CN117180310A - 一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法，包括干细胞分离、干细胞扩增、干细胞活性因子和外泌体体系的获取和浓缩、贮存。该体系包括目前已鉴定的间充质干细胞所分泌的活性因子和外泌体。本发明所得的干细胞活性因子和外泌体体系中不含外来的培养液成分，也不含有活细胞及死细胞裂解成分，可以长期保存而维持组织和细胞修复活性。干细胞活性因子和外泌体可以携带多种生物信息分子，同时使用具有多重治疗效应，相互配合发挥协同增效作用，提高治疗效果。本发明简单易行，适宜于大规模生产，为肺部炎症损伤及新型冠状病毒感染后遗症提供了一条新的治疗途径。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，具体涉及干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，在特定的环境中可以定向分化，从而达到修复组织和细胞损伤的作用。近年来研究发现，间充质干细胞具有促进组织修复和抗炎作用，其大部分功能是旁分泌作用，通过分泌的可溶性因子或囊泡与靶细胞发生相互作用而产生的。在干细胞培养过程中可以向培养基中分泌包含有多种活性因子和外泌体的活性物质。
干细胞活性因子：由干细胞合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质，是上清液中富含细胞生物活性的关键物质。包括干细胞因子、内皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子、肝细胞生长因子、神经生长因子、纤维母细胞生长因子、胰岛素样成长因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素等几百种。干细胞所分泌的活性因子不仅是维持生命活动所需要的，而且在修复机体组织损伤中都是必不可少的。
干细胞外泌体(Exosomes)：是一种直径在30-150nm的双层囊泡结构，被脂质双分子层包裹，外泌体中含有与抗炎或组织损伤修复相关的生物活性因子。外泌体是一种运载丰富货物的载体，其功能主要是通过不断转运微小核糖核酸(miRNAs)和蛋白来发挥的。在MSCs来源的外泌体中，已经鉴定出150多个 miRNAs和850多个独特的蛋白质，通过不同的途径，改变靶细胞的各种活性。大量研究表明干细胞外泌体在诸多疾病的治疗中发挥重要作用，在预防和治疗呼吸道炎症性疾病中同样具有巨大的应用潜力。干细胞外泌体是干细胞与靶细胞之间进行信号交流的重要信息载体。一旦被分泌到细胞外空间，干细胞囊泡就可以通过与靶细胞的相互作用而被吞入靶细胞，并最终影响靶细胞的表型，从而发挥其特有的生物学功能。
单一细胞因子所起的是单一刺激作用，譬如生长因子，作用过强和过于持久时，会引起组织过度生长。由于干细胞上清液里因子种类丰富，既有强化的，也有抑制的，所以干细胞上清液是平衡调节细胞生长活化的。另外干细胞外泌体除了自有的调节功能外，它的囊泡运输机制可以顺利穿越人体组织屏障，打开细胞信号通道，调控细胞的功能，使细胞因子等能更好地作用于细胞。干细胞活性因子和干细胞外泌体可以携带多种生物信息分子，所以共同使用具有多重治疗效应，提高治疗效果。
目前，干细胞因子及外泌体产品都是单一的细胞因子或外泌体制剂，还没有两种复合制剂。而且传统提取方式还存在干细胞活性因子或外泌体提取效率不高、纯度较低，提取过程中损伤外泌体自身结构，影响治疗效果等弊端。
发明内容
本发明提供一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液制备方法。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供一种含有干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法，其包括：在无血清干细胞培养基中传代培养间充质干细胞，在干细胞分裂最旺盛的时期，待细胞融合度达到80-90％后，弃去正常培养基，用PBS缓冲液清洗3次，然后加入生理盐水，在细胞培养箱中培养24小时，收集上清液离心、细胞筛网过滤，去除细胞碎片，然后通过0.22μm无菌过滤膜过滤除菌后即可得到富含干细胞活性因子、外泌体体系的复合溶液。
本发明的一个实施例中，所述传代培养间充质干细胞传至P3代，培养条件为5％二氧化碳、温度为37℃、湿度为95％环境中恒温培养。
本发明的一个实施例中，所述脐带间充质干细胞是将健康人脐带剔除羊膜、动静脉血管后，剪成组织匀浆块，平铺在培养皿里，并加入无血清培养基培养。按时更换新鲜培养基培养后，用胰酶消化后，在细胞培养瓶中传代培养，得到所述脐带间充质干细胞。
本发明的一个实施例中，所述无血清干细胞培养基为α-MEM培养基加入10％的人源性血清替代物。
本发明的一个实施例中，所述组织匀浆块体积为1-3mm3。
本发明的一个实施例中，所述离心的环境温度为4℃。
本发明的一个实施例中，所述离心的转速为1200转。
本发明的一个实施例中，所述离心时间为6分钟。
本发明的一个实施例中，所述细胞筛网为100目。
本发明的一个实施例中，所述培养皿为150mm。
本发明的一个实施例中，所述细胞培养瓶为T175，过滤盖。
本发明的一个实施例中，所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
本发明的一个实施例中，每约0.5×106个脐带间充质干细胞制备得到1ml的干细胞活性因子和外泌体复合雾化溶液。
本发明中，上述所述的方法制备得到的不含外来培养物及死细胞裂解物的干细胞活性因子和外泌体复合溶液。其中干细胞活性因子体系包括：干细胞因子（SCF)、内皮细胞生长因子（VEGF)、表皮细胞生长因子（EGF )、肿瘤坏死因子（TNF)、肝细胞生长因子（HGF )、神经生长因子（NGF )、纤维母细胞生长因子 (FGF )、胰岛素样成长因子（IGF )、粒细胞集落刺激因子（G-CSF)、白细胞介素（IL) 等几百种及各种溶菌酶。外泌体为干细胞分泌的一种直径在30-150nm之间的双层囊泡结构，内含有多种生物活性物质，如microRNA、信号蛋白、细胞因子、活性多肽等。
附图说明
图1是本发明实施例的P3代脐带间充质干细胞显微镜观察图；
图2是本发明实施例的间充质干细胞流式检测结果图；
图3本发明实施例的制备的外泌体在扫描电子显微镜下的形态图；
实施方式
本实施实例提供了脐带间充质干细胞活性因子和外泌体体系的制备过程，具体如下：
1、取健康人脐带，用生理盐水冲洗干净，剥离羊膜及动静脉后，获得华通氏胶。
2、用医用剪刀将华通氏胶剪成1-3mm3的碎块，平铺在150mm培养皿中，加入25ml无血清培养基（α-MEM培养基加入10％的人源性血清替代物），5％CO2，37℃，湿度95％条件下培养。
3、培养4-5天后换液，9天后开始出现小的细胞集落，约10-14天后培养皿中贴壁细胞铺满约80％时达到饱和。用磷酸缓冲溶液（PBS)轻轻冲洗培养皿中细胞3次，添加3ml消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA)，培养箱37℃保温2-3分钟，显微镜下观察细胞已经分离，加入10ml无血清培养基终止消化，1200转，4℃离心6分钟，去上清，所得细胞即为原代脐带间充质干细胞。
4、用新鲜无血清培养基10ml重悬所得原代脐带间充质干细胞，接种至2个T175细胞培养瓶中，5％CO2，37℃，湿度95％条件下培养。6小时后细胞即完全贴壁，1天后，细胞呈现典型的成纤维细胞样形态，均匀贴壁在培养瓶培养面。2-3天后细胞密度即达到80-90%。
5、细胞密度达到80-90%时，用磷酸缓冲溶液（PBS)轻轻冲洗培养瓶中细胞3次，添加3ml胰酶消化液（0.25%胰蛋白酶、0.02%EDTA) ，培养箱37℃保温2-3分钟，显微镜下观察细胞已经分离，加入10ml无血清培养基终止消化，1200转4℃离心6分钟，去上清。用新鲜无血清培养基10ml重悬细胞，按1瓶细胞传代5 瓶的比例进行铺瓶接种，5％CO2，37℃，湿度95％条件下培养。
6、2-3天后细胞融合度达到80-90%时，重复以上操作，继续进行传代至P3代，以得到足够数量的脐带间充质干细胞。如图1所示，为P3代脐带间充质干细胞显微镜观察图；如图2所示，间充质干细胞流式检测结果图。
7、在培养的脐带间充质干细胞P3代融合度达到80-90％后，弃去培养基，用PBS或生理盐水清洗3次，然后加入20ml生理盐水，继续培养24小时。
8、取上清液，1200转，4℃离心3分钟，100目细胞筛网过滤去除沉淀物后，得富含干细胞活性因子和外泌体复合溶液。如图3所示，为外泌体在扫描电子显微镜下的形态图。
9、干细胞因子和外泌体复合溶液的保存：用0.22μm滤膜过滤除菌，将过滤除菌后的复合溶液（一次或多次合并），置-20℃冰箱，可长期保存。
相对于现有技术，本发明实施例所述的干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法具有以下优势：
本发明干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法，可在较短时间内取得高纯度、高密度的具有生物学活性的干细胞活性因子和外泌体体系；制备过程中，其离心温度为4℃，保证了干细胞活性因子和外泌体的生物学活性不受影响；本发明通过改进脐带间充质干细胞的分离、培养及上清液获取方法，最大程度保证了干细胞活性因子和外泌体的纯度、密度和结构；雾化溶液不含外来培养液成分，也不含有死细胞及细胞碎片，避免了外来添加剂和细胞裂解毒素产生的不良反应。两种干细胞活性物质可以携带多种生物信息分子，共同使用具有多重治疗效应及协同增效的高效治疗作用。作为肺部雾化吸入给药途径时，可以不限于配合超声波雾化器、压缩雾化器、网式雾化器等雾化设备的使用，通过气道雾化吸入途径，用于治疗急慢性呼吸道炎症、慢性阻塞性肺疾病及新型冠状病毒感染后遗症等呼吸道疾病，提高了治疗效果。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种干细胞活性因子和外泌体复合雾化吸入溶液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)分离干细胞：原代间充质干细胞；
2)干细胞的扩增，用无血清培养方法，包括α-MEM培养基，加入10％的人源性血清替代物，5％CO2，37℃条件下培养，定期换液，传代，进而得到所需数量的干细胞；
3)干细胞活性因子和外泌体体系的获取：在干细胞分裂最旺盛的时期，弃去正常培养基，用PBS缓冲液清洗3次，然后加入生理盐水，细胞培养箱中培养24小时，收集上清液，即可得到富含干细胞活性因子和外泌体体系的溶液；
4)浓缩、贮存：把所得液体离心后用100目细胞筛过滤，去除散落细胞及细胞碎片，再用0.22μm滤膜过滤除菌，所得干细胞活性因子和外泌体复合溶液，可于-20℃长期保存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞活性因子和外泌体体系来源于人体干细胞在体外培养过程中所收集的上清液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞活性因子和外泌体体系为干细胞分泌活性因子及外泌体的复合溶液。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上清液是不含有活细胞和死细胞裂解物及细胞碎片。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述上清液是不含有外来培养液及其他物质。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞来源：人脐带血来源的干细胞、人外周血来源的干细胞、人骨髓来源的干细胞、人脐带间充质干细胞、人胎盘间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞或其组合。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的来源于干细胞所分泌的干细胞活性因子和外泌体体系，该体系包括干细胞因子、内皮细胞生长因子、表皮细胞生长因子、肿瘤坏死因子、肝细胞生长因子、神经生长因子、纤维母细胞生长因子、胰岛素样成长因子、粒细胞集落刺激因子、白细胞介素、各种溶菌酶以及包含外泌体的干细胞胞外囊泡。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞活性因子和外泌体复合溶液，每1ml是0.5×106个脐带间充质干细胞制备所得。
9.如权利要求1-7任一项所述的干细胞活性因子和外泌体复合溶液的用途：用于肺部雾化吸入。
10.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述肺部雾化吸入用于治疗包括呼吸道急慢性炎症、慢性阻塞性肺病、哮喘及新型冠状病毒感染后遗症。
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