ITRM20110500A1 - Lisato piastrinico, usi di esso e metodo per la sua preparazione - Google Patents

Description

DESCRIZIONE

a corredo di una domanda di brevetto per invenzione dal titolo:

“LISATO PIASTRINICO, USI DI ESSO E METODO PER LA SUA PREPARAZIONEâ€

SETTORE DELL’INVENZIONE

La presente invenzione concerne un metodo rapido, semplice, efficace ed economico per la preparazione di lisato piastrinico privo da contaminanti che possano generare trasmissione di malattie da agenti virali, microbici, fungini o parassitari, anche denominato lisato inattivato. La presente invenzione concerne l’uso del lisato piastrinico ottenuto come coadiuvante per la coltivazione, crescita e espansione di cellule staminali, in particolare mesenchimali.

TECNICA ANTERIORE

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono progenitori multipotenti, capaci di autoreplicarsi e di orientarsi secondo diverse linee di differenziazione. Per le sue caratteristiche e potenzialità questa sorgente cellulare ha destato un vivo interesse da parte di ricercatori e clinici in considerazione delle possibili applicazioni terapeutiche, soprattutto nella medicina rigenerativa (1,2).

Il midollo osseo à ̈ la sorgente di MSC maggiormente impiegata e studiata. Tuttavia i precursori mesenchimali sono scarsamente rappresentati nel midollo osseo (0.001-0.01%), ma possono essere facilmente espansi ex vivo e replicarsi attivamente in appropriati mezzi di coltura. La possibilità di espandere le MSC ex vivo ha aperto nuovi orizzonti ed opportunità di applicazioni terapeutiche nella rigenerazione tessutale e come mezzi cellulari per l’immunomodulazione sistemica. Tuttavia, la maggior parte dei protocolli inizialmente adottati per l’espansione di MSC ex vivo hanno utilizzato mezzi di coltura addizionati con sieri di origine animale con potenziale rischio di trasmissione di agenti patogeni o di induzione di reazioni allergiche.

Il lisato piastrinico (LP) può essere una fonte alternativa al siero animale per la crescita di MSC (3,4). Le piastrine, per la loro fisiologica funzione di riparazione dei tessuti, sono infatti una fonte ricca di numerosi fattori di crescita quali PDGF (platelet-derived growth factor), b-FGF (basic-fibroblast growth factor), VEGF (vascular endothelial growth factor), TGF- β (transforming growth factor- β). Tuttavia la concentrazione di tali fattori nel lisato di piastrine à ̈ molto variabile. Pertanto, la preparazione di lisato piastrinico finalizzato ad una procedura di espansione di MSC a scopo clinico necessita di una fonte multipla, al fine di compensare le variabilità individuali, e di un protocollo standardizzato.

Sebbene le attuali strategie di screening delle donazioni per la prevenzione delle malattie trasmissibili con la terapia trasfusionale includono test virologici sia molecolari che sierologici ad elevata sensibilità, il rischio di trasmissione di virus epatici, dell’immunodeficienza acquisita e di altri patogeni (batteri, parassiti) o di nuovi virus emergenti, rappresenta un elemento di incertezza nell’adozione di preparati di LP in protocolli di MSC da espandere a fini terapeutici. Per una migliore contestualizzazione del problema correlato alle residue possibilità di trasmettere con gli emocomponenti malattie dovute ad agenti patogeni contaminanti tali prodotti, à ̈ utile considerare come, a tutt’oggi, il rischio di trasmissione del virus dell’epatite B (HBV) sia di 1 caso su 280.000 - 350.000 nei paesi sviluppati, con frequenze più alte nei paesi mediterranei e dell’est europeo, di 1 caso su 1.500.000 -4.000.000 per il virus dell’immunodeficienza acquisita (HIV) e di 1 caso su 1.000.000-2.000.000 per il virus dell’epatite C (HCV)(5). Riguardo alla contaminazione batterica degli emocomponenti, tale evenienza si verifica con frequenza preponderante nei prodotti piastrinici. Essa deriva più frequentemente da batteri di provenienza cutanea e quindi da normali saprofiti della cute umana o, alternativamente, da contaminazione ambientale dei luoghi ove i componenti del sangue vengono lavorati e conservati. Nei prodotti piastrinici, la frequenza di contaminazione batterica à ̈ circa di 1 caso su 1.500 e la conseguente frequenza di reazioni avverse correlabili alla re-infusione di specie batteriche con la trasfusione piastrinica à ̈ di circa 1 caso ogni 10.000-100.000 (6). Nel contesto dei LP va anche considerato che trattasi di prodotti assemblati provenienti da almeno 10/12 donatori data la necessità di ampliare il pool di soggetti di provenienza per rendere più possibile omogeneo il rilascio di fattori trofici, minimizzando la variabilità individuale del singolo donatore. Pertanto, ciascun rischio menzionato va incrementato di almeno un logaritmo, rendendo la contaminazione batterica probabile in 1 caso ogni 150 prodotti e la possibile trasmissione di HBV ipotizzabile in 1 caso ogni 30.000 prodotti. Il rischio di malattia trasmissibile, inoltre, deve essere anche correlato a nuove emergenze riferibili a forme di contagio riconducibili alla maggiore inclinazione dei donatori a viaggiare e soggiornare in zone endemiche per malattie virali, parassitarie e batteriche ed al sempre maggiore contributo alla donazione di comunità migrate nei nostri paesi da paesi endemici per malattie ad eziologia infettiva e potenzialmente trasmissibili con i prodotti del sangue. Gli screening a cui si affida la sicurezza della trasfusione, infatti, non esplorano, se non in alcune circostanze mirate, la presenza di forme infettive silenti ed asintomatiche quali la malattia di Chagas, la malaria, la babesiosi, la dengue, la leishmaniosi, le virosi da west nile virus, chikungunya, da influenza H1N1, da virus di Epstein Barr o da patogeni virali di nuovo interesse quali lo xenotropic murine leukemia virus (XMLV) associabile ad alcune forme di cancro nell’uomo ed alla sindrome d’affaticamento cronico. Ciò incrementa di un ulteriore ed incomputabile fattore il rischio residuo di malattia trasmissibile con emocomponenti, specialmente nel caso dei prodotti piastrinici che vengono sistematicamente de-leucocitati (venendo così a mancare completamente la capacità di auto-sterilizzazione del sangue) e conservati a temperatura ambiente in rilevanti quantità di plasma (il plasma costituisce un terreno di sopravvivenza o crescita ottimale per diversi patogeni).

Il contesto epidemiologico descritto pone seri interrogativi sull’opportunità di usare come tale il LP come fonte di stimolo per la crescita e l’amplificazione delle MSC. Infatti, se da un lato costituisce un prodotto potente, tanto più omogeneo nella quantità di stimolo quanto più ottenuto da un numero di donatori elevato, dall’altro lato rappresenta un componente tanto più rischioso per malattie trasmissibili da agenti patogeni noti e non noti tanto più à ̈ incrementata proprio la quota di donatori di provenienza. Tale circostanza pone un limite difficilmente superabile nella produzione ed uso di una fonte di stimolo come il LP ove lo stesso debba essere utilizzato per procedure che esitino in terapie di grado clinico, per forme terapeutiche ancora sperimentali e che non siano consolidate nel loro impatto sanitario sulle rispettive forme morbose. Si ri-proporrebbe, pertanto, quella condizione d’incertezza sanitaria già vissuta quando, nel secolo scorso, gli emoderivati anti-emorragici (fattori antiemofilici VIII e IX) venivano prodotti senza forme industriali di frazionamento ed inattivazione ai patogeni, configurandosi un rischio di malattia trasmissibile ormai inaccettabile per qualsiasi forma di farmaco emoderivato, tanto più per quelle preparazioni utilizzabili in ambiti sperimentali e non consolidati.

Una possibilità realistica per incrementare la sicurezza di un prodotto derivato dal sangue e non derivato da processi industriali ma di laboratorio, non essendo realizzabile un percorso di screening dei donatori che preveda l’individuazione pronta e costo-efficace degli agenti infettivi precedentemente menzionati, à ̈ rappresentata dalla possibilità di affidarsi a forme d’inattivazione ai patogeni di accertata efficacia. Le sostanze attualmente registrate e disponibili per l’inattivazione ai patogeni dei concentrati piastrinici sono il sistema Intercept ® dell’ Azienda Cerus ed il sistema Mirasol ® dell’ Azienda Caridian. I due sistemi possiedono simili capacità biologiche d’inattivazione di virus, batteri e parassiti ma il sistema Intercept ® vanta un uso ormai consolidato e riferibile a migliaia di prodotti inattivati ed utilizzati con successo nella terapia trasfusionale dei soggetti con difetto piastrinico. Al contrario, il sistema Mirasol ® può vantare un solo studio di fase III ed una modesta applicazione in ambito clinico (7) . Il sistema Intercept ® si avvale di una sostanza attivabile ad i raggi UVA rappresentata dall’amotosalene, il quale viene poi rimosso dal componente inattivato dopo la foto-illuminazione. L’esperienza clinica dimostra che le piastrine trattate con Intercept ® producono un effetto emostatico valido ma a fronte di incrementi meno validi della conta piastrinica dopo trasfusione. L’inattivazione, infatti, determina una riduzione del numero degli elementi cellulari disponibili nelle preparazioni ma anche un ridotto recupero piastrinico dopo trasfusione dovuto ad un effetto negativo dose-indipendente sulla sopravvivenza delle stesse dopo trasfusione. Questo effetto che appare indipendente, sia dalla dose infusa, sia dal periodo di conservazione e sia dalla compatibilità tra donatore e ricevente, spiega almeno il 40-50% dei ridotti incrementi osservati dopo inattivazione (8). Da un punto di vista biologico, infatti, le piastrine sottoposte a trattamento con Intercept ® mostrano alterazioni funzionali e metaboliche da riferire a maggiore riduzione del pH durante la conservazione, ad una minore disponibilità dell’eccesso di basi (da correlare alla riduzione più marcata del pH), a maggiore pO2 e pCO2, a maggior consumo di glucosio e produzione di lattato, a maggiore rilascio di lattico deidrogenasi e a maggiore espressione del marker di attivazione p-selectina (9) . Questi fenomeni, nel loro complesso, dimostrano come la fotoattivazione dell’amotosalene, a fronte di una sterilizzazione del prodotto pressoché completa in termini di carica parassitaria, virale e microbica, determina uno stress respiratorio e metabolico nonché l’attivazione delle piastrine trattate. In riferimento a quanto detto, diviene di assoluta importanza la valutazione di come i lisati piastrinici, ottenuti da pool di donatori e poi inattivati con sistemi d’inattivazione consolidati quali l’Intercept ®, mantengano a valle dell’inattivazione una capacità trofica e di stimolo sulle MSC comparabile ad i lisati piastrinici convenzionali. Infatti, lo stress metabolico osservato potrebbe influire negativamente sulla capacità del lisato piastrinico così trattato di rilasciare valide concentrazioni di fattori stimolanti e di stimolo della crescita ed espansione delle MSC.

Complessivamente, da questa premessa emerge l’importanza di produrre lisati piastrinici da un appropriato numero di donatori come stimolo ottimale per le MSC, di procedere ad una forma d’inattivazione ai patogeni per la riduzione del rischio trasfusionale e di valutare gli effetti del processo d’inattivazione su una metodologia ottimizzata di produzione del LP utilizzando sistemi di produzione di grado-clinico.

Al fine di produrre un LP al massimo livello di sicurezza à ̈ stato sviluppato un protocollo per la preparazione di LP in sistema chiuso che utilizza unità di piastrine da buffy-coat preventivamente sottoposte a procedura di inattivazione ai patogeni. I prodotti cosi ottenuti sono stati valutati nella loro efficacia e sicurezza e comparati a LP di controllo prodotti in maniera sovrapponibile ma omettendo il processo d’inattivazione.

DESCRIZIONE DELL’INVENZIONE

Pertanto forma oggetto dell’invenzione un metodo per la preparazione di lisato piastrinico privo di agenti contaminanti comprendente le fasi di:

a) isolare la frazione buffy-coat da sangue intero ottenuto da almeno due soggetti; b) esporre la frazione buffy-coat isolata ad un agente fotochimico e a raggi UV in condizioni tali da ottenere una frazione buffy-coat isolata e priva di agenti contaminanti;

c) sottoporre ad almeno un ciclo di congelamento/scongelamento detta frazione tale da ottenere una lisi delle piastrine contenute nella frazione buffy-coat; d) centrifugare detta frazione e prelevare la fase liquida.

Preferibilmente l’agente fotochimico à ̈ uno psoralene. Più preferibilmente lo psoralene à ̈ l’amotosalen.

In una forma preferita, l’agente fotochimico à ̈ utilizzato a una concentrazione finale di 150 umol/L.

Preferibilmente i raggi UV sono UVA. Ancora preferibilmente l’esposizione ai raggi UVA à ̈ di 3 J/cm2.

Forma oggetto dell’invenzione un lisato piastrinico privo di agenti contaminanti ottenibile con il metodo dell’invenzione.

Forma oggetto dell’invenzione l’uso del lisato piastrinico privo di agenti contaminanti ottenibile con il metodo dell’invenzione come coadiuvante per la crescita e/o l’espansione di cellule staminali.

Preferibilmente, le cellule staminali sono mesenchimali.

Preferibilmente il lisato piastrinico privo di agenti contaminanti ottenibile con il metodo dell’invenzione à ̈ aggiunto al mezzo di coltura di dette cellule ad una concentrazione tra 5% e 10%.

La presente invenzione consente di ottenere un lisato piastrinico privo di agenti contaminanti, utilizzabile per la coltura di cellule mesenchimali; le cellule possono vantaggiosamente essere utilizzate per terapia e reintrodotte in soggetti.

La presente invenzione verrà descritta in esempi non limitativi, facendo riferimento alle seguenti figure:

Fig. 1: Schema del protocollo di preparazione del lisato piastrinico. PLT: concentrato di piastrine.

Fig. 2: Campione esemplificativo di LP (LP0006 sub-lotto 1, inattivato) dopo confezionamento finale, etichettatura e congelamento.

Fig. 3: Crescita cellulare delle MNC di sangue midollare dalla semina al primo passaggio (P1), e delle MSC derivate dal primo passaggio P1 al terzo passaggio (P3) in presenza dei vari LP: LP controllo 0001, LP controllo 0002, LP controllo 0003, LP inattivato 0004, LP inattivato 0005, LP inattivato 0006, LP inattivato 0007. Sono state utilizzate in colture di MSC ottenute da 5 diversi soggetti (MSC1, MSC2, MSC4, MSC6, MSC8).

Fig. 4: Grado di purezza e di fedeltà di linea delle diverse MSC, coltivate in presenza dei diversi LP (LP controllo 0001, LP controllo 0002, LP controllo 0003, LP inattivato 0004, LP inattivato 0005, LP inattivato 0006, LP inattivato 0007), valutati al primo passaggio (P1) ed al terzo passaggio (P3) mediante analisi citofluorimetrica dell’espressione dei marcatori specifici di superficie A: CD105, B: CD166, C: CD90, D: CD71, E: CD73). Fig. 5: Esempio di caratterizzazione fenotipica con valutazione della vitalità (7-AAD) associata all’analisi del marcatore CD105 delle MSC4 al terzo passaggio (P3) in presenza di LP0004 inattivato (a,b,c,d) e LP0003 di controllo (e,f,g,h).

Fig. 6: Esempio di differenziazione delle MSC8 in senso osseo (O), adiposo (A) e condrocitico (Co) dopo trattamento con LP controllo 0003 (O1, A1 e Co1) o dopo trattamento con LP inattivato 0004 (O2, A2 e Co2). C1 (LP controllo 0003) e C2 (LP inattivato 0004) sono un esempio di controlli non differenziati e colorati per la differenziazione ossea.

MATERIALI E METODI

Protocollo per la produzione e valutazione biologica di LP

Produzione di Pool di concentrati piastrinici

I concentrati di piastrine (PLT) sono stati prodotti da unità di sangue intero di donatori volontari risultati idonei alla donazione, raccolte in circuiti sterili dedicati dotati di sacca quintupla (Fresenius Kabi AG, Bad Homburg, Germany).

Per la produzione di PLT da buffy-coat le unità di sangue sono state processate entro le sei ore dal prelievo. Dopo aver verificato che il prelievo di sangue intero fosse conforme (volume prelevato, assenza di coaguli visibili, assenza di chilosità), l’unità à ̈ stata sottoposta a centrifugazione a 6477 relative centrifugal force (rcf) x g per 12 min.

Da ogni singola unità, mediante separatori Compomat G4 (Fresenius Kabi AG) sono stati estratti:

 1 unità di plasma fresco

 1 unità di emazie buffy-coat deplete

 1 unità di buffy coat (BC) contenente la componente piastrinica.

I BC prodotti sono stati conservati in incubatore a 22°C in continua agitazione ed assemblati per la produzione del pool entro 24 h. Il pool di 6 unità di BC à ̈ stato preparato mediante connessione sterile dei BC (Composeal, Fresenius Kabi AG) tra loro in ambiente di produzione dedicato, con la soluzione salina InterSol (Fenwal Inc. Lake Zurich, Illinois, con composizione: Na-citrato 2H2O 318mg, Na2-fosfato anidro 305mg, Na Diidrogenofosfato 2H2O 105mg, Na-Acetato 3H2O 442mg, NaCl 452mg, H2O 100mL) e con la sacca di raccolta del pool (kit monouso BioP-plus, Fresenius Kabi AG ). Le sacche di raccolta dei BC e del pool finale sono state identificate con etichetta specifica con il codice a barre associato al pool in produzione. Al termine della procedura di assemblaggio la sacca di raccolta dei 6 BC à ̈ stata chiusa mediante saldatura (Composeal, Fresenius Kabi AG), disconnessa dal kit di lavorazione e centrifugata a 480 rcf x g per 9 min. Al termine della centrifugazione il concentrato piastrinico à ̈ stato separato dal BC residuo mediante separatore automatico Compomat G4.

Procedura di Inattivazione ai Patogeni

Due pool da 6 unità di PLT sono stati sottoposti alla procedura di inattivazione dei patogeni mediante trattamento fotochimico con psoraleni ed esposizione ad UV (INTERCEPT Blood System for Platelets, Cerus Corporation, Concord, California USA). Nel processo di inattivazione dei patogeni mediante tecnologia INTERCEPT à ̈ stato introdotto nel pool di PLT un composto della famiglia degli psoraleni (Amotosalen hydrochloride) che, a seguito dell’esposizione ai raggi UVA, si lega con legame covalente agli acidi nucleici eventualmente presenti nel prodotto e blocca il processo di duplicazione delle eliche di DNA e RNA.

Per la procedura di inattivazione, la sacca del pool à ̈ stata connessa sterilmente al kit INTERCEPT ed avviata alla procedura di inattivazione che avviene in sistema completamente chiuso e comprende le seguenti fasi:

ï‚· immissione nel pool di PLT dello psoralene Amotosalen (S-59, INTERCEPT Blood System for Platelets, Cerus Corporation, Concord, California USA; codice prodotto INT2204B) alla concentrazione finale di 150 Î1⁄4mol/L;

ï‚· esposizione del pool di PLT addizionato con psoralene ai raggi UVA 3 J/cm2 ï‚· trasferimento del prodotto nella sacca contenente apposito dispositivo (CAD Compound Adsorption Device) per la rimozione dello psoralene;

 trasferimento nella sacca finale per la conservazione del prodotto “Pool PLT Inattivato†fino al suo utilizzo.

Il pool finale di PLT sottoposto al trattamento inattivante descritto à ̈ stato identificato con l’etichetta riportante, oltre al codice a barre associato al pool nella fase di produzione, la specifica “Inattivato†.

Al termine della procedura d’inattivazione le unità di PLT sono state risospese in InterSol con una quota residua di plasma pari a circa il 20-30%.

Da questa fase in poi le ulteriori operazioni di produzione del LP sono state eseguite in ambiente controllato di classe C classificato secondo le Linee Guida Internazionali per Norme di Buona Fabbricazione (Good Manufacturing Practice, GMP) recepite a livello della comunità europea nei seguenti riferimenti legislativi: EU GMP Directive “Manufacturing of Sterile Medicinal Products†,-Annex 1, EU GMP directive “Manufacture of Biological Medicinal Products for Human Use†–Annex 2, EMEA Guideline on Human Cell Based Medicinal Products –EMEA/CHMP/CPWP/323774/2005. Le Linee Guida GMP prevedono un controllo ambientale specifico della contaminazione particellare che consente una classificazione del laboratorio di “grade†A, B, C, D secondo la tabella I di seguito riportata.

Tabella I: Gradi di classificazione di laboratorio

Numero max permesso di parti/mc

In riposo In operazione

Grade 0.5 Î1⁄4m 5 Î1⁄4m 0.5 Î1⁄4m 5 Î1⁄4m

A 3.500 1 3.500 1

B 3.500 1 350.000 2.000

C 3.500.000 2.000 3.500.000 20.000

D 3.500.000 20.000 non definito non definito

Produzione Lisato Piastrinico

Dai 2 pool di PLT inattivati sono stati effettuati dei prelievi, mediante inserimento di un dispositivo di campionamento sterile (Terumo, Tokyo, Japan) nell’apposito ingresso della sacca (punto di campionamento sterile “sampling site†dei dispositivi di raccolta Fresenius Kabi AG), per il controllo della conta piastrinica e della sterilità.

Le conte piastriniche sono state realizzate con l’analizzatore ematologico ABX Pentra DX 120 (Horiba ABX, Montpellier, France). I test di sterilità sono stati eseguiti con il Sistema BacT/ALERT utilizzando terreni specifici per batteri aerobi, anaerobi e miceti (bioMérieux SA, Marcy l'Etoile, France).

Il volume del pool di 6 unità al termine della procedura completa à ̈ risultato mediamente di 300 mL ed il contenuto di piastrine compreso tra 2.5-3.5 x 1011.

I 2 pool di 6 unità di PLT inattivate sono stati successivamente riuniti, mediante connessione sterile (TSCD II, Terumo, Tokyo, Japan), in un'unica sacca, ottenendo un pool finale di volume pari a circa 600 mL costituito da 12 unità di PLT inattivate. Il pool complessivo à ̈ stato sottoposto a 3 successivi congelamenti (-80°C; permanenza a tale temperatura di 24 ore in congelatore meccanico) e scongelamenti (37°C; scongelamento in scongelatore biologico per unità di plasma (Bloodline, KW, Siena, Italia) e mantenimento di tale temperatura per 60 minuti) per assicurare la rottura delle piastrine con liberazione dei fattori di crescita.

Per la rimozione degli stromi cellulari, il pool à ̈ stato suddiviso in 2 sacche ed ognuna delle 2 sacche connesse sterilmente (TSCD II) con una seconda sacca di trasferimento (transfer bag 600 ml, JMS Singapore PTE LTD, Singapore) per la rimozione del sopranatante dopo centrifugazione di 45’ a temperatura ambiente a 5313 rcf x g. La sacca residua contenente gli stromi cellulari à ̈ stata rimossa dopo doppia saldatura e la procedura di centrifugazione ripetuta seguendo le stesse modalità.

Al termine della preparazione, sono stati eseguiti prelievi per il controllo finale di sterilità. Al fine di poter utilizzare in colture di cellule per terapie cellulari il LP prodotto nella presente invenzione, oltre ai batteri aerobi, anaerobi e miceti à ̈ stato eseguito anche il controllo per le endotossine utilizzando il LAL test (Limulus Amebocyte Lysate; International PBI spa, Milano, Italia) con una sensibilità di 0.06 UE/mL.

I prodotti di LP sono stati identificati con apposito codice in chiaro e a barre per individuare il lotto di produzione, aliquotati mediante connessione sterile (TSCD II) in sacche pediatriche (sacca trasferimento plasma fresco congelato da 100 ml, Fresenius Kabi AG), con identificazione dei sub-lotti. Ogni unità di sub-lotto conteneva 40-50 mL di LP pari a circa 3 dosi (da intendersi come 3 dosi per attività colturali su larga scala, ciascuna di esse sufficiente per l’allestimento di una coltura di grado-clinico con volume di partenza di 100-150 ml) per l’espansione ex vivo di MSC in sistemi chiusi CellSTACK® CORNING® cell culture chambers (MacoPharma, Mouvaux, France; Corning Incorporated, Corning, New York, USA) se utilizzato alla concentrazione del 10%.

Seguendo lo stesso schema operativo, escludendo la fase di inattivazione virale, Ã ̈ stato prodotto LP non inattivato quale controllo.

La procedura di preparazione del LP Ã ̈ schematicamente riassunta riportata nella flow-chart presentata nella Fig.1.

Valutazione del contenuto in fattori di stimolo per le MSC e del potenziale proliferativo indotto dalle diverse preparazioni di LP sulle MSC.

Sui diversi prodotti di LP Ã ̈ stato eseguito il dosaggio immuno-enzimatico dei seguenti fattori utilizzando campioni diluiti in misura variabile da 1:2 a 1:10:

ï‚· PDGF-AB (Quantikine Human PDGF-AB, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)

ï‚· VEGF (Quantikine Human VEGF, R&D System)

ï‚· basic-FGF (Quantikine Human FGF basic, R&D System)

ï‚· TGF-Beta (Quantikine Human TGF-Beta 1, R&D System)

Tutte le preparazioni di LP (LP controllo 0001, LP controllo 0002, LP controllo 0003, LP inattivato 0004, LP inattivato 0005, LP inattivato 0006, LP inattivato 0007) sono state utilizzate in colture di MSC ottenute da 5 diversi soggetti (MSC1, MSC2, MSC4, MSC6, MSC8) a partire e da aliquote di sangue midollare aspirato in corso di donazione di cellule staminali per trapianto allogenico, dopo raccolta di specifico consenso informato (vedi paragrafo successivo per i dettagli riguardanti le colture di MSC).

Protocollo per la selezione ed espansione di MSC

Campioni di 5 mL di sangue midollare da donatore di cellule staminali allogeniche sono stati utilizzati per la separazione delle cellule mononucleate (MNC). Dopo l’esecuzione di un esame emocromocitometrico per valutare la componente linfo-monocitaria iniziale, il sangue midollare à ̈ stato diluito 1:3 in Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (PBS, Biowest S.A.S, Nuaillé, France) e la separazione delle MNC effettuata mediante gradiente di sedimentazione utilizzando come mezzo di separazione Lympholyte (Cedarlane, Burlington, Ontario, Canada) ed una centrifugazione di 30 minuti a 652 rcf x g a temperatura ambiente. Sono stati quindi effettuati 2 lavaggi con PBS addizionato con albumina umana al 2% (Uman Albumin, Kedrion S.p.A., Lucca, Italia) e ri-sospensione finale delle cellule in terreno D-MEM GMP grade (Li-Star Fish, Milano, Italia). La componente linfo-monocitaria à ̈ stata rivalutata emometricamente dopo la separazione su gradiente ed à ̈ stata eseguita l’analisi in citometria a flusso per la valutazione della componente mesenchimale individuata dalle cellule CD71+ (allophycocyanin, APC, conjugated,, anti-CD71; Becton Dickinson, San José, California, USA), CD73+ (phycoerytrhin, PE, conjugated,, anti-CD73; Becton Dickinson), CD90+ (allophycocyanin, APC, conjugated anti-CD90, Becton-Dickinson), CD105+ (peridinin chlorophyll protein complex, PerCP, conjugated anti-CD105; Becton Dickinson; o fluorescein isothiocyanate, FITC, conjugated anti-CD105; Partec GmbH, Munster, Germany), CD166+ (PE conjugated,, anti-CD166; Becton Dickinson), CD45- (FITC, conjugated anti-CD45, Becton-Dickinson) e CD34- (FITC, conjugated anti-CD34, Becton-Dickinson) utilizzando un citofluorimetro FacsCalibur (Becton-Dickinson) ed i succitati anticorpi monoclonali. 1 x 106 MNC/mL sono state poste in coltura con terreno D-MEM GMP grade addizionato con 10% (sono state anche utilizzate e valutate concentrazioni di LP del 5% che hanno prodotto risultati comparabili al 10 %) di LP in fiasche T25 (Asahi Techno Glass, Iwaki, Japan) in incubatore a 37°C , 5% CO2. Per le prove di espansione su vasta scala à ̈ stata eseguita un’espansione di MSC utilizzando il sistema di coltura CellSTACK® CORNING® cell culture chambers (MacoPharma; Corning Incorporated). Dopo 48 h dall’inizio della coltura, il sopranatante à ̈ stato rimosso e sostituito con terreno fresco. In seguito il terreno à ̈ stato sostituito ogni 4 giorni e le cellule controllate al microscopio per valutare l’adesione, la crescita e la confluenza. Al raggiungimento di una confluenza cellulare pari a circa l’80%, le cellule adese sono state rimosse mediante trattamento con tripsina (GMP grade, Li Star Fish), centrifugate e contate al citofluorimetro mediante l’impiego di ioduro di propidio (Calbiochem, Merck KGSA, Darmstadt, Germany) e l’utilizzo di fluorosfere (Flow Count Fluorosphere, Beckman Coulter, Galway, Ireland). La soluzione di propidio contenente Tween à ̈ in grado di permeabilizzare la membrana cellulare e consentire al propidio fluorescente (FL2) di entrare nella cellula e legarsi agli acidi nucleici. L’aggiunta di fluorosfere a concentrazione nota(12) consente una valutazione in termini di conta assoluta delle MSC marcate con propidio. Le cellule sono state inoltre caratterizzate come MSC utilizzando lo stesso pannello di marcatori di superficie indicati per la tipizzazione iniziale. Questo primo passaggio à ̈ stato identificato come P1.

Per la successiva espansione le cellule sono state seminate alla concentrazione di 4000 cell/cm2 (20.000 cell/mL) utilizzando le stesse condizioni di coltura descritte. Al successivo raggiungimento della confluenza, passaggio 2 (P2), le cellule sono state nuovamente rimosse, contate, tipizzate ed ulteriormente espanse. Al terzo passaggio (P3) le cellule sono state contate, caratterizzate mediante analisi in citometria a flusso anche con valutazione della vitalità mediante l’impiego di 7-Amino-Actinomicina D (7AAD, Becton Dickinson), testate per il potenziale differenziativo in senso osteogenico, adiposo e condrocitico e congelate in azoto liquido per verificare la vitalità, il potenziale replicativo e differenziativo post congelamento.

L’espansione delle cellule mesenchimali à ̈ stata calcolata a partire dal Passaggio1 in cui oltre il 95% delle cellule mostrava il fenotipo MSC (i.e. cellule esprimenti i marcatori CD105, CD166, CD90, CD71, CD73).

Protocollo per la valutazione del potenziale differenziativo delle MSC

Per tutte le linee differenziative, le MSC sono state coltivate in piastre di Petri da 35 millimetri (NUNC A/S, Roskilde, Denmark) alla concentrazione di 5000 cell/mL in mezzo di coltura appropriatamente condizionato per 3 settimane con cambi del terreno ogni 3-4 giorni. Al termine dei 21 giorni di coltura, sono state effettuate colorazioni selettive per la rilevazione delle diverse tipologie cellulari.

Osteogenesi

 Mezzo di coltura: α-MEM (Gibco Invitrogen, San Giuliano Milanese, Italia) addizionato con Desametasone 10-7M (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri, USA), Acido Ascorbico 10-5M (Sigma-Aldrich) , β-Glicerofosfato 10-2M (Sigma-Aldrich).  Colorazione di rivelazione: Fast Blue, Naftol AS-D Cloroacetato Esterasi e α-Naftil Acetato Esterasi (Sigma-Aldrich).

Condrogenesi

ï‚· Mezzo di coltura: α-MEM (Gibco Invitrogen) aggiunto con Desametasone 10-7M (Sigma-Aldrich), Acido Ascorbico 10-4M (Sigma-Aldrich), β-Trasforming Growth Factor 10ng/mL (Sigma-Aldrich), Insulina 10 Î1⁄4g/mL (Sigma-Aldrich).

ï‚· Colorazione di rivelazione: Blu Toluidina (Bio-Optica SpA, Milano, Italy).

Adipogenesi

ï‚· Mezzo di coltura: α-MEM (Gibco Invitrogen) aggiunto con Desametasone 10-6M (Sigma-Aldrich), Insulina 10 Î1⁄4g/mL (Sigma-Aldrich), 1-metil-3-isobutilxantina 5 x 10-4 M (Sigma-Aldrich), Indometacina 60 Î1⁄4M (Sigma-Aldrich).

ï‚· Colorazione di rivelazione: Oil RED O (Bio-Optica)

Protocollo per il congelamento e scongelamento di MSC

Procedura di congelamento

Aliquote di 2 x 106 MSC (ottenute al P3) in D-MEM GMP grade addizionato con albumina umana al 5% e DMSO al 10% (WAK-Chemie Medical GmbH, Steinbach, Germany) quale concentrazione finale sono state congelate in criotubi utilizzando un sistema di congelamento con protocollo dedicato di discesa programmata della temperatura validato per il congelamento di cellule staminali a fini trapiantologici (Kryo 560-16 Planer; Planer PLC Sunbury-On-Thames, United Kingdom). Le cellule sono state criopreservate in vapori di azoto liquido per 3 mesi.

Procedura di scongelamento

Per lo scongelamento i criotubi sono stati prelevati dai vapori di azoto liquido e rapidamente scongelati in bagno termostatato a 37°C. A scongelamento completo la sospensione cellulare à ̈ stata immediatamente diluita in PBS-EDTA (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) con albumina al 5% e sottoposta a 3 lavaggi per la rimozione completa del DMSO. Al termine dell’ultimo lavaggio le MSC sono state contate al citofluorimetro e valutate per la vitalità.

Espansione di MSC post-scongelamento

15.000 MSC vitali/cm2 sono state poste nuovamente in coltura in terreno D-MEM GMP grade addizionato con la stessa preparazione di LP utilizzata per la selezione ed espansione pre-congelamento (con concentrazioni di LP comprese tra il 5% ed il 10%). Al raggiungimento della confluenza, le MSC adese sono state staccate mediante trattamento con tripsina, tipizzate in analisi in citometria a flusso utilizzando il pannello di anticorpi monoclonali descritto sopra ed espanse secondo il protocollo “base†(i.e. il protocollo come dettagliato nel precedente paragrafo “Protocollo per la selezione ed espansione di MSC†) per valutare il potenziale replicativo e di differenziazione post congelamento.

Valutazione dell’assetto cromosomico e dell'espressione genica

Alla fine del passaggio P1 e P3 le cellule sono state poste in coltura alla concentrazione di 7000 cell/cm2, alle stesse condizioni di coltura descritte, ed à ̈ stata eseguita l'analisi del cariotipo in accordo con i protocolli descritti dall’International System for Human Cytogenetics Nomenclature.

RISULTATI

Sono state allestite 7 preparazioni di LP identificate rispettivamente come LP (controllo) 0001, LP (controllo) 0002, LP (controllo) 0003, LP (inattivato) 0004, LP (inattivato) 0005, LP (inattivato) 0006, LP (inattivato) 0007, 3 di controllo e le rimanenti 4 sottoposte a processo d’inattivazione con il sistema Intercept ®. Tutte le 7 preparazioni sono risultate sterili ai controlli microbiologici (batteri aerobi, anaerobi, miceti ed endotossine) e quindi sono state utilizzate nei protocolli di selezione ed espansione di MSC da sangue midollare. La figura 2 mostra un campione esemplificativo di LP (LP0006, inattivato) dopo confezionamento finale, etichettatura e congelamento.

Il dosaggio dei fattori solubili ad azione trofico-rigenerativa tipici del LP, ovvero PDGF-AB, VEGF, bFGF e TGF-b, ha mostrato la presenza di valori attesi e paragonabili a quelli osservati in altre esperienze di preparazione di LP. In particolare, non si sono osservate differenze rilevanti tra le concentrazioni dei fattori nei LP di controllo ed in quelli inattivati, a testimonianza che l’intero processo di preparazione, inclusa la delicata fase dell’inattivazione, permette il rilascio ottimale dei fattori attesi, nelle concentrazioni attese. La Tabella II mostra le concentrazioni di ciascun fattore rilevate nelle singole preparazioni di LP.

Tabella II. Concentrazioni dei fattori nei diversi LP rilevate con metodo immunoenzimatico

PDGF-AB VEGF bFGF TGF-b (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) LP controllo 20.700 920 110 15.000 0001

LP controllo 28.830 751 99 11.000 0002

LP controllo 21.710 530 100 14.000 0003

MEDIA LP

controllo 23.75 733.67 103 13.33

LP inattivato 22.760 560 118 10.200 0004

LP inattivato 20.530 490 88 16.990 0005

LP inattivato 27.500 880 97 13.000 0006

LP inattivato 24.360 990 100 14.800 0007

MEDIA LP

inattivato 23.78 730 100.75 13.75

Inoltre, i valori delle concentrazioni dei fattori rilevati nei diversi LP sono omogenei. L’assemblaggio di prodotti provenienti da 12 donatori à ̈ in grado di minimizzare le variabilità interindividuali nel rilascio dei fattori medesimi, caratteristica peraltro preservata dal processo d’inattivazione. La valutazione delle concentrazioni sui campioni diluiti ha dato risultati congrui al fattore di diluizione introdotto.

Dai donatori di cellule staminali allogeniche gli autori hanno ottenuto, attraverso l’isolamento fisico delle MNC e la coltura in presenza delle diverse preparazioni di LP prodotto secondo il protocollo oggetto dell’invenzione, 5 distinte linee primarie di MSC, denominate già al P1 (Passaggio 1, vedi la sezione sui Metodi) MSC1, MSC2, MSC4, MSC6, MSC8.

Tutti i LP sono stati valutati nella loro capacità di supportare la crescita al P1, al P2 ed al P3 di tutte le linee di MSC, nonché di sostenere un fenotipo coerente ed omogeneo alle caratteristiche di linea, la vitalità cellulare ed il potenziale osteogenico, adiposo e condrocitico delle MSC al P3.

La figura 3 mostra in scala logaritmica l’incremento numerico dei vari campioni di MNC di sangue midollare dalla semina in coltura fino al raggiungimento del P1 in presenza dei diversi LP, e l’espansione delle MSC da questo punto sperimentale fino al P3.

Alla semina ciascun esperimento di selezione ed espansione cellulare à ̈ stato allestito con un numero iniziale di 10x106 cellule MNC midollari totali. Il raggiungimento del P1 coincideva con l’ottenimento di un mono-strato aderente ed omogeneo che, come mostrato dalla successiva fig. 4, consisteva di MSC con purezza di almeno il 90%, in base all’espressione dei marcatori di linea. Dal P1 al P3 sono mostrate le conte cellulari totali ottenute amplificando, per ciascun campione, tutte le MSC ottenute al P1.

Dalla Fig. 3 si può evidenziare che i diversi LP, sia di controllo che inattivati, hanno sostenuto la crescita cellulare dei vari campioni in coltura in maniera comparabile, sia nel raggiungimento del P1, sia nell’espansione delle MSC da P1 a P3.

I risultati ottenuti al P2 non sono mostrati ma anche per tale punto sperimentale si à ̈ osservata una paritetica e sovrapponibile capacità di espansione cellulare da parte dei diversi LP a carico delle diverse MSC. In generale, à ̈ possibile osservare come dalla fase dalla semina a quella P1 si ottenga la selezione e l’espansione della linea delle MSC con una consistente perdita cellulare della componente MNC contaminante non desiderata. Dalla fase P1 a P3, le MSC in stato di purezza si espandono, raggiungendo in alcuni casi un numero totale di elementi superiore a 150 x106. Il tasso di espansione considerato come l’amplificazione numerica ottenuta al P3 a partire dalle MSC seminate al P1 à ̈ mostrato nella Tabella III.

Tabella III. Espansione dei diversi campioni di MSC dal P1 al P3 in presenza dei diversi LP. L’espansione di ciascun campione à ̈ espressa come numero di amplificazioni della conta cellulare; tali figure numeriche sono state calcolate dividendo il numero assoluto di MSC recuperate al P3 per il numero di cellule seminate al P1. In parentesi sono indicati i giorni di coltura intercorsi tra la semina ed il raggiungimento del P3 nelle diverse colture di MSC, in presenza dei diversi LP.

MSC1 MSC2 MSC4 MSC6 MSC8

P1P3 P1P3 P1P3 P1P3 P1P3 LP controllo 0001 200,7 (27) 73,5 (27) 263,6 (28) 112,5 (27) 158,8 (27) LP controllo 0002 209,6 (28) 76,6 (30) 300 (27) 112,3 (30) 129,4 (28) LP controllo 0003 171,5 (28) 65,7 (31) 311,1 (30) 103,5 (30) 143,7 (31) LP inattivato 0004 197,7 (31) 75 (28) 238,4 (29) 108 (27) 111,7 (27) LP inattivato 0005 218,3 (27) 68,9 (27) 320 (30) 111,1 (27) 122,2 (31) LP inattivato 0006 200,2 (27) 67,7 (29) 275 (27) 130 (28) 141,1 (27) LP inattivato 0007 180,4 (30) 85,7 (28) 272,7 (27) 128,5 (30) 150 (28)

Complessivamente si à ̈ osservato un tasso di amplificazione dal P1 al P3 variabile da un minimo di 65 (MSC2) ad un massimo di 320 volte (MSC4).

Inoltre, il grado di purezza delle MSC ottenute ai diversi passaggi e testimoniato dall’espressione dei marcatori specifici di linea, valutata mediante citofluorimetria, à ̈ agguardevole e comunque comparabile per i vari campioni di MSC ottenuti in presenza dei diversi LP. La figura 4 indica la percentuale di MSC esprimenti ciascun marcatore di linea nelle diverse colture di MSC in presenza dei diversi LP.

Il grado di purezza e la caratterizzazione delle diverse MSC, coltivate in presenza dei diversi LP, sono state valutati al P1 ed al P3 mediante analisi citofluorimetrica dell’espressione dei marcatori specifici di superficie (CD105, CD166, CD90, CD71, CD73. Il grado di purezza si dimostra già rilevante al P1, dove tutti i marcatori sono presenti su almeno il 90% delle MSC ottenute da tutte le colture, in presenza dei diversi LP.

Al P3, il grado di purezza diventa assoluto con l’espressione dei marcatori di linea nel circa 100% delle MSC in tutti i casi analizzati.

I dati del P2 non sono mostrati in figura ma sono risultati sovrapponibili a quelli illustrati per il P3.

L’analisi citometrica ha permesso sia la valutazione della congrua espressione fenotipica delle MSC espanse a partire dai diversi campioni in presenza dei diversi LP sia quella della vitalità cellulare (associata all’analisi dell’antigene MSC specifico CD105). La concomitante analisi di vitalità dimostra come in tutti i campioni ottenuti sia al P1, che al P2 ed al P3 la vitalità cellulare sia costantemente superiore al 95% in tutti i campioni coltivati con LP di controllo od inattivato.

La Figura 5 riporta un esempio di caratterizzazione fenotipica con valutazione della vitalità (7-AAD) associata all’analisi del marcatore CD105 delle MSC4 al P3 in presenza di LP0004 inattivato (a,b,c,d) e LP0003 di controllo (e,f,g,h) che mostra una vitalita’ pari al 95,85 % e al 94,75 % delle MSC4, rispettivamente.

Con i campioni derivati dalle MSC6 (espanse in presenza di LP0003 di controllo e LP0004 inattivato) ed MSC8 (espanse in presenza di LP0003 di controllo e LP0004 inattivato) sono state allestite colture clinical grade su larga scala in sistemi di coltura CellSTACK® CORNING® cell culture chambers le cui lavorazioni sono state eseguite adottando le misure proprie della GMP, ovvero operando in cappe di classe A poste in ambienti di fondo di classe B, con incubazioni in incubatori a 37°C con 5% CO2posti nei medesimi laboratori di classe B. In tali esperimenti sono state osservate espansioni con magnitudine simile a quelle ottenute negli esperimenti su piccola scala ed in particolare gli autori hanno osservato per le MSC6 espanse con LP0003 di controllo un espansione di 98 volte, con LP0004 inattivato di 105 volte e per le MSC8 espanse con LP0003 di controllo un espansione di 110 volte e con LP0004 inattivato di 100 volte.

Sulle popolazioni cellulari ottenute al P3 dagli esperimenti “clinical grade†(MSC6 espanse in presenza di LP0003 di controllo e LP0004 inattivato ed MSC8 espanse in presenza di LP0003 di controllo e LP0004 inattivato) à ̈ stata esaminata la capacità di tali MSC di produrre una differenziazione in vitro in senso osteogenico, adiposo e condrocitico.

In tutti i casi analizzati, le MSC del P3, sia ottenute con LP di controllo che inattivato, hanno mantenuto la capacità di differenziare in 21 giorni lungo la linea dei precursori ossei, adiposi e cartilaginei. La figura 6 mostra un esempio di rivelazione dell’avvenuta differenziazione nei campioni cresciuti in mezzi di coltura differenziativi, rispetto ai controlli cresciuti in terreni standard provenienti dalla linea MSC8, in presenza del LP0003 di controllo o del LP0004 inattivato.

Le colorazioni specifiche, rispetto al controllo non differenziato, dimostrano la specializzazione cellulare ancora ottenibile dalle MSC coltivate in presenza degli LP di controllo ed inattivati. Questo testimonia della preservata capacità funzionale delle MSC selezionate ed espanse e giunte al punto sperimentale P3.

Risultati simili di avvenuta differenziazione in senso osteogenico, adiposo e condrocitico sono stati ottenuti con il LP0003 di controllo ed il LP0004 inattivato sulla linea MSC6. Come già illustrato, le MSC6 ed MSC8 sono state espanse e portate al P3 anche con procedure su vasta scala “clinical grade†e, essendo quantitativamente abbondanti, sono state anche utilizzate per valutare il potenziale biologico di tali cellule dopo averle sottoposte a procedure di congelamento/scongelamento con procedure ottimizzate di discesa controllata della temperatura, in presenza di crioprotettore, e conservazione temporanea in vapori di azoto per 3 mesi.

Subito dopo lo scongelamento ed i lavaggi per la rimozione del crioprotettore, le MSC6 ed MSC8 scongelate (per tali ulteriori esperimenti sono state utilizzate le MSC6 e MSC8 espanse fino al P3 con il LP0004 inattivato) sono state caratterizzate per la vitalità ed il loro fenotipo e tali accertamenti hanno potuto dimostrare una vitalità sempre superiore all’85 % ed un fenotipo totalmente coerente con la linea di appartenenza, data una frequenza sempre superiore al 95% degli elementi cellulari esprimenti i marcatori CD105, CD166, CD90, CD71, CD73.

Le stesse MSC scongelate sono state poi sottoposte ad un nuovo ciclo di espansione in vitro ove si à ̈ ottenuta una condizione di crescita e di confluenza paragonabile a quanto osservato dal P2 al P3 per le medesime cellule, con amplificazioni di ulteriori 100 (MSC6) e 105 (MSC8) volte in presenza del LP0003 di controllo e di 105 (MSC6) e 120 (MSC8) volte in presenza del LP0004 inattivato.

Le MSC ri-espanse a partire dalle MSC8 sono state indotte alla differenziazione in senso osteogenico, adiposo e condrocitico ottenendo risultati sovrapponibili in termini di specializzazione cellulare (rivelata dalle colorazioni specifiche precedentemente mostrate) a quelli osservati per le stesse MSC8 non congelate, con paritetica capacità differenziativa sia per le MSC8 ri-espanse in presenza del LP0003 di controllo sia ri-espanse in presenza del LP0004 inattivato.

In nessun campione di MSC ai vari P1, P2 e P3 ed in nessuna condizione sperimentale di crescita cellulare, sia su piccola scala, sia “clinical grade†su vasta scala, sia in presenza degli LP di controllo, sia degli LP inattivati gli autori hanno osservato alterazioni del cariotipo delle MSC. L’assenza delle condizioni descritte à ̈ stata dimostrata anche per tutte le MSC ri-espanse dopo le procedure di congelamento/scongelamento.

La presente invenzione dimostra la possibilità di preparare un LP sottoposto ad inattivazione dei patogeni a partire da un pool di più donatori di sangue (nell’esempio 12) le cui unità donate vengono sottoposte ai test di qualificazione del caso ed a un processo di lavorazione che estrae ed assembla in 2 iniziali semi-prodotti (nell’esempio due pool distinti da 6 donatori) ciascuna sospensione piastrinica in soluzioni di conservazione e ridotte quantità di plasma. I due semi-prodotti sono poi sottoposti al processo d’inattivazione ai patogeni mediante il sistema Intercept ® includente un’illuminazione con raggi UVA, riunificati con sistemi atti al mantenimento della sterilità e della continuità dei circuiti, sottoposti a 3 cicli di congelamento/scongelamento per la lisi piastrinica, centrifugati e risospesi per l’allontanamento degli stromi ed aliquotati in sacche sterili etichettabili, conservabili a -80°C e contenenti circa 3 dosi di LP per colture di MSC su vasta scala. Il processo di produzione à ̈ stato condotto in ambienti protetti di classe C (vedi metodi) ed utilizzando sistemi di connessione sterile. Questi provvedimenti, unitamente al processo d’inattivazione ai patogeni nei LP di studio, hanno permesso l’ottenimento di prodotti sempre sterili e privi di endotossine e quindi atti al rilascio per uso su scala clinica. L’analisi qualitativa dei LP inattivati, comparati a prodotti gemelli non inattivati, ha mostrato:

-una sostanziale equivalenza dei prodotti in termini di concentrazione di fattori ad azione trofico-rigenerativa quali il PDGF, il VEGF, TGF-beta e basic FGF;

-un’equivalenza nell’ambito funzionale inteso come la capacità di selezionare ed espandere linee di MSC ottenute da diversi donatori (valutati in parallelo con LP non inattivati) con fenotipo coerente ed omogeneo; e

-capacità differenziativa intatta in senso osseo, adiposo e condrocitico.

Le MSC ottenute con i LP inattivati sono anche passibili di congelamento vitale e conservazione in vapori d’azoto per 3 mesi, mantenendo intatte le loro capacità di espansione se ri-sottoposte all’azione dei LP inattivati. I risultati presentati e discussi appaiono, sia per gli LP di controllo, che gli LP inattivati, comparabili a quelli già riportati in letteratura ove nei LP descritti sono riscontrabili simili livelli di fattori trofici, simile capacità di sostenere la crescita delle MSC con espansione di circa 100-200 volte degli elementi di partenza e simile capacità differenziativa dopo espansione della crescita cellulare (3,4,10,11) .

Nello specifico, la presente invenzione dimostra come un processo d’inattivazione con agente fotochimico preserva le proprietà trofiche, le capacità funzionali e di stimolo del LP utilizzato per la selezione ed amplificazione di MSC fenotipicamente valide, intatte nel potenziale differenziativo e criopreservabili.

Pertanto, il prodotto della presente invenzione, anche definito “Lisato piastrinico plasma povero da mini-pool inattivato ai patogeni†si dimostra realizzabile, efficace e potenzialmente scevro da contaminanti che possano generare trasmissione di malattie da agenti virali, microbici, fungini o parassitari.

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Claims (10)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo per la preparazione di lisato piastrinico privo di agenti contaminanti comprendente le fasi di: a) isolare la frazione buffy-coat da sangue intero ottenuto da almeno due soggetti; b) esporre la frazione buffy-coat isolata ad un agente fotochimico e a raggi UV in condizioni tali da ottenere una frazione buffy-coat isolata e priva di agenti contaminanti; c) sottoporre ad almeno un ciclo di congelamento/scongelamento detta frazione tale da ottenere una lisi delle piastrine contenute nella frazione buffy-coat; d) centrifugare detta frazione e prelevare la fase liquida.
2. 2. Metodo secondo la rivendicazione 1 in cui l’agente fotochimico à ̈ uno psoralene.
3. 3. Metodo secondo la rivendicazione 2 in cui lo psoralene à ̈ l’amotosalen.
4. 4. Metodo secondo una qualsiasi rivendicazione da 1 a 3 in cui l’agente fotochimico à ̈ utilizzato a una concentrazione finale di 150 umol/L.
5. 5. Metodo secondo una qualsiasi rivendicazione da 1 a 4 in cui i raggi UV sono UVA.
6. 6. Metodo secondo la rivendicazione 5 in cui l’esposizione ai raggi UVA à ̈ di 3 J/cm2.
7. 7. Lisato piastrinico privo di agenti contaminanti ottenibile con il metodo secondo una qualsiasi rivendicazione precedente.
8. 8. Uso del lisato piastrinico privo di agenti contaminanti secondo la rivendicazione 7 come coadiuvante per la crescita e/o l’espansione di cellule staminali.
9. 9. Uso secondo la rivendicazione 8 in cui le cellule staminali sono mesenchimali.
10. 10. Uso secondo le rivendicazioni 8 o 9 in cui il lisato piastrinico privo di agenti contaminanti à ̈ aggiunto al mezzo di coltura di dette cellule ad una concentrazione tra 5% e 10%.