KR20130135590A - 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포 - Google Patents

로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포 Download PDF

Info

Publication number
KR20130135590A
KR20130135590A KR1020120059303A KR20120059303A KR20130135590A KR 20130135590 A KR20130135590 A KR 20130135590A KR 1020120059303 A KR1020120059303 A KR 1020120059303A KR 20120059303 A KR20120059303 A KR 20120059303A KR 20130135590 A KR20130135590 A KR 20130135590A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
monoclonal antibody
lawsonia intracellularis
antibody
cells
antigen
Prior art date
Application number
KR1020120059303A
Other languages
English (en)
Inventor
예정용
김종만
황정민
Original Assignee
녹십자수의약품(주)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 녹십자수의약품(주) filed Critical 녹십자수의약품(주)
Priority to KR1020120059303A priority Critical patent/KR20130135590A/ko
Publication of KR20130135590A publication Critical patent/KR20130135590A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells
    • C12N5/163—Animal cells one of the fusion partners being a B or a T lymphocyte
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포, 상기 단일클론항체를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 검출용 키트 및 상기 단일클론항체를 이용하여 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단일클론항체는 시료 내의 로소니아 인트라셀룰라리스 균주만을 선별적으로 인지할 수 있어, 돼지의 증식성 회장염의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

Description

로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포 {Lawsonia intracellularis-specific monoclonal antibody and hybridoma cell producing the same}
본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis)에 특이적으로 결합하는 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포, 상기 단일클론항체를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 검출용 키트 및 상기 단일클론항체를 이용하여 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
회장염(ileitis), 장선종(intestinal adenomatosis), 출혈성 장염(hemorrhagic enteropathy), 또는 괴사성 장염(necrotic enteritis)으로 알려져 있는 돼지 증식성 장염(porcine proliferative enteritis, PPE)은 어린 성체 이후의 돼지에게 영향을 주는 자연 발생 질환이다.
돼지의 증식성 회장염은 우리나라를 비롯하여 전 세계적으로 양돈 산업에 큰 문제가 되고 있으며 수많은 양돈 농가가 돼지 증식성 회장염으로 경제적인 피해를 입고 있지만, 그 원인체 균의 분리배양이 어려워 연구가 미진한 실정이다. 영국과 미국 등지에서 증식성 회장염의 원인균인 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis)를 실험실 내에서 순수 분리배양하는 데 성공하여 연구가 활발히 진행 중에 있으나, 로소니아 인트라셀룰라리스는 종래의 세포 배양액 상에서 보통의 박테리아적 방법에 의해 배양될 수 없는 절대적인 세포 내 박테리아이며, 성장하기 위해 부착할 상피세포를 필요로 한다 (Micorist et al., Infect. and Immun.,61:4286, 1993). 이러한 선행 배양방법은 많은 노력을 필요로 하며, 대규모 배양에는 적합하지 않은 실정이다.
따라서, 국내에서 발생하는 증식성 회장염의 예방을 위한 백신개발, 진단 및 면역학적 연구를 위해 로소니아 인트라셀룰라리스 균주의 검출이 매우 중요하며, 이에 대한 단일클론 항체는 가장 필수적이고 중요한 연구 재료이다.
이에 본 발명자들은 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출할 수 있는 단일클론항체를 개발하고자 노력한 결과, 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
국내특허출원번호 : 10-2004-0077819
본 발명의 목적은 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단일클론항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 시료에서 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적으로 결합하는 단일클론항체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 검출용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 단일클론항체를 이용한 항원-항체 결합반응을 통해 시료에서 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 단일클론항체는 시료 내의 로소니아 인트라셀룰라리스 균주만을 선별적으로 인지할 수 있어, 돼지의 증식성 회장염의 진단에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 로소니아 인트라셀룰라리스 MyCoy/L1 균주에 특이적인 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 나타낸 도이다.
도 2는 로소니아 인트라셀룰라리스 MyCoy/L1 균주를 본 발명의 단일클론항체로 반응시키고, 형광 항체를 이용하여 그 발광 양상을 나타낸 도이다. (200배 확대, 오른쪽은 비감염대조군).
도 3 및 도 4는 돼지회장염에 감염되어 폐사한 돼지의 소장 조직을 본 발명의 단일클론항체를 이용하여 반응시킨 후, 로소니아 인트라셀룰라리스 균주의 검출 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 단일클론항체의 아이소 타입을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 단일클론항체가 반응하는 분획물의 크기를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명은 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적으로 결합하는 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 “단일클론항체”는 당해 분야에 공지된 용어로서, 단일 항원성 부위에 대해서 지시되는 고도의 특이적인 항체를 의미한다. 통상적으로, 상이한 결정기(epitope)들에 대해 지시되는 상이한 항체들을 포함하는 다클론항체와는 다르게, 단일클론항체는 항원상의 단일 결정기에 대해서 지시된다. 단일클론항체는 항원-항체 결합을 이용하는 진단 및 분석학적 분석법의 선택성과 특이성을 개선시키는 장점이 있으며, 융합 배양에 의해 합성되기 때문에 다른 면역글로불린에 의해 오염되지 않는 또 다른 장점을 갖는다. 상기 단일클론항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Mislstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조) 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991 등 참조) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌글리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.
본 발명에서 용어 "하이브리도마"는 2개의 다른 종류의 세포를 인공적으로 융합시켜 만든 세포를 의미한다. 하이브리도마 세포는 폴리에틸렌글리콜 등 세포융합을 일으키게 하는 물질이나 특정 종의 바이러스를 사용하여 둘 이상의 동종 세포나 이종 세포를 융합시킴으로써 제조되는데, 하이브리도마 세포를 형성시킴으로써 각기 다른 세포가 갖는 다른 기능을 하나의 세포에 통합시킬 수 있게 된다. 이러한 하이브리도마 세포는 일반적으로 시험관 내에서도 증식이 되는 암세포와 생체로부터 추출한 어느 특정의 분화 형질을 가진 대형 세포를 융합시켜 제조될 수 있다. 대표적인 하이브리도마는 림프구 하이브리도마로서, 골수종세포와 B세포를 융합시킨 하이브리도마 세포, T세포와 그 종양세포인 하이브리도마 세포, 림포카인(생리활성물질)을 만들어내는 T세포와 그 종양세포인 하이브리도마 세포 등이 있으며, 본 발명의 하이브리도마 세포주는 당업자의 선택에 따라 본 발명의 단일클론항체를 효과적으로 생산하기 위한 최적의 조건으로 융합 및 배양될 수 있음은 자명하다. 본 발명의 바람직한 실시예에서는 마우스의 비장에서 B세포를 확보하고 이를 마우스 골수종 세포와 융합하여 배양한 후, 로소니아 인트라셀룰라리스 항체가 확인된 B세포 하이브리도마 세포만을 선택하였으며, 이를 한국세포주연구재단에 2010년 12월 22일 자로 기탁하였다 (수탁번호 KCLRF-BP-00252).
본 발명의 하이브리도마 세포가 생산하는 단일클론항체는 항체는 정제하지 않고 이를 포함하는 세포 배양액 상태로 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 고순도(예컨대, 95% 이상)로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 크로마토그래피 등이 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에는 본 발명의 단일클론항체뿐만 아니라, 로소니아 인트라셀룰라리스을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 다른 항체, 예를 들어 다클론항체, 키메릭-항체, 인간화-항체, 단일클론항체의 단편 등도 함께 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 키트에는 면역학적 분석에 사용되는 도구 및 시약이 포함될 수 있다. 상기 도구 및 시약으로는 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 상기 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 함께 포함할 수 있다. 상기 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS; 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로오스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립, 방사분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow through) 디바이스 등을 포함한다.
또한 본 발명은 (a) 상기 단일클론항체를 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 로소니아 인트라셀룰라리스과 상기 단일클론항체를 결합하여 생성된 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계;를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용된 용어 “시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 초유, 관절액, 타액, 배변, 세포 배양 상등액 또는 상층액 등의 생물학적 시료를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 상기 생물학적 시료는, 돼지, 햄스터, 파란 여우, 에뮤, 사슴, 개, 기니 피그, 말, 레서스 마커스 원숭이, 타조, 토끼, 쥐 등의 각종 동물로부터 채취할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용된 용어 “항원-항체 복합체”는 시료 중의 로소니아 인트라셀룰라리스의 존재 또는 부재를 확인하기 위한, 로소니아 인트라셀룰라리스와 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 바람직하게는 상기 항원-항체 복합체는 로소니아 인트라셀룰라리스 및 본 발명에 따른 단일클론항체의 복합체이다.
상기 항원-항체 복합체 형성의 확인은, 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩(Protein Chip) 또는 키트 등에 의해 이루어질 수 있으며 이로 제한되지는 않는다. 상기 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다.
항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코오스 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코오스 옥시다제와 루시퍼라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 상기 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 상기 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 상기 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K4W(CN)8, [Os(bpy)3]2+,[RU(bpy)3]2+, [MO(CN)8]4-등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 상기 방사성 동위원소에는3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 로소니아 인트라셀룰라리스 항원의 제조
로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) MyCoy/L1 균주 (수탁번호 : KCLRF-BP-00254)를 배양하여 항원으로 사용하였다. 보다 구체적으로는, 마우스 장 세포주에서 로소니아 인트라셀룰라리스 MyCoy/L1 균주를 5일간 배양한 후, 배양 상층액을 수거하여 3000rpm에서 30분간 원심분리하여 침전물을 수득하였다. 상기 수득된 침전물을 인산완충용액(PBS)을 사용하여 5회 반복 세척하였으며, 이를 통해 세포배양액 내의 다른 성분을 배제하고, 상층액에 부유하고 있는 균을 정제하였다. 최종적으로 로소니아 인트라셀룰라리스 항원을 0.5mg/ml의 농도로 준비하였다.
실시예 2: 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조
2-1 : 항체 생성 세포 수득
로소니아 인트라셀룰라리스(Lawsonia intracellularis) MyCoy/L1 균주 (수탁번호 : KCLRF-BP-00254)에 대한 마우스 면역을 유도하기 위하여 실시예 1에서 수득한 항원을 마리당 1 회에 100 μg 이상이 접종되도록, 하기 두 가지 경로를 통해 마우스에 접종한 후, 면역세포를 수득하였다.
1) Freud's adjuvant를 이용하여 항원을 유제화하고, 마우스의 복강 및 피하에 항원을 0일, 21일, 42일에 접종한 후, 마우스 비장에서 B세포를 수확.
2) PBS에 항원을 풀고, 마우스의 경구를 통해 항원을 접종한 후, 28일 경에 마우스 장간막 림프절에서 B세포를 수확.
2-2 : 하이브리도마 세포의 제조
실시예 2-1의 면역된 마우스에서 수득한 B세포를 PEG등을 이용하여 골수종세포와 융합하여 하이브리도마 세포를 제조하였다. 이 후, HAT를 첨가한 배지를 사용하여 비융합 세포를 제거하였다.
2-3 : 하이브리도마 세포의 선별 및 분리
(1) 간접형광항체법
실시예 2-2에서 제조한 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 간접형광항체법을 수행하였다. 실시예 1에서 수득한 항원을 PBS로 희석하여 사용하였다. 항원이 도말되어 고정된 유리 슬라이드에 하이브리도마 배양 상층액 시료들을 원액 그대로 20㎕씩 적용하여 37℃에서 60분간 반응하였다. 이를 30분간 PBS로 5차례 세척한 후 20㎕의 형광물질이 결합된 토끼 항돼지면역글로불린 G 혈청을 이용하여 37℃에서 60분간 반응시킨 후 형광현미경 하에서 관찰하였다. 200배에서 400배의 배율에서 형광을 발하는 세균 항원이 동일한 시야 내에서 100개 이상 관찰될 때 양성으로 판정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 2-2에서 제조된 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포가 생산한 단일클론항체에 의하여 로소니아 인트라셀룰라리스 특이적 단간균 성상이 형광물질에 의해 관찰되며, 대조군에서는 이러한 반응이 전혀 일어나지 않았음을 확인하였다. 상기 결과를 통하여 본 발명의 로소니아 인트라셀룰라리스에 대한 단일클론항체의 항원-항체 반응을 확인하였다.
(2) 면역조직화학염색
실시예 2-2에서 제조한 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여, 면역조직화학염색을 수행하였다. 10% 포르말린 고정 후 파라핀 절편으로 얻어진 양성 조직시료 (돼지회장염에 감염되어 폐사한 돼지의 소장조직)에 대해 실시예 2-2의 하이브리도마 배양 상층액을 이용하여, 균체와의 반응성 유무를 확인하였다. 비특이 여부와 반응강도를 기준으로 적합한 하이브리도마 세포를 선발하였다. 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2-2에서 제조한 하이브리도마 세포가 생산한 단일클론항체에 의하여 로소니아 인트라셀룰라리스 세균의 전형적인 세균성상이 AEC염색물질에 의해 특이적으로 검출되는 것을 확인하였다.
최종적으로 선별된 로소니아 인트라셀룰라리스 균주에 대한 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 한국세포주연구재단에 2010년 12월 22일 자로 기탁하였다 (수탁번호 KCLRF-BP-00252).
(3) 아이소타입 확인 및 단일클론항체의 항원 분획물 (fraction) 확인
상기 수탁번호 KCLRF-BP-00252인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 로소니아 인트라셀루라리스에 대한 단일클론항체의 아이소 타입 결정을 위해 Roche Applied Science의 Mouse Isotyping Kit를 사용하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 IgG2a 형임을 확인하였다.
또한, 상기 수탁번호 KCLRF-BP-00252인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 로소니아 인트라셀루라리스에 대한 단일클론항체가 파쇄된 로소니아인트라셀룰라리스 세균 분획물 중 어디와 반응하는지를 확인하기 위하여, 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 단일클론항체는 상기 분획물 중 80kda 크기의 분획물에 반응함을 확인하였다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00252 20101222

Claims (6)

  1. 수탁번호가 KCLRF-BP-00252인 하이브리도마 세포에 의해 생산되는, 로소니아 인트라셀룰라리스 (Lawsonia intracellularis)에 대한 단일클론항체.
  2. 제1항의 단일클론항체를 생산하는 수탁번호가 KCLRF-BP-00252인 하이브리도마 세포.
  3. 제1항의 단일클론항체를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스 검출용 키트.
  4. (a) 제1항의 단일클론항체를 시료와 접촉시키는 단계; 및
    (b) 로소니아 인트라셀룰라리스와 상기 단일클론항체를 결합하여 생성된 항원-항체 복합체의 형성을 확인하는 단계;를 포함하는 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 초유, 관절액, 타액, 배변 및 세포 배양 상등액으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 (b) 단계의 항원-항체 복합체의 형성 확인은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법 (Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 및 단백질 칩(Protein Chip)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는, 로소니아 인트라셀룰라리스를 검출하는 방법.
KR1020120059303A 2012-06-01 2012-06-01 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포 KR20130135590A (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120059303A KR20130135590A (ko) 2012-06-01 2012-06-01 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120059303A KR20130135590A (ko) 2012-06-01 2012-06-01 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130135590A true KR20130135590A (ko) 2013-12-11

Family

ID=49982795

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120059303A KR20130135590A (ko) 2012-06-01 2012-06-01 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20130135590A (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107576791A (zh) * 2017-09-13 2018-01-12 河南农业大学 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107576791A (zh) * 2017-09-13 2018-01-12 河南农业大学 一种猪胞内劳森菌elisa检测试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5932430A (en) Immunoassay for H. pylori in fecal specimens
US8741582B2 (en) Detection of a specific DEK isoform as a urine-based biomarker for bladder cancer
US8329875B2 (en) Antibodies to an epitope of AGR2, assays and hybridomas
KR101678428B1 (ko) 폐렴구군 검출방법
KR101484294B1 (ko) 퀴놀론계 항균제 특이적 단일클론항체
JP4536588B2 (ja) 成人ｔ細胞白血病の診断器具
JPS63159762A (ja) 口内微生物の評価方法
KR101495225B1 (ko) Ast 양의 측정을 통한 간 질환 진단, 예후 또는 모니터링 키트 및 방법
US20140087400A1 (en) Diagnosis and prognosis of triple negative breast and ovarian cancer
KR20130135590A (ko) 로소니아 인트라셀룰라리스에 특이적인 단일클론항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 세포
EP0664453A1 (en) Detection of basement membrane components as diagnostic of cancer and other diseases
CN109266620B (zh) 抗人IgG单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
KR101851332B1 (ko) 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트
KR20180020992A (ko) 피검 대상의 검출 방법 및 그것을 위한 면역 측정 기구 및 모노클로널 항체
CN108531460B (zh) 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
EP1751190B1 (en) Spore specific antibodies
KR20160072516A (ko) 스타필로코커스 아우레우스에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트
KR101806522B1 (ko) 병원성 대장균에 특이적인 신규한 단클론 항체, 이를 생산하는 하이브리도마, 이를 포함하는 검출용 조성물, 검출 방법 및 검출 키트
JP2014066641A (ja) 大腸菌ｏ１５７の検出方法
US7928204B2 (en) Spore specific antigen
AU600261B2 (en) Reagent for and procedure in the determination of C3a by immunochemical assay
CN108531459B (zh) 抗人IgM单克隆抗体、其杂交瘤细胞株及应用
WO2013125879A1 (ko) D-알라닌-d-알라닌 리가제에 대한 항체 및 이를 이용한 항생제 내성 세균의 탐지
JP2004300060A (ja) ストレプトコッカス・ミュータンスに対するポリクローナル抗体の製造方法
JP2018062466A (ja) 新規甲状腺癌関連抗原に結合する抗体および甲状腺癌診断剤

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application