CN111492051B - 间充质基质细胞以及从脐带获得间充质基质细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及间充质基质细胞以及从脐带分离间充质基质细胞的有益方法。具体地，可通过下述方法获得所述细胞：所述方法包括从脐带分离基质华通氏胶或其级分，并使所述基质华通氏胶或其级分进行酶处理，由此从所述华通氏胶或其级分释放至少一种细胞。优选地，在允许扩增所述细胞群的条件下进行细胞的繁殖。根据本发明所述的细胞群具有增殖特性并且具有用于多种目的的工业意义。

Description

间充质基质细胞以及从脐带获得间充质基质细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种获得基质细胞、特别是基质祖细胞的方法。基质祖细胞典型地能够产生表型和基因型相同的子代(自我更新)以及至少一个其他的最终细胞类型。一些基质细胞具有自我更新能力并且近年来此类细胞已经得到越来越多的关注。与本发明有关的基质细胞是非胚胎间充质基质细胞。它们可通过本发明的方法从脐带分离而获得，在本文中详细公开本发明的方法。
背景技术
间充质基质细胞(MSC)是科学界特别感兴趣的基质细胞，特别是因其多能性和低免疫原性(Pittenger等人,1999,Science；,vol.284,p.143-147)。根据现有技术，间充质基质细胞(MSC)传统上典型地从骨髓获得，但MSC还可以从众多的其他哺乳动物来源分离，诸如脂肪组织、肌肉、结缔组织、牙髓、脐带血、胎盘和羊水(Iudicone等人,2014,J.Transl.Med.,12:28)。在MSC中，来源于骨髓的成体MSC(BM-MSC)已经得到最广泛的研究(例如，WO 2008/042174 A2)。在骨髓中，MSC与多种细胞类型共存，包括许多原始的和胚胎样的干细胞、间充质干细胞、谱系定向祖细胞以及成熟细胞诸如成骨细胞和成纤维细胞,并且描述了用于分离例如骨髓来源MSC的不同方法(参见，例如Majore,CellCommun.Signal.,2009,vol.20；7:6)。过去还已经进行了一些努力致力于开发间充质基质细胞的替代来源。例如，脐带(UC)被提议作为不同细胞类型的适合储库，其中一些细胞类型显示具有干细胞样特性。脐带是胎盘哺乳动物中的结构，该结构将胎盘连接到发育中的胎儿，由此提供胎儿营养的来源。在出生后胎盘是可利用的，无需任何有创操作且没有伦理问题(Hass等人,2011,Cell.Commun.Signal.,vol.9:12)。脐带包括华通氏胶(Wharton’sJelly)，华通氏胶是一种富含基质细胞的凝胶状、疏松的粘膜结缔组织，以解剖学家ThomasWharton命名。华通氏胶包括分散在由蛋白聚糖组成的无定形基质中的细胞，所述蛋白聚糖包括透明质酸和不同类型的聚糖(参见，例如WO 2004/072273 A1)。其通常被认为是主要在胚胎外起源的原始间充质组织(Weiss,1983,Histology,cell and tissue biology,NewYork,Elsevier Biomedical,p.997-998)，并且被提议作为MSC的有希望的来源(Wang等人,2004,Stem Cells,vol.22:p.1330–1337)。
一般认识到就结构、生物特性和UC内的定位而言，脐带(UC)的基质细胞是异源的。已经记载了几种从UC的华通氏胶(WJ)获得细胞的方法，并且记载了具有MSC-样特性的细胞驻留在且来源于UC的不同部分。人脐带包含三个血管，正常以左螺旋(逆时针)转圈的形式组织在一起。Mitchell等人(2003,Stem Cells,vol.21,p.50-60)描述了一种方法，其中去除脐带血管，然后收获剩余组织。这种剩余组织包括一小部分WJ和羊膜上皮，然后将剩余组织切成块并产生小的组织碎片，将这些组织碎片转移到组织培养板；然而未预见对脐带或剩余组织的酶消化。相反，组织碎片随后被用作原代外植体，细胞从原代外植体迁移出组织标本外到培养底层上。另一报道(Romanov等人,2003,Stem Cells,vol.21,p.105-110)指出成纤维细胞样MSC可以通过用胶原酶消化脐静脉而从脐带血管被分离出来，然而却产生了血管内皮细胞和内皮下细胞的混合群。US 5,919,702 A(Purchio等人)记载了一种分离方法，包括纵向切开约2.5cm长的脐带段，去除血管和鞘(casing)并将WJ收集到无菌容器中，在所述无菌容器中进行切断和培养。例如，记载了可以通过将2-3mm3的WJ段放置在皮氏培养皿底部上的载玻片上，用另一个载玻片盖上，培养10-12天以使一些细胞(“前软骨细胞(pre-chondrocytes)”)迁移出培养皿来分离细胞。还提到了使用前软骨细胞产生软骨。
还报道了从动物组织来源分离脐带-基质来源细胞。例如，Lange-Consiglio等人,(2011,Open Tissue Engineer.Regen.Med.J.,vol.4,p.120-133)报道了从马脐带的“血管间”和“血管周围”区域分离“脐带-基质来源细胞”。
人脐带的重量为约40g(Raio等人,1999,Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Biol.,vol.83；p.131-135；Conconi等人,2011,Open Tissue Engineer.Regen.Med.J.,vol.4,p.6-20)，这对于分离具有MSC样特性的细胞可用的起始原料产生了天然的上限。根据US2004/0136967 A1和Seshareddy等人(2008,Meth.Cell Biol.,vol.86,p.101-119)所述，难以从脐带获得高数目的期望细胞。因此，作者推荐了提取相对大的细胞数目，并且描述了已经被优化用于分离相对高的细胞数目的条件；例如，为了能够提取大的细胞数目。他们提议对脐带进行相对强烈的酶处理。描述了华通氏胶的不同区带，但没有具体建议对于提取排除细胞来源的哪些特定区域，诸如血管周围区域，与使用高细胞数目的一般推荐一致。在分离后对细胞进行培养。WO 2004/072273 A和Sarugaser等人(Stem Cells,2005,23:220-229)记载了一种替代方式；这些出版物记载了对具有MSC样特性的细胞的分离不包括从脐带的血管周围区域分离。由于此区域在解剖学上相对受限，因此与从整个脐带开始的分离方法相比起始原料的量相对很低。此外，考虑到接近含血液的血管，不能排除被血细胞的污染；因此，记载了针对CD45表达的负性选择以避免在培养中被不期望细胞污染。WO 2017/058003 A1还记载了从脐带、牙髓、包皮、角膜或其他来源分离MSC的过程；从脐带分离间充质基质细胞的过程优选地在无菌条件下进行，并且脐带优选地接受胶原酶处理持续以相对长的时间间隔。根据Conconi等人,2011,Open Tissue Engineer.Regen.Med.J.,vol.4,p.6-20所述，用于增强MSC的体外扩增和保存的最合适方案还未建立。因此，仍然存在着对提供由特征为具有基本上均一的特性并且能够离体可靠地扩增的细胞组成的细胞群的需求；还需要用于提供它们的可靠方法。
要解决的技术问题
因此，本发明的目的包括消除与现有技术相关的不利因素。具体的目标包括提供用于获得间充质基质细胞(MSC)以及以良好的产率可重复地提供具有优良的自我更新特性的间充质基质细胞(MSC)和MSC细胞群的可靠方法。期望的是所述细胞群是相对均一的并且不含不期望的细胞，诸如凋亡细胞、造血谱系细胞等。因此，换句话说，期望通过在可靠性和/或产率方面相对于目前已知和实施的方法有优势的方法提供间充质基质细胞。现有技术的各种缺陷确定了本发明人所提出的改进的进一步目标，并且这些目标已经通过本文所述和权利要求中所述的贡献而达到。
发明内容
本发明涉及获得间充质基质细胞(MSC)的方法，各种间充质基质细胞(MSC)和与其相关的其他方面，它们全部都在本文中描述。本发明的主要方面和实施方案归纳如下。
在第一个方面，本发明涉及一种获得间充质基质细胞的方法。该方法包括：(a)从脐带分离基质华通氏胶或其级分，和(b)使所述基质华通氏胶或其级分接受酶处理，由此从所述基质华通氏胶或其级分释放至少一种细胞。优选地，在步骤(b)后获得的细胞是多能性的。
除了步骤(a)和(b)以外，更优选地是在本发明的方法中包括至少一个附加步骤。具体地，优选所包括的用于增加细胞数目的步骤利用了步骤(b)中所获得的细胞的细胞分裂潜力。在此类优选的实施方案中，步骤(b)后面接着步骤(c)；步骤(c)包括扩增步骤(b)中所获得的至少一种细胞。优选地，在步骤(c)后所获得的细胞是多能性的。
本发明的发明人出人意料地发现源自脐带基质的细胞是特别有优势的。优点包括细胞群的均质性和干细胞样特性。具体地，在缺少脐带血管的情况下，可以实现这些优点。因此，优选的是步骤(a)从脐带分离基质华通氏胶或其级分的特征在于从脐带物理去除血管和血管周围区域的步骤。血管和血管周围区域可以在步骤(a)之前或在步骤(a)期间被去除。在本发明中优选的去除血管和血管周围区域的一种技术上有优势的方式的特征在于从脐带剥离血管和血管周围区域。发明人已经观察到对血管的剥离(例如通过将血管拉出)也去除了血管周围区域。
此外，发明人已经发现在物理去除血管和血管周围区域的所述步骤之前将脐带分段是有利的。所述分段典型地通过物理手段来实现，诸如剪刀或手术刀。优选地，所述分段垂直于脐带。更优选地，所述垂直段优选地各自具有约1cm-约4cm、优选地约2cm-约3cm、更优选地约2.5cm的长度。在优选的实施方案中，在步骤(b)之前从脐带的一个或多个段去除一段或多段血管。具体地，优选在将脐带分段(优选地垂直分段)之后去除血管，或更准确地说去除血管段。
优选地，步骤(b)中的酶处理是包括暴露于胶原酶的处理。发明人还发现胶原酶活性的量很重要。在优选的实施方案中，如下面进一步详述的那样，在酶处理步骤(b)期间胶原酶以相对低的比活性存在。
在本发明的方法中，从脐带快速分离基质细胞是有利的。在优选的实施方案中，步骤(a)和(b)一起在小于6小时、更优选小于5小时、更优选小于4小时和最优选小于3小时的总时间内进行。显然步骤(a)和(b)一起的短持续时间还意味着步骤(b)本身的时间很短。通常，步骤(b)的时间短，即，快速分离，具体来说酶处理的时间短可以有助于步骤(b)期间的温和条件。
令人惊讶地是，发明人进一步发现在酶消化期间血小板裂解物的存在是有利的。首先，发明人发现人血小板裂解物的存在不抑制或减少或阻断胶原酶的酶活性，至少不会达到将负面地干扰所期望的从周围组织(例如，从基质间质)酶促地释放细胞的程度。已知血液血浆含有大量的蛋白酶，并且因此对于在血液血浆或其成分存在时添加催化性蛋白(诸如胶原酶)存在着偏见，或反之亦然，因为预期所述催化性蛋白质(诸如蛋白酶)会随着时间推移而被降解，并且因此其活性会消失；令人惊奇的是，本发明人确定了即使在血小板裂解物的存在下胶原酶仍然有效地起作用。其次，发明人发现在根据本发明所述的方法中在血小板裂解物的存在下可通过消化获得的细胞具有优异的增殖特性(参见，例如实施例2B和2C)。因此，优选地，在步骤(b)中，基质华通氏胶或其级分在哺乳动物血小板裂解物(PL)、更优选人血小板裂解物(hPL)的存在下接受酶处理。
除此之外，血小板裂解物优选地存在于步骤(c)中。优选地，在步骤(c)中，所述至少一种细胞在包含血小板裂解物(PL)、优选人血小板裂解物(hPL)的生长培养基中扩增。优选地，所述至少一种细胞在不含任何添加的血清、特别是不含胎牛血清(FBS)的生长培养基中扩增。
在特别优选的实施方案中，所述至少一种细胞在特定的生长培养基中扩增，所述生长培养基特别适合于本发明的方法，任选地具有补充剂。此类生长培养基可以包含化学成分限定基础培养基和/或血小板裂解物。
本发明的方法产生具有特定特性的细胞，所述特性也在本文中进行了描述。因此，特别优选的是可通过本发明的第一个方面的方法获得的细胞是如下在本发明的第二个方面中所述的细胞。
在第二个方面，本发明涉及一种间充质基质细胞(MSC)。本发明的MSC也称作“本发明的细胞”或简称为“细胞”。本发明的MSC的特征在于：(a)其表达APCDD1基因，且(b)其不表达3G5基因。优选地，所述细胞是分离的细胞。更优选所述细胞来源于脐带的基质华通氏胶。优选地，所述细胞是灵长类动物细胞。因此，所述细胞优选地不来自马，即，不是马细胞。此外，所述细胞优选地不来自啮齿类动物(例如小鼠或大鼠)，即，不是啮齿类动物细胞(例如，小鼠细胞或大鼠细胞)。最优选地，所述细胞是人细胞。
在优选的实施方案中，所述细胞是人细胞，其来源于基质华通氏胶并且表达APCDD1基因。
在优选的实施方案中，所述细胞进一步表达PPARG基因。在另一个且不相互排斥的优选实施方案中，所述细胞进一步表达FLVCR2基因。在人细胞的情况下，优选所述人细胞表达人白细胞抗原HLA-A、HLA-B和HLA-C中的至少一个、优选至少两个的任意组合，和最优选全部。此外，在人细胞的情况下，优选所述细胞不展示人白细胞抗原HLA-DP和/或HLA-DQ。任选地也不展示HLA-DR。在一个实施方案中，所述细胞不展示人白细胞抗原HLA-DP、HLA-DR和HLA-DQ中的任一个。备选地，HLA-DR以低水平展示。
根据本发明所述的细胞典型地比通过根据现有技术的各种方法分离的一些MSC小。例如，根据本发明所述的细胞可以具有较小的体积和/或较小的表面积。测定细胞体积或表面积的各种方法是可获得的，诸如流式细胞术，用于测定悬浮细胞的细胞体积，和在显微镜下测定贴壁细胞的细胞表面。此类方法在下文中描述。
优选地，所述细胞不显示任何端粒酶活性，和/或不表达任何端粒酶。优选地所述细胞是多能性的。更优选所述细胞能够分化成各种细胞类型。特别优选的是所述细胞具有至少全部下列分化潜能：(a)脂肪形成；(b)软骨形成；(c)骨形成。
在优选的实施方案中，所述细胞是间充质干细胞。
根据本发明的第二个方面所述的细胞是可通过根据本发明的第一个方面所述的方法获得的细胞。本发明的第一个方面的优选实施方案可与本发明的第二个方面的优选方面以每种和任一种组合组合在一起，除非上下文以另外的方式指示。备选地，根据本发明所述的细胞因此可以描述为可通过根据本发明的第一个方面所述的方法获得的细胞。
在第三个方面，本发明涉及一种细胞群。所述细胞群包含根据本发明的第二个方面所述的至少一种细胞。更优选所述细胞群包含大量细胞，其中至少80％(按细胞数计)，优选至少90％(按细胞数计)，更优选至少95％，诸如至少96％、至少97％、至少98％、至少99％(各自按细胞数计)是根据第二个方面所述的细胞。第二个方面的全部优选实施方案还适用于本发明的第三个方面。优选的，站细胞总数至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，诸如至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％,最优选100％的细胞是在第二个方面、和任选地其优选实施方案中的一个或多个(单独地或组合在一起)中限定的细胞。所述细胞群的APCDD1基因表达是阳性的。
优选地，所述细胞群是分离的细胞群。
所述细胞群优选的进一步特征在于所述细胞群中的细胞的体积和/或表面积是相似的，或者，备选地，其特征在于高百分比的所述细胞具有小的体积和/或表面积，如下面所详述的那样。所述体积通常与可由流式细胞术测定的前向散射光(FSC)相关联。
优选地，所述细胞群的进一步特征在于至少70％或更多的所述细胞(按细胞数计)是有活力的。这代表了相对于现有技术的显著优势，在现有技术中有活力细胞的百分比较低。更优选地，至少75％的所述细胞(按细胞数计)是有活力的。更优选地，至少80％的所述细胞(按细胞数计)是有活力的。在一个实施方案中，在分离所述细胞后立即，即，在扩增之前，测定活力。
在优选的实施方案中，所述细胞群不含任何血管周细胞。血管周细胞的标志物是3G5。因此，此实施方案可以备选地被描述为，所述细胞群不含表达标志物3G5的任意细胞和/或其表面上展示3G5的任意细胞。
在优选的实施方案中，所述细胞群不含任意上皮细胞。上皮细胞的标志物是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。因此，此实施方案可以备选地被描述为，所述细胞群不含表达标志物EpCAM的任意细胞和/或在表面上展示EpCAM的任意细胞。
在优选的实施方案中，所述细胞群不含任意内皮细胞。内皮细胞的标志物是CD31。因此，此实施方案可以备选地被描述为，所述细胞群不含表达标志物CD31的任意细胞和/或在表面上展示CD31的任意细胞。
优选地，所述细胞群可通过根据本发明的第一个方面所述的方法获得，尤其是，当包括步骤(c)时，即，扩增步骤。
备选地，根据本发明所述的细胞群因此可以被描述为可通过本发明的第一个方面所述的包括步骤(c)的方法获得的细胞群。
具体实施方式
下面的详述公开了本发明的单个特征的具体的和/或优选的变化形式。本发明还涵盖一些实施方案作为特别优选的实施方案，那些实施方案通过将对于本发明的两个或更多个特征描述的具体的和/或优选的变化形式中的两个或更多个组合在一起而产生。
本领域普通技术人员将认识到本文所述的发明在具体描述的那些以外容易进行变化和改动。因此，对于本领域普通技术人员而言显而易见的是本公开内容包括所有这些变化和改动。本公开内容还包括本说明书中提及的或指示的全部实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物，它们单个地或综合在一起，以及所述实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物中的任意两个或更多个的任一种和全部组合。因此，除非本文另外具体说明或上下文另外需要，否则提到单个实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物应当被认为涵盖这些实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物中的一个和多个(即，多于一个，诸如两个或更多个，三个或更多个，或全部)。
本公开内容在范围上不受本文所述的具体实施方案的限制，在本文中提供这些具体实施方案用于说明和举例的目的。功能上或以另外的方式等效的实体、化合物、特征、步骤、方法或组合物在本公开内容的范围内。
本文引用的每个文件(包括所有专利、专利申请、科学出版物、制造商说明书、使用说明书、介绍等),无论是上文的还是下文的，其全部内容都通过引用并入本文中。本文中的任何内容都不应解释为承认本发明无资格先于具体的教导。
本文件应以理解并以最大程度地从技术上实现的最佳客观意图的意愿进行阅读。本文中所使用的所有术语应以赋予这些词以它们在相关领域中正常所具有的含义和范围来阅读，除非在具体实例中本文件通过明确定义或另外赋予一个或多个词以特殊含义。在本文所提供的定义与一些或全部文献中的定义部分或完全不同的情况下，应以本文中的定义为准。
除非另外具体说明或上下文另外需要，否则本文公开的每个实施方案、方面和实施例应当适用于本文公开的任意其他实施方案、方面或实施例，并与它们相容。
除非另外具体说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员普遍理解的相同含义(例如，在遗传学、分子生物学、基因表达、细胞生物学、细胞培养、干细胞、基质细胞、新生儿科学、再生医学、解剖学、组织学、免疫学、免疫组织化学、蛋白质化学和生物化学)。例如以英语发表的教科书和综述文章代表性地定义本领域普通技术人员所普遍理解的含义。
表述“和/或”，例如，“X和/或Y”应当理解为“X和Y”或“X或Y”，并且应当理解提供“和”、“或”以及两种含义(“和”或“或”)的明确公开。
如本文所用，除非另外指明，否则术语“大约”、“约”和“基本上”全部都意指大约或相近，并且在本文给出的数值或范围的上下文中优选地指围绕所述的或所要求保护的数值或范围的+/-10％，更优选+/-5％。关于细胞的特征，类似于“基本上不”、“基本上不存在”等的术语意指利用根据现有技术在各个领域中一般使用的分析方法在细胞上可以检测不到的各个特征，和/或所述的细胞群中基本上所有细胞不具有所述各个特征。
除非另外明确指明，否则词“包括”或变化形式诸如“包含”或“含有”在本文件的上下文中用来指示除了被“包括”引入的列表中的成员以外，更多的成员可以任选地存在。然而，要考虑到，作为本发明的具体实施方案，术语“包括”涵盖没有更多成员存在的可能性，即，对于此实施方案的目的，“包括”要理解为具有“由…组成”的含义。
除非另外明确指明，关于本发明对相对量的所有指示基于重量/重量得到。对以通称为特征的组分的相对量的指示意在指被所述通称所涵盖的所有具体的变体或成员的总量。如果由通称所限定的特定组分被指定以特定的相对量存在，并且此组分进一步被表征为由该通称所涵盖的具体变体或成员，则其意指被该通称涵盖的其他变体或成员不另外存在使得由该通称所涵盖的组分的总相对量大于指定的相对量；更优选被该通称涵盖的其他变体或成员根本不存在。
术语“同种异体的”在本文中用来描述来源于同一物种的不同个体的任何物质。当在一个或多个基因座处的基因不相同是，则两个或更多个个体被认为彼此是同种异体的。
关于细胞，术语“面积”或“表面积”或“细胞表面积”是指当俯视时细胞的表面积。在本公开内容的背景下，在细胞处于贴壁培养的时候，即，当细胞粘附于培养板时，测定细胞的二维表面积。为了有利于测定再现性考虑细胞处于低汇合率状态，因为据信在低汇合率时，细胞不会因接触抑制而彼此显著地抑制。测定表面积的方法在下文中给出。
表述“平均表面积”和“平均面积”是指两个或更多个单个细胞的表面积的平均值，其中在第一步骤，首先如上所述测定每个单个细胞的面积，然后在后续的第二步骤，平均面积作为如第一步骤中所测定的单个细胞面积的算术平均数来确定。典型地，将至少35个细胞进行第一和第二步骤用于确定平均面积；换句话说，平均值代表至少35个细胞的平均值。
术语“自体的”在本文中用来描述来源于同一受试者的任何物质。作为实例，“自体细胞”是指来源于同一受试者的细胞。自体细胞的移植有时被认为是有利的，因为其克服了免疫屏障，否则所述免疫屏障会导致排斥。细胞是由被膜包围的细胞质构成的生物学实体。如本文所用，术语“细胞”优选地是指真核细胞。术语“细胞”可以指干细胞或缺少干细胞特性的细胞，诸如终末分化细胞或甚至死细胞。典型地，所述细胞是起源自多细胞生物体或其一部分的细胞。优选地，所述细胞从所述多细胞生物体分离，即，不与其起源的所述多细胞生物体物理连接和/或在营养上不依赖于所述多细胞生物体。基质细胞是根据本发明所述的优选细胞。
术语“细胞群”和“细胞的群”可互换，是指多个细胞的全体。在最窄的实施方案中，细胞群包含两个细胞，但更典型的包含大量细胞。该术语涵盖基本上相同的细胞(诸如源自单个克隆形成细胞的细胞群)以及异源细胞群(即，具有异源起源的细胞和/或在至少一种功能或结构特征方面彼此不同的细胞)两者。该术语涵盖仅有悬浮细胞的群，仅有贴壁细胞的群以及悬浮细胞和贴壁细胞的混合群。细胞群可以包括干细胞和缺少干细胞特性的细胞两者。在另一个但不互斥的实例中，细胞群包括活细胞和死细胞两者。
除非上下文另外指明，否则“CD”，一般与数字一起使用(例如，“CD34”)在本文中代表“分化抗原簇”。
术语“克隆形成的”是指细胞扩增的能力，由此产生大量子代细胞，所述子代细胞一般在基因型上是相同的。“克隆形成”细胞也可以称作“集落形成单位”或“CFU”。
术语“胶原酶”当在本文中使用时是指能够破坏胶原蛋白中的肽键的酶(E.C.3.4.24.7)。通常，胶原酶可以辅助破坏细胞外结构。该术语不暗指对胶原酶的类型或起源的任何具体限制，除非另外指明。胶原酶可以是重组的或来自其天然来源。许多市售的胶原酶包括除了E.C.3.4.24.7以外的其他酶活性。此类市售的胶原酶在本发明的情形(参见实施例)下是适合的。
表述“汇合率”在本文中用来描述培养容器的底表面被细胞(典型地为贴壁细胞)覆盖的比例。汇合率典型地表示为“％汇合”。
表述“％汇合”或“汇合百分比”是指培养皿的底表面被细胞(典型地为贴壁细胞)覆盖的百分比，即，细胞的总面积的总和相对于培养皿的底表面的百分比。例如，50％汇合意指基本上一半的表面被覆盖，仍有空间允许细胞生长。100％汇合意指表面完全被细胞覆盖，没有留下更多的空间使细胞生长为单层。在本发明的情形下，在达到100％汇合之前典型地对细胞传代以便最优地保持其增殖表型。
表述“低汇合率”意指50％或更小、典型地10-50％的汇合百分比。表述“亚汇合的”和“亚汇合率”意指超过50％但不大于80％的汇合百分比。
术语“培养容器”或“细胞培养容器”一般是指适合于培养哺乳动物细胞的容器。典型的培养容器是培养瓶、培养板和多层培养室(stack)(其中多层培养室典型地由上下叠在一起的大量培养板组成)。在本发明的情形下特别适合的培养容器是在培养容器底部处允许细胞贴壁的培养容器；这样的容器是具有平面的底表面的培养瓶、培养板和培养室。
关于培养容器，术语“表面”或“底表面”是可互换的，意欲指培养容器的内部底表面，即，具有粘附特性的细胞通常粘附于所述表面同时在该培养容器内生长。通常，所述表面在培养容器的内部底部处并且仅由培养容器的侧壁限定边界。
术语“密度”或“细胞密度”是指每个二维面积的细胞数，诸如具体地，每cm2的细胞数，典型地细胞培养容器的每cm2底表面的细胞数，除非上下文另外指明。典型地，该术语用来描述多少细胞被接种到培养容器中，例如，在特定的代数开始时。所述培养容器的全部底表面和在该培养容器中接种的细胞的总数则限定了在所述代数开始时所述培养容器每cm2的细胞密度。在实践中，在代数(I)开始时作为接种物使用的细胞数合适地在所述代数开始前通过细胞计数来确定；因此I是细胞密度和培养皿的底表面的函数。除非另外明确地指明，否则“细胞密度”是指在培养容器的整个底表面上的平均细胞密度；尽管如此,在本发明中优选细胞均匀地分布在培养容器的整个底表面上。
关于细胞，术语“直径”或“细胞直径”是指俯视来看细胞的最长直径。在本文件的背景下，在细胞处于贴壁培养时(即，细胞贴附于培养板上)测定细胞的直径。重要的是细胞处于亚汇合状态。亚汇合被认为对于测定的再现性是有利的，因为亚汇合的细胞基本上不会通过接触抑制而彼此抑制。对于直径的测定，对一个或多个细胞拍照或以其他的方式目测观察或记录，典型地利用显微镜，从与所述一个或多个细胞贴附的培养板表面垂直(即90°)的维度进行。在所述细胞的图形图像(即，照片)上手动地限定所述区域的边界。优选地，在记录所述图形图像之前不搅动培养容器。在两极细胞的情况下，直径是细胞的两个极之间的距离。对于多极，例如，三角形细胞，直径是细胞的彼此相隔最远的两个极之间的距离。在每种情况下，“距离”意味着两极各自之间的最短直线连接线。
术语“平均直径”是指两个或更多个单个细胞的直径的平均值，其中在第一步骤，每个单个细胞的直径如上所述进行测定，然后在后续的步骤，平均直径作为在第一步骤中测定的细胞直径的算术平均数来确定。
如本文所用，术语“扩增”或“扩增的”一般是指细胞或细胞群的增殖。典型地，在本发明的情形内的扩增在体外或离体(ex vivo)进行。典型地，扩增是细胞分离后续的活性或过程。典型地，在扩增期间，细胞的总数目增加。细胞数目的增加可以通过“累积群体倍增”或“传代次数”(“P”)或指示在各个阶段时细胞的总数目等来描述。
如本文所用，术语“表达了”、“表达的”和“表达”、“基因表达”等涉及在功能基因产物的合成中使用来自基因的信息。基因表达至少包括转录，任选地包括多个附加特征中的一个，所述附加特征任选地选自包括下列的开放式列表：RNA编辑、翻译和翻译后修饰。当测定基因表达时，测定表达产物诸如未编辑的或编辑的RNA、或甚至编码蛋白的存在。上述术语，与特定的基因或基因座结合使用，意在指定来自该基因或基因座的遗传信息的表达；例如，当提到表达APCDD1时，其意在是表达了APCDD1基因。
如本文所用，术语“提取”是指与生物学环境的分离。根据上下文，该术语可以意指“提取(动词)”或已经被提取的物理实体(例如，通过从其天然环境提取而获得的细胞或细胞群)。例如，当细胞从脐带被提取时，所述细胞从脐带中的原始位置被分离和/或与脐带的其他解剖区域分开。优选地，提取的细胞是在活体外和/或与血管物理分开和/或与同一器官或组织的其他细胞物理分开和/或与同一器官或组织的无细胞解剖区域物理分开的细胞。
如本文所用，术语“流式细胞术”是指适合用于细胞计数、细胞分选、分析细胞特性和生物标志物检测(诸如，具体地，检测细胞表面分子，诸如分化抗原簇(CD)分子)的基于激光或阻抗的生物物理学技术。流式细胞术需要悬浮的细胞；为了分析贴壁细胞，这些细胞需要从它们贴附的基底(例如，培养容器)上脱离，例如通过酶处理，诸如胰蛋白酶消化，通过酶处理它们成为悬浮的细胞。悬浮的细胞，即处于流体流中的细胞，穿过电子检测仪器(流式细胞仪)。流式细胞仪分析所述细胞，例如基于每个细胞的特定光散射。可以使用市售的流式细胞仪，诸如FACSAria III流式细胞仪(BD Biosciences)。由流式细胞仪生成的数据可以以单一维度作图，以产生直方图，或以二维作点图或甚至以三维作图。可以使用选择的标度作图，诸如线性或对数标度。这些图上的区域可以基于荧光密度通过建立一系列亚群(称为“门”)抽取而相继地分隔。
如本文所用，“荧光激活细胞分选”或可互换地“FACS”是一种专门类型的流式细胞术。FACS是一种基于每个细胞的特定光散射和/或荧光特性将生物细胞的异源混合物分选成两个或更多个群的方法。用作用于FACS的标记的荧光团的类型不特别地限制；在一些实施方案中，荧光团附接到识别靶特征的抗体，所述靶特征诸如细胞表面蛋白(诸如，特别地，检测细胞表面分子，诸如分化抗原簇(CD)分子)。荧光团可以备选地附接到对细胞膜或另一细胞结构有亲和性的化学实体。每个荧光团具有特征性的峰激发和发射波长，其通过适合于FACS的仪器检测。可以使用市售的仪器，诸如FACSAria III流式细胞仪(BDBiosciences)。
如本文中所用，术语“异源的”描述了由多个不同元件组成的物质。例如，将一个个体的细胞传输到不同的个体中构成了异源移植物。异源基因是来源于该受试者以外的来源的基因。
如本文所用，术语“永生化的”和“永生性”是指可以不受海弗利克极限(Hayflicklimit，海弗利克极限是细胞由于DNA损伤或端粒缩短导致不再能分裂的点)限制分裂的细胞。永生化细胞典型地表达端粒延长的端粒酶，但这不是严格的要求。
如本文所用，术语“接种物”是指用来在指定的培养容器中起始指定的细胞培养(传代)的全部细胞。
“分离的”意指基本上或大部分不含在其天然状态下正常伴随其存在的组分的材料。例如，如本文所用，“分离的细胞”是指已经从细胞环境和细胞外环境纯化的细胞，所述环境诸如在天然存在状态下围绕其的组织，例如，已经从脐带组织取出的间充质基质细胞，脐带组织正常情况下邻接所述间充质基质细胞。换一种可替代的描述方式，如本文所用，“分离的细胞”或类似描述是指在体外将细胞从其天然细胞环境分离和/或纯化，并且从与所述细胞正常驻留的组织的其他组分的缔合中分离和/或纯化。除非上下文另外指明，否则“分离的细胞”不一定是不含任意其他细胞的单一细胞；相反，当甚至两个或更多个细胞，诸如大量细胞的群在基本上或大部分不含在其天然状态下正常伴随此类细胞群存在的组分这个意义上被分离时，所述细胞群可以称为“分离的”。例如，当间充质基质细胞的群已经从原始组织诸如脐带中取出时，其可以称为“分离的”。如本文所用，根据词“分离的”的此定义，“分离”是描述获得“分离的”材料(诸如例如，分离的细胞)的活动的动词。
如本文所用，术语“谱系定向”是指能够有丝分裂但典型地不能够无限次数的有丝分裂的子代细胞。最后，谱系定向细胞的后代确定分化。
如本文所用，术语“培养基”意在指适合于培养细胞、特别是哺乳动物细胞的水性混合物。所述水性混合物典型地是溶液，尽管也包括混悬液和胶体混合物。培养基典型地是液体，尽管一些培养基也可以暂时是冷冻的，例如，用于保存目的；在任何情况下，当培养基是液体时其用于细胞培养。培养基可以是“基础培养基”，其是限定水性混合物，或是“生长培养基”,其是包含基础培养基和至少一种补充剂的水性混合物，并且通常具有维持离体时细胞活力的能力，以及任选地还在离体时扩增细胞的能力。除非明确指定，否则上下文会叙述意指是基础培养基还是生长培养基。基础培养基优选是化学成分限定培养基。生长培养基优选包含基础培养基(典型地85％-99.5％体积/体积)加上至少一种人来源的、动物来源的或植物来源的补充剂，诸如血清、细胞裂解物或特别是在本发明的情形下，血小板裂解物。
术语“间充质的”在本文中用来指属于间充质细胞类型的细胞，诸如脂肪细胞，结缔组织、骨、软骨、血液、淋巴管和血管的细胞，以及能够分化成间充质细胞类型的基质细胞或干细胞。不希望对本发明施加任何限制，间充质细胞在体内有时是松散的，并且嵌入在凝胶状基质中。典型地，间充质细胞是中胚层起源的(胚胎中胚层或胚外中胚层)。在一些实施方案中，间充质细胞是基质细胞(间充质基质细胞)或干细胞(间充质干细胞)，或来源于这些中任一个的细胞。
术语“间充质基质细胞”,缩写为“MSC”，在本文中用来指间充质起源的细胞，即，起源于基质，诸如特别是中胚层来源的结缔组织。“间充质基质细胞”的组织起源并不进一步限于此；然而，根据本发明的优选方面，“间充质基质细胞”源自脐带,更准确地说源自脐带的基质华通氏胶，如本文详述的那样。间充质基质细胞典型地表达表面标志物CD105和CD73，通常还表达CD90。优选地，根据本发明所述的“间充质基质细胞”的特征在于表达CD105(已知为内皮糖蛋白)、CD73(已知为胞外5’核苷酸酶)和CD90(也已知为Thy-1)。间充质基质细胞的特征在于基本上不表达造血抗原，诸如特别是CD45、CD34、CD14、CD19或CD3。典型地，在体外MSC表达MHC I类分子，但不表达II类分子，除非在组织培养中被刺激，例如被干扰素刺激。因此，MSC的典型表面标志物表型是CD105+、CD73+、CD90+、CD45-、CD34-CD14-、CD19-、CD3-、HLA DR-。尽管明确地鉴定了MSC，但此表面标志物谱是复杂的。MSC的典型特征性特征是在体外分化成各种细胞类型的能力，所述细胞类型典型地包括成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。典型地MSC在体外是塑料粘附的。术语“间充质基质细胞”不固有地要求这样提到的细胞是干细胞；尽管如此,如本文所述，在优选的实施方案中，根据本发明所述的或根据本发明获得的MSC可以具有干细胞样特性。
术语“间充质谱系前体细胞”是指具有自我更新能力同时保持多能性和分化成大量的间充质起源的任一种细胞类型(例如，成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、基质细胞、成纤维细胞和腱)以及还可能分化成非间充质起源的细胞(例如，神经细胞和上皮细胞)的能力的间充质基质细胞。术语“间充质谱系前体细胞”因此是指能够分化成各种细胞类型的细胞，尽管该细胞是多能性的(与全能性相反)。不希望受任何特定理论约束，要理解“间充质谱系前体细胞”是中胚层谱系的细胞。然而，除非另外指明或上下文另外叙述，否则术语“间充质谱系前体细胞”不暗示对各种细胞的组织起源的任何限制。因此，通常，称作“间充质谱系前体细胞”的细胞不限于特定的组织起源，并且可以起源于例如骨髓、脐带、成人外周血、脂肪组织、骨小梁和牙髓。根据本发明的优选方面，“间充质谱系前体细胞”起源于脐带，更具体地起源于脐带的华通氏胶，如本文详述的那样。术语“间充质谱系前体细胞”包括亲代细胞和它们的未分化的子代。术语“间充质谱系前体细胞”还包括间充质前体细胞、多能性基质细胞、间充质干细胞和它们的未分化子代。根据本发明，强烈优选“间充质谱系前体细胞”是干细胞，如本文所定义，条件是所述干细胞不是全能性的。
术语“多”和“多个”如本文所用意指大量的，即，两个或更多个中的任一个数目。
如本文所用，“多能性的(multipotent)”是指能够产生几种成熟细胞类型中的任一种的细胞。术语“多能性的”涵盖祖细胞和此类细胞的所有仍然是多能性的子代。术语“多能性的”是指具有分化成超过一种不同的细胞类型的潜力的祖细胞。不希望受特定理论的约束，要理解多能性干细胞位于谱系层次的顶端，并且可以产生多种类型的分化细胞。不受限制地，多能性细胞可以在脐带、脂肪组织、心脏细胞、骨髓和牙髓中发现。在一些实施方案中，多能性细胞是多能的。
术语“血管周围的”或“血管周围区带”或“血管周围区域”,如本文所用，是指脉管诸如血管附近的物理区域或区带。“血管周围区带”或“血管周围区域”在图1中绘制为图标(5)。特别地，脐带的血管周围区带/区域(5)是指脐带的每根血管周围的每个区带/区域。血管周围区带/区域可以合适地定义为从每根脐带血管的外壁延伸3mm的空间(WO 2004/072273 A1)。举例而言，血管周围区带/区域已由Takechi等人,1993(Placenta vol.14；p.235-245)描述。
术语“血小板裂解物”是指可从血小板(也称为凝血细胞)获得的制品。血小板可从供体，优选人供体获得，可从多个采集单位的全血分离并汇集，或通过血小板单采采集：从供体获取血液，并使血液通过去除血小板的装置。在分离后，血小板(例如，(重新)悬浮在血浆中)典型地例如通过一个或多个冷冻/解冻循环进行裂解。血小板裂解物可从大量的商业供应商获得，例如，Macropharma(Mouvaux,France)，从临床血库获得，例如，意大利摩德纳综合医院血库(Blood Bank of the Polyclinic in Modena，意大利),但也可以从血液血小板直接制备，如例如由Naaijkens等人,Cell Tissue Res.,2012,vol.348,p.119–130和WO 2013/042095 A1所述。
术语“多能的(pluripotent)”如本文所用是指具有分化成三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)中任一个的潜能但不分化成生殖系细胞的细胞。典型的多能细胞可以分化成成年生物体的除生殖系细胞以外的所有细胞类型。在一个实施方案中，多能细胞是能够分化成哺乳动物机体的任一种细胞类型的细胞——不希望受任何理论约束，这些可以是大约260种细胞类型。多能细胞可以是自我更新的，并且可以在组织内保持休眠或静息。多能细胞优选地遵循下列的所有条件：(i)能够在未分化状态下增殖，(ii)在长期培养期间保持正常的核型和(iii)甚至在长期培养后保持分化成三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)中任一个的能力。
术语“代数”，缩写“P”后面跟着数字(例如，“P1”)是指细胞的培养物被传代培养的次数。因此，术语“代数”是可用来描述在细胞扩增期间的状态的术语。
术语“群体倍增”，缩写“PD”，在本文中用来描述细胞倍增的次数，例如，在从早期时间点t0至晚期时间点t0+x的时间间隔内。在这种情况下，x表示细胞数被倍增持续的时间间隔。例如，t0可以是原代分离的时间点，或启动某次传代的时间点。因此，术语“群体倍增”是指细胞扩增的术语。该术语通常是指在体外细胞倍增的次数。群体倍增(PD)通过下面的公式来计算：
PD＝log(N/N0)/log2
其中N0是接种的细胞数，以及
N是收获的细胞数
(Purpura等人,2004,Stem Cells.Vol.22,p.39-50)。
术语“累积群体倍增”在本文中用来指自特定的时间点(例如，细胞的原代分离)起，细胞群中的细胞在体外倍增的总次数。因此，术语“累积群体倍增”还是指通常在体外扩增细胞的术语。合适地，对每次传代都测定累积PD。累积PD数通过下列的公式计算：
n＝log(N/N0)/log2+X
其中n＝累积PD数，
N0＝接种的细胞数(即，在传代开始时)，
N＝收获的细胞数(即，在所述传代结束时)，
X＝在所述传代开始时的累积PD。
N0适宜地在传代开始前通过细胞计数测定；N0是细胞密度和培养皿的底表面的函数。N适宜地在传代结束时在脱附(例如，胰蛋白酶消化)后通过细胞计数测定。
累积PD是累加的(在此是上面公式中的X)；例如，当细胞在第一代P1期间经历5个累积PD并在随后的第二代P2期间再次经历5个累积PD时，则在P1+P2的总时程期间细胞经历了10个累积PD。定义刚分离的细胞的累积PD＝0。因此，在P0开始时，X＝0。由于在P0之前有时难以确定N0(并且因此难以对P0测定n)，因此累积群体倍增任选地向前仅从P1测定；然而，在这样的情况下，在本公开内容中具体指出这种情况。
有可能将累积PD表示为舍入为最接近的整数的估计值。当使用规定的培养条件时，则有可能以算术方式将代数转换成累积PD，且反之亦然。
术语“祖细胞”在本文中用来指这样的细胞，所述细胞可以是干细胞和/或干细胞的子代。祖细胞典型地是干细胞的子代，然而它们更多地在它们的分化潜能或自我更新能力方面受约束。祖细胞可以是例如，多能性的或单能性的。
术语“分泌”或“释放”，当在本文中与细胞结合使用时，一般是指从细胞外化到外部环境中的任何物质。所述物质典型地已经由细胞产生和/或修饰，尽管这不是必要条件。例如，一些细胞将蛋白质和/或调控分子(诸如激素、前列腺素和神经递质)和/或微泡和/或外泌体分泌至它们各自的外部环境中。例如，由细胞产生的前列腺素可以被外化至细胞的环境中。如本文所用，所述术语不限于体内分泌/体内环境，也不限于体外分泌/体外环境，除非上下文另外指明。
术语“细胞体积”或简单地说“体积”，关于细胞来说，是指如通过流式细胞术测定的细胞体积，具体来说，通过FACS分析，更具体地通过测定前向散射光(FSC)。在本公开的背景下，在细胞(例如，脱附的细胞，诸如经胰蛋白酶消化的细胞(在贴壁培养后)或用胶原酶释放的细胞(从组织分离后))处于悬浮时，即，细胞没有贴附到培养板或组织上时，测定细胞的体积。对SSC和任选地对细胞体积的测定在下文中描述。
术语“平均体积”或“平均细胞体积”是指两个或更多个单个细胞的体积的平均值，其中在第一步骤中，如本文所述通过流式细胞术测定每个单个细胞的体积，然后在后续的第二步骤，平均体积作为在第一步骤中测定的单个细胞的细胞体积的算术平均数来确定。典型地至少1,000个细胞经历第一和第二步骤用于测定平均细胞体积；换句话说，平均值代表至少1,000个细胞的平均值。
术语“干细胞”在本文中用来指能够产生表型和基因型相同的子代(“自我更新”)以及至少一个其他的最终细胞类型(例如，终末分化细胞)的真核细胞。术语“干细胞”所指的细胞可以是全能的、多能的或多能性的细胞，以及来源于其分化的祖细胞和/或前体细胞和/或谱系定向子代细胞。通常，术语“干细胞”可以指成体干细胞或胚胎干细胞。术语“干细胞”可以任选地指诱导性干细胞,诸如诱导性多能干细胞,但更优选地指没有被诱导的细胞。
术语“干细胞性”或“干细胞-样特性”/“干-细胞-样特性”可互换使用以表示细胞的特性，特别是自我更新的能力和产生分化细胞的能力。更明确地，具有干-细胞-样特性的细胞可以产生与它们的亲本相同的子代细胞(自我更新)，以及产生具有更有限的潜能的子代，诸如分化细胞。具有干-细胞-样特性的细胞的特征在于一定程度的潜能，即，产生分化的子代的潜能。具有干细胞-样特性的一些细胞可以能够产生多种分化细胞类型(例如“多能性的”或“多能的”),而其他细胞可以能够产生一种类型的分化细胞(“单能的”)。尽管具有干细胞-样特性的细胞具有自我更新的能力，但大多数体细胞，包括具有干-细胞样特性的那些细胞当在体外培养时，能够在复制停滞或衰老前扩增有限次数的累积群体倍增。在优选的实施方案中，根据本发明所述的间充质基质细胞是具有干细胞-样特性的间充质基质细胞。
通常，“基质(stroma)”是人或动物组织或器官的一部分，其在机械性支持组织方面，诸如提供连接性、结构性支持，和/或(优选地和)功能性支持组织方面具有一定地位。因此，在活体内，基质是生物组织，或器官的连接性、功能性支持框架(与实质相反，实质是组织的功能性方面)。术语“基质”如本文所用，是指任何器官的结缔组织细胞，例如但非限制性地，脐带、子宫粘膜(子宫内膜)、前列腺、骨髓、淋巴结和卵巢中的结缔组织细胞。在各个器官中，基质要理解为支持该器官的实质细胞的功能。因此，基质由不执行器官的特异性功能的所有部分组成，例如，结缔组织、血管、神经、导管等。因此，脐带的基质是由除了血管、血管周围区域和羊膜上皮以外的脐带组成的基质。术语基质可以指整个器官或其特定的解剖区域的基质。具体地，术语基质可以指脐带整体或其特定的解剖区域中的基质，即包含在脐带的特定段内的基质。
术语“基质的”当在本文中使用时是指存在于基质中或来源于基质的任何物质。该术语不限于“基质的”材料(例如基质细胞)驻留在基质内的位置，其还指存在于活的人体或动物体的器官中的基质中但后续从该器官提取或分离使得其不再存在于活的人体或动物体的器官中的材料(例如细胞)。换句话说，术语“基质的”是指特定体内来源的材料(例如细胞)，无论该材料(例如细胞)是否已经被提取或分离。已经从基质提取或分离的材料(例如细胞)在本文中也可以称作“基质-来源的”，“来源于基质”等。在本发明的一些优选实施方案中，基质材料(例如基质细胞)被提取或分离或已经被提取或分离，使得其不存在或不再存在于活的人体或动物体的器官中。
因此，“基质细胞”是如下的生物细胞，所述生物细胞存在于基质中或来源于基质，即，被提取或分离，使得其不存在或不再存在于活的人体或动物体的器官中。基质细胞是活的，除非另外指明，或上下文另外地说明。在许多器官中，成纤维细胞和周细胞是最常见类型的基质细胞。作为说明性实例，基质细胞可以是存在于基质(例如脐带的基质)中的细胞或已经从基质(例如脐带的基质)分离(例如提取)——和任选地扩增——的细胞。基质细胞典型地是非恶性细胞。
术语“同基因的”在本文中用来描述来源于个体或具有相同的基因型的细胞的任何物体，诸如相同的双胞胎或同一近交系的动物，或它们的细胞。
术语“全能的”如本文所用是指能够分裂并且产生生物体中的所有分化细胞的细胞。典型地，全能细胞能够产生完整的胚胎。在哺乳动物中，典型地仅受精卵和随后的卵裂球是全能的。
术语“脐带”，也称作“naval string”是指在胎盘动物中在新生儿和胎盘之间的导管。在出生前发育期间，脐带是胎儿的生理上和遗传上的部分。尽管脐带在整个胚胎形成期间均存在，其中它将胎盘与发育中的胚胎或胎儿联系在一起，但在本说明书中该术语专门指已经出生的婴儿的脐带。在人类中，脐带通常包括三根血管，即，两条动脉(脐动脉)和一条静脉(脐静脉)。三条血管典型地包埋在华通氏胶中。胎盘或其部分、新生儿或其部分都不是脐带的一部分；该术语专门指导管。
术语“单能的”是指具有干-细胞样特性的细胞，其可以仅产生一种类型的分化子代。这样的单能细胞还可以称作祖细胞。
术语“有活力的”如本文所用，当提及细胞时意指该细胞是活细胞。活细胞一般是有代谢活性的。尽管几种不同的着色剂和荧光色素可以用来染色无活力细胞，本文优选指定利用7-氨基放线菌素D(7-AAD)染色。7-AAD是膜不通透性染料，其一般从活细胞中被排出。其通过插入到富含G-C区中的碱基对之间与双链DNA结合。7-AAD可以在488nm处被发射，例如利用氩激光，并且在647nm的最大波长处发射荧光。使用7-AAC，细胞的活力可以通过流式细胞术，尤其是FACS(荧光激活细胞分选)测定。
术语“脉管(vessel)”(不应与“培养容器”混淆——参见该处),如本文所用，一般是指其中容纳和传送或循环体液(诸如血液)的管道或导管(诸如静脉或动脉)。除非上下文另外指明，术语“脉管”在本文中还具体地指脐带的血管。在人类和许多其他哺乳动物中，脐带正常地包含三根血管，即，一根静脉，其在体内将氧合的富含营养物质的血液携带到胎儿，以及两根动脉，其在体内将脱氧的、营养物质耗竭的血液运走；尽管已经报道了在脐带中仅存在两根血管(一根静脉和一根动脉)的偶然情况。
术语“华通氏胶(Wharton’s Jelly)”,缩写为“WJ”,是指胎盘动物来源的包含细胞的凝胶状物质。一般来说，华通氏胶包括基质细胞，更具体地是间充质基质细胞。此外，华通氏胶典型地包含粘多糖，诸如透明质酸和硫酸软骨素，以及水。尽管在眼球的玻璃状液中也记载过有华通氏胶，但在本说明书强烈优选的是，华通氏胶是新生的胎盘动物诸如人的脐带的一部分。在该情况下，华通氏胶还可以指胶状质脐带(substantia gelatineafuniculi umbilicalis)。换句话说，强烈优选本文所用的华通氏胶是脐带来源的，甚至更优选人脐带来源。如下文所述，脐带通常包括血管周围区域(5)、血管间区域(4)和羊膜下区域(1b)中的华通氏胶。
“血管周围的华通氏胶”或“PVWJ”或“VPWJ”都是同义词，是指脐带的特定解剖区域的华通氏胶，即华通氏胶的解剖区域位于脐带(5)的血管周围。对于人脐带的情况(其代表优选的实施方案)，PVWJ位于从血管的外表面向外延伸3.0mm或更小的区域中(对于综述，参见Davies等人,Stem Cells Translational Medicine,2017,vol.6,p.1620–1630)。因此，当位于距人脐带的血管的外壁3.0mm内的区域被完全取出时，血管周围区带并且因此包含在其中的任何血管周围华通氏胶被完全取出，视情况而定。还参见图1的图示。缩写“PVWJ”和“VPWJ”在本文中作为同义词使用，是指源自血管周围区带的细胞，包括“血管周围华通氏胶”,视情况而定，例如在附图图例中。血管周围华通氏胶(PVWJ)-来源的间充质基质细胞也可以称作“血管周围区带-来源的间充质基质细胞”。
术语“羊膜下基质”是指紧邻脐带的羊膜上皮(1a)的区带(1b)。对于人脐带的情况(其代表优选的实施方案)，羊膜下基质位于从羊膜上皮的内表面向内延伸3.0mm或更小的区域中。
术语“羊膜下华通氏胶”是指与脐带的羊膜上皮(1a)紧邻的羊膜下基质(1b)中的华通氏胶。对于人脐带的情况(其代表优选的实施方案)，羊膜下华通氏胶位于从羊膜上皮的内表面向内延伸3.0mm或更小的区域中。
术语“基质华通氏胶”,缩写为“SWJ”,如本文所用，是指不包括血管周围区域(4)的脐带的华通氏胶。因此，术语“基质华通氏胶”不包括血管周围区域(4)并且因此不包括来自血管周围区域(4)的细胞。尽管在本领域中关于血管周围区域是否包含间充质基质细胞存在一些争论，但这些争论对于本发明来说不重要，至少因为本发明不考虑从血管周围区域分离间充质基质细胞，至少出于血管周围区域不是根据本发明所述的细胞的来源的缘故。除非另外明确地指明，羊膜下基质(1b)包含在本文所提及的基质中。除非另外明确地指明，羊膜下华通氏胶包含在本文中称作“基质华通氏胶”的华通氏胶中。羊膜下华通氏胶包含在羊膜下基质中。缩写“SWJ”在本文中也用来指源自“基质华通氏胶”的细胞，例如在附图图例中。因此，参照图1，基质(并且因此华通氏胶的来源)最广义地包括脐带的所有如下那些区域，所述区域不是下列任一个的一部分：(1a)羊膜(或上皮)层；(2)脐静脉；(3)脐动脉；(5)血管周围区域；(7):脐带血。换句话说，最广义地，基质(并且因此华通氏胶的来源)包括(6)脐带腔中的华通氏胶加(1b)羊膜下(或间充质)层；加(4)血管间区域。优选地，除非另外明确地指明，羊膜下华通氏胶(1b)包含在本文中称作“基质华通氏胶”的华通氏胶中。优选地，(4)血管间区域包含在本文中称作“基质华通氏胶”的华通氏胶中。因此，基质(并且因此华通氏胶的来源)最广义地包括图1中图示为1b、4和6的脐带的所有那些区域。在本文中提供的关于脐带的解剖学定义部分地全部地与一些或所有文献中的定义有歧义的情况下，应以本文的定义为准。
在文献(Davies等人,Stem Cells Translational Medicine,2017,vol.6,p.1620–1630)中已经提出，从实用的角度来说，仅(1a)脐带内衬和(5)血管周围华通氏胶可以与其余的区域或区带清晰地解剖开。本发明在一个实施方案中考虑了这种清晰的解剖，即，将基质华通氏胶与(1a)脐带内衬和(5)血管周围区带(包括血管周围华通氏胶)分离。
本发明基于几个发现，这些发现相互关联并且因此结合在一起使得发明人获得了本发明的各个方面，这些方面将在下面全部单个地进行描述。因此，在本说明书中描述的各个方面彼此之间全部是可以组合的，即使没有明确地那样描述，除非上下文另外清楚地指明。本发明的所有方面尤其是基于下面的发现：脐带的基质华通氏胶将具有独特特性的细胞保持处于特别的能够扩增的状态，并且特定的分离程序可靠地提供这些潜在多能的基质细胞使得它们可以在培养中维持和扩增。
在本发明的情形下没有破坏或已经破坏任何人类胚胎。具体地，本发明的方法、细胞、或细胞群都不需要破坏人类胚胎。
获得间充质基质细胞的方法
在第一个方面，本发明涉及一种获得间充质基质细胞的方法。该方法包括：(a)从脐带分离基质华通氏胶或其级分，和(b)使所述基质华通氏胶或其级分接受酶处理，由此从所述基质华通氏胶或其级分释放至少一种细胞。
具体地，参照图1，图1代表(人)脐带的横截面和(人)脐带的多个节段(解剖区域)的示意性视图，所述方法可以描述为：一种获得间充质基质细胞的方法，其中所述方法包括：(a)分离基质华通氏胶(1b,4,6)或其级分，和(b)使所述基质华通氏胶或其级分接受酶处理，由此从所述基质华通氏胶或其级分释放至少一种细胞。
在步骤(b)后获得的细胞可以是多能的，或更典型的，是多能性的。任选地但优选地包括附加步骤，特别是在扩增步骤中，其在下文中详细描述。
在本发明的方法中，从脐带分离华通氏胶。这代表了相对于本领域中的普遍趋势的变革，根据该普遍趋势，骨髓(BM)-来源的间充质基质细胞(MSC)代表了被最广泛研究的成体MSC的群体，并且被认为是基于MSC的应用的金标准(例如Batsali等人,Blood,2013vol.122,p.1212)。然而，对骨髓的抽吸通常是有创的且有痛苦的。根据本发明所述的方法相对于从骨髓(BM)分离的一个巨大的优势在于在哺乳动物出生时很容易获得脐带，而为获得骨髓所需要的手术通常是的且是有痛苦的。患者、供者和卫生保健人员因此抵触使用骨髓来源的MSC，并且只要可获得可靠的替代品，他们可能甚至更抵触。
因此，根据本发明所述的方法的优势在于该方法是离体方法。优选地，完全避免了对活的人体或动物体的创伤。因此，本发明的方法优选地不代表通过手术或疗法来治疗人体或动物体的方法。由此，与如文献中所述从骨髓分离相比，成功地解决了痛苦方面、处置方面和伦理方面的问题。
与几个早期研究和报道的进一步的关键差异在于，根据现有技术，MSC可以有效地从围绕脐带血管的结缔组织分离(例如Batsali等人,Blood,2013vol.122,p.1212),而本发明依靠从不包括血管周围区带并且因此不包括血管周围华通氏胶的区域分离MSC。因此，本发明的发明人已经发现脐带的特定解剖区域应当有目的地选择以便实现如本文所述的优点。更具体地，根据本发明所述的方法的特征在于细胞的来源的特定解剖区域和/或脐带的特定切分和分段和/或特定的分离步骤和/或任选地特定的扩增步骤，全部如下文中所详述和实施例中所说明的那样。重要的是根据本发明细胞的来源的特定解剖区域，脐带的特定切分和分段，特定的分离步骤，任选地特定的扩增步骤的优选的和/或任选的实施方案和细节可以彼此以每种和任一种组合进行组合，除非上下文明确地教导根据本发明特定的组合是不可能的或是不合乎需要的。
在本发明的方法中，从脐带快速分离基质细胞是有利的。在优选的实施方案中，步骤(a)和(b)一起在小于6小时、更优选小于5小时、更优选小于4小时和最优选小于3小时的总时间内进行。小于3小时包括0.5-2.5小时和1-2小时的时间间隔。很显然步骤(a)和(b)一起的短持续时间还意味着步骤(a)本身的持续时间间隔很短。
除非另外指明，与细胞直接接触或间接接触的所有试剂、成分、培养器皿、容器和材料优选是无菌的，且更优选GMP级的。
所述方法及其实施方案的详述如下。
组织来源
根据本发明所述的方法的第一步骤是步骤(a)，其特征在于从脐带分离基质华通氏胶或其级分。步骤(a)优选地是机械步骤，即，其一般不依靠用于分离目的的化学或酶促步骤。因此，在优选的实施方案中，步骤(a)不包括在步骤(a)期间添加具有酶活性的成分。然而，如下面进一步描述的那样，酶处理对于后续的步骤(b)是很重要的。
词语“级分”当与基质华通氏胶结合使用时不特别地受限制，并且一般意指，在一些实施方案中，脐带的总基质华通氏胶的小于100％可以在本发明的方法中使用。例如，总基质华通氏胶的10-99％,诸如20-90％、30-80％、40-60％可以在一些实施方案中使用。在一些实施方案中，使用小于100％的原因可以是多种多样的，并且可以是因在回收100％的脐带的基质华通氏胶方面有实验性限制，或有特别目的地，例如当期望使用部分基质华通氏胶用于对比实验。尽管如此,优选期望使用尽可能大的级分，即80％或更多的基质华通氏胶,优选地，90％或更多。除非另外指明，否则％值是指一根脐带中包含的基质华通氏胶的总体积的百分数。
因此，根据本发明，从脐带分离细胞。脐带是胎盘动物来源的，但优选地，脐带是哺乳动物来源的。在胎盘动物中，脐带是将胎盘连接到发育中的胎儿并且在出生后即刻与新生儿连接的结构。胎盘或新生儿都不是脐带的一部分；脐带限于胎盘和新生儿之间的连接管。
脐带在出生后获得。优选地，脐带在出生后24小时或更短时间获得，诸如出生后12小时或更短时间，出生后6小时或更短时间，出生后3小时或更短时间，出生后2小时或更短时间，且优选出生后1小时或更短时间获得。因此，脐带可以在分离细胞前保存，优选在出生后最多24小时，优选在0-10℃的低温，优选2-8℃。然而，脐带在分离细胞前不进行冷冻。任选地，在分离细胞前用无菌水或无菌缓冲水溶液漂洗脐带。
在分离细胞前和期间脐带优选地在无菌条件下维持和处置。任选地，脐带可以通过用例如水性(70％体积/体积的乙醇)溶液或聚维酮碘进行简单的表面处理，接着用无菌水漂洗来另外地进行表面灭菌。
优选地，从人脐带分离细胞。人脐带(UC)足月重大约40g且平均直径为约1.5cm(Raio等人,1999,Eur.J.Obstet.Gynecol.Reprod.Biol.,vol.83；p.131-135)。因此，优选地，根据本发明使用的脐带是人脐带。经受本发明的方法的人脐带优选地具有大约40-65cm,诸如44-51cm的长度。
典型地，在健康的新生儿从健康的母亲(优选，人母亲)中出生后分离脐带。优选地，所述母亲在分娩前至少一个月期间避免吸烟、饮酒和服用精神病药物。
当提到从脐带分离基质华通氏胶或其级分时，这优选地意指使用不超过一根脐带作为起始材料。然而，还有可能的是使用超过一根脐带作为起始材料。在一个实施方案中，在根据本发明所述的方法中使用一根脐带作为起始材料。在该实施方案中，所有起始材料是自体的，即，同种异体的脐带材料不是起始材料的一部分，并且因此通过每一轮方法可通过本发明的方法获得的所有细胞源自一个单一供体。
有可能使用整根脐带作为起始材料，但同样可能使用一根脐带的一部分作为起始材料。当在根据本发明所述的方法中使用一整根脐带作为起始材料时，可以说该方法以“全面”的方式运转。因此，根据本发明的一个优选方面的方法包括步骤(a)、(b)和任选的(c),当使用一整根脐带作为起始材料时该方法称为“全面”流程。在此情况下，词语“整根”不排除脐带的多个小部分，例如，脐带的两端，被修剪或剪掉，因此不包括作为起始材料；其也不排除在本文所述的方法期间脐带被切分和/或分段；其更准确地意指基本上全部数量的脐带用作起始材料。对于来自足月分娩的人脐带的情况，整根脐带典型地重35-40克，或更准确地约40克。在一个实施方案中，全面流程以来自单一供体的35-45克脐带起始。起始材料，即脐带的量当然影响在根据本发明的方法的下游阶段期间所获得的细胞的总量。除非另外明确地指明，否则本文中所给出的所有量(例如细胞数)是指全面流程。词语“全面”与术语基质华通氏胶的“级分”不冲突，只要作出合理的尝试从一根脐带回收尽可能多的基质华通氏胶即可。
脐带的最外层(也称作脐带内衬、脐带组织或脐带衬膜,在图1中示意性地图示为1a)，不是本发明的方法中的细胞的期望来源。因为脐带本身是胎盘的延伸，因此脐带衬膜是覆盖胎盘的羊膜的延伸。脐带衬膜包括两层：羊膜(或上皮)层(也称作脐带衬膜)和羊膜下(或间充质)层。人脐带,例如，被单层/多层鳞状-立方上皮细胞覆盖(Copland等人,Placenta,2002；vol.23,p.311–321；Mizoguchi等人,J.Dermatol.Sci.,2004,vol.35,p.199–206)；这些细胞不期望在本发明的方法中被分离。在本发明的方法的一个实施方案中，期望不分离来自羊膜层的细胞或来自羊膜下层的细胞，因此此类细胞在进一步的下游任选的扩增中不用作起始材料。
脐带的内部组织架构由两根动脉和一根静脉以及粘液结缔组织(基质华通氏胶)的周围基质构成。华通氏胶被描述为包含成纤维细胞样细胞(Parry,1970,J.Anatomy,vol.107,p.505-518)且偶尔包含肥大细胞。另外，华通氏胶包含无定形基质，所述无定形基质富含蛋白聚糖，主要是透明质酸。
优选地在根据本发明所述的方法中使用的脐带来自足月分娩，也称作“妊娠足月”。更准确地，在根据本发明所述的方法中使用的人脐带来自妊娠38-42周内的分娩，更优选妊娠39-41周内。在一个实施方案中，人脐带来自自然(阴道)分娩；在备选的实施方案中，人脐带来自非自然分娩，例如，剖宫产。
在一个实施方案中，从人或动物分娩获得脐带不是本发明的一部分。在该实施方案中，本发明的方法在已经获得脐带后开始。换句话说，本发明的方法使用脐带作为起始材料后实施，所述脐带在步骤(a)前已经获得。
脐带的分段
此外，发明人已经发现机械性地切断脐带是有利的，如本文所述。切断优选地包括分段和切分，两者如本文所述。
在第一步骤中，将脐带分段是有利的，如本文所述。分段是任选的，但是优选的。特别地，分段使得后续步骤更容易处理并且可靠地重现。另外，分段提高了在后续切分步骤中对基质华通氏胶的分离效率。因此，分段优选地在下述的将脐带(节段)切分的步骤之前发生。
根据本发明所述的分段典型地通过物理手段实现，诸如剪刀或手术刀。通过将脐带分段，获得脐带节段(其说明参见例如实施例1)。术语节段在本文中用来指此类的脐带切割。优选的分段垂直于脐带。如本文所用，关于脐带，垂直意指切割脐带的方向相对于脐带方向的角度为约90°。对于角度的测定，脐带优选地以拉伸的方式放置，即，没有卷曲或弯曲。约90°意指75°-105°,优选80°-100°,更优选85°-95°。专业技术人员将还能够在缺少测量角度的装置的条件下基于其经验来垂直地切割脐带。尽管如此,如需要可以使用装置用于测定角度。
更优选地，垂直的节段优选地各自具有约1-约4cm,优选地约2-约3cm,和更优选约2.5cm的长度。在优选的实施方案中，在步骤(b)之前从脐带的一个或多个节段去除一段或多段血管。特别地，在对脐带分段(优选垂直分段)后，优选地去除血管，或更准确地去除血管的节段。
分段是任选的，但是有利的，因此优选是本发明的方法的一部分。所述分段优选地在无菌条件下进行。
切分以便获得基质华通氏胶
通常，哺乳动物脐带，且特别地人脐带，表现出组织区室化，其中细胞特征和细胞外基质成分彼此不同。基于结构和功能研究，已经记载了至少6个不同的区带或部分(也参见图1)：在此以从外向内的次序列举，而数字是指图1中的数字：脐带内衬(包括羊膜上皮和羊膜下细胞)(1)、(血管间)基质(经典地命名为基质华通氏胶)、血管间基质(4)、血管周围基质(5)、血管(2和3)、羊膜下基质(1b)、裂(clefts，未图示)。
在现有技术中，已经考虑到，假设血管周细胞典型地从血管系统附近迁移走，则华通氏胶中的大部分MSC源自血管周围区域(Davies等人，Stem Cells TranslationalMedicine,2017,vol.,6,p.1620–1630)。
然而，发明人已经获得了令人惊讶的发现，即当力求从UC中提取MSC时切分的方式是有利的，并且携带有具有优异特性的MSC的部分是基质华通氏胶。发明人令人惊讶地发现来源于基质华通氏胶或其级分的细胞具有优异的特性。因此，本发明的方法的一个至关重要的步骤是分离基质华通氏胶或其级分。
在分离基质华通氏胶之前，重要的是漂洗脐带，或特别是脐带节段。适合用于漂洗的是水溶液，理想地被缓冲处于或接近生理pH和等渗，任选地补充以抗生素。例如，HEPES-缓冲盐水溶液(HBSS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS),优选补充以300μg/ml庆大霉素和0.15μg/ml两性霉素B的HBSS是合适的。典型的漂洗时间可以是优选1-30分钟,优选约10分钟。在该时间期间，采用机械运动，例如震动，以便适宜地将脐带，或优选脐带节段，暴露于水性漂洗溶液。特别是在脐带已经被分段后，漂洗是很重要的，因为由此可以去除由分段所产生的在节段界面处的血液残留物。
然后，为了分离基质华通氏胶,优选地，脐带，或更优选地，脐带节段接受切分，如本文所述。由此，获得期望的基质华通氏胶。获得基质华通氏胶的其他方式合适地作为本文所述的切分的替代方法，并且也是本发明的一部分。然而，优选地，基质华通氏胶用过本文所述的切分方式获得。
为了分离期望的华通氏胶的目的，侧面切开脐带，或脐带节段，已被证明是有利的。优选地，脐带，或脐带节段被纵向切开，例如，利用手术刀。纵向意指平行于脐带的延伸方向。在多个切口上优选每个节段一个纵向切口。侧向切开，或更具体地，纵向切口使得脐带的各个节段可以后续被有效地分离，特别是可以分离基质华通氏胶，如下文所述。
如本文所详述和本文中实施例中所示，来自基质华通氏胶的细胞证明是高度有利的。因此，待被切分和选择用于本发明的下游加工的华通氏胶不包括血管周围区带,并且因此不包括任何血管周围华通氏胶。换句话说，待被切分和选择用于下游加工的华通氏胶是基质华通氏胶。来自根据本发明分离的基质华通氏胶的细胞较佳的发现是本发明人的令人惊讶的发现。以前通过精细结构、免疫组织化学(例如Akerman等人,Gynecol.Endocrinol.,2002,vol.16,p.299–306和Karahuseyinoglu等人,Stem Cells,2007,vol.25,p.319–331)和体外功能研究(Sarugaser等人,2005,Stem Cells,vol.23,p.220-229；Karahuseyinoglu等人,Stem Cells,2007,vol.25,p.319–331)已经确定在羊膜下(1b)、血管间(4)和血管周围(5)区域间细胞的数目和性质是不同的，并且在羊膜下、血管间和血管周围区域间在给定空间中的细胞密度不同：在羊膜下区细胞密度相当低，而血管周围区域具有最高的细胞密度(Takechi等人,1993,Placenta；vol.14,p.235-245；Karahuseyinoglu等人,2007,StemCells,vol.25,p.319–331)。要注意在本段落中术语“细胞密度”关于三维空间自由地使用，而在本公开内容的其余部分中该术语关于二维区域使用。例如，在早期研究中，粘附于浆膜且粘附于血管的样品被提议为脐带来源的基质细胞的来源(例如US 2004/0136967 A1)。尽管以前已知细胞可以从华通氏胶分离，并且不同的细胞群存在于华通氏胶中，但根据本发明对基质华通氏胶的特异性选择是比早期发表的方式(例如US 2004/0136967 A1)更特异的选择，与其他人所提出的方式(例如WO 2004/072273 A)不同的选择。因此，在物理性去除之前的切分与文献中的提议显著不同，依照文献中的提议在分离细胞前组织一般不重点选择和切分，但其中从细胞群分离期望的细胞，诸如通过对不希望细胞的选择性破坏(负性选择，参见，例如US 2004/0136967 A1)。根据本发明的发明人的知识，没有具体地知晓就均质性、尺寸(分别为体积和表面积)、分化潜能和干细胞性而言，源自脐带的基质华通氏胶的细胞优于血管周细胞。因此，与依照现有技术的主要思路相反，本发明人已经发现基质华通氏胶-来源的细胞在许多方面是优异的。这些方面中的几个在本文中的实验实施例中说明。通常，具有均一的形态和功能特性的细胞群可以想象到适合用于开发相对均一的基于细胞的产品。不希望受特定的理论约束，有可能均一性可以归因于下面的事实：即如果有的话，与血管周围区域相比，基质华通氏胶典型地包含更少的周细胞和内皮细胞。
本发明人令人惊讶地发现源自脐带的基质华通氏胶的细胞是特别有优势的。羊膜下基质(典型地包含华通氏胶)(1b)可以通过利用机械性手段刮下羊膜上皮(1a)的内表面来获得；然而，要小心以避免破坏或破碎羊膜上皮，羊膜上皮的破坏或破碎会导致不期望的获得一部分羊膜上皮。
优点包括细胞群的均质性和干细胞样特性。具体地，在缺少脐带血管和血管周围区带的情况下，并且因此缺少来自脐带血管和血管周围区带的细胞，可以实现这些优点。
因此，优选步骤(a)从脐带分离基质华通氏胶或其级分包括脐带或其节段的切分。优选地，其包括对脐带的节段的切分。在切分步骤期间，将期望的基质华通氏胶与具有血管周围区带的血管分开，血管周围区带可能包含血管周围华通氏胶。在切分步骤期间，还将基质华通氏胶至少与羊膜上皮分开。要小心以避免破坏或破碎羊膜上皮，羊膜上皮的破坏或破碎会导致不期望的获得一部分羊膜上皮。
切分优选地在无菌条件下进行。
切分是根据本发明的方法的步骤(a)的必要部分，即，从脐带分离基质华通氏胶或其级分的步骤。因此，在一个实施方案中，从脐带分离基质华通氏胶或其级分通过使脐带接受物理分离来实现，其中脐带的血管和血管周围区域以及脐带内衬的至少羊膜层被去除，并保留基质华通氏胶或其级分。
对于切分，或更准确地通过机械性去除进行的切分，已经证明是很有优势的，原因在于脐带已经如上所述被提前分段，并且另外如上所述被纵向切开。因此，在本发明的优选实施方案中，该方法的步骤(a)包括如上所述的分段步骤和此处所述的切分步骤两者。
从脐带分离基质华通氏胶或其级分的合适方式包括从脐带去除血管和血管周围区域。适宜地，还将血管周围区带(在文献中已经提示包含血管周围华通氏胶)与脐带内衬(特别是脐带内衬的至少羊膜层)分开。
因此，根据本发明的切分的特征在于从脐带物理去除血管和血管周围区域。根据本发明，血管和血管周围区域可以在步骤(a)之前被去除或作为步骤(a)的一部分被去除，后者是优选的。一种去除血管和血管周围区域的在技术上有优势的(是本发明优选的)方式的特征在于从脐带剥离血管和血管周围区域。例如，利用无菌手术钳剥离脐带的血管(两根静脉和一根动脉)。
本发明人已经观察到对血管的剥离，例如通过将血管拉出，也去除血管周围区域。在优选的实施方案中，血管周围区域全部被去除；这意味着一旦血管被去除则在脐带(段)中不留下任何属于血管周围区域的细胞。任何其他方法同样是适合的，只要血管周围区域被完全去除即可。靠近脐带血管系统的外壁的区带是血管周围区带。血管周围区带典型地位于从血管的外壁延伸约3mm或更少的区带内。当血管被剥离时血管周围区带与血管一起被去除。有可能位于靠近脐带血管系统的外壁的血管周围区域内的任何华通氏胶可以被称为血管周围华通氏胶。血管周围华通氏胶典型地位于从血管的外壁延伸约3mm或更少的区带内。当血管被剥离时任何血管周围华通氏胶与血管一起被去除。
因此，在优选的实施方案中，从脐带或脐带的节段剥离血管。可以通过机械性手段抓住一根或多根血管，诸如通过镊子或用于该目的的任何其他合适手段，并将一根或多根血管拉出来实现剥离。优选地，血管被一根接一根地拉出，但这不是严格的要求。在血管被剥离的同时，通常将脐带或其节段固定，例如通过利用机械性手段将其抓持，诸如通过镊子或用于该目的的任何其他合适手段。由此，可以施加机械力并可以去除血管。去除应当小心地进行，从某种意义上说，应当避免使血管开放和/或损失血管细胞或血管周细胞。去除应当小心地进行，从某种意义上说，应当避免拉出脐带基质，或备选地，保持在最小程度。
优选地，在所述步骤或去除血管后，对脐带或各个节段进行光学再检查以确保血管(并且由此还有PVWJ)已经被完全去除。
丢弃血管，包括在被剥离后附着于其的任何组织。这意味着血管，包括在被剥离后附着于其的任何组织，不接受进一步的下游酶处理步骤。根据本发明的方法，血管周围区带华通氏胶不用作分离细胞的来源。因此，血管周围华通氏胶不用作分离细胞的来源。为了说明的目的，在图1和2中，图示了血管周围华通氏胶(图1中的5)。
根据本发明，丢弃血管和血管周围的区域。血管周围的区域直径为至少约2.0mm，由此测量从血管的外表面向外(参见图2)延伸，诸如直径2.0mm，优选2.5mm和更优选3.0mm。因此，根据本发明，脐带的血管周围至少约2.0mm,诸如2.0mm,优选地2.5mm和更优选3.0mm不用作分离细胞的起始材料。方便地实现此的优选方式是从脐带，或更准确地从脐带节段物理去除(“剥离”)血管节段，如本文所述。因此，在优选的实施方案中，从脐带物理地去除血管，或从脐带的节段物理地去除血管节段。后一选项是优选的；这要求如本文所述在从所述脐带节段去除血管之前将脐带分段。
既然已经去除了血管和血管周围区域，则如下所述从不含血管的脐带或不含血管的脐带段获得基质华通氏胶：优选地，分离基质华通氏胶或其级分的附加特征在于从脐带衬膜(1a)物理分离羊膜下基质(1b)的步骤。这可以包括从脐带衬膜，特别是至少从脐带衬膜的上皮层，分离华通氏胶。由此，获得不含各个脐带内衬材料的基质(包含基质华通氏胶)。优选地，从脐带衬膜，特别是至少从脐带衬膜的上皮层，物理分离基质(可能包含华通氏胶)的步骤也对可如上所述获得的节段进行。出于实践的原因，该步骤通常逐段地进行(即，一个节段接着另一个节段)，尽管优选快速地执行此步骤。
基质华通氏胶典型地具有相对松散的胶状粘度；因此其可以从不含血管的脐带，或优选地不含血管的脐带节段机械性地切下。
优选地，机械性切下特征在于剥离。对于剥离，可以使用适合于或被设计用于此类目的的任何工具，优选地机械工具。所述去除优选地通过机械性手段；在本领域中公开了合适的机械性手段，例如在US20080181967 A1、WO2008146992 A1和WO2007080591 A2中。在一个实施方案中，使用机械性手段来从UC节段中剪下多片基质组织。在一个实施方案中，利用机械性手段剥离脐带(节段)的内表面。在一个实施方案中，机械性地去除羊膜上皮膜，例如，利用机械性手段。如果小心地完成剥离(这是优选的)，则上皮层不会被损坏，并且因此，通过剥离不会获得上皮层的细胞。
重要的是，当收集基质组织时不包括多片羊膜上皮膜。为了实现此，应当避免切割脐带内衬，或保持在最小程度。特别地，从脐带衬膜物理分离基质华通氏胶优选的特征在于剥离华通氏胶，优选地不机械性地切割脐带内衬，或仅最小程度地切割脐带内衬。“机械性地切割”包括通过施加机械力切开、挤压或以其他的方式影响组织完整性。在优选的实施方案中，“最小程度”由一个单一纵向切口组成，优选地所述单一纵向切口平行于脐带的方向。由此，脐带或脐带节段，视情况而定，被侧向打开，由此提供进入脐带内部的入径。
任选地，也不获得羊膜下层的细胞。为了实现此，非常小心地执行剥离，在脐带衬膜附近不施加过大的机械力。在此实施方案中，整个脐带内衬(包含羊膜层和羊膜下间充质层)是不需要的。
无论如何也不需要羊膜(上皮)层。丢弃在机械性取出期望的基质华通氏胶后遗留的任何不合乎需要的脐带内衬材料。
由此，获得基质华通氏胶组织。
基于根据本发明分离的细胞的有利特性，发明人得出结论，然而不希望受任何特定的理论约束，具有有益的增殖能力的不太成熟的细胞相对地进一步远离血管定位并且因此更靠近羊膜表面，而发现更多分化的细胞更靠近脐带血管。总之，发明人选择基质华通氏胶作为分离根据本发明所述的细胞的来源区域。
在优选的实施方案中，从脐带分离基质华通氏胶或其级分的步骤(a)包括如本文所述的切分步骤和如下所述的切碎步骤。
在更优选的实施方案中，从脐带分离基质华通氏胶或其级分的步骤(a)包括如上所述的分段步骤，如本文所述的切分步骤，还包括如下所述的切碎步骤。
通过机械性处理减小组织碎片的尺寸
优选地，通过切分获得的基质华通氏胶后续接受机械性处理，其目标是减小组织碎片的尺寸。机械性处理目标是切断基质华通氏胶内的物理连接，使得基质华通氏胶片的尺寸减小。关于如下所述的后续酶处理，机械性处理是有利的。基质华通氏胶的碎片的相对小的和相对均一的尺寸与几种优点有关：其与增加的表面积有关并且因此被认为使得材料可接近用于酶处理的酶，并且其允许血小板裂解物(其被认为包含生长因子和适合于MSC的其他成分)紧密接近基本上全部分离的华通氏胶。
优选地，通过利用锋利的剪刀和/或手术刀细细地切碎碎片进行机械性处理，但适合于机械性减小碎片的任意其他手段也是合适的，只要细胞基本上不被机械性损伤或破坏即可。例如，各种仪器可获自Miltenyi Biotec(Bergisch Gladbach,Germany)。无论如何，机械性处理优选地在无菌条件下进行。
机械性处理的(例如切碎的)组织任选地添加到水溶液中并分散在其中，以防止所述组织变干。水溶液理想地被缓冲处于或接近生理pH并且是等渗的，任选补充有抗生素。例如，HEPES-缓冲盐水溶液(HBSS)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，优选HBSS是合适的。任选地，所述水溶液包含处于合适浓度的抗生素。
优选地，机械性处理的(例如切碎的)组织随后被接纳(汇集)在合适的无菌培养皿中，诸如皮氏培养皿。在组织分离后且在酶消化(下文将描述)前，可以全面流程方式获得的全部切碎的组织重量一般为14克或更大，诸如16克或更大，或18克或更大。
酶处理
根据本发明，通过酶处理从脐带或其节段或其部分或由它们获得的切碎组织释放细胞。与早期的教导(例如Conconi等人,2011,Open Tissue Engineer.Regen.Med.J.,vol.4,p.6-20)相反，本发明人发现酶处理，特别是当在如本文优选描述的条件(即，温和条件)下执行时，产生了不以细胞损伤为特征的有利的MSC。
优选切碎组织的实施方案。因此，优选地，通过酶处理从切碎组织释放细胞，所述切碎组织获自脐带或其节段或其部分。
具体地，在本发明的方法的步骤(b)中，基质华通氏胶或其级分接受酶处理,由此从基质华通氏胶或其级分释放至少一种细胞。典型地，释放大量细胞。基质华通氏胶或其级分接受酶消化。具体地，细胞从基质华通氏胶释放，所述基质华通氏胶是脐带的特殊部分，并且可在如上所述的先前步骤(a)期间获得。根据本发明所述的方法的包括酶处理的步骤可以称作“酶处理”、“酶消化”等，或简称为“步骤(b)”。
酶处理可以任选地与从脐带物理分离基质华通氏胶并行地和/或后续发生；然而，更优选后续发生。更准确地，优选本发明的方法的步骤(b)在本发明的方法的步骤(a)之后。在该实施方案中，步骤(b)是根据本发明的方法中的仅有的加入酶活性的步骤。
本发明的方式与现有技术方式显著不同，本发明的方式的特征在于从脐带组织，具体地从基质华通氏胶释放细胞，而在现有技术方式中脐带组织本身进行培养，细胞从组织长出，例如由于从中迁移或细胞分裂或两者皆有的结果(US 2004/0136967 A1)。然而，根据本发明，通过酶处理而不是通过从中迁移或细胞分裂释放包含在基质华通氏胶中的至少一种细胞，或优选地大部分细胞。这对于分离来说，提供了在时间上的显著改良：如下文详述的那样，可以在几小时内从脐带分离细胞，而非几天(例如2004/0136967 A1)。
酶处理是其中通过利用至少一种酶的处理从脐带或其节段或其部分释放细胞的处理。合适的酶是蛋白酶。因此，利用至少一种蛋白酶的处理优选地从脐带或其节段释放细胞。蛋白酶(也称为肽酶或蛋白质酶)是执行蛋白水解的酶；通过水解肽键执行蛋白质分解代谢。优选地，蛋白酶能够消化至少一种细胞外基质蛋白，优选地胶原蛋白。最优选地，步骤(b)的酶处理是包括暴露于胶原酶的处理。换句话说，至少一种蛋白酶优选是胶原酶。任选地另外存在其他蛋白酶。在一个实施方案中，基本上不存在除胶原酶以外的其他蛋白酶。“基本上没有其他蛋白酶”意指添加的胶原酶制剂已经被纯化到合理地可能的最大程度和/或通过一般的实验室方法不能检测到胶原酶制剂中其他蛋白酶的活性。
用于根据本发明的提取的特别合适的和因此优选的酶是胶原酶(EC 3.4.24.7)。术语“胶原酶”是指能够破坏(更具体地说水解)细胞外基质蛋白胶原蛋白中的肽键的酶活性。胶原蛋白存在于各种组织的细胞外基质中，包括脐带。胶原酶协助破坏细胞外结构。胶原酶可从真核生物和原核生物来源获得，尽管来自原核生物来源，特别是来自细菌诸如梭状芽孢杆菌种属(Clostridium sp.)的蛋白酶在本文中是优选的。胶原酶可以分离自其天然来源，或重组产生，例如在大肠杆菌(E.coli)中重组产生。在一些实施方案中，优选来自其天然来源，例如梭状芽孢杆菌种属的胶原酶。例如，胶原酶可以来自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)。
除非上下文另外指明，否则“胶原酶”在本文中是指酶活性，而“胶原酶制剂”是指包含胶原酶活性的产品，该产品是市售的或不是市售的。胶原酶活性由存在于胶原酶制剂中的胶原酶酶(是纯的或不纯的)提供。
胶原酶制剂是可市售获得的。在一些实施方案中，使用的胶原酶制剂是无菌的或GMP级的。优选地，胶原酶制剂是胶原酶制剂NB4或胶原酶制剂NB5或胶原酶制剂NB6，它们均来自SERVA(Heidelberg,Germany)或任何其他与这些制剂中任一个等效的胶原酶制剂。等效性可以通过运行实施例2A中所述的方法来测定，利用NB4/NB6胶原酶制剂和待测定其等效性的胶原酶制剂平行地进行，任选地在滴定实验中测定等效的胶原消化活性。
任选地，使用的胶原酶制剂不含除胶原酶活性以外的任何酶活性。特别地，优选不存在透明质酸酶活性。在其他实施方案中，存在透明质酸酶活性。以前已经有报道胶原酶与透明质酸酶的组合可以是有利的(例如Bailey等人,Tissue Eng.,2007,vol.13,p.2003-2010)。然而，在本发明的实验实施例中，在不加入透明质酸酶的条件下获得了满意的结果。因此，优选在本发明中在酶消化期间不加入透明质酸酶活性。
在一些实施方案中，不存在除胶原酶活性以外的任何蛋白酶。在其他实施方案中，存在一种或多种非胶原酶蛋白酶的活性。其他蛋白酶可以是特异性蛋白酶或非特异性蛋白酶、内肽酶或外肽酶。因此，除了胶原酶以外，可以使用任选地其他酶活性，诸如特别是其他蛋白酶。此类其他酶活性可以存在于胶原酶制剂中或单独加入。例如，可以存在梭菌蛋白酶(EC 3.4.22.8,也称作梭菌肽酶B、溶组织梭状芽孢杆菌蛋白酶B、α-梭菌蛋白酶(α-clostridipain)、梭菌肽酶、胞内蛋白酶Arg-C)或等效形式，梭菌蛋白酶为一种在精氨酸的羧基肽键上切割蛋白的蛋白酶。在另一个非互斥的实施例中，可以存在酪蛋白酶c(EC3.4.24)。在另一个非互斥的实施方案中，可以存在胰蛋白酶(EC 3.4.21.4)，其为一种丝氨酸蛋白酶。
任选地，使用的胶原酶制剂不含除蛋白水解活性(即，胶原酶活性)和非胶原酶蛋白水解活性以外的任何酶活性。然而，在一个实施方案中，在另外存在透明质酸酶，仅仅存在透明质酸酶的条件下执行酶处理；这仅仅是任选的。
合适地，制备包含水和用于消化的酶(即，蛋白酶，更具体地胶原酶)和任选地但优选地缓冲剂的水溶液。缓冲剂确保pH处于所需的pH范围。可以使用适合于在所需的范围内缓冲pH的任何缓冲剂。
包含所述酶和所述缓冲剂、和水、和任选地更多成分的水溶液称为消化缓冲液。在一些实施方案中，消化缓冲液不含金属螯合剂诸如EDTA或EGTA。
优选地，消化缓冲液的pH为6.0-9.0,更优选7.0-8.0。这不仅接近于生理pH，而且还描述了合适的酶具有在pH 7.0-pH 8.0的范围内的pH最适值。因此，消化优选地在该pH范围内进行。pH优选地在发生消化的温度下测定。
任选地，在消化缓冲液中存在钙离子；例如，可以在制备消化缓冲液期间添加水溶性钙盐，诸如氯化钙。例如当酶处理是胶原酶处理时，钙离子的存在是有益的，并且因此是优选的。
任选地，肝素存在于消化缓冲液中。已知肝素是用于含血小板裂解物的液体组合物以避免凝结的合适添加剂(例如Lohmann等人,2012,PLoS ONE,vol.7e37839)。在根据本发明所述的消化缓冲液中肝素的合适浓度为0.1-100U/mL,诸如1-10U/mL,例如2U/mL肝素。mL是指消化缓冲液的总体积。一单位肝素(“豪威尔氏单位(Howell unit)”)是大致相当于0.002mg纯肝素的量，其是将1ml猫血液在0℃保持24小时所需的量("Online MedicalDictionary",2000,Centre for Cancer Education)。
为了起始消化，将消化缓冲液添加到待消化组织——或反之亦然。重要的是含酶水溶液(即，消化缓冲液)和组织混合在一起。优选地，将消化缓冲液和组织的全部立即轻轻地搅动以确保适宜的混合。通过所述添加，起始酶处理。
优选地，先前分离的基质华通氏胶来源组织和消化缓冲液以限定的比率混合。这与所述方法的重现性和在温和条件下消化(如果需要的话)以及其他的优势是相关的。
比率＝X mg组织/1ml消化缓冲液
当切碎的组织在与消化缓冲液混合之前任选地立即保存于盐水缓冲溶液(优选HEPES-缓冲盐水溶液，HBSS)中以防止组织干燥之前，在该实施方案中，所述限定的比率如下规定：
比率＝X mg(组织+盐水缓冲溶液)/1ml消化缓冲液
(“盐水缓冲溶液”不应与“消化缓冲液”混淆。“盐水缓冲溶液”一般不含任何消化酶，特别是不含胶原酶。)
在上面的两个公式中，X的合适范围是10-1000,优选50-500,更优选80-200,且最优选基本上为100。因此，在优选的实施方案中，100mg切碎组织/HBSS与1mL消化缓冲液混合。
除非另外指明，则胶原酶处理典型地在35-39℃,更优选36-38℃,和最优选在大约37℃的温度执行。因此，优选地，酶消化在35-39℃，诸如38-38℃,优选37℃的温度执行。如本文所述，源自脐带的组织接受胶原酶处理持续以确定的时间间隔(持续时间)。在本文中描述了合适的时间间隔。
优选地，酶消化在搅拌下进行。例如，发现以约50-100rpm的持续轻微搅拌，例如在轨道摇床上，对于消化是合适的。
在更优选的实施方案中，在温和条件下进行蛋白酶消化。本发明人已经惊奇地发现，在一个实施方案中，1小时的消化时间是合适的。更普遍地，与一些早期研究的建议相反，相对温和的条件适合于在根据本发明的方法中的消化。在早期研究中，可以提到WO2004/072273 A和Sarugaser等人,2005,Stem Cells,vol.23,p.220-229用于说明的目的：根据WO 2004/072273 A，推荐未知来源和浓度的胶原酶以例如0.1mg/ml或1mg/ml的浓度使用；推荐的胶原酶消化时间为12-36小时,诸如约24小时；根据Sarugaser等人(见上),使用1mg/ml胶原酶(来自Sigma,C-0130)；胶原酶消化时间为18-24小时。因此，在本发明的情形下使用的温和条件与早期研究所述的条件是有区别的。
“温和条件”或同义词“轻微条件”如本文所用，意指如下文所述的条件中的至少任意两个，但最优选全部三个：(1)消化时间，(2)酶活性和(3)血小板裂解物。酶活性当然与所使用的酶的类型，以及所使用的酶的量相关，所述量相对于其使用的体积(酶浓度)或相对于待消化的组织的量。
除非上下文另外指明，则(1)消化时间,(2)酶活性和(3)血小板裂解物的所有实施方案可以彼此组合。因此，通常，下述因素有助于温和条件：短的酶消化时间，低的酶浓度和hPL的存在。
在一个实施方案中，如下所述的短的酶消化时间与如下所述的低酶活性组合。如下所述的短的酶消化时间的优选实施方案还可以与如下所述的低酶活性的优选实施方案组合。
在一个实施方案中，如下所述的短的酶消化时间与如下所述的血小板裂解物的存在组合。如下所述的短的酶消化时间的优选实施方案还可以与如下所述的血小板裂解物的优选实施方案组合。
在一个实施方案中，如下所述的低酶活性与如下所述的血小板裂解物的存在组合。如下所述的低酶活性的优选实施方案还可以与如下所述的血小板裂解物的优选实施方案组合。
在特别优选的实施方案中，如下所述的短的酶消化时间与如下所述的低酶活性，并且还与如下所述的血小板裂解物的存在组合。如下所述的短的酶消化时间的优选实施方案，如下所述的低酶活性的优选实施方案和如下所述的血小板裂解物的优选实施方案可以彼此全部组合在一起。此实施方案在实施例2A中实现。
在不偏离本发明的前提下，(1)在本文中示出的消化时间，(2)在本文中示出的酶活性和(3)在本文中示出的血小板裂解物的确切数值的变化也是有可能的。例如，有可能减少本文示出的消化时间达例如50％，以及增加本文示出的酶活性达例如50％。技术人员基于他的一般经验并且基于一般的酶动力学观察结果(即，当相应地增加消化时间时较低的酶活性仍然可以足以消化指定量的物质，且反之亦然)，可以想象到和实施这样的变化。例如，有可能增加本文示出的消化时间达例如50％以及减少本文示出的酶活性达例如50％。各个变化的条件仍然可以称作温和条件。胶原酶一般不是自身催化的；因此随着时间推移在消化期间在一般不导致胶原酶的量减少的前提下变化是有可能的。
通过施加温和条件，可以在非常大程度上避免待分离的MSC严重受损伤。温和条件使得能够比以前可用方法获得更多部分的活细胞。
尽管本发明的方法在典型的实施方案中产生的总细胞数低于参照方法(参见图4B和4C)，但根据本发明的方法分离的细胞在典型的实施方案中的特征在于凋亡细胞的百分比低(参见图4B和4D)。这对于例如，任选的扩增是有优势的，这将在下文中描述。
(1)本发明人已经发现在本发明的方法中短的酶消化时间是有优势的。在由本发明人开始发现的实施例中，短的酶消化时间是1小时。基于此，一般来说，在优选的实施方案中，步骤(b)在小于5小时,更优选小于4小时和最优选小于3小时的总时间内进行。小于3小时包括0.5-2.5小时和1-2小时的时间间隔，以及上限小于3小时的任意时间间隔(诸如2.5小时、2.6小时、2.7小时、2.8小时、2.9小时和2.95小时)。所有这样的时间间隔可以称为“快速”或“短的”，尽管“快速”和“短的”也是个相对的术语，例如2小时当然比4小时更快/更短。快速进行酶处理避免了脱水问题和与持续长时间地暴露于非天然环境的细胞相关的其他可能问题；快速地进行酶处理还克服了Seshareddy等人(2008,Meth.Cell Biol.,vol.86,p.101-119)所述的困难。
已经提议短的酶处理时间间隔可以是有利的，特别是在利用透明质酸酶和胶原酶共同消化的情况下(Can等人,Stem Cells,25:2886-2895,2007)。有点令人惊讶的是，在本发明中，在缺少透明质酸酶的情况下，短处理时间也是有益的。这在两方面是很显著的：首先，在缺少透明质酸酶的情况下，预期一般不会发生透明质酸酶的不期望效应，诸如对细胞外环境和细胞表面的不合乎需要的广泛消化；其次，不希望受任何特定理论的约束，要理解单独胶原酶仅作用于细胞外基质，而不作用于所需要的细胞本身。尽管如此，温和处理，包括短的处理持续时间，对于细胞活力的优点是十分显著的。在一个实施方案中，酶消化是在不添加任何透明质酸酶的温和条件下的酶消化。在一个实施方案中，酶消化是在缺少透明质酸酶的温和条件下的酶消化。在优选的实施方案中，步骤(b)在小于5小时，更优选小于4小时和最优选小于3小时的总时间内进行，并且不添加任何透明质酸酶，或优选地缺少透明质酸酶。
理想地，步骤(a)和(b)都快速地处理。由此，可以在很少的时间内从脐带获得细胞。这代表了相对于一些早期研究的优势，这些早期研究依赖于长时间的酶消化脐带组织，或从脐带组织中长出细胞，或两者皆有。在优选的实施方案中，步骤(a)和(b)一起在小于6小时,更优选小于5小时,更优选小于4小时和最优选小于3小时的总时间内进行。小于3小时包括0.5-2.5小时和1-2小时的时间间隔，以及上限小于3小时的任意时间间隔，诸如2.5小时、2.6小时、2.7小时、2.8小时、2.9小时和2.95小时。很显然步骤(a)和(b)一起的短持续时间还意味着步骤(b)本身的持续时间很短。本发明人已经发现，在一个实施方案中，约1小时的消化时间是有利的。
(2)本发明人还已经发现酶活性的量很重要。酶活性当然与所使用的酶的类型，以及所使用的酶的量相关，所述量相对于其使用的体积(酶浓度)或相对于待消化的组织的量。
具体地，本发明人已经显示胶原酶活性的量很重要。为了描述本发明的目的，胶原酶活性以Wünsch单位表示。根据Wünsch(Wünsch单位，或PZ单位)，1单位(U)在25℃,pH 7.1每分钟催化1微摩尔4-苯基偶氮苄基氧基羰基-L-脯氨酰基-L-亮氨酰甘氨酰基-L-脯氨酰基-D-精氨酸水解(Wünsch等人,1963,Hoppe-Seyler's Z.Physiol.Chem.333,149-51)。
根据本发明的方法典型的特征在于在酶处理步骤(b)期间相对低的胶原酶活性。在本文中，对加入胶原酶的时间点标示指示量的胶原酶活性。例如，在步骤(b)期间胶原酶活性随着时间推移丧失的情况下，不加入额外的胶原酶。然而，胶原酶一般不是自消化的，因此是相对稳定的，并且可以合理地假设，在加入后，胶原酶在整个酶处理步骤(b)期间均存在。
胶原酶活性可以适宜地参照消化缓冲液的总体积来指示。在一个实施方案中，消化缓冲液包括0.01Wünsch U/ml至10Wünsch U/ml,优选0.05Wünsch U/ml至5Wünsch U/ml,优选0.1Wünsch U/ml至1Wünsch U/ml,优选0.15Wünsch U/ml至0.5Wünsch U/ml,优选地，例如约0.1Wünsch U/ml或约0.2Wünsch U/ml的胶原酶比活性。在一个实施方案中，胶原酶活性的下限不特别地限定，只要加入的胶原酶活性足以在5小时或更短时间内从组织释放间充质基质细胞即可。在这个和其他实施方案中，胶原酶活性的上限可以定义为不超过0.5Wünsch U/ml,更优选不超过0.25Wünsch U/ml,且具体为0.18Wünsch U/ml或0.09Wünsch U/ml。
在优选的实施方案中，在酶处理步骤(b)期间关于消化缓冲液，胶原酶以不超过0.5Wünsch U/ml,更优选不超过0.25Wünsch U/ml,且具体为0.18Wünsch U/ml的比活性存在。甚至更优选地，根据本发明的方法的步骤(b)中使用的胶原酶的活性在0.18-0.09Wünsch U/ml消化缓冲液的范围内(也参见实施例1)。此活性与依照WO 2004/072273 A和Sarugaser等人,2005,Stem Cells,vol.23,p.220-229所使用的胶原酶的活性不同。事实上，在一个实施方案中，在本发明的方法的步骤(b)期间的胶原酶活性可以定义为小于由WO2004/072273 A和Sarugaser等人(见前)所述的胶原酶活性。
备选地，胶原酶活性可以适宜地关于待消化的组织重量指示(所述组织的重量可以合适地通过在装入所述组织之前和之后对容纳所述组织的容器称重来测定)。所述组织，任选地包含在容器中，任选地包含盐水缓冲溶液(例如HBSS)。在一个实施方案中，合适的比率范围为0.01-10Wünsch U胶原酶/100mg组织，优选0.05-5Wünsch U胶原酶/100mg组织，优选0.1l-1Wünsch U胶原酶/100mg组织，优选0.15-0.5Wünsch U胶原酶/100mg组织，优选地，例如约0.1Wünsch U胶原酶/100mg组织或约0.2Wünsch U胶原酶/100mg组织。在一个实施方案中，胶原酶活性的下限不特别地限定，只要加入的胶原酶活性足以在5小时或更短时间内从组织释放间充质基质细胞即可。在这个和其他实施方案中，胶原酶活性的上限可以定义为不超过0.5Wünsch U胶原酶/100mg组织，更优选不超过0.25Wünsch U胶原酶/100mg组织，且具体地为约0.16Wünsch U胶原酶/100mg组织或约0.08Wünsch U胶原酶/100mg组织，或该优选范围内的任意值。在本发明中优选胶原酶活性与组织的总重量的比率小于由WO 2004/072273 A和Sarugaser等人,2005,Stem Cells,vol.23,p.220-229所述的胶原酶活性。
(3)发明人已经进一步发现在酶消化期间血小板裂解物的存在是有利的。这是发明人出人意料的发现。在本领域中存在一些偏见，即在血小板裂解物的存在下胶原酶将不能良好地发挥作用。例如，以前记载由于抑制剂诸如α1-抗胰蛋白酶，正常人血浆抑制溶胶原活性(Chesney等人,J.Clin.Invest.,1974,vol.53,p.1647–1654)。然而，发明人已经发现即使在血小板裂解物的存在下，胶原酶消化也是有效的。事实上，甚至处于在本发明中优选的非常少量的胶原酶时，胶原酶消化也是有效的(见上)。因此，优选地，血小板裂解物在酶处理期间存在。血小板裂解物可以获自商业来源或新鲜制备。许多医院、血库和研究所已经建立了制备血小板裂解物的实验流程，并且这样的裂解物在本发明的情形下一般是合适的。例如，其可以通过冷冻-解冻过程获得。这样的裂解物可以通过将血小板悬液冷冻然后将材料解冻来制备，尽管其他冷冻-解冻方案也是合适的，条件是它们导致血小板的细胞溶解。利用冷冻-解冻技术，该方法导致细胞溶胀和破裂，大概是因为冰晶形成，接着在解冻时收缩。因此，周期性溶胀和收缩最终导致血小板破裂。多个周期可以优先地用于更完全的细胞溶解，但“更完全的”细胞溶解不一定是必需的。可以存在不同的程度的血小板溶解，例如，通过血小板计数至少30％、至少50％、至少70％、至少90％或至多100％细胞溶解。任选地，在使用前从血小板裂解物去除未裂解的材料和其他碎片。
优选地，血小板裂解物包含裂解的哺乳动物血小板，和任选地哺乳动物血浆。在第二种情况下，血小板裂解物是包含血小板裂解物和血浆的组合物。为什么可以包含血浆的原因包括其中在其裂解前血小板没有完全从血浆分离的实施方案和/或其中在其裂解前血小板已经(重新)悬浮在血浆中的实施方案。优选地，在所述组合物中哺乳动物血浆的浓度小于总体积的约30％,小于总体积的约20％或小于总体积的约10％。优选地，在血小板裂解物中哺乳动物血浆的浓度为约0％-约10％,诸如约1％-约10％。任选地，血小板裂解物包含浓缩血小板。优选地，哺乳动物血小板裂解物是人血小板裂解物。优选地，血小板裂解物基本上不含哺乳动物血小板膜。
血小板裂解物可以从分离自全血或通过单采血液成分法分离的单一或汇集的供体捐献的血小板产生。优选地，单采血液成分法基于分离具有不同密度的物质，诸如离心，和/或单采血液成分法涉及吸附到包被有吸附材料的珠子上和过滤。
任选地，在本发明中使用的血小板裂解物可通过裂解包含血小板的悬浮液来获得，其中血小板任选地悬浮在血浆中。所述包含血小板的悬浮液优选地包含1x108个血小板/ml至5x109个血小板/ml,优选3.8x108个血小板/ml至1.2x109个血小板/ml,平均约7.9x108个血小板/ml。
还想到血小板裂解物的存在有助于促进酶消化的温和性。令人惊奇地是，本发明人发现血小板裂解物的存在对细胞的消化没有负面影响(其说明参见实施例2A和3)，尽管以前报道血小板裂解物负面地影响某些酶的活性，包括蛋白酶。因此根据本发明的方法的重要基础是酶处理，更准确地说胶原酶消化可以在血小板裂解物的存在下进行。
优选地，血小板裂解物在酶消化期间以0.01％至30％,诸如0.05％至20％,优选0.1％至10％,更优选0.5％至5％,更优选0.8％至2％且最优选约1％的体积百分比存在。“体积百分比”意指在消化缓冲液的总体积中存在的血小板裂解物的总体积。
本发明人已经发现，在酶消化期间血小板裂解物或其衍生物的存在，特别是以上面所示的比率存在，是有利的。
术语“血小板裂解物”,当在本文中提及时，包括可通过裂解血小板直接获得的血小板裂解物，以及其衍生物两者，诸如热灭活的血小板裂解物,无菌过滤的血小板裂解物等。在一些情况下，衍生物的使用可以是必需的或可推荐的，例如鉴于监管考虑。在更优选的实施方案中，血小板裂解物基本上不含污染原。基本上不含污染原的血小板裂解物在本文中定义为基本上不含传染原诸如病毒(有包膜的和无包膜的)、寄生虫、细菌和内毒素的无菌血小板制剂，即，含有不能利用基于培养、血清学或分子鉴定系统或利用LAL测试(内毒素)检测到的量的此类传染原的血小板裂解物。强烈优选灭活病原体的血小板裂解物(PI-PL)，参见，例如WO 2013/042095 A1和Iudicone等人,2014,J.Transl.Med.,12:28。
与在酶处理期间血小板裂解物的存在有几个相关的优点，这些优点是无法预期的，并且将在下文中描述。
首先，本发明人发现人血小板裂解物的存在不阻断胶原酶的酶活性，至少不达到将负面地干扰所期望的从间质基质中酶促释放细胞的程度。
其次，本发明人发现在血小板裂解物或衍生物的存在下通过消化可获得的细胞的特征在于具有优良的活力(参见，例如图4A)。
第三，本发明人发现在根据本发明的方法中在血小板裂解物或其衍生物的存在下通过消化可获得的细胞具有优良的增殖特性。因此，优选地，在步骤(b)中，在哺乳动物血小板裂解物(PL)或其衍生物,更优选人血小板裂解物(hPL)或其衍生物的存在下，使基质华通氏胶或其级分接受酶处理。
尽管血小板包含生物活性分子和生长因子诸如凝血因子、粘附分子和蛋白聚糖、碱性成纤维细胞衍生生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、HGF、血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1),TGF-β1和其他物质，但还已知它们包含蛋白酶抑制剂(Astori等人,Stem Cell.Res.Ther.,2016,vol.7,93)。鉴于此教导，在酶处理期间血小板裂解物可以适宜地存在的发现是很不同寻常的。
总体上，提取的具体条件，与根据现有技术所述的胶原酶消化实验流程不同，可以显示对细胞活力和细胞提取有益并且因此提供了出人意料有利的分离方法。具体地，有可能在根据本发明所述的分离方法期间获得比由Seshareddy等人(2008,Meth.Cell Biol.,vol.86,p.101-119)所述的方法更高的细胞收率。更具体地，根据本发明，有可能在分离方法期间获得比由Seshareddy等人(见前)所述的细胞收率高10-25倍的细胞收率。由于根据本发明分离的细胞的优良活力，如果需要，所述细胞可以在体外有效地扩增。
优选地，在根据本发明的方法中仅执行一次胶原酶消化步骤。这意味着如本文所述，源自脐带的组织接受胶原酶的处理持续以确定的时间间隔，并且在该时间间隔结束后，回收已经被物理分离或从组织上脱离的细胞，然而，剩余组织不接受一轮或更多轮次的胶原酶消化。相反，优选在该时间间隔结束和回收所述细胞后丢弃剩余组织。
在消化间隔结束时，经消化的混合物可以用含蛋白质溶液稀释，诸如补充了血小板裂解物的基础培养基。添加含蛋白质溶液的时机限定了消化时间的结束。基础培养基的类型不特别地限制，只要所述培养基适合于培养哺乳动物细胞即可，然而，优选地，适合于培养间充质干细胞和/或间充质基质细胞。含蛋白质溶液优选地包含肝素。
优选的基础培养基是MSCBM CD(用于间充质细胞的化学成分限定基础培养基，Lonza),且优选的补充剂是5％(体积/体积)人血小板裂解物(hPL)。
含蛋白质溶液，诸如人血小板裂解物的添加据信会抑制酶活性。不希望受此类理论的约束，所述添加还导致酶的稀释。优选地，相对于经消化的混合物的体积，添加至少1体积的含蛋白质溶液。含蛋白质溶液当然应当不是与细胞培养目的不相容的溶液，即，举例来说，其应当是无菌的，且任选地是GMP级等。
优选地，包含已经接受消化的组织的液体(消化后液体)后续接受分离。术语“分离”，如在本文中关于所述消化后液体所用，不特别地限制，并且通常意指细胞可以通过合适的方法从未消化的组织、不完全消化的组织和其他碎片分离，所述方法包括过滤和离心。在一个实施方案中，所述消化后液体被过滤以从未消化的组织、不完全消化的组织和其他碎片分离释放的细胞，例如通过过滤，例如通过120μm网过滤或通过纱布过滤，如前所述(例如Del Bue等人,2007,Veterin.Res.Comm,vol.31,p.289-292)。例如，50-150μm,诸如70-100μm的滤器孔径(网孔)是合适的。任选地，过滤材料是纱布；可以使用多层纱布。因此，优选地，包含已经接受消化的组织的液体通过纱布过滤。然后滤液被称为“经消化的混合物”。用于分离的另一合适方法包括低速离心；在这种情况下细胞仍然处于上清液中，而未消化的组织、不完全消化的组织和其他碎片被沉淀；在这种情况下，上清液被称作“经消化的混合物”。任选地，过滤和低速离心可以任意的顺序组合。备选地，分离通过仅过滤进行或通过仅低速离心进行，其中优选仅过滤。
优选地，经消化的混合物随后被离心，优选地随后过滤。专业技术人员可以将离心条件调整至适合于沉淀间充质基质细胞的那些条件，而不会损害它们的增殖特性和活力。例如，经消化的混合物可以使用250ml离心管以680x g离心15分钟。在离心结束时，去除上清液并将包含所期望细胞的片状沉淀物重新悬浮。理想地，在其中根据本发明的方法包括一个或多个扩增步骤的实施方案中，细胞沉淀物重新悬浮于与在(第一)扩增步骤时所使用相同的生长培养基中。根据本发明的扩增将在后面详细描述。
正常地，经消化的混合物包含多个细胞，即，细胞群。优选地，通过如本文所述的酶处理所获得的细胞群如所获得的那样直接使用，即，无需任何负选择(选择性破坏不希望的细胞)。合适的但任选的使用在于对细胞的扩增，这在下文描述。
分离程序的说明性实例描述于实施例2A中。如实施例3中所示，血小板裂解物的使用没有在释放细胞和它们的活力方面负面地影响胶原酶活性。这是出人意料的发现，因为以前报道血小板裂解物会负面地影响某些酶包括蛋白酶的活性。
酶处理优选地在无菌条件下进行。
如果需要，对单个细胞的分离可以例如通过连续稀释来实现。由此，可获得分离的单个细胞。连续稀释是步骤(b)后的任选步骤；然而，获得单个分离细胞不是本发明的主要目的；相反，优选步骤(b)后接着用于扩增细胞的步骤(c)，如下文中所述。
扩增
在分离期间，特别是在本发明的方法的步骤(a)和(b)期间获得的细胞，可以进行扩增(即，接受扩增)。所述细胞离体扩增。离体扩增允许技术人员选择用于培养的限定条件。这些将在下文中描述。
扩增的目标是将之前分离的细胞大量繁殖，所述细胞具有有利的特性。如在本领域中普遍的那样，扩增在培养基中发生。除非另外指明，则适合于扩增的条件包括一般已知适合于培养哺乳动物细胞，更具体地适合于扩增哺乳动物细胞的条件。
扩增是细胞培养/生产过程的时期，其主要特征在于高的细胞生长和高的有丝分裂活性。在本发明中，扩增尤其地服务于增加细胞数目的目的，这意味着产生增加数目的细胞，所述细胞优选是有有丝分裂活性的并且更优选处于指数生长期。通过扩增，可以获得较大的细胞群。根据本发明扩增细胞的步骤可以是在适宜的条件下允许细胞增殖的单一步骤；然而，更优选地，根据本发明的扩增包括多次传代，如下面进一步所述的那样。
扩增一般在无菌条件下进行，并且典型地还另外在对培养哺乳动物细胞来说必需的或有用的或推荐的条件下进行。
本发明的此实施方案基于下面的发现：华通氏胶的特定部分，即，基质华通氏胶，包含可以有效地和可靠地分离，并且随后有效地和可靠地扩增的细胞。因此，一旦细胞被分离，则有丝分裂地扩增其群体。
因此，任选地和非常普遍地，根据本发明的方法包括一个或多个附加步骤。具体地，在本发明的优选实施方案中，包括增加细胞数目的步骤，利用步骤(b)中获得的细胞的细胞分裂潜能。在这样的优选实施方案中，步骤(b)后面接着步骤(c)；步骤(c)包括扩增在步骤(b)中获得的至少一种细胞。步骤(c)在本文中还称作“扩增步骤”或简称为“扩增”。
选择扩增条件以适合于间充质基质细胞的离体生长和细胞分裂。由此，获得富含间充质基质细胞的培养物。不希望受特定理论的约束，能够想象对特定亚组的分离细胞选择培养，由此富集它们，或另外地所述细胞改变它们的表型。
根据本发明的扩增提供了与根据本发明的分离的如下协同作用：尽管在根据本发明的优选温和条件下分离的细胞的总数目可以(并且典型地)低于通过由US 2004 0136967A1和Seshareddy等人,Meth.Cell Biol.,86:101-119,2008所提出的方法可提取的细胞的总数目，但本发明人已经发现在根据本发明的优选温和条件下分离的细胞特别适合于扩增，例如就它们的高活力百分比而言(参见图4B的图示)，以及就它们的高增殖潜力而言(参见图9的图示),并且因此可以通过扩增根据本发明分离的SWJ来源的细胞获得高细胞数。换句话说，根据本发明的优选分离程序以及根据本发明的扩增具有协同的优点，即达到特定的细胞数需要较少的起始材料和/或较少的传代次数，因为接受扩增的大部分细胞是有活力的，并且它们的增殖特别良好。
优选根据本发明获得的脐带-来源的细胞仅仅是接受扩增步骤的细胞。在此类实施方案中，特别优选在扩增步骤期间不存在饲养细胞。
扩增典型地在培养容器中进行。更准确地，将确定要接受扩增的细胞接种在培养容器中。典型地此类培养容器是培养瓶、培养板和多层培养室(其中多层培养室典型地由彼此一个接一个上下叠在一起的大量培养板构成)。在本发明的情形下特别合适的培养容器是允许细胞贴附在培养室底部的培养容器；此类培养容器是具有平面底面的培养瓶、培养板和多层培养室。优选地，培养容器具有至少塑料底面。更优选地，培养容器是塑料培养容器。培养容器优选地具有扁平的底面(“平底的”)。
塑料的类型不特别地限制，只要其适合于培养细胞即可；然而，优选疏水聚合物诸如特别是聚苯乙烯，任选地被表面改性。表面改性可以通过等离子体技术来实现，该技术使得在聚苯乙烯表面上多个化学官能团可用，并且通常适合于细胞的贴附。此技术是现有技术的一部分，并且用于培养贴壁细胞的表面改性的塑料容器是可商购的。
然而，优选地，细胞培养容器的表面在使用前不用蛋白质包被。具体地，其没有用蛋白质诸如细胞基质蛋白如胶原蛋白和聚赖氨酸包被。
优选地，多次传代完成扩增。传代的细节在下文中描述。
生长培养基
用于根据本发明的扩增的生长培养基典型地包含基础培养基和一种或多种补充剂。广义上，所使用的基础培养基的类型不特别地限制。基础培养基典型地是基于水的并且是化学成分限定的。“化学成分限定”意指基础培养基由特定量的特定成分组成；化学成分限定基础培养基的优点在于它们可以可重复地制备，无需根据实验条件、实验室等发生变化。基础培养基通常是无菌的。用于哺乳动物细胞生长的基础培养基可商购自不同的商业供应商。
典型地，基础培养基包含的成分包括氨基酸、盐类(诸如氯化钙、氯化钾、硫酸镁、氯化钠、和磷酸二氢钠)、葡萄糖和维生素(诸如叶酸、尼克酰胺、核黄素、B12)、至少一种缓冲剂(诸如例如HEPES),并且典型地还包括着色剂(例如酚红)；然而，这不是必要的。大多数市售的基础培养基包括酚红作为pH指示剂(着色剂)，其允许持续地监测pH。
优选地，基础生长培养基是不需要添加贴壁基质以接种细胞的培养基。
优选地，基础培养基是无血清的。无血清意指其中不含人或动物血清。更优选地，基础培养基是化学成分限定基础培养基，其是无血清的。
优选地，基础培养基是化学成分限定的。化学成分限定基础培养基是适合于人或动物细胞的体外细胞培养的基础培养基，其中所有化学成分是已知的。具体地，化学成分限定培养基需要全部成分必须被鉴定并且其确切浓度已知。因此，化学成分限定培养基必须完全不含有动物来源的成分并且可以不含血清或血清来源的蛋白质，诸如胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白。化学成分限定基础培养基只包含重组蛋白和/或激素。为了实现此目的，化学成分限定培养基不含来自人或动物来源的成分，诸如蛋白和/或生长因子；特别地，其不含来自人或动物来源的白蛋白，也不含来自人或动物来源的生长因子。优选地其包含重组白蛋白和/或重组生长因子，通常来源于非人、非动物来源诸如植物细胞和细菌，和/或合成的化学物质诸如例如聚乙烯醇。
在一些实施方案中，化学成分限定基础培养基包含：
(a)常规基础培养基(诸如DMEM、F12或RPMI 1640,包含氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、抗氧化剂和能量来源)，
和
(b)一种或多种血清替代成分，任选地选自但不限于下列的开放性列表：重组白蛋白、化学成分限定脂质、重组胰岛素和/或金属离子诸如锌、重组转铁蛋白或铁、硒和抗氧化剂硫醇诸如2-巯基乙醇或1-硫代甘油。
基础培养基可以例如选自下列的列表但不限于下列：Eagle极限必需培养基(EMEM)、达尔伯克改良Eagle培养基(DMEM)、α-MEM、RPMI-1640、IMDM和其他培养基。如果需要，将一种或多种血清替代成分添加至这些培养基中。由此，获得无血清基础培养基。
更优选地，基础培养基是适合于培养间充质基质细胞和/或间充质干细胞的基础培养基。优选地，基础生长培养基适合于MSC的多次扩增传代，特别是人MSC，更具体地是基质华通氏胶来源的(优选人)MSC。
适合于培养间充质基质细胞和/或间充质干细胞的培养基是商购的并且这些中的一些被专门销售用于此类目的。例如，TheraPEAKTM MSCBM CD(为简便起见，在本文中始终称为MSCBM CD)是被其生产厂商Lonza描述为适合于间充质干细胞的化学成分限定基础培养基(Wakersville,MD,USA；Cat.No.95062-688)。实际上，本发明人已经鉴定出此基础培养基特别合适。因此，MSCBM CD是用于本发明中的优选基础培养基。
同样优选地是基本上与MSCBM CD等效的所有基础培养基。术语“基本上等效”在下文中定义。基础培养基组成在成分和它们的相对量方面的相似性可以通过色谱分析法和/或分光光度法的组合或类似方法来测试。
通常，发现合适的培养基对于细胞培养的整体性能来说是非常重要的。这个问题已经通过鉴定MSCBM CD和与其基本上等效的基础培养基作为特别合适的用于本发明的合适基础培养基来解决。MSCBM CD是用于间充质细胞的化学成分限定基础培养基并且商购自Lonza(Lonza,Wakersville,MD,USA),Cat.No.95062-688。MSCBM CD的变化形式，诸如特别是由与MSCBM CD相同的成分组成或包含与MSCBM CD相同的成分的基础培养基，尽管例如处于其他量或比率，或由与MSCBM CD的成分部分或全部不同的成分组成或包含与MSCBM CD的成分部分或全部不同的成分的基础培养基，虽然对MSC的生长的作用基本上相同，但当如本文所述使用时，同样包含在根据本发明的用途中。
其他基础培养基也适合于在本发明的方法中扩增MSC。例如，发明人已经发现DMEM也是可以使用的基础培养基，当包含在生长培养基中时其另外包含至少一种补充剂，如下文所述(数据未示出)。
在本发明的重要实施方案中，生长培养基包含基础培养基和至少一种补充剂，特别是血小板裂解物。因此，优选地，所述至少一种细胞在生长培养基中扩增，所述生长培养基基于基础培养基并且包含至少一种补充剂。血小板裂解物是优选的补充剂。
“基于”意指基础培养基，例如MSCBM CD，补充以至少一种补充剂。如果所述补充剂以液体形式添加，则基础培养基通过所述至少一种补充剂的添加而被稍稍稀释；然而，稍稍稀释不会导致任何的一般问题。在优选的实施方案中，补充剂可以选自包括下列的列表：人或动物血清，人或动物血小板裂解物，人或动物或植物细胞裂解物，一种或多种抗生素，肝素，补充性生长因子诸如胰岛素，或氢化可的松，氨基酸诸如谷氨酰胺或其低聚体。
优选地，生长培养基包含肝素作为补充剂。在生长培养基中肝素的合适浓度是0.1-100U/mL,诸如1-10U/mL,例如2U/mL。U代表肝素的单位(豪威尔氏单位)，如上所述。肝素可以添加到基础培养基中。
在特别优选的实施方案中，所述至少一种细胞在基于基础培养基MSCBM CD(Lonza,Wakersville,MD,USA；Cat.No.95062-688)的生长培养基中，或在与其基本等效的基础培养基中扩增。在本发明中，例如，MSCBM CD,已经证明对产生高的累积群体倍增/高细胞数是特别有优势的。
为了本发明的目的，通过使细胞生长来测试两种基础培养基是否彼此基本上等效，理想地所述细胞分离自同一根脐带，在基于所述基础培养基的生长培养基中在基本上相同的条件下测试，即，利用相同的添加物(例如血小板裂解物),以相同的量，在相同的培养皿中，在相同的温度下，等等，理想地平行进行。换句话说，为了测试所述两种基础培养基是否基本上彼此等效，生长测试中的仅有变量是基础培养基本身。所述细胞优选是基质华通氏胶-来源的MSC，如实施例1和2A中分离，并且如实施例2B中传代培养(“P0”)。来自P0的细胞，在胰蛋白酶消化后，然后平行地在基于第一基础培养基(例如MSCBM CD)的生长培养基和基于第二基础培养基(待测试基本上等效)的生长培养基中生长。当观察到下列两者时，所述两种基础培养基被认为是基本上等效的：每次接种(P1-P8)的平均累积群体倍增基本上相同(最大10％+/-偏离值)以及在第8次传代后获得的细胞的衰老(参见实施例11)基本上相同(最大10％+/-偏离值)。
在备选的实施方案中，所述生长培养基基于与MSCBM CD基本上不等效的基础培养基，其特征如下：每次接种(P1-P8)的平均累积群体倍增为与基于基础培养基MSCMB CD的其他的相同生长培养基相比至少高70％，并且在第8次传代后获得的细胞的衰老(参见实施例11)与在其他相同的基于基础培养基MSCMB CD的生长培养基平行生长的细胞的衰老相比为150％或更小。DMEM(可商购自不同的供应商)可以是此类基础培养基的一个实施方案。
优选地，生长培养基支持MSC的多谱系分化，特别是本发明的MSC的多谱系分化。如果需要，向基础培养基添加补充剂以驱动细胞分化成特定的谱系。对多谱系分化的测试在下文中描述。
优选地，血小板裂解物或其衍生物存在于生长培养基中。因此，在本发明中可用的生长培养基优选地包含血小板裂解物。更具体地，本发明人已经表明基础培养基MSCBM CD，或与其基本上等效的基础培养基与补充剂血小板裂解物的组合是特别合适地，并且这样的生长培养基是更优选地。优选地，当血小板裂解物存在时，在生长培养基中，不存在人或动物血清，且更优选不存在除了血小板裂解物以外的任何人、动物或植物细胞裂解物。在根据本发明的生长培养基中使用血小板裂解物代替人或动物血清，就传输朊病毒、病毒或在输注后诱发受者中的免疫学反应的风险以及根据良好制造规范(GMP)的监管约束而言，解决了与传统使用动物血清相关的问题。
如果血小板裂解物存在于生长培养基中，或更准确地说已经添加到基础培养基(诸如来自Lonza的MSCBM CD，例如，或与其基本上等效的基础培养基)中，则血小板裂解物也可以称作所述基础培养基的补充剂。
在此实施方案中适合作为补充剂的血小板裂解物一般对应于对于在上面描述的在酶消化期间添加血小板裂解物的实施方案所描述的血小板裂解物，然而，下面四个另外的更优选的实施方案另外理想地单独或组合地实现：
在第一个特别优选的实施方案中，血小板裂解物来自与脐带相同的物种(然而，一般不来自相同的个体)。在来自相同物种的血小板裂解物的存在下与培养相关的优势是令人惊讶的，特别是考虑到现有技术中针对使用相同物种的血小板裂解物用于培养基质细胞的偏见：例如，已有报道称马血小板裂解物对于马间充质基质细胞培养物的培养一般不是有利的(Russell等人,2016,Equine Vet.J.,vol.48,p.261-264)以及对于犬间充质基质细胞的分离和增殖，犬血小板裂解物不及胎牛血清(Russell等人,PLOS One,2015,vol.Vol.10,e0136621)。强烈优选所使用的血小板裂解物包含来自多个供体的血小板，所述血小板包括在每个制剂中用于抵消个体变异性并且获得更标准化和可重现的血小板裂解物产品；对通过全血来源的白膜层所获得的血小板的汇集是标准化程序，参见，例如Iudicone等人,2014,J.Transl.Med.,12:28。优选地，血小板裂解物来自哺乳动物血液。取决于目的，可以选择合适的哺乳动物作为血液来源。根据本发明意欲使用的哺乳动物原则上可以是所有动物，年幼的或成年的，从它们可以合理地采集所需量的血小板。在一些实施方案中，主要使用成年哺乳动物。非人动物的实例是屠宰动物和其他农场饲养动物诸如牛、猪、绵羊或家禽。优选哺乳动物血小板裂解物，强烈优选人血小板裂解物(缩写为“hPL”)。在一些实施方案中，哺乳动物是人。通常，添加的血小板裂解物优选来自与脐带/细胞相同的物种。具体地，对于培养源自人脐带的细胞，优选添加人血小板裂解物。血小板裂解物典型地与所述细胞是同种异体的。在一些实施方案中，血液供体是健康的并且满足由相关监管部门提出的要求。例如，血液可以满足国家食品/药品管理机关对期望用于食品和医疗用途的产品的要求，或满足在实施本发明的地理区域内的相应规章制度。人血小板裂解物可以，全部地或部分地(优选全部地)代替胎牛血清。在最优选的实施方案中，血小板裂解物来自人供体。在这些实施方案中，优选所述供体的年龄为约50岁、约45岁、约40岁或更小。
在第二个特别优选的实施方案中，当在细胞培养基中用作补充剂时，与处于相同浓度的牛血清，特别是胎牛血清(FBS)相比，血小板裂解物对细胞，特别是对根据本发明的华通氏胶-来源的MSC具有增加的生长促进活性。在一些实施方案中，与处于相同浓度的胎牛血清(FBS)相比，所述组合物对细胞具有至少20％的增加的生长促进活性。
在第三个特别优选的实施方案中，血小板裂解物在生长培养基中的浓度为约0.1％(体积/体积)-约20％(体积/体积)、优选约0.5％(体积/体积)-约10％体积/体积)、更优选约1％(体积/体积)-约5％体积/体积)、诸如1％(体积/体积)、2％(体积/体积)、3％(体积/体积)、4％(体积/体积)或5％(体积/体积)。约5％(体积/体积)已经证明是特别有用的(参见本文中的实施例)并且因此是优选地，特别是与适合用于间充质干细胞的化学成分限定基础培养基，诸如MSCBM CD(Lonza)，或与其基本上等效的基础培养基组合。
在第四个特别优选的实施方案中，添加到生长培养基中的血小板裂解物包括血小板的衍生物。备选地，血小板裂解物基本上不含哺乳动物血小板膜和/或其他细胞碎片。如本文所用，基本上不含意指仅有检测不到的量的血小板膜，或所述量的血小板膜不可以通过任何合理的、商业上标准的方法进一步减少，或所述量的血小板膜基本上不干扰血小板裂解物的使用。可以使用本领域中已知的任何合适的方法，诸如密度梯度，从血小板裂解物中分离血小板膜。
一些有用的实施方案在实施例0和2中提供。
优选地，血小板裂解物或其衍生物优选在整个或部分扩增步骤(c)期间存在。因此，优选地，在步骤(c)中，至少一种细胞在包含血小板裂解物(PL)或其衍生物、优选人血小板裂解物(hPL)或其衍生物的生长培养基中扩增。
不希望受任何理论约束，认识到血小板裂解物的存在提供营养物和生长因子并促成能够有效扩增细胞的环境。不希望受任何理论约束，还可想象到血小板裂解物的存在有助于中和或抑制在酶提取后残留的任何酶活性，并且因此有助于在后续扩增阶段期间条件的温和性。人血小板裂解物(hPL)优选用于人MSC。
因此，在本发明中，血小板裂解物(PL)可以是用于培养间充质基质细胞的动物血清的替代物(其说明和进一步细节还参见WO 2013/042095 A1)。血小板已知是大量生长因子的丰富来源，所述生长因子诸如PDGF(血小板衍生生长因子)、b-FGF(碱性-成纤维细胞生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)和TGF-β(转化生长因子-β)。
任选地，一种或多种抗生素存在于生长培养基中。如果这样，一种或多种抗生素可以作为补充剂添加到基础培养基中。在本发明的情形下，合适的抗生素包括例如两性霉素和庆大霉素，等等。在生长培养基中所述一种或多种抗生素的浓度优选地处于本领域中一般使用的浓度范围。备选地，在生长培养基中不存在任何添加的抗生素。
优选地，除了上面列举的那些以外不向基础培养基中添加任何附加的成分。具体地，更优选地，至少一种细胞在不含任何添加的血清，特别是不含牛血清，诸如胎牛血清(FBS)的生长培养基中扩增。为了该实施方案的目的，血小板裂解物不包括在血清定义内；换句话说，即使一些血清或痕量的血清可以包含在加入到生长培养基中的血小板裂解物中，所述生长培养基仍然可以说不含“添加的血清”，这意在规定在经典的意义上血清不作为细胞培养成分添加。在本发明中，FBS是不合乎需要的添加物，例如，因为其具有传递病毒和朊病毒疾病的风险。相反，本发明的方法在血小板裂解物的存在下有效地进行，例如，所述血小板裂解物作为FBS的替代物。对于人MSC的生长，人血小板裂解物优选作为优于FBS的添加物。
优选地，当细胞在生长培养板上传代时不提供或不存在贴壁基质。因此，当接种细胞时不提供或不存在任何贴壁基质和/或不将贴壁基质作为补充剂加入到基础培养基中。
传代
在优选的实施方案中，所述细胞可以经一次或多次传代扩增。
“传代”是指(特定类型的)培养容器中的细胞培养物，在所述培养容器内细胞被接种以起始各次传代。正常地，在细胞进行繁殖时，其贴附于所述培养容器，并且在繁殖的同时，所述细胞正常地在所述培养容器内扩增。代次的结束被定义为正常贴壁细胞的脱附(例如通过胰蛋白酶消化)。随后细胞被任选地接种到相同或不同类型的新培养容器中；所述接种到新培养容器中限定了后续代次的起始。因此，当细胞在经历这样的扩增后从该培养容器转移到另一个培养容器时，在该另一个培养容器内存在的细胞代表下一代。
“收获”是指在传代结束时获得在培养容器中生长的基本上所有细胞的过程。
对于每一次传代，可以使用一个培养容器；然而更优选地，每一次传代平行地使用多个培养容器。然后细胞平行地在所述多个培养容器中培养，在基本上相同的条件下持续基本上相同的时间。优选地，在所述多个培养容器中的接种密度基本上相同。
在每次传代开始时，将细胞(未贴壁的/分离的，优选以所需的数目/密度)加入到包含生长培养基的培养容器中。
尽管对于细胞生长是不需要的，但经常使用抗生素来控制细菌和真菌污染物的生长。这在早期的代次时是特别优选地，但在后期的代次时不优选，诸如例如从P2向上或从P1向上。因此，即使在细胞分离后的第一代(“P0”)存在抗生素，对于P0后的所有代次均优选停止抗生素；换句话说，对于P1和所有后续的代次可以使用不添加抗生素的生长培养基。因此，在本发明中，在从脐带分离细胞后的第一次细胞培养(例如P0)中抗生素优选作为补充剂存在，但在后续的细胞培养中，即P0的子代中则不存在。
在每一代的结束时，当细胞已经达到根据下表中的标准3的汇合百分比时，收获细胞。对于该目的，吸取生长培养基(和包含在其中的任何未贴壁细胞，如果有的话)，贴壁细胞任选地利用合适的无菌缓冲液洗涤并且任选地但优选地用酶消化脱附，诸如胰蛋白酶消化，任选地进行计数，任选地但优选地通过离心浓缩，并且任选地但优选地重新悬浮，优选地在适合于MSC的生长培养基中，如本文中所述。然后重新悬浮的未贴壁细胞任选地用来在后续培养代次开始时加入。
如下文详细描述那样连续地对代次编号，以0代开始(P0)。P0是在获得细胞后的第一代，优选地如上所述通过酶消化获得。因此，P0可以称为“原代培养”。用于原代培养的接种的细胞源自脐带的华通氏胶，源自机械和/或酶解离的组织，如上所述，或——备选地但不太优选地——源自迁移细胞从基质华通氏胶组织的长出。
通过使细胞多代次地生长，与仅在一个单一代次中可能出现的相比，细胞可以扩增到较高的总细胞数和/或较高的均质性和/或被不期望的细胞较少的污染。所述细胞可以在限定的条件下或在另外期望的条件下进行扩增。
通常认识到就结构、生物学特性和UC内的定位而言，脐带(UC)的基质细胞是不均一的。例如，图7A示出了根据本发明和根据现有技术的刚分离的UC来源的细胞就某些表面标志物的展示而言是不均一的。
典型地，从基质华通氏胶分离的细胞(从脐带的任何其他区域分离的细胞也不都是)不全部都是克隆形成细胞。换句话说，不是所有分离的细胞都是集落形成单位(CFU)。然而，通过使根据本发明分离的细胞生长多代，可以富集所期望的间充质基质细胞，所述间充质基质细胞是克隆形成细胞。因此，在一个实施方案中，根据本发明的扩增的特征在于MSC的百分比随时时间推移增加。例如，在P0结束时MSC的百分比典型地比在P0开始时MSC的百分比高。
在本发明中，多次培养传代赋予的优势是，相对于其他(非期望的或污染的)细胞(如红细胞)，可以富集MSC，因为(a)在一次培养传代结束时未贴壁(因此非-MSC)细胞与生长培养基一起被去除，(b)增殖特性差于MSC的细胞基本上不如MSC那样增殖良好，因此，在几次累积传代的过程后细胞群变得富含MSC，并且最终(一般从P1向上)MSC是基本上纯的。
一般有可能将代数通过算术转换成累积群体倍增，只要使用限定的或另外公认的条件即可。
细胞优选地多次传代进行扩增，优选地大于1代至小于14代。例如，所述细胞培养3-6代。
在一个精确的实施方案中，在酶消化后，刚分离的细胞初始地接受原代培养(其示例性说明参见实施例2B)——所述原代培养代次可以称为P0；任选地在用于P0的条件下在新一次传代中重复扩增(则所述重复的培养代次称为P0+)。后续的传代，即，在直接在P0后，或在P0+后，用数字编号为P1、P2，以此类推。在优选的实施方案中，细胞被扩增至少持续到P2且不超过P6。在最优选的实施方案中，细胞被扩增至P4为止。
关于累积群体倍增，一般难以确定P0期间的累积群体倍增。主要原因在于，以本发明人的经验，在P0开始时接种的细胞不都能扩增。为了确定P0期间的累积群体倍增，需要确定在P0开始时克隆形成细胞(即，能够扩增的那些细胞)的数目或分数，由此得到子代细胞的起源。尽管这样的确定本身一般不是不可行的，但其不是本发明的方法所需要的；相反，在这样的实施方案中，对除P0以外的所有代次确定累积群体倍增。尽管初始从脐带分离的细胞典型地包含MSC(其是克隆形成的)以及其他细胞(例如，红细胞，其是非克隆形成细胞)，但所述其他细胞在P0以外基本上不存在，如下所述，特别是因为这样的非克隆形成细胞在P0期间不产生后代。
在一个实施方案中，细胞被扩增持续5-30个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增),诸如8-25个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增)。在一个优选的实施方案中，细胞被扩增持续仅5-14个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增)。此实施方案适合于建立原始细胞库。
在备选的优选实施方案中，细胞被扩增持续14-25个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增)。此实施方案适合于建立继代细胞库。
以发明人的经验，在P1和P2期间(P1加P2的总和，但不包括P0)的累积群体倍增，一般来说，正常在7-15的范围内，优选9-13。以发明人的经验，在P3和P4期间(P3加P4的总和，但不包括P0、P1和P2)的累积群体倍增，一般来说，正常在4-12的范围内，优选6-10。因此，在P1、P2、P3和P4期间(P1加P2加P3加P4的总和，但不包括P0)的累积群体倍增，一般来说，正常在9-27的范围内，优选15-23的范围内。这些数字不包括P0期间的累积群体倍增。
在每次传代开始时，将细胞转移至细胞培养容器。优选地，每个培养容器转移特定量的所述细胞。所述量优选地定义为细胞培养容器的二维表面的函数。由此有可能以限定的细胞密度开始传代。在本发明的情形下用于起始培养传代的细胞密度如下：
在P0和P0+(如果适用)的每个开始时，接种全部可获得的细胞。因此，不规定确切的用于起始P0和P0+(如果适用)的细胞密度。无论如何，用于起始P0和P0+(如果适用)的细胞密度应当为8.000个细胞/m2或更高。
如对于间充质基质细胞普遍的那样，本发明的细胞当在培养容器中生长时一般是贴壁细胞，所述培养容器特别是具有塑料底表面的培养容器。优选地，无论选择哪种生长培养基，细胞都是贴壁的。无论如何，更优选的是，当在根据本发明的优选生长培养基中繁殖时所述细胞是贴壁的。
在每次传代结束时，收获细胞。对于该目的，它们任选地但优选地通过酶消化脱附，诸如胰蛋白酶消化。如普遍已知的那样，胰蛋白酶是适合用于蛋白水解消化细胞粘附分子，并且因此将贴壁细胞从培养容器分离和彼此分离的市售酶。“胰蛋白酶消化”因此意指利用胰蛋白酶——或具有胰蛋白酶样消化谱的任何其他酶——在适合于此类消化的条件下处理。用于胰蛋白酶消化哺乳动物细胞，特别是间充质细胞的标准方法也适合于胰蛋白酶消化根据本发明获得的细胞。用于此类目的的胰蛋白酶制剂可商购，并且可以根据生产厂商的说明书使用。备选地，利用胰蛋白酶以外的合适酶进行酶促脱附。
在酶促脱附后，例如通过胰蛋白酶消化，任选地但优选地测定总细胞数(每个培养瓶或每个培养板或每个多层培养室或在各次传代中使用的全部培养容器的每个总数)。
当在本文中提到细胞扩增直至特定代次时，例如至P4，则这意指在该各个代次后细胞的扩增不再继续进行或停止。
在每代后，优选评估下列的验收标准：1产量，2活力，3汇合率，4形态学。在细胞的酶促脱附前确定验收标准3和4。在细胞的酶促脱附后确定验收标准1和2。细节如下。
优选地，必须满足所有4个验收标准。
对汇合率的显微镜测定针对测定细胞培养容器的表面积被粘附于其上的细胞覆盖的百分比。
如果不满足汇合率标准，则细胞进一步扩增，并且定期观察以便发现哪个时刻满足汇合率标准。
为了测定产量，将细胞酶促脱附，例如接受胰蛋白酶消化，并将规定的一部分含细胞悬液接受自动细胞计数，诸如通过计数。然后基于所述部分通过算术方法确定细胞的总数。
对形态学(即，细胞形态学)的显微镜测定针对测定粘附于细胞培养容器的底面上的细胞的形状。对于MSC来说，典型地是大部分细胞是纺锤形的。为了说明的目的，显示包含此类细胞的细胞培养皿的底面上的视图的照片显示在图5C中，图例称为“SWJ”)。
对活力的测定确保制备细胞库和/或接受随后的传代的细胞适合用于进一步的扩增(在冷冻和解冻后，视情况而定)。本发明的细胞与根据现有技术的方法分离的MSC相比活力更优。由此，并且通过依赖于根据本发明的扩增，可以获得大的细胞群，即使当从脐带的基质华通氏胶初始分离的细胞总数相对低时。因此，可根据本发明获得的细胞在它们的增殖潜力方面较优。
冷冻
细胞可以冷冻，例如依照标准程序，速冻于液氮中。很有可能将此类冷冻的细胞化冻并且将它们在化冻后进一步培养传代。冷冻可以整批地或以等分试样进行。
当在本文中提到细胞扩增直至特定代次时，例如至P4，则这意指在该各个代次后细胞的扩增不再继续进行或停止。示例性但典型的实施方案是在各次传代后冷冻细胞。有可能在反复传代后反复冷冻。例如，细胞可以在P2后和/或P4后冷冻。优选地，细胞在P2后和P4后冷冻。
冷冻细胞和冷冻细胞群也是本发明的主题。冷冻细胞群可以称作细胞库。可在本发明的情形下获得的合适的细胞库将在下文中描述。
在一个实施方案中，细胞在5-30个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增),诸如8-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻。在一个优选实施方案中，细胞在仅5-14个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻。此实施方案适合于建立原始细胞库。在备选的优选实施方案中，细胞在14-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻。此实施方案适合于建立继代细胞库。
用于冷冻哺乳动物细胞，特别是间充质细胞的标准方法适合于冷冻根据本发明获得的细胞。优选地，细胞于–70℃或更低(诸如–80℃)的温度冷冻，任选地提前在–190℃或更低的温度速冻。在一个实施方案中，所述细胞冷冻于液氮中。
冷冻的细胞可以任选地但优选地以冷冻的形式保存。用于保存哺乳动物细胞，特别是间充质细胞的标准方法适合于保存根据本发明获得的细胞。优选地将细胞冷冻于小瓶中。在一个实施方案中，冷冻的细胞保存在液氮中。
在优选的实施方案中，在冷冻前将细胞分成等分试样。用于容纳可根据本发明获得的细胞的等分试样的合适容器是适合于接收各种量(等分试样)的细胞和用于在低温保存的所有容器，尤其是小瓶。小瓶(也称作有塞小瓶(flacon))是适合于保存液体的小玻璃或塑料容器或瓶子。适合于本发明的小瓶的性质不特别地限制，只要其允许容纳处于所指示的培养基的细胞即可，并且只要其适合于在细胞仍然处于允许其后续解冻和传代的状态的条件下被冷冻即可。因此，为此目的，小瓶必须是可耐受冰箱的(冻存瓶)。小瓶可以由任何合适的材料制成，尽管玻璃小瓶和由塑料诸如聚丙烯制成的小瓶是最典型的。小瓶可以被封闭，为此目的，其典型地具有盖子，并且适合于根据本发明的用途的冻存瓶优选地适合于在–196℃或更低的温度下冷冻。盖子的选项包括螺口小瓶(用螺旋帽或滴管/移液管封闭)、唇形小瓶(lip vial)(用软木塞或塑料或塑料塞封闭)和钳口瓶(用橡胶塞和金属帽封闭)，或者，对于塑料小瓶的情况，还包括“铰盖”(按盖),当按压时其快速关闭。小瓶的底部优选地是平坦的，然而这不是严格的要求。优选地，在一个指定的分离/扩增过程中使用的所有小瓶都彼此相同，并且填充以相同体积的含细胞液体(处于培养基，典型地处于悬液中的细胞，但这不是必要条件)。
优选的小瓶具有适合于容纳2-10ml处于培养基(典型地处于悬液中，但这不是必要条件)中的细胞的尺寸，诸如3-8ml处于培养基中的细胞，且最优选约4ml处于培养基中的细胞。优选的小瓶具有适合于容纳处于培养基中的106-109个细胞的尺寸，诸如处于培养基中的10x106-100x106个细胞，且最优选处于培养基中的约20x106个细胞。
冷冻的和/或保存的细胞可以任选地但优选地被解冻。在解冻后，细胞可以任选地接受进一步培养(继代培养)，包括扩增。用于解冻和任选地继代培养特别是间充质细胞的标准方法适合于解冻根据本发明获得的细胞。为了进一步培养或继代培养，本文所述的方法，包括生长培养基等是合适的。
在优选的实施方案中，细胞在第2代(P2)后冷冻。在P2后获得并冷冻的细胞在本文中称作“原始细胞库”或“PCB”，或备选地“主细胞库”。在一个优选实施方案中，原始细胞库包括在5-14个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞或由在5-14个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞组成。
在另一个优选实施方案中，细胞在第4代(P4)后冷冻。在P4后获得并冷冻的细胞在本文中称作“继代细胞库”或“SCB”，或备选地“工作细胞库”。在优选的实施方案中，所述继代细胞库包括在14-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞或由在14-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞组成。
优选地，PCB实施方案和SCB实施方案联系起来，使得细胞首先被冷冻作为PCB,然后后续地，所有或部分PCB被解冻并进行继代培养，然后在两次进一步传代(总共P4)后获得SCB。优选地，不是在P2后获得并冷冻的所有细胞，例如不是整个PCB被解冻并一起继代培养。而是，最优选地，将作为PCB获得并冷冻的一个容器(典型地一个小瓶)解冻并继代培养，而其他容器(小瓶)仍然作为PCB冷冻。
重要的是要注意在本文中指定提到的个别代次用于指导的目的。例如，还有可能在除P2以外的代次后制备PCB。在P2后制备PCB和在P4后制备SCB的偏好性基于在基于基础培养基MSCBM CD或与其基本上等效的基础培养基的培养基中在实验实施例中具体描述的培养条件(特别是实施例2)下生长的经验。当使用其他培养条件(在本发明的情形下同样是可能的)时，在本文的实验实施例中，特别是在实施例2C中在分别对应于在P2和P4后观察到的累积群体倍增的累积群体倍增后理想地制备PCB和SCB。
如果需要，对单个细胞的分离可以例如在扩增前或扩增后通过连续稀释实现。除非具体地执行这样的分离，否则本发明的方法产生间充质基质细胞群。如下所述，与以前已知的方法相比，产量可以相对高，尤其是考虑到根据本发明的细胞的优异的活力和扩增特性。
产量
根据本发明的方法，包括步骤(c),产生间充质基质细胞群。在本文中描述了这样的间充质基质细胞群。优选地，本发明的方法提供了不含血细胞的细胞群。在本发明的方法中产生的细胞群的更多方面在本发明的第三方面中描述。
在优选的实施方案中，在根据本发明的扩增期间产生的细胞被等分并任选地冷冻。用于等分和冷冻细胞的合适时间点是在任一次传代结束后，以及后续的酶促脱附,例如胰蛋白酶消化、离心和重新悬浮于生长培养基中后。如此获得的并通过冷冻保存，优选地以等分试样保存的细胞(细胞群)也可以称作细胞库。
在一个优选的实施方案中，细胞在P2后被冷冻。如此获得的并通过冷冻保存，优选地以等分试样保存的细胞(细胞群)也可以称作原始细胞库。在一个优选实施方案中，原始细胞库包括在5-14个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞或由在5-14个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞组成。
在一个附加的但不互斥的优选实施方案中，细胞在P4后冷冻。如此获得的并通过冷冻保存，优选地以等分试样保存的细胞(细胞群)也可以称作继代细胞库。在优选的实施方案中，所述继代细胞库包括在14-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞或由在14-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞组成。
如此获得的来自各个细胞库的冷冻的等分试样可获得用于在所需的时间点个别地解冻。换句话说，没有必要——并且一般不期望——在相同的时间点解冻细胞库的所有等分试样。相反，对等分试样的等分和单个地冷冻提供的优势在于单个等分试样可以在单个时间点以及单个期望的时间点从冷冻移出，解冻和接受进一步培养(继代培养，进一步扩增)。
从人脐带开始并包括步骤(c)以及运行至P2代的全面流程典型地产生至少1x109个细胞，更优选至少2x109个细胞，更优选至少3x109个细胞，更优选至少4x109个细胞，更优选至少5x109个细胞，更优选至少6x109个细胞，更优选至少7x109个细胞，更优选至少8x109个细胞，更优选至少9x109个细胞的原始细胞库(PCB)，并且在一些实施方案中，至少10x109个细胞的原始细胞库。在一个优选实施方案中，原始细胞库包括在5-14个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞或由在5-14个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞组成。
然而，由于本发明的细胞的优异增殖特性，所述细胞可以在P2以后良好地繁殖。这可以通过将在P2期间获得的一些或所有细胞在酶促脱附(例如胰蛋白酶消化)传到后续的代次(P3)，或通过在P2后建立原始细胞库，然后在所期望的时间点将来自所述原始细胞库的一个或多个小瓶解冻，由此起始后续的代次(P3)来发生。在任何情况下，P3可以接着一个或多个额外的代次，并且任选地，可以产生继代细胞库，例如在P4后。由于优异的增殖特性，在较晚代次(例如P4)后的细胞的总数一般将显著地高于在P2后的细胞的总数，其典型的产量如上所示。例如，在P4后，细胞的总产量可以比P2后高至少10倍，但更典型地比P2后高至少100倍-至少1000倍。在一些实施方案中，在P4后，关于一个全面流程，总产量可以为至少10x1012个细胞。任选地，在P4后制备继代细胞库。在优选的实施方案中，这样的继代细胞库包括在14-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞或由在14-25个累积群体倍增(不计数P0期间的累积群体倍增)后冷冻的细胞组成。
所述产量可以任选地通过进一步继代培养，例如P5代以及以后的代次来进一步增加。
分化潜能
本发明的细胞的潜力可以通过实验来评估。通常，这通过使细胞接受有助于分化成一种或多种特定细胞类型的条件来完成。
优选地，在步骤(c)后获得的细胞至少是多能性的,并且任选地是多能的。在典型的实施方案中，在步骤(c)后获得的细胞是多能性的。多能性可以通过分化测定来测试，所述测定如本领域中所普遍知晓的那样。在特定条件下，多能性细胞将分化成组织(脂肪形成，软骨形成和骨形成)。实施例12、13和14示出了根据本发明的细胞具有这样的能力。在特定条件下，细胞将分化成不同组织的组织(脂肪形成，软骨形成和骨形成)。优选地，可通过本发明的方法获得的多能性细胞具有下列分化潜能中的至少全部：(a)脂肪形成；(b)软骨形成；(c)骨形成。实施例12、13和14显示了根据本发明所述的细胞具有这样的能力。在这些实施例中，特别是实施例12，描述了允许分化的具体条件，尽管对本发明的基质华通氏胶-来源的细胞进行了快速扩增。
任选地，所述细胞具有进一步分化潜能，所述分化潜能选自间充质基质细胞典型的分化潜能。然而，如对于间充质基质细胞典型的那样，本发明的细胞典型地不是全能的。
然而，本发明的细胞典型地不是全能的。尽管如此，所述细胞可以任选地接受遗传操作和/或核再编程，由此可以影响分化潜能。
与本发明的其他方面的关系
通过本发明的方法，如本发明的第二个方面中所详述的那样，可以获得细胞。通过本发明的方法，如本发明的第三个方面中所详述的那样，可以获得细胞群。例如，通过本发明的方法，可以获得细胞库。在一个实施方案中，可以通过根据本发明的第一个方面所述的方法获得细胞库。在该实施方案中，本发明的方法的步骤(c)任选地接着等分细胞的步骤(d)和保存细胞的步骤(e)。细胞可以在任何合适的条件下保存，尽管在180℃或更低的温度冷冻是最典型的。细胞可以被冷冻，优选地速冻于液氮中。可以在冷冻之前添加冷冻保护剂。
因为本发明的各个方面彼此相关，关于第二个和第三个方面所述的实施方案也可以在第一方面中解读，且反之亦然。例如，通过显示基本上缺少内皮标志物蛋白，通过表达谱分析或表面标志物测定，如在本发明的第二个方面中所述，可以通过实验来确认根据本发明的第一个方面所述的方法的方面已经被正确地实现，即，去除上皮。
特别优选的是可通过本发明的第一个方面的方法获得的细胞群是下面进一步如本发明的第三个方面中所述的细胞群。还特别优选的是根据本发明的第一个方面所述的获得细胞的方法产生如在本发明的第二个方面中所述的细胞；因此，本文中被描述为以根据本发明的第二个方面所述的细胞为特征的所有实施方案和特征也适合于以根据本发明的第一个方面所述的获得细胞的方法为特征。还特别优选的是可通过本发明的第一个方面的方法获得的细胞是如下如在本发明的第二个方面中所述的细胞。
间充质基质细胞
在第二个方面，本发明涉及间充质细胞。更准确地，所述间充质细胞是间充质基质细胞(MSC)。所述细胞的特征和实施方案将在下面进行描述。
根据本发明所述的细胞的一些特征和实施方案将在下面进行描述，它们涉及本发明的细胞的物理特征。仅用于说明，并且尽管本文其他地方所公开的细节，物理特征包括可以利用物理方法直接确定的那些特征，诸如细胞的基因表达、尺寸、形状等。根据本发明所述的细胞的一些特征和实施方案将在下面进行描述，它们涉及可获得或获得本发明的细胞的方法。仅用于说明，并且尽管本文其他地方所公开的细节，与可获得或获得本发明的细胞的方法相关的细胞的特征可以包括：(a)细胞的解剖学来源，特别是脐带和作为其优选部分的基质华通氏胶，(b)被应用用于分离所述细胞的条件，和任选地但优选地还包括(c)被应用用于扩增所述细胞的条件。
分离的细胞
优选地，根据本发明所述的细胞是分离的细胞，特别是分离的间充质基质细胞。具体地，本发明的间充质基质细胞优选地是源自脐带的血管间区域(其图示参见图1)的分离的间充质基质细胞，或来源于此类细胞。分离的基质细胞可以通过包括如本文所述的分离的方法从所述基质获得。细胞可以通过扩增来源于此类细胞。因此，通常，当提到给定的细胞“来源于”另一细胞，则这意指该指定的细胞通过扩增(细胞分裂)和/或分化源自所述另一细胞。
在一个实施方案中，所述细胞是分离的细胞，所述分离的细胞位于人体或动物体的外部。分离的细胞通常是在其生理体内环境外的细胞。优选地，所述细胞是离体细胞。具体地，所述离体细胞优选地位于脐带外。具体地，所述离体细胞优选地不接触血管，无论是直接接触还是间接接触。在一个实施方案中，所述离体细胞处于培养容器中。在一个实施方案中，所述离体细胞在适合保存的容器中，诸如在小瓶中。在一个实施方案中，所述离体细胞处于约35℃-39℃的温度，优选地在培养容器中。在一个实施方案中，所述离体细胞在适合冷冻保存的容器中，诸如在冻存瓶中，优选地处于–180℃或更低的温度。在一个实施方案中，所述离体细胞在培养容器中。在一个实施方案中，所述离体细胞是有代谢活性的细胞。在一个实施方案中，所述离体细胞被冷冻。
在一个实施方案中，所述细胞的特征在于至少一个特征——结构性的或功能性的——该特征一般不存在于人脐带的细胞中。例如，此类特征可以是对可获得本发明的细胞的方法特异的特征。此类结构性或功能性特征可以选自在本公开中明确描述的特征，和/或选自在本公开中没有明确描述但却是本发明的细胞所固有的特征，例如可通过本发明的方法获得的细胞所固有的特征。在一个实施方案中，所述细胞是贴壁细胞，例如贴附于培养容器，诸如具有塑料底面的培养容器。
根据本发明的分离的基质细胞可以通过培养在体外扩增。由此可以获得衍生的细胞。所述衍生的细胞也是本发明的细胞，只要其符合所要求保护的定义本发明的细胞的特征即可。因此，由于本发明的细胞的干细胞-样特性，本发明可以涵盖多代细胞。多代可通过如本文所述的扩增来获得。实际上，根据本发明所述的细胞的具体实施方案包括对细胞的离体扩增。因此，尽管细胞被分离，但其能够得到相同或相似细胞的子代，并且因此产生细胞群。这样的细胞群在本发明的第三个方面中描述。合适的培养条件不特别地限制，但包括在本发明的第一个方面中描述的那些。
用于分离细胞的合适的但非限制性的方法，包括酶处理，在本文中在本发明的第一个方面的情形中进行描述。如果需要，对单个细胞的分离可以例如通过连续稀释来实现。因此，优选地，本发明的细胞是在离体环境中的细胞，诸如体外。用于在体外培养细胞的各种方法可以由技术人员来实施，包括关于本发明的第一个方面所述的那些。
通常，间充质基质细胞可以源自各种组织，诸如骨髓、脂肪组织和脐带。优选地，根据本发明所述的细胞源自或来源于脐带,更优选来自脐带的基质华通氏胶。然而，本发明的细胞不来自脐带血。所述细胞也不是上皮细胞或内皮细胞。
在一个实施方案中，本发明的细胞是刚分离的细胞。刚分离的细胞是通过从其起源的组织分离直接获得的细胞，诸如通过上述方法。然而更优选地，本发明的细胞是来源于刚分离的细胞的细胞，最典型地通过体外扩增。对于在刚分离细胞后在体外传代或累积群体倍增的次数没有限制；然而，本发明的细胞典型地通过在体外扩增12代或更少，或等效次数的累积群体倍增，而来源于刚分离的细胞。通常，符合所要求保护的限定的任何细胞是根据本发明的细胞，无论在从组织来源刚分离后获得其的传代或累积群体倍增的次数为多少。
如对于间充质基质细胞普遍的那样，本发明的细胞当在培养容器中生长时典型地是贴壁细胞，特别是在具有塑料底面的培养容器中。因此，在一个实施方案中，本发明的间充质基质细胞在体外是表面-贴附细胞，特别是塑料-贴附细胞。如果需要，塑料-贴附细胞可以从培养容器脱附，例如通过胰蛋白酶消化。由此，可获得不贴壁的细胞。本发明还包括这样的不贴壁细胞。
在一个实施方案中，本发明的间充质基质细胞是纺锤形的。当间充质基质细胞贴附于培养容器，诸如具有塑料底面的培养容器时，这一般也适用。具体地，在间充质基质细胞群中，大多数，例如按细胞数计50％或更多，一般是纺锤形的，特别是当在体外贴附于塑料表面时。
当本发明的细胞不贴壁时，例如当其已经通过酶促脱附时，诸如例如通过胰蛋白酶消化，诸如例如当其存在于原始或继代细胞库中时，任选地被冷冻，所述细胞一般不是纺锤形的。因此，纺锤形与在培养条件下的表面贴附特别地相关。
在一个实施方案中，本发明的细胞可通过在本发明的第一个方面中描述的方法获得。在该实施方案中，本发明的细胞合适地选自刚分离的细胞，即，还没有接受离体扩增的细胞，或扩增的细胞，即，可通过之前刚分离的细胞的离体扩增获得的细胞。
基因表达和表面抗原展示
根据本发明所述的细胞可以通过基因表达谱表征。如本文所用，“基因表达谱”意指至少一个基因表达，或不表达，或以特定的水平表达，视情况而定。因此，此特定基因表达，或不表达或以特定的水平表达的事实表征根据本发明的细胞，例如用于与参照细胞区分的目的。这同样适用于表达一个以上的基因，诸如例如两个基因，三个基因，四个基因，五个基因，六个基因，七个基因，八个基因，九个基因，十个基因等。当本发明的细胞的特征在于表达一个或多个基因时，不需要具体说明在该情形中没有提到的任何其他基因的表达。作为说明性实例，在本文中提到本发明的细胞表达APCDD1的时候，这不应当被认为说明任何具体的其他基因也表达，或不表达，或以特定水平表达，除非上下文另外指明。
通常，基因的表达可以通过各种方法测试，在核酸水平上和在蛋白质水平上两者。基因表达可以相对常见地以分子生物学、生物化学和细胞生物学进行测试，并且已知的或对其合适的任何方法可以在本发明的情形中使用。一些方法在下文中描述。与基因表达相关的方法也可以称作是转录组学方法。因此，细胞的基因表达谱也可以称作转录物组。在一个实施方案中，本发明的细胞的特征在于其基因表达谱。
可以使用不同的术语来描述分析基因的表达：例如，所述表达可以称为被测试、分析、评估、测定、测量、确定等。这些术语包括定性测定和定量测定两者，定性测定即各个基因是否表达的问题，定量测定即各个基因以哪种水平表达的问题。
典型地，对于基因表达的测定，从细胞群获取一个或大量细胞(这是优选的)的样品，随后分析在该样品中的基因表达，其中该样品中的细胞可以被破坏或不被破坏，视情况而定。由于根据本发明的细胞群一般是同源的，意指包含在其中的基本上所有单个细胞是很像的或很相似的，因此对从所述细胞群获取的样品(代表性样品)中包含的细胞的基因表达的发现最终也将适用于该群中的其余细胞，除非上下文另有所指和/或所述细胞群似乎不是基本上同源的。
对任一个基因的表达的测定可以是非定向测定，即其中整体地测定(例如通过广泛方式，诸如微阵列)基因表达而不专注于一个基因，或定向测定，其中专门测试各个基因是否表达。特别是在第二种情况下，各个基因也可以称作“目的基因”。
可以使用几种转录组学技术来生成用于基因表达分析的数据。例如，DNA微阵列测量先前鉴定的靶基因的相对活性。基于序列的技术，如RNA-Seq,提供了除了基因表达水平以外的关于基因的序列的信息。
本发明的细胞是来自胎盘动物的细胞，优选哺乳动物，优选灵长类动物，更优选人。因此，在一个实施方案中，本发明的间充质基质细胞(MSC)是哺乳动物细胞。因此，除非另外指明，否则对特定基因的所有指示意指各个哺乳动物基因。
更优选地，本发明的间充质基质细胞是来自灵长类动物，更优选来自人的细胞。因此，更优选地，本发明的间充质基质细胞(MSC)是人细胞。因此，在该实施方案中，对特定基因的所有指示意指各个人基因。在一些情况下，从上下文中直接是显而易见的，诸如在人白细胞抗原(HLA)的情况下，在其他情况下在上下文中这些不具体提及；然而，其是显而易见的：例如，参照人细胞，APCDD1的表达意指人APCDD1的表达等。当在一个优选实施方案中本发明的细胞是人细胞时，优选在该实施方案中本发明的细胞表达人APCDD1。
优选地，本发明的细胞不是转基因细胞。因此，在该实施方案中，涉及特定基因的表达的所有指示意指各个基因从编码所述各个基因的基因组表达，更具体地，其中所述各个基因通过孟德尔遗传定律编码。然而，在一些备选实施方案中，本发明的细胞是转基因细胞。
优选地，至少在一式两份的样品中，优选至少在一式三份的样品中测试基因表达。在一些情况下，接受测试的细胞被破坏，暴露于非无菌条件或以另外的方式被损伤作为分析的一部分，并且不可以用于培养；尽管如此,从这些破坏的、暴露的或以其他方式损伤的细胞获得的信息仍然是有价值的，特别是当所述细胞源自同源细胞群时；这样获得的信息，特别是基因表达信息，可以合理地被假定不仅适用于被分析的破坏的、暴露的或以另外的方式损伤的细胞，而且也适用于各个被分析的细胞所来源的群体中的其他细胞。可以假设适用于细胞群本身或此类细胞群中包含的任意单个细胞两者。在此上下文中均质意指基本上所有细胞是很像的或很相似的。
样品可以由单一细胞组成，或其可以备选地包含多个细胞。对样品中包含的细胞的总数没有严格的上限；然而，该数字典型地大大小于细胞群中包含的细胞的总数；例如相对于细胞群中包含的细胞的量，其为1/100或更小、1/100或更小、1/1.000或更小、1/10.000或更小、1/100.000或更小、1/1.000.000或更小。
一般来说，基因的表达可以直接测试，诸如典型地通过分子生物学方法，包括测定基因产物的存在，以及，如果需要或期望，基因产物的水平，诸如特定的信使RNA(mRNA)或其前体或其降解产物；或者，备选地，基因的表达可以间接地测试，诸如典型地通过生物化学方法，包括测定由特定基因编码的蛋白质的存在，以及如果需要或期望，所述蛋白质的水平，诸如特定的细胞表面蛋白或其前体或其降解产物。用于表征本发明的细胞的合适的表面蛋白包括特定的分化抗原簇(CD)。
用于测试基因表达的任何已知方法也可以用于本发明中。合适的方法包括选自下列列表中的那些，包括但不限于基因表达谱分析、聚合酶链式反应，如PCR,诸如优选地定量PCR(qPCR),包括RT-qPCR，对转录产物的测序，任何类型的转录组学分析，等等。在核酸水平，优选的方法包括微阵列和qPCR。
在一个实施方案中，通过基因表达谱分析测定基因表达。在分子生物学领域，基因表达谱分析是指测量几个，经常是几千个基因的表达，典型地一次全部分析，以建立细胞基因表达的全局图像。例如，基因表达谱分析是一次测量几个，典型地但非必须地测量几千个基因的表达，以建立细胞的全局图像。基因表达谱分析，可以，例如区分本发明的细胞和其他细胞。甚至有可能同时测定整个基因组的表达，即，特定细胞中存在的每一个基因。此类中的许多实验同时测量整个基因组，即，特定细胞中存在的每一个基因。可以使用几种转录组学技术来生成用来分析的必要数据。在本发明的一些实施方案中优选微阵列。微阵列测定基因的相对表达，包括一个或多个目的基因，诸如，例如APCDD1。不希望受任何特定理论的约束，要理解的是，目前，基因表达谱分析在单一实验中提供了基因表达的最全局的可能图像。
通常，微阵列是用于基因表达谱分析的合适方法。实际上，微阵列优选地在本发明中用于该目的。如普遍已知的那样，微阵列显示与例如根据现有技术中所述制备的细胞相比，特定的具体基因是否在细胞中被差异表达。微阵列是可商购的并且可以在本发明的情形下使用。
在一个实施方案中，基因表达在高通量实验中测定。在备选的实施方案中，在非高通量实验的实验中测定基因表达，诸如例如针对一个特定基因的特定实验。在一个实施方案中，在高通量实验和为非高通量实验的实验两者中测定基因表达；在此情况下，高通量典型地首先进行；并且为非高通量实验的实验随后在较晚的阶段进行，例如为验证高通量实验的发现。例如，微阵列(高通量)后面可以接着qPCR(非高通量)，例如用于验证或确认特定基因的表达的目的。
基于序列的技术，包括高通量测序，如下一代测序(NGS),可以在本发明中用来测定基因表达。例如，RNA-Seq(RNA测序)，也称为全转录物组鸟枪法测序，除基因表达水平以外可以提供关于基因序列的信息。RNA-Seq使用下一代测序(NGS)来揭示在给定的时刻生物样品中RNA的存在和量。在一个实施方案中，以基于序列的技术测定基因表达，如RNA-Seq或PCR及其任意变化形式。
然后可以通过定量RT PCR(qRT PCR)验证一些或全部基因的表达，例如通过基因表达谱分析，诸如在微阵列中所揭示的基因。
如普遍已知的那样，定量聚合酶链式反应(qPCR,也称作实时聚合酶链式反映(实时PCR),是一种基于聚合酶链式反应(PCR)的实验室方法，其适合用于测定核酸的量。具体地，为了测定转录物(例如mRNA)的量，选择的方法是定量逆转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)。与其他RNA定量方法诸如northern blot相比，qRT-PCR一般被认为是用于检测RNA水平的最强力的、灵敏的和定量的测定，因此在本发明中是优选的。对于基因表达的测定，qRTPCR也比在蛋白质水平对基因表达产物的间接测定灵敏得多，所述间接测定诸如免疫检测，例如通过利用荧光一抗或二抗的免疫修饰的和流式细胞术。qRT PCR典型地需要各个核酸的特异性引物，然而所述引物的序列一般可通过序列数据库获得，例如，对于人基因，或可以由技术人员基于此类信息进行设计。可获得市售的用于qRT-PCR的试剂盒和仪器，并且这些可以用于本发明中。在qRT PCR中充当测定基因表达的模板(也称作“靶”)的核酸是转录产物，典型地是mRNA。
qPCR通常运行总计35-45个连续循环，更优选38-42个循环，最优选40个循环。当即使在完成全部数目的循环后没有观察到荧光，则得出结论在被分析的样品中不存在靶核酸。
合适地是，通过qPCR(优选qRT-PCR)测定基因表达，由此测定目的基因的表达水平，并且优选地与看家基因的表达水平相比较。为此，优选的看家基因是β-肌动蛋白(参见，例如图8)。
如在本领域中标准的那样，通过qRT-PCR测定的基因表达谱分别通过Ct和dCt表示：通常，在qPCR中，Ct(循环阈值)定义为荧光信号超过所述阈值(即，超过背景水平)所需的循环数。通常，Ct值与样品中的各个(靶)核酸的量成反比(即，Ct值越低，样品中的各个(靶)核酸的量越大)。Ct对一个基因的表达是特异性的。δCt(dCt)表示2个基因之间的表达差异，一般是目的基因和看家基因之间的表达差异，所述看家基因诸如β-肌动蛋白(参见，例如图8)。
优选地本发明的细胞表达对间充质基质细胞特异的至少一个基因。
本发明的细胞的特征在于其表达APCDD1，等等。具体地，所述细胞表达APCDD1。本发明人发现对根据本发明的间充质基质细胞特异的基因包括在下列列表中，所述列表包括但不限于APCDD1和PPARG,以及任选地FLVCR2。更优选地，与看家基因β-肌动蛋白相比，对基质细胞特异的所述至少一个基因相对于表达比率以高水平表达或将所述至少一个基因与在参照细胞中β-肌动蛋白相比较。此表型的一个实例显示在实施例8中。
尽管早期文献对于非血管周围MSC与血管周围MSC是否有区别不明确(例如Davies等人,Stem Cells Translational Medicine,2017,vol.6,p.1620–1630),但本发明提供了证据(例如实施例8)，根据本发明获得的基质华通氏胶来源细胞与血管周围MSC截然不同。
在一个实施方案中，间接地测定基因表达，即不通过测定初级转录产物，mRNA或其前体或其降解产物，而是通过测定更下游的特异性产物。典型地，更下游的特异性产物是由mRNA编码的蛋白质；然而，其也可以是任意其他的特异性产物，诸如例如对特定的(例如有酶活性的)蛋白质的存在特异的代谢物。
优选地，测定蛋白质的存在。更优选地，测定蛋白质在细胞表面上的存在。换句话说，测定蛋白质是否展示在细胞表面上。
可以分析在细胞表面上展示特定蛋白质的细胞，例如通过免疫活性分子，诸如特异性抗体和其他免疫反应分子。“细胞表面”在本文中根据其在本领域中的通常含义使用，因此其具体地包括可被蛋白质和其他分子可及而结合的细胞的外部。如果蛋白质至少部分地位于细胞的表面并且可被添加到所述细胞的抗原结合分子诸如抗原特异性抗体可及而结合，则所述蛋白质展示在所述细胞的表面上。在一个实施方案中，展示在细胞表面上的蛋白质是具有可以被抗体识别的细胞外部分的内在膜蛋白。术语“细胞外部分”或“胞外结构域”在本发明的情形下意指分子，尤其是蛋白质的一部分，该部分面向细胞的细胞外空间并且优选地其可从所述细胞的外部可及，例如被位于所述细胞外部的结合分子诸如抗体可及。优选地，该术语是指一个或多个细胞外环或结构域或其片段。术语“部分”在本文中使用并且是指结构的连续或非连续元件，诸如氨基酸序列。蛋白质序列的一部分或一部优选地包含组成所述蛋白质的氨基酸序列的至少5个，特别是至少8个,至少12个,至少15个,至少20个,至少30个,至少50个或至少100个连续和/或非连续氨基酸。
可通过抗体或其他免疫活性分子检测到的蛋白质也可以称作抗原。在一些实施方案中，本发明的细胞的特征可以是展示–或不展示–一个或多个特异性抗原。在本发明的情形下，此类抗原优选地展示在细胞的表面上。此类抗原也可以称作“表面抗原”。其实例在实施例7中提供。
与细胞生物学的一般原理一致，当抗原展示在细胞的表面上时，则编码该抗原的基因由所述细胞表达。因此，对展示在细胞表面上的抗原的检测是显示表达编码该抗原的基因的间接手段。例如，当在本文中提及细胞表达特定基因(其编码在所述细胞的表面上表达的抗原)时，则所述基因的表达可以在基因表达产物(诸如mRNA)的水平直接测试，或在所述细胞的表面上展示的蛋白质的水平间接测试。尽管词“表达”在严格意义上意指表达基因，但词语“表达”也可以意在描述被所述基因编码的蛋白质，特别是细胞表面蛋白质展示在所述细胞上。
根据本发明，如果抗原的表达水平大于检出限和/或所述表达水平足够高从而允许被添加至细胞的抗原特异性抗体结合，则所述抗原展示在所述细胞上。根据本发明，如果抗原的表达水平低于检出限和/或所述表达水平太低不足以允许被添加至细胞的抗原特异性抗体结合，则所述抗原被认为不在所述细胞上表达。优选地，在细胞中表达的抗原表达或暴露于，即，存在于所述细胞的表面上，并且因此可用于被添加至细胞的抗原特异性分子诸如抗体或其他免疫反应分子结合。在一些情况下，也添加辅助检测的二级分子，诸如例如任选地标记的二抗。
抗体或其他免疫反应分子可以识别细胞上的表位。术语“表位”是指分子诸如抗原中的抗原决定簇，即，分子中的被免疫系统识别，即，结合的部分或片段，例如，被抗体或其他免疫反应分子识别。检测对任意特定抗原特异的表位一般允许得出结论该特定抗原在被分析的细胞上表达。
在一个实施方案中，本发明的细胞可以通过免疫表型分型来表征。“免疫表型分型”一般意指，所述细胞可以通过抗原特异性分子诸如抗体或其他免疫反应分子来表征，所述抗原特异性分子被添加到所述细胞以确定所述抗原是否在细胞上表达。免疫表型分型包括使用各种方法的细胞分选，包括流式细胞术。
用于免疫表型分型的优选方法是流式细胞术，特别是FACS。一般利用抗体或其他免疫反应分子识别分析物，特别是细胞表面蛋白。抗体或其他免疫反应分子本身是荧光团标记的，或荧光团标记的二抗或被添加用于该目的的其他免疫反应分子识别。
在本发明的情形中适合用于免疫表型分型的优选分析物是属于分化抗原簇(也称作指定簇或分类决定子并且在本文中缩写为CD)的分子。CD是用于通过对细胞进行免疫表型分型来鉴定和调查细胞表面分子的术语。在本文中描述了适合于本发明的细胞的表征实施方案的分化抗原簇的一些实例。除非上下文另外指明，当提到任何分化抗原簇(CD)分子的表达时，意指各种CD分子的表达优选地通过免疫表型分型来确定；然而，也有可能在核酸水平上测定。在本文中，关于人细胞，提到特异性CD分子意在是指根据由人白细胞分化抗原协作组I-IX指定的定义的各个特异性CD分子。实施例7提供了对于根据本发明的免疫表型分型的示例性和有用的说明。
另一方面，除非上下文另外指明，当在本公开中提及为非分化抗原簇(CD)分子的任何基因或编码其的核酸的表达时，意在各个基因的表达优选地在核酸水平上测定，优选地通过上面提到或描述的方法。
首先，根据本发明的MSC的特征在于其(a)表达APCDD1。优选地在基因表达水平上检测APCDD1的表达，最优选通过qRT PCR检测。其实例显示在图8中。
不希望受任何特定理论约束，相信APCDD1对细胞的自我更新能力很重要：以前显示该基因产物保持高β-连环蛋白水平，并且β-连环蛋白升高保持细胞的干细胞性，特别是MSC(Viale-Bouroncle等人,Biochem.Biophys.Res.Commun.,2015vol.457,p.314-317；Yu,Cell Transplant.,2017,vol.26,p.365-377)。如实施例8中所示，根据本发明的细胞通过APCDD1的表达尤其与PVWJ-来源细胞相区分。因此，根据本发明的表达APCDD1的细胞与现有技术描述的MSC明显不同，特别地参见WO 2004/072273 A和Sarugaser等人,2005,StemCells,vol.23,p.220-229。
然而，根据本发明的MSC不表达3G5。3G5是血管周细胞的标志物。因此，本发明的细胞不是血管周细胞。因此，优选地，本发明的细胞不表达血管周细胞的任何标志物，同时血管周细胞的任何标志物也不是间充质细胞和/或干细胞的标志物。
优选地，所述细胞表达对基质细胞特异，更特别地对间充质基质细胞特异的至少一个基因。优选地，所述细胞在其表面上展示对基质细胞特异，更特别地对间充质基质细胞特异的至少一个表面标志物。
在一个实施方案中，对基质细胞特异，更特别地对间充质基质细胞特异的至少一个表面标志物选自下列列表，所述列表包括但不限于膜辅因子蛋白(CD46)、衰变加速因子或CD55和MAC抑制蛋白(CD59)。所有三种标志物以前被描述为与补体级联相关。如图7B中所示，在本发明中举例说明的细胞在其表面上展示这些标志物。不希望受任何特定理论约束，相信这些表面标志物中的一个或多个在保护细胞在体内免受补体介导的细胞裂解方面具有一定作用。优选地，所述细胞表达CD46、CD55和CD59中的至少一个，更优选CD46、CD55和CD59中的至少任意两个，和最优选CD46、CD55和CD59中的全部。就本发明人所知，CD46、CD55和CD59以前没有被描述在特定的UC来源的MSC中，尽管当然可以不排除一些细胞实际上表达这些表面分子中的一个或多个。
优选地，根据本发明所述的细胞表达CD73。CD73还已知是外切5’核苷酸酶并且是间充质基质细胞(MSC)的标志物，参见Dominici等人,2006(Cytotherapy,vol.8,p.315-317)。
优选地，根据本发明所述的细胞表达CD105。CD105(也称作内皮糖蛋白)是间充质基质细胞(MSC)的另一个标志物，参见Dominici等人,2006(Cytotherapy,vol.8,p.315-317)。
优选地，根据本发明所述的细胞表达CD90。CD90(也称作Thy-1)是间充质基质细胞(MSC)的另一个标志物，参见Dominici等人,2006(Cytotherapy,vol.8,p.315-317)。
在更优选的实施方案中，根据本发明所述的细胞表达CD105和CD73两者。除了上述的一般方法以外，这些分化抗原簇可以例如通过SH2和SH3抗体检测(Horwitz等人,Curr.Opin.Hematol.,2006,vol.13,p.419-425)。一般来说，根据本发明的间充质基质细胞表达CD105和CD73两者，优选地还表达CD90。因此，CD105和/或CD73和/或CD73的表达可以合适地区分本发明的细胞与一些其他细胞。更优选地，除了CD105和/或CD73和/或CD73中的任一个或多个以外，所述细胞还表达CD46、CD55和CD59中的至少一个，更优选CD46、CD55和CD59中的至少任意两个，和最优选CD46、CD55和CD59中的全部。
在优选的实施方案中，所述细胞还表达PPARG。其实例显示在图8中。不希望受任何特定理论约束，相信PPARG基因的产物能够将细胞，特别是MSC保持于多能性表型，尤其是防止分化成骨组织。其详情参见，例如Xu等人(Curr.Stem Cell Res.Ther.,2016,vol.11,p.247-254)。
在另一个和非互斥的优选实施方案中，所述细胞还表达FLVCR2基因。其实例显示在图8中。缩写FLVCR2代表猫白血病病毒C亚类细胞受体家族，成员2。编码的FLVCR2蛋白是来自主要协同转运蛋白超家族的成员的跨膜蛋白，其作为钙转运蛋白起作用。在生物中，编码的蛋白已经被描述为在脑血管内皮细胞的发育中潜在地具有一定作用。
在优选的实施方案中，所述细胞不表达CD117。CD117是对某些类型的造血(血液)祖细胞特异的细胞表面标志物，诸如在骨髓中。本发明的细胞不是血细胞，优选也不是骨髓细胞。CD117还与一些类型的癌症相关联；然而，本发明的细胞一般不是癌细胞。换句话说，致瘤细胞在本文中不称作本发明的细胞。
根据本发明的细胞优选地表达MHC I。在人间充质基质细胞的情况下，优选地所述人细胞表达人白细胞抗原HLA-A、HLA-B和HLA-C中的至少一种，优选至少两种的任意组合，且最优选全部。
在一些实施方案中，根据本发明的细胞不表达MHC II，或表达低水平的MHC II。“低水平”是相对的表述，其表示所述表达水平低于来自相同个体的抗原呈递细胞中的表达水平，例如来自同一个体的树突状细胞、单核巨噬细胞和B细胞。在一个实施方案中，所述细胞基本上不表达MHC II。具体地，在人间充质基质细胞的情况下，优选地所述细胞不表达人白细胞抗原HLA-DP和/或HLA-DQ中的任一个或多个。任选地也不表达HLA-DR；备选地，HLA-DR以低水平表达。这些人白细胞抗原(HLA)的表达的缺失或以低水平表达，导致本发明的细胞被免疫豁免，允许例如与来自HLA不匹配的个体的细胞，以及甚至来自其他物种的细胞，包括免疫系统细胞共培养。这些人白细胞抗原的表达可以例如通过利用特异性抗体的表面染色，或通过qRT PCR来检测。
在一个实施方案中，本发明的细胞是表面标志物CD34和/或CD45阴性的。这意味着所述细胞不展示CD34和/或CD45。
在一个实施方案中，本发明的细胞产生前列腺素E2(PGE2)。如公知的那样，前列腺素E2(PGE2)也称作地诺前列酮，其是天然存在的前列腺素，被描述为Wnt信号传导通路的激活物(Goessling等人,Cell,2009,vol.136,p.1136-1147)。几种市售产品，特别是ELISA试剂盒可获得用于测定PGE2产生。所述检测可以使用细胞上清液或细胞裂解物，或其组合作为样品来进行。
在一个实施方案中，本发明的细胞表达一种或多种干细胞标志物。此类干细胞标志物可以包括选自但不限于Oct-4和Nanog的典型标志物。
细胞尺寸
在本文所述的其他特征和实施方案以外，根据本发明所述的细胞还优选的特征在于相对小的尺寸。所述尺寸可以例如通过细胞体积、细胞直径或细胞表面积，或通过与细胞体积、细胞直径或细胞表面积相关的参数来描述。所述尺寸还可以通过上述参数中的任意组合来描述。“相对”意指与其他细胞相比较，特别是与来自其他来源的间充质基质细胞和/或通过其他方法分离的其他细胞相比较。“其他来源”意指其他解剖学区域，诸如，例如，其他器官，例如骨髓，以及脐带的其他区段，诸如血管周围区带,以及来自任何血管周围华通氏胶。
不希望受任何特定理论的约束，相信在一些实施方案中，较小的细胞(例如具有较小直径的细胞和/或具有较小表面积的细胞)在细胞周期中较早。用于测定MSC的细胞周期状态的方法已经发表(例如Achille等人,J.Cell.Biochem.,2011,vol.112,p.1817-1821)并且可以应用于本发明的细胞，例如用于分析目的。
根据本发明，通过流式细胞术对单个细胞测定的前向散射光(FSC)值与细胞体积相关联。较大的细胞，即，特别是具有较大细胞体积的那些，由较高的FSC值表征，且反之亦然。如普遍已知的那样，FSC值是无量纲参数。对于FSC的测定，通过流式细胞术分析一个或多个细胞。通常，通过流式细胞术测定的FSC值取决于所使用的仪器，特别是机器对机器光电倍增管的激光特性和功率。因此，没有绝对FSC值，所述值典型地取决于所使用的机器和激光。因此，为了确保重现性，在本发明的情形中，下列的详述优先以组合的方式。
在本发明中，当通过流式细胞术测定FSC时，激发波长优选地在470-500nm的范围内,最优选488nm,并测定前向散射光(FSC)。对于FSC的测定没有必要细胞本身是发荧光的。对于通过流式细胞术进行的此类测定，典型地使用市售的流式细胞仪。在优选的实施方案中，使用FACSAria III流式细胞仪(BD Biosciences)，激发波长为488nm。在下文中指定的具体FSC数值优选地全部是指所述条件，即，所述流式细胞仪和所述波长。优选地，本发明的细胞的特征在于60或更小,诸如59或更小,诸如58或更小,诸如57或更小,诸如56或更小,诸如55或更小,诸如54或更小,诸如53或更小,诸如52或更小,诸如51或更小，或甚至50或更小的FSC值。在一些实施方案中，本发明的细胞的特征在于32-58,诸如33-57,诸如34-56,诸如35-55,诸如36-54,诸如37-53,诸如38-52,诸如39-51,诸如40-50,诸如41-49,诸如42-48,诸如43-47,诸如44-46的FSC值。在优选的实施方案中，FSC值为约45。这些具体的FSC数值是指通过FACSAria III流式细胞仪在上述的条件下的测定值。
优选地，本发明的细胞的特征在于比PVWJ-来源细胞的FSC值小的FSC值。优选地，本发明的细胞的FSC值显著小于PVWJ-来源细胞的FSC值，参见，例如实施例4。
优选地，本发明的细胞的细胞体积小于PVWJ-来源细胞的体积。更优选地，本发明的细胞的细胞体积显著地小于PVWJ-来源细胞的体积。所述细胞体积可以通过由流式细胞术测定FSC值(关于FSC值的测定的详情参见上面)来间接测定。然后，为了比较目的，将已知尺寸的珠子任选地在相同的条件下进行流式细胞术；由此可以基于经实验测定的细胞FSC值和经实验测定的珠子FSC值以及珠子的已知体积来确定细胞的体积。所使用的珠子优选地具有与MSC的折射率相似或基本上相同的折射率。可获得市售软件用于基于经实验测定的FSC计算细胞体积。优选的用于测定细胞体积的工具是FACS ARIA III和FACS DIVA(两者均来自Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)。数据分析采用FACS DIVA 6.0版本软件来完成，该软件一般与FACS ARIA III相关联。使用FACS DIVA标准配置。为了基于FSC值比较多个样品，或多个细胞，有必要总是在同一仪器上工作，并且总是采用对FSC光电倍增管的相同设置。
可以对刚分离的细胞以及对培养的和酶促脱附的——例如胰蛋白酶消化的——细胞两者测定FSC并因此测定细胞体积。然而，优选对未贴壁细胞测定FSC和细胞体积。对于流式细胞术，在测定细胞体积之前，任何贴壁细胞必须从其贴附的培养容器表面脱附，典型地通过酶处理，更特别地通过胰蛋白酶消化。更具体地，FSC典型地通过使未贴壁细胞进行流式细胞术，并测定前向散射光(FSC)来测定。可获得市售软件用于基于经实验测定的FSC测定细胞体积。根据本发明优选的用于细胞体积测定的市售软件是BD FACSDiva软件(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ,USA)。
尽管本发明人已经显示本发明的细胞是相对均一的，但典型地关于细胞体积也存在一些变化，如与所有生物产品一样。因此，细胞体积也可以被描述为平均细胞体积。在多个细胞的群体中，对于FSC的实验测定，平均细胞体积优选地是与如实施例1和实施例2A中所述获得的细胞的细胞体积对应的细胞体积。实施例4借助实施例描述了大量细胞的FSC如何通过流式细胞术和前向散射来测定。“平均体积”代表了单个细胞的体积的算术平均值，如通过实验测定。典型地，“平均体积”代表至少1,000个单一事件，诸如至少5,000个单一事件，诸如至少10,000个单一事件，在一些实施方案中100-1,000,00000个单一事件的体积的算术平均值。通过流式细胞术测定的每个事件一般对应于一个细胞。由于通过流式细胞术测定细胞体积是高通量方法，因此这些数目的单一细胞的平均值一般可以在无需过度的时间和努力的条件下测定。
在一个实施方案中，不测定细胞体积本身，而是测定FSC值。一般来说，当给定的细胞的FSC值低于参考细胞的FSC值，则所述给定的细胞也将比参考细胞具有更小的细胞体积；因此，对FSC的测定允许对细胞的体积得出间接的结论。
优选地，本发明的细胞的表面积不超过3,500μm2。优选所述细胞的表面积不超过3,000μm2。优选所述细胞的表面积不超过2,500μm2。优选所述细胞的表面积不超过2,100μm2。在一些实施方案中，所述细胞的表面积不超过2,000μm2。“表面积”是指细胞的二维表面积。
在本公开的情形中，在细胞处于贴壁培养(即，所述细胞贴附于培养板)的同时测定细胞的二维表面积。重要的是所述细胞处于低汇合状态。亚汇合被认为对于测定的重现性是有利的，因为相信亚汇合的细胞基本上不会通过接触抑制而彼此抑制。为了测定表面积，将一个或多个细胞拍照或以另外的方式视觉观察或记录，典型地利用显微镜，从垂直于(即90°)所述一个或多个细胞贴附的培养板的表面的维度。面积的边界典型地在细胞的图形图像(即，照片)上手动地划定。在拍摄所述图形图像之前优选地避免搅动培养板，或保持在最低程度。用于测定表面积的方法和软件不特别地限制，并且可从几个商业供应商获得各种软件，例如Carl Zeiss(Jena,Germany)。对于图6中的测定，使用来自Carl Zeiss(Jena,Germany)的Axiovision LE 4.8。借助于实例，用于测定在培养皿中生长的细胞的表面积的方法由Agley等人,2012,J.Histochem.Cytochem.,vol.60,p.428–438等描述。
尽管本发明人已经显示本发明的细胞是相对均一的，但典型地关于细胞表面积也存在一些变化，如与所有生物产品一样。因此，细胞表面积也可以描述为平均细胞表面积。在这样的情况下，优选地所述细胞的平均表面积为不超过3000μm2。优选地所述细胞的平均表面积为不超过2500μm2。优选地所述细胞的平均表面积为不超过2100μm2。在一些实施方案中，所述细胞的表面积为不超过2000μm2。在多个细胞的群体中，平均表面积优选地在本文所给出的限制范围内。“平均面积”代表单个细胞的面积的算术平均值，如通过实验测定。典型地“平均面积”代表至少35个单一细胞，诸如至少50个单一细胞，诸如至少100个单一细胞，在一些实施方案中35-200个单一细胞的面积的算术平均值。
如图6中所示，本发明的细胞优选地具有显著小于骨髓来源的MSC的表面积的表面积。在一些实施方案中，本发明的细胞还具有小于血管周围华通氏胶(PVWJ)-来源的间充质基质细胞(诸如WO 2004/072273 A和Sarugaser等人,2005,Stem Cells,vol.23,p.220-229中描述的那些)的表面积的表面积。血管周围华通氏胶(PVWJ)-来源的间充质基质细胞也可以称作“血管周围区带-来源的间充质基质细胞”。
优选地，根据本发明的细胞的平均体积和/或表面积小于骨髓来源的MSC(图6)的平均体积和/或表面积且小于来自血管周围区域的脐带来源的MSC(图5B)的平均体积和/或表面积。在文献中，MSC的较小细胞体积被认为对于许多原因来说是有利的(参见，例如Ge等人,Stem Cell Rev.,2014,vol.10,p.295-303)。通过本发明,具有这些有利的特性的细胞现在可以可靠地获得。
优选地，本发明的细胞的内在复杂性比PVWJ-来源的MSC的内在复杂性小。内在复杂性典型地通过侧向散射分析(SSC)来测定。通常，归因于内部结构，具有较复杂的内部结构的细胞在侧向散射分析中看上去更闪亮/明亮，参见，例如实施例4A。不希望受任何特定理论约束，低内部复杂性可能与干细胞性有关。为了基于SSC值比较多个样品，有必要总是在同一仪器上工作并总是利用FSC和SSC光电倍增管的相同设置，因为通过流式细胞术测定的SSC值，像SSC值一样取决于所使用的仪器，特别是机器对机器光电倍增管的激光特性和功率。在本发明中流式细胞仪、激光和设置和用于测定SSC值的软件优选地与上面描述的用于测定FSC值的那些相同。
在一个实施方案中，根据本发明的SWJ-来源细胞的特征在于比PVWJ-来源细胞更低的内在复杂性(由SSC显示)。
在优选的实施方案中，所述SWJ-来源细胞的特征在于比PVWJ-来源细胞更小的细胞体积(由FSC显示)和更低的内在复杂性(由SSC显示)两者。PVWJ-来源细胞可例如如本公开的对比实施例中所述获得。
细胞生物学特性：分化潜能、衰老和永生性
通常，分化潜能、衰老和永生性可以一起被称作“细胞生物学特性”。更不用说，本发明的细胞具有另外的细胞生物学特性，其可以由本领域技术人员通过实验来分析。因此术语“细胞生物学特性”如本文所用，是开放式术语，其也包括细胞的可以通过生物学测定来测定的另外的特性，即使那些另外的特性在本文中没有明确指明。
根据本发明的细胞是间充质细胞，特别是间充质基质细胞(MSC)。所述MSC一般是克隆形成细胞，除非上下文以另外的方式说明。因此，本发明的甚至单个细胞是可以产生大量子代细胞的集落形成单位(CFU)。
本发明的细胞还可以称作“基质祖细胞”。通常，基质祖细胞能够产生表型和基因型相同的子代(自我更新)以及至少一个其他的最终细胞类型。在一个实施方案中，本发明的细胞不是谱系定向的。
因此，优选地，所述细胞不是终末分化的。在一个实施方案中，所述细胞在除成为间充质细胞以外，不进一步分化。优选地，所述细胞能够分化成各种细胞类型。在一些实施方案中，分化成这些各种细胞类型中的一种或多种是可诱导的，例如通过外部刺激和/或特定的培养条件。
在优选的实施方案中，所述细胞至少是多能性的。多能性可以通过显示细胞能够分化成多种，至少两种不同的细胞类型来测试。对于适合于获得此类显示的测定没有特别的限制。然而，典型地所述显示在体外完成。因此，在优选的实施方案中，本发明的MSC是在体外具有多能分化能力的细胞。对于不同类型的分化的实施例在实施例12、13和14中给出。例如，骨形成分化潜能可以如实施例12中所述测定，尽管可以备选地使用已建立的方法。在本发明的情形中专门开发了如实施例12中所述的用于骨形成分化潜能的测定。与现有技术的用于骨形成潜能的测定(其中许多利用骨髓来源的MSC开发)相比，实施例12的测定允许相对缓慢地扩增细胞；这又会允许(脐带-来源的)细胞贴附于培养容器，这一般是骨形成测定的先决条件。
例如，脂肪形成分化潜能可以如实施例13中所述测定，尽管也可以使用其他已建立的方法。例如，软骨形成分化潜能可以如实施例14中所述测定，尽管也可以使用其他已建立的方法。“分化潜能”意指给定的细胞能够分化成特定谱系的细胞。
优选地，所述细胞能够分化成成骨谱系的细胞。优选地，所述细胞能够分化成软骨形成谱系的细胞。优选地，所述细胞能够分化成脂肪形成谱系的细胞。优选地，所述细胞能够分化成成骨谱系的细胞和分化成软骨形成谱系的细胞。优选地，所述细胞能够分化成成骨谱系的细胞和分化成脂肪形成谱系的细胞。优选地，所述细胞能够分化成成骨谱系的细胞和分化成脂肪形成谱系的细胞。最优选地，所述细胞能够分化成成骨谱系的细胞和分化成软骨形成谱系的细胞和分化成脂肪形成谱系的细胞。当所述细胞能够分化成特定谱系的细胞时，这意在是指所述细胞将相应地分化，条件是其经受合适的条件。例如，用于分化成成骨谱系的细胞的特别合适的条件在实施例12中提供。备选地，可以使用适合用于将间充质基质细胞分化成成骨谱系的细胞的市售试剂盒，至少该试剂盒允许所述细胞贴附至培养容器以测试任何给定的细胞(间充质基质细胞)是否能够分化成成骨谱系的细胞即可；被描述用于此类测定的一种试剂盒是来自Lonza(Wakersville,MD,USA)的hMSC间充质干细胞骨形成分化BulletKitTM试剂盒。例如，用于分化成软骨形成谱系的细胞的合适条件在实施例13中提供。备选地，可以使用适合用于将间充质基质细胞分化成软骨形成谱系的细胞的市售试剂盒以测试任何给定的细胞(间充质基质细胞)是否能够分化成软骨形成谱系的细胞；一种合适的试剂盒是来自Lonza(Wakersville,MD,USA)的hMSC间充质干细胞软骨形成分化试剂盒BulletKitTM。例如，用于分化成软骨形成谱系的细胞的合适条件在实施例14中提供。备选地，可以使用适合用于将间充质基质细胞分化成软骨形成谱系的细胞的市售试剂盒以测试任何给定的细胞(间充质基质细胞)是否能够分化成软骨形成谱系的细胞；一种合适的试剂盒是来自Lonza的hMSC间充质干细胞软骨形成分化试剂盒BulletKitTM。例如，用于分化成脂肪形成谱系的细胞的合适条件在实施例13中提供。备选地，可以使用适合用于将间充质基质细胞分化成脂肪形成谱系的细胞的市售试剂盒以测试任何给定的细胞(间充质基质细胞)是否能够分化成脂肪形成谱系的细胞；一种合适的试剂盒是来自Lonza的hMSC间充质干细胞脂肪形成分化BulletKitTM试剂盒。
任选地，所述细胞甚至是多能的，然而其不是全能的。分化潜能可以通过使细胞经受特定条件来测定。转分化已经在本领域中记载，并且因此，可以测试任何给定的细胞，诸如MSC是否能够分化成特定的外胚层细胞或内胚层细胞。
任选地，所述细胞具有更多的分化潜能。这些更多的分化潜能选自间充质基质细胞的典型分化潜能。然而，如对于间充质基质细胞典型的那样，本发明的细胞典型地不是全能的。
在优选的实施方案中，本发明的细胞是间充质干细胞。因此，在该实施方案中，间充质基质细胞是间充质干细胞。换句话说，优选地所述细胞具有干细胞-样特性。干-细胞样特性及其标志物例如由Melton在Lanza和Atala(编辑),Essentials of Stem Cell,Biology,第三版,Elsevier,2014的第2章中描述。
优选地，根据本发明所述的细胞不显示异常高水平的端粒酶活性。“端粒酶活性”是指端粒酶的酶活性。如一般已知的那样，端粒酶是延长DNA链中的端粒的酶，由此允许衰老细胞超越海夫利克极限(Hayflick limit)(否则衰老细胞会变成有丝分裂后的并经历凋亡)，并且在一些情况下变成永生的。然而，在一些备选的实施方案中，本发明的细胞显示低水平的端粒酶活性。端粒酶活性典型地通过测定酶活性来测定；更具体地，其典型地通过测定端粒酶逆转录酶(缩写为TERT，或在人类中为hTERT)的酶活性来测定，所述端粒酶逆转录酶是酶端粒酶的催化亚基。其实例在实施例10中给出。端粒酶活性可以通过TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA PLUS试剂盒(Roche Diagnostics)来测定，所述试剂盒是一种用于定量测定端粒酶活性的光度酶免疫测定。其说明参见，例如实施例10。如果根据生产厂商的说明书使用该试剂盒，且相对于在所述TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA PLUS试剂盒中提供的阳性对照(被认为100％)，被分析的细胞显示10％或更小,诸如优选5％或更小的端粒酶活性，则端粒酶活性被认为很低。百分比，即10％或更小,诸如优选5％或更小,是指细胞的平均值，即意思是相对于所述对照，被分析的细胞显示平均值为10％或更小,诸如优选5％或更小的端粒酶活性。几种可选的用于检测端粒酶活性的试剂和试剂盒是可商购的并且这些可以备选地用于本发明的情形中。
备选地，本发明的细胞不表达任何端粒酶。换句话说，在此实施方案中，根据本发明所述的细胞不显示任何端粒酶活性。更准确地，这样的细胞的特征在于缺少可检测到的端粒酶表达。基因表达可以直接检测，或通过检测由表达产物转录的蛋白质间接检测。缺少任何可检测到的端粒酶，无论是在酶活性水平、蛋白水平或基因表达水平上，可以合适地具体地进一步表征本发明的细胞，还参照在文献(例如US 2004/0136967 A1)中已经记载的其他MSC。“不表达任何端粒酶”意指通过在本文件的有效日时可获得的现有技术方法，诸如特别是qRT-PCR，在细胞中不能检测到端粒酶表达。典型地这意味着可以检测不到TERT活性(对于人细胞的情况为hTERT活性)。对于检测编码端粒酶的基因的表达，可以使用例如对hTERT基因特异的PCR引物(Nekani等人,2010,Stem Cell Res.,vol.3,p.244–254)。
当细胞不显示端粒酶表达和/或端粒酶活性时，则它们不会永远在培养中维持；在此实施方案中，本发明的细胞不是永生的；尽管如此,本发明的细胞适合于在如实验实施例中所述的条件下培养持续至少12代，或等效数目的群体倍增。
在优选的实施方案中，本发明的细胞不是永生的。例如，如实施例10中所示，根据本发明的细胞中的端粒酶活性相对很低。实施例10的细胞因此不被认为是永生的。
本发明的细胞当存在于合适的生长培养基中处于合适的条件下时，优选是有丝分裂活性的。更优选所述细胞处于指数生长期，这适用于所述细胞在合适的条件下处于合适的生长培养基中时。更不用说，冷冻细胞不是有丝分裂活性的；然而，当本发明的冷冻细胞被解冻并置于合适的生长培养基中处于合适的条件下时，它们可以变成有丝分裂活性的并且优选地以指数生长期生长。例如，当原始细胞库(在下文中详细描述)的冷冻细胞被解冻并置于合适的生长培养基中处于合适的条件下时，它们将变成有丝分裂活性的并且产生大量子代细胞，所述子代细胞又可以任选地用来建立继代细胞库。
本发明的细胞不是上皮细胞,诸如羊膜上皮细胞。
本发明的细胞不是内皮细胞。
本发明的细胞尽管具有优异的增殖特性，但其不是癌细胞。
根据本发明，要求保护的细胞不是胚胎细胞。具体地，要求保护的细胞不是胚胎干细胞。在本发明中不预期损伤或破坏胚胎(包括人胚胎)，并且当进行以本发明为基础的研究时也不损伤或破坏胚胎。
在优选的实施方案中，本发明的间充质基质细胞基本上不含血液或其衍生物,特别是脐带血。尽管一些MSC是骨髓的基质骨架的成分(其在造血期间提供物理和功能支持)，但本发明的细胞不是造血细胞。具体地，本发明的细胞不是血细胞。更具体地，所述细胞不是造血干细胞(HSC)，也不是造血系统(MPP)的多能性祖细胞，也不是共同髓系祖细胞(CMP)。
在一个实施方案中，本发明的细胞不是衰老的。在另一个实施方案中，本发明的细胞的特征是低衰老性。如一般已知的那样，酶β-半乳糖苷酶在衰老细胞中特别有活性，其中其催化β-半乳糖苷水解为单糖。不希望受任何特定理论约束，普遍理解的是β-半乳糖苷酶活性归因于在衰老细胞中特异性的内源性溶酶体β-半乳糖苷酶。不希望受任何特定理论约束，其活性不认为本身是衰老所必须的。然而，β-半乳糖苷酶活性很容易在原位和在体外均以可靠的方式检测到。在本发明中，β-半乳糖苷酶活性通过本领域中常用的方法测定(参见，例如Lee等人,Aging Cell,vol.5,p.187–195。“衰老细胞”的同义词是“年老的细胞”。
在一个实施方案中，本发明的细胞是已经生长至P11代或更低，更优选至P10或更低的细胞，更优选至P9代或更低，更优选至P8代或更低,更优选至P7代或更低,更优选至P6代或更低，更优选至P5代或更低，且最优选至P4代或更低的细胞。如实施例9中所示，本发明的细胞具有优异的增殖特性持续许多代，并且如实施例11中所示，本发明的细胞一般不是衰老的或仅稍微衰老的持续以许多累积群体倍增。
在一个实施方案中，本发明的细胞在分离后在至少16个累积群体倍增，诸如至少18个累积群体倍增，至少20个累积群体倍增内保持多能性。在一个实施方案中，本发明的细胞在分离后在至少12代内保持多能性。
在一个实施方案中，本发明的细胞在分离后在至少16个累积群体倍增内保持未分化。本发明的细胞在分离后在至少12代内保持未分化。
可通过根据本发明的方法获得的细胞
根据本发明的第二个方面的细胞也可以以可获得所述细胞的方法为特征。这是可能的，因为根据本发明所述的细胞具有与根据以前描述的方法获得的细胞不同的特性(参见本文中的实施例和比较实施例)并且因此，获得根据本发明所述的细胞的方法使得细胞具有独特的特性。具体地，根据第二个方面的细胞可以以可通过本发明的第一个方面的方法获得的细胞为特征。
在另一个且非互斥的实施方案中，第二个方面的细胞可通过根据本发明的第一个方面的方法获得。在此实施方案中，根据本发明的第一个方面的方法通过对细胞赋予特定的特征而对所述细胞的定义有贡献，诸如例如来自脐带的基质华通氏胶的来源，和/或与分离和扩增程序有关的活力和/或体积和表面积，提到几个特征用于说明的目的。
本发明的第一个方面的优选实施方案可与本发明的第二个方面的优选方面以每种和每一个组合进行组合，除非上下文另外指明。因此，根据本发明的第一个方面的方法还在一些实施方案中，限定可通过所述方法直接获得的产品。在一些实施方案中，根据本发明所述的细胞因此可以被描述为可通过根据本发明的第一个方面的方法获得的细胞。由根据本发明的第一个方面的方法产生的由方法限定的产品特征一般可与根据本发明的第二个和第三个方面的产品特征组合。
本发明还涉及可通过本发明的第二个方面的方法获得的细胞。就此而言，第二个方面的方法限定通过所述方法获得的细胞并以此为特征。优选地，间充质基质细胞可通过分离，和任选地但优选地如本文所述的扩增获得。
从间充质基质细胞衍生的细胞
进一步，由于它们的分化潜能，本发明的细胞可以用来产生成熟细胞或细胞系。成熟细胞是不具有干细胞-样特性的细胞。间充质基质细胞分化为成熟细胞可以通过特定的条件触发，诸如向培养基添加特定的外源生长因子，其说明参见实施例12、13和14。
在一个实施方案中，本发明涉及从本发明的间充质细胞衍生的细胞。在一个实施方案中，所述衍生细胞是单能的或终末分化的。在一个实施方案中，所述衍生细胞不是永生的。优选类型的衍生细胞包括骨形成谱系、脂肪形成谱系和软骨形成谱系的细胞。
细胞群
在第三个方面，本发明涉及细胞的群体(细胞群)。所述细胞群包含根据本发明的第二个方面的至少一种细胞。
在一个实施方案中，本发明的细胞群是可通过从脐带的基质华通氏胶分离细胞直接获得的细胞群，如本文所述。然而，更优选地，本发明的细胞群是可通过对先前已经从脐带的基质华通氏分离的细胞离体扩增获得的细胞群，如本文所述。
将在下文中描述的根据本发明的细胞群的一些特征和实施方案与所述细胞群，特别是包含在所述群中的细胞，的物理特征有关。仅用于说明，并且尽管本文其他地方所公开的细节，物理特征包括可以利用物理方法直接确定的那些特征，诸如细胞的基因表达、体积或表面积、形状等，所述细胞群内这些中的任一个的比率和分布。将在下文中描述的细胞群的一些特征和实施方案与可获得细胞群或获得细胞群的方法有关。仅用于说明，并且尽管本文其他地方所公开的细节，与可获得或获得所述细胞群的方法相关的细胞群的特征可以包括：(a)细胞的解剖学来源，特别是脐带和作为其优选节段的基质华通氏胶，(b)被应用用于分离所述细胞的条件和(c)被应用用于扩增所述细胞的条件，由此获得细胞群。
本发明的细胞群包括大量细胞。因此，所述细胞群包含至少两个细胞，然而，一般将包含显著地多于两个细胞。尽管对包含在细胞群中的细胞的数目没有严格的上限，但在典型的实施方案中，由在全面流程中可获得的细胞的总数代表天然上限，除非使用多于一根脐带作为起始材料。以人脐带起始并且包括步骤(c)且运行至P2代的全面流程典型地产生至少1x109个细胞，更优选至少2x109个细胞,更优选至少3x109个细胞,更优选至少4x109个细胞,更优选至少5x109个细胞,更优选至少6x109个细胞,更优选至少7x109个细胞,更优选至少8x109个细胞,更优选至少9x109个细胞，并且在一些实施方案中至少10x109个细胞。可以在后续的传代时获得更多的细胞。
所述细胞群包含至少一个表达APCDD1的细胞。这一般可以通过显示所述细胞群的样品表达APCDD1阳性来确认。换句话说，所述细胞群的特征在于表达APCDD1基因。在一个实施方案中，所述细胞群中的大多数细胞表达APCDD1基因。优选地，所述细胞群中包含的细胞的至少80％(按细胞数计),优选至少90％(按细胞数计),更优选至少95％,诸如至少96％,至少97％,至少98％,至少99％(各自按细胞数计)表达APCDD1。
任选地，所述细胞包含至少一种另外的细胞，即与本发明的细胞，特别是根据本发明的第二个方面的细胞不同的一种或多种另外的细胞。具体地，在此实施方案中，所述至少一种另外的细胞在至少一个特征方面，必要的或任选的(优选的)，与本发明的第二个方面的细胞不同。然而，优选地，所述至少一种另外的细胞与本发明的细胞是同基因的，更优选自体的。
在一个实施方案中，所述细胞群的所有细胞是MSC。根据此实施方案的细胞典型地可通过培养超过初始代次(“P0”)而获得。同时，在一些实施方案中，原始地分离自脐带的细胞包含MSC以及其他细胞(例如红细胞)，在P0以后所述其他细胞基本上将不存在，这是因为：(a)在P0结束时未贴壁的细胞与生长培养基一起被去除，(b)使用的生长培养基优选地特别适合于扩增MSC，和(c)增殖特性差于MSC的细胞基本上不如MSC那样增殖良好，因此，在几次累积群体倍增的过程后，所述细胞群变得富含MSC。
在另一个实施方案中，所述细胞群包含MSC以及非-MSC。根据此实施方案的细胞典型地可在分离后立即获得，例如在初始代次(“P0”)之前或期间，和/或通过将本发明的至少一种细胞与至少一种其他细胞组合获得。
优选地，细胞群中的全部细胞源自同一物种。更优选地，所述细胞群中的全部细胞是人细胞。优选地，所述细胞群中的全部细胞彼此是同基因的；更优选地，所述细胞群中包含的所有细胞彼此是自体的。甚至更优选地，所述细胞群中的所有细胞源自同一个体。这样的细胞群可通过使用一根单一脐带，或其部分，作为起始材料获得。
优选地，所述细胞群不含源自除脐带以外的组织的MSC。更优选地，所述细胞群不含可检测量的源自除基质华通氏胶以外的脐带节段的MSC。当在细胞群中不能检测到内皮细胞特异性标志物(例如3G5)和上皮细胞特异性标志物(例如EpCAM)时，所述细胞群符合所述特征。
优选地，所述细胞群包含大量细胞，其中至少80％(按细胞数计),优选至少90％(按细胞数计),更优选至少95％,诸如至少96％,至少97％,至少98％,至少99％(各自按细胞数计)是根据第二个方面的细胞。第二个方面的所有优选实施方案也适用于本发明的第三个方面。细胞总数的优选至少70％,优选至少80％,更优选至少90％,诸如至少95％,至少96％,至少97％,至少99％或至少99％,最优选100％是如在第二个方面，和任选地一个或多个其优选实施方案(单独地或组合在一起)中限定的细胞。在一个实施方案中，所述细胞群基本上由根据第二个方面的细胞组成。在一个实施方案中，所述细胞群基本上全部地由根据第二个方面的细胞组成。
优选地，所述群是分离的细胞群。在一个实施方案中，所述细胞群位于人体或动物体外。分离的细胞群一般是在其生理体内环境外的细胞群。优选地，所述细胞群是离体细胞群。特别地，所述离体细胞群优选地位于脐带外。特别地，所述离体细胞群优选地不含血管。在一个实施方案中，所述离体细胞群在培养容器中。在一个实施方案中，所述离体细胞群在适合于保存的容器中，诸如在小瓶中。在一个实施方案中，所述离体细胞群处于约35℃-39℃的温度，优选约36℃-38℃,诸如约37℃。在一个非互斥的实施方案中，所述离体细胞群在培养容器中，或在适合于保存的容器中。优选地，所述适合于保存的容器适合于运输在上述温度范围内的细胞。在一个实施方案中，所述离体细胞群在适合于冷冻保存的容器中，诸如在冷冻瓶中，优选地处于–180℃或更低的温度。在一个实施方案中，所述离体细胞群在培养容器中。在一个实施方案中，所述离体细胞群是有代谢活性的，优选正在扩增的细胞群。
所述细胞群的一些特征可以通过物理特性来描述。对于物理特性的测定，通常，有可能从所述细胞群获取样品，并且测定包含在所述细胞群的样品中的所有或部分细胞的物理特性。由于根据本发明的细胞群典型地是均质的和/或特征在于其中包含的单个细胞彼此类似或很相像，因此关于包含在所述样品中的细胞的特定特性，诸如例如基因表达、体积或表面积、形状等的发现通常也适用于该群中的其余细胞，除非上下文另外地说明和/或另外很明显特定的细胞群包含彼此在基因型和/或表型上明显不同的细胞。在此情形中均质意指基本上所有细胞很相像或相似。
所述细胞群优选进一步的特征在于所有细胞的特征是基本上均一的物理特性。“基本上均一”意指至少90％的细胞，诸如至少91％的细胞,诸如至少92％的细胞,诸如至少93％的细胞,诸如至少94％的细胞,诸如至少95％的细胞,诸如至少96％的细胞，诸如至少97％的细胞，诸如至少98％的细胞，和优选至少91％的细胞，符合一个或多个所期望的物理特征。特别期望的是如上所述与在流式细胞术期间的前向散射光(FSC)相关的细胞体积是物理特征，其在根据本发明的细胞群中是基本上均一的。
优选地包含在根据本发明的细胞群中的细胞的平均体积小于PVWJ-来源MSC的平均体积。PVWJ-来源MSC可例如如本文比较实施例中所述获得。一旦对单个细胞测定了细胞体积，则可以通过算术方法确定平均细胞体积。用于测定细胞体积的方法不特别地限制，尽管优选基于FACS的方法，特别是如上面对单一细胞详述的那样。
所述细胞群优选进一步的特征在于所述细胞群中的细胞的体积和/或表面积，或备选地，在于高百分比的所述细胞具有小的体积和/或表面积。
优选地，本发明的细胞群的特征是平均FSC值为60或更小，或在所述范围内的优选值，如上面对于单一细胞所述。例如，所述细胞群的特征可以是平均FSC值为55或更小，诸如50或更小。在具体的实施方案中，所述细胞群内的至少90％的细胞的特征是FSC值为45+/-10。在更具体的实施方案中，所述群的所有细胞的FSC值为45+/-10。在优选的实施方案中，所述细胞群内至少90％的细胞的平均FSC值为约45。在更优选的实施方案中，所述群的所有细胞的平均FSC值为约45。优选地，本发明的细胞的特征为FSC值小于PVWJ-来源细胞的FSC值。
优选地，所述细胞群中的细胞的平均表面积不超过3000μm2。优选地所述细胞的表面积不超过2500μm2。优选地所述细胞的表面积不超2100μm2。在一些实施方案中，所述细胞的表面积不超过2000μm2。在多个细胞的群中，平均表面积优选地在本文给出的限制范围内。在一些实施方案中，所述细胞群中的细胞的平均表面积为优选1000-300μm2,优选1100-2700μm2,优选1200-2500μm2,优选1300-2200μm2,优选1400-2000μm2,优选1500-1900μm2,更优选1600-1800μm2,和最优选约1700μm2。
优选所述细胞群进一步的特征在于至少70％的细胞(按细胞数计),优选至少80％(按细胞数计),优选至少90％(按细胞数计),更优选至少95％,诸如至少96％,至少97％,至少98％,至少99％(各自按细胞数计)是有活力的。“有活力的”表示不是凋亡的细胞。因此，依次地，所述细胞群包含占细胞总数的30％或更小，优选细胞总数的20％或更小，更优选细胞总数的10％或更小，和最优选细胞总数的5％或更小的比率的凋亡细胞。在一个实施方案中，所述细胞群不含任何凋亡细胞。凋亡细胞的合适标志物是7AAD(参见，例如实施例3)。在一个实施方案中，活力在分离细胞后立即测定，即，在扩增前。高百分比的活力代表了相对于以前所述的MSC群的优势。
优选所述细胞群的进一步特征在于至少60％的细胞(按细胞数计),至少70％的细胞(按细胞数计),优选至少80％(按细胞数计),优选至少90％(按细胞数计),更优选至少95％,诸如至少96％,至少97％,至少98％,至少99％(各自按细胞数计)是多能性的。
在一个实施方案中，所述细胞群包含占细胞总数的2％或更小，优选细胞总数的1％或更小的比率的肥大细胞。最优选地，所述细胞群不含肥大细胞。
在一个实施方案中，所述细胞群包含占细胞总数的2％或更小，优选细胞总数的1％或更小的比率的成纤维细胞。最优选地，所述细胞群不含成纤维细胞。在此实施方案中，术语“成纤维细胞”要狭义地理解，其是指已经分化成成纤维细胞的那些细胞并且不包括为多能性的且仅具有分化成成纤维细胞的能力的那些细胞。
在一个实施方案中，所述细胞群包含占细胞总数的2％或更小，优选细胞总数的1％或更小的比率的造血谱系的细胞。最优选地，所述细胞群不含造血谱系的细胞。在优选的实施方案中，所述细胞不含任何血细胞，诸如来自脐带血的血细胞。对于血细胞确定了几种标志物，因此，可以很容易地测试符合此优选实施方案。
在一个实施方案中，所述细胞群包含占细胞总数的2％或更小，优选细胞总数的1％或更小的比率的血管周细胞。最优选地，所述细胞群不含任何血管周细胞。血管周细胞的标志物是3G5。因此，此实施方案可以备选地描述为所述细胞群不含表达标志物3G5的任何细胞和/或在其表面上展示3G5的任何细胞。在一个实施方案中，所述细胞群没有被血管周细胞污染。对于骨髓来源的MSC已经记载了表达3G5(Khan等人,J.Orthop.Res.,2010,vol.28,p.834-40)。因此，不表达3G5也可以适合于区分根据本发明的细胞群与骨髓来源的MSC群。在一个实施方案中，所述细胞群没有被血管周细胞污染。在一个实施方案中，所述细胞群不含骨髓来源的MSC。
在一个实施方案中，所述细胞群包含占细胞总数的2％或更小，优选细胞总数的1％或更小的比率的上皮细胞。最优选地，所述细胞群不含任何上皮细胞。上皮细胞的标志物是上皮细胞粘附分子(EpCAM)。因此，此实施方案可以备选地描述为所述细胞群不含表达标志物EpCAM的任何细胞和/或在其表面上展示EpCAM的任何细胞。在一个实施方案中，所述细胞群没有被上皮细胞污染。
在一个实施方案中，所述细胞群占细胞总数的2％或更小，优选细胞总数的1％或更小的比率的内皮细胞。最优选地，所述细胞群不含任何内皮细胞。内皮细胞的标志物是CD31。因此，此实施方案可以备选地描述为所述细胞群不含表达标志物CD31的任何细胞和/或在其表面上展示CD31的任何细胞。在一个实施方案中，所述细胞群没有被内皮细胞污染。
在一个实施方案中，所述细胞群占细胞总数的2％或更小，优选细胞总数的1％或更小的比率的红细胞。最优选地，所述细胞群不含任何红细胞。红细胞的标志物是血红蛋白和BGP1。因此，此实施方案可以备选地描述为所述细胞群不含表达BGP1和/或血红蛋白的任何细胞的任何细胞。在一个实施方案中，所述细胞群没有被红细胞污染。
优选地，所述细胞群中包含的细胞的小于10％显示端粒酶活性,更优选所述细胞群中包含的细胞的小于5％显示端粒酶活性,和最优选小于所述细胞群中包含的细胞的2.5％显示端粒酶活性。端粒酶活性的测定和与其相关的方面在上面进行了描述并且也适用于本发明的此第三个方面。各个细胞群可以区别于以前描述的其他细胞群(例如US2004/0136967 A1)。
在一个实施方案中，所述细胞群的进一步特征在于其中包含的细胞，或更具体地和优选地，其中包含的MSC在其表面上不展示MHC II，或不表达MHC II。因此，优选地，所述细胞群的MSC不表达MHC II。在一个实施方案中，MHC II表达可以适合于区分根据本发明的细胞群与其他含有MSC的细胞群(参见，例如Sarugaser等人,2005,Stem Cells,vol.23,p.220-229)。
优选地，所述细胞群可通过根据本发明的第一个方面的方法获得，特别是当包括步骤(c),即，扩增步骤时。因此，根据本发明的包括步骤(c)的方法可以产生间充质基质细胞群。由根据本发明的第一个方面的方法产生的由方法限定的产品特征一般可与根据本发明的第二个和第三个方面的产品特征组合。备选地或另外地，根据本发明的细胞群因此可以描述为可通过根据本发明的第一个方面的包括步骤(c)的方法获得的细胞群。
优选地根据本发明的基质细胞群基本上不含有污染因子。基本上不含污染因子的基质细胞群在本文中定义为基本上不含传染原诸如病毒(有包膜的和无包膜的)、寄生虫、细菌和内毒素的细胞群，即，含有不能利用基于培养、血清学或分子鉴定系统或利用LAL测试(内毒素)检测到的量的此类传染原的细胞群。
优选地，根据本发明的细胞群基本上不含有抗生素。基本上不含有抗生素的细胞群可通过使细胞在缺少抗生素的条件下生长至少一代来获得。例如，即使在分离细胞后的第一代(“P0”)中存在抗生素，但对于P0后的所有代次优选停用抗生素；换句话说，例如对于P1和所有后续的代次可以使用不添加抗生素的含有5％hPL的生长培养基MSCBM CD。
在一个实施方案中，所述离体细胞群被冷冻。冷冻细胞通常在-180℃或更低的温度下是保存稳定的，尽管在此实施方案中适合于保存细胞的任何条件都是合适的。细胞可以被冷冻，优选速冻于液氮中。在冷冻前可以添加冷冻保护剂。在一个实施方案中，所述细胞群保存于液氮中。在优选的实施方案中，冷冻的细胞群是细胞库。此实施方案现在将进一步详述。
细胞库
如例如在实施例6中所示，本发明的细胞的可靠特征是对于从单一脐带不同的分离产生的特定表型，并且随着几次累积群体倍增保持所述特定表型。因此，可根据本发明获得的细胞或另外地与本发明有关的细胞可靠地具有特定表型并且在许多代内在扩增期间保持该表型。因此，本发明的细胞特别适合于建立细胞库。
实际上，优选地，根据本发明的细胞群是细胞库。因此，本发明的细胞群可以为细胞库的形式。所述细胞库包括SWJ-来源的细胞。除非另外指明，则所述细胞库中包含的细胞群一般对应于上述的细胞群。优选所述细胞库包括大量细胞，其中细胞总数的至少70％,优选至少80％,更优选至少90％,诸如至少95％,至少96％,至少97％,至少99％或至少99％,最优选100％是如在本发明的第二个方面，和任选地其优选实施方案中的一个或多个(单独地或组合在一起)中限定的细胞。
本发明的细胞库可通过包括扩增根据本发明的SWJ-来源的细胞的方法获得。备选地，可以保持刚分离的细胞(未扩增的细胞)的细胞库，从中可以在后续的阶段任选地获得扩增的细胞。然而，优选地，所述细胞库包括扩增的细胞，即，可通过本发明的包括步骤(c)的方法获得的细胞。
所述细胞库优选包括未贴壁细胞。这样的细胞库可通过下列的方法获得，所述方法包括在产生细胞库之前酶促脱附,例如胰蛋白酶消化贴壁细胞。可以通过根据现有技术的方法执行酶促脱附。
在一个实施方案中，细胞库在所述细胞生长持续5-30个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增),诸如8-25个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增)后产生。
保持所述细胞库，使得一些或所有细胞可以从细胞库取出和/或使用，例如用于进一步培养，在所期望的时间点，诸如未来的时间点。
当细胞群被“保持”时，这可以在不干扰对所述细胞群的未来培养的任何条件下完成；细胞群可以以冷冻或非冷冻形式保持；然而，对于根据本发明的细胞库，优选以冷冻形式的保持。
优选地，根据本发明的细胞库是冷冻细胞库。冷冻细胞通常在-180℃或更低的温度下是保存稳定的，尽管在此实施方案中适合于保存细胞的任何条件都是合适的。细胞可以被冷冻，优选速冻于液氮中。在冷冻前可以添加冷冻保护剂。所述细胞可以保存在任何合适的条件，尽管在-180℃或更低的温度下冷冻是最典型的。
所述细胞库典型地包含容纳在多个独立等分试样中的细胞，诸如在多个单个小瓶中。优选地，每个小瓶包含细胞悬液。适合于悬浮间充质基质细胞的任何液体，特别是生长培养基,且优选适合于本发明的生长培养基，适合于重新悬浮根据本发明的细胞。在优选的实施方案中，所述细胞库包含这样的液体，所述液体包含用于培养间充质基质细胞的基础培养基，诸如例如MSCBM CD，或与其基本上等效的基础培养基。优选地，其中悬浮了所述细胞库的细胞的液体进一步包含血小板裂解物,例如5％(体积/体积)血小板裂解物(PL),并且在人细胞的情况下，包含人血小板裂解物(hPL)。
细胞库或其等分试样可以在未来的时间点使用，例如用于接种传代培养物，例如在生产生物反应器中。
本发明的细胞库的典型实施方案包括原始细胞库(PCB)和继代细胞库(SCB)。因此，本发明的细胞库优选选自原始细胞库(PCB)和继代细胞库(SCB)。
广义上，术语“原始细胞库”是指在从脐带分离细胞后制备的第一个细胞库,更优选第一个冷冻的细胞库。
在一个实施方案中，原始细胞库在所述细胞生长持续5-14个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增)后产生。
原始细胞库(PCB)典型地为等分试样的形式。在各个先前代次(例如P2)和酶促脱附，诸如例如胰蛋白酶消化、离心和重新悬浮后制备等分试样。优选地，用于原始细胞库的细胞等分至100-300个小瓶中，诸如150-200个小瓶，诸如160-180个小瓶，或更准确地165-175个小瓶。
优选地，原始细胞库的每个小瓶包含1x106个细胞-1x107个细胞，优选5x106个细胞-500x106个细胞,优选10x106个细胞-100x106个细胞,优选15x106个细胞-50x106个细胞,优选18x106个细胞-30x106个细胞,诸如约20x106个细胞。
优选地，每个小瓶中包含的体积为1-100ml,诸如2-20ml,优选3-10ml,和最优选约4ml。
在一个说明性实施方案中，在全面流程后获得的原始细胞库由150-200个小瓶组成，每个包含20x106个细胞，并且每个容纳4ml包含所述细胞的(冷冻的)液体。
还有可能将最终用于继代细胞库的细胞的悬液填充在不同尺寸或容量或具有不同的量或浓度的细胞的小瓶或容器中。尽管如此,上述量指示典型地可以在全面流程中获得多少，并且可以计算向不同尺寸或容量或不同的量或浓度的细胞的小瓶或容器的转换。
广义上，术语“继代细胞库”是指在从脐带分离细胞后制备的继代细胞库,更优选第二个冷冻的细胞库；换句话说，由原始细胞库中包含的所有或部分细胞制备的第一个细胞库，更优选第一个冷冻的细胞库。
在一个实施方案中，继代细胞库在所述细胞生长持续14-25个累积群体倍增(在P0期间不计数累积群体倍增)后产生。
由于原始细胞库一般包含多个等分试样的细胞，它们可以在相同的或不同的时间点使用用于进一步的培养，因此有可能同时地或相继地从一个原始细胞库生成多个继代细胞库。
例如，有可能从原始细胞库中包含的每个小瓶生成一个继代细胞库。例如，有可能从一个原始细胞库开始生成100-300个继代细胞库，诸如150-200个继代细胞库，诸如160-180个继代细胞库，或更准确地165-175个继代细胞库。
继代细胞库(SCB)典型地为等分试样的形式。在各个先前代次(例如P4)和酶处理，诸如例如胰蛋白酶消化、离心和重新悬浮后制备等分试样。优选地，用于继代细胞库的细胞等分至100-300个小瓶中，诸如150-200个小瓶，诸如160-180个小瓶，或更准确地165-175个小瓶。
优选地，继代细胞库的每个小瓶包含1x106个细胞-1x107个细胞，优选5x106个细胞-500x106个细胞,优选10x106个细胞-100x106个细胞,优选15x106个细胞-50x106个细胞,优选18x106个细胞-30x106个细胞,诸如约20x106个细胞。
优选地，继代细胞库的每个小瓶中包含的体积为1-100ml,诸如2-20ml,优选3-10ml,和最优选约4ml。
还有可能将最终用于继代细胞库的细胞的悬液填充在不同尺寸或容量或具有不同的量或浓度的细胞的小瓶或容器中。尽管如此,上述量指示典型地可以在全面流程中获得多少，并且可以计算向不同尺寸或容量或不同的量或浓度的细胞的小瓶或容器的转换。
工业应用性
具有增殖特性的哺乳动物细胞以及各个细胞群对于非商业和商业活动，诸如研究活动来说都是有价值的。本发明的细胞对于此类目的是特别有吸引力的，尤其是考虑到所述方法的良好再现性，所述细胞的优异的增殖特性和高产量。根据本发明的细胞群可以适合于制造细胞制品，例如用于研究或商业用途。例如，在工业上可行的是制备原始细胞库或继代细胞库以及在商业上提供这样的细胞库，或更典型地来自它们的单个等分试样，在商业上用于研究目的，诸如例如体外基于细胞的测定。
除此之外，有可能以自动的方式运行本发明的方法的全部或部分，使用机器，包括机器人，用于执行一个或多个处理步骤。因此，本发明的方法也易于工业应用。
在一些实施方案中，本发明的细胞可以在体外培养和扩增，例如用于研究或生产目的。例如，本发明的细胞或由其衍生的细胞，可以用来筛选药物化合物和组合物的功效和/或细胞毒性和/或作用机制和/或研究特定疾病的机制和/或用于体外基因传递和/或用于生产生物分子，诸如蛋白质，包括有治疗活性的蛋白质。
本发明的细胞可以作为纯培养物培养，或与其他细胞系共培养，原代或继代培养。
此外，由于其分化潜能，所述细胞可以用来产生成熟细胞或细胞系。间充质基质细胞向成熟细胞的分化可以通过特定条件触发，诸如向培养基添加特定的外源生长因子。
下列的实施例和附图用于说明的目的并且不意在限制本发明，本发明由权利要求限定。
实施例
实施例0:本发明的各个方面共用的材料和方法
在所有实验实施例中，除非另外指明，否则使用MSCBM CD或与其基本上等效的基础培养基。示例性的培养基描述如下。
基础培养基MSCBM CD和包含它的生长培养基
基础培养基MSCBM CD商购自Lonza(Wakersville,MD,USA；Cat.No.95062-688)。根据生产厂商的资料，其是无血清的，优化用于所有类型的人间充质干细胞的多次传代扩增，支持多谱系分化并且不需要贴壁基质用于细胞的接种。与MSCBM CD基本上等效的培养基也是适合的。
“MSCBM CD/GA”如下制备：
-500ml MSCBM CD(Lonza)
-0.5ml GA1000(Lonza；根据生产厂商的资料，GA1000包含30mg/ml庆大霉素和15μg/ml两性霉素)
“MSCBM CD/hPL”——除非具体地指示变化的量或比率——包含5％(体积/体积)人血小板裂解物(hPL),和2U/ml肝素,两者均添加至MSCBM CD(即，不含抗生素庆大霉素和两性霉素)。hPL合适地由包含3.8x108个血小板/ml至1.2x109个血小板/ml,平均约7.9x108个血小板/ml的组合物制备；这样的血小板裂解物可获自例如意大利摩德纳综合医院血库或任何其他供应商。
“MSCBM CD/GA/hPL”——除非具体地指示变化的量或比率——包含5％(体积/体积)人血小板裂解物(hPL),和2U/ml肝素,两者均添加至MSCBM CD/GA(即，具有抗生素庆大霉素和两性霉素)。
不添加生长因子(除了最终包含在hPL和/或在基础培养基中的那些以外)，除非另外明确地说明。
上述培养基特别适合于扩增根据本发明的细胞。
细胞计数
对于细胞数目的测定，除非另外指示，则细胞通过自动细胞计数仪计数，诸如特别是如果有必要，在细胞计数前，将细胞通过酶促脱附，诸如例如通过胰蛋白酶消化。如果不需要对红细胞计数，则在细胞群经历氯化铵处理后完成细胞计数；这样的处理已知用来裂解红细胞。结果，可以确定细胞群中除红细胞以外的细胞总数。为此，推荐用于裂解红细胞的氯化铵溶液可商购自多个供应商(例如STEMCELL Technologies)。可以根据生产厂商的说明书添加和使用此类溶液。
实施例1:脐带的分段和切分，以及获得切碎的基质华通氏胶
从足月分娩获得人脐带。如果总重量为40g或更高则接受该脐带。使用锋利的无菌手术刀通过垂直切成约2.5cm长的节段来对脐带分段。将脐带段用HEPES-缓冲盐水溶液(HBSS)+300μg/ml庆大霉素和0.15μg/ml两性霉素B漂洗总共10min。使用机械震摇来洗掉组织中的血液。
对于每个这样获得的节段，继续如下获得基质华通氏胶部分：纵向切开脐带，去除血管以及紧邻的一般3mm的周围基质(血管-血管周围区带,也称作血管-血管周围华通氏胶–PVWJ)并丢弃。去除应当小心地进行，从某种意义上说，应当避免使血管开放和/或损失血管细胞或血管周细胞。避免拉出脐带基质。
在收集基质组织之前，重新光学检查组织的每个节段以确保PVWJ已经被完全去除。在节段中应当不保留任何血管或血管的片段。
一旦已经从脐带段去除PVWJ，则使用锋利的剪刀从脐带段剪下基质组织片。利用锋利的手术刀刮除脐带段的内表面以获得残留的基质组织。非常小心地去除在刮除后留下的薄羊膜上皮膜并丢弃。脐带内衬的羊膜下(或间充质)层包括在被分离的WJ中。这通过小心地从组织上刮除羊膜上皮来实现；重要的是当收集所述组织时小心地不要包括羊膜上皮膜片。这样获得的组织是纯的基质华通氏胶(SWJ)。
用锋利的剪刀和/或手术刀精细地切碎这样获得的(剪下和刮除)SWJ。向切碎的组织添加HEPES-缓冲盐水溶液(HBSS)。将切碎的组织汇集在皮氏培养皿中。
为了提取SWJ，在提取期间要小心避免提取来自脐带血的细胞，上皮细胞或内皮细胞以及来自血管结构的细胞。出于对照的目的(任选地但是可推荐的，特别是当首次重新实施此实施例时),内皮细胞的标志物是CD31；上皮细胞的标志物是上皮细胞粘附分子(EpCAM)，血管周细胞的标志物是3G5。
实施例1的步骤显示在图3中。
如实施例1中所举例说明的本发明的方法通过完全地节段性地去除和消除脐带的非-WJ成分(诸如脐带衬膜/羊膜、血管和血液)产生了纯华通氏胶，避免了提取脐带血的细胞、上皮细胞或内皮细胞以及来自血管结构的细胞。这允许获得纯的华通氏胶组织(WJ组织)。因其来源，此特定的WJ组织是基质WJ组织。
实施例2A:酶处理
材料和方法：如实施例1中所述获得的WJ组织用来从其分离WJ-来源的原代细胞，步骤如下：切碎的组织/HBSS混合物以每1mL消化缓冲液(参见下表)100mg切碎的组织/HBSS混合物的比率悬浮在250ml锥形管中的消化缓冲液(参见下表)中。消化缓冲液包含适合于从分离的组织释放MSC的酶。
表:100ml消化缓冲液的配方(所有成分均无菌)
-1ml hPL,例如来自意大利摩德纳综合医院血库(由包含3.8x108个血小板/ml至1.2x109个血小板/ml,平均约7.9x108个血小板/ml的组合物制备)
-肝素至2U/mL的终浓度
-1ml丙酮酸钠(来自100mM储备液)
-36μl 1M CaCl2
-胶原酶制剂NB4或NB6(均来自SERVA)至0.18Wünsch U/ml消化缓冲液的最终活性
-基础培养基(商购的用于哺乳动物细胞的生长培养基，诸如DMEM或MSCBM CD)–补足100ml
使用来自SERVA的胶原酶制剂(NB4,NB6)，典型地使用NB4。根据生产厂商的说明，胶原酶制剂NB4/NB6是来自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶生产株的天然产品，并且是无毒性的胶原酶制剂，其包含胶原酶和其他蛋白酶。根据生产厂商的说明，NB4标准级(17454.02和17454.01(均来自SERVA))被设计用于解离不同的组织以分离各种细胞类型，例如软骨细胞，肌肉细胞，上皮细胞，皮肤成纤维细胞，肝细胞，脂肪细胞，它们用于研究目的。根据生产厂商的说明，胶原酶制剂NB4也可以用作胶原酶制剂NB6的低成本替代品，用于建立程序的目的。根据生产厂商的说明，胶原酶制剂NB6 GMP级(NB6 GMP级,17454.02(SERVA)被专门设计用于分离细胞用于一些特定的移植目的。在本公开中报道的实验中，自始至终使用NB4，除非另外明确地指明。根据SERVA(在本实验中使用的胶原酶制剂的生产厂商)的说明，SERVA指出胶原酶活性以根据Wünsch(在本文中同义地称为Wünsch单位)的PZ单位(PZ-U)为单位。
已知肝素是含有血小板裂解物的液体组合物的合适添加剂，用于避免凝结(例如Lohmann等人,2012,PLoS ONE,vol.7e37839)。
还初步地基于以前被描述用于酶消化脂肪组织的胶原酶活性，测试具有较高胶原酶活性(终浓度高于0.18Wünsch U/ml)的消化缓冲液，但在较高胶原酶活性的存在下的消化是不利的(数据未显示)。
将切碎的组织(实施例1)置于无菌试管中。添加消化缓冲液(见上)。将这些含有切碎组织和消化缓冲液的试管(消化物)在37±1℃温育持续以3小时的消化时间间隔，同时在轨道摇床上以75rpm持续轻柔搅动进行消化。“消化物”是指待消化的组织和消化缓冲液的整体。
在所述消化时间间隔结束时，通过添加2体积的补充了1％(v/v)人血小板裂解物(hPL)的MSCBM CD稀释消化物并使其通过一块无菌纱布垫的两层以从未消化组织/部分消化组织中分离。滤液称为“经消化的混合物”。
使用250ml离心管将经消化的混合物以680x g离心15分钟。在离心结束时，去除上清液并将片状沉淀物(含有来自脐带的华通氏胶的刚分离的间充质基质细胞)重悬于1-2mLMSCBM CD/GA/hPL中(参见实施例0)。
随后，测定总细胞数。最典型地，在经消化的混合物中包含的细胞不全是MSC：
实施例2B:首次培养(P0和任选地P0+)
将来自实施例2A的重悬细胞接种在T-225培养瓶(Corning的商标,Corning,NY,USA)中的含有5％hPL的MSCBM CD/GA(参见实施例0；每个T-225培养瓶50mL培养基)中以起始源自基质华通氏胶的细胞的首次体外培养。此次细胞培养称为“P0”。开始P0的那天称为“第0天”，随后以升序的数字计数天数。在P0开始时的细胞密度为8.000个细胞/cm2或更多。cm2是指在细胞在P0进行培养时培养瓶底部被生长培养基覆盖的表面。
从第5天开始每3天用新鲜的MSCBM CD/GA/hPL饲养细胞。备选地，也可以在P0期间在多层培养室中培养细胞，代替培养瓶：在该情况下，每1x1培养室使用150mL MSCBM CD/GA/hPL以起始首次细胞培养；然而，除非另外明确提及，否则P0培养在T-225培养瓶中进行。
如所述的那样细胞在P0培养直至细胞的汇合率达到80-90％。这通常是5-12天的时期之后的情况。然后，对细胞进行胰蛋白酶消化。在传代结束时在胰蛋白酶消化后对细胞计数。
评价下列的验收标准：1产量，2活力，3汇合率，4形态学。在胰蛋白酶消化细胞后确定验收标准1和2。细节如下。
在此实验实施例中，所有4个验收标准必须满足。另外，在形态学检查中，另外目测细胞的尺寸和形状是否是相对均一的。优选地，就是均一的。
在不满足标准2、3或4中的任一个或多个的情况下，丢弃整个细胞培养物。本发明人观察到通常满足标准2、3和4，因此没必要丢弃。然而，在不满足的情况下丢弃的可能性保证了仅在满足验收标准时进行后续的传代。
在P0后细胞总数大于800万个细胞的情况下(条件是还满足验收标准2、3和4)，直接继续进行实施例2B。
在P0后细胞总数不大于800万个细胞的情况下(条件是然而满足验收标准2、3和4)，进行额外的继代培养步骤，称为“P0+”或“P0加”。(为避免歧义，在本文件中自始至终，在某些细胞在步骤“P0+”中继代培养的情况下具体指示；换句话说，在没有给出这样的具体指示的情况下，细胞从P0直接进入P1(实施例2B))。P0的条件完全对应于上面描述的P0的条件，不同之处在于经历P0+的重悬细胞来自P0,不直接来自实施例2A。
细胞在P0+中培养直至细胞的汇合率达到80-90％。然后，将细胞进行胰蛋白酶消化。评价上面的验收标准：1产量，2活力，3汇合率，4形态学。当满足所有标准时，继续进行实施例2B。当不满足一个或多个标准(包括产量)时，丢弃细胞。特别地，如果在P0+后总细胞数没有至少800万个细胞，则丢弃细胞。
在此实施例中的总细胞数基于一整根人脐带作为起始材料(全面流程)指示。如果起始材料的量不同(例如仅半根人脐带)，则对于验收标准1的细胞总量要相应地通过算术方法调整。
尤其取决于细胞的产量(在不同的全面流程之间有一些程度的变化)，还考虑到来自不同个体的生物材料的变化，P0期间的累积群体倍增要进行一些变化。
实施例2C:进一步扩增(P1和后续的传代)
如本文所述，获得来自实施例2B中的P0(或P0+,但仅仅在明确地那样描述的情况下)的经胰蛋白酶消化的细胞，并如下将其继代培养一代或多代。
第一次继代培养称为“P1”。在P1结束时，将细胞再次用胰蛋白酶消化并继代培养。此继代培养/胰蛋白酶消化循环优选进行4代(P1计数为“第一代”)，尽管在一些情况下已经进行达到12代。每一代连续编号，即，P1在P0后，P2在P1后，以此类推。除非另外指明，否则细胞生长并继代培养至第4代(P4)。
对于从P1向上的每一代，所有培养板具有相同的规定尺寸。具体地，对于每一代，培养容器由CS5、CS10或CS20培养板(Corning,Corning,NY,USA)的多层培养室构成。对于从P1向上的每一代，细胞在含有5％hPL且不含抗生素的MSCBM CD(参见实施例0；每个T-225培养瓶50mL MSCBM CD/hPL)中生长。除非另外说明，否则在此实施例中对于P0后的所有代均停用抗生素；换句话说，在此实施例中，对于P1和后续的所有代均使用不添加抗生素的MSCBM CD/hPL。
在每次传代开始时的细胞密度为2.500个细胞/cm2。
在每次传代后细胞被胰蛋白酶消化。在胰蛋白酶消化后在每次传代结束时对细胞计数。
作为接种时的细胞密度、细胞培养容器的底面(其一起限定在传代开始时的总细胞计数)和在传代结束时的总细胞计数的函数，累积群体倍增可以通过算术方法来确定。
根据本发明人的经验，P1和P2期间的累积群体倍增(P1加P2的总和，但不包括P0),通常正常在9-13的范围内。
根据本发明人的经验，P3和P4期间的累积群体倍增(P3加P4的总和，但不包括P0、P1和P2),通常正常在6-10的范围内。因此，P1、P2、P3和P4期间的累积群体倍增(P1加P2加P3加P4的总和，但不包括P0),通常正常在15-23的范围内。
任选地——在本文中具体指示的情况下——在特定的代次，例如P2后将细胞冷冻。细胞可以被冷冻，例如速冻于液氮中，根据标准程序。很有可能将这样冷冻的细胞化冻并在化冻后例如使它们经历进一步的培养传代。冷冻可以整批地或以等分试样进行。以等分试样，优选在小瓶中冷冻是非常优选的并且典型地在本实施例中进行，除非另外指定。
当在特定的代次后将细胞冷冻和解冻时，该代的编号在解冻后延续。例如，当在P2后将细胞冷冻时，则在解冻后的下一代为P3。优选地，并且除非另外指示，在解冻后累积群体倍增的计数也延续。
在优选的实施方案中，在P2后细胞被制成等分试样并冷冻。这样获得的冷冻的等分试样可利用用于在所需的时间点时单独地解冻。冷冻的细胞，优选为等分试样，可以称作原始细胞库(PCB)。换句话说，没有必要——且典型地不期望——在同一时间点解冻所有等分试样的PCB。相反，对等分试样的等分和单个地冷冻提供的优势在于单个等分试样可以在单个时间点以及单个期望的时间点从冷冻移出、解冻和接受进一步培养(继代培养，进一步扩增)。
在全面流程的具体实例中，从一根人脐带作为起始材料开始，在P2后获得168个小瓶(每个小瓶包含20x 106个细胞,4ml容量)。每个小瓶可以被冷冻，并且单个小瓶可以在单个时间点被解冻用于进一步培养，例如P3和以上。在全面流程的一个具体实例中，将在P2后获得并冷冻的一个小瓶解冻，并将其中包含的细胞经历P3和P4。在该具体实例中，在P4后，获得168个小瓶(每个包含20x 106个细胞，4ml容量)。
在每次传代中将细胞如所述的那样培养至细胞的汇合率达到80-90％。这通常是约3-4天的时期之后的情况。然后，优选评价下列的验收标准：1产量，2活力，3汇合率，4形态学。在胰蛋白酶消化细胞后确定验收标准1和2。细节如下。
(*)在P2后细胞可以以等分试样冷冻以制备原始细胞库(PCB)。基于下列的情形指示P3和P4的细胞数：P3利用来自PCB的一个小瓶起始，所述小瓶包含20x106个细胞。
重要的是注意到与以前已知的用于制备和扩增间充质干细胞的方法相比，可通过根据本发明的扩增获得的产量非常高。
在此实施例中，所有四个验收标准必须满足：如果一个标准不满足，则来自各代的整个细胞培养物都要丢弃。本发明人观察到通常满足全部标准1、2、3和4，因此没必要丢弃。然而，在不满足的情况下丢弃的可能性保证了仅在满足全部验收标准时进行后续的传代。
总之，实施例2显示了基质华通氏胶将细胞保持于能够扩增的状态。基质华通氏胶细胞被鉴定为潜在的多能性基质细胞的便利来源，其可以在培养中保持和扩增。
比较实施例
为了比较目的，如WO 2004/072273 A和Sarugaser等人,2005,Stem Cells,vol.23,p.220-229所述分离细胞，具体如下面比较实施例1、2A、2B和2C中所述。
比较实施例1
从人脐带分离血管。将切下的血管缝合以形成环，阻断流体进出血管的通道。
比较实施例2A
将环(比较实施例1)立即置于含有在处于37℃的PBS(w/o Mg2+和Ca2+)中的1mg/mL胶原酶Sigma C-0130溶液的50mL试管中。根据文献，胶原酶Sigma C-0130的比活性为0.25-1.0FALGPA单位/mg固体。对于信息来说，FALGPA单位不能直接通过算术方法转换成Wünsch单位，因为各个单位涉及具有不同底物的不同测定；然而，在本领域中关于Wünsch单位如何与FALGPA单位相关联有一些一般经验。基于该一般经验，可以得出结论在比较实施例2中使用的胶原酶的总活性比实施例2中使用的胶原酶的总活性高得多。
在与胶原酶温育18-20小时后，通过添加2体积的PBS和1mL的胎牛血清(FBS)终止消化溶液。因此，在比较实施例2中胶原酶处理的总持续时间比实施例2中使用的胶原酶处理的总持续时间长得多。将经消化的样品过滤以去除未消化的组织并以1,800rpm(BeckhamCoulter AllegraTM25R)离心15分钟。将细胞重悬于75％α-MEM培养基,15％限定成分FBS,10％抗生素中。为了裂解血细胞，以与细胞悬液1:3v/v的比率使用氯化铵(NH4Cl)、碳酸氢钾(KHCO3)和EDTA的溶液在冰上通过轻轻搅拌持续5-10分钟。以500x g离心10分钟后，将细胞重悬并通过台盼蓝(0.4％)染料计数。
比较实施例2B
将如比较实施例2A中所述获得的血管周围-华通氏胶-来源的细胞(PVWJ)以6,000-8,000个细胞/cm2的密度接种并在37℃在补充有15％限定成分FBS(HyClone,GEHealthcare,USA,#SH30070.03)和抗生素的α-MEM(不含核苷，Life Technologies,Waltham,MA,USA,#22561-021)中在5％CO2,95％湿度的培养箱中温育以起始培养“P0”。
在5-6天后首次更换培养基，然后每2天更换。在培养6-10天后，细胞达到汇合。在P0结束时，在6-10天的时期后，细胞达到汇合。然后将它们用胰蛋白酶消化。利用台盼蓝染料(0.4％)测定总细胞数。
比较实施例2C
获得从比较实施例1B获得的经胰蛋白酶消化的细胞并如下继代培养。从第1代培养(“P1”)向上，将细胞以3,500-4,000个细胞/cm2的密度接种于含有15％限定成分FBS的α-MEM中。在P0后应当停用抗生素；换句话说，在不添加抗生素的情况下使用生长培养基。所述细胞称为血管周围华通氏胶-来源的细胞(“PVWJ”)。血管周围华通氏胶(PVWJ)-来源的间充质基质细胞也可以称为“血管周围区带-来源的间充质基质细胞”。除非另外指明，细胞生长并继代培养直至第4代(P4)。
任选地——但仅在具体指示的情况下——在特定的代次，例如P2后将细胞冷冻。很有可能将这样冷冻的细胞解冻(化冻)并在化冻后例如使它们经历进一步的培养传代。
实施例3:在消化后对细胞的分析
如实施例2A中所述获得的细胞(即在消化步骤后，含有或不含有血小板裂解物(PL))称为基质-华通氏胶来源的细胞或“SWJ”。将这些与PVWJ-来源的对照细胞(“PVWJ”,比较实施例2A)比较。将SWJ和PVWJ用7-氨基-放线菌素-D(7AAD)-染色(Via Probe；BDBiosciences；根据生产厂商的说明书使用)以通过FACS分析检测凋亡。获取未染色的样品以检测样品自发荧光并对所有考虑的通道设置光电倍增管(PMT；FACS传感器)。通过获取单色染色管来建立补偿设置。采集的数据通过Diva软件(BD Biosciences)分析。统计学通过t-检验进行。结果显示在图4A中。
对刚分离的样品的FACS分析揭示了，对于两种基于NB4-胶原酶制剂的消化实验规程(含有和不含血小板裂解物(PL),参见图4A),本发明人检测到大于总细胞群的97％的细胞具有活力。特别是在基于NB4-胶原酶制剂的不含PL的消化(3小时消化)后，他们观察到1.5％±1.3％的凋亡率，在基于NB4-胶原酶制剂的含有1％PL的消化(3小时消化)后，凋亡细胞仅为全部分离细胞的1.45％±0.3％。然而，根据比较实施例1的全部分离的PVWJ有30.6％±9.6％是7AAD阳性(图4A,右侧较高的带阴影的条)。因此，可以显示用NB4-胶原酶制剂(SERVA)处理3小时的样品的活力高于如比较实施例1中所述分离的细胞。这提示根据比较实施例1的实验规程比根据本发明的实验规程伤害更大；即，尽管根据比较实施例1的实验规程导致分离更多的细胞，但它们中的较大比例是凋亡的。凋亡细胞不适合于扩增。
此外，通过比较血小板裂解物的使用(是/否)并且就AAD7阳性细胞的百分比而言没有观察到显著的差异(图4A),本发明人可以显示血小板裂解物不会负面地影响胶原酶活性，在释放细胞和细胞的活力方面没有负面影响。令人惊讶地，血小板裂解物(通常包含血浆)的存在对消化没有负面影响，或更特别地对细胞的产量没有负面影响，尽管血小板裂解物以前被报道负面地影响某些酶的活性，包括蛋白酶(Chesney等人,J.Clin.Invest.,1974,vol.53,p.1647–1654)。
实施例4A:根据本发明分离的SWJ-来源细胞的物理特性与PVWJ-来源细胞比较的 分析
下一步，本发明人的目标是评价根据本发明分离的SWJ-来源细胞(实施例1和实施例2A)的总细胞数和物理特性与根据比较实施例1和比较实施例2A的实验规程获得的PVWJ-来源细胞的比较。此比较研究基于对各种刚分离的细胞的胶原酶效率和物理参数(通过FACS)的评价。
首先，关于刚分离的细胞的总数，本发明人通过根据比较实施例1的方法获得的PVWJ-来源细胞比根据本发明的方法如实施例1中所述获得的SWJ-来源细胞多。
其次，通过流式细胞术分析物理参数，即前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)，揭示了SWJ-来源细胞与通过根据比较实施例1的方法分离的PVWJ-来源细胞相比具有较低的FSC和SSC。结果在下表中示出并显示在图5A中。
表：经实验测定的SSC和FSC
平均来说，SWJ-来源细胞与PVWJ-来源细胞相比具有较小的细胞体积(通过FSC测定)，具有较低的内部复杂性(通过SSC测定)。FSC的差异是统计学显著的。具体地，SWJ-来源细胞(根据本发明,n＝4)与根据比较实施例1和2A的方法分离的PVWJ-来源细胞(PVWJ,n＝6)相比具有较低的FSC和SSC。此流式细胞术读数表明通过根据本发明的方法分离的SWJ-来源细胞的特征是更多均质的小细胞，具有低的胞质复杂性，而PVWJ-来源细胞的特征是非均质群体，具有较大的平均体积和较大的胞质复杂性。在此情形中均质意指基本上所有细胞很像或相似。较小的体积和较低的内在复杂性是指示干细胞性和性能的两个特征(参见，例如Wagner等人,2008,PLoS One,2008,3:e2213)。通常，归因于内部结构，具有较复杂的内部结构的细胞在侧向散射分析中看上去更闪亮/明亮。
实施例4B:刚分离的细胞的形态学表型：PVWJ细胞不同于根据本发明分离的细胞
比较SWJ细胞和PVWJ细胞的形态学。为了确保高度的可比较性，将单根脐带分成两部分：一部分采用实施例1、2A和2B中所述的方法制备，另一部分根据比较实施例1、2A和2B制备，然而在两种情况下，在培养第1代(P1)接种后两天或三天具体地分析细胞，(原始放大倍数100X)。
本发明人发现来源于根据本发明的纯基质华通氏胶(SWJ)的细胞是均质的，小的和纺锤形的(图5B,左)，而来源于血管周围华通氏胶(PVWJ)的细胞是大的且具有明显的细胞骨架(图5B,右)。血管周围华通氏胶(PVWJ)-来源的间充质基质细胞也可以称为“血管周围区带-来源的间充质基质细胞”。
实施例4C:刚分离的细胞的克隆形成：PVWJ细胞不同于根据本发明分离的细胞
下一步，研究根据本发明的细胞的克隆形成潜能。这如下完成：如实施例1和2A所述获得SWJ，如比较实施例1中所述获得PVWJ。然后，使用无菌漏斗，将含细胞的提取物通过一个无菌纱布垫的两层过滤以去除未消化的组织。使用250ml离心管以680x g离心15分钟。去掉上清液(倒掉或使用低真空抽吸)。将片状沉淀物重悬于1-2mL MSCBM CD/GA/hPL(参见实施例0)中。将重悬的细胞接种于3x T225培养瓶或1x 1-多层培养室中的MSCBM CD/GA/hPL培养基(参见实施例0；每个T-225培养瓶50mL培养基或每个1x1多层培养室150mL)中以起始P0培养。在接种后前5天不要移动P0培养物。5天后更换培养基。此后每3天利用MSCBMCD/GA/hPL饲养。在第12天利用3U/mL胰蛋白酶并用MSCBM+1％hPL中和收获P0细胞。结果显示于图5C中。这些发现证明根据本发明的细胞分离实验规程在初始接种(第0代)后产生了更均一的能够生成更紧密的集落的细胞群。
实施例5:根据本发明的SWJ-来源细胞与骨髓来源细胞(BM)的比较。
骨髓来源的MSC(BM-MSC,如Grisendi等人,Cytotherapy,2010,vol.,12,p.466-477所述获得)以6,000个细胞/cm2的密度接种。根据本发明的SWJ-来源细胞(实施例1、2A、2B和2C,具体地培养至第5代(P5),以2,800个细胞/cm2的密度接种。在培养2-3天后，它们达到亚汇合，对两个细胞类型均获取5个代表性图像。具体地，利用装有Axiocam照相机的Axioskop-Observer-1显微镜(Zeiss)使用10x物镜观察贴附塑料的MSC。获取图像并通过AxioVision 4.8.2软件处理以评价细胞面积。(Moore等人,Exp.Eye Res.2013,vol.115,p.178–188；Zeilbeck等人,PLoS One.,2014；vol.9(4),e95546)。
结果显示在图6中，发现根据本发明的SWJ-来源细胞的平均表面积比从BM提取的MSC小。
实施例6：刚分离的细胞的细胞表面标志物
材料和方法：将三根脐带接受两种不同的方法(根据比较实施例1和2A的现有技术，“PVWJ”，与之相较的是根据本发明的细胞，参见实施例1和2A，“SWJ”)。
分离后立即计数PVWJ/SWJ-来源的细胞并将其重悬于荧光激活细胞分选(FACS)分析聚丙烯管中的1mL PBS 1X中(200,000个细胞/管)。细胞在含有达尔伯克改良Eagle培养基(DMEM)、10％胎牛血清(FBS)、0.1M叠氮化钠和66.6mg/mL人免疫球蛋白G的100μL封闭缓冲液中在冰上温育20分钟。随后将它们在1ml 1x PBS中洗涤并以300g离心5分钟。
样品随后用在含有0.5％牛血清白蛋白(BSA；Sigma)的90μL PBS中的一抗在冰上染色30min并用装有处于488和633-nm波长的两个空冷式激光的FACSAria III流式细胞仪(BD Biosciences)分析。对于间接染色(仅对于抗-GD2)，使用一种二级大鼠抗小鼠别藻蓝蛋白(APC)-缀合抗体(BD Pharmingen)。7-氨基-放线菌素-D(7AAD)-染色(ViaProbe；BDBiosciences；根据生产厂商的说明书使用)通过流式细胞术评价以检测凋亡。获取未染色样品以检测样品的自发荧光并且为所有被考虑的通道设置PMT；通过补偿调节控制荧光串扰。通过获取单色-染色管建立补偿设置。采集的数据通过Diva软件(BD Biosciences)分析。
结果：对刚分离的样品的免疫-表型分析揭示了，对于两种分离方法，发明人鉴定了CD105、CD73和CD90，它们都是MSC的典型表面抗原表达。类似地，在两种分离方法后检测血小板衍生生长因子β(CD140b)。在两个样品中没有检测到HLA-DR，然而，发现PVWJ-来源细胞表达3G5,而SWJ-来源细胞不表达，表明依照基质华通氏胶中细胞的来源，根据本发明的方法没有导致对血管周细胞的分离。一些表面标志物的相对展示显示在图7A中。在图7A，右侧图例中，指示了在大多数细胞中表达/不表达的一些表面标志物。
还在细胞的延期培养后分析细胞表面标志物。分析了源自两种独立的分离和不同的累积群体倍增的细胞培养物。发现了下列情况：在不同细胞分离之间，在CD105、CD90和CD73(MSC的阳性标志物)的展示方面没有显著差异。在不同的累积群体倍增(cPD)时，CD105、CD90和CD73也是一致地高。相反，在来自两种分离和不同的累积群体倍增的细胞中CD45、CD14、CD34、CD19和HLA-DR(已知是MSC的阴性标志物)以非常低的水平表达(参见下表)。
表:通过流式细胞术的表型表征(％阳性细胞)。cPD＝累积群体倍增
这些数据显示了在根据本发明的方法中扩增基质WJ-来源细胞的条件能够以高产量以稳定的表型在几个累积群体倍增期间生成纯的基质WJ-来源细胞。因此，本发明的细胞适合于建立细胞库。
实施例7:扩增的细胞上的细胞表面标志物
材料和方法：为了表征PVWJ-来源细胞和SWJ-来源细胞上的表面抗原，从根据不同的方法(实施例1和2A、2B和2C vs.比较实施例1和2A、2B和2C)由同一脐带制备的细胞库中包含的细胞进行FACS阵列。将所述细胞在P2化冻(实施例2C/比较实施例2C)并扩增至P4(实施例2C/比较实施例2C)以执行FACS分析。在利用蛋白水解酶和胶原水解酶的细胞脱附溶液(Accutase,Thermo Fisher)脱附后，将细胞以500x g离心10分钟。将片状沉淀物重悬于培养基(MSCBM CD/hPL用于SWJ或含有15％限定成分FBS的α-MEM用于PVWJ)中并通过台盼蓝0.4％染料计数。细胞在1X PBS中洗涤并以300X g离心5分钟。将细胞重悬于BD Pharmingen染色缓冲液+EDTA并将250,000个细胞/孔接种于96孔板中。根据Human Cell SurfaceMarker Panel datasheet(BD LyoplateTM,BD Biosciences)依照生产厂商的说明书进行流式细胞筛选。结果显示在图7B中。
具体地测试根据本发明的刚分离的细胞(实施例1,2A)是否表达CD46、CD55和CD59。如图7B中所示，VPWL细胞和SWJ细胞两者均表达这些表面补体调节物。这与例如Ignatius等人,J.Cell.Biochem.,2011,vol.112,p.2594-2605和Schraufstatter等人,World J.Stem Cells,2015,vol.7,p.1090-1108的早期记载一致，他们显示骨髓来源的MSC表达细胞表面补体调节物，并且被改造以上调CD46、CD55和CD59的MSC据信能在体外和体内保护它们自身免受补体介导的细胞裂解。图7B证实本发明的细胞共享这种特殊的表达表型。
实施例8：通过定量逆转录酶PCR(qRT-PCR)测定的根据本发明的细胞的基因表达。
材料和方法：根据本发明获得的细胞(实施例2C),特别是：在第4代后，用于此分析。利用TRIzol(Life Technologies)根据生产厂商的说明书使用一步法分离总细胞RNA。使用revertAid H minus第一链cDNA合成试剂盒(Thermo Scientific)根据生产厂商的说明书从1μg总RNA合成第一链互补cDNA。通过分光光度计(Beckman Coulter730)定量单链cDNA以便在每个实时PCR孔中使用10ng cDNA。
通过Applied Biosystems StepOneTM实时PCR系统和FastGreen MasterMix试剂进行定量实时PCR技术。在独立的管中对每个靶基因和参照基因进行基因表达的定量。使用IDT/>(可在线在http://eu.idtdna.com/PrimerQuest/Home/Index获得)设计正向和反向引物，确保它们跨越对mRNA特异的内含子序列而非基因组DNA。将靶基因的相对表达水平针对内源性参照β-肌动蛋白基因的表达水平归一化。
结果显示在图8中。图8显示了例如APCDD1、PPARG和FLVCR2在SWJ-来源细胞中表达。在根据本发明制备的不同的SWJ-来源细胞群之间表达是一致性的。这种共享的表达谱从基因表达的角度表明了本发明的细胞的一致性。
然而很明显地，这些基因的表达谱与根据现有技术分离的PVWJ-来源细胞显著不同。具体地，APCDD1在PVWJ-来源细胞中根本不表达。从所述发现得出结论：在来自PVWJ-来源细胞的样品中根本观察不到APCDD1基因的扩增。发明人得出结论：通过实时-PCR，APCDD1表达仅在根据本发明的SWJ-来源细胞中可检测到，但在PVWJ-来源细胞中检测不到。因此APCDD1的表达清晰地区分本发明的细胞与PVWJ-来源细胞。
尽管早期的文献关于非血管周围MSC是否与血管周围MSC不同尚不明确(例如Davies等人,Stem Cells Translational Medicine,2017,vol.6,p.1620–1630)，但现在本实施例提供了证据表明根据本发明获得的基质华通氏胶来源细胞与血管周围MSC截然不同。
实施例9:根据本发明的细胞与参考细胞相比较的增殖潜能
材料和方法：细胞培养:如实施例1、2A、2B和2C中所述在P1后获得的根据本发明的基质华通氏胶-来源细胞(SWJ)，或根据比较实施例1、2A、2B和2C获得的血管周围华通氏胶-来源细胞(PVWJ)，从同一根脐带获得的两种细胞群接种在含有5％hPL(参见实施例0)的不含生长因子的MSCBM CD中，并置于37℃,5％CO2，95％湿度的培养箱中。接种后3天，并且之后每3天，更换培养基。在每代的第4天或第5天将细胞用胰蛋白酶消化，并计数。
细胞计数：使用0.4％台盼蓝染料在Burker计数室中对细胞计数，并如上所述计算累积群体倍增(CPD)。
结果显示在图9中。在SWJ-来源细胞中观察到比PVWJ-来源细胞每代更大数目的群体倍增(PD)(图9A)。因此，根据本发明的SWJ-来源细胞中的PD比PVWJ-来源细胞快。与PVWJ-来源细胞相比，在第2、3和4代时在SWJ-来源细胞中测量到群体倍增统计学显著的增加(通过t检验)。
SWJ-来源细胞具有高增殖潜能，其在所述使用的培养条件(含有5％hPL的生长培养基MSCBM CD)下保持至少9代。在这些培养条件下，如利用SWJ-来源细胞的两种独立分离株经实验测定的那样，SWJ-来源细胞在第10代和第12代之间达到衰老，如下表所示。
表:根据本发明的SVWJ的生长
本实施例增加了额外的证据，即根据本发明的分离和扩增基质华通氏胶-来源细胞(SWJ-来源细胞)的条件允许产生SWJ-来源细胞的大细胞群。本实施例还增加了证据，即SWJ-来源细胞不同于PVWJ-来源细胞并且具有较高的增殖潜能。
与参照MSC，诸如PVWJ-来源细胞相比，每代高的增殖潜能和群体倍增(PD)分别增加了细胞库的产量和/或减少了制备细胞库的时间。从工业的角度来看，这是有优势的。
实施例10:端粒酶活性
对于此测定，将200,000–500,000个根据本发明的华通氏胶-来源基质细胞(SWJ)等分装入1mL Eppendorf管，然后以1,200rpm(Beckham Coulter AllegraTM25R)在+4℃离心10分钟。去掉上清液，并将细胞重悬于1X PBS。在第二次离心步骤后，将干燥的沉淀物在-80℃保存。为了执行该测定，根据生产厂商的说明书使用TeloTAGGG端粒酶PCR ELISA PLUS试剂盒(Roche Diagnostics)。结果显示在图10中。被分析的样品显示相对于该试剂盒提供的阳性对照(被认为100％)，端粒酶活性的平均值为2.4±1.7％。这确认了SWJ-来源细胞的较高增殖能力与异常高的端粒酶活性不相关。
实施例11:衰老
材料和方法：根据本发明的华通氏胶-来源的基质细胞(SWJ)(细胞来源参见实施例1和2A；代次参见实施例2B和2C)在胰蛋白酶消化后，在第6代(P6)、第8代(P8)或第11代(P11)、第12代(P12),以3,000个细胞/cm2的密度接种在6孔多孔板中的3ml培养基(含有5％hPL的DMEM或含有5％hPL的MSCBM CD)中，并在37℃在5％CO2,95％湿度的培养箱中培养4-5天，除非另外指明均一式三份地进行。然后，将细胞在1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，并在室温在2％甲醛/0.2％戊二醛中固定10分钟。将培养板在PBS 1X中漂洗两次，并加入1mL新鲜的β-Gal染色溶液(1mg 5-溴-4-氯-3-吲哚基-βD-半乳糖苷/100μL二甲基甲酰胺,40mM柠檬酸/磷酸钠,pH 6.0,5mM亚铁氰化钾,5mM铁氰化钾,150mM NaCl,和2mM MgCl2)(根据生产厂商的说明书使用)。使细胞在37℃温育过夜，并且如生产厂商(Cell SignalingTechnology)所提供的说明书中所述利用倒置显微镜的光显色。阳性染色细胞看上去胞质中为蓝-绿色。经染色的样品在PBS 1X中洗涤，使用倒置显微镜(Zeiss)通过2.5X物镜观察。由一个观察者对阳性染色细胞(每个视野)定量，并且对每个供体检查至少8个视野(除非另外指明)。
结果：在早期的培养代次(P6-P8)，仅少数细胞对β-半乳糖苷酶染色弱阳性(数据未显示)，表明甚至以非常低的密度接种，根据本发明的SWJ-来源细胞仍具有最低限度衰老的倾向。不希望受任何理论约束，有可能血小板裂解物包含了对于细胞离体生长有利的补充物，例如，生长因子。
实施例12:骨形成分化潜能
方法的描述：将处于第5代的SWJ(实施例2C)诱导分化成骨形成谱系。简言之，SWJ以10,000个细胞/cm2的密度接种在6孔多孔(6-MW)板中的含有5％hPL的MSCBM CD中。这些6-MW板预包被有0.1％明胶溶液。在3-4天的平衡后，更换维持培养基并更换以骨形成培养基。从诱导第7天以后，骨形成培养基由补充以10mMβ-甘油磷酸酯,0.1mM抗坏血酸-2-磷酸酯和10nM地塞米松，另外加100ng/mL rhBMP-2(骨形态发生蛋白2)的含有5％hPL的MSCBMCD构成。通过von Kossa染色(使得骨基质被标记为黑色)结合实时qPCR分析(下文描述)进行骨形成分化的确认。
2周后，将处于骨形成培养基(参见上面)的培养物和平行对照培养物(平行地生长于MSCBM CD加5％hPL中，即，不诱导骨形成的培养基)固定并染色以鉴定有机钙沉积物。对于von Kossa染色，将样品在冰冷甲醇中固定2min，然后在蒸馏水中漂洗两次，并在紫外线(UV)灯下与硝酸银在水中温育30min。在蒸馏水中另外洗涤两次后，使用10X放大倍数(Axioskop-Observer-1倒置显微镜；Zeiss)观察10个高倍视野。通过ImageJ软件(国立卫生研究院,USA)分析数字记录图像，选择性地定量有机钙沉积物的黑色阳性染色区域。实验一式三份地进行。
结果：结果显示在图12中。如所示的那样，在用骨形成培养基处理14天后，对照样品的形态学与骨形成培养基诱导的样品不同，并且磷酸钙的von Kossa染色提供了黑色阳性染色(图12A)。对照样品和诱导样品中阳性染色区域之间的差异是统计学上显著的(通过T检验)(图12B)。为了进一步证实骨形成特征，通过实时-PCR进行分子分析(图12C)。骨形成生物标志物基因的相对表达水平针对内源性参考β肌动蛋白基因归一化。基于定义为非诱导的亚汇合细胞的SWJ标准培养条件(MSCBM CD加5％hPL)计算mRNA的倍数诱导。相对于标准培养条件，所有测试的基因均显著上调(p≤0.05,通过T-检验)。发明人观察到碱性磷酸酶(ALPL)和某些基质蛋白，诸如双糖链蛋白聚糖(BGN)、胶原蛋白(COL1A1)、核心蛋白聚糖(DCN)和弹性蛋白(ELN)是上调最多的生物标志物。这些标志物的组合对于骨形成谱系是特征性的(Murgia等人,PLoS One.2016,vol.11:e0163629)。此表达谱证实了所述细胞的初始骨形成定向。
实施例13:脂肪形成分化潜能
方法的描述：对于脂肪形成分化，将处于培养第5代的SWJ细胞(实施例1、2A、2B、2C)以10,000个细胞/cm2的密度接种在6孔多孔(6-MW)板中的含有5％hPL的MSCBM CD中，并且在3天后，将培养基更换为脂肪形成诱导培养基。脂肪形成培养基由补充以1μM地塞米松,60μM吲哚美辛,10μM胰岛素,0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX),10％兔血清,5％马血清,1％L-谷氨酰胺和1％青霉素/链霉素的含有5％hPL的MSCBM CD构成。对照细胞用含有5％hPL的MSCBM CD培养。对于每种条件以技术重复的方式接种细胞。
10天后，细胞用油红O染料(一种用于脂肪细胞的市售染料)染色以确认分化，如下进行：细胞用PBS 1x简单地洗涤，用37％甲醛蒸汽固定10分钟，然后用水洗涤2分钟。通过向孔中添加油红O溶液(在70％乙醇和丙酮中的10mg/mL油红O)持续3分钟获得染色。将细胞通过Harris苏木素(Bio-Optica,Milan,Italy)复染3分钟。处理后，通过显微镜观察可视化分化的细胞和对照(带有Axiocam MRC5彩色照相机和Axiovision 4.82软件的Axio ObserverA1；均来自Zeiss)。
结果显示在图13中。在处理10天后，SWJ细胞能够在细胞内部产生圆的脂滴，证实脂肪定向。在诱导的样品中大量地检测到脂泡，而在未诱导的对照中则没有(图13)。
实施例14:软骨形成分化潜能
方法的描述：对于软骨形成分化，将处于培养P5代的200,000–500,000个SWJ(实施例1、2A、2B、2C)等分到15mL管中并以1,200rpm(Beckham Coulter AllegraTM25R)离心10分钟。将细胞在生长培养基中在37℃保持在沉淀物中，并打开塞子。温育2天后，用诱导培养基代替生长培养基，所述诱导培养基由补充以500ng/mL rhBMP-6、10ng/mL转化生长因子-β,50mg/mL ITS+Premix(含有胰岛素6.25μg/mL、转铁蛋白6.25μg/mL、硒酸6.25ng/mL、BSA1.25mg/mL和亚油酸5.35μg/mL)、100nM地塞米松、0.2mM L-抗坏血酸-2-磷酸酯、100μg/mL丙酮酸钠、40μg/mL脯氨酸的含有5％人血小板裂解物(hPL)的MSCBM CD构成。每三天更换培养基。在每次更换培养基之前和之后，如上所述将管以1,200rpm离心10分钟。在温育期期间，细胞保持为沉淀物，管塞打开。诱导持续21天，将标本在10％甲醛中固定1小时，然后通过连续经过递增浓度(从70％(v/v)-100％)的乙醇进行脱水。然后将样品包裹在石蜡块中并切成切片至显微镜载玻片上用于阿尔新蓝(Alcian Blue)染色。载玻片用Histo-C清除剂脱蜡并通过经过递减浓度的乙醇梯度(从100％乙醇至70％乙醇)(v/v)再水合化。然后将样品切片与处于缓冲磷酸盐溶液(8g/L NaCl,2g/L NaH2PO4和0.3g/L Na2HPO4)中的0.5mg/mL透明质酸酶和10mg/mL BSA温育。载玻片在水中洗涤5分钟，然后浸在3％(v/v)乙酸溶液中几秒钟。将切片用在3％乙酸(pH 2.5)中的10mg/mL阿尔新蓝溶液(一种市售染料)染色，在其中保持30分钟，并且在水中的洗涤步骤后，用核固红(nuclear Fast Red)溶液(一种市售染料)复染5分钟。
结果显示在图14中。在处理21天后，SWJ已经形成多层的富含基质的形态。诱导的SWJ显示较低的细胞性和细胞外基质内的糖胺聚糖。对照SWJ显示高的细胞性和很少的基质成分。
附图简述
图1:
(人)脐带的横截面和(人)脐带的节段(解剖区域)的示意性视图。在外侧的两个带灰色阴影的椭圆形(1a和1b)一起形成脐带衬膜(包括两层:1a(画为外侧的深灰色圆圈),羊膜(或上皮)层，也称作脐带衬膜；和1b(画为内侧的浅灰色圆圈):羊膜下(或间充质)层)；2:脐静脉；3:脐动脉；4:血管间区域；5:血管周围区域(显示为灰色)；6:华通氏胶的位置的说明性实例；7:脐带血(在血管腔内)。除非另外明确地指明，羊膜下基质(1b)包括在本文中所提到的“基质”中。除非另外明确地指明，羊膜下华通氏胶包括在本文中称作“基质华通氏胶”的华通氏胶中。
图2:人脐带的不同区域的免疫组织化学表征。WJ:华通氏胶；MW:多层壁；PV:血管周围；V:血管；L:腔。基质WJ:远离脐带血管的外壁至少3mm的WJ，和羊膜上皮的内部。约2.00mm的血管周围区域，包括WJ+周细胞+内皮细胞。
材料和方法：人脐带标本用福尔马林固定，用石蜡包埋。分离节段并切成5μm切片用于进一步染色。在不同区域的不同染色很明显代表基质华通氏胶和血管周围区域。血管周围区域具有更复杂的组织形态学模式，具有血管(V),血管周细胞(PV)接壤WJ区域。复杂性还涉及在血管周围区域中所代表的不同细胞类型。相反，基质华通氏胶在组织学上看上去为相对更均一的区域，更均质的细胞成分分散在基质组织的基质中。分离的细胞表达离体MSC群中常见的标志物，诸如CD10、CD140b、GD2、CD73(在此图中未显示)。在两个区域之间这些标志物的免疫组织化学染色模式也不同。在图2B中，在脐带血管区域和基质华通氏胶之间组织学差异更明显。在血管(V)中，腔(L)和代表内皮层(CD31)和内皮下层(CD146,CD271,GD2)的细胞(箭头)清晰地显而易见。还发现CD140b在血管的腔内部分表达。在内皮下层中发现CD73-阳性染色，强度朝向华通氏胶的基质增强(Rasini等人,2013,Cytotherapy,vol.15,p.292-306)。
图3:切断(切分)和细胞的提取——详情参见实施例1。
图4:实施例4的结果，证明了本发明的方法是显著较高活力的原因。详情参见实施例4。
*PVWJ:根据常规方法获得的细胞，参见比较实施例。SWJ:根据本发明分离的细胞。
A:凋亡细胞：血小板裂解物的作用和与常规方法的比较。关于刚分离的细胞的数目，发明人由根据比较实施例1的实验规程获得的细胞(PVWJ)(4.15±1.28x106)比根据本发明的实验规程获得的细胞(1.49±0.35x106)更多。该图代表在三次消化(n＝3)中凋亡细胞的平均值和平均值的标准误(SEM)。全部分离的根据比较实施例1的PVWJ-来源细胞的30.6％±9.6％是7AAD阳性(图4A,右侧较高的带阴影的条)。相反，在存在和不存在hPL的情况下，SWJ-来源细胞的7AAD阳性百分比都很低。因此，发明人发现根据本发明获得的细胞与通过根据现有技术的方法获得的细胞相比具有更高的活力。
B:对刚分离的细胞样品的FACS分析。4个FACS作图分别代表了SWJ-来源细胞(上)和PVWJ-来源细胞(下)的物理参数(右)和7AAD阳性(即，凋亡，左侧)。在右侧的图上，活细胞在垂直线的左侧。
C:总细胞数的图形表示，通过流式细胞术测定(图4B)。该图代表了在三次消化(对两种细胞群均为n＝3)中凋亡细胞的平均值和平均值的标准误(SEM)。
D:凋亡细胞的百分比的图形表示，通过流式细胞术测定(图4B)。对刚分离的样品的FACS分析揭示了对于根据本发明的SWJ-来源细胞，全部细胞群中大于79％具有活力。相反，根据比较实施例1分离的全部细胞(PVWJ-来源细胞)中52.9％±2.6％是7AAD阳性的。C:在SWJ(n＝5)和PVWJ(n＝9)样品中的细胞分离效率。D:该图代表了在三次消化(对两种细胞群均为n＝3)中凋亡细胞的平均值和平均值的标准误(SEM)。
图5:形态学和集落形成
A:代表了通过流式细胞术测定的物理参数，即，来自脐带的刚分离的细胞的前向散射(FSC)和侧向散射(SSC)(FACS图在左侧)。该图代表了物理参数的平均值和SEM。分离的SWJ-来源的细胞群(根据实施例1和2A)的特征在于FSC值比分离的PVWJ-来源的细胞群(根据比较实施例1和2A；p＝0.02，通过T-检验)显著更小。SSC:SWJ来源细胞与来自PVWJ的细胞相比具有较低的胞质复杂性。详情参见实施例4A。
B:在培养第1代时的形态学研究(n＝3)。在扩增后，SWJ-来源细胞(实施例2C)的特征是小的和纺锤形的细胞群,而PVWJ-来源细胞(根据比较实施例2C)的特征是大的形状和明显的细胞骨架。两张图代表了在代表性样品中在培养第1代(P1)时在接种后2天或3天，SWJ-来源细胞(左)相比于PVWJ-来源细胞(右)的形态学(原始放大倍数100X)。
C:SWJ-来源细胞和PVWJ-来源细胞的集落形成。详情参见实施例4C。在拍摄显示在下部的图片之前细胞用结晶紫染色。SWJ-来源的细胞群的培养物的特征是由具有小表面积的细胞组成；这些细胞往往建立集落，而PVWJ-来源的细胞群的培养物的特征是由具有不同的表面积的细胞组成，也包括大的细胞。因此，PVWJ-来源细胞看上去更均质；在此情形中均质意指基本上所有细胞很相像或相似。大的PVWJ-来源细胞往往生长相对更缓慢(数据未显示)。
图6:对细胞表面积的定量测定：SWJ-来源细胞相对于骨髓来源的间充质基质细胞(BM，或BM-MSC)。来自骨髓和来自基质华通氏胶(分别是BM和SWJ)的塑料贴附性MSC在培养第5代(P5)时进行可视化。对每个样品获取5张图片，光学标识34个BM-MSC和33个SWJ细胞。在肉眼检查时人工地将细胞用图形圈起来。BM-来源细胞的特征是与SWJ-来源细胞(1701.2±1137.3μm2)相比具有较大的平均细胞表面积(4300.5±2486.5μm2)(p＝5.15X10-7,通过ANOVA)。因此得出结论：根据本发明的SWJ-来源的MSC比BM-来源的MSC小。
图7:实施例7的结果。左侧上的图代表了PVWJ-来源细胞和SWJ-来源细胞中的表面标志物的平均值和SEM，两种细胞均通过两种不同的分离方法刚分离自三根脐带(SWJ:根据实施例1和2A；PVWJ:根据比较实施例1和2A)。对刚分离的样品的免疫表型分析揭示了对于两种方法均展示了CD105、CD73和CD90，它们是MSC的典型表面抗原展示。类似地，在两种方法后检测到血小板衍生生长因子β(CD140b)的展示。在两个样品中均不表达HLA-DR。然而，仅在PVWJ-来源细胞的群中检测到3G5的展示，表明本发明的方法特别适合于分离SWJ-来源的MSC，所述MSC不含血管周细胞。
A:左侧的图代表了通过两种不同的消化方法从三根脐带刚分离的PVWJ和SPPC中的表面标志物的平均值和SEM(比较实施例1,“PVWJ”，相比于根据本发明的细胞，SWJ)。右侧上的图片指示了在大多数细胞中表达/不表达的一些表面标志物。
B:该图代表了在通过两种不同的方法从脐带刚分离的细胞中的展示特异性表面标志物的细胞的平均百分比(比较实施例1,“PVWJ”，相比于根据本发明的细胞，SWJ)。
图8:如通过实时-PCR(RT-PCR)测定的根据本发明的细胞的定量基因表达。根据本发明分离的两个独立的细胞群接受RT-PCR分析；两者均显示在图8中并与对照PVWJ细胞比较。该图显示了在两个基因之间表达的差异(ΔCt)(目的基因相比于β-肌动蛋白，β-肌动蛋白为一种看家基因)。
在对照细胞中检测不到APCDD1表达。
图9:增殖潜力：该图代表了在被分析的4个培养代(从P1至P4)中PVWJ-来源细胞(n＝9)和SWJ-来源细胞(n＝7)的累积群体倍增的平均值和SEM(平均值的标准误)。与PVWJ-来源细胞相比，在SWJ-来源细胞中观察到每代大量的群体倍增(PD)。详情参见实施例9。
图10：在不同批次的SWJ-来源细胞中的端粒酶表达。详情参见实施例10。
图11:不同批次的SWJ-来源细胞中的衰老。CAKE2是基本上与MSCBM CD等效的基础培养基的首字母缩写；5PL是5％(体积/体积)人血小板裂解物的首字母缩写。详情参见实施例11。
图12:WJ-来源细胞群的骨形成潜能。直方条的中断表示比例尺的改变。CAKE2是基本上与MSCBM CD等效的基础培养基的首字母缩写；5PL是5％(体积/体积)人血小板裂解物的首字母缩写。详情参见实施例12。
图13：WJ-来源的细胞群的脂肪形成潜能。详情参见实施例13。SWJ-来源细胞在细胞内部产生圆的脂滴(右侧的上面和下面的图片)，证实脂肪定向。在诱导的样品中大量地检测到脂泡，而在未诱导的对照中则没有。CAKE2是基本上与MSCBM CD等效的基础培养基的首字母缩写；5PL是5％(体积/体积)人血小板裂解物的首字母缩写。
图14:SWJ-来源的细胞群的软骨形成潜能。详情参见实施例14。在处理21天后，未诱导的SWJ-来源细胞(对照)已经形成多层的富含基质的形态(左侧的两个图片)。诱导的SWJ-来源细胞(右侧的两个图片)显示较低的细胞性，和细胞外基质内的糖胺聚糖(深色区域，对应于原始彩色图像中的强蓝色染色)。CAKE2是基本上与MSCBM CD等效的基础培养基的首字母缩写；5PL是5％(体积/体积)人血小板裂解物的首字母缩写。

Claims (21)

1.一种获得间充质基质细胞的方法，所述方法包括：
(a)从脐带分离基质华通氏胶或其级分，
(b)使所述基质华通氏胶或其级分在血小板裂解物(PL)的存在下接受酶处理，由此从所述基质华通氏胶或其级分释放至少一种细胞，所述酶处理包括胶原酶，
其中步骤(b)后面接着步骤(c):
(c)在包含血小板裂解物(PL)的生长培养基中扩增所述至少一种细胞，
其中(a)分离基质华通氏胶或其级分的特征在于从所述脐带物理去除血管和血管周围区域的步骤，并且
其中所述物理去除血管和血管周围区域的特征在于从所述脐带剥离所述血管和所述血管周围区域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)分离基质华通氏胶或其级分的附加特征在于从脐带衬膜物理分离羊膜下基质的步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述华通氏胶从所述脐带衬膜分离。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述华通氏胶至少从所述脐带衬膜的上皮层分离。
5.根据权利要求2所述的方法，其中从所述脐带衬膜物理分离华通氏胶的特征在于刮下所述华通氏胶。
6.根据权利要求5所述的方法，其中不机械切开所述脐带衬膜而刮下所述华通氏胶。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述物理去除血管和血管周围区域的步骤之前将所述脐带分段。
8.根据权利要求7所述的方法，其中垂直于所述脐带进行所述分段，并且其中每个垂直段具有1cm至4cm的长度。
9.根据权利要求8所述的方法，其中每个垂直段具有2cm至3cm的长度。
10.根据权利要求8所述的方法，其中每个垂直段具有2.5cm的长度。
11.根据权利要求7所述的方法，其中在步骤(b)之前从所述脐带的一个或多个段去除一段或多段血管。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述酶处理通过将基质华通氏胶或其级分与包含胶原酶的消化缓冲液混合来执行。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述胶原酶的比活性不超过0.5Wünsch U/ml。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述胶原酶的比活性不超过0.25Wünsch U/ml。
15.根据权利要求12所述的方法，其中所述胶原酶的比活性是0.18Wünsch U/ml。
16.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)和(b)一起在小于3小时的总时间内进行。
17.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中，所述基质华通氏胶或其级分在人血小板裂解物(hPL)的存在下接受酶处理。
18.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中，所述至少一种细胞在包含人血小板裂解物(hPL)的生长培养基中扩增。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种细胞在不含任何添加的血清的生长培养基中扩增。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述生长培养基不含胎牛血清(FBS)。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述至少一种细胞在包含基础培养基MSCBM CD的生长培养基中扩增。
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