CN116606377A - 靶向cd24和cd47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用 - Google Patents

靶向cd24和cd47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用。本发明的双特异性抗体融合蛋白包含CD24抗体重链、CD24抗体轻链及CD47‑Fc结合肽，其中CD24抗体重链的恒定区与CD47‑Fc结合肽的Fc段通过“锁钥结构”连接，该融合蛋白能够同时与CD47、CD24结合。本发明的双特异性抗体融合蛋白兼具anti‑CD24和CV1‑hFc的功能，能阻断CD47及CD24介导的肿瘤细胞的增殖。此外，该双特异性抗体融合蛋白PPAB001可以像传统的IgG分子一样，最大程度地保留了传统单克隆抗体结构，由于Fc片段的存在，可通过Protein A柱亲和层析法纯化，利于大规模的生产纯化。

Description

靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与 应用
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫学领域，具体地说，涉及一种靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病，在各种致死性的疾病中高居第二位。近年来，恶性肿瘤的发病率明显上升，同时，其治疗效果较差，晚期易发生转移，预后不佳。目前临床上，所采用的常规治疗方法如放化疗和手术治疗很大程度缓解了疼痛，但这些疗法的副作用及局限性仍很大，疗效难以进一步提高。
肿瘤的发生发展是个多因素多机制多种因子参与的过程。CD47即整合素相关蛋白(Integrin-Associated Protein，IAP)，表达于细胞表面，可结合巨噬细胞表面的信号调节蛋白-α(Signal-RegμLatory Proteinα，SIRPα)进而磷酸化SIRPα的胞质内免疫受体酪氨酸抑制性基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motifs，ITIMs)，招募磷酸酶SHP-1后向巨噬细胞发出“别吃我”的抑制性信号。CD47分子在肿瘤细胞表面的广泛表达抑制了巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬效应。据此，研究人员开发了可激活巨噬细胞吞噬效应的CD47拮抗剂(CD47 antagonists)。CD47拮抗剂将通过封闭CD47和SIRPα结合而激活巨噬细胞的吞噬作用，增强抗肿瘤免疫反应，最终达到抑制肿瘤生长的目的。
CD24又名热稳定抗原(Heat Stable Antigen,HSA)，是一个含有31个氨基酸的短肽。作为一种细胞黏附分子，CD24的糖基化高度多变且和细胞类型相关，高度糖基化的CD24通过磷脂酰肌醇(Glycosyl-Phoshphatidyl-Inositol，GPI)锚定在细胞膜内的脂质筏上。研究发现CD24在乳腺癌、卵巢癌及肺癌等多种肿瘤细胞表面过表达。它可与巨噬细胞表面表达的抑制性受体Siglec-10结合发出“别吃我”的信号从而限制了巨噬细胞的吞噬作用，这种免疫抑制性信号往往通过和经典的CD47信号互补的方式发挥作用，因此CD24可能是肿瘤免疫治疗的一个新靶点。进一步研究发现，抗CD24的抗体可有效激活巨噬细胞吞噬作用的活性。为此，CD24不仅是一个新发现的免疫检查点，同时也是潜在的抗肿瘤药物作用靶点。另外，研究发现人红细胞表面不表达CD24分子，故CD24靶向药物不存在潜在的血液毒性风险。
由此可见，如果能同时阻断CD47和CD24，不但可以抑制CD24信号激活导致的肿瘤的侵袭和转移，也将阻断CD47和CD24介导的肿瘤抑制性信号，激活对肿瘤的免疫反应，故可能会比单独阻断CD24或CD47有更好的抑制肿瘤生长增殖的协同作用，对肿瘤的治疗将具有重要意义。
然而，单抗联合应用具有多方面的限制。首先，临床上应用两种抗体的安全性和效果至今未有详尽的报道，可能存在安全风险；另外，联合应用两种抗体也存在调节障碍和造价太高的缺陷，限制了其临床应用。
因此，采用基因工程技术构建一个可以同时阻断两个靶点的双特异性抗体融合蛋白，既能阻断CD24，又能阻断CD47，进而更有效地抑制肿瘤的生长和增殖，成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法与应用。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白CD47/CD24-BsAb-Ig(记为PPAB001)，所述融合蛋白包含CD24抗体重链、CD24抗体轻链以及CD47-Fc结合肽；
其中，CD24抗体重链的恒定区与CD47-Fc结合肽的Fc段通过“锁钥结构”连接；
所述融合蛋白能够同时与CD47、CD24结合。
进一步地，所述CD24抗体轻链包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述CD24抗体重链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述CD47-Fc结合肽包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供所述融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1、分别构建含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的载体，并将其共转染至宿主细胞中进行培养，筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆；
S2、对细胞培养物进行分离纯化，得到目标融合蛋白。
进一步地，所述载体可以是真核表达载体pcDNA3.1。
进一步地，所述宿主细胞可以是CHO-K1细胞。
进一步地，用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆。
第三方面，本发明提供编码所述融合蛋白的核酸分子。
第四方面，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
第五方面，本发明提供含有所述融合蛋白的组合物，所述组合物任选包含抗肿瘤制剂。
所述抗肿瘤制剂选自如下A～E中的至少一种：
A、细胞毒类药物，包括：(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂，如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂，如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物，如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)作用于微管蛋白合成的药物，如紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药，如门冬酰胺酶，主要抑制蛋白质的合成；
B、激素类药物，包括：(1)抗雌激素，如三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；(2)芳香化酶抑制剂，如氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：(3)氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂，如诺雷德、依那通等；
C、生物反应调节剂：包括：(1)主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素，如白细胞介素-2；(2)胸腺肽类；
D、单克隆抗体，如西妥昔Cetuximab(C225)；赫赛汀单抗(Trastuzumab)贝伐单抗(Avastin)；
E、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物：包括：(1)细胞分化诱导剂，如维甲类；(2)细胞凋亡诱导剂。
第六方面，本发明提供所述融合蛋白或所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌等，优选乳腺癌、卵巢癌。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明采用基因工程技术构建了可以同时阻断两个靶点的双特异性抗体融合蛋白CD47/CD24-BsAb-Ig，包含抗CD24侧的重链、抗CD24侧的轻链以及抗CD47侧的Fc融合蛋白，该双特异性抗体融合蛋白既能阻断CD24，又能阻断CD47，进而更有效地抑制肿瘤的生长和增殖。
采用本发明提供的制备方法制备的所述双特异性抗体融合蛋白，可同时具有anti-CD24和CV1-hFc的功能，能阻断CD47及CD24介导的肿瘤细胞的增殖。此外，该双特异性抗体融合蛋白像传统的IgG分子一样，最大程度地保留了传统单克隆抗体结构，由于有Fc片段的存在，可以用普通的Protein A柱亲和层析法纯化，利于大规模的生产纯化。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白结构示意图及凝胶过滤层析纯化结果；其中，A为anti-CD24蛋白，B为双特异性抗体融合蛋白PPAB001，C为CV1-hFc蛋白，D为各组分分子量大小的分析结果。
图2为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白的SDS-PAGE验证试验；从左至右，第一泳道为蛋白质分子量对照品，第二泳道为CV1-hFc蛋白，第三泳道为anti-CD24蛋白，第四泳道为双特异性抗体融合蛋白PPAB001。
图3为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白与CD24及CD47结合活性实验结果。
图4为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白与CD24及CD47双阳性细胞结合的流式细胞术验证结果。
图5为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白激活巨噬细胞的免疫荧光实验。其中，A为免疫荧光观察巨噬细胞对乳腺癌细胞吞噬作用(荧光显微镜放大倍数400倍)，B为统计学分析乳腺癌细胞被吞噬的比率。
图6为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白抑制荷瘤小鼠4T-1细胞肿瘤生成实验。
图7为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白抑制荷瘤小鼠SK-OV-3细胞肿瘤生成实验。
图8为本发明较佳实施例中双特异性抗体融合蛋白对荷瘤小鼠MFC细胞肿瘤生成的影响。
具体实施方式
本发明提供一种抗CD47和CD24的双特异性抗体融合蛋白及其制备方法，所述双特异性抗体融合蛋白既可以抑制CD24，也能拮抗CD47，可用于制备抗肿瘤药物。
本发明采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种抗CD47和CD24的双特异性抗体融合蛋白CD24/CD47-BsAb-Ig(即PPAB001)，所述双特异性抗体融合蛋白包含抗CD24侧的重链、抗CD24侧的轻链以及抗CD47侧的Fc融合蛋白。
所述抗CD24侧的重链、抗CD24侧的轻链以及抗CD47侧的Fc融合蛋白可通过在CHO细胞内形成二硫键组成得到一种即可抑制CD24，又可拮抗CD47的双特异性抗体融合蛋白。
为了避免在上述元件的组成过程中发生抗CD24侧抗体或抗CD47侧融合蛋白的自我连接或组合，本发明对上述抗CD24侧的重链和抗CD47侧的Fc融合蛋白中的恒定区CH3区进行了定点突变，具体如下：在抗CD24侧重链恒定区CH3引入一个突变，包括SEQ ID NO:2中第249位由苏氨酸转变为色氨酸。在PPAB001的抗CD47侧Fc区引入三个突变，包括SEQ IDNO:12中第152位由苏氨酸转变为丝氨酸，第154位亮氨酸转变为丙氨酸及第193位酪氨酸转变为缬氨酸。经突变后抗CD47侧Fc段和抗CD24侧重链恒定区可通过这些氨基酸形成类似于“锁钥结构(Knob-in-hole)”的结合模式，大大增加了正确配对的几率，降低了形成自身配对的可能性。
基于上述调整，所述双特异性抗体融合蛋白具体包含SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供前述双特异性抗体融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：
S1、构建分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的载体，并将其用脂质体法共转染至宿主细胞中进行培养，筛选稳定表达双特异性抗体融合蛋白的细胞克隆；
S2、对细胞培养物进行分离纯化，得到双特异性抗体融合蛋白PPAB001。
需要说明的是，本发明所述的载体可为本领域常规使用的载体，例如pCDNA3.1、pDHFF等。表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。
可选地，如在本发明的具体实施方式中，使用真核表达载体pcDNA3.1。
进一步地，用于表达所述双特异性抗体融合蛋白的宿主细胞可为原核细胞，例如DH5α、BL21(DE3)、TG1等；也可为哺乳动物或昆虫宿主细胞，COS、CHO、NSO、sf9及sf21等均可适用于本发明。
作为优选，本发明选择CHO-K1细胞(ATCC)作为宿主细胞进行双特异性抗体融合蛋白的表达。
进一步地，宿主细胞的培养条件为本领域常规培养条件，例如使用含10％血清的DMEM培养基进行培养。
进一步地，S2中，用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选稳定表达双特异性抗体融合蛋白的细胞克隆。利用上述方法，可将双特异性抗体融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。更进一步地，可以利用亲和层析的方法对本发明公开的双特异性抗体融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规方法例如高盐缓冲液、改变pH等方法洗脱结合在亲和柱上的双特异性抗体融合蛋白。
本发明对PPAB001进行亲和力检测，发现其完好地保留了anti-CD24和CV1-hFc的亲和力。利用PPAB001进行下一步实验，包括肿瘤细胞增殖、体内抑瘤和促巨噬细胞吞噬等实验，结果表明，本发明公开的双特异性抗体融合蛋白PPAB001同时具有anti-CD24和CV1-hFc的功能，它能够阻断CD47及CD24介导的肿瘤细胞的增殖。此外，该双特异性抗体融合蛋白PPAB001可以和传统的IgG分子一样，最大程度地保留了传统单克隆抗体结构，由于有Fc片段的存在，可以用普通的Protein A柱亲和层析法纯化，利于大规模的生产纯化。实验表明，在相同剂量下，双特异性抗体融合蛋白PPAB001具有明显优于anti-CD24的抗肿瘤治疗效果。
第三方面，基于前述技术方案，可同时表达SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16及SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列的宿主细胞，以及包括分别含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17所示核苷酸序列的载体组合也在本发明的保护范围之内。
第四方面，本发明还提供含有前述双特异性抗体融合蛋白PPAB001的组合物。
本发明还提供前述双特异性抗体融合蛋白PPAB001或含有其的组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明公开的上述双特异性抗体融合蛋白PPAB001，与药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的全人源抗体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述全人源抗体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer 188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUATTM等，其加入量应使双特异性抗体融合蛋白的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。
上述制剂为包含双特异性抗体融合蛋白的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。
本发明所述的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，并减少或防止转移。
本发明中双特异性抗体融合蛋白PPAB001及含有其的组合物在对包括人在内的动物给药，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。
本发明提供的双特异性抗体融合蛋白PPAB001及含有其的组合物还可以与其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括：
1、细胞毒类药物
(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物，如放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；
2、激素类，抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；
3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；
4、单克隆抗体：西妥昔Cetuximab(C225)；赫赛汀单抗(Trastuzumab)贝伐单抗(Avastin)；
5、其他包括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。
本发明提供的双特异性抗体融合蛋白PPAB001及其组合物可以与上述抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，MolecμLar Cloning(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.，1989)：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold springHarbor Laboratory Press，或按照制造厂商说明书建议的条件。
本发明中所涉及的术语及简称如下：
PPAB001：靶向CD47和CD24的双特异性抗体融合蛋白；
anti-CD24：抗CD24的单克隆抗体；
CV1-hFc：信号调节蛋白-α突变体可结晶片段融合蛋白；
CD47：整合素相关蛋白；
IgG：免疫球蛋白G；
ELISA：酶联免疫吸附试验；
SDS-PAGE：十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳。
实施例1人抗体轻、重链恒定区和Fc区基因的克隆
用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic Acids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物扩增IgG1型抗体重链和轻链恒定区基因，PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃5分钟；94℃45秒，60℃45秒，72℃70秒，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别为重链恒定区(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别为轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12分别为恒定区Fc段(Fc)的核苷酸和氨基酸序列。将正确的克隆记作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL、pGEM-T/Fc。
实施例2双特异性抗体融合蛋白PPAB001的构建
具体构建方法：anti-CD24是通过杂交瘤细胞技术筛选后并对抗体的恒定区进行人源化改造而获得的，全基因合成anti-CD24的重、轻链可变区基因，CV1的序列参见Science 341，88(2013)。Anti-CD24的重链可变区与人IgG1抗体的重链恒定区连接，组成了PPAB001的抗CD24侧重链基因；PCR克隆出CV1与人IgG1抗体的重链恒定区Fc段连接，组成了PPAB001的抗CD47侧融合蛋白基因。Anti-CD24的轻链可变区通过overlap PCR的方法与人IgG1抗体的轻链恒定区连接，组成了PPAB001的抗CD24侧轻链基因。将上述重、轻链基因及融合蛋白基因分别装入真核表达载体pcDNA3.1(Invitrogen公司产品)。上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞(ATCC)，并用含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选稳定表达双特异性抗体融合蛋白的细胞克隆。利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清纯化双特异性抗体融合蛋白PPAB001。
双特异性抗体融合蛋白PPAB001的构建表达过程如下：
PPAB001抗CD24侧的重链和轻链可变区及抗CD47侧CV1分别为PPAB001VH，PPAB001VL及PPAB001CV1，经Overlap PCR合成后回收目的条带并克隆到pGEM-T载体中，筛选阳性克隆测序，分别得到pGEM-T/PPAB001VH(核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)，pGEM-T/PPAB001VL(核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)及pGEM-T/PPAB001 CV1(核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)。PCR采用Roche公司的高保真扩增系统，反应条件均为：95℃5分钟；94℃50秒，55℃45秒，72℃55秒，30个循环；72℃10分钟。
采用Overlap PCR将pGEM-T/PPAB001VH基因与pGEM-T/CH中的重链恒定区基因连接，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindIII和EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pCDNA3.1(+)用T4 DNA连接酶进行连接，构建真核表达载体pCDNA3.1/ZEO(+)(PPAB001VHCH)(核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16)。
采用Overlap PCR将pGEM-T/PPAB001CV1基因与pGEM-T/Fc中的Fc段基因连接，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindIII和EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pCDNA3.1(+)用T4 DNA连接酶进行连接，构建真核表达载体pCDNA3.1/ZEO(+)(PPAB001CV1-hFc)(核苷酸序列和氨基酸序列见SEQ ID NO:17和SEQ IDNO:18)。
采用Overlap PCR将pGEM-T/PPAB001VL中的PPAB001VL基因与pGEM-T/CL中的轻链恒定区基因相连，并克隆到pGEM-T载体中，挑选正确克隆后以HindIII和EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的片段，与同酶切的质粒pCDNA3.1(+)用T4DNA连接酶进行连接，构建真核表达载体pCDNA3.1/ZEO(+)(PPAB001VLCL)(核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示)。
于3.5cm组织培养皿中接种3×105个CHO-K1细胞，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒9μg(质粒pCDNA3.1(+)pCDNA3.1/ZEO(+)(PPAB001VHCH)3μg，pCDNA3.1/ZEO(+)(PPAB001VLCL)3μg，pCDNA3.1/ZEO(+)(PPAB001CV1-hFc)3μg)和20μLLipofectamine2000Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500μL无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3mL无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO2孵箱培养4h后补加2mL含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO2孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/mL G418和250μg/mL Zeocin的选择培养基筛选抗性克隆。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化双特异性抗体融合蛋白PPAB001。将PPAB001用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。PPAB001的结构如图1B所示，左侧为PPAB001的抗CD24侧重链与轻链，右侧为PPAB001的抗CD47侧CV1的Fc融合蛋白。抗CD24蛋白的结构如图1A所示，CV1-hFc蛋白的结构如图1C所示。
实验例1双特异性抗体融合蛋白的凝胶过滤层析纯化试验
用平衡液(10mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(pH7.4)、150mmol/L氯化钠)平衡Superose 12 10/300GL柱子(GE公司产品)40mL后，将浓缩好的anti-CD24、PPAB001和CV1-hFc蛋白分别上样进行凝胶过滤层析纯化，以分析各组分的分子量大小。结果如图1D所示，抗体anti-CD24因分子量最大首先被洗脱出来，其次是双特异性抗体融合蛋白PPAB001，最后是融合蛋白CV1-hFc。
实验例2双特异性抗体融合蛋白纯度的验证试验
配制含有SDS 10％丙烯酰胺浓度的聚丙烯酰胺凝胶，将融合蛋白CV1-hFc，抗体anti-CD24及双特异性抗体融合蛋白PPAB001分别上样进行凝胶电泳试验，以分析各组分的纯度。结果如图2所示，PPAB001的纯度在90％以上。
实验例3双特异性抗体融合蛋白PPAB001与CD24和CD47的结合活性检测
将CD24(R&D公司产品)用0.05mmol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9.6)稀释成2μg/mL，50μL/孔，4℃包被过夜。10％脱脂奶室温封闭2h后，加入不同浓度的双特异性抗体融合蛋白，CV1-hFc和anti-CD24，50μL/孔，每个浓度取3个平行孔，室温孵育2h。弃上清液，PBS洗涤3次，加入按效价稀释好的HRP标记的CD47，50μL/孔，室温孵育45min。PBS充分洗涤后，TMB显色后，置酶标仪(酶标比色仪，美国BIO-Rad公司)中测定450nm吸光度(A450)值。实验结果如图3所示，图中纵坐标为450nm的光密度值(或称吸光度值)，横坐标为抗体浓度的对数。CV1-hFc和anti-CD24仅能结合CD47或CD47，因此读值接近于0，而PPAB001组显示了随加入抗体浓度升高，相应OD值也增高的浓度依赖性效应。通过此试验证实了PPAB001既可结合CD47又可结合CD24的结合特性。实验结果表明，因双特异性抗体融合蛋白PPAB001可结合CD24也可结合CD47，而显现出浓度依赖效应呈S曲线。Anti-CD24和CV1-hFc因只能结合CD24或CD47，因此无结合活性。以上实验结果表明，构建的双特异性抗体融合蛋白PPAB001同时保留了亲本anti-CD24和CV1-hFc的结合活性。
实验例4流式细胞术分析
将CD24和CD47双阳性的乳腺癌BT-474细胞用2％ FCS-PBS重悬成1×106个/mL，分别加入不同稀释度的PPAB001、anti-CD24、CV1-hFc和对照品IgG，置于4℃孵育1h，用2％FCS-PBS洗细胞2遍。再加入FITC标记的羊抗人IgG(H+L)的二抗于4℃孵育1h，用2％ FCS-PBS洗细胞2遍后在流式细胞仪上进行分析，计算染色阳性细胞的百分数并比较各抗体的相对亲和力。实验结果如图4所示，图中横坐标为抗体的浓度，纵坐标为平均荧光强度。流式细胞术的结果表明，PPAB001对CD47和CD24双阳性的细胞结合具有浓度依赖性结合，呈现S曲线。Anti-CD24、CV1-hFc对CD47和CD24双阳性的细胞结合也具有浓度依赖性结合，但平均荧光强度较低。对照组为加入无关IgG组。实验结果表明，PPAB001可以结合CD24和CD47双阳性的BT-474细胞，即PPAB001可以同时结合细胞表面的CD24和CD47。
实验例5双特异性抗体融合蛋白PPAB001体外促进巨噬细胞对肿瘤细胞吞噬实验
利用无血清培养基灌洗小鼠腹腔，灌洗液制备鼠腹腔巨噬细胞，具体方法如下：对三只NOD-SCID小鼠提前5天腹腔注射1-2mL巯基乙酸盐培养基；5天后，颈椎脱臼法处死小鼠。用注射器抽取5mL含有双抗的RPMI-1640无血清培养基注入腹腔；用棉球轻揉腹部1-2分钟后吸取细胞悬液；1000rpm离心5min后，用无血清RPMI-1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中培养；接着利用荧光显微镜观察吞噬效果，其具体方法如下：以5×104个/孔的密度将腹腔来源的鼠巨噬细胞铺在24孔板中培养过夜；将5×106个BT474或BT474R或SK-OV-3细胞标记上羧基荧光素乙酰乙酸酯(CFSE)。将培养巨噬细胞的培养基更换为不添加血清的培养基，饥饿处理2h。每孔加入2×105个CFSE标记的肿瘤细胞；接下来加入以下组别的抗体，每组三个复孔，终浓度为10μg/mL：(1)IgG组；(2)CV1-hFc组；(3)anti-CD24组；(4)PPAB001组，37℃孵育2-3h。用培养基洗涤细胞三次，在共聚焦荧光显微镜下观察拍照，计算每100个巨噬细胞(三个视野)中CFSE阳性细胞的比率。实验结果如图5所示，其中A为PPAB001组处理后，较之CV1-hFc或anti-CD24单抗处理组，巨噬细胞对乳腺癌细胞吞噬效能显著增强；B为统计学数据，显示了PPAB001处理组被吞噬的细胞数目与CV1-hFc组或anti-CD24组比较有显著差异。实验结果表明，与对照组CV1-hFc和anti-CD24组相比，PPAB001可以有效促进巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。
实验例6双特异性抗体融合蛋白PPAB001体内抑制肿瘤细胞生长实验
分别以乳腺癌4T-1细胞、卵巢癌SK-OV-3细胞或胃癌MFC细胞皮下接种雌性NOD-SCID鼠，在接种肿瘤细胞后待肿瘤组织达到80-120mm3，静脉注射以下4组，每组6只小鼠：①人IgG对照组；②anti-CD24；③CV1-hFc；④PPAB001。每周注射2次，共注射1周。给药过程中，每隔2日观察肿瘤生长情况，测量肿瘤大小以评价PPAB001的抑瘤作用。
实验结果分别如图6～图8所示，图6中横坐标为4T-1肿瘤的荷瘤小鼠接种肿瘤后的时间，纵坐标为肿瘤体积，箭头为两次药物注射的时间，表明经过一段时间的药物PPAB001治疗后，较之无关IgG治疗组及anti-CD24组或CV1-hFc组，PPAB001组显示了显著的肿瘤消退趋势，差异有统计学意义；图7中横坐标为SK-OV-3肿瘤的荷瘤小鼠接种肿瘤后的时间，纵坐标为肿瘤体积，箭头为两次药物注射的时间，表明经过一段时间的药物PPAB001治疗后，较之无关IgG治疗组及anti-CD24组或CV1-hFc组，PPAB001组显示了显著的肿瘤消退趋势，差异有统计学意义；图8中横坐标为MFC肿瘤的荷瘤小鼠接种肿瘤后时间，纵坐标为肿瘤体积，箭头为两次药物注射的时间，表明经过一段时间的药物PPAB001治疗后，较之无关IgG治疗组及anti-CD24组或CV1-hFc组，PPAB001组的肿瘤并未消退。以上实验结果表明，PPAB001可以有效抑制荷瘤小鼠身上乳腺癌和卵巢癌的肿瘤生长，且其抑瘤效果显著强于anti-CD24组、CV1-hFc组和IgG对照组，但PPAB001不能抑制荷瘤小鼠体内的胃癌肿瘤生长。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.靶向CD24和CD47的双特异性抗体融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含CD24抗体重链、CD24抗体轻链以及CD47-Fc结合肽；
其中，CD24抗体重链的恒定区与CD47-Fc结合肽的Fc段通过“锁钥结构”连接；
所述融合蛋白能够同时与CD47、CD24结合。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述CD24抗体轻链包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，所述CD24抗体重链包含SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列，所述CD47-Fc结合肽包含SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述融合蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、分别构建含有SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15及SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列的载体，并将其共转染至宿主细胞中进行培养，筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆；
S2、对细胞培养物进行分离纯化，得到目标融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述载体为真核表达载体pcDNA3.1。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述宿主细胞为CHO-K1细胞。
6.根据权利要求3～5任一项所述的方法，其特征在于，用含600μg/mL G418和250μg/mLZeocin的选择培养基筛选稳定表达目标融合蛋白的细胞克隆。
7.编码权利要求1或2所述融合蛋白的核酸分子。
8.含有权利要求7所述核酸分子的生物材料，其特征在于，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
9.含有权利要求1或2所述融合蛋白的组合物，所述组合物任选包含抗肿瘤制剂；
优选地，所述抗肿瘤制剂选自如下A～E中的至少一种：
A、细胞毒类药物，包括：(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂优选氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物优选顺铂、卡铂和草酸铂；丝裂霉素；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂，优选甲氨喋呤和Alimta；胸腺核苷合成酶抑制剂优选氟尿嘧啶类；嘌呤核苷合成酶抑制剂，优选6-巯基嘌呤和6-TG；核苷酸还原酶抑制剂，优选羟基脲；DNA多聚酶抑制剂，优选阿糖胞苷和健择；(3)作用于核酸转录的药物，优选放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素；(4)作用于微管蛋白合成的药物，优选紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药，优选门冬酰胺酶；
B、激素类药物，包括：(1)抗雌激素，优选三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦；(2)芳香化酶抑制剂，优选氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德；抗雄激素：(3)氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂，优选诺雷德、依那通；
C、生物反应调节剂：包括：(1)干扰素，优选白细胞介素-2；(2)胸腺肽类；
D、单克隆抗体，优选西妥昔Cetuximab；赫赛汀单抗，贝伐单抗；
E、其他药物：包括：(1)细胞分化诱导剂，优选维甲类；(2)细胞凋亡诱导剂。
10.权利要求1或2所述融合蛋白或者权利要求9所述组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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