BR112020012436A2 - células estromais mesenquimais e métodos para obter células estromais mesenquimais do cordão umbilical - Google Patents

Abstract

A presente invenção se refere às células estromais mesenquimais e a um método vantajoso para seu isolamento do cordão umbilical. Em particular, as células podem ser obtidas por um método que compreende o isolamento da Geleia de Wharton estromal ou uma fração de um cordão umbilical e submetendo a Geleia de Wharton estromal ou sua fração a tratamento enzimático liberando, dessa forma, pelo menos uma célula da Geleia de Wharton estromal ou de sua fração. Preferivelmente, o cultivo de células ocorre sob condições que permitem a expansão da população celular. A população celular de acordo com a presente invenção apresenta propriedades proliferativas e é de interesse industrial para muitos propósitos.

Description

CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS E MÉTODOS PARA OBTER CÉLULAS ESTROMAIS MESENQUIMAIS DO CORDÃO UMBILICAL CAMPO DA INVENÇÃO

[001]. A presente invenção se refere a um método para obter células estromais, particularmente células progenitoras estromais. As células progenitoras estromais são tipicamente capazes de dar origem a células derivadas fenotipicamente e genotipicamente idênticas (autorrenovação), bem como a pelo menos outro tipo celular final. Algumas células estromais apresentam capacidade de autorrenovação e tais células receberam cada vez mais atenções nos últimos anos. As células estromais relativas à presente invenção são células estromais mesenquimais não embrionárias. É possível obtê-las pelo isolamento do cordão umbilical pelo método da invenção, que é revelado em detalhes neste documento.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002]. As células estromais mesenquimais (MSC) são células estromais de interesse particular para a comunidade científica, entre outras coisas por causa de sua multipotência e baixa imunogenicidade (Pittenger et al., 1999, Science;, vol. 284, p. 143-147). De acordo com o estado da técnica, as células estromais mesenquimais (MSCs) são tradicionalmente e tipicamente obtidas da medula óssea, mas as MSCs também podem ser isoladas de uma variedade de outras fontes mamíferas, como tecido adiposo, músculo, tecido conjuntivo, polpa dentária, sangue do cordão, placenta e líquido amniótico (Iudicone et al., 2014, J. Transi. Med., 12:28). Entre as MSCs, a MSC adulta derivada da medula óssea (BM-MSC) tem sido mais amplamente estudada (por exemplo, WO 2008/042174 A2). Na medula óssea, as MSCs coexistem com uma variedade de tipos celulares incluindo as células tronco primitivas e semelhantes às embrionárias, células-tronco mesenquimais, progenitoras comprometidas com a linhagem, bem como células maduras como osteoblastos e fibroblastos, e diferentes métodos foram descritos para o isolamento de, por exemplo, MSCs derivadas da medula óssea (veja, por exemplo, Majore, Cell Commun. Signal., 2009, vol. 20; 7:6).

[003]. Alguns esforços também foram feitos no passado para explorar fontes alternativas de células estromais mesenquimais. Por exemplo, propôs-se o cordão umbilical (UC) como um reservatório adequado de diferentes tipos celulares, alguns dos quais demonstraram ter propriedades semelhantes às das células-tronco. O cordão umbilical é uma estrutura em mamíferos placentários que conecta a placenta ao feto em desenvolvimento proporcionando, dessa forma, uma fonte de nutrição fetal. Ele está disponível após o nascimento sem qualquer procedimento invasivo e questões éticas (Hass et al., 2011, Cell. Commun. Signal., vol. 9:12). O cordão umbilical compreende a Geleia de Wharton, um tecido conjuntivo flácido, gelatinoso rico em células estromais que recebeu o nome do anatomista Thomas Wharton. A Geleia de Wharton compreende células dispersas em uma substância fundamental amorfa composta de proteoglicanos, incluindo ácido hialurônico e diferentes tipos de glicanos (veja, por exemplo, a publicação WO 2004/072273 A1). Ela é geralmente considerada um tecido mesenquimal primitivo de derivação primariamente extraembrionária (Weiss, 1983, Histology, cell and tissue biology, New York, Elsevier Biomedical, p. 997-998), e foi proposta como sendo uma fonte promissora de MSCs (Wang et al., 2004, Stem Cells, vol. 22: p. 1330-1337).

[004]. Reconhece-se geralmente que as células estromais do cordão umbilical (UC) são heterogêneas com relação à estrutura, as propriedades biológicas e a localização dentro do UC. Diversos métodos para obter células da Geleia de Wharton (WJ) do UC foram descritos, e as células com propriedades semelhantes às das MSCs foram descritas como sendo residentes e originárias de diferentes partes do UC. O cordão umbilical humano compreende três vasos, que são normalmente organizados em uma volta espiral esquerda (sentido anti-horário). Mitchell et al. (2003, Stem Cells, vol. 21, p. 50-60) descrevem um método onde os vasos do cordão umbilical são removidos antes de coletar o tecido restante. O tecido restante, que inclui tanto uma fração da WJ quanto o epitélio amniótico é, então, cortado para produzir pequenos fragmentos de tecidos que são transferidos para placas de cultura de tecido; a digestão enzimática do cordão umbilical ou do tecido restante não é, entretanto, prevista. Ao invés disso, os fragmentos de tecido são subsequentemente utilizados como explantes primários a partir dos quais as células migram para fora das amostras de tecido para o substrato da cultura. Outro relatório (Romanov et al., 2003, Stem Cells, vol. 21, p. 105- 110) indica que MSCs semelhantes aos fibroblastos podem ser isoladas da vasculatura do cordão por digestão da veia umbilical com colagenase, o que, no entanto gera uma população mista de células endoteliais e subendoteliais vasculares. A US 5,919,702 A (Purchio et al.) descreve um método de isolamento que compreende cortar um segmento longo de aproximadamente 2,5 cm do cordão longitudinalmente, remover os vasos sanguíneos e isolar e coletar a WJ em um recipiente estéril, onde ele seja cortado e submetido a cultura. Por exemplo, descreve-se que as células podem ser isoladas colocando-se uma seção de 2-3 mm3 do WJ em uma lâmina de vidro no fundo de uma placa de Petri, cobrindo-a com outra lâmina e submetendo-a a cultura por 10-12 dias para permitir que algumas células (“pré-condrócitos”) migrem para fora da placa de cultura. O uso dos pré-condrócitos para produzir cartilagem também é mencionado.

[005]. O isolamento de células derivadas da matriz do cordão umbilical também foi relatado a partir de tecido de origem animal. Por exemplo, Lange-Consiglio et al., (2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 120-133) relatam o isolamento de “células derivadas da matriz do cordão umbilical” a partir de áreas “intervasculares” e “perivasculares” do cordão umbilical de cavalos.

[006]. O peso do cordão umbilical humano de aproximadamente 40 g a termo (Raio et al., 1999, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 83; p. 131-135; Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20) possui um limite máximo natural para material de partida disponível para o isolamento de células com propriedades semelhantes às de MSCs. De acordo com o processo de patente US2004/0136967 A1 e Seshareddy et al. (2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119), é difícil obter números elevados de células desejadas do cordão umbilical. Portanto, os autores recomendam extrair números de células relativamente altos, e descrevem condições que foram otimizadas para o isolamento de número de células relativamente altos, a fim de permitir a extração de grandes números de células. Eles propõem um tratamento enzimático relativamente difícil do cordão umbilical. Diferentes zonas da Geleia de Wharton são descritas, mas a exclusão de áreas particulares de origem de células para extração, como da área perivascular, não é especificamente recomendada, em linha com a recomendação geral de utilizar elevados números de células. As células são cultivadas depois do isolamento. Uma abordagem alternativa é descrita pela publicação WO 2004/072273 A e por Sarugaser et al. (Stem Cells, 2005, 23:220-229); estas publicações descrevem o isolamento de células com propriedades semelhantes às de MSCs exclusivamente da área perivascular do cordão umbilical. Como esta área é relativamente restrita sob o ponto de vista anatômico, a quantidade de material de partida é relativamente baixa, em comparação com métodos de isolamento que partem de todo o cordão umbilical. Adicionalmente, em vista da proximidade dos vasos que contém sangue, não se pode excluir a contaminação pelas células sanguíneas; portanto, descreve-se a seleção negativa contra a expressão de CD45 para evitar contaminação com células indesejadas na cultura. Também, a publicação WO 2017/058003 A1 descreve processos para o isolamento de MSCs do cordão umbilical, da polpa dentária, do prepúcio, da córnea ou de outras fontes; o processo de isolamento de células estromais mesenquimais do cordão umbilical é preferivelmente realizado sob condições estéreis, e o cordão umbilical é preferivelmente submetido ao tratamento com colagenase por intervalos de tempo relativamente longos. De acordo com Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20, os protocolos mais adequados para melhorar a expansão in vitro e a armazenagem de MSCs ainda devem ser estabelecidos. Dessa forma, ainda existe uma necessidade de fornecer populações que consistem em células que são caracterizadas por propriedades essencialmente uniformes e que sejam capazes de se expandir confiavelmente ex vivo; e métodos confiáveis para fornecê-las também são necessários.

PROBLEMA A SER RESOLVIDO

[007]. Dessa forma, um objeto da presente invenção inclui eliminar as desvantagens associadas com o estado da técnica. Objetos particulares compreendem a apresentação de um método confiável para obter uma célula estromal mesenquimal (MSC), e do fornecimento reprodutível de células estromais mesenquimais (MSCs) e de populações de MSCs, com propriedades de autorrenovação superiores em boas quantidades. Deseja-se que as populações sejam relativamente uniformes e que não contenham células indesejadas, como células apoptóticas, células de linhagem hematopoiética, etc. Dessa forma, em outras palavras, deseja-se fornecer células estromais mesenquimais por um método que seja vantajoso em termos de confiabilidade e/ou de rendimento, com relação aos métodos atualmente conhecidos e praticados. Várias desvantagens do estado da técnica definem objetivos adicionais de melhora tratados pelos presentes inventores, e estes objetivos foram alcançados pela contribuição descrita e reivindicada neste documento.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[008]. A presente invenção se refere a um método para obter células estromais mesenquimais (MSCs), às respectivas células estromais mesenquimais (MSCs) e a outros aspectos relacionados, todos descritos neste documento. Os principais aspectos e configurações da invenção são resumidos como segue.

[009]. Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para obter uma célula estromal mesenquimal. O método compreende (a) isolar a Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela de um cordão umbilical, e (b) submeter a Geleia de Wharton estromal ou sua fração a tratamento enzimático liberando, dessa forma, pelo menos uma célula da Geleia de Wharton estromal ou de sua fração. Preferivelmente, a célula obtida depois da etapa (b) é multipotente.

[0010]. Além das etapas (a) e (b), prefere-se que pelo menos uma etapa adicional esteja compreendida no método da invenção. Em particular, prefere-se que uma etapa para aumentar o número de células seja compreendida, tirando vantagem da divisão celular potencial das células obtidas na etapa (b). Nestas configurações preferidas, a etapa (b) é seguida por uma etapa (c); a etapa (c) compreende a expansão de pelo menos uma célula obtida na etapa (b). Preferivelmente, a(s) célula(s) obtida(s) depois da etapa (c) são multipotentes.

[0011]. Os presentes inventores desvendaram surpreendentemente que as células originárias do estroma do cordão umbilical são particularmente vantajosas. As vantagens incluem a homogeneidade das populações celulares e propriedades semelhantes às das células tronco. Em particular, na ausência de vasos do cordão umbilical, estas vantagens podem ser alcançadas. Portanto, é preferível que a etapa (a) isolar a Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela do cordão umbilical seja caracterizada por uma etapa de remoção físicas dos vasos e da área perivascular do cordão umbilical. Os vasos e a área perivascular podem ser removidos antes da etapa (a) ou durante a etapa (a). Uma forma tecnicamente vantajosa de remover os vasos e a área perivascular, que é preferida na presente invenção, é caracterizada por eliminar os vasos e a área perivascular do cordão umbilical. Os inventores observaram que a eliminação dos vasos, por exemplo, puxando os vasos para fora, também remove a área perivascular.

[0012]. Adicionalmente, os inventores desvendaram que é vantajoso segmentar o cordão umbilical antes da referida etapa de remover fisicamente os vasos e a área perivascular. A segmentação é normalmente alcançada por meios físicos, como uma tesoura ou um bisturi. Preferivelmente, a segmentação é perpendicular ao cordão. Mais preferivelmente, os segmentos perpendiculares apresentam, cada um, preferivelmente, um comprimento de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 cm, preferivelmente de 2 a aproximadamente 3 cm, e mais preferivelmente de aproximadamente 2,5 cm. Em uma configuração preferida o(s) segmento(s) de vasos é/são removido(s) do(s) segmento(s) do cordão umbilical antes da etapa (b). Em particular, é preferível remover os vasos, ou mais precisamente segmentos de vasos, depois da – preferivelmente perpendicular - segmentação do cordão umbilical.

[0013]. Preferivelmente, o tratamento enzimático da etapa (b) é um tratamento que compreende a exposição à enzima colagenase. Os inventores também desvendaram que a quantidade de atividade da colagenase tem importância. Em uma configuração preferida, a colagenase está presente durante a etapa de tratamento enzimático (b) com uma atividade específica relativamente baixa, conforme detalhado adicionalmente abaixo.

[0014]. No método da presente invenção, um rápido isolamento de células estromais do cordão umbilical é vantajoso. Em uma configuração preferida, as etapas (a) e (b) juntas são realizadas em um tempo total de menos de 6 horas, mais preferivelmente de menos de 5 horas, mais preferivelmente de menos de 4 horas e mais preferivelmente de menos de 3 horas. Fica evidente que uma duração curta das etapas (a) e (b) juntas também significa que a etapa (b) propriamente dita é curta. Geralmente, a brevidade da etapa (b), isto é, o isolamento rápido, em particular a brevidade do tratamento enzimático, pode contribuir para as condições leves durante a etapa (b).

[0015]. Surpreendentemente, os inventores desvendaram adicionalmente que a presença de lisado de plaquetas durante a digestão enzimática é vantajosa. Primeiro, os inventores desvendaram que a presença de lisado de plaquetas humanas não inibe ou diminui ou bloqueia a atividade enzimática da enzima colagenase, pelo menos não em uma extensão que viesse a interferir negativamente com a liberação enzimática desejada das células do tecido adjacente, por exemplo, da matriz estromal. Sabe-se que o plasma sanguíneo contém diversas proteases, e que havia, dessa forma, um preconceito contra a adição de uma proteína catalítica (como a colagenase) enquanto o plasma sanguíneo ou seus componentes estivessem presentes, ou vice- versa, como alguém teria esperado que a proteína catalítica (como a colagenase) fosse degradada ao longo do tempo e sua atividade, dessa forma, seria diminuída; surpreendentemente, os presentes inventores estabeleceram que a digestão com colagenase funciona eficientemente mesmo na presença de lisado de plaquetas. Segundo, os inventores desvendaram que as células possíveis de obter por digestão na presença de lisado de plaquetas no método de acordo com a presente invenção apresentam excelentes propriedades proliferativas (veja, por exemplo, os Exemplos 2B e 2C). Assim, preferivelmente, na etapa (b) a Geleia de Wharton estromal ou sua fração é submetida a tratamento enzimático na presença de lisado de plaquetas (PL) de mamífero, mais preferivelmente de lisado de plaquetas humanas (hPL).

[0016]. Além disso, o lisado de plaquetas está preferivelmente presente na etapa (c). Preferivelmente, na etapa (c) pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento compreendendo lisado de plaquetas (PL), preferivelmente lisado de plaquetas humanas (hPL). Preferivelmente, pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento que não compreende qualquer soro adicionado, em particular nenhum soro fetal bovino (FBS).

[0017]. Em uma configuração particularmente preferida, pelo menos uma célula é expandida em um determinado meio de crescimento especificamente apropriado para o método da invenção, opcionalmente com suplementos. Este meio de crescimento pode compreender um meio básico quimicamente definido e/ou lisado de plaquetas.

[0018]. O método da invenção gera células com propriedades particulares, que também são descritas neste documento. Dessa forma, prefere-se particularmente que a célula obtida pelo método do primeiro aspecto da invenção seja uma célula conforme descrito no segundo aspecto da invenção, como segue.

[0019]. Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a uma célula estromal mesenquimal (MSC). A MSC da invenção também pode ser referida como “célula da invenção”, ou simplesmente como “célula”. A MSC da invenção é caracterizada de forma que (a) expresse o gene APCDD1, e (b) não expresse o gene 3G5.

[0020]. Preferivelmente, a célula é uma célula isolada. Mais preferivelmente, a célula é derivada da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical. Preferivelmente, a célula é uma de primata isolada.

[0021]. Dessa forma, a célula, preferivelmente, não é de um cavalo, isto é, não uma célula de cavalo. Também, a célula não é preferivelmente de um roedor (por exemplo, camundongo ou rato), isto é, não uma célula de roedor (por exemplo, célula de camundongo ou célula de rato). Mais preferivelmente, a célula é uma célula humana.

[0022]. Em uma configuração preferida, a célula é uma célula humana derivada da Geleia de Wharton e que expressa o gene APCDD1.

[0023]. Em uma configuração preferida, a célula ainda expressa o gene

PPARG. Em outra e não mutuamente exclusiva configuração preferida, a célula ainda expressa o gene FLVCR2. No caso de uma célula humana, prefere-se que a célula humana expresse pelo menos um, preferivelmente pelo menos qualquer combinação de dois, e mais preferivelmente todos os antígenos leucocitários humanos HLA-A, HLA-B e HLA-C. Além disso, no caso de uma célula humana, prefere-se que as células não apresentem os antígenos leucocitários humanos HLA-DP, e /ou HLA-DQ. Opcionalmente, também, o HLA-DR não é exibido. Em uma configuração, a célula não exibe quaisquer dos antígenos leucocitários humanos HLA-DP, HLA-DR e HLA-DQ. Alternativamente, o HLA-DR é exibido em níveis baixos.

[0024]. A célula de acordo com a presente invenção é tipicamente menor do que algumas MSCs que foram isoladas por vários métodos de acordo com o estado da técnica. Por exemplo, a célula de acordo com a presente invenção pode ter um volume menor e/ou uma área superficial menor. Vários métodos para determinar o volume ou a área superficial da célula estão disponíveis, como a citometria de fluxo para determinar o volume celular das células separadas, e a determinação da superfície celular sob microscópio para células aderentes. Estes métodos são descritos neste documento abaixo.

[0025]. Preferivelmente, a célula não apresenta qualquer atividade da telomerase, e/ou não expressa qualquer telomerase. Preferivelmente, a célula é multipotente. Mais preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em vários tipos celulares. Prefere-se particularmente que a célula tenha pelo menos todos os potenciais de diferenciação a seguir: (a) adipogênica; (b) condrogênica;(c) osteogênica.

[0026]. Em uma configuração preferida, a célula é uma célula-tronco mesenquimal.

[0027]. A célula de acordo com o segundo aspecto da invenção é uma célula que pode ser obtida pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Configurações preferidas do primeiro aspecto da invenção são combináveis com aspectos preferidos do segundo aspecto da invenção em cada e em todas as combinações, a menos que o contexto determine o contrário. Alternativamente, a célula de acordo com a presente invenção pode, portanto, ser descrita como uma célula que pode ser obtida pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[0028]. Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a uma população de células. A população compreende pelo menos uma célula de acordo com o segundo aspecto da invenção. Mais preferivelmente, a população celular compreende uma grande quantidade de células, das quais pelo menos 80% (por número de células), preferivelmente pelo menos 90% (por número de células), mais preferivelmente pelo menos 95%, de forma que pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% (cada por número de células) são células de acordo com o segundo aspecto. Todas as configurações preferidas do segundo aspecto também se aplicam ao terceiro aspecto da invenção. Preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, de forma que pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, mais preferivelmente 100%, do número total de células são células conforme definido no segundo aspecto e, opcionalmente, uma ou mais de suas configurações preferidas, sozinha ou em combinação. A população celular é positiva para a expressão do gene APCDD1.

[0029]. Preferivelmente, a população é uma população de células isolada.

[0030]. A população celular é preferivelmente caracterizada adicionalmente de forma que o volume e/ou área superficial das células da população celular seja semelhante ou, alternativamente, de forma que um alto percentual de células tenha um volume e/ou área superficial pequeno(a), conforme descrito detalhadamente abaixo. O volume está normalmente correlacionado à dispersão frontal da luz (FSC) determinável por citometria de fluxo.

[0031]. Preferivelmente, a população celular é adicionalmente caracterizada de forma que pelo menos 70% das células (por número de células) ou mais sejam viáveis. Isto representa uma vantagem significativa com relação à técnica anterior, onde o percentual de células viáveis é inferior. Mais preferivelmente, pelo menos 75% das células (por número de células) são viáveis. Mais preferivelmente, pelo menos 80% das células (por número de células) são viáveis. Em uma configuração, a viabilidade é determinada imediatamente após o isolamento das células, isto é, antes da expansão.

[0032]. Em uma configuração preferida, a população celular não compreende qualquer célula perivascular. Um marcador de células perivasculares é o 3G5. Portanto, esta configuração pode alternativamente ser descrita de forma que a população celular não compreenda qualquer célula que expresse o marcador 3G5 e/ou qualquer célula que apresente o 3G5 em sua superfície.

[0033]. Em uma configuração preferida, a população celular não compreende qualquer célula epitelial. Um marcador de células epiteliais é a molécula de adesão de célula Epitelial (EpCAM). Portanto, esta configuração pode alternativamente ser descrita de forma que a população celular não compreenda qualquer célula que expresse o marcador EpCAM e/ou qualquer célula que apresente a EpCAM em sua superfície.

[0034]. Em uma configuração preferida, a população celular não compreende qualquer célula endotelial. Um marcador de células endoteliais é o CD31. Portanto, esta configuração pode alternativamente ser descrita de forma que a população celular não compreenda qualquer célula que expresse o marcador CD31 e/ou qualquer célula que apresente o CD31 em sua superfície.

[0035]. Preferivelmente, a população celular pode ser obtida por um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, particularmente quando a etapa (c), isto é, a etapa de expansão, é compreendida.

[0036]. Alternativamente, a célula de acordo com a presente invenção pode, portanto, ser descrita como uma população celular que pode ser obtida pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, compreendendo a etapa (c).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0037]. A descrição detalhada a seguir revela variantes específicas e/ou preferidas das características individuais da invenção. A presente invenção também contempla como configurações particularmente preferidas aquelas configurações que são geradas combinando-se duas ou mais das variantes específicas e/ou preferidas descritas para duas ou mais características da presente invenção.

[0038]. Uma pessoa com habilidade comum na técnica apreciará que a invenção descrita aqui é susceptível a variações e modificações que não sejam aquelas especificamente descritas. Dessa forma, ficará aparente para a pessoa com habilidade comum na técnica que a presente revelação inclui todas estas variações e modificações. A revelação também inclui todas as entidades, compostos, características, etapas, métodos ou composições referidas ou indicadas nesta especificação, individualmente ou coletivamente, e quaisquer e todas as combinações ou quaisquer duas ou mais das referidas entidades, compostos, características, etapas, métodos ou composições. Assim, a menos que especificamente declarado de outra forma neste documento ou que o contexto exija o contrário, a referência a uma única entidade, composto, característica, etapa, método ou composição englobará uma ou uma pluralidade (isto é, mais de uma, como duas ou mais, três ou mais ou todas) daquelas entidades, compostos, características, etapas, métodos ou composições.

[0039]. A presente revelação não é limitada no escopo pelas configurações específicas descritas aqui, que são apresentadas neste documento para propósitos de ilustração e de exemplificação. Entidades, compostos, características, etapas, métodos ou composições funcionalmente ou de outra forma equivalentes estão dentro do escopo da presente revelação.

[0040]. Cada um dos documentos mencionados aqui (incluindo todas as patentes, pedidos de patente, publicações científicas, especificações do fabricante, instruções, apresentações, etc.), seja acima ou abaixo, é incorporado neste documento como referência em sua totalidade. Nada neste documento deve ser interpretado como uma admissão de que a presente invenção não está autorizada a antedatar um ensinamento específico.

[0041]. Este documento deve ser lido com uma disposição de entender e com a melhor intenção objetiva de fazer sentido. Todos os termos utilizados neste documento devem ser lidos dando às palavras o significado e o escopo que eles normalmente têm na técnica relevante, a menos que em casos particulares este documento atribua a uma ou mais palavras um significado especial, por definição explícita ou de outra forma. Caso as definições apresentadas neste documento devam divergir parcialmente ou totalmente da definição em alguma ou em toda a literatura, as definições contidas neste documento devem prevalecer.

[0042]. A menos que declarado especificamente de outra forma ou que o contexto exija o contrário, cada configuração, aspecto e exemplo revelado aqui deve ser considerado aplicável, e combinável com qualquer outra configuração, aspecto ou exemplo revelado neste documento.

[0043]. A menos que especificamente definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos utilizados neste documento têm o mesmo significado que o comumente compreendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica (por exemplo, em genética, biologia molecular, expressão genética, biologia celular, cultura celular, células-tronco, células estromais, neonatologia, medicina regenerativa, anatomia, histologia, imunologia, imunohistoquímica, química de proteínas e bioquímica). Livros e artigos de revisão publicados, por exemplo, em inglês definem tipicamente o significado comumente compreendido por uma pessoa com habilidade comum na técnica.

[0044]. A expressão "e/ou", por exemplo, "X e/ou Y" deve ser compreendida significando "X e Y" ou "X ou Y" e deve-se considerar que apresenta revelação explícita de "e", de "ou" e de ambos os significados ("e" ou "ou").

[0045]. Conforme utilizados neste documento, a menos que especificado de outra forma, os termos “sobre”, “por volta de” e “substancialmente” todos significam aproximadamente ou quase, e no contexto de um valor ou faixa numérica estabelecido aqui designam +/- 10%, mais preferivelmente +/- 5%, com relação ao valor ou faixa numérica mencionado ou alegado. Termos como “substancialmente não”, “substancialmente ausente(s)” etc., com referência a uma característica de uma célula, significam que a respectiva característica não pode ser detectada em uma célula com métodos analíticos normalmente utilizados na respectiva área de acordo com o estado da técnica, e/ou que substancialmente todas as células de uma população assim descrita não têm a respectiva característica.

[0046]. A menos que expressamente especificado de outra forma, a palavra “compreender”, ou variações como “compreende” ou “compreendendo”, é utilizada no contexto do presente documento para indicar que membros adicionais podem, opcionalmente, estar presentes além dos membros da lista introduzida por “compreendendo”. Contempla-se, no entanto, como uma configuração específica da presente invenção que o termo “compreendendo” envolve a possibilidade de que nenhum membro adicional esteja presente, isto é, para o propósito desta configuração “compreendendo” deve ser compreendido como tendo o significado de “consistindo de”.

[0047]. A menos que seja expressamente especificado de outra forma, todas as indicações de quantidades relativas com relação à presente invenção são feitas com base no peso/peso. Indicações de quantidades relativas de um componente caracterizado por um termo genérico são utilizadas para se referir à quantidade total de todas as variantes ou membros específicos cobertos pelo referido termo genérico. Se um determinado componente definido por um termo genérico for especificado como presente em uma determinada quantidade relativa, e se este componente for caracterizado adicionalmente como sendo uma variante ou membro específico coberto pelo termo genérico, isto significa que nenhuma outra variante ou membro coberto pelo termo genérico está adicionalmente presente de forma que a quantidade relativa total de componentes cobertos pelo termo genérico exceda a quantidade relativa especificada; mais preferivelmente, nenhuma outra variante ou membro coberto pelo termo genérico está presente de alguma forma.

[0048]. O termo “alogênico”, conforme utilizado neste documento, descreve qualquer coisa que seja derivada de um indivíduo diferente da mesma espécie. Diz-se que dois ou mais indivíduos são alogênicos a outro quando os genes em um ou mais lócus não são idênticos.

[0049]. O termo “área” ou “área superficial” ou “área da superfície celular”, com relação a uma célula, se refere à área superficial das células vista de cima. No contexto da presente revelação, a área superficial bidimensional de uma célula é determinada enquanto a célula está em cultura aderente, isto é, a célula adere à placa de cultura. Considera-se vantajoso para a reprodutibilidade da determinação que as células estejam em um estado de baixa confluência porque se acredita que com baixa confluência as células não inibem significativamente umas à outras por inibição de contato. Os métodos para determinação da área superficial são indicados neste documento, abaixo.

[0050]. As expressões “área superficial média” e "área média" se referem à média das áreas superficiais de duas ou mais células individuais, onde em uma primeira etapa primeiro a área de cada célula individual é determinada conforme descrito acima e, então, em uma segunda etapa subsequente, a área média é determinada como a média aritmética das áreas de células individuais, conforme determinado na primeira etapa. Tipicamente, pelo menos 35 células são submetidas à primeira e à segunda etapa para determinação da área média; em outras palavras, a média representa a média de pelo menos 35 células.

[0051]. O termo “autólogo” é utilizado neste documento para descrever qualquer coisa que seja derivada do mesmo indivíduo. Como exemplo, “célula autóloga” se refere a uma célula derivada do mesmo indivíduo. A transplantação de células autólogas é, às vezes, considerada vantajosa porque ela supera a barreira imunológica que, de outra forma, resulta em rejeição. Uma célula é uma entidade biológica composta de citoplasma incluso dentro de uma membrana. Conforme utilizado aqui, o termo “célula” se refere, preferivelmente, a uma célula eucariótica. O termo “célula” pode se referir a uma célula-tronco ou a uma célula que carece de propriedades de célula-tronco, como uma célula terminalmente diferenciada ou até mesmo uma célula morta. Tipicamente, a célula é uma célula originária de um organismo multicelular ou de uma parte dele. Preferivelmente, a célula é isolada do referido organismo multicelular, isto é, não fisicamente conectada e/ou nutricionalmente independente do organismo multicelular a partir do qual ela se origina. Uma célula estromal é uma célula preferida de acordo com a invenção.

[0052]. Os termos “população celular” e “população de células” intercambiavelmente se referem a um conjunto de uma pluralidade de células. Na configuração mais estreita, uma população celular compreende duas células, mas mais tipicamente uma multiplicidade de células. O termo engloba ambas as populações de células essencialmente idênticas, como populações celulares originárias de uma única célula clonogênica, bem como de populações celulares heterogêneas, isto é, células que têm a mesma origem heterogênea e/ou que diferente umas das outras em pelo menos uma característica funcional ou estrutural. O termo engloba somente populações de células em suspensão, somente populações de células aderentes e populações mistas de células em suspensão e aderentes. Uma população celular pode compreender tanto células-tronco quanto células desprovidas de propriedades de células-tronco. Em outro, mas não mutuamente exclusivo exemplo, uma população celular compreende tanto células vivas quanto células mortas.

[0053]. A menos que o contexto determine o contrário, “CD”, tipicamente utilizado juntamente com um número (por exemplo, “CD34”), quer dizer, neste documento, “Cluster (grupamento) de Diferenciação”.

[0054]. O termo “clonogênico” se refere à capacidade de uma célula de se expandir, dando origem, dessa forma, a uma multiplicidade de células derivadas, que são normalmente genotipicamente idênticas. Uma célula “clonogênica” também pode ser chamada de “Unidade Formadora de Colônia”, ou “UFC”.

[0055]. O termo “colagenase”, conforme utilizado neste documento, se refere a uma enzima (E.C. 3.4.24.7) que é capaz de romper ligações peptídicas em colágeno. Em geral, a colagenase pode ajudar a destruir estruturas extracelulares. O termo não implica quaisquer limitações específicas sobre o tipo ou a origem da colagenase, a menos que especificado o contrário. A colagenase pode ser recombinante ou de sua fonte natural. Muitas colagenases comercialmente disponíveis compreendem outras atividades enzimáticas, além da E.C. 3.4.24.7. Estas colagenases comercialmente disponíveis são adequadas no contexto da presente invenção (veja os Exemplos).

[0056]. A expressão “confluência” é utilizada neste documento para descrever a proporção de superfície de fundo de um vaso de cultura que é coberto por células, tipicamente células aderentes. A confluência é, tipicamente, indicada como “% de confluência”.

[0057]. As expressões “% de confluência” ou “percentual de confluência” se referem ao percentual da superfície de fundo de uma placa de cultura que é coberta por células, tipicamente células aderentes, isto é, a soma da área total de células em relação à superfície de fundo da placa de cultura. Por exemplo, 50 por cento de confluência significa que substancialmente metade da superfície está coberta e que ainda há espaço para as células crescerem. 100 por cento de confluência significa que a superfície está totalmente coberta pelas células, e não há mais espaço para que as células cresçam como uma monocamada. No contexto da presente invenção, as células são tipicamente passadas antes de atingir 100 por cento de confluência a fim de manter de forma apropriada seu fenótipo de proliferação.

[0058]. A expressão “baixa confluência” significa um percentual de confluência de 50% ou menos, tipicamente de 10 a 50%. As expressões “subconfluente” e “subconfluência” significam um percentual de confluência de mais de 50%, mas não mais do que 80%.

[0059]. O termo “vaso de cultura” ou “vaso de cultura celular” geralmente se refere a um recipiente que é adequado para o cultivo de células de mamíferos. Recipientes de cultura típicos são frascos, placas e pilhas (onde as pilhas são tipicamente compostas de uma multiplicidade de placas empilhadas umas sobre as outras). Os recipientes de cultura particularmente adequados no contexto das presentes invenções são recipientes de cultura que permitem a aderência das células no fundo do vaso de cultura; estes recipientes são frascos, placas e pilhas com uma superfície de fundo planar.

[0060]. Com relação a um vaso de cultura, os termos “superfície” ou “superfície de fundo” são intercambiavelmente destinados a se referirem à superfície de fundo interna do vaso de cultura, isto é, aquela superfície à qual as células com propriedades aderentes normalmente irão aderir enquanto se desenvolvem naquele vaso de cultura. Normalmente, a referida superfície fica na parte inferior interna do vaso de cultura e é confinada exclusivamente pelas paredes laterais do vaso de cultura.

[0061]. O termo "densidade" ou "densidade celular” se refere ao número de células por área bidimensional, como, em particular, o número de células por cm2 de superfície de fundo do vaso de cultura celular, a menos que o contexto determine o contrário. Tipicamente, o termo é utilizado para descrever quantas células estão semeadas no vaso de cultura, por exemplo, no início de uma passagem particular. A superfície de fundo total do referido vaso de cultura e o número total de células semeadas naquele vaso de cultura, então, definem a densidade celular por cm2 do referido vaso de cultura no início da referida passagem. Na prática, o número de células utilizadas como inóculo no início de uma passagem (I) é adequadamente determinado por contagem celular antes do início da referida passagem; I é, portanto, uma função da densidade celular e da superfície de fundo da placa de cultura. A menos que seja explicitamente declarado de outra forma, “densidade celular” se refere à densidade celular média sobre toda a superfície de fundo do vaso de cultura; não obstante, prefere-se, na presente invenção que as células sejam uniformemente distribuídas por toda a superfície de fundo do vaso de cultura.

[0062]. O termo "diâmetro" ou “diâmetro celular”, com relação a uma célula, se refere ao maior diâmetro de uma célula vista de cima. No contexto do presente documento, o diâmetro de uma célula é determinado enquanto a célula está em cultura aderente, isto é, a célula adere à placa de cultura. É importante que as células estejam em um estado de subconfluência. A subconfluência é considerada vantajosa para a reprodutibilidade da determinação porque se acredita que as células subconfluentes substancialmente não inibem umas às outras por inibição de contato. Para a determinação do diâmetro, uma ou mais células são fotografadas ou de outra forma observadas ou registradas visualmente, tipicamente com um microscópio, da dimensão perpendicular (isto é, 90º) à superfície da placa de cultura à qual a célula ou as células aderem. Os limites da área são definidos manualmente em uma imagem gráfica (isto é, fotografia) da célula. Preferivelmente, o vaso de cultura não é agitado antes do registro da imagem gráfica. No caso de uma célula bipolar, o diâmetro é a distância entre os dois polos da célula. Para células multipolares, por exemplo, triangulares, o diâmetro é a distância entre aqueles dois polos da célula que estão mais longes um do outro. Em cada caso, “distância” significa a linha de conexão reta mais curta entre os dois respectivos polos.

[0063]. O termo “diâmetro médio” se refere à média dos diâmetros de duas ou mais células individuais, onde em uma primeira etapa o diâmetro de cada célula individual é determinado conforme descrito abaixo e, então, em uma etapa subsequente o diâmetro médio é determinado como a média aritmética do diâmetro da célula determinada na primeira etapa.

[0064]. Os termos “expandir” ou “expandindo”, conforme utilizados aqui, geralmente se referem à proliferação de uma célula ou de uma população de células. Tipicamente, a expansão dentro do contexto da presente invenção ocorre in vitro ou ex vivo. Tipicamente, a expansão é uma atividade ou processo subsequente ao isolamento das células. Tipicamente, durante a expansão o número total de células aumenta. O aumento do número de células pode ser descrito se referindo a “Duplicação(ões) cumulativa(s) da População" ou se referindo a "Número(s) de Passagem(ns) (“P”), ou indicando o número total de células no respectivo estágio, etc.

[0065]. Os termos “expressar”, “expresso” e “expressão”, “expressão genética” e termos semelhantes, conforme utilizados neste documento, se referem ao uso de informações de um gene na síntese de um produto genético funcional. A expressão genética compreende pelo menos a transcrição, e opcionalmente compreende uma ou mais características adicionais, opcionalmente selecionadas da lista aberta que compreende a edição, a tradução e a modificação pós-traducional do RNA. Quando a expressão genética é determinada, a presença de um produto de expressão, como RNA não editado ou editado, ou até mesmo a proteína codificada, é determinada. Os termos acima, utilizados em conexão com um determinado gene ou lócus, se destinam a especificar a expressão das informações genéticas daquele gene ou lócus; por exemplo, quando se diz que o APCDD1 é expresso, isto significa dizer que o gene APCDD1 é expresso.

[0066]. O termo “extrair”, conforme utilizado neste documento, se refere ao isolamento de um ambiente biológico. Dependendo do contexto, o termo pode significar “extrair” (verbo) ou a entidade física que foi extraída (por exemplo, uma célula ou uma população celular obtida por extração de seu ambiente natural). Por exemplo, quando as células são extraídas do cordão umbilical, as células são isoladas de sua localização original no cordão umbilical e/ou separadas de outras áreas anatômicas do cordão umbilical. Preferivelmente, uma célula extraída é uma célula fora de um corpo vivo e/ou fisicamente separada dos vasos sanguíneos e/ou fisicamente separada de outras células do mesmo órgão ou tecido e/ou fisicamente separada de áreas anatômicas não celulares do mesmo órgão ou tecido.

[0067]. Conforme utilizado neste documento, o termo "citometria de fluxo" se refere a uma tecnologia biofísica baseada em laser ou em impedância adequada para a contagem celular, classificação celular, análise de propriedades celulares, e detecção de biomarcadores (tal como, em particular, a detecção de moléculas da superfície celular, como as moléculas do Cluster de Diferenciação (CD)). A citometria de fluxo requer células em suspensão; a fim de analisar as células aderentes, estas precisam ser separadas do substrato, por exemplo, vaso de cultura, ao qual elas aderiram, por exemplo, por tratamento enzimático como a tripsinização, pela qual elas se tornam células em suspensão. As células em suspensão, isto é as células em uma corrente de fluido, são passadas através de um aparelho de detecção eletrônico (aparelho de citometria de fluxo). O aparelho de citometria de fluxo analisa a célula, por exemplo, com base na dispersão de luz específica de cada célula. Um aparelho de citometria de fluxo comercial pode ser utilizado, como o citômetro de fluxo FACSAria III (BD Biosciences). Os dados gerados pelos citômetros de fluxo podem ser representados em uma única dimensão, para produzir um histograma, ou em gráficos de pontos bidimensionais ou até mesmo em três dimensões. Os gráficos podem ser produzidos utilizando escalas de escolha como escalas lineares ou logarítmicas. As regiões nestes gráficos podem ser separadas sequencialmente, com base na intensidade da fluorescência, criando uma série de extrações por subconjunto, chamada de “regiões”.

[0068]. A “classificação celular ativada por fluorescência”, ou intercambiavelmente “FACS”, conforme utilizada neste documento, e um tipo especializado de citometria de fluxo. A FACS é um método utilizado para classificar uma mistura heterogênea de células biológicas em duas ou mais populações, com base na dispersão de luz específica e/ou nas características fluorescentes de cada célula. O tipo de fluoróforo utilizado como rótulo para a FACs não é particularmente limitado; em algumas configurações, os fluoróforos são ligados a um anticorpo que reconhece uma característica-alvo, como uma proteína de superfície celular (como, em particular, a detecção de moléculas da superfície celular, como as moléculas do Cluster de Diferenciação (CD)). Alternativamente, um fluoróforo pode ser ligado a uma entidade química com afinidade para a membrana celular ou outra estrutura celular. Cada fluoróforo apresenta uma excitação de pico e comprimento de onda de emissão característicos, que são detectados pelo aparelho adequado para FACS. Um aparelho comercial pode ser utilizado, como o citômetro de fluxo FACSAria III (BD Biosciences).

[0069]. O termo “heterólogo”, conforme utilizado aqui, descreve algo que consiste de múltiplos elementos diferentes. Por exemplo, a transferência de uma célula individual para um indivíduo diferente constitui um transplante heterólogo. Um gene heterólogo é um gene derivado de uma fonte que não seja o indivíduo.

[0070]. Os termos “imortal” e “imortalidade”, conforme utilizados neste documento, designam células que podem se dividir sem estar sujeitas ao limite de Hayflick (o limite de Hayflick é o ponto no qual as células não podem mais se dividir devido a danos no DNA ou telômeros encurtados). Células imortais tipicamente expressam a enzima alongadora de telômeros telomerase, mas esta não é uma exigência estrita.

[0071]. O termo “inóculo”, conforme utilizado neste documento, se refere ao número total de células pelas quais uma determinada cultura (passagem) é iniciada em um determinado vaso de cultura.

[0072]. “Isolado” significa que o material é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente o acompanham em seu estado nativo. Por exemplo, uma “célula isolada”, conforme utilizado aqui, se refere a uma célula, que foi purificada do ambiente celular e extracelular, como um tecido, que a envolve em um estado que ocorre naturalmente, por exemplo, uma célula estromal mesenquimal que foi removida do tecido do cordão umbilical que é normalmente adjacente à célula. Em uma descrição alternativa, uma “célula isolada” e/ou semelhante, conforme utilizado aqui, se refere ao isolamento in vitro e/ou purificação de uma célula a partir de seu ambiente celular natural, e da associação com outros componentes do tecido no qual a célula normalmente reside. A menos que o contexto determine o contrário, uma “célula isolada” não precisa necessariamente ser uma única célula desprovida de quaisquer outras células; ao contrário, mesmo uma população de duas ou mais célula, com uma multiplicidade de células, pode ser chamada de "isolada" quando a referida população de células é isolada no sentido de que esteja substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham esta população de células em seu estado nativo. Por exemplo, uma população de células estromais mesenquimais pode ser chamada de “isolada” quando ela foi removida do tecido original, como o cordão umbilical. De acordo com esta definição da palavra “isolada”, “isolar”, conforme utilizada aqui, é o verbo que descreve a atividade de obter material “isolado”, como, por exemplo, uma célula isolada.

[0073]. O termo “comprometida com a linhagem” conforme utilizado neste documento se refere a uma célula de descendência que é capaz de sofrer divisões mitóticas, mas tipicamente incapaz de sofrer um número ilimitado de divisões mitóticas. Eventualmente, a descendência de uma célula comprometida com a linhagem é determinada para diferenciar. Conforme utilizado neste documento, o termo “meio” significa se referir a uma mistura aquosa adequada para o cultivo de células, particularmente células de mamíferos. A mistura aquosa é tipicamente uma solução, muito embora suspensões e misturas coloidais também estejam compreendidas. O meio é tipicamente líquido, muito embora alguns meios também possam ser temporariamente congelados, por exemplo, para propósitos de armazenagem; em qualquer caso, um meio é utilizado para cultura celular quando está em estado líquido. Um meio pode ser um “meio basal”, que é uma mistura aquosa definida, ou um “meio de crescimento”, que é uma mistura aquosa compreendendo um meio basal e pelo menos um suplemento, e que geralmente tem capacidade para sustentar a viabilidade de células ex vivo, e opcionalmente a expansão de células, também ex vivo. A menos que expressamente especificado, o texto determina se se trata de um meio basal ou de crescimento. Um meio basal é preferivelmente um meio quimicamente definido. Um meio de crescimento preferivelmente compreende um meio basal (tipicamente 85% a 99,5% vol./vol.) mais pelo menos um suplemento derivado de humanos, derivado de animais ou derivados de plantas, como soro, lisado celular, ou particularmente no contexto da presente invenção, lisado de plaquetas.

[0074]. O termo “mesenquimal” é utilizado neste documento para se referir a uma célula que pertence a um tipo de célula mesenquimal, como uma célula adiposa, uma célula dos tecidos conjuntivos, osso, cartilagem, sangue, vasos linfáticos e vasos sanguíneos, bem como a uma célula estromal ou célula-tronco que seja capaz de se diferenciar em um tipo de célula mesenquimal. Sem desejar implicar quaisquer limitações na presente invenção, as células mesenquimais são às vezes pouco concentradas in vivo e fixadas em uma substância fundamental gelatinosa. Tipicamente, uma célula mesenquimal é de origem mesodérmica (mesoderma embrionário ou mesoderma extraembrionário). Em algumas configurações, uma célula mesenquimal é uma célula estromal (célula estromal mesenquimal) ou célula-tronco

(célula-tronco mesenquimal), ou uma célula derivada de quaisquer destas.

[0075]. O termo “célula estromal mesenquimal”, abreviada como "MSC", é utilizado neste documento para se referir a uma célula de origem mesenquimal, isto é, originária do estroma, como o tecido conjuntivo particularmente derivado do mesoderma. A origem tecidual de uma “célula estromal mesenquimal” não é adicionalmente limitada como tal; no entanto, de acordo com aspectos preferidos da presente invenção, uma "célula estromal mesenquimal" se origina do cordão umbilical, mais precisamente da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical, conforme descrito em detalhes neste documento. Uma célula estromal mesenquimal tipicamente expressa os marcadores de superfície CD105 e CD73, e normalmente também CD90. Preferivelmente, a "célula estromal mesenquimal" de acordo com a presente invenção é caracterizada pela expressão de CD105 (conhecido como endoglina), CD73 (conhecido como ecto 5' nucleotidase) e CD90 (também conhecido como Thy-1. As células estromais mesenquimais são caracterizadas por não expressarem substancialmente antígenos hematopoiéticos, como particularmente CD45, CD34, CD14, CD19, ou CD3. Tipicamente, as MSCs expressam moléculas do MHC Classe I in vitro, mas não moléculas de Classe II a menos que sejam estimuladas, por exemplo, por interferon, em cultura tecidual. Dessa forma, um fenótipo marcador de superfície típico de MSCs é CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34-CD14-, CD19-, CD3-, HLA DR-. Muito embora inequivocamente identificando as MSCs, o perfil deste marcador de superfície é complexo. Uma característica típica das MSCs é a capacidade de se diferenciar in vitro em uma variedade de tipos celulares, tipicamente incluindo osteoblastos, adipócitos e condroblastos. Tipicamente, as MSCs aderentes ao plástico in vitro. O termo “célula estromal mesenquimal” não requer inerentemente que a célula referida desta forma seja uma célula-tronco; no entanto, conforme descrito neste documento, as MSCs de acordo com a presente invenção, ou obtidas de acordo com a presente invenção, podem ter propriedades semelhantes às da célula-tronco em configurações preferidas.

[0076]. O termo “célula precursora de linhagem mesenquimal” se refere a uma célula estromal mesenquimal que tem a capacidade de se autorrenovar mantendo a multipotência e a capacidade de se diferenciar em diversos tipos de células de origem mesenquimal, por exemplo, osteoblastos, condrócitos, adipócitos, células estromais, fibroblastos e tendões, e, possivelmente, também células de origem não mesenquimal, por exemplo, células neurais e células epiteliais. O termo “célula precursora de linhagem mesenquimal” se refere, dessa forma, a uma célula capaz de se diferenciar em uma variedade de tipos de células, muito embora a célula seja multipotente (ao contrário de totipotente). Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, entende-se que uma “célula precursora de linhagem mesenquimal” é uma célula da linhagem mesodérmica. No entanto, a menos que especificado de outra forma ou que o contexto determine de outra forma, o termo “célula precursora de linhagem mesenquimal” não implica quaisquer limitações sobre a origem do tecido da respectiva célula. Dessa forma, em geral, as células chamadas “célula precursora de linhagem mesenquimal” não estão limitadas a uma origem tecidual particular e podem se originar, por exemplo, da medula óssea, cordão umbilical, sangue periférico adulto, tecido adiposo, osso trabecular e polpa dentária. De acordo com aspectos preferidos da presente invenção, a "célula precursora de linhagem mesenquimal" se original do cordão umbilical, mais precisamente da Geleia de Wharton do cordão umbilical, conforme descrito em detalhes neste documento. O termo “célula precursora de linhagem mesenquimal” inclui tanto células progenitoras e sua descendência não diferenciada. O termo “célula precursora de linhagem mesenquimal” também inclui células precursoras mesenquimais, células estromais multipotentes e células-tronco mesenquimais e sua descendência não diferenciada. De acordo com a presente invenção, prefere-se fortemente que uma “célula precursora de linhagem mesenquimal” seja uma célula-tronco, conforme definido neste documento, com a limitação de que a célula-tronco não é totipotente.

[0077]. Os termos “multi” e “múltiplo(a)” conforme utilizados neste documento significam uma multiplicidade, isto é qualquer número de dois ou mais.

[0078]. Conforme utilizado neste documento, “multipotente” se refere a uma célula capaz de Dara origem a quaisquer dos diversos tipos de células maduras. O termo “multipotente” abrange células progenitoras e toda a descendência de tais células que ainda é multipotente. O termo “multipotente” se refere a uma célula progenitora que tem potencial para se diferenciar em mais do que um tipo celular discreto. Sem desejar estar vinculado a uma teoria particular, entende-se que uma célula-tronco multipotente se encontra acima de uma hierarquia de linhagem e pode gerar múltiplos tipos de células diferenciadas. Sem limitação, células multipotentes podem ser encontradas no cordão umbilical, no tecido adiposo, em células cardíacas, na medula óssea e na polpa dentária. Em algumas configurações, as células multipotentes são pluripotentes.

[0079]. O termo "perivascular" ou "zona perivascular" ou "área perivascular", conforme utilizado neste documento, se refere a uma área ou zona física próxima de um vaso, como um vaso sanguíneo. A “zona perivascular” ou “área perivascular” é representada como item (5) na Figura 1. Em particular, zona/área perivascular do cordão umbilical (5) se refere a cada zona/área nas proximidades de cada vaso sanguíneo do cordão umbilical. A zona/área perivascular pode ser definida adequadamente como o espaço que se estende até 3 mm das paredes externas de cada um dos vasos do cordão umbilical (publicação WO 2004/072273 A1). Por meio de exemplo, a zona/área perivascular zona/área foi descrita por Takechi et al., 1993 (Placenta vol. 14; p. 235-245).

[0080]. O termo “lisado de plaquetas” se refere a uma preparação que pode ser obtida de plaquetas sanguíneas (também chamadas de trombócitos). As plaquetas podem ser obtidas de um doador, preferivelmente um doador humano, sejam isoladas de unidades coletadas do sangue total e agrupadas, ou coletadas por aférese de plaquetas: o sangue é coletado do doador e passado por um dispositivo que remove as plaquetas. Após o seu isolamento, as plaquetas, por exemplo, (re)suspensas em plasma, são tipicamente lisadas, por exemplo por um ou mais ciclo(s) de congelamento/descongelamento. O lisado de plaquetas está disponível a partir de um grande número de fornecedores comerciais, por exemplo, Macropharma (Mouvaux, França), de bancos de sangue clínicos, por exemplo, Banco de Sangue da Policlínica em Modena (Itália), mas também pode ser preparado diretamente a partir de plaquetas sanguíneas, conforme descrito, por exemplo, por Naaijkens et al., Cell Tissue Res., 2012, vol. 348, p. 119-130 e na publicação WO 2013/042095 A1.

[0081]. O termo “pluripotente”, conforme utilizado neste documento, se refere a uma célula que tem potencial para se diferenciar em quaisquer das três camadas germinativas (endoderma, mesoderma, ectoderma), mas não em células da linha germinativa. Tipicamente, uma célula pluripotente pode se diferenciar em todos os tipos de células de um organismo adulto, exceto células da linha germinativa. Em uma configuração, uma célula pluripotente é uma célula capaz de se diferenciar em quaisquer dos tipos de células do corpo de mamíferos – sem desejar estar vinculado a qualquer teoria, estes podem ser aproximadamente 260 tipos de células. Uma célula pluripotente pode ser autorrenovadora, e pode permanecer dormente ou quiescente dentro de um tecido. Uma célula pluripotente está em conformidade com todos os itens a seguir: (i) é capaz de proliferação em um estado não diferenciado, (ii) mantém um cariótipo normal durante cultura prolongada e (iii) mantém a capacidade de se diferenciar em quaisquer das três camadas germinativas (endoderma, mesoderma, ectoderma) mesmo depois de cultura prolongada.

[0082]. O termo “número de passagens”, abreviado por “P”, seguido por um número (por exemplo, “P1”), se refere ao número de vezes que uma cultura de células foi submetida a subculturas. Dessa forma, o termo “número de passagens” é um termo útil para descrever um status durante a expansão das células.

[0083]. O termo "Duplicação da População", abreviada como "PD", é utilizado neste documento para descrever se o número de células foi duplicado, por exemplo, em um intervalo de tempo a partir de um ponto de tempo inicial t0 até um ponto de tempo posterior t0+x. Neste caso, x designa o intervalo de tempo durante o qual o número de células duplicou. Por exemplo, t0 pode ser o ponto de tempo de isolamento primário, ou o ponto de tempo no qual uma determinada passagem foi iniciada. Assim, o termo “Duplicação da População” é um termo que se refere à expansão das células. O termo geralmente se refere à duplicação do número de células in vitro. A Duplicação da População (PD) é calculada pela fórmula: PD = log(N/N0)/log2 onde: N0 é o número de células semeadas e N é o número de células colhidas (Purpura et al., 2004, Stem Cells. Vol. 22, p. 39- 50).

[0084]. O termo “Duplicação cumulativa da População” é utilizado neste documento para se referir ao número total de vezes que as células de uma população celular se duplicaram in vitro, desde um determinado ponto de tempo, por exemplo, seu isolamento primário. Assim, também o termo “Duplicação cumulativa da População” é um termo que se refere à expansão das células, geralmente in vitro. Adequadamente, a DP cumulativa é determinada para cada passagem. O número da PD cumulativa é calculado pela fórmula: n = log(N/N0)/log2 + X onde: n = o número da PD cumulativa,

N0 = é o número de células semeadas (isto é, no início de uma passagem), N = o número de células colhidas (isto é, no final da referida passagem), X = o número da PD cumulativa no início da referida passagem.

[0085]. N0 é adequadamente determinado por contagem celular antes do início da referida passagem; N0 é uma função da densidade celular e da superfície de fundo da placa de cultura. N é adequadamente determinado pela contagem celular depois da separação, por exemplo, tripsinização, no final de uma passagem.

[0086]. A PD cumulativa é aditiva (assim, o X na fórmula acima); por exemplo, quando as células foram submetidas à PD cumulativa durante uma primeira passagem P1 e novamente à PD cumulativa durante uma segunda passagem subsequente P2, então, as células foram submetidas à 10 PDs cumulativas durante o curso total de P1 mais P2. Células frescamente isoladas têm uma PD cumulativa = 0 por definição. Assim, no início de P0, X = 0. Como às vezes é difícil determinar N0 antes de P0 (e consequentemente, para determinar n para P0), as Duplicações cumulativas da População são opcionalmente determinadas somente a partir de P1 em diante; no entanto, onde este for o caso, isto é especificamente indicado na presente revelação.

[0087]. É possível indicar a PD cumulativa como uma estimativa arredondada para o número inteiro mais próximo. Quando condições de cultura definidas forem utilizadas, então, é possível converter aritmeticamente o número de passagens em PD cumulativa, e vice-versa.

[0088]. O termo “célula progenitora” é utilizado neste documento para se referir a uma célula, que pode ser uma célula-tronco e/ou um descendente de uma célula-tronco. As progenitoras são tipicamente as descendentes das células-tronco, elas são apenas mais limitadas em sua diferenciação potencial ou capacidade de autorrenovação. As células progenitoras podem ser, por exemplo, multipotentes ou unipotentes.

[0089]. Os termos “secretar” ou “liberar”, quando utilizados neste documento em conexão com uma célula, geralmente se referem a qualquer material que seja externalizado da célula no ambiente externo. O referido material foi tipicamente produzido e/ou modificado pela célula, muito embora isto não seja uma exigência. Por exemplo, algumas células secretam proteínas e/ou moléculas reguladoras como hormônios, prostaglandinas e neurotransmissores, e/ou microvesículas e/ou exossomos, em seu respectivo ambiente externo. Por exemplo,

uma prostaglandina produzida por uma célula pode ser externalizada no ambiente da célula. Os referidos termos, conforme utilizados neste documento, não são nem limitados à secreção in vivo/ambiente in vitro, a menos que o contexto determine o contrário.

[0090]. O termo “volume celular” ou simplesmente “volume”, com relação a uma célula, se refere ao volume celular conforme determinável por citometria de fluxo, em particular, análise de FACS, mais particularmente pela determinação de dispersão frontal da luz (FSC). No contexto da presente revelação, o volume de uma célula é determinado enquanto a célula, por exemplo, uma célula separada, como uma célula tripsinizada (após cultura aderente) ou uma célula liberada pela colagenase (após isolamento do tecido), estiver em suspensão, isto é a célula não adere a uma placa de cultura ou a um tecido. A determinação de SSC e, opcionalmente, do volume celular é descrita neste documento a seguir.

[0091]. O termo “volume médio” ou “volume celular médio” se refere à média do volume de duas ou mais células individuais, onde em uma primeira etapa o volume de cada célula individual é determinado por citometria de fluxo conforme descrito neste documento e, então, em uma segunda etapa subsequente o volume médio é determinado pela média aritmética do volume celular de células individuais, conforme determinado na primeira etapa. Tipicamente, pelo menos 1.000 células são submetidas à primeira e à segunda etapa para determinação do volume celular médio; em outras palavras, a média representa a média de pelo menos 1.000 células.

[0092]. O termo “célula-tronco” é utilizado neste documento para se referir a uma célula eucariocítica capaz de dar origem a células derivadas fenotipicamente e genotipicamente idênticas (“autorrenovação”) bem comoa pelo menos outro tipo de célula final (por exemplo, células diferenciais terminais). O termo “célula-tronco” se refere a uma célula que pode ser totipotente, pluripotente ou multipotente, bem como a uma célula progenitora e/ou precursora derivada de sua diferenciação e/ou a uma célula de descendência comprometida com a linhagem. Em geral, o termo “célula- tronco" pode se referir a uma célula-tronco adulta ou a uma célula-tronco embrionária. O termo “célula-tronco” pode se referir opcionalmente a uma célula-tronco induzida, como uma célula-tronco pluripotente induzida, mas mais preferivelmente se refere a uma célula que não tenha sido induzida.

[0093]. Os termos “similaridade com a célula-tronco” ou “propriedade semelhante à da célula-tronco”/”propriedades semelhantes às da célula-tronco” são utilizados intercambiavelmente para designar a propriedade de uma célula, em particular a capacidade de autorrenovação e a capacidade gerar células diferenciadas. Mais explicitamente, células que apresentam propriedades semelhantes às da célula- tronco podem gerar células derivadas idênticas às suas células progenitoras (autorrenovação), bem como produzir descendência com potencial mais restrito, como células diferenciadas. As células com propriedades semelhantes às da célula-tronco são caracterizadas por um determinado grau de potência, isto é, potencial para produzir descendência diferenciada. Algumas células com propriedades semelhantes às da célula-tronco podem ser capazes de gerar múltiplos tipos de células diferenciadas (por exemplo, "multipotentes" ou "pluripotentes"), enquanto outras podem ser capazes de produzir um tipo de célula diferenciada ("unipotente"). Muito embora células com propriedades semelhantes às da célula-tronco tenham a capacidade de se autorrenovar, a maioria das células somáticas, incluindo aquelas com propriedades semelhantes às da célula-tronco, quando submetidas à cultura in vitro são capazes de se expandir por um número finito de duplicações cumulativas da população antes da parada da replicação ou senescência. Em configurações preferidas, as células estromais mesenquimais de acordo com a presente revelação são células estromais mesenquimais com propriedades semelhantes às da célula-tronco.

[0094]. Em geral, o “estroma” é a parte de um tecido ou órgão humano ou animal que tem uma função no suporte mecânico do tecido, como proporcionar suporte conectivo, estrutural, e/ou (preferivelmente e) no suporte funcional do tecido. Dessa forma, dentro do corpo vivo, o estroma é a estrutura conectiva, funcionalmente suportiva de um tecido biológico, ou órgão (ao contrário do parênquima que é o aspecto funcional de um tecido). O termo “estroma” conforme utilizado neste documento, se refere às células do tecido conjuntivo de qualquer órgão, por exemplo, sem limitação, no cordão umbilical, na mucosa uterina (endométrio), próstata, medula óssea, linfonodo e ovário. No respectivo órgão, o estroma é entendido por apoiar a função das células parenquimais daquele órgão. Dessa forma, o estroma consiste em todas as partes que não realizam as funções específicas do órgão, por exemplo, tecido conjuntivo, vasos sanguíneos, nervos, dutos, etc. Assim, o estroma do cordão umbilical é uma matriz que compreende o cordão umbilical, exceto os vasos, a área perivascular e os epitélios amnióticos. O termo estroma pode se referir ao estroma de um órgão inteiro ou a uma área anatômica específica dele. Em particular, o termo estroma pode se referir ao estroma do cordão umbilical em sua totalidade ou a uma área anatômica específica dele, isto é, o estroma contido em uma seção específica do cordão umbilical.

[0095]. O termo “estromal” conforme utilizado neste documento se refere a qualquer coisa presente no estroma ou derivado do estroma. O termo não é limitado à localização do material “estromal” (por exemplo, célula estromal) que reside dentro do estroma, mas também se refere ao material (por exemplo, uma célula) que estava presente no estroma em um órgão de um corpo humano ou animal vivo, mas que foi subsequentemente extraído ou isolado do órgão de forma que não esteja mais presente em um órgão do corpo de um humano ou animal vivo. Em outras palavras, o termo “estromal” se refere à origem in vivo específica do material (por exemplo, uma célula), independente se o material (por exemplo, a célula) foi extraído ou isolado. O material (por exemplo, a célula) que foi extraído ou isolado do estroma também pode ser chamado aqui de “estroma-derivado”, “derivado do estroma”, ou de forma semelhante. Em algumas configurações preferidas da presente invenção, o material estromal (por exemplo, a célula estromal) é ou foi extraído ou isolado, de forma que não está, ou não mais está presente em um órgão do corpo de um humano ou animal vivo.

[0096]. Assim, uma “célula estromal” é uma célula biológica que está presente no estroma ou é derivada do estroma, isto é, extraída ou isolada, de forma que está, ou não mais está presente em um órgão do corpo de um humano ou animal vivo. Uma célula estromal está viva, a menos que especificado de outra forma, ou se o contexto determinar o contrário. Em muitos órgãos, fibroblastos e pericitos estão entre os tipos mais comuns de células estromais. Como um exemplo ilustrativo, uma célula estromal pode ser uma célula presente no estroma (por exemplo, o estroma do cordão umbilical) ou uma célula que foi isolada (por exemplo, extraída) - e opcionalmente expandida – do estroma (por exemplo, o estroma do cordão umbilical). As células estromais são tipicamente células não malignas.

[0097]. O termo “singênico” é utilizado neste documento para descrever qualquer coisa que seja derivada de indivíduos ou células que apresentam genótipos idênticos, como gêmeos idênticos ou animais da mesma cepa consanguínea, ou outras células.

[0098]. O termo “totipotente”, conforme utilizado neste documento, se refere a uma célula capaz de se dividir e produzir todas das células diferenciadas em um organismo. Tipicamente, uma célula totipotente é capaz de dar origem a um embrião completo. Em mamíferos, tipicamente somente o zigoto e os blastômeros subsequentes são totipotentes.

[0099]. O termo “cordão umbilical”, também chamado de “cordão naval” se refere ao conduíte entre um bebê recém-nascido e a placenta em animais placentários. Durante o desenvolvimento pré-natal, o cordão umbilical faz parte fisiologicamente e geneticamente do feto. Muito embora um cordão umbilical esteja presente ao longo da embriogênese, onde ele conecta a placenta com o embrião ou feto em desenvolvimento, na presente especificação o termo se refere especificamente ao cordão umbilical de um bebê que já tenha nascido. Em humanos, o cordão umbilical normalmente compreende três vasos sanguíneos, isto é, duas artérias (as artérias umbilicais) e uma veia (a veia umbilical). Os três vasos sanguíneos são tipicamente integrados na Geleia de Wharton. Nem a placenta nem partes dela, nem o recém- nascido, ou partes dele, fazem parte do cordão umbilical; aquele termo se refere exclusivamente ao conduíte.

[00100]. O termo “unipotente” se refere a uma célula com propriedades semelhantes às da célula tronco que só pode produzir um tipo de descendente diferenciado. Esta célula unipotente também pode ser chamada de célula progenitora.

[00101]. O termo “viável”, conforme utilizado neste documento, onde se referir a uma célula, significa que a célula é uma célula viva. As células vivas são tipicamente metabolicamente ativas. Muito embora diversos agentes corantes diferentes e fluorocromos possam ser utilizados para tingir células não viáveis, dá-se preferência neste documento à coloração com 7-aminoactinomicina D (7-AAD) A 7-AAD é um corante à impermeável membrana que é geralmente excluído das células viáveis. Ele se liga ao DNA de fita dupla intercalando-se entre os pares de base em regiões ricas em G-C. A 7-AAD pode ser excitada a 488 nm, por exemplo, com um laser de argônio, e emite fluorescência a um comprimento de onda máximo de 647 nm. Utilizando a 7-AAC, a viabilidade das células pode ser determinada por citometria de fluxo, em particular FACS (classificação celular ativada por fluorescência).

[00102]. O termo “vaso” (não deve ser confundido com um "vaso de cultura" - veja lá), conforme utilizado aqui, geralmente se refere a um tubo ou canal (como uma veia ou uma artéria) na qual o fluido corporal (como o sangue) é contido e transportado ou circulado. A menos que o contexto determine o contrário, o termo

"vaso" é utilizado neste documento também, especificamente, para se referir aos vasos do cordão umbilical. Em humanos e em muitos outros mamíferos, o cordão umbilical normalmente contém três vasos sanguíneos, isto é, uma veia, que carrega sangue oxigenado, rico em nutrientes in vivo para o feto, e duas artérias que in vivo carregam o sangue desoxigenado, empobrecido em nutrientes para fora; muito embora casos ocasionais tenham sido relatados onde apenas dois vasos (uma veia e uma artéria) estejam presentes no cordão umbilical.

[00103]. O termo “Geleia de Wharton”, abreviado como “WJ”, se refere a uma substância gelatinosa da placenta de origem animal que compreende células. Tipicamente, a Geleia de Wharton compreende células estromais, mais particularmente células estromais mesenquimais. Além disso, a Geleia de Wharton tipicamente compreende mucopolissacarídeos, como o ácido hialurônico e sulfato de condroitina, bem como água. Muito embora a Geleia de Wharton também tenha sido descrita no humor vítreo do globo ocular, prefere-se fortemente nesta especificação que a Geleia de Wharton faça parte do cordão umbilical de um animal placentário recém-nascido, preferivelmente um mamífero, como um humano. Neste caso, a Geleia de Wharton também pode ser referida como substantia gelatinea funiculi umbilicalis. Em outras palavras, prefere-se fortemente que a Geleia de Wharton, conforme utilizado neste documento seja de origem do cordão umbilical, ainda mais preferida originária do cordão umbilical humano. Conforme descrito a seguir, um cordão umbilical normalmente compreende Geleia de Wharton na área perivascular (5), na área intervascular (4) e na área subamniótica (1b).

[00104]. "Geleia de Wharton Perivascular" ou "PVWJ" ou "VPWJ" todos sinonimamente se referem à Geleia de Wharton de uma área anatômica específica do cordão umbilical, a saber, a área anatômica da Geleia de Wharton que está localizada próxima dos vasos do cordão umbilical (5). Para o caso de um cordão umbilical humano, que representa uma configuração preferida, a PVWJ está localizada na área que se estender da superfície externa do vaso 3,0 mm ou menos para fora (para revisar, veja Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630). Portanto, quando a área que está localizada dentro de 3,0 mm da parede externa dos vasos do cordão umbilical humano é totalmente removida, a zona Perivascular e, dessa forma, qualquer Geleia de Wharton perivascular compreendida lá, conforme o caso, é totalmente removida. Para propósito de ilustração, veja também a Figura 1. As abreviações "PVWJ" e "VPWJ" também são utilizadas neste documento sinonimamente para se referir às células que se originam da zona perivascular, incluindo a "Geleia de Wharton Perivascular", conforme o caso, por exemplo, nas legendas da Figura. As células estromais mesenquimais derivadas da Geleia de Wharton Perivascular (PVWJ) também podem ser chamadas de “células estromais mesenquimais derivadas da zona perivascular".

[00105]. O termo “estroma subamniótica” se refere à zona (1b) diretamente adjacente ao epitélio amniótico (1a) do cordão umbilical. No caso de um cordão umbilical humano, que representa uma configuração preferida, o estroma subamniótico está localizado na área que se estende da superfície interna do epitélio amniótico 3,0 mm ou menos para dentro.

[00106]. O termo “Geleia de Wharton subamniótica” se refere à Geleia de Wharton no estroma subamniótico (1b) diretamente adjacente ao epitélio amniótico (1a) do cordão umbilical. No caso de um cordão umbilical humano, que representa uma configuração preferida, a Geleia de Wharton subamniótica está localizada na área que se estende da superfície interna do epitélio amniótico 3,0 mm ou menos para dentro.

[00107]. O termo "Geleia de Wharton estromal", abreviada como "SWJ", conforme utilizado neste documento, se refere à Geleia de Wharton do cordão umbilical que exclui a área perivascular (4). Dessa forma, o termo "Geleia de Wharton estromal" não inclui a área perivascular (4) e consequentemente não inclui células da área perivascular (4). Embora tenha havido algum debate na técnica sobre se a área perivascular compreende ou não células estromais mesenquimais, este debate não é crítico para a presente invenção, pelo menos porque a presente invenção não contempla o isolamento de células estromais mesenquimais da área perivascular, pelo menos pelo motivo de que a área perivascular não é uma fonte de células de acordo com a presente invenção. A menos que seja explicitamente declarado o contrário, o estroma subamniótico (1b) é compreendido no estroma referido neste documento. A menos que seja explicitamente declarado o contrário, a Geleia de Wharton subamniótica está compreendida na Geleia de Wharton referida como “Geleia de Wharton estromal” neste documento. A Geleia de Wharton subamniótica está compreendida no estroma subamniótico. A abreviação "SWJ" também é utilizada aqui para se referir às células originárias da “Geleia de Wharton estromal”, por exemplo, nas legendas da Figura. Dessa forma, com referência à Figura 1, o estroma (e, assim, a origem da Geleia de Wharton) em sua definição mais ampla, compreende todas aquelas áreas do cordão umbilical que não faz parte de quaisquer dos itens a seguir: (1a) camada amniótica (ou epitelial); (2) veia umbilical; (3) artérias umbilicais; (5) área perivascular; (7): sangue do cordão umbilical. Em outras palavras, nesta definição mais ampla, o estroma (e dessa forma a origem da Geleia de Wharton) compreende (6) a Geleia de Wharton no lúmen do cordão umbilical mais (1b) a camada subamniótica (ou mesenquimal); mais (4) a área intervascular. Preferivelmente, a menos que seja explicitamente declarado o contrário, a Geleia de Wharton subamniótica (1b) está compreendida na Geleia de Wharton referida como “Geleia de Wharton estromal” neste documento. Preferivelmente, (4) a área intervascular está compreendida na Geleia de Wharton referida como “Geleia de Wharton estromal” neste documento. Dessa forma, o estroma (e, assim, a origem da Geleia de Wharton) em sua definição mais ampla, compreende todas aquelas áreas do cordão umbilical que estão esquematicamente descritas como 1b, 4 e 6 na Figura 1. Caso as definições anatômicas apresentadas neste documento com relação ao cordão umbilical devam divergir parcialmente ou totalmente da definição em alguma ou em toda a literatura, as definições contidas neste documento devem prevalecer.

[00108]. Propôs-se na literatura (Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630) que, a partir de uma perspectiva pragmática, somente (1a) o revestimento do cordão e (5) a Geleia de Wharton perivascular que podem ser distintamente dissecadas a partir das regiões ou zonas remanescentes. A presente invenção contempla, em uma configuração, aquela dissecação distinta, isto é, a separação da Geleia de Wharton estromal do (1a) revestimento do cordão e (5) da zona perivascular, incluindo a Geleia de Wharton perivascular.

[00109]. A presente invenção é baseada em diversos achados, que são inter-relacionados e, dessa forma, juntos levam os inventores a alcançar os vários aspectos da invenção, que serão descritos individualmente a seguir. Portanto, os aspectos descritos nesta especificação são todos combináveis uns com os outros, mesmo se não estiverem explicitamente descritos, a menos que o contexto claramente determine o contrário. Todos os aspectos da presente invenção são baseados, entre outras coisas no achado de que a Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical contém células com propriedades exclusivas em um estado competente particularmente de expansão, e que um procedimento de isolamento específico confiavelmente apresenta estas células estromais potencialmente multipotentes de forma que elas possam ser mantidas e expandidas em cultura.

[00110]. Nenhum embrião humano está, ou foi, destruído no contexto da presente invenção. Em particular, nem o método nem a célula nem a população celular da presente invenção requer a destruição de um embrião humano. Método para obter uma célula estromal mesenquimal

[00111]. Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um método para obter uma célula estromal mesenquimal. O método compreende (a) isolar a Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela, e (b) submeter a Geleia de Wharton estromal ou sua fração a tratamento enzimático liberando, dessa forma, pelo menos uma célula da Geleia de Wharton estromal ou de sua fração.

[00112]. Em particular, com referência à Figura 1, que representa um corte transversal do cordão umbilical (humano) e uma vista esquemática das seções (áreas anatômicas) do cordão umbilical (humano), o método pode ser descrito como: um método para obter uma célula estromal mesenquimal, onde o método compreende (a) isolar a Geleia de Wharton estromal (1b, 4, 6) ou uma fração dela, e (b) submeter a referida Geleia de Wharton estromal ou sua fração a tratamento enzimático liberando, dessa forma, pelo menos uma célula da Geleia de Wharton estromal ou de sua fração.

[00113]. A célula obtida depois da etapa (b) pode ser pluripotente, ou mais tipicamente, multipotente. Etapas adicionais são opcionalmente, mas preferivelmente compreendidas, em particular uma etapa de expansão, que é descrita em detalhes abaixo.

[00114]. No método da presente invenção, a Geleia de Wharton é isolada de um cordão umbilical. Isto representa uma mudança de paradigma com relação à tendência geral na técnica de acordo com a qual células estromais mesenquimais (MSCs) derivadas da medula óssea (BM) representam a população mais extensivamente estudada de MSCs adultas e são consideradas o padrão de ouro para aplicações à base de MSC (por exemplo, Batsali et al., Blood, 2013 vol. 122, p. 1212). No entanto, a aspiração de medula óssea é geralmente invasiva e dolorosa. Uma grande vantagem do método de acordo com a presente invenção em relação ao isolamento a partir da medula óssea (BM) é que o cordão umbilical já está disponível no nascimento de um mamífero, ao passo que a cirurgia necessária para obter medula óssea é geralmente invasiva e dolorosa. Pacientes, doadores e profissionais de saúde são, portanto, relutantes ao uso de MSCs derivadas da medula óssea, e provavelmente seriam ainda mais se apenas alternativas confiáveis estivessem disponíveis.

[00115]. Assim, é uma vantagem do método de acordo com a presente invenção que o método seja um método ex vivo. Preferivelmente, a invasão no corpo de um humano ou animal vivo é completamente evitada. Dessa forma, o método da presente invenção preferivelmente não representa um método para o tratamento do corpo humano ou animal por cirurgia ou terapia. Assim, aspectos de dor, aspectos de manuseio e aspectos éticos são tratados com sucesso, em comparação com o isolamento da medula óssea conforme descrito na literatura.

[00116]. Uma diferença importante adicional com relação a diversos estudos e relatos anteriores é que, de acordo com a técnica anterior as MSCs podem ser eficientemente isoladas do tecido conjuntivo adjacente aos vasos do cordão umbilical (por exemplo, Batsali et al., Blood, 2013 vol. 122, p. 1212), ao passo que a presente invenção se baseia no isolamento de MSCs da área que exclui a zona perivascular, e, dessa forma, a Geleia de Wharton perivascular. Assim, os inventores da presente invenção desvendaram que uma área anatômica específica do cordão umbilical deve ser propositalmente selecionada a fim de alcançar as vantagens descritas neste documento. Mais especificamente, o método de acordo com a presente invenção é caracterizado por uma área anatômica específica de origem de células e/ou de um seccionamento específico e segmentação do cordão umbilical e/ou de uma etapa de isolamento específica e/ou opcionalmente uma etapa de expansão específica, todos descritos detalhadamente neste documento a seguir e ilustradas pelos exemplos. É importante que configurações preferidas e/ou opcionais e detalhes da área anatômica específica de origem das células, seccionamento específico e segmentação do cordão umbilical, etapa de isolamento específica e etapa de expansão específica opcional sejam combináveis umas com as outras de acordo com a presente invenção em cada e em toda combinação, a menos que contexto claramente ensine que uma determinada combinação não é possível ou não é desejada de acordo com a presente invenção.

[00117]. No método da presente invenção, um rápido isolamento de células estromais do cordão umbilical é vantajoso. Em uma configuração preferida, as etapas (a) e (b) juntas são realizadas em um tempo total de menos de 6 horas, mais preferivelmente de menos de 5 horas, mais preferivelmente de menos de 4 horas e mais preferivelmente de menos de 3 horas. Menos de 3 horas inclui intervalos de tempo de 0,5 a 2,5 horas e de 1 a 2 horas. Fica evidente que uma duração curta das etapas (a) e (b) juntas também significa que o intervalo de tempo de duração da etapa (b) propriamente dita é curto.

[00118]. A menos que especificado de outra forma, todos os reagentes, ingredientes, vasos de cultura, recipientes e materiais que entram em contato direto ou indireto com as células são, preferivelmente, estéreis, e, mais preferivelmente de grau BPF.

[00119]. Uma descrição detalhada do método e de suas configurações é apresentada a seguir. Origem do tecido

[00120]. A primeira etapa do método de acordo com o método da invenção é a etapa (a) caracterizada pelo isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela de um cordão umbilical. A etapa (a) é preferivelmente uma etapa mecânica, isto é, ela não se baseia normalmente em etapas químicas ou enzimáticas para propósitos de isolamento. Dessa forma, em uma configuração preferida, a etapa (a) significa nenhum ingrediente com atividade enzimática é adicionado durante a etapa (a). Conforme será descrito adicionalmente abaixo, o tratamento enzimático é, no entanto, importante para a etapa subsequente (b).

[00121]. A palavra "fração", quando utilizada em conexão com a Geleia de Wharton estromal, não é particularmente limitada e geralmente significa que, em algumas configurações, menos de 100% da Geleia de Wharton estromal total de um cordão umbilical pode ser utilizado no método da invenção. Por exemplo, 10 a 99%, como 20 a 90%, 30 a 80%, 40 a 60%, da Geleia de Wharton estromal total podem ser utilizados em algumas configurações. Os motivos para utilizar menos de 100%, em algumas configurações, podem ser variados e podem ser devidos a limitações experimentais na recuperação de 100% da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical, ou propositalmente, por exemplo, quando se deseja utilizar parte da Geleia de Wharton estromal para experimentos comparativos. No entanto, é preferivelmente desejado utilizar uma fração maior possível, isto é, 80% ou mais, da Geleia de Wharton estromal, preferivelmente 90% ou mais. Os valores %, a menos que indicado de outra forma, se referem ao % do volume total de Geleia de Wharton estromal contido em um cordão umbilical.

[00122]. Dessa forma, de acordo com a presente invenção, as células são isoladas do cordão umbilical. O cordão umbilical é originário de animal placentário, mas, preferivelmente, o cordão umbilical é de origem de mamífero. Em mamíferos placentários, o cordão umbilical é uma estrutura que conecta a placenta ao feto em desenvolvimento, e imediatamente após o nascimento ao bebê recém-nascido. Nem a placenta e nem o bebê-recém-nascido fazem parte do cordão umbilical; o cordão umbilical está confinado ao tubo conectivo entre a placenta e o bebê recém-nascido.

[00123]. O cordão umbilical é obtido depois do nascimento. Preferivelmente, o cordão umbilical é obtido 24 horas depois do nascimento ou menos, como 12 horas ou menos depois do nascimento, 6 horas ou menos depois do nascimento, 3 horas ou menos depois do nascimento, como 2 horas ou menos depois do nascimento e, preferivelmente, 1 hora ou menos depois do nascimento. Assim, o cordão umbilical pode ser armazenado, preferivelmente por um máximo de 24 horas depois do nascimento, preferivelmente em baixas temperaturas de 0 a 10°C, preferivelmente de 2 a 8°C, antes do isolamento das células. No entanto, o cordão umbilical não é congelado antes do isolamento de células. Opcionalmente, o cordão umbilical é enxaguado com água estéril ou com solução aquosa tamponada estéril antes do isolamento das células.

[00124]. O cordão umbilical é preferivelmente mantido e manuseado sob condições estéreis antes e durante o isolamento das células. Opcionalmente, o cordão umbilical pode ser adicionalmente esterilizado na superfície por meio de um breve tratamento superficial do cordão com, por exemplo, uma solução aquosa (70% vol./vol. de etanol) ou betadina, seguido por um enxágue com água estéril.

[00125]. Preferivelmente, as células são isoladas de um cordão umbilical humano. O cordão umbilical (UC) humano a termo pesa aproximadamente 40 g e apresenta um diâmetro médio por volta de 1,5 cm (Raio et al., 1999, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 83; p. 131-135). Dessa forma, preferivelmente, o cordão umbilical utilizado de acordo com a presente invenção é um cordão umbilical humano. Um cordão umbilical humano submetido ao método da presente invenção apresenta, preferivelmente, um comprimento aproximado de 40-65 cm, como de 44 a 51 cm.

[00126]. Tipicamente, o cordão umbilical é isolado após o nascimento de um recém-nascido saudável de uma mãe saudável, preferivelmente de uma mãe humana. Preferivelmente, a referida mãe tenha se abstido de fumar, consumir álcool e consumir produtos farmacêuticos psicoativos durante pelo menos um mês antes de dar à luz.

[00127]. Quando se diz que a Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela é isolada de um cordão umbilical, isto preferivelmente significa que mais de um cordão umbilical é utilizado como material de partida. No entanto, também é possível que mais de um cordão umbilical seja utilizado como material de partida. Em uma configuração, um cordão umbilical é utilizado como material de partida no método de acordo com a presente invenção. Naquela configuração, todo material de partida é autólogo, isto é, nenhum material alogênico do cordão umbilical faz parte do material de partida e, consequentemente, todas as células obtidas pelo método da presente invenção são originárias de um único doador, por cada ciclo do método.

[00128]. É possível utilizar um cordão umbilical completo como material de partida, mas, é igualmente possível utilizar uma fração de um cordão umbilical como material de partida. Quando todo cordão umbilical é utilizado como material de partida no método de acordo com a presente invenção, pode-se dizer que o método é executado em “escala completa”. Assim, o método de acordo com um aspecto preferido da presente invenção, compreendendo as etapas (a), (b) e opcionalmente (c), é chamado de ciclo de “escala completa” quando um cordão umbilical inteiro é utilizado como material de partida. Neste contexto, a palavra “completo” não exclui que partes menores do cordão, por exemplo, as duas extremidades do cordão, são cortadas ou separadas e, dessa forma, não incluídas como material de partida; ela também não exclui que o cordão umbilical é seccionado e/ou segmentado durante o método descrito neste documento; ela significa, ao invés disso, que essencialmente toda a quantidade de um cordão umbilical é utilizado como material de partida. No caso de um cordão umbilical humano de nascidos a termo, um cordão umbilical completo normalmente pesa entre 35 e 40 gramas, ou mais precisamente por volta de 40 gramas. Em uma configuração, um ciclo de escala completa começa com um cordão umbilical de 35 a 45 gramas de um único doador. A quantidade do material de partida, isto é, o cordão umbilical, tem, é claro, uma influência sobre a quantidade total de células obtidas durante as fases a jusante do método de acordo com a presente invenção. A menos que seja expressamente indicado o contrário, todas as quantidades (por exemplo, números de células) apresentadas neste documento se referem a um ciclo em escala completa. A palavra “escala completa” não está em conflito com o termo “fração” da Geleia de

Wharton estromal, uma vez que se faz um esforço razoável para recuperar o máximo de Geleia de Wharton estromal de um cordão umbilical possível.

[00129]. A camada mais externa do cordão umbilical (também chamada de revestimento do cordão, tecido do cordão ou membrana de revestimento do cordão umbilical, esquematicamente representada como 1a na Figura 1), não é uma fonte desejada de células no método da invenção. Como o cordão umbilical propriamente dito é uma extensão da placenta, a membrana de revestimento do cordão umbilical é uma extensão da membrana amniótica que cobre a placenta. A membrana de revestimento do cordão umbilical compreende duas camadas: a camada amniótica (ou epitelial) (também chamada de membrana de revestimento do cordão umbilical) e a cama subaminiótica (ou mesenquimal). O cordão umbilical humano, por exemplo, é coberto por uma única/múltipla(s) camada(s) de células epiteliais cúbicas escamosas (Copland et al., Placenta, 2002; vol. 23, p. 311-321; Mizoguchi et al., J. Dermatol. Sci., 2004, vol. 35, p. 199-206); não se deseja que estas células sejam isoladas no método da invenção. Em uma configuração do método da invenção, deseja-se que nem as células da camada amniótica e nem as células da camada subamniótica seja isoladas e, dessa forma, estas células não são utilizadas como material de partida na expansão opcional mais a jusante.

[00130]. A arquitetura do tecido interno do cordão umbilical é composta de duas artérias e uma veia e uma matriz adjacente de tecido conjuntivo mucoso (Geleia de Wharton estromal). Descreveu-se que a Geleia de Wharton compreende células semelhantes aos fibroblastos (Parry, 1970, J. Anatomy, vol. 107, p. 505-518) e, ocasionalmente, aos mastócitos. Além disso, a Geleia de Wharton compreende uma substância fundamental amorfa que é rica em proteoglicanos, principalmente ácido hialurônico.

[00131]. Preferivelmente o cordão umbilical utilizado no método de acordo com a presente invenção é de um nascimento a termo, também chamado de "termo completo". Mais precisamente, o cordão umbilical humano utilizado no método de acordo com a presente invenção é de um nascimento dentro de 38 a 42 semanas de gestação, mais preferivelmente dentro de 39 a 41 semanas de gestação. Em uma configuração, o cordão umbilical humano é de um nascimento natural (vaginal); em uma configuração alternativa, o cordão umbilical humano é de um nascimento não natural, por exemplo, Cesariana.

[00132]. Em uma configuração, a obtenção do cordão umbilical de um nascimento humano ou animal não faz parte da presente invenção. Naquela configuração, o método da invenção começa depois que o cordão umbilical foi obtido. Em outras palavras, o método da invenção é, então, praticado utilizando um cordão umbilical como material de partida que foi obtido antes da etapa (a). Segmentação do cordão umbilical

[00133]. Adicionalmente, os inventores desvendaram que é vantajoso dissecar o cordão umbilical mecanicamente, conforme descrito neste documento. A dissecação preferivelmente compreende segmentação e seccionamento, ambas conforme descrito neste documento.

[00134]. Em uma primeira etapa, é vantajoso segmentar o cordão umbilical, conforme descrito neste documento. A segmentação é opcional, mas preferível. Em particular, a segmentação torna as etapas subsequentes mais fáceis de realizar e reproduzir confiavelmente. Além disso, a segmentação melhora a eficiência do isolamento da Geleia de Wharton estromal na etapa subsequente de seccionamento. Dessa forma, a segmentação preferivelmente ocorre antes da etapa de seccionamento do cordão umbilical descrita abaixo (segmentos).

[00135]. A segmentação de acordo com a presente invenção é normalmente alcançada por meios físicos, como uma tesoura ou um bisturi. Ao segmentar o cordão, são obtidos segmentos de cordão (para ver a ilustração, consulte, por exemplo, o Exemplo 1). O termo segmentos é utilizado neste documento para se referir a tais cortes do cordão. Preferivelmente, a segmentação é perpendicular ao cordão. Perpendicular, conforme utilizado neste documento, com relação ao cordão umbilical, significa que a direção do corte do cordão umbilical tem um ângulo de aproximadamente 90º com relação à direção do cordão. Para a determinação do ângulo, o cordão é preferivelmente colocado esticado, isto é, sem ondulações ou curvas. Aproximadamente 90° significa 75° a 105°, preferivelmente 80° a 100°, mais preferivelmente 85° a 95°. Um artesão com habilidade será capaz de cortar o cordão perpendicular também na ausência de um dispositivo para medir o ângulo, com base em sua experiência. Não obstante, um dispositivo pode ser utilizado se desejado, para determinar o ângulo.

[00136]. Mais preferivelmente, os segmentos perpendiculares apresentam, cada um, preferivelmente, um comprimento de aproximadamente 1 a aproximadamente

4 cm, preferivelmente de 2 a aproximadamente 3 cm, e mais preferivelmente de aproximadamente 2,5 cm. Em uma configuração preferida, o(s) segmento(s) de vasos é/são removido(s) do(s) segmento(s) do cordão umbilical antes da etapa (b). Em particular, é preferível remover os vasos, ou mais precisamente segmentos de vasos, depois da – preferivelmente perpendicular - segmentação do cordão umbilical.

[00137]. A segmentação é opcional, mas vantajosa e, dessa forma, preferivelmente, faz parte do método da invenção. A segmentação é preferivelmente realizada sob condições estéreis. Seccionamento a fim de obter Geleia de Wharton estromal

[00138]. Em geral, o cordão umbilical de mamíferos, e em particular o cordão umbilical humano, mostra uma compartimentalização tecidual na qual as características celulares e os elementos da matriz extracelular diferem uns dos outros. Pelo menos seis zonas ou seções distintas foram descritas, com base em estudos estruturais e funcionais (veja, também, a Figura 1): aqui listadas na ordem de fora para dentro, ao passo que os números se referem aos números na Figura 1: revestimento do cordão (compreendendo o epitélio amniótico e células subaminióticas) (1), estroma (intervascular) (chamado classicamente de Geleia de Wharton estromal), estroma intervascular (4), estroma perivascular (5), vasos (2 e 3), estroma subaminiótico (1b), fissuras (não ilustradas).

[00139]. No estado da técnica considerou-se que, dada a hipótese de que as células perivasculares normalmente migram das proximidades da vasculatura, a maioria das MSCs da Geleia de Wharton se originam da região perivascular (Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol., 6, p. 1620-1630).

[00140]. Os inventores, no entanto, chegaram ao surpreendente achado de que uma abordagem seccional é vantajosa ao visar a extração de MSCs do UC, e que a seção que abriga as MSCs com propriedades superiores é a Geleia de Wharton estromal. Surpreendentemente, os inventores desvendaram que as células derivadas da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela apresentam propriedades superiores. Portanto, é uma etapa essencial do método da presente invenção que a Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela seja isolada.

[00141]. Antes do isolamento da Geleia de Wharton estromal é importante enxaguar o cordão, ou particularmente os segmentos do cordão. Uma solução aquosa é adequada para enxágue, de preferência tamponada com pH fisiológico ou quase fisiológico e isotônico, opcionalmente suplementado com antibióticos. Por exemplo, Solução Salina Tamponada com HEPES (HBSS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), preferivelmente HBSS suplementada com 300 µg/ml de gentamicina e 0,15 µg/ml de anfotericina B é adequada. O tempo de enxágue típico pode ser preferivelmente de 1 a 30 minutos, preferivelmente de aproximadamente 10 minutos. Durante este tempo, um movimento mecânico, por exemplo, agitação, é empregado a fim de expor adequadamente o cordão umbilical, ou preferivelmente segmentos do cordão umbilical, à solução aquosa de enxágue. Particularmente depois que o cordão tiver sido segmentado, o enxágue é importante porque dessa forma, restos de sangue nas interfaces dos segmentos resultantes da segmentação podem ser removidos.

[00142]. Então, para o isolamento da Geleia de Wharton estromal, preferivelmente, o cordão umbilical, ou mais preferivelmente o(s) segmento(s) do cordão umbilical é/são submetido(s) ao seccionamento, conforme descrito neste documento. Assim, a Geleia de Wharton estromal desejada é obtida. Outras maneiras de obter Geleia de Wharton estromal são adequadas com uma alternativa ao seccionamento descrito neste documento, e também fazem parte da presente invenção. No entanto, preferivelmente, a Geleia de Wharton estromal é obtida pela abordagem de seccionamento descrita neste documento.

[00143]. O propósito de isolar a Geleia de Wharton desejada, a abertura lateral do cordão umbilical, ou de segmento(s) do cordão umbilical, comprovou ser vantajoso. Preferivelmente, o cordão umbilical ou o(s) segmento(s) do cordão umbilical é/são incisados longitudinalmente, por exemplo, com um bisturi. Longitudinalmente significa em paralelo à extensão do cordão. Uma incisão longitudinal por segmento é preferida ao invés de múltiplas incisões. A abertura lateral, ou mais especificamente a incisão longitudinal, permite que as várias seções do cordão umbilical possam ser subsequentemente e eficientemente separadas, em particular a Geleia de Wharton estromal pode ser isolada, conforme descrito a seguir.

[00144]. Conforme descrito em detalhes aqui e ilustrado nos exemplos deste documento, as células da Geleia de Wharton estromal comprovaram ser altamente vantajosas. Dessa forma, a Geleia de Wharton a ser seccionada e selecionada para processamento a jusante na presente invenção exclui a zona perivascular, e, assim, exclui qualquer Geleia de Wharton perivascular. Em outras palavras, a Geleia de Wharton a ser seccionada e selecionada para processamento a jusante é a Geleia de Wharton estromal.

O achado de que as células da Geleia de Wharton estromal isoladas de acordo com a presente invenção são superiores é um achado surpreendente dos presentes inventores.

Havia-se estabelecido anteriormente por imunohistoquímica estrutural fina (por exemplo, Akerman et al., Gynecol.

Endocrinol., 2002, vol. 16, p. 299-306 e Karahuseyinoglu et al., Stem Cells, 2007, vol. 25, p. 319-331) e estudos funcionais in vitro (Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229; Karahuseyinoglu et al., Stem Cells, 2007, vol. 25, p. 319-331) que existem diferenças no número e na natureza de células entre as áreas subamniótica (1b), intervascular (4), e perivascular (5), e que a densidade das células em um determinado espaço difere entre as áreas subamniótica, intervascular, e perivascular: a densidade celular é consideravelmente baixa nas regiões subamnióticas, ao passo que as áreas perivasculares possuem a mais elevada densidade celular (Takechi et al., 1993, Placenta; vol. 14, p. 235-245; Karahuseyinoglu et al., 2007, Stem Cells, vol. 25, p. 319 -331). Observe que neste parágrafo o termo “densidade celular” é utilizado de forma não convencional com relação a um espaço tridimensional, ao passo que o termo é utilizado com relação a uma área bidimensional no resto da revelação.

Por exemplo, em estudos anteriores, amostras aderentes à serosa e aderentes aos vasos propuseram uma fonte de células estromais derivadas do cordão umbilical (por exemplo, no processo de patente US2004/0136967 A1). Muito embora se soubesse anteriormente que as células podem ser isoladas da Geleia de Wharton e que existem diferentes populações celulares na Geleia de Wharton, a seleção específica da Geleia de Wharton estromal de acordo com a presente invenção é uma seleção mais específica do que as abordagens publicadas anteriormente (por exemplo, no processo de patente US2004/0136967 A1), e uma seleção diferente do que aquela sugerida por outros (por exemplo, na publicação WO 2004/072273 A). Dessa forma, o seccionamento antes da remoção física é marcantemente diferente das sugestões encontradas na literatura de acordo com o qual o tecido não é normalmente tão criticamente selecionado e seccionado antes do isolamento das células, mas onde as células desejadas são isoladas a partir de uma população celular, como pela destruição seletiva de células indesejadas (seleção negativa, veja, por exemplo, a US 2004/0136967 A1). Para o conhecimento dos inventores da presente invenção não se sabia especificamente se as células originárias da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical são superiores às células perivasculares com relação à homogeneidade, tamanho (volume e área superficial, respectivamente), diferenciação potencial e similaridade com a célula-tronco. Assim, ao contrário do pensamento principal de acordo com o estado da técnica, os presentes inventores desvendaram que as células derivadas da Geleia de Wharton estromal são superiores em muitos aspectos. Diversos destes aspectos são ilustrados nos exemplos experimentais deste documento. Em geral, populações celulares com propriedades morfológicas e funcionais homogêneas podem ser previstas como sendo adequadas para desenvolver um produto à base de células relativamente uniforme. Sem desejar estar vinculado a uma teoria particular, é possível que a uniformidade possa ser atribuída ao fato de que a Geleia de Wharton estromal tipicamente compreende menos pericitos e células endoteliais do que a área perivascular, se é que existe alguma.

[00145]. Os presentes inventores desvendaram surpreendentemente que as células originárias da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical são particularmente vantajosas. O estroma subamniótico (tipicamente compreendendo a Geleia de Wharton) (1b) pode ser obtido raspando a superfície interna do epitélio amniótico (1a) utilizando um meio mecânico; no entanto, deve-se ter cuidado para evitar romper ou fracionar o epitélio amniótico, o que pode resultar na obtenção indesejada de uma parte do epitélio amniótico.

[00146]. As vantagens incluem a homogeneidade das populações celulares e propriedades semelhantes às das células-tronco. Em particular, na ausência de vasos no cordão umbilical e da zona perivascular e, dessa forma, na ausência de células dos vasos do cordão umbilical e da zona perivascular, estas vantagens podem ser alcançadas.

[00147]. Portanto, é preferível que a etapa (a) isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela do cordão umbilical compreende o seccionamento do cordão umbilical ou de segmentos dele. Preferivelmente, ela compreende o seccionamento de segmentos do cordão umbilical. Durante a etapa de seccionamento, a Geleia de Wharton estromal desejada é separada dos vasos pela zona perivascular, que pode compreender a Geleia de Wharton perivascular. Durante a etapa de seccionamento, a Geleia de Wharton estromal também é separada pelo menos do epitélio amniótico. Deve-se ter cuidado para evitar ruptura ou fracionamento do epitélio amniótico, que pode resultar na obtenção indesejada de uma parte do epitélio amniótico.

[00148]. O seccionamento é preferivelmente realizado sob condições estéreis.

[00149]. O seccionamento é uma parte essencial da etapa (a) do método de acordo com a presente invenção, isto é, da etapa de isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela de um cordão umbilical. Dessa forma, em uma configuração, o isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela do cordão umbilical é alcançado submetendo-se o cordão umbilical a separação física, onde os vasos e a área perivascular do cordão umbilical e pelo menos a camada amniótica do revestimento do cordão são descartados, e a Geleia de Wharton estromal ou uma parte dela é retida.

[00150]. Para o seccionamento, ou mais precisamente o seccionamento por remoção mecânica, comprovou-se ser significativamente vantajoso que o cordão umbilical tenha sido previamente segmentado conforme descrito acima, e adicionalmente incisido longitudinalmente, conforme descrito acima. Assim, em uma configuração preferida da presente invenção, a etapa (a) do método compreende tanto uma etapa de segmentação, conforme descrito acima, quanto uma etapa de seccionamento, conforme descrito aqui.

[00151]. Uma maneira adequada de isolar a Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela a partir de um cordão umbilical compreende a remoção de vasos sanguíneos e da área perivascular do cordão umbilical. Adequadamente, a zona perivascular, que foi proposta na literatura por compreender Geleia de Wharton perivascular, também é separada do revestimento do cordão, particularmente pelo menos a camada amniótica do revestimento do cordão.

[00152]. Dessa forma, o seccionamento de acordo com a presente invenção é caracterizado pela remoção física dos vasos e da área perivascular do cordão umbilical. De acordo com a presente invenção, os vasos e a área perivascular podem ser removidos antes da etapa (a) ou como parte da etapa (a), o que é preferido. Uma forma tecnicamente vantajosa de remover os vasos e a área perivascular, que é preferida na presente invenção, é caracterizada por eliminar os vasos e a área perivascular do cordão umbilical. Por exemplo, os vasos sanguíneos do cordão umbilical (duas veias e uma artéria) são removidos com um fórceps estéril.

[00153]. Os inventores observaram que a eliminação dos vasos, por exemplo, puxando os vasos para fora, também remove a área perivascular. Em uma configuração preferida, a área perivascular é removida totalmente; isto significa que nenhuma célula pertencente à área perivascular permanece no cordão (segmentos) uma vez que os vasos tenham sido removidos. Qualquer outro método é igualmente adequado, uma vez que a área perivascular é totalmente removida. A zona proximal à parede externa da vasculatura umbilical é a zona perivascular. A zona perivascular fica tipicamente dentro de uma zona que se estende aproximadamente 3 mm ou menos da parede externa dos vasos. A zona perivascular é removida juntamente com os vasos quando estes são removidos. Qualquer Geleia de Wharton que possivelmente esteja dentro da área perivascular proximal à parede externa da vasculatura umbilical pode ser chamada de Geleia de Wharton perivascular. A Geleia de Wharton perivascular fica tipicamente dentro de uma zona que se estende aproximadamente 3 mm ou menos da parede externa dos vasos. A Geleia de Wharton perivascular é removida juntamente com os vasos quando estes são removidos.

[00154]. Assim, em uma configuração preferida, os vasos são removidos do cordão umbilical, ou do(s) segmento(s) do cordão umbilical. A remoção pode ser feita agarrando-se o(s) vaso(s) por meios mecânicos, como por meio de pinças ou utilizando qualquer outro meio adequado para aquele propósito, e puxando o(s) vaso(s) para fora. Preferivelmente, os vasos são puxados para fora um após o outro, mas esta não é uma exigência estrita. Enquanto os vasos são removidos, o cordão umbilical ou um segmento dele é geralmente fixado, por exemplo, prendendo-o com um meio mecânico, como, por exemplo, utilizando pinças ou qualquer outro meio adequado para este propósito. Dessa forma, uma força mecânica pode ser aplicada e os vasos podem ser removidos. A remoção deve ser realizada com cuidado, no sentido de que a abertura dos vasos e/ou a perda de células vasculares ou perivasculares deve ser evitada. A remoção deve ser realizada com cuidado, no sentido de que se deve evitar retirar a matriz do cordão, ou alternativamente, mantê-la a um mínimo.

[00155]. Preferivelmente, depois da etapa de remoção dos vasos, o cordão umbilical, ou o(s) respectivo(s) segmento(s), é/são reexaminados opticamente para garantir que os vasos (e, dessa forma, também a PVWJ) tenham sido totalmente removidos.

[00156]. Os vasos, incluindo qualquer tecido aderido a eles depois de serem removidos, são descartados. Isto significa que os vasos, incluindo qualquer tecido que tenha aderido a eles depois da remoção, não são submetidos à etapa a jusante adicional de tratamento enzimático. De acordo com o método da presente invenção, a Geleia de Wharton da zona perivascular não é utilizada como uma fonte para o isolamento de células. Assim, nenhuma Geleia de Wharton perivascular é utilizada como uma fonte para o isolamento de células. Para propósitos ilustrativos, as Figuras 1 e 2 ilustram a Geleia de Wharton perivascular (5 na Figura 1).

[00157]. De acordo com a presente invenção, os vasos e a área ao redor dos vasos são descartados. A área ao redor dos vasos é de pelo menos aproximadamente 2,0 mm de diâmetro, onde a medição se estende a partir da superfície externa do vaso para fora (veja a Figura 2), como 2,0 mm de diâmetro, preferivelmente, 2,5 mm, e mais preferivelmente 3,0 mm. Dessa forma, pelo menos aproximadamente 2,0 mm, como 2,0 mm, preferivelmente, 2,5 mm, e mais preferivelmente 3,0 mm ao redor dos vasos do cordão umbilical não são utilizados como material de partida para isolamento de células de acordo coma presente invenção. Uma forma preferida de realizar convenientemente esta remoção física (“retirada”) dos vasos do cordão umbilical, ou mais precisamente, dos segmentos vasculares dos segmentos do cordão umbilical, conforme descrito neste documento. Assim, em uma configuração preferida, os vasos são removidos fisicamente do cordão umbilical, ou os segmentos vasculares são removidos fisicamente dos segmentos do cordão umbilical. A última opção é preferida; isto requer a segmentação do cordão umbilical conforme descrito neste documento antes da remoção dos vasos dos segmentos.

[00158]. Agora que os vasos e a área perivascular foram removidos, a Geleia de Wharton estromal é obtida do cordão umbilical livre de vasos, ou de seções do cordão umbilical livres de vasos, como segue: Preferivelmente, o isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela é adicionalmente caracterizado por uma etapa de separação física do estroma subamniótico (1b) da membrana que reveste o cordão umbilical (1a). Isto pode incluir a separação da Geleia de Wharton da membrana que reveste o cordão umbilical, particularmente pelo menos da camada epitelial da membrana que reveste o cordão umbilical.

[00159]. Dessa forma, o estroma (compreendendo a Geleia de Wharton estromal) livre do material que reveste o respectivo cordão é obtido. Preferivelmente, a etapa de separar fisicamente o estroma (possivelmente incluindo a Geleia de Wharton) da membrana que reveste o cordão umbilical, particularmente pelo menos da camada epitelial da membrana que reveste o cordão umbilical, também é realizada nos segmentos que podem ser obtidos conforme descrito acima. Por motivos práticos, a etapa é normalmente realizada segmento por segmento (isto é, um segmento depois do outro), muito embora se prefira que esta etapa seja realizada rapidamente.

[00160]. A Geleia de Wharton estromal normalmente apresenta uma consistência mole semelhante à da geleia; portanto, ela pode ser mecanicamente dissecada do cordão umbilical livre de vasos, ou preferivelmente de segmentos do cordão umbilical livres de vasos.

[00161]. A dissecação mecânica é preferivelmente caracterizada por raspagem. Para realizar a raspagem, qualquer ferramenta, preferivelmente uma ferramenta mecânica adequada ou projetada para tal propósito pode ser utilizada. A remoção é preferivelmente realizada por meios mecânicos; meios mecânicos adequados são revelados na técnica, por exemplo, na US20080181967 A1, WO2008146992 A1, e na publicação WO2007080591 A2. Em uma configuração, um meio mecânico é utilizado para cortar peças de tecido matricial dos segmentos do UC. Em uma configuração, a superfície interna do cordão (segmentos) é raspada utilizando meios mecânicos. Em uma configuração, a membrana epitelial amniótica é removida mecanicamente, por exemplo, utilizando um meio mecânico. Se a raspagem for realizada cuidadosamente, o que é preferido, a camada epitelial não é danificada e, dessa forma, nenhuma célula da camada epitelial é obtida pela raspagem.

[00162]. É importante não incluir pedaços da membrana epitelial amniótica ao coletar o tecido matricial. Para realizar isto, deve-se evitar cortar o revestimento do cordão, ou manter um mínimo. Em particular, a separação física da Geleia de Wharton estromal da membrana que reveste o cordão umbilical é preferivelmente caracterizada pela raspagem da Geleia de Wharton, preferivelmente sem dissecação mecânica do revestimento do cordão umbilical, ou com dissecação do revestimento do cordão somente em uma extensão mínima. “dissecar mecanicamente” inclui cortar, prensar ou de outra forma afetar a integridade do tecido com a aplicação de força mecânica. Em uma configuração preferida, “uma extensão mínima” consiste em uma única incisão longitudinal, preferivelmente paralela à direção do cordão. Dessa forma, o cordão, ou segmento do cordão, conforme o caso, é aberto lateralmente, proporcionando, dessa forma, acesso à parte interna do cordão.

[00163]. Opcionalmente, também, nenhuma célula da camada subamniótica é obtida. Para alcançar isto, a raspagem deve ser realizada com grande cuidado, sem exercer força mecânica indevida próximo da membrana que reveste o cordão umbilical. Nesta configuração, todo o revestimento do cordão (compreendendo a camada amniótica e a camada mesenquimal subamniótica) não é desejado.

[00164]. Em qualquer taxa, a camada amniótica (epitelial) não é desejada. Qualquer material do revestimento do cordão indesejado depois da remoção mecânica da Geleia de Wharton estromal desejada é descartado.

[00165]. Assim, o tecido da Geleia de Wharton estromal é obtido.

[00166]. Com base nas propriedades vantajosas das células isoladas de acordo com a presente invenção, os inventores concluem, sem, entretanto, desejarem estar vinculados a qualquer teoria particular, que menos células maduras com uma capacidade benéfica de proliferar estão localizadas relativamente mais longes dos vasos e, dessa forma, mais próximas da superfície amniótica, ao passo que células mais diferenciadas são encontradas mais próximas dos vasos umbilicais. Em conclusão, os inventores selecionaram a Geleia de Wharton estromal como a região de origem do isolamento de células de acordo com a presente invenção.

[00167]. Em uma configuração preferida, a etapa (a) de isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela de um cordão umbilical compreende a etapa de seccionamento conforme descrito neste documento e a etapa de trituração conforme descrito abaixo.

[00168]. Em uma configuração mais preferida, a etapa (a) de isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela de um cordão umbilical compreende a etapa de segmentação conforme descrito acima, a etapa de seccionamento conforme descrito neste documento, e também a etapa de trituração conforme descrito abaixo. Diminuição do tamanho dos fragmentos de tecido por tratamento mecânico

[00169]. Preferivelmente, a Geleia de Wharton estromal obtida pelo seccionamento é subsequentemente submetida a tratamento mecânico que visa a diminuição do tamanho dos fragmentos de tecido. O tratamento mecânico tem o objetivo de dissecar ligações físicas dentro da Geleia de Wharton estromal, de forma que o tamanho dos pedaços da Geleia de Wharton estromal seja reduzido. O tratamento mecânico é vantajoso com relação ao tratamento enzimático subsequente, conforme descrito abaixo. Um tamanho relativamente pequeno e relativamente uniforme dos fragmentos de Geleia de Wharton estromal está associado com diversas vantagens:

está associado com um aumento da área superficial e, dessa forma, entende-se que torne o material acessível à(s) enzima(s) utilizada(s) no tratamento enzimático, e permite que lisado de plaquetas, que entende-se que contenha fatores de crescimento e outros elementos adequados para MSCs, esteja em grande proximidade a substancialmente toda a Geleia de Wharton isolada.

[00170]. Preferivelmente, o tratamento mecânico é realizado triturando-se os fragmentos finamente com tesouras afiadas e/ou bisturi, mas qualquer outro meio adequado para a diminuição mecânica dos fragmentos é adequado, desde que as células não sejam substancialmente e mecanicamente danificadas ou destruídas. Por exemplo, os respectivos instrumentos são disponibilizados pela Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Alemanha). Em qualquer taxa, o tratamento mecânico é preferivelmente realizado em condições estéreis.

[00171]. O tecido tratado mecanicamente (por exemplo, triturado) é opcionalmente adicionado a uma solução aquosa e disperso, para prevenir que o referido tecido seque, trata-se de uma solução aquosa, preferivelmente tamponada em ou próximo de pH fisiológico e isotônica, opcionalmente suplementada com antibióticos. Por exemplo, Solução Salina Tamponada com HEPES (HBSS) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS), preferivelmente, a HBSS é adequada. Opcionalmente, a solução aquosa compreende antibióticos em concentrações adequadas.

[00172]. Preferivelmente, o tecido tratado mecanicamente (por exemplo, triturado) é subsequentemente recebido (agrupado) em uma placa estéril adequada, como uma placa de Petri. Depois do isolamento do tecido, e antes da digestão enzimática, que será descrita abaixo, o peso do tecido triturado total obtido em um ciclo de escala completa é normalmente de 14 gramas ou mais, como de 16 gramas ou mais ou de 18 gramas ou mais. Tratamento enzimático

[00173]. De acordo com a presente invenção, células são liberadas do cordão umbilical ou de seus segmentos ou seções ou do tecido triturado obtido deles por tratamento enzimático. Ao contrário dos ensinamentos anteriores (por exemplo, Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20), os presentes inventores desvendaram que o tratamento enzimático, particularmente quando realizado de acordo com as condições descritas como sendo preferíveis aqui, isto é, condições leves, rendem MSCs vantajosas não caracterizadas por dano celular.

[00174]. A configuração de tecido triturado é preferida. Assim, preferivelmente, células são liberadas por tratamento enzimático do tecido triturado obtido do cordão umbilical ou de seus segmentos ou seções.

[00175]. Em particular, na etapa (b) do método da invenção, a Geleia de Wharton estromal ou sua fração é submetida a tratamento enzimático liberando, dessa forma, pelo menos uma célula da Geleia de Wharton estromal ou de sua fração. Tipicamente, uma multiplicidade de células é liberada. A Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela é submetida a digestão enzimática. Em particular, as células são liberadas da Geleia de Wharton estromal, que é uma seção específica do cordão umbilical, e que pode ser obtida durante a etapa (a) precedente conforme descrito acima. A etapa do método de acordo com a presente invenção que compreende o tratamento enzimático pode ser chamada de “tratamento enzimático”, “digestão enzimática”, ou de forma semelhante, ou simplesmente de “etapa (b)”.

[00176]. Opcionalmente, o tratamento enzimático pode ocorrer em paralelo e/ou subsequente ao isolamento físico da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical; no entanto, o subsequente é mais preferido. Mais precisamente, prefere-se que a etapa (b) do método da invenção seja subsequente à etapa (a) do método da invenção. Naquela configuração, a etapa (b) é a única etapa do método de acordo com a presente invenção na qual a atividade enzimática é adicionada.

[00177]. A abordagem da presente invenção, que caracteriza a liberação das células do tecido do cordão umbilical, especificamente, a Geleia de Wharton estromal, é marcantemente diferente das abordagens da técnica anterior onde o tecido do cordão umbilical é submetido a cultura como tal, e células se desenvolvem a partir do tecido, por exemplo, como resultado da migração dela ou divisão celular ou ambas (US 2004/0136967 A1). De acordo com a presente invenção, no entanto, pelo menos uma célula, ou preferivelmente a maioria das células contidas na Geleia de Wharton estromal, é/são liberada(s) por tratamento enzimático ao invés de migração dela ou divisão celular. Isso proporciona uma melhora temporal significativa do isolamento: ao invés de diversos dias (por exemplo, 2004/0136967 A1), as células podem ser isoladas do cordão umbilical em poucas horas, conforme descrito em detalhes abaixo.

[00178]. O tratamento enzimático é um tratamento onde as células são liberadas do cordão umbilical ou de seus segmentos ou de suas seções por tratamento com pelo menos uma enzima. Uma enzima adequada é uma protease. Dessa forma, as células são preferivelmente liberadas do cordão umbilical ou de seus segmentos por tratamento com pelo menos uma protease. Uma protease (também chamada de peptidase ou proteinase) é qualquer enzima que realiza a proteólise; catabolismo proteico por hidrólise de ligações peptídicas. Preferivelmente, a protease é capaz de digerir pelo menos uma proteína da matriz extracelular, preferivelmente o colágeno. Mais preferivelmente, o tratamento enzimático da etapa (b) é um tratamento que compreende a exposição à enzima colagenase. Em outras palavras, pelo menos uma protease é preferivelmente uma colagenase. Outras proteases estão opcionalmente adicionalmente presentes. Em uma configuração, essencialmente nenhuma outra protease ao invés da colagenase está presente. “Essencialmente nenhuma outra protease” significa que a preparação de colagenase que é adicionada foi purificada até o grau máximo razoavelmente possível e/ou que a atividade de outras proteases na preparação de colagenase não pode ser detectada por métodos laboratoriais normais.

[00179]. Uma enzima particularmente adequada e, dessa forma, preferida para extração de acordo com a presente invenção é a colagenase (EC 3.4.24.7). O termo "colagenase" se refere a uma atividade enzimática que é capaz de quebrar (mais especificamente hidrolisar) as ligações peptídicas na proteína da matriz extracelular colágeno. O colágeno está presente na matriz extracelular de vários tecidos, incluindo o cordão umbilical. A colagenase auxilia na destruição de estruturas extracelulares. A colagenase está disponível de origem tanto eucariótica quanto procariótica, muito embora a protease de origem procariótica, particularmente de bactérias como Clostridium sp., é preferida aqui. A colagenase pode ser isolada de sua fonte natural, ou ser produzida recombinantemente, por exemplo, em E. coli. Em algumas configurações, a colagenase de sua fonte natural, por exemplo, Clostridium sp., é preferida. Por exemplo, a colagenase pode ser de Clostridium histolyticum.

[00180]. A menos que o contexto determine o contrário, “colagenase” se refere aqui à atividade enzimática, ao passo que “preparação de colagenase” se refere a um produto, comercial ou não, que compreende atividade da colagenase. A atividade da colagenase é proporcionada pela enzima colagenase – pura ou não - presente na preparação de colagenase.

[00181]. Preparações de colagenase estão comercialmente disponíveis. Em algumas configurações, a preparação de colagenase utilizada é estéril ou de grau BPF. Preferivelmente, a preparação de colagenase é preparação de colagenase NB4 ou preparação de colagenase NB5 ou preparação de colagenase NB6, todas da SERVA (Heidelberg, Alemanha) ou qualquer outra preparação de colagenase equivalente a qualquer uma destas. A equivalência pode ser determinada executando o método descrito no Exemplo 2A, em paralelo com a preparação de colagenase NB4/NB6 e com a preparação de colagenase para a qual a equivalência tem que ser determinada, opcionalmente em um experimento de titulação para determinar atividade de digestão de colágeno equivalente.

[00182]. Opcionalmente, a preparação de colagenase utilizada não compreende qualquer atividade enzimática que não seja a atividade da colagenase. Em particular, prefere-se que nenhuma atividade da hialuronidase esteja presente. Em outras configurações, a atividade da hialuronidase está presente. Relatou-se anteriormente que a combinação de colagenase com hialuronidase pode ser vantajosa (por exemplo, Bailey et al., Tissue Eng., 2007, vol. 13, p. 2003-2010). Nos exemplos experimentais da presente invenção, no entanto, resultados satisfatórios foram obtidos sem hialuronidase adicionada. Portanto, prefere-se na presente invenção que nenhuma atividade da hialuronidase adicionada esteja presente durante a digestão enzimática.

[00183]. Em algumas configurações, nenhuma protease além da atividade da colagenase está presente. Em outras configurações, a atividade de uma ou mais proteases não colagenase está presente. Outras proteases podem ser proteases específicas ou proteases não específicas, endo ou exopeptidases. Assim, opcionalmente outras atividades enzimáticas, como outras proteases em particular, podem ser utilizadas além da colagenase. Estas outras atividades enzimáticas podem estar presentes na preparação de colagenase ou adicionadas separadamente. Por exemplo, clostripain (EC 3.4.22.8, também chamada de clostridiopeptidase B, clostridium histolyticum proteinase B, alfa-clostridipain, clostridiopeptidase, Endoproteinase Arg-C), uma proteinase que cliva proteínas na ligação do peptídeo carboxila de arginina, ou um equivalente, pode estar presente. Em outro exemplo não mutuamente exclusivo caseinase c (EC 3.4.24) pode estar presente. Em outra configuração não mutuamente exclusiva tripsina (EC 3.4.21.4), uma serina protease, pode estar presente.

[00184]. Opcionalmente, a preparação de colagenase utilizada não compreende qualquer atividade enzimática que não seja a atividade proteolítica, isto é a atividade da colagenase e a atividade proteolítica não colagenase. Em uma configuração, no entanto, o tratamento enzimático é realizado na presença adicional de hialuronidase, mas hialuronidase; isto é meramente opcional.

[00185]. Adequadamente, uma solução aquosa compreendendo água e a enzima para digestão, isto é, protease, mais especificamente a colagenase, e opcionalmente, mas preferivelmente, um agente tamponante, é preparado. O agente tamponante garante que o pH fique na faixa de pH desejada. Qualquer agente tamponante pode ser utilizado, que seja adequado para tamponar o pH na faixa desejada.

[00186]. A solução aquosa que compreende a enzima, e o agente tamponante, e água, e opcionalmente ingredientes adicionais, é chamado de Tampão de Digestão. Em algumas configurações, o Tampão de Digestão não compreende um agente quelante de metal como EDTA ou EGTA. Preferivelmente, o Tampão de Digestão apresenta um pH de 6,0 a 9,0, mais preferivelmente de 7,0 a 8,0. Não apenas isto fica próximo do pH fisiológico, mas enzimas adequadas também foram descritas como tendo um pH excelente na faixa de pH 7,0 a pH 8,0. Assim, a digestão é preferivelmente realizada naquela faixa de pH. O pH deve preferivelmente ser determinado na temperatura na qual a digestão deve ocorrer.

[00187]. Opcionalmente, íons de cálcio estão presentes no Tampão de Digestão; por exemplo, um sal de cálcio solúvel em água, como cloreto de cálcio, pode ser adicionado durante o preparo do Tampão de Digestão. Por exemplo, quando o tratamento enzimático é um tratamento com colagenase, a presença de íons de cálcio é benéfica, e, dessa forma, preferida.

[00188]. Opcionalmente, heparina está presente no Tampão de Digestão. Sabe-se que a heparina é um aditivo adequado para composições líquidas contendo lisado de plaquetas para evitar coagulação (por exemplo, Lohmann et al., 2012, PLoS ONE, vol. 7e37839). Concentrações adequadas de heparina no Tampão de Digestão de acordo com a presente invenção são de 0,1 a 100 U/mL, como 1 a 10 U/mL, por exemplo, 2 U/mL de heparina. O mL se refere ao volume total de Tampão de Digestão. Uma unidade de heparina (a "unidade Howell") é uma quantidade aproximadamente equivalente a 0,002 mg de heparina pura, que é a quantidade necessária para manter 1 ml de fluido sanguíneo de gato por 24 horas a 0°C ("Online Medical Dictionary", 2000, Centre for Cancer Education).

[00189]. Para iniciar a digestão, o Tampão de Digestão é adicionado ao tecido a ser digerido - ou vice-versa. É importante que a solução aquosa contendo enzima, isto é Tampão de Digestão, e o tecido sejam misturados. Preferivelmente, o conjunto de Tampão de Digestão e tecido é imediatamente, gentilmente, agitado para garantir uma mistura adequada. Com a adição, o tratamento enzimático é iniciado.

[00190]. Preferivelmente, o tecido derivado da Geleia de Wharton estromal anteriormente isolada e o Tampão de Digestão são misturados com uma proporção definida. Isto está associado, entre outras coisas, com as vantagens de reprodutibilidade do método e digestão em condições leves, se desejado. Proporção = X mg de tecido / 1 ml de Tampão de Digestão

[00191]. Como o tecido triturado, imediatamente antes de ser misturado com o Tampão de Digestão, é opcionalmente armazenado em uma solução salina tamponada (preferivelmente solução salina tamponada com HEPES, HBSS), para prevenir que o tecido seque, a proporção definida, naquela configuração, é definida como segue: Proporção = X mg (tecido + solução salina tamponada) /1 ml de Tampão de Digestão

[00192]. A “solução salina tamponada” não deve ser confundida com o “Tampão de Digestão”. A “solução salina tamponada” tipicamente não conterá qualquer enzima digestiva, particularmente nenhuma colagenase.

[00193]. Em ambas as fórmulas acima, X está adequadamente na faixa de 10 a 1.000, preferivelmente de 50 a 500, mais preferivelmente de 80 a 200, e mais preferivelmente essencialmente 100. Assim, em uma configuração preferida, 100 mg de tecido triturado/HBSS são misturado com 1 mL de Tampão de Digestão.

[00194]. A menos que declarado de outra forma, o tratamento com colagenase é tipicamente realizado a uma temperatura entre 35 e 39°C, mais preferivelmente entre 36 e 38°C, e mais preferivelmente a aproximadamente 37°C. Assim, preferivelmente, a digestão enzimática é realizada a uma temperatura de 35- 39°C, como de 38-38°C, preferivelmente a 37°C. O tecido originário do cordão umbilical, conforme descrito neste documento, é submetido a tratamento por colagenase por um determinado intervalo de tempo (duração). Intervalos de tempo adequados são descritos neste documento.

[00195]. Preferivelmente, a digestão enzimática é realizada sob agitação. Por exemplo, descobriu-se que uma agitação cuidadosa constante por volta de 50 a

100 rpm, por exemplo, em um agitador orbital, é adequado para digestão.

[00196]. Em uma configuração mais preferida, a digestão da protease é realizada em condições leves. Os presentes inventores desvendaram surpreendentemente que, em uma configuração um tempo de digestão de 1 hora é adequado. Mais geralmente, ao contrário da sugestão de alguns estudos anteriores, condições relativamente leves são adequadas para digestão no método de acordo com a presente invenção. Entre os estudos anteriores, WO 2004/072273 A e Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229 podem ser mencionados para propósitos ilustrativos: de acordo com a publicação WO 2004/072273 A, uma colagenase de origem e concentração não especificada é recomendada para ser utilizada em uma concentração de, por exemplo, 0,1 mg/ml ou 1 mg/ml; o tempo de digestão com colagenase recomendado é de 12 a 36 horas, como aproximadamente 24 horas; de acordo com Sarugaser et al. (supra), 1 mg/ml de colagenase da Sigma, C-0130) é utilizado; o tempo de digestão com colagenase é de 18 a 24 horas. Assim, as condições leves utilizadas no contexto da presente invenção são distinguíveis a partir das condições descritas pelos estudos anteriores.

[00197]. “Condições leves” ou sinonimamente “condições delicadas”, conforme utilizados neste documento, significa que pelo menos dois, mas mais preferivelmente todas as três condições (1) tempo de digestão, (2) atividade enzimática e (3) lisados de plaquetas são conforme descrito abaixo. A atividade enzimática está, é claro, relacionada ao tipo de enzima utilizado, e à quantidade de enzima utilizada, em relação ao volume que é utilizado (concentração enzimática) ou em relação à quantidade de tecido a ser digerido.

[00198]. A menos que o contexto determine o contrário, todas as configurações de (1) tempo de digestão, (2) atividade enzimática e (3) lisado de plaquetas são combináveis umas com as outras. Dessa forma, em geral, fatores que contribuem para condições leves: curto tempo de digestão enzimática, baixa concentração enzimática e, presença de hPL.

[00199]. Em uma configuração, o curto tempo de digestão enzimática, conforme descrito abaixo, é combinado com baixa atividade enzimática, conforme descrito abaixo. Configurações preferidas de curto tempo de digestão enzimática, conforme descrito abaixo, também podem ser combinadas com configurações preferidas de baixa atividade enzimática, conforme descrito abaixo.

[00200]. Em uma configuração, o curto tempo de digestão enzimática, conforme descrito abaixo, é combinado com a presença de lisado de plaquetas, conforme descrito abaixo. Configurações preferidas de curto tempo de digestão enzimática, conforme descrito abaixo, também podem ser combinadas com configurações preferidas de lisado de plaquetas, conforme descrito abaixo.

[00201]. Em uma configuração, a baixa atividade enzimática, conforme descrito abaixo, é combinada com a presença de lisado de plaquetas, conforme descrito abaixo. Configurações preferidas de baixa atividade enzimática, conforme descrito abaixo, também podem ser combinadas com configurações preferidas de lisado de plaquetas, conforme descrito abaixo.

[00202]. Em uma configuração particularmente preferida, o curto tempo de digestão enzimática, conforme descrito abaixo, é combinado com baixa atividade enzimática, conforme descrito abaixo e, também, com a presença do lisado de plaquetas, conforme descrito abaixo. Configurações preferidas de curto tempo de digestão enzimática, conforme descrito abaixo, de configurações preferidas de baixa atividade enzimática, conforme descrito abaixo, e configurações preferidas de lisado de plaquetas, conforme descrito abaixo, podem todas ser combinadas umas com as outras. Esta configuração é realizada no Exemplo 2A.

[00203]. Variações dos valores exatos de (1) tempo de digestão indicado aqui, (2) atividade enzimática indicada aqui e (3) lisado de plaquetas indicado aqui também são possíveis sem desviar da presente invenção. Por exemplo, pode ser possível reduzir o tempo de digestão indicado aqui, até, por exemplo, 50%, juntamente com o aumento da atividade enzimática indicada aqui, até, por exemplo, 50%. A pessoa com habilidade pode prever e praticar tais variações com base em sua experiência geral, e com base na observação da cinética enzimática geral de que uma atividade enzimática mais baixa ainda pode ser suficiente para digerir uma determinada quantidade de substrato quando o tempo de digestão for aumentado adequadamente, e vice-versa. Por exemplo, pode ser possível aumentar o tempo de digestão indicado aqui, até, por exemplo, 50%, juntamente com a diminuição da atividade enzimática indicada aqui, até, por exemplo, 50%. Respectivas condições variadas ainda podem ser chamadas de condições leves. A colagenase não é normalmente autocatalítica; portanto, variações são possíveis sem normalmente causar uma redução da quantidade de colagenase durante a digestão ao longo do tempo.

[00204]. Ao aplicar condições leves, pode-se evitar em uma extensão muito grande que as MSCs que devem ser isoladas sejam gravemente danificadas. As condições leves permitem obter frações muito maiores de células viáveis do que os métodos disponíveis anteriormente.

[00205]. Muito embora o método da presente invenção, em configurações típicas, gere um número menor de células totais do que um método de referência (veja a Figura 4 B e 4C), as células isoladas de acordo com o método da invenção estão em configurações típicas caracterizadas por um baixo percentual de células apoptóticas (veja a Figura 4 B e 4D). Isto é vantajoso, por exemplo, para a expansão opcional, que serão descritas abaixo.

[00206]. Os presentes inventores desvendaram que tempos de digestão enzimática curtos são vantajosos no método da invenção. Em um exemplo inicialmente descoberto pelos presentes inventores, um tempo de digestão enzimática curto é de 1 hora. Com base no acima exposto, geralmente falando, em uma configuração preferida, a etapa (b) é realizada em um tempo total de menos de 5 horas, mais preferivelmente de menos de 4 horas e mais preferivelmente de menos de 3 horas. Menos de 3 horas inclui intervalos de tempo de 0,5 a 2,5 horas e 1 a 2 horas, e qualquer intervalo de tempo com um limite máximo de menos de 3 horas, como 2,5 horas, 2,6 horas, 2,7 horas, 2,8 horas, 2,9 horas e 2,95 horas. Todos estes intervalos de tempo podem ser chamados de “rápido” ou “curto”, embora “rápido” e “curto” também sejam termos relativos, por exemplo, 2 horas, é claro, é mais rápido/curto do que 4 horas. A realização rápida do tratamento enzimático evita problemas de desidratação e outros problemas possíveis associados com células sendo expostas a um ambiente não natural por períodos de tempo prolongados; uma realização rápida do tratamento enzimático também supera dificuldades descritas por Seshareddy et al. (2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119).

[00207]. Sugeriu-se que curtos intervalos de tempo de tratamento enzimático podem ser vantajosos, particularmente em caso de uma codigestão com hialuronidase e colagenase (Can et al., Stem Cells, 25:2886-2895, 2007). De alguma forma surpreendente, na presente invenção, tempos de tratamento curtos também são benéficos na ausência de hialuronidase. Isto é marcante de duas formas: primeiro, na ausência de hialuronidase normalmente não se esperaria que ocorresse efeito indesejado da hialuronidase, como digestão indesejada extensiva das superfícies da extremidade celular no ambiente extracelular; segundo, sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, entende-se que a colagenase sozinha atua somente na matriz extracelular, não nas células desejadas em si. Não obstante as vantagens de um tratamento leve, incluindo a curta duração do tratamento, sobre a viabilidade celular são muito marcantes. Em uma configuração, a digestão enzimática é uma digestão enzimática sob condições leves sem qualquer hialuronidase adicionada. Em uma configuração, a digestão enzimática é uma digestão enzimática sob condições leves na ausência de hialuronidase. Em uma configuração preferida, a etapa (b) é realizada em um tempo total de menos de 5 horas, mais preferivelmente de menos de 4 horas e mais preferivelmente de menos de 3 horas, e sem qualquer hialuronidase adicionada, ou preferivelmente na ausência de hialuronidase.

[00208]. Preferivelmente, ambas as etapas (a) e (b) são realizadas rapidamente. Dessa forma, células podem ser obtidas em curto tempo a partir do cordão umbilical. Isto representa uma vantagem sobre alguns estudos anteriores que se baseiam em intervalos de tempo prolongados para digestão enzimática do tecido do cordão umbilical, ou crescimento excessivo de células do tecido do cordão umbilical, ou ambos. Em uma configuração preferida, as etapas (a) e (b) juntas são realizadas em um tempo total de menos de 6 horas, mais preferivelmente de menos de 5 horas, mais preferivelmente de menos de 4 horas e mais preferivelmente de menos de 3 horas. Menos de 3 horas inclui intervalos de tempo de 0,5 a 2,5 horas e 1 a 2 horas, e qualquer intervalo de tempo com um limite máximo de menos de 3 horas, como 2,5 horas, 2,6 horas, 2,7 horas, 2,8 horas, 2,9 horas e 2,95 horas. Fica evidente que uma duração curta das etapas (a) e (b) juntas também significa que a etapa (b) propriamente dita é curta. Os presentes inventores desvendaram que, em uma configuração, um tempo de digestão de 1 hora é vantajoso.

[00209]. Os inventores também desvendaram que a quantidade de atividade enzimática tem importância. A atividade enzimática está, é claro, relacionada ao tipo de enzima utilizado, e à quantidade de enzima utilizada, em relação ao volume que é utilizado (concentração enzimática) ou em relação à quantidade de tecido a ser digerido.

[00210]. Em particular, os inventores mostraram que a quantidade de atividade da colagenase tem importância. Para os propósitos de descrever a presente invenção, a atividade da colagenase é indicada em unidades Wünsch. 1 unidade (U) de acordo com Wünsch (unidade Wünsch, ou unidade PZ) catalisa a hidrólise de um 1 µmol de 4-fenilazobenziloxicarbonil-L-prolil-L-leucilglicil-L-prolil-D-arginina por minuto a 25°C, pH 7,1 (Wünsch et al., 1963, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 333, 149-51).

[00211]. O processo de acordo com a presente invenção é tipicamente caracterizado por uma atividade relativamente baixa da colagenase durante o tratamento enzimático da etapa (b). Aqui, a quantidade indicada de atividade da colagenase é indicada para o ponto de tempo no qual a colagenase é adequada. Por exemplo, caso a colagenase perca a atividade ao longo do tempo durante a etapa (b), nenhuma colagenase adicional é acrescentada. No entanto, a colagenase não é normalmente autodigestiva e, dessa forma, relativamente estável, e não é possível assumir razoavelmente que, depois de ser adicionada, a colagenase esteja presente durante todo o tratamento enzimático da etapa (b).

[00212]. A atividade da colagenase pode ser indicada adequadamente com referência ao volume total do Tampão de Digestão. Em uma configuração, o Tampão de Digestão compreende uma atividade da colagenase específica de 0,01 Wünsch U/ml a 10 Wünsch U/ml, preferivelmente de 0,05 Wünsch U/ml a 5 Wünsch U/ml, preferivelmente de 0,1 Wünsch U/ml a 1 Wünsch U/ml, preferivelmente de 0,15 Wünsch U/ml a 0,5 Wünsch U/ml, preferivelmente, por exemplo, por volta de 0,1 Wünsch U/ml ou por volta de 0,2 Wünsch U/ml. Em uma configuração, o limite mínimo de atividade da colagenase não é particularmente definido, uma vez que a atividade da colagenase adicionada é suficiente para liberar células estromais mesenquimais do tecido dentro de 5 horas ou menos. Nesta e em outras configurações, o limite máximo de atividade da colagenase pode ser definido como não mais do que 0,5 Wünsch U/ml, mais preferivelmente de não mais do que 0,25 Wünsch U/ml, e especificamente de 0,18 Wünsch U/ml ou de 0,09 Wünsch U/ml.

[00213]. Em uma configuração preferida, a colagenase está presente durante o tratamento enzimático da etapa (b) em uma atividade específica de não mais do que 0,5 Wünsch U/ml, mais preferivelmente não mais do que 0,25 Wünsch U/ml, e especificamente de 0,18 Wünsch U/ml com relação ao Tampão de Digestão. Ainda mais preferivelmente, a atividade da colagenase utilizada na etapa (b) do método de acordo com a presente invenção está na faixa de 0,18 a 0,09 Wünsch U/ml de Tampão de digestão (veja, também, o Exemplo 1). Esta atividade difere da atividade da colagenase utilizada de acordo com a publicação WO 2004/072273 A e Sarugaser et al., 2005,

Stem Cells, vol. 23, p. 220-229. De fato, em uma configuração, a atividade da colagenase durante a etapa (b) do método da presente invenção pode ser definida como sendo inferior à atividade da colagenase descrita pela publicação WO 2004/072273 A e Sarugaser et al. (supra).

[00214]. Alternativamente, a atividade da colagenase pode ser adequadamente indicada em relação ao peso do tecido a ser digerido. (O peso do referido tecido podem ser adequadamente determinado pesando-se o recipiente no qual ele está contido antes e depois do enchimento com o referido tecido). O referido tecido, opcionalmente compreendido em um recipiente, opcionalmente compreende uma solução salina tamponada (por exemplo, HBSS). Em uma configuração, uma proporção adequada fica na faixa de 0,01 a 10 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido, preferivelmente de 0,05 a 5 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido, preferivelmente de 0,1 a 1 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido, preferivelmente de 0,15 a 0,5 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido, preferivelmente, por exemplo, por volta de 0,1 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido ou por volta de 0,2 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido. Em uma configuração, o limite mínimo de atividade da colagenase não é particularmente definido, uma vez que a atividade da colagenase adicionada é suficiente para liberar células estromais mesenquimais do tecido dentro de 5 horas ou menos. Nesta e em outras configurações, o limite máximo de atividade da colagenase pode ser definido como não mais do que 0,5 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido, mais preferivelmente de não mais do que 0,25 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido, e especificamente por volta de 0,16 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido ou por volta de 0,08 Wünsch U de colagenase/100 mg de tecido, ou qualquer valor dentro daquela faixa preferida. Na presente invenção, é preferível que a proporção de atividade da colagenase com relação ao peso total do tecido seja inferior à atividade da colagenase descrita na publicação WO 2004/072273 A e Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229.

[00215]. Os inventores desvendaram adicionalmente que a presença de lisado de plaquetas durante a digestão enzimática é vantajosa. Este é um achado surpreendente dos inventores. Houve algum preconceito na técnica de que a colagenase não funcionaria bem na presença de lisado de plaquetas. Por exemplo, descreveu-se anteriormente que a atividade colagenolítica foi inibida pelo plasma humano normal, devido a inibidores como 1-antitripsina (Chesney et al., J. Clin. Invest.,

1974, vol. 53, p. 1647-1654). No entanto, os inventores desvendaram que a digestão com colagenase é eficiente mesmo na presença de lisado de plaquetas. Na realidade, a digestão com colagenase é eficiente mesmo com quantidades muito baixas de colagenase preferidas na presente invenção (veja acima). Assim, preferivelmente, o lisado de plaquetas está presente durante o tratamento enzimático. O lisado de plaquetas pode ser obtido de fontes comerciais ou preparado frescamente. Muitos hospitais, bancos de sangue e instituições de pesquisa estabeleceram protocolos para o preparo do lisado de plaquetas, e tais lisados são geralmente adequados no contexto da invenção. Por exemplo, ele pode ser obtido por um processo de congelamento- descongelamento. Este lisados podem ser produzidos congelando-se uma suspensão de plaquetas e, então, descongelando o material, muito embora outros regimes de congelamento-descongelamento também sejam adequados, desde que levam à citólise das plaquetas. Com a técnica de congelamento-descongelamento, este método faz com que as células dilatem e quebrem, presumivelmente por causa da formação de cristais de gelo, seguida pela contração no descongelamento. Dessa forma, a dilatação e contração cíclicas finalmente faz com que as plaquetas se rompam. Múltiplos ciclos podem ser preferencialmente utilizados para uma citólise mais completa, mas a citólise “mais completa” não é necessariamente exigida. Graus variáveis de citólise de plaquetas podem ocorrer, por exemplo, pelo menos 30%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 90%, ou até 100% de citólise, por contagem de plaquetas. Opcionalmente, o material não lisado e outros resíduos são removidos do lisado de plaquetas antes do uso.

[00216]. Preferivelmente, o lisado de plaquetas compreende plaquetas de mamíferos lisadas e, opcionalmente, plasma de mamíferos. No segundo caso, o lisado de plaquetas é uma composição que compreende lisado de plaquetas e plasma. Os motivos pelos quais o plasma pode ser compreendido inclui configurações onde as plaquetas não foram totalmente separadas do plasma antes de sua lise e/ou onde as plaquetas tenham sido (re)suspensas em plasma antes de sua lise. Preferivelmente, a concentração de plasma de mamíferos na composição é inferior a aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, ou menos de aproximadamente 10% do volume total. Preferivelmente, a concentração de plasma de mamíferos no lisado de plaquetas é de aproximadamente 0% a aproximadamente 10%, como de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%. Opcionalmente, o lisado de plaquetas compreende plaquetas concentradas. Preferivelmente, o lisado de plaquetas de mamíferos é lisado de plaquetas humanas. Preferivelmente, o lisado de plaquetas é substancialmente livre de membranas de plaquetas de mamíferos.

[00217]. O lisado de plaquetas pode ser gerado de plaquetas de doadores únicos ou agrupados isoladas do sangue total ou por aférese. Preferivelmente, a aférese é baseada na separação de substâncias com diferentes densidades, como centrifugação e/ou a aférese envolve a absorção em esferas revestidas com um material absorvente e filtração.

[00218]. Opcionalmente, o lisado de plaquetas utilizado na presente invenção pode ser obtido submetendo uma suspensão contendo plaquetas à lise, onde as plaquetas são opcionalmente suspensas em plasma. A referida suspensão contendo plaquetas preferivelmente compreende entre 1 x 108 plaquetas/ml e 5 x 109 plaquetas/ml, preferivelmente entre 3,8 x108 plaquetas/ml e 1,2 x 109 plaquetas/ml, em média aproximadamente 7,9 x 108 plaquetas/ml.

[00219]. Prevê-se, também, que a presença do lisado de plaquetas auxilia a contribuir para a suavidade da digestão enzimática. Surpreendentemente, os inventores desvendaram que a presença de lisado de plaquetas não tem efeito negativo sobre a digestão das células (para propósitos de ilustração, veja os Exemplos 2A e 3), muito embora o lisado de plaquetas tenha sido relatado anteriormente como tendo efeito negativo sobre a atividade de determinadas enzimas, incluindo as proteases. Assim, é um fundamento importante do método de acordo com a presente invenção que o tratamento enzimático, mais precisamente a digestão com colagenase, possa ser realizada na presença do lisado de plaquetas.

[00220]. Preferivelmente, o lisado de plaquetas está presente durante a digestão enzimática a um volume percentual de 0,01% a 30%, como 0,05% a 20%, preferivelmente de 0,1% a 10%, mais preferivelmente de 0,5% a 5%, mais preferivelmente de 0,8% a 2%, e mais preferivelmente de aproximadamente 1%. “volume percentual” significa o volume total de lisado de plaquetas presente no volume total de Tampão de Digestão.

[00221]. Os inventores desvendaram que a presença de lisado de plaquetas ou de seus derivados durante a digestão enzimática, particularmente na proporção indicada acima, é vantajosa.

[00222]. O termo “lisado de plaquetas”, quando mencionado neste documento, compreende tanto o lisado de plaquetas que pode ser obtido diretamente submetendo as plaquetas à lise, bem como seus derivados, como o lisado de plaquetas inativado por calor, lisado de plaquetas filtrado estéril, etc. Em alguns casos, o uso de derivados pode ser necessário ou recomendável, por exemplo, em vista de considerações regulatórias. Em uma configuração mais preferida, o lisado de plaquetas é essencialmente livre de agentes contaminantes. Um lisado de plaquetas essencialmente livre de agentes contaminantes é definido neste documento como uma preparação de plaquetas estéril essencialmente livre de agentes infectantes como vírus (encapsulados e não encapsulados), parasitas, bactérias e endotoxinas, isto é, um lisado de plaquetas contendo tais agentes infectantes em uma quantidade que não pode ser detectada com sistemas de identificação à base de cultura, sorológicos ou moleculares ou com o teste de LAL (endotoxinas). O lisado de plaquetas inativado por patógenos (PI-PL) é fortemente preferido, veja, por exemplo, a publicação WO 2013/042095 A1 e Iudicone et al., 2014, J. Transi. Med., 12:28.

[00223]. Existem diversas vantagens associadas com a presença do lisado de plaquetas durante o tratamento enzimático, que não eram esperadas, e que serão descritas a seguir.

[00224]. Primeiro, os inventores desvendaram que a presença de lisado de plaquetas humanas não bloqueia a atividade enzimática da enzima colagenase, pelo menos não em uma extensão que viesse a interferir negativamente com a liberação enzimática desejada das células da matriz estromal.

[00225]. Os inventores desvendaram que as células que podem ser obtidas pela digestão na presença do lisado de plaquetas ou derivados são caracterizadas por excelente viabilidade (veja, por exemplo, a Figura 4A).

[00226]. Terceiro, os inventores desvendaram que as células possíveis de obter por digestão na presença de lisado de plaquetas ou derivados no método de acordo com a presente invenção apresentam excelentes propriedades proliferativas. Assim, preferivelmente, na etapa (b) a Geleia de Wharton estromal ou sua fração é submetida a tratamento enzimático na presença de lisado de plaquetas (PL) de mamífero ou de seus derivados, mais preferivelmente de lisado de plaquetas humanas (hPL) ou de seus derivados.

[00227]. Embora as plaquetas contenham moléculas bioativas e fatores de crescimento como fatores de coagulação, moléculas de adesão e proteoglicanos, fator de crescimento derivado de fibroblastos básico (bFGF), fator de crescimento epidermal (EGF), HGF, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-1), TGF-β1 e outros, sabe-se que elas contêm inibidores da protease (Astori et al., Stem Cell. Res. Ther., 2016, vol. 7, 93). Em vista deste ensinamento, a descoberta de que o lisados de plaquetas pode estar adequadamente presente durante o tratamento enzimático é marcante.

[00228]. No geral, pode-se demonstrar que as condições de extração específicas, que divergem dos protocolos de digestão com colagenase de acordo com o estado da técnica, são benéficas para a viabilidade celular e extração celular e, dessa forma, proporcionam um processo de isolamento surpreendentemente vantajoso. Em particular, é possível obter um rendimento celular maior durante o processo de isolamento de acordo com a presente invenção do que por meio do processo descrito por Seshareddy et al. (2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119). Mais particularmente, de acordo com a presente invenção, é possível obter um rendimento celular durante o processo de isolamento que é 10-25 vezes maior do que o rendimento celular descrito por Seshareddy et al. (supra). Devido à excelente viabilidade das células isoladas de acordo com a presente invenção, as células podem ser expandidas eficientemente in vitro, se desejado.

[00229]. Preferivelmente, somente uma etapa de digestão com colagenase é realizada no método de acordo com a presente invenção. Isto significa que o tecido originário do cordão umbilical, conforme descrito neste documento, é submetido a tratamento por colagenase por um determinado intervalo de tempo, e depois do término daquele intervalo de tempo, as células que foram fisicamente isoladas ou separadas do tecido são recuperadas, no entanto, o tecido restante não é submetido a ciclos adicionais de digestão por colagenase. Ao contrário, ele é preferivelmente descartado após o término do intervalo de tempo e recuperação das células.

[00230]. No final do intervalo de digestão, a mistura da digestão pode ser diluída com uma solução contendo proteína, como um meio basal suplementado com lisado de plaquetas. O momento da adição da solução contendo proteínas define o final do tempo de digestão. O tipo de meio basal não é particularmente limitado, desde que o meio seja adequado para cultivo de células de mamíferos, preferivelmente, entretanto, células-tronco mesenquimais e/ou células estromais mesenquimais. A solução contendo proteína preferivelmente compreende heparina.

[00231]. Um meio basal preferido é o MSCBM CD (meio basal definido quimicamente para células mesenquimais, Lonza), e um suplemento preferido é o lisado de plaquetas humanas (hPL) a 5% (vol./vol.).

[00232]. Acredita-se que a adição de uma solução contendo proteína, como o lisado de plaquetas humanas inibe a atividade enzimática. Sem desejar estar vinculado a tal teoria, a adição também resulta em uma diluição da enzima. Preferivelmente, pelo menos 1 volume da solução contendo proteína, com relação ao volume da mistura de digestão, é adicionado. A solução contendo proteína deve, é claro, ser uma solução que não seja incompatível com os propósitos da cultura celular, isto é, ilustrativamente ela deve ser estéril, e opcionalmente de grau BPF, etc.

[00233]. Preferivelmente, o líquido compreendendo o tecido que havia sido submetido à digestão (líquido pós-digestão) é subsequentemente submetido à separação. O termo “separação”, conforme utilizado neste documento com referência ao referido líquido pós-digestão, não é particularmente limitado e, geralmente significa que as células podem ser separadas do tecido não digerido, tecido incompletamente digerido e de outros resíduos por um método adequado, incluindo filtração e centrifugação. Em uma configuração, o referido líquido pós-digestão é filtrado para separar as células liberadas do tecido não digerido, tecido incompletamente digerido e de outros resíduos, por exemplo, por filtração, por exemplo, por filtração através de uma malha de 120 µm ou filtração com gaze, conforme descrito anteriormente (por exemplo, Del Bue et al., 2007, Veterin. Res. Comm, vol. 31, p. 289-292). Por exemplo, um tamanho de poro de filtro (malha) de 50 a 150 µm, como de 70 a 100 µm, é adequado. Opcionalmente, o material filtrante é gaze; múltiplas camadas de gaze podem ser utilizadas. Assim, preferivelmente, o líquido compreendendo o tecido que havia sido submetido à digestão é filtrado através de gaze. O filtrado é, então, chamado de “mistura digerida”. Outro método adequado de separação inclui centrifugação a baixa velocidade; neste caso, as células permanecem no sobrenadante, ao passo que o tecido não digerido, tecido incompletamente digerido ou outros resíduos são peletizados; neste caso, o sobrenadante é chamado de “mistura digerida”. Opcionalmente, a filtração e a centrifugação a baixa velocidade são combináveis, em qualquer ordem. Alternativamente, a separação é realizada somente por filtração ou somente por centrifugação a baixa velocidade, onde somente a filtração é preferida.

[00234]. Preferivelmente, a mistura digerida é subsequentemente centrifugada, preferivelmente subsequente à filtração. A pessoa com habilidade pode ajustar as condições da centrífuga àquelas adequadas para peletizar células estromais mesenquimais, sem prejudicar suas propriedades proliferativas e viabilidade. Por exemplo, a mistura digerida pode ser centrifugada a 680 x g por 15 minutos utilizando 250 ml de tubos de centrifugação. No final da centrifugação, o sobrenadante é removido e o agregado, que contém as células desejadas, é ressuspenso. De preferência, em configurações onde o método de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais etapas de expansão, o agregado de células é ressuspenso no mesmo meio de crescimento conforme utilizado na (primeira) etapa de expansão. A expansão de acordo com a presente invenção será descrita subsequentemente em detalhes.

[00235]. Normalmente, a mistura digerida compreende múltiplas células, isto é, uma população celular. Preferivelmente, a população celular obtida pelo tratamento enzimático conforme descrito neste documento é utilizada diretamente conforme obtida, isto é, sem qualquer seleção negativa (destruição seletiva de células indesejadas). Um uso adequado, mas opcional, consiste na expansão da célula, que será descrita abaixo.

[00236]. Um exemplo ilustrativo do procedimento de isolamento é descrito no Exemplo 2A. Conforme mostrado no Exemplo 3, o uso do lisado de plaquetas não influencia negativamente a atividade da colagenase, na liberação das células e em sua viabilidade. É um achado surpreendente porque se relatou, anteriormente, que o lisado de plaquetas afeta negativamente a atividade de determinadas enzimas, incluindo as proteases.

[00237]. O tratamento enzimático é preferivelmente realizado sob condições estéreis.

[00238]. O isolamento de uma célula individual, se desejado, pode ser alcançado, por exemplo, por diluição em série. Dessa forma, uma célula individual isolada pode ser obtida. A diluição em série é uma etapa opcional após a etapa (b); no entanto, obter uma célula única isolada não é um objetivo principal da invenção; ao contrário, prefere-se que a etapa (b) seja seguida pela etapa (c) para expansão da(s) célula(s), conforme descrito a seguir. Expansão

[00239]. As células obtidas durante o isolamento, em particular as etapas

(a) e (b) do método da invenção, podem ser expandidas (isto é, submetidas à expansão). As células são expandidas ex vivo. A expansão ex vivo permite que a pessoa com habilidade selecione condições de cultivo definidas. Estas serão descritas a seguir.

[00240]. O objetivo da expansão é multiplicar as células isoladas anteriormente, que apresentam propriedades vantajosas. Como é comum na técnica, a expansão ocorre em um meio de cultura. A menos que especificado de outra forma, as condições adequadas para expansão incluem condições geralmente conhecidas como sendo adequadas para a cultura de células de mamíferos, mais especificamente para expansão de células de mamíferos.

[00241]. A expansão é um período do processo de cultivo/produção celular que é predominantemente caracterizado pelo elevado crescimento celular e elevada atividade mitótica. Na presente invenção, a expansão serve, entre outras coisas, para aumentar o número de células, o que significa gerar um aumento do número de células, que são, preferivelmente mitoticamente ativas e mais preferivelmente na fase de crescimento exponencial. Com a expansão, populações celulares maiores podem ser obtidas. A etapa de expansão das células de acordo com a presente invenção pode ser uma etapa única de permitir que as células proliferem sob condições apropriadas. No entanto, mais preferivelmente, a expansão de acordo com a presente invenção compreende múltiplas passagens, conforme será descrito adicionalmente abaixo.

[00242]. A expansão é geralmente realizada sob condições estéreis, e tipicamente também sob condições de outra forma necessárias ou úteis ou recomendadas para o cultivo de células de mamíferos.

[00243]. Esta configuração da invenção é baseada no achado de que uma seção específica da Geleia de Wharton, isto é, a Geleia de Wharton estromal, compreende células que podem ser isoladas de forma eficiente e confiável, e subsequentemente expandidas eficientemente e confiavelmente. Dessa forma, uma vez que as células tenham sido isoladas, sua população é expandida mitoticamente.

[00244]. Assim, opcionalmente e muito geralmente, o método de acordo com a presente invenção compreende uma ou mais etapas adicionais. Em particular, em configurações preferidas da presente invenção, uma etapa para aumentar o número de células é compreendida, tirando vantagem da divisão celular potencial das células obtidas na etapa (b). Nestas configurações preferidas, a etapa (b) é seguida por uma etapa (c); a etapa (c) compreende a expansão de pelo menos uma célula obtida na etapa (b). A etapa (c) também é chamada aqui de “etapa de expansão” ou simplesmente de “expansão”.

[00245]. As condições de expansão são selecionadas para serem adequadas para crescimento ex vivo e divisão celular de células estromais mesenquimais. Dessa forma, obtém-se uma cultura enriquecida para células estromais mesenquimais. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, é possível prever que a cultura selecione um subconjunto específico das células isoladas, enriquecendo-as, ou mais, as células estão mudando seu fenótipo.

[00246]. A expansão de acordo com a presente invenção apresenta sinergias com o isolamento de acordo com a invenção, como segue: Embora o número total de células isoladas nas condições leves preferidas de acordo com a presente invenção possa ser (e normalmente é) menor do que o número total de células extraíveis pelo método sugerido pelo processo de patente US2004 0136967 A1 e Seshareddy et al., Meth. Cell Biol., 86:101-119, 2008, os inventores desvendaram que células de células isoladas nas condições leves preferidas de acordo com a presente invenção são particularmente adequadas para expansão, por exemplo, em vista de seu elevado percentual de viabilidade (para propósitos de ilustração, veja a Figura 4B), e também em vista de seu elevado potencial proliferativo (para propósitos de ilustração, veja a Figura 9), e, dessa forma, elevados números de células podem ser obtidos expandindo as células derivadas de SWJ isoladas de acordo com a presente invenção. Em outras palavras, o procedimento de isolamento preferido de acordo com a presente invenção juntamente com a expansão de acordo com a presente invenção carrega a vantagem sinergística de que menos material de partida e/ou menos passagens são necessárias para alcançar um número de células desejado específico porque a maioria das células submetidas à expansão é viável, e elas se proliferam particularmente bem.

[00247]. Preferivelmente, as células derivadas do cordão umbilical obtidas de acordo com a presente revelação são as únicas células submetidas à etapa de expansão. Nestas configurações, é particularmente preferido que nenhuma célula nutriente esteja presente durante a etapa de expansão.

[00248]. Tipicamente, a expansão ocorre em um vaso de cultura. Mais precisamente, as células destinadas a serem submetidas à expansão são semeadas em um vaso de cultura. Vasos de cultura típicos são frascos, placas e pilhas (onde as pilhas são tipicamente compostas de uma multiplicidade de placas empilhadas umas sobre as outras). Os vasos de cultura particularmente adequados no contexto das presentes invenções são recipientes de cultura que permitem a aderência das células no fundo do vaso de cultura; estes vasos são frascos, placas e pilhas com uma superfície de fundo planar. Preferivelmente, os vasos de cultura apresentam pelo menos uma superfície de fundo plástica. Mais preferivelmente, o vaso de cultura é um vaso de cultura plástico. Preferivelmente, o vaso de cultura apresenta uma superfície de fundo plana (“fundo plano”).

[00249]. O tipo de plástico não é particularmente limitado, desde que seja adequado para a cultura celular; no entanto, polímeros hidrofóbicos como, particularmente, poliestireno, opcionalmente de superfície modificada, são preferidos. A modificação da superfície pode ser realizada pela técnica de plasma, que torna uma variedade de grupos químicos funcionais disponíveis sobre a superfície do poliestireno, e que são adequados para a aderência de células em geral. Estas técnicas fazem parte do estado da técnica, e vasos de plásticos com superfície modificada para a cultura de células aderente estão comercialmente disponíveis.

[00250]. Preferivelmente, no entanto, a superfície do vaso de cultura celular não é revestida com proteína antes do uso. Em particular, ele não é revestido com proteínas como proteínas de matriz celular como colágeno e polilisina.

[00251]. Preferivelmente, a expansão é realizada para múltiplas passagens. Os detalhes das passagens são descritos abaixo. Meio de crescimento

[00252]. O meio de crescimento para expansão de acordo com a presente invenção compreenderá tipicamente um meio basal e um ou mais suplementos. Em um sentido amplo, o tipo de meio basal utilizado não é particularmente limitado. Meios basais típicos são à base de água e são quimicamente definidos. “quimicamente definido” significa que o meio basal é composto de ingredientes específicos em quantidades específicas; a vantagem de meios basais quimicamente definidos é que eles podem ser preparados de forma reprodutível, sem variação devido às condições experimentais, laboratoriais, etc. O meio basal é normalmente estéril. Meios basais para crescimento de células de mamíferos são comercialmente disponibilizados por diferentes fornecedores comerciais.

[00253]. Tipicamente, meios basais compreendem ingrediente que compreendem aminoácidos, sais (como cloreto de cálcio, cloreto de potássio, sulfato de magnésio, cloreto de sódio e fosfato monossódico), glicose, e vitaminas (como ácido fólico, nicotinamida, riboflavina, B12), pelo menos um agente tamponante (como, por exemplo, HEPES), e tipicamente também um agente corante (por exemplo, vermelho de fenol); no entanto, isto não é essencial. A maioria dos meios basais comercialmente disponíveis inclui vermelho de fenol como um indicador de pH (agente corante), que permite o monitoramento constante do pH.

[00254]. Preferivelmente, o meio de crescimento basal é um que não exija a adição de uma matriz de fixação nas células da placa.

[00255]. Preferivelmente, o meio basal é livre de soro. Livre de soro significa que nenhum soro humano ou animal está contido nele. Mais preferivelmente, o meio basal é um meio basal quimicamente definido, que é livre de soro.

[00256]. Preferivelmente, o meio basal é quimicamente definido. Um meio basal quimicamente definido é um meio basal adequado para a cultura celular in vitro de células humanas ou animais no qual todos os componentes químicos são conhecidos. Em particular, meios quimicamente definidos exigem que todos os componentes devem ser identificados e ter suas concentrações exatas conhecidas. Portanto, um meio quimicamente definido deve ser totalmente livre de componentes derivados de animais e não pode conter soro ou proteínas derivadas de soro, como soro fetal bovino, albumina sérica bovina ou albumina sérica humana. Um meio basal quimicamente definido não compreende somente proteínas recombinantes e/ou hormônios. Para alcançar isto, meios quimicamente definidos não compreendem componentes de fontes humanas ou animais, como proteínas e/ou fatores de crescimento; particularmente, não compreende albumina de fontes humanas ou animais, nem fatores de crescimento de fontes humanas ou animais. Preferivelmente, compreende albumina recombinante e/ou fatores de crescimento recombinantes, geralmente derivados de fontes não humanas, não animais como células vegetais e bactérias, e/ou substâncias químicas sintéticas como, por exemplo, álcool polivinílico.

[00257]. Em algumas configurações, um meio basal quimicamente definido compreende (a) um meio basal convencional (como DMEM, F12, ou RPMI 1640, compreendendo aminoácidos, vitaminas, sais inorgânicos, tampões, antioxidantes e fontes de energia), e (b) um ou mais ingredientes substitutos de soro, opcionalmente selecionados mas não limitados à seguinte lista aberta: albumina recombinante, lipídeo(s) quimicamente definidos, insulina recombinante e/ou íon(s) metálico(s) como zinco, transferrina recombinante ou ferro, selênio e um antioxidante tiol como 2- mercaptoetanol ou 1-tioglicerol.

[00258]. Meios basais podem, por exemplo, ser selecionados da lista que compreende, mas não está limita ao meio essencial mínimo de Eagle (EMEM), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), alfa-MEM, RPMI-1640, IMDM, e outros. Se desejado, um ou mais ingredientes substitutos de soro são adicionados a estes meios. Assim, meios basais livres de soro são obtidos.

[00259]. Mais preferivelmente, o meio basal é um meio basal adequado para cultura de células estromais mesenquimais e/ou células-tronco mesenquimais. Preferivelmente, o meio de crescimento basal é adequado para múltiplas passagens de expansão de MSCs, particularmente de MSCs humanas, mais particularmente de MSCs (preferivelmente humanas) derivadas de Geleia de Wharton estromal.

[00260]. Meios adequados para cultura de células estromais mesenquimais e/ou células-tronco mesenquimais são comercialmente disponíveis e algumas delas são especificamente comercializadas para este propósito. Por exemplo, o TheraPEAK™ MSCBM CD (ao longo deste documento chamado de MSCBM CD, para propósitos de simplicidade) é um meio basal quimicamente definido que foi descrito como sendo adequado para células-tronco mesenquimais por seu fabricante Lonza (Wakersville, MD, EUA; Cat. No 95062-688). De fato, os presentes inventores identificaram este meio basal como sendo particularmente adequado. Assim, o MSCBM CD é um meio basal preferido para uso na presente invenção.

[00261]. Igualmente preferidos são todos os meios basais substancialmente equivalentes ao MSCBM CD. O termo “substancialmente equivalente” é definido abaixo. A similaridade da composição do meio basal, em termos de ingredientes e suas quantidades relativas, podem ser testadas por uma combinação de métodos cromatográficos e/ou espectrométricos, ou semelhantes.

[00262]. Em geral, encontrar um meio de cultura adequado é muito importante para o desempenho geral de uma cultura celular. Isto tem sido tratado identificando-se o MSCBM CD e os meios basais substanciais equivalentes a ele como um meio basal particularmente adequado para a presente invenção. O MSCBM CD é um meio basal quimicamente definido para célula mesenquimal e é disponibilizado comercialmente pela Lonza (Lonza, Wakersville, MD, EUA), Cat. No 95062-688. Variações do MSCBM CD, como meios particularmente basais que são compostos ou que compreendem os mesmos componentes que o MSCBM CD, muito embora, por exemplo, em outras quantidades e proporções, ou meios basais que são compostos ou que compreendem compostos particularmente ou totalmente diversos dos componentes do MSCBM CD, embora com efeito substancialmente equivalente sobre o crescimento das MSCs, quando utilizados conforme descrito neste documento, são igualmente compreendidos pelo uso de acordo com a presente invenção.

[00263]. Outros meios basais também são adequados para expansão de MSCs no método da presente invenção. Por exemplo, os inventores desvendaram que o DMEM é um meio basal que também pode ser utilizado, quando compreendido em um meio de crescimento adicionalmente compreendendo pelo menos um suplemento, conforme descrito abaixo (dados não mostrados).

[00264]. Em configurações importantes da presente invenção, o meio de crescimento compreende um meio basal e pelo menos um suplemento(s), particularmente o lisado de plaquetas. Dessa forma, preferivelmente, pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento baseado em um meio basal e que contém pelo menos um suplemento. O lisado de plaquetas é um suplemento preferido.

[00265]. “Com base em” significa que o meio basal, por exemplo, MSCBM CD, é suplementado com pelo menos um suplemento. Se os suplementos forem adicionados na forma líquida, então, o meio basal é levemente diluído pela adição de pelo menos um suplemento; no entanto, uma leve diluição não causa qualquer preocupação geral. Em uma configuração preferida, suplementos podem ser selecionados da lista que compreende soro humano ou animal, lisado de plaquetas humanas ou animais, lisado de células humanas ou animais ou vegetais, um ou mais antibióticos, heparina, fatores de crescimento suplementares, como insulina, ou hidrocortisona, aminoácidos como glutamina ou seus oligômeros.

[00266]. Preferivelmente, o meio de crescimento compreende heparina como suplemento. Concentrações adequadas de heparina no meio de crescimento são de 0,1 a 100 U/mL, como 1 a 10 U/mL, por exemplo, 2 U/mL. U significa uma unidade (unidade Howell) de heparina, conforme descrito acima. Heparina pode ser adicionada ao meio basal.

[00267]. Em uma configuração particularmente preferida, pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento baseado no meio basal MSCBM CD (Lonza, Wakersville, MD, EUA; Cat. No 95062-688), ou em um meio basal substancialmente equivalente a ele. Na presente invenção, o MSCBM CD, por exemplo, comprovou ser particularmente vantajoso para gerar duplicações de população cumulativas elevadas/elevados números de células.

[00268]. Se dois meios basais são substancialmente equivalentes um ao outro ou não, para o propósito da presente invenção, eles são testados desenvolvendo células, preferivelmente isoladas do mesmo cordão umbilical, em meios de crescimento baseados nos referidos meios basais substancialmente sob as mesmas condições, isto é, com os mesmos aditivos (por exemplo, lisado de plaquetas), nas mesmas quantidades, nas mesmas placas de cultura na mesma temperatura, etc., preferivelmente em paralelo. Em outras palavras, para testar se os referidos dois meios basais são substancialmente equivalentes um ao outro, a única variável no teste de crescimento é o próprio meio basal. As células são preferivelmente MSCs derivadas da Geleia de Wharton estromal, isoladas de acordo com os Exemplos 1 e 2A, e submetidas a subcultura ("P0") como no Exemplo 2B. As células da P0, após tripsinização são, então, submetidas a crescimento, em paralelo, em um meio de crescimento baseado em um primeiro meio basal (por exemplo, MSCBM CD), e em um meio de crescimento baseado em um segundo meio basal (a ser testado quanto à equivalência substancial). Os dois meios basais são considerados substancialmente equivalentes quando o seguinte for observado: a duplicação cumulativa média da população por placa (P1-P8) é substancialmente a mesma (máximo de 10% +/- desvio) e a senescência das células obtidas depois da passagem 8 (para conhecer a referência, veja o Exemplo 11) é substancialmente a mesma (máximo de 10% +/- desvio).

[00269]. Em uma configuração alternativa, o meio de crescimento é baseado em um meio basal que, embora não seja substancialmente equivalente ao MSCBM CD, é caracterizado como segue: a duplicação cumulativa média da população por placa (P1-P8) é de pelo menos 70%, em comparação com o crescimento em um meio de crescimento de outra forma idêntico baseado no meio basal MSCMB CD, e a senescência das células obtidas depois da passagem 8 (para conhecer a referência, veja o Exemplo 11) é de 150% ou menos, em comparação com a senescência de células desenvolvidas em paralelo em um meio de crescimento de outra forma idêntico, mas com base no meio basal MSCMB CD. O DMEM (disponibilizado comercialmente por diferentes fornecedores) pode ser uma configuração de tal meio basal.

[00270]. Preferivelmente, o meio de crescimento suporta a diferenciação multilinhagem de MSCs, particularmente das MSCs da invenção. Se necessário, suplementos são adicionados a um meio basal para conduzir a diferenciação de células em uma linhagem particular. Testes para diferenciação multilinhagem são descritos abaixo.

[00271]. Preferivelmente, o lisado de plaquetas ou um derivado dele está presente no meio de crescimento. Assim, um meio de crescimento útil na presente invenção compreende preferivelmente o lisado de plaquetas. Mais especificamente, os presentes inventores demonstraram que a combinação do meio basal MSCBM CD, ou meios basais substancialmente equivalentes a ele, com o suplemento lisado de plaquetas é particularmente adequado, e este meio de crescimento é mais preferido. Preferivelmente, quando o lisado de plaquetas está presente, nenhum soro humano ou animal está presente no meio de crescimento, e mais preferivelmente nenhum lisado de células humanas, animais ou vegetais, exceto o lisado de plaquetas, está presente. O uso de lisado de plaquetas no meio de crescimento de acordo com a presente invenção, ao invés de soro humano ou animal, trata de questões associadas com o uso tradicional de soro humano em vista dos riscos de transmitir príons, vírus ou de induzir reações imunológicas nos beneficiários após a infusão e restrições regulatórias de acordo com a boa prática de fabricação (BPF).

[00272]. Se o lisado de plaquetas estiver presente no meio de crescimento, ou mais precisamente tiver sido adicionado a um meio basal (como o MSCBM CD da Lonza, por exemplo, ou um meio basal substancialmente equivalente a ele), então, o lisado de plaquetas também pode ser chamado de suplemento do meio basal.

[00273]. O lisado de plaquetas adequado como suplemento nesta configuração geralmente corresponde ao lisado de plaquetas descrito para a configuração de adicionar lisado de plaquetas durante a digestão enzimática, descrita, acima, no entanto, as quatro configurações adicionais mais preferidas a seguir são preferivelmente, adicionalmente atendidas, sozinhas ou em combinação.

[00274]. Em uma primeira configuração particularmente preferida, o lisado de plaquetas é da mesma espécie (no entanto, tipicamente não do mesmo indivíduo) como o cordão umbilical. A vantagem associada com o cultivo na presença de lisado de plaquetas da mesma espécie é surpreendente, particularmente em vista do preconceito na técnica anterior contra o uso de lisado de plaquetas da mesma espécie para cultura de células estromais: por exemplo, relatou-se que o lisado de plaquetas equino não é geralmente vantajoso para a cultura de células estromais mesenquimais equinas (Russell et al., 2016, Equine Vet. J., vol. 48, p. 261-264) e que o lisado de plaquetas canino é inferior ao soro fetal bovino para o isolamento e propagação de células estromais mesenquimais caninas (Russell et al., PLOS One, 2015, vol. Vol. 10, e0136621). É fortemente preferido que o lisado de plaquetas utilizado compreenda plaquetas de múltiplos doadores, incluídos em cada preparação para compensar a variabilidade individual e para obter um produto de lisado de plaquetas mais padronizado e reprodutível; o agrupamento de plaquetas obtidas por buffy-coats (camadas leucoplaquetárias) derivadas de sangue total é um procedimento padronizado, veja, por exemplo, Iudicone et al., 2014, J. Transl. Med., 12: 28. Preferivelmente, o lisado de plaquetas é derivado de sangue de mamíferos. Dependendo do propósito, um mamífero adequado pode ser escolhido como fonte de sangue.

[00275]. Os mamíferos destinados ao uso de acordo com a presente invenção podem, a princípio, ser todos os animais, jovens ou adultos, a partir dos quais a quantidade de plaquetas necessária pode ser razoavelmente coletada. Em algumas configurações, principalmente animais mamíferos adultos são utilizados. Exemplos de animais não humanos são animais para abate e outros animais criados em fazenda como gado, porcos, ovelhas ou aves. O lisado de plaquetas de mamíferos é preferido, o lisado de plaquetas humanas (abreviado como "hPL") é fortemente preferido. Em algumas configurações, o mamífero é humano. Em geral, o lisado de plaquetas adicionado é preferivelmente da mesma espécie que o cordão umbilical/células. Em particular, para o cultivo de células originárias do cordão umbilical humano, a adição de lisado de plaquetas humanas é preferida. O lisado de plaquetas é tipicamente alogênico às células. Em algumas configurações, os doadores de sangue são saudáveis e satisfazem às exigências estabelecidas pelas agências reguladoras relevantes. Por exemplo, o sangue pode satisfazer às exigências que uma autoridade de administração de alimentos/medicamentos nacional faz sobre produtos destinados a alimentos ou uso médico, ou satisfazer os regulamentos correspondentes dentro da área geográfica onde a presente invenção é colocada em prática. O lisado de plaquetas humanas pode, no todo ou em parte, (preferivelmente no todo), substituir o soro fetal bovino. Em configurações mais preferidas, o lisado de plaquetas é de doadores humanos. Nestas configurações, é preferível que os doadores tenham idade inferior a aproximadamente 50, aproximadamente 45, aproximadamente 40, ou menos.

[00276]. Em uma segunda configuração particularmente preferida, o lisado de plaquetas aumentou a atividade promotora de crescimento nas células, particularmente em MSCs derivadas da Geleia de Wharton de acordo com a presente invenção, quando utilizadas como suplemento em um meio de cultura celular, em comparação com o soro bovino, particularmente o soro fetal bovino (FBS) na mesma concentração. Em algumas configurações, a composição apresenta pelo menos 20% de aumento da atividade promotora de crescimento nas células em comparação com o soro fetal bovino (FBS) na mesma concentração.

[00277]. Em uma terceira configuração particularmente preferida, a concentração de lisado de plaquetas no meio de crescimento é de aproximadamente 0,1% (vol./vol.) a aproximadamente 20% (vol./vol.), preferivelmente de aproximadamente 0,5% (vol./vol.) a aproximadamente 10% (vol./vol.), mais preferivelmente de aproximadamente 1% (vol./vol.) a aproximadamente 5% (vol./vol.), como 1% (vol./vol.), 2% (vol./vol.), 3% (vol./vol.), 4% (vol./vol.) ou 5% (vol./vol.). Aproximadamente 5% (vol./vol.) foi comprovada como sendo particularmente útil (veja os exemplos neste documento) e, assim, é a preferida, em particular em combinação com um meio basal quimicamente definido para células-tronco mesenquimais, como MSCBM CD (Lonza), ou um meio basal substancialmente equivalente a ele.

[00278]. Em uma quarta configuração particularmente preferida, o lisado de plaquetas que é adicional ao meio de crescimento compreende derivados de plaquetas. Alternativamente, o lisado de plaquetas é substancialmente livre de membranas de plaquetas de mamíferos e/ou de outros resíduos celulares. Conforme utilizado neste documento, substancialmente livre significa que existe apenas uma quantidade não detectável de membranas de plaquetas, ou que a quantidade de membranas de plaquetas não pode ser reduzida adicionalmente por qualquer método razoável, comercialmente adequado, ou que a quantidade de membranas de plaquetas não interfere substancialmente com o uso do lisado de plaquetas. As membranas de plaquetas podem ser separadas do lisado de plaquetas utilizando qualquer método adequado conhecido no campo, como o gradiente de densidade.

[00279]. Algumas configurações úteis são apresentadas nos Exemplos 0 e

2.

[00280]. Preferivelmente, o lisado de plaquetas ou seus derivados é/estão preferivelmente presente(s) durante toda ou parte da etapa de expansão (c). Assim, preferivelmente, na etapa (c) pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento que compreende lisado de plaquetas (PL) ou seus derivados, preferivelmente lisado de plaquetas humanas (hPL) ou seus derivados.

[00281]. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria, prevê-se que a presença de lisado de plaquetas oferece nutrientes e fatores de crescimento e contribui para um ambiente que permite a expansão eficiente de células. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria, também é concebível que a presença de lisado de plaquetas auxilia no equilíbrio ou na inibição de qualquer atividade enzimática remanescente depois da extração enzimática, e, dessa forma, para a suavidade das condições durante a fase de expansão subsequente. O lisado de plaquetas humanas (hPL) é preferido para uso com MSCs humanas.

[00282]. Assim, na presente invenção, o lisado de plaquetas (PL) pode ser uma alternativa ao soro animal para submeter células estromais mesenquimais à cultura (para propósitos de ilustração e obter detalhes adicionais, veja, também, a publicação WO 2013/042095 A1). As plaquetas são conhecidas por ser uma rica fonte de diversos fatores de crescimento como o PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas), b-FGF (fator de crescimento de fibroblastos básico), VEGF (fator de crescimento endotelial vascular) e TGF-β (fator de crescimento transformador-β).

[00283]. Opcionalmente, um ou mais antibióticos estão presentes no meio de crescimento. Se sim, um ou mais antibióticos podem ser adicionados ao meio basal como suplementos. Antibióticos adequados no contexto da presente invenção incluem, por exemplo, anfotericina e gentamicina, entre outros. As concentrações de um ou mais antibióticos no meio de crescimento são preferivelmente as faixas de concentração comumente utilizadas na técnica. Alternativamente, nenhum antibiótico adicionado está presente no meio de crescimento.

[00284]. Preferivelmente, nenhum ingrediente adicional além daqueles listados acima é adicionado ao meio basal. Em particular, é mais preferido que pelo menos uma célula seja expandida em um meio de crescimento que não compreenda qualquer adição de soro, em particular nenhum soro bovino, como o soro fetal bovino (FBS). Para o propósito daquela configuração, o lisado de plaquetas não se enquadra na definição de soro; em outras palavras, mesmo que algum soro ou traços de soro possam ser incluídos no lisado de plaquetas adicionado ao meio de crescimento, pode- se dizer que o meio de crescimento não contém "soro adicionado", que se destina a especificar que não há adição de soro como ingrediente de cultura celular no sentido clássico. Na presente invenção, o FBS é um aditivo indesejado, por exemplo, porque apresenta o risco de transmitir doenças virais e príons. Ao contrário, o método da presente invenção funciona eficientemente na presença de lisado de plaquetas, por exemplo, como um substituto para o FBS. Para o crescimento de MSCs humanas, o lisado de plaquetas humanas é preferido como aditivo ao invés do FBS.

[00285]. Preferivelmente, nenhuma matriz de fixação é fornecida ou está presente quando as células são submetidas a uma passagem em uma placa de crescimento. Assim, nenhuma matriz de fixação é fornecida ou está presente quando as células são semeadas em placa e/ou nenhuma matriz de fixação é adicionada como suplemento ao meio basal. Passagens

[00286]. Em uma configuração preferida, as células são expandidas durante uma ou mais passagens.

[00287]. "Passagem" se refere a uma cultura de células em um vaso de cultura (de um determinado tipo), dentro do qual as células são semeadas para iniciar a respectiva passagem. Normalmente as células aderem ao referido vaso de cultura enquanto estão sendo cultivadas, e as células normalmente se expandem dentro do referido vaso de cultura enquanto estão sendo cultivadas. O final de uma passagem é definido pela separação das células normalmente aderentes (por exemplo, por tripsinização). Então, células são subsequentemente, opcionalmente semeadas em um vaso de cultura fresco do mesmo tipo ou diferente; a semeadura no vaso de cultura fresco define o início de uma passagem subsequente. Assim, quando as células, após tal expansão, são transferidas daquele vaso de cultura para outro vaso de cultura, então as células presentes naquele outro vaso de cultura representam a próxima passagem.

[00288]. “Colheita” se refere ao processo de obter substancialmente todas as células crescidas em um vaso de cultura no final de uma passagem.

[00289]. Para cada passagem, um vaso de cultura pode ser utilizado; mais preferivelmente, no entanto, múltiplos vasos de cultura são utilizados em paralelo por cada passagem. Então, as células são submetidas a cultura em paralelo nos múltiplos vasos de cultura, sob condições substancialmente idênticas por substancialmente o mesmo tempo. Preferivelmente, a densidade da semeadura nos múltiplos vasos de cultura é substancialmente a mesma.

[00290]. No início de cada passagem, as células (não aderentes/isoladas, preferivelmente em um número/densidade desejado(a)) são adicionadas a um vaso de cultura que inclui meio de crescimento.

[00291]. Embora não seja necessário para o crescimento celular, antibióticos são frequentemente utilizados para controlar o crescimento de contaminantes bacterianos e fúngicos. Isto é particularmente preferido nas passagens iniciais, mas não é preferido em passagens posteriores, como, por exemplo, da P2 em diante ou da P1 em diante. Assim, mesmo que antibióticos estejam presentes na primeira passagem após o isolamento das células ("P0"), os antibióticos são preferivelmente descontinuados para todas as passagens depois da P0; em outras palavras, um meio de crescimento sem adição de antibióticos pode ser utilizado para P1 e para todas as passagens subsequentes. Dessa forma, na presente invenção, antibióticos estão preferivelmente presentes como um suplemento na primeira cultura celular (por exemplo, P0), depois do isolamento das células do cordão umbilical, mas não nas culturas celulares posteriores, isto é, nas subculturas de P0.

[00292]. No final de cada passagem, quando as células alcançaram um percentual de confluência de acordo com o critério 3 da tabela abaixo, as células são coletadas. Para este propósito, o meio de crescimento (e quaisquer células não aderentes incluídas nele, se houver) é aspirado, as células aderentes são opcionalmente lavadas com um tampão estéril adequado e opcionalmente, mas preferivelmente, separadas enzimaticamente, como tripsinizadas, opcionalmente contadas, opcionalmente, mas preferivelmente, concentradas por centrifugação, e opcionalmente, mas preferivelmente, ressuspensas, preferivelmente em meio de crescimento adequado para MSCs, conforme descrito neste documento. As células não aderentes ressuspensas são, então, opcionalmente utilizadas para serem adicionadas no início da passagem de cultura subsequente.

[00293]. As passagens são numeradas consecutivamente conforme descrito abaixo em detalhes, começando com a passagem 0 (P0). A P0 é a primeira passagem depois da obtenção das células, preferivelmente por digestão enzimática,

conforme descrito acima. Dessa forma, a P0 pode ser chamada de “cultura primária”. As células para inoculação do originado primário da Geleia de Wharton do cordão umbilical, do tecido mecanicamente e/ou enzimaticamente dissociado, conforme descrito acima, ou – alternativamente, mas muito menos preferido – de um crescimento excessivo de células migratórias do tecido da Geleia de Wharton estromal.

[00294]. Pelo crescimento de células em várias passagens, as células podem ser expandidas para número de células totais mais elevados e/ou maior homogeneidade e/ou menos contaminação por células não desejadas do que o que seria possível em uma única passagem. As células podem ser expandidas sob condições definidas ou de outra forma, sob condições desejadas.

[00295]. Reconhece-se, geralmente, que as células estromais do cordão umbilical (UC) são heterogêneas com relação à estrutura, propriedades bilógicas e localização dentro do UC. Por exemplo, a Figura 7A mostra que as células derivadas do UC frescamente isoladas, tanto de acordo com a presente invenção quanto de acordo com o estado da técnica, são heterogêneas com relação à exibição de determinados marcadores de superfície.

[00296]. É normal que nem todas as células isoladas da Geleia de Wharton estromal (nem qualquer área do cordão umbilical) sejam clonogênicas. Em outras palavras, nem todas as células isoladas são unidades formadoras de colônia (UFC). No entanto, pelo crescimento das células isoladas de acordo com a presente invenção por múltiplas passagens, as células estromais mesenquimais desejadas, que são clonogênicas, podem ser enriquecidas. Assim, em uma configuração, a expansão de acordo com a presente invenção é caracterizada de forma que o percentual de MSCs aumente ao longo do tempo. Por exemplo, o percentual de MSCs no final da P0 pode ser tipicamente maior do que o percentual de MSCs no início da P0.

[00297]. Na presente invenção, múltiplas passagens da cultura conferem a vantagem de que as MSCs podem ser enriquecidas, com relação a outras células (não desejadas ou contaminantes), como as hemácias, porque (a) as células não aderentes (e, dessa forma, não MSC) são removidas juntamente com o meio de crescimento no final de uma passagem de cultura, (b) as células com propriedades proliferativas inferiores às das MSCs substancialmente não se proliferarão, bem como as MSCs, e dessa forma, ao longo do curso de diversas passagens cumulativas, a população celular se torna enriquecida nas MSCs, e eventualmente (normalmente a partir da P1 em diante) substancialmente pura para MSCs.

[00298]. É geralmente possível converter aritmeticamente o número de passagens em duplicações cumulativas da população, desde que sejam utilizadas condições definidas ou de outra forma bem estabelecidas.

[00299]. As células são preferivelmente expandidas em múltiplas passagens, preferivelmente mais de uma a menos do que catorze passagens. Por exemplo, as células são submetidas a cultura por três a seis passagens.

[00300]. Em uma configuração precisa, células frescamente isoladas são, depois da digestão enzimática, inicialmente submetidas a uma passagem de cultura primária (para propósitos de ilustração exemplar, veja o Exemplo 2B) – a passagem de cultura primária pode ser chamada de P0; opcionalmente, a expansão é repetida em uma nova passagem sob condições para P0 (a passagem de cultura repetida é, então, chamada de P0+). Passagens subsequentes, isto é, após a P0 diretamente, ou depois da P0+, são numeradas como P1, P2, e assim por diante. Em uma configuração preferida, as células são expandidas pelo menos até P2 e não mais do que até P6. Em uma configuração mais preferida, as células ao expandidas até P4.

[00301]. Com relação às Duplicações cumulativas da População, é tipicamente difícil determinar a Duplicações cumulativas da População durante a P0. O principal motivo é que, na experiência dos presentes inventores, nem todas as células semeadas no início da P0 serão expandidas. A fim de determinar as Duplicações cumulativas da População durante a P0, seria necessário determinar o número ou fração de células clonogênicas no início da P0, isto é, aquelas células que são capazes de se expandir, dessa forma, dando origem a células derivadas. Embora esta determinação não seja geralmente inviável, ela não é necessária para o método da presente invenção; ao invés disso, nestas configurações, as Duplicações cumulativas da População são determinadas para todas as passagens, exceto a P0. Embora as células originalmente isoladas do cordão umbilical normalmente compreendam MSCs, que são clonogênicas, bem como outras células (por exemplo, hemácias), que não são clonogênicas, as outras células não estarão substancialmente presentes além da P0, conforme descrito abaixo, entre outras coisas, porque estas células não clonogênicas não geram descendentes durante a P0.

[00302]. Em uma configuração, as células são expandidas por 5 a 30 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da

População durante a P0), como 8 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0). Em uma configuração preferida, as células são expandidas por apenas 5 a 14 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0). Esta configuração é adequada para a criação de um Banco de Células Primário.

[00303]. Em uma configuração alternativa preferida, as células são expandidas por 14 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0). Esta configuração é adequada para a criação de um Banco de Células Secundário.

[00304]. Na experiência dos inventores, as Duplicações cumulativas da População durante a P1 e a P2 (total de P1 mais P2, mas não incluindo a P0), como uma regra muito geral, estão normalmente na faixa de 7 a 15, preferivelmente de 9 a

13. Na experiência dos inventores, as Duplicações cumulativas da População durante a P3 e a P4 (total de P3 mais P4, mas não incluindo a P0, P1 e P2), como uma regra muito geral, estão normalmente na faixa de 4 a 12, preferivelmente de 6-10. Consequentemente, as Duplicações cumulativas da População durante a P1, P2, P3 e P4 (total de P1 mais P2 mais P3 mais P4, mas nãoincluindo a P0), como uma regra muito geral, estão normalmente na faixa de 9 a 27, preferivelmente na faixa de 15 a

23. Estes números não incluem as Duplicações cumulativas da População durante a P0.

[00305]. No início de cada passagem, as células são transferidas para um vaso de cultura celular. Preferivelmente, as células são transferidas em uma quantidade específica de células por vaso de cultura. A quantidade é preferivelmente definida como uma função de superfície bidimensional do vaso de cultura celular. Dessa forma, é possível iniciar a passagem com uma densidade celular definida.

[00306]. As densidades celulares para iniciar passagens de cultura no contexto da presente invenção são como segue: Para iniciar a P0 e a P0+ Para iniciar a P1 e todas as passagens subsequentes à P1 Faixa adequada 1.000- 50.000 células/cm2 200 - 50.000 células/cm2 Faixa preferida 8.000 células/cm2 ou mais 2.000- 3.000 células/cm2

Para iniciar a P0 e a P0+ Para iniciar a P1 e todas as passagens subsequentes à P1 Valor definido Não aplicável 2.500 células/cm2

[00307]. No início de cada P0 e P0+ (se aplicável), o total de células disponíveis é semeado. Portanto, a densidade celular não exatamente definida para iniciar a P0 e a P0+ (se aplicável) foi definida. Em qualquer taxa, a densidade celular para iniciar a P0 e a P0+ (se aplicável), deve ser de 8.000 células/m2 ou maior.

[00308]. Como é comum para células estromais mesenquimais, a célula da invenção é tipicamente uma célula aderente quando cultivada em um vaso de cultura, particularmente um vaso de cultura com uma superfície de fundo de plástico. Preferivelmente, a célula é aderente independente da escolha do meio de crescimento. Em qualquer taxa, é muito preferido que a célula seja aderente quando cultivada em um meio de crescimento preferido de acordo com a presente invenção.

[00309]. No final de cada passagem, as células são colhidas. Para este propósito, elas são opcionalmente, mas preferivelmente, enzimaticamente separadas, como tripsinizadas. Conforme se sabe comumente, a tripsina é uma enzima comercialmente disponível adequada para digerir proteoliticamente as moléculas de aderência celular e, dessa forma, separar as células aderentes do vaso de cultura e uma da outra. Dessa forma, “tripsinizada” significa tratada com tripsina – ou com qualquer outra enzima com uma tripsina como padrão de digestão – sob condições adequadas para esta digestão. Métodos padrão para a tripsinização de células de mamíferos, particularmente células mesenquimais, também são adequada para tripsinizar as células obtidas de acordo com a presente invenção. Preparações de tripsina para estes propósitos são comercialmente disponíveis e podem ser utilizadas de acordo com as instruções do fabricante. Alternativamente, a separação enzimática é realizada com uma enzima adequada que não seja tripsina.

[00310]. Após a separação enzimática, por exemplo, por tripsinização, opcionalmente, ma preferivelmente, o número total de células (por frasco ou por placa ou por pilha ou por total de todos os vasos de cultura utilizados naquela respectiva passagem) é determinado.

[00311]. Quando se diz aqui que as células são expandidas até uma determinada passagem, por exemplo, até a P4, então, isto significa que a expansão das células não é continuada ou é interrompida depois daquela respectiva passagem.

[00312]. Depois de cada passagem, os critérios de aceitação a seguir são preferivelmente avaliados: 1 rendimento, 2 viabilidade, 2 confluência, 4 morfologia. A determinação dos critérios de aceitação 3 e 4 ocorre antes da separação enzimática das células. A determinação dos critérios de aceitação 1 e 2 ocorre depois da separação enzimática das células. Os detalhes são como segue. Depois da P1 e todas Critério de Depois da P0 e P0+ as passagens após a Teste aceitação P1 Rendimento Contagem de células (Ciclo em 1 Veja o Exemplo 2B Veja o Exemplo 2C depois da separação Escala enzimática Completa) Coloração com 7- Mais de 80% de Mais de 80% de células aminoactinomicina D 2 Viabilidade células viáveis viáveis (7-AAD) depois da separação enzimática Pelo menos 80%, Pelo menos 80%, Determinação 3 Confluência preferivelmente 80 preferivelmente 80 a microscópica a 90% confluente 90% confluente Maioria de células Maioria de células pequenas, Determinação 4 Morfologia pequenas, fusiforme e fusiforme e em microscópica em colônias definidas colônias definidas

[00313]. Preferivelmente, todos os quatro critérios de aceitação devem ser atendidos.

[00314]. A determinação microscópica da confluência é direcionada para a determinação do percentual da área superficial do vaso de cultura celular que é coberto por células aderidas a ele. Se o critério de confluência não for atendido, as células são expandidas adicionalmente, e regularmente observadas a fim de desvendar em que momento o critério de confluência é atendido.

[00315]. Para a determinação do rendimento, as células são separadas enzimaticamente, por exemplo, submetidas à tripsinização, e uma fração definida da suspensão contendo células é submetida a uma contagem automatizada de células,

como por meio do NucleoCounter®. Então, o número total de células é determinado aritmeticamente com base na fração.

[00316]. A determinação microscópica da morfologia (isto é, da morfologia celular) está direcionada para a determinação do formato das células aderidas à área superficial de fundo do vaso de cultura celular. É típico para as MSCs que a maioria das células seja fusiforme. Para propósitos ilustrativos, uma fotografia mostrando uma vista da superfície de fundo de uma placa de cultura celular incluindo tais células é mostrada na Figura 5 C, painel chamado "SWJ".

[00317]. A determinação da viabilidade garante que as células que são submetidas à preparação de um banco de células e/ou a uma passagem subsequente são adequadas para expansão adicional (após congelamento e descongelamento, conforme o caso). As células da presente invenção são superiores em termos de viabilidade em comparação com as MSCs isoladas de acordo com os métodos do estado da técnica. Assim, e baseando-se na expansão de acordo com a presente invenção, grandes populações celulares podem ser obtidas mesmo quando o número total de células inicialmente isolado da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical for relativamente baixo. Assim, as células obtidas de acordo com a presente invenção são superiores em seu potencial proliferativo. Congelamento.

[00318]. As células podem ser congeladas, por exemplo, congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido, de acordo com procedimentos padrão. É possível descongelar tais células congeladas e, por exemplo, submetê-las a passagens de cultura adicionais depois do descongelamento. O congelamento pode ocorrer como um lote inteiro ou em alíquotas.

[00319]. Quando se diz aqui que as células são expandidas até uma determinada passagem, por exemplo, até a P4, então, isto significa que a expansão das células não é continuada adicionalmente, ou é interrompida, depois daquela respectiva passagem. Uma configuração exemplar, mas típica, é que as células são congeladas depois da respectiva passagem. O congelamento repetido depois de passagens repetidas é possível. Por exemplo, as células podem ser congeladas depois da P2 e/ou depois da P4. Preferivelmente, as células são congeladas depois da P2 e depois da P4.

[00320]. As células congeladas e populações de células congeladas também estão objeto da presente invenção. Populações de células congeladas podem ser chamadas de Bancos de Células. Bancos de células adequados que podem ser obtidos no contexto da presente invenção serão descritos abaixo.

[00321]. Em uma configuração, as células são congeladas depois de 5 a 30 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0), como 8 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0). Em uma configuração preferida, as células são congeladas depois de apenas 5 a 14 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0). Esta configuração é adequada para a criação de um Banco de Células Primário. Em uma configuração preferida, as células são congeladas depois de 14 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0). Esta configuração é adequada para a criação de um Banco de Células Secundário.

[00322]. Métodos padrão para congelamento de células de mamíferos, particularmente células mesenquimais, são adequadas para congelar as células obtidas de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, as células são congeladas a temperaturas de -70°C ou menos (como -80°C), opcionalmente precedidas por congelamento instantâneo a temperaturas de -190°C ou menos. Em uma configuração, as células são congeladas em nitrogênio líquido.

[00323]. As células congeladas podem, opcionalmente, mas preferivelmente, ser armazenadas na forma congelada. Métodos padrão para armazenagem de células de mamíferos, particularmente células mesenquimais, são adequados para armazenar as células obtidas de acordo com a presente invenção. É preferível congelar as células em frascos. Em uma configuração, as células congeladas são armazenadas em nitrogênio líquido.

[00324]. Em uma configuração preferida, as células são aliquotadas antes do congelamento. Recipientes adequados para conter alíquotas das células obtidas de acordo com a presente invenção são recipientes adequados para receber quantidades (alíquotas) respectivas de células, e para armazenagem em baixas temperaturas, particularmente frascos. Um frasco (também conhecido como um flaconete) é um vaso ou garrafa pequeno de vidro ou de plástico, adequado para armazenar líquidos. A natureza do frasco adequado na presente invenção não é particularmente limitada uma vez que permite a contenção das células no meio indicado, e desde que seja adequado para ser congelado nas condições nas quais as células permaneçam em um estado que permita seu descongelamento e subcultura subsequente. Assim, para aquele propósito, os frascos devem ser apropriados para congelador (criofrascos). Os frascos podem ser feitos de qualquer material adequado, embora os frascos de vidro e os frascos feitos de plásticos como o polipropileno sejam os mais comuns. O frasco pode ser fechado, para tanto ele normalmente apresenta uma tampa, e um criofrasco adequado para uso de acordo com a presente invenção é preferivelmente adequada para congelamento em temperaturas de -196°C ou menos. Opções de tampa incluem frascos de rosca (fechados com uma tampa de rosca ou conta-gotas/pipeta), frascos com tampa (fechados com uma rolha de cortiça ou de plástico) e frascos crimpados (fechados com uma rolha de borracha e uma tampa de metal), ou, em caso de frascos plásticos, também 'tampas articuladas’ (tampas de encaixe), tal encaixe fechado quando pressionado. O fundo de um frasco é preferivelmente plano, no entanto, esta não é uma exigência estrita. Preferivelmente, todos os frascos utilizados em um determinado processo de isolamento/expansão são todos idênticos uns aos outros e preenchidos com volumes idênticos de líquido contendo células (células em meio, tipicamente em suspensão, mas esta não é uma exigência).

[00325]. Frascos preferidos apresentam um tamanho que seja adequado para conter entre 2 e 10 ml de células em meio (tipicamente em suspensão, mas esta não é uma exigência), como entre 3 e 8 ml de células em meio, e mais preferivelmente aproximadamente 4 ml de células em meio. Frascos preferidos apresentam um tamanho que seja adequado para conter entre 106 e 109 células em meio, como entre 3 10 x 106 e 100 x 106 células em meio, e mais preferivelmente aproximadamente 20 x 106 células em meio.

[00326]. As células congeladas e/ou armazenadas podem, opcionalmente, mas preferivelmente, ser descongeladas. Depois do congelamento, as células podem opcionalmente ser submetidas a cultura adicional (subcultura), incluindo expansão. Métodos padrão para congelamento e, opcionalmente subcultura, particularmente células mesenquimais, são adequados para congelar as células obtidas de acordo com a presente invenção. Para cultura adicional, ou subcultura, os métodos descritos aqui, incluindo meios de crescimento, etc. são adequados.

[00327]. Em uma configuração preferida, as células são congeladas depois da passagem 2 (P2). As células obtidas e congeladas depois da P2 são chamadas neste documento de "Banco de Células Primário" ou "PCB", ou alternativamente "Banco de Células Mestre". Em uma configuração preferida, o Banco de Células Primário compreende ou consiste de células que foram congeladas depois de apenas 5 a 14 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00328]. Em outra configuração preferida, as células são congeladas depois da passagem 4 (P4). As células obtidas e congeladas depois da P4 são chamadas neste documento de "Banco de Células Secundário" ou "SCB", ou alternativamente "Banco de Células de Trabalho". Em uma configuração preferida, o Banco de Células Secundário compreende ou consiste em células que foram congeladas depois de 14 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00329]. Preferivelmente, a configuração de PCB e a configuração de SCB estão ligadas, de forma que as células são primeiro congeladas como um PCB e, então, subsequentemente, todo ou parte do PCB é descongelado e submetidas à subcultura e, então o SCB é obtido depois de duas passagens adicionais (P4 no total). Preferivelmente, nem todas as células obtidas e congeladas depois da P2, por exemplo, não o PCB inteiro, é/são congelada(s) e submetida(s) à subcultura juntas. Ao contrário, mais preferivelmente, um recipiente (tipicamente um frasco) obtido e congelado como PCB é descongelado e submetido à subcultura, enquanto outros recipientes (frascos) permanecem congelados como PCB.

[00330]. É importante observar que referências a passagens individuais são apresentadas neste documento para propósitos de orientação. Por exemplo, também é possível preparar o PCB depois de uma passagem que não seja a passagem P2. A preferência por preparar o PCB depois da P2 e o SCB depois da P4 é baseada na experiência com crescimento em um meio baseado no meio basal MSCBM CD, ou um meio basal substancialmente equivalente a ele, nas condições de cultura especificamente descritas nos exemplos experimentais (particularmente o Exemplo 2). Quando outras condições de cultura forem utilizadas, o que é igualmente possível no contexto da presente invenção, então o PCB e o SCB são preferivelmente preparados depois de Duplicações cumulativas da População que correspondem às Duplicações cumulativas da População observadas depois da P2 e da P4, respectivamente, nos exemplos experimentais destes documento, em particular o Exemplo 2C.

[00331]. O isolamento de uma célula individual, se desejado, pode ser alcançado, por exemplo, por diluição em série, pré ou pós-expansão. A menos que tal isolamento seja realizado especificamente, o método da invenção gera uma população de células estromais mesenquimais. Conforme descrito a seguir, o rendimento pode ser relativamente alto, em comparação com os métodos conhecidos anteriormente, entre outras coisas em vista da viabilidade superior e das propriedades de expansão das células de acordo com a presente invenção. Rendimento

[00332]. O método de acordo com a presente invenção, compreendendo a etapa (c), gera uma população de células estromais mesenquimais. Esta população de células estromais mesenquimais é descrita neste documento. Preferivelmente, o método da presente invenção proporciona uma população celular desprovida de células sanguíneas. Aspectos adicionais da população celular gerada no método da invenção são descritos no terceiro aspecto da invenção.

[00333]. Em uma configuração preferida, as células geradas durante a expansão de acordo com a presente invenção são aliquotadas e opcionalmente congeladas. Um ponto de tempo adequado para aliquotar e congelar as células é depois da conclusão de qualquer passagem, e subsequente separação enzimática, por exemplo, tripsinização, centrifugação e ressuspensão em meio de crescimento. As células (população celular), que são obtidas desta forma e armazenadas por congelamento, preferivelmente em alíquotas, também são chamadas de banco de células.

[00334]. Em uma configuração preferida, as células são congeladas depois da P2. As células (população celular), que são obtidas desta forma e armazenadas por congelamento, preferivelmente em alíquotas, também são chamadas de Banco de Células Primário. Em uma configuração preferida, o Banco de Células Primário compreende ou consiste de células que foram congeladas depois de apenas 5 a 14 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00335]. Em uma configuração preferida adicional, mas não mutuamente exclusiva, as células são congeladas depois da P4. As células (população celular), que são obtidas desta forma e armazenadas por congelamento, preferivelmente em alíquotas, também são chamadas de Banco de Células Secundário. Em uma configuração preferida, o Banco de Células Secundário compreende ou consiste de células que foram congeladas depois de 14 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00336]. As alíquotas congeladas obtidas desta forma a partir do respectivo banco de células estão disponíveis para congelamento individualmente em um ponto de tempo desejado. Em outras palavras, não é necessário – e tipicamente não desejado - descongelar todas as alíquotas do banco de células no mesmo ponto de tempo. Ao contrário, a aliquotagem e o congelamento individual das alíquotas apresentam a vantagem de que alíquotas individuais podem ser removidas do congelamento, descongeladas e submetidas a cultura adicional (subcultura, expansão adicional) em pontos de tempo individuais e individualmente desejados.

[00337]. Um ciclo de escala completa começando com o cordão umbilical humano e compreendendo a etapa(c) e sendo executado até a passagem P2 tipicamente gera um Banco de Células Primário (PCB) de pelo menos 1 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 2 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 3 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 4 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 5 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 6 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 7 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 8 x 109 células, mais preferivelmente de pelo menos 9 x 109 células, e em algumas configurações de pelo menos 10 x 109 células. Em uma configuração preferida, o Banco de Células Primário compreende ou consiste de células que foram congeladas depois de apenas 5 a 14 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00338]. Devido às excelentes propriedades proliferativas das células da invenção, as células podem ser cultivadas, no entanto, bem além da P2. Isto pode ocorrer passando algumas ou todas as células obtidas durante a P2, depois da separação enzimática (por exemplo, tripsinização) para uma passagem subsequente (P3), ou criando um Banco de Células Primário depois da P2 e, então, descongelando um ou mais frascos de células do Banco de Células Primário em um ponto de tempo desejado para, dessa forma, iniciar uma passagem subsequente (P3). Em qualquer caso, a P3 pode ser seguida por uma ou mais passagens adicionais, e, opcionalmente, um Banco de Células Secundário pode ser gerado, por exemplo, depois da P4. Devido às excelentes propriedades proliferativas, o número total de células depois de uma passagem posterior, por exemplo, P4, será normalmente significativamente maior do que o número total de células depois da P2, para o que os rendimentos típicos são indicados acima. Por exemplo, depois da P4, o rendimento total das células pode ser pelo menos 10 vezes tão elevado quanto depois da P2, mas mais tipicamente pelo menos 100 vezes até pelo menos 1000 vezes tão elevado quanto depois da P2. Em algumas configurações, depois da P4, o rendimento total pode ser de pelo menos 10 x 1012 células, com relação a um ciclo em escala completa. Opcionalmente, um Banco de Células Secundário é preparado depois da P4. Em uma configuração preferida, este Banco de Células Secundário compreende ou consiste de células que foram congeladas depois de 14 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00339]. O rendimento pode, opcionalmente, ser aumentado ainda mais por meio de subcultura, por exemplo, passagem P5 e além. Potencial de diferenciação

[00340]. A potência das células da invenção pode ser avaliada experimentalmente. Em geral, isto é feito submetendo-se uma célula a condições sob as quais a diferenciação em um ou mais tipos de célula específicos é favorecida.

[00341]. Preferivelmente, a(s) célula(s) obtida(s) depois da etapa (c) é/são pelo menos multipotente(s), e opcionalmente pluripotente(s). Em uma configuração típica, a(s) célula(s) obtida(s) depois da etapa (c) é/são multipontente(s). A multipotência pode ser testada por um ensaio de diferenciação, conforme comumente conhecido na técnica. Sob condições especiais, uma célula multipotente se diferenciará em tecidos (adipogênicos, condrogênicos e osteogênicos). Os Exemplos 12, 13 e 14 mostram que as células de acordo com a presente invenção apresentam tais capacidades. Sob condições especiais, a célula se diferenciará em tecidos de diferentes tecidos (adipogênicos, condrogênicos e osteogênicos). Preferivelmente, uma célula multipotente capaz de ser obtida pelo método da presente invenção tem pelo menos todos os seguintes potenciais de diferenciação: (a) adipogênico; (b) condrogênico; (c) osteogênico. Os Exemplos 12, 13 e 14 mostram que as células de acordo com apresente invenção apresentam tais capacidades. Nestes exemplos, particularmente o Exemplo 12, são descritas condições específicas que permitem a diferenciação apesar da rápida expansão das células derivadas da Geleia de Wharton estromal da invenção.

[00342]. Opcionalmente, a célula apresenta potenciais de diferenciação adicionais que são selecionados dos potenciais de diferenciação típicos para células estromais mesenquimais. No entanto, como é típico para células estromais mesenquimais, a célula da invenção é tipicamente não totipotente.

[00343]. No entanto, a célula da invenção não é tipicamente totipotente. No entanto, a célula pode opcionalmente ser submetida à manipulação genética e/ou à reprogramação nuclear, onde o potencial de diferenciação pode ser influenciado. Relação com outros aspectos da invenção

[00344]. Pelo método da invenção, uma célula pode ser obtida conforme descrito em detalhes no segundo aspecto da invenção. Pelo método da invenção, uma população celular pode ser obtida conforme descrito em detalhes no terceiro aspecto da invenção. Por exemplo, pelo método da invenção, é possível obter um banco de células. Em uma configuração, um banco de células pode ser obtido pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Naquela configuração, a etapa (c) do método da invenção é opcionalmente seguida por uma etapa (d) de aliquotagem das células e por uma etapa (e) de armazenagem das células. As células podem ser armazenadas em qualquer condição adequada, muito embora o congelamento em temperaturas de 180ºC ou menos é mais típica. As células podem ser congeladas, preferivelmente congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido. Um crioprotetor pode ser adicionado antes do congelamento.

[00345]. Como os aspectos da presente invenção estão relacionados uns com os outros, as configurações descritas com relação ao segundo e ao terceiro aspectos também podem ser lidos no primeiro aspecto, e vice-versa. Por exemplo, mostrando ausência substancial de proteínas do marcador endotelial, expressando caracterização ou determinação do marcador superficial, conforme descrito no segundo aspecto da invenção, pode-se confirmar experimentalmente que um aspecto do método de acordo com o primeiro aspecto da invenção foi implementado adequadamente, a saber, a remoção do epitélio.

[00346]. Prefere-se particularmente que a população celular que pode ser obtida pelo método do primeiro aspecto da invenção seja uma população celular conforme descrito no terceiro aspecto da invenção mais abaixo. Também, é particularmente preferido que o método para obter uma célula de acordo com o primeiro aspecto da invenção gere uma célula conforme descrito no segundo aspecto da invenção; dessa forma, todas as configurações e características descritas neste documento caracterizando a célula de acordo com o segundo aspecto da presente invenção também são adequados para caracterizar o método para obter a célula de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção. Prefere-se particularmente também que a população celular que pode ser obtida pelo método do primeiro aspecto da invenção seja uma célula conforme descrito no segundo aspecto da invenção, como segue. Célula estromal mesenquimal

[00347]. Em um segundo aspecto, a presente invenção se refere a uma célula mesenquimal. Mais precisamente, a célula mesenquimal é uma célula estromal mesenquimal (MSC). As características e configurações das células serão descritas a seguir.

[00348]. Algumas características e configurações da célula de acordo com a presente invenção, que serão descritas a seguir, estão relacionadas às características físicas da célula da invenção. Meramente para ilustração, e não obstante os detalhes revelados em qualquer outro lugar deste documento, as características físicas incluem aquelas características que podem ser determinadas diretamente com métodos físicos, como expressão genética, tamanho, formato, etc. da célula. Algumas características e configurações da célula de acordo com a presente invenção, que serão descritas a seguir, estão relacionadas ao método pelo qual a célula da invenção pode ser obtida ou é obtida. Meramente para ilustração, e não obstante os detalhes revelados em qualquer outro lugar deste documento as características da célula relacionadas ao método pelo qual a célula da obtenção pode ser obtida ou é obtida podem incluir (a) a origem anatômica da célula, em particular o cordão umbilical e a Geleia de Wharton estromal como uma seção preferida dela, (b) as condições aplicadas para isolar a célula e opcionalmente, mas preferivelmente, também (c) as condições aplicadas para expandir a célula. Célula Isolada

[00349]. Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção é uma célula isolada, particularmente uma célula estromal mesenquimal isolada. Em particular, a célula estromal mesenquimal da invenção é preferivelmente uma célula estromal mesenquimal isolada originária da área intervascular (para efeito de ilustração, veja a Figura 1) do cordão umbilical, ou derivada desta célula. Uma célula estromal isolada pode ser obtida a partir do estroma por um método que compreende isolamento conforme descrito neste documento. Uma célula pode ser derivada de tal célula por expansão. Assim, em geral, quando se diz que uma determinada célula é “derivada de” outra célula, então, significa que a determinada célula é originada da referida outra célula, por expansão (divisão celular) e/ou diferenciação.

[00350]. Em uma configuração, a célula é uma célula isolada que está localizada fora de um corpo humano ou animal. Uma célula isolada é geralmente uma célula fora de seu ambiente fisiológico in vivo. Preferivelmente, a célula é uma célula ex vivo. Em particular, a célula ex vivo é preferivelmente localizada fora do cordão umbilical. Em particular, a célula ex vivo, preferivelmente, não está em contato com vasos sanguíneos, seja em contato direto ou indireto. Em uma configuração, a célula ex vivo está em um vaso de cultura. Em uma configuração, a célula ex vivo está em um recipiente adequado para armazenagem, como em um frasco. Em uma configuração, a célula ex vivo está em uma temperatura de aproximadamente 35°C a 39°C, preferivelmente em um vaso de cultura. Em uma configuração, a célula ex vivo está em um recipiente de criopreservação adequado, como em um criofrasco, preferivelmente a uma temperatura de -180°C ou menos. Em uma configuração, a célula ex vivo está em um vaso de cultura. Em uma configuração, a célula ex vivo é uma célula metabolicamente ativa. Em uma configuração, a célula ex vivo é congelada.

[00351]. Em uma configuração, a célula é caracterizada por pelo menos uma característica – estrutural ou funcional - que não é encontrada normalmente em uma célula do cordão umbilical humano. Por exemplo, esta característica pode ser uma característica específica para o método pelo qual a célula da invenção pode ser obtida. Esta característica estrutural ou funcional pode ser selecionada das características explicitamente descritas nesta revelação, e/ou de características não explicitamente descritas nesta revelação, mas inerentes à célula da invenção, por exemplo, inerentes à célula que pode ser obtida pelo método da invenção. Em uma configuração, a célula é uma célula aderente, por exemplo, aderente a um vaso de cultura, como um vaso de cultura com uma superfície de fundo plástica.

[00352]. Uma célula estromal isolada de acordo com a presente invenção pode ser expandida in vitro por cultura. Dessa forma, uma célula derivada pode ser obtida. A célula derivada também é uma célula da invenção, desde que ela esteja em conformidade com as características reivindicadas que definem a célula da invenção. Dessa forma, devido às propriedades semelhantes às da célula-tronco da célula da invenção, a presente invenção pode cobrir múltiplas gerações de células. Múltiplas gerações podem ser obtidas por expansão conforme descrito neste documento. De fato, uma configuração específica da célula de acordo com a presente invenção compreende a expansão da célula ex vivo. Assim, muito embora a célula seja isolada, ela é capaz de gerar descendentes à mesma ou a células semelhantes e, dessa forma, gerar uma população celular. Esta população celular é descrita no terceiro aspecto da invenção. Condições de cultura adequadas não são particularmente limitadas, mas incluem aquelas descritas no primeiro aspecto da invenção.

[00353]. Um método adequado, mas não limitante para o isolamento de uma célula, incluindo o tratamento enzimático, é descrito neste documento no contexto do primeiro aspecto da presente invenção. O isolamento de células individuais, se desejado, pode ser alcançado, por exemplo, por diluição em série. Assim, preferivelmente, a célula da invenção é uma célula em um ambiente ex vivo, como in vitro. Vários métodos para cultivar células in vitro podem ser praticados pela pessoa com habilidade incluindo aqueles descritos com relação ao primeiro aspecto da presente invenção.

[00354]. Em geral, uma célula estromal mesenquimal pode se originar de vários tecidos, como a medula óssea, o tecido adiposo e o cordão umbilical. Preferivelmente, a célula de acordo com apresente invenção se origina ou é derivada do cordão umbilical, mais preferivelmente da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical. A célula da invenção não é, no entanto, derivada do sangue do cordão umbilical. A célula também não é uma célula epitelial nem endotelial.

[00355]. Em uma configuração, a célula da invenção é uma célula isolada frescamente. Uma célula isolada frescamente é uma célula que foi diretamente obtida pelo isolamento do tecido do qual ela se original, como pelo método descrito acima. Mais preferivelmente, no entanto, a célula da invenção é uma célula que é derivada de uma célula isolada frescamente, mais tipicamente por expansão in vitro. Não existe limitação como tal no número de passagens ou Duplicações cumulativas da População in vitro, depois do isolamento fresco de uma célula; no entanto, tipicamente, a célula da invenção é derivada de uma célula isolada frescamente por expansão in vitro por 12 passagens ou menos, ou um número equivalente de duplicações cumulativas da população. Geralmente, qualquer célula que atenda às limitações reivindicadas é uma célula de acordo com a invenção, independentemente do número de passagens ou duplicações cumulativas da população pelas quais ela é obtida, após o isolamento fresco do tecido de origem.

[00356]. Como é comum para células estromais mesenquimais, a célula da invenção é tipicamente uma célula aderente quando cultivada em um vaso de cultura, particularmente um vaso de cultura com uma superfície de fundo de plástico. Dessa forma, em uma configuração, a célula estromal mesenquimal da invenção é uma célula aderente à superfície, particularmente uma célula aderente ao plástico in vitro. Se desejado, uma célula aderente ao plástico pode ser separada do vaso de cultura, por exemplo, por tripsinização. Assim, uma célula não aderente pode ser obtida. A invenção também compreende tal célula não aderente.

[00357]. Em uma configuração, a célula estromal mesenquimal da invenção é fusiforme. Isto se aplica normalmente quando a célula estromal mesenquimal é aderida a um vaso de cultura, como um vaso de cultura com uma superfície de fundo plástico. Em particular, em uma população de células estromais mesenquimais, a maioria, por exemplo, 50% ou mais por número de células, são normalmente de formato fusiforme, particularmente ao aderir a uma superfície plástica in vitro.

[00358]. Quando a célula da invenção não é aderente, por exemplo, quando ela foi enzimaticamente separada, como, por exemplo, tripsinizada, como, por exemplo, quando ela está presente em um Banco de Células Primário ou Secundário, opcionalmente congelada, a célula normalmente não é fusiforme. Dessa forma o formato fusiforme está especificamente associado com a aderência à superfície sob condições de cultura.

[00359]. Em uma configuração, a célula da invenção pode ser obtida pelo método descrito no primeiro aspecto da invenção. Naquela configuração, a célula da invenção é adequadamente selecionada de uma célula isolada frescamente, isto é, uma célula que não foi submetida a expansão ex vivo, ou uma célula expandida, isto é, uma célula que pode ser obtida por expansão ex vivo de uma célula isolada frescamente anteriormente. Expressão Genética e Manifestação do Antígeno de Superfície

[00360]. A célula de acordo com a presente invenção pode ser caracterizada por um padrão de expressão genética. Conforme utilizado neste documento, “padrão de expressão genética” significa que pelo menos um gene é expresso, ou não expresso, ou expresso em um determinado nível, conforme o caso.

Assim, o fato de que este gene particular é expresso, ou não expresso, ou expresso em um determinado nível, caracteriza a célula de acordo com a invenção, por exemplo, para o propósito de distinção de uma célula de referência. O mesmo se aplica para a expressão de mais de um gene, como, por exemplo, dois genes, três genes, quatro genes, cinco genes, seis genes, sete genes, oito genes, nove genes, dez genes, etc. Quando a célula da invenção for caracterizada pela expressão de um ou mais genes, não se deseja fazer uma declaração específica sobre a expressão de qualquer outro gene não mencionado naquele contexto. Como exemplo ilustrativo, sempre que se diz neste documento que a célula da invenção expressa APCDD1, isto não deve ser considerado como uma declaração de que qualquer outro gene específico também é expresso, ou não expresso, ou expresso em um determinado nível, a menos que o contexto determine o contrário.

[00361]. Em geral, a expressão de um gene pode ser testada por vários métodos, tanto no nível do ácido nucleico quanto no nível da proteína. A expressão genética pode ser relativamente, comumente, testada na biologia molecular, na bioquímica e na biologia celular, e qualquer método conhecido ou adequado, portanto, pode ser utilizado no contexto da presente invenção. Alguns métodos são descritos abaixo. Métodos relativos à expressão genética também podem ser chamados de métodos transcriptômicos. Assim, o perfil de expressão genética de uma célula também pode ser chamado de transcriptoma. Em uma configuração, a célula da invenção é caracterizada por seu perfil de expressão genética.

[00362]. Diferentes termos podem ser utilizados para descrever que a expressão de um gene está sendo analisada: por exemplo, pode-se dizer que a expressão foi testada, analisada, avaliada, ensaiada, medida, determinada, etc. Estes termos incluem tanto a determinação qualitativa, isto é, a questão se o respectivo gene é expresso ou não, e a determinação quantitativa, isto é, a questão em qual nível o respectivo gene é expresso.

[00363]. Tipicamente, para a determinação da expressão genética, uma amostra de uma célula de uma multiplicidade de células (o que é preferido) é coletada de uma população celular, e a expressão genética é subsequentemente analisada naquela amostra, onde as células daquela amostra podem ser destruídas ou não, conforme o caso. Como a população celular de acordo com a presente invenção é normalmente homogênea, significando que substancialmente todas as células individuais compreendidas lá são muito parecidas ou semelhantes, o achado sobre a expressão genética nas células compreendidas na amostra coletada da população celular (amostra representativa) também geralmente se aplicará às células remanescentes naquela população, a menos que o contexto determine o contrário e/ou que a população celular não parece ser substancialmente homogênea.

[00364]. A determinação da expressão de qualquer respectivo gene pode ser uma determinação indireta, isto é, onde a expressão genética é ensaiada em geral (por exemplo, por uma abordagem ampla como o microarranjo) sem focar em um gene, ou uma determinação direta, onde ela é especificamente testada se o respectivo gene é expresso. No segundo caso particularmente, também se pode dizer que o respectivo gene é um “gene de interesse”.

[00365]. Diversas tecnologias transcriptômicas podem ser utilizadas para gerar os dados para a análise da expressão genética. Por exemplo, os microarranjos de DNA medem a atividade relativa de genes-alvo identificados anteriormente. Técnicas baseadas na sequência, como RNA-Seq, fornecem informações sobre as sequências de genes além de seu nível de expressão.

[00366]. A célula da invenção é uma célula de uma placenta animal, preferivelmente de mamífero, preferivelmente de primata, mais preferivelmente humana. Dessa forma, em uma configuração, as células estromais mesenquimais (MSCs) da invenção são células de mamíferos. Portanto, a menos que especificado o contrário, todas as indicações para um gene específico significam o respectivo gene de mamífero.

[00367]. Mais preferivelmente, a célula estromal mesenquimal da invenção é uma célula de um primata, mais particularmente de um humano. Assim, mais preferivelmente, as células estromais mesenquimais (MSCs) da invenção são células humanas. Portanto, naquela configuração, todas as indicações para um gene específico significam o respectivo gene humano. Em alguns casos isto fica diretamente aparente a partir do contexto, como no caso dos antígenos leucocitários humanos (HLAs), em outros casos isto não é especificamente dito no contexto; no entanto, é evidente: por exemplo, com referência a uma célula humana, a expressão de APCDD1 significa a expressão do APCDD1 humano, etc. Como a célula da invenção é, em uma configuração preferida, uma célula humana, prefere-se que a célula da presente invenção naquela configuração expresse o APCDD1 humano.

[00368]. Preferivelmente, a célula da invenção não é uma célula transgênica. Portanto, naquela configuração, todas as indicações com relação à expressão de um gene específico, significam que o respectivo gene é expresso a partir do genoma, onde ele é codificado, mais especificamente, onde ele é codificado através de herança Mendeliana. No entanto, em algumas configurações alternativas, a célula da invenção é uma célula transgênica.

[00369]. Preferivelmente, a expressão genética é testada pelo menos em amostras duplicadas, preferivelmente pelo menos em amostras triplicadas. Em alguns casos, as células submetidas ao teste são destruídas, expostas a condições não estéreis ou de outra forma danificadas como parte da análise e não podem ser utilizadas para cultura; no entanto, a informação obtida a partir destas células destruídas, expostas ou de outra forma danificadas ainda é valiosa, particularmente quando a células se originam de uma população celular homogênea; pode-se assumir que as informações obtidas desta forma, particularmente as informações sobre a expressão genética, se aplicam não somente à célula destruída, exposta ou de outra forma danificada analisada, mas, também, a células adicionais da população da qual a respectiva célula analisada se origina. Pode-se presumir que se aplica tanto à população celular como tal, ou a qualquer célula individual compreendida nesta população celular. Homogêneo, neste contexto, significa que todas as células substancialmente são muito parecidas ou semelhantes.

[00370]. Uma amostra pode consistir de uma única célula, ou pode alternativamente conter múltiplas células. Não há limite máximo estrito no número total de células compreendidas na amostra; no entanto, o número é tipicamente muito menor do que o número total de células compreendidas em uma população celular; por exemplo, é de 1/100 ou menos, 1/100 ou menos, 1/1.000 ou menos, 1/10.000 ou menos, 1/100.000 ou menos, 1/1.000.000 ou menos, com relação à quantidade de células compreendidas em uma população celular.

[00371]. Falando muito geralmente, a expressão de um gene pode ser testada diretamente, como normalmente por métodos de biologia molecular, incluindo a determinação da presença e, se necessário ou desejado, níveis de um produto genético, como um RNA mensageiro particular (mRNA) ou um precursor ou produto de degradação dele; ou, alternativamente, a expressão de um gene pode ser testada indiretamente, como normalmente por métodos bioquímicos incluindo a determinação da presença e, se necessário ou desejado, os níveis de uma proteína codificada por um determinado gene, como uma determinada proteína da superfície celular ou um precursor ou um produto de degradação dele. Proteínas de superfície adequadas para a caracterização da célula da invenção incluem particularmente clusters (grupamentos) de diferenciação (CD).

[00372]. Qualquer método conhecido para testar a expressão de um gene também pode ser utilizado na presente invenção. Métodos adequados incluem aqueles selecionados da lista que compreende, mas se limita à caracterização da expressão genética, reação em cadeia da polimerase, como a PCR, com preferivelmente a PCR quantitativa (qPCR), incluindo RT-qPCR, sequenciamento de produtos da transcrição, qualquer tipo de análise de transcriptoma, e outros. No nível de ácido nucleico, métodos preferidos incluem microarranjos e qPCR.

[00373]. Em uma configuração, a expressão genética é determinada pela caracterização da expressão genética. No campo da biologia molecular, a caracterização da expressão genética se refere à medição da expressão de diversos, frequentemente milhares, de genes, tipicamente tudo de uma vez, para criar um cenário geral de expressão genética celular. Por exemplo, a caracterização da expressão genética é a medição da expressão de diversos, tipicamente, mas não necessariamente milhares, de genes de uma vez, para criar um cenário global de uma célula. A caracterização da expressão genética pode, por exemplo, distinguir entre células da invenção e outras células. É até mesmo possível determinar a expressão de um genoma completo simultaneamente, isto é, cada gene presente em uma célula particular. Muitos experimentos deste tipo medem um genoma completo simultaneamente, isto é, cada gene presente em uma célula particular. Diversas tecnologias transcriptômicas podem ser utilizadas para gerar os dados necessários a serem analisados. Microarranjos são preferidos em algumas configurações da presente invenção. Microarranjos determinam a expressão relativa de genes, incluindo um ou mais genes de interesse, como, por exemplo, o APCDD1. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, entende-se que, atualmente, a caracterização da expressão genética apresenta o cenário possível mais global de expressão genética em um único experimento.

[00374]. Em geral, um microarranjo é um método adequado de caracterização da expressão genética. Assim, um microarranjo é preferivelmente utilizado para aquele propósito na presente invenção. Conforme se sabe comumente, um microarranjo mostra se determinados genes específicos são expressos de forma diferente ou não em uma célula, em comparação com, por exemplo, uma célula preparada conforme descrito na técnica anterior. Microarranjos são comercialmente disponíveis e podem ser utilizados no contexto da presente invenção.

[00375]. Em uma configuração, a expressão genética é determinada em um experimento de alto rendimento. Em uma configuração alternativa, a expressão genética é determinada em um experimento que não é um experimento de alto rendimento, como, por exemplo, um experimento específico direcionado para um gene específico. Em uma configuração, a expressão genética é determinada tanto em um experimento de alto rendimento quanto em um experimento que não é um experimento de alto rendimento; neste caso, o alto rendimento é tipicamente conduzido primeiro; e o experimento que não é um experimento de alto rendimento é realizado subsequentemente em um estágio posterior, por exemplo, para verificar o achado do experimento de alto rendimento. Por exemplo, um microarranjo (alto rendimento) pode ser seguido, por exemplo, para o propósito de validação ou confirmação da expressão de genes específicos, por qPCR (não de alto rendimento).

[00376]. Técnicas baseadas na sequência, incluindo o sequenciamento de alto rendimento, como o Sequenciamento de Nova Geração (NGS), podem ser utilizadas para determinar a expressão genética na presente invenção. Por exemplo, o RNA-Seq (sequenciamento de RNA), também chamado de whole transcriptome shotgun sequencing, pode fornecer informações sobre as sequências de genes além de seu nível de expressão. O RNA-Seq utiliza o sequenciamento de nova geração (NGS) para revelar a presença e a quantidade de RNA em uma amostra biológica em um determinado momento no tempo. Em uma configuração, a expressão genética é determinada em uma técnica baseada na sequência, como RNA-Seq ou PCR e qualquer variação dele.

[00377]. A expressão de alguns ou de todos os genes, por exemplo, conforme revelado pela caracterização da expressão genética, como no microarranjo, pode, então, ser verificado por RT PCR quantitativa (qRT PCR).

[00378]. Como se sabe comumente, uma reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), também conhecida como reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR em Tempo Real), é um método laboratorial com base na reação em cadeia da polimerase (PCR), que é adequada para determinar a quantidade de um ácido nucleico. Em particular, para determinar a quantidade de uma transcrição (por exemplo, mRNA), o método de escolha é a reação em cadeia da polimerase com transcrição reversa quantitativa (qRT-PCR). Em comparação com outros métodos de quantificação de RNA, como northern blot, a qRT-PCR é normalmente considerada como sendo o ensaio mais poderoso, sensível e quantitativo para detecção de níveis de RNA, e é, portanto, preferido na presente invenção. A qRT PCR também é muito mais sensível, para determinação da expressão genética, do que a determinação indireta do produto da expressão genética no nível da proteína, como imunodetecção, por exemplo, por imunodecoração com anticorpos primários ou secundários fluorescentes e citometria de fluxo. A qRT PCR requer tipicamente iniciadores específicos para o respectivo ácido nucleico, a sequência do qual é, no entanto, normalmente disponível através de bases de dados de sequências, por exemplo, para genes humanos, ou pode ser designado pela pessoa com habilidade com base em tais informações. Kits comerciais e máquinas estão disponíveis para qRT-PCR, e estes podem ser utilizados na presente invenção. O ácido nucleico que serve como modelo (também chamado de “alvo”) para determinação da expressão genética na qRT PCR é um produto de transcrição, tipicamente mRNA.

[00379]. A qPCR é normalmente executada por um total de 35 a 45 ciclos consecutivos, mais preferivelmente de 38 a 42 ciclos, e mais preferivelmente 40 ciclos. Quando nenhuma fluorescência for observada mesmo após o término do número total de ciclos, então, conclui-se que o ácido nucleico-alvo está ausente na amostra analisada.

[00380]. Adequadamente, a expressão genética é determinada por qPCR (preferivelmente por qRT-PCR), onde os níveis de expressão de interesse são determinados, e preferivelmente comparados com os níveis de expressão de um gene de referência. Para aquela finalidade, o gene de referência preferido é a beta-actina (veja, por exemplo, a Figura 8).

[00381]. Como é padrão na técnica, os padrões de expressão genética conforme determinados pela qRT-PCR são indicados por Ct e dCt, respectivamente. Em geral, na qPCR, o Ct (limite do ciclo) é definido como sendo o número de ciclos necessários para que o sinal fluorescente atravesse o limite (isto é, exceda o nível de base). Em geral, o valor do Ct é inversamente proporcional à quantidade do respectivo ácido nucleico (alvo) na amostra (isto é, quanto menor o valor do Ct, maior a quantidade do respectivo ácido nucleico (alvo) na amostra). O Ct é específico para a expressão de um gene. Delta Ct (dCt) indica a diferença de expressão entre 2 genes, normalmente entre um gene de interesse e um gene de referência, como a beta-actina (veja, por exemplo, a Figura 8).

[00382]. Preferivelmente, a célula da invenção expressa pelo menos um gene específico para células estromais mesenquimais.

[00383]. A célula da invenção é caracterizada, entre outras coisas, por expressar o APCDD1. Em particular, a célula expressa o APCDD1. Os inventores desvendaram que genes específicos para células estromais mesenquimais de acordo com a presente invenção são compreendidos na lista que inclui, mas não se limita ao APCDD1 e PPARG, e opcionalmente FLVCR2. Mais preferivelmente, o referido gene específico para células estromais é expresso em níveis elevados, em comparação com o gene de referência beta-actina, em relação à relação da expressão ou o referido gene vs. beta-actina nas células de referência. Um exemplo deste fenótipo é mostrado no Exemplo 8.

[00384]. Muito embora a literatura anterior tenha sido incerta sobre se as MSCs não perivasculares são distintas ou não das MSCs perivasculares (por exemplo, Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630), a presente invenção apresenta evidência (por exemplo, Exemplo 8) de que as células derivadas da Geleia de Wharton estromal obtidas de acordo com a presente invenção são distintas das MSCs perivasculares.

[00385]. Em uma configuração, a expressão genética é determinada indiretamente, isto é, não pela determinação do produto de transcrição primário, o mRNA ou seu precursor e seu produto de degradação, mas por determinação de um produto específico mais a jusante.

[00386]. Tipicamente, o produto específico mais a jusante é uma proteína codificada pelo mRNA; no entanto, também pode ser qualquer outro produto específico, como, por exemplo, um metabólito que é específico para a presença de uma proteína particular, por exemplo, enzimaticamente ativa.

[00387]. Preferivelmente, a presença de uma proteína é determinada. Mais preferivelmente, a presença de uma proteína na superfície celular é determinada. Em outras palavras, determina-se se uma proteína é manifestada na superfície celular.

[00388]. Células que exibem uma determinada proteína na superfície celular podem ser analisadas, por exemplo, por moléculas imunologicamente ativas, como anticorpos específicos e outras moléculas imunorreativas. “Superfície celular” é utilizado neste documento de acordo com seu significado normal na técnica e, dessa forma, inclui especificamente a parte externa da célula que é acessível para ligação por proteínas e outras moléculas. Uma proteína é manifestada na superfície da célula se estiver pelo menos parcialmente localizada na superfície da referida célula e acessível para ligação por moléculas de ligação ao antígeno como anticorpos específicos ao antígeno adicionados à célula. Em uma configuração, uma proteína manifestada na superfície da célula é uma proteína integral de membrana que apresenta uma porção extracelular que pode ser reconhecida por um anticorpo. O termo “porção extracelular” ou “exodomínio” no contexto da presente invenção significa uma parte de uma molécula, particularmente uma proteína, que enfrenta o espaço extracelular de uma célula e, preferivelmente, é acessível pela parte externa da referida célula, por exemplo, ligando moléculas como anticorpos localizadas fora da célula. Preferivelmente, o termo se refere a uma ou mais alças extracelulares ou domínios ou a um fragmento delas. O termo “porção” é utilizado neste documento e se refere a um elemento contínuo ou descontínuo de uma estrutura como uma sequência de aminoácidos. Uma porção ou parte de uma sequência de proteínas preferivelmente compreende pelo menos 5, em particular pelo menos 8, pelo menos 12, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 30, pelo menos 50, ou pelo menos 100 aminoácidos consecutivos e/ou não consecutivos da sequência de aminoácidos que constituem a proteína.

[00389]. A proteína detectável por um anticorpo ou por outra molécula imunorreativa também pode ser chamada de antígeno. Em algumas configurações, a célula da invenção pode ser caracterizada por manifestar – ou não manifestar – um ou mais antígenos específicos. No contexto da presente invenção, este antígeno é preferivelmente manifestado na superfície da célula. Este antígeno também pode ser chamado de “antígeno de superfície”. Exemplos dele são apresentados no Exemplo 7.

[00390]. Em linha com os princípios gerais de biologia celular, quando um antígeno é manifestado na superfície da célula, então, o gene que codifica o antígeno é expresso pela célula. Portanto, a detecção de um antígeno que é manifestado na superfície da célula é um meio indireto para mostrar que o gene que codifica o antígeno é expresso. Por exemplo, quando se diz neste documento que a célula expressa um determinado gene, que codifica um antígeno expresso na superfície da célula, então, a expressão do referido gene pode ser testada diretamente no nível do produto da expressão genética (como mRNA), ou indiretamente no nível da proteína manifestada na superfície da célula. Muito embora a palavra “expresso”, no sentido estrito significa que um gene é expresso, a palavra “expresso” também pode significar descrever que uma proteína, particularmente uma proteína da superfície celular, que é codificada pelo referido gene, é manifestada na célula.

[00391]. De acordo com a invenção, um antígeno é manifestado em uma célula se o nível de expressão estiver acima do limite de detecção e/ou se o nível de expressão for alto o suficiente para permitir a ligação por anticorpos específicos do antígeno adicionados à célula. De acordo com a invenção, diz-se que um antígeno não é expresso em uma célula se o nível de expressão estiver abaixo do limite de detecção e/ou se o nível de expressão for muito baixo para permitir a ligação por anticorpos específicos do antígeno adicionados à célula. Preferivelmente, um antígeno expresso em uma célula é expresso ou exposto, isto é, está presente, na superfície da referida célula e, dessa forma, disponível para ligação por moléculas específicas do antígeno como anticorpos ou outra molécula imunorreativa adicionada à célula. Em alguns casos, uma molécula secundária que auxilia na detecção, como, por exemplo, um anticorpo secundário opcionalmente marcado, também é adicionado.

[00392]. Um anticorpo ou outra molécula imunorreativa pode reconhecer um epítopo na célula. O termo “epítopo” se refere a um determinante antigênico em uma molécula como um antígeno, isto é, a uma parte ou fragmento da molécula que é reconhecida, isto é, ligada, pelo sistema imunológico, por exemplo, que é reconhecido por um anticorpo ou outra molécula imunorreativa. A detecção de um epítopo específico para qualquer antígeno particular normalmente permite concluir que aquele antígeno particular é expresso na célula que está sendo analisada.

[00393]. Em uma configuração, a célula da invenção pode ser caracterizada por imunofenotipagem. “imunofenotipagem” geralmente significa que a célula pode ser caracterizada por moléculas específicas do antígeno como anticorpos ou outras moléculas imunorreativas, que são adicionadas à célula para determinar se um antígeno é expresso em uma célula. A imunofenotipagem inclui a separação de células utilizando vários métodos incluindo a citometria de fluxo.

[00394]. Um método preferido para a imunofenotipagem é a citometria de fluxo, em particular a FACS, um analito, em particular uma proteína de superfície celular, é reconhecida, normalmente com um anticorpo ou outra molécula imunorreativa. O anticorpo ou outra molécula imunorreativa é ela mesma marcada com fluoróforo, ou reconhecida por um anticorpo secundário marcado com fluoróforo ou outra molécula imunorreativa, que é adicionada para aquele propósito.

[00395]. Analitos preferidos adequados para imunofenotipagem no contexto da presente invenção são moléculas que pertencem ao cluster de diferenciação (também chamado de cluster de designação ou determinante de classificação e abreviado neste documento como CD). O CD é um termo utilizado para a identificação e investigação de moléculas de superfície celular por imunofenotipagem de células. Alguns exemplos de clusters de diferenciação adequados para caracterizar configurações da célula da invenção são descritos neste documento. A menos que o contexto determine o contrário, quando se faz referência à expressão de qualquer molécula do Cluster de Diferenciação (CD), isto significa que a expressão da respectiva molécula do CD é preferivelmente determinada por imunofenotipagem; no entanto, a determinação no nível do ácido nucleico também é possível. Aqui, referência a uma molécula específica do CD, com referência às células humanas, quer dizer a respectiva molécula específica do CD de acordo com as definições atribuídas pelo Human Leukocyte Differentiation Antigen Workshops I-IX. O Exemplo 7 apresenta uma descrição exemplar e útil para imunofenotipagem de acordo com a presente invenção.

[00396]. Por outro lado, a menos que o contexto determine o contrário, quando se faz referência na presente revelação à expressão de qualquer gene que não seja uma molécula do Cluster de Diferenciação (CD) ou ácido nucleico que codifica a mesma, pretende-se que a expressão do respectivo gene seja preferivelmente determinada no nível do ácido nucleico, preferivelmente por um método mencionado ou descrito acima.

[00397]. Primeiro, a MSC de acordo com a invenção é caracterizada de forma que ela (a) expressa o APCDD1. A expressão de APCDD1 é preferivelmente detectada no nível da expressão genética, mais preferivelmente por qRT PCR. Um exemplo disto é mostrado na Figura 8.

[00398]. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, acredita- se que o APCDD1 seja importante para a capacidade de autorrenovação da célula: mostrou-se anteriormente que o produto genético mantinha altos níveis de beta-

catenina, e a beta-catenina mantém a similaridade com a célula-tronco das células, em particular as MSCs (Viale-Bouroncle et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015 vol. 457, p. 314-317; Yu, Cell Transplant., 2017, vol. 26, p. 365-377). Conforme mostra o Exemplo 8, as células de acordo com a presente invenção são distintas das células derivadas do PVWJ, entre outras coisas, pela expressão de APCDD1. Dessa forma, a célula que expressa o APCDD1 de acordo com a presente invenção é claramente diferente das MSCs descritas pela técnica anterior, veja particularmente a publicação WO 2004/072273 A e Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229.

[00399]. A MSC de acordo com a presente invenção, no entanto, não expressa 3G5. O 3G5 é um marcador para células perivasculares. Dessa forma, a célula da invenção não é uma célula perivascular. Portanto, preferivelmente, a célula da invenção não expressa qualquer marcador para uma célula perivascular que não é ao mesmo tempo um marcador para uma célula mesenquimal e/ou uma célula-tronco.

[00400]. Preferivelmente, a célula expressa pelo menos um gene específico para células estromais, mais particularmente para células estromais mesenquimais. Preferivelmente, a célula manifesta pelo menos um marcador de superfície específico para células estromais, mais particularmente para células estromais mesenquimais, em sua superfície.

[00401]. Em uma configuração, pelo menos um marcador de superfície específico para células estromais, mais particularmente para células estromais mesenquimais, é selecionado da lista que compreende, mas não está limitada, à proteína cofator de membrana (CD46), fator acelerador de degradação ou CD55, e proteína inibidora de MAC (CD59). Relatou-se anteriormente que todos os três marcadores estão relacionados à cascata do complemento. Conforme mostra a Figura 7B, as células exemplificadas na presente invenção manifestam estes marcadores em sua superfície. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, acredita-se que um ou mais destes marcadores de superfície exercem uma função na proteção das células da lise celular mediada pelo complemento in vivo. Preferivelmente, a célula expressa pelo menos um de CD46, CD55, e CD59, mais preferivelmente pelo menos dois de CD46, CD55, e CD59, e mais preferivelmente todos de CD46, CD55, e CD59. Até onde os inventores sabem, CD46, CD55, e CD59 não foram descritos anteriormente em MSCs especificas derivadas do UC, muito embora não se possa excluir que algumas células realmente expressam uma ou mais destas moléculas de superfície.

[00402]. Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção expressa CD73. CD73 também é conhecida como ecto 5' nucleotidase e é um marcador para células estromais mesenquimais (MSCs), veja Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).

[00403]. Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção expressa CD105. CD105 (também conhecida como endoglina) é um marcador adicional para células estromais mesenquimais (MSCs), veja Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).

[00404]. Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção expressa CD90. CD90 (também conhecida como Thy-1) é um marcador adicional para células estromais mesenquimais (MSCs), veja Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).

[00405]. Em uma configuração mais preferida, a célula de acordo com a presente invenção expressa tanto CD105 quanto CD73. Além dos métodos gerais descritos acima, estes clusters de diferenciação podem ser detectados, por exemplo, pelos anticorpos SH2 e SH3 (Horwitz et al., Curr. Opin. Hematol., 2006, vol. 13, p. 419- 425). Normalmente, uma célula estromal mesenquimal de acordo com a presente invenção expressa tanto CD105 quanto CD73, e preferivelmente também CD90. Dessa forma, a expressão de CD105 e/ou de CD73 e/ou de CD73 pode ser adequada para distinguir a célula da invenção de algumas outras células. Mais preferivelmente, a célula expressa, além de qualquer uma ou mais de CD105 e/ou de CD73 e/ou de CD73, também pelo menos uma de CD46, CD55, e CD59, mais preferivelmente pelo menos quaisquer duas de CD46, CD55, e CD59, e mais preferivelmente todas de CD46, CD55, e CD59.

[00406]. Em uma configuração preferida, a célula expressa adicionalmente PPARG. Um exemplo disto é mostrado na Figura 8. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, acredita-se que o produto do gene PPARG é capaz de manter as células, em particular as MSCs, em um fenótipo multipotente, em particular para prevenir diferenciação no tecido ósseo. Para conhecer os detalhes, veja, por exemplo, Xu et al. (Curr. Stem Cell Res. Ther, 2016, vol. 11, p. 247-254).

[00407]. Em outra, e não mutuamente exclusiva, configuração preferida, a célula expressa adicionalmente o gene FLVCR2. Um exemplo disto é mostrado na Figura

8. A abreviação FLVCR2 significa família do receptor celular do vírus da leucemia Felina subgrupo C, membro 2. A proteína codificada FLVCR2 é uma proteína transmembrana do membro da maior família de facilitadores que funciona como um transportador de cálcio. Em seres vivos, descreveu-se anteriormente que a proteína codificada exerce potencialmente uma função no desenvolvimento de células endoteliais vasculares cerebrais.

[00408]. Em uma configuração preferida, a células não expressa CD117. A CD117 é um marcador de superfície celular específico para determinados tipos de progenitores hematopoiéticos (sangue), como na medula óssea. A célula da invenção não é uma célula sanguínea, e preferivelmente, também, não é uma célula da medula óssea. A CD117 também tem sido associada com alguns tipos de câncer; no entanto, a célula da invenção não é normalmente uma célula cancerosa. Em outras palavras, células oncogênicas não são referidas aqui como células da invenção.

[00409]. A célula de acordo com a invenção preferivelmente expressa MHC I. No caso de uma célula estromal mesenquimal humana, prefere-se que a célula humana expresse pelo menos um, preferivelmente pelo menos qualquer combinação de dois, e mais preferivelmente todos os antígenos leucocitários humanos HLA-A, HLA-B e HLA-C.

[00410]. Em algumas configurações, a célula de acordo com a invenção não expressa MHC II, ou expressa MHC II em baixos níveis. “baixos níveis” é uma expressão relativa que indica que os níveis de expressão são menores do que nas células que apresentam antígeno do mesmo indivíduo, por exemplo, células dendríticas, fagócitos mononucleares e células B do mesmo indivíduo. Em uma configuração, a célula não expressa substancialmente MHC II. Em particular, no caso de uma célula estromal mesenquimal humana, prefere-se que a célula não expresse qualquer um ou mais dos antígenos leucocitários humanos HLA-DP, e/ou HLA-DQ. Opcionalmente, também, HLA-DR não é expresso; alternativamente, HLA-DR é expresso em baixos níveis. A ausência de expressão destes antígenos leucocitários humanos (HLA), ou de expressão em baixos níveis, faz com que a célula da invenção seja imunoprivilegiada, permitindo, por exemplo, co-cultura com células de indivíduos HLA-incompatíveis, e até mesmo células de outras espécies, incluindo células do sistema imunológico. A expressão destes antígenos leucocitários humanos pode ser testada, por exemplo, pela coloração superficial com anticorpos específicos, ou por qRT PCR.

[00411]. Em uma configuração, a célula da invenção é negativa para marcadores de superfície CD34 e/ou CD45. Isto significa que a célula não manifesta CD34 e/ou CD45.

[00412]. Em uma configuração, a célula da invenção produz prostaglandina E2 (PGE2). Como é comumente conhecida, Prostaglandina E2 (PGE2), também conhecida como dinoprostona, é uma prostaglandina que ocorre naturalmente que foi descrita como um ativador da via de sinalização de Wnt (Goessling et al., Cell, 2009, vol. 136, p. 1136-1147). Diversos produtos comerciais, em particular kits de ELISA, estão disponíveis para determinação da produção de PGE2. A detecção pode ser realizada utilizando sobrenadante celular ou lisado de células, ou uma combinação deles, como uma amostra.

[00413]. Em uma configuração, a célula da invenção expressa um ou mais marcadores de células-tronco. Estes marcadores de células-tronco podem incluir marcadores tipicamente selecionados, mas não limitados a Oct-4 e Nanog. Tamanho da Célula

[00414]. Além de outras características e configurações descritas neste documento, a célula de acordo com a presente invenção também é preferivelmente caracterizada por um tamanho relativamente pequeno. O tamanho pode ser descrito, por exemplo, pelo volume celular, o diâmetro celular ou a área da superfície celular, ou por um parâmetro que se correlacione com o volume celular, com o diâmetro celular ou com a área da superfície celular. O tamanho também pode ser descrito como uma combinação de quaisquer dos itens anteriores. “relativamente” significa em comparação com outras células, particularmente em comparação com células estromais mesenquimais de outras fontes e/ou outras isoladas por outros métodos. “outras fontes” significa outras áreas anatômicas, como, por exemplo, outros órgãos, por exemplo, a medula óssea, mas, também, outras seções do cordão umbilical, como a zona perivascular, e de qualquer Geleia de Wharton perivascular.

[00415]. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, acredita- se que, em algumas configurações, células menores (por exemplo, células com um diâmetro menor e/ou células com uma área superficial menor) sejam mais precoces no ciclo celular. Métodos para determinação do estado do ciclo celular das MSCs foram publicados (e.g. Achille et al., J. Cell. Biochem., 2011, vol. 112, p. 1817-1821) e podem ser aplicados às células da presente invenção, por exemplo, para propósitos analíticos.

[00416]. De acordo com a presente invenção, o valor da dispersão frontal da luz (FSC) determinado para uma célula individual por citometria de fluxo de correlaciona ao volume celular. Células maiores, isto é, particularmente aquelas com um volume celular maior, são caracterizadas por valores de FSC maiores, e vice-versa. Como é geralmente conhecido, o valor da FSC é um número sem dimensão. Para a determinação da FSC, uma ou mais células são analisadas por citometria de fluxo. Em geral, os valores da FSC, determinados por citometria de fluxo, dependem do instrumento utilizado, em particular das características do laser e da potência dos fotomultiplicadores de máquina para máquina. Consequente, não há valor absoluto para FSC, o valor tipicamente depende da máquina e do laser utilizados. Portanto, para garantir a reprodutibilidade, os detalhes a seguir, em combinação, são preferenciais no contexto da presente invenção.

[00417]. Na presente invenção, quando o valor da FSC é determinado por citometria de fluxo, o comprimento de onda de excitação é preferivelmente na faixa de 470 a 500 nm, mais preferivelmente de 488 nm, e a dispersão frontal da luz (FSC) é determinada. Não é necessário que a célula em si seja fluorescente para a determinação da FSC. Para tal determinação por citometria de fluxo, um dispositivo de citometria de fluxo comercial é normalmente utilizado. Em uma configuração preferida o citômetro de fluxo FACSAria III (BD Biosciences) é utilizado, com comprimento de onda de excitação de 488 nm. Os valores numéricos específicos da FSC especificado a seguir preferivelmente se referem às referidas condições, isto é, o referido citômetro e o referido comprimento de onda. Preferivelmente, a célula da invenção é caracterizada por um valor de FSC de 60 ou menos, como de 59 ou menos, como de 58 ou menos, como de 57 ou menos, como de 56 ou menos, como de 55 ou menos, como de 54 ou menos, como de 53 ou menos, como de 52 ou menos, como de 51 ou menos, ou até mesmo 50 ou menos. Em algumas configurações, a célula da invenção é caracterizada por um valor de FSC de 32 a 58, como de 33 a 57, como de 34 a 56, como de 35 a 55, como de 36 a 54, como de 37 a 53, como de 38 a 52, como de 39 a 51, como de 40 a 50, como de 41 a 49, como de 42 a 48, como de 43 a 47, como de 44 a 46. Em uma configuração preferida, o valor da FSC é de aproximadamente 45. Estes valores numéricos, específicos da FSC se referem à determinação pelo citômetro de fluxo FACSAria III sob as condições descritas acima.

[00418]. Preferivelmente, a célula da invenção é caracterizada por um valor de FSC que é menor do que o valor de FSC de uma célula derivada de PVWJ.

Preferivelmente, o valor da FSC da célula da invenção é significativamente menor do que o valor da FSC de uma célula derivada de PVWJ, veja, por exemplo, o Exemplo 4.

[00419]. Preferivelmente, a célula da invenção apresenta um volume celular menor do que o volume de uma célula derivada de PVWJ. Mais preferivelmente, a célula da invenção apresenta um volume celular significativamente menor do que o volume de uma célula derivada de PVWJ. O volume celular pode ser determinado indiretamente pela determinação do valor da FSC por citometria de fluxo (para conhecer os detalhes sobre a determinação do valor da FSC, veja acima). Então, para propósitos comparativos, uma esfera de um tamanho conhecido é opcionalmente submetida a citometria de fluxo sob condições ideais; dessa forma, uma pessoa pode determinar o volume de uma célula com base no valor da FSC determinado experimentalmente para a célula e o valor da FSC determinado experimentalmente para o grânulo, e o volume conhecido do grânulo. O grânulo utilizado preferivelmente apresenta um índice refrativo semelhante ou essencialmente idêntico ao índice refrativo da MSC. Um software comercial está disponível para o cálculo do volume celular com base na FSC determinada experimentalmente. Ferramentas preferidas para determinar o volume celular são FACS ARIA III e FACS DIVA (ambos da Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). A análise dos dados é realizada com o software FACS DIVA versão 6.0 que é normalmente associado com o FACS ARIA III. A configuração padrão do FACS DIVA é utilizada. Para comparar múltiplas amostras, ou células, com base nos valores da FSC, é necessário sempre trabalhar no mesmo instrumento e sempre com as mesmas configurações para fotomultiplicadores de FSC.

[00420]. A FSC e, dessa forma, o volume celular, podem ser determinados tanto para células frescamente isoladas, bem como para células submetidas à cultura e separadas enzimaticamente – por exemplo, tripsinizadas. No entanto, a FSC e o volume celular são preferivelmente determinados para células não aderentes. Para citometria de fluxo, qualquer célula aderente deve ser separada da superfície do vaso de cultura à qual ela está aderida, antes da determinação do volume celular, normalmente por tratamento enzimático, mais particularmente por tripsinização. Mais especificamente, a FSC é tipicamente determinada submetendo-se as células não aderentes a citometria de fluxo, e determinação da Dispersão Frontal da Luz (FSC). Um software comercial está disponível para a determinação do volume celular com base na FSC determinada experimentalmente. Um software comercial preferido para determinação do volume celular de acordo com a presente invenção é o BD FACSDiva (Becton Dicksnson, Franklin Lakes; NJ; EUA).

[00421]. Muito embora os inventores tenham demonstrado que as células da presente invenção são relativamente homogêneas, existe, normalmente, alguma variação, como acontece com todos os produtos biológicos, também com relação ao volume celular. Portanto, o volume celular também pode ser descrito como o volume celular médio. Em uma população de múltiplas células, o volume celular médio é preferivelmente um volume celular que corresponde ao volume celular de células obtidas conforme descrito no Exemplo 1 e no Exemplo 2A, para determinação experimental da FSC. O Exemplo 4 descreve, por meio de exemplo, como a FSC de uma multiplicidade de células é determinada por citometria de fluxo e dispersão frontal. O “volume médio” representa a média aritmética do volume de células individuais, conforme determinado experimentalmente. Tipicamente, o “volume médio” representa a média aritmética dos volumes de pelo menos 1.000 eventos individuais, como de pelo menos 5.000 eventos individuais, como de pelo menos 10.000 eventos individuais, em algumas configurações de 100 a 1.000.00000 eventos individuais. Cada evento determinado por citometria de fluxo normalmente corresponde a uma célula. Como a determinação do volume celular por citometria de fluxo é um método de alto rendimento, a média destes números de células individuais pode ser normalmente determinado sem tempo e esforço não razoáveis.

[00422]. Em uma configuração, o volume celular em si não é determinado, mas o valor da FSC é determinado. Normalmente, quando uma determinada célula apresentar um valor de FSC menor do que o valor de FSC de uma célula de referência, então, a determinada célula também apresenta um volume celular menor do que o da célula de referência; portanto, a determinação do FSC permite uma conclusão indireta sobre o volume de uma célula.

[00423]. Preferivelmente, a célula da invenção apresenta uma área superficial de não mais do que 3.500 µm2. Preferivelmente, a célula apresenta uma área superficial de não mais do que 3.000 µm2. Preferivelmente, a célula apresenta uma área superficial de não mais do que 2.500 µm2. Preferivelmente, a célula apresenta uma área superficial de não mais do que 2.100 µm2. Em algumas configurações, a célula apresenta uma área superficial de não mais do que 2.000 µm2, "área superficial" se refere à área superficial bidimensional de uma célula.

[00424]. No contexto da presente revelação, a área superficial bidimensional de uma célula é determinada enquanto a célula está na cultura aderente, isto é, a célula adere à placa de cultura. É importante que as células estejam em um estado de baixa confluência. A subconfluência é considerada vantajosa para a reprodutibilidade da determinação porque acredita-se que células subconfluentes não inibem substancialmente umas às outras por inibição de contato. Para a determinação da área superficial, uma ou mais células são fotografadas ou de outra forma visualmente observadas ou registradas, tipicamente com um microscópio, da dimensão perpendicular (isto é, 90º) até a superfície da placa de cultura à qual a célula ou as células aderem. Os limites da área são tipicamente definidos manualmente em uma imagem gráfica (isto é, fotografia) da célula. A agitação das placas antes de realizar a referida imagem gráfica é preferivelmente evitada, ou mantida em um mínimo. Os métodos e o software utilizados para determinar a área superficial não são particularmente limitados, e o respectivo software é disponibilizado por diversos fornecedores comerciais, por exemplo, Carl Zeiss (Jena, Alemanha). Para a determinação na Figura 6, o Axiovision LE 4.8 da Cari Zeiss (Jena, Alemanha) foi utilizado. Por meio de exemplo, os métodos para determinar a área superficial de células cultivadas em uma placa de cultura são descritas por Agley et al., 2012, J. Histochem. Cytochem., vol. 60, p. 428-438, entre outros.

[00425]. Muito embora os inventores tenham demonstrado que as células da presente invenção são relativamente homogêneas, existe, normalmente, alguma variação, como acontece com todos os produtos biológicos, também com relação à área da superfície celular. Portanto, a superfície celular também pode ser descrita como a área da superfície celular média. Neste caso, preferivelmente a célula apresenta uma área superficial média de não mais do que 3000 µm2. Preferivelmente a célula apresenta uma área superficial média de não mais do que 2500 µm2. Preferivelmente a célula apresenta uma área superficial média de não mais do que 2100 µm2. Em algumas configurações, a célula apresenta uma área superficial de não mais do que 2000 µm2. Em uma população de múltiplas células, a área superficial média está preferivelmente dentro dos limites apresentados aqui. A “área média” representa a média aritmética das áreas de células individuais, conforme determinado experimentalmente. Tipicamente, a “área média” representa a média aritmética das áreas de pelo menos 35 células individuais, como pelo menos 50 células individuais,

como pelo menos 100 células individuais, em algumas configurações de 35 a 200 células individuais.

[00426]. Conforme mostra a Figura 6, a célula da presente invenção preferivelmente apresenta uma área superficial que é significativamente menor do que as MSCs derivadas da medula óssea. Em algumas configurações, a célula da presente invenção também apresenta uma área superficial que é menor do que a área superficial de células estromais mesenquimais derivadas da Geleia de Wharton perivascular (PVWJ), como aquelas descritas na publicação WO 2004/072273 A e Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229. As células estromais mesenquimais derivadas da Geleia de Wharton perivascular (PVWJ) também podem ser chamadas de “células estromais mesenquimais derivadas da zona perivascular".

[00427]. Preferivelmente, o volume e/ou a área superficial médio(a) das células de acordo com a presente invenção é menor do que o volume e/ou área superficial médio(a) de MSCs derivadas da medula óssea (Figura 6) e menor do que as MSCs derivadas do cordão umbilical da área perivascular (Figura 5B). Na literatura, o volume celular menor de MSCs foi considerado vantajoso por uma variedade de motivos (veja, por exemplo, Ge et al., Stem Cell Rev., 2014, vol. 10, p. 295-303). Através da presente invenção, células com tais propriedades vantajosas agora se tornam confiavelmente disponíveis.

[00428]. Preferivelmente, a complexidade interna da célula da presente invenção é menor do que a complexidade interna de uma MSC derivada da PVWJ. A complexidade interna é tipicamente determinada por análise de dispersão lateral (SSC). Em geral, células com uma estrutura interna mais complexa parecem ser mais reluzentes/brilhantes na análise de dispersão lateral, devido às estruturas internas, veja, por exemplo, o Exemplo 4A. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, uma baixa complexidade interna pode estar associada com a similaridade com a célula-tronco. Para comparar múltiplas amostras com base nos valores da SSC, é necessário sempre trabalhar no mesmo instrumento e sempre com as mesmas configurações para os fotomultiplicadores da FSC e da SSC por causa dos valores de SSC, como e os valores de SSC, determinados por citometria de fluxo, dependem do instrumento utilizado, em particular as características do laser e a potência dos fotomultiplicadores de máquina para máquina. Na presente invenção, a máquina de citometria de fluxo, o laser e as configurações e o software utilizados para determinação dos valores de SSC são preferivelmente os mesmos que aqueles descritos acima para a determinação dos valores de FSC.

[00429]. Em uma configuração, células derivadas da SWJ de acordo com a presente invenção são caracterizadas por uma complexidade interna menor (mostrada por SSC) do que as células derivadas de PVWJ.

[00430]. Em uma configuração preferida, as referidas células derivadas da SWJ são caracterizadas tanto por um volume celular menor (mostrado por FSC) quanto por uma complexidade interna menor (mostrada por SSC), do que as células derivadas da PVWJ. As células derivadas da PVWJ podem ser obtidas, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos Comparativos desta revelação. Propriedades Biológicas Celulares: Potencial de Diferenciação, Senescência e Imortalidade

[00431]. Em geral, o potencial de diferenciação, a senescência e a imortalidade podem ser chamados juntamente de “propriedades biológicas celulares”. É desnecessário dizer que a célula da invenção apresenta propriedades biológicas celulares adicionais, que podem ser analisadas experimentalmente pela pessoa com habilidade na técnica. O termo “propriedades biológicas celulares”, conforme utilizado neste documento é, portanto, um termo aberto que também inclui propriedades adicionais de uma célula que podem ser determinadas por um ensaio biológico, mesmo que aquelas propriedades adicionais não sejam explicitamente especificadas aqui.

[00432]. A célula de acordo com a invenção é uma célula mesenquimal, particularmente uma célula estromal mesenquimal (MSC). A referida MSC é normalmente clonogênica, a menos que o contexto determine o contrário. Assim, mesmo uma única célula da invenção é uma unidade formadora de colônia (UFC) que pode dar origem a uma multiplicidade de células derivadas.

[00433]. A célula da invenção também pode ser chamada de “célula progenitora estromal”. Em geral, uma célula progenitora estromal é tipicamente capaz de dar origem a derivadas fenotipicamente e genotipicamente idênticas (autorrenovação), bem como pelo menos outro tipo de célula final. Em uma configuração, a célula da presente invenção não é comprometida com a linhagem.

[00434]. Assim, preferivelmente, a célula não é terminalmente diferenciada. Em uma configuração, a célula não é diferenciada adicionalmente, além de ser uma célula mesenquimal. Preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em vários tipos de células. Em algumas configurações, a diferenciação em um ou mais destes vários tipos de células é induzível, por exemplo, por estímulos externos e/ou por condições de cultura específicas.

[00435]. Em uma configuração preferida, a célula é pelo menos multipotente. A multipotência pode ser testada mostrando que uma célula é capaz de se diferenciar em múltiplos, pelo menos dois, tipos de células diferentes. Não existem limitações particulares no ensaio adequado para fazer tal apresentação. No entanto, tipicamente a apresentação é realizada in vitro. Assim, em uma configuração preferida, a MSC da invenção é uma célula que apresenta capacidade de diferenciação multipotente in vitro. Exemplos de diferentes tipos de diferenciação são apresentados nos Exemplos 12, 13 e 14. Por exemplo, o potencial de diferenciação osteogênica pode ser determinado conforme descrito no Exemplo 12, embora métodos estabelecidos possam alternativamente ser utilizados. O ensaio para potencial de diferenciação osteogênica conforme descrito no Exemplo 12 foi especificamente desenvolvido no contexto da presente invenção. Em comparação com os ensaios de potencial osteogênico do estado da técnica, muitos dos quais foram desenvolvidos com MSCs derivadas da medula óssea, o ensaio do Exemplo 12 permite uma expansão relativamente das células; isto, por sua vez, permite que as células (derivados do cordão umbilical) venham a aderir ao vaso de cultura, que é normalmente um pré- requisito para um ensaio osteogênico.

[00436]. Por exemplo, o potencial de diferenciação osteogênica pode ser determinado conforme descrito no Exemplo 13, embora métodos estabelecidos também possam ser utilizados. Por exemplo, o potencial de diferenciação condrogênica pode ser determinado conforme descrito no Exemplo 14, embora métodos estabelecidos também possam ser utilizados. “potencial de diferenciação” significa que uma determinada célula é capaz de se diferenciar em uma célula de uma determinada linhagem.

[00437]. Preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem osteogênica. Preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem condrogênica. Preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem adipogênica. Preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem osteogênica e em uma célula da linhagem condrogênica. Preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem osteogênica e em uma célula da linhagem adipogênica. Preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem osteogênica e em uma célula da linhagem adipogênica. Mais preferivelmente, a célula é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem osteogênica e em uma célula da linhagem condrogênica e em uma célula da linhagem adopogênica. Quando uma célula é capaz de se diferenciar em uma célula de uma determinada linhagem, pretende-se dizer que a célula se diferenciará adequadamente, desde que seja submetida a condições apropriadas. Por exemplo, condições particularmente adequadas para diferenciação em uma célula da linhagem osteogênica são apresentadas no Exemplo 12. Alternativamente, um kit comercial adequado para a diferenciação de uma célula estromal mesenquimal em uma célula da linhagem osteogênica pode ser utilizado, desde que o kit permita a aderência da célula no vaso de cultura, para testar se qualquer célula (célula estromal mesenquimal) é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem osteogênica; um kit descrito para este ensaio é o Kit de Diferenciação Osteogênica de Célula-Tronco Mesenquimal para hMSC BulletKit™ da Lonza (Wakersville, MD, EUA). Por exemplo, condições apropriadas para diferenciação em uma célula da linhagem condrogênica são apresentadas no Exemplo 13. Alternativamente, um kit comercial adequado para a diferenciação de uma célula estromal mesenquimal em uma célula da linhagem condrogênica pode ser utilizado para testar se qualquer célula (célula estromal mesenquimal) é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem condrogênica; um kit adequado é o Kit de Diferenciação Condrogênica de Célula-Tronco Mesenquimal para hMSC BulletKit™ da Lonza (Wakersville, MD, EUA). Por exemplo, condições apropriadas para diferenciação em uma célula da linhagem condrogênica são apresentadas no Exemplo 14. Alternativamente, um kit comercial adequado para a diferenciação de uma célula estromal mesenquimal em uma célula da linhagem condrogênica pode ser utilizado para testar se qualquer célula (célula estromal mesenquimal) é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem condrogênica; um kit adequado é o Kit de Diferenciação Condrogênica de Célula-Tronco Mesenquimal para hMSC BulletKit™ da Lonza. Por exemplo, condições apropriadas para a diferenciação em uma célula da linhagem adipogênica são apresentadas no Exemplo 13.

[00438]. Alternativamente, um kit comercial adequado para a diferenciação de uma célula estromal mesenquimal em uma célula da linhagem adipogênica pode ser utilizado para testar se qualquer célula (célula estromal mesenquimal) é capaz de se diferenciar em uma célula da linhagem adipogênica; um kit adequado é o Kit de Diferenciação Adipogênica de Célula-Tronco Mesenquimal para hMSC BulletKit™ da Lonza.

[00439]. Opcionalmente, a célula é até mesmo pluripotente, no entanto ela não é totipotente. A diferenciação potencial pode ser determinada submetendo-se uma célula a condições específicas. A transdiferenciação foi descrita na técnica e, dessa forma, pode-se testar se uma determinada célula, como uma MSC, é capaz de se diferenciar em uma célula ectodérmica ou célula endodérmica específica.

[00440]. Opcionalmente, a célula apresenta potenciais de diferenciação adicionais. Estes potenciais de diferenciação adicionais que são selecionados dos potenciais de diferenciação típicos para células estromais mesenquimais. No entanto, como é típico para células estromais mesenquimais, a célula da invenção é tipicamente não totipotente.

[00441]. Em uma configuração preferida, a célula da invenção é uma célula-tronco mesenquimal. Assim, naquela configuração, a célula estromal mesenquimal é uma célula-tronco mesenquimal. Em outras palavras, prefere-se que a célula tenha propriedades semelhantes às da célula-tronco. Propriedades e marcadores semelhantes aos da célula tronco, portanto, são descritos, por exemplo, por Melton, no Capítulo 2 de Lanza e Atala (eds.), Essentials of Stem Cell, Biology, 3rd ed., Elsevier,

2014.

[00442]. Preferivelmente, a célula de acordo com a presente invenção não mostra níveis anormalmente elevados de atividade da telomerase. “atividade da telomerase” se refere à atividade enzimática da enzima telomerase. Como é geralmente conhecido, a telomerase é uma enzima que alonga os telômeros em fitas de DNA permitindo, dessa forma, que as células senescentes que de outra forma se tornariam pós-mitóticas e se submeteriam à apoptose excedam o limite de Hayflick, e em alguns casos se tornem imortais. Em algumas configurações alternativas, a célula da invenção mostra atividade da telomerase, no entanto, em baixos níveis. A atividade da telomerase é tipicamente determinada pela determinação da atividade enzimática; mais especificamente, ela é tipicamente determinada pela determinação da atividade enzimática da transcriptase reversa da telomerase (abreviada como TERT, ou hTERT em humanos), que é uma subunidade catalítica da enzima telomerase. Um exemplo disso é apresentado no Exemplo 10. A atividade da telomerase pode ser determinada pelo kit

TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS (Roche Diagnostics), um imunoensaio enzimático fotométrico para determinação quantitativa de atividade da telomerase. Para ver a ilustração, veja, por exemplo, o Exemplo 10. Diz-se que a atividade da telomerase é baixa, se o kit for utilizado de acordo com as instruções do fabricante e as células analisadas mostrarem 10% ou menos, como preferivelmente 5% ou menos, de atividade da telomerase com relação ao controle positivo fornecido no referido kit TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS (considerado como 100%). O percentual, isto é, 10% ou menos, como preferivelmente 5% ou menos, se refere à média das células, isto é, significando que as células analisadas mostram uma média de 10% ou menos, como preferivelmente 5% ou menos, de atividade da telomerase com relação ao referido controle. Diversos reagentes alternativos e kits para detectar a atividade da telomerase estão disponíveis comercialmente e eles podem, alternativamente, ser utilizados no contexto da presente invenção.

[00443]. Alternativamente, a célula da invenção não expressa qualquer telomerase. Em outras palavras, nesta configuração, a célula de acordo com a presente invenção não apresenta qualquer atividade da telomerase. Mais precisamente, esta célula é caracterizada pela ausência de expressão detectável da telomerase. A expressão genética pode ser detectada diretamente ou indiretamente pela detecção da proteína transcrita do produto de expressão. A ausência de qualquer telomerase detectável, seja no nível da atividade enzimática, no nível da proteína ou no nível da expressão genética, pode ser adequada para caracterizar especificamente as células da invenção, também com referência a outras MSCs que foram descritas na literatura (por exemplo, US 2004/0136967 A1). "não expressa qualquer telomerase" significa que a expressão da telomerase não pode ser detectada na célula pelos métodos do estado da técnica disponíveis na data de vigência deste documento, como particularmente a qRT- PCR. Tipicamente significa que a atividade da TERT (atividade da hTERT no caso de células humanas) não pode ser detectada. Para a detecção da expressão de um gene que codifica a telomerase, por exemplo, iniciadores da PCR específicos para o gene hTERT podem ser utilizados (Nekani et al., 2010, Stem Cell Res., vol. 3, p. 244-254).

[00444]. Quando as células não mostram expressão da telomerase e/ou atividade da telomerase, então, elas não podem ser mantidas na cultura para sempre; nestas configurações, a célula da invenção não é imortal; não obstante, a célula da invenção é adequada para cultivo sob condições conforme descrito nos exemplos experimentais por pelo menos 12 passagens, ou um número equivalente de duplicações da população.

[00445]. Em uma configuração preferida, a célula da invenção não é imortal. Por exemplo, como mostra o Exemplo 10, a atividade da telomerase em células de acordo com a invenção é relativamente baixa. As células do Exemplo 10 são, dessa forma, consideradas como não sendo imortais.

[00446]. A célula da invenção, quando presente em um meio de crescimento adequado em condições adequadas, é preferivelmente mitoticamente ativa. Mais preferivelmente, a célula está na fase de crescimento exponencial, isto se aplica quando a célula está em um meio de crescimento adequado sob condições adequadas. Desnecessário dizer que uma célula congelada não é mitoticamente ativa; no entanto, quando as células congeladas da invenção são descongeladas e colocadas em um meio de crescimento adequado sob condições adequadas, elas podem se tornar mitoticamente ativas e preferivelmente crescem na fase de crescimento exponencial. Por exemplo, quando as células congeladas do Banco de Células Primário (descrito em detalhes abaixo) são descongeladas e colocadas em um meio de crescimento adequado sob condições adequadas, elas se tornarão mitoticamente ativas e darão origem a uma multiplicidade de células derivadas, que, por sua vez, podem, opcionalmente, ser utilizadas para criar um Banco de Células Secundário.

[00447]. A célula da invenção não é uma célula epitelial, como uma célula epitelial amniótica. A célula da invenção não é uma célula endotelial.

[00448]. A célula da invenção, apesar de suas excelentes propriedades proliferativas, não é uma célula cancerosa.

[00449]. De acordo com a presente invenção, a célula reivindicada não é uma célula embrionária. Em particular, a célula reivindicada não é uma célula-tronco embrionária. A danificação ou destruição de embriões (incluindo embriões humanos) não é prevista nesta invenção e não foi realizada quando a pesquisa subjacente à presente invenção foi conduzida.

[00450]. Em uma configuração preferida, a célula estromal mesenquimal da invenção é substancialmente livre de sangue ou de seus derivados, particularmente o sangue do cordão umbilical.

[00451]. Muito embora algumas MSCs sejam um componente da estrutura estromal da medula óssea, que oferece suporte físico e funcional durante a hematopoiese, a célula da presente invenção não é uma célula hematopoiética. Em particular, a célula da invenção não é uma célula sanguínea. Mais especificamente, a célula não é uma célula-tronco hematopoiética (HSC), nem uma célula progenitora multipotente do sistema hematopoiético (MPP), nem um progenitor mieloide comum (CMP).

[00452]. Em uma configuração, a célula da invenção não é senescente. Em outra configuração, a célula da invenção é caracterizada por baixa senescência. Como é geralmente conhecido, a enzima (β-galactosidase é particularmente ativa em células senescentes, onde ela catalisa a hidrólise de β-galactosidase em monossacarídeos. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, entende-se comumente que a atividade da β-galactosidase é atribuída à beta-galactosidase lisossomal endógena especificamente em células senescentes. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria particular, não se acredita que sua atividade seja propriamente dita necessária para a senescência. No entanto, a atividade da β-galactosidase é fácil de detectar de maneira confiável, tanto in situ quanto in vitro. Na presente invenção, a atividade da β- galactosidase é determinada por métodos usuais na técnica (veja, por exemplo, Lee et al., Aging Cell, vol. 5, p. 187-195. Um sinônimo para “célula senescente” é “célula envelhecida”.

[00453]. Em uma configuração, a célula da invenção é uma célula que cresceu até a passagem P11 ou menos, mais preferivelmente até a passagem P10 ou menos, mais preferivelmente até a passagem P9 ou menos, mais preferivelmente até a passagem P8 ou menos, mais preferivelmente até a passagem P7 ou menos, mais preferivelmente até a passagem P6 ou menos, mais preferivelmente até a passagem P5 ou menos, e mais preferivelmente até a passagem P4 ou menos. Conforme mostra o Exemplo 9, as células da invenção apresentam excelentes propriedades proliferativas para muitas passagens, e conforme mostra o Exemplo 11, as células da invenção não são normalmente senescentes ou apenas marginalmente senescentes por muitas duplicações cumulativas da população.

[00454]. Em uma configuração, a célula da invenção permanece multipotente durante pelo menos 16 duplicações cumulativas da população, como pelo menos 18 duplicações cumulativas da população, pelo menos 20 duplicações cumulativas da população, após o isolamento. Em uma configuração, a célula da invenção permanece multipotente durante pelo menos 12 passagens, após o isolamento.

[00455]. Em uma configuração, a célula da invenção permanece indiferenciada durante pelo menos 16 duplicações cumulativas da população, após o isolamento. Em uma configuração, a célula da invenção permanece indiferenciada durante pelo menos 12 passagens, após o isolamento. Célula obtida pelo método de acordo com a invenção

[00456]. A célula de acordo com o segundo aspecto da invenção também pode ser caracterizada pelo método pelo qual ela pode ser obtida. Isto é possível porque a célula de acordo com a presente invenção possui propriedades que são diferentes de células obtidas de acordo com os métodos descritos anteriormente (veja os exemplos e os exemplos comparativos neste documento) e, dessa forma, o método para obter a célula de acordo com a presente invenção resulta em uma célula com propriedades exclusivas. Em particular, a célula de acordo com o segundo aspecto pode ser caracterizada como uma célula que pode ser obtida pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção.

[00457]. Em outra, e não mutuamente exclusiva, configuração a célula do segundo aspecto pode ser obtida por um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção. Nesta configuração, o método de acordo com o primeiro aspecto da invenção contribui para a definição da célula, impondo características específicas na célula, como, por exemplo, a origem da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical, e/ou a viabilidade e/ou o volume e a área superficial associada com o procedimento de isolamento e expansão, para nomear apenas poucas características para propósitos ilustrativos.

[00458]. Configurações preferidas do primeiro aspecto da invenção são combináveis com aspectos preferidos do segundo aspecto da invenção em cada e toda combinação, a menos que o contexto determine o contrário. Assim, o método de acordo com o primeiro aspecto da invenção também define, em algumas configurações, o produto diretamente obtido pelo processo. Em algumas configurações, a célula de acordo com a presente invenção pode, portanto, ser descrita como uma célula que pode ser obtida pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção. As características de produto por processo resultantes do método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção são geralmente combináveis com as características do produto de acordo com o segundo e o terceiro aspectos da presente invenção.

[00459]. A presente invenção também diz respeito a uma célula que pode ser obtida pelo método do segundo aspecto da invenção. A este respeito, o método do segundo aspecto define e caracteriza a célula obtida desta forma. Preferivelmente, a célula estromal mesenquimal pode ser obtida por isolamento e, opcionalmente, mas preferivelmente, expansão, conforme descrito neste documento. Célula derivada da célula estromal mesenquimal

[00460]. Além disso, devido ao seu potencial de diferencial, a célula da invenção pode ser utilizada para produzir células maduras ou linhas de células. Uma célula madura é uma célula que não apresenta propriedades semelhantes às da célula- tronco. A diferenciação de células estromais mesenquimais para células maduras pode ser desencadeada por condições específicas, como a adição de fatores de crescimento exógenos específico ao meio de cultura, para propósitos de ilustração, veja os Exemplos 12, 13 e 14.

[00461]. Em uma configuração, a invenção diz respeito a uma célula derivada de uma célula mesenquimal da invenção. Em uma configuração, a célula derivada é unipotente ou terminalmente diferenciada. Em uma configuração, a célula derivada não é imortal. Tipos preferidos de células derivadas incluem células da linhagem osteogênica, linhagem adipogênica e da linhagem condrogênica. População Celular

[00462]. Em um terceiro aspecto, a invenção se refere a uma população de células (população celular). A população celular compreende pelo menos uma célula de acordo com o segundo aspecto da invenção.

[00463]. Em uma configuração, a população celular da invenção é uma população celular diretamente obtida pelo isolamento de células da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical, conforme descrito neste documento. Mais preferível, no entanto, a população celular da invenção é uma população celular obtida por expansão ex vivo de células que haviam sido isoladas anteriormente da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical, conforme descrito neste documento.

[00464]. Algumas características e configurações da população celular de acordo com a presente invenção, que serão descritas a seguir, estão relacionadas às características físicas da população celular, em particular as células compreendidas na população. Meramente para ilustração, e não obstante os detalhes revelados em qualquer lugar deste documento, as características físicas incluem aquelas características que podem ser diretamente determinadas com métodos físicos, como a expressão genética, volume ou área superficial, formato, etc. das células, a proporção e a distribuição de quaisquer delas dentro da população celular. Algumas características e configurações da população celular, que serão descritas a seguir, estão relacionadas ao método pelo qual a população celular pode ser obtida ou é obtida. Meramente para ilustração, e não obstante os detalhes revelados em algum lugar deste documento, as características da população celular relacionadas ao método pelo qual a população celular pode ser obtida ou é obtida podem incluir (a) a origem anatômica das células, em particular o cordão umbilical e a Geleia de Wharton estromal como uma seção preferida dele, (b) as condições aplicadas para isolar as células e (c) as condições aplicadas para expandir a célula, onde a população celular é obtida.

[00465]. A população celular da invenção compreende uma multiplicidade de células. Assim, a população celular compreende pelo menos duas células, no entanto, normalmente significativamente mais de duas células serão compreendidas. Muito embora não haja limite máximo estrito para o número de células compreendidas na população celular, um limite máximo natural é, em uma configuração típica, representado pelo número total de células que podem ser obtidas em um ciclo de escala completa, a menos que mais de um cordão seja utilizado como material de partida. Um ciclo de escala completa com o cordão umbilical humano e compreendendo a etapa (c) sendo executado até a passagem P2 tipicamente rende pelo menos 1 x 10 9 células, mais preferivelmente pelo menos 2 x 109 células, mais preferivelmente pelo menos 3 x 109 células, mais preferivelmente pelo menos 4 x 109 células, mais preferivelmente pelo menos 5 x 109 células, mais preferivelmente pelo menos 6 x 109 células, mais preferivelmente pelo menos 7 x 109 células, mais preferivelmente pelo menos 8 x 109 células, mais preferivelmente pelo menos 9 x 109 células, e em algumas configurações pelo menos 10 x 109 células. Mais células podem ser obtidas em passagens posteriores.

[00466]. A população celular compreende pelo menos uma célula que expressa o APCDD1. Isto pode normalmente ser confirmado mostrando que uma amostra da população celular é positiva para a expressão de APCDD1. Em outras palavras, a população celular é caracterizada pela expressão do gene APCDD1. Em uma configuração, a maioria das células da população celular expressa o gene APCDD1.

Preferivelmente, pelo menos 80% (por número de células), preferivelmente pelo menos 90% (por número de células), mais preferivelmente pelo menos 95%, como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% (cada por número de células) das células compreendidas na população celular expressam o APCDD1.

[00467]. Opcionalmente, a célula compreende pelo menos uma célula adicional, isto é uma ou mais células adicionais que é/são distinta(s) da célula da invenção, em particular a célula de acordo com o segundo aspecto da invenção. Em particular, nesta configuração, pelo menos uma célula adicional difere em pelo menos uma característica, compulsória ou opcional (preferida), da célula do segundo aspecto da invenção. Preferivelmente, no entanto, pelo menos uma célula adicional é singênica, mais preferivelmente autóloga, à célula da invenção.

[00468]. Em uma configuração, todas as células da população celular são MSCs. As células de acordo com esta configuração são tipicamente obtidas por cultura além da passagem inicial ("P0"). Embora, em algumas configurações as células originalmente isoladas do cordão umbilical compreendam MSCs bem como outras células (por exemplo, hemácias), as outras células não estarão substancialmente presentes além da P0 porque (a) as células não aderentes são removidas juntamente com o meio de crescimento no final da P0, (b) o meio de crescimento utilizado é preferivelmente, particularmente adequado para a expansão de MSCs, e (c) células com propriedades proliferativas inferiores às das MSCs não se proliferarão substancialmente tão bem como as MSCs, e assim, durante o curso de diversas Duplicações cumulativas da População, a população celular se torna enriquecida em MSCs.

[00469]. Em outra configuração, a população celular compreende MSCs bem como não MSCs. As células de acordo com esta configuração são tipicamente obtidas imediatamente após o isolamento, por exemplo, antes ou durante a passagem inicial ("P0"), e/ou combinando pelo menos uma célula da invenção com pelo menos outra célula.

[00470]. Preferivelmente, todas as células da população celular se originam da mesma espécie. Mais preferivelmente, todas as células da população celular são células humanas. Preferivelmente, todas as células da população celular são singênicas com relação umas às outras; mais preferivelmente, todas as células compreendidas na população celular são autólogas com relação umas às outras. Ainda mais preferivelmente, todas as células da população celular se originam do mesmo indivíduo.

Esta população celular é obtida utilizando um único cordão umbilical, ou uma fração dele, como material de partida.

[00471]. Preferivelmente, a população celular não compreende MSCs originárias de tecidos que não sejam o cordão umbilical. Mais preferivelmente, a população celular não compreende quantidades detectáveis de MSCs originárias de seções do cordão umbilical, exceto a Geleia de Wharton estromal. A população celular compreende a referida característica quando um marcador específico da célula endotelial (por exemplo, 3G5) e um marcador específico da célula epitelial (por exemplo, EpCAM) não pode ser detectado na população celular.

[00472]. Preferivelmente, a população celular compreende uma multiplicidade de células, das quais pelo menos 80% (por número de células), preferivelmente pelo menos 90% (por número de células), mais preferivelmente pelo menos 95%, como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% (cada por número de células) das células de acordo com o segundo aspecto. Todas as configurações preferidas do segundo aspecto também se aplicam ao terceiro aspecto da invenção. Preferivelmente pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, como pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou pelo menos 99%, mais preferivelmente 100%, do número total de células são células conforme definido no segundo aspecto e, opcionalmente um ou mais de suas configurações preferidas, sozinhas ou em combinação. Em uma configuração, a população celular consiste essencialmente de células de acordo com o segundo aspecto. Em uma configuração, a população celular consiste exclusivamente de células de acordo com o segundo aspecto.

[00473]. Preferivelmente, a população é uma população de células isolada. Em uma configuração, a população celular está localizada fora de um corpo humano ou animal. Uma população celular isolada é geralmente uma população celular fora de seu ambiente fisiológico in vivo. Preferivelmente, a população celular é uma população celular ex vivo. Em particular a população celular ex vivo está preferivelmente localizada fora do cordão umbilical. Em particular, a população celular ex vivo é preferivelmente livre de vasos sanguíneos. Em uma configuração, a população celular ex vivo está em um vaso de cultura. Em uma configuração, a população celular ex vivo está em um recipiente adequado para armazenagem, como em um frasco. Em uma configuração, a população celular ex vivo está em uma temperatura de aproximadamente 35°C a

39°C, preferivelmente de aproximadamente 36°C a 38°C, como aproximadamente de 37°C. Em uma configuração não mutuamente exclusiva, a população celular ex vivo está em um vaso de cultura, ou em um recipiente de armazenagem adequado. Preferivelmente, o recipiente adequado para armazenagem é adequado para o transporte da célula dentro da faixa de temperatura cima. Em uma configuração, a população celular ex vivo está em um recipiente adequado para criopreservação, como em um criofrasco, preferivelmente a uma temperatura de -180°C ou menos. Em uma configuração, a população celular ex vivo está em um vaso de cultura. Em uma configuração, a população celular ex vivo é uma população celular metabolicamente ativa, preferivelmente em expansão.

[00474]. Algumas das características da população celular podem ser descritas pelas propriedades físicas. Para a determinação das propriedades físicas, em geral, é possível coletar uma amostra da população celular, e para determinar as propriedades físicas de todas ou de parte das células compreendidas na amostra da população celular. Como as populações de células de acordo com a presente invenção são tipicamente homogêneas e/ou caracterizadas de forma que aquelas células individuais lá compreendidas sejam semelhantes umas às outras ou muito similares, o achado em propriedades particulares, como, por exemplo, a expressão genética, o volume ou a área superficial, o formato etc., nas células compreendidas na amostra geralmente também se aplicarão às demais células daquela população, a menos que o contexto determine o contrário e/ou que fique, de outra forma, aparente que uma população celular específica compreende células que são claramente diferentes umas das outras, genotipicamente e/ou fenotipicamente. Homogêneas neste contexto significa que substancialmente todas as células são muito semelhantes ou similares.

[00475]. A população celular é preferivelmente caracterizada de forma que todas as células são caracterizadas pelas características físicas essencialmente uniformes. “essencialmente uniformes” significa que pelo menos 90% das células, como pelo menos 91% das células, como pelo menos 92% das células, como pelo menos 93% das células, como pelo menos 94% das células, como pelo menos 95% das células, como pelo menos 96% das células, como pelo menos 97% das células, com pelo menos 98% das células, e preferivelmente pelo menos 91% das células, satisfazem uma ou mais características físicas desejadas. É particularmente desejável que o volume celular, que está correlacionado com a dispersão frontal da luz (FSC)

durante a citometria de fluxo, conforme descrito acima, seja uma característica física, que é essencialmente uniforme na população celular de acordo com a invenção.

[00476]. Preferivelmente o volume médio das células compreendidas na população de acordo com a presente invenção é menor do que o volume médio das MSCs derivadas da PVWJ. As MSCs derivadas da PVWJ podem ser obtidas, por exemplo, conforme descrito nos Exemplos Comparativos deste documento. Uma vez que o volume celular tenha sido determinado para uma célula individual, o volume celular médio pode ser determinado aritmeticamente. Métodos para a determinação do volume celular não são particularmente limitados, embora um método baseado na FACS, particularmente conforme descrito em detalhes para uma célula individual, seja preferido.

[00477]. A população celular é preferivelmente adicionalmente caracterizada de forma que o volume e/ou a área das células da população celular seja semelhante, ou alternativamente de forma que um percentual elevado de célula apresente um volume e/ou área superficial pequena.

[00478]. Preferivelmente, a população celular da invenção é caracterizada por um valor médio de FSC de 60 ou menos, ou valore preferidos dentro da referida faixa, conforme descrito acima para uma célula individual. Por exemplo, a população celular pode ser caracterizada por um valor médio de FSC de 55 ou menos, como de 50 ou menos. Em uma configuração específica, pelo menos 90% das células dentro da população celular são caracterizadas por um valor de FSC de 45 +/-10. Em uma configuração mais específica, o valor da FSC de todas as células da população é de 45 +/-10. Em uma configuração preferida, o valor médio da FSC de pelo menos 90% de células dentro da população celular é de aproximadamente 45. Em uma configuração mais preferida, o valor médio da FSC de todas as células da população é de aproximadamente 45. Preferivelmente, a célula da invenção é caracterizada por um valor de FSC que é menor do que o valor de FSC de uma célula derivada da PVWJ.

[00479]. Preferivelmente a área superficial média das células na população celular não é superior a 3000 µm2. Preferivelmente, a célula apresenta uma área superficial não superior a 2500 µm2. Preferivelmente a célula apresenta uma área superficial não superior a 2100 µm2. Em algumas configurações, a célula apresenta uma área superficial não superior a 2000 µm2. Em uma população de múltiplas células, a área superficial média está preferivelmente dentro dos limites apresentados aqui. Em algumas configurações, a área superficial média das células da população celular é preferivelmente de 1000 a 300 µm2, preferivelmente de 1100 a 2700 µm2, preferivelmente de 1200 a 2500 µm2, preferivelmente 1300 a 2200 µm2, preferivelmente 1400 a 2000 µm2, preferivelmente 1500 a 1900 µm2, mais preferivelmente 1600 a 1800 um2, e mais preferivelmente de aproximadamente 1700 µm2.

[00480]. Preferivelmente, a população celular é adicionalmente caracterizada de forma que pelo menos 70% (por número de células), preferivelmente pelo menos 80% (por número de células), mais preferivelmente pelo menos 90% (por número de células), mais preferivelmente pelo menos 95%, como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% (cada por número de células) sejam viáveis. “viável” designa uma célula que não é apoptótica. Dessa forma, por sua vez, a população celular compreende células apoptóticas em uma proporção de 30% ou menos do número total de células, preferivelmente 20% ou menos do número total de células, mais preferivelmente 10% ou menos do número total de células, e mais preferivelmente 5% ou menos do número total de células. Em uma configuração, a população celular não compreende quaisquer células apoptóticas. Um marcador adequado para células apoptóticas é o 7AAD (veja, por exemplo, o Exemplo 3). Em uma configuração, a viabilidade é determinada imediatamente depois do isolamento das células, isto é, antes da expansão. Um elevado percentual de viabilidade representa uma vantagem com relação às populações de MSCs descritas anteriormente.

[00481]. Preferivelmente, a população celular é adicionalmente caracterizada de forma que pelo menos 60% das células (por número de células), pelo menos 70% das células (por número de células), preferivelmente pelo menos 80% (por número de células), preferivelmente pelo menos 90% (por número de células), mais preferivelmente pelo menos 95%, como pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% (cada por número de células) sejam multipotentes.

[00482]. Em uma configuração, a população celular compreende mastócitos em uma proporção de 2% ou menos do número total de células, preferivelmente 1% ou menos do número total de células. Mais preferivelmente, a população celular não compreende mastócitos.

[00483]. Em uma configuração, a população celular compreende fibroblastos em uma proporção de 2% ou menos do número total de células,

preferivelmente 1% ou menos do número total de células. Mais preferivelmente, a população celular não compreende fibroblastos. Nesta configuração, o termo “fibroblastos” deve ser entendido estreitamente, como se referindo àquelas células que já se diferenciaram em fibroblastos e para excluir aquelas células que são multipotentes e têm a mera capacidade de se diferenciar em fibroblastos.

[00484]. Em uma configuração, a população celular compreende células da linhagem hematopoiética em uma proporção de 2% ou menos do número total de células, preferivelmente 1% ou menos do número total de células. Mais preferivelmente, a população celular não compreende células da linhagem hematopoiética. Em uma configuração preferida, a célula não compreende qualquer célula sanguínea, como célula sanguínea do sangue do cordão umbilical. Diversos marcadores são bem estabelecidos para células sanguíneas e, portanto, a conformidade com esta configuração preferida pode ser prontamente testada.

[00485]. Em uma configuração, a população celular compreende células perivasculares em uma proporção de 2% ou menos do número total de células, preferivelmente 1% ou menos do número total de células. Mais preferivelmente, a população celular não compreende qualquer célula perivascular. Um marcador para células perivasculares é o 3G5. Portanto, esta configuração pode ser alternativamente descrita de forma que a população celular não compreende qualquer célula que expressa o marcador 3G5 e/ou qualquer célula que manifeste o 3G5 em sua superfície. Em uma configuração, a população celular não é contaminada com células perivasculares. A expressão de 3G5 também foi descrita para MSCs derivadas da medula óssea (Khan et al., J. Orthop. Res., 2010, vol. 28, p. 834-40). Portanto, a não expressão de 3G5 também pode ser adequada para discriminar uma população celular de acordo com a presente invenção de populações de MSCs derivadas da medula óssea. Em uma configuração, a população celular não é contaminada com células perivasculares. Em uma configuração, a população celular não compreende MSCs derivadas da medula óssea.

[00486]. Em uma configuração, a população celular compreende células epiteliais em uma proporção de 2% ou menos do número total de células, preferivelmente 1% ou menos do número total de células. Mais preferivelmente, a população celular não compreende qualquer célula epitelial. Um marcador para células epiteliais é a molécula de adesão de célula Epitelial (EpCAM). Portanto, esta configuração pode ser alternativamente descrita de forma que a população celular não compreenda qualquer célula que expressa o marcador EpCAM e/ou qualquer célula que manifeste a EpCAM em sua superfície. Em uma configuração, a população celular não é contaminada com células epiteliais.

[00487]. Em uma configuração, a população celular compreende células endoteliais em uma proporção de 2% ou menos do número total de células, preferivelmente 1% ou menos do número total de células.

[00488]. Mais preferivelmente, a população celular não compreende qualquer célula endotelial. Um marcador para células endoteliais é o CD31. Portanto, esta configuração pode ser alternativamente descrita de forma que a população celular não compreende qualquer célula que expressa o marcador CD31 e/ou que manifeste o CD31 em sua superfície. Em uma configuração, a população celular não é contaminada com células endoteliais.

[00489]. Em uma configuração, a população celular compreende hemácias em uma proporção de 2% ou menos do número total de células, preferivelmente 1% ou menos do número total de células. Mais preferivelmente, a população celular não compreende qualquer hemácia. Marcadores para hemácia são globina e BGP1. Portanto, esta configuração pode ser alternativamente descrita de forma que a população celular não compreende qualquer célula que expressa o BGP1 e/ou globina. Em uma configuração, a população celular não é contaminada com hemácias.

[00490]. Preferivelmente, menos de 10% das células compreendidas na população celular mostram atividade da telomerase, mais preferivelmente menos de 5% das células compreendidas na população celular manifestam atividade da telomerase, e mais preferivelmente menos de 2,5% das células compreendidas na população celular mostram atividade da telomerase. A determinação da atividade da telomerase e de aspectos relacionados a ela estão descritos acima e também se aplicam a este terceiro aspecto da invenção. Respectivas populações celulares podem ser distintas de outras populações celulares descritas anteriormente (por exemplo, o processo de patente US2004/0136967 A1).

[00491]. Em uma configuração, a população celular é caracterizada adicionalmente de forma que nenhuma célula contida nela, ou, mais especificamente e preferivelmente nenhuma MSC contida nela, manifeste MHC II em sua superfície, ou expresse MHC II. Dessa forma, preferivelmente, nenhuma MSC da população celular expressa nenhuma MHC II. Em uma configuração, a expressão de MHC II pode ser adequada para distinguir a população celular de acordo com a presente invenção de outras populações celulares contendo MSC (veja, por exemplo, Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229).

[00492]. Preferivelmente, a população celular pode ser obtida por um método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, particularmente quando a etapa (c), isto é, a etapa de expansão, está envolvida. Dessa forma, o método de acordo com a presente invenção, compreendendo a etapa (c), pode gerar uma população de células estromais mesenquimais. As características de produto por processo resultantes do método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção são geralmente combináveis com as características do produto de acordo com o segundo e o terceiro aspectos da presente invenção. Alternativamente ou adicionalmente, a população celular de acordo com a presente invenção pode, portanto, ser descrita como uma população celular que pode ser obtida pelo método de acordo com o primeiro aspecto da invenção, compreendendo a etapa (c).

[00493]. Preferivelmente, a população celular estromal de acordo com a presente invenção é essencialmente livre de agentes contaminantes. Uma população celular estromal essencialmente livre de agentes contaminantes é definida neste documento como uma população celular essencialmente livre de agentes infectantes como vírus (encapsulados ou não encapsulados), parasitas, bactérias e endotoxinas, isto é, uma população celular contendo tais agentes infectantes em uma quantidade que não possa ser detectada em sistemas de identificação baseados em cultura, sorológicos ou moleculares ou com o teste de LAL (endotoxinas).

[00494]. Preferivelmente, a população celular de acordo com a presente invenção é essencialmente livre de antibióticos. Uma população celular essencialmente livre de antibióticos pode ser obtida cultivando células para pelo menos uma passagem na ausência de antibióticos. Por exemplo, mesmo que antibióticos estejam presentes na primeira passagem após o isolamento das células (“P0”), os antibióticos são preferivelmente descontinuados para todas as passagens depois da P0; em outras palavras, por exemplo, o meio de crescimento MSCBM-CD com 5% de hPL pode ser utilizado sem adição de antibióticos para P1 e todas as passagens subsequentes.

[00495]. Em uma configuração, a população celular ex vivo está congelada. Células congeladas são geralmente estáveis para armazenagem em temperaturas de -

180°C ou menos, muito embora qualquer condição adequada para armazenar células seja adequada nesta configuração. As células podem ser congeladas, preferivelmente congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido. Um crioprotetor pode ser adicionado antes do congelamento. Em uma configuração, a população celular é armazenada em nitrogênio líquido. Em uma configuração preferida, a população celular congelada é um banco de células. Esta configuração será agora descrita, mais detalhadamente. Banco de Células

[00496]. Conforme mostra, por exemplo, o Exemplo 6, as células da presente invenção são confiavelmente caracterizadas por um fenótipo específico também para diferentes isolamentos de cordões umbilicais individuais, e mantêm o fenótipo específico ao longo de diversas duplicações cumulativas da população. Assim, as células obtidas de acordo com a invenção ou de outra forma relativas à presente invenção apresentam confiavelmente um fenótipo específico e mantêm aquele fenótipo durante a expansão durante muitas passagens. Portanto, as células da invenção são particularmente adequadas para a criação de um banco de células.

[00497]. De fato, preferivelmente, a população celular de acordo com a presente invenção é um banco de células. Dessa forma a população celular da invenção pode estar na forma de um banco de células. A população celular compreende células derivadas de SWJ. A menos que especificado de outra forma, a população celular compreendida no bando de células geralmente coresponde à população celular descrita acima. Preferivelmente, o banco de células compreende uma multiplicidade de células, das quais pelo menos 70%, preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 90%, como pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 99% ou pelo menos 99%, mais preferivelmente 100%, do número total de células são células conforme definido no segundo aspecto da invenção e, opcionalmente, uma ou mais de suas configurações preferidas, sozinhas ou em combinação.

[00498]. O banco de células da invenção pode ser obtido por um método que compreende a expansão de células derivadas de SWJ de acordo com a invenção. Alternativamente, um banco de células de células isoladas frescamente (células não expandidas) pode ser mantido, a partir do qual células expandidas podem, opcionalmente, ser obtidas em um estágio posterior. Preferivelmente, no entanto, o banco de células compreende células expandidas, isto é, células que podem ser obtidas pelo método da invenção, incluindo a etapa (c).

[00499]. O banco de células preferivelmente compreende células não aderentes. Este banco de células pode ser obtido por um método que compreende a separação enzimática, por exemplo, a tripsinização, de células aderentes antes da produção do banco de células. A separação enzimática pode ser realizada pelos métodos de acordo com o estado da técnica.

[00500]. Em uma configuração, o banco de células é gerado depois de as células terem sido cultivadas por 5 a 30 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0), como 8 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00501]. O banco de células é mantido de forma que algumas ou todas as células sejam retiradas do banco de células e/ou utilizadas, por exemplo, para cultivo adicional, no ponto de tempo desejado, como em um ponto de tempo futuro.

[00502]. Quando uma população celular é “mantida”, isto pode ser realizado em qualquer condição que não interfira com a cultura futura da população celular; as populações celulares podem ser mantidas nas formas congelada ou não congelada; para o banco de células de acordo com a invenção, no entanto, a manutenção na forma congelada é preferida.

[00503]. Preferivelmente, o banco de células de acordo com a presente invenção é um banco de células congelado. Células congeladas são geralmente estáveis para armazenagem em temperaturas de -180°C ou menos, muito embora qualquer condição adequada para armazenar células seja adequada nesta configuração. As células podem ser congeladas, preferivelmente congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido. Um crioprotetor pode ser adicionado antes do congelamento. As células podem ser armazenadas em qualquer condição adequada, muito embora o congelamento em temperaturas de -180ºC ou menos é mais típico.

[00504]. O banco de células tipicamente contém células contidas em múltiplas alíquotas separadas, como em múltiplos frascos individuais. Preferivelmente, cada frasco compreende uma suspensão de células. Qualquer líquido que seja adequado para suspender células estromais mesenquimais, particularmente meio de crescimento, e preferivelmente o meio de crescimento adequado para a presente invenção, é adequado para ressuspender as células de acordo com a presente invenção. Em uma configuração preferida, o banco de células compreende um líquido que inclui um meio basal para cultura de células estromais mesenquimais, como, por exemplo, MSCBM CD, ou um meio basal substancialmente equivalente a ele. Preferivelmente, o líquido no qual as células do banco de células são suspensas compreende, ainda, lisado de plaquetas, por exemplo, 5% (vol./vol.) de lisado de plaquetas (PL), e no caso de células humanas, o lisado de plaquetas humanas (hPL).

[00505]. Bancos de células ou alíquotas deles podem ser utilizados em um ponto de tempo futuro, por exemplo, para inocular uma subcultura, por exemplo em um biorreator de produção.

[00506]. Configurações típicas do banco de células da invenção incluem um Banco de Células Primário (PCB) e um Banco de Células Secundário (SCB). Assim, o banco de células da invenção é preferivelmente selecionado de um Banco de Células Primário (PCB) e de um Banco de Células Secundário (SCB).

[00507]. No sentido mais amplo, o termo “Banco de Células Primário” se refere ao primeiro banco de células, mais preferivelmente o primeiro banco de células congeladas, que é preparado depois do isolamento das células do cordão umbilical.

[00508]. Em uma configuração, o Banco de Células Primário é gerado depois de as células terem sido cultivadas por 5 a 14 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00509]. Um Banco de Células Primário (PCB) é tipicamente na forma de alíquotas. As alíquotas são preparadas depois da respectiva passagem precedente (por exemplo, P2) e separação enzimática, como, por exemplo, tripsinização, centrifugação e ressuspensão. Preferivelmente, as células para o Banco de Células Primário são aliquotadas em 100-300 frascos, como 150-200 frascos, como 160 as 180 frascos, ou mais precisamente 165 a 175 frascos.

[00510]. Preferivelmente, cada frasco do Banco de Células Primário compreende 1 x 106 células a 1 x 107 células, preferivelmente 5 x 106 células a 500 x 106 células, preferivelmente 10 x 106 células a 100 x 106 células, preferivelmente 15 x 106 células a 50 x 106 células, preferivelmente 18 x 106 células a 30 x 106 células, como aproximadamente 20 x 106 células.

[00511]. Preferivelmente, o volume contido em cada frasco é entre 1 e 100 ml, como entre 2 e 20 ml, preferivelmente entre 3 e 10 ml, e mais preferivelmente por volta de 4 ml.

[00512]. Em uma configuração ilustrativa, o Banco de Células Primário obtido depois de um Ciclo em Escala completa consiste em 150 a 200 frascos, cada um contendo 20 x 106 células, e cada um contendo 4 ml de líquido (congelado) compreendendo as células.

[00513]. Também é possível envasar a suspensão de células destinadas ao Banco de Células Secundário em frascos ou recipientes de diferente tamanho ou conteúdo ou com uma quantidade ou concentração diferente de células. No entanto, as quantidades acima são indicativas do que pode tipicamente ser obtido em um ciclo de escala completa, e conversões para frascos ou recipientes de diferente tamanho ou conteúdo ou uma quantidade ou concentração diferente de células podem ser calculadas.

[00514]. No sentido mais amplo, o termo “Banco de Células Secundário” se refere ao segundo banco de células, mais preferivelmente o segundo banco de células congeladas, que é preparado depois do isolamento das células do cordão umbilical; o primeiro banco de células, mais preferivelmente o primeiro banco de células congeladas, que é preparado a partir de todas ou de parte das células compreendidas no Banco de Células Primário.

[00515]. Em uma configuração, o Banco de Células Secundário é gerado depois de as células terem sido cultivadas por 14 a 25 Duplicações cumulativas da População (não contando as Duplicações cumulativas da População durante a P0).

[00516]. Como o Banco de Células Primário compreende normalmente múltiplas alíquotas de células, que podem ser utilizadas no mesmo ou em diferentes pontos de tempo para cultura adicional, é possível gerar múltiplos Bancos de Células Secundários, simultaneamente ou sequencialmente, a partir de um Banco de Células Primário.

[00517]. Por exemplo, é possível gerar a partir de cada frasco compreendido no Banco de Células Primário um Banco de Células Secundário. Por exemplo, é possível gerar, começando a partir de um Banco de Células Primário, 100 a 300 Bancos de Células Secundários, como 150 a 200 Bancos de Células Secundários, como 160 a 180 Bancos de Células Secundários, ou mais precisamente 165 a 175 Bancos de Células Secundários.

[00518]. Um Banco de Células Secundário (SCB) é tipicamente na forma de alíquotas. As alíquotas são preparadas depois da respectiva passagem precedente (por exemplo, P4) e tratamento enzimático, como, por exemplo, tripsinização, centrifugação e ressuspensão. Preferivelmente, as células para o Banco de Células Secundário são aliquotadas em 100-300 frascos, como 150 a 200 frascos, como 160 a 180 frascos, ou mais precisamente 165 a 175 frascos.

[00519]. Preferivelmente, cada frasco do Banco de Células Secundário compreende 1 x 106 células a 1 x 107 células, preferivelmente 5 x 106 células a 500 x 106 células, preferivelmente 10 x 106 células a 100 x 106 células, preferivelmente 15 x 106 células a 50 x 106 células, preferivelmente 18 x 106 células a 30 x 106 células, como aproximadamente 20 x 106 células.

[00520]. Preferivelmente, o volume contido em cada frasco do Banco de Células Secundário é entre 1 e 100 ml, como entre 2 e 20 ml, preferivelmente entre 3 e 10 ml, e mais preferivelmente por volta de 4 ml.

[00521]. Também é possível envasar a suspensão de células destinadas ao Banco de Células Secundário em frascos ou recipientes de diferente tamanho ou conteúdo ou com uma quantidade ou concentração diferente de células. No entanto, as quantidades acima são indicativas do que pode tipicamente ser obtido em um ciclo de escala completa, e conversões para frascos ou recipientes de diferente tamanho ou conteúdo ou uma quantidade ou concentração diferente de células podem ser calculadas. Aplicabilidade Industrial

[00522]. Células de mamíferos com propriedades proliferativas, e as respectivas populações celulares, são valiosas para atividades não comerciais e comerciais, como atividades de pesquisa. As células da presente invenção são particularmente atraentes para tais propósitos, entre outras coisas em vista da boa reprodutibilidade do método, das excelentes propriedades proliferativas e do alto rendimento das células, entre outros. Populações celulares de acordo com a invenção podem ser adequadas para a fabricação de produtos celulares, por exemplo, para uso em pesquisa ou comercial. Por exemplo, é industrialmente viável preparar um Banco de Células Primário ou um Banco de Células Secundário para oferecer comercialmente tal Banco de Células, ou mais tipicamente alíquotas individuais dele, comercialmente para propósitos de pesquisa, como, por exemplo, ensaios in vitro à base de células.

[00523]. Além disso, é possível executar todo ou parte do método da invenção de forma automatizada, utilizando máquinas, incluindo robôs, para execução de uma ou mais etapas do processo. Assim, também, o método da invenção é suscetível à aplicação industrial.

[00524]. Em algumas configurações, as células da invenção podem ser submetidas a cultura e expandidas in vitro, por exemplo, para propósitos de pesquisa ou de produção. Por exemplo, a célula da invenção, ou células derivadas dela, pode ser utilizada para a triagem da eficácia e/ou citotoxicidade e/ou mecanismo de ação de compostos e composições farmacêuticas e/ou para estudar o mecanismo de uma determinada doença e/ou para transferência genética in vitro e/ou para produzir biomoléculas, como proteínas incluindo proteínas terapeuticamente ativas.

[00525]. As células da invenção podem ser submetidas à cultura como uma cultura pura, ou co-cultura com outras linhas celulares, primárias ou secundárias.

[00526]. Além disso, devido ao seu potencial de diferencial, as células podem ser utilizadas para produzir células maduras ou linhas de células. A diferenciação de células estromais mesenquimais para células maduras pode ser desencadeada por condições específicas, como a adição de fatores de crescimento exógenos específicos ao meio de cultura.

[00527]. Os exemplos e figuras a seguir são para propósitos ilustrativos e não se destinam a limitar a invenção, que é definida pelas reivindicações. Exemplos Exemplo 0: Materiais e métodos comuns a vários aspectos da invenção

[00528]. Em todos os exemplos experimentais, a menos que indicado de outra forma, MSCBM C ou meio basal substancialmente equivalente a ele foi utilizado. Meios exemplares são descritos a seguir. Meio basal MSCBM CD e meios de crescimento compreendendo o mesmo

[00529]. O meio basal MSCBM CD é disponibilizado comercialmente pela Lonza (Wakersville, MD, EUA; Cat. No 95062-688). De acordo com o fabricante, trata-se de um meio livre de soro, otimizado para expansão por múltiplas passagens de todos os tipos de células-tronco mesenquimais humanas, suporta diferenciação de múltiplas linhagens e não requer uma matriz de fixação para a colocação das células em placas. Meios basais substancialmente equivalentes ao MSCBM CD também são adequados.

[00530]. O "MSCBM CD/GA" é preparado como segue: - 500 ml de MSCBMCD (Lonza)

- 0,5 ml de GA1000 (Lonza; de acordo com o fabricante, o GA1000 contém 30 mg/ml de Gentamicina e 15 µg/ml de Anfotericina)

[00531]. O "MSCBM CD/hPL" – a menos que quantidades ou proporções divergentes sejam especificamente indicadas – contém 5% (vol./vol.) de lisado de plaquetas humanas (hPL), e 2 U/ml de heparina, que são ambos adicionados ao MSCBM CD (Istoé, sem os antibióticos Gentamicina e Anfotericina). O hPL é adequadamente preparado a partir de uma composição que compreende entre 3,8 x 108 plaquetas/ml e 1,2 x 109 plaquetas/ml, em média aproximadamente 7,9 x 108 plaquetas/ml); o lisado de plaquetas pode ser obtido, por exemplo, a partir do Banco de Sangue da Policlínica em Modena, Itália ou de qualquer outro fornecedor.

[00532]. O "MSCBM CD/hPL" – a menos que quantidades ou proporções divergentes sejam especificamente indicadas – contém 5% (vol./vol.) de lisado de plaquetas humanas (hPL), e 2 U/ml de heparina, que são ambos adicionados ao MSCBM CD (isto é, sem os antibióticos Gentamicina e Anfotericina).

[00533]. Fatores de crescimento (exceto aqueles eventualmente compreendidos no hPL e/ou no meio basal) não são adicionados, a menos que explicitamente declarados de outra forma.

[00534]. Os meios acima são particularmente adequados para expandir as células de acordo com a presente invenção. Contagem Celular

[00535]. Para a determinação do número de células, a menos que indicado de outra forma, as células são contadas por Contadores Celulares automatizados, como, particularmente, o NucleoCounter®. Se necessário, as células são separadas enzimaticamente como, por exemplo, tripsinizadas, antes da contagem celular. Se a contagem de hemácias não for desejada, então, a contagem celular é realizada depois de a população celular ter sido submetida a um tratamento com cloreto de amônio; este tratamento é conhecido por lisar as hemácias. Como resultado, o número total de células de uma população, exceto as hemácias, pode ser determinado. Para este fim, a Solução de Cloreto de Amônio recomendada para a lise de hemácias é comercialmente disponibilizado por vários fornecedores (por exemplo, a STEMCELL Technologies). Esta solução pode ser adicionada e utilizada de acordo com as instruções dos fabricantes. Exemplo 1: Segmentação e seccionamento do cordão umbilical, e obtenção de Geleia de Wharton estromal triturado

[00536]. Obtenha um cordão umbilical humano de um nascimento a termo. Aceite o cordão se o peso total for de 40 g ou mais. Segmente o cordão cortando perpendicularmente em segmentos de aproximadamente 2,5 cm de comprimento utilizando um bisturi afiado, estéril. Enxágue os segmentos do cordão com Solução Salina Tamponada com HEPES (HBSS) + 300 µg/ml de gentamicina e 0,15 µg/ml de anfotericina B por um total de 10 min. Utilize agitação mecânica para lavar o sangue do tecido.

[00537]. Para cada segmento obtido desta maneira, proceda para obter a seção de Geleia de Wharton estromal, como segue: faça uma incisão longitudinal no cordão e remova os vasos com a matriz imediatamente adjacente de tipicamente 3 mm (zona vascular-perivascular, também chamada de Geleia de Wharton vascular- perivascular - PVWJ) e descarte. A remoção deve ser realizada com cuidado, no sentido de que a abertura dos vasos e/ou a perda de células vasculares ou perivasculares deve ser evitada. Evite puxar a matriz do cordão.

[00538]. Antes de coletar o tecido da matriz, reexamine opticamente cada segmento de tecido a fim de garantir que a PVWJ tenha sido completamente removida. Nenhum vaso ou fragmento de vaso deve permanecer no segmento.

[00539]. Uma vez que a PVWJ tenha sido removida dos segmentos do cordão umbilical, corte pedaços de tecido da matriz dos segmentos do cordão umbilical utilizando uma tesoura afiada. Raspe a superfície interna dos segmentos do cordão com um bisturi afiado para obter o tecido da matriz remanescente. A fina membrana epitelial amniótica remanescente depois da raspagem é muito cuidadosamente removida e descartada. A camada subamniótica (ou mesenquimal) do revestimento do cordão é incluída na WJ que é isolada. Isto é realizado raspando-se cuidadosamente o tecido do epitélio amniótico; é importante ter cuidado para não incluir pedaços da membrana epitelial amniótica ao coletar o referido tecido. O tecido obtido desta forma é a Geleia de Wharton estroma (SWJ) pura.

[00540]. Triture finamente a SWJ obtida desta forma (cortada e raspada) com uma tesoura e/ou bisturi afiado. Adicione Solução Salina Tamponada com HEPES (HBSS) ao tecido triturado. Reúna o tecido triturado em uma placa de Petri.

[00541]. Para extrair a SWJ, deve-se tomar cuidado durante a extração para evitar extrair células do sangue do UC, células epiteliais ou endoteliais e células da estrutura vascular. Para propósitos de controle (opcional, mas recomendável,

particularmente ao retrabalhar este exemplo pela primeira vez), um marcador para células endoteliais é o CD31; um marcador para células epiteliais é a molécula de adesão de célula Epitelial (EpCAM), um marcador para células perivasculares é o 3G5.

[00542]. As etapas do Exemplo 1 são mostradas na Figura 3.

[00543]. O método da presente invenção, conforme exemplificado no Exemplo 1, produz Geleia de Wharton pura através da remoção seccional completa e eliminação dos componentes não WJ do cordão (como a membrana de revestimento do cordão umbilical/membrana amniótica, vasos e sangue), evita a extração de células de sangue do UC, células epiteliais ou endoteliais e células da estrutura vascular. Isto permite obter tecido da Geleia de Wharton puro (tecido da WJ). Devido à sua origem, este tecido da WJ específico é o tecido de WJ estromal. Exemplo 2A: Tratamento Enzimático

[00544]. Material e Métodos: O tecido de WJ obtido conforme descrito no Exemplo 1 foi utilizado para isolar células primárias derivadas de WJ dele, como segue: Uma mistura de tecido triturado/HBSS foi suspensa em Tampão de Digestão (veja a Tabela) em uma proporção de 100 mg de mistura de tecido triturado/HBSS por 1 mL de Tampão de Digestão (veja a Tabela abaixo) em um tubo cônico de 250 ml. O tampão de digestão compreende uma enzima adequada para liberar as MSCs do tecido isolado. TABELA: Formulação de 100 ml de Tampão de Digestão (todos os ingredientes estéreis) - 1 ml de hPL, por exemplo do Banco de Sangue da Policlínica, Modena, Itália (preparado a partir de uma composição compreendendo entre 3,8 x 10 8 plaquetas/ml e 1,2 x 109 plaquetas/ml, em média aproximadamente 7,9 x 108 plaquetas/ml) - Heparina a uma concentração final de 2 U/mL - 1 ml de piruvato de sódio (de um estoque de 100 mM). - 36 µl de 1M CaCl2 - Preparação de colagenase NB4 ou NB6 (ambas da SERVA) até uma atividade final de 0,18 Wünsch U/ml de Tampão de Digestão - Meio basal (meio de crescimento comercial para células de mamíferos, como DMEM ou MSCBM CD) - adicione 100 ml

[00545]. A preparação de colagenase da SERVA (NB4, NB6) foi utilizada, tipicamente NB4. De acordo com o fabricante, a preparação de colagenase NB4/NB6 é um produto natural de uma cepa de Clostridium histolyticum produtora de colagenase, e é uma preparação de colagenase que é não tóxica, que contém colagenase e outras proteases. De acordo com o fabricante, o NB4 de Grau Padrão (17454.02 e 17454.01 (ambos da SERVA)) foi desenvolvido para dissociação de diferentes tecidos para isolar vários tipos de células, por exemplo, condrócitos, células musculares, células epiteliais, fibroblastos cutâneos, hepatócitos, adipócitos que são utilizados para propósitos de pesquisa. De acordo com o fabricante, a preparação de colagenase NB4 também pode ser utilizada como alternativa de baixo custo à preparação de colagenase NB6 para propósitos de estabelecer procedimentos. De acordo com o fabricante, a preparação de colagenase NB6 de Grau BPF (NB6 de grau BPF, 17454.02 (SERVA) foi especialmente desenvolvida para o isolamento de células para alguns propósitos de transplantação específicos. Ao longo dos experimentos relatados na presente revelação, NB4 foi utilizada a menos que explicitamente especificado o contrário. De acordo com a SERVA, o fabricante da preparação da colagenase utilizada neste experimento, a SERVA indica a atividade da colagenase em unidades de PZ (PZ-U) de acordo com Wünsch (sinonimamente chamado de unidades Wünsch neste documento).

[00546]. Sabe-se que a heparina é um aditivo adequado para composições líquidas contendo lisado de plaquetas para evitar coagulação (por exemplo, Lohmann et al., 2012, PLoS ONE, vol. 7e37839).

[00547]. Tampões de Digestão com atividade da colagenase maior (concentração final superior a 0,18 Wünsch U/ml) também foram testados, inicialmente com base na atividade da colagenase que foi descrita anteriormente para digestão enzimática de tecido adiposo, mas a digestão na presença de maior atividade da colagenase não foi vantajosa (dados não mostrados).

[00548]. O tecido triturado (Exemplo 1) foi colocado em tubos estéreis. O tampão de digestão (veja acima) foi adicionado. Estes tubos contendo tecido triturado e Tampão de Digestão (digestão) foram incubados a 37±1°C por um intervalo de tempo de digestão de 3 horas com agitação suave constante a 75 rpm em um agitador orbital para digestão. “digestão” se refere a ao conjunto de tecido a ser digerido e tampão de digestão.

[00549]. No final do intervalo de tempo de digestão, a digestão foi diluída adicionando-se 2 volumes de MSCBM CD, suplementado com 1% (v/v) de lisado de plaquetas humanas (hPL) e passado através de duas camadas de uma atadura de gaze estéril para separação do tecido não digerido/tecido parcialmente digerido. O filtrado foi chamado de “mistura digerida”.

[00550]. A mistura digerida é centrifugada a 680 x g por 15 minutos utilizando 250 ml tubos de centrífuga. No final da centrifugação, o sobrenadante é removido e o grânulo (contendo células estromais mesenquimais frescamente isoladas da Geleia de Wharton do cordão umbilical) é ressuspenso em 1-2 mL de MSCBM CD/GA/hPL (veja o Exemplo 0).

[00551]. Subsequentemente, o número total de células é determinado. Mais tipicamente, as células compreendidas na mistura digerida não são todas MSCs: Exemplo 2B: Primeira cultura (P0 e opcionalmente P0+)

[00552]. As células ressuspensas que formam o Exemplo 2A são colocadas em placas em frascos de cultura T-225 (Falcon®, uma marca da Corning, Corning, NY, EUA) em MSCBM CD/GA com 5% de hPL (veja o Exemplo 0; 50 mL de meio por frasco T- 225) para iniciar a primeira cultura in vitro das células originárias da Geleia de Wharton estromal. Esta cultura celular é chamada de “P0”. O dia em que a P0 é iniciada é chamado de “Dia 0”, e os dias são contados com números ascendentes a partir de então. A densidade celular no início da P0 é de 8.000 células/cm2 ou mais. cm2 se refere à superfície do frasco que está na parte inferior e coberto por meio de crescimento enquanto as células estão sendo submetidas à cultura na P0.

[00553]. Alimente as células a cada 3 dias iniciando a partir do Dia 5 com MSCBM CD/GA/hPL fresco. Alternativamente, também pode ser possível cultivar as células durante a P0 em pilhas, ao invés de frascos: neste caso, 150 mL de MSCBM CD/GA/hPL são utilizados por pilha de 1 x 1 para iniciar a primeira cultura celular; no entanto, a menos que explicitamente mencionado de outra forma, a cultura na P0 é realizada em frascos de cultura T-225.

[00554]. As células são submetidas à cultura na P0 conforme descrito até que a confluência das células seja de 80 a 90%. Este é geralmente o caso depois de um período de 5-12 dias. Então, as células são tripsinizadas. As células são contadas após a tripsinização no final da passagem.

[00555]. Os critérios de aceitação a seguir são avaliados: 1 rendimento, 2 viabilidade, 3 confluência, 4 morfologia. A determinação dos critérios de aceitação 1 e 2 ocorre depois da tripsinização das células. Os detalhes são como segue:

Critério de Depois da P0 e P0+ Teste aceitação Contagem de células 1 Rendimento Pelo menos 8 milhões de células depois da tripsinização Coloração com 7- 2 Viabilidade Mais de 80% de células viáveis aminoactinomicina D (7- AAD) Pelo menos 80%, preferivelmente 80 a Determinação 3 Confluência 90% confluente microscópica Maioria de células pequenas, Determinação 4 Morfologia fusiformes e em colônias definidas microscópica

[00556]. Neste exemplo experimental, todos os quatro critérios de aceitação devem ser atendidos. Além disso, na inspeção morfológica, realiza-se uma inspeção visual adicional para verificar se o tamanho e o formato das células são relativamente uniformes. Preferivelmente, este é o caso.

[00557]. Caso qualquer um ou mais dos critérios 2, 3 ou 4 não sejam atendidos, toda a cultura celular é descartada. É a observação dos presentes inventores que os critérios 2, 3 e 4 sejam normalmente atendidos e que o descarte seja, dessa forma, desnecessário. No entanto, a possibilidade de descarte no caso de não atendimento garante que as passagens subsequentes só sejam realizadas se os critérios de aceitação forem atendidos.

[00558]. Caso o número total de células depois da P0 seja maior do que 8 milhões de células (desde que os critérios de aceitação 2, 3 e 4 também sejam atendidos), proceda diretamente com o Exemplo 2B.

[00559]. Caso o número total de células depois da P0 não seja superior a 8 milhões de células (desde que, no entanto, os critérios de aceitação 2, 3 e 4 sejam atendidos), uma etapa de subcultivo extra, chamada de "P0+" ou "P0 mais" é realizada. (Para evitar dúvida, ao longo deste documento, indica-se especificamente se determinadas células foram subcultivadas em uma etapa "P0+"; em outras palavras, onde nenhuma indicação específica for apresentada, as células são passadas da P0 diretamente para a P1 (Exemplo 2B)). As condições da P0 correspondem exatamente às condições da P0, descritas acima, exceto que as células ressuspensas submetidas à P0+ se originam da P0, não diretamente do Exemplo 2A.

[00560]. As células são submetidas à cultura na P0+ até que a confluência das células seja de 80 a 90%. Então, as células são tripsinizadas. Os critérios de aceitação acima são avaliados: 1 rendimento, 2 viabilidade, 3 confluência, 4 morfologia. Quando todos os critérios forem atendidos, prossiga com o Exemplo 2B. Quando um ou mais dos critérios não forem atendidos (incluindo o rendimento), descarte as células. Em particular, as células são descartadas se o número total de células após a P0+ não for de pelo menos 8 milhões de células. Os números totais de células neste exemplo são indicados com base em um cordão umbilical humano inteiro como material de partida (ciclo de escala completa). Se a quantidade de material de partida for diferente (por exemplo, apenas metade de um cordão umbilical humano), então, a quantidade total das células para o critério de aceitação 1 é ajustado aritmeticamente de forma adequada.

[00561]. Dependendo, entre outras coisas, do rendimento das células, que varia em algum grau entre diferentes ciclos de escala completa, também, em vista da variação do material biológico de diferentes indivíduos, as Duplicações cumulativas da População durante a P0 estão sujeitas a alguma variação. Exemplo 2C: Expansão Adicional (P1 e passagens subsequentes)

[00562]. As células tripsinizadas da P0 (ou P0+, mas somente caso seja explicitamente descrito desta forma) no Exemplo 2B, conforme descrito, foram obtidas e submetidas à subcultura por uma ou mais passagens, como segue.

[00563]. A primeira subcultura é chamada de “P1”. No final da P1, as células são tripsinizadas novamente e submetidas à subcultura. Este ciclo de subcultura/tripsinização é realizado preferivelmente por 4 passagens (P1 contando como sendo a “primeira passagem”), muito embora até 12 passagens tenham sido realizadas em alguns casos. Cada passagem é numerada consecutivamente, isto é, a P1 segue depois da P0, a P2 segue depois da P1, e assim por diante. A menos que especificado de outra forma, as células foram cultivadas e submetidas a subcultura até a passagem 4 (P4).

[00564]. Para cada passagem a partir de P1 em diante, todas as placas de cultura têm o mesmo tamanho definido. Em particular, para cada passagem, o vaso de cultura foi composto de uma pilha de placas de cultura CS5, CS10 ou CS20 (Corning, Corning, NY, EUA). Para cada passagem de P1 em diante, as células são cultivadas em MSCBM CD com 5% de hPL sem antibióticos (veja o Exemplo 0; 50 mL de MSCBM

CD/hPL por frasco T-225). A menos que declarado de outra forma, os antibióticos são descontinuados neste exemplo para todas as passagens depois da P0; em outras palavras, neste exemplo, o MSCBM-CD/hPL é utilizado sem adição de antibióticos para P1 e todas as passagens subsequentes.

[00565]. A densidade celular no início de cada passagem é de 2.500 células/cm2.

[00566]. Depois de cada passagem, as células são tripsinizadas. As células são contadas no final de cada passagem, depois da tripsinização.

[00567]. Como uma função da densidade celular na época da inoculação, a superfície de fundo do vaso de cultura celular (que juntamente define a contagem de células totais no início da passagem) e a contagem de células totais no final da passagem, as duplicações cumulativas da População podem ser aritmeticamente determinadas.

[00568]. Na experiência dos inventores, as Duplicações cumulativas da População durante a P1 e a P2 (total de P1 mais P2, mas não incluindo a P0), como uma regra muito geral, são normalmente na faixa de 9-13.

[00569]. Na experiência dos inventores, as Duplicações cumulativas da População durante a P3 e a P4 (total de P3 mais P4, mas não incluindo a P0, P1 e P2), como uma regra muito geral, são normalmente na faixa de 6-10. Consequentemente, as Duplicações cumulativas da População durante a P1, P2, P3 e P4 (total de P1 mais P2 mais P3 mais P4, mas não incluindo a P0), como uma regra muito geral, são normalmente na faixa de 15-23.

[00570]. Especificamente – onde especificamente indicado neste documento – as células foram congeladas depois de uma passagem específica, por exemplo, P2. As células podem ser congeladas, por exemplo, congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido, de acordo com procedimentos padrão. É bem possível descongelar tais células congeladas e, por exemplo, submetê-las a passagens de cultura adicionais depois do descongelamento. O congelamento pode ocorrer como um lote inteiro ou em alíquotas. O congelamento em alíquotas, preferivelmente em frascos, é muito preferido e foi tipicamente realizado neste exemplo, a menos que especificado de outra forma.

[00571]. Quando as células são congeladas e descongeladas depois de uma passagem específica, a numeração da passagem continua depois do descongelamento. Por exemplo, quando as células são congeladas depois da P2, a próxima passagem depois do descongelamento é, então P3. Preferivelmente, e a menos que indicado de outra forma, também, a contagem das Duplicações cumulativas da População continua depois do descongelamento.

[00572]. Em uma configuração preferida, as células são aliquotadas e congeladas depois da P2. As alíquotas congeladas obtidas desta forma estão disponíveis para descongelamento individualmente em um ponto de tempo desejado. As células congeladas, preferivelmente em alíquotas, podem ser chamadas de Banco de Células Primário (PCB). Em outras palavras, não é necessário – e tipicamente não desejado – descongelar todas as alíquotas do PCB no mesmo ponto de tempo. Ao contrário, a aliquotação e o congelamento individual das alíquotas apresenta a vantagem de que alíquotas individuais podem ser removidas do congelamento, descongeladas e submetidas a cultura adicional (subcultura, expansão adicional) em pontos de tempos individuais e individualmente desejados.

[00573]. Em um exemplo específico de um ciclo de escala completa, 168 frascos (cada um contendo 20 x 106 células, 4 ml de conteúdo) foram obtidos depois da P2, começando a partir de um cordão umbilical humano como material de partida. Cada um dos frascos pode ser congelado, e frascos individuais podem ser descongelados em pontos de tempo individuais para subcultura adicional, por exemplo, P3 e seguintes. Em um exemplo específico de um ciclo de escala completa, um frasco obtido e congelado depois da P2 é descongelado e as células contidas nele são submetidas a P3 e P4. Naquele exemplo específico, depois da P4, 168 frascos (cada um contendo 20 x 106 células, 4 ml de conteúdo) foram obtidos.

[00574]. As células são submetidas à cultura em cada passagem conforme descrito até que a confluência das células seja de 80 a 90%. Este é geralmente o caso depois de um período de aproximadamente 3-4 dias. Então, os critérios de aceitação a seguir são preferivelmente avaliados: 1 rendimento, 2 viabilidade, 3 confluência, 4 morfologia. A determinação dos critérios de aceitação 1 e 2 ocorre depois da tripsinização das células. Os detalhes são como segue:

Depois da P1 e todas as passagens Critério de aceitação Teste depois da P1 Depois da P1: pelo menos 225 x 106 células Rendimento Depois da P2: pelo menos 7 x 109 (ciclo de células (*) Contagem de células 1 escala Depois da P3: pelo menos 250 x depois da tripsinização completa) 106 células (*) Depois da P4: pelo menos 7 x 109 células (*) Coloração com 7- 2 Viabilidade Mais de 80% de células viáveis aminoactinomicina D (7- AAD) Pelo menos 80%, preferivelmente Determinação 3 Confluência 80 a 90% confluente microscópica Maioria de células pequenas, Determinação 4 Morfologia fusiformes e em colônias definidas microscópica

[00575]. (*) Depois da P2 as células podem ser congeladas em alíquotas para preparar um Banco de Células Primário (PCB). Os números de células para P3 e P4 são indicados com base no cenário de que a P3 é iniciada com um frasco do PCB, que contém 20 x 106 células.

[00576]. É importante observar que os rendimentos obtidos por expansão de acordo com a presente invenção são muito altos em comparação com os métodos conhecidos anteriormente para o preparo e expansão de células-tronco mesenquimais.

[00577]. Neste exemplo, experimental, todos os quatro critérios de aceitação devem ser atendidos: se um dos critérios não for atendido, toda a cultura celular da respectiva passagem é descartada. É a observação dos presentes inventores que todos os critérios 1, 2, 3 e 4 sejam normalmente atendidos e que o descarte seja, dessa forma, desnecessário. No entanto, a possibilidade de descarte no caso de não atendimento garante que as passagens subsequentes só sejam realizadas se os critérios de aceitação forem atendidos.

[00578]. Em resumo, o Exemplo 2 mostra que a Geleia de Wharton estromal retém células em um estado competente de expansão. As células da Geleia de Wharton estromal foram identificadas como sendo uma fonte conveniente de células estromais potencialmente multipotente que podem ser mantidas e expandidas em cultura. Exemplos Comparativos

[00579]. Para propósitos de comparação, as células foram isoladas conforme descrito na publicação WO 2004/072273 A e Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229, especificamente conforme descrito nos Exemplos Comparativos 1, 2A, 2B e 2C a seguir. Exemplo Comparativo 1

[00580]. Os vasos foram isolados do cordão umbilical humano. Os vasos dissecados foram suturados para criar uma alça, bloqueando a passagem de fluído para dentro e para fora do vaso. Exemplo Comparativo 2A

[00581]. A alça (Exemplo Comparativo 1) foi imediatamente colocado em um tubo de 50 mL contendo 1 mg/mL de solução de colagenase Sigma C-0130 em PBS (sem Mg2+ e Ca2+) a 37°C. De acordo com a literatura, a colagenase Sigma C-0130 apresenta uma atividade específica de 0,25-1,0 FALGPA unidades/mg sólida. Para propósito de informação, as unidades FALGPA não são diretamente aritmeticamente conversíveis para Wünsch porque as respectivas unidades se referem a ensaios diferentes com substratos diferentes; no entanto, existe alguma experiência geral na técnica sobre como as unidades Wünsch são relacionadas com as unidades FLGPA. Com base naquela experiência geral, pode-se concluir que a atividade total da colagenase utilizada no Exemplo Comparativo 2 é muito maior do que a atividade total da colagenase utilizada no Exemplo 2.

[00582]. Depois de 18-20 horas de incubação com colagenase, a solução de digestão foi interrompida adicionando-se 2 volumes de PBS e 1 mL de Soro Fetal Bovino (FBS). Dessa forma, a duração total do tratamento com colagenase no Exemplo Comparativo 2 é muito mais longa do que a duração total do tratamento com colagenase utilizado no Exemplo 2. As amostras digeridas foram filtradas para remover tecido não digerido e centrifugadas a 1.800 rpm (Beckham Coulter Allegra™ 25R) por 15 minutos. As células foram ressuspensas em 75% de meio -MEM, 15% de FBS definido, 10% de antibióticos. Para lisar as células sanguíneas, uma solução de cloreto de amônio (NH4Cl), bicarbonato de potássio (KHCO3) e EDTA foi utilizada em uma proporção de 1:3 v/v com a suspensão celular por 5-10 minutos em gelo com agitação suave. Depois de centrifugação a 500 x g por 10 minutos, as células foram ressuspensas e contadas com corante Trypan Blue (0,4%). Exemplo Comparativo 2B

[00583]. As células derivadas da Geleia de Wharton perivascular (PVWJ) obtidas conforme descrito no Exemplo Comparativo 2A foram semeadas com densidade de 6.000-8.000 células/cm2 e incubadas a 37°C em -MEM (sem nucleosídeos, Life Technologies, Waltham, MA, EUA, no 22561-021) suplementado com 15% de FBS definido (HyClone, GE Healthcare, EUA, no SH30070.03) e antibióticos em uma incubadora de 5% de CO2, 95% de umidade para iniciar a cultura "P0".

[00584]. Os meios foram trocados pela primeira vez depois de 5-6 dias, então, foram renovados a cada 2 dias. Depois de 6-10 dias de cultura, as células alcançaram a confluência. No final da P0, depois de um período de 6-10 dias, as células alcançaram a confluência. Elas foram, então, tripsinizadas. O número total de células foi determinado com corante Trypan Blue (0,4%). Exemplo Comparativo 2C

[00585]. As células tripsinizadas obtidas do Exemplo Comparativo 1B foram obtidas e submetidas à subcultura, como segue. A partir da passagem de cultura 1 ("P1") em diante, as células foram semeadas a uma densidade de 3.500-4.000 células/cm2 em -MEM com 15% de FBS definido. Os antibióticos devem ser descontinuados depois da P0; em outras palavras, o meio de crescimento é utilizado sem adição de antibióticos. As células são chamadas de células derivadas da Geleia de Wharton perivascular ("PVWJ"). As células estromais mesenquimais derivadas da Geleia de Wharton perivascular (PVWJ) também podem ser chamadas de “células estromais mesenquimais derivadas da zona perivascular”.

[00586]. A menos que especificado de outra forma, as células foram cultivadas e submetidas a subcultura até a passagem 4 (P4).

[00587]. pcionalmente – mas somente onde especificamente indicado – as células foram congeladas depois de uma passagem específica, por exemplo, P2. É bem possível descongelar estas células congeladas para, por exemplo, submetê-las a passagens de cultura adicionais depois do descongelamento. Exemplo 3: Análise das células depois da digestão

[00588]. As células obtidas conforme descrito no Exemplo 2A (isto é, depois da etapa de digestão, com ou sem lisados de plaquetas (PL)) são chamadas de células derivadas de Geleia de Wharton estromal ou "SWJ". Elas são comparadas às células de controle derivadas de PVWJ (“PVWJ”, Exemplo Comparativo 2A). SWJ e PVWJ foram coradas com corante 7-Aminoactinomicina-D (7AAD) (Via Probe; BD Biosciences; utilizado de acordo com as instruções do fabricante) para detectar apoptose por análise de FACS. Uma amostra não corada foi adquirida para detectar a autofluorescência da amostra e ajustar os tubos fotomultiplicadores (PMT; sensores para FACS) para todos os canais considerados. Configurações de compensação foram estabelecidas adquirindo tubos corados com cor única. Os dados coletados foram analisados com o software Diva (BD Biosciences). Estatística por teste t. Os resultados são mostrados na Figura 4A.

[00589]. A análise de FACS de amostras isoladas frescamente revelou que, para ambos os protocolos de digestão baseados na preparação de colagenase NB4 (com e sem lisado de plaquetas (PL), veja a Figura 4A), os inventores detectaram uma viabilidade maior do que 97% da população celular total. Em particular, depois da digestão baseada na preparação de colagenase NB4 sem PL (digestão por 3 horas), eles observaram uma taxa de apoptose de 1,5%±1,3%, e depois da digestão baseada na preparação de colagenase NB4 com 1% de PL (digestão por 3 horas), as células apoptóticas foram apenas 1,45% ± 0,3% das células isoladas totais. No entanto, 30,6% ± 9,6% da PVWJ total isolada de acordo com o Exemplo Comparativo 1 foram positivas para 7AAD (Figura 4A, barra sombreada maior à direita). Assim, pode-se mostrar que as amostras tratadas com preparação de colagenase NB4 (SERVA) por 3 horas foram mais viáveis do que as células isoladas conforme descrito no Exemplo Comparativo 1. Isto sugere que o protocolo de acordo com o Exemplo Comparativo 1 é mais prejudicial para as células do que o protocolo de acordo com a presente invenção; isto é, embora o protocolo de acordo com o Exemplo Comparativo 1 leve ao isolamento de mais células, uma fração maior delas é apoptótica. Células apoptóticas não são adequadas para expansão.

[00590]. Além disso, comparando o uso de lisado de plaquetas (sim/não) e não observando uma diferença significativa com relação ao percentual de células positivas para AAD7 (Figura 4A), os inventores puderam mostrar que o lisado de plaquetas não influencia negativamente a atividade da colagenase, na liberação de células e em sua viabilidade. Surpreendentemente, a presença de lisado de plaquetas

(normalmente compreendendo plasma) não teve efeito negativo sobre a digestão, ou mais particularmente sobre o rendimento das células, muito embora tivesse sido relatado anteriormente que o lisado de plaquetas afeta negativamente a atividade de determinadas enzimas, incluindo as proteases (Chesney et al., J. Clin. Invest., 1974, vol. 53, p. 1647-1654). Exemplo 4A: Análise das propriedades físicas de células derivadas de SWJ isoladas de acordo com a presente invenção em comparação com células derivadas de

PVWJ

[00591]. Em seguida, os inventores visaram avaliar o número total de células e as propriedades físicas de células derivadas de SWJ isoladas de acordo com a presente invenção (Exemplo 1 e Exemplo 2A) versus as células derivadas de PVWJ do protocolo de acordo com o Exemplo Comparativo 1 e o Exemplo Comparativo 2A). Este estudo comparativo foi baseado na avaliação da eficiência da colagenase e dos parâmetros físicos (por FACS) das respectivas células isoladas frescamente.

[00592]. Primeiro, com relação ao número total de células frescamente isoladas, os inventores obtiveram mais células derivadas de PVWJ pelo método de acordo com o Exemplo Comparativo 1 do que células derivadas de SWJ obtidas pelo método de acordo com a presente invenção conforme descrito no Exemplo 1.

[00593]. Segundo a análise de parâmetros físicos por citometria de fluxo, a saber, dispersão frontal da luz (FSC) e dispersão lateral da luz (SSC), revelou que as células derivadas de SWJ apresentam FSC e SSC menores em comparação com as células derivadas de PVWJ isoladas pelo método de acordo com o Exemplo Comparativo

1. Os resultados são indicados na tabela a seguir e visualizados na Figura 5A. Tabela: SSC e FSC determinadas experimentalmente Célula FSC SSC Média de seis Células derivadas de PVWJ de 75,42166667 64,65666667 amostras acordo com o Exemplo ST-DEV 18,66791951 15,1647779 Comparativo 2A SEM 7,75 6,19 Células derivadas de SWJ de Média de quatro 46,1925 50,795 acordo com o Exemplo amostras Comparativo 2A ST-DEV 9,660766986 21,28367273

Célula FSC SSC SEM 5,58 12,29 Teste t 0,025231608 0,296671217

[00594]. Em média, as células derivadas de SWJ apresentam um volume celular menor (determinado por FSC) com uma complexidade interna menor (determinada por SSC) do que as células derivadas de PVWJ. A diferença na FSC é estatisticamente significativa. Em particular, as células derivadas de SWJ (de acordo com a presente invenção, n=4) apresentam FSC e SSC menores em comparação com as células derivadas de PVWJ isoladas pelo método de acordo com os Exemplos Comparativos 1 e 2A (PVWJ, n=6). Esta leitura da citrometria de fluxo indica que as células derivadas de SWJ isoladas pelo método de acordo com a presente invenção são caracterizadas por células pequenas mais homogêneas com baixa complexidade citoplasmática, ao passo que as células derivadas de PVWJ são caracterizadas por uma população heterogênea com maior volume médio e maior complexidade citoplasmática. Homogêneas neste contexto significa que substancialmente todas as células são muito semelhantes ou similares. Volume menor e menor complexidade interna são características que indicam similaridade com a célula-tronco e desempenho (veja, por exemplo, Wagner et al., 2008, PLoS One, 2008, 3: e2213). Em geral, células com uma estrutura interna mais complexa parecem mais reluzentes/brilhantes na análise de dispersão lateral, devido às estruturas internas. Exemplo 4B: Fenótipo morfológico de células isoladas frescamente: as células PVWJ são diferentes das células isoladas de acordo com a presente invenção

[00595]. A morfologia das células SWJ e das células PVWJ foi comparada. Para garantir um elevado grau de comparabilidade, um único cordão foi dividido em duas partes: uma parte foi preparada com o método descrito nos Exemplos 1, 2A e 2B, a outra parte foi preparada de acordo com os Exemplos Comparativos 1, 2A e 2B, em ambos os casos, no entanto, as células foram analisadas especificamente dois ou três dias após a semeadura da passagem de cultura 1 (P1), (magnificação original 100X).

[00596]. Os inventores desvendaram que as células derivadas da Geleia de Wharton estromal pura de acordo com a presente invenção (SWJ) são homogêneas, pequenas e fusiformes (Figura 5B, esquerda), enquanto das células da Geleia de Wharton perivascular (PVWJ) são grandes e apresentam um citoesqueleto proeminente (Figura 5B, direita). As células estromais mesenquimais derivadas da Geleia de Wharton perivascular (PVWJ) também podem ser chamadas de “células estromais mesenquimais derivadas da zona perivascular”. Exemplo 4C: Formação de colônia de células isoladas frescamente: as células PVWJ são diferentes das células isoladas de acordo com a presente invenção

[00597]. Em seguida, o potencial de formação de colônia das células de acordo com a presente invenção foi investigado. Isto foi realizado como segue: a SWJ foi obtida conforme descrito nos Exemplos 1 e 2A, a PVWJ foi obtida conforme descrito no Exemplo Comparativo 1. Então, utilizando um funil estéril, o extrato contendo células é filtrado através de duas camadas de uma atadura de gaze estéril para remover o tecido não digerido. Centrifugue a 680 x g por 15 minutos utilizando 250 ml tubos de centrífuga. Descarte o sobrenadante (despeje ou aspire utilizando baixo vácuo). Ressupenda o grânulo em 1-2 mL de MSCBM CD/GA/hPL (veja o Exemplo 0). Coloque as células ressuspensas em placa em 3 x frascos T-225 ou 1 x 1-Pilha em meio MSCBM CD/GA/hPL (veja o Exemplo 0; 50 mL de meio por frasco T-225 ou 150 mL por 1 x 1 pilha) para iniciar a cultura P0. Não movimente a cultura da P0 nos primeiros 5 dias depois da semeadura. Mude o meio depois de 5 dias. Alimente a cada 3 dias a partir de então com MSCBM CD/GA/hPL. Colete as células da P0 no dia 12 com 3 U/mL de tripsina e neutralize com MSCBM + 1% de hPL. Os resultados são mostrados na Figura 5C. Estes achados demonstram que o protocolo de isolamento celular de acordo com a presente invenção gera uma população celular mais homogênea capaz de gerar colônias mais compactas depois da semeadura inicial (Passagem 0). Exemplo 5: Comparação de células derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção vs. células derivadas da medula óssea (BM).

[00598]. As MSCs derivadas da medula óssea (BM-MSC, obtidas conforme descrito por Grisendi et al., Cytotherapy, 2010, vol., 12, p. 466-477, foram semeadas na densidade de 6.000 células/cm2. As células derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção (Exemplos 1, 2A, 2B e 2C, especificamente submetidas à cultura até a passagem 5 (P5), foram semeadas na densidade de 2.800 células/cm2. Depois de 2- 3 dias de cultura elas foram subconfluentes, e cinco imagens representativas foram adquiridas para ambos os tipos de células. Em particular, as MSCs aderentes ao plástico foram visualizadas com um microscópio Axioskop-Observer-1 (Zeiss) utilizando uma objetiva de 10x, equipado com uma câmera Axiocam. As imagens foram adquiridas e processadas pelo software AxioVision 4.8.2 para avaliar a área celular. (Moore et al.,

Exp. Eye Res. 2013, vol. 115, p. 178-188; Zeilbeck et al., PLoS One., 2014; vol. 9(4), e95546).

[00599]. Os resultados são mostrados na Figura 6. Descobriu-se que as células derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção apresentam área superficial média menor do que as MSCs extraídas da BM. Exemplo 6: Marcadores de superfície celular de células isoladas frescamente

[00600]. Materiais e Métodos: Três cordões umbilicais foram submetidos a dois diferentes métodos (estado da técnica de acordo com os Exemplos Comparativos 1 e 2A, "PVWJ" vs. células de acordo com a presente invenção, veja os Exemplos 1 e 2A, "SWJ").

[00601]. Imediatamente após o isolamento, as células derivadas de PVWJ/SWJ foram contadas e ressuspensas em 1 mL de PBS 1X em tubos de polipropileno para análise de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (200.000 células/tubo). As células foram incubadas em 100 µL de tampão de bloqueio contendo meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% de soro fetal bovino (FBS), 0,1 M de azida de sódio e 66,6 mg/mL de imunoglobulina humana G por 20 minutos em gelo. Subsequentemente, elas foram lavadas em 1 ml de 1 x PBS e centrifugadas a 300 g por 5 minutos.

[00602]. As amostras foram subsequentemente coradas por 30 min. em gelo com anticorpos primários em 90 µL de PBS com 0,5% de albumina sérica bovina (BSA; Sigma) e analisadas com o citômetro de fluxo FACSAria III (BD Biosciences) equipado com dois laseres refrigerados a ar com comprimentos de onda de 488 e 633 nm. Para coloração indireta (somente para anti-GD2), um anticorpo secundário conjugado com Aloficocianina (APC) anti-camundongo em rato (BD Pharmingen) foi utilizado. Coloração com 7-Aminoactinomicina-D (7AAD) (ViaProbe; BD Biosciences; utilizada de acordo com as instruções do fabricante) foi avaliada por citometria de fluxo para detectar apoptose. Uma amostra não corada foi adquirida para detectar a autofluorescência da amostra e configurada para PMT para todos os canais considerados; a diafonia fluorescente é controlada pelo ajuste da compensação. Configurações de compensação foram estabelecidas adquirindo tubos corados com cor única. Os dados coletados foram analisados com o software Diva (BD Biosciences).

[00603]. Resultados: A análise imunofenotípica de amostras isoladas frescamente revelou que, para ambos os métodos de isolamento, os inventores identificaram CD105, CD73 e CD90, que são a expressão típica do antígeno de superfície das MSCs. Semelhantemente, o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas β (CD140b) foi detectado depois de ambos os métodos de isolamento. O HLA- DR não foi detectado em ambas as amostras, no entanto, descobriu-se que as células derivadas de PVWJ expressam 3G5, enquanto que as células derivadas de SWJ não, indicando que o método de acordo com a presente invenção não leva ao isolamento de células perivasculares, de acordo com a origem das células na Geleia de Wharton estromal. A manifestação relativa de alguns marcadores de superfície é mostrada na Figura 7 A, painel esquerdo. Na Figura 7A, painel direito, alguns marcadores de superfície são indicados que são expressos/não expressos na maioria das células.

[00604]. Os marcadores de superfície celular também foram analisados depois da cultura prolongada das células. As culturas celulares originárias de dois isolamentos independentes e em diferentes duplicações cumulativas da população foram analisadas. Descobriu-se o seguinte: Não existem diferenças significativas na manifestação de CD105, CD90 e CD73 (marcadores positivos de MSCs) entre diferentes isolamentos de células. CD105, CD90 e CD73 também são uniformemente elevados em diferentes Duplicações cumulativas da População (cPD). Ao contrário, CD45, CD14, CD34, CD19 e HLA-DR (conhecidos por serem marcadores negativos de MSCs) são expressos em níveis muito baixos nas células de ambos os isolamentos e em diferentes Duplicações cumulativas da População (veja a Tabela a seguir). Tabela: caracterização fenotípica por citometria de fluxo (% de células positivas). cPD = Duplicações cumulativas da População CD45 CD73 HL-DR CD14 CD34 CD90 CD105 CD19 Lote 1 depois 3,8 98,9 -0,6 0,0 1,1 99,2 99,1 -0,5 de 8 cPDs Lote 1 depois 4,1 99,1 -0,7 -0,2 1,7 99,2 99,1 -0,8 de 16 cPDs Lote 2 depois 1,4 99,2 -0,3 0,1 2,6 99,2 99,1 -0,2 de 8 cPDs Lote 2 depois 0,8 99,1 -0,2 0,7 4,2 99,1 99,10 -0,1 de 16 cPDs

[00605]. Estes dados mostram que as condições de expansão de células derivadas de WJ estromal no método de acordo com a presente invenção são capazes de gerar populações de células derivadas de WJ estromal puras com alto rendimento com um fenótipo estável durante diversas Duplicações cumulativas da População. Portanto, as células da invenção são adequadas para a criação de um Banco de Células. Exemplo 7: Marcadores de superfície celular em células expandidas

[00606]. Materiais e Métodos: A fim de caracterizar antígenos de superfície em células derivadas de PVWJ e células derivadas de SWJ, um arranjo de FACS foi realizado a partir de células contidas em um Banco de Células, preparado a partir do mesmo cordão umbilical de acordo com diferentes métodos (Exemplos 1 e 2A, 2B e 2C vs. Exemplos Comparativos 1 e 2A, 2B e 2C). As células foram descongeladas na P2 (Exemplo 2C/Exemplo Comparativo 2C) e expandidas até a P4 (Exemplo 2C/Exemplo Comparativo 2C) para realizar análises de FACS. Depois da separação com uma solução de separação celular de enzimas proteolíticas e colagenolíticas (Accutase, Thermo Fisher) as células foram centrifugadas a 500 x g por 10 minutos. Os grânulos foram ressuspensos em meios de cultura (MSCBM CD/hPL para SWJ ou -MEM com 15% de FBS definido para PVWJ) e contados por corante Trypan Blue 0,4%. As células foram lavadas em 1 X PBS e centrifugadas a 300 X g por 5 minutos. As células foram ressuspensas em Tampão de Coloração BD Pharmingen + EDTA e 250.000 células/poço são colocadas em placas de 96 poços. A triagem por citometria de fluxo foi realizada de acordo com a ficha de dados do Painel de Marcadores de Superfície Celular Humana (BD Lyoplate™, BD Biosciences) de acordo com as instruções do Fabricante. Os resultados são mostrados na Figura 7B.

[00607]. Testou-se mais especificamente se as células frescamente isoladas de acordo com a presente invenção (Exemplos 1, 2A) expressam CD46, CD55, e CD59. Conforme mostra a Figura 7B, tanto as células VPWL quanto as células SWJ expressam estes reguladores do complemento de superfície. Isto está em linha com descrições anteriores, por exemplo, por Ignatius et al., J. Cell. Biochem., 2011, vol. 112, p. 2594-2605 e Schraufstatter et al., World J. Stem Cells, 2015, vol. 7, p.1090-1108, que haviam mostrado que as MSCs derivadas da medula óssea expressam os reguladores do complemento da superfície celular, e acredita-se que as MSCs desenvolvidas para suprarregular CD46, CD55, e CD59 se protejam da lise celular mediada pelo complemento in vitro e in vivo. A Figura 7B confirma que as células da presente invenção compartilham este fenótipo de expressão particular.

Exemplo 8: Expressão genética de células de acordo com a presente invenção conforme determinado por PCR com Transcriptase Reversa quantitativa (qRT-PCR).

[00608]. Materiais e Métodos: As células obtidas de acordo com a presente invenção (Exemplo 2C), em particular: depois da passagem 4, foram utilizadas para esta análise. O RNA celular total foi isolado utilizando um método de etapa única com TRIzol (Life Technologies) de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA complementar de primeira fita foi sintetizado a partir de 1 µg de RNA total utilizando um kit revertAID H minus de síntese de cDNA de primeira fita (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. O cDNA de fita única foi quantificado por espectrofotômetro (Beckman Coulter DU® 730) a fim de utilizar 10 ng de cDNA em cada poço de PCR em Tempo Real.

[00609]. A técnica de PCR em tempo real quantitativa foi realizada pelo Sistema de PCR em Tempo Real Applied Biosystems StepOne™ e o reagente Fast SYBR® Green Master Mix. A quantificação da expressão genética de cada gene-alvo e gene de referência foi realizada em tubos separados. Iniciadores diretos e reversos foram desenvolvidos utilizando IDT PrimerQuest® (disponível online em http://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/lndex), garantindo que eles abranjam uma sequência de íntrons para ser específica para mRNA ao invés de DNA genômico. O nível de expressão relativo do gene-alvo foi normalizado para o nível de expressão do gene de referência endógeno β-actina.

[00610]. Os resultados são mostrados na Figura 8. A Figura 8 mostra que, por exemplo, APCDD1, PPARG e FLVCR2, são expressos em células derivadas de SWJ. A expressão é consistente entre diferentes populações celulares derivadas de SWJ preparadas de acordo com a presente invenção. Este padrão de expressão compartilhado indica a consistência das células da presente invenção do ponto de vista da expressão genética.

[00611]. No entanto, marcantemente, o padrão de expressão destes genes difere marcantemente das células derivadas de PVWJ isoladas de acordo com o estado da técnica. Em particular, o APCDD1 não é expresso em todas as células derivadas de PVWJ. Pode-se concluir isto a partir do achado de que nenhuma amplificação do gene APCDD1 foi observado em todas as amostras das células derivadas de PVWJ. Os inventores concluem que a expressão de APCDD1 por PCR em Tempo Real é detectável somente em células derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção, mas não detectáveis em células derivadas de PVWJ. A expressão de APCDD1, dessa forma, distingue claramente as células da presente invenção das células derivadas de PVWJ.

[00612]. Embora a literatura anterior tenha sido incerta sobre se as MSCs não perivasculares são ou não distintas das MSCs perivasculares (por exemplo, Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630), este exemplo agora apresenta evidência de que as células derivadas de Geleia de Wharton estromal obtidas de acordo com a presente invenção são distintas de MSCs perivasculares. Exemplo 9: Potencial proliferativo das células de acordo com a presente invenção vs. células de referência

[00613]. Materiais e Métodos: Cultura Celular: As células derivadas de Geleia de Wharton estromal (SWJ) de acordo com a presente invenção, obtidas conforme descrito nos Exemplos 1, 2A, 2B e 2C depois da P1, ou células derivadas de Geleia de Wharton perivascular (PVWJ), obtidas de acordo com os Exemplos Comparativos 1, 2A, 2B e 2C, ambas as populações celulares obtidas do mesmo cordão umbilical, foram semeadas em MSCBM CD com 5% de hPL (veja o Exemplo 0) sem fatores de crescimento e colocadas em uma incubadora a 37°C, 5% de CO2 com 95% de umidade. Três dias depois da colocação em placa, e a cada 3 dias a partir de então, as culturas foram realimentadas. No dia 4 ou 5 de cada passagem, as células foram tripsinizadas e contadas.

[00614]. Contagem Celular: as células foram contadas utilizando corante Trypan Blue 0,4% em uma câmara de Burker e a duplicação cumulativa da população (CPD) foi calculada conforme descrito acima.

[00615]. Os resultados são mostrados na Figura 9. Um número maior de Duplicações da População (PD) por passagem é observado nas células derivadas de SWJ do que em células derivadas de PVWJ (Figura 9A). Assim, a PD em células derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção é mais rápida do que em células derivadas de PVWJ. Um aumento estatisticamente significativo na duplicação da população foi medido em células derivadas de SWJ nas passagens 2, 3 e 4 em comparação com as células derivadas de PVWJ (por teste t).

[00616]. As células derivadas de SWJ apresentam um potencial proliferativo elevado, que é mantido por pelo menos 9 passagens nas condições de cultura utilizadas (meio de crescimento MSCBM CD com 5% de hPL). Sob estas condições de cultura, conforme determinado experimentalmente com dois isolados independentes de células derivadas de SWJ, as células derivadas de SWJ alcançarão a senescência entre a passagem 10 e a passagem 12, conforme mostrado na Tabela a seguir. Tabela: crescimento de SVWJ de acordo com a invenção Passagem Isolamento 1 Isolamento 2 1 5,89 4,99 2 5,00 5,47 3 5,04 4,76 4 5-02 4,24 5 4,58 5,03 Duplicações da 6 4,95 5,30 População por 7 5,40 4,69 passagem 8 5,22 4,63 9 4,92 4,54 10 4,83 1,81 11 4,58 n/a 12 3,27 n/a Duplicações Total 58,70 45,44 Cumulativas da População

[00617]. Este exemplo acrescenta evidência adicional de que as condições de isolamento e expansão de células derivadas de Geleia de Wharton estromal (células derivadas de SWJ) de acordo com a presente invenção permite gerar grandes populações celulares de células derivadas de SWJ. Este Exemplo também adiciona evidência de que as células derivadas de SWJ são diferentes das derivadas de PVWJ e têm um potencial proliferativo maior.

[00618]. O elevado potencial proliferativo e duplicação da população (PD) por passagem aumenta o rendimento do banco de células e/ou reduz o tempo para produção de um banco de células, respectivamente, em comparação com as MSCs de referência, como as células derivadas de PVWJ. Isto é vantajoso a partir de um ponto de vista industrial Exemplo 10: Atividade da Telomerase

[00619]. Para este ensaio, 200.000-500.000 células estromais derivadas de Geleia de Wharton (SWJ) de acordo com a presente invenção foram aliquotadas em um tubo Eppendorf de 1 mL e, então, centrifugadas a 1.200 rpm (Beckham Coulter Allegra ™ 25R) por 10 minutos a +4°C. O sobrenadante foi removido e as células foram ressuspensas em 1X PBS. Depois de uma segunda etapa de centrifugação, os grânulos secos foram armazenados a -80°C. Para realizar o ensaio, o kit TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS (Roche Diagnostics) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados são mostrados na Figura 10. As amostras analisadas mostraram uma média de 2,4±1,7% de atividade da telomerase em relação ao controle positivo fornecido com o kit (considerado como 100%). Isto confirma que a capacidade de proliferação maior de células derivadas de SWJ não está correlacionada com uma atividade da telomerase anormalmente elevada. Exemplo 11: Senescência

[00620]. Material e Métodos: Células estromais derivadas de Geleia de Wharton (SWJ) de acordo com a presente invenção após tripsinização (para conhecer a origem das células, veja os Exemplos 1 e 2A; para conhecer as passagens, veja os Exemplos 2B e 2C) depois da passagem 6 (P6), passagem 8 (P8) ou passagem 11 (P11), passagem 12 (P12), foram semeadas em seis placas multipoços a uma densidade de 3.000 células/cm2 em 3 ml de meios de cultura (DMEM com 5% de hPL ou MSCBM CD com 5% de hPL) e submetidas a cultura por 4-5 dias a 37°C em incubadora com 5% de CO2, 95% de umidade, em triplicatas a menos que especificado de outra forma. Então, as células foram lavadas em 1X de solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixadas por 10 minutos em temperatura ambiente em 2% de formaldeído/0,2% de gluturaldeído. A placa de cultura foi enxaguada duas vezes em PBS 1X e 1 mL de solução corante β-Gal fresca (1 mg de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-βD- galactosídeo/100 µL de dimetilformamida, 40 mM de ácido cítrico/fosfato de sódio, pH 6,0, 5 mM de ferrocianeto de potássio, 5 mM de ferricianeto de potássio, 150 mM de NaCl, e 2 mM de MgCl2) foi adicionado (utilizado de acordo com as instruções do fabricante). As células foram incubadas durante a noite a 37°C e a cor foi desenvolvida com a luz de um microscópio invertido conforme descrito nas instruções fornecidas pelo fabricante (Cell Signaling Technology). As células coradas positivas pareceram azuis- verdes no citoplasma. As mostras foram lavadas em PBS 1X e visualizadas com uma objetiva 2,5X utilizando um microscópio invertido (Zeiss). As células coradas positivas (por campo) foram quantificadas por um observador e pelo menos 8 campos de visualização foram examinados para cada doador (a menos que especificado de outra forma).

[00621]. Resultados: Nas passagens de cultura iniciais (P6-P8) somente poucas células estavam fracamente positivas para coloração com â-galactosidase (dados não mostrados), indicando que, mesmo com densidade de semeadura muito baixa, as células derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção apresentam uma tendência a serem marginalmente senescentes. Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria, é possível que o lisado de plaquetas compreenda suplementos que são vantajosos para crescimento das células ex vivo, por exemplo, fatores de crescimento. Exemplo 12: Potencial de diferenciação osteogênica

[00622]. Descrição do Método: A SWJ na passagem 5 (Exemplo 2C) foi induzida para diferenciar na linhagem osteogênica. Em resumo, a SWJ foi semeada na densidade de 10.000 células/cm2 em MSCBM CD com 5% de hPL em 6 placas multipoços (6-MW). Estas placas 6-MW foram pré-revestidas com 0,1% de solução de gelatina. Depois de 3-4 dias de equilíbrio, o meio de manutenção foi trocado e substituído por meio osteogênico. O meio osteogênico era composto de MSCBM CD com 5% de hPL, suplementado com 10 mM de beta-glicerofosfato, 0,1 mM de acido ascórbico-2-fosfato e 10 nM de Dexametasona, mais 100 ng/mL de rhBMP-2 adicionais (proteína óssea morfogenética 2) a partir do 7o dia de indução em diante. A confirmação da diferenciação osteogênica foi realizada através de corante von Kossa (de forma que a matriz óssea é marcada escura) em combinação com análise de qPCR em Tempo Real (descrita abaixo).

[00623]. Depois de 2 semanas, as culturas em meio osteogênico (conforme acima) e culturas de controle paralelas (cultivadas em paralelo em MSCBM CD mais 5% de hPL, isto é, um meio que não induz osteogênese) foram fixadas e coradas para identificar os depósitos de cálcio orgânico. Para o corante von Kossa, as amostras foram fixadas em metanol gelado por 2 min., então, enxaguadas duas vezes em água destilada, e incubadas sob luz ultravioleta (UV) com nitrato de prato em água por 30 min. Depois de duas lavagens adicionais em água destilada, 10 campos de alta potência foram observados utilizando magnificação 10X (microscópio invertido Axioskop-Observer-1; Zeiss). Imagens registradas digitalmente foram analisadas pelo software ImageJ (Instituto Nacional de Saúde, EUA) seletivamente quantificando as áreas coradas positivamente escuras de depósitos de cálcio orgânico. Os experimentos foram realizados em triplicatas.

[00624]. Resultados: Os resultados são mostrados na Figura 12. Conforme mostrado, depois de 14 dias de tratamento com meio osteogênico, a morfologia de amostras de controle foi diferente das amostras induzidas com meio osteogênico, e a coloração Von Kossa de fosfato de cálcio apresentou uma coloração preta positiva (Figura 12A). A diferença entre as áreas positivamente coradas nas amostras de controle e induzidas foi estatisticamente significativa (por teste t) (Figura 12B). Para confirmar adicionalmente a assinatura osteogênica, análises moleculares foram realizadas por PCR em Tempo Real (Figura 12C). O nível de expressão relativo do gene biomarcador osteogênico foi normalizado para aquele do gene de referência endógeno beta actina. O mRNA da fold induction foi calculado com base na condição de cultura padrão para SWJ (MSCBM CD mais 5% de hPL), definido como células não induzidas e subconfluentes. Todos os genes testados foram significativamente suprarregulados com relação à condição de cultura padrão (p≤0,05, por teste t). Os inventores observaram que a fosfatase alcalina (ALPL) em determinadas proteínas de matriz, como biglicano (BGN), colágeno (COL1A1), decorina (DCN) e elastina (ELN) foram os biomarcadores mais suprarregulados. Uma combinação destes marcadores é característica para a linhagem osteogênica (Murgia et al., PLoS One. 2016, vol. 11: e0163629). Este perfil de expressão confirma um comprometimento osteogênico inicial das células. Exemplo 13: Potencial de diferencial adipogênico

[00625]. Descrição do Método: Para a diferenciação adipogênica, células de SWJ (Exemplos 1, 2A, 2B, 2C) na passagem de cultura 5 foram semeadas a 10.000 células/cm2 em MSCBM CD com 5% de hPL em 6 placas multipoços (6-MW) e, depois de 3 dias, o meio foi substituído por meio de indução adipogênica. O meio adipogênico foi composto de MSCBM CD com 5% de hPL, suplementado com 1 µM de dexametasona, 60 µM de indometacina, 10 µM de insulina, 0,5 mM de 3-isobutil-1- metilxantina (IBMX), 10% de soro de coelho, 5% de soro de cavalo, 1% de L-glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina. As células de controle foram submetidas a cultura com MSCBM CD com 5% de hPL. As células foram semeadas em duplicatas técnicas para cada condição.

[00626]. Depois de 10 dias, as células foram coradas com corante Vermelho Óleo O (um corante comercialmente disponível para adipócitos) para confirmar o diferencial, como segue: As células foram lavadas rapidamente com PBS 1x,

fixadas com vapores de formaldeído 37% por 10 minutos e, então, lavadas com água por 2 minutos. A coloração foi obtida com a adição de uma solução de Vermelho Óleo O (10 mg/mL de Vermelho Óleo O em etanol 70% e acetona) por 3 minutos nos poços. As células foram contracoradas por Harris Hematoxylin (Bio-Optica, Milão, Itália) por 3 minutos. Depois do tratamento, as células diferenciadas e controles foram visualizados por observações microscópicas (Axio Observer A1 com câmera colorida Axiocam MRC5 e software Axiovision 4.82; todos da Zeiss).

[00627]. Os resultados são mostrados na Figura 13. As células de SWJ, depois de 10 dias de tratamento, foram capazes de produzir gotículas de lipídeos arredondadas dentro das células, confirmando o envolvimento adiposo. Vacúolos lipídicos foram amplamente detectados nas amostras induzidas, mas não nos controles não induzidos (Figura 13). Exemplo 14: Potencial de diferenciação condrogênica

[00628]. Descrição do Método: Para a diferenciação condrogênica,

200.000-500.000 células de SWJ (Exemplos 1, 2A, 2B, 2C) na passagem de cultura P5 foram aliquotadas em um tubo de 15 mL e centrifugadas a 1.200 rpm (Beckham Coulter Allegra™ 25R) por 10 minutos. As células foram mantidas no grânulo em meio de crescimento a 37ºC com a tampa aberta. Depois de 2 dias de incubação, o meio de crescimento foi substituído com o meio de indução, composto de MSCBM CD com 5% de lisado de plaquetas humanas (hPL), suplementado com: 500 ng/mL de rhBMP-6, 10 ng/mL fator de crescimento transformador-β, 50 mg/mL de ITS+Pré-mistura (contendo insulina 6,25 µg/mL, transferrina 6,25 µg/mL, ácido selênico 6,25 ng/mL, BSA 1,25 mg/mL e ácido linoleico 5,35 µg/mL), 100 nM de dexametasona, 0,2 mM de L-ácido ascórbico-2-fosfato, 100 µg/mL de piruvato de sódio, 40 µg/mL prolina. O meio foi trocado a cada três dias. Antes e depois de cada troca de meio, os tubos foram centrifugados a 1.200 rpm por 10 minutos conforme descrito acima. Durante o período de incubação, as células permanecem como grânulos com as tampas do tubo abertas. A indução durou 21 dias, e as amostras foram fixadas por 1 hora em formaldeído 10% e, então, desidratadas por passagens em série em etanol e, concentrações crescentes, de 70% (v/v) a 100%. Então, as amostras foram incluídas em blocos de parafina e cortadas em fatias em lâminas de microscópio para coloração com Azul de Alcian. As lâminas foram desparafinizadas com agente de limpeza Histo-C e rehidratadas através de passagens em uma escada alcoólica com concentração decrescente (de 100% de etanol a 70% de etanol) (v/v). Então, seções da amostra foram incubadas com uma solução de 0,5 mg/mL de hialuronidase em tampão fosfato (8 g/L de NaCl, 2 g/L de NaH2PO4, e 0,3 g/L de Na2HPO4) com 10 mg/mL de BSA. Os slides foram lavados em água por 5 minutos e, então, submersos em uma solução de ácido acético 3% (v/v) por alguns segundos. As seções foram coradas com 10 mg/mL de solução de Azul de Alcian (um corante comercial) em ácido acético 3% (pH 2,5), permaneceram lá por 30 minutos e, depois, uma etapa de lavagem em água, foram contracoradas por 5 minutos com uma solução de Vermelho rápido nuclear (um corante comercial).

[00629]. Os resultados são mostrados na Figura 14. A SWJ, depois de 21 dias de tratamento, havia desenvolvido uma morfologia multicamada rica em matriz. O SWJ induzido apresentou celularidade mais baixa e os glicosaminoglicanos dentro da matriz extracelular. O SWJ de controle apresentou alta celularidade e um componente de matriz insatisfatório. Breve descrição das Figuras

[00630]. Figura 1: Corte transversal do cordão umbilical (humano) e vista esquemática de seções (áreas anatômicas) do cordão umbilical (humano). As duas formas elípticas sombreadas em cinza na parte externa (1a e 1b) juntas formam a membrana de revestimento do cordão umbilical (compreendendo duas camadas: 1a (desenhada como um círculo cinza escuro na parte externa), a camada amniótica (ou epitelial), também chamada de membrana de revestimento do cordão umbilical; e 1b (desenhada como um círculo cinza claro na parte interna): a camada subamniótica (ou mesenquimal)); 2: veia umbilical; 3: artérias umbilicais; 4: área intervascular; 5: área perivascular (mostrada em cinza); 6: exemplo ilustrativo da localização da Geleia de Wharton; 7: sangue do cordão umbilical (no lúmen do vaso). A menos que explicitamente declarado de outra forma, o estroma subamniótico (1b) está compreendido no "estroma" referido neste documento. A menos que explicitamente declarado de outra forma, a Geleia de Wharton subamniótica está compreendida na Geleia de Wharton chamada aqui de "Geleia de Wharton estromal".

[00631]. Figura 2: Caracterização imunohistoquímica de diferentes áreas do cordão umbilical humano. WJ: Geleia de Wharton; MW: parede multicamada; PV: perivascular; V: vaso; L: lúmen. WJ Estromal: WJ pelo menos 3 mm distante da parede externa dos vasos da corda, e interna do epitélio amniótico.

[00632]. : Área perivascular de aproximadamente 2,00 mm incluindo

WJ+pericito+células endoteliais.

[00633]. Materiais e Métodos: Uma amostra do cordão umbilical humano foi fixada em formalina e integrada em parafina. As seções foram isoladas e cortadas em seções de 5 µm para coloração adicional. A coloração distinta nas áreas diferentes representando a Geleia de Wharton estromal e a área perivascular está aparente. A área perivascular apresenta um padrão histomorfológico mais complexo com vasos (V), células perivasculares (PV) adjacentes às áreas da WJ. A complexidade também é relativa ao diferente tipo celular representado na região perivascular. Ao contrário, a Geleia de Wharton estromal aparece histologicamente como uma área relativamente mais uniforme com elementos celulares mais homogêneos dispersos na matriz do tecido estromal. As células isoladas expressam marcadores que são comumente encontrados em populações de MSC ex vivo, como CD10, CD140b, GD2, CD73 (não mostrados nesta Figura). O padrão de coloração imunohistoquímico para estes marcadores também difere entre as duas regiões. Na Figura 2B, as diferenças histológicas são mais evidentes entre a área vascular do cordão e a Geleia de Wharton estromal. Nos vasos (V), o lúmen (L) e as células (setas) que representam a camada endotelial (CD31) e a camada subendotelial (CD146, CD271, GD2) são claramente evidentes. Descobriu-se, também, que a CD140b também é expressa na parte endoluminal do vaso. A coloração positiva para CD73 é encontrada na camada subendotelial, com uma intensidade que aumenta seguindo na direção da matriz da Geleia de Wharton (Rasini et al., 2013, Cytotherapy, vol. 15, p. 292-306).

[00634]. Figura 3: Dissecação (seccionamento) e extração de células – para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 1.

[00635]. Figura 4: Resultados do Exemplo 4, evidenciando que o método da invenção é causador da viabilidade significativamente maior. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 4.

[00636]. PVWJ: Células obtidas de acordo com um método convencional, veja Exemplos Comparativos. SWJ: células isoladas de acordo com a presente invenção.

[00637]. A: Células apoptóticas: efeito do lisado de plaquetas e comparação com um método convencional. Com relação ao número de células frescamente isoladas, os inventores obtiveram mais células (PVWJ) do protocolo de acordo com o Exemplo Comparativo 1, (4,15±1,28 x 106) do que do protocolo de acordo com a presente invenção (1,49±0,35 x 106). O gráfico representa a média e o erro padrão da média (SEM) de células apoptóticas em três digestões (n=3). 30,6% ± 9,6% do total de células derivadas de PVWJ isoladas de acordo com o Exemplo Comparativo 1 foram positivas para 7AAD (Figura 4A, barra sombreada maior à direita). Ao contrário, o percentual de células derivadas de SWJ positivas para 7AAD, tanto na presença quanto na ausência de hPL, é muito menor. Dessa forma, os inventores desvendaram que as células obtidas de acordo com a presente invenção apresentam um grau mais elevado de viabilidade do que as células obtidas por um método de acordo com o estado da técnica.

[00638]. B: Análise de FACS de amostras de células frescamente isoladas. Os 4 gráficos de FACS representam parâmetros físicos (direita) e a positividade para 7AAD (isto é, apoptose, à esquerda) de células derivadas de SWJ (parte superior), células derivadas de PVWJ (parte inferior), respectivamente. Nos gráficos à direita, células vivas são encontradas à esquerda da linha vertical.

[00639]. C: A representação gráfica do número total de células, conforme determinado por citometria de fluxo (Figura 4B). O gráfico representa a média e o erro padrão da média (SEM) de células apoptóticas em três digestões (n=3 para ambas as populações celulares).

[00640]. D: A representação gráfica do percentual de células apoptóticas, conforme determinado por citometria de fluxo (Figura 4B). A análise de FACS de amostras isoladas frescamente revelou para células derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção uma viabilidade maior do que 79% da população celular total. Ao contrário 52,9% ± 2,6% do total de células isoladas de acordo com o Exemplo Comparativo 1 (células derivadas de PVWJ) eram positivas para 7AAD. C: Eficiência do isolamento celular em amostras de SWJ (n=5) e PVWJ (n=9) D: O gráfico representa a média e o erro padrão da média (SEM) de células apoptóticas em três digestões (n=3 para ambas as populações celulares).

[00641]. Figura 5: Morfologia e formação de colônia

[00642]. A: Os parâmetros físicos determinados por citometria de fluxo, Dispersão Frontal (FSC) e Dispersão Lateral (SSC) de células frescamente isoladas de um cordão umbilical são representados (gráfico de FACS à esquerda). O gráfico representa a média e o SEM dos parâmetros físicos. A população celular derivada de SWJ isolada (de acordo com os Exemplos 1 e 2A) é caracterizada por valores de FSC significativamente menores do que os da população celular derivada de PVWJ isolada

(de acordo com os Exemplos Comparativos 1 e 2A; p=0,02 pelo teste T). SSC: As células derivadas de SWJ apresentam complexidade citoplasmática menor do que as células da PVWJ. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 4A.

[00643]. B: Estudos morfológico na passagem de cultura 1 (n=3). Depois da expansão, as células derivadas de SWJ (Exemplo 2C) foram caracterizadas por população celular menor e fusiforme, ao contrário, as células derivadas de PVWJ (de acordo com o Comparativo 2C) foram caracterizadas por um formato grande e citoesqueleto proeminente. As duas figuras representam a morfologia de células derivadas de SWJ (esquerda) versus células derivadas de PVWJ (direita) dois ou três dias após a semeadura na passagem de cultura 1 (P1) em uma amostra representativa (magnificação original de 100X).

[00644]. C: Formação de colônia das células derivadas de SWJ e células derivadas de PVWJ. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 4C. As células foram coradas com violeta cristal antes de tirar a fotografia mostrada na parte inferior. As culturas de populações celulares derivadas de SWJ são caracterizadas por consistirem de células com uma pequena área superficial; estas células tendem a construir colônias, enquanto as culturas de populações celulares derivadas de PVWJ são caracterizadas por consistirem de células com diferentes áreas superficiais, também incluindo células grandes. Dessa forma, as células derivadas de PVWJ parecem ser mais homogêneas; homogêneas neste contexto significa que substancialmente todas as células parecem ser muito semelhantes ou similares. As células derivadas de PVWJ maiores tendem a crescer de forma relativamente mais lenta (dados não mostrados).

[00645]. Figura 6: Determinação quantitativa da área da superfície celular: Células derivadas de SWJ vs. células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (BM, ou BM-MSC). MSCs aderentes ao plástico da medula óssea e de Geleia de Wharton estromal (BM e SWJ respectivamente) foram visualizadas na passagem de cultura 5 (P5). Cinco fotografias de cada amostra foram adquiridas, e 34 BM-MSC e 33 células SWJ foram identificadas opticamente. As células foram circundadas geograficamente manualmente mediante inspeção visual. As células derivadas da BM foram caracterizadas por uma área da superfície celular média maior (4300,5 ± 2486,5 µm2) em comparação com células derivadas de SWJ (1701,2±1137,3 µm 2) (p = 5,15X10-7, por ANOVA). Concluiu-se, dessa forma, que as MSC derivadas de SWJ de acordo com a presente invenção são menores do que as MSCs derivadas da BM.

[00646]. Figura 7: Resultados do Exemplo 7. O gráfico à esquerda representa a média e o SEM de marcadores de superfície em células derivadas de PVWJ e em células derivadas de SWJ, tanto isoladas frescamente de três cordões umbilicais pelos dois métodos de isolamento diferentes (SWJ: de acordo com os Exemplos 1 e 2A; PVWJ: de acordo com os Exemplos Comparativos 1 e 2A). A análise imunofenotípica de amostras isoladas frescamente revelou para ambos os métodos a manifestação de CD105, CD73 e de CD90, a manifestação do antígeno de superfície típico das MSCs. Semelhantemente, o receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas β (CD140b) foi detectado depois de ambos os métodos. O HLA-DR não foi expresso em ambas as amostras. No entanto, a manifestação de 3G5 foi detectada somente na população de células derivadas de PVWJ, indicando que o método da presente invenção é especificamente adequado para o isolamento de uma população de MSCs derivadas de SWJ, que não compreende células perivasculares.

[00647]. A: O gráfico à esquerda representa a média e o SEM de marcadores de superfície em PVWJ e SPPC frescamente isolados de três cordões umbilicais tratados pelos dois diferentes métodos de digestão (Exemplo Comparativo 1, "PVWJ" vs. células de acordo com a presente invenção, SWJ). O painel à direita indica alguns marcadores de superfície que são expressos/não expressos na maioria das células.

[00648]. B: O gráfico representa o percentual médio de células que exibem marcadores de superfície específicos, em células isoladas frescamente de cordões umbilicais por dois diferentes métodos (Exemplo Comparativo 1, "PVWJ" vs. células de acordo com a presente invenção, SWJ).

[00649]. Figura 8: Expressão genética quantitativa de células de acordo com a presente invenção conforme determinado por PCR em Tempo Real (RT-PCR). Duas populações celulares independentes, isoladas de acordo com a presente invenção, foram submetidas à análise de RT-PCR; ambas são mostradas na Figura 8 e comparadas com células PVWJ de controle. O gráfico mostra a diferença de expressão (Delta Ct) entre 2 genes (gene de interesse vs. beta-actina, um gene de referência). A expressão de APCDD1 não foi detectada em células de controle.

[00650]. Figura 9: Potencial proliferativo: O gráfico representa a média e o SEM (erro padrão da média) de duplicações cumulativas da população de células derivadas de PVWJ (n=9) e de células derivadas de SWJ (n=7) nas quatro passagens de cultura analisadas (de P1 a P4). Um número maior de Duplicações da População (PD) por passagem é observado nas células derivadas de SWJ, em comparação com células derivadas de PVWJ. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 9.

[00651]. Figura 10: Expressão da telomerase em diferentes lotes de células derivadas de SWJ. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 10.

[00652]. Figura 11: Senescência em diferentes lotes de células derivadas de SWJ. CAKE2 é um acrônimo para um meio basal substancialmente equivalente ao MSCBM CD; 5PL é um acrônimo para 5% (vol./vol.) de lisado de plaquetas humanas. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 11.

[00653]. Figura 12: Potencial osteogênico de populações celulares derivadas de WJ. A interrupção das barras indica uma mudança de escala. CAKE2 é um acrônimo para um meio basal substancialmente equivalente ao MSCBM CD; 5PL é um acrônimo para 5% (vol./vol.) de lisado de plaquetas humanas. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 12.

[00654]. Figura 13: Potencial adipogênico de populações celulares derivadas de WJ. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 13. As células derivadas de SWJ produziram gotículas lipídicas arredondadas dentro das células (painel superior e inferior à esquerda), confirmando o envolvimento adiposo. Vacúolos lipídicos foram amplamente detectados nas amostras induzidas, enquanto estavam ausentes nos controles não induzidos. CAKE2 é um acrônimo para um meio basal substancialmente equivalente ao MSCBM CD; 5PL é um acrônimo para 5% (vol./vol.) de lisado de plaquetas humanas.

[00655]. Figura 14: Diferenciação condrogênica de populações celulares derivadas de SWJ. Para conhecer os detalhes, veja o Exemplo 14. Depois de 21 dias de tratamento, as células derivadas de SWJ não induzidas (controle) haviam desenvolvido uma morfologia multicamada rica em matriz (dois painéis à esquerda). As células derivadas de SWJ induzidas (dois painéis à direita) mostraram uma celularidade menor, e os glicosaminoglicanos dentro da matriz extracelular (áreas de cores escuras, correspondendo a coloração azul forte na imagem colorida original). CAKE2 é um acrônimo para um meio basal substancialmente equivalente ao MSCBM CD; 5PL é um acrônimo para 5% (vol./vol.) de lisado de plaquetas humanas.

Claims (48)

Reivindicações

1. MÉTODO PARA OBTER UMA CÉLULA ESTROMAL MESENQUIMAL caraterizado pelo fato de que compreende: (a) isolamento da Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela de um cordão umbilical (b) submissão da Geleia de Wharton estromal ou fração dela a tratamento enzimático liberando, dessa forma, pelo menos uma célula da Geleia de Wharton estromal ou de sua fração.

2. MÉTODO de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) é seguida pela etapa (c) que consistem em: (c) expansão da referida célula.

3. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 1 a 2, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) de isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela, compreende uma etapa de remoção física dos vasos e da área perivascular do cordão umbilical.

4. MÉTODO de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a remoção física dos vasos e da área perivascular compreende a remoção dos vasos e da área perivascular do cordão umbilical.

5. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a etapa (a) isolamento da Geleia de Wharton estromal ou de uma fração dela compreende adicionalmente uma etapa de separação física do estroma subamniótico da membrana de revestimento do cordão umbilical, como pela separação da Geleia de Wharton da membrana de revestimento do cordão umbilical, particularmente pelo menos da camada epitelial da membrana de revestimento do cordão umbilical.

6. MÉTODO de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a separação física da Geleia de Wharton da membrana de revestimento do cordão umbilical compreende a raspagem da Geleia de Wharton, preferivelmente sem dissecação mecânica da membrana de revestimento do cordão umbilical.

7. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 3 a 6, caracterizado pelo fato de que o cordão umbilical é segmentado antes da referida etapa de remoção física dos vasos e da área perivascular.

8. MÉTODO de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a segmentação é perpendicular ao cordão, e onde cada segmento perpendicular tenha, preferivelmente, um comprimento de aproximadamente 1 a aproximadamente 4 cm, preferivelmente de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 cm, e mais preferivelmente de aproximadamente 2,5 cm.

9. MÉTODO de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o(s) segmento(s) dos vasos é(são) removido(s) do(s) segmento(s) do cordão umbilical antes da etapa (b).

10. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o tratamento enzimático da etapa (b) é um tratamento que compreende a enzima colagenase.

11. MÉTODO de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o tratamento enzimático é realizado misturando-se Geleia de Wharton estromal ou uma fração dela com um Tampão de Digestão compreendendo colagenase, preferivelmente em uma atividade específica de não mais do que 0,5 Wünsch U/ml, mais preferivelmente não mais do que 0,25 Wünsch U/ml, e especificamente 0,18 Wünsch U/ml.

12. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 1 a 11, caracterizado pelo fato de que as etapas (a) e (b) juntas são realizadas em um tempo total inferior a 3 horas.

13. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 1 a 12, caracterizado pelo fato de que na etapa (b) a Geleia de Wharton estromal ou fração dela é submetida a tratamento enzimático na presença de lisado de plaquetas (PL) ou de seus derivados, preferivelmente lisado de plaquetas humanas (hPL) ou de seus derivados.

14. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 3 a 13, caracterizado pelo fato de que na etapa (c) pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento compreendendo lisado de plaquetas (PL) ou seus derivados, preferivelmente lisado de plaquetas humanas (hPL) ou seus derivados.

15. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 3 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento que não compreende qualquer soro adicionado, em particular nenhum soro bovino fetal (FBS).

16. MÉTODO de acordo com as reivindicações de 3 a 14, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma célula é expandida em um meio de crescimento compreendendo meio basal MSCBM CD.

17. CÉLULA ESTROMAL MESENQUIMAL (MSC) caracterizada pelo fato de que é como segue: (a) a célula expressa APCDD1, (b) a célula não expressa 3G5.

18. CÉLULA de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que não é uma célula isolada.

19.CÉLULA de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracterizada pelo fato de que é derivada da Geleia de Wharton estromal do cordão umbilical.

20. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 19, caracterizada pelo fato de que expresse adicionalmente pelo menos um PPARG e FLVCR2.

21. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 20, caracterizada pelo fato de que não é uma célula humana.

22. CÉLULA de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a célula humana manifeste pelo menos um, preferivelmente pelo menos qualquer combinação de dois, e mais preferivelmente todos os antígenos leucocitários humanos HLA-A, HLA-B e HLA-C.

23. CÉLULA de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que não manifeste quaisquer dos antígenos leucocitários humanos HLA-DP, HLA-DR e HLA-DQ.

24. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 23, caracterizada pelo fato de que a célula compreende um valor de dispersão frontal de luz (FSC), determinado por citometria de fluxo a um comprimento de onda de excitação de 488 nm, de 55 ou menos.

25. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 24, caracterizada pelo fato de que tem uma área de superfície média não superior a 3000 µm2.

26. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 25, caracterizada pelo fato de que a célula é multipotente.

27. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 26, caracterizada pelo fato de que a célula apresenta baixa atividade da telomerase, preferivelmente de 10% ou menos de atividade da telomerase com relação ao controle positivo do kit TeloTAGGG Telomerase PCR ELISA PLUS (considerado como 100%).

28. CÉLULA caracterizada pelo fato de que possui ausência de expressão detectável da telomerase e/ou ausência de atividade detectável da telomerase.

29. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 27, caracterizada pelo fato de que a célula é capaz de se diferenciar em vários tipos celulares, preferivelmente onde a célula tenha pelo menos todos os potenciais de diferenciação a seguir: (a) adipogênico; (b) condrogênico; (c) Osteogênico.

30. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 28, caracterizada pelo fato de que é uma célula-tronco mesenquimal.

31. CÉLULA de acordo com as reivindicações de 17 a 29, caracterizada pelo fato de que a célula é obtida pelo método conforme definido por uma das reivindicações de 1 a 16.

32. POPULAÇÃO DE CÉLULAS caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma célula conforme definida por uma das reivindicações de 17 a 30.

33. POPULAÇÃO de acordo com a reivindicação 31, caracterizada pelo fato de que é uma população de células isolada.

34. POPULAÇÃO de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizada pelo fato de que todas as células compreendidas na população celular são autólogas com relação umas às outras.

35. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 33, caracterizada pelo fato de que pelo menos 70% do número total de células são células conforme definido em qualquer uma das reivindicações 17-30.

36. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 34, caracterizada pelo fato de que possui um valor de FSC médio de 55 ou menos.

37. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 35, caracterizada pelo fato de que expressa o APCDD1.

38. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 36, caracterizada pelo fato de que a área superficial média das células é de 1400 a 2000 µm2, preferivelmente de 1500 a 1900 µm2, mais preferivelmente 1600 a 1800 µm2, e mais preferivelmente de aproximadamente 1700 µm2.

39. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 37, caracterizada pelo fato de que pelo menos 70% das células (número total de células) são viáveis.

40. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 39, caracterizada pelo fato de que não compreende qualquer célula perivascular e/ou não compreende qualquer célula epitelial.

41. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 39, caracterizada pelo fato de que é obtida por um método conforme definido por uma das reivindicações de 3 a 16.

42. POPULAÇÃO de acordo com as reivindicações de 31 a 40, caracterizada pelo fato de que compreende apenas células humanas.

43.MÉTODO de acordo com uma ou mais das reivindicações de 1 a 16, caracterizado pelo fato de que célula obtida pelo método é a célula conforme definida por uma das reivindicações de 17 a 29.

44. CÉLULA caracterizada pelo fato de eu é obtida pelo método conforme definido por uma das reivindicações de 1 a16.

45. POPULAÇÃO CELULAR caracterizada pelo fato de que é obtida pelo método conforme definido por uma das reivindicações de 3 a16.

46. POPULAÇÃO CELULAR de acordo com uma das reivindicações de 31 a 41 ou 44, caracterizada pelo fato de que é uma população celular congelada.

47. POPULAÇÃO CELULAR de acordo com a reivindicação 45, caracterizada pelo fato de que é um banco de células, como um Banco de Células Primário (PCB) ou um Banco de Células Secundário (SCB).

48. POPULAÇÃO CELULAR de acordo com a reivindicação 46, caracterizada pelo fato de que está em múltiplas alíquotas em recipientes individuais, por exemplo, frascos.