KR20140115373A - 손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약 - Google Patents

손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약 Download PDF

Info

Publication number
KR20140115373A
KR20140115373A KR1020147023740A KR20147023740A KR20140115373A KR 20140115373 A KR20140115373 A KR 20140115373A KR 1020147023740 A KR1020147023740 A KR 1020147023740A KR 20147023740 A KR20147023740 A KR 20147023740A KR 20140115373 A KR20140115373 A KR 20140115373A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
protein
bone marrow
derived
cell
Prior art date
Application number
KR1020147023740A
Other languages
English (en)
Inventor
가츠토 다마이
다케히코 야마자키
야스후미 가네다
Original Assignee
가부시키가이샤 제노믹스
고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 제노믹스, 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸 filed Critical 가부시키가이샤 제노믹스
Publication of KR20140115373A publication Critical patent/KR20140115373A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)

Abstract

본 발명자들은, 1)골수 유래 세포가 이식피부 내에 대량으로 동원되는 것, 2)동원된 골수 유래 세포는 이식피부 조각 내에서 진피 섬유아세포, 지방세포, 근육세포, 혈관내피세포, 표피 각질세포의 어느 것으로도 분화되고, 동원된 골수 유래 세포 중에 골수 유래 중간엽 줄기세포가 포함되어 있는 것, 3)골수 유래 중간엽 줄기세포를 말초혈에서 이식피부 조각으로 동원하고 있는 것은 이식피부의 괴사조직에서 방출된 HMGB1, HMGB2, HMGB3인 것, 4)정제한 HMGB1, HMGB2, HMGB3은 골수에서 분리·배양한 중간엽 줄기세포의 유주를 촉진하는 것, 5)골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 HMGB1을 포함하는 활성물질을 피부, 뇌, 심장을 포함하는 다수의 장기 추출액으로부터 간편하게 정제할 수 있는 것, 6)골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성물질을 배양세포에서 간편하게 추출할 수 있는 것, 7)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획이 뇌손상 시에 골수 유래 세포를 대량으로 동원하는 것을 세계에서 처음으로 밝혀냈다.

Description

손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약{Pharmaceuticals that promote functional regeneration of damaged tissues}
본 발명은 손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약에 관한 것이다.
최근, 손상 조직의 회복과정에 여러가지의 줄기세포가 기여하고 있는 것이 명백해지고, 손상부위에 줄기세포를 다수 동원함으로써 기능적 조직재생을 유도하는 새로운 재생 의료의 개발이 진행되고 있다. 이러한 새로운 재생 의료를 실현하기 위해서는, 1)손상부위에 동원 가능한 줄기세포가 생체 내에 풍부하게 존재하는 것, 2)줄기세포를 손상부위에 동원하는 인자가 단리·동정(同定)되어 있는 것이 필요하다.
손상부위에 동원 가능한 줄기세포는, 손상부 또는 그 주변 조직에 존재하는 조직 줄기세포와 말초혈 중에 존재하는 골수 유래 줄기세포가 있다. 최근에 골수 유래 세포가 많은 손상 조직 재생에 기여하고 있는 것이 보고되고 있지만, 손상 조직에의 골수 유래 세포 동원 기전에 대해서는 알려져 있지 않다. 여기서 말하는 골수 유래 세포는 혈액 세포(백혈구, 적혈구)로의 분화능을 가진 조혈계 줄기세포와 구별되고, 지금까지 골수 중간엽 줄기세포라고 불리는 세포로 대표되는 줄기세포 또는 골수 중에 존재하는 조직 전구세포 집단을 포함한다. 골수 중간엽 줄기세포는 골아세포, 지방세포, 연골세포로의 분화능을 가진 미분화 줄기세포로서, 섬유아세포, 근육세포, 간질 세포(stromal cell), 힘줄세포 등 그 밖의 중간엽의 세포로 더 분화하는 것이 가능하게 되어 있다. 최근에는 골수 중간엽 줄기세포가 신경세포, 더 나아가 상피계 세포(피부 각질세포 등)나 혈관내피세포로 분화되는 것이 증명되어 있다(비특허문헌 9). 조직 전구세포는, 혈액계 이외의 특정 조직세포로의 일방향성 분화능을 가진 미분화 세포라고 정의되고, 상술한 중간엽 조직, 상피계 조직, 신경조직, 실질장기, 혈관내피로의 분화능을 가진 미분화 세포를 포함한다.
HMGB1(High mobility group box 1: 고이동성 그룹 1 단백질)은 생체 내 거의 모든 세포에 존재하는 분자량 약 25,000의 단백질로서, 과거의 보고에 의하면, 1)세포 내에서 DNA와 결합하고, 크로마틴 구조를 제어함으로써 유전자 발현을 조절하고 있고(비특허문헌 1), 2)염증성 사이토카인 TNF-α나 IL-1, LPS의 작용에 의해 염증조직에 존재하는 단구나 마크로파지로부터 분비되고, 세포 밖에서 RAGE(당화 최종산물 수용체)에 결합하여(비특허문헌 2) 강력한 염증반응을 유도하고(비특허문헌 3), 3) 관류저하(hypoperfusion)에 의해 괴사에 빠진 세포에서 주위의 조직으로 방출되고(비특허문헌 4), 4)중증 감염증인 패혈증 환자에서의 염증의 진전에 관여하고 있고(비특허문헌 5), 5)심근경색 모델에 있어서, 경색부에 투여함으로써 심근 내에 존재하는 줄기세포의 분열·증식을 촉진하여 심근의 재생·기능회복을 촉진하고(특허문헌 1), 6) 관류저하 간장 모델 동물에 있어서, 관류저하상태 제작 전에 미리 투여함으로써 간장해의 정도를 경감시키고(비특허문헌 6), 7)근육손상 모델에 있어서, 손상부위에 투여한 HMGB1은 동시에 투여한 혈관 전구세포를 손상부위로 유도하여 근조직재생을 촉진하고(비특허문헌 7), 8)신경세포에 있어서, 신경돌기의 형성을 유도하는(비특허문헌 8) 등의 기능이 알려져 있다. 그러나, 골수 유래 줄기세포, 특히 골아세포, 연골세포, 지방세포 등으로 분화 가능한, 이른바 중간엽 줄기세포를 손상 조직에 동원한다는 보고는 과거에 존재하지 않는다.
종래, 뇌나 척수의 중추신경세포는 한번 장해를 받으면 재생이 일어나지 않는다고 믿어 왔다. 그러나, 최근 신경 줄기세포의 존재 및 이 유도가 가능하게 되었다. 또한, 정상 신경계에서의 신경 줄기세포 니치(niche)도 동정되어 왔다. 이 때문에, 이미 불가능하다고 되어 있던 손상 중추 신경계 세포의 회복도 기대할 수 있게 되었다. 현재, 뇌척수 손상, 변성 질환 등에 대한 신경재생에 관한 연구가 과감하게 전개되고 있다.
뇌조직(세포)손상의 원인으로서 외상에 의한 뇌좌상, 뇌허혈성 질환이 주요한 것이다. 다른 원인으로서, 뇌종양 적출수술을 비롯한 뇌외과적 수술에 기인하는 것을 들 수 있다. 특히, 뇌실질세포에서 발생하는 신경교종의 모든 적출은 어렵고, 운동이나 언어기능장해를 피하기 위해서는 부분적 적출에 그치지 않을 수 없다. 또한, 악성 신경교종은 생명 예후도 나쁘고, 화학요법이나 방사선 요법을 비롯하여 최근 연구가 활발하게 이루어지고 있는 면역·유전자 치료도 충분한 효과를 나타내기까지는 이르지 않고 있다. 따라서, 가급적 많은 종양세포의 적출을 하고, 그 결과 생기는 뇌기능손상을 회복시키는 치료가 있으면 이상적이다.
비특허문헌 1: Bustin 등, Mol Cell Biol, 19:5237-5246, 1999년
비특허문헌 2: Horiet 등, J.Biol. Chem., 270, 25752-25761, 1995년
비특허문헌 3: Wang 등, Science, 285:248-251, 1999년
비특허문헌 4: Muller 등, EMBO J, 20:4337-4340, 2001년
비특허문헌 5: Wang 등, Science, 285:248-251, 1999년
비특허문헌 6: Germani 등, J.Leukoc.Biol., 81, 2007 전자 저널판
비특허문헌 7: Palumbo 등, J.Cell Biol., 164:441-449, 2004년
비특허문헌 8: Merenmies 등, J.Biol.Chem., 266:16722-16729, 1991년
비특허문헌 9: Yaojiong 등, Stem cells, 25:2648-1659
특허문헌 1: 특표 2005-537253
본 발명은, 손상 조직으로 분화하는 세포를 손상부위에 동원하는 인자를 단리·동정하고, 당해 인자를 이용한 발명을 제공하는 것을 과제로 한다.
손상 조직으로 분화하는 세포의 동원 인자가 명백하게 되면, 이 인자를 손상부위에 투여함으로써 말초혈 중에 존재하는 손상 조직으로 분화하는 세포나 국소 조직에 존재하는 손상 조직으로 분화하는 세포를 손상부위에 다수 동원하는 것이 가능하게 되고, 기능적 조직재생을 촉진하는 새로운 재생 의료의 개발이 가능하게 된다.
본 발명자들은, 이식피부 조각이 생체조직에 생착하는 과정에서 골수 유래 세포가 피부외 조직에서 이식피부 조각으로 동원되어 피부조직 재생에 기여할 가능성을 검토하여, 1)로부터 골수 유래 세포가 이식피부 내에 대량으로 동원되는 것, 2) 동원된 골수 유래 세포는 이식피부 조각 내에서 진피 섬유아세포, 지방세포, 근육세포, 혈관내피세포, 표피 각화세포 중 어느 것으로도 분화되고, 동원된 골수 유래 세포 중에 골수 유래 중간엽 줄기세포가 포함되어 있는 것, 3)골수 유래 중간엽 줄기세포를 말초혈에서 이식피부 조각으로 동원하고 있는 것은 이식피부의 괴사조직에서 방출된 HMGB1, HMGB2, HMGB3인 것, 4)정제한 HMGB1, HMGB2, HMGB3은 골수에서 분리·배양한 중간엽 줄기세포의 유주(遊走)를 촉진하는 것, 5)골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 HMGB1을 포함하는 활성물질을 피부, 뇌, 심장을 포함하는 다수의 장기 추출액으로부터 헤파린 친화성 칼럼을 이용하여 칼럼 크로마토그래피법으로 간편하게 정제할 수 있는 것, 6)골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성물질을 배양세포에서 간편하게 추출할 수 있는 것, 7)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획이 뇌손상 시에 골수 유래 세포를 대량으로 동원하는 것을 세계에서 최초로 밝혀냈다. 본원은 이러한 발견에 기초하여 이하의 발명을 제공하는 것이다.
[1] 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 함유하는 골수 유래 세포의 유도제;
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
[2] 골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 [1]에 기재된 유도제.
[3] 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 함유하는 조직재생 촉진제;
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
[4] 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 함유하는 조직재생 촉진용 키트;
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
[5] 세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 방법으로 제조되는 세포의 추출액으로서, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 추출액.
[6] 세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 세포의 추출액의 제조방법.
[7] 이하의 공정을 포함하는 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획으로서, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 분획;
(a)세포를 용매에 침지하는 공정,
(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
(c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
[8] 이하의 공정을 포함하는 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 헤파린 결합 분획의 제조방법;
(a)세포를 용매에 침지하는 공정,
(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
(c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
[9] [5]에 기재된 추출액 또는 [6]에 기재된 방법에 의해 제조된 추출액 또는 [7]에 기재된 분획 또는 [8]에 기재된 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 골수 유래 세포의 유도제.
[10] 골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 [9]에 기재된 유도제.
[11] [5]에 기재된 추출액 또는 [6]에 기재된 방법에 의해 제조된 추출액 또는 [7]에 기재된 분획 또는 [8]에 기재된 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 조직재생 촉진제.
[12] [5]에 기재된 추출액 또는 [6]에 기재된 방법에 의해 제조된 추출액 또는 [7]에 기재된 분획 또는 [8]에 기재된 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 조직재생 촉진용 키트.
[13] 이하의 공정을 포함하는, 세포의 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는지의 여부를 평가하는 방법으로서, 공정(b)에서의 피험세포의 유도활성이 대조군과 비교하여 높은 경우에 세포의 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함된다고 판정되는 방법;
(a)세포의 추출액을 제조하는 공정 및
(b)공정(a)에서 제조된 추출액에 의한 피험세포의 유도활성을 측정하는 공정.
[14] 하기 공정을 포함하는, 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는 세포의 추출액을 스크리닝하는 방법;
(a)복수의 추출액에 대해, [13]에 기재된 방법으로 당해 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는지의 여부를 평가하는 공정 및
(b)공정(a)에서 피험세포를 유도하는 인자가 포함된다고 평가된 추출액을 선택하는 공정.
[15] [13] 또는 [14]에 기재된 방법에 의해, 피험세포를 유도하는 인자를 포함한다고 판정된 추출액으로부터, 피험세포의 유도활성을 지표로 피험세포를 유도하는 인자를 정제하는 공정을 포함하는 피험세포를 유도하는 인자의 동정방법.
[16] 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 조직이 손상한 대상에 투여하는 공정을 포함하는 당해 손상한 조직에 골수 유래 세포를 유도하는 방법;
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
[17] 골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 [16]에 기재된 방법.
[18] 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 조직이 손상한 대상에 투여하는 공정을 포함하는 당해 손상한 조직의 재생을 촉진하는 방법;
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코 하는 DNA가 삽입된 벡터.
[19] [5]에 기재된 추출액 또는 [6]에 기재된 방법에 의해 제조된 추출액을 조직이 손상된 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 당해 손상된 조직에 골수 유래 세포를 유도하는 방법.
[20] [7]에 기재된 분획 또는 [8]에 기재된 방법에 의해 제조된 분획을 조직이 손상된 대상에 투여하는 공정을 포함하는 당해 손상된 조직에 골수 유래 세포를 유도하는 방법.
[21] 골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 [19] 또는 [20]에 기재된 방법.
[22] [5]에 기재된 추출액 또는 [6]에 기재된 방법에 의해 제조된 추출액을 조직이 손상된 대상에 투여하는 공정을 포함하는 당해 손상된 조직의 재생을 촉진하는 방법.
[23] [7]에 기재된 분획 또는 [8]에 기재된 방법에 의해 제조된 분획을 조직이 손상된 대상에 투여하는 공정을 포함하는 당해 손상된 조직의 재생을 촉진하는 방법.
[24] 골수 유래 세포의 유도제의 제조에 있어서의 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분의 용도;
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
[25] 골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 [24]에 기재된 용도.
[26] 조직재생 촉진제의 제조에 있어서의 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분의 용도;
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
[27] 골수 유래 세포의 유도제의 제조에 있어서의 [5]에 기재된 추출액 또는 [6]에 기재된 방법에 의해 제조된 추출액의 용도.
[28] 골수 유래 세포의 유도제의 제조에 있어서의 [7]에 기재된 분획 또는 [8]에 기재된 방법에 의해 제조된 분획의 용도.
*[29] 골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 [27] 또는 [28]에 기재된 용도.
*[30] 조직재생 촉진제의 제조에 있어서의 [5]에 기재된 추출액 또는 [6]에 기재된 방법에 의해 제조된 추출액의 용도.
[31] 조직재생 촉진제의 제조에 있어서의 [7]에 기재된 분획 또는 [8]에 기재된 방법에 의해 제조된 분획의 용도.
도 1은 GFP골수이식 마우스 제작법을 나타내는 도면이다.
도 2는 GFP골수이식 마우스 배부(背部)로의 피부이식 후에 관찰한 이식피부 조각에 대한 GFP형광집적을 나타내는 사진이다. 상단 좌측의 사진은 피부 이식부의 육안상을, 상단 중앙의 사진은 이식피부와 수여자 피부의 경계부(「↓」로 나타낸 부분) 근방에서 수혜자 피부의 HE 조직상을, 상단 우측의 사진은 이식피부의 HE 조직상을 나타낸다. 또한, 하단 좌측의 사진은 이식피부로의 GFP 형광의 집적을, 하단 중앙의 사진은 이식피부의 확대상을, 하단 우측의 사진은 동일한 확대부 피부로의 GFP형광의 집적을 나타낸다.
도 3은 GFP 골수이식 마우스 배부로의 이식피부 조각에 집적한 골수 유래 표피세포, 골수 유래 진피 섬유아세포를 나타내는 사진이다. 좌측에서 첫째 줄은 DAPI염색(핵염색)으로, 상단의 사진은 식피부(植皮部) 피부의 저배율상(100배)을, 중간의 사진은 그 고배율상(200배)으로 표피·진피 경계부를, 하단은 고배율상(200배)으로 모낭부를 나타낸다. 좌측에서 둘째 줄은 첫째 줄의 각각의 영역의 GFP형광상, 좌측에서 셋째 줄은 그 케라틴 5(K5)의 면역 염색상을, 좌측에서 넷째 줄은 각각의 형광을 겹쳐 맞춘 상(Merge)을 나타낸다. GFP양성 표피세포 및 진피 섬유아세포가 다수 관찰되고 있다.
도 4는 피부 추출액 내의 골수 유래 중간엽 줄기세포 유도인자 동정의 순서를 나타내는 도면이다.
도 5는 절제 피부조각으로부터의 재생 유도인자(골수 유래 중간엽 줄기세포 동원인자) 추출법을 나타내는 도면이다.
도 6은 보이덴·챔버(Boyden chamber)를 이용한 피부 추출액의 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주능 활성 측정결과를 나타내는 사진이다. 상단 좌측의 사진은 보이덴·챔버의 상조 내로부터 실리콘막 상의 미세구멍을 통과하여 피부 추출액측(하조측)으로 유주하고, 실리콘막 하조측에 부착되어 있는 골수 중간엽 줄기세포를 청색 색소로 염색한 상으로 위에서부터 배양 개시 직후(0h), 12시간 후(12h), 24시간 후(24h)의 염색상(각 4웰씩)을 나타낸다. 상단 우측의 사진은 0h의 고배율상, 하단 좌측의 사진은 12h의 고배율상, 하단 우측의 사진은 24h의 고배율상을 나타낸다.
도 7은 피부 추출액 정제 분획 표품군(preparation group)에 있어서의 보이덴 챔버를 이용한 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주능 활성 측정결과와, 각각의 정제분획 표품의 SDS-PAGE 전기영동의 결과의 대응을 나타내는 사진이다. 좌측에서 제1 레인(M.W.)은 분자량 마커를 영동, 제2 레인(C.E.)은 정제전 피부 추출액을 영동, 제3 레인(H.A.)은 헤파린 친화성 칼럼 결합분획(중간 정제분획)을 영동, 제4~13 레인(A.E.)은 여러가지의 NaCl농도로 용출한 음이온 교환 칼럼 결합분화(최종 정제분획)를 영동한 후의 은염색상을 나타낸다. 또, 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주활성이 가장 강한 최종 정제분화 번호 4의 영동 겔 은염색상(레인 7)에서의 각 염색 밴드를 추출하여 질량분석 및 데이터베이스 해석을 수행한 결과, 「←」로 나타낸 밴드가 HMGB1이라는 것이 명백해졌다.
도 8은 보이덴 챔버를 이용한 HMGB1의 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주활성(migrating activity) 측정결과를 나타내는 사진이다. 상단의 2개는 피부 추출액 중으로 유주시킨 골수 유래 중간엽 줄기세포의 염색상을, 중간의 2개는 HMGB1 정제표품으로 유주시킨 골수 유래 중간엽 줄기세포의 염색상을, 하단은 중간에 이용한 HMGB1 정제표품에 항HMGB1 폴리클로날 항체를 더하여 중화한 용액으로 유주시킨 골수 유래 중간엽 줄기세포의 염색상(거의 유주활성은 소실)을 나타낸다.
도 9는 생체 내 골수 유래 중간엽 줄기세포 유도활성 측정법을 나타내는 도면이다.
도 10은 HMGB1에 의한 생체 내 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원 활성을 나타내는 사진이다. HMGB1 분획(최종 정제분화 번호 4)는 대상 대조군(최종 정제분화 번호 1)의 약 3배의 동원활성을 나타내었다.
도 11은 HMGB1 분획(최종 정제분화 번호 4)에 의해 생체 내에서 동원된 세포의 고배율의 사진이다.
도 12는 실리콘 튜브 내 유주세포의 배양 개시 직후의 사진이다. 좌측의 사진은 배지 내에 파종한 유주세포의 명시야상을, 우측의 사진은 그 암시야에서의 GFP형광상을 나타낸다.
도 13은 실리콘 튜브 내 유주세포의 배양 개시 24시간 후의 사진이다. 좌측의 사진은 배양 플라스틱 샬레에 부착하여 증식하고 있는 섬유아세포양 세포 및 상피세포양 세포의 명시야상을, 우측의 사진은 그 암시야에서의 GFP형광상을 나타낸다.
도 14는 실리콘 튜브 내 유주세포의 배양 개시 2주일 후의 사진이다. 좌우의 사진은 동일한 시야에서 좌측의 사진은 명시야, 우측의 사진은 형광 필터(B 및 D는 GFP의 형광을 검출함, F는 케라틴 5의 형광을 검출함)을 통과한 사진이다. 배양 플라스틱 샬레에 원형으로 콜로니를 형성하는 골수 유래 GFP 양성세포집단의 좌측에 선형상의 모발형상의 형태가 관찰되었다 <△(화살표)로 표시>. F는 골수 유래 세포가 모발형상의 형태변화를 나타내고, 또 케라틴 5을 발현하고 있는 것을 나타내고 있다(△(화살표)로 표시).
도 15는 신생 마우스 피부 추출액 중의 HMGB 패밀리를 웨스턴 블랏법을 이용하여 검출한 사진이다.
도 16은 포유류세포에서의 HMGB 패밀리의 발현 벡터의 지도(MAP)를 나타내는 도면이다. 사이토메갈로바이러스 증진제와 치킨 β-액틴 프로모터를 가지고, 프로모터 하류에 존재하는 HMGB 패밀리의 cDNA(complementary DNA: 상보DNA)가 코드하는 mRNA를 대량으로 합성한다.
도 17은 HEK293 세포에 발현시킨 정제 재조합 Flag tag-HMGB패밀리 융합 단백질의 웨스턴 블랏의 결과를 나타내는 사진이다.
도 18은 보이덴 챔버를 이용한 재조합 HMGB1·HMGB2·HMGB3의 골수 중간엽 줄기세포 유주활성을 나타내는 도면이다. 모든 재조합 단백질이 대조군에 비해 유주활성을 나타내었다.
도 19는 마우스의 피부궤양 치료 모델에서의 HMGB 패밀리에 의한 치료 결과를 나타내는 도면이다. HMGB1·HMGB2·HMGB3 모두 콘트롤군에 비해 유의적으로 궤양면적의 축소효과를 나타내었다.
도 20은 인간 HMGB1 및 인간 피부 추출액이 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성을 보이덴·챔버를 이용하여 확인한 사진이다.
도 21은 마우스 심장, 마우스 뇌 및 마우스 피부 추출액 중의 골수 중간엽 줄기세포 유도활성물질을 헤파린 칼럼으로 정제하고, 보이덴·챔버를 이용하여 활성을 확인한 사진이다.
도 22는 배양 세포주 HEK293 및 HeLa추출액의 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주활성을 보이덴 챔버법을 이용하여 확인한 사진이다. 모든 배양 세포주가 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주활성을 나타내었다.
도 23a는 마우스를 뇌정위 고정장치(brain stereotaxic apparatus)에 고정하고, 메스로 머리부의 정중앙을 절개하고 드릴을 이용하여 천두(穿頭)를 실시한 사진이다. 도 23b는 뇌에 주사기를 이용하여 음압을 가하고 뇌조직을 일부 흡인한 사진이다. 도 23c는 피브린 접착제(피브리노겐)에 용해한 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 5μl 주입하고, 다음에 피브린 접착제(트롬빈)를 5μl 주입한 후의 사진이다. 도 23d 및 도 23e는 뇌손상 모델 치료 후 2주일 후의 사진이다. 대조군의 23d에 비해 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의한 치료군 23e에서 GFP 양성세포의 집적이 인정되었다. 도 23f 및 도 23g는 뇌손상 모델 치료 후 6주일 후의 사진이다. 대조군의 23f에 비해 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의한 치료군의 23g에서 GFP 양성세포의 집적이 인정되었다.
발명의 실시의 형태
본 발명은, 이하의 (a)부터 (i)에 기재된 성분 중에서 적어도 하나의 성분을 함유하는 골수 유래 세포의 유도제를 제공한다.
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
당해 유도제를 사용함으로써, 국소(상기 성분의 투여·첨가부위나 그 근방)에 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)를 유도하여 조직의 기능적 재생을 촉진하는 것이 가능하게 되기 때문에, 당해 유도제는 재생 의료, 재생 유도 의료 개발을 위한 기초연구 및 임상연구에 필요한 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 실험동물에 있어서 필요한 생체조직에 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)를 동원하여 조직 수복, 조직기능 재건의 정도를 검토하는 것이 가능하게 된다. 또한, 시험관 내에서 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)의 동원에 의한 조직재생 유도 연구를 할 수 있다.
또한, 상기 유도제를 사용함으로써 손상 조직의 재생을 촉진할 수 있다. 또한, 상기 유도제에는 기능적 조직재생 유도·촉진제로서의 용도뿐만 아니라, 조직 줄기세포의 감소에 의한 조직·장기기능의 저하를 예방하는, 이른바 예방의약으로서의 용도 혹은 노화 관련 변화의 진행을 지연시키는 항노화 의약으로서의 용도를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 (a)부터 (i)에 기재된 성분 중에서 적어도 하나의 성분을 함유하는 조직재생 촉진제 또는 조직재생 촉진용 키트를 제공한다.
(a)HMGB1단백질
(b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
(c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(d)HMGB2단백질
(e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
(f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
(g)HMGB3단백질
(h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
(i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
당해 조직재생 촉진제 또는 조직재생 촉진용 키트는, 손상 조직부위 또는 그 근방에 투여됨으로써 혈액 중에 순환하는 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)를 말초혈 중에서 당해 손상 조직으로 유도(국소 유도)하는 것을 특징으로 한다.
또한, 조직재생 촉진용 키트로는, (1)피브리노겐에 용해한 상기 추출액 또는 상기 분획 등, (2)트롬빈을 포함하는 조직재생 촉진용 키트 또는 (1)상기 추출액 또는 상기 분획 등, (2)피브리노겐 및 (3)트롬빈을 포함하는 조직재생 촉진용 키트를 예시할 수 있다. 본 발명에서는, 시판 피브리노겐이나 트롬빈을 사용할 수 있다. 예를 들어, 피브리노겐 HT-Wf(Benesis-Mitsubishi Pharma), 베리플라스트(ZLB Behring), 티씰(Baxter), 볼힐(Kaketsuken), 타코콤(ZLB Behring)을 들 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은, 세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 세포의 추출액의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 당해 제조방법으로 제조되는 세포의 추출액으로서, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 추출액에 관한 것이다.
용매에 침지되는 세포로는, 특별히 제한되는 것은 아니지만, 조직 유래 세포, 조직 유래 세포에서 확립된 세포주(예를 들어, Hela, HEK293을 예시할 수 있으나, 이에 한정되지 않음), 단리된 세포, 단리되지 않은 세포(예를 들어, 단리된 조직 중에 존재하는 세포), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 도입된 세포 등을 예시할 수 있다. 상기 조직으로서는 어떠한 조직이어도 되고, 예를 들어 생체 피부 조직, 체내 생검(수술) 조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 정소나 혈액 등)을 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 용매로서는 생리 식염수, PBS(Phosphate-buffered saline), TBS(Tris-buffered saline)를 예시할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 시간으로서는, 세포 괴사를 유도하기 위해 필요·충분한 시간, 즉 1시간 내지 48시간(예를 들어, 6시간 내지 48시간), 바람직하게는 12시간 내지 24시간인데, 이 시간에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 「세포를 용매에 침지하는 공정」은 「괴사를 유도하기 위해 필요·충분한 시간, 세포를 용매에 침지하는 공정」이나 「세포를 괴사시키는 공정」으로 바꾸어 말할 수 있다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 온도로서 4℃ 내지 25℃(예를 들어, 4℃ 내지 8℃), 바람직하게는 4℃를 예시할 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 pH로는 pH 7 내지 8, 바람직하게는 pH 7.5를 예시할 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 완충액의 성분으로서 10 mM 내지 50 mM, 바람직하게는 10 내지 20 mM의 농도의 인산 완충액을 들 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서는, 세포나 조직을 용매에 담근 후에 세포나 조직을 포함하는 용매에서 당해 세포나 당해 조직을 제거할 수도 있다. 용매에서 세포나 조직을 제거하는 방법은 당업자에게 주지된 방법이면, 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 4℃ 내지 25℃(예를 들어, 4℃), 또한 중력 가속도 10G ~ 4000G(예를 들어, 440G)에서 원심분리하고 상청액을 분리함으로써 용매로부터 세포나 조직을 제거할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 그 상청액을 세포나 조직의 추출액으로서 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은, 하기 공정을 포함하는 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 헤파린 결합 분획의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 당해 제조방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획으로서, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 분획에 관한 것이다.
(a)세포나 조직을 용매에 침지하는 공정,
(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
(c)고정화 헤파린에서 헤파린 결합 분획(헤파린 정제 분획, 헤파린 칼럼 정제 분획이라고도 표현할 수 있음)을 용출하는 공정.
고정화 헤파린이란, 헤파린을 불용성 담체에 공유 결합시킨 것이다. 상기 불용성 담체로서는, Sepharose beads(Sepharose 4B, Sepharose 6B 등: GE Healthcare)가 예시되는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는, 시판의 고정화 헤파린(Hitrap Hepalin HP column: GE Healthcare)을 이용해도 된다.
세포나 조직의 추출액과 고정화 헤파린의 접촉조건으로서는, pH7~8정도(바람직하게는 pH7.5), 염농도는 0~200mM, 바람직하게는 100~200mM정도가 예시되지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 추출액과 고정화 헤파린이 접촉하고 있는 시간은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 헤파린 결합 분획을 고정화 헤파린에 충분히 흡착시킨다는 관점에서는 5분 이상 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 온도로서는 4~8℃, 바람직하게는 4℃를 들 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 고정화 헤파린에 흡착한 헤파린 결합 분획의 용출조건으로서는 pH 7~8정도, 염농도 200~1000 mM(바람직하게는 1000 mM정도)가 예시되는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.
또, 본 발명은, 하기 공정을 포함하는 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 음이온 교환체 결합 분획의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당해 제조방법으로 제조되는 음이온 교환체 결합 분획으로서, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 분획에 관한 것이다:
(a)세포나 조직을 용매에 침지하는 공정,
(b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정,
(c)고정화 헤파린에서 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정,
(d)공정(c)에서 얻어지는 헤파린 결합 분획을 음이온 교환체에 접촉시키는 공정 및
(e)음이온 교환체에서 음이온 교환체 결합 분획을 용출하는 공정.
음이온 교환체로서는 DEAE(diethylaminoethyl)이나 Q(quaternary ammonium)을 이용한 교환체를 예시할 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서는, 시판 음이온 교환체(예를 들어, Source15Q, Source30Q, MonoQ, MiniQ, PC3.2/3, MiniQ4.6/50PE, HiTrap IEX Columns, HiTrap SP HP, Q Sepharose High Performance, Hiload 16/10 Q Sepharose HP, HiPrep 16/10 SP XL, Q Sepharose XL, HiPrer 16/10 Q FF, HiPrep 16/10DEAE FF, Q Sepharose Fast Flow, DEAE Sepharose Fast Flow(모두 GE Healthcare))를 이용해도 된다.
헤파린 결합 분획과 음이온 교환체의 접촉조건으로서는 pH 7~9정도(바람직하게는 pH8), 염농도는 0~100mM, 바람직하게는 50mM정도가 예시되는데, 이들에 제한되는 것은 아니다. 추출액과 음이온 교환체가 접촉하고 있는 시간은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 음이온 교환체 결합 분획을 음이온 교환체에 충분히 흡착시킨다는 관점에서는 5분 이상 유지되는 것이 바람직하다. 또한, 온도로서는 4~16℃, 바람직하게는 4℃를 들 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또, 음이온 교환체에 흡착한 음이온 교환체 결합 분획의 용출조건으로서는 pH7~9정도(바람직하게는, pH8정도), 염농도 100~2000mM(바람직하게는 1000mM정도)가 예시되는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은, 상기 추출액 또는 상기 분획, 또는 상기 방법에 의해 제조된 추출액 또는 상기 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 골수 유래 세포의 유도제에 관한 것이다.
당해 유도제를 사용함으로써, 국소(상기 성분의 투여·첨가부위나 그 근방)에 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)를 유도하여 조직의 기능적 재생을 촉진하는 것이 가능하게 되기 때문에, 당해 유도제는 재생 의료, 재생 유도 의료 개발을 위한 기초연구 및 임상연구에 필요한 시약으로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 실험동물에서의 필요한 생체조직에 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)를 동원하여 조직 수복 , 조직기능 재건의 정도를 검토하는 것이 가능하게 된다. 또한, 시험관 내에서 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)의 동원에 의한 조직재생 유도연구를 할 수 있다.
또한, 상기 유도제를 사용함으로써 손상 조직의 재생을 촉진할 수 있다. 또한, 상기 유도제에는 기능적 조직재생 유도·촉진제로서의 용도뿐만 아니라, 조직줄기세포의 감소에 의한 조직·장기기능의 저하를 예방하는, 이른바 예방의약으로서의 용도 혹은 노화 변화의 진행을 지연시키는 항노화 의약으로서의 용도를 기대할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 추출액 또는 상기 분획, 또는 상기 방법에 의해 제조된 추출액 또는 상기 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 조직재생 촉진제 또는 조직재생 촉진용 키트에 관한 것이다. 재생되는 조직으로서는 특별히 제한은 없으며, 손상되어 있는 조직인 한 어떠한 조직이어도 되고, 예를 들어 생체 피부 조직, 체내 생검(수술) 조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 정소나 혈액 등)을 예시할 수 있다.
당해 조직재생 촉진제 또는 조직재생 촉진용 키트는, 손상 조직부위 또는 그 근방에 투여됨으로써 혈액 중에 순환하고 있는 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)를 말초혈 중에서 당해 손상 조직으로 유도(국소 유도)하는 것을 특징으로 한다.
또한, 조직재생 촉진용 키트로서는, (1)피브리노겐에 용해한 상기 추출액 또는 상기 분획 등 및 (2)트롬빈을 포함하는 조직재생 촉진용 키트, 또는 (1)상기 추출액 또는 상기 분획 등, (2)피브리노겐 및 (3)트롬빈을 포함하는 조직재생 촉진용 키트를 예시할 수 있다. 본 발명에서는, 시판의 피브리노겐이나 트롬빈을 사용할 수 있다.
손상 조직에 동원된 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)는 여러가지의 세포로 분화하여 손상 조직의 기능적 재생 및 기능유지, 기능강화에 기여한다. 본 발명에 있어서, 손상 조직으로서는 허혈, 관류저하·저산소상태를 초래하는 여러가지의 병태, 외상, 화상, 염증, 자기면역, 유전자 이상 등에 의해 손상된 조직을 들 수 있는데, 이들 원인에 한정되는 것은 아니다. 또한, 손상 조직에는 괴사 조직도 포함된다.
본 발명에서의 조직으로서는, 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)가 분화 가능한 조직인 한 특별히 제한은 없지만, 예를 들어 피부조직, 골조직, 연골조직, 근조직, 지방조직, 심근조직, 신경계조직, 폐조직, 소화관조직, 간·담·췌조직, 비뇨·생식기 등 생체 내의 모든 조직을 예시할 수 있다. 또한, 상기 조직재생 촉진제를 이용함으로써, 난치성 피부궤양, 피부창상, 수포증, 탈모증 등의 피부질환은 물론이고, 뇌경색, 심근경색, 골절, 폐경색, 위궤양, 장염 등의 조직손상에 있어서 기능적 조직재생을 유도하는 치료가 가능하게 된다. 상기 조직재생 촉진제가 투여되는 동물종류로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있고, 예를 들어 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 모르모트 등을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 골수 유래 세포는 조혈계 줄기세포 및 이에 유래하는 백혈구, 적혈구, 혈소판 이외의 세포로서, 지금까지 골수 중간엽 줄기세포라고 불리는 세포로 대표되는 줄기세포 또는 골수 중에 존재하는 조직 전구세포집단을 포함한다. 본 발명의 골수 유래 세포로서는 골수 채혈 혹은 말초혈 채혈에 의해 단리할 수 있는 세포이다. 조혈계 줄기세포는 비부착 세포이고, 본 발명의 골수 유래 세포는 골수 채혈, 말초혈 채혈에 의해 얻어진 혈액 중의 단핵구 분화 세포 배양에 의해 부착세포로서 얻어진다. 또한, 본 발명의 골수 유래 세포는 중간엽 줄기세포를 포함하고, 골아세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 인정함으로써 특정 가능), 연골세포(알시안 블루 염색 양성, 사프라닌-O 염색 양성 등으로 특정 가능), 지방세포(수단III 염색 양성으로 특정 가능), 또한 섬유아세포, 평활근세포, 간질 세포, 힘줄세포 등의 중간엽 세포, 또한 신경세포, 상피세포(예를 들어, 표피 각질세포, 장관 상피세포는 사이토케라틴 패밀리를 발현함), 혈관 내피세포로의 분화능력을 가지는 것이 바람직하지만, 분화 후의 세포는 상기 세포에 한정되는 것은 아니고, 간장, 신장, 췌장 등의 실질 장기세포로의 분화능도 포함한다.
본 발명에 있어서, 골수 유래 중간엽 줄기세포란 골수 내에 존재하는 세포로서, 골수에서 직접 혹은 그 밖의 조직(혈액이나 피부, 지방 등의 중간엽 조직)에서 간접적으로 채취되고, (플라스틱 혹은 유리제) 배양용기에의 부착세포로서 배양·증식 가능하며, 뼈, 연골, 지방 등의 중간엽 조직으로의 분화능을 가진다는 특징을 갖는 세포이고, 골수혈 채혈, 말초혈 채혈, 또 중간엽 조직으로부터의 채취에 의해 취득할 수 있다. 또한, 골수 유래 중간엽 줄기세포는 한 번 배양그릇에 부착시킨 세포를 생체의 손상부에 투여함으로써, 예를 들어 피부를 구성하는 케라티노사이트 등의 상피계 조직으로의 분화능도 가진다는 특징도 갖는다.
본 발명의 골수 유래 중간엽 줄기세포는 다능성 줄기세포로서, 골아세포(분화를 유도하면 칼슘의 침착을 인정함으로써 특정 가능), 연골세포(알시안 블루 염색 양성, 사프라닌-0 염색 양성 등으로 특정 가능), 지방세포(수단 Ⅲ 염색 양성 등으로 특정 가능) 이외에, 예를 들어 섬유아세포, 평활근세포, 골격근세포, 스트로마 세포, 힘줄세포 등의 중간엽 세포, 신경세포, 색소세포, 표피세포, 모낭세포(사이토케라틴 패밀리, 헤어케라틴 패밀리 등을 발현함), 상피계 세포(예를 들어, 표피 각화세포, 장관 상피세포는 사이토케라틴 패밀리 등을 발현함), 내피세포, 또 간장, 신장, 췌장 등의 실질 장기세포로 분화하는 능력을 가지는 것이 바람직하지만, 분화 후의 세포는 상기 세포에 한정되는 것은 아니다.
또한, 인간 골수 중간엽 줄기세포는 골수 채혈, 말초혈 채혈, 지방 채취, 직접 혹은 단핵구 분획을 분리 후에 배양하여 부착세포로서 취득할 수 있는 세포를 예시할 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 인간 골수 중간엽 줄기세포의 마커로서는 Lin음성, CD45음성, CD44양성의 전부 또는 일부를 예시할 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.
또한, 마우스 골수 중간엽 줄기세포는, 예를 들어 실시예에 기재된 방법에 의해 취득할 수 있는 세포를 예시할 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 마우스 골수 중간엽 줄기세포의 마커로서는 Lin음성, CD45음성, CD44양성, Sca-1양성, c-kit음성의 전부 또는 일부를 예시할 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.
조직 전구세포는 혈액계 이외의 특정 조직세포로의 일방향성 분화능을 갖는 미분화세포라고 정의되고, 상술한 중간엽 조직, 상피계 조직, 신경조직, 실질 장기, 혈관내피로의 분화능을 갖는 미분화세포를 포함한다.
본 발명의 유도제 및 본 발명의 조직재생 촉진제에 있어서, 상기 추출액, 상기 헤파린 결합 분획, 상기 음이온 교환체 결합 분획 또는 상기 (a)부터 (i)에 기재된 성분 중에서 적어도 하나의 성분 이외의 성분으로서는, 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)의 유도나 조직재생 촉진을 저해하지 않는 한 특별히 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 본 발명의 조직재생 촉진제에는 상기 추출액, 상기 헤파린 결합 분획, 상기 음이온 교환체 결합 분획 또는 상기 (a) 내지 (i)에 기재된 성분 중에서 적어도 하나의 성분과 함께, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3의 기능적 조직재생 유도기능을 강화하는 관련분자(군), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3의 기대되는 효과 이외의 작용을 억제하는 분자(군), 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)의 증식이나 분화를 제어하는 인자, 이들 인자 혹은 세포의 기능을 강화·유지하는 그 이외의 인자를 포함하는 것이 가능하다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제에서의 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질의 기원이 되는 동물종류로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있고, 예를 들어 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 돼지,개, 토끼, 햄스터, 모르모트 등을 예시할 수 있는데, 상기 추출액 등이 투여되는 동물종류와 같은 동물종류인 것이 바람직하다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제에서의 HMGB1단백질로서는 서열번호:1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 HMGB1단백질에는 서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 이러한 단백질로서는, 예를 들어 1)서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실(缺失), 삽입 및/또는 부가한 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호: 2, 4 또는 6에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 1, 3 또는 5에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제에서의 HMGB2단백질로서는 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 HMGB2단백질에는 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 이러한 단백질로서는, 예를 들어 1)서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호: 8, 10 또는 12에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 7, 9 또는 11에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제에서의 HMGB3단백질로서는 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 HMGB3단백질에는 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질도 포함된다. 이러한 단백질로서는, 예를 들어 1)서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질 및 2)서열번호: 14 또는 16에 기재된 염기서열을 포함하는 DNA와 엄격한 조건 하에서 혼성화하는 DNA에 의해 코드되는 단백질로서, 서열번호: 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질을 들 수 있다.
서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단리된 단백질은, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 호모로그 혹은 파라로그일 수 있다. 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은, 당업자에 의해 주지의 방법(실험 의학 별책·유전자 공학 핸드북, pp 246-251, 요도사, 1991년 발행)으로 단리할 수 있다.
서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질로서는, 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)의 유도활성을 가지는 단백질을 들 수 있다.
서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 아미노산 서열로 이루어지고, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 천연에 존재하는 단백질을 포함한다. 일반적으로 진핵생물의 유전자는 인터페론 유전자 등으로 알려져 있는 바와 같이 다형현상(polymorphism)을 가진다. 이 다형현상에 의해 생긴 염기서열의 변화에 따라 1 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가되는 경우가 있다. 이와 같이 자연에 존재하는 단백질로서, 또한 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열에 있어서 1 또는 복수의 아미노산이 치환, 결실, 삽입 및/또는 부가한 아미노산 서열을 가지고, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은 본 발명의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질에 포함된다.
또한, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 기능적으로 동등한 단백질인 한 인위적으로 제작된 변이 단백질도 본 발명에 포함된다. 주어진 염기 서열에 대해 무작위로 변이를 가하는 방법으로서는, 예를 들어 DNA의 아질산처리에 의한 염기쌍의 치환이 알려져 있다(Hirose, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 79:7258-7260, 1982). 이 방법으로는, 변이를 도입하고자 하는 세그먼트를 아질산처리함으로써 특정의 세그먼트 내에 무작위로 염기쌍의 치환을 도입할 수 있다. 혹은, 또한 목적으로 하는 변이를 임의의 장소로 가져오는 기술로서는 gapped duplex법 등이 있다(Kramer W. and Fritz HJ., Methods in Enzymol., 154:350-367, 1987). 변이를 도입해야 할 유전자를 클로닝한 환상 이중쇄의 벡터를 단일쇄로 분리하고, 목적으로 하는 부위에 변이를 가진 합성 올리고뉴클레오티드를 혼성화시킨다. 제한효소에 의해 절단하여 선형화된 벡터 유래의 상보적 단일쇄 DNA를 상기 환상 단일쇄 벡터에 어닐링하고, 상기 합성 뉴클레오티드와의 사이의 간격을 DNA 폴리머라아제를 이용하여 채우며 라이게이션함으로써 완전한 이중쇄 환상 벡터로 한다.
변형되는 아미노산의 수는 전형적으로는 50 개 이내의 아미노산이고, 바람직하게는 30 개 이내의 아미노산이며, 더 바람직하게는 5 개 이내의 아미노산(예를 들어, 1 개의 아미노산)이라고 여겨진다.
아미노산을 인위적으로 치환하는 경우, 성질이 비슷한 아미노산으로 치환하면 원래의 단백질의 활성이 유지되기 쉽다고 여겨진다. 본 발명의 단백질에는 상기 아미노산 치환에 있어서 보존적 치환이 가해진 단백질로서, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질이 포함된다. 보존적 치환은, 단백질의 활성에 중요한 도메인의 아미노산을 치환하는 경우 등에 있어 중요하다고 생각된다. 이러한 아미노산의 보존적 치환은 당업자에게는 잘 알려져 있다.
보존적 치환에 상당하는 아미노산의 그룹으로서는, 예를 들어 염기성 아미노산(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 아미노산(예를 들어, 아스파라긴산, 글루타민산), 비하전극성 아미노산(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 아미노산(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β분기 아미노산(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 아미노산(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)을 들 수 있다.
또한, 비보존적 치환에 의해 단백질의 활성 등을 보다 상승(예를 들어, 항상적 활성화형 단백질 등을 포함함)시키는 것도 고려된다.
그 밖에, 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질을 얻는 방법으로서 혼성화를 이용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 서열번호: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 또는 16에 나타내는 바와 같은 본 발명에 의한 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA 혹은 그 단편을 프로브로 하고, 이것과 혼성화할 수 있는 DNA를 단리한다. 혼성화를 엄격한 조건 하에서 실시하면, 염기서열로서는 상동성이 높은 DNA가 선택되고, 그 결과로서 단리되는 단백질에는 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질과 기능적으로 동등한 단백질이 포함될 가능성이 높아진다. 상동성이 높은 염기서열이란, 예를 들어 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상의 동일성을 나타낼 수 있다.
또, 엄격한 조건이란, 구체적으로는 예를 들어 6×SSC, 40% 포름아미드, 25℃에서의 혼성화와 1×SSC, 55℃에서의 세정이라는 조건을 나타낼 수 있다. 엄격함은 염농도, 포름아미드의 농도 혹은 온도의 조건으로 좌우되는데, 당업자라면 이들의 조건을 필요한 엄격함이 얻어지도록 설정하는 것은 자명하다.
혼성화를 이용함으로써, 예를 들어 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질 이외의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질의 호몰로그를 코드하는 DNA의 단리가 가능하다.
서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 기능적으로 동등한 단백질은, 통상적으로 서열번호: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 또는 15에 기재된 아미노산 서열과 높은 상동성을 가진다. 높은 상동성이란, 적어도 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상(예를 들어, 95% 이상)의 서열의 동일성을 가리킨다. 염기서열이나 아미노산 서열의 동일성은 인터넷을 이용한 상동성 검색 사이트를 이용하여 행할 수 있다[예를 들어, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)에 있어서, FASTA, BLAST, PSI-BLAST 및 SSEARCH 등의 상동성 검색을 이용할 수 있다[예를 들어, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)의 웹사이트의 상동성 검색(Search and Analysis)의 페이지; http//www.ddbj.nig.ac.jp/E-mail/homology-j.html]. 또한, National Center for Biotechnology Information(NCBI)에 있어서 BLAST를 이용한 검색을 할 수 있다(예를 들어, NCBI의 홈페이지의 웹사이트의 BLAST의 페이지;http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/;Altschul, S.F. et al., J. Mol. Biol., 1990, 215(3):403-10; Altschul, S.F. & Gish, W., Meth. Enzymol., 1996, 266:460-480; Altschul, S.F. et al., Nucleic Acids Res., 1997, 25:3389-3402)].
예를 들어, Advanced BLAST 2.1에서의 아미노산 서열의 동일성의 산출은 프로그램으로 blastp를 이용하고, Expect값을 10, Filter는 전부 OFF로 하여, Matrix로 BLOSUM62를 이용하고, Gap existence cost, Per residue gap cost 및 Lambda ratio를 각각 11, 1, 0.85(디폴트값)로 설정하여 검색을 하여 동일성(identity)의 값(%)을 얻을 수 있다(Karlin, S. and S.F. Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin, S. and S.F. Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7).
본 발명에 의한 단백질 또는 그 기능적으로 동등한 단백질은, 당쇄 등의 생리적인 수식, 형광이나 방사성 물질과 같은 표식 혹은 다른 단백질과의 융합이라는 각종 수식을 가한 단백질일 수 있다. 특히 이후에 기재하는 유전자 재조합체에 있어서는, 발현시키는 숙주에 따라 당쇄에 의한 수식에 차이가 생길 가능성이 있다. 그러나, 비록 당쇄의 수식에 차이가 있어도, 본 명세서 중에 개시된 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질과 같은 성상을 나타내는 것이면 모두 본 발명에 의한 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질 또는 기능적으로 동등한 단백질이다.
HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질은 생체재료뿐만 아니라, 이를 코드하는 유전자를 적절한 발현 시스템에 도입함으로써 유전자 재조합체(recombinant)로서 얻을 수도 있다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 유전자 공학적인 기술에 의해 얻기 위해서는, 앞에서 말한 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA를 적절한 발현계에 도입하여 발현시키면 된다. 본 발명에 응용 가능한 호스트/벡터계로서는, 예를 들어 발현 벡터 pGEX와 대장균을 나타낼 수 있다. pGEX는 외래 유전자를 글루타티온 S-전이효소(GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있으므로(Gene, 67:31-40, 1988), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 유전자를 도입한 pGEX를 열 쇼크로 BL21과 같은 대장균주에 도입하여 적절한 배양시간 후에 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드(IPTG)를 첨가하여 GST융합 HMGB1, GST융합 HMGB2 또는 GST융합 HMGB3단백질의 발현을 유도한다. 본 발명에 의한 GST는 글루타티온 세파로즈 4B에 흡착하기 때문에, 발현 생성물은 친화성 크로마토그래피에 의해 용이하게 분리·정제하는 것이 가능하다.
HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 재조합체를 얻기 위한 호스트/벡터계로서는 그 밖에도 다음과 같은 것을 응용할 수 있다. 우선, 세균을 호스트로 이용하는 경우에는, 히스티딘 태그, HA태그, FLAG 태그 등을 이용한 융합 단백질의 발현용 벡터가 시판되고 있다. 효모에서는, Pichia속 효모가 당쇄를 구비한 단백질의 발현에 유효한 것이 알려져 있다. 당쇄의 부가라는 점에서는, 곤충세포를 호스트로 하는 바큘로바이러스 벡터를 이용한 발현계도 유용하다(Bio/Technology, 6:47-55, 1988). 또, 포유동물의 세포를 이용하여 CMV, RSV 혹은 SV40 등의 프로모터를 이용한 벡터의 트랜스펙션이 행해져 있고, 이들의 호스트/벡터계는 모두 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질의 발현계로서 이용할 수 있다. 또한, 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노수반 바이러스 벡터 등의 바이러스 벡터를 이용하여 유전자를 도입할 수도 있다.
얻어진 본 발명의 단백질은, 숙주세포 안 또는 세포 밖(배지 등)으로부터 단리하여 실질적으로 순수하고 균일한 단백질로서 정제할 수 있다. 단백질의 분리, 정제는 통상의 단백질의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 무엇이로든지 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다.
크로마토그래피로서는, 예를 들어 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다(Marshak et al., Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996). 이들의 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들어 HPLC, FPLC 등의 액상 크로마토그래피를 이용하여 행할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질은 실질적으로 정제된 단백질인 것이 바람직하다. 여기서 「실질적으로 정제된」이란, 본 발명의 단백질의 정제도(단백질 성분 전체에서의 본 발명의 단백질의 비율)가 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 100% 또는 100%에 가까운 것을 의미한다. 100%에 가까운 상한은 당업자의 정제기술이나 분석기술에 의존하는데, 예를 들어 99.999%, 99.99%, 99.9%, 99% 등이다.
또한, 상기 정제도를 가지는 것이면, 어떠한 정제방법에 의해 정제된 것이어도 실질적으로 정제된 단백질에 포함된다. 예를 들어, 상술한 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택 또는 조합함으로써 실질적으로 정제된 단백질을 예시할 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제에서의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 방출 또는 분비하는 세포로서는, 기본적으로 생체 내의 모든 조직 유래 세포가 해당한다. 채취 및 배양이 용이한 세포로서는 섬유아세포(예를 들어, 정상피부 섬유아세포 및 그것에서 유래하는 세포주)를 예시할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 분비하는 세포는 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 DNA 혹은 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 DNA에 분비 신호를 코드하는 DNA(ATG CAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA TGG GTA CTG CTG CTG TGG GTT CCA GGT TCC ACT GGT GAC; 서열번호: 17)를 결합시킨 DNA를 주지의 발현 벡터나 유전자 치료용 벡터에 삽입함으로써 제작된 벡터를 섬유아세포(예를 들어, 정상피부 섬유아세포 및 그것에 유래하는 세포주) 등의 포유류세포나 곤충세포, 그 이외의 세포에 도입하는 것에 의해서도 제작할 수 있다. 이들 세포가 유래하는 동물종류에 특별히 제한은 없지만, 조직재생이 행해지는 대상동물종의 세포, 대상 자신의 세포 혹은 조직재생이 행해지는 대상의 혈연에 맞는 자에서 유래하는 세포를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제에서의 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA는, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 한 cDNA 또는 게놈 DNA이어도 되고, 또한 천연의 DNA 또는 인공적으로 합성된 DNA이어도 된다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 DNA는, 통상적으로 벡터(예를 들어, 유전자 치료용 벡터)에 삽입된 상태에서 본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제에 함유된다.
본 발명에서의 유전자 치료용 벡터로서는 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 센다이바이러스 엔빌로프 벡터, 파필로마바이러스 벡터 등을 예시할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 당해 유전자 치료용 벡터에는, 유전자 발현을 효과적으로 유도하는 프로모터 DNA 서열이나 유전자 발현을 제어하는 인자, DNA의 안정성을 유지하기 위해 필요한 분자가 포함되어도 된다.
또, 본 발명의 유도제 및 본 발명의 조직재생 촉진제에서는, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 부분 펩티드로서 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포)의 유도활성을 가지는 펩티드, 당해 부분 펩티드를 분비하는 세포 또는 당해 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터를 함유할 수도 있다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제의 투여방법은 경구투여 또는 비경구투여를 들 수 있고, 이러한 투여방법으로서는 구체적으로 주사투여, 경비투여, 경폐투여, 경피투여 등을 들 수 있다. 주사투여의 예로서는, 예를 들어 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사 등에 의해 본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제를 전신 또는 국소적(예를 들어, 피하, 피내, 피부 표면, 안구 혹은 안검결막, 비강점막, 구강 안 및 소화관 점막, 강(腔)·자궁내 점막 또는 손상부위 등)으로 투여할 수 있다.
또한, 환자의 연령, 증상에 의해 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 투여하는 경우, 예를 들어 1 회의 투여에 대해 체중 1 kg당 O.0000001 mg 내지 1000 mg의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. 혹은, 예를 들어 환자당 0.00001 내지 100000 mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수 있다. HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 분비하는 세포나 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 유전자 치료용 벡터를 투여하는 경우도, 손상 조직에 있어서 HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질의 양이 상기 범위 내가 되도록 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제는 이들의 투여량에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 유도제나 조직재생 촉진제는 통상적인 방법에 따라 제제화할 수 있고(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이어도 된다. 예를 들어 계면활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕해제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 들 수 있는데, 이들에 제한되지 않고 그 밖의 상용의 담체를 적절히 사용할 수 있다. 구체적으로는 경질무수규산, 유당, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 카멜로오스 칼슘, 카멜로오스 나트륨, 히드록시프로필 셀룰로오스, 히드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸 셀룰로오스, 옥수수 전분, 무기염류 등을 들 수 있다.
또한, 상술한 세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 분비하는 세포, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질의 부분 펩티드, 당해 부분 펩티드를 분비하는 세포 또는 당해 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터의 용도는 하기 (1) 또는 (2)와 같이 표현할 수도 있다.
(1)세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3단백질, 당해 단백질을 분비하는 세포, 당해 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, 당해 단백질의 부분 펩티드, 당해 부분 펩티드를 분비하는 세포, 또는 당해 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터를 조직이 손상된 대상에 투여하는 공정을 포함하는 당해 손상된 조직 재생을 촉진하는 방법,
(2)세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3단백질, 그 단백질을 분비하는 세포, 당해 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, 당해 단백질의 부분 펩티드, 당해 부분 펩티드를 분비하는 세포 또는 당해 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터를 조직이 손상된 대상에 투여하는 공정을 포함하는 당해 손상된 조직으로 골수세포를 유도하는 방법,
(3)골수 유래 세포의 유도제 또는 조직재생 촉진제의 제조에 있어서, 세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3단백질, 그 단백질을 분비하는 세포, 그 단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터, 그 단백질의 부분 펩티드, 그 부분 펩티드를 분비하는 세포 또는 당해 부분 펩티드를 코드하는 DNA가 삽입된 벡터의 용도.
상기 조직이 손상된 대상으로서는 인간 또는 비인간 동물을 들 수 있고, 예를 들어 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 돼지, 개, 토끼, 햄스터, 모르모트 등을 예시할 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 공정을 포함하는, 세포나 조직의 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는지의 여부를 평가하는 방법으로서, 공정(b)에서의 피험세포의 유도활성이 대조군과 비교하여 높은 경우에 세포나 조직의 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함된다고 판정되는 방법을 제공한다:
(a)세포나 조직의 추출액을 제조하는 공정 및
(b)공정(a)에서 제조된 추출액에 의한 피험세포의 유도활성을 측정하는 공정.
본 발명에서의 피험세포는 손상 조직의 재생에 기여할 가능성이 있는 세포(손상 조직의 재생을 유도하는 것으로 기대되는 세포라고도 표현할 수 있음)인 한 특별히 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서의 피험세포로서는 미분화 세포, 여러가지의 분화단계에 있는 세포를 들 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서의 피험세포로서는 줄기세포, 비줄기세포 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서의 피험세포로서는 순환성의 세포, 비순환성의 세포를 예시할 수 있다. 상기 비순환성의 세포로서는 조직 정주성(定住性)의 세포를 예시할 수 있는데, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서의 피험세포로서는 순환성의 혈액세포, 순환성의 비혈액세포를 예시할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 피험세포로서는 손상된 조직을 재생하기 위해 필요해질 가능성이 있는 세포를 예시할 수 있다.
또한, 본 발명에서의 피험세포로는 골수 유래 세포, 골수 유래 조혈계 세포, 골수 유래 중간엽 세포, 손상 조직 유래의 세포, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 동종의 조직 유래 세포, 손상에 의해 재생이 필요해진 조직과 다른 조직 유래 세포, 손상 조직을 갖는 개체의 조직 유래 세포, 손상 조직을 갖는 개체 이외의 동종 개체의 조직 유래 세포, 손상 조직을 갖는 개체 이외의 이종 개체의 조직 유래 세포, 상술한 세포 및 조직 유래 세포에서 수립된 세포주, 상기 조직 유래 암세포, 상기 세포를 유전자 공학적으로 변경시킨 세포 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다. 이들 세포에는 상술한 특징을 갖는 세포가 포함된다.
본 발명에서의 피험세포로는 골수, 손상 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 동종의 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 다른 조직, 손상 조직을 갖는 개체의 조직, 손상 조직을 갖는 개체 이외의 동종 개체의 조직 또는 손상 조직을 갖는 개체 이외의 이종 개체의 조직에서 직접 또는 간접적으로 단리된 세포를 예시할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 피험세포로서는 골수, 손상 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 동종의 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 다른 조직, 손상 조직을 갖는 개체의 조직, 손상 조직을 갖는 개체 이외의 동종 개체의 조직 또는 손상 조직을 갖는 개체 이외의 이종 개체의 조직 유래의 배양세포도 예시할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 피험세포로는 골수, 손상 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 동종의 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 다른 조직, 손상 조직을 갖는 개체의 조직, 손상 조직을 갖는 개체 이외의 동종 개체의 조직 또는 손상 조직을 갖는 개체 이외의 이종 개체의 조직 유래 세포 혹은 배양세포를 유전 공학적 기술 또는 세포 생물학적 기술로 변경된 세포도 예시할 수 있다. 또한, 본 발명에서의 피험세포로는 골수, 손상 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 동종의 조직, 손상에 의해 재생이 필요해지는 조직과 다른 조직, 손상 조직을 갖는 개체의 조직, 손상 조직을 갖는 개체 이외의 동종 개체의 조직 또는 손상 조직을 갖는 개체 이외의 이종 개체의 조직 유래의 종양세포도 예시할 수 있다.
또한, 본 발명에서의 피험세포로서는 특정 성질을 갖는 단일세포집단을 복수종 함유하는 세포집단 또는 특정한 성질을 갖는 단일세포집단을 예시할 수 있다. 전자의 구체예로서는, 골수 혹은 손상 조직(혈액, 피부, 지방 등)으로부터 직접 또는 간접적으로 채취된 세포군, 후자의 예로서는 골수 유래 중간엽 줄기세포나 피부 섬유아세포를 예시할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에서는, 우선 세포나 조직을 용매에 담근다. 상기 세포로서는 특별히 제한은 없지만, 조직 유래 세포, 조직 유래 세포에서 수립된 세포주(예를 들어, Hela, HEK293을 예시할 수 있는데, 이들에 제한되지 않음), 단리된 세포, 단리되지 않은 세포(예를 들어, 단리된 조직 중에 존재하는 세포), HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 도입된 세포 등을 예시할 수 있다. 상기 조직으로서는 어떠한 조직이어도 되고, 예를 들어 생체 피부 조직, 체내 생검(수술) 조직(뇌, 폐, 심장, 간장, 위, 소장, 대장, 췌장, 신장, 방광, 비장, 자궁, 정소나 혈액 등), 손상 조직을 예시할 수 있다. 또한, 당해 용매로서는 생리 식염수, PBS, TBS를 예시할 수 있는데, 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포나 조직을 용매에 침지하는 시간으로는 세포 괴사를 유도하기 위해 필요·충분한 시간(통상 24시간 이상)인 것이 바람직한데, 이 시간에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서는, 세포나 조직을 용매에 담근 후에 세포나 조직을 포함하는 용매에서 그 세포나 그 조직을 제거할 수도 있다. 용매에서 세포나 조직을 제거하는 방법은 당업자에게 주지된 방법이면, 특별히 제한되는 것은 아니다.
다음에는, 얻어진 세포나 조직의 추출액에 의한 피험세포의 유도활성을 측정한다. 대조로서는, 세포나 조직을 담그기 전의 용매를 예시할 수 있다. 피험세포의 유도활성은, 예를 들어 실시예에 기재된 방법으로 측정할 수 있지만, 이에 한정되지 않고, 그 밖의 시험관 내 혹은 생체 내 세포 유주능 측정방법으로 측정할 수도 있다.
예를 들어, 세포 유래 추출액이나 조직 유래 추출액과 피험세포를, 예를 들어 홀을 가지는 막(예를 들어, 8㎛의 홀을 가지는 막)을 사이에 두고 근접·교통시킨다. 다음에, 피험세포가 세포나 조직의 추출액의 측에 유주하는지의 여부를 확인한다. 또한, 예를 들어 세포나 조직의 추출액을 실시예에 기재된 GFP골수이식 마우스에 투여한다. GFP골수이식 마우스는 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 유전자가 도입된 형질전환 마우스(GFP 마우스)에서 단리된 골수세포를 치사성 방사선을 조사한 마우스로 이식함으로써 제작할 수 있다. 보다 구체적으로는, 치사성 방사선(10Gy)을 조사한 직후의 마우스 꼬리정맥 내에 GFP 마우스의 장관골(long bone)에서 채취한 골수세포(약 105개/마리)를 투여하고, 생착을 기다린다(통상 약 6주일 이상이 필요). 다음에, 피험세포로서의 GFP양성 골수 유래 세포가 세포나 조직 유래 추출액의 투여부위에 동원되어 있는지의 여부를 확인한다.
또한, 본 발명은 하기 공정을 포함하는, 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는 세포나 조직의 추출액을 스크리닝하는 방법을 제공한다:
(a)복수의 추출액에 대해, 상기 평가방법으로 당해 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는지의 여부를 평가하는 공정 및
(b)공정(a)에서 피험세포를 유도하는 인자가 포함된다고 평가된 추출액을 선택하는 공정.
또, 본 발명은, 상기 평가방법이나 스크리닝 방법에 의해 피험세포를 유도하는 인자를 포함한다고 판정한 추출액으로부터 피험세포의 유도활성을 지표로 피험세포를 유도하는 인자를 정제하는 공정을 포함하는, 피험세포를 유도하는 인자의 동정방법을 제공한다. 피험세포를 유도하는 인자의 정제에는 통상의 단백질의 정제에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 전혀 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 용매침전, 용매추출, 증류, 면역침강, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 전기영동법, 투석, 재결정 등을 적절히 선택, 조합하면 단백질을 분리, 정제할 수 있다. 정제된 인자는, 예를 들어 질량분석 등의 당업자에게 주지의 방법에 의해 동정할 수 있다. 동정된 인자를 사용함으로써, 손상 조직의 재생을 촉진할 수 있다. 따라서, 당해 인자는 손상 조직의 재생을 촉진하는 인자나 손상 조직의 재생에 기여하는 인자라고 표현할 수 있다. 또한, 당해 인자는 손상 조직의 재생을 촉진하는 후보나 손상 조직의 재생에 기여하는 후보라고 표현할 수도 있다.
본 발명의 방법에서는, 특정한 성질을 갖는 단일세포집단을 복수종 함유하는 집단으로부터 특정한 성질을 갖는 단일세포집단이 유주될 수도 있다. 이러한 경우는, 본 발명의 방법에 의해 특정한 성질을 갖는 단일세포집단 및 당해 세포집단을 유도하는 인자 모두가 동정된다.
또, 본 명세서에서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 추가된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1]
목적: 생체이식 피부조직의 기능적 재생시에서의 골수 유래 세포 기여의 평가
방법: 상기 목적에 대해 이하의 방법에 의해 연구를 수행하였다.
1)GFP 골수이식 마우스에 대한 생체피부 이식계를 이용하여 이식피부 조각의 기능적 재생 시의 골수 유래 세포의 기여정도를 검토하였다. 구체적으로는, C57BL/6 웅성마우스(6~8주령)에 치사량 방사선(10Gy)을 조사하고, 그 직후에 미정맥을 통해 GFP(green fluorescent protein) 형질전환 마우스 유래 골수 세포(5×106개/O.1ml 생리적 인산 완충용액 pH 7.4)를 이식하였다(도 1).
2)이식 골수 세포의 생착을 기다려서(6주간) 얻어진 GFP 골수이식 마우스의 배부 피부에 신생 마우스 피부(암)를 이식하였다.
3)이식피부 조각의 생착과 충분한 피부조직재생을 기다려서(4주일) 이식피부 조각영역에서의 GFP 형광의 집적정도를 형광 실체 현미경을 이용하여 관찰하였다.
4)흡입마취 하에 이식피부 조각을 생검에 의해 채취하고, 냉각장치부착 마이크로톰(microtome)을 이용하여 피부동결 절편(6㎛)을 제작, 4% 파라포름알데히드 고정(30분간), 조직 내 세포핵을 DAPI로 염색, 표피세포 특이적 케라틴 5의 항체를 이용하여 면역염색을 시행한 후, 조직을 봉입하여 공초점 레이저 현미경에 의해 GFP 양성 골수 유래 세포의 존재를 검토하였다. 또한, 일부의 표본은 HE염색에 의해 그 조직 구축을 검토하였다.
결과: GFP 골수이식 마우스에의 생체피부 이식계에 있어서, 재생한 피부영역과 일치하는 강한 GFP 형광의 집적이 관찰되었다(도 2). 또한, 이식피부 조각의 HE 표본을 이용한 조직학적 관찰에서는 다수의 모낭을 포함하는 피부조직의 기능적 재생이 확인되었다(도 2). 공초점 레이저 현미경에 의한 관찰에서는, 케라틴 5을 발현하는 표피 각화세포, 진피 섬유아세포, 또 평활근 세포나 지방세포의 대부분이 GFP형광을 나타내고, 이들의 세포가 골수 유래인 것으로 나타났다(도 3). 즉, 이식피부의 기능적 재생 시에 필요한 상피계 및 중간엽 세포의 대부분이 골수 유래 줄기세포에 의해 공급되고 있는 것이 비로소 명백하게 되었다.
고찰: 이들의 연구결과는, 지금까지 임상현장에서 일상적으로 행해지고 있는 피부이식에서의 피부 재생 시에 골수 유래 세포가 크게 기여하고 있음을 최초로 명확하게 나타낸 것으로서, 매우 획기적인 발견이다.
골수 내에는 조혈계 줄기세포와 중간엽 줄기세포의 2개의 줄기세포 시스템이 존재하는 것이 보고되어 있다. 이번의 연구에서 나타난, 이식피부 내에 대량 동원된 골수 유래 상피계 세포 및 중간엽 세포가 골수 유래 조혈계 줄기세포에서 공급되고 있다고 예상하기는 어렵고, 이식조직의 기능적 재생에는 골수 유래 중간엽 줄기세포가 기여하고 있을 가능성이 강하게 시사된다. 즉, 피부이식 직후에 관류저하·괴사방향에 있는 이식피부 조직으로부터 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원인자가 방출되고, 골수로부터 중간엽 줄기세포를, 말초혈액순환을 통하여 이식피부 조각 내에 동원하여 기능적 피부조직재생을 유도하고 있는 것으로 예상되었다.
[실시예 2]
목적: 피부조직 추출액 내에 존재하는 골수 중간엽 줄기세포 유도인자의 동정
방법: 관류저하 상태에 있는 절제피부로부터의 방출이 예상되는 골수 중간엽 줄기세포 동원인자의 동정을 목적으로 하여 하기 방법에 의해 연구를 진행하였다.
1)마우스 골수 유래 중간엽 줄기세포를 얻기 위해서, C57BL/6 마우스의 골수 세포를 대퇴골 또는 하퇴골에서 채취하여 10% 우태아혈청 함유 D-MEM(Nacalai사 제품)을 세포 배양 배지로서 세포 배양용기에 분산시키고 37℃, 탄산가스 농도 5%의 조건 하에서 배양하였다. 세포가 차지하는 면적이 배양그릇 저면적에 대해 70 내지 100%로 증식한 시점에서, 0.25% 트립신 1 mM EDTA(Nacalai사 제품)를 이용하여 세포를 배양용기에서 벗기고 동일 조건으로 계대배양하였다. 계대작업은 적어도 5회 이상 반복하였다. 또, 이들의 부착세포를 단리배양하여 유세포 측정법에 의한 세포 표면 항원의 분석을 수행하여 Lin음성, CD45음성, CD44양성, Sca-1양성, c-kit음성임을 확인하였다. 이들의 세포는 골세포, 지방세포로 분화 가능하고 골수 중간엽 줄기세포의 성질을 가지는 것을 확인하였다.
2)신생 마우스 400마리에서 얻은 유리피부 조각을 생리적 인산 완충액 pH 7.4(PBS) 400ml 내에 담그고, 4℃에서 24시간 인큐베이션한 후 조직을 제거하기 위해서, 4℃의 조건 하에서 10분간, 440G에서 원심하여 상청을 회수하여 피부 추출액을 제작하였다.
3)얻어진 피부 추출액 중에 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이 존재하는 것을 확인하기 위해, 보이덴·챔버를 이용하여 본 발명자들이 이미 콜로니화(주화)하고 있는 C57BL6 마우스 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대한 유주 활성을 검토하였다. 구체적으로는 보이덴·챔버의 하조(용량 25μl)에 피부 추출액(25μl)을 삽입하고, 8㎛의 미세홀을 가지는 폴리카보네이트 멤브레인을 실어, 이것에 접하여 보이덴·챔버 상조(용량 50μl)를 얹어 그 중에 골수 유래 중간엽 줄기세포 부유액(5×104개/50ml 배양액: DMEM/10% 소 태자혈청)을 넣고 CO2인큐베이터 내에서 37℃, 4~24시간 배양하였다. 배양 후, 챔버의 상조를 제거하고 실리콘 박막을 추출하여, 그 미세홀을 통과하여 챔버 하조에 유주한 골수 유래 중간엽 줄기세포의 수를 염색에 의해 정량적으로 검토하였다.
4)피부 추출액 내의 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성을 가진 인자를 정제하기 위해, 헤파린 친화성 칼럼·크로마토그래피 및 음이온 교환 칼럼(Q칼럼) 크로마토그래피를 시행하였다. 피부 추출액을 4℃의 9배용량의 20 mM 인산 완충용액 pH 7.5를 이용하여 10배로 희석하였다(희석액 A). 미리 20 mM 인산 완충용액 pH 7.5(30ml)를 HiTrap Hepalin HP column(칼럼 용량: 5ml, GE Healthcare) 중에 흘려서 칼럼을 평형화하였다. 또, 희석액 A를 칼럼에 결합시켰다. 그 후, 20 mM 인산 완충용액 pH 7.5, 100 mM NaCl(30ml)로 칼럼을 세정하였다. 흡착한 단백질을 용출하기 위해 20 mM 인산 버퍼 pH 7.5, 1000 mM NaCl을 칼럼 내에 유입하고, 용출액을 튜브에 분획하였다. 흡착 분획을 각각 2)에서 설명한 보이덴·챔버를 이용한 유주활성 평가법에 의해 유주능을 가지는 분획을 모았다. 이를 9 배 용량의 50 mM Tris HCl pH 8.0으로 희석하였다(희석액 B). 미리 50 mM Tris HCl pH 8.0(30ml)을 HiTrap mono Q column(칼럼 용량: 1ml, GE Healthcare) 중에 흘려서 칼럼을 평형화하였다. 또, 희석액 B를 칼럼에 결합시켰다. 흡착한 단백질을 용출하기 위해 Tris HCl pH 8.0, 1000mM NaCl을 칼럼 내에 유입하고, 용출액을 튜브에 분획화하였다. 이상의 정제과정은 모두 4~16℃에서 행하는 것이 가능하지만, 4~8℃에서 행하는 것이 바람직하고, 4℃에서 행하는 것이 더 바람직하다. 이 용출액을 2)에서 설명한 보이덴·챔버를 이용한 유주활성 평가방법에 의해 평가하였다.
5)보이덴·챔버에 의한 유주활성 평가 및 칼럼·크로마토그래피의 조합을 이용하여 얻어진 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성을 가진 피부 추출액 유래 정제표품을 SDS-PAGE 전기영동법에 의해 분자량을 기초로 하여 겔 내 분획화하고, 은염색에 의해 영동 단백의 밴드를 검출하였다.
6) 5)의 SDS-PAGE 전기영동 및 은염색에 의해 단일 밴드로서 겔 내 분화된 피부 추출액 유래 단백군 중에서, 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성이 가장 강한 크로마토그래피 정제 표품으로부터 얻어진 단백 밴드를 전부 추출하여 질량분석 및 데이터베이스 해석에 의해 당해 단백의 동정을 진행하였다.
7)동정한 단백군 중에서 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성을 가진 후보 단백을 선정하고, 그 후보 단백을 포함하는 정제표품을 중화 항체로 처리(정제표품 용액 100μl를 당해 단백의 폴리클로날 항체 100배 희석 조건으로 얼음 상에서 30분간 인큐베이트)한 후, 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성의 저해정도를 보이덴·챔버를 이용한 유주능 어세이로 검토하였다.
8)얻어진 골수 유래 중간엽 줄기세포 정제표품을 마트리겔(Martigel) 중에 약 10% 부피가 되도록 혼합하여 직경 약 1mm, 5mm 길이의 실리콘 튜브 내에 삽입하고, 이를 GFP 골수이식 마우스 배부 피하로 이식하였다. 2주일 후에 삽입 튜브를 추출하여 튜브 내에 유주한 골수 유래 세포에서 나오는 GFP 형광을 형광측정장치에 의해 정량적으로 해석하였다. 또, 튜브 내에서 유주세포를 추출하고 DMEM/10% 우태아 혈청 배지에 접종하여 CO2인큐베이터 내에서 배양함으로써, 골수 유래 중간엽 줄기세포의 생체 내 동원활성을 검토하였다. 2주일간 계속해서 배양한 세포는 2% 파라포름알데히드로 25℃의 조건 하에서 10분간 고정한 후, 5분씩 4회 PBS를 이용하여 파라포름알데히드를 세정하고, 2% 탈지유 액으로 처리하고, 0.5% tween 20 함유 2% 탈지우유로 1000 배로 희석한 항마우스 케라틴 5 항체를 4℃의 조건 하에서 16시간 반응시켰다. 5분씩 4회 PBS를 이용하여 항체를 세정하고, 2% 탈지우유로 1000배로 희석한 Alexa546 표식 항토끼 IgG항체를 25℃의 조건 하에서 1시간 반응시켰다. 이상의 1)~8)의 실험과정은 도 4에 정리하였다.
결과: 절제한 신생 마우스 피부에서 PBS 중으로 추출한 용액(도 5)을 출발재료로 하여 상술한 방법에 의해 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성을 가진 단백질의 동정과 기능해석을 진행하였다. 보이덴·챔버에 의한 유주활성 해석에 의해, 피부 추출액 중에 매우 강한 골수 유래 중간엽 줄기세포 유도활성이 있는 것이 나타났다(도 6). 이 활성을 지표로 하여 헤파린 친화성 칼럼 및 음이온 교환 칼럼(Q칼럼)을 이용하여 목적 인자의 정제를 진행하여 얻어진 각 분화를 SDS-PAGE 전기영동으로 해석한 결과, 은염색에 의해 단일 밴드로서 겔 내 분획된 수 개의 단백을 포함하는 정제표품 내에 강한 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성이 있는 것이 나타났다(도 7 레인 7). 얻어진 은염색 밴드를 추출하여 질량분석, 데이터베이스 해석을 진행한 결과, 화살표로 나타내는 분자량 약 25,000의 단백이 HMGB1인 것이 명백해졌다(도 7). 이 정제분획(레인 7) 중에 포함되는 HMGB1이 목적의 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성을 가진 것을 명백하게 할 목적으로, 항HMGB1 폴리클로날 항체에 의한 유주저해실험을 하였다. 그 결과, 항HMGB1 폴리클로날 항체가 당해 정제표품 중의 골수 유래 중간엽 줄기세포 유주활성을 강하게 저해하는 것이 명백해지고(도 8), 피부 추출액 내에 존재하는 골수 유래 줄기세포 동원인자가 HMGB1인 것이 명백해졌다.
또, HMGB1이 생체 내에서 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원활성을 가지는 것을 확인할 목적으로, 이 정제표품을 넣은 실리콘 튜브를 GFP 골수이식 마우스 배부 피하에 삽입하고 2주일 후에 튜브 내에 동원된 세포의 성질을 검토하였다(도 9). 그 결과, 대조군(도 7에서의 SDS-PAGE 레인 4에 이용한 정제표품)과 비교하여, HMGB1 정제표품은 GFP 양성의 골수 유래 세포를 튜브 내에 다수(대조 콘트롤의 약 3배) 동원하였다(도 1O). 도 11은 형광 실체 현미경에 의한 고배율상을 나타낸다. 또, 튜브 내에 동원된 GFP양성세포를 추출하여 DMEM/10% 소태자 혈청 배지 내에서 배양한 결과, 배양 개시 직후는 원형의 부유세포상태였지만(도 12), 24시간 후에는 GFP양성 골수 유래 세포는 배양 샬레에 부착하여 방추계의 섬유아세포양 형태, 또 유원형(cylindroid-shaped)의 상피세포양 형태의 세포로서 증식하는 것이 확인되었다(도 13). 또한, 이들의 세포를 2주일 계속해서 배양하면 GFP양성 골수 유래 세포 중에 모낭의 형태를 나타내는 세포를 확인하였다(도 14a; 명시야, 저배율, 도 14b; GFP형광, 저배율, 도 14c; 명시야, 고배율, 도 14d; GFP형광, 고배율). 또한, 상피 케라티노사이트의 마커인 케라틴 5에 대한 면역조직화학을 행한 바, GFP양성 골수 유래 세포 중에 케라틴 5 양성세포를 확인하였다(도 14e; 명시야, 도 14f; 케라틴 5 양성세포의 형광).
고찰: 이번에 본 발명자들은 세계에서 처음으로 유리된 피부 조각이 HMGB1을 생산하는 것, 생산된 HMGB1은 골수 유래 중간엽 줄기세포를 피부조각 내에 대량으로 동원하는 활성을 갖는 것, 피부조각 내에 동원된 골수 유래 중간엽 줄기세포는 피부조직 내에서 섬유아세포, 지방세포, 평활근 세포 등의 중간엽 세포로 분화하고, 또한 표피세포 모낭을 형성하는 세포로 분화함으로써 이식피부조직의 기능적 재생을 유도하는 것을 발견하였다. 이 HMGB1에 의한 골수 유래 중간엽 줄기세포 동원 및 그 결과로서의 기능적 조직재생은 이식피부 재생뿐만 아니라, 관류저하·괴사를 동반하는 많은 장기·조직 손상시에 기능적 조직재생 유도기전으로서 기능하는 것이 쉽게 예상된다. HMGB1제제에 의한 의약품을 개발함으로써, 손상 조직 재생시에 골수 유래 중간엽 줄기세포를 국소에 동원하는 것이 가능하게 되면, 섬유성 반흔치유에 의해 역기능적으로 빠지는 것 없이, 필요한 기능적 기관이 동반하는 기능적 조직재생 유도의료가 가능해진다고 확신한다.
[실시예 3]
목적: 피부 추출액 중 HMGB1패밀리의 동정과 골수 중간엽 줄기세포 유도활성의 검토
방법: 신생 마우스 피부 추출액 중에 포함되는 HMGB단백 패밀리의 유무를 웨스턴 블랏법을 이용하여 확인하였다. 샘플로서 [실시예 2]에서 얻어진 피부 추출액 10μl을 SDS-PAGE법을 이용하여 전기영동하고, 겔 중에서 분리된 단백을 블로팅 장치(ATTO)를 이용하여 PVDF막으로 통과시켰다. 3% 탈지유 및 0.1% Tween 20 함유 PBS(S-T-PBS)로 실온에서 1 시간 배양한 후, S-T-PBS로 1000배로 희석한 토끼 항마우스 HMGB1 항체, 토끼 항마우스 HMGB2항체, 토끼 항마우스 HMGB3항체를 각각 4℃에서 16시간 반응시켰다. 반응 후, 동 PVDF막을 S-T-PBS로 5분간 5회 세정 후, S-T-PBS로 2000배 희석한 퍼옥시다아제 표식 염소 항토끼 IgG항체(GE Healthcare)에서 동 PVDF막을 25℃에서 1시간 배양하였다. 또한, S-T-PBS에서 5분간 5회 세정 후 ECL Western Blotting Detection System(GE Healthcare)을 동 PVDF막과 반응시키고, ECL 필름을 감광시킨 후 현상하여 HMGB1, HMGB2, HMGB3단백의 존재를 검출하였다.
신생 마우스 피부로부터 Trizol(invitrogen)을 이용하여 RNA를 추출하고, 또 SuperScript Ⅲ cDNA 합성 키트(Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA를 주형으로 하여 HMGB1, HMGB2 및 HMGB3의 cDNA를 PCR(폴리메라아제 연쇄반응)법을 이용하여 증폭하고, 아미노산 서열의 N말단에 Flag tag의 서열(Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Lys; 서열번호: 18)을 부가한 단백을 발현하도록 포유류세포에서 단백을 발현시키는 플라스미드 벡터 pCAGGS에 삽입하였다. 이들의 플라스미드 벡터를 HEK293(인간 태아 신세포 유래 배양 세포주)에 유전자 도입하고 48시간 배양하여 단백을 발현시켰다. HMGB1, HMGB2 및 HMGB3단백을 각각 발현시킨 세포 및 배양액의 상청액은 4℃에서 16시간 배양한 후, 4400g·5분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 이 상청액 50 mL당 100μL의 항 Flag항체 겔(Sigma)을 혼합하여 4℃에서 16시간 배양하였다. 원심분리하여 Gel을 회수한 후 PBS를 이용하여 5회 세정하였다. 또, 3X Flag 펩티드(최종 100μg/ml)를 이용하여 용출하였다. 재조합 단백의 발현을 S-T-PBS로 1000배 희석한 마우스 항 Flag항체 및 S-T-PBS로 2000 배 희석한 퍼옥시다아제 표식 항마우스 IgG항체(GE Healthcare)를 이용한 웨스턴 블랏법으로 확인하였다. 이들의 정제 재조합 단백의 마우스 골수 중간엽 줄기세포의 유주활성을 [실시예 2]와 같이 보이덴·챔버를 이용하여 평가하였다. 또한, HMGB 패밀리의 in vivo에서의 약효를 관찰하기 위해, 8주령 C57BL/6 마우스의 배부 피부를 직경 8㎛의 원형으로 절제하여 피부궤양모델을 제작하고, 거기에 정제한 HMGB1·HMGB2·HMGB3 각각(100ng)을 1g/100mL PBS의 농도의 히알루론산 용액과 같은 양씩 혼합하고 그 중에서 100μL을 궤양면에 투여하였다. 궤양면은 건조하지 않도록 점착성 투명 창상피복·보호재 Tegaderm(3M Healthcare)로 덮고, 경시적으로 창상면적을 계측하여 치유효과를 측정하였다.
또한, 인간 골수 중간엽 줄기세포를 인간 피부 추출액 및 인간 정제 HMGB1이 유주하는 활성이 있는지를 조사하기 위해, [실시예 2]와 같이 보이덴 챔버를 이용하여 평가하였다. 면적 1㎠의 인간 피부를 1 ml의 PBS에 담그고 4℃의 조건 하에서 16 시간 배양한 후, 4℃의 조건 하에서 10 분간 440 G로 원심분리 하였다. 상청액만을 회수하여 인간 피부 추출액으로서 사용하였다. 또한, 보이덴 챔버의 상부에 넣는 세포는 인간 골수 중간엽 줄기세포(Cambrex사)를 이용하였다.(본 세포는 유세포 분석기에 의한 세포표면 항원의 분석결과, CD105양성, CD166양성, CD29양성, CD44양성, CD34음성, CD45음성으로 되어 있다. 또, 분화유도시험에 의해 지방세포, 연골세포, 골세포로의 분화가 양성이다.) 또한, 챔버 하부에는 인간 HMGB1을 100ng/웰(R&D사) 및 PBS로 10배 희석한 인간 피부 추출액을 넣고, 대조군으로서 PBS를 이용하였다.
결과: 웨스턴 블랏의 결과, HMGB1의 밴드 이외에 HMGB2나 HMGB3의 밴드가 검출되었다. 따라서, 신생 마우스 피부 추출액 중에는 HMGB1 이외에 패밀리 단백인 HMGB2 및 HMGB3이 함유되어 있는 것이 확인되었다(도 15). 각각의 단백의 N말단에 Flag tag를 부가한 HMGB1·HMGB2·HMGB3의 발현 벡터를 제작하였다(도 16). HEK293세포에 발현 벡터를 유전자 도입하고, 발현한 단백질을 플래그 태그(Flag tag)를 이용하여 정제한 후, 웨스턴 블랏법을 이용하여 단백질을 확인하였다(도 17). 이들의 정제 단백을 이용하여 마우스 골수 중간엽 줄기세포의 유주활성을 측정한 바, 어떤 단백에서도 활성이 확인되었다(도 18). 마우스의 배부에 제작한 궤양면적을 7일마다 계측한 바, 비치료군에 비해 HMGB1, 2 및 3에 의한 치료군의 쪽이 특별히 궤양면적의 축소효과를 확인할 수 있었다(도 19). 마우스의 경우와 같이, 인간 HMGB1 및 인간 피부 추출액은 인간 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성이 있는 것이 명백해졌다(도 20).
고찰: HMGB1과 상동성이 높은 단백으로서 HMGB2 및 HMGB3이 알려져 있다. 이들의 단백도 HMGB1과 같은 성질을 가지는 것이 기대된다. 그래서, 유리된 피부 조각 추출액으로부터 HMGB1의 패밀리인 HMGB2 및 HMGB3도 생산되는 것을 확인하였다. 또, HMGB1·HMGB2·HMGB3의 재조합 단백을 제작하여 in vitro에서의 골수 중간엽 줄기세포 유주활성을 확인하고, in vivo에서의 피부궤양 치료효과도 확인하였다. 신생 마우스 유리된 피부 조각 중의 HMGB패밀리(HMGB1·HMGB2·HMGB3) 및 재조합 HMGB 패밀리에는 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이나 골수 유래의 상피계로 분화 가능한 줄기세포를 국소로 유도하는 활성이 있고, 또 이들의 유도된 골수 유래의 세포군이 손상 조직에 있어서 표피 각질세포나 모낭이나 섬유아세포와 같은 여러가지 세포로 분화하여 손상 조직의 치유를 촉진하는 효과가 있는 것이 명백해졌다. 또한, 골수 중간엽 줄기세포는 다능성 줄기세포이므로, 다른 조직손상상태, 예를 들어 뇌손상, 심근경색, 골절 등의 조직손상의 치료에 HMGB 패밀리를 전신투여 또는 국소투여함으로써 마찬가지로 치료효과를 기대할 수 있다고 확신한다.
또한, 인간과 마우스의 HMGB1은 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 98%(213/215)의 상동성이 있고, HMGB2는 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 96%(202/210)의 상동성이 있으며, HMGB3은 각각을 구성하는 아미노산 서열에서 97%(195/200)의 상동성이 있음을 알 수 있다. 그래서, 인간의 HMGB가 마우스의 HMGB와 동일한 활성을 가지는 것이 생각되는데, 본 실시예의 결과로부터, 인간의 피부 추출액이나 HMGB1이 마우스의 피부 추출액이나 HMGB1과 동일하게 골수 중간엽 줄기세포를 유도하는 활성이 있음이 명백해졌다.
[실시예 4]
목적: 골수 중간엽 줄기세포 유도인자 조직 추출액의 제작방법의 확립
방법: 6주령 C57BL6 1 마리의 뇌, 심장, 장, 신장, 간장 및 신생 마우스 피부를 생리적 인산 완충액 pH 7.4(PBS) 1ml 내에 담그고 4℃에서 24시간 배양한 후, 조직을 제거하기 위해서 4℃의 조건 하에서 10분간, 440G에서 원심분리하여 상청을 회수하여 조직 추출액으로 하였다. 얻어진 추출액 중에 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이 존재하는 것을 확인하기 위해, 보이덴·챔버를 이용하여 [실시예 2]와 같이 골수 유래 중간엽 줄기세포에 대한 유주활성을 검토하였다. 또한, 동일한 샘플 중에 포함되는 HMGB1의 농도를 HMGB1 ELISA kit(시노테스트)를 이용하여 측정하였다. 또, 뇌, 심장 및 피부의 조직 추출액을 [실시예 2]와 같이 헤파린 친화성 칼럼에 결합시키고, 결합 분획의 단백의 골수 중간엽 줄기세포 유도활성을 보이덴 챔버를 이용하여 확인하였다.
결과: 마우스 뇌 추출액에는 신생 마우스 피부 추출액과 동등한 HMGB1이 함유되어 있었다. 또, 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성은 마우스 뇌에서도 피부와 동일하게 인정되었다. 마우스 장 추출액과 마우스 심장 추출액 중에 HMGB1은 거의 포함되어 있지 않았지만, 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성은 인정되었다. 또한, 마우스 뇌, 마우스 심장의 헤파린 칼럼 결합 분획은 마우스 피부의 헤파린 칼럼 결합 분획과 같이 골수 중간엽 줄기세포를 유도하는 활성이 있었다(도 21). 표 1은 마우스 각 조직 추출액의 HMGB1 농도와 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성을 측정한 결과를 나타낸다.
HMGB1 농도
(ng/mL)		 골수 중간엽 줄기세포의 유도활성
피부 110 있음
뇌 140 있음
심장 4 있음
장 0 있음
신장 115 ND
간장 61 ND
ND:시행하지 않음
고찰: 피부뿐만 아니라 뇌에서도 장기를 생리적 완충액에 침지하는 것뿐이라는 간편한 방법으로 HMGB1을 간편하게 추출하는 방법을 개발하였다. 이 방법은, 다른 장기, 예를 들어 간장이나 신장에서도 동일하다. 또한, 심장이나 장으로부터의 추출액에는 HMGB1을 거의 함유하지 않음에도 불구하고 골수 중간엽 줄기세포 유도활성이 인정되었다. 이는 추출액 중에 HMGB1과 다른, 별개의 골수 중간엽 줄기세포 유도물질이 포함되어 있는 것으로 생각할 수 있다. 이들의 추출액에 포함되는 물질은 원래 각각의 조직에 존재하는 것이고, 생리적으로는 조직 손상시에 골수 중간엽 줄기세포를 손상 조직으로 유도하고 있다고 생각된다. 본 발명에 의해 HMGB1을 포함하는 복수의 골수 중간엽 줄기세포 유도물질을 각종 장기로부터 기능적이고 간편하게 추출하는 신규의 방법을 개발할 수 있었다. 또, 조직 추출액으로부터 골수 중간엽 줄기세포 유도물질을 정제하기 위해 헤파린 칼럼에 결합시키는 방법을 개발하였다. 또한, 이들의 골수 중간엽 줄기세포 유도활성을 가지는 성분은 피부와 같은 방법으로 뇌나 심장으로부터도 헤파린 칼럼을 이용하여 정제하는 것이 가능하다.
[실시예 5]
목적: 배양세포로부터 중간엽 줄기세포 유주활성 물질을 추출하는 방법을 확립한다.
방법: 인간 태아 신장 유래 배양 세포주 HEK293 및 인간 자궁경부암 세포주 HeLa는 각각 1O% 우태아혈청 함유 D-MEM(nacalai사 제품)으로 배양하였다. 각각의 세포를 PBS로 세정 후, 세포 107개를 4℃의 5ml의 PBS(nacalai사 제품)에 16시간 담갔다. 중력 가속도 440G로 4℃에서 5 분간 원심분리하여 상청액을 회수하였다. 보이덴 챔버의 상층에 인간 골수 중간엽 줄기세포를 넣고, 하층에 DMEM으로 5배 희석한 세포 추출액을 넣어 인간 골수 중간엽 줄기세포 유주활성을 확인하였다.
결과: HEK293 추출액도 HeLa 추출액도 모두 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성을 나타내었다(도 22).
고찰: 배양세포를 PBS에 침지하는 간편한 방법으로 골수 중간엽 줄기세포를 유주하는 활성물질을 추출하는 것에 성공하였다.
[실시예 6]
목적: 마우스 뇌 결손 모델을 제조하여 국소 손상부위에 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 서방화(徐放化)하여 투여 시, 자기의 골수계에 포함되는 줄기세포를 국소 손상부위에 유주시킴으로써 신경계세포의 재생을 유도할 수 없는지 검토한다.
방법:
(1)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획의 제작
절제한 신생 마우스 피부로부터 PBS(1마리/ml) 중에 4℃에서 16 시간 배양하여 추출한 피부 추출액을 4℃의 9배용적 20 mM 인산 버퍼 pH 7.5를 이용하여 10배로 희석하였다. 미리 20 mM 인산 완충용액 pH 7.5(30ml)를 HiTrap Hepalin HP column(칼럼 용량: 5ml, GE Healthcare) 중에 흘려서 칼럼을 평형화하였다. 또, 희석액을 칼럼에 결합시켰다. 그 후, 20mM 인산 완충용액 pH 7.5, 100mM NaCl(30ml)로 칼럼을 세정하였다. 흡착된 단백을 용출하기 위해 20 mM 인산 버퍼 pH 7.5, 1000mM NaCl을 칼럼 내에 유입하고, 용출액을 튜브에 분획화 하였다. 흡착 분획에 대해 각각 마우스 골수 유래 세포주의 유주활성을 실시예 2에서 나타낸 보이덴 챔버법을 이용하여 평가하여 유주능을 가지는 분획을 모았다. 이 활성을 가지는 용액을 피부 추출액 헤파린 정제 분획으로서 하기 실시예에 사용하였다.
(2)골수 억제 마우스의 제조
마우스에 10Gy의 X선 단회조사를 하여 골수 억제 마우스를 제조하였다.
(3)골수 억제 마우스로의 GFP 마우스 골수 이식
GFP마우스의 양측 대퇴골 및 하퇴골에서 골수세포를 채취하였다. 이를 조사 후 24시간 경과한 골수 억제 마우스의 꼬리정맥을 통해 투여하였다. 또, 투여는 이소플루란에 의한 흡입 마취하에 시행하였다.
(4)마우스 뇌 손상(뇌조직 결손) 모델의 작성
GFP 마우스의 골수세포를 이식한 골수 억제 마우스에 이소플루란으로 흡입마취를 하고, 펜토바르비탈(45mg/kg)을 복강 내에 주입하였다. 마우스를 뇌정위 고정장치에 고정하고, 메스로 머리부에 정중앙 절개를 가하였다. 정수리점(bregma)로부터 우외측 2.5mm, 전방 1mm에 드릴을 이용하여 천두를 실시하였다(도 23a). 이 부위에서 깊이 3mm의 위치를 선단으로 하여 20G 서플로우(Surflow) 침의 외통을 삽입하여 고정하였다. 여기서 시린지를 이용하여 음압을 가하여 뇌조직을 일부 흡인하였다(도 23b).
(5)피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획의 뇌조직 결손부로의 투여
상술한 위치에 해밀턴 시린지와 26G 시린지를 이용하여 피브린 접착제인 피브리노겐(Bolheal(Kaketsuken))에 용해한 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획을 5μl 주입하고, 다음에 피브린 접착제인 트롬빈(Bolheal(Kaketsuken))을 5μl 주입하였다(도 23c). 이 조작은 피부 추출액에 헤파린 칼럼 정제 분획의 서방제로서의 효과를 위한 것이다.
(6)뇌조직 결손부에서의 신경계세포 재생효과의 평가
대조군과 치료군의 마우스를 이용하여 평가하였다. 적절한 경과설정을 정하고(경시적으로) 마우스를 4% 파라포름알데히드로 관류 고정한 후, 뇌 절취를 수행하였다. 또, 4% 파라포름알데히드를 외부 고정하였다. 15%와 30% 경사의 수크로오스로 탈수하여, 동결 섹션을 얻었다.
DAPI(4',6-Diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride) 용액으로 핵을 염색하고, 광표백 방지제를 이용하여 봉입하였다. 공초점 레이저 현미경으로 손상부위(뇌조직 결손부)에서의 GFP 양성세포의 집적을 평가하였다.
결과: 투여 후, 2주일 및 6주일 후의 GFP 양성세포 집적을 정성적으로 나타내었다. 2주일 후(대조군; 도 23d, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획; 도 23e) 및 6주일 후(대조군; 도 23f, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획; 도 23g) 모두 콘트롤군에 비해 치료군의 손상부위에 GFP 양성세포의 집적이 높은 경향이 있었다.
고찰: 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획 투여에 의해, 골수 유래 세포가 뇌조직 결손부위에 집적하여 신경세포의 형태를 나타내었다. 골수 유래 중간엽 줄기세포는 신경세포로도 분화하는 것이 알려져 있고, 본 결과로부터, 피부 추출액 헤파린 칼럼 정제 분획에 의해 뇌손상부위에서의 신경계세포의 재생을 유도할 수 있는 것이 명백해졌다. 또한, 이는 뇌허혈성 질환이나 뇌타박상에서의 뇌조직 장해부위에서의 신경재생에도 응용 가능하다.
본 발명에 의해, 골수 유래 세포(예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포. 이하동일) 유도활성을 가지는 세포 추출액, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 헤파린 결합 분획 및 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 음이온 교환체 결합 분획이 제공되었다. 또한, 세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3을 함유하는 골수 유래 세포 유도제나 조직재생 촉진제가 제공되었다. 세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3을 골수유래세포 동원 의약으로서 개발함으로써, 난치성 손상 조직의 기능적 재생을 촉진하는 새로운 재생 의료가 가능하게 된다. HMGB1, HMGB2, HMGB3은 혈류 저하에 의해 저산소상태에 빠져 괴사방향에 있는 조직세포에서 방출되고, 그 국소에 골수 유래 세포 혹은 그것을 유래로 하는 여러가지 세포를 동원하는 작용을 가진다. 동원된 골수 유래 세포는 각각의 조직에서 필요로 하는 세포 계보로 분화함으로써, 관류저하·괴사에 의해 상실한 기능의 회복, 이른바 기능적 조직재생을 촉진한다. 예를 들어, 피부의 혈류장해에 의해 생긴 난치성 피부궤양부에 세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2 또는 HMGB3을 투여함으로써, 궤양면에 골수 유래 세포를 동원하고, 동원된 세포가 혈관 내피세포로 분화하면 국소의 혈류가 개선된다. 동시에 섬유아세포, 신경세포, 모낭세포, 또 표피세포로 분화함으로써, 섬유성 반흔치유가 아니라 필요한 피부 부속기관을 구비한 기능적 피부재생이 유도, 촉진된다. 심근경색이나 뇌경색 등 기타 장기의 관류저하성 괴사상태에서도, 그 기능적 조직재생 유도제로서 세포 추출액, 헤파린 결합 분획, 음이온 교환체 결합 분획, HMGB1, HMGB2, HMGB3이 마찬가지로 유효하다고 기대할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> GENOMIX CO., LTD. <120> Pharmaceuticals that Promote Functional Regeneration of Damaged Tissues <130> G6-A0601P <150> JP 2006-293582 <151> 2006-10-30 <160> 18 <170> PatentIn version 3.4 <210> 1 <211> 215 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 2 <211> 648 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt catcatatgc attttttgtg 60 caaacttgtc gggaggagca taagaagaag cacccagatg cttcagtcaa cttctcagag 120 ttttctaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagagaa aggaaaattt 180 gaagatatgg caaaagcgga caaggcccgt tatgaaagag aaatgaaaac ctatatccct 240 cccaaagggg agacaaaaaa gaagttcaag gatcccaatg cacccaagag gcctccttcg 300 gccttcttcc tcttctgctc tgagtatcgc ccaaaaatca aaggagaaca tcctggcctg 360 tccattggtg atgttgcgaa gaaactggga gagatgtgga ataacactgc tgcagatgac 420 aagcagcctt atgaaaagaa ggctgcgaag ctgaaggaaa aatacgaaaa ggatattgct 480 gcatatcgag ctaaaggaaa gcctgatgca gcaaaaaagg gagttgtcaa ggctgaaaaa 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaggaagat gaggaagatg aagaggatga ggaggaggag 600 gaagatgaag aagatgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648 <210> 3 <211> 215 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 4 <211> 648 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 4 atgggcaaag gagatcctaa aaagccgaga ggcaaaatgt cctcatatgc attctttgtg 60 caaacttgcc gggaggagca caagaagaag cacccggatg cttctgtcaa cttctcagag 120 ttctccaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagaaaa ggggaaattt 180 gaagatatgg caaaggctga caaggctcgt tatgaaagag aaatgaaaac ctacatcccc 240 cccaaagggg agaccaaaaa gaagttcaag gaccccaatg cacccaagag gcctccttcg 300 gccttcttct tgttctgttc tgagtaccgc cccaaaatca aaggcgagca tcctggctta 360 tccattggtg atgttgcaaa gaaactagga gagatgtgga acaacactgc agcagatgac 420 aagcagccct atgagaagaa agctgccaag ctgaaggaga agtatgagaa ggatattgct 480 gcctacagag ctaaaggaaa acctgatgca gcgaaaaagg gggtggtcaa ggctgaaaag 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaagatgat gaggaggatg aagaggatga ggaagaggag 600 gaagaagagg aagacgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 5 Met Gly Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ala Ser Val Asn Phe Ser Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Gly Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Ala Arg Tyr Glu Arg Glu Met Lys Thr Tyr Ile Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Glu Thr Lys Lys Lys Phe Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Tyr Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Asn Asn Thr Ala Ala Asp Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Lys Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Pro Asp Ala Ala Lys Lys Gly Val Val 165 170 175 Lys Ala Glu Lys Ser Lys Lys Lys Lys Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu 180 185 190 Asp Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu Glu Asp Asp Asp Asp Glu 210 215 <210> 6 <211> 648 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 6 atgggcaaag gagatcctaa gaagccgaga ggcaaaatgt cctcatatgc attctttgtg 60 caaacctgcc gggaggagca caagaagaag cacccggatg cttctgtcaa cttctcagag 120 ttctccaaga agtgctcaga gaggtggaag accatgtctg ctaaagaaaa ggggaaattt 180 gaagatatgg caaaggctga caaggctcgt tatgaaagag aaatgaaaac ctacatcccc 240 cccaaagggg agaccaaaaa gaagttcaag gaccccaatg cccccaagag gcctccttcg 300 gccttcttct tgttctgttc tgagtaccgc ccaaaaatca aaggcgagca tcctggctta 360 tccattggtg atgttgcgaa gaaactagga gagatgtgga acaacactgc tgcggatgac 420 aagcagccct atgaaaagaa ggccgccaag ctgaaggaga agtatgagaa ggatattgct 480 gcctacagag ctaaaggaaa acctgatgca gcgaaaaagg gggtggtcaa ggctgagaag 540 agcaagaaaa agaaggaaga ggaagacgac gaggaggatg aagaggatga ggaagaggag 600 gaagaggagg aagacgaaga tgaagaagaa gatgatgatg atgaataa 648 <210> 7 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Met Ala 50 55 60 Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175 Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu 195 200 205 Glu <210> 8 <211> 630 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atgggtaaag gagaccccaa caagccgcgg ggcaaaatgt cctcgtacgc cttcttcgtg 60 cagacctgcc gggaagagca caagaagaaa cacccggact cttccgtcaa tttcgcggaa 120 ttctccaaga agtgttcgga gagatggaag accatgtctg caaaggagaa gtcgaagttt 180 gaagatatgg caaaaagtga caaagctcgc tatgacaggg agatgaaaaa ttacgttcct 240 cccaaaggtg ataagaaggg gaagaaaaag gaccccaatg ctcctaaaag gccaccatct 300 gccttcttcc tgttttgctc tgaacatcgc ccaaagatca aaagtgaaca ccctggccta 360 tccattgggg atactgcaaa gaaattgggt gaaatgtggt ctgagcagtc agccaaagat 420 aaacaaccat atgaacagaa agcagctaag ctaaaggaga aatatgaaaa ggatattgct 480 gcatatcgtg ccaagggcaa aagtgaagca ggaaagaagg gccctggcag gccaacaggc 540 tcaaagaaga agaacgaacc agaagatgag gaggaggagg aggaagaaga agatgaagat 600 gaggaggaag aggatgaaga tgaagaataa 630 <210> 9 <211> 210 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Leu Ala 50 55 60 Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Asn Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Ile Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Ala Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175 Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Glu Glu Glu Asp 195 200 205 Glu Glu 210 <210> 10 <211> 633 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 10 atgggcaagg gtgaccccaa caagccgcgg ggcaaaatgt cctcgtacgc cttcttcgtg 60 cagacctgcc gcgaggagca caagaagaag catcccgact cgtcggtgaa cttcgccgag 120 ttctccaaga aatgctccga gagatggaag accatgtctg caaaggaaaa gtccaagttt 180 gaagatttgg ccaagagcga caaagctcgt tatgacaggg agatgaagaa ctatgttcct 240 cccaaagggg ataagaaagg aaagaaaaaa gaccccaatg ctccgaagag accaccgtct 300 gccttcttcc tgttttgctc tgaaaatcgc ccaaagatca aaattgaaca cccaggcctg 360 tctattggag atactgcgaa gaaactgggt gagatgtggt ctgagcaatc tgccaaagat 420 aaacaaccgt atgagcagaa agcagctaaa ctaaaggaga agtatgaaaa ggatattgct 480 gcataccgtg ccaagggcaa aagtgaagca ggaaagaagg gtcctggtag gccaacaggc 540 tcaaagaaga agaacgaacc agaagatgag gaggaggaag aagaggagga agaggaggaa 600 gatgacgagg aagaagagga ggatgaagaa taa 633 <210> 11 <211> 210 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 11 Met Gly Lys Gly Asp Pro Asn Lys Pro Arg Gly Lys Met Ser Ser Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys His Pro 20 25 30 Asp Ser Ser Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ala Lys Glu Lys Ser Lys Phe Glu Asp Leu Ala 50 55 60 Lys Ser Asp Lys Ala Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asn Tyr Val Pro 65 70 75 80 Pro Lys Gly Asp Lys Lys Gly Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys 85 90 95 Arg Pro Pro Ser Ala Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu His Arg Pro Lys 100 105 110 Ile Lys Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys Lys 115 120 125 Leu Gly Glu Met Trp Ser Glu Gln Ser Ala Lys Asp Lys Gln Pro Tyr 130 135 140 Glu Gln Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Tyr Arg Ala Lys Gly Lys Ser Glu Val Gly Lys Lys Gly Pro Gly 165 170 175 Arg Pro Thr Gly Ser Lys Lys Lys Asn Glu Pro Glu Asp Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Asp Asp Glu Asp Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp 195 200 205 Glu Glu 210 <210> 12 <211> 633 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 12 atgggcaagg gggaccccaa caagccgcgg ggcaagatgt cctcgtacgc cttcttcgtg 60 cagacctgcc gggaggagca caagaagaag catcccgact cgtcggtcaa cttcgccgag 120 ttctcgaaga aatgttcgga gagatggaag accatgtctg ccaaggaaaa gtcgaagttt 180 gaggatttgg ccaagagcga caaagctcgt tatgacaggg agatgaagaa ctatgttcct 240 cccaaaggtg ataagaaagg aaagaaaaaa gatccaaatg ctcccaagag accaccgtct 300 gccttcttcc tgttttgctc tgaacatcgc ccaaagatca aaagtgaaca ccccggcctg 360 tctattggag atactgcaaa gaaactgggg gagatgtggt ctgagcaatc tgccaaagat 420 aaacaaccgt atgagcagaa agcagctaaa ctaaaggaga agtatgaaaa ggatattgct 480 gcataccgtg ccaagggcaa aagtgaagta ggaaagaagg gtcctggtag gccaacaggc 540 tcaaagaaga agaatgaacc agaagatgag gaagaggagg aggaggaaga agatgatgaa 600 gatgaagagg aggaagatga ggatgaagaa taa 633 <210> 13 <211> 200 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Met Ala Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Lys Gly Lys Met Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys Asn Pro 20 25 30 Glu Val Pro Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Gly Lys Glu Lys Ser Lys Phe Asp Glu Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Val Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asp Tyr Gly Pro 65 70 75 80 Ala Lys Gly Gly Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro 85 90 95 Pro Ser Gly Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys 100 105 110 Ser Thr Asn Pro Gly Ile Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly 115 120 125 Glu Met Trp Asn Asn Leu Asn Asp Ser Glu Lys Gln Pro Tyr Ile Thr 130 135 140 Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Val Ala Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Lys Gly Lys Phe Asp Gly Ala Lys Gly Pro Ala Lys Val Ala 165 170 175 Arg Lys Lys Val Glu Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu 195 200 <210> 14 <211> 603 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 atggctaaag gtgaccccaa gaaaccaaag ggcaagatgt ccgcttatgc cttctttgtg 60 cagacatgca gagaagaaca taagaagaaa aacccagagg tccctgtcaa ttttgcggaa 120 ttttccaaga agtgctctga gaggtggaag acgatgtccg ggaaagagaa atctaaattt 180 gatgaaatgg caaaggcaga taaagtgcgc tatgatcggg aaatgaagga ttatggacca 240 gctaagggag gcaagaagaa gaaggatcct aatgctccca aaaggccacc gtctggattc 300 ttcctgttct gttcagaatt ccgccccaag atcaaatcca caaaccccgg catctctatt 360 ggagacgtgg caaaaaagct gggtgagatg tggaataatt taaatgacag tgaaaagcag 420 ccttacatca ctaaggcggc aaagctgaag gagaagtatg agaaggatgt tgctgactat 480 aagtcgaaag gaaagtttga tggtgcaaag ggtcctgcta aagttgcccg gaaaaaggtg 540 gaagaggaag atgaagaaga ggaggaggaa gaagaggagg aggaggagga ggaggatgaa 600 taa 603 <210> 15 <211> 200 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Met Ala Lys Gly Asp Pro Lys Lys Pro Lys Gly Lys Met Ser Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Phe Val Gln Thr Cys Arg Glu Glu His Lys Lys Lys Asn Pro 20 25 30 Glu Val Pro Val Asn Phe Ala Glu Phe Ser Lys Lys Cys Ser Glu Arg 35 40 45 Trp Lys Thr Met Ser Ser Lys Glu Lys Ser Lys Phe Asp Glu Met Ala 50 55 60 Lys Ala Asp Lys Val Arg Tyr Asp Arg Glu Met Lys Asp Tyr Gly Pro 65 70 75 80 Ala Lys Gly Gly Lys Lys Lys Lys Asp Pro Asn Ala Pro Lys Arg Pro 85 90 95 Pro Ser Gly Phe Phe Leu Phe Cys Ser Glu Phe Arg Pro Lys Ile Lys 100 105 110 Ser Thr Asn Pro Gly Ile Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys Lys Leu Gly 115 120 125 Glu Met Trp Asn Asn Leu Ser Asp Asn Glu Lys Gln Pro Tyr Val Thr 130 135 140 Lys Ala Ala Lys Leu Lys Glu Lys Tyr Glu Lys Asp Val Ala Asp Tyr 145 150 155 160 Lys Ser Lys Gly Lys Phe Asp Gly Ala Lys Gly Pro Ala Lys Val Ala 165 170 175 Arg Lys Lys Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu 180 185 190 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu 195 200 <210> 16 <211> 603 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 16 atggctaaag gtgaccccaa gaaaccaaag ggcaagatgt ctgcttatgc cttctttgtg 60 cagacatgca gggaagaaca taagaagaaa aacccagagg ttcccgtcaa ttttgctgag 120 ttctccaaga agtgctcgga gaggtggaag accatgtcta gcaaagagaa atcaaagttt 180 gatgaaatgg caaaggcaga taaagtccga tatgatcggg agatgaaaga ttatggacca 240 gctaaaggag gcaagaagaa gaaggaccca aatgccccca aaagacctcc gtctggattt 300 ttcttattct gctctgaatt ccgccccaag atcaaatcca caaaccctgg catctccatt 360 ggagatgtgg caaaaaagct gggtgagatg tggaataact taagtgacaa tgaaaagcag 420 ccttatgtca ccaaggcagc aaagctgaag gagaagtatg agaaggatgt tgctgactat 480 aagtctaaag ggaagtttga tggtgccaag ggtcctgcta aagttgcccg gaaaaaggtg 540 gaagaagagg aagaggagga ggaagaggaa gaagaggagg aggaagagga ggaagatgaa 600 taa 603 <210> 17 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized nucleotide sequence <400> 17 atgcagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctgt gggttccagg ttccactggt 60 gac 63 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> An artificially synthesized peptide sequence <400> 18 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Lys 1 5

Claims (25)

  1. 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 함유하는 골수 유래 세포의 유도제;
    (a)HMGB1단백질
    (b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
    (c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (d)HMGB2단백질
    (e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
    (f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (g)HMGB3단백질
    (h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
    (i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 유도제.
  3. 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 함유하는 조직재생 촉진제;
    (a)HMGB1단백질
    (b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
    (c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (d)HMGB2단백질
    (e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
    (f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (g)HMGB3단백질
    (h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
    (i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
  4. 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 함유하는 조직재생 촉진용 키트;
    (a)HMGB1단백질
    (b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
    (c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (d)HMGB2단백질
    (e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
    (f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (g)HMGB3단백질
    (h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
    (i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
  5. 세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 방법으로 제조되는 세포의 추출액으로서, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 추출액.
  6. 세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 세포의 추출액의 제조방법.
  7. 하기 공정을 포함하는 방법으로 제조되는 헤파린 결합 분획으로서, 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 분획;
    (a)세포를 용매에 침지하는 공정,
    (b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
    (c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
  8. 하기 공정을 포함하는 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 헤파린 결합 분획의 제조방법;
    (a)세포를 용매에 침지하는 공정,
    (b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
    (c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
  9. 제5항에 따른 추출액 또는 제6항에 따른 방법에 의해 제조된 추출액 또는 제7항에 따른 분획 또는 제8항에 따른 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 골수 유래 세포의 유도제.
  10. 제9항에 있어서,
    골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 유도제.
  11. 제5항에 따른 추출액 또는 제6항에 따른 방법에 의해 제조된 추출액 또는 제7항에 따른 분획 또는 제8항에 따른 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 조직재생 촉진제.
  12. 제5항에 따른 추출액 또는 제6항에 따른 방법에 의해 제조된 추출액 또는 제7항에 따른 분획 또는 제8항에 따른 방법에 의해 제조된 분획을 함유하는 조직재생 촉진용 키트.
  13. 하기 공정을 포함하는, 세포의 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는지의 여부를 평가하는 방법으로서, 공정(b)에서의 피험세포의 유도활성이 대조군과 비교하여 높은 경우에 세포의 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함된다고 판정하는 방법;
    (a)세포의 추출액을 제조하는 공정 및
    (b)공정(a)에서 제조된 추출액에 의한 피험세포의 유도활성을 측정하는 공정.
  14. 하기 공정을 포함하는, 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는 세포의 추출액을 스크리닝하는 방법;
    (a)복수의 추출액에 대해, 제13항에 따른 방법으로 상기 추출액에 피험세포를 유도하는 인자가 포함되는지의 여부를 평가하는 공정, 및
    (b)공정(a)에서 피험세포를 유도하는 인자가 포함된다고 평가된 추출액을 선택하는 공정.
  15. 제13항 또는 제14항에 따른 방법에 의해, 피험세포를 유도하는 인자를 포함한다고 판정된 추출액으로부터 피험세포의 유도활성을 지표로 피험세포를 유도하는 인자를 정제하는 공정을 포함하는, 피험세포를 유도하는 인자의 동정방법.
  16. 골수 유래 세포의 유도제의 제조를 위해 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 사용하는 방법;
    (a)HMGB1단백질
    (b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
    (c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (d)HMGB2단백질
    (e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
    (f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (g)HMGB3단백질
    (h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
    (i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
  17. 골수 유래 세포 유도제의 제조를 위해,
    세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 세포의 추출액, 또는 하기 공정을 포함하는 방법으로 제조되는, 골수 유래 세포-결합활성을 가지는 헤파린 결합 분획을 사용하는 방법;
    (a)세포를 용매에 침지하는 공정,
    (b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
    (c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
  18. 골수 유래 세포의 이동 촉진제의 제조를 위해 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 사용하는 방법;
    (a)HMGB1단백질
    (b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
    (c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (d)HMGB2단백질
    (e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
    (f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (g)HMGB3단백질
    (h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
    (i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
  19. 골수 유래 세포의 이동 촉진제의 제조를 위해,
    세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 세포의 추출액, 또는 하기 공정을 포함하는 방법으로 제조되는, 골수 유래 세포-결합활성을 가지는 헤파린 결합 분획을 사용하는 방법;
    (a)세포를 용매에 침지하는 공정,
    (b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
    (c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
  20. 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 방법.
  21. 조직 재생 촉진제의 제조를 위해 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 사용하는 방법;
    (a)HMGB1단백질
    (b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
    (c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (d)HMGB2단백질
    (e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
    (f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (g)HMGB3단백질
    (h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
    (i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
  22. 조직 재생 촉진제의 제조를 위해,
    세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 세포의 추출액, 또는 하기 공정을 포함하는 방법으로 제조되는, 골수 유래 세포-결합활성을 가지는 헤파린 결합 분획을 사용하는 방법;
    (a)세포를 용매에 침지하는 공정,
    (b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
    (c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
  23. 하기 (a) 내지 (i)에서 선택된 성분을 함유하는 골수 유래 세포의 이동 촉진제;
    (a)HMGB1단백질
    (b)HMGB1단백질을 분비하는 세포
    (c)HMGB1단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (d)HMGB2단백질
    (e)HMGB2단백질을 분비하는 세포
    (f)HMGB2단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터
    (g)HMGB3단백질
    (h)HMGB3단백질을 분비하는 세포
    (i)HMGB3단백질을 코드하는 DNA가 삽입된 벡터.
  24. 세포를 용매에 침지하는 공정을 포함하는 방법에 의해 제조된 골수 유래 세포 유도활성을 가지는 세포의 추출액, 또는 하기 공정을 포함하는 방법으로 제조되는, 골수 유래 세포-결합활성을 가지는 헤파린 결합 분획
    을 포함하는 골수 유래 세포의 이동 촉진제;
    (a)세포를 용매에 침지하는 공정,
    (b)공정(a)에서 얻어지는 추출액을 고정화 헤파린에 접촉시키는 공정 및
    (c)고정화 헤파린으로부터 헤파린 결합 분획을 용출하는 공정.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    골수 유래 세포가 골수 유래 중간엽 줄기세포인 이동 촉진제.
KR1020147023740A 2006-10-30 2007-10-30 손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약 KR20140115373A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2006-293582 2006-10-30
JP2006293582 2006-10-30
PCT/JP2007/071133 WO2008053892A1 (fr) 2006-10-30 2007-10-30 Produit pharmaceutique servant à favoriser la régénération fonctionnelle d'un tissu endommagé

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087018560A Division KR20090078304A (ko) 2006-10-30 2007-10-30 손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20140115373A true KR20140115373A (ko) 2014-09-30

Family

ID=39344234

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147023740A KR20140115373A (ko) 2006-10-30 2007-10-30 손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약
KR1020087018560A KR20090078304A (ko) 2006-10-30 2007-10-30 손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020087018560A KR20090078304A (ko) 2006-10-30 2007-10-30 손상 조직의 기능적 재생 촉진용 의약

Country Status (13)

Country Link
US (2) US20090202500A1 (ko)
EP (1) EP2055308B1 (ko)
JP (2) JP5308161B2 (ko)
KR (2) KR20140115373A (ko)
CN (1) CN101374538A (ko)
AU (1) AU2007315073A1 (ko)
CA (1) CA2636788A1 (ko)
DK (1) DK2055308T3 (ko)
ES (1) ES2629086T3 (ko)
HU (1) HUE035043T2 (ko)
PL (1) PL2055308T3 (ko)
PT (1) PT2055308T (ko)
WO (1) WO2008053892A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018004171A1 (ko) * 2016-06-29 2018-01-04 (주)아모레퍼시픽 지방세포 분화 촉진용 조성물 및 지방세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법
KR20180002502A (ko) * 2016-06-29 2018-01-08 (주)아모레퍼시픽 지방세포 분화 촉진용 조성물 및 지방세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5660889B2 (ja) * 2008-04-30 2015-01-28 株式会社ジェノミックス 末梢循環への骨髄由来多能性幹細胞動員薬
US20110097309A1 (en) * 2008-04-30 2011-04-28 Katsuto Tamai Pharmaceutical Agent for Promoting the Functional Regeneration of Damaged Tissue
KR20160070169A (ko) * 2008-04-30 2016-06-17 가부시키가이샤 제노믹스 생체내 기능적 세포의 고효율 채취법
US11191786B2 (en) 2009-10-28 2021-12-07 StemRIM Inc. Agents for promoting tissue regeneration by recruiting bone marrow mesenchymal stem cells and/or pluripotent stem cells into blood
JP5706081B2 (ja) * 2009-10-28 2015-04-22 株式会社ジェノミックス 埋め込み式生体内物質採取デバイス
JP5852773B2 (ja) * 2010-06-01 2016-02-03 ピアス株式会社 骨髄間葉系幹細胞の誘引剤の製造方法、骨髄間葉系幹細胞の誘引方法、及び、骨髄間葉系幹細胞の誘引剤を製造するための使用
DK3358011T3 (da) * 2011-04-26 2020-05-11 Univ Osaka Peptid til inducering af regenerering af væv og anvendelse deraf
CN102864123B (zh) * 2011-07-06 2015-04-22 北京大学第三医院 一种外周血间充质干细胞的获得方法及其应用
PL2913058T3 (pl) 2012-10-25 2018-04-30 Genomix Co., Ltd. Nowy sposób leczenia zawału mięśnia sercowego przy użyciu fragmentu HMGB1
WO2014065348A1 (ja) * 2012-10-25 2014-05-01 株式会社ジェノミックス Hmgb1断片を利用した脊髄の損傷に対する新規治療法
CN103316378B (zh) * 2013-06-27 2014-07-16 重庆大学 一种hmgb 1修饰的骨组织工程支架材料及其制备方法
JP6288672B2 (ja) * 2014-03-28 2018-03-07 株式会社巴川製紙所 異方性光学フィルム
JP6452107B2 (ja) * 2014-09-05 2019-01-16 国立大学法人 東京大学 糖尿病性皮膚潰瘍治療のための多能性幹細胞
JP6941417B2 (ja) * 2016-02-04 2021-09-29 雪印メグミルク株式会社 軟骨機能改善剤
CA3051825A1 (en) 2017-01-27 2018-08-02 StemRIM Inc. Therapeutic agent for cardiomyopathy, old myocardial infarction and chronic heart failure
MX2019012738A (es) * 2017-04-25 2020-02-07 Shionogi & Co Peptido para inducir la regeneracion de tejido, y uso del mismo.
CN106957821B (zh) * 2017-04-26 2020-04-21 南京医科大学第二附属医院 一种调控间充质干细胞定向分化的方法
JPWO2019017355A1 (ja) * 2017-07-18 2020-05-28 株式会社 資生堂 間葉系幹細胞誘引剤
JPWO2019107530A1 (ja) 2017-12-01 2020-11-26 株式会社ステムリム 炎症性腸疾患の治療薬
JPWO2019107566A1 (ja) 2017-12-01 2020-12-03 株式会社ステムリム 外胚葉性間葉系幹細胞およびその製造方法
CN113194978B (zh) 2018-10-05 2024-03-08 斯特姆里姆有限公司 具有间充质干细胞的动员活性的肽
WO2020071519A1 (ja) 2018-10-05 2020-04-09 株式会社ステムリム 間葉系幹細胞の動員に基づく疾患治療薬
JP2022506639A (ja) * 2018-11-04 2022-01-17 フィジーン、エルエルシー 脳卒中、慢性外傷性脳症、及び外傷性脳損傷を含む脳性低酸素症の治療
CN109957015A (zh) * 2019-04-01 2019-07-02 中国人民解放军海军军医大学国家肝癌科学中心 一种hmgb1封闭性抗体的制备方法及其应用
JPWO2021020509A1 (ko) * 2019-07-31 2021-02-04
CA3157785A1 (en) 2019-11-12 2021-05-20 Jagdeep Nanchahal Polypeptides related to hmgb1 useful for promoting tissue regeneration, compositions comprising same, and uses thereof
KR102580518B1 (ko) * 2020-12-07 2023-09-21 사회복지법인 삼성생명공익재단 자가유지능이 향상된 중간엽줄기세포를 선별하는 방법 및 그에 의해 선별된 중간엽줄기세포
AU2022276188A1 (en) 2021-05-19 2023-12-14 Oxford University Innovation Limited Polypeptides related to hmgb1 useful for promoting tissue regeneration, compositions comprising same, and uses thereof

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5658894A (en) * 1989-04-23 1997-08-19 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for inhibiting restenosis
JP3018313B2 (ja) * 1996-02-23 2000-03-13 雪印乳業株式会社 骨形成促進及び骨吸収防止剤
ATE440602T1 (de) * 1999-07-28 2009-09-15 Univ Leland Stanford Junior Nicotinrezeptoragonisten in stammzellen und vorlaüferzellinduktion
JP2004500095A (ja) * 2000-02-24 2004-01-08 エクサイト　セラピーズ，　インコーポレイテッド 細胞の同時の刺激および濃縮
US20040191246A1 (en) * 2003-02-26 2004-09-30 Connelly Patrick R. Process for in vivo treatment of specific biological targets in bodily fluid
DE10121254A1 (de) * 2001-04-30 2002-11-07 Switch Biotech Ag MRP8/MRP14 Heterodimers oder seiner Einzelkomponenten alleine oder in Kombination zur Behandlung und/oder Prävention von Hauterkrankungen, Wunden und/oder Wundheilungsstörungen, die durch eine verringerte Menge an MRP8/MRP14 Heterodimeren gekennzeichnet sind
US7220723B2 (en) * 2001-05-15 2007-05-22 The Feinstein Institute For Medical Research Inhibitors of the interaction between HMGB polypeptides and toll-like receptor 2 as anti-inflammatory agents
ITMI20011986A1 (it) * 2001-09-25 2003-03-25 San Raffaele Centro Fond Metodo e composizione per l'attivazione di cellule presentanti l'antigene
CA2467557A1 (en) * 2001-11-19 2003-05-30 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Agent which mobilizes multipotential stem cells from tissues to peripheral blood
WO2004004763A2 (en) * 2002-07-03 2004-01-15 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Use of hmgb1 in the treatment of tissue damage and/or to promote tissue repair
GB0226251D0 (en) * 2002-11-11 2002-12-18 San Raffaele Centro Fond Acetylated protein
JP2006517537A (ja) * 2003-01-03 2006-07-27 アルケド バイオテック ゲーエムベーハー Ｄｎａ結合タンパク質の使用
ATE411038T1 (de) * 2003-03-28 2008-10-15 Univ Laval S100 protein als aktivator neutrophiler zellen zur verminderung der neutropenie bei der krebsbehandlung
WO2005025604A2 (en) * 2003-09-10 2005-03-24 The General Hospital Corporation Use of hmgb and hmgb fragments to decrease specific immune response
CA2574548A1 (en) * 2004-07-20 2006-01-26 Fondazione Centro San Raffaele Del Monte Tabor Use of hmgb1 for wound healing
KR100593397B1 (ko) * 2004-10-27 2006-06-28 한국원자력연구소 중배엽 줄기세포 및/또는 ｐ 물질을 함유하는 상처 치유또는 상처 치유 촉진제, 또는 세포 치료제
WO2007015546A1 (ja) * 2005-08-04 2007-02-08 Genomix Co., Ltd 間葉系幹細胞誘導剤及び組織再生促進剤並びに間葉系幹細胞の調製方法
WO2007031100A1 (en) * 2005-09-14 2007-03-22 Ostini, Marco Active immunotherapy of life-threatening systemic inflammation
WO2007130725A2 (en) * 2006-02-06 2007-11-15 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Use of hmgb1 for protection against ischemia reperfusion injury
KR20160070169A (ko) * 2008-04-30 2016-06-17 가부시키가이샤 제노믹스 생체내 기능적 세포의 고효율 채취법

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018004171A1 (ko) * 2016-06-29 2018-01-04 (주)아모레퍼시픽 지방세포 분화 촉진용 조성물 및 지방세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법
KR20180002502A (ko) * 2016-06-29 2018-01-08 (주)아모레퍼시픽 지방세포 분화 촉진용 조성물 및 지방세포 분화 촉진 물질의 스크리닝 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CA2636788A1 (en) 2008-05-08
US20090202500A1 (en) 2009-08-13
US20240050460A1 (en) 2024-02-15
ES2629086T3 (es) 2017-08-07
CN101374538A (zh) 2009-02-25
EP2055308B1 (en) 2017-05-10
PL2055308T3 (pl) 2017-11-30
JP2013227330A (ja) 2013-11-07
KR20090078304A (ko) 2009-07-17
JP5308161B2 (ja) 2013-10-09
AU2007315073A1 (en) 2008-05-08
EP2055308A4 (en) 2010-10-27
HUE035043T2 (en) 2018-05-02
JPWO2008053892A1 (ja) 2010-02-25
PT2055308T (pt) 2017-07-05
DK2055308T3 (en) 2017-07-17
EP2055308A1 (en) 2009-05-06
WO2008053892A1 (fr) 2008-05-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240050460A1 (en) Pharmaceuticals That Promote Functional Regeneration of Damaged Tissues
KR101728379B1 (ko) 말초 순환으로의 골수 유래 다능성 줄기세포 동원약
JP5960735B2 (ja) 損傷組織の機能的再生促進医薬
KR20120135190A (ko) 골수 간엽계 및/또는 다능성 줄기세포의 혈중 동원(動員)에 의한 조직 재생 촉진제
KR20110017371A (ko) 생체내 기능적 세포의 고효율 채취법
AU2014200688C1 (en) Pharmaceuticals that promote functional regeneration of damaged tissues

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application