CN113924361A - 从全血中扩增成体干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
从血液中扩增成体干细胞的方法，包括对血液样本的成体造血干细胞进行生长和去编程，所述方法是用基于PRP的血液衍生物产品对血液样本进行体外处理，所述血液衍生物产品包括由相同自体血液样本的一部分通过血小板裂解获得的自体MCSF。
Description
技术领域
这里描述的实施方案涉及一种从成年哺乳动物的全血，特别是，但不限于，从外周血中扩增成体干细胞的方法，以及在医疗领域的相应应用，特别是在人类或兽医学中用于治疗损伤、外部损伤、内部损伤、肌腱损伤、韧带损伤、软骨损伤、骨折，以及治疗和或预防慢性和/或急性炎症病变、神经系统和神经退行性病理学(病变)、心脏病理学、肿瘤病理学、自身免疫病理学、眼科病理学和遗传性病变。
此处和之后的描述中，正如文献中所已知的那样，"扩增"指的是增加细胞数量的过程，可以是通过细胞分裂，也可以像此处描述和要求保护的具体方案那样，通过"去分化(de-differentiation)"或"去编程(de-programming)"来增加细胞数量的过程，也就是说，血液中的一些细胞在适当的体外处理后重新转变为干细胞的过程，如下文所述。
背景技术
近年来，干细胞在医疗中的使用已经获得了广泛的共识，但除了从血液中获得的干细胞外，所获得的治疗效果远远低于预期。
事实上，许多已知的获取干细胞的方法已被证明是耗时、费力、昂贵的，效果有限，有时还有副作用。
我们有胚胎干细胞和成体干细胞：前者来自8天的囊胚，另一方面，成体干细胞主要可以从骨髓、脂肪组织、肌肉组织、外周血和脐带中获得。
干细胞的定义一直在不断演变。对于所有这些细胞，胚胎干细胞(ES)和成体干细胞，包括造血干细胞(HSC)和间(充)质干细胞(MSC)(Kuwana M.,et al.,2003)，已经识别出不同的遗传标记，其中一些是许多细胞类型所共有的(Condomines M,et al.,2006；KangWJ,et al.,2006；Zhao Y.et al.,2003；Rabinovitch,M.et al.1976)。
另一方面，为了识别多能干细胞(Pluripotent Stem Cells，PSCs)，胚胎干细胞和成体干细胞，要考虑一些细胞内转录因子的表达(Sox2、Oct3/4和Nanog)。
最初，研究的方向是胚胎衍生的干细胞，因为它们是多能的，也是可以定性和定量的，因此适合进行实验研究，但伦理问题，尤其是由于会产生禁忌症肿瘤，导致它们被搁置。因此，如今成体干细胞是优选的。
来自另外个体的成体干细胞(同种异体)经常出现严重的排异现象，因为它们不被接受为"自体"。这主要影响到几乎完全作为异体干细胞使用的脐带干细胞。
诱导多能干细胞是通过病毒或不通过病毒，将胚胎干细胞的多能性因子转移到成体干细胞的过程中产生，由于存在与胚胎干细胞类似的禁忌症和高成本，因此不适合用于治疗。
目前，在人类中，已经接受通过一种称为“清血法(apheresis)”或"白细胞单采术(leukapheresis)"的过程从外周血中获得干细胞。干细胞从血液中提取、收集，然后在化疗或放疗后立即接种到患有某些白血病的病人身上。这些干细胞是造血细胞，因此它们只与血液中的病变发生相互作用。
在持续6至8个小时的清血法中，从手臂静脉或颈部或胸部的静脉中抽取血液，并通过一台机器分离干细胞。以这种方式纯化的血液返回给病人，而收集的细胞则在液氮中冷藏保存(Condomines M，等，2006；Kang WJ，等，2006)。这种技术，不仅痛苦，而且对患者也非常有压力。它提供了生长因子的体内接种，以刺激干细胞从骨髓释放到血液中，无法真正区分/或纯化循环中的干细胞。
现今，从监管的角度来看，这些细胞被允许用于治疗专属于血液的病症。
现今被引入市场以治疗不同病症的干细胞是成体干细胞，主要是从骨髓和脂肪中获得的间质干细胞。然而，它们有一些局限性：
-侵入式取样，骨髓干细胞需要通过钻取骨髓，而脂肪干细胞则需要通过手术取样。
-由于它们的间质衍生性，只具有能与某些组织发生相互反应的能力。
-当投入培养以获得足够的数量用于治疗时，它们开始分化成其他类型的细胞，显示出总是不同的膜受体，因此不能被定性和定量，而这些是对于人体实验研究必不可少的特征。
另一种已知的方法是由Zhao Y.等人在《人外周血单核细胞衍生的亚群充当多能干细胞》(A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotentstem cells)这一文章和WO-A-2004/043990中描述的。这是一种由单核细胞制备干细胞的方法，它包括如下步骤：从外周血中分离出单核细胞，使其与有丝分裂成分接触，随后在适合细胞繁殖的条件下对外周血中的单核细胞进行培养。
这种方法最初需要分离单核细胞，然后在培养基中进行扩增，要获得大量的干细胞，时间非常长，大约15-20天，而且不能获得多能干细胞。
同样在从单核细胞制备干细胞的架构内，已知的还有WO-A-2005/046570、WO-A-2007/131200和WO-A-03/083092描述的方法。然而，即使是这些文件中描述的方法，由于它们必须对血液进行初步纯化，以便只分离出部分细胞，即单核细胞，并随后进行扩增以获得所需的干细胞，因此需要很长的时间，一般是在15-40天左右，才能获得可接受数量的干细胞。
以本申请人名义申请的WO-A-2008/034370申请也是已知的，在此引入全文作为参考，它涉及使用MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)扩增来自血液中的成体干细胞的方法。这种已知的方法使用浓度在8nM和15nM之间的MCSF在血液抽取后进行体外处理，并随后进行纯化，优选利用Ficoll梯度进行分馏，从而使血液成体干细胞生长。所述方法还可以通过使用浓度在35nM和55nM之间的MCSF进行体外处理，使纯化的外周血干细胞生长。
所述方法的有效性体现在CD90、CD90/34、CD34和CD117干细胞标记物的存在和识别，以及干细胞在分裂或扩增后不会失去"自体"识别因子的事实。这些干细胞不会产生一旦在病人身上施用就会出现的副作用，如排异现象、感染、畸胎瘤，它们能够在体内分化，并表现为多能干细胞。
发明人发现，这样通过分裂或扩增生长的细胞，一旦局部或静脉注射，就能在体内获得(而不是像现有技术中已知的方法那样，通过适当的生长因子和/或化学刺激而体外获得(Gulati R.等人，2003年；Katz RL等人，2002年；Okazaki T.等人，2005年))，根据所治疗的生物体的需求和病症，获得巨噬细胞、淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞和肝细胞的所有形态和化学特征。所述方法比迄今为止用于收集干细胞的其他方法侵入性更小，无痛(相对于清血法)，经济上也更可行。
最后，由于可以很容易地获得这些细胞，并且之后能够长期保存，例如在液氮中冷藏，使得用已知方法获得这些细胞适合于自体移植和治疗许多病症(不同种类的病变、代谢性疾病、急性和慢性神经和炎性病症)。
此外，本申请人申请的WO-A-2009/115522号文件也是已知的，在此全文引入作为参考，它涉及一种用于收集血液，最好是外周血，以生产多能干细胞的试剂盒，包括适合容纳所收集血液的容器，其中含有抗凝血剂和MCSF物质(巨噬细胞集落刺激因子)。这个试剂盒可以在WO-A-2008/034370中描述的方法范围内使用。
然而，本申请人发现，在实施WO-A-2008/034370中描述的方法时，干细胞要经过各种处理和操作步骤，如消除红血球、干细胞相对于其他血液成分的纯化，相对于造血干细胞和间质干细胞而言获得更大量的多能干细胞，对其进行培养，分化成其他细胞类型，这些都会对由此获得的成体干细胞产生压力，它们虽然保持活力，但效力较低，潜在能量和信息能力下降。
在兽医领域，有不同的技术和设备来生产干细胞，特别是浓缩来自脂肪、骨髓的干细胞并获得生长因子。
然而，对于干细胞，第一个障碍是难以收集；事实上，如前所述，要从骨髓中获得干细胞，必须钻骨或穿透胸骨，而要从脂肪中获得干细胞，可能需要进行缝合的真正的外科手术，或者，即使不需要这种干预，它也总是构成一种侵入性技术。
然后还有后勤方面的复杂性：传送样本和接收干细胞，保持它们的活性和稳定性。
其他障碍包括人工技能、迄今使用的所有成体干细胞的成本和准备时间。
这些困难，加上临床效果不佳，几乎使干细胞从兽医临床实践中完全消失，只有少数兽医继续还在继续使用，主要用于实验目的。
WO-A-2008/034370中描述并且各种科学出版物中报道的细胞制备方法能够对获得的干细胞进行定性和定量，确认其多能性特征。它也比迄今为止使用的技术容易得多，因为取样很简单——几毫升的血液即可，也因为细胞不需要被培养。
然而，这个系统可以被改进，克服将样本运到实验室、随后用MCSF去编程(de-programming)和重新送至进行治疗的设施内等方面的障碍，以便在人类临床实践中使用干细胞。另一个限制是用WO-A-2008/034370中描述的方法对从血液中获得的干细胞进行完全纯化，这使得异体接种的安全性更高。事实上，为消除红血细胞而进行的纯化和处理，以及细胞在分拣机中的通过(用于鉴定)，对所获得的干细胞产生了相当大的压力，导致它们失去了部分的治疗能力。因此，非常有必要将对血液的操作减少到最低限度，以获得有效的干细胞，从而达到更好的效果。
用已知方法，获得的干细胞的现有所有疗法的另一个限制，包括WO-A-2008/034370中描述的方法，是它们需要有专门的实验室存在。
此外，WO-A-2008/03374号文件是已知的，它描述了将干细胞移植到之前没有受到免疫抑制的病人身上的方法和组合物。
以下科学文章也是已知的：
-Spaas J.H.、Gambacurta A.、Polettini M.Broeckx S.等人，《马外周血干细胞的纯化和扩增及临床应用》，第80卷，第2期，第129-135页，互联网可检索的网址为：http://hdl.handle.net/1854/lu-1215157。
-G.E:Garber等人，《臭氧治疗人类免疫缺陷病毒感染和免疫性疾病的治疗及血液的使用：安全性和有效性的研究》，AIDS，1991年1月1日，第981-984页，互联网上可检索的网址为：http://graphics.tx.ovid.com/ovftpdfs/FPDDNCFBHADJCP00/fs047/ovft/live/gv039/00002030/00002030-199108000-00009.pdf；
-Larini等人，“臭氧作用分离周边血液单核细胞”，体外毒理学,ElsevierScience,GB,vol.19,no.1,1February 2005,pages 55-61。
以本申请人名义提交的国际申请WO-A-2015/170291也是众所周知的，其中描述了一种扩增来自血液中的成体干细胞的方法，其中包括通过用MCSF体外处理血液样本和对血液样本进行臭氧处理，使抽取的血液样本的成体干细胞生长和去编程。
因此，有必要提供一种改进的从全血中扩增成体干细胞的方法，所述方法至少可以克服本领域现有技术的一个缺点。
申请人已经设计、测试和例举了本发明，以克服现有技术的缺点，并获得这些和其他目的和优点。
除非另有定义，这里和下面使用的所有技术和科学术语具有本申请所属技术领域中具有普通经验的人通常理解的相同含义。
在本申请的实践或验证试验中可以使用与这里描述的方法和材料相似或等效的方法和材料，下面仅以例举的方式描述这些方法和材料。如果出现冲突，则以本申请为准，包括定义。这些材料、方法和实施例纯粹是说明性的，不应该以限制性方式理解。
发明概述
本发明在独立权利要求中进行了阐述和描述，而从属权利要求描述了本发明的其他特征或对主要发明思想的变体。
根据上述目的，一种从血液中扩增成体干细胞的方法，它克服了现有技术的局限性，并消除了其中存在的缺陷，包括
-提供一个全血液样本；
-从全血液样本的第一部分获得富含血小板的血浆(Platelet Rich Plasma,PRP)，并使PRP中含有的血小板裂解，获得基于PRP的血液衍生物产品，其中含有生长因子，包括自体MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)；
-体外处理，将含有包括MCSF在内的生长因子的基于PRP的血液衍生物产品与全血液样本的剩余部分接触，触发全血液样本中存在的成人造血干细胞的生长和去编程。
有利的是，本发明允许从血液样本中获得多能成体干细胞，而无需处理血液样本，不添加或仅以有限的方式添加具有生物体外部或外部来源的成分，并且没有可能产生副作用风险，因为为了使血液样本中存在的成体血干细胞生长和去编程，即扩增，使用了基于PRP的血液衍生物产品，其中含有自体MCSF，有利地来自同一血液样本。
申请人已经发现，存在于生长因子中的自体MCSF的数量，通过裂解根据这里描述的方法获得的PRP中所含的血小板而释放出来，使存在于全血液样本中的成体干细胞在体外接受处理时得以生长和去编程。通过这种方式，有可能在很大程度上，如果不是完全地，取代现有技术中使用的不衍生于自体干细胞的MCSF。这样一来，随后使用这样处理过的血液样本，其中有扩增的干细胞，在实践中可与自体输血相媲美，从而克服了由于可能的副作用而产生的风险和禁忌，这些副作用是因为例如细菌来源生长因子，并因此是生物体外因素而导致的，同时也克服了许多官方和监管方面的限制，这些限制可能阻碍了对病人的治疗应用。
因此，有利的是，全血液样本是病人的自体血液样本。
根据可能的实施方案，血小板的裂解释放出包含在PRP的血小板中的生长因子，其中有利的是包括MCSF。
根据可能的实施方案，血小板的裂解是通过离心全血液样本的第一部分来实现的。
根据可能的实施方案，所述方法使用通过离心得到的血浆，其中，作为血小板裂解的结果，包含在血小板中的生长因子，其中有利地包括MCSF，已被释放。
根据进一步的实施方案，为了使血液样本中存在的成体造血干细胞生长和去编程，可以将血液样本不仅添加到包括自体MCSF的自体PRP血液衍生物产品中，而且还添加到通常是从细菌细胞中获得的不同来源的MCSF中。这样是有利的，因为自体PRP血液衍生物产品中天然含有的MCSF数量可能因人而异，因此在某些情况下，可能不足以让存在的成体干细胞生长和去编程。然而，由于本发明，与已知技术相比，有可能向生物体内添加较少数量的外源性MCSF，这要归功于来自同一血液样本的基于PRP的血液衍生品的自体生长因子中存在的自体MCSF。换句话说，使用根据本方法获得的基于PRP的血液衍生物产品中所包含的自体MCSF，减少了外源性MCSF的数量，特别是细菌来源并因此也是生物体外的MCSF，这对被治疗的血液样本中存在的成体干细胞的生长和去编程是必要的。
根据进一步的实施方案，所述方法规定在获得的全血液样本中存在抗凝血剂。
根据进一步的实施方案，所述方法规定在将血液样本分成多个部分之前对其进行臭氧处理，或在血液样本接受体外处理时，或在血液样本接受体外处理后对其进行臭氧处理，或这些可能性的组合。
有利的是，臭氧处理对被处理的血液样本中可能存在的外源性和/或内源性污染有杀菌作用。特别是，如果待处理的血液样本中存在病原体，那么根据本文所述方法处理的血液样本由于处理的血液样本中因待处理的生物组织引入/接种而带来的待处理的包含自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品中存在的病原体而产生问题。相反，由于臭氧的完全灭菌作用，血液样本被灭菌，导入/接种变得更加安全。此外，臭氧对血液样本中的成体干细胞的生长和去编程，即扩增，具有有利的催化作用。
根据可能的实施方案，所述方法规定在用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品体外处理全血液样本之前，对血液样本进行臭氧处理。通过这种方式，成体造血干细胞的生长和去编程是在已经臭氧化的血液样本中进行的。
根据其他可能的实施方案，所述方法规定在用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理时，对血液样本进行臭氧处理。特别是，用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品的处理，可以在臭氧处理期间对血液样本进行。
根据进一步的可能实施方案，所述方法包括在用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理后，对血液样本进行臭氧处理。特别是，在对血液样本进行臭氧处理之前，可以用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品对其进行处理。
根据可能的实施方案，可与本文描述的所有实施方案相结合，所述方法中，所述臭氧处理步骤对血液样本提供O2-O3的混合物。
根据可能的实施方案，可以与本文描述的所有实施方案相结合，所述方法中，血液/O2-O3混合物的体积比等于1：1。
根据可能的实施方案，可与本文描述的所有实施方案相结合，所述方法中，在所述血液样本中O2-O3混合物的量大于或等于约1微克/升(mcg/l)。
根据可能的实施方案，可与本文描述的所有实施方案相结合，在所述方法中，血液样本中O2-O3混合物的量能够在约1微克/毫升至约42微克/毫升的范围内选择。
根据可能的实施方案，可与本文描述的所有实施方案相结合，所述方法中，包括向血液样本中加入抗凝剂。
根据可能的实施方案，可以与本文描述的所有实施方案相结合，所述方法中，提供使用收集血液的试剂盒，所述试剂盒包括至少一个能够至少容纳所抽取的血液的容器，其中至少包含基于PRP的自体血液衍生物，其中包括自体MCSF。
根据可能的实施方案，可以与本文描述的所有实施方案相结合，所述方法中，所提供和处理的血液样本量包括10毫升至1000毫升，特别是10毫升至500毫升，更特别是15毫升至250毫升，甚至更特别是20毫升至150毫升。样品的一个可能的实例是100毫升。
根据可能的实施方案，可以与本文描述的所有实施方案相结合，所述方法中，通过用含有自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理的生长和去编程的时间，包括4小时至120小时，特别是24小时至96小时，更特别是24小时至72小时，甚至更特别是36小时至72小时之间。
本文描述的实施方案还涉及含有成体干细胞的血液样本，所述样本可通过根据本描述的方法获得。
根据可能的实施方案，所述血液样本被提供用于病症的治疗和/或预防性处理，例如通过自体导入/接种、局部或静脉注射。
根据可能的实施方案，血液样本被提供用于治疗性治疗，包括治疗病变、外部病变、内部病变、肌腱病变、韧带病变、软骨病变、骨折的治疗和/或预防慢性和/或急性炎症病变、神经和神经退行性病变、心脏病变、肿瘤病变、自身免疫性病变、眼科病变和遗传病变。
根据可能的实施方案，血液样本被提供用于治疗，所述治疗提供静脉内或动脉内或局部给药(例如皮下、肌肉内或组织内)所述血液样本，所述血液样本经包括自体和臭氧化的MCSF的基于PRP的血液衍生物产品处理。
根据其他可能的实施方案，血液样本被提供用于治疗，所述治疗提供静脉内或动脉内或局部给药(例如皮下、肌肉内或组织内)经包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品处理的血液样本和患者的全身臭氧处理。
本文描述的实施方案还涉及一种试剂盒，包括至少一个容器，其中包含可通过根据本文描述的方法获得的成体干细胞的血液样本。
参照下面的描述和所附的权利要求书，可以更好地理解本文公开的这些和其他方面、特点和优点。
在可能的情况下，本说明中描述的各方面和特征可以单独应用。这些单独的方面，例如所附权利要求书中描述的方面和特征，可以成为分案申请的主题。
可以理解的是，在专利申请过程中发现的任何已知的方面或特征，不会提出权利要求保护，并应成为放弃的对象。
发明详述
我们现在将详细描述本发明的各实施例。每个实施例都是以说明本发明的方式提供的，不应理解为对本发明的限制。例如，当如此显示或描述的特征是一个实施例的一部分时，它们就可以在其他实施例上采用，或与其他实施例相结合，以产生另外的实施例。可以理解的是，本发明应包括所有这些修改和变体。
在描述这些实施例之前，我们还必须澄清，本描述在本申请中并不限于以下描述的各部分的构建和配置。本描述可以提供其他的实施方案，并且可以通过各种其他方式获得或实施。我们还必须澄清，这里使用的短语和术语仅用于描述的目的，不能被视为限制性的。
诸如"约"、"一般"、"基本上"等术语应理解为具有修改某个术语或数值的功能，所述术语或数值不是绝对的，但在本现有技术中没有报道。这类术语应根据具体情况和它们所要修改的术语，按照特定领域对这类术语的普遍接受程度来定义。它们应至少考虑到预期的为测量某一数值而采用的特定技术的实验误差、技术误差和仪器误差程度。除非另有说明，在本说明中，诸如"a"、"an"和"one"等表示为“一”的单数形式应理解为包括复数形式，除非上下文另有提示。
除非另有说明，本文所给出的所有区间应理解为包括极端值，包括那些在两个值"之间"的端点值。
除非另有说明，本说明还包括由两个或多个描述的区间联合或重叠产生的区间。
除非另有说明，本说明还包括从多个不同点取两个或更多个值得到的组合中得出的区间。
除非另有定义，否则此处和此后使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域中具有普通经验的人通常理解的含义相同。即使在实践中和本发明的试验中可以使用与这里描述的方法和材料相似或等效的方法和材料，以下所描述的这些方法和材料也仅作为实施例例举。如果发生冲突，应以本申请为准，包括其定义。这些材料、方法和实施例纯粹是为了说明问题，不应限制性地理解。
这里描述的实施例涉及一种从血液中扩增成体干细胞的方法，该方法包括：
-通过用基于PRP的血液衍生物产品对血液样本进行体外处理从而实现血液样本的生长和去编程，所述产品包括含有自体MCSF的生长因子，这些生长因子是从部分血液样本获得的PRP中含有的血小板裂解中获得。
特别是，血液可以是全血，更特别是外周全血，即存在于血管(动脉、静脉、毛细血管)的血液。
有利的是，当PRP衍生的血液衍生物产品与血液样本的剩余部分接触时，为了触发所含成体干细胞的生长和去编程，生长因子的释放和扩散也在继续，其中生长引子包括自体的MCSF，存在于经裂解的血小板中，因此进一步富集了由此处理的血液样本。
有利的是，离心操作第一部分的全血液样本可以用来获得血小板的裂解，这引起血浆的分离和血小板的裂解。离心操作也是获得PRP的有利操作。裂解后的血小板可以将其中的生长因子(有利地包括MCSF)释放到血浆中。富含血小板和生长因子的血浆，包括自体的MCSF，在这些实施方案中，构成了基于PRP的血液衍生自体产品。
从本质上讲，本发明主要使用了由于PRP的血小板裂解而释放的生长因子中所包含的MCSF，也就是在所提供的血液样本中天然含有的MCSF，代替了外源性的MCSF或其他生长因子，特别是来自细菌细胞的那些。
特别是，本发明使用了PRP，其血小板经裂解后释放出各种生长因子，包括MCSF和其他生长因子，进入如通过离心法获得的血浆，作为基于PRP的血液衍生自体产品。在这种情况下，存在于PRP中并由于其血小板被裂解而释放的生长因子，包括MCSF，最好是从自体血液中获得，即来自同一病人，并在一定时间内与全血液样本重新接触，以使其中包含的成体干细胞去编程和生长。
有利的是，主要使用PRP中由于血小板裂解而释放的自体生长因子中的MCSF，而不是细菌来源的MCSF，排除了或最大限度地减少了处理血液的最低操作。
本发明规定使用基于PRP的血液衍生物产品中包含的自体生长因子，包括自体MCSF，而不是完全使用生物体外源性MCSF或其他外源性生长因子，特别是来自细菌细胞的生长因子，既避免了或大大减少了对血液样本的干预和操作，如添加来自细菌细胞的外源成分，也避免了由于使用外源物质而可能产生副作用的潜在风险。
根据一些实施方案，存在于从第一部分血液样本中获得的PRP中的血小板裂解能够用任何一已知的方法获得。
根据本发明的一些实施方案，获得基于PRP的血液衍生物产品，其中存在于血小板中的生长因子，包括MCSF，作为裂解的结果被释放出来，可以通过离心全血液样本的部分而发生。
根据优选的实施方案，基于PRP的血液衍生物产品可以通过离心处理所述部分血液而得到。根据可能的实施方案，本文所述的方法可以包括例如一次离心。根据实施方案，离心可以进行3至9分钟，特别是5至7分钟，速度为800至1200rpm(每分钟转数)，特别是900至1100rpm。作为非限制性的实例，所述方法可以包括以1000转/分钟的速度进行6分钟的单一离心。
根据一些实施方案，所述方法规定在提供的全血液样本中存在抗凝血剂。
根据进一步的实施方案，所提供的抗凝剂优选为柠檬酸钠。
根据一些实施方案，用于获得PRP的部分能够是所提供的总血液样本的大约一半。
根据可能的实施方案，部分血液样本在任何情况下都可以根据所提供的血液样本的体积来选择。
根据一个变体，也有可能引入外源性的MCSF，特别是细菌来源的MCSF，但有利的是，其数量比现有技术中提供的要少，因为已经存在自体的MCSF，作为血小板裂解的结果，从PRP中释放的自体生长因子自然存在。有利的是，在这种变体中，在任何情况下都可以减少生物体外的MCSF的数量，由此减少可能的副作用。
根据一些实施方案，所述方法可以用非自体的生长因子，例如细菌来源的MCSF来补充基于PRP的血液衍生物产品。特别是，优选的补充生长因子可以是细菌来源的MCSF，其浓度例如在0.5nM到4nM之间，特别是在1nM到4nM。
根据一些实施方案，基于富血小板血浆(PRP)的血液衍生物自体产品含有以下自体生长因子：b-NGF(神经生长因子β)、EGF(表皮生长因子)、FGF-2(碱性成纤维细胞生长因子)、FGF-4(成纤维细胞生长因子4)、FGF-6(成纤维细胞生长因子6)、FGF-7(成纤维细胞生长因子7)、GCSF(粒细胞集落刺激因子)、GDNF(胶质细胞衍生神经营养因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)、HB-EGF(肝素结合EGF样生长因子)、HGF(肝细胞生长因子)、IGF-I(胰岛素样生长因子)、IGF-II(胰岛素样生长因子2)、MCSF(巨噬细胞集落刺激因子)。可能地，基于富血小板(PRP)的血液衍生物自体产品还含有以下自体生长因子：NT-3(神经营养素-3)、NT-4(神经营养素-4)、PDGF-AA(血小板衍生的生长因子-AA)、PDGF-AB(血小板衍生的生长因子-AB)、PDGF-BB(血小板衍生的生长因子-BB)、SCF(干细胞因子)、TGF-α(转化生长因子-α)、TGF-β(转化生长因子-β)、TGF-β2(转化生长因子-β2)、TGF-β3(转化生长因子-β3)、VEGF(内皮细胞生长因子)、VEGF-D(内皮细胞生长因子-D)。
根据本发明的一些实施方案，将包括自体MCSF的PRP衍生的血液衍生物产品，可能辅以生物体外的生长因子，例如细菌来源的，进行组合和混合，以在体外处理剩余全血的相应部分。在这种情况下，有利的是，包含在已裂解的血小板中的生长因子继续被释放并在血液样本中传播。
例如，全血液样本的分份可以规定，第一部分是所提供的血液样本的大约一半。剩下的部分，例如大约一半，可以依次分成几份，每份都可以加入所获得的基于PRP的血液衍生物产品，以触发存在的成体血液干细胞的生长和去编程。
根据一些实施方案，处理方法可以提供将基于PRP的血液衍生物产品与全血的各自剩余部分混合，这最好是在玻璃容器中以循环运动的方式(circular movement)进行。
根据可能的实施方案，可以与这里描述的所有实施方案相结合，所述方法提供的体外处理时间包括4小时至120小时，特别是24小时至96小时，更特别是24小时至72小时，甚至更特别是36小时至72小时。
根据进一步的实施方案，所述方法还提供血液样本的臭氧处理。
因此，本发明允许从提供的血液样本中获得多能成体干细胞。
申请人发现，应用本文所述方法获得的干细胞包括干细胞标记物CD90、CD90/34、CD34和CD117，它们还表达一些与多能性特征密切相关的细胞内转录因子(Sox2、Oct3/4和Nanog)，并且在分裂或扩增后不会丢失自我识别因子。这些干细胞不会产生一旦在病人身上使用就会产生的副作用，如排异现象、感染、畸胎瘤，它们能够在体内分化，因此表现为多能干细胞。
所谓"通过用包括自体MCSF的PRP型血液衍生物产品对血液样本进行体外处理，使血液样本的成体干细胞生长和去编程"，是指用包括自体MCSF的PRP型血液衍生物产品对本身含有一定量成体干细胞的血液样本进行体外处理，通过对白细胞系即白血球去编程，获得血液样本中原来存在的成体干细胞的生长。
此外，需要强调的是，这里表达的"臭氧"是指用臭氧处理血液样本，即向血液样本中添加、输送、施用或混合臭氧，或氧气和臭氧的混合物。
臭氧(符号O3)是氧的一种同素异形体，具有三原子的分子，分子量为48。臭氧在正常情况下是一种蓝色的、有刺鼻气味的气体，具有强氧化能力。臭氧可以作为消毒剂、除臭剂、杀菌剂、消毒剂，或在许多有机合成中作为氧化剂。
根据可能的实施方案，血液样本的臭氧处理可以在用基于PRP的血液衍生物产品处理之前进行。
根据可能的实施方案，血液样本的臭氧处理可以与基于PRP的血液衍生物产品的处理同时进行。
根据进一步的可能的实施方案，血液样本的臭氧处理可以在用基于PRP的血液衍生物产品处理后进行。
根据可能的实施方案，规定向血液样本添加抗凝剂。肝素、EDTA或柠檬酸钠是可能的抗凝剂的实例。
在一些实施方案中，根据本描述的方法可以提供使用用来收集血液的试剂盒，用于根据上述方法生产多能干细胞，所述试剂盒包括至少一容器，如试管，适合容纳血液样本，其中包含基于PRP的血液衍生物产品，如果需要，可含有抗凝剂。
使用这种类型的试剂盒，就有可能收集全血，最好是外周血，以根据本说明通过上述方法迅速启动干细胞的生长和生产，从而使其生产速度大大加快。
这里描述的实施方案可以规定，收集并根据本文所述方法，即用基于PRP的血液衍生物产品进行生长和去编程，以及可能对血液样本进行臭氧处理的血液样本的数量为几毫升，例如包括10毫升和1000毫升之间，特别是10毫升和500毫升之间，更特别是15毫升和250毫升之间，甚至更特别是20毫升和150毫升之间。一个可能的实例是100毫升。
血液样本一旦经过这里描述的体外处理，例如可以注射到病人的血液循环中(静脉内或动脉内给药)，然后可以随后进行系统性臭氧处理。
一些实施方案，可以与这里描述的所有实施方案相结合，可以提供一种如上所述的方法，所述方法可以使用任何类型的收集容器，在其中引入全血和臭氧与任何类型的可能的抗凝剂，以及任何浓度体积的基于PRP的血液衍生物产品，其中包括自体MCSF。
一些实施方案，可以与这里描述的所有实施方案相结合，所述实施方案可以规定，臭氧处理使血液样本具有O2-O3的混合物。
在可能的实施方案中，申请人发现，血液/O2-O3混合物的体积比可以优选为1：1。
在可能的实施方案中，血液样本中的O2-O3混合物的量可以大于或等于约1微克/升，特别是选择在约1微克/毫升至约42微克/毫升的范围内，更特别是约5微克/毫升至约30微克/毫升，甚至更特别是约10微克/毫升至约20微克/毫升。
这里描述的实施方案规定，将血液在这些条件下可能被臭氧处理，最好是在室温下，经过一定的时间，最好是在4小时到96小时之间，特别是在4小时到72小时之间，更特别是在4小时到48小时之间，这样获得的全血与从去编程中获得的干细胞成分可以完全接种，既可以全身接种(静脉内、动脉内)，也可以局部接种到病变组织或附近。
在可能的实施方案中，通过用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理，生长和去编程的时间可以包括在12小时和120小时之间，特别是在12小时和96小时之间，更特别是在12小时和72小时之间，甚至更特别是在12小时和36小时之间。
在可能的实施方案中，通过用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理，生长和去编程的时间可以包括在24小时和120小时之间，特别是24小时和96小时之间，更特别是24小时和72小时之间，甚至更特别是24小时和36小时之间。
在可能的实施方案中，通过用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理，生长和去编程的时间可以包括在48小时和120小时之间，特别是48小时和96小时之间，更特别是48小时和72小时之间，甚至更特别是48小时和60小时之间。
申请人已设想，通过用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理，对受到生长和去编程的血液样本进行臭氧处理，会刺激成体干细胞的扩增和去编程过程，因此，即使在几小时后也有大量有用的成体干细胞。
这里描述的实施方案还可以提供，除了存在包括自体MCSF的PRP基血液衍生物产品和发生成体干细胞扩增的容器外，使用第二容器来容纳如上所述获得的干细胞，例如在静脉内或动脉内使用的情况下，可能还有第三容器，大小不同，用于局部使用。产生并保存在容器中的干细胞可以立即使用，或者可以保存在例如液氮中，以便随后在有需要时使用。
根据这里描述的实施方案的变体，臭氧处理可以对含有干细胞的血液样本进行，在这些干细胞用基于PRP的血液衍生物产品扩增和去编程之前、期间或之后进行，其中包括自体MCSF，包含在上述的任何一个容器中。
根据可能的实施方案，刚从患者身上抽取的血液可以立即放入带有抗凝剂的试管中。抗凝剂可以阻止凝结的开始。从所述样本中取出第一部分，对其进行处理以获得包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品。后者被放入剩余的血液样本中，快速开始扩增过程，并以确保对患者开始治疗的时间最小化。此外，根据本说明，所述样本可能要经过臭氧处理。
根据进一步的可能实施方案，能够在从病人身上抽取的血液中加入抗凝血剂，以阻断血液的凝结；所述血液经过的保存步骤，不改变其产生干细胞的能力。当需要时，从储存血液的地方取出血液，并进行上述的干细胞扩增程序，即取其第一部分进行处理，以获得基于PRP的血液衍生物产品，其中包括自体MCSF，然后将其加入血液样本的剩余部分，迅速获得必要数量的干细胞。此外，在这种情况下，也要根据本说明对样品进行臭氧处理。
根据本说明的方法可以克服现有技术的缺点并带来许多好处。
例如，本发明允许制备全血并大大简化治疗，避免在实验室中进行任何类型的细胞操作，以及根据有利的变体，避免添加生物体外源成分，如来自细菌细胞的生长因子。特别是，本发明消除了进行处理的需要或可能性，例如消除红血球，相对所有其他血液成分纯化干细胞，相对其他两种干细胞成分(造血和间质)获得更多的多能干细胞，培养它们，使它们分化成其他细胞类型的这些处理。这些额外的处理通常会给所获得的干细胞带来压力，使它们活着，但信息和能量潜力降低。相反，本发明有利地避免了对血液样本的所有进一步处理和操作，因此存在于全血中的成体干细胞能更好地保持其特性，因为它们没有受到压力，而且它们能从在血液中存在其他协助再生过程的元素中受益。
申请人发现，如WO-A-2008/034370所述，利用从血液中获得的干细胞进行去编程，已经取得了良好的效果，而利用全血中的干细胞进行去编程，避免了上述的额外操作和处理，使已进行的对不治之症如心肌变性的治疗有了明显的好结果，所述采用的方法甚至能够用完全包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行生长和去编程，而没有额外的处理步骤，包括纯化、后续扩增，或者可以用包括自体MCSF和进行过臭氧处理的基于PRP的血液衍生物产品进行生长和去编程。
根据这里描述的方法制备干细胞，避免了复杂的实验室准备工作，允许任何医院、诊所或医生通过拥有一个简单的试管来制备干细胞，其中包括如上所述获得的自体MCSF，最好是最小数量的基于PRP的血液衍生物产品。换句话说，只需在一个试管中放入足够量的包含基于PRP的血液衍生物产品的血液样本，其中包括自体MCSF，就有可能治疗和改善甚至严重的病症，例如心脏病发作或帕金森氏病的后遗症。因此，这些结果支持这样一个事实：根据可能的实施方案，扩增血液中成体干细胞的方法甚至可以完全是用包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品对血液样本进行体外处理，由血液样本中的成体干细胞的生长和去编程而进行。
此外，在一些实施方案中，向血液样本中添加或提供臭氧，进行对所述血液样本的臭氧处理，可以对成体干细胞的去编程过程、所获得的干细胞的质量以及它们的信息和能量含量产生催化作用，从而对受损组织的细胞再生产生积极的影响，并使产品在无菌方面具有额外的安全性。事实上，正如我们所说，臭氧可以作为消毒剂或杀菌剂。
很明显，在不脱离本发明的领域和范围的情况下，可以对前述的从全血中扩增成体干细胞的方法进行修改和/或添加。
同样清楚的是，尽管本发明已经参照一些具体的实例进行了描述，但本领域的技术人员肯定能够实现许多其他同等形式的从全血中扩增成体干细胞的方法，这些方法具有权利要求书中规定的特征，并因此都落入由此限定的保护范围内。
Claims (19)
1.从血液中扩增成体干细胞的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
-提供一份全血液样本；
-从所述全血液样本的第一部分获得富含血小板的血浆，即PRP，并使所述PRP中含有的血小板的裂解，获得含有生长因子的基于PRP的血液衍生物产品，所述生长因子包括自体巨噬细胞集落刺激因子，即MCSF；
-体外处理，其中将所述含有包括MCSF在内的生长因子的基于PRP的血液衍生物产品与所述全血液样本的剩余部分接触，触发存在于所述全血液样本中存在的成体造血干细胞的生长和去编程。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血小板的裂解释放出所述血小板中含有的所述生长因子。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述血小板的裂解是由所述全血液样本的第一部分的离心引起。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：使用通过所述离心得到的血浆，在所述血浆中，由于所述血小板的裂解，所述血小板中含有的所述生长因子已被释放。
5.如权利要求3或4的方法，其特征在于：所述方法包括一次离心。
6.如权利要求3、4或5所述的方法，其特征在于：所述离心的时间在3至9分钟之间，特别是5至7分钟之间，转数在800至1200rpm之间，特别是900至1100rpm之间。
7.如权利要求1至6中任一项的方法，其特征在于：所述方法包括在将所述血液样本分成多个部分之前对其进行臭氧处理的步骤，或对经所述体外处理的所述血液样本进行臭氧处理。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所述臭氧处理的步骤对所述血液样本提供O2-O3的混合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：在所述方法中，血液/O2-O3混合物的比例为1：1。
10.如权利要求8或9所述的方法，其特征在于：在所述方法中，在所述血液样本中的O2-O3混合物的量大于或等于约1微克/升。
11.如权利要求8、9或10所述的方法，其特征在于：在所述方法中，在所述血液样本中的O2-O3混合物的量选自约1微克/毫升至约42微克/毫升的范围。
12.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于：在所述方法中，提供其中已经加入抗凝血剂的血液样本。
13.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于：在所述方法中，所提供的血液样本的量在10毫升和1000毫升之间，特别是在10毫升和500毫升之间，更特别是在15毫升和250毫升之间，甚至更特别是在20毫升和150毫升之间。
14.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于：在所述方法中，在所述体外处理中，用生物体外源性生长因子补充所述基于PRP的血液衍生物产品。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：所述生物体外源性生长因子包括或为生物体外源性MCSF，特别是细菌源来源的MCSF。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于：补充的生物体外源性MCSF的浓度包含在约0.5nM至约4nM的范围内。
17.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于：在所述方法中，通过用所述包括自体MCSF的基于PRP的血液衍生物产品进行体外处理，以提供生长和去编程的时间，在4小时至96小时之间，特别是在24小时至72小时之间，更特别是在36小时至72小时之间。
18.如前述任一项权利要求所述的方法，其特征在于：通过将所述含有包括MCSF在内的生长因子的基于PRP的血液衍生物产品与所述全血液样本的剩余部分接触，继续将包括MCSF在内的生长因子从经裂解的所述血小板扩散到所述全血液样本。
19.通过前述任一项权利要求所述的方法获得的血液样本，其特征在于：用于自体治疗。
Applications Claiming Priority (3)
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| IT201900007076 | 2019-05-22 | ||
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Publications (1)
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