서 확인한 결과 도면이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에서, T3PP-15 RNA 앱타머에 의한 지질대사 지표인자(A), 및 간 또는 신장 손상 지표 인자(B)의 변화를 동물모델에서 확인한 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에서, T3PP-15 RNA 앱타머에 의한 간, 및 신장 및 부고환 지방조직 내 중성지방의 변화를 동물모델에서 확인한 결과 도면이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에서, T3PP-15 RNA 앱타머에 의한 간 조직에서의 지방 세포 분화와 관련된 유전자 및 단백질의 발현 억제 효과를 동물모델에서 확인한 결과이다.
도 16은 T3PP-15 RNA 앱타머에 의한 신장 및 부고환 지방조직에서의 지방 세포 분화와 관련된 유전자 및 단백질의 발현 억제 효과를 동물모델에서 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함하는 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 단백질"은 PPARG 유전자에 의해 암호화된 인간의 제2형 핵 수용체 중의 하나로서, 주로 지방조직에서 발현되는 단백질을 의미한다. PPARγ 단백질은 지방산 저장 및 포도당 대사를 조절하고, RXR(retinoid X receptor)와 이량체를 형성함으로써, 다양한 유전자의 전사를 조절할 수 있다. 상기 PPARγ 단백질은 통상의 기술분야에 PPARγ 단백질이라고 알려진 모든 폴리펩티드 서열을 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 PPARγ 단백질은 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "앱타머(aptamer)"는 특정 물질에 고친화성 및 특이성으로 결합할 수 있는 핵산분자를 의미한다. 상기 앱타머는 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있고, 상기 방법은 필요에 따라 적절히 변형될 수 있다.
본 발명에 따른 RNA 앱타머는 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함할 수 있다. 이때, 상기 RNA 앱타머는 코어서열의 5' 및 3' 말단 중 한쪽, 또는 양쪽에 추가로 염기서열을 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 DNA 앱타머는 코어서열의 5' 및 3' 말단에 각각 10 내지 70개, 14 내지 70개, 18 내지 70개, 10 내지 62개, 14 내지 62개, 18 내지 62개, 10 내지 55개, 14 내지 55개, 18 내지 55개의 염기서열을 더 포함할 수 있다.
일례로, 상기 RNA 앱타머 중, 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 이의 3' 말단에 30 내지 70개, 38 내지 70개, 45 내지 70개, 30 내지 63개, 38 내지 63개, 45 내지 63개, 30 내지 55개, 38 내지 55개, 45 내지 55개의 염기서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 서열번호 2로 기재된 염기서열의 3' 말단에 염기서열이 더 포함된 RNA 앱타머는 서열번호 1로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
한편, 상기 RNA 앱타머 중, 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 이의 5' 및 3' 말단에 각각 10 내지 40개, 13 내지 40개, 17 내지 40개, 10 내지 32개, 13 내지 32개, 17 내지 32개, 10 내지 24개, 13 내지 24개, 17 내지 24개의 염기서열을 더 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 서열번호 4로 기재된 염기서열의 5' 및 3' 말단 각각에 염기서열이 더 포함된 RNA 앱타머는 서열번호 3으로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시에에서, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 1 내지 4로 기재된 염기서열로 구성된 군으로부터 선택된 염기서열로 구성되는 RNA 앱타머일 수 있다. 본 발명에 따른 DNA 앱타머 및 폴리뉴클레오티드는 이와 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상 상동성을 갖는 염기서열도 모두 포함할 수 있다.
상기 RNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성 및 안정성을 높이기 위해, 각 뉴클레오티드의 당 잔기, 구체적으로 리보오스 또는 디옥시리보스가 수식될 수 있다. 상기 수식은 당 잔기의 2'위치, 3'위치 및 4'위치로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 산소 원자를 다른 원자로 치환한 것일 수 있다. 수식의 예로는 플루오로화, O-알킬화, O-알릴화, S-알킬화, S-알릴화, 아미노화 등이 포함될 수 있다. 상기와 같은 당 잔기의 변형은 통상적인 방법으로 수행될 수 있다.
또한, 상기 RNA 앱타머는 표적 물질에 대한 결합성을 높이기 위해, 핵산염기가 변형될 수 있다. 상기 핵산염기의 변형은 5위치의 피리미딘 변형, 6위치의 푸린 변형, 8위치의 푸린 변형, 환외(環外) 아민에서의 변형, 4-티오우리딘으로의 치환, 5-브로모로의 치환 또는 5-요오드-우리실로의 치환 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 RNA 앱타머는 뉴클레아제 및 가수분해효소 등에 대해 내성을 갖도록 인산기가 변형될 수 있다. 예를 들면, 상기 인산기는 티오에이트, 디티오에이트, 아미데이트, 포름아세탈, 3'-아민 등으로 치환될 수 있다. 나아가, 상기 RNA 앱타머는 3' 말단 또는 5' 말단의 변형을 포함할 수 있고, 상기 변형은 캡핑이나, 바이오티닐, 폴리에틸글리콜, 아미노산, 펩티드, 핵산, 뉴클레오시드, 미리스토일(myristoyl), 리소콜릭-올레일(lithocolic-oleyl), 도코사닐(docosanyl), 라우로일(lauroyl), 스테아로일(stearoyl), 팔미토일(palmitoyl), 올레오일(oleoyl), 리놀레오일(linoleoyl), 지질, 스테로이드, 콜레스테롤, 카페인, 비타민, 색소, 형광물질, 항암제, 독소, 효소, 방사성 물질, 비오틴 등이 부가된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 PPARγ 단백질 검출용 조성물 및 키트를 제공한다.
상기 PPARγ 단백질 검출용 조성물 또는 키트에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함할 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 PPARγ 단백질 검출용 조성물에 포함되는 RNA 앱타머는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 RNA 앱타머는 상기 RNA 앱타머에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 검출용 조성물을 포함하는 키트는 이에 포함되는 RNA 앱타머의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 PPARγ 단백질 검출방법을 제공한다.
상기 PPARγ 단백질 검출방법에 사용되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함할 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 시료는 PPARγ 단백질을 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함할 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 본 발명에 따른 RNA 앱타머를 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예로서, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합한 것일 수 있다. 이때, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화할 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구제제 또는 비경구제제로 제형화 될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 트로키제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 첨가될 수 있다. 한편, 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 여기에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등의 주사제가 포함될 수 있다.
비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여될수 있으며, 비경구 투여는 피부 외용 또는 복강내 주사, 직장내 주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식중 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여된다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.001 ~ 10,000 mg/㎏, 구체적으로는 0.1 g ~ 5 g/kg 일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회일 수 있고, 수회로 나뉠 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 건강기능식품에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함할 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
본 발명의 RNA 앱타머는 식품에 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있고, 일반적으로는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 RNA 앱타머를 포함하는 비만 진단용 조성물 및 키트를 제공한다.
상기 비만 진단용 조성물 및 키트에 포함되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함할 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
또한, 상기 비만 진단용 조성물 및 키트는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 비만의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 비만의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 사용되는 RNA 앱타머는 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 RNA 앱타머는 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함할 수 있다. 또한, 상기 RNA 앱타머는 안정성을 고려하여 이에 대한 cDNA 형태로 포함될 수 있다.
상기 시료는 비만을 진단하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 시료는 포유동물 유래 시료일 수 있고, 구체적으로 인간 유래 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 혈액, 타액, 누액, 요액, 활액, 점액, 세포 및 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 시료는 본 발명에 따른 방법에 사용되기 전에 상술한 바와 같은 방법으로 전처리될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. RNA 앱타머의 제작
PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 제작하기 위해, 먼저 하기 기재된 바와 같이 RNA 라이브러리를 제작하였다.
1-1. 랜덤 RNA의 증폭
먼저, dA:dG:dC:dT가 1.5:1.15:1.25:1의 비율로 포함된 40개의 랜덤 염기서열을 포함하는 100 bp 크기의 주형 DNA와 이에 대한 정방향 프라이머(서열번호 6: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATT-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 7: 5'-AGATTGCACTTACTATCT-3')를 바이오니아 사(한국)에 주문제작하였다. 1 ㎕의 주형 DNA, 5 ㎕의 10x PCR 완충용액, 4 ㎕의 dNTP 혼합물, 2 ㎕의 25 μM 정방향 프라이머, 2 ㎕의 25 μM 역방향 프라이머, 0.25 ㎕의 ExTaq 중합효소(Takara, 일본)(1 unit/㎕), 및 35.75 ㎕의 증류수를 혼합하여 PCR 반응물을 준비하였다. 준비된 반응물을 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조건으로 PCR을 수행하였다.
초기 변성 단계 95℃, 5분 1회
변성 단계 95℃, 30초 4회
어닐링(annealing) 단계 55℃, 30초
연신(elongation) 단계 72℃, 30초
후기 연신 단계 72℃, 5분 1회
수득된 PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인하고, 상기 PCR 산물을 PCR 정제키트(Qiagen, 미국)를 사용하여 수득한 뒤, 이를 아가로스 겔 전기영동으로 확인한 결과 100 bp 크기의 PCR 산물이 증폭 및 정제된 것을 확인하였다.
1-2. RNA 라이브러리의 제작
실시예 1-1에서 수득된 PCR 산물을 주형으로, MEGAshortscript™ T7 키트(Ambion, 미국)를 이용하여 시험관 내 전사(in vitro transcription)를 수행하였다. 구체적으로, 8 ㎕의 랜덤 RNA, 2 ㎕의 10x 완충용액, 2 ㎕의 75 mM ATP, 2 ㎕의 75 mM UTP, 2 ㎕의 75 mM GTP, 2 ㎕의 75 mM CTP, 2 ㎕의 T7 효소 혼합물(enzyme mix)을 혼합하여 반응물을 제조하고, 이를 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 시험관 내 전사를 수행하였다. 이후, 여기에 1 ㎕의 TURBO DNase를 첨가하여 37℃에서 15분 동안 반응시킴으로써, 주형으로 사용된 PCR 산물을 제거하였다. PCR 산물이 제거된 반응물에 115 ㎕의 뉴클레아제(nuclease)가 포함되지 않은 증류수 및 15 ㎕의 암모늄 아세테이트를 첨가하여 최종 부피를 200 ㎕로 조절하였다. 여기에 동일 부피의 PCI(페놀:클로로폼:이소아밀알콜=25:24:1) 용액을 첨가하고, 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 15분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 상층액을 취하여, 상층액의 1/100 부피에 해당하는 tRNA(sigma aldrich, 미국) 및 상층액의 3배 부피에 해당하는 100% 에탄올을 첨가하였다. 이를 -70℃에서 1시간 동안 반응시키고, 다시 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 펠렛을 65℃에서 건조시키고, 건조된 펠렛에 50 ㎕의 0.1% 디에틸피로카르본산이 포함된 증류수를 첨가하여 RNA를 수득하였다. 수득된 RNA는 2% 아크릴아마이드 겔에 전기영동하여 확인하였다.
1-3. 3차원 구조의 RNA 앱타머 제작
실시예 1-2에서 수득된 RNA를 142 ㎍/100 ㎕(514.7 pmol)의 농도로 0.1% 디에틸피로카르본산이 포함된 1×PBS에 희석하고, 이를 85℃에서 5분 동안 끓여 변성시킨 후, 상온에서 1시간 이상 방치하여 서서히 식힘으로써, 3차원 구조의 RNA 앱타머를 제작하였다.
실시예 2. PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 선별
2-1. PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 선별
PPARγ 단백질과 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머를 SELEX 기법을 이용하여 선별하였다.
구체적으로, 실시예 1-3에서 제작된 RNA 앱타머에 7 ㎍/10 ㎕(102.94 pmol)의 PPARγ 단백질을 첨가하고, 0.1% 디에틸피로카르본산이 포함된 1×PBS를 첨가하여 전체 부피를 200 ㎕로 조절하였다. 이를 4℃에서 12시간 이상 반응시켜 준비하였다. 한편, 니켈-나이트릴로트라이아세트산 아가로즈 비드(Ni-NTA agarose bead, Qiagen, 미국)는 500 ㎕의 1× 결합 완충액을 2회 첨가하여 활성화시켰다. 활성화된 Ni-NTA 아가로즈 비드에 상기 준비된 혼합물을 첨가하고 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후, 반응물을 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 5분 동안 원심분리하여 상층액을 제거하고, 남은 비드는 500 ㎕의 1× 세척 완충액을 첨가하여 4℃, 13,000 rpm의 조건하에서 5분 동안 원심분리함으로써 세척하였다. 세척 후, 200 ㎕의 0.1% 디에틸피로카르본산이 포함된 1×PBS를 첨가하여 이를 85℃에서 5분 동안 끓이고, 4℃에서 13,000 rpm의 조건 하에서 10분 동안 원심분리하여 변성된 RNA 앱타머를 수득하였고, 이는 2회 수행되었다. 이후, 얻어진 펠렛에 PCI 용액 및 에탄올 침전법을 수행하여 최종적으로 50 ㎕의 0.1% 디에틸피로카르본산이 포함된 증류수에 현탁된 RNA 앱타머를 회수하였다.
2-2. RNA 앱타머의 역전사 반응 수행
실시예 2-1에서 수득된 RNA 앱타머를 다음 라운드의 SELEX에 사용하기 위해 cDNA로 제작하였다.
구체적으로, 9 ㎕의 RNA 앱타머 및 1 ㎕의 역방향 프라이머(서열번호 7)를 혼합하고, 70℃에서 5분 동안 가열한 뒤 얼음에 냉각시켰다. 냉각된 반응물에 2 ㎕의 10x 역전사 완충용액, 2 ㎕의 dNTP 혼합물, 0.5 ㎕의 RNase 억제제, 1 ㎕의 역전사 효소 및 4.5 ㎕의 증류수를 첨가하고 혼합하였다. 상기 혼합액을 42℃에서 1시간 동안 반응시킨 뒤, 95℃에서 5분 동안 끓여 역전사 효소를 비활성화시킴으로써, 선별된 RNA 앱타머의 cDNA를 수득하였다.
2-3. 비특이적으로 결합하는 RNA 앱타머의 제거
PPARγ 단백질이 아닌 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하는 비특이적 RNA 앱타머를 제거하는 동시에 PPARγ 단백질에 결합하는 RNA 앱타머의 특이성을 향상시키기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
먼저, 실시예 2-2에서 수득된 cDNA를 이용하여, 상술한 바와 같이 RNA 앱타머를 제조하고, 실시예 2-1의 과정을 6회 반복하여 특이성이 향상된 RNA 앱타머를 선별하였다. 선별된 RNA 앱타머를 이용하여 PPARγ 단백질이 결합되지 않은 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하는 RNA 앱타머를 선별하는 네가티브 SELEX(negative SELEX)을 수행하였다. 실험은 PPARγ 단백질 및 Ni-NTA 아가로즈 레진을 함께 첨가하는 것 대신 활성화된 Ni-NTA 아가로즈 레진만을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 이때, RNA 앱타머는 Ni-NTA 아가로즈 레진에 결합하지 않는 앱타머만을 수득하였다. 수득된 앱타머를 이용하여, 실시예 2-1의 과정을 5회 더 반복하여 총 11회의 SELEX를 수행함으로써 최종적으로 PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머를 수득하였다.
실시예 3. 친화성이 높은 RNA 앱타머 풀의 선별
3-1. 나노드랍 방법을 이용한 친화성 확인
11회의 SELEX를 통해 각 라운드에서 수득된 RNA 앱타머의 PPARγ 단백질에 대한 친화성을 나노드랍 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 실시예 2에서 각 회별로 수득된 RNA 앱타머 샘플의 농도를 나노드롭(Nanodrop 2000 Micro spectrophotometer, Thermo scientific)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 1A에 나타난 바와 같이, 10회에 수득된 RNA 앱타머의 농도가 1110.0 ng/㎕로 가장 높았다.
3-2. 실시간 PCR 방법을 이용한 친화성 확인
나노드랍 결과, PPARγ 단백질과 친화력이 높은 것으로 확인된 SELEX를 7 내지 11회 수행하여 수득된 RNA 앱타머 풀을 이용하여 실시간 PCR을 통해 친화성을 재확인하였다. 실험은 SELEX를 7 내지 11회 수행한 샘플을 iQ SYBR Green Supermix(Bio-rad, 미국)를 이용하여 통상적인 방법으로 수행되었다. 이때, PCR 조건은 하기 표 2에, 그 결과 수득된 C(t) 값을 도 1B에 나타내었다.
초기 변성 단계 94℃, 5분 1회
변성 단계 94℃, 20초 40회
어닐링 단계 52℃, 20초
연신 단계 72℃, 20초
후기 연신 단계 72℃, 5분 1회
도 1B에 나타낸 바와 같이, SELEX를 10회 수행하고 수득한 앱타머 풀이 6.20의 가장 낮은 C(t) 값을 나타내었다.
따라서, 상기로부터 SELEX를 10회 수행한 뒤 수득된 RNA 앱타머 풀(pool)이 PPARγ 단백질과 가장 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
실시예 4. DNA 앱타머의 서열 확인
상기에서 PPARγ 단백질과 가장 친화성을 높은것으로 확인된 10회의 SELEX 수득을 통해 얻은 DNA 앱타머의 서열을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 상기 실시예 3에서 SELEX를 10회 수행하여 수득된 DNA 앱타머를 주형으로 PCR을 수행하여 이중가닥 형태의 DNA를 수득하였다. 수득된 dsDNA는 T-블런트 클로닝 키트(SolGent, 한국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 T-벡터에 클로닝되었다.
구체적으로, 1 ㎕의 T-벡터(10 ng/㎕), 4 ㎕의 PCR 산물(20 ng/㎕) 및 1 ㎕의 6x T-블런트 완충액을 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 상기 반응물을 100 ㎕의 DH5α 수용성 균주와 혼합하고, 42℃에서 30초 동안 열충격을 가해 형질전환시켰다. 이를 5분 동안 얼음에 방치하고, 900 ㎕의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모 추출물, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4 및 20 mM 글루코스)를 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 200 ㎕의 배양액을 50 ㎍/㎖의 암피실린(Sigma Aldrich, 미국), 50 ㎍/㎖의 카나마이신(Sigma Aldrich, 미국), 50 ㎍/㎖의 X-갈(X-gal, Sigma Aldrich, 미국) 및 5 ㎍/㎖의 IPTG(Thermo Scientific, 미국)가 포함된 LB 배양 플레이트에 스프레딩하였다. 이를 37℃에서 15시간 배양한 뒤, 생성된 콜로니 중 흰색 콜로니만 선별하여 통상적인 방법으로 DNA를 추출하고, 그 염기서열을 Solgent(한국) 사에 의뢰하여 확인한 결과를 표 3에 나타내었다.
앱타머 서열(5'→3') 서열번호
PPAR-11 GGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGAUAUCUCGCGCCUGUCUUACCUAUCGGGUGAAAUUCCAUAGAUAGUAAGUGCAAUCU 서열번호 1
PPAR-15 GGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGCCGCCAAGAUAAGGCACGUCUUGUGUGUGUGUUCCUUUGAGAUAGUAAGUGCAAUCU 서열번호 3
표 3에 나타낸 바와 같이, 2개의 RNA 앱타머를 확인하였다.
실시예 5. PPARγ 단백질과 RNA 앱타머의 결합 구조예측
먼저, 실시예 4에서 선별된 2개의 RNA 앱타머의 2차원 구조를 DNA mfold 프로그램(Rensselear polytechnic institute)을 이용하여 예측하였다. 예측된 2차원 구조를 바탕으로 RNAcomposer 웹사이트(http://rnacomposer.cs.put.poznan.pl/)를 사용하여 3차원 구조를 예측하였다. 한편, PPARγ 단백질 구조는 RCSB PDB 웹사이트(https://www.rcsb.org/)에서 제공된 PDB 코드 2acl을 이용하여 모델을 확보하였다. 상기 확보된 RNA 앱타머 및 PPARγ 단백질 구조를 이용하여 결합된 구조를 MOE 2016.08 소프트웨어를 이용해 예측하고, Pymol structure 프로그램을 이용하여 이를 도식화하였다. 구조 예측 전에, RNA 앱타머 및 PPARγ 단백질 구조는 모든 에너지를 최소화하여 준비하였고, RNA 앱타머 및 PPARγ 단백질의 상호작용(interaction)은 트라이앵글 매쳐 방법(triangle matcher method)을 이용하여 확인하였다. 모든 구조는 10회 반복하여 수득하였고, 이 중 가장 많이 예측된 결과를 도식화하여 하기 도 2 및 3에 나타내었다.
도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 선별된 2개 RNA 앱타머는 모두 PPARγ 단백질이 RXR 단백질과 결합하는 위치에 결합하는 것을 확인하였다.
PPARγ 단백질은 크게 2개의 도메인을 갖고 있는데, 그중에서 DNA 결합 도메인(DNA binding domain, DBD)에 RXR 단백질이 결합함으로써, PPARγ 및 RXR 단백질의 이량체가 지방 분화를 촉진하는데 관여한다고 알려져 있다. 따라서, 상기 2개의 RNA 앱타머는 지방의 분화를 억제하는 효과가 있을 것으로 예상되었다.
실시예 6. RNA 앱타머의 서열 최적화
실시예 5에서 예측된 구조를 기초로, PPARγ 단백질에 결합하는 PPAR-11 및 PPAR-15 RNA 앱타머의 서열을 최적화하였다.
구체적으로, Pymol 구조분석 프로그램을 이용하여, PPARγ 단백질과 결합하고 있는 PPAR-11 또는 PPAR-15 RNA 앱타머의 염기서열을 확인하고, 결합하고 있지 않은 PPAR-11 또는 PPAR-15 RNA 앱타머의 염기서열을 삭제하였다. 그 결과, 서열이 최적화된 PPAR-11t 및 PPAR-15t RNA 앱타머의 서열을 하기 표 4에, 그 구조를 도 4에 나타내었다.
앱타머 서열(5'→3') 서열번호
PPAR-11t GGGAGAUACCAGCUUAUUCAAUUGAUAUCUCGC 서열번호 2
PPAR-15t AAUUGCCGCCAAGAUAAGGCACGUCUUGUGUGUGUGUUCCUUU 서열번호 4
실험예 1. PPARγ 단백질 및 RNA 앱타머 친화력의 정량적 확인
1-1. PPARγ 단백질 코팅 센서 칩의 제작
표면 플라즈마 공명(surface plasmon resonance, SPR) 실험을 통해, 실시예 5에서 PPARγ 단백질에 결합하는 것으로 확인된 2개의 RNA 앱타머와, 상기 RNA 앱타머의 서열을 최적화하여 수득한 2개의 RNA 앱타머의 PPARγ 단백질에 대한 결합력을 정량적으로 확인하였다.
먼저, 카르복실기로 표면이 코팅된 센서 칩 CM5(GE healthcare, 영국)에 0.1 M NHS(Nhydroxysuccinimide) 및 0.4 M EDC(N-ethyl-N'(dimethylaminopropyl) carbodiimide)가 혼합된 혼합액을 10 ㎕/min의 속도로 7분 동안 흘려주어 표면의 카르복실기를 활성화시켰다. 카르복실기가 활성화된 센서 칩 CM5의 표면에, 100 ㎍/㎖ 농도의 PPARγ 단백질을 포함하는 10 mM 아세트산 나트륨(pH 4.5) 용액을 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 처리하였다. PPARγ 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5에 1 M 에탄올아민 하이드로클로라이드(pH 8.5)를 10 ㎕/min의 속도로 10분 동안 흘려주어 표면의 활성화된 카르복실기를 불활성화시켰다. 그 결과, 표면에 PPARγ 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5를 제작하였다.
1-2. RNA 앱타머의 친화력 확인
상기 선별된 RNA 앱타머의 PPARγ 단백질에 대한 친화력을 SPR 방법을 이용하여 정량적으로 확인하였다.
먼저, 4개의 RNA 앱타머를 HBS-EP 완충액(GE Healthcare, BR-1001-88)에 0, 100, 200, 500, 1,000 또는 2,000 nM의 농도가 되도록 희석하여 준비하였다. 실험은 BIAcore 3000(BIACORE)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행되었으며, 실험예 1-1에서 제작된 PPARγ 단백질이 코팅된 센서 칩 CM5에 대한 RNA 앱타머의 결합력과 아무것도 코팅되지 않은 센서 칩 CM5에 대한 RNA 앱타머의 결합력 차이를 확인하였다. 이때, 속도 변수는 BIA 평가프로그램(BIACORE)을 이용하여 수득 및 정량하였고, 각 실험 후, 센서 칩은 1 M NaCl 및 50 mM NaOH 완충액을 이용하여 재생시켰다. 그 결과, RNA 앱타머의 PPARγ 단백질에 대한 친화력을 하기 표 5에 해리 상수(KD) 값으로 나타내었다.
앱타머 KD(M)
PPAR-11 5.14×10-10
PPAR-11t 1.251×10-9
PPAR-15 4.12×10-11
PPAR-15t 7.76×10-9
표 5에 나타낸 바와 같이, 4개의 RNA 앱타머는 모두 PPARγ 단백질과 높은 결합력으로 결합하였다.
실험예 2. 세포투과 펩티드가 결합되고, 안정성이 향상된 RNA 앱타머의 제작
2-1. 세포 내 안정성이 향상된 RNA 앱타머의 제작
실시예 6에서 서열최적화된 PPAR-11t 및 PPAR-15t RNA 앱타머의 지방세포 분화 억제 효과를 확인하기 위해, 상기 RNA 앱타머가 세포 내 안정성이 향상되도록 3WJ(three-way junction) 구조를 도입하였다. 3WJ 구조는 도 5A에 나타난 바와 같은 원리로 도입하였으며, 모든 RNA는 IDT(Integrated DNA Technologise) 사에 의뢰하여 합성하였다.
그 결과, 도 5B에 나타난 바와 같은 구조를 갖는 PPAR-11t 및 PPAR-15t RNA 앱타머를 수득하였으며, 이를 도 5C에 나타난 바와 같이, 8% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 확인하였다.
2-2. 세포투과 펩티드가 결합된 RNA 앱타머의 제작
실험예 2-1에서 제작된 RNA 앱타머가 세포 내로 도입되도록 세포투과 펩티드를 결합하였다. 이때, 3WJ 구조 도입시 사용된 티올기(thiol)에 세포투과 펩티드인 TAT 펩티드를 이황화결합(disulfide bridge)으로 결합시켰다. 이때, 100 pmol의 3WJ 구조가 도입된 RNA 앱타머에 0, 0.5, 1, 1.2, 1.5, 3 또는 5의 비율로 TAT 펩티드를 첨가하여 RNA 앱타머 복합체를 수득하고, 2% 아가로즈 겔 전기영동을 통해 세포투과 펩티드가 결합된 RNA 앱타머를 확인하여 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 3WJ 구조가 도입된 RNA 앱타머 및 TAT 펩티드의 비율이 1:1.2인 경우에 세포투과 펩티드가 결합된 RNA 앱타머를 수득하였다. 또한, PPAR-11t 및 PPAR-15t RNA 앱타머에 3WJ 구조 및 세포투과 펩티드가 도입된 앱타머를 각각 T3PP-11 및 T3PP-15로 명명하였다.
2-3. RNA 앱타머의 세포투과능 확인
3T3-L1 세포주(KCLB, 한국)를 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, 미국), 1% 페니실린/스트렙토마이신(Gibco, 미국) 및 1% 안티바이오틱-안티마이코틱(antibiotic-antimycotic, AA, Gibco, 미국)이 포함된 DMEM 배양 배지를 이용하여 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 배양하였다. 배양된 세포의 융합성이 80% 정도 되었을 때, 배양배지를 제거하고, T3PP-11 또는 T3PP-15 RNA 앱타머가 첨가된 지방세포 분화배지(adipocyte differentiation basal media with adipogenesis supplement, Gibco, 미국)로 교체하였다. 이후, 24시간 동안 세포를 배양하고, 배지를 제거한 뒤, DPBS로 세포를 세척하였다. 세척된 세포는 4% 파라포름알데하이드를 첨가하여 고정시키고, DAPI 염색약을 이용하여 핵을 염색하였다. 상기 세포주를 슬라이드에 놓고, 마운팅 솔루션을 이용하여 마운팅을 한 뒤, 공초점 현미경(×400)으로 관찰한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 T3PP-11 및 T3PP-15 RNA 앱타머는 세포막을 투과하여 세포질에 존재하였다.
실험예 3. RNA 앱타머의 세포독성 확인
실험예 2-2에서 제작된 T3PP-11 및 T3PP-15 RNA 앱타머의 세포생존율 및 세포독성을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
먼저, 3T3-L1 세포주는 실험예 2-3에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 배양하였다. 배양된 세포를 96웰 블랙 플레이트에 웰당 6×103개가 되도록 분주하고, 융합성이 90%가 될때까지 배양하였다. 배양된 세포에 MT 세포 생존율 기질, NanoLuc 효소 및 CellTox 녹색 염료(Promega, 미국)을 1,000배로 희석하여 배지에 첨가한 뒤, T3PP-11 및 T3PP-15 RNA 앱타머를 0.01, 0.1, 1, 10 또는 100 ㎍/㎖의 농도로 첨가하였다. 이후, 상기 세포를 48시간 동안 배양하고, 485/520 ㎚의 파장에서 마이크로플레이트 리더(microplate reader)로 형광을 측정하였다. 측정 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 RNA 앱타머는 세포독성을 나타내지 않았다.
실험예 4. RNA 앱타머의 지방분화 억제 효과 확인-(1)
실험예 2-2에서 제작된 PPAR-11, PPAR-15, T3PP-11 및 T3PP-15 RNA 앱타머의 지방분화 억제 효과를 오일-레드 O 염색 방법으로 확인하였다.
먼저, 3T3-L1 세포주는 실험예 2-3에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 배양하였다. 배양된 세포를 24웰 플레이트에 분주하고, 세포의 융합성이 약 70~80% 정도 되었을 때, 지방세포 분화배지로 교체하였다. 이후, 3일마다 지방세포 분화배지를 교체하면서 7일 또는 14일까지 배양하였다. 이때, 지방세포 분화배지에 PPAR-11, PPAR-15, T3PP-11 또는 T3PP-15 RNA 앱타머를 첨가하여 처리하였다. 상기 7일 또는 14일 동안 배양된 세포에서 배양 배지를 제거하고 4% 포름알데하이드를 첨가하여 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 60% 이소프로판올로 세척 및 건조시키고, 오일 레드-O 용액으로 염색하였다. 염색 후, 염색된 세포를 증류수로 세척하고, 100% 이소프로판올을 첨가하여 지방에 염색된 오일 레드-O 용액을 모두 용출시켜 이를 490 ㎚의 파장에서 측정한 결과를 도 9에 나타내었다. 이때, 대조군으로서 지방세포로 분화를 유도하지 않은 세포를 사용하였다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 지방세포로 분화가 유도된 세포(Diff)는 세포내 지방이 많이 축적된 반면, 본 발명의 RNA 앱타머를 처리한 세포는 지방세포로의 분화가 억제되었다.
실험예 5. RNA 앱타머의 지방분화 억제 효과 확인-(2)
5-1. 지방세포 분화와 관련된 유전자의 발현 변화 확인
본 발명의 RNA 앱타머가 지방세포 분화와 관련된 유전자인 PPARγ, C/EBPα(CCAAT-enhancer-binding protein alpha), FABP4(fatty acid-binding protein 4), GLUT4(glucose transporter type 4), ADIPOQ(adiponectin), LPL(lipoprotein lipase) 및 LEP(leptin precursor) 유전자들의 발현 변화를 억제하는지를 RT-PCR 방법으로 확인하였다.
먼저, 실험예 4에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 본 발명의 RNA 앱타머를 처리하며 지방세포로 분화된 3T3-L1 세포를 준비하였다. 지방세포로 분화가 유도된 3T3-L1 세포를 1×PBS 완충용액으로 2회 세척하고, 세포만을 모아서 통상적인 방법으로 RNA를 추출하였다. 1 ㎍의 추출된 RNA를 사용하여 cDNA를 합성하고, 각각의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 통상적인 방법으로 RT-PCR을 수행하였다. 이때, GAPDH 유전자를 대조군으로서 사용하였다.
그 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, PPAR-11, PPAR-15, T3PP-11 및 T3PP-15 RNA 앱타머가 지방세포 분화와 관련된 유전자들의 발현을 억제하였다.
5-2. 지방세포 분화와 관련된 단백질의 발현 변화 확인
상기 실험예 5-1에 기재된 지방세포 분화와 관련된 유전자의 단백질 수준에서의 발현 변화를 웨스턴 블롯으로 확인하였다.
구체적으로, 실험예 4에서 지방세포로 분화를 유도한 3T3-L1 세포를 DPBS 완충용액(Welgene, 한국)으로 세척하고, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF 및 1% 단백질 분해효소 억제제 칵테일이 포함된 RIPA 완충액을 이용하여 용해시켰다. 용해된 세포를 15,000 rpm의 조건으로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 수득하였다. 수득된 상층액에 포함된 단백질의 양을 BCS 분석 방법으로 정량하고, 30 ㎍이 되도록 시료를 준비하였다. 준비된 시료를 SDS-PAGE 겔을 이용하여 전기영동 한 뒤, 전기영동된 단백질을 막으로 이동시킨 후, 5% BSA를 포함하는 TBS-T 완충액을 이용하여 전처리하였다. 전저리된 막을 PPARγ, C/EBPα, FABP4, GLUT4, ADIPOQ, LPL 및 LEP 단백질 각각에 대한 1차 항체로 반응시킨 뒤, 2차 항체를 처리하고 ECL 용액을 이용하여 통상적인 방법으로 확인하였다. 웨스턴 블롯 결과를 하기 도 8B에, 웨스턴 블랏 결과를 정량하여 도 8C 내지 8F에 그래프로 나타내었다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, PPAR-11, PPAR-15, T3PP-11 및 T3PP-15 RNA 앱타머가 지방세포 분화와 관련된 단백질들의 발현을 억제하였다.
실험예 6. 동물모델에서 RNA 앱타머의 지방분화 억제 효과 확인
상기에서 지방분화 억제 효과가 가장 우수한 것으로 확인된 T3PP-15 RNA 앱타머가 생체 내(in vivo)에서도 동일한 효과를 나타내는지 확인하였다.
6-1. RNA 앱타머의 투여
체중 20 g 전후의 4주령 C57BL/6 수컷 마우스((주)샘타코바이오코리아, 한국)를 8마리씩 3개 그룹으로 나누어 1주 동안 적응시키고, 8주 동안 사육하였다. 이때, 마우스는 24±0.5℃의 온도, 45±5%의 습도 및 12시간의 명암 조건하에서 식이와 물을 자유공급하면서 4마리씩 한 케이지에서 사육하였다. 3개 그룹으로 나눈 마우스는 T3PP-15 RNA 앱타머 투여군, 정상식이 섭취군(음성대조군) 및 고지방식이 섭취군(양성대조군)으로 나누어 실험하였고, 이때, T3PP-15 RNA 앱타머는 멸균된 PBS에 희석하여 0.2 ㎖의 양으로 2일 1회 복강투여하였다. 모든 동물실험은 전북대학교 실험동물 윤리위원회로부터 승인을 받아 진행하였다.
6-2. 마우스의 체중 변화 확인
T3PP-15 RNA 앱타머 투여에 의한 마우스 체중변화를 장기 중량변화 및 식이 섭취 효율과 함께 확인하였다.
마우스의 체중은 실험예 6-1과 같이 T3PP-15 RNA 앱타머를 투여하는 8주동안 매주 측정하였고, 이때 마우스의 사료섭취량도 함께 측정하였다. 8주 후, 투여가 끝나고 마우스를 희생하여 부검을 진행하였으며, 부검 시, 혈액을 채취하고 병리학적 관찰을 수행하였다. 또한, 마우스의 간, 부고환 지방조직 및 신장 지방조직을 적출하여 중량을 확인하였다. 한편, 마우스의 체중 증가량과 사료섭취량을 측정하여 사료섭취 효율을 계산하였으며, 이는 실험기간 동안 증가한 체중 증가량을 사료첩취량으로 계산하였다.
그 결과, 도 12A에 나타낸 바와 같이, 고지방식이 섭취군에서 확인된 유의적인 체중증가가 T3PP-15 RNA 앱타머의 투여에 의해 감소하였다. 또한, 도 12B에 나타낸 바와 같이, 마우스를 부검한 결과에서도 고지방식이 섭취군에서 복부 내 많은 양의 지방이 관찰되었으나, T3PP-15 RNA 앱타머의 투여에 의해 지방축적이 억제되었다.
또한, 도 12C에 나타낸 바와 같이, 고지방식이 섭취군과 비교하여 T3PP-15 RNA 앱타머 투여군은 체중 증가량이 감소하였고, 사료섭취 효율 또한 감소하였다.
나아가, 도 12D 및 12E에 나타낸 바와 같이, 고지방식이 섭취군은 간, 부고환 지방조직 및 신장 지방조직의 무게가 유의적으로 증가하였으나, T3PP-15 RNA 앱타머 투여에 의해 이와 같은 증가가 억제되었다.
6-3. 생화학적 변화 확인
희생된 마우스로부터 수득한 혈액을 이용하여 총 콜레스테롤, 중성지방(triglyceride), HDL-C(high-density lipoprotein), LDL-C(low-density lipoprotein), ALT(alanine transaminase), AST(aspartate transaminase), BUN(blood urea nitrogen) 및 크레아틴(creatinine)을 생화학자동분석기로 측정하고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13A에 나타낸 바와 같이, 고지방식이 섭취군에서 지질대사 지표인자인 총 콜레스테롤, 중성지방, HDL-C 및 LDL-C 값이 증가하였다. 그러나 이와 같은 증가는 T3PP-15 RNA 앱타머의 투여에 의해 유의적으로 억제되었다. 또한, 도 13B에 나타낸 바와 같이, 고지방식이 섭취군과 달리 T3PP-15 RNA 앱타머 투여군에서는 AST, ALT, BUN 및 크레아틴의 수치가 정상식이 섭취군과 유사하였다.
따라서, 상기로부터 본 발명에 따른 T3PP-15 RNA 앱타머는 간이나 신장에 손상을 초래하지 않으면서도 지질대사를 억제함을 알 수 있었다.
6-4. 조직 내 중성지방 확인
부검 시 조직을 현미경으로 관찰하거나, 통상적인 방법으로 H&E 염색 또는 오일-레드 O 염색을 수행하여 관찰한 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 고지방식이 섭취군은 간세포의 팽윤과 세포질 내의 공포화를 동반하는 지방변성(fatty degeneration)이 관찰되었으나, 이와 같은 현상은 T3PP-15 RNA 앱타머의 투여에 의해 억제되었으며, 간조직 내 증가한 지질의 양 또한 감소하였다. 또한, 신장 및 부고환 지방조직의 경우, 고지방식이 섭취에 의해 증가한 지방세포의 크기가 T3PP-15 RNA 앱타머의 투여에 의해 억제되었다.
6-5. 지방세포 분화와 관련된 유전자 및 단백질의 발현 변화 확인
희생된 마우스로부터 수득된 간 조직, 또는 신장 및 부고환 지방조직을 이용하여 실험예 5에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 지방세포 분화와 관련된 유전자 및 단백질의 발현 변화를 확인하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이, 간 조직에서 T3PP-15 RNA 앱타머 투여군은 고지방식이 섭취군에 비해 지방세포 분화 조절 전사 인자인 PPARγ 및 C/EBPα 유전자 및 단백질의 발현이 억제되었고, 세포 내 지방 축적과 관련된 LPL 유전자 및 단백질의 발현도 감소하였다. 또한, T3PP-15 RNA 앱타머 투여군에서, 혈액 내 여분의 에너지를 간세포로 수송하는 GLUT4 유전자의 발현이 감소하여 지방세포의 성장이 억제되면서도, ADIPOQ 유전자 및 단백질은 크게 변하지 않아 인슐린 대사가 원활하게 일어나는 것을 알 수 있었다.
도 16에 나타난 바와 같이, 신장 지방조직에서, T3PP-15 RNA 앱타머 투여군은 PPARγ, C/EBPα, FABP4, LPL 및 GLUT4 유전자 및 단백질의 발현이 억제됨으로써, T3PP-15 RNA 앱타머에 의해 신장 주변조직에서 지방 축적이 억제됨을 알 수 있었다.
한편, LEP 단백질은 증가된 지방세포에 의해 그 발현이 증가되면 식욕을 억제하는데, 과도하게 발현된 LEP 단백질은 오히려 식욕을 억제하지 못한다. 그러나, T3PP-15 RNA 앱타머 투여군은 이와 같은 LEP 단백질의 발현을 억제함으로써, 식욕을 적절히 조절하는 것을 알 수 있었다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> RNA APTAMER SPECIFICALLY BINDING TO PPAR-gamma PROTEIN AND USING THE SAME <130> DP-2019-0283-KR <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-11 <400> 1 gggagauacc agcuuauuca auugauaucu cgcgccuguc uuaccuaucg ggugaaauuc 60 cauagauagu aagugcaauc u 81 <210> 2 <211> 33 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-11t <400> 2 gggagauacc agcuuauuca auugauaucu cgc 33 <210> 3 <211> 81 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-15 <400> 3 gggagauacc agcuuauuca auugccgcca agauaaggca cgucuugugu guguguuccu 60 uugagauagu aagugcaauc u 81 <210> 4 <211> 43 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPAR-15t <400> 4 aauugccgcc aagauaaggc acgucuugug uguguguucc uuu 43 <210> 5 <211> 505 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Gly Glu Thr Leu Gly Asp Ser Pro Ile Asp Pro Glu Ser Asp Ser 1 5 10 15 Phe Thr Asp Thr Leu Ser Ala Asn Ile Ser Gln Glu Met Thr Met Val 20 25 30 Asp Thr Glu Met Pro Phe Trp Pro Thr Asn Phe Gly Ile Ser Ser Val 35 40 45 Asp Leu Ser Val Met Glu Asp His Ser His Ser Phe Asp Ile Lys Pro 50 55 60 Phe Thr Thr Val Asp Phe Ser Ser Ile Ser Thr Pro His Tyr Glu Asp 65 70 75 80 Ile Pro Phe Thr Arg Thr Asp Pro Val Val Ala Asp Tyr Lys Tyr Asp 85 90 95 Leu Lys Leu Gln Glu Tyr Gln Ser Ala Ile Lys Val Glu Pro Ala Ser 100 105 110 Pro Pro Tyr Tyr Ser Glu Lys Thr Gln Leu Tyr Asn Lys Pro His Glu 115 120 125 Glu Pro Ser Asn Ser Leu Met Ala Ile Glu Cys Arg Val Cys Gly Asp 130 135 140 Lys Ala Ser Gly Phe His Tyr Gly Val His Ala Cys Glu Gly Cys Lys 145 150 155 160 Gly Phe Phe Arg Arg Thr Ile Arg Leu Lys Leu Ile Tyr Asp Arg Cys 165 170 175 Asp Leu Asn Cys Arg Ile His Lys Lys Ser Arg Asn Lys Cys Gln Tyr 180 185 190 Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Ser His Asn Ala Ile 195 200 205 Arg Phe Gly Arg Met Pro Gln Ala Glu Lys Glu Lys Leu Leu Ala Glu 210 215 220 Ile Ser Ser Asp Ile Asp Gln Leu Asn Pro Glu Ser Ala Asp Leu Arg 225 230 235 240 Ala Leu Ala Lys His Leu Tyr Asp Ser Tyr Ile Lys Ser Phe Pro Leu 245 250 255 Thr Lys Ala Lys Ala Arg Ala Ile Leu Thr Gly Lys Thr Thr Asp Lys 260 265 270 Ser Pro Phe Val Ile Tyr Asp Met Asn Ser Leu Met Met Gly Glu Asp 275 280 285 Lys Ile Lys Phe Lys His Ile Thr Pro Leu Gln Glu Gln Ser Lys Glu 290 295 300 Val Ala Ile Arg Ile Phe Gln Gly Cys Gln Phe Arg Ser Val Glu Ala 305 310 315 320 Val Gln Glu Ile Thr Glu Tyr Ala Lys Ser Ile Pro Gly Phe Val Asn 325 330 335 Leu Asp Leu Asn Asp Gln Val Thr Leu Leu Lys Tyr Gly Val His Glu 340 345 350 Ile Ile Tyr Thr Met Leu Ala Ser Leu Met Asn Lys Asp Gly Val Leu 355 360 365 Ile Ser Glu Gly Gln Gly Phe Met Thr Arg Glu Phe Leu Lys Ser Leu 370 375 380 Arg Lys Pro Phe Gly Asp Phe Met Glu Pro Lys Phe Glu Phe Ala Val 385 390 395 400 Lys Phe Asn Ala Leu Glu Leu Asp Asp Ser Asp Leu Ala Ile Phe Ile 405 410 415 Ala Val Ile Ile Leu Ser Gly Asp Arg Pro Gly Leu Leu Asn Val Lys 420 425 430 Pro Ile Glu Asp Ile Gln Asp Asn Leu Leu Gln Ala Leu Glu Leu Gln 435 440 445 Leu Lys Leu Asn His Pro Glu Ser Ser Gln Leu Phe Ala Lys Leu Leu 450 455 460 Gln Lys Met Thr Asp Leu Arg Gln Ile Val Thr Glu His Val Gln Leu 465 470 475 480 Leu Gln Val Ile Lys Lys Thr Glu Thr Asp Met Ser Leu His Pro Leu 485 490 495 Leu Gln Glu Ile Tyr Lys Asp Leu Tyr 500 505 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 6 ggtaatacga ctcactatag ggagatacca gcttattcaa tt 42 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 7 agattgcact tactatct 18

Claims (13)

  1. 서열번호 2 또는 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드를 코어서열로서 포함하는 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma) 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
  2. 제1항에 있어서, 상기 RNA 앱타머는 코어서열의 5' 및 3' 말단 중 한쪽, 또는 양쪽에 각각 10 내지 70개의 염기서열을 더 포함하는, PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 2로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 이의 3' 말단에 30 내지 70개의 염기서열을 더 포함하는, PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
  4. 제1항에 있어서, 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 폴리뉴클레오티드는 이의 5' 및 3' 말단에 각각 10 내지 40개의 염기서열을 더 포함하는, PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
  5. 제1항에 있어서, 상기 PPARγ 단백질은 서열번호 5로 기재된 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드인, PPARγ 단백질에 특이적으로 결합하는 RNA 앱타머.
  6. 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 PPARγ 단백질 검출용 조성물.
  7. 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 PPARγ 단백질 검출용 키트.
  8. 제6항의 검출용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 PPARγ 단백질 검출방법.
  9. 제1항의 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제1항의 RNA 앱타머를 유효성분으로 함유하는 비만의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  11. 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 비만 진단용 조성물.
  12. 제1항의 RNA 앱타머를 포함하는 비만 진단용 키트.
  13. 제11항의 진단용 조성물을 시료와 반응시키는 단계를 포함하는 비만의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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