KR20200104300A - 중간엽 기질세포 및 탯줄로부터 중간엽 기질세포를 얻기 위한 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 중간엽 기질세포 및 탯줄로부터 그들의 분리를 위해 이점이 있는 방법에 관한 것이다. 특히, 상기 세포들은 탯줄로부터 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 것 및 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 효소적 처리하고, 이에 의해 상기 기질 와튼 젤리 및 이의 부분으로부터 적어도 하나 이상의 세포를 방출시키는 것을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 바람직하게, 세포들의 배양은 상기 세포 집단의 증식을 가능하게 하는 조건들 하에서 발생한다. 본 발명에 따른 상기 세포 집단은 증식하는 특성을 가지고 다양한 목적을 위해 산업적 관심 중에 있다.

Description

중간엽 기질세포 및 탯줄로부터 중간엽 기질세포를 얻기 위한 방법

도입부

본 발명은 기질세포(stromal cell), 특히 기질 전구세포(stromal progenitor cell)를 얻기 위한 방법에 관한 것이다. 기질 전구세포는 통상적으로 표현형적으로(phenotypically) 및 유전자형적으로(genotypically) 동일한 딸(자가 재생(self-renewal)) 뿐만 아니라 적어도 하나의 다른 최종 세포 타입을 생기게 할 수 있다. 몇 기질세포는 자가 재생능을 가지고 그러한 세포들은 최근 몇 해에서 증가하는 주목을 받고 있다. 본 발명에 관한 상기 기질세포는 비배아 중간엽 기질세포이다. 그들은 본 발명의 방법에 의한 탯줄로부터의 분리에 의해서 얻을 수 있고, 그것은 본 명세서에서 상세하게 개시된다.

중간엽 기질세포(Mesenchymal stromal cells, MSC)들은 그 중에서도 그들의 다능성(multipotency) 및 낮은 면역원성(immunogenicity) 때문에 과학계에서 특별한 관심을 끄는 기질세포이다(Pittenger et al., 1999, Science;, vol. 284, p. 143-147). 최신 기술에 따르면, 중간엽 기질세포들(MSCs)은 전통적으로 통상적으로 골수(bone marrow)로부터 얻어졌으나, MSCs는 또한 다양한 다른 포유류(mammalian)의 근원들, 예컨대 지방조직(adipose tissue), 근육, 결합조직(connective tissue), 치수(dental pulp), 탯줄혈액(cord blood, 제대혈), 태반(placenta), 및 양수(amniotic fluid)로부터 분리될 수 있다(Iudicone et al., 2014, J. Transl. Med., 12: 28). MSC들 사이에서, 골수로부터 유래된 성체 MSC(BM-MSC)는 가장 광범위하게 연구되었다(예컨대, WO 2008/042174 A2). 골수에서, MSC들은 더 원시적이고 배아같은(embryonic-like) 줄기세포, 중간엽 줄기세포, 계통-분화 전구체(lineage-committed progenitor), 뿐만 아니라 성숙 세포(mature cell), 예컨대 골모세포(osteoblast) 및 섬유모세포(fibroblast)를 포함하는 다양한 세포 타입들과 공존하고, 상이한 방법들은 예컨대, 골수에서 유래된 MSC들의 분리를 위해 기술되었다(예컨대, Majore, Cell Commun. Signal., 2009, vol. 20; 7:6 참조). 몇몇의 노력들은 또한 과거에 중간엽 기질 세포의 대안적인 근원들을 탐구하기 위해 만들어졌다. 예컨대, 탯줄(UC)은 상이한 세포 타입들의 적절한 저장소로 제안되었고, 이들의 몇몇은 줄기세포 유사 특성들을 갖는 것으로 나타났다. 탯줄은 태반(placenta)을 발달하는 태아(fetus)와 연결하는 태반의 포유동물에 구조이고, 이에 의해서 태아의 영양분의 근원을 제공한다. 이것은 임의의 침습적 절차 및 윤리적인 걱정이 없이 출산 후에 이용가능하다(Hass et al., 2011, Cell. Commun. Signal., vol. 9:12). 탯줄은 기질세포에 풍부한 젤리 같고(gelatinous), 느슨한 점액질의 결합조직인 와튼 젤리(Wharton's Jelly)를 포함하고, 이는 해부학자 토마스 와튼(Thomas Wharton)의 이름을 따서 명명되었다. 와튼 젤리는 히알루론산(hyaluronic acid) 및 글리칸(glycan)의 상이한 타입을 포함하는, 프로테오글리칸(proteoglycan)으로 구성된 무정형의 기저물질(ground substance)에서 분산된 세포들을 포함한다(예컨대, WO 2004/072273 A1 참조). 이것은 일반적으로 주로 배아 외 유래(extra-embryonic derivation)의 원시적인 중간엽 조직으로 간주되고(Weiss, 1983, Histology, cell and tissue biology, New York, Elsevier Biomedical, p. 997-998), MSC의 전도 유망한 근원으로 제안되었다(Wang et al., 2004, Stem Cells, vol. 22: p. 1330-1337).

탯줄(UC)의 기질세포들은 구조, 생물학적 특성 및 UC 내에서 위치(localization)에 관해서, 이질적(heterogeneous)이라고 일반적으로 인식된다. UC의 와튼 젤리(WJ)로부터 세포들을 얻기 위한 몇몇의 방법들은 기술되었고, MSC 같은 특성들을 가진 세포들은 UC의 상이한 부위들에서 존재하고 상이한 부위들로부터 기원한다고 기술되었다. 인간의 탯줄은 세가지 혈관을 포함하고, 이는 보통 왼쪽 나선(반시계 방향) 회전으로 조직된다. Mitchell et al.(2003, Stem Cells, vol. 21, p. 50-60)는 탯줄 혈관들이 남아있는 조직을 수확(harvest)하기 전에 제거되는 방법을 기술한다. 이 남아있는 조직은, 이것이 WJ 및 양막 상피(amniotic epithelium)의 부분(fraction) 모두를 포함하고, 그 후 절단되고(dice) 조직 배양 플레이트에 옮겨지는 작은 조직 조각을 제조하기 위함이다. 그러나 탯줄 또는 남아있는 조직의 효소적 소화는 예견되지 않는다. 오히려, 조직 조각은 세포가 배양 하층(culture substratum) 위에 조직 표본 밖으로 이동하는 주요한 체외이식편(explant)으로 다음에 사용된다. 다른 보고(Romanov et al., 2003, Stem Cells, vol. 21, p. 105-110)는 섬유모세포 유사 MSC들이 콜라겐 분해효소(collagenase)를 가지고 탯줄 정맥의 소화에 의해 탯줄 혈관구조(cord vasculature)로부터 분리될 수 있다는 것을 나타내지만, 이는 혈관의 내피(endothelial) 및 내피 하(subendothelial) 세포의 혼합 집단(population)을 생성한다. US 5,919,702 A(Purchio et al.)는 개방된 약(ca.) 2.5 cm 길이의 탯줄의 세그먼트(segment, 분절)를 길이방향으로 슬라이싱 하여 개방하고, 혈관을 제거하고, WJ를 이것이 잘리고 배양되는 살균 용기에 포장 및 수집하는 것을 포함하는 분리 방법을 기술한다. 예컨대, 배양 접시로부터 몇몇 세포들("전연골세포(pre-chondrocyte)")이 이동하도록 하기 위해서, 페트리 접시의 바닥에 유리 슬라이드에 WJ의 2-3 mm³ 섹션(section, 분할)을 두고 그것을 또 다른 슬라이드로 덮고, 그것을 10-12일 동안 배양함으로써, 세포들이 분리될 수 있다는 것이 기술된다. 연골(cartilage)을 생성하기 위한 전연골세포의 사용 또한 언급된다.

탯줄-매트릭스(umbilical cord-matrix)로부터 유래된 세포의 분리는 또한 동물 조직 기원으로부터 보고되었다. 예컨대, Lange-Consiglio et al.,(2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 120-133)는 말 탯줄의 "혈관 간(intervascular)" 및 "혈관 주위(perivascular)" 영역으로부터 "탯줄-매트릭스로부터 유래된 세포의 분리"를 보고한다.

만삭(term)에서 대략적으로 40 g의 인간의 탯줄의 중량(Raio et al., 1999, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 83; p. 131-135; Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20)은 MSC 같은 특성을 가지는 세포들의 분리를 위해 이용가능한 시작 물질에 대한 자연적인 상한을 제기한다. US 2004/0136967 A1 및 Seshareddy et al.(2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119)에 따르면, 탯줄로부터 높은 수의 바람직한 세포들을 얻는 것은 어렵다. 따라서, 저자들은 상대적으로 큰 세포 수를 추출하는 것을 추천하고, 예컨대, 상대적으로 높은 세포 수의 분리를 위해, 예컨대 큰 세포의 수의 추출을 가능하게 하기 위해서 최적화된 조건을 기술한다. 그들은 상대적으로 가혹한 탯줄의 효소적 처리를 제안한다. 와튼 젤리의 다른 영역들은 기술되지만, 추출을 위한 세포들의 기원의 특정 영역, 예컨대 혈관 주위 영역의 제외는, 높은 세포 수를 사용하기 위한 일반적인 추천에 따라, 특별히 추천되지 않았다. 세포들은 분리 후에 배양되었다. 대안적인 접근은 WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al. (Stem Cells, 2005, 23:220-229)에 의해 기술되었다; 이러한 간행물들은 탯줄의 혈관 주위의 영역으로부터 MSC 같은 특성들을 가진 세포들만의 분리를 기술하였다. 이 영역은 해부학적으로 상대적으로 제한되기 때문에, 전체 탯줄로부터 시작하는 분리 방법과 비교하면, 시작 물질의 양은 상대적으로 낮다. 또한, 혈액을 포함하는 혈관에 근접해있다는 점에서, 혈액 세포에 의한 오염은 배제될 수 없다; 그러므로 CD45 발현에 대항한 음성 선택(negative selection)은 배양에서 바람직하지 않은 세포들로의 오염을 피하는 것으로 기술된다. 또한, WO 2017/058003 A1는 탯줄, 치주, 포피(foreskin), 각막(cornea) 또는 다른 근원으로부터 MSC들의 분리를 위한 과정들을 기술한다; 탯줄로부터 중간엽 기질세포의 분리를 위한 과정은 살균 조건 하에서 바람직하게 수행되고, 탯줄은 상대적으로 긴 시간 간격동안 바람직하게 콜라겐 분해효소 처리에 있게 된다. Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20에 따르면, 인 비트로(in vitro)에서 MSC들의 증식(expansion) 및 보관을 개선하기 위한 가장 적절한 프로토콜은 아직 확립되지 않았다. 따라서, 근본적으로 균일한 특성에 의해 특징지어지고 엑스 비보(ex vivo)에서 확실하게 증식할 수 있는 세포들로 구성된 집단을 제공할 필요가 여전히 있다; 그리고 그들을 제공하기 위한 신뢰할 수 있는 방법들 또한 필요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 최신 기술과 연관된 불이익을 제거하는 것을 포함한다. 특별한 목적은 좋은 수율에서 우수한 자가 재생 특성을 가지는, 중간엽 기질세포(MSC)를 얻기 위한 신뢰할 수 있는 방법의 제공 및 중간엽 기질세포들(MSCs) 및 MSC들의 집단의 재현가능한 제공을 포함한다. 집단은 상대적으로 균일해야 하고 바람직하지 않은 세포들, 예컨대, 사멸 세포(apoptotic cells), 조혈 계통 세포(hematopoietic lineage cells) 등을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 따라서, 다시 말해서, 현재 알려지고 실행되는 방법에 관해서, 신뢰성 및/또는 수율의 관점에서 이점이 있는 방법에 의해 중간엽 기질세포를 제공하는 것은 바람직하다. 최신 기술의 다양한 결점들은 본 발명자에 의해 다뤄지는 개선을 위한 추가적인 목표들을 정의하고, 이러한 목표들은 본 명세서에서 기술되고 청구되는 기여에 의해 달성되었다.

본 발명의 요약

본 발명은 모두 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 중간엽 기질세포들(MSCs)을 얻기 위한 방법에 관한 것이고, 각각의 중간엽 기질세포들(MSCs) 및 이에 관련된 다른 태양들에 관한 것이다. 본 발명의 주된 태양 및 구현예는 다음과 같이 요약된다.

제1 태양에서, 본 발명은 중간엽 기질세포를 얻기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 탯줄로부터 분리시키는 것, 및 (b) 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 효소적 처리하고, 이에 의해 최소한 하나의 세포를 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분으로부터 방출하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 단계 (b) 후에 얻어진 상기 세포는 다능성(multipotent)이다.

단계 (a) 및 (b) 이외에 적어도 하나의 추가적인 단계는 본 발명의 상기 방법에서 포함되는 것이 훨씬 바람직하다. 특히, 단계 (b)에서 얻어지는 상기 세포들의 세포 분열 잠재력을 이용하면서, 세포들의 수를 증가시키기 위한 단계가 포함되는 것이 바람직하다. 그러한 바람직한 구현예에서, 단계 (b) 다음에 단계 (c)가 이어지고, 단계 (c)는 단계 (b)에서 얻어진 적어도 하나의 세포를 증식시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 단계 (c) 후에 얻어진 상기 세포(들)는 다능성이다.

본 발명자들은 놀랍게도 상기 탯줄의 기질로부터 기원하는 세포들이 특히 이점이 있는 것을 발견했다. 이점들은 상기 세포 집단의 균일성 및 줄기세포 유사 특성들을 포함한다. 특히, 탯줄 혈관의 부재에서, 이러한 이점들은 달성될 수 있다. 따라서, 상기 기질의 와튼 젤리 또는 이의 부분을 상기 탯줄로부터 분리시키는 상기 단계 (a)는 상기 탯줄로부터 혈관들 및 혈관 주위 영역을 물리적으로 제거하는 단계에 의해 특징지어지는 것이 바람직하다. 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역은 단계 (a) 전 또는 단계 (a) 동안에 제거될 수 있다. 본 발명에서 바람직한, 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역을 제거하는 하나의 기술적으로 이점이 있는 방법은 상기 탯줄로부터 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역을 벗겨내는 것(strip out)에 의해 특징지어진다. 본 발명자들은 또한 혈관들을 벗겨내는 것, 예컨대 혈관들을 당김으로써 상기 혈관 주위 영역을 제거하는 것을 관찰했다.

또한, 본 발명자들은 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역을 물리적으로 제거하는 상기 단계 전에 상기 탯줄을 분절하는 것이 이점이 있다는 것을 발견하였다. 상기 분절은 물리적인 수단, 예컨대 통상적으로 가위 또는 메스(scalpel)에 의해 달성된다. 바람직하게 분절하는 것은 상기 탯줄에 수직이다. 더 바람직하게는, 상기 수직적인 세그먼트들은 바람직하게 각각 약 1 내지 약 4 cm, 바람직하게 약 2 내지 약 3 cm, 및 더 바람직하게 약 2.5 cm의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 혈관들의 상기 세그먼트(들)은 단계 (b) 이전에 탯줄의 세그먼트(들)로부터 제거된다. 특히, 바람직하게 수직적인, 상기 탯줄의 분절 후에, 상기 혈관들, 또는 더 정확하게 혈관들의 세그먼트들을 제거하는 것이 바람직하다.

바람직하게는, 상기 효소적인 처리는 단계 (b)가 효소인 콜라겐 분해효소에 노출을 포함하는 처리이다. 본 발명자들은 또한 콜라겐 분해효소 활성의 양이 중요하다는 것을 발견했다. 바람직한 구현예에서, 아래에 더 상세하게 설명된 바와 같이, 상기 콜라겐 분해효소는 상대적으로 낮은 특이적 활성에서 효소적 처리 단계 (b) 동안에 존재한다.

본 발명의 방법에서, 상기 탯줄로부터 기질 세포의 빠른 분리는 이점이 있다. 바람직한 구현예에서, 단계 (a) 및 (b)는 함께 6 시간 이하, 더 바람직하게는 5 시간 이하, 더 바람직하게는 4 시간 이하, 그리고 가장 바람직하게는 3 시간 이하의 총 시간에서 수행된다. 단계 (a) 및 (b) 함께의 짧은 지속시간은 또한 단계 (b) 그 자체가 짧다는 것이 명백하다. 일반적으로, 단계 (b)의 짧음, 즉 빠른 분리, 특히 상기 효소적 처리의 짧음이 단계 (b) 동안에 온화한 조건에 기여할 수 있다.

놀랍게도, 본 발명자들은 또한 효소적 소화 동안 혈소판 용해물(platelet lysate)의 존재가 이점이 있다는 것을 발견하였다. 첫번째로, 본 발명자들은 적어도 주변의 조직 예컨대, 상기 기질 매트릭스로부터 상기 세포들의 바람직한 효소적 유리(liberation)를 음성적으로 방해할 정도가 아니도록, 인간의 혈소판 용해물의 존재가 효소 콜라겐 분해효소의 효소적 활성을 억제 또는 감소 또는 차단하지 않는다는 것을 발견하였다. 혈장은 많은 단백질 분해효소(protease)를 포함하고, 따라서 혈장 또는 그것의 구성성분들이 존재하는 동안, 촉매 단백질(예컨대 콜라겐 분해효소)을 첨가하는 것 또는 그 반대에 대항하여 편견이 있었는데, 이는 상기 촉매 단백질(예컨대 콜라겐 분해효소)이 시간이 지남에 따라 분해되고 그것의 활성이 따라서 줄어든다고 예상했기 때문이다. 그러나 놀랍게도 본 발명자들은 상기 콜라겐 분해효소 소화가 심지어 혈소판 용해물의 존재에서도 효율적으로 작용한다는 것을 확립하였다. 두번째로, 본 발명자들은 그의 본 발명에 따른 상기 방법에서 혈소판 용해물의 존재에서 소화에 의해 얻을 수 있는 세포들이 우수한 증식(proliferative) 특성들을 갖는 것을 발견했다(예컨대 실시예 2B 및 2C 참조). 따라서, 바람직하게, 단계 (b)에서 기질의 와튼 젤리 또는 이의 부분은 포유류의 혈소판 용해물(PL), 더 바람직하게는 인간의 혈소판 용해물(hPL)의 존재 하에 효소적 처리된다.

그것 이외에도, 혈소판 용해물은 바람직하게 단계 (c)에서 존재한다. 바람직하게는, 단계 (c)에서 적어도 하나의 세포는 혈소판 용해물(PL), 바람직하게는 인간의 혈소판 용해물(hPL)을 포함하는 성장 배지(growth medium)에서 증식된다. 바람직하게는 적어도 하나의 세포는 임의로 첨가된 혈청을 포함하지 않는, 특히 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)이 없는 성장 배지에서 증식된다.

특히 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 세포는 선택적으로 보충물을 가지는, 본 발명의 상기 방법을 위해 구체적으로 적절한 특정 성장 배지에서 증식된다. 그러한 성장 배지는 화학적으로 정의된 기초 배지 및/또는 혈소판 용해물을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 방법은 또한 본 명세서에서 기술된, 특정 특성들을 가진 세포들을 산출한다. 따라서, 본 발명의 제1 태양의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 상기 세포는 다음과 같이 본 발명의 제2 태양에서 기술된 바와 같은 세포임이 특히 바람직하다.

제2 태양에서, 본 발명은 중간엽 기질세포(MSC)에 관한 것이다. 본 발명의 상기 MSC는 또한 "본 발명의 세포" 또는 간단하게 "세포"로 일컬어 질 수 있다. 본 발명의 상기 MSC는 그것이 (a) APCDD1 유전자를 발현하고, (b) 3G5 유전자를 발현하지 않는다는 것으로 특징지어진다. 바람직하게, 상기 세포는 분리된 세포이다. 더 바람직하게는, 상기 세포는 탯줄의 기질 와튼 젤리로부터 유래된다. 바람직하게, 상기 세포는 영장류(primate) 세포이다. 따라서, 상기 세포는 바람직하게 말(horse)로부터 오는 것이 아니며, 즉, 말 세포가 아니다. 또한, 상기 세포는 바람직하게 설치류(rodent)로부터 오는 것이 아니며(예컨대, 쥐 또는 생쥐), 즉, 설치류 세포가 아니다(예컨대, 쥐세포 또는 생쥐세포). 가장 바람직하게, 상기 세포는 인간의 세포이다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포는 상기 기질 와튼 젤리로부터 유래되고 APCDD1 유전자를 발현하는 인간 세포이다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포는 또한 PPARG 유전자를 발현한다. 상호간에 배타적이지 않은 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 또한 FLVCR2 유전자를 발현한다. 인간의 세포의 경우에, 상기 인간의 세포는 인간의 백혈구(leukocyte) 항원들 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 임의의 둘의 조합, 및 가장 바람직하게는 모두를 발현하는 것이 바람직하다. 또한, 인간의 세포의 경우에, 상기 세포가 인간의 백혈구 항원들 HLA-DP, 및/또는 HLA-DQ를 표시하지 않는 것이 바람직하다. 선택적으로 또한 HLA-DR은 표시되지 않는다. 일 구현예에서, 상기 세포는 인간의 백혈구 항원 HLA-DP, HLA-DR, 및 HLA-DQ 중 임의의 것을 표시하지 않는다. 대안적으로, HLA-DR은 낮은 수준에서 표시된다.

본 발명에 따른 상기 세포는 통상적으로 최신 기술에 따른 다양한 방법에 의해 분리된 몇 MSC들보다 더 작다. 예컨대, 본 발명에 따른 상기 세포가 더 작은 부피 및/또는 더 작은 표면적을 가질 수 있다. 상기 세포의 부피 또는 표면적을 측정하기 위한 다양한 방법들, 예컨대 분리된 세포들의 세포 부피를 측정하기 위한 유세포측정(flow cytometry), 및 부착된 세포들에 대한 현미경 아래에서 세포 표면적의 측정이 이용가능하다. 그러한 방법들은 본 명세서에서 아래에 기술된다.

바람직하게는, 상기 세포는 임의의 텔로머라제(telomerase) 활성을 나타내지 않고/또는 임의의 텔로머라제를 발현하지 않는다. 바람직하게는 상기 세포는 다능성이다. 더 바람직하게는, 상기 세포는 다양한 세포 타입들로 분화할 수 있다. 상기 세포가 적어도 다음의 분화 잠재력 모두를 가지는 것이 특히 바람직하다: (a) 지방생성(adipogenic); (b) 연골형성(chondrogenic); (c) 뼈형성(osteogenic).

바람직한 구현예에서, 상기 세포는 중간엽 줄기세포이다.

본 발명의 제2 태양에 따른 상기 세포는 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포이다. 문맥상 달리 지시하지 않는다면, 본 발명의 제1 태양의 바람직한 구현예는 각각 및 모든 조합에서 본 발명의 제2 태양의 바람직한 태양과 조합할 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 상기 세포는 따라서 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포로 기술될 수 있다.

제3 태양에서 본 발명은 세포들의 집단(population)에 관한 것이다. 상기 집단은 본 발명의 제2 태양에 따른 적어도 하나의 세포를 포함한다. 더 바람직하게는 상기 세포 집단은 다수의 세포들을 포함하고, 그 중 적어도 80 %(세포 수에서), 바람직하게 적어도 90 %(세포 수에서), 더 바람직하게는 적어도 95 %, 예컨대, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %(각각 세포 수에서)는 제2 태양에 따른 세포들이다. 제2 태양의 모든 바람직한 구현예들은 또한 본 발명의 제3 태양에 적용된다. 세포들의 총 수의 바람직하게는 적어도 70 %, 바람직하게는 적어도 80 %, 더 바람직하게는 적어도 90 %, 예컨대, 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 % 또는 적어도 99 %, 가장 바람직하게는 100 %는 제2 태양 및 단독 또는 조합에서, 선택적으로 하나 이상의 바람직한 구현예에서 정의된 바와 같은 세포들이다. 상기 세포 집단은 상기 APCDD1 유전자의 발현에 대해 양성이다.

바람직하게는, 상기 집단은 세포들의 분리된 집단이다.

상기 세포 집단은 또한 바람직하게 상기 세포 집단에서 상기 세포들의 부피 및/또는 표면적이 유사하다는 점에서, 또는 대안적으로, 아래에서 상세하게 기술되는 바와 같이, 상기 세포들의 높은 퍼센트가 작은 부피 및/또는 표면적을 갖는다는 점에서 특징지어진다. 상기 부피는 일반적으로 유세포측정에 의해 측정할 수 있는 전방 산란광(forward scattered light, FSC)에 서로 관련되어 있다.

바람직하게, 상기 세포 집단은 또한 상기 세포들의 적어도 70 %(세포 수에서) 이상이 생존 가능하다는 점에서 특징지어진다. 이것은 생존 가능한 세포들의 퍼센트가 낮은 선행 기술을 넘어 충분한 이점을 나타낸다. 더 바람직하게는, 상기 세포들의 적어도 75 %(세포 수에서)는 생존 가능하다. 더 바람직하게는, 상기 세포들의 적어도 80 %(세포 수에서)는 생존 가능하다. 일 구현예에서, 생존능력은 상기 세포들의 분리 후 즉시, 즉, 증식 이전에 측정된다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포 집단은 임의의 혈관 주위 세포를 포함하지 않는다. 혈관 주위 세포들에 대한 마커(marker)는 3G5이다. 그러므로, 이 구현예는 상기 세포 집단이 상기 마커 3G5를 발현하는 임의의 세포 및/또는 이의 표면에 3G5를 표시하는 임의의 세포를 포함하지 않는다는 점에서 대안적으로 기술될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포 집단은 임의의 상피 세포를 포함하지 않는다. 상피 세포들에 대한 마커는 상피세포부착분자(Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)이다. 그러므로, 이 구현예는 상기 세포 집단이 상기 마커 EpCAM을 발현하는 임의의 세포 및/또는 이의 표면에 EpCAM을 표시하는 임의의 세포를 포함하지 않는다는 점에서 대안적으로 기술될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포 집단은 임의의 내피 세포를 포함하지 않는다. 내피 세포들에 대한 마커는 CD31이다. 그러므로, 이 구현예는 상기 세포 집단이 상기 마커 CD31을 발현하는 임의의 세포 및/또는 이의 표면에 CD31을 표시하는 임의의 세포를 포함하지 않는다는 점에서 대안적으로 기술될 수 있다.

바람직하게 상기 세포 집단은, 특히 단계 (c), 즉 증식 단계가 포함될 때, 본 발명의 제1 태양에 따른 방법에 의해 얻을 수 있다.

대안적으로, 본 발명에 따른 상기 세포 집단은 따라서 단계 (c)를 포함하는, 본 발명의 제 1태양에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포 집단으로 기술될 수 있다.

도 1.
(인간) 탯줄의 단면도 및 상기 (인간) 탯줄의 섹션들의 모식도(해부학적 영역). 외부에서 두개의 회색으로 음영된 타원형 모양(1a 및 1b)은 함께 탯줄 라이닝 막(lining membrane)을 형성(두 층을 포함: 1a (외부에 어두운 회색 원으로 그림), 양막(또는 상피) 층, 또한 탯줄 라이닝 막으로 불림; 및 1b(내부에 밝은 회색 원으로 그림): 양막 아래(또는 중간엽) 층; 2: 탯줄 정맥; 3: 탯줄 동맥; 4: 혈관 간 영역; 5: 혈관 주위 영역(회색으로 나타냄); 6: 와튼 젤리의 위치의 설명적인 예시; 7: 탯줄 혈액(혈관의 루멘에). 달리 분명하게 기재되지 않는다면, 상기 양막 아래 기질(1b)은 본 명세서에서 일컬어지는 “기질”에 포함된다. 달리 분명하게 기재되지 않는다면, 상기 양막 아래 와튼 젤리는 본 명세서에서 “기질 와튼 젤리”로 일컬어지는 와튼 젤리에 포함된다.
도 2: 인간 탯줄의 상이한 영역들의 면역조직화학적 특성. WJ: 와튼 젤리; MW: 다수 층의 벽; PV: 혈관 주위; V: 혈관; L: 루멘. 기질 WJ: 양막 상피의 내부 및 상기 탯줄 혈관의 외부 벽으로부터 적어도 3 mm의 거리에 WJ.

: WJ + 혈관주위세포 + 내피 세포들을 포함하는 약 2.00 mm의 혈관 주위 영역.
물질 및 방법: 인간 탯줄 표본은 포르말린 고정되었고 파라핀 포매(embed)하였다. 섹션들은 분리되었고 추가적인 염색을 위해 5 μm의 섹션들로 잘렸다. 상기 기질 와튼 젤리 및 상기 혈관 주위 영역을 나타내는 상이한 영역에서 특유한 염색이 관찰된다. 상기 혈관 주위 영역은 WJ 영역 경계를 이루면서, 혈관(V), 혈관 주위 세포(PV)를 가진 더 복잡한 조직형태학적(histo-morphological) 패턴을 가진다. 상기 복잡성은 또한 상기 혈관 주위 영역에서 나타난 상이한 세포 타입과 연관된다. 대조적으로, 상기 기질 와튼 젤리는 상기 기질 조직의 매트릭스로 분산된 더 동질적인 세포 요소들을 가진 상대적으로 더 균일한 영역으로 조직학적으로 나타난다. 분리된 세포들은 엑스 비보에 MSC 집단들에서 공통적으로 발견되는 마커들, 예컨대 CD10, CD140b, GD2, CD73(상기 도면에 미도시)을 발현한다. 이러한 마커들에 대한 상기 면역조직화학적인 염색 패턴은 또한 두 영역 사이에서 상이하다. 도 2B에서, 조직학적 차이는 상기 탯줄 혈관 영역 및 상기 기질 와튼 젤리 사이에서 더 명백하다. 상기 혈관(V)에서, 내피 층(CD31) 및 하위 내피 층(CD146, CD271, GD2)을 나타내는, 상기 루멘(L) 및 상기 세포들(화살표)은 분명히 명백하다. CD140b는 또한 상기 혈관의 관내(endoluminal) 부분에 발현되는 것으로 발견된다. CD73 양성 염색은 상기 와튼 젤리의 상기 매트릭스로 가는 동안 증가하는 강도를 가지고, 하위 내피 층에서 발견된다(Rasini et al., 2013, Cytotherapy, vol. 15, p. 292-306).
도 3: 세포들의 해부(분절) 및 추출 - 세부사항을 위해 실시예 1 참조.
도 4: 본 발명의 상기 방법이 상당히 높은 생존능력에 대한 원인이 된다는 것을 증명하는, 실시예 4의 결과들. 세부사항을 위해 실시예 4 참조.
* PVWJ: 관습적인 방법에 따라 얻어진 세포들, 비교 실시예 참조. SWJ: 본 발명에 따라 분리된 세포들.
A: 사멸 세포들: 혈소판 용해물의 효과 및 관습적인 방법과 비교. 갓 분리된 세포들의 수에 관해, 본 발명자들은 본 발명에 따른 프로토콜로부터(1.49±0.35 x10⁶)보다, 비교 실시예 1에 따른 프로토콜로부터 더 많은 세포들(PVWJ)(4.15±1.28 x10⁶)을 얻었다. 상기 그래프는 세가지의 소화들(n=3)에서 사멸 세포들의 평균 및 상기 평균의 표준 오차(SEM)을 나타낸다. 비교 실시예 1에 따른 총 분리된 PVWJ로부터 유래된 세포들의 30.6 % ± 9.6 %는 7AAD에 양성적이었다(도 4A, 우측에 더 음영된 막대). 대조적으로, 7AAD에 대해 양성인 SWJ로부터 유래된 세포들의 퍼센트는, hPL 존재 및 부존재에서 모두 더 훨씬 낮다. 따라서, 본 발명자들은 본 발명에 따라 얻어진 세포들이 최신 기술에 따른 방법에 의해 얻어진 세포들보다 더 높은 수준의 생존능력을 가진다는 것을 발견했다.
B: 갓 분리된 세포 샘플들의 FACS 분석. 상기 4 개의 FACS 플롯들은 SWJ로부터 유래된 세포(위) PVWJ로부터 유래된 세포들(아래)의 각각의 물리적 파라미터들(우측) 및 상기 7AAD 양성(즉, 세포사멸, 좌측)을 나타낸다. 우측에 그래프에서, 살아있는 세포들은 수직 선의 좌측에서 발견된다.
C: 유세포측정에 의해 측정된 바와 같은(도 4B), 총 세포 수의 그래픽 표현. 상기 그래프는 3 개의 소화들(두 세포 집단 모두에 대해 n=3)에서 사멸 세포의 평균 및 상기 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
D: 유세포측정에 의해 측정된 바와 같은(도 4B), 사멸세포의 퍼센트의 그래프의 표현. 갓 분리된 샘플들의 상기 FACS 분석은 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들에 대해 총 세포 집단의 79 %보다 더 큰 생존능력을 나타냈다. 대조적으로, 비교 실시예 1(PVWJ로부터 유래된 세포들)에 따라 분리된 총 세포들의 52.9 % ± 2.6 %는 7AAD에 대해 양성적이었다. C: SWJ(n=5) 및 PVWJ(n=9) 샘플들에서 세포 분리 효율 D: 상기 그래프는 3 개의 소화들(두 세포 집단 모두에 대해 n=3)에서 사멸 세포들의 평균 및 상기 평균의 표준 오차(SEM)를 나타낸다.
도 5: 형태 및 콜로니 형성
A: 유세포측정, 즉 탯줄로부터 갓 분리된 세포들의 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)에 의해 측정된 물리적인 파라미터들이 나타난다(좌측 FACS 플롯). 상기 그래프는 물리적인 파라미터들의 평균 및 SEM을 나타낸다. 분리된 상기 SWJ로부터 유래된 세포 집단(실시예 1 및 2A에 따름)은 분리된 상기 PVWJ로부터 유래된 세포 집단(비교 실시예 1 및 2A에 따라; T-테스트에 의해 p=0.02)보다 상당히 더 작은 FSC 수치에 의해 특징지어진다. SSC: SWJ로부터 유래된 세포들은 PVWJ로부터의 세포들보다 더 낮은 세포질의 복잡성을 가진다. 세부사항을 위해 실시예 4A 참조.
B: 배양 계대 1(n=3)에서의 형태학적 연구. 증식 후, 상기 SWJ로부터 유래된 세포들(실시예 2C)은 PVWJ로부터 유래된 세포들(비교 2C에 따름)이 큰 형태 및 돌출된 세포골격에 의해 특징지어지는 대신에, 작고 스핀들 모양 세포 집단에 의해 특징지어졌다. 상기 두 사진은 대표 샘플(원래 배율 100X)에서 배양 계대 1(P1)에 시딩 후 2- 또는 3일차에 SWJ로부터 유래된 세포들(좌측) 대 PVWJ로부터 유래된 세포들(우측)의 형태를 나타낸다.
C: 상기 SWJ로부터 유래된 세포들 및 PVWJ로부터 유래된 세포들의 콜로니 형성. 세부사항을 위해 실시예 4C 참조. 세포들은 아래에 나타난 사진을 찍기 전에, 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. SWJ로부터 유래된 세포 집단들의 배양은 작은 표면적을 가진 세포들로 구성되는 것에 의해 특징지어진다; 이러한 세포들은 콜로니를 짓는 경향을 가지는 반면, PVWJ로부터 유래된 세포 집단들의 배양은 상이한 표면적을 가진 세포들로 구성되는 것, 또한 큰 세포들을 포함하는 것에 의해 특징지어진다. 따라서, 상기 PVWJ로부터 유래된 세포들은 더 동질적으로 나타난다; 이 문맥에서 동질성은 실질적으로 모든 세포들이 많이 비슷하거나 유사한 것으로 나타난다는 것을 의미한다. 상기 더 큰 PVWJ로부터 유래된 세포들은 상대적으로 느리게 성장하는 경향이 있다(데이터는 미도시).
도 6: 세포 표면적의 정량적인 측정: SWJ로부터 유래된 세포들 대 골수로부터 유래된 중간엽 기질세포들(BM, 또는 BM-MSC). 골수로부터 및 기질 와튼 젤리로부터(BM 및 SWJ 각각) 플라스틱에 부착된 MSC는 배양 계대 5(P5)에 시각화되었다. 각 샘플에 대한 다섯개의 사진들은 획득되었고 34 BM-MSC 및 33 SWJ 세포들은 광학적으로 확인되었다. 상기 세포들은 육안 검사에서 수동으로 그래픽적으로 둘러싸였다. 상기 BM으로부터 유래된 세포들은 SWJ로부터 유래된 세포들(1701.2±1137.3 μm²)(p = 5.15X10^-7, ANOVA에 의함)과 비교되면 더 큰 평균 세포 표면적(4300.5 ± 2486.5 μm²)에 의해 특징지어졌다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 SWJ로부터 유래된 MSC들이 상기 BM으로부터 유래된 MSC들보다 더 작다고 결론지어졌다.
도 7: 실시예 7의 결과. 좌측에 상기 그래프는 둘 모두 두가지 상이한 분리 방법들에 의해 세가지의 탯줄로부터 갓 분리된(SWJ: 실시예 1 및 2A에 따름; PVWJ: 비교 실시예 1 및 2A에 따름), PVWJ로부터 유래된 세포들 및 SWJ로부터 유래된 세포들에 표면 마커들의 평균 및 SEM을 나타낸다. 갓 분리된 샘플들의 면역 표현형 분석은 MSC의 통상적인 표면 항원 표시인 CD105, CD73 및 CD90의 두가지 모든 방법들 표시에 대해 밝혀졌다. 유사하게, 혈소판으로부터 유래된 성장 인자 수용체 β(CD140b)의 표시는 두가지 모든 방법들 후에 탐지되었다. 상기 HLA-DR은 두가지 모든 샘플들에서 발현되지 않았다. 그러나, 3G5의 표시는 본 발명의 상기 방법이 혈관 주위 세포들을 포함하지 않는, SWJ로부터 유래된 MSC들의 집단의 분리에 특별히 적절하다는 것을 가리키면서, PVWJ로부터 유래된 세포들의 집단에서만 탐지되었다.
A: 좌측에 그래프는 두가지 상이한 소화 방법들(비교 실시예 1, "PVWJ" 대 본 발명에 따른 세포들, SWJ)에 의해 처리된 세가지 탯줄로부터 갓 분리된 PVWJ 및 SPPC에 표면 마커들의 평균 및 SEM을 나타낸다. 우측에 패널은 세포들의 대다수에서 발현되는/발현되지 않는 일부 표면 마커들을 나타낸다.
B: 그래프는 두가지 상이한 방법들(비교 실시예 1, "PVWJ" 대 본 발명에 따른 세포들, SWJ)에 의해 탯줄로부터 갓 분리된 세포들에서 특이적인 표면 마커들을 표시하는 세포들의 평균 퍼센트를 나타낸다.
도 8: Real-Time-PCR (RT-PCR)에 의해 측정된 바와 같이 본 발명에 따른 세포들의 정량적 유전자 발현. 본 발명에 따라 분리된 두가지 독립적인 세포 집단들은 RT-PCR에 적용 되었다; 둘 모두는 도 8에 나타나고 대조 PVWJ 세포들과 비교된다. 상기 그래프는 두가지 유전자들(관심 유전자 대 베타-액틴, 하우스키핑 유전자) 사이에 발현(Delta Ct)의 차이를 보여준다.
APCDD1 발현은 대조 세포에서 탐지되지 않았다.
도 9: 증식 잠재력: 상기 그래프는 분석된 네가지 배양 계대(P1 내지 P4)에서 PVWJ로부터 유래된 세포들(n=9) 및 SWJ로부터 유래된 세포들(n=7)의 누적 집단 배가의 평균 및 SEM(상기 평균의 표준 오차)을 나타낸다. 계대 당 집단 배가(PD)의 더 큰 수는 PVWJ로부터 유래된 세포들과 비교되어, 상기 SWJ로부터 유래된 세포들에서 관찰되었다. 세부사항을 위해 실시예 9 참조.
도 10: 상이한 많은 SWJ로부터 유래된 세포들에서의 텔로머라제 발현. 세부사항을 위해 실시예 10 참조.
도 11: 상이한 많은 SWJ로부터 유래된 세포들에서의 노화. CAKE2는 MSCBM CD에 실질적으로 동등한 기초 배지에 대한 두문자어(acronym)이다; 5PL은 5 %(vol./vol.)의 인간 혈소판 용해물에 대한 두문자어이다. 세부사항을 위해 실시예 11 참조.
도 12: WJ로부터 유래된 세포 집단들의 뼈형성 잠재력. 막대들의 중단은 스케일의 변화를 나타낸다. CAKE2는 MSCBM CD에 실질적으로 동등한 기초 배지에 대한 두문자어(acronym)이다; 5PL은 5 %(vol./vol.)의 인간 혈소판 용해물에 대한 두문자어이다. 세부사항을 위해 실시예 12 참조.
도 13: WJ로부터 유래된 세포 집단들의 지방생성 잠재력. 세부사항을 위해 실시예 13 참조. 상기 SWJ로부터 유래된 세포들은 지방 분화 결정(commitment)을 확인하면서, 상기 세포 내부에 둥근 지질 방울을 생성했다(우측 상하 패널). 지질 액포는 유도된 샘플들에서 크게 탐지된 반면에, 유도되지 않은 대조에서 부재하였다. CAKE2는 MSCBM CD에 실질적으로 동등한 기초 배지에 대한 두문자어(acronym)이다; 5PL은 5 %(vol./vol.)의 인간 혈소판 용해물에 대한 두문자어이다.
도 14: SWJ로부터 유래된 세포 집단들의 연골형성 분화. 세부사항을 위해 실시예 14 참조. 처리의 21일 후, 유도되지 않은 SWJ로부터 유래된 세포들(대조)은 다수의 층의 매트릭스가 풍부한 형태(좌측 두가지 패널)를 발달시켰다. 상기 유도된 SWJ로부터 유래된 세포들(우측 두가지 패널)은 더 낮은 세포충실성 및 세포 외 매트릭스 내에 글리코사미노글리칸(원래 색의 이미지에 강한 파란 염색에 대응하는, 어두운 색의 영역)을 보여준다. CAKE2는 MSCBM CD에 실질적으로 동등한 기초 배지에 대한 두문자어이다; 5PL은 5 %(vol./vol.)의 인간 혈소판 용해물에 대한 두문자어이다.

발명의 상세한 설명

다음의 상세한 설명은 본 발명의 개개의 특징들의 구체적 및/또는 바람직한 변형을 개시한다. 본 발명은 또한 본 발명의 둘 이상의 특징들에 대해 기술되는 둘 이상의 구체적 및/또는 바람직한 변형을 결합함으로써 생성되는 구현예들을, 특히 바람직한 구현예들로 고려한다.

이 기술 분야에 통상의 기술을 가진 사람은 본 명세서에서 개시된 본 발명이 구체적으로 기술된 것 이외에 변화 및 수정하기 용이하다고 이해할 것이다. 따라서, 본 개시가 모든 그런 변화 및 수정을 포함한다는 것은 이 기술 분야에 통상의 기술을 가진 사람에게 분명할 것이다. 본 개시는 또한 본 명세서에서 일컬어지거나 지시된 모든 실체(entity)들, 화합물들, 특징들, 단계들, 방법들, 또는 조성물들, 개별적으로 또는 집합적으로, 및 임의 및 모든 조합 또는 임의의 둘 이상의 상기 실체들, 화합물들, 특징들, 단계들, 방법들, 또는 조성물들을 포함한다. 따라서, 본 명세서에서 달리 구체적으로 기재되지 않거나 달리 문맥상 요구하지 않는다면, 단일의 실체, 화합물, 특징, 단계, 방법 또는 조성물에 대한 언급은 그런 실체들, 화합물들, 특징들, 단계들, 방법들, 또는 조성물들의 단수 및 복수(즉, 하나 이상, 예컨대 둘 이상, 셋 이상, 또는 전부)를 아우르는 것으로 받아들여질 것이다.

본 개시는 설명 및 예시의 목적을 위해 본 명세서에서 제공되는, 본 명세서에서 기술된 구체적인 구현예들에 의해 범위가 제한되지 않는다. 기능적으로 또는 그 외 동등한 실체들, 화합물들, 특징들, 단계들, 방법들, 또는 조성물들은 본 개시의 범위 내에 있다.

본 명세서에서 인용된 문서의 각각(모든 특허들, 특허 출원들, 과학 간행물들, 제조업체의 사양들, 설명들, 프레젠테이션들 등 포함)은, 아래 또는 위에서, 그것의 전문에서 참조로 본 명세서에서 통합된다. 본 명세서의 어떤 것도, 본 발명이 특정 교시를 앞서는 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석될 수 없다.

본 문서는 기꺼이 이해하려는 마음 및 이로부터 기술적 의미를 만들기 위한 가장 객관적인 의도를 가지고 읽혀져야 한다. 본 명세서에서 사용되는 모든 용어들은, 명백한 정의 또는 그 외에 의해 이 문서가 하나 이상의 단어들에 특별한 의미를 제공하는 경우가 아니라면, 그들이 일반적으로 관련된 기술 분야에서 가지는 의미 및 범위를 상기 단어에 제공하는 것으로 읽혀져야 한다. 본 명세서에서 제공되는 정의들이 부분적으로 또는 완전히 몇몇 또는 모든 문헌에서의 정의로부터 벗어나야 하는 경우에, 본 명세서의 정의들이 우선시 될 것이다.

달리 구체적으로 기재되지 않거나 문맥상 달리 요구하지 않으면, 본 명세서에서 개시된 각 구현예, 태양 및 실시예는 본 명세서에서 개시된 임의의 다른 구현예, 태양 또는 실시예들에 적용될 수 있고 조합할 수 있는 것으로 받아들여질 것이다.

달리 구체적으로 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 이 기술분야에 통상의 기술을 가진 사람에 의해 공통적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 가진다(예컨대, 유전학, 분자 생물학, 유전자 발현, 세포 생물학, 세포 배양, 줄기세포, 기질세포, 신생아학(neonatology), 재생 의학(regenerative medicine), 해부학, 조직학(histology), 면역학(immunology), 면역조직화학(immunohistochemistry), 단백질 화학, 및 생화학). 예컨대 영어로 발행된 교과서들 및 리뷰 기사들은 이 기술 분야에 통상의 기술을 가진 사람에 의해 공통적으로 이해되는 것과 같은 의미로 통상적으로 정의한다.

표현 “및/또는”, 예컨대, “X 및/또는 Y”는 “X 및 Y” 또는 “X 또는 Y”을 의미하는 것으로 이해될 것이고 “및”, “또는”, 및 둘의 의미들(“및” 또는 “또는”)의 명백한 개시를 제공하는 것으로 받아들여질 것이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 명시되지 않으면, 상기 용어들 “약(about)”, “약(ca.)”, 및 “대체로(substantially)”는 모두 대략 또는 대부분을 의미하고, 본 명세서에서 제시한 수치 값 또는 범위의 문맥상 인용 또는 청구되는 수치 값 또는 범위 주위에, 바람직하게 +/- 10%, 더 바람직하게 +/- 5%를 지정하는 것을 의미한다. “대체로 없다”, “대체로 결여된다” 등 같은 용어들은, 세포의 특성에 관해서, 각각의 특성들이 최신 기술에 따른 각각의 영역에서 일반적으로 사용되는, 분석적인 방법으로 세포에서 탐지될 수 없는 것 및/또는 이처럼 기술된 집단의 대체로 모든 세포들이 각각의 특징을 갖지 않는다는 것을 의미한다.

달리 분명히 명시되지 않는다면, 단어 “포함하다(comprise)”, 또는 변형, 예컨대 “포함하다(comprises)” 또는 “포함하는(comprising)”은 추가적인 구성들이 “포함하는”에 의해 소개되는 리스트의 구성들 외에 선택적으로 존재할 수 있다는 것을 가리키기 위해 본 문서의 문맥에서 사용되었다. 그러나, 용어 “포함하는”이 추가적인 구성들이 존재하지 않을 가능성을 아우른다는 것, 즉 이 구현예의 목적을 위해 “포함하는”이 “구성되는(consisting of)”의 의미를 갖는 것으로 이해되는 것이 본 발명의 구체적인 구현예로 고려된다.

달리 분명히 명시되지 않는다면, 본 발명과 관련된 상대적인 양의 모든 지시들은 중량/중량 기초에서 만들어진다. 상기 포괄적인 용어에 의해 특징지어지는 구성의 상대적인 양의 지시들은 포괄적인 용어에 포함되는 모든 구체적인 변화 또는 상기 구성들의 총량을 가리키는 것을 의미한다. 만약 포괄적인 용어에 의해 정의된 특정 구성이 특정한 상대적인 양에서 존재하는 것으로 명시된다면, 그리고 만약 이 구성이 또한 포괄적인 용어에 포함되는 구체적인 변형 또는 구성이 될 것으로 특징지어진다면, 포괄적인 용어에 포함되는 구성들의 총 상대적인 양이 명시된 상대적인 양을 초과하도록 포괄적인 용어에 포함되는 다른 변형 또는 구성들이 추가적으로 존재하지 않는다는 것; 더 바람직하게는 포괄적인 용어에 포함되는 다른 변형들 또는 구성들이 전혀 존재하지 않는다는 의미이다.

용어 “동종이계(allogeneic)”는 본 명세서에서 동일한 종들의 상이한 개체로부터 유래된 것을 기술하기 위해 사용된다. 둘 이상의 개체들은 하나 이상의 유전자 자리들(loci)에서 유전자들이 동일하지 않을 때, 서로 동종이계로 불린다.

용어 “면적(area)” 또는 “표면적(surface area)” 또는 “세포 표면적(cellular surface area)”은, 세포와 관련하여, 위로부터 보여지는 바와 같은 상기 세포의 표면적을 가리킨다. 본 개시의 문맥상, 상기 세포가 부착 배양에 있는, 즉, 상기 세포가 배양 플레이트에 부착하는 동안, 세포의 2차원 표면적은 측정된다. 상기 세포들은 낮은 컨플루언스(confluence)에서 접촉 억제(contact inhibition)에 의해 서로 중요하게 억제하지 않는다고 믿어지기 때문에, 측정의 재현성(reproducibility)을 위해 세포들이 낮은 컨플루언스 상태에 있는 것이 이점이 있다고 간주된다. 상기 표면적의 측정을 위한 방법들은 본 명세서에서 아래에 지시된다.

표현 “평균 표면적(average surface area)” 및 “평균 면적(average area)”은 둘 이상의 개개의 세포들의 상기 표면적들의 평균을 가리키고, 여기서 제1 단계에서 처음 각 개개의 세포의 면적은 위에 기술된 바와 같이 측정되고, 그 후 다음의 제2 단계에서 상기 평균 면적은 제1 단계에서 측정된 바와 같이, 개개의 세포들의 면적의 산술 평균(arithmetic mean)으로 결정된다. 통상적으로 적어도 35 개 세포들이 상기 평균 면적의 측정을 위해 제1 및 제2 단계에 적용되고; 다시 말해서, 평균은 적어도 35 개 세포들의 평균을 나타낸다.

용어 “자기유래(autologous, 자가유래)”는 본 명세서에서 동일한 대상으로부터 유래된 것을 기술하기 위해 사용된다. 일 예로서, “자기유래 세포(autologous cell)”는 동일한 대상으로부터 유래된 세포를 가리킨다. 그렇지 않으면 거부를 야기하는 면역 장벽을 극복하기 때문에, 자기유래 세포의 이식은 때때로 이점이 있다. 세포는 막 내에 둘러싸인 세포질(cytoplasm)으로 구성된 생물학적 실체이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “세포”는 바람직하게 진핵세포(eukaryotic cell)를 가리킨다. 용어 “세포”는 줄기세포 또는 줄기세포 특성들이 결여된 세포들, 예컨대 최종 분화 세포 또는 심지어 죽은 세포를 가리킬 수 있다. 통상적으로 상기 세포는 다세포 유기체 또는 이의 부분으로부터 기원하는 세포이다. 바람직하게, 상기 세포는 상기 다세포 유기체로부터 분리되며, 즉 그것이 기원하는 다세포 유기체로부터 물리적으로 연결되지 않고/또는 영양적으로 독립적이다. 기질세포는 본 발명에 따라 바람직한 세포이다.

용어 “세포 집단(cell population)” 및 “세포들의 집단(population of cells)”은 복수의 세포들의 총체(ensemble)를 상호 교환가능하게 가리킨다. 가장 좁은 구현예에서, 세포 집단은 두 개의 세포들을 포함하지만, 더 통상적으로 다수의 세포들을 포함한다. 상기 용어는 근본적으로 동일한 세포들의 두 집단들 모두, 예컨대 단일 클론원성 세포(clonogenic cell)로부터 기원하는 세포 집단들, 뿐만 아니라 이질적인 세포 집단, 즉 이질적인 기원을 가지는 및/또는 적어도 하나의 기능적 또는 구조적 특성에서 서로 다른 세포들을 아우른다. 용어는 현탁 세포들만의 집단들, 부착 세포들만의 집단들 및 현탁 및 부착 세포들의 혼합된 집단들을 아우른다. 세포 집단은 줄기 세포들 및 줄기 세포 특성들이 결여된 세포들을 포함할 수 있다. 상호 배타적이지 않지만 다른 예에서, 세포 집단은 살아있는 세포들 및 죽은 세포들 모두를 포함한다.

문맥상 달리 지시하지 않는다면, “CD”는, 통상적으로 숫자와 함께 사용되어(예컨대, “CD34”), 본 명세서에서 “분화 무리(Cluster of Differentiation)”를 의미한다.

용어 “클론원성(clonogenic)”은 증식하기 위한 세포의 능력을 가리키고, 이에 의해 다수의 딸 세포들을 생기게 하고, 이는 일반적으로 유전자형적으로 동일하다. “클론원성” 세포는 또한 “콜로니 형성 유닛(Colony Forming Unit)” 또는 “CFU”로 일컬어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “콜라겐 분해효소(collagenase)”는 콜라겐에서 펩타이드 결합들을 깰 수 있는 효소(E.C. 3.4.24.7)를 가리킨다. 일반적으로, 콜라겐 분해효소는 세포 외 구조들을 파괴하는 것을 도울 수 있다. 달리 명시되지 않는다면, 상기 용어는 상기 콜라겐 분해효소의 타입 또는 기원에서 임의의 구체적인 제한을 암시하지 않는다. 상기 콜라겐 분해효소는 재조합체이거나 이의 자연적 근원으로부터 올 수 있다. E.C. 3.4.24.7 이외에도, 많은 상업적으로 이용가능한 콜라겐 분해효소들은 다른 효소적 활성들을 포함한다. 그러한 상업적으로 이용가능한 콜라겐 분해효소들은 본 발명의 문맥상 적절하다(실시예 참고).

본 명세서에서 사용된 표현 “컨플루언스(confluence)”는 세포, 통상적으로 부착 세포들에 의해 덮인 배양 용기의 바닥 표면의 비율을 기술하기 위해 사용된다. 컨플루언스는 통상적으로 “% 컨플루언스”로 표시된다.

표현 “% 컨플루언스(% confluence)” 또는 “컨플루언스 퍼센트”는 세포들, 통상적으로 부착 세포에 의해 덮인 배양 접시의 바닥 표면의 퍼센트, 즉 배양 접시의 바닥 표면에 상대적인 세포의 총 면적의 총합을 가리킨다. 예컨대, 50 퍼센트 컨플루언스는 대체로 상기 표면의 절반이 덮여지고 여전히 세포들이 성장할 공간이 있다는 것을 의미한다. 100 퍼센트 컨플루언스는 상기 세포들에 의해 상기 표면이 완전하게 덮여지고, 세포들이 단층으로 성장하기 위한 공간이 남아있지 않다는 것을 의미한다. 본 발명의 문맥상, 세포들은 그들의 증식하는 표현형을 최적으로 유지하기 위해서, 통상적으로 100 퍼센트 컨플루언스에 도달하기 전에 계대배양된다(passage).

표현 “낮은 컨플루언스(low confluence)”는 50 % 이하, 통상적으로 10 내지 50 %의 컨플루언스 퍼센트를 의미한다. 표현 “하위 컨플루언트(sub-confluent)” 및 “하위 컨플루언스(sub-confluence)”는 50 % 이상이지만 80 % 이상이 아닌 컨플루언스 퍼센트를 의미한다.

용어 “배양 용기(culture vessel)” 또는 “세포 배양 용기(cell culture vessel)”는 포유류 세포들의 배양에 적합한 용기를 일반적으로 가리킨다. 통상적인 배양 용기들은 플라스크, 플레이트 및 스택(stack)이다(스택은 통상적으로 서로의 위에 쌓인 다수의 플레이트들로 구성된다). 본 발명의 문맥에서 특히 적합한 배양 용기들은 상기 배양 용기의 바닥에서 세포의 부착을 허용하는 배양 용기이고; 그러한 용기들은 편평한 바닥 표면을 가진 플라스크들, 플레이트들 및 스택들이다.

배양 용기에 관해서, 용어 “표면(surface)” 또는 “바닥 표면(ground surface)”은 상호 교환가능하게 상기 배양 용기의 내부의 바닥 표면, 즉 부착 특성을 가진 세포들이 그 배양 용기에서 성장하는 동안 일반적으로 부착하게 되는 표면을 가리키는 것으로 의도된다. 일반적으로, 상기 표면은 배양 용기의 내부 바닥에 있고 상기 배양 용기의 측면 벽에 의해서만 한정된다.

달리 문맥상 지시하지 않는다면, 용어 “밀도(density)” 또는 “세포 밀도(cell density)”는 2차원 면적당 세포들의 수, 예컨대 특히 cm²당, 통상적으로 상기 세포 배양 용기의 cm² 바닥 표면당 세포들의 수를 가리킨다. 통상적으로, 상기 용어는 상기 배양 용기에서, 예컨대 특정 계대(passage)의 시작에서 얼마나 많은 세포들이 시딩(seed)되는지 기술하기 위해 사용된다. 상기 배양 용기의 총 바닥 표면 및 그 배양 용기에서 시딩된 세포들의 총 수는 그 후 상기 계대의 시작에서 상기 배양 용기의 cm²당 세포 밀도를 정의한다. 실제로, 계대 (Ⅰ)의 시작에 접종물(inoculum)로 사용되는 상기 세포 수는 상기 계대의 시작 전에 세포 카운팅에 의해 적절하게 측정되고; I는 따라서 세포 밀도 및 배양 접시의 바닥 표면의 함수이다. 달리 명시적으로 기재되지 않는다면, “세포 밀도”는 상기 배양 용기의 전체 바닥 표면에 대한 평균 세포 밀도를 가리킨다; 그럼에도 불구하고, 상기 세포들이 상기 배양 용기의 전체 바닥 표면 도처에 고르게 분포되었다는 것이 본 발명에서 바람직하다.

용어 “직경(diameter)” 또는 “세포 직경(cell diameter)”은, 세포에 관해서, 위로부터 보여지는 바와 같이 상기 세포의 가장 긴 직경을 가리킨다. 본 문서의 문맥상, 상기 세포의 직경은 세포가 부착 배양에 있는, 즉 상기 세포가 배양 플레이트에 부착된 동안에 측정된다. 세포들이 하위 컨플루언스 상태에 있는 것은 중요하다. 하위 컨플루언스는 하위 컨플루언트 세포가 접촉 억제에 의해 서로를 대체로 억제하지 않는다고 믿어지기 때문에, 측정의 재현성(reproducibility)에 대해 이점이 있다고 고려된다. 직경의 측정을 위해, 하나 이상의 세포들이 통상적으로 현미경을 가지고, 상기 세포 또는 세포들이 부착하는 배양 플레이트의 표면에 수직 치수(예컨대, 90 °)로부터, 사진 찍히거나, 그렇지 않으면 시각적으로 관찰되거나 기록된다. 상기 면적의 경계들은 상기 세포의 그래픽 이미지(예컨대, 사진)에서 수동으로 정의된다. 바람직하게 상기 배양 용기는 상기 그래픽 이미지를 기록하기 전에 교반되지 않는다. 양극 세포(bipolar cell)의 경우에, 상기 직경은 상기 세포의 두 극 사이의 거리이다. 다극, 예컨대, 삼각, 세포들에 대해서, 상기 직경은 서로 가장 멀리 떨어진 세포의 두 극들 사이의 거리이다. 각 경우에, “거리(distance)”는 각각 두 극들 사이에 가장 짧은 직선 연결을 의미한다.

용어 “평균 직경(average diameter)”은 둘 이상의 개개의 세포들의 직경들의 평균을 가리키고, 여기서 제1 단계에서 각 개개의 세포의 상기 직경은 위에 기술된 바와 같이 측정되고, 그 후 다음의 단계에서 상기 평균 직경은 제1 단계에서 측정된 세포 직경의 산술 평균으로 결정된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “증식하다(expand)” 또는 “증식하는(expanding)”은 세포 또는 세포들의 집단의 증식을 일반적으로 가리킨다. 통상적으로, 본 발명의 문맥 내에 증식은 인 비트로 또는 엑스 비보에서 발생한다. 통상적으로, 증식은 세포들의 분리 다음에 오는 활동 또는 과정이다. 통상적으로, 증식 동안에, 세포들의 총 수는 증가한다. 상기 세포 수의 증가는 “누적 집단 배가(들)(cumulative Population Doubling(s))”를 가리킴으로써 또는 “계대수(들)(Passage Number(s))”(“P”)를 가리킴으로써, 또는 각각의 단계에서 세포들의 총 수를 표시 등을 함으로써 기술될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “발현하다(express)”, “발현된(expressed)”, 및 “발현(expression)”, “유전자 발현(gene expression)” 및 이와 같은 것은 기능 유전자 산물의 합성에서 유전자로부터의 정보의 사용에 관한 것이다. 유전자 발현은 적어도 전사를 포함하고, RNA 편집, 번역 및 번역 후 수정을 포함하는 개방된 리스트로부터 선택되는, 하나 이상의 추가적인 특징들을 선택적으로 포함한다. 유전자 발현이 측정될 때, 발현 산물 예컨대 편집되지 않거나 편집된 RNA, 또는 심지어 암호화된 단백질의 존재가 측정된다. 특정 유전자 또는 유전자 자리(locus)와 관련하여 사용되는, 상기 용어들은 그 유전자 또는 유전자 자리로부터 유전적 정보의 발현을 명시할 의도이다; 예컨대, APCDD1이 발현된다고 서술된 때, 상기 APCDD1 유전자가 발현되는 것을 말할 의도이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “추출(extract)하다”는 생물학적 환경으로부터의 분리를 가리킨다. 문맥에 따라, 상기 용어는 “추출하는 것(to extract)”(동사) 또는 추출되는 물리적 실체(예컨대, 이의 자연 환경으로부터 추출에 의해 얻어진 세포 또는 세포 집단)를 의미할 수 있다. 예컨대, 세포들이 상기 탯줄로부터 추출될 때, 상기 세포들은 상기 탯줄에서 이들의 원래 위치로부터 분리되고/또는 탯줄의 다른 해부학적 영역으로부터 분리된다. 바람직하게, 추출된 세포는 살아있는 신체 외부의 세포이고/또는 혈관으로부터 물리적으로 분리되고/또는 동일한 기관 또는 조직의 다른 세포들로부터 물리적으로 분리되고/또는 동일한 기관 또는 조직의 비세포 해부학적 영역으로부터 물리적으로 분리된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “유세포측정(flow cytometry)”은 세포 카운팅(count), 세포 분류(sorting), 세포특성의 분석, 및 바이오마커(biomarker) 탐지(예컨대, 특히, 세포 표면 분자, 예컨대, 분화 무리(CD) 분자들의 탐지)에 적합한 레이저- 또는 임피던스 기반, 생물리학 기술을 가리킨다. 유세포측정은 현탁액에서 세포들을 요구한다; 부착 세포들을 분석하기 위해, 이것들은 그들이 부착하는 기질(substrate) 예컨대 배양 용기로부터 분리될 필요가 있고, 예컨대 트립신 처리(trypsinization)와 같은 효소적 처리에 의해, 이에 의해 그들은 현탁액 내 세포들이 된다. 현탁액 세포들, 즉 유체의 흐름 내 세포들은 전기 탐지 장치(유세포측정 장치)를 통해 통과된다. 예컨대 각 세포의 특정한 광산란에 기초해서, 유세포측정 장치는 세포를 분석한다. 상업적인 유세포측정 장치 예컨대, FACSAria Ⅲ 유세포측정기(flow cytometer)(BD Biosciences)가 사용될 수 있다. 히스토그램(histogram)을 생성하기 위해, 유세포측정기에 의해 생성되는 데이터는 1차원에서, 또는 2차원 점 플롯(plot)에서 또는 심지어 3차원에서 플롯될 수 있다. 플롯은 선택한 스케일, 예컨대 선형 또는 로그 스케일을 사용하여 만들 수 있다. 형광 강도에 기초하여, “게이트”로 불리는, 일련의 아집단(subset) 추출을 생성함으로써, 이 플롯 상의 영역들은 순차적으로 분리될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, “형광 활성화 세포 분류(Fluorescence-activated cell sorting)”, 또는 상호 교환가능하게 “FACS”는 유세포측정의 전문화된 타입이다. FACS는 특정한 광산란 및/또는 각 세포의 형광 특성들에 기초하여, 생물학적 세포들의 이종 혼합물을 둘 이상의 집단으로 분류하기 위한 방법이다. FACS를 위한 표지로 사용되는 형광단(fluorophore)의 타입은 특별히 제한되지 않는다; 일부 구현예에서, 형광단은 세포 표면 단백질(예를 들어 세포 표면 분자 예컨대, 특히, 분화 무리(CD) 분자들의 탐지)같은 타겟 특징을 인식하는 항체에 부착된다. 형광단은 세포막 또는 또 다른 세포 구조에 친화성(affinity)을 가지고 대안적으로 화학적 실체에 부착될 수 있다. 각 형광단은 특징적인 피크 여기(excitation) 및 방출 파장을 갖고, 이는 FACS에 적합한 장치에 의해 탐지된다. 상업적인 장치 예컨대 FACSAria Ⅲ 유세포측정기(BD Biosciences)가 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 용어 “이종(heterologous)”은 다수의 다른 요인들로 구성된 것을 기술한다. 예컨대, 한 개인의 세포를 다른 개인으로 전달하는 것은 이종 이식을 구성한다. 이종 유전자는 대상 이외의 근원으로부터 유래된 유전자이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “불멸의(immortal)” 및 “불멸(immortality)”는 헤이플릭 한계(Hayflick limit)(헤이플릭 한계는 세포가 DNA 손상 또는 짧아진 텔로미어 때문에 더 이상 분열할 수 없는 지점이다)에 있지 않고 분열할 수 있는 세포를 지정한다. 불사의 세포들은 통상적으로 텔로미어 연장 효소인 텔로머라제를 발현하지만, 이것은 엄격한 요건은 아니다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “접종물(inoculum)”은 제공되는 배양 용기에서 제공되는 세포 배양(계대)가 개시되는 세포의 총 수를 가리킨다.

“분리된(isolated)”은 그것의 본래 상태에서 일반적으로 수반하는 구성이 실질적으로 또는 근본적으로 없는 물질을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 예컨대, “분리된 세포(isolated cell)”는 자연적으로 발생하는 상태에서 그것을 둘러싸는, 세포 내 및 세포 외 환경, 예컨대 조직으로부터 정제된 세포, 예컨대, 상기 세포에 일반적으로 인접한 탯줄 조직으로부터 제거된 중간엽 기질 세포를 가리킨다. 대안적인 기술에서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 “분리된 세포” 또는 이와 같은 것은 인 비트로에서 분리 및/또는 그것의 자연적 세포 환경으로부터, 및 상기 세포가 일반적으로 존재하는 상기 조직의 다른 구성들과의 연관으로부터 세포의 정제를 가리킨다. 달리 문맥상 지시하지 않는다면, “분리된 세포”는 필수적으로 임의의 다른 세포들이 없는 단일 세포일 필요가 없으며; 대조적으로, 심지어 둘 이상의 세포들의 집단, 예컨대 다수의 세포들도 상기 세포들의 집단이 이의 본래 상태에서 그런 세포들의 집단을 일반적으로 수반하는 구성들이 실질적으로 또는 근본적으로 없다는 의미에서 분리될 때, “분리된”으로 일컬어질 수 있다. 예컨대, 중간엽 기질 세포들의 집단은 그것이 원래 조직, 예컨대 탯줄로부터 제거된 때, “분리된”으로 일컬어질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단어 “분리된”의 이러한 정의에 따르면, 단어 “분리하다”는 “분리된” 물질 예컨대, 분리된 세포를 얻기 위한 활동을 기술하는 동사이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “계통-분화(lineage-committed)”는 유사 분열(mitotic division)할 수 있지만, 통상적으로 제한되지 않는 수의 유사분열을 할 수 없는 자손(progeny) 세포를 가리킨다. 결국, 계통-분화 세포의 상기 자손은 분화하도록 결정된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, “배지(medium)”는 세포의 배양, 특히 포유류 세포의 배양에 적합한 수용성의 혼합물을 가리킨다. 수용성의 혼합물은 현탁액 및 콜로이드 혼합물이 또한 포함됨에도 불구하고, 통상적으로 용액이다. 상기 배지는 통상적으로 액체이지만, 몇몇의 배지는 예컨대, 보관 목적으로 일시적으로 얼려질 수 있다; 임의의 경우에, 배지는 액체일 때, 세포 배양을 위해 사용된다. 배지는 수용성 혼합물로 정의되는, “기초 배지(basal medium)”, 또는 기초 배지 및 적어도 하나의 보충물을 포함하는 수용성 혼합물이고, 보통 엑스 비보에서 세포의 생존능력(viability) 및, 또한 엑스 비보에서 선택적으로 세포의 증식을 지탱하는 능력을 가지는, “성장 배지(growth medium)”일 수 있다. 명확히 명시되지 않는다면, 문맥이 기초 배지 또는 성장 배지를 의미하는지 여부를 지시한다. 기초 배지는 바람직하게 화학적으로 정의된 배지다. 성장 배지는 바람직하게 기초 배지(통상적으로 85 % 내지 99.5 % vol./vol.) 플러스 적어도 하나의 인간에서 유래된, 동물에서 유래된, 또는 식물에서 유래된 보충물, 예컨대 혈청, 세포 용해물, 또는 특히 본 발명의 문맥에서, 혈소판 용해물을 포함한다.

용어 “중간엽(mesenchymal)”은 본 명세서에서 중간엽 세포 타입에 속하는 세포, 예컨대 지방 세포, 결합 조직(connective tissue), 뼈, 연골, 혈액, 림프관(lymphatic vessel) 및 혈관의 세포뿐만 아니라 중간엽 세포 타입으로 분화할 수 있는 기질세포 또는 줄기세포를 가리키기 위해 사용된다. 본 발명에 임의의 제한들을 함축하는 것을 바라는 것은 아니고, 중간엽 세포들은 인 비보에서 때때로 느슨하게 패킹(pack)되고 젤리 같은 기저물질에 세팅된다. 통상적으로, 중간엽 세포는 중배엽(mesodermal) 기원(배아 중배엽 또는 배아 외 중배엽)이다. 일부 구현예에서, 중간엽 세포는 기질세포(중간엽 기질세포) 또는 줄기세포(중간엽 줄기세포), 또는 이들 중 임의의 것으로부터 유래된 세포이다.

용어 “중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell)” 축약형 “MSC”는 본 명세서에서 특히 중간엽 기원, 즉 기질로부터 기원된 세포, 예컨대 중배엽으로부터 유래된 결합 조직을 가리키기 위해 사용된다. “중간엽 기질세포”의 조직 기원은 또한 이와 같이 제한되지 않는다; 그러나 본 발명의 바람직한 태양에 따라, 본 명세서에서 상세하게 기술되는 바와 같이, “중간엽 기질세포”는 탯줄로부터, 더 정확하게 상기 탯줄의 기질 와튼 젤리로부터 기원한다. 중간엽 기질 세포는 통상적으로 표면 마커 CD105 및 CD73, 및 일반적으로 또한 CD90을 발현한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 “중간엽 기질세포”는 CD105 (엔도글린(endoglin)으로 알려짐), CD73 (엑토 5' 뉴클레오티다제(ecto 5' nucleotidase)로 알려짐) 및 CD90 (또한 Thy-1로 알려짐)의 발현에 의해 특징지어진다. 중간엽 기질세포가 조혈 (hematopoietic) 항원, 예를 들어 특히 CD45, CD34, CD14, CD19, 또는 CD3을 대체로 발현하지 않는 것에 의해 특징지어진다. 통상적으로, MSC들은 MHC 클래스 Ⅰ 분자들을 인 비트로에서 발현하지만, 클래스 Ⅱ 분자들은 예컨대, 조직 배양에서 인터페론에 의해 자극되지 않는다면 발현하지 않는다. 따라서, MSC들의 통상적인 표면 마커 표현형은 CD105+, CD73+, CD90+, CD45-, CD34- CD14-, CD19-, CD3-, HLA DR-이다. 명백히 MSC들을 확인하는 동안, 이 표면 마커 프로파일은 복잡하다. 통상적인 MSC들의 특징적인 특성은 통상적으로 골모세포, 지방세포(adipocyte), 및 연골모세포(chondroblast)를 포함하는, 다양한 세포 타입들로 인 비트로에서 분화하는 능력이다. 통상적으로 MSC들은 인 비트로에서 플라스틱에 부착한다. 용어 “중간엽 기질 세포”는 이렇게 언급된 상기 세포가 줄기세포라는 것을 근본적으로 요구하지 않고; 그럼에도 불구하고, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 또는 본 발명에 따라 얻어진 MSC들은 바람직한 구현예에서 줄기세포 유사 특성들을 가질 수 있다.

용어 “중간엽 계통 전구세포(mesenchymal lineage precursor cell)”는 다능성을 유지하는 동안 자가 재생 능력 및 중간엽 기원의 많은 세포 타입들 각각, 예컨대 골모세포, 연골모세포, 지방세포, 기질세포, 섬유모세포 및 힘줄(tendon) 및 가능하게 또한 비중간엽 기원의 세포, 예컨대 신경 세포들 및 상피 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지는 중간엽 기질세포를 가리킨다. 상기 용어 “중간엽 계통 전구세포”는 따라서 상기 세포가 다능성이지만(전능성(totipotent) 반대) 다양한 세포 타입들로 분화할 수 있는 세포들을 가리킨다. 임의의 특정한 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, “중간엽 계통 전구세포”는 중배엽 계통의 세포라고 이해된다. 그러나, 달리 명시되거나 달리 문맥상 지시되지 않는다면, 상기 용어 “중간엽 계통 전구세포”는 각각의 세포의 조직 기원에 임의의 제한을 함축하지 않는다. 따라서, 일반적으로 “중간엽 계통 전구세포”로 불리는 세포들은 특정 조직 기원에 제한되지 않고 예컨대 골수, 탯줄, 성인 말초(peripheral) 혈액, 지방 조직, 지주골(trabecular bone) 및 치수로부터 기원할 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에 따라, 본 명세서에서 상세하게 기술된 바와 같이 상기 “중간엽 계통 전구세포”는 탯줄, 더 정확하게 상기 탯줄의 와튼 젤리로부터 기원한다. 상기 용어 “중간엽 계통 전구세포”는 부모 세포들 및 이들의 분화되지 않은 자손을 포함한다. 상기 용어 “중간엽 계통 전구세포”는 또한 중간엽 전구세포, 다능성 기질세포, 중간엽 줄기세포 및 이들의 분화되지 않은 자손을 포함한다. 본 발명에 따라, “중간엽 계통 전구세포”는 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 상기 줄기세포가 전능성이 아니라는 제한을 가진 줄기세포인 것이 강하게 선호된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 “다수(multi)” 및 “다수(multiple)”는 다수(multitude), 즉 둘 이상의 임의의 수를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, “다능성(multipotent)”은 몇몇의 성숙한 세포 타입들 중 임의의 것을 생기게 할 수 있는 세포를 가리킨다. 상기 용어 “다능성”은 전구세포 및 여전히 다능성인 그런 세포들의 모든 자손들을 아우른다. 상기 용어 “다능성”은 하나 이상의 별개의 세포 타입으로 분화할 수 있는 잠재력을 가진 전구세포를 가리킨다. 특정한 이론에 얽매이기를 바라지 않으며, 다능성 줄기 세포는 계통 계층(lineage hierarchy) 위에 위치하며 다수의 분화된 세포들의 타입들을 생성할 수 있는 것으로 이해된다. 제한 없이, 다능성 세포들은 탯줄, 지방 조직, 심장 세포(cardiac cell), 골수, 및 치수에서 발견될 수 있다. 일부 구현예에서, 다능성 세포들은 만능성(pluripotent)이다.

본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 “혈관 주위(perivascular)” 또는 “혈관 주위 부위(perivascular zone)” 또는 “혈관 주위 영역(perivascular area)”은 혈관 같은 관 근처의 물리적 영역 또는 부위를 가리킨다. “혈관 주위 부위” 또는 “혈관 주위 영역”은 도 1에 항목(5)로 기술된다. 특히, 상기 탯줄의 혈관 주위 부위/영역(5)은 탯줄의 각 혈관 주위의 각 부위/영역을 가리킨다. 혈관 주위 부위/영역은 상기 탯줄 혈관들의 각각의 외부 벽으로부터 3 mm까지 연장되는 공간으로 적절하게 정의될 수 있다(WO 2004/072273 A1). 예시에 의해, 혈관 주위 부위/영역은 Takechi et al., 1993(Placenta vol. 14; p. 235-245)에 의해 기술되었다.

용어 “혈소판 용해물(platelet lysate)”은 혈소판(또한 트롬보사이트(thrombocyte)로 불림)로부터 얻을 수 있는 제제(preparation)를 가리킨다. 혈소판은 전혈 및 풀링(pool)의 수집된 단위로부터 분리되거나 혈소판 성분채집술(apheresis)에 의해 수집되면서, 기증자, 바람직하게 인간 기증자에 의해 얻을 수 있다: 혈액은 기증자로부터 채취되고 혈소판을 제거하는 장치를 통해 통과된다. 이들의 분리 후에, 예컨대, 혈장에 (재)현탁된 상기 혈소판들은 통상적으로 예컨대, 하나 이상의 동결/해동(thaw) 사이클(들)에 의해 용해된다. 혈소판 용해물은 다수의 상업적 공급자들, 예컨대 Macropharma (Mouvaux, France)로부터, 임상적 혈액은행, 예컨대, Modena에 Blood Bank of the Polyclinic(Italy)로부터 이용가능하지만, 또한 Naaijkens et al., Cell Tissue Res., 2012, vol. 348, p. 119-130 및 WO 2013/042095 A1에서 기술된 바와 같이 혈소판으로부터 직접적으로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “만능성(pluripotent)”은 3 배엽층(germ layer)(내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm)) 중 임의의 것으로 분화하지만, 생식선 세포들(germ line cells)로 분화하지 않는 잠재력을 갖는 세포를 가리킨다. 통상적으로, 만능성 세포는 생식선 세포들을 제외하고 성체 유기체의 모든 세포 타입들로 분화할 수 있다. 일 구현예에서, 임의의 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으며, 만능성 세포는 포유류 신체의 세포 타입들 중 어느 것으로 분화할 수 있는 세포이고, 이러한 것들은 대략적으로 260 개의 세포 타입들일 수 있다. 만능성 세포는 자가 재생할 수 있고, 조직 내에서 휴면(dormant) 또는 정지(quiescent)로 남아있을 수 있다. 만능성 세포는 바람직하게 다음의 모든 것들을 따른다: (ⅰ) 분화되지 않는 상태에서 증식할 수 있고, (ⅱ) 지속되는 배양 동안 일반적인 핵형(karyotype)을 유지하며, (ⅲ) 심지어 지속된 배양 후에 3 배엽층들(내배엽, 중배엽, 외배엽) 중 하나로 분화하는 능력을 유지한다.

용어 “계대 수(passage number)”, 다음에 숫자가 따라오며(예컨대, “P1”), 축약형 “P”는, 세포들의 배양이 하위배양(sub-culture)되는 횟수를 가리킨다. 따라서, 용어 “계대 수”는 세포들의 증식동안 상태를 기술하기 위해 유용한 용어이다.

용어 “집단 배가(Population Doubling)”, 축약형 “PD”는 본 명세서에서 예컨대, 초기 시간 지점 t₀ 내지 후기 시간 지점 t_0+x의 시간 간격에서 세포들의 수가 배가 된다는 것을 기술하기 위해 사용된다. 그 경우에, x는 세포들의 수가 배가되는 시간 간격을 지정한다. 예컨대, t₀는 제1 분리의 시간 지점이거나 특정한 계대가 개시되는 시간 지점일 수 있다. 따라서, 상기 용어 “집단 배가”는 세포의 증식을 가리키는 용어이다. 상기 용어는 일반적으로 인 비트로에서 세포들의 수의 배가를 가리킨다. 집단 배가(PD)는 공식에 의해 계산된다:

여기서, N₀는 시딩된 세포 수 및

N은 수확된 세포 수

(Purpura et al., 2004, Stem Cells. Vol. 22, p. 39- 50).

용어 “누적 집단 배가(cumulative Population Doubling)”는 본 명세서에서 특정 시간 지점, 예컨대 그들의 제1 분리 이후로, 인 비트로에서 세포 집단 내 세포들이 배가되는 총 횟수를 가리키기 위해 사용된다. 따라서, 또한 상기 용어 “누적 집단 배가”는 일반적으로 인 비트로에서, 세포들의 증식을 가리키는 용어이다. 적절하게, 누적 PD는 각 계대에 대해 측정된다. 상기 누적 PD 수는 공식에 의해 계산된다.

여기서, n = 누적 PD 수

N₀ = 시딩된 세포 수(즉, 계대 초기에)

N = 수확된 세포 수 (즉, 상기 계대의 말기에)

X = 상기 계대의 초기에 누적 PD 수

N₀는 계대의 초기 전에 세포 카운팅에 의해 적절하게 측정된다; N₀는 세포 밀도 및 배양 접시의 바닥 표면의 함수이다. N은 분리, 예컨대 트립신 처리 후에 계대의 말기에 세포 카운팅에 의해 적절하게 측정된다.

상기 누적 PD는 부가적(따라서 상기 공식에서 X)이고; 예컨대, 제1 계대 P1 동안 5 누적 PD 및 다시 다음 제2 계대 P2 동안 5 누적 PD를 겪는 경우, 그 후 상기 세포들은 P1 플러스 P2의 총 경로 동안 10 누적 PD를 겪는다. 갓 분리된 세포들은 정의에 의해 누적 PD = 0을 가진다. 따라서, P0의 시작에, X = 0이다. P0 이전에 N₀를 측정하는 것(그리고 따라서, P0에 대한 n을 측정하는 것)은 때때로 어렵기 때문에, 상기 누적 집단 배가는 오직 P1 이후로부터만 선택적으로 측정된다; 그러나 이러한 경우에 이것은 본 개시에서 구체적으로 지시된다.

누적 PD를 가장 가까운 정수로 반올림한 추정값으로 표시하는 것은 가능하다. 정의된 배양 조건들이 사용될 때, 그 후 산술적으로 계대 수를 누적 PD로 변환하는 것이 가능하며, 그 반대도 가능하다.

용어 “전구세포(progenitor cell)”는 본 명세서에서 줄기세포 및/또는 줄기세포의 자손일 수 있는, 세포를 가리키기 위해 사용된다. 전구체들은 통상적으로 줄기세포의 자손이고, 오직 그들은 그들의 분화 잠재력 또는 자기 재생을 위한 능력에서 더 제한된다. 전구세포들은 예컨대, 다능성 또는 단분화능성(unipotent)일 수 있다.

본 명세서에서 세포와 연결되어 사용될 때, 용어 “분비(secrete)” 또는 “방출(release)”은 일반적으로 상기 세포에서 외부 환경으로 외면화(externalize)되는 임의의 물질을 가리킨다. 상기 물질은 상기 세포에 의해 통상적으로 제조 및/또는 수정되지만, 이것은 요건은 아니다. 예컨대, 몇몇의 세포들은 단백질들 및/또는 조절 분자들, 예컨대 호르몬, 프로스타글란딘(prostaglandin) 및 신경전달물질(neurotransmitter), 및/또는 마이크로베시클(microvesicle) 및/또는 엑소좀(exosome)을 그들의 각각의 외부의 환경으로 분비할 수 있다. 예컨대, 세포에 의해 생성된 프로스타글란딘은 상기 세포의 환경으로 외면화될 수 있다. 달리 문맥상 지시하지 않는다면, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어들은 인 비보 분비/인 비보 환경 또는 인 비트로 분비/인 비트로 환경에 제한되지 않는다.

용어 “세포 부피” 또는 간단히 “부피”는, 세포에 관해서 유세포측정, 특히 FACS 분석에 의한 측정, 보다 특별하게 전방 산란광(FSC)의 측정에 의해 측정될 수 있는 바와 같은 세포 부피를 가리킨다. 본 개시의 문맥에서, 상기 세포, 예컨대 분리된 세포들, 예컨대 트립신 처리된 세포(부착 배양 후) 또는 콜라겐 분해 효소가 방출된 세포(조직으로부터 분리된 후)가 현탁액 내에 있는 동안, 즉 상기 세포가 배양 접시 또는 조직에 부착하지 않는 동안, 상기 세포의 부피는 측정된다. SSC 및 선택적으로 세포 부피의 측정은 본 명세서에서 아래에 기술된다.

용어 “평균 부피(average volume)” 또는 “평균 세포 부피(average cell volume)”는 둘 이상의 개개의 세포들의 부피의 평균을 가리키고, 여기서 제1 단계에서 각 개개의 세포의 부피는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 유세포측정에 의해 측정되고, 그 후 다음의 제2 단계에서 평균 부피는 제1 단계에서 측정된 바와 같이, 개개의 상기 세포들의 세포 부피의 산술 평균으로 측정된다. 통상적으로 적어도 1000 세포들이 상기 평균 세포 부피의 측정을 위해 상기 제1 및 상기 제2 단계를 거친다; 즉, 상기 평균은 적어도 1000 세포들의 평균을 나타낸다.

용어 “줄기세포(stem cell)”는 본 명세서에서 표현형적으로 및 유전자형적으로 동일한 딸 세포들(“자가-재생”)뿐만 아니라 적어도 하나의 다른 최종 세포 타입(예컨대, 최종 분화 세포)을 생기게 할 수 있는 진핵 세포를 가리키기 위해 사용된다. 용어 “줄기세포”는 전능성, 만능성 또는 다능성일 수 있는 세포뿐만아니라 이의 분화로부터 유래된 전구체 및/또는 전구세포 및/또는 계통 분화 자손 세포를 가리킨다. 일반적으로, 상기 용어 “줄기세포”는 성체 줄기세포 또는 배아 줄기세포를 가리킬 수 있다. 상기 용어 “줄기세포”는 유도된 줄기세포(induced stem cell), 예컨대 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)를 선택적으로 가리킬 수 있지만, 더 바람직하게는 유도되지 않은 세포를 가리킨다.

용어 “줄기세포능(stemness)” 또는 “줄기 세포-유사 특성(stem cell-like property)”/”줄기-세포-유사 특성(stem-cell-like property)”은 세포의 특성, 특히 자가 재생하는 능력 및 분화된 세포들을 발생시키는 능력을 지정하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 더 명확하게, 줄기-세포-유사 특성들을 가진 세포들은 그들의 모세포에 동일한 딸 세포들을 발생시킬 수 있을뿐만 아니라(자가-재생), 더 제한된 잠재력을 가진 자손, 예컨대 분화된 세포들을 제조할 수 있다. 줄기-세포-유사 특성들을 가진 세포들은 능력, 즉 분화된 자손을 제조하는 잠재력의 특정한 정도에 의해 특징지어진다. 줄기세포-유사 특성들을 가진 몇몇의 세포들은 다수의 분화된 세포 타입들(예컨대, “다능성” 또는 “만능성”)을 발생시킬 수 있을 수 있는 반면에, 다른 것들은 분화된 세포의 한 타입(“단분화능성”)을 생산할 수 있다. 비록 줄기세포-유사 특성들을 가진 세포들은 자가 재생하는 능력을 가졌음에도 불구하고, 줄기-세포 유사 특성들을 가진 것들을 포함하는, 대부분의 체세포들(somatic cell)은 인 비트로에서 배양될 때 복제 정지(replicative arrest) 또는 노화(senescence) 전에 누적 집단 배가의 한정된 수에 대해서 증식할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 개시에 따른 상기 중간엽 기질세포는 줄기 세포-유사 특성들을 가진 중간엽 기질세포이다.

일반적으로, “기질(stroma)”은 상기 조직을 기계적으로 지지하는, 예컨대 결합적, 구조적 지지를 제공하는, 및/또는 (바람직하게는 및) 상기 조직을 기능적으로 지지하는 역할을 갖는 인간 또는 동물 조직 또는 기관의 부분이다. 따라서, 살아있는 신체 내에, 상기 기질은 생물학적 조직, 또는 기관(조직의 기능적인 태양인 실질(parenchyma)에 반대)의 결합적, 기능적으로 지지하는 뼈대이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 상기 용어 “기질”은 예컨대 탯줄, 자궁 점막(uterine mucosa)(자궁내막(endometrium)), 전립샘(prostate), 골수, 림프절(lymph node) 및 난소(ovary)에 제한이 없이, 임의의 기관의 결합조직 세포들을 가리킨다. 각각의 기관에서, 상기 기질은 그 기관의 실질 세포들의 기능을 지지하는 것으로 이해된다. 따라서, 상기 기질은 상기 기관, 예컨대 결합조직, 혈관, 신경, 관 등의 특정 기능들을 수행하지 않는 모든 부분들로 구성된다. 따라서, 상기 탯줄의 기질은 상기 혈관, 상기 혈관 주위 영역 및 상기 양막 상피를 제외한 상기 탯줄로 구성되는 매트릭스이다. 상기 용어 기질은 전체 기관의 기질 또는 이들의 특정 해부학적 영역을 가리킬 수 있다. 특히, 상기 용어 기질은 전체적으로 상기 탯줄의 기질 또는 이들의 특정 해부학적 영역, 즉 상기 탯줄의 특정 섹션에 포함된 기질을 가리킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 용어 “기질의(stromal)”는 상기 기질에 존재하는 또는 상기 기질로부터 유래된 것을 가리킨다. 상기 용어는 기질 내에 존재하는 “기질의” 물질(예컨대, 기질세포)의 위치에 제한되지 않고, 그것은 또한 살아있는 인간 또는 동물 몸체의 기관에 기질에 존재했었으나, 이후 더 이상 살아있는 인간 또는 동물 몸체의 기관에 존재하지 않도록 기관으로부터 추출 또는 분리된 물질(예컨대, 세포)을 가리킨다. 다시 말해서, 상기 용어 “기질의”는 물질(예컨대, 세포)이 추출 또는 분리되는지 관계없이, 인 비보에서 물질(예컨대, 세포)의 특정 기원을 가리킨다. 상기 기질로부터 추출 또는 분리된 물질(예컨대, 세포)은 또한 본 명세서에서 “기질 유래(stroma-derived)”, ”기질로부터 유래된(derived from stroma)”, 또는 이와 같은 것들로 일컬어질 수 있다. 본 발명의 일부 바람직한 구현예에서, 상기 기질 물질(예컨대, 기질세포)은 이것이 살아있는 인간 또는 동물의 몸체의 기관에서 존재하지 않거나 더 이상 존재하지 않도록, 추출 또는 분리되거나 추출 또는 분리되었다.

따라서, “기질세포”는 그것이 살아있는 인간 또는 동물 몸체의 기관에서 존재하지 않거나 더 이상 존재하지 않도록, 기질에 존재하거나 기질로부터 유래된, 즉 추출 또는 분리된 생물학적 세포이다. 기질세포는 달리 명시되지 않거나, 달리 문맥상 지시하지 않는다면 살아있다. 많은 기관에서 섬유모세포들 및 혈관주위세포(pericyte)들이 가장 일반적인 타입의 기질세포 중 하나이다. 설명적인 예시로서, 기질세포는 상기 기질(예컨대, 상기 탯줄의 상기 기질)에 존재하는 세포일 수 있거나 상기 기질(예컨대, 상기 탯줄의 상기 기질)로부터 분리(예컨대, 추출) 및 선택적으로 증식된 세포일 수 있다. 기질세포들은 일반적으로 비악성 세포들(non-malignant cells)이다.

용어 “동계(syngeneic)”는 동일한 유전자형을 갖는 개체 또는 세포들, 예컨대 일란성 쌍둥이 또는 동일한 근교계(inbred strain)의 동물들, 또는 이들의 세포들로부터 유래된 것을 기술하기 위해 사용된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “전능성(totipotent)”은 분열하여 유기체 내 모든 분화된 세포들을 생성할 수 있는 세포를 가리킨다. 통상적으로, 전능성 세포는 완전 배아를 생기게 할 수 있다. 포유류에서, 통상적으로 수정란(zygote) 및 다음의 할구(blastomere)들만이 전능성이다.

용어 “탯줄(umbilical cord)”은, 또한 “탯줄(navel string)”로도 불리면서, 신생아 및 태반 동물들의 태반 사이의 통로(conduit)를 가리킨다. 출산 전(prenatal) 발달동안, 상기 탯줄은 생리학적으로 및 유전적으로 태아의 부분이다. 비록 탯줄은 그것이 상기 태반을 발달하는 배아 또는 태아와 연결하는, 배아발생(embryogenesis) 전체에 존재함에도 불구하고, 본 명세서에서 상기 용어는 이미 태어난 아기의 상기 탯줄을 구체적으로 가리킨다. 인간에서, 상기 탯줄은 세가지 혈관들, 즉 두가지 동맥들(탯줄 동맥) 및 한가지 정맥(탯줄 정맥)을 일반적으로 포함한다. 상기 세가지 혈관들은 와튼 젤리에 통상적으로 묻힌다. 태반 또는 이들의 부분들, 또는 신생아 또는 이들의 부분들은 상기 탯줄의 부분이 아니고; 그 용어는 오로지 상기 통로만을 가리킨다.

용어 “단분화능성”은 분화된 자손의 한 타입만을 생성할 수 있는 줄기-세포 유사 특성들을 가진 세포를 가리킨다. 그러한 단분화능성 세포는 또한 전구세포로 일컬어질 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 세포를 가리킬 때, 용어 “생존가능한(viable)”은 상기 세포가 살아있는 세포인 것을 의미한다. 살아있는 세포들은 통상적으로 대사적으로 활성이 있다. 비록 몇몇의 다른 착색제들(coloring agent) 및 형광체들(fluorochrome)이 생존할 수 없는 세포들을 염색하기 위해 사용될 수 있음에도 불구하고, 본 명세서에서는 7-아미노 악티노마이신 D(7-amino actinomycin D, 7-AAD)로 염색하는 것이 선호된다. 7-AAD는 생존가능한 세포들로부터 일반적으로 배제되는 막 투과가 가능한 염료이다. 그것은 G-C가 풍부한 영역에서 염기 쌍들 사이에 삽입함으로써 이중가닥의 DNA에 결합한다. 7-AAD는 488 nm에서 예컨대, 아르곤 레이저를 가지고 여기될 수 있고, 647 nm의 최대 파장에서 형광을 방출한다. 세포들의 생존가능성은 7-AAD를 사용하여, 유세포측정, 특히 FACS(형광 활성화 세포 분류)에 의해 측정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “혈관(vessel)”(참조 “배양 용기(culture vessel)”와 혼동되지 않을 것)은 신체 유체(예컨대, 혈액)이 포함되고 전달 또는 순환되는 튜브 또는 도관(예컨대, 정맥 또는 동맥)을 일반적으로 가리킨다. 달리 문맥상 지시하지 않는다면, 상기 용어 “혈관”은 또한 본 명세서에서 상기 탯줄의 혈관들을 구체적으로 가리키기 위해 사용된다. 인간들 및 많은 다른 포유류들에서, 상기 탯줄은 일반적으로 세가지 혈관들, 즉 인 비보에서 산소화되고 영양이 풍부한 혈액을 태아에게 전달하는, 하나의 정맥 및 인 비보에서 탈산소화되고 영양이 고갈된 혈액을 전달하는, 두가지 동맥들을 포함하지만; 가끔의 경우들은 두가지 혈관들(하나의 정맥 및 하나의 동맥)만이 상기 탯줄에 존재한다고 보고된다.

용어 “와튼 젤리(Wharton's Jelly)”, 축약형 “WJ”는 세포들을 포함하는 태반 동물 기원의 젤리 같은 물질을 가리킨다. 통상적으로, 상기 와튼 젤리는 기질세포, 보다 구체적으로 중간엽 기질세포들을 포함한다. 또한, 상기 와튼 젤리는 통상적으로 점액 다당류들(mucopolysaccharide), 예컨대 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate) 뿐만 아니라 물을 포함한다. 비록 와튼 젤리가 또한 안구의 유리체액(vitreous humor)에 기술되지만, 상기 와튼 젤리가 신생아 태반 동물, 바람직하게 포유류, 예컨대 인간의 상기 탯줄의 부분인 것이 본 명세서에서 강하게 선호된다. 그 경우에, 상기 와튼 젤리는 또한 substantia gelatinea funiculi umbilicalis로 일컬어질 수 있다. 다시 말해서, 본 명세서에서 사용된 바와 같이 상기 와튼 젤리가 탯줄 기원인, 훨씬 더 바람직하게 인간 탯줄 기원에 있는 것이 강하게 선호된다. 다음에 기술된 바와 같이, 탯줄은 상기 혈관 주위 영역(5), 혈관 간 영역(4) 및 양막 아래(subamniotic) 영역(1b)에 와튼 젤리를 일반적으로 포함한다.

“혈관 주위 와튼 젤리(Perivascular Wharton's Jelly)” 또는 “PVWJ” 또는 “VPWJ” 모두 동의어로 탯줄의 특정 해부학적 영역의 와튼 젤리, 즉 상기 탯줄(5)의 상기 혈관 주위에 위치되는 와튼 젤리의 해부학적 영역을 가리킨다. 바람직한 구현예를 나타내는, 인간의 탯줄의 경우에 대해, 상기 PVWJ는 상기 혈관의 외부 표면으로부터 3.0 mm 이하 바깥으로 연장되는 영역에 위치된다(리뷰를 위해, Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630 참조). 그러므로, 상기 인간 탯줄의 상기 혈관의 벽 외부로부터 3.0 mm 내에 위치된 상기 영역이 완전하게 제거될 때, 이에 포함된 혈관 주위 부위, 및 따라서 임의의 혈관 주위 와튼 젤리는 경우에 따라, 완전히 제거된다. 설명을 위해 또한 도 1을 참조한다. 축약어 “PVWJ” 및 “VPWJ”는 또한 본 명세서에서 경우에 따라, 예컨대 도면 범례에서 “혈관 주위 와튼 젤리”를 포함하는, 혈관 주위 부위로부터 기원하는 세포들을 가리키기 위해 동의어로 사용된다. 혈관 주위 와튼 젤리(PVWJ)로부터 유래된 중간엽 기질세포는 또한 “혈관 주위 부위로부터 유래된 중간엽 기질세포(perivascular zone-derived mesenchymal stromal cells)”로 일컬어질 수 있다.

용어 “양막 아래 기질(subamniotic stroma)”은 상기 탯줄의 양막 상피(1a)에 직접적으로 인접한 부위(1b)를 가리킨다. 바람직한 구현예를 나타내는 인간의 탯줄의 경우에 대해, 양막 아래 기질은 양막 상피의 내부 표면으로부터 3.0 mm 이하 안으로 연장되는 영역에 위치된다.

용어 “양막 아래 와튼 젤리(subamniotic Wharton's Jelly)”는 탯줄의 양막 상피(1a)에 직접적으로 인접한 양막 아래 기질(1b) 내에 와튼 젤리를 가리킨다. 바람직한 구현예를 나타내는 인간 탯줄의 경우에 대해서, 상기 양막 아래 와튼 젤리는 양막 상피의 내부 표면으로부터 3.0 mm 이하 안으로 연장되는 영역에 위치된다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “기질 와튼 젤리(stromal Wharton's Jelly)”, 축약형 “SWJ”는 혈관 주위 영역(4)을 배제하는 탯줄의 와튼 젤리를 가리킨다. 따라서, 상기 용어 “기질 와튼 젤리”는 혈관 주위 영역(4)을 포함하지 않고 결과적으로 혈관 주위 영역(4)으로부터 세포들을 포함하지 않는다. 혈관 주위 영역이 중간엽 기질세포들을 포함하는지 아닌지에 이 기술분야에 몇몇 논쟁이 있어온 반면에, 적어도 본 발명이 혈관 주위 영역으로부터 중간엽 기질세포의 분리를 고려하지 않기 때문에, 적어도 혈관 주위 영역이 본 발명에 따른 세포들의 근원이 아니라는 이유에서, 그러한 논쟁은 본 발명에서 중요하지 않다. 달리 명확하게 기재되지 않는다면, 양막 아래 기질(1b)은 본 명세서에서 일컬어지는 상기 기질에 포함된다. 달리 명확하게 기재되지 않는다면, 상기 양막 아래 와튼 젤리는 본 명세서에서 “기질 와튼 젤리”로 일컬어지는 상기 와튼 젤리에 포함된다. 양막 아래 와튼 젤리는 양막 아래 기질에 포함된다. 축약형 “SWJ”는 또한 본 명세서에서 예컨대, 도면 범례에서 “기질 와튼 젤리”로부터 기원하는 세포들을 가리키기 위해 사용된다. 따라서, 도 1을 참조하여, 상기 기질(그리고 따라서 와튼 젤리의 기원)은 이의 가장 넓은 정의에 다음 중 하나의 부분이 아닌 상기 탯줄의 모든 그러한 영역들을 포함한다: (1a) 양막(또는 상피) 층; (2) 탯줄 정맥; (3) 탯줄 동맥; (5) 혈관 주위 영역; (7) 탯줄 혈액. 다시 말해서, 이 가장 넓은 정의에서, 상기 기질(그리고 따라서 와튼 젤리의 기원)은 (6) 상기 탯줄의 루멘에 상기 와튼 젤리 플러스 (1b) 상기 양막 아래(또는 중간엽) 층; 플러스 (4) 혈관 간 영역을 포함한다. 바람직하게, 달리 명확하게 기재되지 않는다면, 양막 아래 와튼 젤리(1b)는 본 명세서에서 “기질 와튼 젤리”로 일컬어지는 상기 와튼 젤리에 포함된다. 바람직하게, (4) 혈관 간 영역은 본 명세서에서 “기질 와튼 젤리”로 일컬어지는 와튼 젤리에 포함된다. 따라서, 기질(그리고 따라서 와튼 젤리의 기원)은 이의 가장 넓은 정의에서 상기 도 1에 1b, 4 및 6으로 개략적으로 기술되는 상기 탯줄의 모든 그러한 영역들을 포함한다. 탯줄에 관해서 본 명세서에서 제공되는 해부학적 정의들이 일부 또는 모든 문헌의 정의로부터 부분적으로 또는 완전히 벗어난다면, 본 명세서의 정의들이 우선시될 것이다.

문헌(Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630)에서 실용적인 관점에서, 남아있는 영역들 또는 부위들로부터 뚜렷하게 해부될 수 있는 것(1a)은 상기 탯줄 라이닝(cord lining) 및 (5) 상기 혈관 주위 와튼 젤리만이라는 것이 제안된다. 일 구현예에서, 본 발명은 뚜렷한 해부, 즉 상기 혈관 주위 와튼 젤리를 포함하는 (1a) 상기 탯줄 라이닝 및 (5) 상기 혈관 주위 부위로부터 상기 기질 와튼 젤리의 분리를 고려한다.

본 발명은 상호 관련되어 있고 따라서 발명자들을 본 발명의 다양한 태양에 도달하도록 함께 이끄는, 몇 가지 발견들에 기초하고 있으며, 이들은 모두 이하에서 개별적으로 기술될 것이다. 그러므로, 비록 명확하게 그렇게 기술되지 않더라도, 달리 문맥상 명확하게 지시하지 않는다면, 본 명세서에서 기술되는 태양들은 모두 서로 결합될 수 있다. 본 발명의 모든 태양들은 그 중에서도 상기 탯줄의 상기 기질 와튼 젤리가 특히 증식-능력이 있는 상태에 독특한 특성들을 가진 세포들을 보유하고, 그들이 배양에서 유지되고 증식될 수 있도록 특정 분리 과정이 이러한 잠재적으로 다능성인 기질 세포들을 확실하게 제공한다는 발견에 기초된다.

인간 배아들은 본 발명의 문맥에서 파괴되지 않거나, 파괴되지 않았었다. 특히, 본 발명의 상기 방법 또는 상기 세포 또는 상기 세포 집단은 인간 배아의 파괴를 요구하지 않는다.

중간엽 기질세포를 얻기 위한 방법

제1 태양에서, 본 발명은 중간엽 기질세포를 얻기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 (a) 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 것, 및 (b) 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 효소적 처리하고, 이에 의해 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분으로부터 적어도 하나의 세포를 방출시키는 것을 포함한다.

특히, (인간) 탯줄의 단면 및 (인간) 탯줄의 섹션들(해부학적 영역)의 모식도를 나타내는 도 1을 참조하면, 상기 방법, 중간엽 기질세포를 얻기 위한 방법은 다음과 같이 기술될 수 있다: 여기서 상기 방법은 (a) 상기 기질 와튼 젤리(1b, 4, 6) 또는 이의 부분을 분리시키는 것, 및 (b) 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 효소적 처리하고, 이에 의해 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분으로부터 적어도 하나의 세포를 방출시키는 것을 포함한다.

단계 (b) 후에 얻어진 상기 세포는 만능성, 또는 더 통상적인, 다능성 일 수 있다. 추가적인 단계들은 선택적으로 그러나 바람직하게, 특히 아래 상세하게 기술될, 증식 단계에서 포함된다.

본 발명의 상기 방법에서, 상기 와튼 젤리는 탯줄로부터 분리된다. 이것은 골수(BM)로부터 유래된 중간엽 기질세포들(MSC)이 성체 MSC들의 가장 광범위하게 연구되는 집단을 나타내고 MSC 기초된 적용들(예컨대, Batsali et al., Blood, 2013 vol. 122, p. 1212)에 대해 황금표준(gold-standard, 최적표준)으로 간주된다는 이 기술분야에 따른 일반적인 트렌드에 관해 패러다임의 이동을 나타낸다. 그러나, 골수의 흡인(aspiration)은 일반적으로 침습적이고 고통이 있다. 본 발명에 따른 상기 방법이 골수(BM)로부터의 분리보다 크게 유리한 점은 탯줄이 포유류의 출생시 쉽게 이용가능하고, 그런데 반해 골수를 얻기 위해 요구되는 수술이 대개 외과적이고 고통이 있다는 것이다. 환자들, 기증자들 및 건강관리 전문가들은 그러므로 골수로부터 유래된 MSC들을 사용하는 것을 꺼려하고, 만일 오직 신뢰할 수 있는 대안들이 이용가능하다면, 아마 훨씬 더 그럴 것이다.

따라서, 상기 방법이 엑스 비보 방법이라는 것은 본 발명에 따른 상기 방법의 이점이다. 바람직하게, 살아있는 인간 또는 동물 몸체로의 침입은 완전히 피해진다. 따라서, 본 발명의 상기 방법은 바람직하게 수술 또는 요법에 의한 인간 또는 동물 몸체의 치료 방법을 나타내지 않는다. 이에 의해, 본 문헌에서 기술된 바와 같이 골수로부터의 분리와 비교하면, 고통 측면들, 취급 측면들 및 윤리적 측면들이 성공적으로 해결된다.

이전의 기술분야에 따라, 몇몇의 선행 연구들 및 보고들과 추가적인 중요 차이는, MSC들이 탯줄 혈관들을 둘러싸는 결합조직으로부터 효율적으로 분리될 수 있다는 것(예컨대, Batsali et al., Blood, 2013 vol. 122, p. 1212)인데 반해, 본 발명은 혈관 주위 부위 및 따라서 혈관 주위 와튼 젤리를 배제하는 영역으로부터 MSC들의 분리에 의존한다는 것이다. 따라서, 본 발명의 발명가들은 상기 탯줄의 특정 해부학적 영역이 본 명세서에서 기술된 바와 같은 이점들에 도달하기 위해 목적이 분명하게 선택되어야 한다는 것을 발견했다. 더 구체적으로, 본 발명에 따른 상기 방법은 본 명세서에서 아래에서 상세하게 모두 기술되는 바와 같이 그리고 실시예에 의해 설명되는 바와 같이, 상기 세포들의 기원의 특정 해부학적 영역 및/또는 상기 탯줄의 특정 분할 및 분절 및/또는 특정 분리 단계 및/또는 선택적으로 특정 증식 단계에 의해 특징지어진다. 본 발명에 따라 문맥상 특정 조합이 가능하지 않거나 바람직하지 않다는 분명한 교시가 없다면, 바람직한 및/또는 선택적인 구현예들 및 상기 세포들의 기원의 특정 해부학적 영역, 상기 탯줄의 분할 및 분절, 특정 분리 단계, 및 선택적인 특정 증식 단계의 세부사항들은 본 발명에 따라 각각 및 모든 조합에서 서로 조합 가능한 것은 중요하다.

본 발명의 상기 방법에서, 상기 탯줄로부터 기질세포들의 빠른 분리는 이점이 있다. 바람직한 구현예에서, 단계들 (a) 및 (b)는 함께 6 시간 이하, 더 바람직하게 5 시간 이하, 더 바람직하게 4 시간 이하 및 가장 바람직하게 3 시간 이하의 총 시간에서 수행된다. 3 시간 이하는 0.5 내지 2.5 시간 및 1 내지 2 시간의 시간 간격을 포함한다. 단계들 (a) 및 (b) 함께의 짧은 지속시간은 또한 단계 (a) 그 자체의 지속시간의 시간 간격이 짧다는 것을 의미한다는 것이 명백하다.

달리 명시되지 않는다면, 상기 세포들과 직접적 또는 간접적인 접촉을 가져오는 모든 시약들, 재료들, 배양 용기들, 용기들 및 물질들은 바람직하게 살균되고, 더 바람직하게 GMP 등급이다.

상기 방법 및 그의 구현예들의 상세한 설명은 다음과 같다.

조직 기원

본 발명의 상기 방법에 따른 상기 방법의 제1 단계는 탯줄로부터 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 것에 의해 특징지어지는 단계 (a)다. 단계 (a)는 바람직하게 기계적인 단계이고, 즉 그것이 분리 목적으로 일반적으로 화학적 또는 효소적 단계들에 의존하지 않는다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 단계 (a)는 단계 (a) 동안 효소적 활성을 가진 재료가 첨가되지 않는다. 그러나 추가적으로 아래에서 기술될 바와 같이, 효소적 처리는 다음의 단계 (b)에서 중요하다.

상기 기질 와튼 젤리와 관련하여 사용될 때, 단어 “부분(fraction)”은 특별히 제한되지 않고 일부 구현예에서, 100 % 이하의 탯줄의 총 기질 와튼 젤리가 본 발명의 상기 방법에서 사용될 수 있다는 것을 일반적으로 의미한다. 예컨대, 10 내지 99 %, 예컨대 20 내지 90 %, 30 내지 80 %, 40 내지 60 %의 총 기질 와튼 젤리는 일부 구현예에서 사용될 수 있다. 일부 구현예들에서, 100% 이하를 사용하는 것에 대한 이유들은 다수일 수 있고 또는 목적이 분명하게, 예컨대 비교적인 실험들을 위해 기질 와튼 젤리의 일부를 사용하는 것이 바람직할 때, 또는 100 %의 상기 탯줄의 상기 기질 와튼 젤리를 회수하는데 있어 실험적인 한계들 때문일 수 있다. 그럼에도 불구하고, 가능한한 많은 부분, 즉 80% 이상, 바람직하게 90% 이상의 기질 와튼 젤리를 사용하는 것은 바람직하게 희망된다. 달리 지시되지 않는다면, 상기 % 수치들은 하나의 탯줄에 포함된 기질 와튼 젤리의 총 부피의 %를 가리킨다.

따라서, 본 발명에 따라, 상기 세포들은 상기 탯줄로부터 분리될 수 있다. 상기 탯줄은 태반 동물 기원이지만 바람직하게 상기 탯줄은 포유류 기원이다. 태반 포유류에서, 상기 탯줄은 태반을 발달하는 태아 및 출산 직후 신생아로 연결하는 구조이다. 상기 태반 또는 신생아는 상기 탯줄의 일부가 아니고; 상기 탯줄은 상기 태반 및 상기 신생아 사이에 결합 튜브로 한정된다.

상기 탯줄은 출산 후 얻어진다. 바람직하게, 상기 탯줄은 출산 후 24 시간 이하, 예컨대, 출산 후 12 시간 이하, 출산 후 6 시간 이하, 출산 후 3 시간 이하, 예컨대, 출산 후 2 시간 이하, 및 바람직하게 출산 후 1 시간 이하에 얻어진다. 따라서, 상기 탯줄은 세포들의 분리 전에 출산 후 바람직하게 최대 24 시간 동안, 바람직하게 0 내지 10 ℃의 낮은 온도에서, 바람직하게 2 내지 8 ℃에 보관될 수 있다. 그러나 상기 탯줄은 세포들의 분리 전에 동결되지 않는다. 선택적으로, 세포들의 분리 전에 상기 탯줄은 멸균 수 또는 살균 완충 수용성 용액으로 헹궈진다.

상기 탯줄은 상기 세포들의 분리 전 및 분리동안 바람직하게 살균 조건들 하에서 유지되고 취급된다. 선택적으로, 상기 탯줄은 예컨대 수용성의(70 % vol./vol. 에탄올) 용액 또는 베타딘(betadine)을 가지고 상기 탯줄의 간단한 표면 처리에 의해 추가적으로 표면-살균될 수 있고, 이어서 멸균 수로 헹궈진다.

바람직하게, 상기 세포들은 인간 탯줄로부터 분리된다. 만삭에서 상기 인간 탯줄(UC)은 대략적으로 40 g의 중량이 나가고 약 1.5 cm의 평균 직경을 가진다(Raio et al., 1999, Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol., vol. 83; p. 131-135). 따라서, 바람직하게, 본 발명에 따라 사용되는 상기 탯줄은 인간 탯줄이다. 본 발명의 상기 방법에 있는 인간 탯줄은 바람직하게 대략적으로 40-65 cm, 예컨대 44 내지 51 cm의 길이를 가진다.

통상적으로, 상기 탯줄은 건강한 모친, 바람직하게 인간 모친으로부터 건강한 신생아의 출산 후에 분리된다. 바람직하게, 상기 모친은 출산 전 적어도 한달 동안 흡연, 음주 및 정신작용 약품 섭취를 삼간다.

상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분이 탯줄로부터 분리된다고 진술될 때, 이것은 바람직하게 하나 이상의 탯줄이 시작 물질로서 사용되지 않는다는 것을 의미한다. 그러나, 하나 이상의 탯줄이 시작 물질로 사용되는 것은 또한 가능하다. 일 구현예에서, 하나의 탯줄은 본 발명에 따른 상기 방법에서 시작 물질로 사용된다. 그 구현예에서, 각 방법의 실행마다 모든 시작 물질은 자기유래(autologous)이고, 즉 동종이계 탯줄 물질이 시작 물질의 부분이 아니고, 결과적으로 본 발명의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 모든 세포들이 하나의 단일 기증자로부터 기원한다.

시작 물질로 전체 탯줄을 사용하는 것은 가능하지만, 시작 물질로 하나의 탯줄의 부분을 사용하는 것은 동등하게 가능하다. 하나의 전체 탯줄이 본 발명에 따른 상기 방법에서 시작 물질로 사용될 때, 상기 방법은 “완전한 스케일(full scale)”에서 실행된다고 진술될 수 있다. 따라서, 단계들 (a), (b) 및 선택적으로 (c)를 포함하는, 본 발명의 바람직한 태양에 따른 상기 방법은 하나의 전체 탯줄이 시작 물질로 사용될 때, “완전한 스케일”의 실행으로 일컬어진다. 이 문맥에서 상기 단어 “전체(entire)”는 상기 탯줄의 작은 부분들, 예컨대 상기 탯줄의 두 끝이 다듬어지거나 잘려서, 따라서 시작 물질로 포함되지 않는 것을 배제하지 않는다; 그것은 또한 본 명세서에서 기술된 상기 방법 동안 탯줄이 분할 및/또는 분절되는 것을 배제하지 않는다; 그것은 다소 근본적으로 탯줄의 전체 양이 시작 물질로 사용된다는 것을 의미한다. 만기 출산으로부터 인간 탯줄의 경우에 대해서, 전체 탯줄은 통상적으로 35 내지 40 그램 사이, 또는 더 정확하게 약 40 그램의 중량이 나간다. 일 구현예에서, 완전한 스케일 실행은 단일 기증자로부터 35 내지 45 그램 탯줄을 가지고 시작한다. 시작 물질, 즉 탯줄의 양은 물론 본 발명에 따른 상기 방법의 하류 단계들 동안에 얻어지는 세포들의 총량에 영향을 미친다. 달리 분명하게 지시되지 않는다면, 본 명세서에서 제공되는 모든 양들(예컨대, 세포 수)은 완전한 스케일 실행을 가리킨다. 단어 “완전한 스케일”은 하나의 탯줄로부터 가능한 한 많은 상기 기질 와튼 젤리를 회수하도록 합리적인 노력이 이루어지는 한, 상기 용어 기질 와튼 젤리의 “부분”과 대립되지 않는다.

상기 탯줄의 가장 바깥 층(또한 탯줄 라이닝, 탯줄 조직, 또는 탯줄 라이닝 막으로 불리며, 도 1에 1a로 개략적으로 기술)은 본 발명의 상기 방법에 세포들의 바람직한 근원이 아니다. 상기 탯줄 그 자체가 태반의 연장이기 때문에, 상기 탯줄 라이닝 막은 태반을 덮고 있는 양막의 연장이다. 상기 탯줄 라이닝 막은 두 층을 포함한다: 양막(또는 상피) 층(또한 탯줄 라이닝 막으로 불림) 및 양막 아래(또는 중간엽) 층. 상기 인간 탯줄은, 예컨대 편평 입방체 상피 세포들(squamous-cubic epithelial cell)의 단일/다수의 층(들)에 의해 덮여있다(Copland et al., Placenta, 2002; vol. 23, p. 311-321; Mizoguchi et al., J. Dermatol. Sci., 2004, vol. 35, p. 199-206); 이러한 세포들은 본 발명의 상기 방법에서 분리되는 것이 바람직하지 않다. 본 발명의 상기 방법의 일 구현예에서 상기 양막 층으로부터 세포들이 그리고 상기 양막 아래 층으로부터 세포들이 분리되지 않고, 따라서 그러한 세포들이 추가 하류에 선택적인 증식에서 시작 물질로 사용되지 않는 것이 바람직하다.

상기 탯줄의 내부 조직 구조는 두가지 동맥들 및 한가지 정맥 및 점액 결합조직의 주변 매트릭스(기질 와튼 젤리)로 구성된다. 상기 와튼 젤리는 섬유모세포 유사 세포들(Parry, 1970, J. Anatomy, vol. 107, p. 505-518) 및 가끔 비만세포(mast cell)들을 포함하는 것으로 기술되었다. 게다가, 상기 와튼 젤리는 프로테오글리칸, 주로 히알루론산이 풍부한 무정형 기저 물질을 포함한다.

바람직하게 본 발명에 따른 상기 방법에 사용되는 상기 탯줄은 또한 “만삭(full term)”으로 일컬어지는, 만삭(term)에 출산으로부터 온다. 더 정확하게, 본 발명에 따른 상기 방법에 사용되는 상기 인간 탯줄은 임신(gestation) 38 내지 42 주 내, 더 바람직하게 임신 39 내지 41 주 내에 출산으로부터 온다. 일 구현예에서, 상기 인간 탯줄은 자연적(질식) 출산으로부터 온다; 대안적인 구현예에서, 상기 인간 탯줄은 비자연적 출산, 예컨대 제왕절개(Cesarean section)로부터 온다.

일 구현예에서, 인간 또는 동물 출산으로부터 상기 탯줄을 얻는 것은 본 발명의 부분이 아니다. 그 구현예에서, 본 발명의 상기 방법은 상기 탯줄이 얻어진 후에 시작된다. 다시 말해서, 본 발명의 상기 방법은 그 후 단계 (a) 전에 얻어진 시작 물질로 탯줄을 사용하여 실행된다.

상기 탯줄의 분절

또한, 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명가들은 상기 탯줄을 기계적으로 해부(dissect)하는 것이 이점이 있다는 것을 발견했다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이 해부는 바람직하게 분절 및 분할을 모두 포함한다.

제1 단계에서, 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 상기 탯줄을 분절하는 것이 이점이 있다. 분절은 선택적이지만 바람직하다. 특히, 분절은 다음 단계들을 다루기에 그리고 확실하게 재현하기에 더 쉽도록 만든다. 게다가, 상기 분절은 다음 분할 단계에서 기질 와튼 젤리에 대해 분리 효율을 향상시킨다. 따라서, 상기 분절은 아래에 기술된 상기 탯줄(세그먼트들)을 분할하는 단계 전에 바람직하게 발생한다.

본 발명에 따른 분절은 물리적 수단들, 예컨대 가위들 또는 메스에 의해 통상적으로 달성된다. 상기 탯줄을 분절하여, 탯줄 세그먼트들은 얻어진다(설명을 위해 예컨대 실시예 1 참조). 상기 용어 세그먼트는 본 명세서에서 그러한 탯줄 절단을 가리키기 위해 사용된다. 바람직하게 상기 분절은 상기 탯줄에 수직적이다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 탯줄에 관해서 수직적이라는 것은 상기 탯줄의 절단 방향이 상기 탯줄의 방향에 대해 약 90 °의 각을 갖는다는 것을 의미한다. 상기 각도의 측정을 위해, 상기 탯줄은 바람직하게 늘려진 방식, 즉 꼬임(curl) 또는 구부러짐(bend) 없이 놓인다. 약 90 °는 75 ° 내지 105 °, 바람직하게 80 ° 내지 100 °, 더 바람직하게 85 ° 내지 95 °를 의미한다. 통상의 기술자는 그의 경험에 기초해서, 또한 각도를 측정하는 장치 없이도 상기 탯줄을 수직으로 절단할 수 있을 것이다. 그럼에도 불구하고, 장치는 만일 원한다면 상기 각도를 측정하기 위해 사용될 수 있다.

더 바람직하게는, 상기 수직적인 세그먼트들은 바람직하게 각각 약 1 내지 약 4 cm, 바람직하게 약 2 내지 약 3 cm, 및 더 바람직하게 약 2.5 cm의 길이를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 혈관들의 상기 세그먼트(들)은 단계 (b) 전에 상기 탯줄의 상기 세그먼트(들)로부터 제거된다. 특히, 바람직하게는 수직으로, 상기 탯줄의 분절 후에 상기 혈관들, 또는 더 정확하게 혈관들의 세그먼트들을 제거하는 것이 바람직하다.

상기 분절은 선택적이지만 이점이 있고 따라서, 그것은 바람직하게 본 발명의 상기 방법의 부분이다. 상기 분절은 바람직하게 살균된 조건들에서 수행된다.

기질 와튼 젤리를 얻기 위한 분할

일반적으로, 포유류 탯줄, 및 특히 인간 탯줄은 세포의 특성들 및 세포 외 매트릭스(extracellular matrix) 인자들이 서로 다르다는 조직 구획화(tissue compartmentalization)를 보여준다. 구조적 및 기능적 연구들(또한 도 1 참조)에 기초하여, 적어도 6 가지의 구별되는 부위들 또는 섹션들은 기술되었다: 여기서 외부에서 내부로의 순서에서 리스트가 작성되는데 반해 숫자들은 도 1에서 숫자들을 가리킨다: 탯줄 라이닝(양막 상피 및 양막 아래 세포들을 포함)(1), (혈관 간) 기질(기질 와튼 젤리로 관행적으로 이름 붙여짐), 혈관 간 기질(4), 혈관 주위 기질(5), 혈관(2 및 3), 양막 아래 기질(1b), 틈(cleft)(미도시).

최신 기술에서, 혈관 주위 세포들은 혈관 구조(vasculature)에 통상적으로 근접에서 이동한다는 가정을 고려한다면, 와튼 젤리의 MSC의 다수는 상기 혈관 주위 영역으로부터 기원한다고 간주된다(Davies et al, Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol., 6, p. 1620-1630).

그러나 본 발명자들은 UC로부터 MSC를 추출하는 것을 목표할 때, 섹션적 접근이 이점이 있고 우수한 특성들을 가진 MSC들을 포함하는 상기 섹션이 상기 기질 와튼 젤리라는 놀라운 발견에 도달했다. 본 발명자들은 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분으로부터 유래된 세포들이 우수한 특성들을 가진다는 것을 놀랍게도 발견했다. 그러므로, 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분이 분리되는 것이 본 발명의 상기 방법의 필수적인 단계이다.

상기 기질 와튼 젤리의 분리 전에, 상기 탯줄 또는 특히 상기 탯줄 세그먼트들을 헹구는 것이 중요하다. 헹굼에 적절한 것은 선택적으로 항체들로 보충된, 이상적으로 생리학적 pH에서 또는 그 근접에서 완충되거나 근접하고 등장성인(isotonic) 수용성 용액이다. 예컨대, HEPES-완충 식염수(HEPES-Buffered Saline Solution, HBSS) 또는 인산염 완충 식염수(phosphate buffered saline, PBS), 바람직하게는 300 μg/ml의 젠타마이신(gentamycin) 및 0.15 μg/ml의 암포테리신 B(amphotericin B)로 보충된 HBSS가 적절하다. 통상적인 헹굼 시간은 바람직하게 1 내지 30분, 바람직하게 대략적으로 10분일 수 있다. 그 시간 동안, 기계적인 운동, 예컨대, 쉐이킹(shaking)은 상기 탯줄, 또는 바람직하게 탯줄 세그먼트들을 수용성 헹굼 용액에 적절하게 노출시키기 위해서 채용된다. 특히, 상기 탯줄이 분절된 후에, 분절로부터 야기된 상기 세그먼트 계면들에서의 혈액 잔여물들이 이에 의해 제거될 수 있기 때문에, 상기 헹굼은 중요하다.

그 후, 상기 기질 와튼 젤리의 분리를 위해, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 바람직하게 상기 탯줄 또는 더 선호되는 상기 탯줄 세그먼트(들)은 분할된다. 이에 의해, 상기 바람직한 기질 와튼 젤리는 얻어진다. 기질 와튼 젤리를 얻는 다른 방법들은 본 명세서에서 기술되는 상기 분할에 대안으로 적절하고, 또한 본 발명의 일부이다. 바람직하게, 그러나, 상기 기질 와튼 젤리는 본 명세서에서 기술되는 분할하는 접근에 의해 얻어진다.

상기 바람직한 와튼 젤리를 분리하는 목적을 위해, 상기 탯줄 또는 상기 탯줄의 세그먼트(들)의 측면 개방이 이점이 있다는 것을 증명했다. 바람직하게, 상기 탯줄 또는 상기 탯줄의 세그먼트(들)은 길이 방향으로 예컨대, 메스로 절개된다(incise). 길이방향은 상기 탯줄의 연장에 평행을 의미한다. 세그먼트당 하나의 길이 방향 절개는 다수의 절개들 보다 선호된다. 다음에 기술되는 바와 같이, 측면 개방, 또는 더 구체적으로 길이 방향 절개는 상기 탯줄의 다양한 섹션들이 다음에 효율적으로 분리될 수 있고 특히 상기 기질 와튼 젤리가 분리될 수 있는 것이 가능하게 한다.

본 명세서에서 상세하게 기술되고 본 명세서에 실시예들에서 설명되는 바와 같이, 상기 기질 와튼 젤리로부터의 세포들이 매우 이롭다는 것이 증명되었다. 따라서, 본 발명에서 하류 과정을 위해 분할되고 선택된 상기 와튼 젤리는 혈관 주위 부위를 배제하고 따라서 임의의 혈관 주위 와튼 젤리를 배제한다. 다시 말해서, 하류 과정을 위해 분할되고 선택된 상기 와튼 젤리는 상기 기질 와튼 젤리이다. 본 발명에 따라 분리된 기질 와튼 젤리로부터의 세포들이 우월하다는 발견은 본 발명자들의 놀라운 발견이다. 그것은 이전에 미세 구조, 면역조직화학(예컨대, Akerman et al., Gynecol. Endocrinol., 2002, vol. 16, p. 299-306 및 Karahuseyinoglu et al., Stem Cells, 2007, vol. 25, p. 319-331) 및 양막 아래(1b), 혈관 간(4), 및 혈관 주위(5) 영역들 사이에 세포들의 수 및 본성에서 차이가 있고, 제공되는 공간에서 세포들의 밀도가 양막 아래, 혈관 간, 및 혈관 주위 영역들 사이에서 다르고: 세포 밀도가 양막 아래 부분에서 상당히 낮은데 반해 혈관 주위 영역은 가장 높은 세포 밀도를 갖는다(Takechi et al., 1993, Placenta; vol. 14, p. 235-245; Karahuseyinoglu et al., 2007, Stem Cells, vol. 25, p. 319 -331)는 인 비트로에서 기능적 연구들(Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229; Karahuseyinoglu et al., Stem Cells, 2007, vol. 25, p. 319-331)에 의해 확립되었다. 이 단락에서 용어 “세포 밀도”가 3 차원 공간에 관해 비관습적으로 사용되는데 반해, 본 개시의 나머지에서 상기 용어가 2 차원 영역에 관해서 사용된다는 것에 주목한다. 예컨대, 초기 연구에서, 장막(serosa)에 부착된 및 상기 혈관들에 부착된 샘플들이 탯줄로부터 유래된 기질 세포들에 대한 근원이라고 제안되었다(예컨대, US 2004/0136967 A1). 비록 세포들이 와튼 젤리로부터 분리될 수 있고 와튼 젤리 내에 다른 세포 집단들이 존재할 수 있다고 이전에 알려져 있을지라도, 본 발명에 따른 상기 기질 와튼 젤리의 구체적인 선택이 초기 간행된 접근들(예컨대, US 2004/0136967 A1)보다 더 구체적인 선택이고, 다른 것들(예컨대, WO 2004/072273 A)에 의해 제안된 것과 다른 선택이다. 따라서, 물리적인 제거 전의 분할은 조직이 일반적으로 세포들의 분리 이전에 필수적으로 선택되고 분할되지 않지만 여기서 바람직한 세포들이 예컨대 원하지 않는 세포들의 선택적 파괴(음성 선택, 예컨대 US 2004/0136967 A1 참조)에 의해 세포 집단으로부터 분리된다는 문헌의 제안들과 현저하게 다르다. 본 발명의 본 발명자들의 지식에서, 상기 탯줄의 기질 와튼 젤리로부터 기원하는 세포들이 동질성(homogeneity), 크기(부피 및 표면적, 각각), 분화 잠재력 및 줄기세포능에 관해서 혈관 주위 세포들보다 우수하다고 구체적으로 알려져 있지 않았다. 따라서, 이 기술 분야의 수준에 따른 주요 사고와 반대로, 본 발명자들은 상기 기질 와튼 젤리로부터 유래된 세포들이 많은 측면에서 우수하다는 것을 발견했다. 이러한 측면들의 몇몇은 본 명세서에서 실험적인 실시예들에 설명되었다. 일반적으로, 동질적, 형태학적(morphological) 및 기능적인 특성들을 가진 세포 집단들이 상대적으로 균일한 세포에 기초된 생성물들을 발전시키기 위해 적합할 것으로 예상(envisage)될 수 있다. 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 만일 있더라도, 상기 균일성은 상기 기질 와튼 젤리가 통상적으로 혈관 주위 영역보다 더 적은 혈관주위세포들 및 내피 세포들을 포함한다는 사실 때문일 수 있다는 것이 가능하다.

본 발명자들은 놀랍게도 상기 탯줄의 상기 기질 와튼 젤리로부터 기원하는 세포들이 특히 이점이 있다는 것을 발견했다. 양막 아래 기질(통상적으로 와튼 젤리를 포함)(1b)은 기계적 수단들로 양막 상피(1a)의 내부 표면을 긁어내는 것(scrape out, 스크레이핑)에 의해 얻어질 수 있으나; 양막 상피의 부분의 바람직하지 않은 획득을 야기할 수 있는, 상기 양막 상피의 파열(rupture) 또는 조각화(fractioning)를 피하기 위해 주의해야 한다.

이점들은 상기 세포 집단의 동질성 및 줄기 세포 유사 특성들을 포함한다. 특히, 탯줄 혈관 및 혈관 주위 부위의 부재, 및 따라서 상기 탯줄 혈관 및 혈관 주위 영역으로부터 세포들의 부재에서, 이러한 이점들은 달성될 수 있다.

따라서, 상기 탯줄로부터 상기 기질 와튼 젤리 또는 그의 부분들을 분리시키는 단계 (a)가 상기 탯줄의 또는 그의 세그먼트들의 분할을 포함하는 것이 바람직하다. 바람직하게, 그것은 상기 탯줄의 세그먼트들의 분할을 포함한다. 분할 단계 동안, 상기 바람직한 기질 와튼 젤리는 상기 혈관 주위 와튼 젤리를 포함할 수 있는, 상기 혈관 주위 부위를 가지는 상기 혈관들로부터 분리된다. 분할의 단계 동안, 상기 기질 와튼 젤리는 또한 적어도 양막 상피로부터 분리된다. 양막 상피의 부분의 바람직하지 않은 획득을 야기할 수 있는, 상기 양막 상피의 파열 또는 조각화를 피하기 위해 주의해야 한다.

상기 분할은 바람직하게 살균 조건에서 수행된다.

상기 분할은 본 발명에 따른 상기 방법의 단계 (a), 즉 탯줄로부터 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리하는 단계의 필수적인 부분이다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 탯줄로부터 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 것은 상기 탯줄을 물리적인 분리에 있게 함으로써 달성되고, 여기서 상기 탯줄의 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역 및 적어도 상기 탯줄 라이닝의 양막 층은 폐기되고, 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분은 유지된다.

분할, 더 정확하게 기계적인 제거에 의한 분할을 위해, 위에서 기술된 바와 같이 상기 탯줄이 이전에 분절되고, 위에서 기술된 바와 같이 추가적으로 길이 방향으로 절개되는 것이 크게 이점이 있는 것을 증명했다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 상기 방법의 단계 (a)가 위에서 기술된 바와 같이 분절 단계, 및 여기서 기술된 바와 같이 분할 단계를 포함한다.

탯줄로부터 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 적절한 방법은 상기 탯줄로부터 혈관들 및 혈관 주위 부위의 제거를 포함한다. 적절하게, 혈관 주위 와튼 젤리를 포함하는 것으로 본 문헌에서 제안되는 상기 혈관 주위 부위는 또한 탯줄 라이닝, 특히 적어도 탯줄 라이닝의 양막 층으로부터 분리된다.

따라서, 본 발명에 따른 상기 분할은 상기 탯줄로부터 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역의 물리적 제거에 의해 특징지어진다. 본 발명에 따라, 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역은 단계 (a) 전 또는 단계 (a)의 부분으로서 제거될 수 있고, 이는 바람직하다. 본 발명에서 선호되는, 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역을 제거하는, 하나의 기술적으로 이점이 있는 방법은 상기 탯줄로부터 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역을 벗겨냄으로써 특징지어진다. 예컨대, 상기 탯줄의 혈관들(두개의 정맥들 및 하나의 동맥)은 살균된 집게(forceps)로 벗겨진다.

본 발명자들은 혈관을 벗겨내는 것, 예컨대 혈관을 당기는 것에 의해서 또한 상기 혈관 주위 영역을 제거한다는 것을 관찰했다. 바람직한 구현예에서, 상기 혈관 주위 영역은 그것 전체에서 제거된다; 이것은 일단 상기 혈관들이 제거된다면, 혈관 주위 영역에 속하는 세포들은 상기 탯줄(세그먼트들)에 남지 않는다는 것을 의미한다. 임의의 다른 방법은 상기 혈관 주위 영역이 완전히 제거되는 한 동등하게 적절하다. 상기 탯줄 혈관구조의 외부 벽에 인접한(proximal) 상기 부위는 혈관 주위 부위다. 상기 혈관 주위 부위는 통상적으로 상기 혈관들의 외부 벽으로부터 약 3 mm 이하에 연장된 부위 내에 있다. 상기 혈관 주위 부위는 상기 혈관들이 벗겨질 때, 상기 혈관들과 함께 제거된다. 상기 탯줄의 혈관구조의 외부 벽에 인접한 상기 혈관 주위 부위 내에 있을 수 있는 임의의 와튼 젤리는 혈관 주위 와튼 젤리로 일컬어질 수 있다. 상기 혈관 주위 와튼 젤리는 통상적으로 상기 혈관의 상기 외부 벽으로부터 약 3 mm 이하에 연장되는 부위 내에 있다. 임의의 혈관 주위 와튼 젤리는 상기 혈관들이 벗겨질 때, 상기 혈관들과 함께 제거된다.

따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 혈관들은 상기 탯줄로부터 또는 상기 탯줄의 세그먼트(들)로부터 벗겨진다. 벗기는 것은 기계적인 수단들, 예컨대 겸자(tweezer)들 또는 그 목적을 위한 임의의 다른 적절한 수단들로 상기 혈관(들)을 잡음으로써, 그리고 상기 혈관(들)을 당김으로써 달성될 수 있다. 바람직하게, 상기 혈관들은 차례 차례 당겨지지만, 이것은 엄격한 요건이 아니다. 상기 혈관들이 벗겨지는 동안, 예컨대 기계적인 수단들, 예컨대 겸자 또는 그 목적을 위한 임의의 다른 적절한 수단들로 그것을 잡음으로써, 상기 탯줄 또는 이의 세그먼트는 대개 고정된다. 이에 의해, 기계적인 힘은 적용될 수 있고 상기 혈관들은 제거될 수 있다. 상기 혈관의 개방 및/또는 혈관의 또는 혈관 주위의 세포들의 손실이 회피되어야 한다는 의미에서, 상기 제거는 주의를 가지고 수행되어야 한다. 상기 탯줄 매트릭스를 당기는 것이 회피, 또는 대안적으로 최소로 유지되어야 한다는 의미에서, 상기 제거는 주의를 가지고 수행되어야 한다.

바람직하게, 상기 단계 또는 상기 혈관들을 제거하는 것 후에, 상기 탯줄, 또는 각각의 세그먼트(들)은 상기 혈관들(및 따라서 또한 PVWJ)이 완전히 제거된 것을 확실히 하기 위해 광학적으로 다시 검사된다.

벗겨진 후에 그들에게 부착되어 있는 임의의 조직을 포함하는 상기 혈관들은 폐기된다. 그것은 벗겨진 후에 그들에게 부착되어 있는 임의의 조직을 포함하는 상기 혈관들이 효소적 처리의 추가적인 하류 단계에 적용되지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 상기 방법에 따라, 상기 혈관 주위 부위 와튼 젤리는 세포들의 분리를 위한 근원으로 사용되지 않는다. 따라서, 혈관 주위 와튼 젤리는 세포들의 분리를 위한 근원으로 사용되지 않는다. 설명 목적들을 위해, 도 1 및 2에 상기 혈관 주위 와튼 젤리가 설명된다(도 1에 5).

본 발명에 따라, 상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 상기 영역은 폐기된다. 상기 혈관들 주위 상기 영역은 적어도 직경에서 약 2.0 mm, 예컨대 직경에서 약 2.0 mm, 바람직하게 2.5 mm, 및 더 바람직하게 3.0 mm이고, 이에 의해 측정은 상기 혈관의 외부 표면으로부터 외부로 연장한다(도 2 참조). 따라서, 상기 탯줄의 상기 혈관들 주위 적어도 약 2.0 mm, 예컨대, 2.0 mm, 바람직하게 2.5 mm, 및 더 바람직하게 3.0 mm은 본 발명에 따른 세포들의 분리를 위한 시작 물질로 사용되지 않는다. 본 명세서에서 기술되는 바와 같이, 이것을 편하게 달성하는 바람직한 방법은 상기 탯줄로부터 상기 혈관들, 더 정확하게, 탯줄 세그먼트들로부터 혈관 세그컨트들의 물리적인 제거(“벗기는 것(stripping out)”)이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 상기 혈관들은 상기 탯줄로부터 물리적으로 제거되거나 혈관 세그먼트들이 상기 탯줄의 세그먼트들로부터 물리적으로 제거된다. 후자 선택은 바람직하다; 이것은 상기 세그먼트들로부터 상기 혈관들의 제거 전에, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 상기 탯줄의 분절을 요구한다.

상기 혈관들 및 상기 혈관 주위 영역이 제거되었으므로, 상기 기질 와튼 젤리는 상기 혈관 없는 탯줄 또는 혈관 없는 탯줄 섹션들로부터 다음과 같이 얻어질 수 있다: 바람직하게, 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분들을 분리하는 것은 상기 양막 아래 기질(1b)을 상기 탯줄 라이닝 막(1a)로부터 물리적으로 분리하는 단계에 의해 추가적으로 특징지어진다. 이것은 상기 와튼 젤리를 상기 탯줄 라이닝 막으로부터, 특히 적어도 상기 탯줄 라이닝 막의 상피 층으로부터 분리하는 것을 포함할 수 있다. 이에 의해, 각각의 탯줄 라이닝 물질이 없는 기질(기질 와튼 젤리를 포함)이 얻어진다. 바람직하게, 상기 탯줄 라이닝 막으로부터, 특히 적어도 상기 탯줄 라이닝 막의 상피 층으로부터 기질(아마 와튼 젤리를 포함)을 물리적으로 분리하는, 상기 단계는 또한 위에서 기술된 바와 같이 얻을 수 있는 상기 세그먼트들에서 행해진다. 비록 이 단계의 빠른 수행이 바람직하지만, 현실적인 이유들 때문에 상기 단계는 세그먼트별 기초(즉, 한 세그먼트 후 다른 세그먼트)에서 일반적으로 수행된다.

상기 기질 와튼 젤리는 통상적으로 상대적으로 느슨한 젤리 같은 경도(consistency)를 갖는다; 그러므로 그것은 상기 혈관 없는 탯줄, 또는 바람직하게 혈관 없는 탯줄 세그먼트들로부터 기계적으로 해부될 수 있다.

기계적인 해부는 바람직하게 긁어내는 것에 의해 특징지어진다. 긁어내기 위해, 그러한 목적을 위해 적절하거나 고안된 임의의 도구, 바람직하게 기계적인 도구가 사용될 수 있다. 제거는 바람직하게 기계적인 수단들에 의한다; 적절한 기계적인 수단들은 이 기술 분야, 예컨대 US20080181967 A1, WO2008146992 A1, 및 WO2007080591 A2에 개시된다. 일 구현예에서, 기계적인 수단들은 UC 세그먼트들로부터 매트릭스 조직의 조각들을 자르기(snip) 위해 사용된다. 일 구현예에서, 상기 탯줄(세그먼트들)의 내부 표면은 기계적인 수단들로 긁어내어진다. 일 구현예에서, 양막 상피 막은 기계적으로 예컨대, 기계적인 수단들로 제거된다. 만약 상기 긁어내는 것이 주의 깊게 행해진다면, 이는 바람직하고 상기 상피 층은 손상되지 않고 따라서, 상피 층의 세포들이 긁어내는 것에 의해 얻어질 수 없다.

매트릭스 조직을 수집할 때, 양막 상피 막의 조각들을 포함하지 않는 것이 중요하다. 이것을 달성하기 위해, 탯줄 라이닝의 절개는 피해져야하거나 최소에서 유지되어야 한다. 특히, 기질 와튼 젤리를 상기 탯줄 라이닝 막으로부터 물리적으로 분리시키는 것은 바람직하게 상기 탯줄 라이닝을 기계적으로 해부하는 것 없이, 또는 최소의 범위에서만 상기 탯줄 라이닝을 해부하여 상기 와튼 젤리를 긁어내는 것에 의해 바람직하게 특징지어진다. “기계적으로 해부하는 것(mechanically dissecting)”은 절개, 압축(squeeze), 또는 그렇지 않으면 기계적인 힘의 적용에 의해 상기 조직 통합성에 영향을 미치는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, “최소의 범위(minimal extent)”는 하나의 단일 길이 방향, 바람직하게 탯줄의 방향에 평행한 절개로 구성된다. 이에 의해, 상기 탯줄, 또는 상기 탯줄의 세그먼트는 경우에 따라 옆으로 개방되고 이에 의해 상기 탯줄의 내부로의 접근을 제공한다.

선택적으로, 또한 양막 아래 층의 세포들은 얻어지지 않는다. 이것을 달성하기 위해, 긁어내는 것은 상기 탯줄 라이닝 막 근처에 과도한 기계적 힘을 행사하지 않으면서, 큰 주의를 가지고 수행되어야 한다. 이 구현예에서, 전체 탯줄 라이닝(양막 층 및 양막 아래 중간엽 층을 포함)은 바람직하지 않다.

여하튼, 상기 양막(상피) 층은 바람직하지 않다. 남아있는 임의의 바람직하지 않은 탯줄 라이닝 물질은 상기 바람직한 기질 와튼 젤리의 기계적인 제거 후에 폐기된다.

이에 의해, 기질 와튼 젤리 조직은 얻어진다.

본 발명에 따라 분리된 상기 세포들의 이점이 있는 특성들에 기초하여, 그러나 본 발명자들은 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 증식하는 유익한 능력을 갖는 덜 성숙한 세포들이 혈관들로부터 상대적으로 더 멀리 따라서 양막 표면에 더 가깝게 위치되고, 그런데 반해 더 분화된 세포들은 상기 탯줄 혈관들에 더 가까운 근처에서 발견된다는 것으로 결론내렸다. 결론적으로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 세포들의 분리를 위한 기원의 부위로서 상기 기질 와튼 젤리를 선택했다.

바람직한 구현예에서, 탯줄로부터 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 단계 (a)는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 분할의 단계 및 아래에서 기술된 바와 같이 민싱(mince) 단계를 포함한다.

더 바람직한 구현예에서, 탯줄로부터 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 단계 (a)는 위에서 기술된 바와 같이 분절의 단계, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 분할의 단계 및 또한 아래에서 기술된 바와 같이 민싱 단계를 포함한다.

기계적인 처리에 의해 조직 조각들의 크기를 줄이는 것

바람직하게, 상기 분할에 의해 얻어진 상기 기질 와튼 젤리는 다음에 조직 조각들의 크기를 줄이는 것을 목표로 하는 기계적 처리를 받는다. 상기 기계적 처리는 기질 와튼 젤리의 조각들의 크기를 줄이기 위해, 상기 기질 와튼 젤리 내에 물리적 결합들을 해부하는 것을 목표로 한다. 아래에서 기술된 바와 같이, 상기 기계적 처리는 다음의 효소적 처리에 관해서 이점이 있다. 상대적으로 작고 상대적으로 균일한 기질 와튼 젤리의 상기 조각들의 크기는 몇 가지 이점들과 연관되어 있다: 그것은 증가된 표면적과 연관되어 있고 따라서 상기 물질들이 효소적 처리를 위해 사용된 효소(들)에 접근하도록 만드는 것으로 이해되고, 그것은 MSC들에 대해 적절한 성장 요인들 및 다른 요인들을 포함하는 것으로 이해되는, 혈소판 용해물이 실질적으로 전체 분리된 와튼 젤리에 가까운 근접에 있도록 한다.

바람직하게, 상기 기계적 처리는 날카로운 가위들 및/또는 메스로 상기 조각들을 미세하게 민싱함으로써 수행되지만, 상기 세포들이 실질적으로 기계적으로 손상되거나 파괴되지 않는 한, 상기 조각들의 기계적인 줄임을 위해 적절한 임의의 다른 수단들은 적합하다. 예컨대, 각각의 도구들은 Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany)으로부터 이용가능하다. 여하튼, 상기 기계적 처리는 살균 조건들에서 바람직하게 수행된다.

상기 기계적으로 처리된(예컨대, 민싱된(mince)) 조직은 상기 조직이 건조되는 것을 방지하도록 선택적으로 수용성 용액에 첨가되고 그 안에 분산된다. 수용성 용액, 이상적으로 생리학적 pH에서 또는 근접에서 완충되고 등장성인, 선택적으로 항체들로 보충된 수용성 용액이다. 예컨대, HEPES-완충 식염수(HBSS) 또는 인산염 완충 식염수(PBS), 바람직하게 HBSS가 적절하다. 선택적으로, 상기 수용성 용액은 적절한 농도에서 항체들을 포함한다.

바람직하게 상기 기계적 처리된(예컨대, 민싱된) 조직은 다음에 적절한 살균 접시, 예컨대 페트리 접시(Petri dish)에 수용된다(풀링된다). 조직 분리 후에, 그리고 아래에 기술될 효소적 소화 전에, 완전한 스케일 실행에서 얻을 수 있는 총 민싱된 조직 중량은 일반적으로 14 그램 이상, 예컨대, 16 그램 이상, 또는 18 그램 이상이다.

효소적 처리

본 발명에 따르면, 세포들은 효소적 처리에 의해 상기 탯줄 또는 이의 세그먼트들 또는 이들로부터 얻어진 민싱된 조직으로부터 방출된다. 초기 교시들(예컨대, Conconi et al., 2011, Open Tissue Engineer. Regen. Med. J., vol. 4, p. 6-20)에 대조적으로, 본 발명자들은 상기 효소적 처리가, 본 명세서에서 바람직한 것으로 기술된 바와 같이 상기 조건들 하에서 수행되는 특정 때, 즉 온화한 조건에서 세포 손상을 특징으로 하지 않는 이점이 있는 MSC들을 산출한다.

상기 민싱된 조직 구현예는 바람직하다. 따라서, 바람직하게, 세포들은 상기 탯줄 또는 이의 세그먼트들 또는 이의 섹션들로부터 얻어진 민싱된 조직으로부터 효소적 처리에 의해 방출된다.

특히, 본 발명의 상기 방법의 단계 (b)에서, 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분은 효소적 처리를 받고, 이에 의해 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분으로부터 적어도 하나의 세포를 방출한다. 통상적으로, 다수의 세포들이 방출된다. 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분은 효소적 소화가 적용된다. 특히, 상기 세포들은 상기 탯줄의 특정 섹션 및 위에서 기술된 바와 같이 상기 선행 단계 (a) 동안에 얻어질 수 있는, 상기 기질 와튼 젤리로부터 방출된다. 상기 효소적 처리를 포함하는, 본 발명에 따른 상기 방법의 상기 단계는 “효소적 처리(enzymatic treatment)”, “효소 소화(enzyme digestion)”, 또는 이와 같은 것, 또는 간단히 “단계 (b)”로 일컬어질 수 있다.

상기 효소적 처리는 상기 탯줄로부터 상기 기질 와튼 젤리의 물리적 분리와 동시에 및/또는 다음에 선택적으로 발생할 수 있다; 그러나, 다음은 훨씬 더 바람직하다. 더 정확하게, 본 발명의 상기 방법의 단계 (b)가 본 발명의 상기 방법의 단계 (a) 다음에 있는 것은 바람직하다. 그 구현예에서, 단계 (b)는 효소적 활성이 추가되는, 본 발명에 따른 상기 방법에 유일한 단계이다.

상기 탯줄 조직, 구체적으로, 상기 기질 와튼 젤리로부터 세포들의 방출로 특성을 이루는, 본 발명의 상기 접근은 선행 기술분야의 접근들과 현저하게 다르고, 여기서 이와 같이 탯줄 조직은 배양되고, 세포들은 예컨대 이들로부터 이동 또는 세포 분열 또는 둘 모두의 결과로 조직들로부터 성장한다(US 2004/0136967 A1). 그러나, 본 발명에 따라서, 상기 기질 와튼 젤리에 포함된 적어도 하나의 세포들, 또는 바람직하게 상기 세포들의 대다수는 이들로부터 이동 또는 세포 분열이라기보다는 효소적 처리에 의해 방출된다. 이것은 상기 분리를 위해 충분한 시간적 개선을 제공한다: 며칠 대신에(예컨대, 2004/0136967 A1), 상기 세포들은, 아래에서 상세하게 기술되는 바와 같이 몇 시간 내에 탯줄로부터 분리될 수 있다.

상기 효소적 처리는 상기 세포들이 적어도 하나의 효소를 가진 처리에 의해 상기 탯줄 또는 이의 세그먼트들 또는 이의 섹션들로부터 방출되는, 처리이다. 적절한 효소는 단백질 분해효소(protease)이다. 따라서, 상기 세포들은 바람직하게 적어도 하나의 단백질 분해효소를 가진 처리에 의해 상기 탯줄 또는 이의 세그먼트들로부터 방출된다. 단백질 분해효소(또한 펩티드 분해효소(peptidase) 또는 프로테이나제(proteinase)로 불림)는 단백질 가수분해(proteolysis), 펩티드 결합의 가수분해에 의한 단백질 이화작용(protein catabolism)을 수행하는 임의의 효소이다. 바람직하게, 상기 단백질 분해효소는 적어도 하나의 세포 외 매트릭스 단백질, 바람직하게 콜라겐을 소화할 수 있다. 바람직하게, 단계 (b)의 상기 효소적 처리는 효소 콜라겐 분해효소에의 노출을 포함하는 처리이다. 다시 말해서, 상기 적어도 하나의 단백질 분해효소는 바람직하게 콜라겐 분해효소이다. 다른 단백질 분해효소는 선택적으로 추가적으로 존재한다. 일 구현예에서, 근본적으로 콜라겐 분해효소 외 다른 단백질 분해효소는 존재하지 않는다. “근본적으로 다른 단백질 분해효소가 없다(Essentially no other protease)”는 첨가되는 상기 콜라겐 분해효소 제제는 합리적으로 가능한 최대 정도로 정제되고/또는 상기 콜라겐 분해효소 제제에서 다른 단백질 분해효소들의 활성은 일반적인 실험실 방법들에 의해 탐지될 수 없다는 것을 의미한다.

본 발명에 따라 추출을 위해 특히 적절하고 따라서 바람직한 효소는 콜라겐 분해효소(EC 3.4.24.7)이다. 용어 “콜라겐 분해효소(collagenase)”는 세포 외 매트릭스 단백질 콜라겐에서 펩티드 결합들을 깰 수 있는(더 구체적으로 가수분해할 수 있는) 효소적 활성을 가리킨다. 콜라겐은 상기 탯줄을 포함하는, 다양한 조직들의 세포 외 매트릭스에 존재한다. 콜라겐 분해효소는 세포 외 구조들을 파괴하는 것에 도움을 준다. 비록 원핵 기원으로부터, 특히 박테리아, 예컨대 Clostridium sp.로부터의 단백질 분해효소가 본 명세서에서 바람직하지만, 콜라겐 분해효소는 진핵 및 원핵 모두의 기원으로부터 이용가능하다. 상기 콜라겐 분해효소는 이의 자연적 근원으로부터 분리될 수 있거나, 재조합으로, 예컨대 E. coli.에서 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, 이의 자연적 근원, 예컨대 Clostridium sp.로부터의 콜라겐 분해효소는 바람직하다. 예컨대, 상기 콜라겐 분해효소는 Clostridium histolyticum로부터 일 수 있다.

달리 문맥상 지시하지 않는다면, “콜라겐 분해효소”는 본 명세서에서 효소적 활성을 가리키고, 그런데 반해 “콜라겐 분해효소 제제”는 상업적이거나 그렇지 않은, 콜라겐 분해효소 활성을 포함하는 제품을 가리킨다. 상기 콜라겐 분해효소 활성은 상기 콜라겐 분해효소 제제에서 존재하는, 순수(pure)하거나 그렇지 않은, 콜라겐 분해효소에 의해 제공된다.

콜라겐 분해효소 제제는 상업적으로 이용가능하다. 일부 구현예들에서, 사용되는 상기 콜라겐 분해효소 제제는 살균되거나 GMP 등급이다. 바람직하게, 상기 콜라겐 분해효소 제제는 콜라겐 분해효소 제제 NB4 또는 콜라겐 분해효소 제제 NB5 또는 콜라겐 분해효소 제제 NB6이고, 모두 SERVA(Heidelberg, Germany)로부터 온 것 또는 이들 중 임의의 것과 동등한 임의의 다른 콜라겐 분해효소 제제이다. 동등성은 NB4 / NB6 콜라겐 분해효소 제제 및 동등성이 측정되어야 하는 콜라겐 분해효소 제제와 동시에, 선택적으로 동등한 콜라겐 소화 활성을 측정하기 위한 적정(titrate) 실험에서 실시예 2A에서 기술된 상기 방법을 실행함으로써 측정될 수 있다.

선택적으로, 사용된 상기 콜라겐 분해효소 제제는 콜라겐 분해효소 활성 이외의 임의의 효소적 활성을 포함하지 않는다. 특히, 히알루로니다제(hyaluronidase) 활성이 존재하지 않는다는 것은 바람직하다. 다른 구현예들에서, 히알루로니다제 활성은 존재한다. 히알루로니다제와 콜라겐 분해효소의 조합이 이점이 있을 수 있다는 것이 이전에 보고되었다(예컨대, Bailey et al., Tissue Eng., 2007, vol. 13, p. 2003-2010). 그러나, 본 발명의 실험적인 실시예들에서, 만족스러운 결과들은 히알루로니다제가 첨가되지 않은 채 얻어졌다. 그러므로, 첨가된 히알루로니다제 활성이 상기 효소적 처리 동안 존재하지 않는 것이 본 발명에서 바람직하다.

일부 구현예들에서, 콜라겐 분해효소 활성 이외에 단백질 분해효소는 존재하지 않는다. 다른 구현예들에서, 하나 이상의 비콜라겐 분해효소 단백질 분해효소의 활성이 존재한다. 다른 단백질 분해효소들은 특정 단백질 분해효소들 또는 불특정 단백질 분해효소들, 엔도-(endo-) 또는 엑소-(exo-) 펩티드 분해효소들일 수 있다. 따라서, 선택적으로 다른 효소적 활성들, 예컨대 다른 단백질 분해효소들은 특히, 콜라겐 분해효소 이외에도 사용될 수 있다. 그러한 다른 효소적 활성들은 상기 콜라겐 분해효소 제제에 존재하거나 별도로 첨가될 수 있다. 아르기닌의 카르복실 펩티드 결합에서 단백질들을 쪼개는 프로테이나제 또는 동등한 것인, 예컨대, 클로스트리파인은(clostripain, EC 3.4.22.8, 또한 클로스트리디오펩티다제 B(clostridiopeptidase B), 클로스트리디움 히스톨리티쿰 프로테이나제 B(clostridium histolyticum proteinase B), 알파-클로스트리디파인(alpha-clostridipain), 클로스트리디오펩티다제(clostridiopeptidase), 엔도프로테이나제 Arg-C(Endoproteinase Arg-C)로 불림) 존재할 수 있다. 다른 상호 배타적이지 않은 예인 카제이나제 c(caseinase c, EC 3.4.24)는 존재할 수 있다. 다른 상호 배타적이지 않은 구현예에서 세린 단백질 분해효소인, 트립신(trypsin, EC 3.4.21.4)은 존재할 수 있다.

선택적으로, 사용된 상기 콜라겐 분해효소 제제는 단백질 가수분해 활성(proteolytic activity) 이외의 임의의 효소적 활성, 즉 콜라겐 분해효소 활성 및 비콜라겐 분해효소 단백질 가수분해 활성을 포함하지 않는다. 그러나, 일 구현예에서, 상기 효소적 처리는 히알루로니다제의 추가적인 존재에서 수행된다; 그러나 히알루로니다제; 이것은 단지 선택적이다.

적절하게, 물 및 소화를 위한 상기 효소, 즉 단백질 분해효소, 더 구체적으로 상기 콜라겐 분해효소, 및 선택적이지만 바람직하게 완충제를 포함하는 수용성의 용액이 제조된다. 상기 완충제는 pH가 바람직한 pH 범위에 있도록 한다. 바람직한 범위에 상기 pH를 완충시키기에 적절한, 임의의 완충제가 사용될 수 있다.

상기 효소, 및 상기 완충제, 및 물, 및 선택적으로 추가적인 재료들을 포함하는, 상기 수용성 용액은 소화 완충제(Digestion Buffer)로 불린다. 일부 구현예들에서, 상기 소화 완충제는 금속 킬레이트제(chelating agent) 예컨대, EDTA 또는 EGTA를 포함하지 않는다.

바람직하게, 상기 소화 완충제는 6.0 내지 9.0의 pH, 더 바람직하게 7.0 내지 8.0의 pH를 가진다. 이것이 생리학적인 pH에 가까울 뿐만 아니라, 적절한 효소들은 또한 pH 7.0 내지 pH 8.0 범위에서 최적의 pH를 가진다고 기술되었다. 따라서, 상기 소화는 그 pH 범위에서 바람직하게 수행된다. pH는 바람직하게 소화가 발생하는 온도에서 측정된다.

선택적으로, 칼슘 이온들은 상기 소화 완충제에 존재한다; 예컨대, 수용성 칼슘 염, 예컨대, 칼슘 클로라이드(calcium chloride)는 상기 소화 완충제의 제조 동안 첨가될 수 있다. 예컨대, 상기 효소적 처리가 콜라겐 분해효소 처리일 때, 상기 칼슘 이온들의 존재는 이익적이고 따라서 바람직하다.

선택적으로, 헤파린(heparin)은 상기 소화 완충제에 존재한다. 헤파린은 혈소판 용해물을 포함하는 액체 조성물들이 클로깅(clog)을 피하도록 하는데 적절한 첨가제라고 알려져 있다(예컨대, Lohmann et al., 2012, PLoS ONE, vol. 7e37839). 본 발명에 따르는 상기 소화 완충제 내 헤파린의 적절한 농도는 0.1 내지 100 U/mL, 예컨대, 1 내지 10 U/mL, 예컨대, 2 U/mL의 헤파린이다. 상기 mL는 상기 소화 완충제의 총 부피를 가리킨다. 헤파린의 1 단위(“하웰 단위(Howell unit)”)는 0 ℃에 24 시간동안 고양이의 혈액 1 ml를 유지하기 위해 요구되는, 순수한 헤파린 0.002 mg에 대략적으로 동등한 양이다("Online Medical Dictionary", 2000, Centre for Cancer Education).

상기 소화를 시작하기 위해, 상기 소화 완충제는 소화될 상기 조직에 또는 그 반대로 첨가된다. 상기 효소를 포함한 수용성 용액, 즉 소화 완충제, 및 상기 조직이 혼합되는 것이 중요하다. 바람직하게, 소화 완충제 및 조직의 총체는 적절한 혼합을 보장하기 위해 즉시 부드럽게 교반된다. 상기 첨가에 의해, 상기 효소적 처리는 시작된다.

바람직하게, 이전에 분리된 상기 기질 와튼 젤리 유래 조직 및 상기 소화 완충제는 정의된 비율에서 혼합된다. 원한다면, 이것은 그 중에서도 상기 방법의 재현성 및 온화한 조건에서 소화의 이점들과 관련이 있다.

비율 = X mg 조직 / 1 ml 소화 완충제

상기 민싱된 조직은, 상기 소화 완충제와 혼합되기 직전에, 상기 조직이 건조해지는 것을 방지하기 위해, 식염 완충 용액(바람직하게 HEPES-완충 식염수, HBSS)에 선택적으로 보관되므로, 그 구현예에서, 상기 정의된 비율은 다음과 같이 정의된다.

비율 = X mg (조직+ 식염 완충 용액) / 1 ml 소화 완충제

(상기 “식염 완충 용액”은 상기 “소화 완충제”와 혼동되지 않아야 한다. 상기 “식염 완충 용액”은 통상적으로 임의의 소화 효소를 포함하지 않고, 특히 콜라겐 분해효소를 포함하지 않는다.)

상기 두개의 공식에서, X는 적절하게 10 내지 1.000, 바람직하게 50 내지 500, 더 바람직하게 80 내지 200의 범위, 및 가장 바람직하게 근본적으로 100이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 100 mg의 민싱된 조직/HBSS는 1 mL의 소화 완충제와 혼합된다.

달리 기재되지 않는다면, 상기 콜라겐 분해효소 처리는 통상적으로 35 내지 39 ℃ 사이, 더 바람직하게 36 내지 38 ℃ 사이의 온도에서, 및 가장 바람직하게 약 37 ℃에서 수행된다. 따라서, 바람직하게 상기 효소적 소화는 35-39 ℃, 예컨대, 38-38 ℃, 바람직하게 37 ℃의 온도에서 수행된다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 상기 탯줄로부터 기원한 상기 조직은 측정된 시간 간격(지속시간) 동안 콜라겐 분해효소에 의한 처리에 있게 된다. 적절한 시간 간격은 본 명세서에서 기술된다.

바람직하게, 상기 효소적 소화는 교반 하에서 수행된다. 예컨대, 약 50 내지 100 rpm, 예컨대, 회전 진탕기(orbital shaker)에서 지속적인 부드러운 교반이 소화에 적절하다는 것이 알려졌다.

훨씬 바람직한 구현예에서, 상기 단백질 분해효소 소화는 온화한 조건에서 수행된다. 본 발명자들은 일 구현예에서 1시간의 소화 시간이 적절하다는 것을 놀랍게도 발견했다. 더 일반적으로, 일부 초기 연구의 제안과 반대로, 상대적으로 온화한 조건들이 본 발명에 따른 상기 방법에서 소화를 위해 적절하다. 초기 연구들 사이에, WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229는 설명 목적들을 위해 언급될 수 있다: WO 2004/072273 A에 따르면, 불특정 기원 및 농도의 콜라겐 분해효소는 예컨대 0.1 mg/ml 또는 1 mg/ml의 농도에서 사용되는 것이 추천되고; 상기 추천된 콜라겐 분해효소 소화 시간은 12 내지 36시간, 예컨대 약 24시간이다; Sarugaser et al.에 따르면(위에(supra)), 시그마, C-0130으로부터 1 mg/ml의 콜라겐 분해효소는 사용된다; 상기 콜라겐 분해효소 소화 시간은 18 내지 24시간이다. 따라서, 본 발명의 문맥상 사용되는 상기 온화한 조건들은 초기 연구들에 의해 기술되는 조건들과 구별될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, “온화한 조건(mild condition)들” 또는 동의어로 “부드러운 조건(gentle condition)들”은 상기 조건들 (1) 소화 시간, (2) 효소적 활성 및 (3) 혈소판 용해물 중 적어도 임의의 둘, 그러나 가장 바람직하게 세가지 모두가 아래에 기술된 것과 같다는 것을 의미한다. 상기 효소적 활성은 물론 사용된 효소의 타입, 및 사용된(효소 농도) 부피에 상대적인 또는 소화될 조직의 양에 상대적인, 사용된 효소의 양에 관련되었다.

달리 문맥상 지시하지 않는다면, 모든 (1) 소화 시간, (2) 효소적 활성 및 (3) 혈소판 용해물의 구현예들은 서로 조합될 수 있다. 따라서, 일반적으로 온화한 조건들에 기여하는 요인들: 짧은 효소 소화 시간, 낮은 효소 농도, 및 hPL의 존재.

일 구현예에서, 아래에서 기술된 바와 같이, 짧은 효소 소화 시간은 아래에서 기술된 바와 같이, 낮은 효소적 활성과 조합된다. 아래에서 기술된 바와 같이, 짧은 효소 소화 시간의 바람직한 구현예들은 또한 아래에서 기술된 바와 같이, 낮은 효소적 활성의 바람직한 구현예들과 조합될 수 있다.

일 구현예에서, 아래에서 기술된 바와 같이, 짧은 효소 소화 시간은 아래에서 기술된 바와 같이, 혈소판 용해물의 존재와 조합된다. 아래에서 기술된 바와 같이, 짧은 효소 소화 시간의 바람직한 구현예들은 또한 아래에서 기술된 바와 같이 혈소판 용해물의 바람직한 구현예들과 조합될 수 있다.

일 구현예에서, 아래에서 기술된 바와 같이 낮은 효소적 활성은 아래에서 기술된 바와 같이 혈소판 용해물의 존재와 조합된다. 아래에서 기술된 바와 같이 낮은 효소적 활성의 바람직한 구현예들은 또한 아래에서 기술된 바와 같이 혈소판 용해물의 바람직한 구현예들과 조합된다.

특히 바람직한 구현예에서, 아래에서 기술된 바와 같이 짧은 효소 소화 시간은 아래에서 기술된 바와 같이 낮은 효소적 활성과 그리고 또한 아래에서 기술된 바와 같이 혈소판 용해물의 존재와 조합된다. 아래에서 기술된 바와 같이 짧은 효소 소화 시간의 바람직한 구현예들, 아래에서 기술된 바와 같이 낮은 효소적 활성의 바람직한 구현예들, 및 아래에서 기술된 바와 같이 혈소판 용해물의 바람직한 구현예들은 모두 서로 조합될 수 있다. 이 구현예는 실시예 2A에서 실현된다.

본 명세서에서 지시된 (1) 소화 시간 (2) 본 명세서에서 지시된 효소적 활성 및 (3) 본 명세서에서 지시된 혈소판 용해물의 정확한 수치의 변화는 또한 본 발명으로부터 벗어나지 않은 채로 가능하다. 예컨대, 본 명세서에서 지시된 상기 소화 시간을, 예컨대 50%까지 줄이면서, 동시에 본 명세서에서 지시된 효소적 활성을, 예컨대 50%까지 증가시키는 것은 가능할 수 있다. 통상의 기술자는 그의 일반적인 경험에 기초하고, 상기 소화 시간이 적절히 증가할 때, 낮은 효소적 활성이 주어진 양의 기질을 소화시키기에 여전히 충분할 수 있고, 그리고 그 반대도 마찬가지라는 일반적인 효소 운동 관찰에 기초하여, 그러한 변화들을 예상(envisage) 및 실행할 수 있다. 예컨대, 본 명세서에서 지시된 상기 소화 시간을, 예컨대 50%까지 증가시키는 것은 동시에 본 명세서에서 지시된 상기 효소적 활성을, 예컨대 50%까지 줄이면서도 가능할 수 있다. 각각의 다양한 조건들은 여전히 온화한 조건들로 일컬어질 수 있다. 콜라겐 분해효소는 일반적으로 자가촉매적(autocatalytic)이지 않다; 그러므로 시간이 지나 상기 소화 동안 콜라겐 분해효소의 양의 감소를 일반적으로 야기하지 않으면서, 변화들은 가능하다.

온화한 조건들을 적용함으로써, 분리될 상기 MSC들이 심하게 손상되는 것을 매우 큰 정도에서 피할 수 있다. 상기 온화한 조건들은 이전의 이용가능한 방법들보다 훨씬 높은 분율의 생존가능한 세포들을 얻는 것을 가능하게 한다.

비록 통상적인 구현예들에서 본 발명의 상기 방법이 기준 방법보다 더 낮은 수의 총 세포들을 산출할지라도(참조 도 4B 및 4C), 본 발명의 상기 방법에 따라 분리된 상기 세포들은 사멸 세포의 낮은 퍼센트에 의해 특징지어지는 통상적인 구현예들에 있다(참조 도 4B 및 4D). 이것은 아래에서 기술될, 예컨대 선택적인 증식을 위해 이점이 있다.

(1) 본 발명자들은 짧은 효소적 소화 시간이 본 발명의 방법에 이점이 있는 것을 발견했다. 본 발명자들에 의해 초기에 발견된 실시예에서, 짧은 효소적 소화 시간은 1 시간이다. 이에 기초하여, 일반적으로 말하면, 바람직한 구현예에서 단계 (b)는 총 시간에서 5 시간 이하, 더 바람직하게 4 시간 이하 및 가장 바람직하게 3 시간 이하에서 수행된다. 3 시간 이하는 0.5 내지 2.5 시간 및 1 내지 2 시간의 시간 간격, 및 3 시간 이하의 상한을 가진 임의의 시간 간격, 예컨대 2.5 시간, 2.6 시간, 2.7 시간, 2.8 시간, 2.9 시간 및 2.95 시간을 포함한다. 예컨대 2 시간은 물론 4 시간보다 더 빠른/짧은 것처럼, “빠른(rapid)” 또는 “짧은(short)”은 또한 상대적인 용어지만, 모든 그러한 시간 간격들은 “빠른” 또는 “짧은”으로 일컬어질 수 있다. 상기 효소적 처리의 빠른 수행은 탈수 문제들 및 시간의 연장된 기간 동안 비자연적인 환경에 노출된 세포들과 연관된 다른 가능한 문제들을 피할 수 있다; 상기 효소적 처리의 빠른 수행은 또한 Seshareddy et al.(2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119)에 의해 기술된 어려움들을 극복한다.

짧은 효소적 처리 시간 간격들이 특히 히알루로니다제 및 콜라겐 분해효소와의 공동소화의 경우에 이점이 있을 수 있다는 것이 제안되었다(Can et al., Stem Cells, 25:2886-2895, 2007). 다소 놀랍게도, 본 발명에서, 짧은 처리 시간은 또한 히알루로니다제의 부재에서 이익적이다. 이것은 2 가지 방법들에서 주목할 만하다; 첫째, 히알루로니다제의 부재에서, 히알루로니다제의 바람직하지 않은 효과, 예컨대 세포 외 환경 말단 세포 표면의 광범위한 바람직하지 않은 소화가 일반적으로 발생할 것으로 기대되지 않을 것이다; 둘째, 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 콜라겐 분해효소 단독으로 세포 외의 매트릭스에만 작용하고, 상기 바람직한 세포들 그 자체에는 작용하지 않는다고 이해된다. 그럼에도 불구하고, 상기 처리의 짧은 지속시간을 포함하는, 온화한 처리의 이점들은 세포 생존능력에서 꽤 주목할 만하다. 일 구현예에서, 상기 효소 소화는 임의의 첨가된 히알루로니다제 없이 온화한 조건들 하에서 효소 소화이다. 일 구현예에서, 상기 효소 소화는 히알루로니다제의 부재에서 온화한 조건들 하에서 효소 소화이다. 바람직한 구현예에서, 단계 (b)는 5시간 이하, 더 바람직하게는 4시간 이하 및 가장 바람직하게 3시간 이하의 총 시간에서, 그리고 임의의 추가된 히알루로니다제 없이, 또는 바람직하게 히알루로니다제의 부재에서 수행된다.

이상적으로, 단계들 (a) 및 (b) 모두는 빠르게 취급된다. 이에 의해, 세포들은 상기 탯줄로부터 적은 시간 내에 얻어질 수 있다. 이것은 상기 탯줄 조직의 효소적 소화를 위한 광범위한 시간 간격들 또는 탯줄 조직으로부터 세포들의 고속성장(outgrow) 또는 둘 다에 의존하는, 일부 초기 연구들을 넘어서는 이점을 나타낸다. 바람직한 구현예에서, 단계들 (a) 및 (b)는 함께 6 시간 이하, 바람직하게 5 시간 이하, 더 바람직하게 4 시간 이하, 및 가장 바람직하게 3시간 이하의 총 시간에서 수행된다. 3 시간 이하는 0.5 내지 2.5 시간 및 1 내지 2 시간의 시간 간격, 및 3 시간 이하의 상한을 가진 임의의 시간 간격, 예컨대 2.5 시간, 2.6 시간, 2.7 시간, 2.8 시간, 2.9 시간 및 2.95 시간을 포함한다. 단계들 (a) 및 (b) 모두의 짧은 지속시간이 또한 단계 (b) 그 자체의 지속시간이 짧다는 것을 의미한다는 것은 명백하다. 본 발명자들은 일 구현예에서 약 1 시간의 소화 시간이 이점이 있다는 것을 발견했다.

(2) 본 발명자들은 또한 효소적 활성의 양이 중요하다는 것을 발견했다. 상기 효소적 활성은 물론 사용된 효소의 타입, 및 그것이 사용된 상기 부피에 상대적이거나(효소 농도) 소화될 조직의 양에 상대적인, 사용된 효소의 양에 관련된다.

특히, 본 발명자들은 콜라겐 분해효소 활성의 양이 중요한 것을 보여준다. 본 발명을 기술하고자 하는 목적을 위해, 상기 콜라겐 분해효소 활성은 W

nsch 유닛에서 지시된다. W

nsch에 따른(W

nsch 유닛, 또는 PZ 유닛) 1 유닛(U)은 25 ℃, pH 7.1에서 분당 1 μmole의 4-페닐아조벤질옥시카르보닐-L-프롤릴-L-류실글리실-L-프롤릴-D-아르기닌(4-phenylazobenzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-leucylglycyl-L-prolyl-D-arginine)의 가수분해에 촉매 작용을 미친다(W

nsch et al., 1963, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 333, 149-51).

본 발명에 따른 상기 과정은 통상적으로 효소적 처리 단계 (b) 동안 콜라겐 분해효소의 상대적으로 낮은 활성에 의해 특징지어진다. 본 명세서에서, 콜라겐 분해효소 활성의 지시된 양은 상기 콜라겐 분해효소가 첨가된 시간 지점에 대해 지시된다. 예컨대, 단계 (b) 동안 시간이 지남에 따라, 상기 콜라겐 분해효소가 활성을 잃는 경우에, 추가적인 콜라겐 분해효소는 첨가되지 않는다. 그러나, 콜라겐 분해효소는 일반적으로 자가 소화적(autodigestive)이지 않고 따라서 상대적으로 안정하고, 첨가된 후에 콜라겐 분해효소가 전체 효소적 처리 단계 (b) 동안 존재한다는 것이 합리적으로 추정될 수 있다.

상기 콜라겐 분해효소 활성은 상기 소화 완충제의 총 부피에 관해 적절하게 지시될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 소화 완충제는 0.01 W

nsch U/ml 내지 10 W

nsch U/ml, 바람직하게 0.05 W

nsch U/ml 내지 5 W

nsch U/ml, 바람직하게 0.1 W

nsch U/ml 내지 1 W

nsch U/ml, 바람직하게 0.15 W

nsch U/ml 내지 0.5 W

nsch U/ml, 바람직하게 예컨대, 약 0.1 W

nsch U/ml 또는 약 0.2 W

nsch U/ml의 특정 콜라겐 분해효소 활성을 포함한다. 일 구현예에서, 콜라겐 분해효소 활성의 하한은 첨가된 상기 콜라겐 분해효소 활성이 5 시간 이하 내에 상기 조직으로부터 중간엽 기질세포들을 방출시키기에 충분한 한, 특별하게 정의되지 않는다. 상기 및 다른 구현예들에서, 콜라겐 분해효소 활성의 상한은 0.5 W

nsch U/ml 이하, 더 바람직하게 0.25 W

nsch U/ml 이하, 및 구체적으로 0.18 W

nsch U/ml 또는 0.09 W

nsch U/ml로 정의될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 콜라겐 분해효소는 상기 소화 완충제에 관해서 0.5 W

nsch U/ml 이하, 더 바람직하게 0.25 W

nsch U/ml 이하, 및 구체적으로 0.18 W

nsch U/ml의 특정 활성에 효소적 처리 단계 (b) 동안 존재한다. 훨씬 더 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 방법의 단계 (b)에 사용된 콜라겐 분해효소의 활성은 0.18 내지 0.09 W

nsch U/ml 소화 완충제의 범위에 있다(또한 실시예 1 참조). 이 활성은 WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229에 따라 사용된 콜라겐 분해효소의 활성과 다르다. 실제로, 일 구현예에서 본 발명의 상기 방법의 단계 (b) 동안 상기 콜라겐 분해효소 활성은 WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al.(위에)에 의해 기술되는 상기 콜라겐 분해효소 활성보다 더 낮은 것으로 정의될 수 있다.

대안적으로, 상기 콜라겐 분해효소 활성은 소화될 상기 조직의 중량에 관계에서 적절하게 지시될 수 있다. (상기 조직의 중량은 이들이 수용되는 용기를 상기 조직으로 채우기 전과 후에 중량을 매김으로써 적절하게 측정될 수 있다.) 선택적으로 용기에 포함된 상기 조직은 선택적으로 식염-완충 용액(예컨대, HBSS)를 포함한다. 일 구현예에서, 적절한 비율은 0.01 내지 10 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직, 바람직하게 0.05 내지 5 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직, 바람직하게 0.1 내지 1 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직, 바람직하게 0.15 내지 0.5 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직의 범위에, 바람직하게, 예컨대 약 0.1 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직 또는 약 0.2 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직에 놓인다. 일 구현예에서 콜라겐 분해효소 활성의 하한은 첨가된 상기 콜라겐 분해효소 활성이 5 시간 이하 내에 상기 조직으로부터 중간엽 기질세포들을 방출시키기에 충분한 한, 특별히 정의되지 않는다. 상기 및 다른 구현예들에서, 콜라겐 분해효소 활성의 상한은 0.5 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직 이하, 더 바람직하게 0.25 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직 이하, 및 구체적으로 약 0.16 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직 또는 약 0.08 W

nsch U 콜라겐 분해효소/100 mg 조직, 또는 상기 바람직한 범위 내에 임의의 수치로 정의될 수 있다. 본 발명에서 상기 조직의 총 중량에 대한 콜라겐 분해효소 활성의 비는 WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229에 의해 기술된 상기 콜라겐 분해효소 활성보다 더 낮은 것이 바람직하다.

(3) 본 발명자들은 상기 효소적 소화 동안 혈소판 용해물의 존재가 이점이 있다는 것을 또한 발견했다. 이것은 본 발명자들의 놀라운 발견이다. 이 기술분야에 콜라겐 분해효소가 혈소판 용해물의 존재에서 잘 작용하지 못할 것이라는 일부 편견이 있었다. 예컨대, 콜라겐용해(collagenolytic) 활성은 억제제들 예컨대, 알파1-안티트립신(α₁- antitrypsin) 때문에 일반적인 인간의 혈정에 의해 억제되었다고 기술되었다(Chesney et al., J. Clin. Invest., 1974, vol. 53, p. 1647-1654). 그러나, 본 발명자들은 콜라겐 분해효소 소화가 심지어 혈소판 용해물의 존재에서도 효율적이라는 것을 발견했다. 실제, 상기 콜라겐 분해효소 소화는 심지어 본 발명에 바람직한 콜라겐 분해효소의 매우 낮은 양에서도 효율적이다(상기 참조). 따라서, 바람직하게 혈소판 용해물은 상기 효소적 처리 동안 존재한다. 혈소판 용해물은 상업적인 근원들로부터 얻어질 수 있거나 새롭게 제조될 수 있다. 많은 병원들, 혈액은행들 및 조사 기관들은 혈소판 용해물을 제조하기 위한 프로토콜들을 확립하였고 그러한 용해물들은 일반적으로 본 발명의 문맥상 적절하다. 예컨대, 그것은 동결-해동 과정에 의해 얻어질 수 있다. 그러한 용해물들은 비록 다른 동결-해동 요법들이 만약 그들이 상기 혈소판의 세포용해(cytolysis)를 이끈다면, 또한 적절하지만, 혈소판 현탁액을 동결시킴으로써, 그리고 그 후 상기 물질을 해동시킴으로써 만들어 질 수 있다. 상기 동결-해동 기술로, 이 방법은 아마 얼음 크리스탈이 형성되고, 그 후 해동에서 수축(contraction)이 오기 때문에, 세포들이 부풀고 깨지는 것을 야기한다. 따라서, 상기 순환적인 팽창 및 수축은 궁극적으로 상기 혈소판들이 깨져서 열리는 것을 야기한다. 다수의 순환들은 우선적으로 더 많은 완전한 세포용해를 위해 사용될 수 있지만, "더 완전한(more complete)" 세포용해는 필수적으로 요구되지 않는다. 혈소판 세포용해의 다양한 정도는 예컨대, 혈소판 수의 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 70%, 적어도 90%, 또는 100% 까지의 세포용해에서 발생할 수 있다. 선택적으로, 비용해 물질 및 다른 잔해(debris)는 사용 전에 상기 혈소판 용해물로부터 제거된다.

바람직하게, 상기 혈소판 용해물은 용해된 포유류의 혈소판들, 및 선택적으로 포유류의 혈장을 포함한다. 제2 경우에, 상기 혈소판 용해물은 혈소판 용해물 및 혈장을 포함하는 조성물이다. 혈장이 포함될 수 있는 이유들은 혈소판들은 그들의 용해 전에 혈장으로부터 완전히 분리되지 않고/또는 혈소판들은 그들의 용해 전에 혈장에서 (재)현탁되는, 구현예들을 포함하기 때문이다. 바람직하게, 상기 조성물에서 포유류 혈장의 농도는 총 부피의 약 30 % 이하, 약 20 % 이하, 또는 약 10 % 이하이다. 바람직하게, 상기 혈소판 용해물에서 포유류 혈장의 농도는 약 0 % 내지 약 10 %, 예컨대 약 1 % 내지 약 10 %이다. 선택적으로 상기 혈소판 용해물은 농축된 혈소판들을 포함한다. 바람직하게, 상기 포유류 혈소판 용해물은 인간 혈소판 용해물이다. 바람직하게, 상기 혈소판 용해물은 대체로 포유류 혈소판 막들이 없다.

혈소판 용해물은 전혈로부터 분리된 단일 또는 풀링된(pool) 기증자로부터 기증된 혈소판들로부터 또는 성분채집술에 의해 발생될 수 있다. 바람직하게, 상기 성분채집술은 다양한 밀도를 갖는 물질들을 분리하는 것, 예컨대 원심분리(centrifugation)에 기초되고/또는 상기 성분채집술은 흡수력 있는 물질로 코팅된 비드(bead)들에서 흡수 및 여과를 포함한다.

선택적으로, 본 명세서에서 사용된 상기 혈소판 용해물은 현탁액을 포함하는 혈소판을 용해시킴으로써 얻을 수 있고, 여기서 상기 혈소판들은 선택적으로 혈장에 현탁된다. 현탁액을 포함하는 상기 혈소판은 바람직하게 1 x 10⁸ 혈소판/ml 내지 5 x 10⁹ 혈소판/ml 사이, 바람직하게 3.8 x 10⁸ 혈소판/ml 내지 1.2 x 10⁹ 혈소판/ml 사이, 평균적으로 약 7.9 x 10⁸ 혈소판/ml를 포함한다.

혈소판 용해물의 존재는 상기 효소적 소화의 온화함에 기여하는 것에 도움을 준다는 것은 또한 예상된다. 본 발명자들은 놀랍게도, 비록 혈소판 용해물이 단백질 분해효소를 포함하는, 특정 효소들의 활성에 음성적으로 영향을 준다는 것이 이전에 보고되었으나, 혈소판 용해물의 존재가 상기 세포들의 소화에 음성적인 영향을 미치지 않는다는 것을 발견했다(설명을 위해 실시예 2A 및 3 참조). 따라서, 상기 효소적 처리, 더 정확하게 상기 콜라겐 분해효소 소화가 혈소판 용해물의 존재에서 수행될 수 있다는 것은 본 발명에 따른 상기 방법의 중요한 토대(cornerstone)이다.

바람직하게, 혈소판 용해물은 0.01 % 내지 30 %, 예컨대 0.05 % 내지 20 %, 바람직하게 0.1 % 내지 10 %, 더 바람직하게 0.5 % 내지 5 %, 더 바람직하게 0.8 % 내지 2 %, 및 가장 바람직하게 약 1 %의 부피 퍼센트에서 효소적 소화 동안 존재한다. “부피 퍼센트(volume percentage)”는 상기 소화 완충제의 총 부피에 존재하는 혈소판 용해물의 총 부피를 의미한다.

본 발명자들은 혈소판 용해물 또는 그의 유도체들의 존재는 상기 효소적 소화 동안, 특히 위에 지시된 비율에서 이점이 있다는 것을 발견했다.

본 명세서에서 언급될 때, 용어 “혈소판 용해물(platelet lysate)”은 혈소판 뿐만 아니라, 이의 유도체들 모두를 용해함으로써 직접적으로 얻을 수 있는 혈소판 용해물, 예컨대 열에 비활성화된 혈소판 용해물, 살균 여과된 혈소판 용해물 등을 포함한다. 일부 경우에서, 유도체들의 사용은 예컨대 규제적인 고려의 관점에서 요구되거나 추천될 수 있다. 더 바람직한 구현예에서, 혈소판 용해물은 근본적으로 오염제(contaminating agent)가 없다. 근본적으로 오염제가 없는 혈소판 용해물은 본 명세서에서 근본적으로 감염제, 예컨대 바이러스(캡슐화 및 비캡슐화), 기생물, 박테리아, 및 내 독소(endotoxin)가 없는 살균된 혈소판 제제, 즉 배양에 기초된, 혈청학적(serological) 또는 분자적 확인 체계들을 가지고 또는 LAL 테스트(내 독소)를 가지고 탐지될 수 없는 양에서 그러한 감염제를 포함하는 혈소판 용해물로 정의된다. 병원체-비활성화된(pathogen-inactivated) 혈소판 용해물(PI-PL)은 강하게 선호된다. 예컨대 WO 2013/042095 A1 및 Iudicone et al., 2014, J. Transl. Med., 12: 28 참조.

상기 효소적 처리 동안 혈소판 용해물의 존재와 연관하여 몇 가지 이점들이 있는데, 이는 예상되지 않았었고, 다음에 기술될 것이다.

첫째로, 본 발명자들은 인간 혈소판 용해물의 존재가 적어도 상기 기질 매트릭스로부터 상기 세포들의 바람직한 효소적 유리를 음성적으로 간섭하지 않을 정도에서 상기 효소 콜라겐 분해효소의 상기 효소적 활성을 막지 않는다는 것을 발견했다.

둘째로, 본 발명자들은 혈소판 용해물 또는 유도체들의 존재에서 소화에 의해 얻을 수 있는 세포들이 우수한 생존능력으로 특징지어진다는 것을 발견했다(참조 예컨대, 도 4A).

셋째로, 본 발명자들은 본 발명에 따른 상기 방법에서 혈소판 용해물 또는 이의 유도체들의 존재에서 소화에 의해 얻을 수 있는 상기 세포들이 우수한 증식 특성을 갖는다는 것을 발견했다. 따라서, 바람직하게, 단계 (b)에서 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분은 포유류 혈소판 용해물(PL) 또는 이의 유도체, 더 바람직하게 인간 혈소판 용해물(hPL) 또는 이의 유도체의 존재에서 효소적 처리에 있게 된다.

혈소판들은 생물에 작용하는 분자들 및 성장 인자들, 예컨대 응집 인자들, 부착 분자들, 및 프로테오글리칸들, 기본적인 섬유모세포 유래 성장 인자(bFGF), 상피 성장 인자(EGF), HGF, 혈관 상피 성장 인자(VEGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-1), TGF-β1 및 다른 것들을 포함하는 반면, 그들은 단백질 분해효소 억제제를 포함하는 것으로 또한 알려져있다(Astori et al., Stem Cell. Res. Ther., 2016, vol. 7, 93). 이 교시의 관점에서, 혈소판 용해물이 상기 효소적 처리 동안 적절하게 존재할 수 있다는 발견은 주목할 만하다.

전반적으로, 최신 기술에 따라 콜라겐 분해효소 소화 프로토콜로부터 나뉘는, 추출의 특정 조건들은 세포 생존능력 및 세포 추출을 위해 이익적인 것으로 나타날 수 있고, 따라서 놀랍게도 이익적인 분리 과정을 제공할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 상기 분리과정 동안, Seshareddy et al. (2008, Meth. Cell Biol., vol. 86, p. 101-119)에 의해 기술된 과정에 의해서 보다 더 높은 세포 수율을 얻는 것은 가능하다. 보다 구체적으로, 본 발명에 따라, Seshareddy et al. (위에)에 의해 기술되는 세포 수율보다 10-25 배 더 높은 세포 수율을 분리 과정 동안 얻는 것은 가능하다. 원한다면, 본 발명에 따라 분리된 상기 세포들의 우수한 생존능력 때문에, 상기 세포들은 인 비트로에서 효율적으로 증식될 수 있다.

바람직하게, 오직 하나의 콜라겐 분해효소 소화 단계가 본 발명에 따라 상기 방법에서 수행된다. 이것은 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 상기 탯줄로부터 기원하는 상기 조직이 측정된 시간 간격 동안 콜라겐 분해효소에 의한 처리에 있게 되고, 그 시간 간격의 종료 후에, 상기 조직으로부터 물리적으로 분리되거나 떨어지는 세포들이 회수되지만, 남아있는 조직들은 콜라겐 분해효소 소화의 하나 이상의 추가 라운드(round)에 있게 될 수 없다는 것을 의미한다. 오히려, 그것은 상기 시간 간격의 종료 및 상기 세포들의 회수 후에 바람직하게 폐기된다.

상기 소화 간격의 끝에서, 상기 소화 혼합물은 단백질 함유 용액, 예컨대 혈소판 용해물로 보충된 기초 배지로 희석될 수 있다. 상기 단백질 함유 용액의 첨가의 순간은 소화 시간의 끝으로 정의한다. 그러나 상기 배지가 포유류 세포들, 바람직하게 중간엽 줄기세포들 및/또는 중간엽 기질세포들의 배양에 적합한 한, 기초 배지의 타입은 특별히 제한되지 않는다. 단백질 함유 용액은 바람직하게 헤파린을 포함한다.

바람직한 기초 배지는 MSCBM CD(중간엽 세포들을 위해 화학적으로 정의된 기초 배지, Lonza)이고, 바람직한 보충물은 5 % (vol./vol.) 인간 혈소판 용해물(hPL)이다.

단백질 함유 용액, 예컨대 인간 혈소판 용해물의 첨가는 상기 효소적 활성을 억제하는 것으로 믿어진다. 그러한 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 상기 첨가는 또한 상기 효소의 희석을 야기한다. 바람직하게, 상기 소화 혼합물의 부피에 관해서, 단백질 함유 용액의 적어도 1 부피가 첨가된다. 상기 단백질 함유 용액은 물론 세포 배양 목적과 양립할 수 있는, 즉 그것이 예시적으로 살균되어야하고, 선택적으로 GMP 등급 등이어야 하는 용액이어야 한다.

바람직하게, 소화되게 상기 조직을 포함하는 액체(소화 후 액체)는 다음에 분리되게 된다. 용어 "분리(separation)"는 상기 소화 후 액체에 관해, 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 특별하게 제한되지 않고, 일반적으로 세포들이 여과 및 원심분리를 포함하는, 적절한 방법에 의해 소화되지 않은 조직들, 불완전하게 소화된 조직들, 및 다른 잔해들로부터 분리될 수 있다는 것을 의미한다. 일 구현예에서, 이전에 기술된 바와 같이(예컨대, Del Bue at al., 2007, Veterin. Res. Comm, vol. 31, p. 289-292), 예컨대, 여과, 예컨대 120 μm 메쉬(mesh)를 통한 여과 또는 거즈(gauze)를 통한 여과에 의해, 소화되지 않은 조직, 불완전하게 소화된 조직들, 및 다른 잔해들로부터 방출된 상기 세포들을 분리하기 위해서, 상기 소화 후 액체는 여과된다. 예컨대, 50 내지 150 μm , 예컨대, 70 내지 100 μm의 필터 구멍 크기(메쉬)는 적절하다. 선택적으로, 상기 필터 물질은 거즈이다; 다수의 거즈 층들이 사용될 수 있다. 따라서 바람직하게, 소화의 대상이 된 상기 조직을 포함하는 상기 액체는 거즈를 통해 여과된다. 상기 여과액(filtrate)은 그 후에 "소화된 혼합물(digested mixture)"로 불린다. 또 다른 적절한 분리를 위한 방법은 낮은 속도의 원심분리를 포함한다; 이 경우 상기 세포가 상청액(supernatant) 내에 남아있는데 반해, 소화되지 않은 조직, 불완전하게 소화된 조직 및 다른 잔해들이 펠렛팅(pellet) 되고; 이 경우 상기 상청액은 "소화된 혼합물"로 일컬어진다. 선택적으로 여과 및 낮은 속도 원심분리는 임의의 순서에서 조합가능하다. 대안적으로, 분리는 여과에 의해서만 또는 낮은 속도의 원심분리에 의해서만 되고, 이에 의해 여과만 의하는 것이 바람직하다.

바람직하게, 상기 소화된 혼합물은 다음에, 바람직하게 여과 다음에 원심분리된다. 통상의 기술자는 그들의 증식 특성 및 생존능력을 손상시키지 않고, 중간엽 기질세포들을 펠렛팅하기에 적절한 것들로 원심분리 조건들을 조절할 수 있다. 예컨대, 상기 소화된 혼합물은 250 ml 원심분리 튜브들을 사용하여 15분 동안 680 x g에서 원심분리될 수 있다. 원심분리의 끝에, 상기 상청액은 제거되고 바람직한 세포들을 포함하는, 상기 펠렛은 재현탁된다. 이상적으로, 본 발명에 따른 상기 방법이 하나 이상의 증식의 단계를 포함하는 구현예들에서, 상기 세포 펠렛은 (제1) 증식 단계에서 사용된 바와 동일한 성장 배지에 재현탁된다. 본 발명에 따른 증식은 상세하게 다음에 기술될 것이다.

일반적으로, 상기 소화된 혼합물은 다수의 세포들, 즉 세포 집단을 포함한다. 바람직하게, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 상기 효소적 처리에 의해 얻어진 상기 세포 집단은 얻어진 바와 같이 그대로 즉, 임의의 음성 선택(원하지 않는 세포들의 선택적 파괴) 없이 사용된다. 적절하지만 선택적인 사용은 아래에서 기술될 상기 세포들의 증식으로 구성된다.

상기 분리 과정의 설명적인 예는 실시예 2A에 기술된다. 실시예 3에서 나타난 바와 같이, 혈소판 용해물의 사용은 세포들의 방출 및 이들의 생존능력에서 콜라겐 분해효소 활성에 음성적으로 영향을 주지 않는다. 혈소판 용해물이 이전에 단백질 분해효소를 포함하는, 특정 효소들의 활성에 음성적으로 영향을 준다고 보고되었기 때문에, 이것은 놀라운 발견이다.

상기 효소적 처리는 살균된 조건에서 바람직하게 수행된다.

원한다면, 개개의 세포들의 분리는 예컨대 연속 희석(serial dilution)에 의해 달성될 수 있다. 이에 의해, 분리된 개개의 세포를 얻을 수 있다. 연속 희석은 단계 (b) 다음에 선택적인 단계이다; 그러나, 단일 분리된 세포를 얻는 것은 본 발명의 주 목적이 아니다; 오히려, 다음에 기술될 바와 같이 상기 세포(들)의 증식을 위해 단계 (b) 다음에 단계 (c)가 오는 것이 바람직하다.

증식

상기 분리 동안, 특히 본 발명의 상기 방법의 단계 (a) 및 (b)에서 얻어진 상기 세포들은 증식될 수 있다(즉, 증식의 대상이 될 수 있다). 상기 세포들은 엑스 비보에서 증식된다. 상기 엑스 비보 증식은 통상의 기술자가 배양을 위해 정의된 조건들을 선택하도록 한다. 이것들은 다음에 기술될 것이다.

상기 증식은 이점이 있는 특성을 가진, 이전에 분리된 상기 세포들을 배가시키는 것을 목표로 한다. 이 기술분야에서 공통적인 바와 같이, 증식은 배양 배지에서 발생한다. 달리 명시되지 않는다면, 증식에 적합한 상기 조건들은 포유류 세포들의 배양을 위해, 더 구체적으로 포유류 세포들의 증식을 위해 적합하다고 일반적으로 알려진 조건들을 포함한다.

증식은 높은 세포 성장 및 높은 유사 분열 활성에 의해 우세하게 특징지어지는, 상기 세포 배양/제조 과정의 기간이다. 본 발명에서, 상기 증식은 그 중에서도 바람직하게 유사 분열적으로 활성이 있고 더 바람직하게 지수적인 성장 단계에 있는, 증가된 세포들의 수를 발생시키는 것을 의미하는, 세포들의 수를 증가시키는 목적을 충족시킨다. 상기 증식에 의해, 큰 세포 집단들은 얻어질 수 있다. 본 발명에 따른 상기 세포들의 증식의 상기 단계는 세포들이 적절한 조건 하에서 증식하도록 하는 단일 단계일 수 있다: 그러나, 더 바람직하게, 아래에서 추가적으로 기술될 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 증식은 다수의 계대를 포함한다.

상기 증식은 살균된 조건들 하에서, 및 통상적으로 또한 포유류의 세포들의 배양을 위해 그 외 필수적인 또는 유용한 또는 추천되는 조건들 하에서 일반적으로 수행된다.

본 발명의 이 구현예는 상기 와튼 젤리, 즉 상기 기질 와튼 젤리의 특정 섹션이 효율적으로 및 확실하게 분리될 수 있고, 그 다음에 효율적으로 및 확실하게 증식될 수 있는, 세포들을 포함한다는 발견에 기초하였다. 따라서, 일단 상기 세포들이 분리되면, 그들의 집단은 유사 분열적으로 증식된다.

따라서, 선택적으로 및 매우 일반적으로, 본 발명에 따른 상기 방법은 하나 이상의 추가적인 단계들을 포함한다. 특히, 본 발명의 바람직한 구현예들에서, 단계 (b)에서 얻어진 상기 세포들의 세포 분열 잠재력의 이점을 이용하여, 세포들의 수를 증가시키기 위한 단계가 포함된다. 그러한 바람직한 구현예들에서, 단계 (b) 다음에 단계 (c)가 오고; 단계 (c)는 단계 (b)에서 얻어진 상기 적어도 하나의 세포의 증식을 포함한다. 단계 (c)는 또한 본 명세서에서 “증식 단계(expansion step)” 또는 간단히 “증식(expansion)”으로 일컬어 질 수 있다.

증식을 위한 조건들은 중간엽 기질세포들의 엑스 비보 성장 및 세포 분열을 위해 적절하게 선택된다. 이에 의해, 중간엽 기질세포들이 풍부한 배양물이 얻어진다. 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 상기 배양물은 분리된 상기 세포들의 특정 아집단을 선택하고, 이에 의해 그것들을 풍부하게 하거나 그렇지 않으면 상기 세포들이 그들의 표현형을 변경하고 있다고 예상하는 것이 가능하다.

다음과 같이 본 발명에 따른 상기 증식은 본 발명에 따른 상기 분리와 시너지(synergy)를 제공한다: 본 발명에 따라 바람직한 온화한 조건에서 분리된 세포들의 총수가 US 2004 0136967 A1 및 Seshareddy et al., Meth. Cell Biol., 86:101-119, 2008에 의해 제안된 상기 방법들에 의해 추출될 수 있는 세포들의 총 수보다 더 적을 수 있을 지라도(및 통상적으로 그렇다), 본 발명자들은 본 발명에 따른 바람직한 온화한 조건들에서 분리된 세포들이 특히 증식을 위해, 예컨대 그들의 생존능력의 높은 퍼센트의 관점에서(설명을 위해 도 4B 참조) 그리고 또한 그들의 높은 증식의 잠재력의 관점에서(설명을 위해 도 9 참조) 적절하고, 따라서 높은 세포 수는 본 발명에 따라 분리된 상기 SWJ로부터 유래된 세포들을 증식시킴으로써 얻어질 수 있다는 것을 발견했다. 다시 말해서, 증식의 대상이 되는 대부분의 세포들이 생존 가능하고 그들이 특히 잘 증식하기 때문에, 본 발명에 따른 증식과 함께 본 발명에 따른 바람직한 분리 과정은 특정 바람직한 세포 수에 도달하기 위해 더 적은 시작 물질 및/또는 더 적은 계대가 요구된다는 시너지적인 이점을 지닌다.

바람직하게 본 개시에 따라 얻어지는 상기 탯줄로부터 유래된 세포들은 상기 증식 단계의 대상이 되는 유일한 세포들이다. 그러한 구현예들에서, 배양보조세포(feeder cell)들은 상기 증식 단계 동안 존재하지 않는 것이 특히 바람직하다.

증식은 배양 용기에서 통상적으로 발생한다. 더 정확하게, 증식 대상이 될 예정인 세포들이 배양 용기에 시딩된다. 통상적으로 그러한 배양 용기들은 플라스크들, 플레이트들 및 스택들이다(이에 의해 스택들은 통상적으로 서로의 위에 쌓인 다수의 플레이트들로 구성된다). 특히 본 발명의 문맥상 적절한 배양 용기들은 상기 배양 용기의 바닥에 세포들이 부착하도록 하는 배양 용기들이다; 그러한 용기들은 편평한 바닥 표면을 가진 플라스크들, 플레이트들, 및 스택들이다. 바람직하게, 상기 배양 용기는 적어도 플라스틱 바닥 표면을 가진다. 더 바람직하게 상기 배양 용기는 플라스틱 배양 용기이다. 상기 배양 용기는 바람직하게 편평한 바닥 표면(“편평한-바닥(flat-bottom)”을 가진다.

플라스틱의 타입은 세포들의 배양에 적절한 한, 특별하게 제한되지 않는다; 그러나 소수성(hydrophobic) 고분자들, 예컨대 특히 폴리스티렌, 선택적으로 표면 개질된 고분자들이 바람직하다. 표면 개질은 폴리스티렌 표면에 이용가능한, 다양한 화학 작용기(functional chemical group)들을 만들고, 일반적으로 세포들의 부착을 위해 적절한, 플라즈마 기술에 의해 달성될 수 있다. 그러한 기술들은 최신 기술의 일부이고, 부착성 세포들의 배양을 위한 표면 개질 플라스틱 용기는 상업적으로 이용가능하다.

그러나, 바람직하게 상기 세포 배양 용기의 상기 표면은 사용 전에 단백질 코팅되지 않는다. 특히, 그것은 단백질들, 예컨대 세포 매트릭스 단백질들, 예컨대 콜라겐 및 폴리라이신(polylysine)으로 코팅되지 않는다.

바람직하게, 증식은 다수 계대에서 행해진다. 상기 계대들의 세부사항들은 아래에 기술된다.

성장 배지

본 발명에 따른 증식을 위한 상기 성장 배지는 통상적으로 기초 배지 및 하나 이상의 보충물들을 포함할 것이다. 넓은 의미에서, 사용된 기초 배지의 타입은 특별히 제한되지 않는다. 통상적인 기초 배지는 물을 기초로 하고 화학적으로 정의된다. “화학적으로 정의된(chemically defined)”은 상기 기초 배지가 구체적인 양에서 구체적인 재료들로 구성된다는 것을 의미한다; 화학적으로 정의된 기초 배지의 이점은 그들이 실험적 조건들, 실험실 등으로 인한 변화없이, 재현성있게 제조될 수 있다는 것이다. 상기 기초 배지는 일반적으로 살균되었다. 포유류 세포들의 성장을 위한 기초 배지는 다른 상업적인 공급자들로부터 상업적으로 이용가능하다.

통상적으로, 기초 배지는 아미노산, 염(예컨대, 칼슘 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 마그네슘 설페이트, 소듐 클로라이드, 및 모노소듐 포스페이트), 글루코스(glucose), 및 비타민(예컨대, 엽산(folic acid), 니코틴아미드(nicotinamide), 리보플라빈(riboflavin), B₁₂), 적어도 하나의 완충제(예컨대, HEPES), 및 통상적으로 또한 착색제(예컨대, 페놀 레드)를 포함하는 재료들을 포함한다; 그러나 이것은 필수적인 것은 아니다. 대부분의 상업적으로 이용가능한 기초 배지는 pH의 지속적인 감시를 가능하게 하는, pH 지시약(착색제)으로 페놀 레드를 포함한다.

바람직하게, 상기 기초 성장 배지는 플레이트 세포들에 부착 매트릭스의 첨가를 요구하지 않는 것이다.

바람직하게, 상기 기초 배지는 혈청이 없다. 혈청이 없다는 것은 인간 또는 동물의 혈청이 그것에 포함되지 않는다는 것을 의미한다. 더 바람직하게, 상기 기초 배지는 혈청이 없는, 화학적으로 정의된 기초 배지이다.

바람직하게, 상기 기초 배지는 화학적으로 정의된다. 화학적으로 정의된 기초 배지는 모든 화학적 구성들이 알려진, 인간 또는 동물 세포들의 인 비트로에서 세포 배양을 위해 적절한 기초 배지다. 특히, 화학적으로 정의된 배지는 모든 구성들이 확인되어야 하고 그들의 정확한 농도가 알려지도록 해야 한다는 것을 요구한다. 그러므로, 화학적으로 정의된 배지는 전체적으로 동물로부터 유래된 구성들이 없어야 하고 혈청 또는 혈청으로부터 유래된 단백질들, 예컨대 소 태아 혈청, 소 혈청 알부민 또는 인간 혈청 알부민을 포함할 수 없다. 화학적으로 정의된 기초 배지는 재조합 단백질 및/또는 호르몬만을 포함하지 않는다. 이것을 달성하기 위해, 화학적으로 정의된 배지는 인간 또는 동물 근원으로부터의 구성들, 예컨대 단백질들 및/또는 성장 인자들을 포함하지 않는다; 특히, 그것은 인간 또는 동물 근원들로부터의 알부민, 또는 인간 또는 동물 근원들로부터의 성장 인자들을 포함하지 않는다. 바람직하게 그것은 비인간, 비동물 근원들, 예컨대 식물 세포들 및 박테리아, 및/또는 합성 화학물질들 예컨대 폴리비닐 알코올로부터 보통 유래되는 재조합 알부민 및/또는 재조합 성장 인자들을 포함한다.

일부 구현예들에서, 화학적으로 정의된 기초 배지는 다음을 포함한다.

(a) 관습적인 기초 배지(예컨대, 아미노산, 비타민들, 무기염들, 완충제들, 항산화제(antioxidant), 및 에너지 근원들을 포함하는 DMEM, F12, 또는 RPMI 1640), 및

(b) 선택적으로 선택되지만 다음의 열린 리스트들에 제한되지 않는 하나 이상의 혈청 대체 재료들: 재조합 알부민, 화학적으로 정의된 지질(들), 재조합 인슐린 및/또는 금속 이온(들) 예컨대 아연, 재조합 트랜스페린(transferrin) 또는 철, 셀레늄(selenium) 및 항산화제 싸이올 예컨대, 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 또는 1-싸이오글리세롤(1-thioglycerol).

기초 배지는 예컨대 EMEM(Eagle's minimal essential medium), DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), 알파-MEM, RPMI-1640, IMDM, 및 다른 것들을 포함하는 리스트들로부터 선택될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 원한다면, 하나 이상의 혈청 대체 재료들은 이러한 배지에 첨가된다. 이에 의해, 혈청 없는 기초 배지는 얻어진다.

더 바람직하게, 상기 기초 배지는 중간엽 기질세포 및/또는 중간엽 줄기세포의 배양을 위해 적절한, 기초 배지이다. 바람직하게, 상기 기초 성장 배지는 MSC들, 특히 인간 MSC들, 더 특별하게 기질 와튼 젤리로부터 유래된(바람직하게 인간의) MSC들의 다수의 증식 계대들을 위해 적절하다.

중간엽 기질세포들 및/또는 중간엽 줄기세포들의 배양을 위해 적절한 배지는 상업적으로 이용가능하고 그들의 일부는 특히 그러한 목적을 위해 구체적으로 거래된다. 예컨대, TheraPEAK^TM MSCBM CD(간단히 본 명세서 전체에서 MSCBM CD로 불림)는 그것의 제조자 Lonza(Wakersville, MD, USA; Cat. No. 95062-688)에 의해 중간엽 줄기세포들을 위해 적합한 것으로 기술되는 화학적으로 정의된 기초 배지이다. 실제로, 본 발명자들은 이 기초 배지를 특히 적절한 것으로 확인했다. 따라서 MSCBM CD는 본 발명에서 사용하기에 바람직한 기초 배지이다.

MSCBM CD에 실질적으로 동등한 모든 기초 배지는 동등하게 바람직하다. 용어 “실질적으로 동등한(substantially equivalent)”은 아래에 정의된다. 재료들 및 이들의 상대적인 양의 관점에서, 상기 기초 배지 조성의 유사성은 크로마토그래피(chromatographic) 및/또는 분광계(spectrometric)의 방법들, 또는 이와 같은 것들에 의해 테스트될 수 있다.

일반적으로, 적절한 배양 배지를 발견하는 것은 세포 배양의 전반적인 수행을 위해 매우 중요하다. 이것은 MSCBM CD 및 이에 실질적으로 동등한 기초 배지가 본 발명을 위한 특히 적절한 기초 배지임을 확인함으로써 처리되었다. MSCBM CD는 중간엽 세포를 위한 화학적으로 정의된 기초 배지이고 Lonza로부터 상업적으로 이용가능하다(Lonza, Wakersville, MD, USA), Cat. No. 95062-688. MSCBM CD, 예컨대 특히 MSCBM CD와 같은 구성들로 구성되거나 구성들을 포함하는 기초 배지의 변화는 예컨대, 다른 양들 또는 비율들, 또는 구성들로 구성되거나 구성들을 포함하는, 기초 배지가 부분적으로 또는 전체적으로 MSCBM CD의 구성들과 상이할 지라도, 본 명세서에서 기술된 바와 같이 사용될 때, MSC들의 성장에 실질적으로 동등한 효과를 가지고 있다면, 본 발명에 따른 사용에 의해 동등하게 포함된다.

다른 기초 배지는 또한 본 발명에 따른 상기 방법에서 MSC들의 증식을 위해 적절하다. 예컨대, 본 발명자들은 아래에서 기술된 바와 같이(데이터는 미도시) DMEM이 적어도 하나의 보충물(들)을 추가적으로 포함하는 성장 배지에 포함될 때, 또한 사용될 수 있는 기초 배지라는 것을 발견했다.

본 발명의 중요한 구현예들에서, 성장 배지는 기초 배지 및 적어도 하나의 보충물(들), 특히 혈소판 용해물을 포함한다. 따라서, 바람직하게, 적어도 하나의 세포는 기초 배지를 기초로 하고 적어도 하나의 보충물을 포함하는, 성장 배지에서 증식된다. 혈소판 용해물은 바람직한 보충물이다.

“기초된(based on)”은 상기 기초 배지, 예컨대 MSCBM CD가 적어도 하나의 보충물로 보충된다는 것을 의미한다. 만약 상기 보충물들이 액체 형태에서 첨가된다면, 그러면 상기 기초 배지는 적어도 하나의 보충물의 첨가로 약간 희석된다; 그러나 약간의 희석은 임의의 일반적인 문제를 야기하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 보충물들은 인간 또는 동물 혈청, 인간 또는 동물 혈소판 용해물, 인간 또는 동물 또는 식물 세포 용해물, 하나 이상의 항생제들, 헤파린, 보충적인 성장 인자들, 예컨대 인슐린, 또는 하이드로코르티손(hydrocortisone), 아미노산, 예컨대 글루타민(glutamine), 또는 이의 올리고머들을 포함하는 리스트로부터 선택될 수 있다.

바람직하게 상기 성장 배지는 보충물로 헤파린을 포함한다. 성장 배지에서 헤파린의 적절한 농도는 0.1 내지 100 U/mL, 예컨대 1 내지 10 U/mL, 예컨대, 2 U/mL이다. U는 위에서 기술된 바와 같이 헤파린의 단위(하웰 단위)를 나타낸다. 헤파린은 상기 기초 배지에 첨가될 수 있다.

특별하게 바람직한 구현예에서, 상기 적어도 하나의 세포는 상기 기초 배지 MSCBM CD(Lonza, Wakersville, MD, USA; Cat. No. 95062-688)에 기초된 성장 배지, 또는 실질적으로 이에 동등한 기초 배지에서 증식된다. 본 발명에서, MSCBM CD는 예컨대, 높은 누적 집단 배가/높은 세포 수를 발생시키는 데 특히 이점이 있다는 것을 증명했다.

본 발명의 목적을 위해, 두 기초 배지가 서로 실질적으로 동등하든지 아닌지는 이상적으로 동일한 탯줄로부터 분리되는 세포들을, 상기 기초 배지에 기초된 성장 배지에서 실질적으로 동등한 조건들 하에서, 즉 동일한 첨가제들(예컨대 혈소판 용해물)을 가지고, 동일한 양에서, 동일한 온도 등에서 동일한 배양 접시들에서, 이상적으로는 동시에, 성장시킴으로써 테스트된다. 다시 말해서, 상기 두 기초 배지가 서로에게 실질적으로 동등한지 테스트하기 위해, 상기 성장 테스트에 유일한 변수는 기초 배지 그 자체이다. 상기 세포들은 바람직하게 실시예 1 및 2A에서와 같이 분리되고, 실시예 2B에서와 같이 하위-배양되는(“P0”), 기질 와튼 젤리로부터 유래된 MSC들이다. 트립신 처리 후에, P0로부터 상기 세포들은 그 후에, 제1 기초 배지(예컨대, MSCBM CD)에 기초된 성장 배지, 및 제2 기초 배지(충분한 동등성에 대해 테스트되도록)에 기초된 성장 배지에서 동시에 성장하게 된다. 상기 두 기초 배지는 다음의 둘이 관찰될 때, 실질적으로 동등한 것으로 간주된다: 플레이팅(plating)(P1-P8)당 평균 누적 집단 배가는 대체로 동일하고(최대 10 % +/- 분열), 계대 8 후에 얻어진 상기 세포들의 노화(설명을 위해 실시예 11 참조)는 실질적으로 동일하다(최대 10 % +/- 분열).

대안적인 구현예들에서, 상기 성장 배지는 비록 MSCBM CD에 실질적으로 동등하지 않을지라도, 다음과 같이 특징지어진, 기초 배지에 기초된다: 플레이팅(P1-P8)당 평균 누적 집단 배가는 기초 배지 MSCMB CD에 기초된, 그 외에는 동일한 성장 배지에 성장과 비교되면, 적어도 70 % 높고, 그 외에는 동일하지만, 기초 배지 MSCMB CD에 기초된, 성장 배지에서 동시에 성장된 세포들의 노화와 비교되면, 계대 8(설명을 위해 실시예 11 참조) 후에 얻어진 상기 세포들의 노화가 150 % 이하이다. DMEM(다른 공급자로부터 상업적으로 이용가능함)은 그러한 기초 배지의 구현예일 수 있다.

바람직하게, 상기 성장 배지는 MSC들, 특히 본 발명의 MSC들의 다수 계통 분화를 지지한다. 만약 필요하다면, 보충물은 세포들의 분화를 특정 계통으로 이끌기 위해 기초 배지에 첨가된다. 다수 계통 분화를 위한 테스트들은 아래에 기술된다.

바람직하게, 혈소판 용해물 또는 이의 유도체는 상기 성장 배지에 존재한다. 따라서, 본 발명에서 유용한 성장 배지는 바람직하게 혈소판 용해물을 포함한다. 더 구체적으로, 본 발명자들은 상기 기초 배지 MSCBM CD, 또는 이에 실질적으로 동등한 기초 배지의 상기 보충물 혈소판 용해물과의 조합은 특히 적절하고 그러한 성장 배지는 훨씬 바람직한 것을 보여준다. 바람직하게, 혈소판 용해물이 존재할 때, 상기 성장 배지에서 인간 또는 동물의 혈청은 존재하지 않고, 더 바람직하게 혈소판 용해물 이외에 인간, 동물 또는 식물 세포 용해물은 존재하지 않는다. 인간 또는 동물 혈청 대신에, 본 발명에 따른 상기 성장 배지에 혈소판 용해물의 사용은 프리온, 바이러스를 전염시키는 위험, 또는 주입 후 수용자(recipient)에서 면역반응을 유도하는 위험, 및 우수 제조 기준(Good manufacturing practice, GMP) 하의 규제 제약의 관점에서, 동물 혈청의 전통적인 사용과 연관된 문제들을 처리한다.

만약 혈소판 용해물이 성장 배지에 존재한다면, 또는 더 정확하게 기초 배지(예컨대, Lonza의 MSCBM CD, 예컨대, 또는 이에 실질적으로 동등한 기초 배지)에 첨가된다면, 그러면 상기 혈소판 용해물은 또한 상기 기초 배지에 보충물로 일컬어질 수 있다.

본 구현예에서 보충물로 적절한 상기 혈소판 용해물은 일반적으로 위에서 기술된 상기 효소적 소화 동안 혈소판 용해물을 첨가하는 구현예에 대해 기술된 상기 혈소판 용해물에 대응되지만, 다음의 네가지 추가적인 더 바람직한 구현예들이 이상적으로 추가적으로 단독 또는 조합에서 실행된다:

제1 특히 바람직한 구현예에서, 상기 혈소판 용해물은 상기 탯줄과 동일한 종(그러나 통상적으로 동일한 개체로부터는 아니다)으로부터 온다. 상기 동일한 종으로부터의 혈소판 용해물의 존재에서 상기 배양과 연관된 이점은 특히 기질 세포들의 배양을 위해 동일한 종의 혈소판 용해물을 사용하는 것에 대항하는 선행 기술의 편견의 관점에서 놀랍다: 예컨대, 일반적으로 말의(equine) 혈소판 용해물이 말의 중간엽 기질세포 배양에 유리하지 않고(Russell et al., 2016, Equine Vet. J., vol. 48, p. 261-264), 개의(canine) 혈소판 용해물이 개의 중간엽 기질 세포들의 분리 및 증식(propagation)에 대해 소 태아 혈청보다 열등하다는 것(Russell et al., PLOS One, 2015, vol. Vol. 10, e0136621)이 보고되었다. 사용된 상기 혈소판 용해물이 개개의 변동성을 보상하고 더 표준화되고 재현성있는 혈소판 용해물 산물을 얻기 위해 각 제제에 포함된, 다수의 기증자로부터의 혈소판들을 포함하는 것이 강하게 선호된다; 전혈로부터 유래된 백혈구연층(buffy-coat)에 의해 얻어진 혈소판들의 풀링이 표준화된 절차이다(참조 예컨대, Iudicone et al., 2014, J. Transl. Med., 12: 28). 바람직하게, 상기 혈소판 용해물은 포유류 혈액으로부터 유래된다. 상기 목적에 따라, 적절한 포유류가 상기 혈액 근원으로 선택될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 의도인 상기 포유류들은 원칙적으로 요구된 상기 혈소판의 양이 합리적으로 수집될 수 있는, 모든 동물들, 어린 또는 성체일 수 있다. 일부 구현예들에서, 주로 성체 포유류 동물들은 사용된다. 비인간 동물들의 예시들은 도축동물들 및 다른 농장에서 키워진 동물들, 예컨대 소, 돼지, 양 또는 가금류이다. 포유류 혈소판 용해물은 바람직하고, 인간 혈소판 용해물(축약형 “hPL”)은 강하게 선호된다. 일부 구현예들에서, 상기 포유류는 인간이다. 일반적으로, 첨가된 상기 혈소판 용해물은 바람직하게 상기 탯줄/세포들과 같은 종들로부터 온다. 특히, 인간 탯줄로부터 기원하는 세포들의 배양을 위해, 인간 혈소판 용해물의 첨가는 선호된다. 혈소판 용해물은 통상적으로 상기 세포들에 동종이계이다. 일부 구현예들에서, 혈액 기증자들은 건강하고 관련 규제 기관들에 의해 규정된 요건들을 충족시킨다. 예컨대, 혈액은 국가의 식품/약물 관리 기관이 식품들 또는 의학적 사용을 위해 의도된 제품들에 두는, 요건들을 충족시킬 수 있거나 본 발명이 실시되는 지리적인 영역 내에 대응하는 규제들을 충족시킬 수 있다. 상기 인간 혈소판 용해물은 전체 또는 부분적으로(바람직하게는 전체로) 소 태아 혈청을 대체할 수 있다. 가장 바람직한 구현예들에서, 상기 혈소판 용해물은 인간 기증자로부터 온다. 이러한 구현예들에서, 상기 기증자들이 약 50세, 약 45세, 약 40세, 또는 그 이하의 나이 아래인 것이 바람직하다.

제2 특별하게 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 혈소판 용해물은 세포 배양 배지에 보충물로 사용될 때, 소 혈청, 특히 소 태아 혈청(FBS)에 동일한 농도에서 비교되면, 세포, 특히 와튼 젤리로부터 유래된 MSC들에 성장 촉진 활성을 증가시켰다. 일부 구현예들에서, 상기 조성은 동일한 농도에서 소 태아 혈청(FBS)과 비교되면, 세포들의 적어도 20%의 증가된 성장 촉진 활성을 가진다.

제3 특별하게 바람직한 구현예에서, 상기 성장 배지에서 혈소판 용해물의 농도는 약 0.1 % (vol./vol.) 내지 약 20 % (vol./vol.), 바람직하게 약 0.5 % (vol./vol.) 내지 약 10 % (vol./vol.), 더 바람직하게 약 1 % (vol./vol.) 내지 약 5 % (vol./vol.), 예컨대 1 % (vol./vol.), 2 % (vol./vol.), 3 % (vol./vol.), 4 % (vol./vol.), 또는 5 % (vol./vol.)이다. 약 5 % (vol./vol.)가 특히 중간엽 줄기세포에 적합한 화학적으로 정의된 기초 배지, 예컨대 MSCBM CD(Lonza), 또는 이에 실질적으로 동등한 기초 배지와 조합하여 특히 유용하고 따라서 바람직한 것을 증명했다.

제4 특별하게 바람직한 구현예에서, 상기 성장 배지에 첨가된, 상기 혈소판 용해물은 혈소판들의 유도체들을 포함한다. 대안적으로, 상기 혈소판 용해물은 포유류 혈소판 막들 및/또는 다른 세포 잔해가 실질적으로 없다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 없다는 것은 오직 탐지될 수 없는 양의 혈소판 막이 있거나 혈소판 막들의 양이 임의의 합리적이고 상업적으로 믿을 만한 방법에 의해 추가로 줄여질 수 없거나 혈소판 막들의 양이 상기 혈소판 용해물의 사용을 대체로 방해하지 않는다는 것을 의미한다. 혈소판 막들은 이 분야에서 알려진 임의의 적절한 방법들, 예컨대 밀도 구배를 사용해서 상기 혈소판 용해물로부터 분리될 수 있다.

일부 유용한 구현예들은 실시예 0 및 2에서 제공된다.

바람직하게, 혈소판 용해물 또는 이의 유도체들은 증식 단계 (c)의 모두 또는 부분 동안 바람직하게 존재할 수 있다. 따라서, 바람직하게, 단계 (c)에서, 적어도 하나의 세포는 혈소판 용해물(PL) 또는 이의 유도체들, 바람직하게 인간 혈소판 용해물(hPL) 또는 이의 유도체들을 포함하는, 성장 배지에서 증식된다.

임의의 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 혈소판 용해물의 존재가 영양분 및 성장 인자들을 제공하고 세포들의 효율적인 증식을 가능하게 하는 환경에 기여한다고 예상된다. 임의의 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, 혈소판 용해물의 존재가 효소적 추출 후에 남아있는 임의의 효소적 활성의 균형을 맞추는 것 또는 억제하는 것을 돕고, 따라서 다음의 증식 단계 동안에 조건들의 온화함을 또한 돕는다고 생각할 수 있다. 인간 혈소판 용해물(hPL)은 인간 MSC들과 사용하기에 바람직하다.

따라서, 본 발명에서, 혈소판 용해물(PL)은 중간엽 기질세포들(설명 및 추가적인 세부사항들을 위해, 또한 WO 2013/042095 A1 참조)을 배양하기 위해 동물 혈청에 대안이 될 수 있다. 혈소판들은 수많은 성장 인자들, 예컨대 PDGF(혈소판 유래 성장 인자), b-FGF(기초 섬유모세포 성장 인자), VEGF(혈관 내피 성장 인자), 및 TGF-β(변형 성장 인자- β)의 풍부한 근원으로 알려져있다.

선택적으로, 하나 이상의 항생제들은 상기 성장 배지에 존재한다. 만약 그렇다면, 하나 이상의 항생제들은 기초 배지에 보충물로 첨가될 수 있다. 본 발명의 문맥상 적절한 항체들은 예컨대 특히 암포테리신(amphotericin) 및 겐타마이신(gentamycin)을 포함한다. 상기 성장 배지들에서 하나 이상의 항생제들의 농도는 바람직하게 이 기술분야에서 일반적으로 사용되는 농도 범위에 있다. 대안적으로, 첨가된 항생제들은 상기 성장 배지에 존재하지 않는다.

바람직하게, 위에 열거된 것들 이상의 추가적인 재료들은 상기 기초 배지에 첨가되지 않는다. 특히, 적어도 하나의 세포는 임의의 첨가된 혈청을 포함하지 않는, 특히 소 혈청, 예컨대 소 태아 혈청(FBS)이 없는 성장 배지에서 증식되는 것이 훨씬 바람직하다. 그 구현예의 목적을 위해, 혈소판 용해물은 정의 혈청에 해당하지 않는다; 다시 말해서, 상기 성장 배지는 비록 일부 혈청 또는 미량(trace)의 혈청이 상기 성장 배지에 첨가된 혈소판 용해물에 포함될 수 있을지라도, 혈청이 고전적인 의미에서 세포 배양 재료로 첨가되지 않는다고 명시할 의도로, "첨가된 혈청(added serum)"을 포함하지 않는다고 진술될 수 있다. 본 발명에서 FBS는 예컨대 그것이 바이러스성 및 프리온 질병을 전염시킬 위험을 지니기 때문에, 바람직하지 않은 첨가제이다. 대조적으로, 본 발명의 상기 방법은 혈소판 용해물의 존재에서 예컨대 FBS에 대한 대체품으로 효율적으로 작용한다. 인간 MSC들의 성장을 위해, 인간 혈소판 용해물은 FBS 보다 첨가제로서 바람직하다.

바람직하게, 부착 매트릭스는 상기 세포들이 성장 플레이트에서 계대 대상이 될 때, 제공되거나 존재하지 않는다. 따라서, 부착 매트릭스가 상기 세포들이 플레이팅(plate) 될 때 제공되거나 존재할 수 없고/또는 부착 매트릭스가 상기 기초 배지에 보충물로 첨가되지 않는다.

계대(passage)

바람직한 구현예에서, 상기 세포들은 하나 이상의 계대에 걸쳐 증식된다.

“계대(passage)”는 배양 용기들 내에서 상기 세포들이 각각의 계대를 개시하도록 시딩되는, (특정 타입의) 배양 용기에서의 세포들의 배양을 가리킨다. 일반적으로 상기 세포들은 그들이 배양되는 동안 상기 배양 용기에 부착하고, 상기 세포들은 배양되는 동안 일반적으로 상기 배양 용기 내에서 증식한다. 계대의 끝은 일반적으로 상기 부착성 세포들(예컨대, 트립신 처리에 의해)의 분리에 의해 정의된다. 다음에 세포들은 그 후 동일하거나 다른 타입의 신선한 배양 용기에 선택적으로 시딩되고; 신선한 배양 용기로의 상기 시딩은 다음 계대의 개시를 정의한다. 따라서, 그러한 증식을 따르는 상기 세포들은 그 배양 용기에서 또 다른 배양 용기로 옮겨지고, 그 후 그 다른 배양 용기에 존재하는 상기 세포는 다음 계대를 나타낸다.

“수확(harvest)”은 계대의 끝에서 배양 용기에서 성장된, 실질적으로 모든 세포들을 얻는 과정을 가리킨다.

각 계대에 대해, 하나의 배양 용기가 사용될 수 있고; 그러나 더 바람직하게는 다수의 배양 용기들이 각 계대마다 동시에 사용된다. 그리고 세포들은 실질적으로 동일한 시간 동안 실질적으로 동일한 조건들 하에서, 다수의 배양 용기에서 동시에 배양된다. 바람직하게, 다수의 상기 배양 용기들에서 시딩 밀도는 실질적으로 동일하다.

각 계대의 초기에, 세포들(비부착/분리된, 바람직하게 희망하는 수/밀도에서)은 성장 배지를 포함하는 배양 용기에 첨가된다.

비록 세포 성장을 위해 요구되지 않을지라도, 항생제들은 종종 박테리아 및 곰팡이 오염 물질들의 성장을 제어하기 위해 사용된다. 이것은 특히 초기 계대, 예컨대, P2 이후 또는 P1 이후에 바람직하지만 후기 계대에서는 바람직하지 않다. 따라서, 항생제들이 비록 상기 세포들의 분리(“P0”) 후에 제1 계대에서 존재할지라도, 항생제들은 바람직하게 P0 후에 모든 계대들에 대해 중지된다; 다시 말해서, 항생제들의 첨가가 없는 성장 배지는 P1 및 모든 다음의 계대를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명에서, 항생제들은 탯줄로부터 상기 세포들의 분리 후, 제1 세포 배양(예컨대, P0)에서 보충물로 바람직하게 존재하지만, 이후의 세포 배양, 즉 P0의 하위 배양에서는 아니다.

각 계대의 끝에서, 상기 세포들이 아래 표에서 기준 3에 따라 컨플루언스 퍼센트에 도달할 때, 상기 세포들은 수확된다. 그 목적을 위해, 상기 성장 배지(및 있다면, 이에 포함된 임의의 비부착의 세포들)는 흡인되고(aspirate), 상기 부착 세포들은 선택적으로 적절한 살균 완충제로 세척되고 선택적으로 그러나 바람직하게 효소적으로 분리, 예컨대 트립신 처리되고, 선택적으로 카운팅되고, 선택적으로 그러나 바람직하게 원심분리에 의해 농축되고, 선택적으로 그러나 바람직하게 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 바람직하게 MSC들에 대해 적절한 성장 배지에서 재현탁된다. 상기 재현탁된 비부착 세포는 그 후 선택적으로 다음 배양 계대의 초기에 첨가되기 위해 사용된다.

상세하게 본 명세서 아래에서 기술된 바와 같이, 상기 계대들은 계대 0(P0)으로 시작해서 연속적으로 번호매겨진다. P0는 위에 기술된 바와 같이 바람직하게 효소적 소화에 의해 상기 세포들을 얻은 후인, 제1 계대이다. 따라서, P0는 “최초 배양(primary culture)”으로 일컬어질 수 있다. 최초의 접종(inoculation)을 위한 상기 세포들은 상기 탯줄의 상기 와튼 젤리로부터, 위에서 기술된 바와 같이 기계적으로 및/또는 효소적으로 분리된(dissociate) 조직으로부터, 또는 대안적이지만 훨씬 덜 바람직하게는, 기질 와튼 젤리 조직으로부터 이동하는 세포들의 성장으로부터 기원한다.

다양한 계대에서 세포들을 성장시킴으로써, 상기 세포들은 하나의 단일 계대에서만 가능할 것보다 더 높은 총 세포 수 및/또는 더 높은 동질성 및/또는 바람직하지 않은 세포들에 의한 더 적은 오염에서 증식될 수 있다. 상기 세포들은 정의된 조건들 또는 그렇지 않으면 바람직한 조건들에서 증식될 수 있다.

상기 탯줄(UC)의 기질 세포들이 구조, 생물학적 특성들 및 상기 UC 내에 위치에 관해서, 이질적이라고 일반적으로 인식된다. 예컨대, 도 7A는 본 발명 및 최신 기술 둘 모두에 따라 갓 분리된 UC 유래 세포들은 특정 표면 마커들의 표시에 관해 이질적이라는 것을 보여준다.

상기 기질 와튼 젤리(또한 임의의 다른 상기 탯줄의 영역)로부터 분리된 모든 세포들이 클론원성이 아니라는 것이 통상적이다. 다시 말해서, 모든 분리된 세포들이 콜로니 형성 유닛(colony forming unit, CFU)가 아니다. 그러나, 다수의 계대들에 대해 본 발명에 따라 분리된 상기 세포들을 성장시킴으로써, 클론원성인, 바람직한 중간엽 기질세포들이 풍부하게 될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 증식은 MSC들의 상기 퍼센트가 시간이 지남에 따라 증가하는 점에서 특징지어진다. 예컨대, P0의 끝에서 MSC들의 퍼센트는 P0의 초기에 MSC들의 퍼센트보다 통상적으로 높을 수 있다.

본 발명에서, (a) 비부착(및 따라서 비MSC) 세포들은 배양 계대의 끝에 상기 성장 배지와 함께 제거되고, (b) MSC들 보다 열등한 증식 특성들을 가진 세포들은 실질적으로 MSC들만큼 잘 증식하지 못하고 따라서 몇몇의 누적 계대의 경로를 거쳐, 상기 세포 집단이 MSC들에서 풍부하게 되고 결국 (일반적으로 P1부터 앞으로) 실질적으로 MSC들에 대해 순수하게 되기 때문에 다수의 배양 계대는 다른 세포들(바람직하지 않거나 오염시키는), 예컨대 적혈구에 관해서, MSC들이 풍부하게 될 수 있다는 이점을 준다.

정의되거나 그렇지 않으면 잘 확립된 조건들이 사용되는 한, 상기 계대 수를 누적 집단 배가로 산술적으로 변환하는 것은 일반적으로 가능하다.

상기 세포들은 바람직하게 다수의 계대들, 바람직하게 1 이상 내지 14 이하계대에서 증식된다. 예컨대, 상기 세포들은 3 내지 6 계대들에 대해 배양된다.

한 정확한 구현예에서, 갓 분리된 세포들은 효소적 소화 후 최초 배양 계대에 초기에 있게 된다(모범적인 설명을 위해, 실시예 2B 참조) - 최초 배양 계대는 P0로 일컬어질 수 있고; 선택적으로 증식은 P0에 대한 조건 하에서 새로운 계대에서 반복된다(상기 반복되는 배양 계대는 그 후 P0+로 일컬어진다). 다음의 계대들은, 즉 다음 P0 직후, 또는 P0+ 후에 P1, P2 등으로 숫자로 번호 매겨진다. 바람직한 구현예에서, 세포들은 적어도 P2까지 그리고 P6 이하까지 증식된다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 세포들은 P4까지 증식된다.

누적 집단 배가에 관해, P0 동안 누적 집단 배가를 측정하는 것은 통상적으로 어렵다. 주된 이유는 본 발명자들의 경험에서 P0의 초기에 시딩된 모든 세포들이 증식하지 않을 것이라는 것이다. P0 동안 상기 누적 집단 배가를 측정하기 위해, P0의 초기에 클론원성 세포들, 즉 증식할 수 있는, 이에 의해 딸 세포들에게 기원을 제공하는, 그러한 세포들의 수 또는 분율을 측정하는 것이 요구될 것이다. 그러한 측정이 이와 같이 일반적으로 실현불가능하지 않는 반면에, 본 발명의 상기 방법에 대해서 요구되지 않는다; 대신에, 그러한 구현예들에서, 누적 집단 배가는 P0를 제외한 모든 계대에 대해 측정된다. 상기 탯줄로부터 원래 분리된 상기 세포들이 통상적으로 클론원성인, MSC들 뿐만 아니라 클론원성이 아닌 다른 세포들(예컨대, 적혈구)을 포함하는 반면에, 아래 기술된 바와 같이, 다른 세포들은 그 중에서도 특히 그러한 비클론원성 세포들은 P0 동안 자식을 발생시키지 않기 때문에, 실질적으로 P0를 넘어서 존재하지 않을 것이다.

일 구현예에서, 세포들은 5 내지 30 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음), 예컨대 8 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 동안 증식된다. 바람직한 일 구현예에서, 세포들은 단지 5 내지 14 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 동안 증식된다. 이 구현예는 일차 세포 은행(Primary Cell Bank)의 생성을 위해 적절하다.

대안적인 바람직한 구현예에서, 세포들은 14 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 동안 증식된다. 이 구현예는 이차 세포 은행(Secondary Cell Bank)의 생성을 위해 적절하다.

본 발명자들의 경험에서, 매우 일반적인 규칙으로서 P1 및 P2(총 P1 플러스 P2, 그러나 P0를 포함하지 않음) 동안 상기 누적 집단 배가는 일반적으로 7 내지 15 회, 바람직하게 9 내지 13 회의 범위에 있다. 본 발명자들의 경험에서, 매우 일반적인 규칙으로서 P3 및 P4(총 P3 플러스 P4, 그러나 P0, P1 및 P2를 포함하지 않음) 동안에 상기 누적 집단 배가는 일반적으로 4 내지 12 회, 바람직하게 6-10 회의 범위에 있다. 결과적으로, 매우 일반적인 규칙으로서 P1, P2, P3 및 P4(총 P1 플러스 P2 플러스 P3 플러스 P4, 그러나 P0를 포함하지 않음) 동안 상기 누적 집단 배가는 일반적으로 9 내지 27 회의 범위, 바람직하게 15 내지 23 회의 범위에 있다. 이 숫자들은 P0 동안 누적 집단 배가를 포함하지 않는다.

각 계대의 초기에, 세포들은 세포 배양 용기에 옮겨진다. 바람직하게, 상기 세포들은 배양 용기당 세포들의 구체적인 양으로 옮겨진다. 상기 양은 바람직하게 상기 세포 배양 용기의 이차원 표면의 함수로 정의된다. 이에 의해, 정의된 세포 밀도를 가지고 상기 계대를 시작하는 것은 가능하다. 본 발명의 문맥상 배양 계대들을 시작하기 위한 세포 밀도들은 다음과 같다.

P0 및 P0+ 각각의 초기에(만약 적용할 수 있다면), 총 이용가능한 세포들은 시딩된다. 그러므로, P0 및 P0+를 개시하기 위한 정확하게 정의된 세포 밀도는(만약 적용할 수 있다면) 정의되지 않았다. 여하튼, P0 및 P0+를 개시하기 위한 상기 세포 밀도는(만약 적용할 수 있다면), 8.000 세포/m² 이상이어야 한다.

중간엽 기질세포들에 공통적으로, 본 발명의 상기 세포는 통상적으로 배양 용기, 특히 플라스틱 바닥 표면을 가진 배양 용기에서 성장될 때 부착성 세포이다. 바람직하게, 상기 세포는 성장 배지의 선택에 관계없이 부착한다. 여하튼, 상기 세포가 본 발명에 따른 바람직한 성장 배지에서 배양될 때 부착하는 것이 훨씬 바람직하다.

각 계대의 끝에, 상기 세포들은 수확된다. 그 목적을 위해, 그들은 선택적으로, 그러나 바람직하게 예컨대 트립신 처리로 효소적으로 분리된다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 트립신은 단백질 가수분해로 세포 부착 분자들을 소화시키는 것 그리고 따라서 부착 세포들을 상기 배양 용기로부터 또는 서로 분리시키는 것에 적절한 상업적으로 이용가능한 효소이다. “트립신 처리된(trypsinize)”은 따라서 그러한 소화에 적절한 조건들 아래에서 트립신 - 또는 트립신 같은 소화 패턴을 가진 임의의 다른 효소로 처리되는 것을 의미한다. 포유류 세포들, 특히 중간엽 세포들의 트립신 처리에 적절한 표준 방법들은 또한 본 발명에 따라 얻어진 상기 세포들을 트립신 처리하는 것에 적합하다. 그러한 목적들을 위한 트립신 제제들은 상업적으로 이용가능하고 제조자들의 지시들에 따라 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 효소적 분리는 트립신 이외에 적절한 효소들로 수행된다.

효소적 분리 다음에, 예컨대 트립신 처리에 의해, 선택적으로 그러나 바람직하게 총 세포 수(플라스크 당 또는 플레이트 당 또는 스택 당 또는 각각 그 계대에 사용되는 모든 배양 용기의 합계 당)는 측정된다.

본 명세서에서 세포들이 특정 계대, 예컨대 P4까지 증식된다고 언급되는 때, 그 후 세포들의 상기 증식이 그 각각의 계대 후에 추가적으로 지속되거나 방해되지 않는 것을 의미한다.

각 계대 후에, 다음의 허용 기준이 바람직하게 평가된다: 1 수율, 2 생존능력, 3 컨플루언스, 4 형태(morphology). 허용 기준 3 및 4의 측정은 상기 세포들의 효소적 분리 전에 발생한다. 허용 기준 1 및 2의 측정은 상기 세포들의 효소적 분리 후에 발생한다. 상기 세부사항들은 다음과 같다.

바람직하게, 모든 4 가지의 허용 기준은 충족되어야 한다.

컨플루언스의 현미경 측정은 세포 배양 용기에 부착된 세포들에 의해 덮인 상기 세포 배양 용기의 표면적의 퍼센트를 측정하는 것에 관한 것이다.

만약 상기 컨플루언스 기준이 충족되지 않는다면, 상기 세포들은 더 증식되고, 언제 상기 컨플루언스 기준이 충족되는 지를 알아채기 위해서 규칙적으로 관찰된다.

상기 수율의 측정을 위해, 상기 세포들은 효소적으로 분리, 예컨대, 트립신 처리를 받고 상기 세포를 포함하는 현탁액의 정의된 부분은 예컨대 NucleoCounter®에 의해, 자동화된(automate) 세포 카운팅에 있게 된다. 세포들의 총 수는 그 후 그 부분에 산술적으로 기초되어 측정된다.

형태(즉, 세포 형태)의 현미경 측정은 상기 세포 배양 용기의 바닥 표면 영역에 부착된 세포들의 형태를 측정하는 것에 관한 것이다. 상기 세포들의 대다수는 스핀들 모양(spindle-shape)이라는 것이 MSC들에 대해 통상적이다. 설명적인 목적을 위해, 그러한 세포들을 포함하는 세포 배양 접시의 바닥 표면에 대한 모습을 보여주는 사진은 “SWJ” 로 불리는 패널인 도 5C에서 나타난다.

생존능력의 측정은 세포 은행의 제조에 및/또는 다음의 계대에 있게 된 상기 세포들이 추가적인 증식(경우에 따라, 다음의 동결 및 해동)을 위해 알맞다는 것을 확신시킨다. 본 발명의 상기 세포들은 최신 기술에 따른 방법에 따라 분리된 MSC들과 비교되면, 생존능력에서 우수하다. 이에 의해, 그리고 본 발명에 따른 증식에 의존함으로써, 큰 세포 집단들은 심지어 상기 탯줄의 상기 기질 와튼 젤리로부터 초기에 분리된 전체 세포들의 수가 상대적으로 낮을 때도 얻어질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 얻을 수 있는 상기 세포들은 그들의 증식 잠재력에서 우수하다.

동결

상기 세포들은 표준 절차에 따라 동결, 예컨대 액체 질소에서 스냅-동결(snap-frozen)될 수 있다. 그러한 얼려진 세포들을 해동하는 것(de-frost) 및 예컨대 해동 후 그들을 추가적인 배양 계대에 있게 하는 것은 충분히 가능하다. 동결은 전체 배치(batch) 또는 부분 표본(aliquot)에서 발생할 수 있다.

본 명세서에서 세포들이 특정 계대, 예컨대 P4까지 증식된다고 전술되었을 때, 그 후 상기 세포들의 증식이 그 각각의 계대 후에 추가적으로 지속되거나 방해되지 않는다는 것을 의미한다. 모범적이지만 통상적인 구현예는 세포들이 각각의 계대 후에 얼려진다는 것이다. 반복된 계대 후 반복된 동결은 가능하다. 예컨대, 세포들은 P2 후 및/또는 P4 후에 동결될 수 있다. 바람직하게, 상기 세포들은 P2 후 및 P4 후에 얼려진다.

동결된 세포들 및 동결된 세포들의 집단은 또한 본 발명의 대상이다. 동결된 세포들의 집단들은 세포은행으로 일컬어 질 수 있다. 본 발명의 문맥상 얻을 수 있는 적절한 세포 은행들은 아래에 기술될 것이다.

일 구현예에서, 세포들은 5 내지 30 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음), 예컨대 8 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 동결된다. 바람직한 일 구현예에서, 세포들은 오직 5 내지 14 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 동결된다. 이 구현예는 일차 세포 은행의 생성에 적절하다. 대안적인 바람직한 구현예에서, 세포들은 14 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 동결된다. 이 구현예는 이차 세포 은행의 생성에 적절하다.

포유류 세포들, 특히 중간엽 세포들을 동결시키는 표준 방법들은 본 발명에 따라 얻어진 상기 세포들을 동결시키기에 적절하다. 바람직하게, 상기 세포들은 -70 ℃ 이하(예컨대 -80 ℃)의 온도에서 동결되고, 선택적으로 -190 ℃ 이하의 온도에서의 스냅-동결이 앞서올 수 있다. 일 구현예에서 상기 세포들은 액체 질소에서 동결된다.

상기 동결된 세포들은 선택적으로 그러나 바람직하게 동결된 형태에서 보관될 수 있다. 포유류 세포들, 특히 중간엽 세포들의 보관을 위한 표준 방법들은 본 발명에 따라 얻어질 수 있는 상기 세포들을 보관하기에 적절하다. 상기 세포들을 바이알(vial)에서 동결시키는 것은 바람직하다. 일 구현예에서, 상기 동결된 세포들은 액체 질소에서 보관된다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포들은 동결 전에 분취된다(aliquoted). 본 발명에 따라 얻을 수 있는 상기 세포들의 부분 표본들을 담기에 적절한 용기들은 세포들의 각각의 양(부분 표본들)을 수용하기에 그리고 낮은 온도에서 보관하기에 적절한 모든 용기들, 특히 바이알들이다. 바이알(또한 플라콘(flacon)으로 알려짐)은 액체를 보관하기에 적절한, 작은 유리 또는 플라스틱 용기 또는 병이다. 본 발명에 적절한 상기 바이알의 성질은 지시된 바와 같이 그것이 배지에서 상기 세포들을 포함하도록 하는 한, 그리고 그것이 상기 세포들이 그들의 후속 해동 및 하위 배양을 가능하게 하는 상태로 유지되는, 조건에서 동결되기에 적절한 한, 특별히 제한되지 않는다. 따라서, 그 목적을 위해서, 상기 바이알들은 냉동장치 자격이 있어야 한다(freezer-competent)(냉동 바이알(cryo-vial). 바이알들은 임의의 적절한 물질로 만들어질 수 있으나, 유리 바이알들 및 폴리프로필렌 같은 플라스틱으로 만들어진 바이알들이 가장 통상적이다. 상기 바이알은 닫혀질 수 있고, 그 목적을 위해 통상적으로 뚜껑을 갖으며 본 발명에 따라 사용하기에 적절한 냉동 바이알은 바람직하게 -196 ℃ 이하의 온도에서 동결에 적절하다. 뚜껑 선택은 스크류 바이알(스크류 뚜껑 또는 점적기(dropper)/피펫(pipette)으로 닫힘), 립 바이알(코르크(cork) 또는 플라스틱 마개로 닫힘) 및 크림프 바이알(crimp vial)(고무 마개 및 금속 뚜껑으로 닫힘), 또는 플라스틱 바이알들의 경우에 대해, 또한 눌러지면 스냅 닫히는 '힌지 뚜껑(hinge cap)' (스냅 뚜껑(snap cap))을 포함한다. 바이알의 바닥은 바람직하게 편평하지만, 이것은 엄격한 요건은 아니다. 바람직하게, 하나의 제공되는 분리/증식 과정에서 사용된 모든 바이알은 서로 모두 동일하고 동일한 부피의 세포 함유 액체로 채워진다(배지에, 통상적으로 현탁액에 세포들, 그러나 이것은 요건은 아니다).

바람직한 바이알들은 배지에 세포들의 2 내지 10 ml 사이(통상적으로 현탁액에서, 그러나 이것은 요건은 아님), 예컨대 배지에 세포들의 3 내지 8 ml 사이, 그리고 가장 바람직하게 배지에 세포들의 약 4 ml를 포함하는 것이 적절한 크기를 가진다. 바람직한 바이알들은 배지에 10⁶ 내지 10⁹ 개의 세포들 사이 예컨대, 배지에 10 x 10⁶ 내지 100 x 10⁶ 개의 세포들 사이, 그리고 가장 바람직하게 배지에 약 20 x 10⁶ 개의 세포들을 포함하는 것이 적절한 크기를 가진다.

동결된 및/또는 보관된 세포들은 선택적으로 그러나 바람직하게 해동될 수 있다. 해동 후에, 상기 세포들은 선택적으로 증식을 포함하는, 추가적인 배양(하위 배양)에 있게 될 수 있다. 특히 중간엽 세포들을 해동 및 선택적으로 하위 배양하기 위한 표준 방법들은 본 발명에 따라 얻어질 수 있는 상기 세포들을 해동하는 것에 적절하다. 추가적인 배양 또는 하위 배양을 위해, 성장 배지 등을 포함하는, 본 명세서에서 기술된 상기 방법들은 적절하다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포들은 계대 2(P2) 후에 동결된다. P2 후에 얻어지고 동결된 상기 세포들은 본 명세서에서 “일차 세포 은행” 또는 “PCB”, 또는 대안적으로 “마스터 세포 은행(Master Cell Bank)”으로 일컬어진다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 일차 세포 은행은 5 내지 14 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 얼려진 세포들을 포함하거나 세포들로 구성된다.

또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 세포들은 계대 4(P4) 후에 동결된다. P4 후에 얻어지고 동결된 상기 세포들은 본 명세서에서 “이차 세포 은행” 또는 “SCB”, 또는 대안적으로 “제조용 세포 은행(Working Cell Bank)”으로 일컬어진다. 바람직한 구현예에서, 상기 이차 세포 은행은 14 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 얼려진, 세포들을 포함하거나 세포들로 구성된다.

바람직하게, 상기 PCB 구현예 및 상기 SCB 구현예는 연결되었고, 그 결과 세포들은 PCB로 처음 얼려졌고, 그 후 다음에 PCB의 모두 또는 일부는 해동되고 하위 배양되었고 그리고 그 후 상기 SCB는 2 개의 추가 계대(전체에서 P4) 후에 얻어진다. 바람직하게, P2 후에 얻어지고 동결되는 모든 세포들, 예컨대 전체 PCB가 함께 해동되고 하위 배양되는 것은 아니다. 오히려, 가장 바람직하게, PCB로 얻어지고 얼려진 하나의 용기(통상적으로 하나의 바이알)는 해동되고 하위 배양된 반면에 다른 용기들(바이알들)은 PCB로 열려진 채로 있는다.

개개의 계대에 대한 참조는 본 명세서에서 안내 목적을 위해 제공된다는 것을 주목하는 것은 중요하다. 예컨대, P2 이외에 계대 후에 PCB를 제조하는 것은 또한 가능하다. P2 후에 PCB 및 P4 후에 SCB를 제조하는 것에 대한 선호는 실험적인 예시들(특히 실시예 2)에서 구체적으로 기술되는 배양 조건들에서, 기초 배지 MSCBM CD, 또는 이에 실질적으로 동등한 기초 배지에 기초한 배지에서 성장한 경험에 기초되었다. 본 발명의 문맥상 동등하게 가능한, 다른 배양 조건들이 사용될 때, 그러면 상기 PCB 및 상기 SCB는 본 명세서에서 실험적인 예시들, 특히 실시예 2C에서 각기 P2 및 P4 후에 관찰되는 누적 집단 배가에 대응하는 누적 집단 배가 후에 이상적으로 제조되었다.

개개의 세포의 분리는, 만약 원한다면 예컨대 연속 희석, 전- 또는 후-증식에 의해 달성될 수 있다. 그러한 분리가 구체적으로 수행되지 않는다면, 본 발명의 상기 방법은 중간엽 기질 세포들의 집단을 산출한다. 다음에 기술된 바와 같이, 상기 수율은 이전에 알려진 방법들과 비교되면, 그 중에서도 본 발명에 따른 상기 세포들의 우수한 생존능력 및 증식 특성의 관점에서 상대적으로 높다.

수율(Yield)

본 발명에 따른 단계 (c)를 포함하는 상기 방법은 중간엽 기질 세포들의 집단을 산출한다. 그러한 중간엽 기질 세포들의 집단은 본 명세서에서 기술된다. 바람직하게, 본 발명의 상기 방법은 혈구가 없는 세포 집단을 제공한다. 본 발명의 상기 방법에서 산출된 상기 세포 집단의 추가적인 태양은 본 발명의 제3 태양에서 기술된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 증식 동안 산출된 세포들은 분취되고 선택적으로 동결된다. 세포들을 분취하고 동결하기에 적절한 시점은 임의의 계대의 완성, 및 다음의 효소적 분리, 예컨대 트립신 처리, 원심분리, 및 성장 배지에서 재현탁 후이다. 바람직하게 부분 표본에서 동결함으로써 그렇게 얻어지고 보관된, 상기 세포들(세포 집단)은 또한 세포 은행으로 일컬어질 수 있다.

바람직한 일 구현예에서, 상기 세포들은 P2 후에 동결된다. 바람직하게 부분 표본에서 동결시킴으로써 그렇게 얻어지고 보관된, 상기 세포들(세포 집단)은 또한 일차 세포 은행으로 일컬어질 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 일차 세포 은행은 5 내지 14 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 동결된 세포들을 포함하거나 세포들로 구성된다.

추가적이지만 상호 배제적이지 않은 바람직한 일 구현예에서, 상기 세포들은 P4 후에 동결된다. 바람직하게 부분 표본에서 동결시킴으로써 그렇게 얻어지고 보관된, 상기 세포들(세포 집단)은 또한 이차 세포 은행으로 일컬어질 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 이차 세포 은행은 14 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 동결되는, 세포들을 포함하거나 세포들로 구성된다.

상기 각각 세포 은행들로부터 그렇게 얻어진 동결된 부분 표본들은 바람직한 시간 지점에서 개별적으로 해동하기 위해 이용가능하다. 다시 말해서, 동시에 상기 세포 은행의 모든 부분 표본들을 해동하는 것이 필요하지 않고 통상적으로 바람직하지 않다. 반대로, 분취하는 것 및 상기 부분 표본들의 개별적인 동결은 개별적으로 및 개별적으로 바람직한 시간 지점에서, 개개의 부분 표본들이 동결으로부터 배제되고, 해동되고, 추가적인 배양(하위 배양, 추가적인 증식)에 있게 될 수 있는 이점을 제공한다.

인간 탯줄을 가지고 시작하고 단계 (c)를 포함하고 계대 P2까지 실행하는, 완전한 스케일 실행은 통상적으로 일차 세포 은행(PCB)의 1 x 10⁹의 세포들, 더 바람직하게 적어도 2 x 10⁹의 세포들, 더 바람직하게 적어도 3 x 10⁹의 세포들, 더 바람직하게 적어도 4 x 10⁹의 세포들, 더 바람직하게 적어도 5 x 10⁹의 세포들, 더 바람직하게 적어도 6 x 10⁹의 세포들, 더 바람직하게 적어도 7 x 10⁹의 세포들, 더 바람직하게 적어도 8 x 10⁹의 세포들 더 바람직하게 적어도 9 x 10⁹의 세포들, 일부 구현예에서 적어도 10 x 10⁹의 세포들을 산출한다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 일차 세포 은행은 5 내지 14 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 동결되는 세포들을 포함하거나 세포들로 구성된다.

본 발명의 상기 세포들의 우수한 증식 특성들 때문에, 그러나 상기 세포들은 P2를 충분히 넘어서 배양될 수 있다. 이것은 P2 동안 얻어진 세포의 일부 또는 전부를 효소적 분리(예컨대, 트립신 처리) 후에 다음 계대(P3)로 전달함으로써, 또는 P2 후에 일차 세포 은행을 생성하고 그 후 바람직한 시간 지점에 일차 세포 은행으로부터 하나 이상의 세포 바이알을 해동시켜 다음 계대(P3)를 개시하도록 함으로써 일어날 수 있다. 임의의 경우에, P3 뒤에 하나 이상의 추가적인 계대가 있을 수 있고, 선택적으로 이차 세포 은행은 예컨대 P4 후에 발생될 수 있다. 우수한 증식 특성들 때문에, 나중 계대, 예컨대 P4 이후 세포들의 총 수는, 통상적인 수율이 위에서 지시된 P2 이후 세포들의 총 수보다 일반적으로 상당히 더 높을 것이다. 예컨대, P4 이후, 상기 세포들의 총 수율은 P2 이후보다 적어도 10배만큼, 그러나 더 통상적으로 P2 이후보다 적어도 100배 내지 적어도 1000배만큼 높을 것이다. 일부 구현예들에서, P4 후에 하나의 완전한 스케일 실행에 관해, 총 수율은 적어도 10 x 10¹² 세포들일 수 있다. 선택적으로, 이차 세포 은행은 P4 후에 제조된다. 바람직한 구현예에서, 그러한 이차 세포 은행은 14 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 후에 동결되는 세포들을 포함하거나 세포들로 구성된다.

상기 수율은 선택적으로 추가적인 하위 배양에 의해, 예컨대 계대 P5 및 이를 넘어서 추가적으로 증가될 수 있다.

분화 잠재력

본 발명의 상기 세포들의 능력(potency)은 실험적으로 평가될 수 있다. 일반적으로, 이것은 하나 이상의 특정 세포 타입들로의 분화가 선호되는(favoured), 조건들 하에서 세포들을 있게 함으로써 행해진다.

바람직하게, 단계 (c) 후에 얻어진 상기 세포(들)은 적어도 다능성, 및 선택적으로 만능성이다. 통상적인 구현예에서, 단계 (c) 후에 얻어진 상기 세포(들)이 다능성이다. 다능성은 일반적으로 이 기술분야에서 알려진 바와 같이, 분화 어세이(assay)에 의해 테스트될 수 있다. 특별한 조건들 하에서, 다능성 세포는 조직들(지방생성(adipogenic), 연골형성(chondrogenic) 및 뼈형성(osteogenic))로 분화할 것이다. 실시예 12, 13 및 14는 본 발명에 따른 상기 세포들이 그러한 능력들을 가진다는 것을 보여준다. 특별한 조건들 하에서 상기 세포는 다양한 조직들(지방생성, 연골형성 및 뼈형성)의 조직들로 분화할 것이다. 바람직하게, 본 발명의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 다능성 세포는 적어도 다음의 분화 잠재력의 모두를 가진다: (a) 지방생성; (b) 연골형성; (c) 뼈형성. 실시예 12, 13 및 14는 본 발명에 따른 상기 세포가 그러한 능력들을 가진다는 것을 보여준다. 이 실시예들, 특히 실시예 12에서 본 발명의 상기 기질 와튼 젤리로부터 유래된 세포들의 빠른 증식에도 불구하고, 분화하게 하는, 특별한 조건들이 기술되어있다.

선택적으로, 상기 세포는 중간엽 기질세포들에 대해 통상적인, 분화 잠재력으로부터 선택된, 추가적인 분화 잠재력을 갖는다. 그러나, 중간엽 기질세포들에 대해 통상적인 바와 같이, 본 발명의 상기 세포들은 통상적으로 전능성이 아니다.

그러나, 본 발명의 상기 세포들은 통상적으로 전능성이 아니다. 그럼에도 불구하고, 상기 세포는 선택적으로 유전적 조작 및/또는 핵 리프로그래밍(reprogramming) 될 수 있고, 이에 의해 상기 분화 잠재력은 영향을 받을 수 있다.

본 발명의 다른 태양과의 관계

본 발명의 상기 방법에 의해, 본 발명의 제2 태양에 상세하게 기술된 바와 같이, 세포는 얻어질 수 있다. 본 발명의 상기 방법에 의해, 본 발명의 제3 태양에 의해 상세하게 기술된 바와 같이, 세포 집단은 얻어질 수 있다. 예컨대, 본 발명의 상기 방법에 의해, 세포 은행은 얻어질 수 있다. 일 구현예에서, 세포 은행은 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있다. 그 구현예에서, 본 발명의 상기 방법의 단계 (c)는 선택적으로 상기 세포들을 분취하는 단계 (d) 및 상기 세포들을 보관하는 단계 (e) 전에 온다. 상기 세포들은 -180 ℃ 이하의 온도에서 동결시키는 것이 가장 통상적이지만, 임의의 적절한 조건에서 보관될 수 있다. 세포들은 동결, 바람직하게 액체 질소에서 스냅-동결될 수 있다. 동결보호제(cryoprotectant)는 동결 전에 첨가될 수 있다.

본 발명의 상기 태양들이 서로 관련되었기 때문에, 제2 및 제3 태양에 관련하여 기술된 구현예들은 또한 제1 태양으로, 읽힐 수 있고, 그 반대도 마찬가지이다. 예컨대, 본 발명의 제2 태양에서 기술된 바와 같이, 발현 프로파일링 또는 표면 마커 측정에 의해, 내피 마커 단백질들의 실질적인 부재를 보여줌으로써, 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법의 태양이 적절하게 구현된다는 것, 즉 상기 상피의 제거가 실험적으로 확인될 수 있다.

본 발명의 제1 태양의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 상기 세포집단은 본 발명의 제3 태양에서 추가적으로 아래에서 기술된 것과 같은 세포 집단인 것이 특히 바람직하다. 본 발명의 제1 태양에 따라 세포를 얻기 위한 방법이 본 발명의 제2 태양에 기술된 것과 같은 세포를 산출한다는 것이 또한 특히 바람직하다; 따라서 본 발명의 제2 태양에 따라 상기 세포를 특징짓는 것으로 본 명세서에서 기술된 모든 구현예들 및 특징들은 또한 본 발명의 제1 태양에 따라 상기 세포를 얻기 위한 방법을 특징짓는 것에 적합하다. 본 발명의 제1 태양의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 상기 세포가 다음과 같이 본 발명의 제2 태양에 기술된 것과 같은 세포라는 것은 또한 바람직하다.

중간엽 기질세포

제2 태양에서, 본 발명은 중간엽 세포에 관한 것이다. 더 정확하게, 상기 중간엽 세포는 중간엽 기질세포(MSC)이다. 상기 세포의 특징들 및 구현예들은 다음에 기술될 것이다.

다음에 기술될, 본 발명에 따른 상기 세포의 일부 특징들 및 구현예들은 본 발명의 상기 세포의 물리적인 특징들과 연관된다. 단지 설명을 위해, 그리고 본 명세서에서 어느 곳에서나 개시된 세부사항들에도 불구하고, 물리적인 특징들은 물리적인 방법들로 직접 측정되는 그러한 특징들, 예컨대 상기 세포의 유전자 발현, 크기, 형태 등을 포함한다. 다음에 기술될, 본 발명에 따른 상기 세포의 일부 특징들 및 구현예들은 본 발명의 세포를 얻을 수 있거나 얻어지는, 상기 방법과 연관되었다. 단지 설명을 위해, 그리고 본 명세서에서 어느 곳에서나 개시된 세부사항들에도 불구하고, 본 발명의 세포를 얻을 수 있거나 얻어지는 상기 방법과 연관된, 상기 세포들의 특징들은 (a) 상기 세포의 해부학적 근원, 특히 상기 탯줄 및 이의 바람직한 섹션으로서 상기 기질 와튼 젤리, (b) 상기 세포를 분리하기 위해 적용되는 조건들 및 선택적으로 그러나 바람직하게 또한 (c) 상기 세포를 증식시키기 위해 적용되는 조건들을 포함할 수 있다.

분리된 세포

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포는 분리된 세포, 특히 분리된 중간엽 기질세포이다. 특히, 본 발명의 상기 중간엽 기질세포는 바람직하게 상기 탯줄의 혈관 간 영역(설명을 위해 도 1 참조)으로부터 기원하거나 그러한 세포들로부터 유래된, 분리된 중간엽 기질세포이다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 분리된 기질 세포는 분리를 포함하는 방법에 의해 상기 기질로부터 얻어질 수 있다. 세포는 증식에 의해 그러한 세포로부터 유래될 수 있다. 따라서, 일반적으로, 제공되는 세포가 또다른 세포로부터 “유래되었다(derived from)”는 것이 진술될 때, 그 때 제공되는 세포는 증식(세포 분열) 및/또는 분화에 의해, 상기 다른 세포로부터 기원된 것을 의미한다.

일 구현예에서, 상기 세포는 인간 또는 동물 몸체 외부에 위치되는, 분리된 세포이다. 분리된 세포는 일반적으로 그것의 생리학적, 인 비보 환경 외부의 세포이다. 바람직하게, 상기 세포는 엑스 비보 세포이다. 특히, 상기 엑스 비보 세포는 바람직하게 상기 탯줄 외부에 위치된다. 특히, 상기 엑스 비보 세포는 바람직하게 직접 접촉이든 간접 접촉이든, 혈관과 접촉하지 않는다. 일 구현예에서 상기 엑스 비보 세포는 배양 용기에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포는 보관에 적절한 용기, 예컨대 바이알에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포는 약 35 ℃ 내지 39 ℃의 온도에서, 바람직하게 배양 용기에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포는 냉동보존(cryopreservation)에 적절한 용기, 예컨대 냉동 바이알에서, 바람직하게 -180 ℃ 이하의 온도에서 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포는 배양 배지에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포는 대사적으로 활성이 있는 세포이다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포는 동결되었다.

일 구현예에서, 상기 세포는 상기 인간 탯줄 세포에서 일반적으로 발견되지 않는 구조적 또는 기능적인 적어도 하나의 특징에 의해 특징지어진다. 예컨대, 그러한 특징은 본 발명의 상기 세포가 얻어질 수 있는, 상기 방법에 대해 특이적인 특징일 수 있다. 그러한 구조적 또는 기능적 특징은 이 개시에 분명하게 기술된 상기 특징들, 및/또는 이 개시에 분명하게 기술되지 않았으나, 본 발명의 상기 세포에 고유한(inherent), 예컨대 본 발명의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포들에 고유한, 특징들로부터 선택될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포는 예컨대 배양 용기, 예컨대 플라스틱 바닥 표면을 가진 배양 용기에 부착하는 부착 세포이다.

본 발명에 따른 분리된 기질 세포는 인 비트로에서 배양에 의해 증식될 수 있다. 이에 의해 유래된 세포는 얻어질 수 있다. 상기 유래된 세포는 그것이 본 발명의 상기 세포를 정의하는 청구된 특징들을 준수하는 한, 또한 본 발명의 세포이다. 따라서, 본 발명의 상기 세포의 줄기 세포-유사 특성들 때문에, 본 발명은 세포들의 다수의 세대들을 포괄할 수 있다. 다수의 세대들은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 증식에 의해 얻을 수 있다. 실제로, 본 발명에 따른 상기 세포의 특정 구현예는 엑스 비보에서 상기 세포의 증식을 포함한다. 따라서, 상기 세포가 분리되었지만, 동일하거나 유사한 세포들에게 자손을 제공하는 것 및 따라서 세포 집단을 발생시키는 것을 할 수 있다. 그러한 세포 집단은 본 발명의 제3 태양에 기술되었다. 적절한 배양 조건들은 특별히 제한되지 않지만 본 발명의 제1 태양에서 기술된 것들을 포함한다.

효소적 처리를 포함하는, 세포의 분리를 위해 적절하지만 제한하지 않는 방법은 본 발명의 제1 태양의 문맥에서 본 명세서에서 기술된다. 만약 원한다면, 개개의 세포들의 분리는 예컨대, 연속 희석에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 엑스 비보 환경, 예컨대 인 비트로에서의 세포이다. 본 발명의 제1 태양에 관해서 기술된 것들을 포함하는, 인 비트로에서 세포들을 배양하기 위한 다양한 방법들은 통상의 기술자에 의해 실행될 수 있다.

일반적으로, 중간엽 기질세포는 다양한 조직들, 예컨대 골수, 지방조직 및 탯줄로부터 기원할 수 있다. 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포는 상기 탯줄, 더 바람직하게 상기 탯줄의 상기 기질 와튼 젤리로부터 기원하거나 유래될 수 있다. 그러나, 본 발명의 상기 세포는 탯줄 혈액으로부터 유래되지 않는다. 상기 세포는 또한 상피 또는 내피 세포가 아니다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 갓 분리된 세포이다. 갓 분리된 세포는 그것이 기원한 조직으로부터 분리에 의해, 예컨대 위에 기술된 방법에 의해 직접 얻어지는 세포이다. 그러나, 더 바람직하게 본 발명의 상기 세포는 가장 통상적으로 인 비트로에서 증식에 의해, 갓 분리된 세포로부터 유래된 세포이다. 세포를 갓 분리한 다음에, 이와 같이 인 비트로에서 계대 또는 누적 집단 배가의 수에 따른 제한이 없다; 그러나, 통상적으로 본 발명의 상기 세포는 12 계대 이하, 또는 누적 집단 배가의 동등한 수에 대해 인 비트로에서 증식에 의해 갓 분리된 세포로부터 유래된다. 일반적으로, 청구된 제한들을 준수하는 임의의 세포는 기원의 조직들로부터 갓 분리된 후, 그것이 얻어진, 계대 또는 누적 집단 배가의 수에 관계없이 본 발명에 따른 세포이다.

중간엽 기질세포들에 대해 공통적으로, 본 발명의 상기 세포는 배양 용기, 특히 플라스틱 바닥 표면을 가진 배양 용기에서 성장될 때, 통상적으로 부착 세포이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 상기 중간엽 기질세포는 표면 부착 세포, 특히 인 비트로에서 플라스틱 부착 세포이다. 만약 원한다면, 플라스틱 부착 세포는 상기 배양 용기로부터 예컨대, 트립신 처리에 의해 분리될 수 있다. 이에 의해, 비부착 세포를 얻을 수 있다. 본 발명은 또한 그러한 비부착 세포를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 중간엽 기질세포는 스핀들 모양이다. 이것은 상기 중간엽 기질세포가 배양 용기, 예컨대 플라스틱 바닥 표면을 가진 배양 용기에 부착될 때, 일반적으로 적용한다. 특히, 중간엽 기질세포들의 집단에서, 대다수, 예컨대 세포 수에서 50% 이상은 특히, 인 비트로에서 플라스틱 표면에 부착할 때, 일반적으로 스핀들 모양이다.

본 발명의 상기 세포가 부착하지 않으면, 예컨대 그것이 효소적으로 분리, 예컨대 트립신 처리된 때, 예컨대, 그것이 일차 또는 이차 세포 은행에서 존재할 때, 선택적으로 얼려져서, 상기 세포는 일반적으로 스핀들 모양이 아니다. 따라서, 상기 스핀들 모양은 배양 조건 하에서 표면 부착과 특별하게 연관된다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 본 발명의 제1 태양에서 기술된 상기 방법에 의해 얻을 수 있다. 그 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 갓 분리된 세포, 즉, 엑스 비보 증식에 있지 않은 세포, 또는 증식된 세포, 즉 이전에 갓 분리된 세포의 엑스 비보 증식에 의해 얻을 수 있는 세포로부터 적절하게 선택될 수 있다.

유전자 발현 및 표면 항원 표시

본 발명에 따른 상기 세포는 유전자 발현 패턴에 의해 특징지어 질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, “유전자 발현 패턴(gene expression pattern)”은 경우에 따라 적어도 하나의 유전자가 발현되거나, 발현되지 않거나, 특정 수준에서 발현되는 것을 의미한다. 따라서, 이 특정 유전자가 발현되거나, 발현되지 않거나, 특정 수준에서 발현된다는 사실은 예컨대 기준 세포로부터 구별하기 위한 목적을 위해서 본 발명에 따른 상기 세포를 특징짓는다. 동일한 것은 하나 이상의 유전자, 예컨대 2 개의 유전자들, 3 개의 유전자들, 4 개의 유전자들, 5 개의 유전자들, 6 개의 유전자들, 7 개의 유전자들, 8 개의 유전자들, 9 개의 유전자들, 10 개의 유전자들 등의 발현에 대해 적용된다. 본 발명의 상기 세포가 하나 이상의 유전자들의 발현에 의해 특징지어질 때, 그 문맥에서 언급되지 않은 임의의 다른 유전자의 발현에 대해 구체적인 진술을 하는 것은 바람직하지 않다. 설명적인 예로서, 달리 문맥이 지시하지 않는다면, 본 발명의 상기 세포가 APCDD1을 발현한다고 본 명세서에서 진술된 어느 곳에서나, 이것은 임의의 구체적인 다른 유전자가 또한 발현되거나, 발현되지 않거나, 특정 수준에서 발현된다는 진술로 받아들여질 수 없다.

일반적으로, 상기 유전자의 발현은 핵산 수준 및 단백질 수준에서 다양한 방법들에 의해 테스트될 수 있다. 유전자 발현은 분자 생물학, 생화학 및 세포 생물학에서 상대적으로 흔하게 테스트될 수 있고, 이를 위해 알려지거나 적절한 임의의 방법은 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다. 일부 방법들은 아래에 기술되었다. 유전자 발현과 관련된 방법들은 또한 전사체 방법(transcriptomic method)으로 일컬어질 수 있다. 그러므로, 상기 세포의 유전자 발현 프로파일은 또한 전사체(transcriptome)로 일컬어질 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 그것의 유전자 발현 프로파일에 의해 특징지어진다.

다양한 용어들은 상기 유전자의 발현이 분석되는 것을 기술하기 위해 사용될 수 있다: 예컨대, 상기 발현은 테스트되고, 분석되고, 평가되고, 어세이되고, 측정되고, 결정되는 등으로 말해질 수 있다. 이 용어들은 질적(정성적) 측정, 즉 각각의 유전자가 발현되는지 아닌지의 질문, 및 양적(정량적) 측정, 즉 각각의 유전자가 어느 수준에서 발현되는지의 질문을 포함한다.

통상적으로, 유전자 발현의 측정을 위해, 하나의 세포 또는 다수의 세포들(바람직한)의 샘플은 세포 집단으로부터 취해지고, 상기 유전자 발현은 다음에 그 샘플에서 분석되고, 이에 의해 그 샘플 내 상기 세포들은 경우에 따라 파괴되거나 그렇지 않을 수 있다. 본 발명에 따른 상기 세포 집단이 일반적으로 이에 포함된 실질적으로 모든 개개의 세포들이 많이 비슷하거나 유사한 것을 의미하는, 동질성이 있기 때문에, 상기 세포 집단(대표 샘플)으로부터 취해진 상기 샘플에 포함된 상기 세포들에서 유전자 발현에 대한 발견은 달리 상기 문맥이 지시하지 않는다면, 그리고/또는 상기 세포 집단이 실질적으로 동질적이지 않다고 나타내지 않는 한, 대체로 또한 그 집단에 남아있는 세포들에 적용될 것이다.

임의의 각각의 유전자의 발현의 측정은 직접적이지 않은 측정, 즉 하나의 유전자에 집중하지 않은 채, 유전자 발현이 일반적으로 어세이되는 경우(예컨대, 마이크로어레이(microarray)같은 넓은 접근), 또는 직접적인 측정, 각 유전자가 발현되는지 특별하게 테스트되는 경우일 수 있다. 제2 경우에, 특히 각각의 유전자는 또한 “관심 유전자(gene of interest)”라고 말해질 수 있다.

몇몇의 전사체 기술들은 유전자 발현 분석을 위해 데이터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, DNA 마이크로어레이는 이전에 확인된 타겟 유전자들의 상대적인 활성을 측정한다. RNA-Seq 같은, 서열(sequence) 기반 기술들은 그들의 발현 수준 이외에 유전자의 서열에 대한 정보를 제공한다.

본 발명의 상기 세포는 태반 동물, 바람직하게 포유류, 바람직하게 영장류, 더 바람직하게 사람으로부터 온 세포이다. 따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 상기 중간엽 기질세포(MSC)들은 포유류 세포이다. 따라서, 달리 명시되지 않는다면, 특정 유전자에 대한 모든 지시는 각각 포유류 유전자를 의미한다.

더 바람직하게, 본 발명의 상기 중간엽 기질세포는 영장류, 더 특별하게 인간으로부터 온 세포이다. 따라서, 더 바람직하게, 본 발명의 상기 중간엽 기질세포(MSC)들은 인간 세포이다. 따라서, 그 구현예에서, 특정 유전자에 대한 모든 지시들은 각각 인간 유전자를 의미한다. 일부 경우에서, 이것은 인간 백혈구 항원(HLA)의 경우에서 같이 문맥으로부터 직접적으로 명백하고, 다른 경우에서 이것은 문맥에서 구체적으로 진술되지 않았다; 그러나 이것은 명백하다: 예컨대, 인간 세포에 관해서, APCDD1의 발현은 인간 APCDD1 등의 발현을 의미한다. 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포가 인간 세포이기 때문에, 본 발명의 상기 세포가 그 구현예에서 인간 APCDD1을 발현한다는 것이 바람직하다.

바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 형질전환(transgenic) 세포가 아니다. 그러므로, 그 구현예에서, 특정 유전자의 발현에 관한 모든 지시들은 각각의 유전자가 그것이 암호화되는, 더 구체적으로 그것이 멘델유전(Mendelian Inheritance)을 통해 암호화되는, 유전체(genome)로부터 발현된다는 것을 의미한다. 그러나, 일부 대안적인 구현예들에서, 본 발명의 상기 세포는 형질전환 세포이다.

바람직하게, 유전자 발현은 적어도 이중 복제 샘플들, 바람직하게 적어도 삼중 복제 샘플들에서 테스트된다. 일부 경우에서, 상기 테스팅에 있는 상기 세포들은 파괴되고, 비살균 조건들에 노출되거나 그렇지 않으면 분석의 부분으로 손상되고, 배양을 위해 사용될 수 없다; 그럼에도 불구하고, 이러한 파괴되고, 노출되거나 그렇지 않으면 손상된 세포들로부터 얻어진 정보는 여전히 가치있고, 특히 상기 세포가 동질 세포 집단으로부터 기원했을 때; 그렇게 얻어진 상기 정보, 특히 유전자 발현 정보는 파괴되고, 노출되거나 그렇지 않으면 분석된 손상 세포에 뿐만 아니라 각각 분석된 세포들이 기원하는 상기 집단에서 추가적인 세포들에 적용할 것으로 합리적으로 가정될 수 있다. 그것은 이와 같은 상기 세포 집단, 또는 그러한 세포 집단에 포함된 임의의 개개의 세포 모두에 적용하는 것이 가정될 수 있다. 그 문맥에서 동질성이라는 것은 실질적으로 모든 세포들이 많이 비슷하거나 유사하다는 것을 의미한다.

샘플은 단일 세포로 구성될 수 있고, 또는 그것은 대안적으로 다수의 세포들을 포함할 수 있다. 상기 샘플에 포함된 세포들의 총 수에 엄격한 상한은 없다; 그러나 수는 세포 집단에 포함된 세포들의 총 수보다 통상적으로 훨씬 적다; 예컨대, 그것은 세포 집단에 포함된 세포들의 양에 관해서, 1/100 이하, 1/100 이하, 1/1.000 이하, 1/10.000 이하, 1/100.000 이하, 1/1.000.000 이하이다.

매우 일반적으로 말하자면, 유전자의 발현은 통상적으로 예컨대 존재의 측정 및 필요하거나 원한다면 유전자 산물, 예컨대 특정한 메신저 RNA(mRNA) 또는 이들의 전구체 또는 분해산물(degradation product)의 수준의 측정을 포함하는, 분자 생물학 방법들에 의해서 직접적으로 테스트될 수 있고; 또는, 대안적으로 상기 유전자의 발현은 예컨대 통상적으로 존재의 측정 및 만약 필요하거나 원한다면 특정 유전자에 의해 암호화된 단백질, 예컨대 특정 세포 표면 단백질 또는 이들의 전구체 또는 분해산물의 수준의 측정을 포함하는, 생화학적인 방법들에 의해서 간접적으로 테스트될 수 있다. 본 발명의 상기 세포의 특징화를 위한 적절한 표면 단백질은 특별하게 분화의 무리(CD)를 포함한다.

상기 유전자의 발현을 테스트하기 위한 임의의 알려진 방법은 본 발명에서 또한 사용될 수 있다. 적절한 방법들은 유전자 발현 프로파일링, 중합 연쇄 반응(polymerase chain reaction), 그러한 PCR, 예컨대, 바람직하게 RT-qPCR을 포함하는 양적 PCR(qPCR), 전사 산물의 서열분석(sequencing), 임의의 전사체 타입 분석, 및 다른 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 리스트로부터 선택되는 것들을 포함한다. 핵산 수준에서, 바람직한 방법들은 마이크로어레이 및 qPCR을 포함한다.

일 구현예에서, 상기 유전자 발현은 유전자 발현 프로파일링에 의해 측정된다. 분자 생물학의 분야에서, 유전자 발현 프로파일링은 세포의 유전자 발현의 전반적인 그림을 생성하기 위해, 통상적으로 한번에, 몇몇의, 종종 수천의 유전자들의 발현의 측정을 가리킨다. 예컨대, 유전자 발현 프로파일링은 세포의 전반적인 그림을 생성하기 위해, 한번에 몇몇의, 통상적으로 그러나 필수적이지 않게 수천의 유전자들의 발현의 측정이다. 예컨대, 유전자 발현 프로파일링은 본 발명의 세포들과 다른 세포들 사이를 구별할 수 있다. 전체 유전체, 즉 특정 세포에 존재하는 모든 유전자의 발현을 동시에 측정하는 것은 심지어 가능하다. 이 분류의 많은 방법들이 전체 유전체를 동시에, 즉 특정 세포에 존재하는 모든 유전자를 동시에 측정한다. 몇몇의 전사체학 기술들은 분석하기 위해 필요한 데이터를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 마이크로어레이는 본 발명의 일부 구현예들에서 바람직하다. 마이크로어레이는 하나 이상의 관심 유전자, 예컨대 APCDD1을 포함하는, 유전자들의 상대적인 발현을 측정한다. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 현재 유전자 발현 프로파일링은 단일 실험에서 유전자 발현의 가장 전반적인 가능한 그림을 제공하는 것으로 이해된다.

일반적으로, 마이크로어레이는 유전자 발현 프로파일링을 위한 적절한 방법이다. 실제로, 마이크로어레이는 본 발명에서 그 목적을 위해 바람직하게 사용된다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 마이크로어레이는 예컨대, 선행 기술에 기술된 바와 같이 제공되는 세포와 비교되어, 특정 구체적인 유전자가 세포에서 다르게 발현되는지 아닌지를 보여준다. 마이크로어레이는 상업적으로 이용가능하고 본 발명의 문맥에서 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 유전자 발현은 고처리량 실험(high-throughput experiment)에서 측정된다. 대안적인 구현예에서, 유전자 발현은 고처리량 실험이 아닌 실험, 예컨대 하나의 구체적인 유전자를 겨냥한 구체적인 실험에서 측정된다. 일 구현예에서, 유전자 발현은 고처리량 실험에서 및 고처리량 실험이 아닌 실험에서 측정된다; 그러한 경우에, 상기 고처리량은 통상적으로 먼저 수행된다; 그리고 고처리량 실험이 아닌 실험은, 예컨대 상기 고처리량 실험의 발견을 검증하기 위해 다음에 나중 단계에서 수행된다. 예컨대, 마이크로어레이(고처리량) 다음에 예컨대 특정 유전자의 발현의 검증 또는 확인의 목적을 위해 qPCR(고처리량이 아님)이 올 수 있다.

차세대 서열분석(Next Generation Sequencing, NGS) 같은 고처리량 서열분석을 포함하는, 서열 기반 기술들은 본 발명에서 유전자 발현을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 전체 전사체 산탄 서열분석으로 불리는, RNA-Seq(RNA 서열분석)은 그들의 발현 수준 이외에 유전자들의 서열에 대한 정보를 제공할 수 있다. RNA-Seq는 주어진 시간 순간에 생물학적 샘플에서 RNA의 존재 및 양을 밝히기 위하여 차세대 서열분석(NGS)을 사용한다. 일 구현예에서, 유전자 발현은 서열 기반 기술 예컨대 RNA-Seq 또는 PCR 및 이들의 임의의 변형에서 측정된다.

일부 또는 모든 유전자들의 발현은, 예를 들어 유전자 발현 프로파일링, 예컨대 마이크로어레이에 의해 밝혀지는 바와 같이, 그때 양적 RT PCR(qRT PCR)에 의해 검증될 수 있다.

일반적으로 알려진 바와 같이, 양적 중합 연쇄 반응(qPCR, 또한 리얼타임 중합 연쇄 반응(Real-Time PCR)로 알려짐)은 핵산의 양을 측정하기에 적절한, 상기 중합 연쇄 반응(PCR)에 기반한 실험실의 방법이다. 특히, 전사물(transcript)(예컨대, mRNA)의 양을 측정하기 위한, 선택 방법은 양적 역전사 중합 연쇄 반응(qRT-PCR)이다. 다른 RNA 정량화(quantification) 방법들 예컨대 노던블롯(northern blot)과 비교되면, qRT-PCR은 RNA 수준의 탐지를 위해 가장 강력하고, 민감하며 정량적인 어세이로 일반적으로 고려되고, 그것은 따라서 본 발명에서 바람직하다. qRT PCR은 또한 유전자 발현의 측정을 위해, 단백질 수준의 유전자 발현 산물의 간접적인 측정, 예컨대 면역탐지(immunodetection), 예컨대 형광 1차 또는 2차 항체를 가진 면역장식(immunodecoration) 및 유세포측정에 의해서보다 훨씬 더 민감하다. qRT PCR은 통상적으로 각각의 핵산에 대한 특정 프라이머를 요구하지만, 이의 서열은 서열 데이터베이스, 예컨대 인간 유전자들에 대한 서열 데이터베이스를 통해 일반적으로 이용가능하거나 그러한 정보에 기초하여 통상의 기술자에 의해 고안될 수 있다. 상업적인 키트들 및 기계들은 qRT-PCR을 위해 이용가능하고, 이러한 것들은 본 발명에서 사용될 수 있다. qRT PCR에서 유전자 발현의 측정을 위해 주형(template)(또한 “타겟(target)”으로 불림)으로 작용하는, 핵산은 전사 산물, 통상적으로 mRAN이다.

qPCR은 일반적으로 총 35 내지 45 연속 주기, 더 바람직하게 38 내지 42 주기, 및 가장 바람직하게 40 주기로 실행된다. 형광이 심지어 주기의 총 수의 완료 후에도 관찰되지 않는 경우에, 그 때 상기 타겟 핵산은 상기 분석된 샘플에 부재한 것으로 결론을 내린다.

적절하게, 유전자 발현은 qPCR(바람직하게 qRT-PCR)에 의해 측정되고, 이에 의해 관심 유전자의 발현 수준은 측정되고, 바람직하게 하우스키핑 유전자(housekeeping gene)의 발현 수준과 비교된다. 이를 위해, 바람직한 하우스키핑 유전자는 베타-액틴(예컨대 도 8 참조)이다.

이 기술분야에 표준으로, qRT-PCR에 의해 측정되는 바와 같은 유전자 발현 패턴들은 각각 Ct 및 dCt에 의해 지시된다: 일반적으로, qPCR에서, 상기 Ct(주기 임계점(cycle threshold))는 형광 신호가 상기 임계점을 넘기 위해(즉, 배경 수준을 초과하기 위해) 요구되는 주기의 수로 정의된다. 일반적으로, 상기 Ct 수치는 상기 샘플에서 각각의 (타겟) 핵산의 양에 반비례한다(즉, Ct 수치가 더 낮을수록, 상기 샘플에 각각의 (타겟) 핵산의 양이 더 크다). Ct는 하나의 유전자의 발현에 특이적이다. 델타 Ct(dCt)는 2 개의 유전자들 사이, 일반적으로 관심 유전자 및 하우스키핑 유전자, 예컨대 베타-액틴(예컨대, 도 8 참조) 사이에서 발현의 차이를 지시한다.

바람직하게 본 발명의 상기 세포는 중간엽 기질세포에 특이적인 적어도 하나의 유전자를 발현한다.

본 발명의 상기 세포는 그것이 그 중에서도 APCDD1을 발현하는 점에서 특징지어진다. 특히, 상기 세포는 APCDD1을 발현한다. 본 발명자들은 본 발명에 따른 중간엽 기질세포들에 특이적인 유전자들이 APCDD1 및 PPARG, 및 선택적으로 FLVCR2를 포함하지만 이에 제한되지 않는 리스트에 포함된다는 것을 발견했다. 더 바람직하게, 상기 기질 세포들에 대해 특이적인 적어도 하나의 유전자는 발현 비율 또는 기준 세포에서 상기 적어도 하나의 유전자 대 베타-액틴에 관하여, 하우스키핑 유전자 베타-액틴과 비교되면, 높은 수준에서 발현된다. 이 표현형의 예시는 실시예 8에 나타난다.

선행문헌은 비혈관 주위 MSC들이 혈관 주위의 MSC들과 구별되는지 아닌지 불확실한 반면에(예컨대, Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630), 본 발명은 본 발명에 따라 얻어진 상기 기질 와튼 젤리 유래 세포들이 혈관 주위의 MSC들과 구별된다는 증거를 제공한다(예컨대, 실시예 8).

일 구현예에서, 유전자 발현은, 즉 일차 전사 산물, 상기 mRNA 또는 이의 전구체 또는 그것의 분해산물의 측정에 의해서가 아니라 추가적인 하류의 특정 산물의 측정에 의해 간접적으로 측정된다. 통상적으로, 추가적인 하류의 특정 산물은 mRNA에 의해 암호화된, 단백질이다; 그러나, 그것은 또한 임의의 다른 특정 산물, 특정한 단백질, 예컨대 효소적으로 활성적인 것의 존재에 특이적인, 대사산물(metabolite)일 수 있다.

바람직하게, 단백질의 존재는 측정된다. 더 바람직하게, 상기 세포 표면 상의 단백질의 존재가 측정된다. 다시 말해서, 단백질이 상기 세포 표면에 표시되는지가 측정된다.

상기 세포 표면에서 특정 단백질을 표시하는 세포들은 예컨대 면역학적으로 활성적인 분자들, 예컨대 특정 항체 및 다른 면역 반응적인(immunoreactive) 분자들에 의해 분석될 수 있다. “세포 표면(cell surface)”은 본 명세서에서 이 기술 분야에 일반적인 의미를 따라 사용되고, 따라서 구체적으로 단백질들 및 다른 분자들에 의해 결합할 수 있는, 상기 세포의 외부를 포함한다. 단백질은 만약 그것이 상기 세포의 표면에 적어도 부분적으로 위치된다면, 세포의 표면에 표시되고 항원과 결합하는 분자들, 예컨대 상기 세포에 첨가된 항원-특이적인-항체에 의해 결합할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표면에 표시된 단백질은 항체에 의해 인식될 수 있는 세포 외 부분을 갖는, 내재성 막 단백질(integral membrane protein)이다. 본 발명의 문맥에서 용어 “세포 외 부분(extracellular portion)” 또는 “엑소도메인(exodomain)”은 세포의 세포 외 공간을 마주하고 바람직하게, 결합 분자, 예컨대 세포 외부에 위치된 항체들에 의해 상기 세포의 외부로부터 접근할 수 있는 분자, 특히 단백질의 부분을 의미한다. 바람직하게, 상기 용어는 하나 이상의 세포 외 고리 또는 도메인 또는 이들의 조각을 가리킨다. 용어 “일부(portion)”는 본 명세서에서 사용되고, 구조의 연속적인 또는 비연속적인 요소 예컨대, 아미노산 서열을 가리킨다. 단백질 서열의 일부 또는 부분은 적어도 5 개, 특히 적어도 8 개, 적어도 12 개, 적어도 15 개, 적어도 20 개, 적어도 30 개, 적어도 50 개, 또는 적어도 100의, 단백질을 구성하는 아미노산 서열의 연속적인 및/또는 불연속적인 아미노산을 포함한다.

항체 또는 다른 면역 반응적인 분자에 의해 탐지될 수 있는 단백질은 또한 항원으로 일컬어질 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 하나 이상의 특정 항원을 표시 또는 표시하지 않음으로써 특징지어질 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 그러한 항원은 바람직하게 상기 세포의 표면에 표시된다. 그러한 항원은 또한 “표면 항원(surface antigen)”으로 일컬어 질 수 있다. 이의 예시들은 실시예 7에 제공된다.

세포 생물학의 일반적인 원리와 비슷하게, 항원이 상기 세포의 표면에 표시될 때, 그 때 상기 항원을 암호화하는 유전자는 상기 세포에 의해 발현된다. 그러므로, 상기 세포의 표면에 표시되는 항원의 탐지는 항원을 암호화하는 상기 유전자가 발현되는 것을 보여주기 위한 간접적인 수단이다. 예컨대, 상기 세포가 상기 세포의 표면에서 발현된 항원을 암호화하는 특정 유전자를 발현하는 것이 본 명세서에서 진술될 때, 그 때 상기 유전자의 발현은 유전자 발현 산물(예컨대, mRNA)의 수준에서 직접적으로 또는 상기 세포의 표면에 표시된 단백질의 수준에서 간접적으로 테스트될 수 있다. 비록 단어 “발현하다(express)”가 엄격한 의미에서 유전자가 발현되는 것을 의미함에도 불구하고, 상기 단어 “발현하다”는 또한 단백질, 특히 상기 유전자에 의해 암호화된 세포 표면 단백질이 상기 세포에 표시되는 것을 기술하는 것을 의미할 수 있다.

본 발명에 따라, 항원은 만약 발현의 수준이 탐지 한계 위에 있고/또는 발현의 수준이 상기 세포에 첨가된 항원-특이적인-항체에 의해 결합하도록 하기에 충분히 높다면, 세포에 표시된다. 본 발명에 따라, 항원은 만약 발현의 수준이 탐지 한계 아래에 있고/또는 발현의 수준이 너무 낮아서 상기 세포에 첨가된 항원-특이적인-항체에 의해 결합하도록 할 수 없다면, 세포에 발현되지 않는다고 진술된다. 바람직하게, 세포에 발현된 항원은 발현되거나 노출되고, 즉 상기 세포의 표면에 존재하고 따라서 항원-특이적 분자들, 예컨대 항체 또는 상기 세포에 첨가된 다른 면역 반응적인 분자에 의해 결합하기 위해 이용가능하다. 일부 경우에서, 상기 탐지에 도움을 제공하는 이차 분자, 예컨대 선택적으로 표지된(label) 이차 항체는 또한 첨가된다.

항체 또는 다른 면역 반응적인 분자는 상기 세포에 항원결정인자(epitope, 에피토프)를 인식할 수 있다. 상기 용어 “항원결정인자”는 항원과 같은 분자의 항원 결정기, 즉 면역 체계에 의해 인식되는, 즉 결합되는, 예컨대 항체 또는 다른 면역 반응적인 분자에 의해 인식되는, 분자의 부분 또는 조각을 가리킨다. 임의의 특정 항원에 대해 특이적인, 항원결정인자의 탐지는 특정 항원이 분석된 상기 세포에서 발현되는 것으로 일반적으로 결론을 내릴 수 있게 한다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 면역표현법(immunophenotyping)에 의해 특징지어질 수 있다. “면역표현법”은 상기 세포가 항원이 세포에서 발현되는지 결정하기 위해 상기 세포에 첨가된, 항원 특이적인 분자들, 예컨대 항체 또는 다른 면역 반응적인 분자들에 의해 특징지어질 수 있다는 것을 일반적으로 의미한다. 면역표현법은 유세포측정을 포함한 다양한 방법들을 사용하는, 세포 분류를 포함한다.

면역표현법을 위한 바람직한 방법은 유세포측정, 특히 FACS이다. 피분석물(analyte), 특히 세포 표면 단백질은 항체 또는 다른 면역 반응적인 분자를 가지고 일반적으로 인식된다. 상기 항체 또는 다른 면역 반응적인 분자는 그 자체로 형광단-표지되거나, 그 목적을 위해 첨가된 형광단-표지된 이차 항체 또는 다른 면역 반응적인 분자에 의해 인식된다.

본 발명의 문맥에서 면역 표현법을 위해 적절한 바람직한 피분석물은 분화 무리(또한 지정의 무리(Cluster of designation) 또는 분류 결정인자(Classification determinant)로 알려져있고, 본 명세서에서 CD로 축약됨)에 속하는 분자들이다. 상기 CD는 세포들의 면역 표현법에 의해 세포 표면 분자들의 확인 및 조사를 위해 사용되는 용어이다. 본 발명의 상기 세포의 구현예를 특징짓기에 적절한 분화 무리의 일부 예시들은 본 명세서에서 기술된다. 달리 문맥에서 지시하지 않는다면, 언급이 임의의 분화 무리(CD) 분자의 발현에 대해 이뤄질 때, 각각의 CD 분자의 발현은 면역 표현법에 의해 바람직하게 측정된다는 의도이지만, 핵산 수준에서 측정은 또한 가능하다. 본 명세서에서, 인간 세포에 관해 구체적인 CD 분자들의 언급은 Human Leukocyte Differentiation Antigen Workshops I-IX에 의해 정해진 정의에 따라 각각의 구체적인 CD 분자를 의미한다는 의도이다. 실시예 7은 본 발명에 따라 면역 표현법을 위해 모범적이고 유용한 기술을 제공한다.

반면에, 달리 문맥상 지시하지 않는다면, 본 개시 내용에서 언급이 동일한 것을 암호화하는 분화 무리(CD) 분자 또는 핵산이 아닌 임의의 유전자의 발현에 대해 이뤄질 때, 각각의 유전자의 발현은 바람직하게 핵산 수준에서, 바람직하게 위에서 언급된 또는 기술된 방법에 의해, 측정된다는 의도이다.

처음으로, 본 발명에 따른 상기 MSC는 그것이 (a) APCDD1을 발현한다는 것에서 특징지어진다. APCDD1의 발현은 바람직하게 유전자 발현 수준, 가장 바람직하게 qRT PCR에 의해 탐지된다. 이의 예시는 도 8에서 나타난다.

임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라지 않으면서, APCDD1은 상기 세포의 자가-재생 능력을 위해 중요하다고 믿어진다: 상기 유전자 생성물은 이전에 높은 베타-카테닌(catenin) 수준을 유지하는 것으로 나타났고, 베타-카테닌은 세포들, 특정한 MSC들의 줄기세포능을 유지한다(Viale-Bouroncle et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015 vol. 457, p. 314-317; Yu, Cell Transplant., 2017, vol. 26, p. 365-377). 실시예 8에서 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 상기 세포들은 PVWJ로부터 유래된 세포들과, 그 중에서도 특히 APCDD1의 발현에 의해 구별된다. 따라서, 본 발명에 따라 APCDD1를 발현하는 세포는 선행 기술에 의해 기술된 MSC들과 분명히 다르다. 특히 WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229 참조.

그러나, 본 발명에 따른 상기 MSC들은 3G5를 발현하지 않는다. 3G5는 혈관 주위 세포들에 대한 마커이다. 따라서, 본 발명의 상기 세포는 혈관 주위 세포는 아니다. 따라서, 바람직하게 본 발명의 상기 세포는 동시에 또한 중간엽 세포 및/또는 줄기 세포에 대한 마커가 아닌 혈관 주위 세포에 대한 임의의 마커를 발현하지 않는다.

바람직하게, 상기 세포는 기질세포, 더 특별하게 중간엽 기질세포에 특이적인 적어도 하나의 유전자를 발현한다. 바람직하게, 상기 세포는 기질세포, 더 특별하게 중간엽 기질세포에 특이적인 적어도 하나의 표면 마커를 그 표면에서 표시한다.

일 구현예에서, 기질세포, 더 특별하게 중간엽 기질세포들에 특이적인 적어도 하나의 표면 마커는 막 보조인자 단백질(membrane cofactor protein, CD46), 분해촉진인자(decay accelerating factor) 또는 CD55, 및 MAC 억제 단백질(MAC inhibitory protein, CD59)을 포함하는 리스트로부터 선택되지만, 이에 제한되지 않는다. 모든 세가지 마커들은 이전에 보체연쇄반응(complement cascade)과 연관된 것으로 기술되었다. 도 7B에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 예시된 세포들이 그들의 표면에서 이러한 마커들을 표시한다. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 하나 이상의 이러한 표면 마커들이 인 비보에서 보체-매개 세포 용해로부터 상기 세포들을 보호하는 역할을 한다고 믿어진다. 바람직하게, 상기 세포는 CD46, CD55, 및 CD59 중 적어도 하나, 더 바람직하게 CD46, CD55, 및 CD59 중 적어도 임의의 둘, 및 가장 바람직하게는 CD46, CD55, 및 CD59 모두를 발현한다. 본 발명자들의 지식에서, 일부 세포들이 하나 이상의 이러한 표면 분자들을 실제 발현하는 것은 물론 배제될 수 없으나, CD46, CD55, 및 CD59는 특정 UC로부터 유래된 MSC들에서 이전에 기술되지 않았다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포는 CD73을 발현한다. CD73은 또한 엑토 5' 뉴클레오티다제로 알려졌고 중간엽 기질세포(MSC)들을 위한 마커이다. 참조 Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포는 CD105를 발현한다. CD105(또한, 엔도글린으로 알려짐)는 중간엽 기질세포(MSC)들을 위한 추가적인 마커이다. 참조 Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포는 CD90을 발현한다. CD90(또한, Thy-1으로 알려짐)은 중간엽 기질세포(MSC)들을 위한 추가적인 마커이다. 참조 Dominici et al., 2006 (Cytotherapy, vol. 8, p. 315-317).

훨씬 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포는 CD105 및 CD73 모두를 발현한다. 위에 기술된 일반적인 방법들 이외에, 이러한 분화 무리는 예컨대 SH2 및 SH3 항체들에 의해 탐지될 수 있다(Horwitz et al., Curr. Opin. Hematol., 2006, vol. 13, p. 419-425). 일반적으로, 본 발명에 따른 중간엽 기질세포는 CD105 및 CD73 모두, 및 바람직하게 또한 CD90을 발현한다. 따라서, CD105 및/또는 CD73 및/또는 CD73의 발현은 본 발명의 상기 세포를 일부 다른 세포들과 구별시키기에 적절할 수 있다. 더 바람직하게, 상기 세포는 CD105 및/또는 CD73 및/또는 CD73 중 임의의 하나 이상 이외에도, 또한 CD46, CD55, 및 CD59 중 적어도 하나, 더 바람직하게 CD46, CD55, 및 CD59 중 적어도 임의의 둘, 그리고 가장 바람직하게 CD46, CD55, 및 CD59 모두를 발현한다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포는 또한 PPARG를 발현한다. 이의 예시는 도 8에 나타난다. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 상기 PPARG 유전자의 생성물이 세포들, 특히 MSC들을 다능성 표현형에 유지할 수 있고, 특히 뼈 조직으로 분화하는 것을 막을 수 있다고 믿어진다. 상세하게, 참조 예컨대, Xu et al. (Curr. Stem Cell Res. Ther., 2016, vol. 11, p. 247-254).

또 다른 및 상호 배제적이지 않은 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 FLVCR2 유전자를 추가적으로 발현한다. 이의 예시는 도 8에 나타난다. 축약형 FLVCR2는 고양이 백혈병 바이러스 하위그룹 C 세포의 수용체 패밀리(Feline leukemia virus subgroup C cellular receptor family), 구성 2를 나타낸다. 상기 암호화된 FLVCR2 단백질은 칼슘 수송체(transporter)로 기능하는, 주요한 촉진자 슈퍼패밀리의 구성으로부터 막 횡단 단백질(transmembrane protein)이다. 생물에서, 상기 암호화된 단백질은 뇌 혈관 내피 세포들의 발달에 잠재적으로 역할을 하는 것으로 이전에 기술되었다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포는 CD117을 발현하지 않는다. CD117은, 예컨대 골수에서 조혈(혈액) 전구체의 특정 타입들에 특이적인 세포 표면 마커이다. 본 발명의 상기 세포는 혈액세포가 아니고, 바람직하게 골수 세포 또한 아니다. CD117은 또한 일부 암의 타입들과 연관되었으나, 본 발명의 상기 세포는 일반적으로 암 세포가 아니다. 다시 말해서, 종양발생 세포들(oncogenic cell)은 본 명세서에서 본 발명의 세포들로 일컬어지지 않는다.

본 발명에 따른 상기 세포는 바람직하게 MHC Ⅰ를 발현한다. 인간 중간엽 기질세포의 경우에, 상기 인간 세포는 인간의 백혈구 항원인 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C 중 적어도 하나, 바람직하게 적어도 둘의 임의의 조합, 및 가장 바람직하게 모두를 발현하는 것이 바람직하다.

일부 구현예들에서, 본 발명에 따른 상기 세포는 MHC Ⅱ를 발현하지 않거나, MHC Ⅱ를 낮은 수준에서 발현한다. “낮은 수준(low level)”은 상기 발현 수준이 동일한 개체로부터의 항원제시세포(antigen-presenting cell), 예컨대, 동일한 개체로부터의 수지상 세포(dendritic cell), 단핵 식세포(mononuclear phagocyte) 및 B 세포에서보다 더 낮다는 것을 가리키는 상대적인 표현이다. 일 구현예에서, 상기 세포는 실질적으로 MHC Ⅱ를 발현하지 않는다. 특히, 인간 중간엽 기질세포의 경우에, 상기 세포가 인간 백혈구 항원 HLA-DP 및/또는 HLA-DQ 중 임의의 하나 이상을 발현하지 않는 것이 바람직하다. 선택적으로 또한 HLA-DR는 발현되지 않고; 대안적으로, HLA-DR이 낮은 수준에서 발현된다. 이러한 인간 백혈구 항원(HLA)의 발현의 부재 또는 낮은 수준에서 발현은, 예컨대 HLA가 불일치하는 개체들로부터의 세포들 및 심지어 면역 체계 세포들을 포함하는, 다른종들로부터의 세포들을 가지고 공생배양(co-culture)을 하도록 하면서, 본 발명의 상기 세포가 면역 특권(immunoprivilege)을 가지도록 야기한다. 이러한 인간 백혈구 항원들의 발현은, 예컨대 특이적 항체들로 표면 염색에 의해 또는 qRT PCR에 의해서 테스트될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 표면 마커 CD34 및/또는 CD45에 음성적이다. 이것은 상기 세포가 CD34 및/또는 CD45를 표시하지 않는 것을 의미한다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 생성한다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 또한 디노프로스톤(dinoprostone)으로 알려진, 프로스타글란딘 E2(PGE2)는 Wnt 신호전달경로(signaling pathway)의 활성제로 기술된, 자연적으로 발생하는 프로스타글란딘이다(Goessling et al., Cell, 2009, vol. 136, p. 1136-1147). 몇몇의 상업적인 제품들, 특히 ELISA 키트들은 PGE2 생성의 측정을 위해 이용가능하다. 상기 탐지는 세포 상청액 또는 세포 용해물, 또는 이들의 조합을 샘플으로 사용하여 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 하나 이상의 줄기세포 마커들을 발현한다. 그러한 줄기세포 마커들은 Oct-4 및 나노그(Nanog)로부터 선택되지만 이에 제한되지 않는 마커들을 통상적으로 포함할 수 있다.

세포 크기

본 명세서에서 기술된 다른 특징들 및 구현예들 외에도, 본 발명에 따른 상기 세포가 바람직하게 또한 상대적으로 작은 크기로 특징지어질 수 있다. 상기 크기는 예컨대, 세포 부피로, 세포 직경으로 또는 세포 표면적으로, 또는 상기 세포 부피, 상기 세포 직경, 또는 상기 세포 표면적에 대응하는 파라미터(parameter)로, 기술될 수 있다. 상기 크기는 또한 앞서 말한 것 중의 조합에 의해 기술될 수 있다. “상대적으로(relatively)”는 다른 세포들과 비교, 특히 다른 근원들로부터 중간엽 기질세포들 및/또는 다른 방법들에 의해 분리된 다른 것들과 비교하는 것을 의미한다. “다른 근원들(other source)”은 다른 해부학적 영역, 예컨대 다른 기관들, 예컨대 골수뿐만 아니라 상기 탯줄의 다른 섹션, 예컨대 상기 혈관 주위 부위, 및 임의의 혈관 주위 와튼 젤리로부터 오는 것을 의미한다.

임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 일부 구현예에서, 더 작은 세포들(예컨대, 더 작은 직경을 가진 세포들 및/또는 더 작은 표면적을 가진 세포들)은 세포 주기에 초기라고 믿어진다. MSC들의 세포 주기 상태의 측정을 위한 방법들은 공개되었고(예컨대, Achille et al., J. Cell. Biochem., 2011, vol. 112, p. 1817-1821) 본 발명의 상기 세포에, 예컨대 분석 목적을 위해 적용될 수 있다.

본 발명에 따라, 유세포측정에 의해 개개의 세포에 대해 측정된 전방 산란광(FSC) 수치는 세포 부피와 상관관계가 있다. 더 큰 세포들, 즉 특별하게 큰 세포 부피를 가진 것들은 높은 FSC 수치에 의해 특징지어지고, 그 반대의 경우도 같다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 상기 FSC 수치는 무차원수이다. 상기 FSC의 측정을 위해, 하나 이상의 세포들은 유세포측정에 의해 분석된다. 일반적으로, 유세포측정에 의해 측정된 FSC 수치들은 사용된 도구, 특히 레이저 특성 및 기계간 광전자증배기(photomultiplier)의 출력(power)에 의존한다. 결과적으로, 절대적인 FSC 수치는 없고, 상기 수치는 통상적으로 사용된 상기 기계 및 레이저에 의존한다. 따라서, 재현성을 확신시키기 위해, 다음의 세부사항들은, 조합하여 본 발명의 문맥상 우선한다.

본 발명에서, 상기 FSC 수치가 유세포측정에 의해 측정될 때, 여기 파장은 바람직하게 470 내지 500 nm의 범위에, 가장 바람직하게 488 nm이고 상기 전방 산란광(FSC)은 측정된다. 상기 세포 그 자체가 FSC의 측정을 위해 형광일 필요는 없다. 유세포측정에 의한 그러한 측정을 위해서, 상업적인 유세포측정 장치는 통상적으로 사용된다. 바람직한 구현예에서, 상기 FACSAria Ⅲ 유세포측정기(BD Biosciences)는 여기 파장 488 nm로 사용된다. 다음에 구체화된, 특정 수의 FSC 수치들은 바람직하게 모두 상기 조건들, 즉 상기 유세포측정기 및 상기 파장을 가리킨다. 바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 60 이하, 예컨대 59 이하, 예컨대 58 이하, 예컨대 57 이하, 예컨대 56 이하, 예컨대 55 이하, 예컨대 54 이하, 예컨대 53 이하, 예컨대 52 이하, 예컨대 51 이하, 또는 심지어 50 이하의 FSC 수치로 특징지어진다. 일부 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 32 내지 58, 예컨대 33 내지 57, 예컨대 34 내지 56, 예컨대 35 내지 55, 예컨대 36 내지 54, 예컨대 37 내지 53, 예컨대 38 내지 52, 예컨대 39 내지 51, 예컨대 40 내지 50, 예컨대 41 내지 49, 예컨대 42 내지 48, 예컨대 43 내지 47, 예컨대 44 내지 46의 FSC 수치에 의해 특징지어진다. 바람직한 구현예에서, 상기 FSC 수치는 약 45이다. 이러한 특정 수의 FSC 수치들은 위에서 기술된 조건들 하에서 상기 FACSAria Ⅲ 유세포측정기에 의한 측정을 가리킨다.

바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 PVWJ로부터 유래된 세포의 상기 FSC 수치보다 더 작은 FSC 수치에 의해 특징지어진다. 바람직하게, 본 발명의 상기 세포의 상기 FSC 수치는 PVWJ로부터 유래된 세포의 FSC 수치보다 상당히 작다. 참조 예컨대 실시예 4.

바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 PVWJ로부터 유래된 세포의 부피보다 더 작은 세포 부피를 가진다. 더 바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 PVWJ로부터 유래된 세포의 부피보다 상당히 더 작은 세포 부피를 갖는다. 상기 세포 부피는 유세포측정에 의한 상기 FSC 수치의 측정에 의해 간접적으로 측정될 수 있다(FSC 수치의 측정에 세부사항들을 위해, 위 참고). 그 때, 비교 목적으로, 알려진 크기의 비드는 동일한 조건들 하에서 선택적으로 유세포측정에 있게 된다; 이에 의해 누군가는 상기 세포에 대해 실험적으로 측정된 FSC 수치, 비드에 대해 실험적으로 측정된 FSC 수치, 및 상기 비드의 알려진 부피에 기초하여 세포의 부피를 측정할 수 있다. 사용된 상기 비드는 바람직하게 상기 MSC의 굴절률과 유사하거나 근본적으로 동일한 굴절률을 갖는다. 상업적인 소프트웨어는 실험적으로 측정된 FSC에 기초하여 상기 세포 부피의 계산을 위해 이용가능하다. 상기 세포 부피를 측정하기 위한 바람직한 도구들은 FACS ARIA Ⅲ 및 FACS DIVA(둘 모두 Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)이다. 데이터 분석은 일반적으로 FACS ARIA Ⅲ와 연관된 FACS DIVA 버전 6.0 소프트웨어로 행해진다. FACS DIVA 표준 구성은 사용된다. 다수의 샘플들 또는 세포들을 비교하기 위해서, FSC 수치에 기초하여, 동일한 도구로 그리고 FSC 광전자증배기에 대해 항상 동일한 세팅으로 항상 작업하는 것이 필수적이다.

상기 FSC 및 따라서 상기 세포 부피는 갓 분리된 세포들을 위해서 뿐만 아니라 배양되고 효소적으로 분리된 - 예컨대 트립신 처리된 세포들에 대해서 모두 측정될 수 있다. 그러나, 상기 FSC 및 상기 세포 부피는 비부착 세포들에 대해 바람직하게 측정된다. 유세포측정을 위해, 임의의 부착 세포는 통상적으로 효소적 처리, 더 구체적으로 트립신 처리에 의해 상기 세포 부피의 측정 전에 그것이 부착한, 배양 용기 표면으로부터 분리되어야 한다. 더 구체적으로, 상기 FSC는 비부착 세포들을 유세포측정에 있게 함으로써, 그리고 전방 산란광(FSC)의 측정에 의해서 통상적으로 측정된다. 상업적인 소프트웨어는 상기 실험적으로 측정된 FSC에 기초한 상기 세포 부피의 측정을 위해 이용가능하다. 본 발명에 따른 세포 부피 측정을 위해 바람직한 상업적인 소프트웨어는 BD FACS Diva 소프트웨어(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)이다.

비록 본 발명자들은 본 발명의 세포들이 상대적으로 동질적인 것을 보여줬음에도 불구하고, 모든 생물학적 제품과 마찬가지로, 또한 세포 부피에 관해서 통상적으로 일부 변화가 있다. 그러므로, 상기 세포 부피는 또한 평균 세포 부피로 기술될 수 있다. 다수의 세포들의 집단에서, 평균 세포 부피는 바람직하게 FSC의 실험적 측정을 위해 실시예 1 및 실시예 2A에서 기술된 바와 같이 얻어진 세포들의 세포 부피에 대응하는 세포 부피이다. 실시예 4는 어떻게 상기 세포들의 다수의 FSC가 유세포측정 및 전방 산란에 의해 측정되는지를 예시의 수단에 의해 기술한다. 상기 “평균 부피(average volume)”는 실험적으로 측정된 바와 같이 개개의 세포들의 부피의 산술 평균을 나타낸다. 통상적으로 “평균 부피”는 적어도 1,000 개개의 사건들, 예컨대 적어도 5,000 개개의 사건들, 예컨대 적어도 10,000 개개의 사건들, 일부 구현예들에서 100 내지 1,000,00000 개개의 사건들의 부피의 산술 평균을 나타낸다. 유세포측정에 의해 측정된 각 사건은 일반적으로 하나의 세포에 대응한다. 유세포측정에 의한 세포 부피 측정이 고처리량 방법이기 때문에, 상기 개개의 세포들의 그러한 수의 평균은 일반적으로 불합리한 시간 및 노력이 없이 측정될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 세포 부피는 그 자체로 측정되지 않지만, 상기 FSC 수치는 측정된다. 일반적으로, 제공되는 세포가 기준 세포의 FSC 수치보다 낮은 FSC 수치를 가질 때, 그 때 상기 제공되는 세포는 또한 기준 세포보다 작은 세포 부피를 가질 것이다; 따라서, 상기 FSC의 측정은 세포의 부피에 대해 간접적인 결론을 내리게 한다.

바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 3,500 μm² 이하의 표면적을 가진다. 바람직하게, 상기 세포는 3,000 μm² 이하의 표면적을 가진다. 바람직하게 상기 세포는 2,500 μm² 이하의 표면적을 가진다. 바람직하게 상기 세포는 2,100 μm² 이하의 표면적을 가진다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 2,000 μm² 이하의 표면적을 가진다. “표면적(surface area)”는 세포의 2차원적인 표면적을 가리킨다.

본 개시 내용의 문맥상, 상기 세포의 2차원적인 표면적은 상기 세포가 부착 배양에 있을 동안, 즉 상기 세포가 상기 배양 플레이트에 부착한 동안에 측정된다. 세포들이 낮은-컨플루언스 상태에 있는 것은 중요하다. 서브-컨플루언스는 서브 컨플루언트 세포들이 접촉 억제에 의해 서로를 실질적으로 억제하지 않는다고 믿어지기 때문에, 측정의 재현성을 위해 이점이 있다고 고려된다. 표면적의 측정을 위해, 하나 이상의 세포들이 상기 세포 또는 세포들이 부착한 배양 플레이트의 표면에 수직인(즉, 90 °) 치수로부터, 통상적으로 현미경을 가지고, 사진 찍히거나 그렇지 않으면 시각적으로 관측되거나 기록된다. 상기 영역의 상기 경계는 상기 세포의 그래픽 이미지(즉, 사진)에서 통상적으로 수동적으로 정의된다. 상기 그래픽 이미지를 취하기 전에 상기 플레이트의 교반(agitation)은 바람직하게 피해지거나 최소에서 유지된다. 표면적을 측정하기 위한 방법 및 소프트웨어는 특별히 제한되지 않고 각각의 소프트웨어는 몇몇의 상업적인 공급자, 예컨대 Carl Zeiss (Jena, Germany)로부터 이용가능하다. 도 6의 측정을 위해, Carl Zeiss(Jena, Germany)로부터 Axiovision LE 4.8는 사용되었다. 예를 들어서, 배양 접시에서 성장된 상기 세포들의 표면적을 측정하기 위한 방법들은 무엇보다도 Agley et al., 2012, J. Histochem. Cytochem., vol. 60, p. 428-438에 의해 기술된다.

비록 본 발명자들은 본 발명의 세포들이 상대적으로 동질적인 것을 보여줬음에도 불구하고, 모든 생물학적 제품과 마찬가지로, 또한 세포 표면적에 관해서 통상적으로 일부 변화가 있다. 따라서, 상기 세포 표면은 또한 평균 세포 표면적으로 기술될 수 있다. 그러한 경우에, 바람직하게 상기 세포는 3000 μm² 이하의 평균 표면적을 가진다. 바람직하게, 상기 세포는 2500 μm² 이하의 평균 표면적을 가진다. 바람직하게, 상기 세포는 2100 μm² 이하의 평균 표면적을 가진다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 2000 μm² 이하의 평균 표면적을 가진다. 다수의 세포들의 집단에서, 상기 평균 표면적은 바람직하게 본 명세서에서 제공되는 제약 내에 있다. 상기 "평균 면적(average area)"은 실험적으로 측정된 바와 같이, 개개의 세포들의 면적들의 산술 평균을 나타낸다. 통상적으로 "평균 면적"은 적어도 35 개의 개개의 세포들, 예컨대 적어도 50 개의 개개의 세포들, 예컨대 적어도 100 개의 개개의 세포들, 일부 구현예에서 35 내지 200 개의 개개의 세포들의 면적들의 산술 평균을 나타낸다.

도 6에 나타난 것처럼, 본 발명의 상기 세포는 바람직하게 골수로부터 유래된 MSC들보다 상당히 작은 표면적을 가진다. 일부 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 또한 혈관 주위 와튼 젤리(PVWJ)로부터 유래된 중간엽 기질세포, 예컨대 WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229에 기술된 것들의 표면적보다 작은 표면적을 가진다. 혈관 주위 와튼 젤리(PVWJ)로부터 유래된 중간엽 기질세포는 또한 "혈관 주위 부위로부터 유래된 중간엽 기질세포(perivascular zone-derived mesenchymal stromal cell)"로 일컬어질 수 있다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포들의 평균 부피 및/또는 표면적은 골수로부터 유래된 MSC들의 평균 부피 및/또는 표면적보다 작고(도 6), 상기 혈관 주위 영역으로부터 탯줄로부터 유래된 MSC들보다 더 작다(도 5B). 본 문헌에서, MSC들의 더 작은 세포 부피는 다양한 이유 때문에 이점이 있는 것으로 고려된다(참조 예컨대, Ge et al., Stem Cell Rev., 2014, vol. 10, p. 295-303). 본 발명을 통해, 그러한 이점이 있는 특성들을 가진 세포들이 이제 확실하게 이용가능하게 된다.

바람직하게, 본 발명의 상기 세포의 내부 복잡성은 PVWJ로부터 유래된 MSC의 내부 복잡성보다 더 낮다. 내부 복잡성은 통상적으로 측면 산란 분석(side scatter analysis, SSC)에 의해 측정된다. 일반적으로, 더 복잡한 내부 구조를 가진 세포들이 내부 구조 때문에 상기 측면 산란 분석에서 더 빛나거나/더 밝게 나타난다. 참조 예컨대 실시예 4A. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 낮은 내부 복잡성은 줄기세포능과 연관될 수 있다. SSC 수치에 기초된 다수의 샘플들을 비교하기 위해, 유세포측정에 의해 측정된 SSC 수치, 유사 및 SSC 수치들은 사용된 도구, 특히 레이저 특성 및 기계간 광전자증배기의 출력에 의존하기 때문에, 동일한 도구로 그리고 FSC 및 SSC 광전자증배기들에 대해 항상 동일한 세팅으로 항상 작업하는 것이 필수적이다. 본 발명에서 SSC 수치들의 측정을 위해 사용되는 상기 유세포측정 기계, 레이저 및 세팅 및 소프트웨어는 바람직하게 FSC 수치들의 측정을 위해 위에서 기술된 것들과 동일하다.

일 구현예에서, 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들은 PVWJ로부터 유래된 세포들보다 더 낮은 내부 복잡성(SSC에 의해 나타남)에 의해 특징지어진다.

바람직한 구현예에서, 상기 SWJ로부터 유래된 세포들은 PVWJ로부터 유래된 세포들 보다 더 작은 세포 부피(FSC에 의해 나타남) 및 더 낮은 내부 복잡성(SSC에 의해 나타남) 모두에 의해 특징지어진다. PVWJ로부터 유래된 세포들은 예컨대, 본 개시 내용의 비교 실시예에서 기술된 바와 같이 얻을 수 있다.

세포 생물학적 특성: 분화 잠재력, 노화 및 불멸성

일반적으로, 분화 잠재력, 노화 및 불멸성은 함께 “세포 생물학적 특성들(cell biological properties)”로 함께 일컬어질 수 있다. 말할 필요도 없이, 본 발명의 상기 세포는 이 기술 분야에 통상의 기술자에 의해 실험적으로 분석될 수 있는, 추가적인 세포 생물학적 특성들을 가진다. 그러한 추가적인 특성들이 분명히 본 명세서에서 명시되지 않았지만, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 상기 용어 “세포 생물학적 특성들”은 그러므로 생물학적 어세이에 의해 측정될 수 있는, 세포의 추가적인 특성들을 또한 포함하는 열린 용어이다.

본 발명에 따른 상기 세포는 중간엽 세포, 특히 중간엽 기질세포(MSC)이다. 달리 문맥상 지시하지 않는다면, 상기 MSC는 일반적으로 클론원성이다. 따라서, 심지어 본 발명의 단일 세포가 다수의 딸 세포를 생기게 할 수 있는 콜로니 형성 유닛(CFU)이다.

본 발명의 상기 세포는 또한 “기질 전구세포(stromal progenitor cell)”로 일컬어 질 수 있다. 일반적으로, 기질 전구세포는 통상적으로 표현형적으로 및 유전자형적으로 동일한 딸 세포들(자가 재생)뿐만 아니라 적어도 하나의 다른 최종 세포 타입을 생기게 할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 계통-분화되지 않는다.

따라서, 바람직하게, 상기 세포는 말단으로 분화되지 않는다. 일 구현예에서, 상기 세포는 중간엽 세포를 넘어, 추가적으로 분화되지 않는다. 바람직하게, 상기 세포는 다양한 세포 타입들로 분화할 수 있다. 일부 구현예들에서, 하나 이상의 이러한 다양한 세포 타입들로의 분화는 예컨대, 외부 자극 및/또는 특정 배양 조건들에 의해 유도될 수 있다.

바람직한 구현예에서, 상기 세포는 적어도 다능성이다. 다능성은 세포가 다수, 적어도 둘, 다른 세포 타입들로 분화할 수 있는 것을 보여줌으로써 테스트될 수 있다. 그러한 표시(showing)를 만들기에 적절한 어세이에 특정한 제한은 없다. 그러나, 상기 표시는 통상적으로 인 비트로에서 행해진다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 MSC는 인 비트로에서 다능성 분화 능력을 가진 세포이다. 분화의 다른 타입들에 대한 예시들은 실시예 12, 13 및 14에 제공된다. 뼈형성 분화 잠재력은 예컨대, 확립된 방법들이 대안적으로 사용될 수 있을지라도, 실시예 12에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 실시예 12에서 기술된 바와 같이, 뼈형성 분화 잠재력에 대한 어세이는 구체적으로 본 발명의 문맥에서 발전되었다. 뼈형성 잠재력에 대한 최신의 어세이와 비교되면, 이들의 많은 수가 골수로부터 유래된 MSC들을 가지고 발전되었고, 실시예 12의 상기 어세이는 상기 세포들의 상대적으로 느린 증식을 허용한다; 결과적으로, 이것은 상기 (탯줄로부터 유래된) 세포들이 일반적으로 뼈형성 어세이를 위한 전제조건(prerequisite)인, 상기 배양 용기에 부착하는 것을 허용한다.

상기 지방생성 분화 잠재력은 예컨대, 다른 확립된 방법들이 또한 사용될 수 있을지라도, 실시예 13에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. 상기 연골형성 분화 잠재력은 예컨대, 다른 확립된 방법들이 또한 사용될 수 있을지라도, 실시예 14에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다. “분화 잠재력(differentiation potential)”은 제공되는 세포가 특정 계통의 세포로 분화할 수 있다는 것을 의미한다.

바람직하게, 상기 세포는 뼈형성 계통의 세포로 분화할 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 연골형성 계통의 세포로 분화할 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 지방생성 계통의 세포로 분화할 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 상기 뼈형성 계통의 세포로 및 상기 연골형성 계통의 세포로 분화할 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 상기 뼈형성 계통의 세포로 및 상기 지방생성 계통의 세포로 분화할 수 있다. 바람직하게, 상기 세포는 상기 뼈형성 계통의 세포로 및 상기 지방생성 계통의 세포로 분화할 수 있다. 가장 바람직하게, 상기 세포는 상기 뼈형성 계통의 세포로 및 상기 연골형성 계통의 세포로 및 상기 지방생성 계통의 세포로 분화할 수 있다. 세포가 특정 계통의 세포로 분화할 수 있는 경우, 이것은 상기 세포가 적절한 조건에 있게 된다면, 그에 따라 상기 세포가 분화할 것을 의미할 의도이다. 예컨대, 상기 뼈형성 계통의 세포로의 분화를 위한 특별히 적절한 조건들은 실시예 12에서 제공된다. 대안적으로, 임의의 제공되는 세포(중간엽 기질세포)가 상기 뼈형성 계통의 세포로 분화할 수 있는지를 테스트하도록, 상기 키트가 상기 배양 용기에 상기 세포의 부착을 허용하는 한, 뼈형성 계통의 세포로의 중간엽 기질세포의 분화에 적절한 상업적 키트는 사용될 수 있다; 그러한 어세이를 위해 기술된 하나의 키트는 Lonza (Wakersville, MD, USA)의 hMSC Mesenchymal Stem Cell Osteogenic Differentiation BulletKit™ Kit이다. 예컨대, 상기 연골형성 계통의 세포로의 분화를 위한 적절한 조건들은 실시예 13에서 제공된다. 대안적으로, 연골형성 계통의 세포로의 중간엽 기질세포의 분화에 적절한, 상업적 키트는 임의의 제공되는 세포(중간엽 기질 세포)가 상기 연골형성 계통의 세포로 분화할 수 있는지를 테스트하기 위해 사용될 수 있다; 하나의 적절한 키트는 Lonza (Wakersville, MD, USA)의 hMSC Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Kit BulletKit™이다. 예컨대, 상기 연골형성 계통의 세포로의 분화를 위한 적절한, 조건들은 실시예 14에서 제공된다. 대안적으로, 상기 연골형성 계통의 세포로의 중간엽 기질세포의 분화에 적절한 상업적 키트는 임의의 제공되는 세포(중간엽 기질세포)가 연골형성 계통의 세포로 분화할 수 있는지를 테스트하기 위해 사용될 수 있다; 하나의 적절한 키트는 Lonza의 hMSC Mesenchymal Stem Cell Chondrogenic Differentiation Kit BulletKit™이다. 예컨대, 상기 지방생성 계통의 세포로의 분화를 위한 적절한 조건들은 실시예 13에서 제공된다. 대안적으로, 상기 지방생성 계통의 세포로의 중간엽 기질세포의 분화에 적절한 상업적 키트는 임의의 제공되는 세포(중간엽 기질세포)가 상기 지방생성 계통의 세포로 분화할 수 있는지를 테스트하기 위해 사용될 수 있다; 하나의 적절한 키트는 Lonza의 hMSC Mesenchymal Stem Cell Adipogenic Differentiation BulletKit™ Kit이다.

선택적으로, 상기 세포는 심지어 만능성이지만, 그것은 전능성이 아니다. 분화 잠재력은 세포를 특정 조건들에 있게 함으로써 측정될 수 있다. 전환분화(transdifferentiation)는 이 기술 분야에서 기술되었고, 따라서 그것은 임의의 제공되는 세포, 예컨대 MSC가 특정 외배엽의 세포 또는 내배엽의 세포로 분화할 수 있는지 테스트될 수 있다.

선택적으로 상기 세포는 추가적인 분화 잠재력을 가진다. 그러한 추가적인 분화 잠재력들은 중간엽 기질세포들에 통상적인, 상기 분화 잠재력으로부터 선택된다. 그러나, 중간엽 기질세포들에 대해 통상적인 바와 같이, 본 발명의 상기 세포는 통상적으로 전능성이 아니다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 중간엽 기질세포이다. 따라서, 그 구현예에서, 상기 중간엽 기질세포는 중간엽 줄기세포이다. 다시 말해서, 상기 세포는 줄기세포-유사 특성들을 가지는 것이 바람직하다. 줄기-세포 유사 특성들 및 이들의 마커들은 예컨대 Melton, in Chapter 2 of Lanza and Atala (eds.), Essentials of Stem Cell, Biology, 3^rd ed., Elsevier, 2014에 의해 기술된다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포는 텔로머라제 활성의 비정상적으로 높은 수준을 보여주지 않는다. “텔로머라제 활성(telomerase activity)”은 상기 텔로머라제 효소의 효소적 활성을 가리킨다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 텔로머라제는 DNA 가닥들에 텔로미어를 늘리는 효소이고, 이에 의해 그렇지 않으면 유사분열 후기(postmitotic)가 되고 세포사멸(apoptosis)를 겪을, 노화 세포들이 헤이플릭 한계를 넘고 일부 경우에 죽지 않게 되도록 한다. 그러나, 일부 대안적인 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 낮은 수준에서 텔로머라제 활성을 보여준다. 텔로머라제 활성은 통상적으로 효소적 활성의 측정에 의해 측정된다; 더 구체적으로 그것은 통상적으로 상기 효소 텔로머라제의 촉매하위단위(catalytic subunit)인, 텔로머라제 역 전사효소(reverse trascriptase)(TERT, 또는 인간에서 hTERT로 축약됨)의 효소적 활성의 측정에 의해 측정된다. 이들의 예시는 실시예 10에 제공된다. 텔로머라제 활성은 TeloTAGGG 텔로머라제 PCR ELISA PLUS 키트(Roche Diagnostics), 텔로머라제 활성의 정량적 측정을 위한 광도계 효소 면역 어세이(photometric enzyme immunoassay)에 의해 측정될 수 있다. 설명을 위해 예컨대 실시예 10 참조. 텔로머라제 활성은 상기 키트가 제조자의 지시에 따라 사용되고 분석된 세포들이 상기 TeloTAGGG 텔로머라제 PCR ELISA PLUS 키트(100%로 간주됨)에서 제공된 양성대조(positive control)에 관해서 텔로머라제 활성의 10 % 이하, 예컨대 바람직하게 5 % 이하를 보여준다면, 낮다고 말해진다. 상기 퍼센트, 즉 10 % 이하, 예컨대 바람직하게 5 % 이하는 즉, 상기 분석된 세포들이 상기 대조에 관해서 텔로머라제 활성의 10 % 이하, 예컨대 바람직하게 5 % 이하의 평균을 보여주는 것을 의미하는, 상기 세포들의 평균을 가리킨다. 텔로머라제 활성을 탐지하기 위한 몇몇의 대안적인 시약들 및 키트들은 상업적으로 이용가능하고 이러한 것들은 본 발명의 문맥에서 대안적으로 사용될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 상기 세포는 임의의 텔로머라제를 발현하지 않는다. 다시 말해서, 이 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포는 임의의 텔로머라제 활성을 보여주지 않는다. 더 정확하게, 그러한 세포는 탐지가능한 텔로머라제 발현의 부재에 의해 특징지어진다. 유전자 발현은 직접적으로 또는 발현 제품으로부터 전사된 상기 단백질을 탐지함으로써 간접적으로 탐지될 수 있다. 효소 활성의 수준, 단백질 수준 또는 유전자 발현 수준 각각에서, 임의의 탐지가능한 텔로머라제의 부재는, 또한 문헌(예컨대, US 2004/0136967 A1)에 기술된 다른 MSC들에 관해서, 본 발명의 상기 세포들을 구체적으로 추가적으로 특징짓기에 적절할 수 있다. “임의의 텔로머라제를 발현하지 않는다(does not express any telomerase)”는 텔로머라제 발현이 이 문서의 발효일(effective date)에 이용가능한 최신 방법, 예컨대 특히 qRT-PCR에 의해 상기 세포에서 탐지될 수 없다는 것을 의미한다. 통상적으로 이것은 TERT 활성(인간 세포들의 경우에 hTERT 활성)이 탐지될 수 없다는 것을 의미한다. 텔로머라제를 암호화하는 유전자의 발현의 탐지를 위해, 예컨대 hTERT 유전자에 대해 특이적인 PCR 프라이머들은 사용될 수 있다(Nekani et al., 2010, Stem Cell Res., vol. 3, p. 244-254).

세포들이 텔로머라제 발현 및/또는 텔로머라제 활성을 보이지 않을 경우, 그 때 그들은 배양에 영원히 유지될 수 없다; 그러한 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 불멸의 것이 아니다; 그럼에도 불구하고, 본 발명의 상기 세포는 적어도 12 계대들, 또는 집단 배가의 동등한 수에 대해서 실험적인 예시들에서 기술된 바와 같은 조건들 하에서 배양을 위해 적절하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 불멸의 것이 아니다. 예컨대, 실시예 10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포들에서 텔로머라제 활성은 상대적으로 낮다. 실시예 10의 상기 세포들은 따라서 불멸의 것이 아니라고 간주된다.

본 발명의 상기 세포는, 적절한 조건들에서 적절한 성장 배지에 존재할 때, 바람직하게 유사분열적으로 활성이 있다. 더 바람직하게, 상기 세포가 지수적인 성장 단계에 있고, 이것은 상기 세포는 적절한 조건들에서 적절한 성장 배지에 있을 때 적용된다. 말할 필요도 없이, 동결된 세포는 유사분열적으로 활성이 있지 않다; 그러나, 본 발명의 동결된 세포들이 해동되고 적절한 조건들에서 적절한 성장 배지에 놓일 때, 그들은 유사분열적으로 활성이 있게 되고 바람직하게 지수적인 성장 단계에서 성장한다. 예컨대, 일차 세포 은행(아래에서 상세하게 기술됨)의 동결된 세포들이 해동되고 적절한 조건들에서 적절한 성장 배지에 놓일 때, 그들은 유사분열적으로 활성이 있게 되고 다수의 딸 세포들을 생기게 하고, 결과적으로 이는 선택적으로 이차 세포 은행을 만들기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 세포는 상피 세포, 예컨대 양막 상피 세포가 아니다.

본 발명의 상기 세포는 내피 세포가 아니다.

본 발명의 상기 세포는 그것의 우수한 증식 특성에도 불구하고 암 세포는 아니다.

본 발명에 따라, 청구된 세포는 배아 세포가 아니다. 특히, 상기 청구된 세포는 배아 줄기세포가 아니다. 배아(인간 배아를 포함)의 손상 또는 파괴는 본 발명에서 예견되지 않고 본 발명의 기초가 되는 연구가 수행되었을 때 행해지지 않았다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 중간엽 기질세포는 실질적으로 혈액 또는 이들의 유도체, 특히 탯줄 혈액이 없다. 비록 일부 MSC가 조혈(hematopoiesis) 동안 신체적 및 기능적인 지지를 제공하는, 골수의 기질 골격(scaffold)의 구성일지라도, 본 발명의 상기 세포는 조혈 세포가 아니다. 특히, 본 발명의 상기 세포는 혈액 세포가 아니다. 더 구체적으로, 상기 세포는 조혈 줄기세포(hematopoietic stem cells, HSC), 또는 조혈 체계의 다능성 전구(multipotent progenitor, MPP) 세포, 또는 공통골수성전구체(common myeloid progenitor, CMP) 모두 아니다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 노화되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 낮은 노화에 의해 특징지어진다. 일반적으로 알려진 바와 같이, 효소 β-갈락토시다제(β-galactosidase)는 그것이 단당류(monosaccharide)로의 β-갈락토시드의 가수분해에 촉매작용을 미치는, 노화 세포들에서 특히 활성이 있다. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, β-갈락토시다제 활성이 구체적으로 노화 세포에 내인성(endogenous) 리소좀 베타-갈락토시다제에 기인하는 것으로 일반적으로 이해된다. 임의의 특정 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 그것의 활성은 노화를 위해 그 자체로 요구된다고 믿어지지 않는다. 그러나, β-갈락토시다제 활성은 인 시투(in situ) 및 인 비트로 모두에서 신뢰할 수 있는 방식에서 탐지하기 용이하다. 본 발명에서 상기 β-갈락토시다제 활성은 이 기술 분야에 일반적인 방법들에 의해 측정된다(참조, 예컨대. Lee et al., Aging Cell, vol. 5, p.187-195). "노화 세포(senescent cell)"에 대한 동의어는 "에이징 세포(aging cell)"이다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 계대 P11 이하까지, 더 바람직하게 계대 P10 이하까지, 더 바람직하게 계대 P9 이하까지, 더 바람직하게 계대 P8 이하까지, 더 바람직하게 계대 P7 이하까지, 더 바람직하게 계대 P6 이하까지, 더 바람직하게 계대 P5 이하까지, 그리고 더 바람직하게 계대 P4 이하까지 성장한 세포이다. 실시예 9에 나타난 바와 같이, 본 발명의 세포는 많은 계대들에 대해 우수한 증식 특성들을 가지고, 실시예 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 상기 세포들은 일반적으로 노화하지 않거나 많은 누적 집단 배가에 대해 단지 미미하게 노화한다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 분리 후, 적어도 16 누적 집단 배가 이상, 예컨대 적어도 18 누적 집단 배가, 적어도 20 누적 집단 배가에서 다능성이 유지된다. 일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 분리 후, 적어도 12 계대를 넘어 다능성이 유지된다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 분리 후, 적어도 16 누적 집단 배가를 넘어 분화되지 않은 상태로 남는다. 일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포는 분리 후, 적어도 12 계대를 넘어 분화되지 않은 상태로 남는다.

본 발명에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포

본 발명의 제2 태양에 따른 상기 세포는 또한 그것이 얻어질 수 있는 상기 방법에 의해 특징지어질 수 있다. 이것은 본 발명에 따른 상기 세포가 이전에 기술된 방법들(본 명세서에 실시예들 및 비교 실시예들 참조)에 따라 얻어지는 세포들과 다른 특성들을 가지기 때문에 가능하고 따라서, 본 발명에 따른 상기 세포를 얻기 위한 상기 방법은 세포가 고유한 특성들을 가지도록 만든다. 특히, 제2 태양에 따른 상기 세포는 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포로 특징지어질 수 있다.

또 다른 및 상호 배제적이지 않은 구현예에서, 제2 태양의 상기 세포는 본 발명의 제1 태양에 따른 방법에 의해 얻을 수 있다. 이 구현예에서, 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법은 설명 목적을 위해 단지 몇 가지 특징들을 지명하기 위해, 예컨대 탯줄의 기질 와튼 젤리로부터 기원, 및/또는 생존능력 및/또는 분리 및 증식 과정과 연관된 부피 및 표면적과 같은 특정 특징들을 세포에 부여함으로써, 상기 세포의 정의에 기여한다.

본 발명의 제1 태양의 바람직한 구현예는 달리 문맥상 지시하지 않는다면, 각각에서 그리고 모든 조합에서 본 발명의 제2 태양의 바람직한 태양들과 조합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법은 또한 일부 구현예에서, 상기 제조방법에 의해 직접적으로 얻어지는 생성물을 정의한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 세포는 따라서 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포로서 기술될 수 있다. 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법으로부터 야기된 제조방법에 의한 제품의 특징들은 일반적으로 본 발명의 제2 및 제3 태양에 따른 제품 특징들과 조합할 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 제2 태양의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포에 관한 것이다. 이와 관련하여, 제2 태양의 상기 방법은 이에 의해 얻어진 상기 세포를 정의하고 특징짓는다. 바람직하게, 상기 중간엽 기질세포는 본 명세서에서 기술된 바와 같이 분리, 및 선택적으로 그러나 바람직하게 증식에 의해 얻을 수 있다.

상기 중간엽 기질세포로부터 유래된 세포

추가적으로, 그들의 분화 잠재력 때문에, 본 발명의 상기 세포는 성숙한 세포들 또는 세포주(cell line)들을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 성숙한 세포는 줄기세포-유사 특성들을 가지지 않는 세포이다. 성숙한 세포로의 중간엽 기질세포의 분화는 특정 조건들, 예컨대 상기 배양 배지에 특정 외인성 성장 인자(exogenous growth factor)들의 첨가에 의해 유발될 수 있다, 설명을 위해 실시예 12, 13 및 14를 참조.

일 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 중간엽 세포로부터 유래된 세포에 관한 것이다. 일 구현예에서, 상기 유래된 세포는 단분화능성이거나 최종(terminally)에서 분화된다. 일 구현예에서, 상기 유래된 세포는 불멸의 것이 아니다. 유래된 세포들의 바람직한 타입들은 뼈형성 계통, 지방생성 계통 및 연골형성 계통의 세포들을 포함한다.

세포 집단

제3 태양에서, 본 발명은 세포들의 집단(세포 집단)에 관한 것이다. 상기 세포 집단은 본 발명의 제2 태양에 따른 적어도 하나의 세포를 포함한다.

일 구현예에서, 본 발명의 상기 세포 집단은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 상기 탯줄의 기질 와튼 젤리로부터의 세포들의 분리에 의해 직접적으로 얻을 수 있는 세포 집단이다. 그러나 훨씬 바람직하게, 본 발명의 상기 세포 집단은 본 명세서에서 기술된 바와 같이 상기 탯줄의 기질 와튼 젤리로부터 이전에 분리된 세포들의 엑스 비보 증식에 의해 얻을 수 있는 세포 집단이다.

다음에 기술될, 본 발명에 따른 상기 세포 집단의 일부 특징들 및 구현예들은 상기 세포 집단, 특히 상기 집단에 포함된 세포들의 물리적인 특성들과 관련이 있다. 단지 설명을 위해, 그리고 본 명세서의 다른 곳에서 개시된 세부사항들에도 불구하고, 물리적인 특징들은 물리적 방법으로 직접적으로 측정될 수 있는 그러한 특징들, 예컨대 상기 세포들의 유전자 발현, 부피 또는 표면적, 형태 등, 세포 집단 내에 임의의 이러한 것들의 비율 및 분포를 포함한다. 다음에 기술될 상기 세포 집단의 일부 특성들 및 구현예들은 세포 집단이 얻을 수 있거나 얻어지는 상기 방법과 관련된다. 단지 설명을 위해 그리고 본 명세서의 다른 곳에서 개시된 세부사항들에도 불구하고, 상기 세포 집단이 얻을 수 있거나 얻어지는 상기 방법과 연관된, 상기 세포 집단의 특징들은, (a) 상기 세포의 해부학적 기원, 특히 탯줄 및 이의 바람직한 섹션인 기질 와튼 젤리, (b) 상기 세포들을 분리시키기 위해 적용되는 조건들 및 (c) 상기 세포를 증식시키기 위해 적용되는 조건들을 포함할 수 있고, 이에 의해 세포 집단이 얻어진다.

본 발명의 상기 세포 집단은 다수의 세포를 포함한다. 따라서, 상기 세포 집단은 적어도 2개의 세포들을 포함하나, 일반적으로 두개 보다 현저히 많은 세포들이 포함될 것이다. 상기 세포 집단에 포함된 세포들의 수에 엄격한 상한이 없음에도 불구하고, 통상적인 구현예에서 자연적인 상한은 하나 이상의 탯줄이 시작 물질로 사용되지 않는다면, 완전한-스케일의 실행에서 얻을 수 있는 세포들의 총 수에 의해 나타난다. 인간 탯줄로 시작하고 단계 (c)를 포함하고 계대 P2까지 실행하는, 완전한-스케일 실행은 일반적으로 적어도 1 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 2 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 3 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 4 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 5 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 6 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 7 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 8 x 10⁹ 개의 세포들, 더 바람직하게 적어도 9 x 10⁹ 개의 세포들, 및 일부 구현예에서 적어도 10 x 10⁹ 개의 세포들을 산출한다. 더 많은 세포들은 나중 계대들에서 얻어질 수 있다.

상기 세포 집단은 APCDD1을 발현하는 적어도 하나의 세포를 포함한다. 이것은 일반적으로 상기 세포 집단의 샘플이 APCDD1의 발현에 양성인 것을 보여줌으로써 확인된다. 다시 말해서, 상기 세포 집단은 상기 APCDD1 유전자의 발현에 의해 특징지어진다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단에 상기 세포들의 대다수는 상기 APCDD1 유전자를 발현한다. 바람직하게, 상기 세포 집단에 포함된 상기 세포들의 적어도 80 %(세포 수에 대해), 바람직하게, 적어도 90 %(세포 수에 대해), 더 바람직하게, 적어도 95 %, 예컨대 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % (세포 수에 대해 각각)는 APCDD1을 발현한다.

선택적으로, 상기 세포는 적어도 하나의 추가적인 세포, 즉 본 발명의 상기 세포와 구별되는 하나 이상의 추가적인 세포, 특히 본 발명의 제2 태양에 따른 상기 세포를 포함한다. 특히, 이 구현예에서, 적어도 하나의 추가적인 세포는 본 발명의 제2 태양의 상기 세포와 필수적 또는 선택적(바람직함)으로, 적어도 하나의 특성에서 다르다. 그러나, 바람직하게 적어도 하나의 추가적인 세포는 본 발명의 상기 세포와 동계(syngenic), 더 바람직하게 자기유래가다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단의 모든 세포들은 MSC들이다. 이 구현예에 따른 세포들은 초기 계대(“P0”)를 넘어서 배양에 의해 통상적으로 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 탯줄로부터 원래 분리된 상기 세포들이 MSC들 뿐만 아니라 다른 세포들(예컨대, 적혈구)를 포함하는 반면에, 다른 세포들은 (a) 비부착 세포들이 P0의 끝에서 상기 성장 배지와 함께 제거되고, (b) 사용된 상기 성장 배지는 바람직하게 MSC들의 증식을 위해 특히 적절하며, (c) MSC들보다 열등한 증식 특성을 가진 세포들이 실질적으로 MSC만큼 잘 증식하지 않을 것이고, 따라서 누적 집단 배가의 몇몇의 경로를 거쳐, 상기 세포 집단은 MSC들에 풍부하게 되기 때문에, P0를 넘어서 실질적으로 존재하지 않는다.

또 다른 구현예에서, 상기 세포 집단은 MSC들 뿐만 아니라 비MSC들을 포함한다. 이 구현예에 따른 세포들은 통상적으로 분리 직후, 예컨대 초기 계대(“P0”) 전 또는 그 동안, 및/또는 적어도 하나의 본 발명의 세포를 적어도 하나의 다른 세포와 조합함으로써 얻을 수 있다.

바람직하게, 상기 세포 집단 내 모든 세포들은 동일한 종으로부터 기원한다. 더 바람직하게, 상기 세포 집단 내 모든 세포들은 인간 세포들이다. 바람직하게, 상기 세포 집단 내 모든 세포들은 서로에 관해서 동계이고; 더 바람직하게, 상기 세포 집단 내 포함된 모든 세포들은 서로에 관해 자기유래이다. 훨씬 더 바람직하게, 상기 세포 집단 내 모든 세포들은 동일한 개체로부터 기원한다. 그러한 세포 집단은 시작 물질로 하나의 단일 탯줄 또는 이의 부분을 사용함으로써 얻을 수 있다.

바람직하게, 상기 세포 집단은 상기 탯줄 이외의 조직들로부터 기원하는 MSC들을 포함하지 않는다. 더 바람직하게, 상기 세포 집단은 상기 기질 와튼 젤리 이외에 탯줄 섹션으로부터 기원한 MSC들의 탐지할 수 있는 양을 포함하지 않는다. 세포 집단은 내피 세포-특이적인 마커(예컨대 3G5) 및 상피 세포-특이적인 마커(예컨대, EpCAM)가 상기 세포 집단에서 탐지될 수 없을 때, 상기 특성들을 준수한다.

바람직하게, 상기 세포 집단은 다수의 세포를 포함하며, 이의 적어도 80 %(세포 수에 대해), 바람직하게 적어도 90 %(세포 수에 대해), 더 바람직하게 적어도 95 %(세포 수에 대해), 예컨대 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 %(세포 수에 대해 각각)는 제2 태양에 따른 세포들이다. 제2 태양의 모든 바람직한 구현예들은 또한 본 발명의 제3 태양에 적용된다. 세포들의 총 수의 바람직하게 적어도 70 %, 바람직하게 적어도 80 %, 더 바람직하게 적어도 90 %, 예컨대 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 99 % 또는 적어도 99 %, 가장 바람직하게 100 %는 제2 태양, 및 선택적으로 하나 이상의 이의 바람직한 구현예들, 단독으로 또는 조합에서 정의된 바와 같은 세포들이다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 필수적으로 제2 태양에 따른 세포들로 구성된다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 제2 태양에 따른 세포들만으로 구성된다.

바람직하게, 상기 집단은 세포들의 분리된 집단이다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 인간 또는 동물 몸체 외부에 위치한다. 분리된 세포 집단은 일반적으로 이의 생리학적, 인 비보 환경 외부의 세포 집단이다. 바람직하게, 상기 세포 집단은 엑스 비보 세포 집단이다. 특히, 상기 엑스 비보 세포 집단은 바람직하게 상기 탯줄 외부에 위치한다. 특히, 상기 엑스 비보 세포 집단은 바람직하게 혈관이 없다. 일 구현에에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 배양 용기에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 보관에 적절한 용기, 예컨대 바이알에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 약 35 ℃ 내지 39 ℃, 바람직하게 약 36 ℃ 내지 38 ℃, 예컨대 약 37 ℃의 온도에 있다. 하나의 상호 배제적이지 않은 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 배양 용기에, 또는 보관에 적절한 용기에 있다. 바람직하게, 상기 보관에 적절한 용기는 위의 온도 범위 내에서 상기 세포의 운반을 위해 적절하다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 냉동보존에 적절한 용기, 예컨대 냉동바이알, 바람직하게 -180 ℃ 이하의 온도에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 배양 용기에 있다. 일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 대사적으로 활성이 있고, 바람직하게 증식하는 세포 집단이다.

상기 세포 집단의 특성들의 일부는 물리적인 특성들에 의해 기술될 수 있다. 물리적인 특성들의 측정을 위해, 일반적으로 상기 세포 집단으로부터 샘플을 취하고, 상기 세포 집단의 상기 샘플들에 포함된 상기 세포들의 전부 또는 일부에 대한 물리적인 특성들을 측정하는 것은 가능하다. 본 발명에 따른 세포들의 집단들이 통상적으로 동질적이고/또는 이에 포함된 개개의 세포들이 서로 유사하거나 많이 비슷하다는 점에서 특징지어지기 때문에, 달리 문맥상 지시하지 않는다면, 그리고/또는 특정 세포 집단이 유전적으로 및/또는 표현형적으로, 서로 분명히 다른 세포들을 포함하는 것이 달리 명백하지 않다면, 특정 특성들, 예컨대 상기 샘플에 포함된 상기 세포들에서의 유전자 발현, 부피 또는 표면적, 형태 등의 발견은 대체로 그 집단에 남아있는 세포들에 또한 적용될 것이다. 이 문맥에서 동질성은 실질적으로 모든 세포들이 많이 비슷하거나 유사한 것을 의미한다.

상기 세포 집단은 바람직하게 모든 세포들이 필수적으로 균일한 물리적인 특징들에 의해 특징지어진다는 점에서 추가적으로 특징지어질 수 있다. “필수적으로 균일한(essentially uniform)”은 상기 세포들의 적어도 90 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 91 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 92 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 93 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 94 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 95 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 96 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 97 %, 예컨대 상기 세포들의 적어도 98 %, 및 바람직하게 상기 세포들의 적어도 91 %가 하나 이상의 바람직한 물리적인 특징들을 준수한다는 것을 의미한다. 위에서 기술된 바와 같이 유세포측정 동안에 전방 산란광(FSC)과 상호연관된, 상기 세포 부피는 본 발명에 따른 상기 세포 집단에서 필수적으로 균일한, 물리적인 특징인 것이 특히 바람직하다.

바람직하게 본 발명에 따른 상기 집단에 포함된 상기 세포들의 평균 부피는 PVWJ로부터 유래된 MSC들의 평균 부피보다 더 작다. PVWJ로부터 유래된 MSC들은 예컨대 본 명세서에서 비교 실시예에서 기술된 바와 같이 얻을 수 있다. 일단 상기 세포 부피가 개개의 세포들에 대해 측정되면, 상기 평균 세포 부피는 산술적으로 측정될 수 있다. 상기 세포 부피의 측정을 위한 방법들은 특별히 제한되지 않지만, 특히 개개의 세포에 대해 상세하게 위에서 기술된 바와 같은, FACS에 기초된 방법은 바람직하다.

상기 세포 집단은 상기 세포 집단 내 상기 세포들의 부피 및/또는 표면적이 유사하다는 점에서, 또는 대안적으로 상기 세포들의 높은 퍼센트는 작은 부피 및/또는 표면적을 가진다는 점에서 바람직하게 추가적으로 특징지어진다.

바람직하게, 본 발명의 상기 세포 집단은 60 이하의 평균 FSC 수치 또는 개개의 세포에 대해 위에서 기술된 바와 같이, 상기 범위 내의 바람직한 수치들에 의해 특징지어진다. 예컨대, 상기 세포 집단은 55 이하, 예컨대 50 이하의 평균 FSC 수치에 의해 특징지어 질 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 세포 집단 내에 세포들의 적어도 90 %는 45 +/- 10의 FSC 수치에 의해 특징지어진다. 더 구체적인 구현예에서, 상기 집단의 모든 세포들의 상기 FSC 수치는 45 +/- 10이다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포 집단 내에 세포들의 적어도 90 %의 평균 FSC 수치는 약 45이다. 더 바람직한 구현예에서, 상기 집단의 모든 세포들의 평균 FSC 수치는 약 45이다. 바람직하게, 본 발명의 상기 세포는 PVWJ로부터 유래된 세포의 상기 FSC 수치보다 더 작은 FSC 수치에 의해 특징지어진다.

바람직하게, 상기 세포 집단 내 상기 세포들의 평균 표면적은 3000 μm² 이하이다. 바람직하게 상기 세포는 2500 μm² 이하의 표면적을 가진다. 바람직하게 상기 세포는 2100 μm² 이하의 표면적을 가진다. 일부 구현에에서, 상기 세포는 2000 μm² 이하의 표면적을 가진다. 다수의 세포들의 집단에서, 상기 평균 표면적은 바람직하게 본 명세서에서 제공되는 제약 내에 있다. 일부 구현예에서, 상기 세포 집단 내 상기 세포들의 평균 표면적은 바람직하게 1000 내지 300 μm², 바람직하게 1100 내지 2700 μm², 바람직하게 1200 내지 2500 μm², 바람직하게 1300 내지 2200 μm², 바람직하게 1400 내지 2000 μm², 바람직하게 1500 내지 1900 μm², 더 바람직하게 1600 내지 1800 μm², 및 가장 바람직하게 약 1700 μm²이다.

바람직하게, 상기 세포 집단은 상기 세포들의 적어도 70 % (세포 수에 대해), 바람직하게 적어도 80 % (세포 수에 대해), 바람직하게 적어도 90 % (세포 수에 대해), 더 바람직하게 적어도 95 %, 예컨대 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % (세포 수에 대해 각각)가 생존가능하다는 점에서 추가적으로 특징지어진다. "생존가능한"은 사멸하지 않는 세포를 가리킨다. 따라서, 결과적으로, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 30 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 20 % 이하, 더 바람직하게 세포들의 총 수의 10 % 이하, 및 가장 바람직하게 세포들의 총 수의 5 % 이하의 비율에서 사멸 세포들을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 임의의 사멸 세포들을 포함하지 않는다. 사멸 세포를 위한 적절한 마커는 7AAD이다(예컨대 실시예 3 참조). 일 구현예에서, 생존능력은 상기 세포들의 분리 직후, 즉 증식 전에 측정된다. 생존능력의 높은 퍼센트는 이전에 기술된 MSC들의 집단보다 이점이 있는 것을 나타낸다.

바람직하게 상기 세포 집단은 상기 세포들의 적어도 60 % (세포 수에 대해), 상기 세포들의 적어도 70 % (세포 수에 대해), 바람직하게 적어도 80 % (세포 수에 대해), 바람직하게 적어도 90 % (세포 수에 대해), 더 바람직하게 적어도 95 %, 예컨대 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 98 %, 적어도 99 % (세포 수에 각각)는 다능성인 점에서 추가적으로 특징지어진다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 2 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 1 % 이하의 비율에서 비만세포들을 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 세포 집단은 비만세포들을 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 2 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 1 % 이하의 비율에서 섬유모세포를 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 세포 집단은 섬유모세포를 포함하지 않는다. 이 구현예에서, 상기 용어 "섬유모세포"는 이미 섬유모세포로 분화된 그러한 세포들을 가리키고, 다능적이거나 단지 섬유모세포로 분화할 능력을 가진 그러한 세포들을 제외하기 위해 좁게 이해될 것이다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 2 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 1 % 이하의 비율에서 조혈 계통의 세포들을 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 세포 집단은 조혈 계통의 세포들을 포함하지 않는다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포는 임의의 혈액 세포, 예컨대 탯줄 혈액으로부터 혈액 세포를 포함하지 않는다. 몇몇의 마커들은 혈액 세포들에 대해 상당히 확립되었고, 따라서 바람직한 구현예에 대한 준수성은 용이하게 테스트될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 2 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 1 % 이하의 비율에서 혈관 주위 세포들을 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 세포 집단은 임의의 혈관 주위 세포를 포함하지 않는다. 혈관 주위 세포들에 대한 마커는 3G5이다. 따라서, 이 구현예는 대안적으로 상기 세포 집단이 상기 마커 3G5를 발현하는 임의의 세포 및/또는 이의 표면에 3G5를 표시하는 임의의 세포를 포함하지 않는 것으로 기술될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 혈관 주위 세포들로 오염되지 않는다. 3G5의 발현은 또한 골수로부터 유래된 MSC들에 대해 기술되었다(Khan et al., J. Orthop. Res., 2010, vol. 28, p. 834-40). 따라서, 3G5의 비발현은 또한 골수로부터 유래된 MSC 집단들로부터 본 발명에 따른 세포 집단을 식별하기에 적절할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 혈관 주위 세포들로 오염되지 않는다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 골수로부터 유래된 MSC들을 포함하지 않는다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 2 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 1 % 이하의 비율에서 상피 세포들을 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 세포 집단은 임의의 상피 세포를 포함하지 않는다. 상피 세포들에 대한 마커는 상피세포부착분자(EpCAM)이다. 따라서, 이 구현예는 상기 세포 집단이 상기 마커 EpCAM를 발현하는 임의의 세포 및/또는 이의 표면에 EpCAM을 표시하는 임의의 세포를 포함하지 않는 것으로 대안적으로 기술될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 상피 세포들로 오염되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 2 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 1 % 이하의 비율에서 내피 세포들을 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 세포 집단은 임의의 내피 세포를 포함하지 않는다. 내피 세포들에 대한 마커는 CD31이다. 따라서, 이 구현예는 상기 세포 집단이 상기 마커 CD31을 발현하는 임의의 세포 및/또는 이의 표면에 CD31을 표시하는 임의의 세포를 포함하지 않는 것으로 대안적으로 기술될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 내피 세포들로 오염되지 않는다.

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 세포들의 총 수의 2 % 이하, 바람직하게 세포들의 총 수의 1 % 이하의 비율에서 적혈구를 포함한다. 가장 바람직하게, 상기 세포 집단은 임의의 적혈구를 포함하지 않는다. 적혈구에 대한 마커는 글로빈(globin) 및 BGP1이다. 따라서, 이 구현예는 상기 세포 집단이 BGP1 및/또는 글로빈을 발현하는 임의의 세포를 포함하지 않는 것으로 대안적으로 기술될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 적혈구로 오염되지 않는다.

바람직하게, 상기 세포 집단에 포함된 세포들의 10 % 이하는 텔로머라제 활성을 보여주고, 더 바람직하게 상기 세포 집단에 포함된 세포들의 5 % 이하는 텔로머라제 활성을 표시하고, 가장 바람직하게 상기 세포 집단에 포함된 세포들의 2.5 % 이하는 텔로머라제 활성을 보여준다. 텔로머라제 활성의 측정 및 이에 관련된 태양들은 위에서 기술되고 본 발명의 상기 제3 태양에 또한 적용된다. 각각의 세포 집단들은 이전에 기술된 다른 세포 집단들과 구별될 수 있다(예컨대, US 2004/0136967 A1).

일 구현예에서, 상기 세포 집단은 이에 포함된 세포, 또는 더 구체적으로 그리고 바람직하게 이에 포함된 MSC가 이의 표면에 MHC Ⅱ를 표시하지 않거나 MHC Ⅱ를 발현하지 않는다는 점에서 추가적으로 특징지어질 수 있다. 따라서, 바람직하게 상기 세포 집단의 어떤 MSC도 MHC Ⅱ를 발현하지 않는다. 일 구현예에서, MHC Ⅱ발현은 다른 MSC를 포함하는 세포 집단들과 본 발명에 따른 상기 세포 집단을 구별하기에 적절할 수 있다(예컨대, Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229 참조).

바람직하게, 상기 세포 집단은 본 발명의 제1 태양에 따른 방법에 의해 특히 단계 (c), 즉 증식 단계가 포함될 때, 얻을 수 있다. 따라서, 단계 (c)를 포함하는, 본 발명에 따른 상기 방법은 중간엽 기질세포의 집단을 산출할 수 있다. 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법으로부터 기인한, 제조방법에 의한 제품의 특징들은 일반적으로 본 발명의 제2 및 제3 태양에 따른 제품 특성들과 조합할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명에 따른 상기 세포 집단은 따라서 단계 (c)를 포함하는 본 발명의 제1 태양에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포 집단으로 기술될 수 있다.

바람직하게 본 발명에 따른 상기 기질 세포 집단은 근본적으로 오염제가 없다. 오염제가 근본적으로 없는 기질 세포 집단은 본 명세서에서 감염제, 예컨대 바이러스들(캡슐화 및 비캡슐화), 기생물들, 박테리아 및 내독소가 근본적으로 없는 세포 집단, 즉 배양에 기초된, 혈청학적 또는 분자적 확인 체계들을 가지고 또는 LAL 테스트(내 독소)를 가지고 탐지될 수 없는 양에서 그러한 감염제를 포함하는 세포 집단으로 정의된다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포 집단은 근본적으로 항생제가 없다. 근본적으로 항생제가 없는 세포 집단은 항생제의 부재에서 적어도 하나의 계대에 대해 상기 세포를 성장시킴으로써 얻을 수 있다. 예컨대, 비록 항생제들이 상기 세포들의 분리 후에("P0") 제1 계대에서 존재함에도 불구하고, 항생제들은 바람직하게 P0 후에 모든 계대들에 대해 바람직하게 불연속적이다; 다시 말해서, 예컨대 5 % hPL을 가진 성장 배지 MSCBM CD는 P1 및 모든 다음의 계대들에 대한 항생제의 첨가 없이 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 상기 엑스 비보 세포 집단은 동결된다. 동결된 세포들은 비록 보관하는 세포들에 대해 적절한 임의의 조건이 이 구현예에서 적절함에도 불구하고, 대체로 -180℃ 이하의 온도에서 보관에 안정적이다. 세포들은 동결, 바람직하게 액체 질소에서 스냅 동결될 수 있다. 동결보호제는 동결 전에 첨가될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 세포 집단은 액체 질소에 보관된다. 바람직한 구현예에서, 상기 동결된 세포 집단은 세포 은행이다. 이 구현예는 이제 추가적인 세부사항에서 기술될 것이다.

세포 은행

예컨대 실시예 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 상기 세포는 또한 개개의 탯줄들로부터 다른 분리에 대한 특정 표현형에 의해 확실하게 특징지어지고 몇몇의 누적 집단 배가를 따라 특정 표현형을 유지한다. 따라서, 본 발명에 따라 얻을 수 있는 또는 그렇지 않으면 본 발명에 속하는 세포들은 확실하게 특정 표현형을 가지고 많은 계대를 넘어 증식하는 동안 그 표현형을 유지한다. 따라서, 본 발명의 상기 세포들은 특히 세포 은행의 생성을 위해 적절하다.

실제로, 바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포 집단은 세포 은행이다. 따라서, 본 발명의 상기 세포 집단이 세포 은행의 형태에 있을 수 있다. 상기 세포 은행은 SWJ로부터 유래된 세포들을 포함한다. 달리 명시되지 않는다면, 상기 세포 은행에 포함된 상기 세포 집단은 일반적으로 위에 기술된 상기 세포 집단에 대응한다. 상기 세포 은행은 바람직하게 세포들의 총 수의 적어도 70 %, 바람직하게 적어도 80 %, 더 바람직하게 적어도 90 %, 예컨대 적어도 95 %, 적어도 96 %, 적어도 97 %, 적어도 99 %, 또는 적어도 99 %, 가장 바람직하게 100 %가 본 발명의 제2 태양, 및 선택적으로 하나 이상의 이의 바람직한 구현예들에, 단독으로 또는 조합에서 정의된 바와 같은 세포들인, 세포들의 다수를 포함한다.

본 발명의 상기 세포 은행은 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들을 증식하는 것을 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 대안적으로, 갓 분리된 세포들(비증식 세포들)의 세포 은행은 유지되고, 이로부터 증식된 세포들이 나중 단계에서 선택적으로 얻어질 수 있다. 그러나, 바람직하게, 상기 세포 은행은 증식된 세포들, 즉 단계 (c)를 포함하는 본 발명의 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 세포를 포함한다.

상기 세포 은행은 바람직하게 비부착 세포들을 포함한다. 그러한 세포 은행은 상기 세포 은행을 제조하기 전에 부착 세포의 효소적 분리, 예컨대 트립신 처리를 포함하는 방법에 의해 얻을 수 있다. 효소적 분리는 최신 기술에 따른 방법들에 의해 수행될 수 있다.

일 구현예에서, 세포 은행은 상기 세포들의 5 내지 30 회 누적 집단 배가(P0 동안에 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음), 예컨대 8 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안에 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 동안 성장한 후에 발생된다.

상기 세포 은행은 일부 또는 전부의 세포들이 바람직한 시점에, 예컨대 미래 시점에, 상기 세포 은행으로부터 회수 및/또는 사용될 수 있도록, 예컨대 추가적인 배양을 위해 유지될 수 있다.

세포 집단이 “유지될(maintained)” 때, 이것은 상기 세포 집단의 미래 배양을 방해하지 않는 임의의 조건에서 행해질 수 있다; 세포 집단들은 동결된 또는 비동결된 형태에서 유지될 수 있다; 그러나, 본 발명에 따른 상기 세포 은행을 위해, 동결 형태에서 유지가 바람직하다.

바람직하게, 본 발명에 따른 상기 세포 은행은 동결된 세포 은행이다. 동결된 세포들은 세포들을 보관하기 위해 적절한 임의의 조건이 이 구현예에서 적절할지라도, 대체로 -180 ℃이하의 온도에서 보관에 안정적이다. 세포들은 동결, 바람직하게 액체 질소에서 스냅 동결될 수 있다. 동결보호제는 동결 이전에 첨가될 수 있다. 상기 세포들은 -180 ℃이하의 온도에서 동결하는 것은 가장 통상적임에도 불구하고, 임의의 적절한 조건에 보관될 수 있다.

상기 세포 은행은 다수의 분리된 부분표본, 예컨대 다수의 개개의 바이알들에 포함된 세포들을 포함한다. 바람직하게, 각각의 바이알은 세포들의 현탁액을 포함한다. 중간엽 기질세포들을 현탁하기에 적절한, 임의의 액체, 특히 성장 배지, 및 바람직하게 본 발명에 대해 적절한 상기 성장 배지는 본 발명에 따른 상기 세포들을 재현탁하기에 적절하다. 바람직한 구현예에서, 상기 세포 은행은 중간엽 기질세포들을 배양하기 위한 기초 배지, 예컨대 MSCBM CD, 또는 이에 실질적으로 동등한 기초 배지를 포함하는 액체를 포함한다. 바람직하게, 상기 세포 은행의 상기 세포가 현탁되는 상기 액체는 추가적으로 혈소판 용해물, 예컨대 5 %(vol./vol.) 혈소판 용해물(PL), 및 인간 세포들의 경우에, 인간 혈소판 용해물(hPL)을 포함한다.

세포 은행들 또는 이의 부분 표본은 예컨대 제조 생물반응기에, 예컨대 하위 배양을 접종(inoculate)하기 위해, 미래 시점에 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 세포 은행의 통상적인 구현예는 일차 세포 은행(PCB) 및 이차 세포 은행(SCB)를 포함한다. 따라서, 본 발명의 상기 세포 은행은 바람직하게 일차 세포 은행(PCB) 및 이차 세포 은행(SCB)으로부터 선택된다.

가장 넓은 의미에서, 용어 "일차 세포 은행(Primary Cell Bank)"은 상기 탯줄로부터 상기 세포들의 분리 후에 제조되는, 제1 세포 은행, 더 바람직하게 제1 동결 세포 은행을 가리킨다.

일 구현예에서, 일차 세포 은행은 상기 세포들이 5 내지 14 회 누적 집단 배가(P0 동안에 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 동안 성장한 후에 발생된다.

일차 세포 은행(PCB)은 통상적으로 부분 표본의 형태에 있다. 부분 표본들은 각각 이전 계대(예컨대 P2) 및 효소적 분리, 예컨대 트립신 처리, 원심분리, 및 재현탁 후에 제조된다. 바람직하게, 상기 일차 세포 은행에 대한 상기 세포들은 100-300 개의 바이알들, 예컨대 150-200 개의 바이알들, 예컨대 160 내지 180 개의 바이알들, 또는 더 정확하게 165 내지 175 개의 바이알들에 분취된다.

바람직하게, 상기 일차 세포 은행의 각 바이알은 1 x 10⁶ 개의 세포들 내지 1 x 10⁷ 개의 세포들, 바람직하게 5 x 10⁶ 개의 세포들 내지 500 x 10⁶ 개의 세포들, 바람직하게 10 x 10⁶ 개의 세포들 내지 100 x 10⁶ 개의 세포들, 바람직하게 15 x 10⁶ 개의 세포들 내지 50 x 10⁶ 개의 세포들, 바람직하게 18 x 10⁶ 개의 세포들 내지 30 x 10⁶ 개의 세포들, 예컨대 약 20 x 10⁶ 개의 세포들을 포함한다.

바람직하게, 각 바이알에 포함된 부피는 1 내지 100 ml 사이, 예컨대 2 내지 20 ml 사이, 바람직하게 3 내지 10 ml 사이, 및 가장 바람직하게 약 4 ml이다.

일 설명적인 구현예에서, 완전한 스케일 실행 후에 얻어진 상기 일차 세포 은행은 각각이 20 x 10⁶ 개의 세포들을 포함하고, 및 각각은 상기 세포들을 포함하는 (동결된)액체 4ml를 포함하는, 150 내지 200 개의 바이알들로 구성된다.

상이한 사이즈 또는 함량의 바이알들 또는 용기들에 또는 세포들의 상이한 양 또는 농도로 이차 세포 은행으로 예정된 세포들의 현탁액을 채우는 것은 또한 가능하다. 그럼에도 불구하고, 상기 위의 양은 통상적으로 완전한 스케일의 실행에서 얻어질 수 있는 것을 나타내고, 상이한 사이즈 또는 함량의 바이알들 또는 용기들 또는 세포들의 상이한 양 또는 농도로의 변환은 계산될 수 있다.

가장 넓은 의미에서, 상기 용어 “이차 세포 은행(Secondary Cell Bank)”은 상기 탯줄로부터 상기 세포들의 분리 후에 제조되는, 이차 세포 은행, 더 바람직하게 이차 동결된 세포 은행; 다시 말해서, 상기 일차 세포 은행에 포함된 상기 세포들의 전부 또는 일부로부터 제조되는, 제1 세포 은행, 더 바람직하게 제1 동결된 세포 은행을 가리킨다.

일 구현예에서, 이차 세포 은행은 상기 세포들이 14 내지 25 회 누적 집단 배가(P0 동안에 누적 집단 배가를 카운팅하지 않음) 동안 성장한 후에 발생된다.

상기 일차 세포 은행이 일반적으로 추가적인 배양을 위해 동일 또는 다른 시점에 사용될, 세포들의 다수의 부분 표본을 포함하기 때문에, 하나의 일차 세포 은행과 동시에 또는 순차적으로 다수의 이차 세포 은행들을 발생시키는 것이 가능하다.

예컨대, 상기 일차 세포 은행에 포함된 각 바이알들로부터 하나의 이차 세포 은행을 발생시키는 것이 가능하다. 예컨대, 하나의 일차 세포 은행으로부터 시작하면서, 100 내지 300 개의 이차 세포 은행들, 예컨대 150 내지 200 개의 이차 세포 은행들, 예컨대 160 내지 180 개의 이차 세포 은행들, 또는 더 정확하게 165 내지 175 개의 이차 세포 은행들을 발생시키는 것이 가능하다.

이차 세포 은행(SCB)은 통상적으로 부분 표본의 형태에 있다. 부분 표본들은 각각 이전 계대(예컨대 P4) 및 효소적 분리, 예컨대 트립신 처리, 원심분리, 및 재현탁 후에 제조된다. 바람직하게, 이차 세포 은행에 대한 상기 세포들은 100 내지 300 개의 바이알들, 예컨대 150 내지 200 개의 바이알들, 예컨대 160 내지 180 개의 바이알들, 또는 더 정확하게 165 내지 175 개의 바이알들에 분취된다.

바람직하게, 이차 세포 은행의 각 바이알은 1 x 10⁶ 개의 세포들 내지 1 x 10⁷ 개의 세포들, 바람직하게 5 x 10⁶ 개의 세포들 내지 500 x 10⁶ 개의 세포들, 바람직하게 10 x 10⁶ 개의 세포들 내지 100 x 10⁶ 개의 세포들, 바람직하게 15 x 10⁶ 개의 세포들 내지 50 x 10⁶ 개의 세포들, 바람직하게 18 x 10⁶ 개의 세포들 내지 30 x 10⁶ 개의 세포들, 예컨대 약 20 x 10⁶ 개의 세포들을 포함한다.

바람직하게, 이차 세포 은행의 각 바이알에 포함된 부피는 1 내지 100 ml 사이, 예컨대 2 내지 20 ml 사이, 바람직하게 3 내지 10 ml 사이, 및 가장 바람직하게 약 4 ml이다.

상이한 사이즈 또는 함량의 바이알들 또는 용기들에 또는 세포들의 상이한 양 또는 농도로 이차 세포 은행으로 예정된 상기 세포 현탁액을 채우는 것은 또한 가능하다. 그럼에도 불구하고, 상기 위의 양은 통상적으로 완전한 스케일의 실행에서 얻어질 수 있는 것을 나타내고, 상이한 사이즈 또는 함량의 바이알들 또는 용기들 또는 세포들의 상이한 양 또는 농도로의 변환은 계산될 수 있다.

산업적 적용가능성

증식 특성들을 가진 포유류 세포들, 및 각각 세포 집단들은 비상업적 및 상업적인 활동들, 예컨대 연구 활동들에 가치 있다. 본 발명의 상기 세포들은 특히 그러한 목적들을 위해, 그 중에서도 상기 방법의 좋은 재현성, 무엇보다도 상기 세포들의 우수한 증식 특성들 및 높은 수율의 관점에서 매력적이다. 본 발명에 따른 세포 집단들은 예컨대 연구 또는 상업적 사용을 위한, 세포 제품을 제조하기에 적절할 수 있다. 예컨대, 일차 세포 은행 또는 이차 세포 은행을 제조하는 것 및 상업적으로 그러한 세포 은행, 또는 더 통상적으로 이의 개개의 부분 표본들을 상업적 연구 목적, 예컨대 인 비트로에서 세포에 기초된 어세이를 위해, 상업적으로 제공하는 것은 산업적으로 실행가능하다.

그것 이외에도, 하나 이상의 제조 단계의 실행을 위해 로봇을 포함하고, 기계들을 사용하는, 자동화된 방식에서 본 발명의 상기 방법의 전부 또는 일부를 실행하는 것은 가능하다. 따라서, 또한 본 발명의 상기 방법은 산업적 적용이 용이하다.

일부 구현예에서, 본 발명의 세포들은 예컨대, 연구 또는 제조 목적을 위해 인 비트로에서 배양 및 증식될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 상기 세포, 또는 이로부터 유래된 세포들은 약제학적 화합물 및 조성물의 활성의 효능 및/또는 세포독성(cytotoxicity) 및/또는 메커니즘(mechanism)을 검사하기 위해 그리고/또는 특정 질병의 메커니즘 및/또는 인 비트로에서 유전자 전달(gene transfer)에 대해 연구하기 위해 및/또는 생체분자(biomolecule), 예컨대 치료학적 활성 단백질을 포함하는 단백질들을 제조하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 세포들은 순수배양, 또는 일차 또는 이차의 다른 세포주와 공생배양으로 배양될 수 있다.

또한, 이들의 분화 잠재력 때문에, 상기 세포들은 성숙한 세포들 또는 세포주를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 성숙한 세포들로의 중간엽 기질세포들의 분화는 특정 조건들, 예컨대 배양 배지에 특정 외인성 성장 인자의 첨가에 의해 유발될 수 있다.

다음의 실시예들 및 도면들은 설명 목적을 위한 것이고, 청구항에 의해 정의되는, 본 발명을 제한할 의도가 아니다.

실시예

실시예 0: 본 발명의 다양한 태양들에 공통적인 물질들 및 방법들

모든 실험적인 실시예에서, 달리 지시되지 않는다면, MSCBM CD 또는 실질적으로 이에 동등한 기초 배지가 사용되었다. 모범적인 배지는 다음에 기술된다.

기초 배지 MSCBM CD 및 이를 포함하는 성장 배지

기초 배지 MSCBM CD는 Lonza (Wakersville, MD, USA; Cat. No. 95062-688)로부터 상업적으로 이용가능하다. 상기 제조자에 따르면, 그것은 혈청이 없고, 인간 중간엽 줄기세포들의 모든 타입들의 다수의 계대 증식을 위해 최적화되었고, 다수 계통의 분화를 지지하고 상기 세포들의 플레이팅을 위한 부착 매트릭스를 요구하지 않는다. MSCBM CD와 실질적으로 동등한 기초 배지는 또한 적절하다.

“MSCBM CD/GA”는 다음과 같이 제조된다.

- 500 ml MSCBM CD (Lonza)

- 0.5 ml GA1000 (Lonza; 상기 제조자에 따르면, GA1000은 30 mg/ml의 겐타마이신 및 15 μg/ml의 암포테리신을 포함)

“MSCBM CD/hPL” - 양 또는 비율을 나누는 것이 구체적으로 지시되지 않는다면, 둘 모두 MSCBM CD에 첨가되는, 5 % (vol./vol.)의 인간 혈소판 용해물(hPL), 및 2 U/ml의 헤파린(즉, 상기 항생제 겐타마이신 및 암포테리신 없이)을 포함한다. 상기 hPL은 3.8x10⁸의 혈소판/ml 내지 1.2 x10⁹의 혈소판/ml 사이, 평균적으로 약 7.9x10⁸의 혈소판/ml를 포함하는 조성물로부터 적절하게 제조된다; 그러한 혈소판 용해물은 예컨대 the Polyclinic Blood Bank in Modena, Italy 또는 임의의 다른 공급자로부터 얻을 수 있다.

“MSCBM CD/GA/hPL” - 양 또는 비율을 나누는 것이 구체적으로 지시되지 않는다면, 둘 모두 MSCBM CD/GA에 첨가되는, 5 % (vol./vol.)의 인간 혈소판 용해물(hPL), 및 2 U/ml의 헤파린(즉, 상기 항생제 겐타마이신 및 암포테리신을 포함)을 포함한다.

달리 명확하게 기재되지 않는다면, 성장 인자들(hPL 및/또는 기초 배지에 최종적으로 포함된 것들 이외)은 첨가되지 않는다.

위의 배지는 본 발명에 따른 상기 세포들을 증식시키기에 특히 적절하다.

세포 카운팅

세포 수의 측정을 위해, 달리 지시되지 않는다면, 세포들은 자동화된 세포 카운터, 예컨대 특히 NucleoCounter^®에 의해 카운팅된다. 필요하다면, 세포들은 세포 카운팅 이전에 효소적으로 분리, 예컨대 트립신 처리된다. 적혈구의 카운팅이 바람직하지 않다면, 그 때 상기 세포 카운팅은 상기 세포 집단이 암모늄 클로라이드(ammonium chloride) 처리된 후에 행해진다; 그러한 처리는 적혈구를 용해하는 것으로 알려졌다. 결과적으로, 적혈구를 제외한, 집단의 세포들의 총 수는 측정될 수 있다. 그 끝에서, 적혈구의 용해를 위해 추천되는 암모늄 클로라이드 용액은 다수의 제공자들로부터 상업적으로 이용가능하다(예컨대, STEMCELL Technologies). 그러한 용액은 제조자의 지시에 따라 첨가 및 사용될 수 있다.

실시예 1: 탯줄의 분절 및 분할, 및 민싱된 기질 와튼 젤리의 수득

만기 출생으로부터 인간 탯줄을 얻는다. 총 중량이 40 g 이상이라면 상기 탯줄을 받아들인다. 날카롭고 살균된 메스를 사용하여 약 2.5 cm 길이 세그먼트로 수직으로 자름으로써 상기 탯줄을 분절한다. 총 10분 동안 HEPES-완충 식염수 (HBSS) + 300 μg/ml 겐타마이신 및 0.15 μg/ml 암포테리신 B로 상기 탯줄 세그먼트를 헹군다. 조직에서 혈액을 씻어내기 위해 기계적 흔들림을 사용한다.

각각 그렇게 얻어진 세그먼트에 대해, 다음과 같이 상기 기질 와튼 젤리 섹션을 얻기 위해 진행한다: 상기 탯줄을 길이 방향으로 절개하고 통상적으로 3 mm의 바로 둘러싸는 매트릭스를 가진 혈관(혈관-혈관 주위 부위, 또한 혈관-혈관 주위 와튼 젤리 - PVWJ로 일컬어짐)을 제거하고 폐기한다. 상기 혈관의 개방 및/또는 혈관 또는 혈관 주위의 세포들의 상실은 피해져야 한다는 의미에서, 상기 제거는 주의를 가지고 수행되어야 한다. 상기 탯줄 매트릭스를 잡아 당기는 것은 피한다.

상기 매트릭스 조직을 수집하기 전에, PVWJ가 완전히 제거되었는지 확실히 하기 위해 조직의 세그먼트 각각을 광학적으로 다시 검사한다. 혈관들 또는 혈관의 조각들이 상기 세그먼트에 남아 있으면 안된다.

일단 상기 PVWJ가 상기 탯줄 세그먼트로부터 제거되면, 날카로운 가위를 사용하여 상기 탯줄 세그먼트로부터 매트릭스 조직의 부분을 자른다. 남아있는 매트릭스 조직을 얻기 위해 날카로운 메스로 탯줄 세그먼트의 표면 내부를 긁어낸다. 긁어내는 것 후에 남아있는 얇은 양막 상피 막(amniotic epithelial membrane)은 매우 주의하여 제거되고 폐기된다. 상기 탯줄 라이닝의 양막 아래(또는 중간엽) 층은 분리된 상기 WJ에 포함된다. 이것은 상기 양막 상피에서 조직을 주의하여 긁어내는 것에 의해 달성된다; 상기 조직을 수집할 때, 양막 상피 막의 부분들을 포함하지 않도록 주의하는 것은 중요하다. 그렇게 얻어진 조직은 순수 기질 와튼 젤리(SWJ)이다.

그렇게 얻어진(잘리고 긁어내어진) SWJ를 날카로운 가위들 및/또는 메스로 미세하게 민싱한다. 상기 민싱된 조직에 HEPES-완충 식염수(HBSS)를 첨가한다. 페트리 접시에 민싱된 조직을 풀링한다.

SWJ를 추출하기 위해, UC 혈액의 세포, 상피 또는 내피 세포들로부터 세포들 및 혈관 구조로부터의 세포들을 추출하는 것을 피하기 위해 추출 동안 주의는 집중된다. 대조 목적을 위해(특히 이 실시예를 처음으로 다시 작업할 때, 선택적이지만 추천할 만한), 내피 세포에 대한 마커는 CD31이다; 상피 세포에 대한 마커는 상피 세포 부착 분자(EpCAM)이다; 혈관 주위 세포들에 대한 마커는 3G5이다.

실시예 1의 단계들은 도 3에 나타난다.

실시예 1에 예시된 바와 같이 본 발명의 상기 방법은 상기 완전한 분할적인 제거 및 상기 탯줄의 WJ 아닌 구성의 제거를 통해 순수한 와튼 젤리를 산출하고(예컨대 탯줄 라이닝 막/양막, 혈관 및 혈액), UC 혈액의 세포, 상피 또는 내피 세포들 및 상기 혈관 구조로부터의 세포들을 추출하는 것을 피한다. 이것은 순수한 와튼 젤리 조직(WJ 조직)을 얻도록 한다. 이것의 기원 때문에, 구체적인 WJ 조직은 기질 WJ 조직이다.

실시예 2A: 효소적 처리

물질 및 방법: 실시예 1에 기술된 바와 같이 얻어진 WJ 조직은 WJ로부터 유래된 일차 세포들을 이로부터 다음과 같이 분리하기 위해 사용된다: 민싱된 조직/HBSS 혼합물은 250 ml의 원뿔형 튜브에서 1 mL의 소화 완충제(아래 표 참조)당 100 mg의 민싱된 조직/HBSS 혼합물의 비율에서 소화 완충제(표 참조)에 현탁된다. 상기 소화 완충제는 상기 분리된 조직들로부터 MSC들을 방출시키기에 적절한 효소를 포함한다.

표: 100 ml의 소화 완충제(모든 재료들은 살균됨)의 공식

- 1 ml hPL, 예컨대 the Polyclinic Blood Bank, Modena, Italy로부터 (3.8x10⁸ 혈소판/ml 내지 1.2 x10⁹ 혈소판/ml 사이, 평균적으로 약 7.9x10⁸ 혈소판/ml를 포함하는 조성물로부터 제조됨)

- 2 U/mL의 최종농도에 헤파린

- 1 ml의 소듐 피루베이트(100 mM 스톡(stock)으로부터)

- 36 μl 1M CaCl₂

- 0.18 W

nsch U/ml 소화 완충제의 최종 활성에 대한 콜라겐 분해효소 제제 NB4 또는 NB6 (모두 SERVA)

- 기초 배지(포유류 세포를 위한 상업적인 성장 배지, 예컨대 DMEM 또는 MSCBM CD) - ad 100 ml

SERVA로부터 콜라겐 분해효소 제제(NB4, NB6), 통상적으로 NB4가 사용되었다. 상기 제조자에 따르면, 콜라겐 분해효소 제제 NB4/NB6는 Clostridium histolyticum의 콜라겐 분해효소를 제조하는 균주(strain)로부터의 천연물이고, 비독성, 콜라겐 분해효소 및 다른 단백질 분해효소를 포함하는, 콜라겐 분해효소 제제이다. 상기 제조자에 따르면, NB4 표준 등급(17454.02 및 17454.01 (모두 SERVA))은 연구 목적을 위해 사용되는, 상이한 세포 타입들, 예컨대 연골세포, 근육세포, 상피세포, 피부 섬유모세포, 간세포(hepatocyte), 지방세포를 분리하기 위해 다양한 조직들의 분리를 위해 고안된다. 상기 제조자에 따르면, 콜라겐 분해효소 제제 NB4는 또한 절차 확립 목적을 위해 콜라겐 분해효소 제제 NB6의 대안으로 낮은 가격으로 사용될 수 있다. 상기 제조자에 따르면, 콜라겐 분해효소 제제 NB6 GMP 등급(NB6 GMP 등급, 17454.02 (SERVA))은 특히 일부 특정 이식 목적을 위한 세포들의 분리를 위해 고안된다. 본 개시 내용에 보고된 상기 실험들 내내, 달리 분명하게 명시되지 않는다면, NB4가 사용되었다. SERVA에 따르면, 이 실험에 사용된 상기 콜라겐 분해효소 제제의 제조자, SERVA는 W

nsch(본 명세서에서 동의어로 W

nsch 유닛으로 불림)에 따라 PZ 유닛(PZ-U)에서 콜라겐 분해효소 활성을 나타낸다.

헤파린은 클로깅을 피하기 위해 혈소판 용해물을 포함하는 액체 조성물에 적절한 첨가제라고 알려져있다(예컨대, Lohmann et al., 2012, PLoS ONE, vol. 7e37839).

더 높은 콜라겐 분해효소 활성을 가진 소화 완충제(최종 농도가 0.18 W

nsch U/ml 이상)는 또한 초기에 지방 조직의 효소적 소화를 위해 이전에 기술된 콜라겐 분해효소 활성에 기초하여 테스트되었지만, 더 높은 콜라겐 분해효소 활성의 존재에서 소화는 이점이 없었다(데이터는 미도시).

상기 민싱된 조직(실시예 1)은 살균된 튜브에 놓였다. 소화 완충제(위 참조)는 첨가되었다. 민싱된 조직 및 소화 완충제(소화물)를 포함하는 이러한 튜브들은 소화를 위해 회전 진탕기에서 75 rpm에 지속적인 온화한 교반으로 3시간의 소화 시간 간격 동안에 37±1 ℃에서 인큐베이팅되었다. “소화물(digest)”은 소화된 조직 및 소화 완충제의 총체를 가리킨다.

상기 소화 시간 간격의 끝에, 상기 소화물은 MSCBM CD의 2 부피를 첨가함으로써 희석되었고, 1 % (v/v)의 인간 혈소판 용해물(hPL)로 보충되며 소화되지 않은 조직/부분적으로 소화된 조직으로부터 분리시키기 위해 하나의 살균된 거즈 패드의 두 층을 통해 통과되었다. 상기 여과액은 “소화된 혼합물”로 불린다.

상기 소화된 혼합물은 250 ml 원심분리기 튜브를 사용하여 15분 동안 680 x g에서 원심분리된다. 원심분리의 끝에서, 상청액은 제거되고 펠렛(상기 탯줄의 상기 와튼 젤리로부터 갓 분리된 중간엽 기질세포를 포함)은 1-2 mL의 MSCBM CD/GA/hPL에서 재현탁된다(실시예 0 참조).

다음에, 총 세포 수는 측정된다. 가장 통상적으로, 상기 소화된 혼합물에 포함된 상기 세포들은 모두 MSC들은 아니다.

실시예 2B: 제1 배양(P0 및 선택적으로 P0+)

실시예 2A로부터 재현탁된 세포들은 상기 기질 와튼 젤리로부터 기원하는 상기 세포들의 제1 인 비트로 배양을 시작하기 위해 5 % hPL를 포함한 MSCBM CD/GA(실시예 0 참조; T-225 플라스크 당 50 mL 배지)에 T-225 배양 플라스크(Falcon^®, a brand of Corning, Corning, NY, USA)에 플레이팅된다. 이 세포 배양은 “P0”로 불린다. P0가 개시된 날은 “0일차(Day 0)”로 불리고, 그 후 일수는 올라가는 숫자들로 카운팅된다. P0의 시작에서 상기 세포 밀도는 8.000 세포/cm² 이상이다. 상기 cm²은 상기 세포가 P0에서 배양되는 동안 바닥에 있고 그리고 성장 배지에 의해 덮인 상기 플라스크의 표면을 가리킨다.

신선한 MSCBM CD/GA/hPL으로 5일차로부터 시작하여 3일마다 세포들에게 양분을 준다. 대안적으로, 플라스크 대신에 스택에서 P0 동안에 상기 세포들을 배양하는 것이 또한 가능할 수 있다: 그 경우에, 150 mL의 MSCBM CD/GA/hPL이 제1 세포 배양을 시작하기 위해 1x1 스택당 사용된다; 그러나, 달리 분명하게 언급되지 않는다면, 상기 P0 배양은 T-225 배양 플라스크에서 수행된다.

상기 세포들은 상기 세포들의 컨플루언스가 80 내지 90 %가 될 때까지 기술된 바와 같이 P0에서 배양된다. 이것은 대체로 5-12일차의 기간 후의 경우이다. 그 후, 상기 세포들은 트립신 처리된다. 세포들은 트립신화 처리 다음에 상기 계대의 끝에서 카운팅된다.

다음의 허용 기준은 평가된다: 1 수율, 2 생존능력, 3 컨플루언스, 4 형태. 허용 기준 1 및 2의 측정은 상기 세포들의 트립신 처리 후에 발생한다. 세부사항들은 다음과 같다.

이 실험적인 실시예에서, 모든 네가지 허용 기준은 충족되어야 한다. 게다가, 형태학적 조사에서, 상기 세포의 크기 및 형태가 상대적으로 균일한지 아닌지가 추가로 시각적으로 조사된다. 바람직하게, 이것이 그 경우이다.

임의의 하나 이상의 기준 2, 3 또는 4가 충족되지 않는 경우에, 전체의 세포 배양은 폐기된다. 기준 2, 3 및 4는 일반적으로 충족되고 그러므로 폐기가 필요하지 않다는 것이 본 발명자들의 관찰이다. 그러나, 충족되지 않는 경우에 폐기하는 가능성은 다음의 계대가 상기 허용 기준이 충족된 경우에만 수행된다는 것을 보장한다.

P0 후에 상기 총 세포 수가 8 백만 세포 이상인 경우에(또한 허용 기준 2, 3 및 4가 충족된다면) 직접적으로 실시예 2B로 진행한다.

P0 후에 상기 총 세포 수가 8 백만 세포 이상이 아닌 경우에(그러나 그 허용 기준 2, 3 및 4는 충족된다면), “P0+” 또는 “P0 플러스”로 불리는, 추가 하위배양 단계가 수행된다. (의심을 회피하기 위해, 이 문서 전체에서, 특정 세포들이 단계 “P0+”에서 하위배양되는 경우에 구체적으로 지시된다; 다시 말해서, 그러한 구체적인 지시가 제공되지 않는 곳에서, 세포들은 P0로부터 직접적으로 P1으로 전달된다(실시예 2B)). P0의 조건들은 재현탁된 세포들이 실시예 2A로부터 직접이 아닌, P0로부터 기원한 P0+에 있게 된 것을 제외하고, 위에서 기술된, 상기 P0의 조건들과 정확하게 대응된다.

상기 세포들은 상기 세포들의 컨플루언스가 80 내지 90 %가 될 때까지 P0+에서 배양된다. 그러고 나서, 상기 세포들은 트립신 처리된다. 상기 위 허용 기준은 평가된다: 1 수율, 2 생존능력, 3 컨플루언스, 4 형태. 모든 기준이 충족될 때, 실시예 2B로 진행한다. 상기 기준의 하나 이상이 충족되지 않을 때(수율을 포함), 상기 세포들을 폐기한다. 특히, 상기 세포들은 P0+ 다음에 총 세포 수가 적어도 8 백만 세포가 아니라면 폐기된다.

이 실시예에 총 세포 수는 시작 물질로 전체 인간 탯줄에 기초하여 지시된다(완전한 스케일 실행). 만약 시작 물질의 양이 다르다면(예컨대 오직 인간 탯줄의 절반), 그 때 허용 기준 1에 대한 상기 세포들의 총 수는 산술적으로 그에 따라 조정된다.

그 중에서도, 다른 완전한 스케일 실행 사이에서 어느 정도 변화하는 세포들의 수율에 따라, 그리고 또한 다른 개체들로부터의 생물학적 물질의 변화의 관점에서, P0 동안에 누적 집단 배가는 일부 변화에 있게 된다.

실시예 2C: 추가적인 증식(P1 및 다음의 계대)

실시예 2B에서 P0(또는 P0+, 그러나 그렇게 분명하게 기술된 경우에만)로부터 트립신 처리된 세포들은, 이에 기술된 바와 같이 하나 이상의 계대들에 대해, 다음과 같이 얻어졌고 하위 배양되었다.

제1 하위 배양은 “P1”으로 불린다. P1의 끝에서, 상기 세포들은 다시 트립신 처리되고 하위배양된다. 일부 경우에 12 회 계대까지 행해졌지만, 이 하위배양/트립신 처리 주기는 바람직하게는 4 회 계대들(“제1 계대”로 카운팅되는 P1)에 대해 행해진다. 각 계대는 연속적으로 숫자매겨진다. 즉 P0 뒤이어 P1, P1 뒤이어 P2, 및 기타 등. 달리 명시되지 않는다면, 상기 세포들은 계대 4(P4)까지 성장되고 하위배양된다.

P1 이후 각 계대에 대해, 모든 배양 플레이트들은 동일한 정의된 크기를 가진다. 특히, 각 계대에 대해, 상기 배양 용기는 CS5, CS10 또는 CS20 배양 플레이트(Corning, Corning, NY, USA)의 스택으로 구성된다. P1 이후 각 계대에 대해, 상기 세포들은 항생제 없이 5 % hPL을 포함한 MSCBM CD에서 성장된다(실시예 0 참조; T-225 플라스크 당 50 mL의 MSCBM CD/hPL). 달리 진술되지 않는다면, 항생제들은 P0 후 모든 계대들에 대해 이 실시예에서 중지된다; 다시 말해서, 이 실시예에서 MSCBM CD/hPL은 P1 및 모든 다음의 계대들에 대해 항생제들의 첨가 없이 사용된다.

각 계대의 시작에 상기 세포 밀도는 2.500 세포/cm²이다.

각 계대 세포들이 트립신 처리된 후에. 트립신 처리 후, 세포들은 각 계대의 끝에서 카운팅 된다.

접종의 시간에 상기 세포 밀도의 함수로서, 상기 세포 배양 용기의 바닥 표면(상기 계대의 초기에 총 세포 카운팅을 함께 정의함) 및 상기 계대의 끝에 총 세포 카운팅, 누적 집단 배가는 산술적으로 측정될 수 있다.

본 발명자들의 경험에서, 상기 누적 집단 배가는 P1 및 P2 동안(총 P1 플러스 P2, 그러나 P0를 포함하지 않음), 매우 일반적인 규칙으로, 일반적으로 9-13의 범위에 있다.

본 발명자들의 경험에서, 누적 집단 배가는 P3 및 P4 동안(총 P3 플러스 P4, 그러나 P0, P1 및 P2를 포함하지 않음), 매우 일반적인 규칙으로, 일반적으로 6-10의 범위에 있다. 결과적으로, 상기 누적 집단 배가는 P1, P2, P3 및 P4 동안(총 P1 플러스 P2 플러스 P3 플러스 P4, 그러나 P0를 포함하지 않음), 매우 일반적인 규칙으로, 일반적으로 15-23의 범위에 있다.

선택적으로, 본 명세서에서 구체적으로 지시되는 곳에서, 세포들은 특정 계대, 예컨대, P2 후에 동결되었다. 상기 세포들은 표준 절차에 따라 동결, 예컨대 액체 질소에서 스냅 동결될 수 있다. 그러한 동결된 세포들을 해동하는 것 및 예컨대 해동 후 그들을 추가적인 배양 계대에 있게 하는 것이 충분히 가능하다. 상기 동결은 전체 배치 또는 부분 표본 각각에서 발생할 수 있다. 부분 표본, 바람직하게 바이알들에서 동결은 달리 구체적으로 명시되지 않는다면, 이 실시예에서 훨씬 바람직하고 통상적으로 행해졌다.

세포들이 특정 계대 후에 동결되고 해동될 때, 해동 후 상기 계대의 숫자매기는 것이 지속된다. 예컨대, 상기 세포들이 P2 후에 동결될 때, 해동 후 다음 계대는 그 때 P3이다. 바람직하게, 및 달리 지시되지 않는다면, 또한 해동 후 누적 집단 배가의 카운팅은 지속된다.

바람직한 구현예에서, 세포들은 P2 후에 분취되고 동결된다. 그렇게 얻어진 동결된 부분 표본들은 바람직한 시점에 개별적으로 해동을 위해 이용가능하다. 상기 동결된, 바람직하게 부분 표본에 세포들은 일차 세포 은행(PCB)으로 일컬어 질 수 있다. 다시 말해서, PCB의 모든 부분 표본을 동일한 시점에 해동하는 것은 필수적이지 않고 통상적으로 바람직하지 않다. 대조적으로, 분취하는 것 및 상기 부분표본들의 개개의 동결은 개개의 부분 표본들이 개별적으로 및 개별적으로 바람직한 시점에 동결로부터 배제될 수 있고, 해동될 수 있고, 추가적인 배양(하위배양, 추가적인 증식)에 있게 될 수 있는 이점을 제공한다.

완전한 스케일 실행의 구체적인 실시예에서, 168 개의 바이알들(각 20 x 10⁶ 세포들, 4 ml 함량 포함)은 시작 물질로서 하나의 인간 탯줄로부터 시작하여, P2 후에 얻어졌다. 상기 바이알들의 각각은 동결될 수 있고 개개의 바이알들은 추가적인 하위 배양을 위해, 예컨대 P3 및 앞으로 개개의 시점들에서 해동될 수 있다. 완전한 스케일 실행의 하나의 구체적인 실시예에서, P2 후에 얻어지고 동결된 하나의 바이알은 해동되고 이에 포함된 상기 세포들은 P3 및 P4에 있게 된다. 그 구체적인 실시예에서, P4 후에, 168 개의 바이알들(각 20 x 10⁶ 개의 세포들, 4 ml 함량 포함)은 얻어졌다.

상기 세포들은 상기 세포들의 컨플루언스가 80 내지 90 %가 될 때까지, 기술된 바와 같이 각 계대에서 배양된다. 이것은 대체로 약 3-4일의 기간 후에 경우이다. 그 때, 다음의 허용 기준은 바람직하게 평가된다: 1 수율, 2 생존능력, 3 컨플루언스, 4 형태. 허용 기준 1 및 2의 측정은 상기 세포들의 트립신 처리 후에 발생한다. 세부사항들은 다음과 같다.

(*) P2 후에 상기 세포들은 일차 세포 은행(PCB)을 제조하기 위해 부분 표본에서 동결될 수 있다. P3 및 P4에 대한 세포 수는 P3가 20 x 10⁶의 세포들을 포함하는, 상기 PCB로부터 하나의 바이알을 가지고 개시된다는 시나리오에 기초하여 지시된다.

본 발명에 따른 증식에 의해 얻을 수 있는 상기 수율이 이전에 알려진 중간엽 기질세포를 제조 및 증식하기 위한 방법들과 비교되면 매우 높다는 것을 주목하는 것은 중요하다.

이 실시예에서, 모든 네가지 기준은 충족되어야 한다: 만약 상기 기준의 하나가 충족되지 않는다면, 각 계대로부터 모든 세포 배양은 폐기된다. 기준 1, 2, 3 및 4의 모두는 일반적으로 충족되고, 따라서 폐기는 필요하지 않다는 것이 본 발명자들의 관찰이다. 그러나, 충족되지 않는 경우에 폐기하는 가능성은 다음의 계대가 상기 허용 기준 모두가 충족된 경우에만, 수행된다는 것을 보장한다.

요악하면, 실시예 2는 상기 기질 와튼 젤리가 증식 능력이 있는 상태의 세포들을 포함한다는 것을 보여준다. 상기 기질 와튼 젤리는 배양에서 유지되고 증식되는 잠재적으로 다능성인 기질 세포들의 편리한 근원으로 확인되었다.

비교 실시예

비교 목적을 위해, 세포들은 WO 2004/072273 A 및 Sarugaser et al., 2005, Stem Cells, vol. 23, p. 220-229에 의해 기술된 바와 같이, 구체적으로 다음의 비교 실시예1, 2A, 2B 및 2C에 기술된 바와 같이 분리되었다.

비교 실시예 1

혈관들은 인간 탯줄로부터 분리된다. 상기 해부된 혈관들은 유체의 혈관 안으로 또는 밖으로의 유체의 통과를 막으며, 고리를 만들도록 봉합된다(suture).

비교 실시예 2A

상기 고리(비교 실시예 1)를 37 ℃에서 PBS(w/o Mg2+ 및 Ca2+)에 1 mg/mL의 콜라겐 분해효소 시그마 C-0130 용액을 포함하는 50 mL의 튜브에 즉시 넣었다. 본 문헌에 따라, 상기 콜라겐 분해효소 시그마 C-0130은 0.25-1.0의 고체 FALGPA 유닛/mg의 구체적인 활성을 가진다. 정보를 위해, 상기 각각의 유닛들이 다른 기질들과 다른 어세이들을 가리키기 때문에, FALGPA 유닛은 직접적으로 산술적으로 W

nsch 유닛으로 변환할 수 없다; 그러나, 어떻게 W

nsch 유닛이 FLGPA 유닛을 가리킬 수 있는지에 대해 이 기술 분야에 일부 일반적인 경험이 있다. 그 일반적인 경험에 기초하여, 비교 실시예 2에서 사용된 콜라겐 분해효소의 총 활성이 실시예 2에서 사용된 콜라겐 분해효소의 총 활성보다 훨씬 더 높다는 것으로 결론지어질 수 있다.

콜라겐 분해효소를 가지고 18-20 시간 인큐베이팅한 후에, 상기 소화 용액은 2 부피의 PBS 및 1 mL의 소 태아 혈청(FBS)을 첨가함으로써 멈춰졌다. 따라서, 비교 실시예 2에서의 콜라겐 분해효소 처리의 총 지속시간은 실시예 2에 사용된 콜라겐 분해효소 처리의 총 지속시간보다 훨씬 더 길다. 상기 소화된 샘플들은 소화되지 않은 조직을 제거하기 위해 여과되었고 15분 동안 1,800 rpm에서 원심분리되었다(Beckham Coulter Allegra™ 25R). 상기 세포들은 75 %의 α-MEM 배지, 15 %의 정의된 FBS, 10 %의 항생제에서 재현탁되었다. 상기 혈구를 용해하기 위해, 암모늄 클로라이드(NH4Cl), 포타슘 바이카보네이트(potassium bicarbonate, KHCO3) 및 EDTA의 용액은 온화한 교반에 의해 얼음에서 5-10분 동안 세포 현탁액과 1:3 v/v의 비율에서 사용되었다. 10분 동안 500 x g에서 원심분리한 후에, 상기 세포들은 재현탁되었고 Trypan Blue(0.4 %) 염료에 의해 카운팅 되었다.

비교 실시예 2B

비교 실시예 2A에서 기술된 바와 같이 얻어지는 상기 혈관 주위 와튼 젤리로부터 유래된 세포들(PVWJ)은 배양 “P0”를 시작하기 위해 6,000-8,000 세포/cm²의 밀도에서 시딩되었고 5 %의 CO2, 95 %의 습도 인큐베이터에서 15 %의 정의된 FBS(HyClone, GE Healthcare, USA, #SH30070.03) 및 항생제로 보충된, α-MEM(뉴클레오시드(nucleoside) 없이, Life Technologies, Waltham, MA, USA, #22561-021)에 37 ℃에서 인큐베이팅되었다.

상기 배지는 5-6일차 후에 처음으로 교환되었고, 그 후 2일마다 다시 리프레싱된다(refresh). 배양의 6-10일차 후에 상기 세포는 컨플루언스에 도달한다. P0의 끝에, 6-10 일차의 기간 후에, 상기 세포들은 컨플루언스에 도달한다. 그들은 그 후 트립신 처리된다. 총 세포 수는 Trypan Blue 염료(0.4 %)로 측정된다.

비교 실시예 2C

비교 실시예 1B로부터 얻어진 트립신 처리된 세포들은 다음과 같이 얻어지고 하위배양된다. 배양 계대 1("P1")로부터 앞으로, 상기 세포들은 15 % 정의된 FBS를 가진 α-MEM에서 3,500-4,000 세포/cm²의 밀도에서 시딩되었다. 항생제들은 P0 후에 중단되어야 한다; 다시 말해서, 성장 배지는 항생제의 첨가 없이 사용된다. 상기 세포들은 혈관 주위 와튼 젤리로부터 유래된 세포들("PVWJ")로 불린다. 혈관 주위 와튼 젤리(PVWJ)로부터 유래된 중간엽 기질세포는 또한 "혈관주위 부위로부터 유래된 중간엽 기질세포"로 일컬어질 수 있다. 달리 명시되지 않는다면, 상기 세포들은 계대 4(P4)까지 성장되고 하위배양되었다.

선택적으로, 그러나 구체적으로 지시되는 곳에서만, 세포들은 특정 계대, 예컨대 P2후에 동결되었다. 그러한 동결된 세포들을 해동(thaw, de-frost) 하는 것 및 해동 후 추가적인 배양 계대에 있게 하는 것은 충분히 가능하다.

실시예 3: 소화 후 세포들의 분석

실시예 2A에 기술된 바와 같이 얻어진 세포들(즉, 소화 단계 후에, 혈소판 용해물(PL)과 함께 또는 없이)은 기질 와튼 젤리로부터 유래된 세포들 또는 "SWJ"로 불린다. 이것들은 PVWJ로부터 유래된 대조 세포들("PVWJ", 비교 실시예 2A)과 비교된다. SWJ 및 PVWJ는 FACS 분석에 의해 세포사멸을 탐지하기 위해 7-아미노-악티노마이신-D(7-Amino-actinomycin-D, 7AAD) 염색(Via Probe; BD Biosciences; 제조자의 지시에 따라 사용됨)으로 염색되었다. 염색되지 않은 샘플은 샘플 자가 형광(auto-fluorescence)을 탐지하고 모든 고려된 채널들에 대해 광전자증배튜브(photomultiplying tubes, PMT; FACS 센서)를 세팅하기 위해 획득된다. 보상 세팅은 단일 색 염색된 튜브를 획득함으로써 확립되었다. 수집된 데이터는 Diva 소프트웨어(BD Biosciences)에 의해 분석되었다. t-테스트에 의한 통계. 결과들은 도 4A에 나타난다.

갓 분리된 샘플의 상기 FACS 분석은 NB4 콜라겐 분해효소 제제에 기초된 소화 프로토콜(혈소판 용해물(PL)과 함께 및 없이, 도 4A 참조)에 대해, 본 발명자들이 총 세포 집단의 97 %보다 더 큰 생존능력을 탐지하였다는 것을 밝혔다. 특히, PL 없이 NB4 콜라겐 분해효소 제제에 기초된 소화 후에(3 시간 소화) 그들은 1.5 %±1.3 %의 세포사멸 비율을 관측했고 1 %의 PL을 가지고 NB4 콜라겐 분해효소 제제에 기초된 소화 후에, 상기 사멸 세포들은 총 분리된 세포들의 1.45 % ± 0.3 %만이 있었다. 그러나, 비교 실시예 1에 따른 총 분리된 PVWJ의 30.6 % ± 9.6 %는 7AAD에 대해 양성이었다(도 4A, 우측에 더 높은 음영된 막대). 따라서, 3 시간동안 NB4 콜라겐 분해효소 제제(SERVA)로 처리된 샘플들이 비교 실시예 1에 기술된 바와 같이 분리된 상기 세포들보다 더 생존 가능하다는 것이 나타날 수 있다. 이것은 비교 실시예 1에 따른 상기 프로토콜이 본 발명에 따른 상기 프로토콜보다 상기 세포들에 대해 더 해롭다는 것을 암시한다; 즉 비교 실시예 1에 따른 상기 프로토콜이 더 많은 세포들의 분리를 야기하는 동안, 그들의 더 큰 부분이 사멸된다. 사멸세포는 증식에 적절하지 않다.

또한, 혈소판 용해물(유/무)의 사용을 비교하고, AAD7 양성 세포의 퍼센트 관련하여 중요한 차이를 목격하지 않음으로써(도 4A), 본 발명자들은 혈소판 용해물이 세포들을 방출하는 것과 그들의 생존능력에서, 콜라겐 분해효소 활성에 음성적으로 영향을 주지 않는다는 것을 보여줄 수 있다. 놀랍게도, 혈소판 용해물이 이전에 단백질 분해효소를 포함하는, 특정 효소들의 활성에 음성적으로 영향을 미치는 것으로 보고되었지만(Chesney et al., J. Clin. Invest., 1974, vol. 53, p. 1647-1654), 혈소판 용해물의 존재(일반적으로 혈장 포함)는 소화, 더 특별하게 상기 세포들의 수율에 음성적인 효과를 가지지 않는다.

실시예 4A: PVWJ로부터 유래된 세포들과 비교하여, 본 발명에 따라 분리된 SWJ로부터 유래된 세포들의 물리적 특성들의 분석

다음에, 본 발명자들은 본 발명에 따라 분리된 SWJ로부터 유래된 세포들(실시예 1 및 2A) 대 비교 실시예 1 및 비교 실시예 2A에 따른 상기 프로토콜로부터의 PVWJ로부터 유래된 세포들의 총 세포 수 및 물리적 특성들을 평가하는 것을 목표로 했다. 이 비교적인 연구는 갓 분리된 세포들 각각의 (FACS에 의한) 콜라겐 분해효소 효율 및 물리적 파라미터의 평가에 기초되었다.

처음, 갓 분리된 세포들의 총 수에 관해서, 본 발명자들은 그들이 실시예 1에 기술된 바와 같이 본 발명에 따른 상기 방법에 의해 SWJ로부터 유래된 세포들을 얻었던 것 보다 비교 실시예 1에 따른 상기 방법에 의해 더 많은 PVWJ로부터 유래된 세포들을 얻었다.

둘째로, 유세포측정, 즉 전방 산란광(FSC) 및 측면 산란광(SSC)에 의한 물리적 파라미터의 분석은 상기 SWJ로부터 유래된 세포들이 비교 실시예 1에 따른 상기 방법에 의해 분리된 상기 PVWJ로부터 유래된 세포들과 비교하면, 더 낮은 FSC 및 SSC를 가진다는 것을 밝혔다. 결과들은 다음 표에 지시되고 도 5A에 시각화된다.

표: 실험적으로 측정된 SSC 및 FSC

평균적으로, 상기 SWJ로부터 유래된 세포들은 PVWJ로부터 유래된 세포들보다 더 낮은 내부 복잡성(SSC에 의해 측정됨)과 함께 더 작은 세포 부피(FSC에 의해 측정됨)를 가진다. FSC에서 상기 차이는 통계적으로 중요하다. 특히 상기 SWJ로부터 유래된 세포들(본 발명에 따라, n=4)은 비교 실시예 1 및 2A(PVWJ, n=6)에 따른 상기 방법에 의해 분리된 PVWJ로부터 유래된 세포들과 비교하면 더 낮은 FSC 및 SSC를 가진다. 이 유세포측정 판독(readout)은 본 발명에 따른 상기 방법에 의해 분리된 SWJ로부터 유래된 세포들이 더 낮은 세포질(cytoplasmic) 복잡성을 가진 더 동질적인 작은 세포들에 의해 특징지어지는데 반해, 상기 PVWJ로부터 유래된 세포들은 더 큰 평균 부피 및 더 큰 세포질 복잡성을 가진 이질적인 집단에 의해 특징지어진다는 것을 나타낸다. 이 문맥에서 동질성은 실질적으로 모든 세포들이 많이 비슷하거나 유사한 것을 의미한다. 더 작은 부피 및 더 낮은 내부 복잡성은 둘 다 줄기세포능 및 성능을 나타내는 특성이다(참조 예컨대, Wagner et al., 2008, PLoS One, 2008, 3: e2213). 일반적으로, 더 복잡한 내부 구조를 가진 세포들이 그 내부 구조 때문에, 측면 산란 분석에서 더 빛나거나/더 밝게 나타난다.

실시예 4B: 갓 분리된 세포들의 형태학적 표현형: PVWJ 세포들은 본 발명에 따라 분리된 상기 세포들과 상이하다.

SWJ 세포들 및 PVWJ 세포들의 형태는 비교되었다. 높은 정도의 비교 가능성을 확실히 하기 위해, 하나의 단일 탯줄이 두 부분으로 나뉘어진다: 한 부분은 실시예 1, 2A 및 2B에 기술된 상기 방법으로 제공되었고, 다른 부분은 비교 실시예 1, 2A 및 2B에 따라 제공되었으나 두 경우 모두에서, 상기 세포들은 배양 계대 1(P1), (원래 배율 100X)에서 시딩 후 2 또는 3일차에 구체적으로 분석되었다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 순수한 기질 와튼 젤리(SWJ)로부터 유래된 세포들이 동질성이고, 작고 스핀들 모양인 반면에(도 5B, 좌측) 혈관 주위 와튼 젤리(PVWJ)로부터 유래된 세포들이 크고 돌출된 세포골격(cytoskeleton)을 가지는 것(도 5B, 우측)을 발견했다. 혈관 주위 와튼 젤리(PVWJ)로부터 유래된 중간엽 기질세포들은 또한 "혈관 주위 부위로부터 유래된 중간엽 기질세포"로 일컬어질 수 있다.

실시예 4C: 갓 분리된 세포들의 콜로니 형성: PVWJ 세포들은 본 발명에 따라 분리된 상기 세포들과 상이하다.

다음에, 본 발명에 따른 상기 세포들의 콜로니 형성 잠재력은 조사되었다. 이것은 다음과 같이 행해졌다: SWJ는 실시예 1 및 2A에 기술된 바와 같이 얻어졌고, PVWJ는 비교 실시예 1에 기술된 바와 같이 얻어졌다. 그 때, 살균된 펀넬(funnel, 깔때기)을 사용하여, 상기 세포를 포함하는 추출물은 소화되지 않은 조직을 제거하기 위해 하나의 살균된 거즈 패드의 두 층을 통해 여과된다. 250 ml 원심분리 튜브를 사용하여 15분 동안 680 x g에서 원심분리한다. 상청액을 폐기한다(붓거나 낮은 진공을 사용하여 흡입함). 1-2 mL의 MSCBM CD/GA/hPL에 상기 펠렛을 재현탁한다(참조 실시예 0). P0 배양을 시작하기 위해, MSCBM CD/GA/hPL 배지에서 3 x T225 플라스크들 또는 1x 1-스택에 상기 재현탁된 세포들을 플레이팅한다(참조 실시예 0; T-225 플라스크 당 50 mL 배지 또는 1x1 스택 당 150 mL). 시딩 후에 처음 5일 동안 상기 P0 배양을 움직이지 않는다. 5일차 후에 배지를 바꾼다. 이 이후에 MSCBM CD/GA/hPL로 3일 마다 양분을 제공한다. 12일차에 3 U/mL 트립신으로 P0 세포들을 수확하고 MSCBM + 1 % hPL로 중화시킨다. 결과들은 도 5C에 나타내었다. 이러한 발견들은 본 발명에 따른 상기 세포 분리 프로토콜이 초기 시딩(계대 0) 후에 더 많은 압축 콜로니들을 발생시킬 수 있는 더 많은 동질의 세포 집단을 발생시킨다는 것을 증명했다.

실시예 5: 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들 대 골수로부터 유래된 세포들(BM)의 비교

골수로부터 유래된 MSC(BM-MSC, Grisendi et al., Cytotherapy, 2010, vol., 12, p. 466-477에 의해 기술된 바와 같이 얻어짐)는 6,000 세포/cm²의 밀도에서 시딩되었다. 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된(실시예 1, 2A, 2B 및 2C), 구체적으로 계대 5(P5)까지 배양된, 세포들은 2,800 세포/cm²의 밀도에서 시딩되었다. 배양 2-3일 후에 그들은 서브 컨플루언트되었고 다섯개의 대표적인 이미지들은 두 세포 타입들 모두에 대해 획득되었다. 특히, 플라스틱에 부착한 MSC는 Axiocam camera가 장착된, 10x 대물렌즈를 사용하는, Axioskop-Observer-1 현미경(Zeiss)으로 시각화 되었다. 상기 이미지들은 상기 세포 면적을 평가하기 위해 AxioVision 4.8.2 소프트웨어에 의해 획득되었고 가공되었다(Moore et al., Exp. Eye Res. 2013, vol. 115, p. 178-188; Zeilbeck et al., PLoS One., 2014; vol. 9(4), e95546).

결과들은 도 6에 나타났다. 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들이 BM으로부터 추출된 MSC들보다 더 작은 평균 표면적을 가진다는 것이 발견되었다.

실시예 6: 갓 분리된 세포들의 세포 표면 마커들

물질 및 방법: 세 개의 탯줄에 두가지 상이한 방법들을 적용하였다(비교 실시예 1 및 2A에 따른 최신 기술, “PVWJ” 대 본 발명에 따른 세포들, 실시예 1 및 2A 참조, “SWJ”).

분리 직후, 상기 PVWJ/SWJ로부터 유래된 세포들은 카운팅되었고 형광 활성화 세포 분류(FACS) 분석 폴리프로필렌 튜브(200,000 세포/튜브)에서 1mL의 PBS 1X에 재현탁되었다. 상기 세포들은 얼음에서 20분 동안 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), 10 %의 소 태아 혈청(FBS), 0.1 M의 소듐 아자이드(sodium azide) 및 66.6 mg/mL의 인간 면역글로불린 G(immunoglobulin G)를 포함하는 100 μL의 블로킹 완충제에서 인큐베이팅된다. 다음에 그들은 1 ml의 1 x PBS에서 세척되었고 5분 동안 300 g에서 원심분리되었다.

샘플들은 다음에 0.5 %의 소 혈청 알부민(BSA; Sigma)을 가진 90 μL의 PBS에 일차 항체와 얼음에서 30분 동안 염색되었고 488 및 633-nm 파장에서 두가지 공냉식(air-cooled) 레이저가 장착된 FACSAria Ⅲ 유세포측정기(BD Biosciences)로 분석되었다. 간접적인 염색(안티-GD2만을 위함)을 위해, 이차 랫 안티 마우스 알로피코시아닌에 결합된 항체(secondary rat anti-mouse Allophycocyanin(APC)-conjugated antibody)(BD Pharmingen)는 사용되었다. 7-아미노 악티노마이신 D(7AAD) 염색(ViaProbe; BD Biosciences; 제조자의 지시에 따라 사용됨)은 세포사멸을 탐지하기 위해 유세포측정에 의해 평가되었다. 염색되지 않은 샘플은 샘플 자가 형광을 탐지하고 모든 고려된 채널들에 대해 PMT를 세팅하기 위해 획득되었다; 형광 크로스 토크(fluorescent cross talk)는 보정 조절에 의해 제어된다. 보정 세팅은 단일의 색으로 염색된 튜브들을 획득함으로써 확립되었다. 수집된 데이터는 Diva 소프트웨어(BD Biosciences)에 의해 분석되었다.

결과들: 갓 분리된 샘플들의 면역 표현형 분석은 양자 모든 분리 방법에 대해, 본 발명자들이 MSC들의 통상적인 표면 항원 발현인, CD105, CD73 및 CD90을 확인했다는 것을 밝혔다. 유사하게, 혈소판으로부터 유래된 성장 인자 수용체 β (CD140b)는 양자 모든 분리 방법들 후에 탐지되었다. 기질 와튼 젤리에서 상기 세포들의 기원에 따라, 본 발명에 따른 상기 방법이 혈관 주위의 세포들의 분리를 야기하지 않는다는 것을 지시하면서, HLA-DR은 양자 샘플들 모두에서 탐지되지 않았으나, PVWJ로부터 유래된 세포들은 3G5를 발현시키는 것으로 발견된 반면에, SWJ로부터 유래된 세포들은 그렇지 않다는 것이 발견되었다. 일부 표면 마커들의 상대적인 표시는 도 7A, 좌측 패널에 나타내었다. 도 7A, 우측 패널에, 세포들의 대다수에서 발현되고/발현되지 않는, 일부 표면 마커들이 표시된다.

상기 세포 표면 마커들은 또한 상기 세포들의 연장된 배양 후에 분석되었다. 두가지 독립된 분리로부터 기원하는, 그리고 다른 누적 집단 배가에서의 세포 배양들은 분석되었다. 다음은 발견되었다: 세포들의 상이한 분리 사이에 CD105, CD90 및 CD73(MSC의 양성 마커)의 표시에 중요한 차이가 없다. CD105, CD90 및 CD73은 또한 상이한 누적 집단 배가(cPD)에서 균일하게 높다. 대조적으로, CD45, CD14, CD34, CD19 및 HLA-DR(MSC의 음성 마커인 것으로 알려짐)은 두 분리 모두로부터 그리고 상이한 누적 집단 배가(다음 표 참조)에서 세포에서 매우 낮은 수준으로 발현된다.

표: 유세포측정에 의한 표현형 특징화(% 양성 세포들). cPD = 누적 집단 배가

이러한 데이터들은 본 발명에 따른 상기 방법에서 기질 WJ로부터 유래된 세포들을 증식시키는 조건들이 몇몇의 누적 집단 배가를 넘어 안정적인 표현형을 가지며 높은 수율에서 순수한 기질 WJ로부터 유래된 세포들의 집단들을 발생시킬 수 있다는 것을 보여준다. 그러므로, 본 발명의 상기 세포들은 세포 은행의 생성에 적절하다.

실시예 7: 증식된 세포들상의 세포 표면 마커

물질 및 방법: PVWJ로부터 유래된 세포들 및 SWJ로부터 유래된 세포들에 표면 항원들을 특징짓기 위해, FACS 어레이(array)는 상이한 방법들에 따라 동일한 탯줄로부터 제조된, 세포 은행에 포함된 세포들로부터 수행된다(실시예 1 및 2A, 2B 및 2C 대 비교 실시예 1 및 2A, 2B 및 2C). FACS 분석을 수행하기 위해 상기 세포들은 P2(실시예 2C/비교 실시예 2C)에서 해동되었고 P4(실시예 2C/비교 실시예 2C)까지 증식되었다. 단백질 분해 및 콜라겐 분해 효소(Accutase, Thermo Fisher)의 세포 분리 용액으로 분리 후에 상기 세포들은 10분 동안 500 x g에서 원심분리되었다. 상기 펠렛은 배양 배지(SWJ를 위한 MSCBM CD/hPL 또는 PVWJ를 위한 15 %의 정의된 FBS를 가진 α-MEM)에 재현탁되었고 Trypan Blue 0.4 %의 염료에 의해 카운팅되었다. 상기 세포들은 1X PBS에서 세척되었고 5분 동안 300 X g에서 원심분리되었다. 상기 세포들은 BD Pharmingen Stain Buffer + EDTA에서 재현탁되었고 250,000 세포/웰(well)은 96-웰 플레이트에 플레이팅 되었다. 상기 유세포측정 검사는 제조자의 지시에 따라 Human Cell Surface Marker Panel 데이터 시트(BD Lyoplate™, BD Biosciences)에 따라 수행되었다. 결과는 도 7B에 나타난다.

본 발명에 따른 갓 분리된 세포들(실시예 1, 2A)이 CD46, CD55 및 CD59를 발현하는지는 구체적으로 테스트되었다. 도 7B에 나타난 바와 같이, VPWL 세포들 및 SWJ 세포들 모두 이러한 표면 보체 조절인자(complement regulators)를 발현한다. 이것은 예컨대, 골수로부터 유래된 MSC들이 상기 세포 표면 보체 조절인자를 발현하고 CD46, CD55 및 CD59를 상향 조절하도록 설계된 MSC는 인 비트로 및 인 비보에서 보체가 매개된 세포 용해로부터 그들 스스로를 보호하는 것으로 믿어진다는 것을 보여준, Ignatius et al., J. Cell. Biochem., 2011, vol. 112, p. 2594-2605 및 Schraufstatter et al., World J. Stem Cells, 2015, vol. 7, p. 1090-1108에 의한 초기 기술과 비슷하다. 도 7B는 본 발명의 세포들이 이 특정한 발현 표현형을 공유한다는 것을 확인한다.

실시예 8: 정량적 역 전사효소 PCR(qRT-PCR)에 의해 측정된 바와 같이 본 발명에 따른 세포들의 유전자 발현

물질 및 방법: 본 발명에 따라, 특히 계대 4 후에 얻어진, 세포들(실시예 2C)은 이 분석을 위해 사용되었다. 총 세포의 RNA는 제조자의 지시에 따라 TRIzol(Life Technologies)을 가진 단일 단계 방법을 사용하여 분리된다. 제1 가닥의 상보적인 cDNA는 제조자의 지시에 따라 revertAid H minus 제1 가닥 cDNA 합성 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 1 μg의 총 RNA로부터 합성되었다. 상기 단일 가닥 cDNA는 Real-Time PCR 웰 각각에서 10 ng의 cDNA를 사용하기 위해 분광 광도계(spectrophotometer)(Beckman Coulter DU® 730)에 의해 정량화되었다.

정량적 리얼타임 PCR 기술은 Applied Biosystems StepOne™ Real-Time PCR System 및 Fast SYBR® Green Master Mix reagent에 의해 수행된다. 각 타겟 유전자 및 기준 유전자에 대한 유전자 발현의 정량화는 분리된 튜브들에서 수행되었다. 포워드 및 리버스 프라이머는 그들이 유전체 DNA 보다는 mRNA에 대해 특이적인 인트론 서열을 확장하는 것이 확실하도록, IDT PrimerQuest®(온라인 http://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index에서 이용가능함)를 사용하여 고안되었다. 타겟 유전자의 상대적인 발현 수준은 내인성 기준 ß-액틴 유전자의 발현 수준에 대해 표준화되었다.

결과들은 도 8에 나타난다. 도 8은 예컨대 APCDD1, PPARG 및 FLVCR2가 SWJ로부터 유래된 세포들에서 발현된다는 것을 보여준다. 발현은 본 발명에 따라 제조된 상이한 SWJ로부터 유래된 세포 집단들 사이에 지속된다. 이 공유된 발현 패턴은 유전자 발현의 관점으로부터 본 발명의 상기 세포들의 지속성을 나타낸다.

그러나, 현저하게 이러한 유전자들의 발현 패턴은 최신 기술에 따라 분리된 PVWJ로부터 유래된 세포들과 현저하게 다르다. 특히, APCDD1은 PVWJ로부터 유래된 세포들 모두에서 발현되지 않는다. 이것은 APCDD1 유전자의 증폭(amplification)이 PVWJ로부터 유래된 세포들로부터의 샘플들에서 전혀 관측되지 않았다는 발견으로부터 결론내려졌다. 본 발명자들은 RealTime-PCR에 의해 APCDD1의 발현이 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들에서만 탐지될 수 있고, PVWJ로부터 유래된 세포들에서는 탐지될 수 없다는 것으로 결론내렸다. APCDD1의 발현은 따라서, PVWJ로부터 유래된 세포들과 본 발명의 세포들을 분명하게 구별한다.

초기 문헌은 비혈관 주위 MSC들이 혈관 주위 MSC들과 구별되는지 불확실했던 반면에(예컨대, Davies et al., Stem Cells Translational Medicine, 2017, vol. 6, p. 1620-1630), 이 실시예는 이제 본 발명에 따라 얻어진 기질 와튼 젤리로부터 유래된 세포들이 혈관 주위 MSC들과 구별된다는 증거를 제공한다.

실시예 9: 본 발명에 따른 상기 세포 대 기준 세포들의 증식 잠재력

물질 및 방법: 세포 배양: P1 후 실시예 1, 2A, 2B 및 2C에서 기술된 바와 같이 얻어진, 본 발명에 따른 기질 와튼 젤리로부터 유래된 세포들(SWJ), 또는 비교 실시예 1, 2A, 2B 및 2C에 따라 얻어진, 혈관 주위의 와튼 젤리로부터 유래된 세포들(PVWJ), 동일한 탯줄로부터 얻어진 두 세포 집단들은 모두, 성장 인자 없는 5 % hPL를 포함한 MSCBM CD에 시딩되었고(참조 실시예 0), 95 % 습도를 가진 37 ℃, 5 %의 CO2 인큐베이터에 놓였다. 플레이팅 후 3일차 및 이 이후에 3일 마다, 배양은 다시 영양분이 제공되었다. 4 또는 5일차의 각각 계대에서, 세포들은 트립신 처리되고 카운팅된다.

세포 타운팅: 상기 세포들은 Burker 챔버에서 0.4 %의 Trypan blue 염료를 사용하여 카운팅되었고 상기 누적 집단 배가(CPD)는 위에 기술된 바와 같이 계산되었다.

결과들은 도 9에 나타난다. 계대 당 집단 배가(PD)의 더 큰 수는 PVWJ로부터 유래된 세포들에서보다 SWJ로부터 유래된 세포들에서 관찰되었다(도 9A). 따라서, 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들에서의 상기 PD는 PVWJ로부터 유래된 세포들보다 더 빠르다. 집단 배가에서 통계적으로 유의미한 증가는 PVWJ로부터 유래된 세포들과 비교되는, 계대 2, 3, 및 4에 SWJ로부터 유래된 세포들에서 측정되었다(t 테스트에 의해).

SWJ로부터 유래된 세포들은 사용된 배양 조건들(5 % hPL을 포함한 성장 배지 MSCBM CD)에서 적어도 9 계대들에 대해 유지되는, 높은 증식 잠재력을 가진다. 이러한 배양 조건들 하에서, SWJ로부터 유래된 세포들의 두가지 독립적인 분리주를 가지고 실험적으로 측정된 바와 같이, 상기 SWJ로부터 유래된 세포들은 다음 표에 나타난 바와 같이, 계대 10 내지 계대 12 사이에 노화에 도달할 것이다.

표: 본 발명에 따른 SWJ의 성장

이 실시예는 본 발명에 따른 기질 와튼 젤리로부터 유래된 세포들(SWJ로부터 유래된 세포들)을 분리 및 증식시키는 조건들이 SWJ로부터 유래된 세포들의 큰 세포 집단을 생성하도록 한다는 추가적인 증거를 추가한다. 이 실시예는 또한 SWJ로부터 유래된 세포들이 PVWJ로부터 유래된 것과 다르고 더 높은 증식 잠재력을 가진다는 증거를 추가한다.

상기 높은 증식 잠재력 및 계대 당 집단 배가(PD)는 기준 MSC들, 예컨대 PVWJ로부터 유래된 세포들과 비교되면, 각각 세포 은행의 수율을 증가시키고/또는 세포 은행의 제조를 위한 시간을 줄인다. 이것은 산업적인 관점에서 이점이 있다.

실시예 10: 텔로머라제 활성

이 어세이를 위해 본 발명에 따른 와튼 젤리로부터 유래된 기질 세포들(SWJ)의 200,000-500,000는 1mL의 Eppendorf 튜브에 분취되었고 그 후 10분 동안 +4 ℃에서 1,200 rpm에서 원심분리 되었다(Beckham Coulter Allegra ™ 25R). 상청액은 제거되었고 상기 세포들은 1X PBS에 재현탁되었다. 제2 원심분리 단계 후에, 건조된 펠렛은 - 80 ℃에 보관되었다. 상기 어세이를 수행하기 위해, TeloTAGGG 텔로머라제 PCR ELISA PLUS 키트(Roche Diagnostics)는 제조자의 지시에 따라 사용되었다. 결과들은 도 10에 나타난다. 상기 분석된 샘플들은 상기 키트로부터 제공된 양성 대조에 관해서(100 %로 간주됨), 2.4±1.7 %의 평균의 텔로머라제 활성을 보여줬다. 이것은 SWJ로부터 유래된 세포들의 더 높은 증식 능력이 이례적으로(anomalously) 높은 텔로머라제 활성과 상관관계가 없다는 것을 확인시켜준다.

실시예 11: 노화

물질 및 방법: 본 발명에 따른 와튼 젤리로부터 유래된 기질세포들(SWJ)은 계대 6(P6), 계대 8(P8) 또는 계대 11(P11), 계대 12(P12) 후, 트립신 처리(세포 기원에 대해, 실시예 1 및 2A 참조; 계대에 대해, 실시예 2B 및 2C 참조) 후에, 3 ml의 배양 배지(5 %의 hPL를 포함한 DMEM 또는 5 %의 hPL를 포함한 MSCBM CD)에 3,000 세포/cm²의 밀도로 6개의 다수의 웰 플레이트에 시딩되었고 5 %의 CO2, 95 % 습도 인큐베이터에서 37 ℃에서 4-5일 동안 달리 명시되지 않는다면 삼중(triplicate)으로 배양되었다. 그러고 나서, 상기 세포들은 1X 인산염 완충 식염수(PBS)에서 세척되었고 10분 동안 2 %의 포름알데하이드/0.2 %의 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)에서 실온에서 고정되었다. 상기 배양 플레이트는 PBS 1X에서 두번 헹궈지고 1 mL의 신선한 β-Gal 염색 용액(1 mg의 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-βD-갈락토시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-βD-galactoside)/100 μL의 다이메틸포름아마이드(dimethylformamide), 40 mM 시트르산(citric acid)/소듐 포스페이트(sodium phosphate), pH 6.0, 5 mM의 포타슘 페로시아나이드(potassium ferrocyanide), 5 mM의 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide), 150 mM의 NaCl, 및 2 mM의 MgCl2)이 첨가된다(제조자의 지시에 따라 사용됨). 상기 세포들은 37 ℃에서 밤새 인큐베이팅되고 색은 상기 제조자(Cell Signaling Technology)에 의해 제공된 지시에 기술된 바와 같이 도립 현미경(inverted microscope)의 빛을 가지고 발달되었다. 상기 양성 염색된 세포들은 세포질에서 청록색으로 나타난다. 염색된 샘플들은 PBS 1X에서 세척되고 도립 현미경(Zeiss)를 사용하여 2.5X 대물렌즈에 의해 시각화된다. 상기 양성 염색된 세포들(필드 당)은 하나의 관측자에 의해 정량화되었고 적어도 8개의 시야(field of view, 보기영역)가 각 기증자에 대해 검사되었다(달리 명시되지 않는다면).

결과들: 초기 배양 계대(P6-P8)에서 오직 일부 세포들이, 심지어 매우 낮은 밀도의 시딩에서도, 본 발명에 따른 SWJ로부터 유래된 세포들이 미미하게 노화되는 경향을 가진다는 것을 나타내면서, β-갈락토시다제 염색에 대해 약하게 양성이었다(데이터 미도시). 임의의 이론에 얽매이는 것을 바라는 것은 아니고, 혈소판 용해물은 엑스 비보에서 세포들의 성장을 위해 이점이 있는 보충물들, 예컨대 성장 인자들을 포함하는 것이 가능하다.

실시예 12: 뼈형성 분화 잠재력

상기 방법의 기술: 계대 5(실시예 2C)에서 SWJ는 뼈형성 계통으로 분화하도록 유도되었다. 요약하면, SWJ는 6 다중 웰(6-MW) 플레이트에 5 %의 hPL을 포함한 MSCBM CD에 10,000 세포/cm²의 밀도에서 시딩되었다. 이러한 6-MW 플레이트들은 0.1 %의 젤라틴 용액으로 미리 코팅되었다. 3-4일 평형(equilibration) 후에, 유지 배지는 교체되었고 뼈형성 배지로 대체되었다. 유도 7 일차 이후로 계속, 상기 뼈형성 배지는 10 mM의 베타-글리세로포스페이트(beta-glycerophosphate), 0.1 mM의 아스코르브산-2 포스페이트(ascorbic acid-2-phosphate) 및 10 nM의 덱사메타손(Dexamethasone), 플러스 추가적으로 100 ng/mL의 rhBMP-2(뼈 형태형성(morphogenic) 단백질 2)로 보충된 5 %의 hPL을 포함한 MSCBM CD로 구성되었다. 뼈형성 분화의 확인은 Real-Time qPCR 분석(아래에 기술됨)과 결합되어, von Kossa 염색을 통해 수행되었다(뼈 매트릭스가 어둡게 표지되도록).

2주 후, 뼈 형성 배지(위 참조)에서의 배양물 및 병렬 대조(parallel control) 배양물(MSCBM CD 플러스 5 %의 hPL에서, 즉 뼈형성을 유도하지 않는 배지에서 병렬적으로 성장됨)은 고정되었고 유기적인 칼슘 침착을 확인하도록 염색되었다. von Kossa 염색을 위해, 샘플들은 2분 동안 얼음처럼 차가운(빙냉) 메탄올에 고정되었고, 그 후 증류수에서 두번 헹궈지고 30분 동안 물에서 실버 나이트레이트를 가진 자외선(UV) 램프 아래에 인큐베이팅된다. 증류수에서 두번의 추가적인 세척 후에, 10 고출력 필드(10 high-power fields)는 10X 배율을 사용하여 관측되었다(Axioskop-Observer-1 도립 현미경; Zeiss). 디지털로 기록된 이미지들은 유기적인 칼슘 침적의 어두운 양성 염색된 영역을 선택적으로 정량화하는, ImageJ 소프트웨어(National Institute of Health, USA)에 의해 분석된다. 상기 실험들은 삼중 복제에서 수행되었다.

결과: 결과들은 도 12에 나타난다. 나타난 바와 같이, 뼈형성 배지로 처리의 14일 후에, 대조 샘플의 형태는 뼈형성 배지에 유도된 샘플들과 상이했고 칼슘 포스페이트의 von Kossa 염색은 검은 양성 염색을 제공했다(도 12A). 대조 및 유도된 샘플들에서 양성 염색된 영역 사이의 차이는 통계적으로 유의했다(T test에 의한)(도 12B). 뼈형성 시그니처(signature)를 추가적으로 확인하기 위해, 분자 분석은 RealTime-PCR에 의해 수행되었다(도 12C). 뼈형성 바이오마커 유전자의 상대적인 발현 수준은 내인성의 기준 베타 액틴 유전자의 그것으로 표준화되었다. 상기 폴드(fold) 유도 mRNA는 비유도성 및 서브 컨플루언트 세포로 정의된, SWJ 표준 배양 조건(MSCBM CD 플러스 5 %의 hPL)에 기초되어 계산되었다. 모든 테스트된 유전자들은 표준 배양 조건(p≤0.05, T-테스트에 의함)에 관해 충분히 상향 조절된다. 본 발명자들은 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, ALPL) 및 특정 매트릭스 단백질들, 예컨대 바이글리칸(biglycan, BGN), 콜라겐(COL1A1), 데코린(decorin, DCN) 및 엘라스틴(elastin, ELN)이 가장 상향 조절된 바이오마커였다는 것을 관측했다. 이러한 마커들의 조합은 뼈형성 계통에 대해 특징적이다(Murgia et al., PLoS One. 2016, vol. 11: e0163629). 이 발현 프로파일은 상기 세포의 초기 뼈형성 분화 결정(commitment)을 확인한다.

실시예 13: 지방생성 분화 잠재력

상기 방법의 기술: 지방생성 분화를 위해, 배양 계대 5에서 SWJ 세포들(실시예 1, 2A, 2B, 2C)은 6 다중 웰(6-MW) 플레이트에 5 %의 hPL을 포함한 MSCBM CD에 10,000의 세포/cm²로 시딩되었고, 3일 후, 상기 배지는 지방생성 유도 배지로 대체되었다. 상기 지방생성 배지는 1 μM의 덱사메타손, 60 μM의 인도메타신(indomethacin), 10 μM의 인슐린(insulin), 0.5 mM의 3-아이소부틸-1-메틸크산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine, IBMX), 10 %의 토끼 혈청, 5 %의 말 혈청, 1 %의 L-글루타민 및 1 %의 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 5 %의 hPL을 포함한 MSCBM CD로 구성되었다. 상기 대조 세포들은 5 %의 hPL을 포함한 MSCBM CD로 배양되었다. 세포들은 각 조건들에 대해 기술적인 복제물에 시딩되었다.

10일 후에 상기 세포들은 분화를 확인하기 위해 염료 Oil Red O(지방세포들에 대해 상업적으로 이용가능한 염료)로 다음과 같이 염색되었다: 상기 세포들은 간단히 PBS 1x로 세척되고, 10분 동안 37 %의 포름알데하이드의 증기로 고정되었고 그 후 2분 동안 물로 세척되었다. 염색은 3분 동안 웰로 Oil Red O 용액(에탄올 70 % 및 아세톤에 10 mg/mL의 Oil Red O)를 첨가함으로써 얻어진다. 상기 세포들은 3분 동안 Harris Hematoxylin (Bio-Optica, Milan, Italy)에 의해 대조염색(counterstain)되었다. 처리 후, 상기 분화된 세포들 및 대조는 현미경의 관찰(Axiocam MRC5 컬러 카메라를 가진 Axio Observer A1 및 Axiovision 4.82 소프트웨어; 모두 Zeiss)에 의해 시각화되었다.

결과들은 도 13에 나타난다. 상기 SWJ 세포들은, 처리의 10일 후에 지방 분화 결정(commitment)을 확인하며, 상기 세포 내부에 둥근 지질 방울을 생산할 수 있었다. 지질 액포(vacuole)는 유도된 샘플들에서 크게 탐지되었으나, 유도되지 않은 대조에서 탐지되지 않는다(도 13).

실시예 14: 연골형성 분화 잠재력

상기 방법의 기술: 연골형성 분화를 위해, 배양 계대 P5에서 200,000-500,000의 SWJ(실시예 1, 2A, 2B, 2C)는 15 mL 튜브에 분취되었고 10분 동안 1,200 rpm에서 원심분리되었다(Beckham Coulter Allegra™ 25R). 세포들은 개방된 플러그로 37 ℃에 성장 배지에 상기 펠렛에 유지되었다. 인큐베이팅의 2일 후, 상기 성장 배지는 500 ng/mL의 rhBMP-6, 10 ng/mL의 변형 성장 인자-β, 50 mg/mL의 ITS+Premix (6.25 μg/mL의 인슐린, 6.25 μg/mL의 트랜스페린, 6.25 ng/mL의 셀렌산(selenic acid), 1.25 mg/mL의 BSA 및 5.35 μg/mL의 리놀레산(linoleic acid)을 포함), 100nM의 덱사메타손, 0.2 mM의 L-아스코르브산-2-포스페이트, 100 μg/mL의 소듐 피루베이트, 40 μg/mL의 프롤린(proline)으로 보충된, 5 %의 인간 혈소판 용해물(hPL)을 포함한 MSCBM CD로 구성된, 유도 배지로 대체되었다. 상기 배지는 3일 마다 교체되었다. 각 배지 교체 전후에, 튜브들은 위에 기술된 바와 같이 10분 동안 1,200 rpm에서 원심분리되었다. 인큐베이팅 기간 동안, 세포들은 개방된 튜브 플러그들과 함께 펠렛으로 남는다. 유도는 21일 지속되고, 표본들은 10 %의 포름알데하이드에서 1시간 동안 고정되고, 그 후 70 % (v/v)에서 100 %로 증가하는 농도의 에탄올로 연속 계대에 의해 탈수된다. 샘플들은 그 후 파라핀 블록으로 포함되었고 Alcian Blue 염색을 위해 현미경용 슬라이드 상에 슬라이스(조각)로 잘렸다. 슬라이드들은 Histo-C 세정제로 파라핀이 제거되었고 계대를 통해 감소하는 농도 알코올 래더(ladder)(100 % 에탄올에서 70 % 에탄올로)(v/v)로 재수화(rehydrate)되었다. 샘플 섹션들은 그 후 10 mg/mL의 BSA를 가진 인산염 완충 용액(8 g/L의 NaCl, 2 g/L의 NaH2PO4, 및 0.3 g/L의 Na2HPO4)에서 0.5 mg/mL의 히알루로니다제로 인큐베이팅되었다. 슬라이드들은 5분 동안 물에 세척되었고 그 후 몇 초 동안 3 %(v/v)의 아세트산 용액에 담궈졌다. 상기 섹션들은 3 %의 아세트산(pH 2.5) 10 mg/mL의 Alcian Blue 용액(상업적 염료)으로 염색되었고, 이에 30분 남겨졌고, 물에서 세척 단계 후에, nuclear Fast Red 용액(상업적 염료)으로 5분 동안 대비염색되었다(counterstain).

결과들은 도 14에 나타난다. 처리의 21일 후, 상기 SWJ는 다수 층의 매트릭스가 풍부한 형태를 발달시켰다. 상기 유도된 SWJ는 낮은 세포충실성(cellularity) 및 세포 외 매트릭스(matrix) 내에 글리코사미노글리칸을 보여준다. 상기 대조 SWJ는 높은 세포충실성 및 부족한 매트릭스 구성을 보여준다.

Claims (48)

1. 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell)를 얻기 위한 방법에 있어서, 상기 방법은
   (a) 탯줄로부터 기질 와튼 젤리(stromal Wharton's Jelly) 또는 이의 부분을 분리시키는 것
   (b) 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 효소적 처리하고, 이에 의해 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분으로부터 적어도 하나의 세포를 방출시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
2. 제1항에 있어서,
   상기 단계 (b) 다음에 단계 (c)가 이어지고, 상기 (c)는 상기 적어도 하나의 세포를 증식시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   (a) 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 것은, 상기 탯줄로부터 혈관 및 혈관 주위 영역을 물리적으로 제거하는 단계에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서,
   상기 혈관 및 상기 혈관 주위 영역을 물리적으로 제거하는 것은 상기 탯줄로부터 상기 혈관 및 상기 혈관 주위 영역을 벗겨내는 것(strip out)에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   (a) 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을 분리시키는 것은 탯줄 라이닝 막(lining membrane)으로부터, 특히 적어도 상기 탯줄 라이닝 막의 상피 층(epithelial layer)으로부터 와튼 젤리를 분리시키는 것과 같이 탯줄 라이닝 막으로부터 양막 아래(subamniotic) 기질을 물리적으로 분리시키는 단계에 의해 추가적으로 특징지어지는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 탯줄 라이닝 막으로부터 와튼 젤리를 물리적으로 분리시키는 것은 상기 와튼 젤리를, 바람직하게 상기 탯줄 라이닝 막(lining membrane)을 기계적으로 해부하지 않고, 긁어내는 것(scrape out)에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 탯줄은 상기 혈관 및 상기 혈관 주위 영역을 물리적으로 제거하는 상기 단계 전에 분절되는 것(segment, 세그먼팅)을 특징으로 하는 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 분절은 상기 탯줄에 수직이고, 각각의 수직의 세그먼트는 바람직하게 약 1 내지 약 4 cm, 바람직하게 약 2 내지 약 3 cm, 및 더 바람직하게 약 2.5 cm의 길이를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
   혈관들의 세그먼트(들)은 상기 단계 (b) 이전에 상기 탯줄의 상기 세그먼트(들)로부터 제거되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소적 처리는 상기 단계 (b)가 효소인 콜라겐 분해효소(collagenase)를 포함하는 처리인 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 효소적 처리는 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분을, 콜라겐 분해효소를 바람직하게 0.5 W

    

    nsch U/ml 이하, 더 바람직하게 0.25 W

    

    nsch U/ml 이하, 및 구체적으로 0.18 W

    

    nsch U/ml의 특정 활성에서 포함하는 소화 완충제(Digestion Buffer)와 혼합함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a) 및 (b)는 함께 3 시간 이하의 총 시간에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서 상기 기질 와튼 젤리 또는 이의 부분은 혈소판 용해물(platelet lysate, PL) 또는 이의 유도체, 바람직하게 인간 혈소판 용해물(hPL) 또는 이의 유도체의 존재하에 효소적 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제3항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서 상기 적어도 하나의 세포는 혈소판 용해물(PL) 또는 이의 유도체, 바람직하게 인간 혈소판 용해물(hPL) 또는 이의 유도체를 포함하는 성장 배지에서 증식되는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 세포는 임의의 첨가된 혈청, 특히 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하지 않는 성장 배지에서 증식되는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제3항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 세포는 기초 배지 MSCBM CD를 포함하는 성장 배지에서 증식되는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 중간엽 기질세포(MSC)에 있어서,
    상기 세포는 다음과 같이:
    (a) 상기 세포는 APCDD1을 발현하고,
    (b) 상기 세포는 3G5를 발현하지 않는 것으로 특징지어지는 것을 특징으로 하는 세포.
18. 제17항에 있어서,
    상기 세포는 분리된 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 세포는 탯줄의 기질 와튼 젤리로부터 유래된 것을 특징으로 하는 세포.
20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 적어도 하나의 PPARG 및 FLVCR2를 추가적으로 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 인간 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
22. 제21항에 있어서,
    상기 인간 세포는 인간 백혈구(leukocyte) 항원들 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C의 적어도 하나, 바람직하게 적어도 둘의 임의의 조합, 및 가장 바람직하게 모두를 표시하는 것을 특징으로 하는 세포.
23. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    상기 세포는 인간 백혈구 항원들 HLA-DP, HLA-DR 및 HLA-DQ 중 임의의 것을 표시하지 않는 것을 특징으로 하는 세포.
24. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 여기 파장 488 nm에서 유세포측정(flow cytometry)에 의해 측정된 전방 산란광(forward scattered light, FSC) 수치가 55 이하인 것에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 세포.
25. 제17항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 3000 μm2 이하의 평균 표면적을 가지는 것을 특징으로 하는 세포.
26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 다능성인 것을 특징으로 하는 세포.
27. 제17항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 낮은 텔로머라제(telomerase) 활성, 바람직하게 TeloTAGGG 텔로머라제 PCR ELISA PLUS 키트(100%로 간주)의 양성 대조에 관해서, 10 % 이하의 텔로머라제 활성을 보여주는 것을 특징으로 하는 세포.
28. 상기 세포는 탐지할 수 있는 텔로머라제 발현의 부재 및/또는 탐지할 수 있는 텔로머라제 활성의 부재에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 세포.
29. 제17항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 다양한 세포 타입들로 분화할 수 있고,
    상기 세포는 적어도 다음:
    (a) 지방생성;
    (b) 연골형성;
    (c) 뼈형성
    의 분화 잠재력 모두를 가지는 것을 특징으로 하는 세포.
30. 제17항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 세포.
31. 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포는 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
32. 세포들의 집단에 있어서,
    상기 집단은 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 적어도 하나의 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 집단.
33. 제31항에 있어서,
    상기 집단은 세포들의 분리된 집단인 것을 특징으로 하는 집단.
34. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    상기 세포 집단에 포함된 모든 세포들은 서로에 관해서 자기유래(autologous, 자가유래)인 것을 특징으로 하는 집단.
35. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포들의 총 수의 적어도 70 %는 제17항 내지 제30항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 세포들인 것을 특징으로 하는 집단.
36. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단은 55 이하의 평균 FSC 수치에 의해 특징지어지는 것을 특징으로 하는 집단.
37. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단은 APCDD1을 발현하는 것을 특징으로 하는 집단.
38. 제31항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포들의 평균 표면적은 1400 내지 2000 μm2, 바람직하게 1500 내지 1900 μm2, 더 바람직하게 1600 내지 1800 μm2, 및 가장 바람직하게 약 1700 μm2인 것을 특징으로 하는 집단.
39. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포들(총 세포 수)의 적어도 70 %는 생존 가능한 것을 특징으로 하는 집단.
40. 제31항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단은 임의의 혈관 주위 세포를 포함하지 않고/또는 임의의 상피 세포를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 집단.
41. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 집단은 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 집단.
42. 제31항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 집단은 인간 세포들만 포함하는 것을 특징으로 하는 집단.
43. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 방법에 의해 얻어진 상기 세포는 제17항 내지 제29항 중 어느 한 항에서 정의된 상기 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
44. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 세포.
45. 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 세포 집단.
46. 제31항 내지 제41항 또는 제44항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 집단은 동결된 세포 집단인 것을 특징으로 하는 세포 집단.
47. 제45항에 있어서,
    상기 세포 집단은 일차 세포 은행(Primary Cell Bank, PCB) 또는 이차 세포 은행(Secondary Cell Bank, SCB)과 같은 세포 은행인 것을 특징으로 하는 세포 집단.
48. 제46항에 있어서,
    상기 세포 집단은 개개의 용기, 예컨대 바이알(vial)에 다수의 부분 표본(aliquot, 엘리쿼트)으로 있는 것을 특징으로 하는 세포 집단.
    
    

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