CN105079792A - Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用 - Google Patents
Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105079792A CN105079792A CN201510216007.1A CN201510216007A CN105079792A CN 105079792 A CN105079792 A CN 105079792A CN 201510216007 A CN201510216007 A CN 201510216007A CN 105079792 A CN105079792 A CN 105079792A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- msc
- ifn
- tnf
- auf1
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108050003558 Interleukin-17 Proteins 0.000 title claims abstract description 346
- 102000013691 Interleukin-17 Human genes 0.000 title claims abstract description 344
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 title abstract description 8
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 title abstract description 7
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 title abstract 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 109
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 86
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 claims abstract description 52
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 claims abstract description 33
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 15
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims abstract description 14
- 239000000556 agonist Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 147
- 102000036541 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein D0 Human genes 0.000 claims description 75
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 68
- 108091021225 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein D0 Proteins 0.000 claims description 60
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 51
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 43
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 34
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 23
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 16
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 5
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 claims description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 claims description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 4
- 229940123083 Interleukin 17 antagonist Drugs 0.000 claims description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 2
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 2
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 2
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 abstract description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 abstract description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 4
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 abstract description 3
- 102100033985 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 Human genes 0.000 abstract 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 271
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 207
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 152
- 102100029438 Nitric oxide synthase, inducible Human genes 0.000 description 71
- 101710089543 Nitric oxide synthase, inducible Proteins 0.000 description 71
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 53
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 53
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 45
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 33
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 32
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 27
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 25
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 25
- 238000011160 research Methods 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 20
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 17
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 17
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 17
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 17
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 16
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 15
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 14
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 13
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 12
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 11
- 102100035018 Interleukin-17 receptor A Human genes 0.000 description 11
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 11
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 11
- 230000008859 change Effects 0.000 description 11
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 11
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 11
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 11
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 11
- 101710186083 Interleukin-17 receptor A Proteins 0.000 description 10
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 10
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 10
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 9
- 102100025248 C-X-C motif chemokine 10 Human genes 0.000 description 9
- 101000858088 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 10 Proteins 0.000 description 9
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 9
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 9
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 8
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 8
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 8
- 102100021943 C-C motif chemokine 2 Human genes 0.000 description 7
- 102100032367 C-C motif chemokine 5 Human genes 0.000 description 7
- 102100036170 C-X-C motif chemokine 9 Human genes 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 101000897480 Homo sapiens C-C motif chemokine 2 Proteins 0.000 description 7
- 101000797762 Homo sapiens C-C motif chemokine 5 Proteins 0.000 description 7
- 101000947172 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 9 Proteins 0.000 description 7
- 102100035012 Interleukin-17 receptor C Human genes 0.000 description 7
- 101710186068 Interleukin-17 receptor C Proteins 0.000 description 7
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 7
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 7
- XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N dinoprostone Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@H]1[C@H](O)CC(=O)[C@@H]1C\C=C/CCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-ARSRFYASSA-N 0.000 description 7
- 229960002986 dinoprostone Drugs 0.000 description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 7
- XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N prostaglandin E2 Natural products CCCCCC(O)C=CC1C(O)CC(=O)C1CC=CCCCC(O)=O XEYBRNLFEZDVAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 108010074708 B7-H1 Antigen Proteins 0.000 description 6
- LFPHMXIOQBBTSS-UHFFFAOYSA-N Galetin Natural products C1=CC(O)=CC=C1C1=C(O)C(=O)C2=C(O)C(O)=C(O)C=C2O1 LFPHMXIOQBBTSS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010018924 Heme Oxygenase-1 Proteins 0.000 description 6
- 102100028006 Heme oxygenase 1 Human genes 0.000 description 6
- 101000847156 Homo sapiens Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein Proteins 0.000 description 6
- 102100024216 Programmed cell death 1 ligand 1 Human genes 0.000 description 6
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 6
- 102100032807 Tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein Human genes 0.000 description 6
- 210000003074 dental pulp Anatomy 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 108020004201 indoleamine 2,3-dioxygenase Proteins 0.000 description 6
- 102000006639 indoleamine 2,3-dioxygenase Human genes 0.000 description 6
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 6
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 6
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000007781 pre-processing Methods 0.000 description 5
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 5
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 5
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 5
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 4
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 4
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 4
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 4
- 206010019668 Hepatic fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 108010017525 Interleukin-17 Receptors Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 4
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 238000000749 co-immunoprecipitation Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000004068 intracellular signaling Effects 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N tetrachloromethane Chemical compound ClC(Cl)(Cl)Cl VZGDMQKNWNREIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 3
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- -1 GM-CSF Proteins 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 3
- 102000019223 Interleukin-1 receptor Human genes 0.000 description 3
- 108050006617 Interleukin-1 receptor Proteins 0.000 description 3
- 102000004554 Interleukin-17 Receptors Human genes 0.000 description 3
- NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N N(omega)-methyl-L-arginine Chemical compound CN=C(N)NCCC[C@H](N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 102000003945 NF-kappa B Human genes 0.000 description 3
- 108010057466 NF-kappa B Proteins 0.000 description 3
- NTNWOCRCBQPEKQ-UHFFFAOYSA-N NG-mono-methyl-L-arginine Natural products CN=C(N)NCCCC(N)C(O)=O NTNWOCRCBQPEKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 3
- 210000000068 Th17 cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000002689 Toll-like receptor Human genes 0.000 description 3
- 108020000411 Toll-like receptor Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000007783 downstream signaling Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 2
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 101710088172 HTH-type transcriptional regulator RipA Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000998146 Homo sapiens Interleukin-17A Proteins 0.000 description 2
- 102100020881 Interleukin-1 alpha Human genes 0.000 description 2
- 102100033461 Interleukin-17A Human genes 0.000 description 2
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 2
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 2
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102000003714 TNF receptor-associated factor 6 Human genes 0.000 description 2
- 108090000009 TNF receptor-associated factor 6 Proteins 0.000 description 2
- 238000008050 Total Bilirubin Reagent Methods 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 102000035181 adaptor proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005764 adaptor proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N benzocaine Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BLFLLBZGZJTVJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229950005499 carbon tetrachloride Drugs 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 2
- 238000002247 constant time method Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000000890 drug combination Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 210000003725 endotheliocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 2
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229960004275 glycolic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 2
- 230000007365 immunoregulation Effects 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 2
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 229920001606 poly(lactic acid-co-glycolic acid) Polymers 0.000 description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 239000012144 protein assay dye reagent concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010814 radioimmunoprecipitation assay Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 2-[benzyl-(4-methoxyphenyl)sulfonylamino]-n-hydroxy-4-methylpentanamide Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1S(=O)(=O)N(C(CC(C)C)C(=O)NO)CC1=CC=CC=C1 VKUYLANQOAKALN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150000566 AUF1 gene Proteins 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101710159080 Aconitate hydratase A Proteins 0.000 description 1
- 101710159078 Aconitate hydratase B Proteins 0.000 description 1
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 102100034798 CCAAT/enhancer-binding protein beta Human genes 0.000 description 1
- 101710134031 CCAAT/enhancer-binding protein beta Proteins 0.000 description 1
- 108010072135 Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024649 Cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 101000936738 Coturnix japonica Astacin-like metalloendopeptidase Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 1
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000035519 G0 Phase Effects 0.000 description 1
- 230000010190 G1 phase Effects 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102100034221 Growth-regulated alpha protein Human genes 0.000 description 1
- 108010024164 HLA-G Antigens Proteins 0.000 description 1
- 206010019837 Hepatocellular injury Diseases 0.000 description 1
- 101001069921 Homo sapiens Growth-regulated alpha protein Proteins 0.000 description 1
- 101000959794 Homo sapiens Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000917826 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Proteins 0.000 description 1
- 101000917824 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-b Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000738771 Homo sapiens Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 102000039989 IL-17 family Human genes 0.000 description 1
- 108091069193 IL-17 family Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101150109636 Inos gene Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 102100029204 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II-a Human genes 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 101150110301 MSC gene Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 102000018745 NF-KappaB Inhibitor alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010052419 NF-KappaB Inhibitor alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000794562 Naegleria gruberi Calmodulin, flagellar Proteins 0.000 description 1
- IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M Nitrite anion Chemical compound [O-]N=O IOVCWXUNBOPUCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 101710098398 Probable alanine aminotransferase, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710105008 RNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 102100037422 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C Human genes 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010044012 STAT1 Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100029064 Serine/threonine-protein kinase WNK1 Human genes 0.000 description 1
- 102100029904 Signal transducer and activator of transcription 1-alpha/beta Human genes 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004141 Sodium laurylsulphate Substances 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102100030416 Stromelysin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710108790 Stromelysin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 101710124574 Synaptotagmin-1 Proteins 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 230000033540 T cell apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 231100000354 acute hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000019628 coolness Nutrition 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000222 eosinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000000763 evoking effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 150000002333 glycines Chemical class 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010019692 hepatic necrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000007866 hepatic necrosis Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 229940124644 immune regulator Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 102000053460 interleukin-17 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040001304 interleukin-17 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000002414 leg Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000033952 mRNA binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091000373 mRNA binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 239000000155 melt Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 230000001483 mobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229940005654 nitrite ion Drugs 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000004963 pathophysiological condition Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940076376 protein agonist Drugs 0.000 description 1
- 239000012268 protein inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940121649 protein inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000004080 punching Methods 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 239000001397 quillaja saponaria molina bark Substances 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- OBSZRRSYVTXPNB-UHFFFAOYSA-N tetraphosphorus Chemical compound P12P3P1P32 OBSZRRSYVTXPNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000011800 void material Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/20—Interleukins [IL]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- A61K38/21—Interferons [IFN]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了IL-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用。具体地本发明提供了一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂用于制备制剂或试剂盒的用途，用于提高间充质干细胞的免疫抑制功能；上调间充质干细胞中免疫抑制因子的表达；增强免疫抑制因子的mRNA的稳定性；降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；抑制T细胞的增殖；治疗肝炎或肝损伤。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及IL-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
无论在体内实验还是在体外实验中，MSC对于T细胞的免疫抑制机制已经得到了广泛的研究，目前普遍认为MSC对于T细胞的抑制不是通过诱导T细胞凋亡，而是使得T细胞的细胞周期停留在G0/G1期。也有研究表明MSC可以促进激活的T细胞的凋亡，但可以促进静息状态下的T细胞的存活，这也说明MSC发挥免疫抑制依赖于T细胞活化时所释放的炎症细胞因子的刺激。
白介素-17A(interleukin17A，IL-17A，白细胞介素17，简称为IL-17)是目前已发现的30余种白细胞介素之一，按序号排在第17位。IL-17由CD4+T细胞分泌，能够诱导上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞合成分泌IL-6、IL-8、G-CSF、PGE2，促进ICAM-1的表达。近年来发现IL-17是一种主要由活化的T细胞产生的致炎细胞因子，可以促进T细胞的激活和刺激上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞产生多种细胞因子如IL-6、IL-8、粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和化学增活素及细胞黏附分子1(cellularadhesionmolecule1,CAM-1)，从而导致炎症的产生。IL-17是T细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。IL-17与受体结合后，可通过MAP激酶途径和核转录因子kB(nuclearfactorkB，NF-kB)途径发挥其生物学作用。Th17细胞能够分泌产生IL-17A、IL-17F、IL-6以及肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactora,TNF-α)等，这些细胞因子可以集体动员、募集及活化中性粒细胞。Th17细胞产生的IL-17能有效地介导中性粒细胞动员的兴奋过程，从而有效地介导了组织的炎症反应。
IL-17作为一种促炎症细胞因子，能够作用于多种细胞类型，进而促进其他一些细胞因子、趋化因子和金属蛋白酶的表达，包括TNFα、IL-1β、IL-6、GM-CSF、G-CSF、CXCL1、MMP-3等。同时，IL-17还可以和其他一些细胞因子如TNFα协同促进多种靶基因的表达。体内的实验研究揭示了IL-17家族细胞因子在机体抗微生物感染中所发挥的重要作用。尽管IL-17在机体细菌和真菌感染中起到保护作用，但是IL-17信号通路的过度激活则会导致自身免疫病的发生。在人自身免疫病中，IL-17是明显上升的，许多研究表明IL-17参与了诸多自身免疫病的发病进程，包括MS(多发性硬化)、RA(类风湿性关节炎)和IBD(炎症性肠病)。
发明内容
本发明的目的在于提供白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂的用途。
本发明的另一目的是提供白介素-17拮抗剂的用途。
本发明的另一目的是提供一种经IL-17处理的提高了免疫抑制能力的间充质干细胞。
本发明的第一方面，提供了一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂的用途，用于制备制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒用于：
(1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)抑制T细胞的增殖；和/或
(6)治疗肝炎或肝损伤。
在另一优选例中，所述白介素-17是哺乳动物的白介素-17。
在另一优选例中，所述白介素-17是人白介素-17。
在另一优选例中，所述白介素-17的氨基酸序列如SEQIDNO.:1所示。
在另一优选例中，所述白介素-17的衍生物包括经修饰的白介素-17分子、氨基酸序列与天然白介素-17同源且具有天然白介素-17活性的蛋白分子、白介素-17的二聚体或多聚体、含有白介素-17氨基酸序列的融合蛋白。
在另一优选例中，所述经修饰的白介素-17分子是PEG化的白介素-17。
在另一优选例中，所述“氨基酸序列与天然白介素-17同源且具有天然白介素-17活性的蛋白分子”是指其氨基酸序列与SEQIDNO.:1相比具有≥85％的同源性，较佳地≥90％的同源性，更佳地≥95％的同源性，最佳地≥98％同源性；并且具有天然白介素-17活性的蛋白分子。
在另一优选例中，所述“间充质干细胞的免疫抑制功能”是指间充质干细胞对T细胞的免疫抑制功能。
在另一优选例中，所述的制剂或试剂盒中还包含IFNγ和/或TNFα。
在另一优选例中，所述激动剂是指能够在体内或体外提高白介素-17或其衍生物的活性和/或含量的物质。所述物质可以为人工合成的或天然的化合物、蛋白、核苷酸等。
在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒精性肝损伤、药物诱导性肝损伤、肝纤维化、肝硬化。
在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺-2，3-双加氧酶、PGE2、TSG6、IL-6、HO-1、IL-10、PD-L1、Galetin和/或B7-H4。
本发明的第二方面，提供了一种白介素-17拮抗剂的的用途，用于制备制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒用于：
(1)降低间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)下调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)降低MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)增强RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)促进T细胞的增殖。
在另一优选例中，所述白介素-17的拮抗剂是指能够降低体内或体外白介素-17活性的物质。
在另一优选例中，所述白介素-17的拮抗剂可以为小miRNA、抗白介素-17抗体或iNOS抑制剂、Act1蛋白抑制剂、AUF1蛋白激动剂、白介素-17受体的抑制剂、NFκB抑制剂、TRAF6抑制剂。
在另一优选例中，所述的制剂包括药物组合物、保健品组合物、食品组合物、或实验试剂。
在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺-2，3-双加氧酶、PGE2、TSG6、IL-6、HO-1、IL-10、PD-L1、Galetin和/或B7-H4。
本发明的第三方面，提供了一种组合物，所述组合物包括白介素-17或其衍生物、IFNγ和TNFα。
在另一优选例中，所述白介素-17或其衍生物、IFNγ和TNFα的摩尔比为：1-10：10：10。
在另一优选例中，所述组合物包括固态制剂、液态制剂，较佳地为干粉或溶液形式。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
本发明的第四方面，提供了一种分离的MSC细胞群，所述MSC细胞群由MSC细胞构成或基本上由MSC细胞构成，并且所述的MSC细胞具有增强的抑制T细胞增殖的能力，
并且，所述的MSC细胞选自下组：
(1)体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用(i)白介素-17或其衍生物、(ii)IFNγ和(iii)TNFα同时、依次或先后进行处理；
(2)Act1蛋白过表达和/或AUF1蛋白缺失或活性降低的细胞群；和
(3)体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用IFNγ和TNFα进行处理；
(4)组(1)、组(2)和组(3)的组合。
在另一优选例中，所述预处理中，条件如下：0.5-1000ng/ml(较佳地1-200ng/ml，更佳地1-20ng/ml，最佳地1-10ng/ml)的IFNγ、0.5-1000ng/ml(较佳地1-200ng/ml，更佳地1-20ng/ml，最佳地1-10ng/ml)的TNFα，和0.2-1000ng/ml(较佳地0.5-200ng/ml，更佳地1-20ng/ml，最佳地1-10ng/ml)白介素-17。
在另一优选例中，所述预处理中，使用1-2ng/mlIFNγ、1-2ng/mlTNFα和0.5-2ng/ml白介素-17；或使用10ng/mlIFNγ、10ng/mlTNFα和10ng/ml白介素-17。
在另一优选例中，所述的增强的抑制T细胞增殖的能力指I1/I0≥1.5(较佳地≥2,更佳地≥4),其中，I1为所述MSC细胞对T细胞增殖的百分比抑制率；而I0为对照组的同物种的野生型的MSC细胞对T细胞增殖的百分比抑制率。
在另一优选例中，所述的“基本上由…构成”指MSC细胞占所述细胞群中细胞总数的至少90％，较佳地至少95％，更佳地至少99％。
在另一优选例中，所述MSC细胞群具有以下特征：将所述MSC细胞群施用于动物后，可导致所述动物体内发生选自下组的变化：
(a)血清ALT的水平下降；
(b)肝脏中单个核细胞下降；
(c)CD4+T细胞数下降；和/或
(d)CD8+T细胞数下降。
在另一优选例中，
(a)血清ALT的水平下降50％～80％；
(b)肝脏中单个核细胞下降50％～80％；
(c)CD4+T细胞数下降50％～80％；和/或
(d)CD8+T细胞数下降50％～75％。
在另一优选例中，所述预处理过程包括步骤：
胰酶消化MSC细胞后，先培养至细胞贴壁，然后加入上述浓度的细胞因子，继续培养6-24小时后，再消化收集细胞群。
在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞等。
本发明的第五方面，提供了一种遗传改造的细胞株，所述细胞株是经基因工程改造从而导致内源的Act1蛋白过表达和/或AUF1蛋白缺失或活性降低。
在另一优选例中，所述细胞株为哺乳动物MSC细胞株。
在另一优选例中，所述细胞株用于增强间充质干细胞的免疫抑制功能。
本发明的第六方面，提供了一种分离的蛋白复合物，所述蛋白复合物为Act1蛋白和AUF1蛋白结合的蛋白复合物。
在另一优选例中，所述蛋白复合物分子量在80KD～130KD。
本发明的第七方面，提供了本发明第六方面所述蛋白复合物的应用，所述用途为用于筛选药物或化合物，所述药物或化合物促进或抑制Act1蛋白和AUF1蛋白形成所述的复合物。
在另一优选例中，所述的药物用于：
(1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)抑制T细胞的增殖；和/或
(6)治疗肝炎或肝损伤。
在另一优选例中，当应用所述蛋白复合物筛选药物时，所述应用包括步骤：
(a)将目标物质与MSC细胞共培养；
(b)检测培养的细胞中所述蛋白复合物的含量。当细胞中所述蛋白复合物含量较空白对照升高时，则该物质为阳性候选物质。
在另一优选例中，所述的筛选中还包括阳性对照组，较佳地所述的阳性对照组中添加IL17。(实验表明，IL17能增强两个蛋白的结合形成复合物的能力。)
在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒精性肝损伤、药物诱导性肝损伤、肝纤维化、肝硬化。
在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺-2，3-双加氧酶、PGE2、TSG6、IL-6、HO-1、IL-10、PD-L1、Galetin和/或B7-H4。
本发明的第八方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中含有以下组分：
(a)白介素-17或其衍生物；
(b)IFNγ；和
(c)TNFα；
以及使用说明书，
其中，所述的组分(a)、(b)和(c)分别位于一个或多个不同的容器或位于同一容器中。
在另一优选例中，所述的说明书中描述：所述试剂盒用于
(1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)抑制T细胞的增殖。
在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒精性肝损伤、药物诱导性肝损伤、肝纤维化、肝硬化。
在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺-2，3-双加氧酶、PGE2、TSG6、IL-6、HO-1、IL-10、PD-L1、Galetin和/或B7-H4。
本发明的第九方面，提供了一种药盒，所述药盒中包括如权利要求3所述的药物组合物和说明书，所述说明书中记载该药物组合物用于：
(1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)增强免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)抑制T细胞的增殖；和/或
(6)治疗肝炎或肝损伤。
在另一优选例中，所述MSC细胞为骨髓来源的MSC细胞、脐带来源MSC细胞、脂肪来源MSC细胞、胎盘来源MSC细胞、和/或牙髓来源MSC细胞。
在另一优选例中，所述肝炎包括自身免疫性肝炎、病毒性肝炎；所述肝损伤包括酒精性肝损伤、药物诱导性肝损伤、肝纤维化、肝硬化。
在另一优选例中，所述免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺-2，3-双加氧酶、PGE2、TSG6、IL-6、HO-1、IL-10、PD-L1、Galetin和/或B7-H4。
本发明的第十方面，提供了一种治疗肝炎或肝损伤的方法，所述方法包括步骤：
给需要的对象施加治疗有效量的MSC细胞。
在另一优选例中，所述肝损伤为肝硬化。在另一优选例中，所述对象为哺乳动物(如，人)。
在另一优选例中，所述施加为静脉输注。
在另一优选例中，所述MSC细胞为本发明第四方面所述的MSC细胞群。
在另一优选例中，所述MSC细胞为体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用(i)白介素-17或其衍生物、(ii)IFNγ和(iii)TNFα同时、依次或先后进行处理。
在另一优选例中，所述所述MSC细胞为体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用IFNγ和TNFα同时、依次或先后进行处理。
在另一优选例中，所述预处理过程中MSC细胞群的密度为1×104细胞/ml－5×106细胞/ml，优选为5×104细胞/ml-5×105细胞/ml。
在另一优选例中，所述预处理过程中白介素-17的浓度为0.5-1000ng/ml，优选为1-100ng/ml。
在另一优选例中，所述预处理过程中IFNγ的浓度为0.5-1000ng/ml，优选为1-100ng/ml。
在另一优选例中，所述预处理过程中TNFα的浓度为0.5-1000ng/ml，优选为1-100ng/ml。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1包括图1A、图1B、图1C、图1D、图1E、图1F、图1G、和图1H显示IL-17增强MSC的免疫抑制功能。
图2包括图2A和图2B显示IL-17增强MSC免疫抑制的特性依赖于iNOS的活性。
图3显示IL-17增强MSC的免疫抑制功能不依赖于对T细胞凋亡的影响。
图4包括图4A、图4B、图4C、图4D、图4E、图4F、和图4G显示IL-17协同炎症细胞因子上调MSC中iNOS的表达。
图5包括图5A、图5B、图5C、和图5D显示IL-17在MSC中发挥的增强免疫抑制和基因表达的作用需要Act1的参与。
图6包括图6A、图6B、和图6C显示IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC能有效地治疗ConA诱导的肝损伤。
图7包括图7A、图7B、图7C、和图7D显示IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对于CIH的治疗效果依赖于其对T细胞的免疫抑制功能，而不影响T细胞亚群的比例。
图8中的图A-E显示IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对于CIH的治疗效果依赖于iNOS的表达。
图9包括图9A、图9B、图9C、图9D、图9E、和图9F显示IL-17可以逆转RNA结合蛋白AUF1对基因表达的抑制作用。
图10中的图A-图D显示IL-17通过调节AUF1的水平来增强iNOSmRNA的稳定性。
图11中的图A-图B显示AUF1是介导IL-17信号转导的的关键分子。
图12中的图A-图D显示AUF1是介导IL-17增强MSC治疗CIH效果的关键分子。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，意外地发现IL-17能显著地提高间充质干细胞的免疫抑制功能，抑制T细胞的增殖；该功能通过降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平增强iNOS的mRNA的稳定性并上调MSC中iNOS的表达来实现。体内和体外实验结果证明IL-17预处理的MSC能有效地治疗CONA诱导的肝损伤。在此基础上完成了本发明。
术语
术语“治疗”是指基于治愈、缓解、改善、减轻、影响治疗对象疾病、症状、疾病体质(predisposition)的目的而给予需要治疗的对象本发明的白介素-17。
术语“治疗对象”是指鼠、人及其他哺乳动物。
术语“治疗有效量”是指能够在治疗对象体内达到治疗目的的白介素-17的量。本领域的普通技术人员应理解，所述“治疗有效量”可随白介素-17的给药途径、所用药物辅料以及与其他药物联合用药情况的不同而有所不同。
间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSC)
本发明人的研究成果表明，MSC通过一氧化氮(NO)和趋化因子的联合作用发挥对T细胞的免疫抑制功能。T细胞在其受体(TCR)活化后能分泌大量的炎症细胞因子，包括IFNγ、TNFα、IL-1α和IL-1β，这些炎症细胞因子能够刺激MSC使其分泌大量iNOS和趋化因子，这些趋化因子能够招募T细胞到MSC周围，通过iNOS的代谢产物NO抑制T细胞的增殖。此外，本发明人还发现转录因子C/EBPβ和STAT1在诱导iNOS产生的过程中是关键的。本发明人同时也研究了不同物种来源的MSC在介导对T细胞的免疫抑制中的不同机制。对于小鼠来说，iNOS是MSC抑制T细胞的关键分子，而对人来说，IDO则是MSC抑制T细胞的关键分子。然而，也有其他研究者认为HLA-G5、TGF-β和IL-10是介导人MSC发挥免疫抑制的关键分子。
免疫抑制因子
如本发明所用，“免疫抑制因子”是指可以下调机体过强免疫反应的因子或分子。过强的免疫反应包括B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等细胞介导的超出机体正常范围的免疫反应，可能导致炎症疾病，如过敏反应、自身免疫性疾病等。
本发明中优选地免疫抑制因子包括iNOS、吲哚胺-2，3-双加氧酶、PGE2、TSG6、IL-6、HO-1、IL-10、PD-L1、Galetin和/或B7-H4。
白介素-17或其衍生物及其制备方法
如本发明所用，“白介素-17”或“IL-17”是指一种蛋白质，该蛋白质(a)具有与ZhengbinYao等.HumanIL-17:anovelcytokinederivedfromTcells.J.Immunol.155(12),5483-5486(1995)；和Submitted(11-DEC-1995)JacquelineKennedy,Immunology,DNAXResearchInstitute中描述的人/鼠白介素-17基本相同的氨基酸序列和(b)具有与天然白介素-17相同的生物学活性。本发明的白介素-17包括，但不限于：人白介素-17、重组人白介素、鼠白介素-17和/或重组鼠白介素-17。在某些实施方式中的白介素-17的氨基酸序列为：
人IL-17氨基酸序列：(155aa)
1MTPGKTSLVSLLLLLSLEAIVKAGITIPRNPGCPNSEDKNFPRTVMVNLNIHNRNTNTNP
61KRSSDYYNRSTSPWNLHRNEDPERYPSVIWEAKCRHLGCINADGNVDYHMNSVPIQQEIL
121VLRREPPHCPNSFRLEKILVSVGCTCVTPIVHHVA(SEQIDNO.:1)
鼠IL-17氨基酸序列：(158aa)
1MSPGRASSVSLMLLLLLSLAATVKAAAIIPQSSACPNTEAKDFLQNVKVNLKVFNSLGAK
61VSSRRPSDYLNRSTSPWTLHRNEDPDRYPSVIWEAQCRHQRCVNAEGKLDHHMNSVLIQQ
121EILVLKREPESCPFTFRVEKMLVGVGCTCVASIVRQAA(SEQIDNO.:2)
IL-17信号通路激活后，能启动很多促炎症基因的表达，这一点与一些经典的固有免疫受体的激活类似，包括IL-1R(IL-1受体)、TLR(Toll样受体)等。与IL-1R和TLR类似，IL-17RA与IL-17结合后能通过与接头蛋白Act1和TRAF6相互作用，进而激活NFκB信号通路，促进靶基因的表达。IL-17在激活NFκB通路的同时也能激活MAPK信号通路，MAPK的激活又会导致AP1的活化，从而促进靶基因的转录；另外，MAPK激活还可以通过增强mRNA稳定性从而促进基因表达。对于IL-17来说，增强mRNA稳定性是其促进基因表达的重要环节。其中，Act1是介导IL-17增强mRNA稳定性的重要分子。
炎症微环境中，IL-17主要是由Th17细胞分泌的，另外还可以由其他一些细胞生成，包括γδT细胞、NKT细胞、NK细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞等。IL-17作为一种促炎症因子，参与了诸多自身免疫病的发病过程。在本发明中，本发明人发现在MSC存在时，IL-17则可以增强MSC的免疫抑制功能，从而有效地抑制T细胞增殖，说明IL-17在MSC存在时可以抑制免疫反应。
术语“基本相同的氨基酸序列”是指序列相同或由一个或多个氨基酸改变(缺失、增加、取代)引起的不同，但这种改变基本上不降低其生物学活性，即可以通过结合IL-17靶细胞受体而发生生物学功能。任何符合“基本相同”要求的白介素-17均包括在本发明内，无论它是糖基化的(即来源于天然的或来源于真核生物表达系统的)或是非糖基化的(即来源于原核生物表达系统或化学合成的)。
“白介素-17”还包括PEG化的IL-17以及共价修饰的IL-17蛋白质。例如，可用各种活化的分子量为5,000～100,000的聚乙二醇(PEG)修饰以使IL-17高分子化，延长其半衰期。具体操作可参见Greenwaldetal.,Bioorg.Med.Chem.Lett.1994,4,2465；Calicetietal.,ILFarmaco,1993,48,919；ZalipskyandLee,《聚乙二醇化学：生物技术与生物医学应用》，J.M.Harris编，PlenumPress,N.Y.,1992。
本发明的白介素-17可用基因重组技术克隆表达的。表达的宿主细胞包括原核细胞、酵母细胞或者高等真核生物细胞。除了原核细胞，真核细胞如丝状真菌(filamentousfungi)或酵母菌(yeast)等同样适用于表达或者克隆本发明的白介素-17。用于表达糖基化的本发明的白介素-17的宿主细胞来源于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞如DrosophilaS2和SpodopteraSf9，植物细胞。适用的哺乳动物宿主细胞的例子包括中华仓鼠卵巢细胞(CHO)，COS细胞。本领域的普通技术人员应知如何选择合适的宿主细胞。
上述宿主细胞经白介素-17表达载体或克隆载体转染或者转化后可在传统的营养基(nutrientmedia)中培养，所述营养基经修饰后适于诱导启动子(promoter)、选择性转化体(selectingtransformant)或者扩增白介素-17编码基因序列。培养条件如培养基、温度、pH等的选择对本领域的普通技术人员来说则是应知的。如何使细胞培养繁殖力最大化的一般原则、方案以及操作技术可参见MammalianCellBiotechnology:aPracticalApproach,M.Butler,ed.(IRLPress,1991)andSambrooketal.,supra。
本发明的白介素-17不但可以通过基因重组直接表达，也可以通过与异种多肽形成融和多肽的方式生产，后者可以是一段位于成熟蛋白质或多肽N端的信号序列，也可以是位于成熟蛋白质或多肽N端的具有特异性切割位点的其他多肽片段。
IL-17二聚体及其制备方法
编码本发明IL-17二聚体或融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得IL-17第一单体和/或IL-17第二单体的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量，可以对IL-17二聚体编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明中，可以采用酵母细胞或哺乳动物细胞偏好的密码子，并采用计算机DNA软件对IL-17二聚体基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等。
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是哺乳动物细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。
药物组合物和施用方法
本发明的药物组合物包含安全、有效量范围内的本发明IL-17或其衍生物及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.001-1000mg的IL-17或其衍生物/剂，较佳地0.05-300mg的IL-17或其衍生物/剂，更佳地，含有0.5-200mg的IL-17或其衍生物/剂。
本发明的IL-17或其衍生物及其药理上可接受的盐可制成各种制剂，其中包含安全、有效量范围内的本发明IL-17或其衍生物或其药理上可接受的盐及药理上可以接受的赋形剂或载体。其中“安全、有效量”指的是：化合物的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。化合物的安全、有效量根据治疗对象的年龄、病情、疗程等具体情况来确定。
“药理上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺和，而不明显降低化合物的药效。药理上可以接受的赋形剂或载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
施用本发明IL-17或其衍生物时，可以口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、局部给药。
本发明IL-17或其衍生物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给药。
含有本发明的白介素-17或其衍生物的微胶囊可用于本发明的白介素-17的缓释给药。重组蛋白的微囊缓释给药技术已成功应用于重组人生长激素(rhGH)、重组人干扰素(rhIFN)、白介素-2和MNrgp120(Johnsonetal.,Nat.Med.,2:795-799(1996)；Yasuda,Biomed.Ther27:1221-1223(1993)；WO97/03692,WO96/40072,WO96/07399；U.S.Pat.No.5654010。
本发明的白介素-17或其衍生物的缓释制剂可用具有良好生物兼容性和宽泛生物可降解性的乳酸羟基乙酸高聚物(PLGA)制备。PLGA的降解产物，乳酸和羟基乙酸可被人体很快清除。而且，该高聚物的降解能力可随其分子量和组成的不同，从几个月延长到几年(Lewis,“Controlledreleaseofbioactiveagentsformlactide/glycolidepolymer,”in:M.ChasinandR.Langer(Eds.),BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker:NewYork,1990),pp.1-41))。
使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明IL-17或其二聚体适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，每次给药剂量通常为0.01～300mg，优选0.5～100mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点在于：
(1)首次揭示了IL-17能显著地提高间充质干细胞的免疫抑制功能。
(2)首次发现了IL-17具有抑制T细胞的增殖的能力。
(3)首次阐明了IL-17通过降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平增强iNOS的mRNA的稳定性来上调MSC中iNOS的表达进而实现对间充质干细胞的免疫抑制。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料和方法
实验材料
本发明所用的试剂和实验材料均可从市售获得，其中生物材料来源如下。
重组小鼠IFNγ,TNFα,IL-17A,抗IL-17A抗体购自eBiosciences(LaJolla,CA)；重组小鼠IL-2购自R&DSystems(Minneapolis,MN)；抗β-actin、GAPDH、iNOS、p65、p-IκBα、p-p65、p-JNK、p-ERK1/2抗体购自CellSignalingTechnology(Danvers,MA)；抗Act1抗体购自SantaCruzBiotechnology(Dallas,TX)；L-NMMA、propidiumiodide、actinomycinD购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)；ConcanavalineA(ConA)购自VectorLabs(Burlingame,CA).
C57BL/6小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司。动物饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部清洁级环境中。
细胞制备方法
(1)间充质干细胞的分离与培养：
将实验用小鼠利用颈椎脱臼的方式处死，然后浸泡于75％酒精中3-5分钟。用手术剪刀剪下小鼠两条后腿，取其胫骨、股骨各两根并浸泡于DMEM完全培养基(含有两倍的青霉素和链霉素)中，用手术剪刀剔除骨头周围的肌肉组织。将已剔除干净的骨头两端剪去，留下空腔，即见骨髓；用10ml的注射器抽取5-10mlDMEM培养基(不含FBS)对准骨头空腔，冲洗骨髓至50ml离心管中。离心350g，5分钟，弃上清，沉淀用DMEM完全培养液5ml重悬，显微镜下计数，按照5×106/cm2的接种密度，转移至T25或T75的细胞培养瓶中，放入培养箱(37℃，5％CO2)培养。24小时后换液去除未贴壁的细胞，每隔两天换液一次，通过不断的换液传代对细胞进行纯化，最后用96孔板稀释法挑选单细胞克隆并进行扩增。对所挑选的克隆进行体外分化能力(成骨和成脂)和表面标志的鉴定，所有实验中用的间充质干细胞都在20代以前使用。所有间充质干细胞的培养均使用DMEM完全培养基。
(2)Tcellblasts制备
小鼠单个核细胞悬液，计数后按照1×106细胞/ml的密度培养在10cm培养皿中培养，1640完全培养液中加入抗小鼠CD3抗体(1μg/ml)和抗小鼠CD28抗体(1μg/ml)。48小时后，将细胞收集后离心500g，5分钟，收集上清即为Sup-CD3(经过抗CD3和抗CD28抗体刺激48小时的小鼠脾细胞培养上清)，同时收集细胞沉淀。细胞沉淀用1640完全培养基重悬，计数后按照1×106cells/ml的密度培养在10cm培养皿中(不含抗CD3和抗CD28抗体)，培养液中加入IL-2(200U/ml)，继续培养48小时后，细胞成团状生长，即为Tcellblasts。
T细胞增殖测定(3H-Tdr掺入法)
向用于检测T细胞增殖的96孔板中加入3H-Tdr(0.5μCi每孔)，继续在培养箱中培养，6小时后将96孔板放入-80℃冰箱。直到检测当天，将板子取出放入37℃烘箱化开，将细胞摄取的同位素全部转移到玻璃纤维素膜。利用微波炉将膜烘干后加入闪烁液，WallacMicroBeta液闪计数仪上读取cpm值，检测3H的掺入量。
细胞凋亡检测
将细胞收集后，PBS洗一遍，每个样品加入PropidumIodidestainingbuffer(PBScontaining0.2％saponin,50μg/mlpropidiumiodide，新鲜加入的RNaseA10μg/ml)400μl重悬，室温染色30min，流式细胞仪检测DNA含量。.
RNA抽提和基因表达分析
参照TIANGEN细胞RNA抽提试剂盒说明书抽提RNA。参考TIANGENTIANScriptcDNA第一链生成试剂盒说明将RNA反转为cDNA。采用TAKARA荧光定量PCR试剂，参考其说明书进行荧光定量PCR。以β-actin作为内参，结果分析处理采用2-△△CT法，所有基因表达都换算为β-actin的倍数。所用引物序列如下：
AUF1:
正向引物5’-CAGCAGAGTGGTTATGGGAAAGTATCC-3’(SEQIDNO.:3)；
反向引物5’-GACAGGAGCCACCTTCAAATGAATC-3’(SEQIDNO.:4)；
β-actin:
正向引物5′-CCACGAGCGGTTCCGATG-3′(SEQIDNO.:5)；
反向引物5′-GCCACAGGATTCCATACCCA-3′(SEQIDNO.:6)；
CCL2:
正向引物5’-TCTCTCTTCCTCCACCACCATG-3’(SEQIDNO.:7)；
反向引物5’-GCGTTAACTGCATCTGGCTGA-3’(SEQIDNO.:8)；
CCL5:
正向引物5’-TTTCTACACCAGCAGCAAGTGC-3’(SEQIDNO.:9)；
反向引物5’-CCTTCGTGTGACAAACACGAC-3’(SEQIDNO.:10)；
CXCL9:
正向引物5’-AGTGTGGAGTTCGAGGAACCCT-3’(SEQIDNO.:11)；
反向引物5’-TGCAGGAGCATCGTGCATT-3’(SEQIDNO.:12)；
CXCL10:
正向引物5’-TAGCTCAGGCTCGTCAGTTCT-3’(SEQIDNO.:13)；
反向引物5’-GATGGTGGTTAAGTTCGTGCT-3’(SEQIDNO.:14)；
IL-6:
正向引物5’-GAGGATACCACTCCCAACAGACC-3’(SEQIDNO.:15)；
反向引物5’-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3’(SEQIDNO.:16)；
IL-17RA:
正向引物5’-AGTGTTTCCTCTACCCAGCAC-3’(SEQIDNO.:17)；
反向引物5’-GAAAACCGCCACCGCTTAC-3’(SEQIDNO.:18)；
IL-17RC:
正向引物5’-GCTGCCTGATGGTGACAATGT-3’(SEQIDNO.:19)；
反向引物5’-TGGACGCAGGTACAGTAAGAAG-3’(SEQIDNO.:20)；
iNOS:
正向引物5’-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3’(SEQIDNO.:21)；
反向引物5’-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3’(SEQIDNO.:22).
mRNA半衰期测定
第一天，间充质干细胞传代至5块6孔板：1.5×105cells/孔，每孔加入1.6ml完全培养液，放培养箱过夜使细胞贴壁。
第二天，中午12点向6孔板加入IFNγ+TNFα，IFNγ+TNFα+IL-17细胞因子刺激，终浓度10ng/ml。6hr后，晚上18点向6孔板加入Act.D(5μg/ml)，收0、0.5hr、1hr、2hr、3hr和4hr共5个时间点的RNA，每种处理对应的每个时间点各有三个复孔，加入裂解液混匀后放-80℃。
第三天，抽提总RNA，测定RNA浓度。
第四天，将RNA反转录为cDNA，做实时定量PCR。
第五天，结果分析处理采用2-△△CT法，以β-actin或GAPDH作为内参，每个时间点每个重复的RNA量表示为ratiotoβ-actin/GAPDH，以时间0点的平均RNA量作为基准，计算出剩余各时间点各重复孔RNA量相对于0点基准值的百分比。EXCEL计算完毕后，用GraphpadPrism5软件作mRNAdecay的半对数曲线，其中Y轴为各百分比，采用对数表示；X轴为各时间点，线性表示。根据软件拟合出的非线性回归曲线的斜率k值，计算mRNA的半衰期，计算公式为t1/2＝ln(2/k).
RNA干扰
质粒转染采用电转方法，使用试剂盒AmaxaCellLineNucleofectorKitV，参考其说明书，操作如下。
质粒：shCTRL，shAUF1，shAct1，GFPplasmid(试剂盒自带)。
取出4个6孔板，每个6孔板中的4个孔各加入DMEM完全培养基1ml，放入37℃培养箱预平衡。
取出试剂盒中的NucleofectorSolution和Supplement，平衡至室温，按照NucleofectorSolution:Supplement＝4.5:1配制Solution，每个反应100μl。
消化2个10cmdish小鼠间充质干细胞，收集后用PBS洗一遍，然后计数。
各吸取1.5×106个细胞至4个干净无菌的1.5ml离心管中,90g室温离心10min，尽量去除上清。
用100μl的Solution重悬细胞，并向每个离心管中加入相应的质粒2μg，轻轻吹匀。
将上述溶液转移到电转杯中，不要有气泡，盖上盖子。
打开电转仪，选择U-023程序，将电转杯放入电转仪的holder，按下X按钮启动电转程序。
程序运行完毕后，立即取出电转杯，迅速向杯中加入500μl的预平衡的DMEM完全培养液。用吸管吹匀后，平均转移到6孔板的4个孔中进行培养。
第二天，将孔板取出，荧光显微镜观察转染了GFP质粒的细胞，可以看出80％以上的细胞发出绿色荧光，即转染效率有80％以上。对所有的6孔板进行换液。
(10)第三天，开始用250μg/ml的hygromycinB筛选阳性细胞。
(11)筛选2-3周后，得到均一的阳性细胞，取出少部分细胞裂解蛋白，做WesternBlot鉴定目的蛋白knockdown的效果。若效果好，则稳转细胞株建立成功，可进行下一步实验。
依此方法建立了AUF1knockdown和Act1knockdown两株细胞。
Westernblot
可用细胞刮或者胰酶消化法来收集细胞，PBS洗一遍后，将收集好的细胞，加入一定量的RIPA裂解液，吹打混匀后，冰上放置30分钟，期间震荡3-4次；然后高速13,000rpm，低温离心30min；将上清液转移到一新的离心管中，放冰上待用。采用Bio-Rad公司的ProteinAssayDyeReagentConcentrate(Bradford法)测定蛋白浓度。选用8％分离胶、5％积层胶来制作SDS-聚丙烯酰胺凝胶。将样本按体积比加入5×上样缓冲液，100℃煮10分钟后，室温冷却，上样。各样本约含50-100μg蛋白；每块胶含一道蛋白marker；插好电极，开始电泳，先80V电泳30min，再120V电泳60min。将凝胶取下后，切除积层胶，放到电转移缓冲液中；将NC膜(硝酸纤维素膜)放到转移缓冲液中平衡10分钟左右；从下到上将海绵、滤纸、膜、凝胶、滤纸、海绵依次放好，每放一层都要注意排出气泡，将转移装置连接好，然后接通电源，恒压100V，2小时；转移结束后关闭电源，取出膜，根据蛋白marker和目的蛋白分子量大小剪出相应位置的条带，做好标记。将膜放在塑料盒中，加入适量封闭液，于摇床上室温放置2小时；用1×TBST洗液洗3次，每次3分钟；然后将膜转入到塑料袋中，加入稀释好的第一抗体，4℃摇床过夜。第二天取出膜然后用1×TBST洗3次，每次10分钟，再加入稀释好的HRP标记二抗，室温摇床孵育1-2小时；取出膜用1×TBST洗3次，每次10分钟；将膜转移到片夹中，在暗室里加ECL显色液避光反应，适时终止反应，进行胶片的曝光、冲片。根据胶片相应位置上条带的粗细和浓淡来判断目标蛋白的含量。扫描胶片并保存。
免疫共沉淀
用胰酶消化法来收集细胞，PBS洗一遍后，将收集好的细胞，加入一定量的RIPA裂解液，吹打混匀后，冰上放置30分钟，期间震荡3-4次；然后高速13,000rpm，低温离心30min；将上清液转移到一新的离心管中，放冰上待用。采用Bio-Rad公司的ProteinAssayDyeReagentConcentrate(Bradford法)测定蛋白浓度。将上述蛋白裂解上清与proteinGsepharosebeads进行孵育以去除非特异性结合，然后高速离心后取上清，向上清中加入1μgAct1抗体或1μg非特异性IgG对照，然后将之与20μlproteinGsepharosebeads(GEHealthcare)进行孵育，4℃过夜。将beads用RIPAbuffer洗4次，然后用20μl2×SDSloadingbuffer重悬，在100℃煮10min，然后用WesternBlot检测蛋白表达。
CIH模型的建立，细胞治疗和评价
(1)间充质干细胞提前用细胞因子预处理12-16小时：WTMSC，iNOS-/-MSC或auf1-/-MSC给予IFNγ+TNFα/IFNγ+TNFα+IL-17(10ng/ml)细胞因子刺激。
(2)根据体重，给予小鼠静脉注射15mg/kg的ConA。
(3)给予ConA注射30min后，开始间充质干细胞静脉注射治疗，每只小鼠给予5×105个细胞治疗。每个处理组有5只小鼠。
(4)ConA注射8小时后处死小鼠，收集血清，检测血清中ALT的水平，留取一叶肝脏浸泡在10％福尔马林中作病理切片H&E染色；剩余肝脏全部用来分离单个核细胞。
(5)小鼠血清中ALT的检测：参考上海伊华公司生产的ALT检测试剂盒说明书进行操作。
MSC在损伤肝脏组织中的定位
将GFP-MSC提前用细胞因子IFNγ+TNFα/IFNγ+TNFα+IL-17(10ng/ml)刺激进行预处理12-16小时；ConA注射30min后，开始各组GFP-MSC静脉注射治疗，每只小鼠给予5×105个细胞治疗。ConA注射8小时后处死小鼠。
(1)小鼠处死后，立即取一小叶肝脏直接放入OCT包埋，并冻在-80℃。
(2)冷冻切片机切片，片厚10μm。
(3)切片用-20℃预冷的丙酮中固定10min，晾干后浸入PBS中20min。
(4)PBS洗两遍，加入PBS+3％BSA室温处理1小时。
(5)吸弃多余液体，加入一抗(anti-GFP按1:400稀释)，37℃湿盒2小时。
(6)PBS洗三次，每次5min，加入二抗(AlexaFluor594Donkeyanti-Rabbitantibody1:500)+DAPI(1:500)，37℃湿盒2小时。
(7)PBS洗三次，每次5min，晾干后封片，荧光显微镜观察并拍照。
细胞表面分子的免疫荧光染色
取细胞1×106重悬于100μlFACS缓冲液中用于染色。加入荧光标记的抗体后(如PE标记抗小鼠IL-17RA抗体，PE标记抗小鼠CD3抗体，PerCP/Cy5.5标记抗小鼠CD4抗体，APC标记抗小鼠CD8抗体，APC标记的抗小鼠CD45抗体，APC标记的抗小鼠CD25抗体，FITC标记的抗小鼠CD3抗体)，4℃避光孵育30分钟。用FACS缓冲液洗涤两次。最后将细胞重悬于400μl的FACSbuffer，FACSCalibur流式细胞仪检测分析。
细胞内细胞因子或Foxp3的免疫荧光染色
(1)所有细胞(约5-10×105)用PBS洗一遍后，都用抗小鼠CD16/CD32抗体封闭10min，冰上，每管30μl体系。
(2)先进行细胞表面分子的染色，方法参照11.1.
(3)FACS缓冲液洗一遍后，每管各加入Fixation/Permeabilizationbuffer100μl，放4℃固定过夜。
(4)400×g,离心5min,加入1×Permeabilizationbuffer200μl，混匀。
(5)400×g,离心5min，加入相应的细胞因子抗体或者Foxp3抗体(抗体用1×Permeabilizationbuffer稀释)，每管50μl体系，放冰上避光染色1小时。
(6)直接加入1×Permeabilizationbuffer200μl，混匀，400×g,离心5min。
(7)弃上清后，再加入1×Permeabilizationbuffer200μl，混匀，400×g离心5min。
(8)弃上清后，再加入FACSbuffer200μl，混匀，400×g,离心5min。细胞沉淀用FACSbuffer200μl重悬，即可用流式细胞仪检测分析。
数据处理和统计学分析
所示实验结果中每个处理组都设置有三个或三个以上的重复，通过GraphpadPrism5软件作图，图中所示数据以平均数±标准差表示。数据的统计分析采用Student’st检验或单因素方差分析。显著性水准定为α＝0.05，*代表p<0.05；**代表p<0.01；***代表p<0.001。
实施例1IL-17能够增强MSC的免疫抑制功能
已有研究表明，间充质干细胞的免疫抑制能力不是固有的，而是在炎症细胞因子的诱导下获得的，这些炎症细胞因子包括IFNγ、TNFα、IL-1α和IL-1β。间充质干细胞在炎症细胞因子IFNγ和TNFα的刺激下，分泌大量的iNOS和趋化因子，趋化因子招募T细胞至间充质干细胞的周围，由iNOS的代谢产物NO发挥抑制T细胞增殖的作用。众所周知，IL-17是一种多效的促炎症细胞因子，它在很多感染性疾病、炎症性疾病和自身免疫病的发病过程中发挥了重要作用。本发明人向体外培养的间充质干细胞中加入炎症细胞因子IFNγ和TNFα，或在此基础上再加入IL-17，观察这些细胞因子对间充质干细胞免疫抑制能力的影响。本发明人发现，只有在IFNγ和TNFα存在的情况下，间充质干细胞才获得对T细胞增殖的抑制能力；而IL-17则能够显著增强IFNγ和TNFα所诱导的间充质干细胞的免疫抑制能力，这一作用表现为T细胞增殖明显降低(图1A)。
以往的研究已经证明，IL-17是通过与细胞表面的IL-17RA和IL-17RC组成的异二聚体结合进而激活下游信号通路的。既然IL-17可以作用于间充质干细胞并显著增强其免疫抑制能力，本发明人检测了间充质干细胞的IL-17RA和IL-17RC的表达情况。结果显示，间充质干细胞可以组成性地表达IL-17RA和IL-17RC(图1B，C)。
在炎症反应的不同阶段，炎症细胞因子的水平是不同的，因此本发明人研究了不同剂量的IFNγ和TNFα对IL-17的这一增强免疫抑制的功能是否有影响。本发明人发现，当IFNγ和TNFα的水平仅有1-2ng/ml时，IL-17即可以明显增强间充质干细胞的免疫抑制功能(图1D，4E)。即使当IFNγ和TNFα的水平很高时(10-20ng/ml)，IL-17仍可以改善间充质干细胞的免疫抑制功能。本发明人也观察了不同剂量的IL-17对其增强间充质干细胞的免疫抑制能力这一特性的影响。结果显示，大约0.5ng/ml的IL-17即可明显地增强间充质干细胞的免疫抑制功能(图1F)。
为了进一步明确在T细胞介导的免疫反应中IL-17是否参与MSC对T细胞增殖的抑制作用，本发明人将MSC与anti-CD3激活的脾细胞共培养，并向共培养体系中加入anti-IL-17A抗体。结果显示，MSC可以明显地抑制激活的脾细胞的增殖，而anti-IL-17A抗体可以在很大程度上恢复激活的脾细胞的增殖，逆转MSC的抑制作用(图1G)。当MSC和脾细胞的比例为1:40时，anti-IL-17A的这一逆转作用最为显著；当MSC和脾细胞的比例为1:20时，虽然anti-IL-17A的逆转作用减弱了，但仍有统计学意义。总之，本发明人的研究表明，在T细胞介导的免疫反应中，特别是免疫微环境中存在的炎症细胞因子IFNγ和TNFα水平较低时，IL-17可以显著增强MSC对T细胞的免疫抑制功能。
为了扩展本发明人的研究，本发明人在脂肪来源的MSC上也检测了IL-17对其免疫抑制功能的影响作用，得到了与骨髓来源的MSC类似的结果(图1H)，即IL-17同样可以增强脂肪来源MSC的免疫抑制功能，这提示着IL-17的这一功能可能不依赖于MSC的来源。
图1显示了IL-17增强MSC的免疫抑制功能。
(A).首先将MSC用细胞因子IFNγ、TNFα和IL-17(每种因子的浓度均为2ng/ml)的不同组合刺激12小时，然后将之与Tcellblasts共培养(MSC与Tcellblasts的比例为1:20)，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。(B).运用实时荧光定量PCR的方法检测IL-17RA和IL-17RC在MSC和Raw264.7细胞(阳性对照)上的表达。(C).运用流式细胞术检测MSC表面IL-17RA的表达。(D和E).首先将MSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激12小时(其中IFNγ和TNFα的浓度作梯度稀释，IL-17浓度固定为10ng/ml)，然后将之与Tcellblasts(需加入IL-2方可增殖，且增殖中不产生炎症细胞因子)。(D)或A1.1细胞(T细胞杂交瘤细胞，能自主增殖，且增殖中不产生炎症细胞因子，该细胞的制备方法可参考文献(Nature.1989Jun22；339(6226):625-6.)(E)共培养，MSC和T细胞比例为1:20，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。(F).首先将MSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激12小时(其中IFNγ和TNFα的浓度固定为2ng/ml，IL-17浓度作梯度稀释)，然后将之A1.1细胞共培养，MSC和T细胞比例为1:10，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。(G).将MSC与anti-CD3和anti-CD28激活的脾细胞按1:40或1:20的比例进行共培养，或在培养基中加入anti-IL-17A，48小时后，用3H-Tdr掺入法测定脾细胞增殖。(H).首先将BMMSC或ADSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种因子的浓度均为10ng/ml)刺激12小时，然后将之与A1.1细胞共培养(MSC与A1.1的比例为1:10)，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。结果表示为平均数±标准差，BMMSC：骨髓来源的MSC；ADSC：脂肪来源的MSC。所示数据代表三次实验的结果。
实施例2IL-17增强MSC免疫抑制的特性依赖于iNOS的活性
以上的结果显示，IL-17可以显著增强MSC对T细胞增殖的免疫抑制功能，接下来本发明人进一步研究了其中的相关机制。之前的研究认为，IL-17可以促进人MSC的增殖。因此，本发明人首先研究了IL-17是否通过影响MSC的增殖进而影响其免疫抑制功能。本发明人将MSC用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激24小时，然后检测MSC的增殖情况。本发明人发现，在受到IFNγ和TNFα刺激的同时，IL-17的加入反而能抑制MSC的增殖(图2A)。因此，IL-17并非通过影响MSC的增殖来增强其免疫抑制能力。
本发明人之前的研究表明，iNOS是介导小鼠MSC发挥免疫抑制的重要分子。本发明人检测了IL-17的这一增强MSC免疫抑制的作用是否依赖于iNOS的活性。结果显示，IL-17的作用能够被iNOS抑制剂L-NMMA完全逆转(图2B)，表明iNOS在其中发挥了至关重要的作用。
图2显示IL-17增强MSC免疫抑制的特性依赖于iNOS的活性。
(A).将MSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(IFNγ+TNFα的浓度作梯度稀释，IL-17的浓度固定为10ng/ml)处理24小时,然后用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。(B).首先将MSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种因子的浓度均为2ng/ml)刺激12小时，然后将之与A1.1细胞共培养(MSC与A1.1的比例为1:10)，或在培养基中加入iNOS抑制剂L-NMMA，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。所有数据代表三次独立实验的结果。
实施例3IL-17增强MSC的免疫抑制功能不依赖于对T细胞凋亡的影响
以上的研究表明，IL-17可以协同炎症细胞因子IFNγ和TNFα增强MSC的免疫抑制功能，而这一功能主要体现在对T细胞增殖的抑制，并且依赖于iNOS的活性(图1，图2)。另外，MSC在炎症细胞因子IFNγ和TNFα存在的情况下可以诱导淋巴细胞的凋亡，这一过程也依赖于NO。为了确定IL-17的这一增强MSC免疫抑制的作用是否依赖于对T细胞凋亡的影响，本发明人将MSC用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17提前刺激12小时，然后将之与A1.1细胞按1:10的比例进行共培养，12小时后收集A1.1细胞，检测细胞凋亡情况。本发明人发现，A1.1细胞在单独培养情况下，凋亡细胞比例低于0.5％；而当其与未处理的MSC共培养后，凋亡细胞的比例明显增加，比例在3-5％；当其与IFNγ+TNFα预处理的MSC共培养时，凋亡细胞的比例进一步增加，比例在7-10％；A1.1与IFNγ+TNFα+IL-17预处理的MSC共培养的情况和与IFNγ+TNFα预处理的MSC共培养时相似，凋亡细胞的比例仍在7-10％(图3)。另外，这一现象不依赖于IFNγ和TNFα的浓度，不管IFNγ和TNFα的浓度在5ng/ml还是10ng/ml，IFNγ+TNFα+IL-17预处理的MSC都不能进一步促进T细胞的凋亡。因此，IL-17增强MSC的免疫抑制不依赖于对T细胞凋亡的影响。
图3显示IL-17增强MSC的免疫抑制功能不依赖于对T细胞凋亡的影响。
将MSC提前用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激12小时(其中IFNγ和TNFα的浓度为5ng/ml或10ng/ml，IL-17的浓度始终为10ng/ml)，然后按1：10的比例与A1.1细胞共培养，12小时后，收集A1.1细胞，PI染色后，流式细胞仪分析其DNA含量。
实施例4IL-17协同炎症细胞因子上调MSC中iNOS的表达
之前的研究表明，iNOS和趋化因子是介导MSC免疫抑制功能的核心分子，而且MSC启动表达iNOS和一些趋化因子需要炎症细胞因子IFNγ和TNFα的诱导。本发明人上述结果显示，IL-17增强MSC免疫抑制的特性依赖于iNOS的活性。本发明人用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17来处理MSC，然后用荧光定量PCR和WesternBlot的方法来测定iNOS和趋化因子的表达。结果显示，无论在mRNA水平还是蛋白水平上，IL-17都能够协同IFNγ和TNFα明显促进MSC表达iNOS(图4A，B，C，D)。同时，本发明人也检测了一些和MSC发挥免疫抑制相关的趋化因子的mRNA表达，包括CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10，结果发现IL-17并不能协同IFNγ和TNFα改变这些趋化因子的表达(图4E)。由此可见，IL-17增强MSC的免疫抑制特异地依赖于其对iNOS的上调作用。为了进一步验证在T细胞介导的免疫应答中IL-17对MSC的一些基因表达的上调作用，本发明人将激活的脾细胞上清与anti-IL-17A孵育一段时间以中和上清中的IL-17，然后用这些上清来刺激MSC，进而检测MSC一些免疫调节基因的表达。本发明人发现，激活的脾细胞上清能明显地诱导MSC表达iNOS、CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10；中和了IL-17的上清则不能很好地诱导MSC表达iNOS(图4F，G)，但趋化因子CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10的表达则不受影响(图4G)。上述结果表明，IL-17能够协同IFNγ和TNFα明显促进MSC表达iNOS，但却不影响趋化因子CCL2、CCL5、CXCL9和CXCL10的表达。
图4显示IL-17协同炎症细胞因子上调MSC中iNOS的表达。
(A和E).用IFNγ、TNFα和IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)几种细胞因子的不同组合刺激MSC，12小时后收细胞抽提RNA，用Real-TimePCR的方法检测iNOS、CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10几种mRNA的表达。(B).将MSC用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)处理指定的不同时间，收细胞提取蛋白，WesternBlot检测iNOS的蛋白表达。(C).将MSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激24小时(其中IFNγ和TNFα的浓度作梯度稀释，IL-17浓度固定为10ng/ml)，收集细胞上清，用Greiss试剂测NO的量。(D).用IFNγ、TNFα和IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)几种细胞因子的不同组合刺激MSC，24小时后收细胞提取蛋白，WesternBlot检测iNOS的蛋白表达。(F).将MSC用未处理或anti-IL-17A处理过的激活脾细胞上清刺激24小时，收集细胞提取蛋白，WesternBlot检测iNOS的蛋白表达。(G).将MSC用未处理或anti-IL-17A处理过的激活脾细胞上清刺激12小时，收集细胞提取RNA，用Real-TimePCR的方法检测iNOS、CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10几种mRNA的表达。
实施例5Act1是介导IL-17增强MSC免疫抑制作用和相关基因表达的关键分子
以往的研究已经证明，IL-17是通过与细胞表面的IL-17RA和IL-17RC组成的异二聚体结合进而激活下游信号通路的，而在IL-17与IL-17RA、IL-17RC结合后，接头蛋白Act1与IL-17R的结合是激活IL-17下游信号通路的核心步骤。在下游信号传导中，IL-17主要通过激活MAPK和NFκB通路来实现对靶基因的调节。有报道表明，在Act1基因缺失的MEF(小鼠胚胎成纤维细胞)中，IL-17的功能和信号传导存在明显缺陷。本发明人建立了Act1knockdown稳转细胞及相应的对照细胞，对比研究了两株细胞受到IL-17刺激后MAPK和NFκB信号通路蛋白磷酸化的变化。与Act1-/-MEF相似，Act1knockdownMSC在受到IL-17刺激后，IκBα、ERK、JNK和p65的磷酸化水平都明显降低，可见IL-17信号传导明显受到抑制(图5A)。
本发明人同时研究了Act1knockdown后，MSC受到IFNγ、TNFα和IL-17刺激后免疫抑制功能和相关免疫调节基因表达的变化。结果表明，Act1knockdown之后，IL-17不能有效增加IFNγ和TNFα诱导MSC表达iNOS的水平(图5B、C)，同时，IL-17也不能增强MSC的免疫抑制功能(图5D)。这些可以归因于Act1knockdown之后所引起的IL-17信号传导的抑制，也进一步佐证了IL-17可以增强MSC免疫抑制功能和基因表达这一发现。
图5显示IL-17在MSC中发挥的增强免疫抑制和基因表达的作用需要Act1的参与。
(A).将Act1knockdown细胞(shAct1MSC)和相应的对照细胞(shCTRLMSC)分别用IL-17(10ng/ml)处理指定的时间，收集不同时间点的细胞，抽提蛋白，WesternBlot方法检测p-IκBα、p-ERK、p-JNK、p-p65几种蛋白的表达情况。p-代表磷酸化。(B).将shCTRLMSC和shAct1MSC分别用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)处理24小时，收细胞提取蛋白，WesternBlot检测iNOS的蛋白表达。(C).用IFNγ、TNFα和IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)几种细胞因子的不同组合刺激shCTRLMSC和shAct1MSC，12小时后收细胞抽提RNA，用Real-TimePCR的方法检测iNOSmRNA的表达。(D).首先将shCTRLMSC或shAct1MSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种因子的浓度均为2ng/ml)刺激12小时，然后将之与A1.1细胞共培养(MSC与A1.1的比例为1:10)，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。所有数据代表三次独立实验的结果。
实施例6IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC能有效地治疗ConA诱导的肝损伤
既然IL-17能明显增强IFNγ和TNFα所诱导的MSC的免疫抑制功能。本发明人进而采用了ConA诱导的肝炎(CIH)模型探索IL-17对MSC免疫抑制功能调节在疾病治疗中的作用意义。CIH主要是T细胞介导的急性肝炎模型，它很好地模拟了人急性爆发性肝炎和病毒性肝炎，T细胞的激活增殖和对肝实质细胞的破坏是其重要的致病机理。很多报道认为，通过药物抑制免疫应答或去除特定的T细胞亚群后，ConA诱导的肝损伤均能明显缓解。围绕IL-17能显著增强MSC抑制T细胞增殖的能力这一研究结果，本发明人给予CIH小鼠输注经过不同预处理的GFP-MSC(从GFP转基因小鼠骨髓中分离得到的MSC)，输注后约7.5小时，检测GFP-MSC在肝脏组织中的聚集情况。研究表明MSC能定位到受损肝脏部位(图6A)。进一步的研究中，本发明人将MSC提前用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激12小时，在小鼠接受ConA注射30分钟后，将这些不同处理的MSC输注到小鼠体内，观察并检测小鼠的肝脏损伤程度。结果显示，相比MSC治疗组和IFNγ+TNFα处理过的MSC治疗组，IFNγ+TNFα+IL-17处理过的MSC能更有效地治疗ConA诱导的肝损伤，主要表现在小鼠血清中ALT的含量明显降低(图6B)，肝脏充血程度明显减轻(图6C)。至此，本发明人的研究从体内和体外实验证明了IL-17可以显著增强MSC的免疫抑制功能。
图6显示IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC能有效地治疗ConA诱导的肝损伤。
(A).给小鼠静脉注射ConA(15mg/Kg)30min后，静脉输入control、IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17预处理的GFP-MSC(每只小鼠给予5×105个细胞)。7.5小时后，取一小叶肝脏做冰冻切片，通过免疫荧光的方法检测GFP-MSC在肝脏中的定位。蓝色代表DAPI，红色代表GFP。图中箭头指向GFP-MSC，放大倍数为400×。(B,C).给小鼠静脉注射ConA(15mg/Kg)30min后，静脉输入不同细胞因子预处理的MSC(每组5只小鼠，每只小鼠给予5×105个细胞)。7.5小时后，取血，处死小鼠取肝脏做后续检测。(B).血清ALT的水平。(C).各组小鼠肝脏大体观察。
实施例7IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对于CIH的治疗效果依赖于其对T细胞的免疫抑制功能，而不影响T细胞亚群的比例
基于IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对ConA诱导的肝损伤有很好的治疗效果，本发明人进一步分析了此种预处理MSC调控CIH的具体机制。本发明人从小鼠的肝脏组织中分离了其中的单个核细胞，计数后发现，L-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC治疗后小鼠肝脏单个核细胞数目显著减少(图7A)；流式细胞术分析发现，CD4+和CD8+的T细胞数目明显减少(图7A)。这些结果表明，IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC治疗肝损伤后，MSC强大的免疫抑制功能使得肝脏组织中T细胞增殖受到抑制，进而T细胞介导的免疫应答和对肝细胞的损伤都明显减弱。
MSC的免疫调节功能，不仅体现在其对T细胞的免疫抑制，也表现为对T细胞亚群分化的调节。此外，MSC可以诱导Th17细胞向Treg细胞分化，进而起到降低免疫反应的作用。为此，本发明人进而研究在CIH模型中所观察到的IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC的治疗效果是否也与MSC对T细胞亚群分化的影响相关。本发明人从不同处理组小鼠的肝脏中分离得到单个核细胞，在体外经过PMA和inomycin刺激后，检测了其中T细胞亚群的变化。结果显示，正常小鼠肝脏中，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例约为2.3:1(图7B)。ConA诱导后的肝脏中，CD8+T细胞比例增加了一倍左右，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例约为(0.9～1.1):1；然而不同处理的MSC治疗后，CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例变化不大(图7B)；CD4+T细胞中，IFNγ+IL-17A-的Th1细胞、IFNγ-IL-17A+的Th17细胞(图7C)以及Treg细胞(图7D)的比例都没有显著差异。因此，IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对于CIH的治疗效果依赖于其对T细胞增殖的免疫抑制功能，而不影响T细胞亚群的比例。
图7显示IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对于CIH的治疗效果依赖于其对T细胞的免疫抑制功能，而不影响T细胞亚群的比例。
给小鼠静脉注射ConA(15mg/kg)30min后，静脉输入不同细胞因子预处理的MSC(每组5只小鼠，每只小鼠给予5×105个细胞)。8小时后，处死小鼠取肝脏做后续检测。(A).研磨肝脏后分离单个核细胞并计数。流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞的比例并换算为绝对数目。(B).流式细胞术分析肝脏中CD4+和CD8+T细胞的比例。(C和D).将肝脏中单个核细胞用PMA和inomycin刺激5小时后，向培养体系中加入BFA继续培养1小时，然后流式细胞术分析肝脏CD4+T细胞中IFNγ+IL-17A-Th1、IFNγ-IL-17A+Th17、Foxp3+Treg细胞的比例。
实施例8IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对于CIH的治疗效果依赖于iNOS的表达
由于在体外实验中IL-17增强MSC的免疫抑制作用依赖iNOS的活性(图2B)，本发明人进一步应用体内实验验证iNOS在此过程中的核心作用。为了证明这一点，本发明人用iNOS-/-MSC来替代WTMSC，并以IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17不同因子组合刺激细胞，然后用上述经过不同预处理iNOS-/-MSC来治疗CIH小鼠，观察其疗效。结果显示，当MSC缺失iNOS时，即便以IFNγ、TNFα、和IL-17预处理细胞，MSC也不能很好地治疗ConA诱发的肝损伤。主要表现在，相比于IFNγ+TNFα+IL-17预处理的WTMSC，无论是未处理iNOS-/-MSC还是IFNγ+TNFα+IL-17预处理iNOS-/-MSC均不能有效抑制CIH小鼠血清中的ALT，(图8A)，小鼠肝脏中单个核细胞浸润也未降低(图8B)，CD4+T细胞和CD8+T细胞的数目没有下降(图8C)，并且肝脏病理切片仍显示有较多的坏死区域(图8D，8E)。因此，本发明人的研究以体内实验证明iNOS是IL-17增强MSC免疫抑制功能的关键分子。
图8显示IL-17、IFNγ和TNFα预处理的MSC对于CIH的治疗效果依赖于iNOS的表达。
给小鼠静脉注射ConA(15mg/Kg)30min后，静脉输入不同细胞因子预处理的WTMSC或iNOS-/-MSC(每组5只小鼠，每只小鼠给予5×105个细胞)。7.5小时后，取血后，处死小鼠取肝脏做后续检测。(A).检测血清ALT水平。(B).研磨肝脏后分离单个核细胞并计数。(C).流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞的比例并换算为绝对数目。(D).取一小叶肝脏做石蜡包埋、H&E染色并拍照，放大倍数为200×。(E).计算(D)图中各组肝脏病理切片中坏死区域的百分比。结果以平均数±标准差表示。
实施例9IL-17可以逆转RNA结合蛋白AUF1对基因表达的抑制作用
接下来本发明人研究了IL-17协同炎症细胞因子IFNγ和TNFα促进MSC表达iNOS的分子机制。在免疫应答中产生的许多免疫分子的mRNA量的控制是非常关键的，一旦mRNA存在过多积累就会引起免疫细胞的过度激活，进而引发超敏反应。在体内，mRNA的积累可以受多种机制调节，其中最重要的机制之一就是mRNA结合蛋白和mRNA的相互作用加快mRNA的降解。然而，在许多炎症反应中，信号通路的活化往往能促进一些基因的表达，而这一促进作用则需要通过增强mRNA的稳定性来实现。因此，控制mRNA的稳定性对许多免疫反应中基因表达的调控都是至关重要的。IL-17也不例外，IL-17正是通过提高mRNA的稳定性来促进一些炎症分子的表达。尽管如此，IL-17提高mRNA稳定性的作用机制还未完全阐明。mRNA结合蛋白对于调节mRNA的稳定性起到至关重要的作用，而且有报道认为RNA结合蛋白AUF1可以负向调节iNOSmRNA的稳定性，而敲低AUF1可以明显增加iNOSmRNA的表达，因此本发明人着重研究了AUF1这一RNA结合蛋白是否参与了IL-17调控MSC中iNOS的基因表达。
本发明人从auf1-/-小鼠骨髓中分离得到MSC，并比较了WTMSC和auf1-/-MSC在受到IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激后iNOS的表达情况。结果表明，尽管在WTMSC中IL-17可以协同IFNγ和TNFα上调iNOSmRNA和蛋白的表达，但在auf1-/-MSC中，仅IFNγ和TNFα即可以诱导MSC产生大量的iNOS(图9A，B)，IL-17并不能体现出明显的协同作用。这一现象也在AUF1knockdownMSC中得到了验证。在AUF1knockdownMSC中IL-17的协同作用也是明显削弱的(图9C，D，E)。不仅在基因表达水平上，本发明人在IL-17增强免疫抑制这一特性上也发现了相似的现象：在WTMSC中，IL-17可以增强IFNγ和TNFα所诱导的免疫抑制；但是在auf1-/-MSC中，仅IFNγ和TNFα即可诱导出最强的免疫抑制，不需要IL-17的补充加入(图9F)。这些实验结果提示：在WTMSC中，IL-17可以逆转AUF1对iNOSmRNA表达的抑制作用；当AUF1缺失的情况下，IFNγ和TNFα诱导生成的iNOSmRNA失去了AUF1对其表达的抑制作用，表现出高水平的表达，IL-17的促进作用则会明显减弱；AUF1很可能是IL-17发挥增强基因表达作用过程中作用的靶标。
图9显示IL-17可以逆转RNA结合蛋白AUF1对基因表达的抑制作用。
(A).用IFNγ、TNFα和IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)几种细胞因子的不同组合刺激WTMSC或auf1-/-MSC，12小时后收细胞抽提RNA，用Real-TimePCR的方法检测iNOSmRNA的表达。(B).将WTMSC或auf1-/-MSC用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)刺激24小时，收细胞提取蛋白，WesternBlot检测iNOS的蛋白表达。(C).在WTMSC上稳定转染Act1shRNA后用Real-TimePCR和WesternBlot的方法鉴定knockdown的效率。(D).将Act1knockdown细胞(shAct1MSC)和相应的对照细胞(shCTRLMSC)用IFNγ、TNFα和IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)几种细胞因子的不同组合刺激，12小时后收细胞抽提RNA，用Real-TimePCR的方法检测iNOSmRNA的表达。(E).将shCTRLMSC或shAUF1MSC用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)刺激12或24小时，收细胞提取蛋白，WesternBlot检测iNOS的蛋白表达。(F).首先将WTMSC或auf1-/-MSC用细胞因子IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种因子的浓度均为2ng/ml)刺激12小时，然后将之与A1.1细胞共培养(MSC与A1.1的比例为1:10)，12小时后，用3H-Tdr掺入法测定T细胞增殖。结果表示为平均数±标准差。所示数据代表四次独立实验的结果。
实施例10IL-17通过调节AUF1的水平来增强iNOSmRNA的稳定性
以上的研究数据表明，IL-17可以协同炎症细胞因子IFNγ和TNFα提高MSC的免疫抑制功能iNOS的表达，但在AUF1缺失的情况下，IL-17则不能体现出这一协同作用，主要由于IFNγ和TNFα即可诱导auf1-/-MSC产生最强的免疫抑制。这些现象可以解释为：在WTMSC中，iNOS的表达需要IFNγ和TNFα的诱导，而这些诱导出的iNOSmRNA在AUF1存在并与之相互作用的情况下就会快速降解，而IL-17的加入则能逆转AUF1的这一降解mRNA的作用，进而促进了iNOS的基因表达；而在AUF1缺失的情况下，IFNγ和TNFα诱导出的iNOSmRNA则显得非常稳定，IL-17的加入则显示不出促进基因表达的作用。为了验证这一解释，本发明人分别用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激WTMSC和auf1-/-MSC，检测iNOSmRNA在两株细胞中的半衰期。结果发现，在WTMSC中，IL-17可以明显增强IFNγ+TNFα诱导的iNOSmRNA的稳定性，iNOSmRNA的半衰期由t1/2＝4.3±1.4hr延长到t1/2>10hr(图10A)；在auf1-/-MSC中，IFNγ+TNFα诱导的iNOSmRNA的稳定性大大增强，半衰期t1/2>10hr(图10B)，而IL-17的加入没有体现出进一步的延长作用。这些结果证实了本发明人给出的解释。对于不受IL-17影响的CCL2和CXCL10，IL-17也相应地不能增强这些mRNA的稳定性。为了进一步验证这些结果，本发明人也在检测了AUF1knockdownMSC中iNOSmRNA的半衰期，也得到了与auf1-/-MSC相似的结果(图10C)。
既然IL-17能逆转AUF1引起的iNOSmRNA降解，那么AUF1很可能是IL-17在发挥作用中一个很关键的靶点，本发明人接着研究了其中的分子机制。本发明人检测了MSC在受到IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17刺激后AUF1表达水平的变化。结果显示，MSC在受到IFNγ、TNFα刺激后，IL-17的加入能明显降低AUF1的蛋白水平(图10D)。由此可见，IL-17通过降低AUF1的水平进而增强iNOSmRNA的稳定性；AUF1是MSC中IL-17发挥增强免疫抑制和基因表达的关键分子。
图10显示IL-17通过调节AUF1的水平来增强iNOSmRNA的稳定性。
(A，B，C).将WTMSC(A)，auf1-/-MSC(B)，shCTRLMSC或shAUF1MSC(C).用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)刺激6小时，然后向培养基中加入Act.D(5μg/ml)，在加入Act.D后指定的时间点收集细胞抽提RNA，用Real-TimePCR的方法测定各时间点iNOS、CCL2、CXCL10的mRNA量，并按材料和方法8中的步骤计算mRNA的半衰期。(D).将MSC用IFNγ+TNFα或IFNγ+TNFα+IL-17(每种细胞因子浓度均为10ng/ml)进行处理，在加入细胞因子后的指定时间点收集细胞提取蛋白，用WesternBlot检测各时间点AUF1的蛋白表达。
实施例11AUF1是介导IL-17信号转导的关键分子
在上述研究中，IL-17不能协同炎症细胞因子IFNγ和TNFα上调auf1-/-MSC免疫调节基因的表达；而相同的现象也在Act1-/-MSC中可以观察到(图5)。在IL-17与IL-17受体结合后激活细胞时，Act1与IL-17受体发生相互作用，从而介导了信号向下游传导，所以Act1是IL-17信号通路中的关键分子之一。本发明人首先对比了AUF1knockdownMSC(shAUF1MSC)和其正常对照细胞(shCTRLMSC)受到IL-17刺激后IL-17信号通路中重要信号分子磷酸化的区别。本发明人发现，在AUF1knockdown的情况下，MSC接受IL-17刺激后，IL-17信号通路的关键分子p65(NFκB通路)和ERK(MAPK通路)的磷酸化都明显减弱(图11A)，提示IL-17信号转导受到抑制，AUF1可能参与了IL-17的信号传递。
为了进一步确认AUF1是否通过与Act1相互作用来参与IL-17的信号传导，本发明人将MSC用IL-17刺激后收集不同时间点的细胞，通过免疫共沉淀的方法检测了AUF1和Act1是否存在相互作用。结果显示，在静息状态下的MSC中，Act1与AUF1有少量结合，而在IL-17加入后，与Act1结合的AUF1的量明显增多(图11B)。由此可见，AUF1确实通过与Act1的相互作用参与了IL-17的信号转导。
至此，本发明人得出如下结论：(1)在启动IL-17信号转导过程中，AUF1与Act1相互作用，从而启动了下游NFκB通路和MAPK通路的活化，进而诱导了靶基因的表达。(2)在IL-17与其他炎症细胞因子如IFNγ和TNFα共同存在的情况下，AUF1则成为IL-17调节的靶点，IL-17通过降低AUF1的水平来增强目的基因mRNA的稳定性，从而促进基因表达。
图11显示AUF1是介导IL-17信号转导的的关键分子。
(A).将AUF1knockdown细胞(shAUF1MSC)和相应的对照细胞(shCTRLMSC)分别用IL-17(10ng/ml)处理指定的时间，收集不同时间点的细胞，抽提蛋白，WesternBlot方法检测p-p65、p-ERK蛋白的表达情况。p-代表磷酸化。(B).将MSC用IL-17(10ng/ml)进行处理，在加入细胞因子后的指定时间点收集细胞提取蛋白，用IgG(对照)或抗小鼠Act1抗体与蛋白裂解产物进行免疫共沉淀，WesternBlot检测Act1和AUF1。
实施例12AUF1是介导IL-17增强MSC治疗CIH效果的关键分子
基于AUF1在IL-17发挥增强MSC免疫抑制功能中起到关键作用(图6)。接下来，本发明人将在CIH模型中验证这一发现。本发明人将WTMSC和auf1-/-MSC分别用IFNγ+TNFα、IFNγ+TNFα+IL-17预处理12小时，然后给CIH小鼠静脉注射这些不同处理的细胞，观察疗效。本发明人发现：与之前的结果相符，IL-17可以明显增强WTMSC对于CIH的疗效，血清ALT水平、肝脏中单个核细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的数目、肝脏坏死程度都明显下降。IFNγ+TNFα+IL-17预处理的MSC能明显增强WTMSC对CIH的疗效：血清ALT的平均水平由未处理组的8000U/L降低至2000U/L；肝脏中单个核细胞由未处理组的15×105/gliver降低至5×105/gliver；CD4+T细胞由未处理组的3×105/gliver降低至1×105/gliver；CD8+T细胞由未处理组的3.7×105/gliver降低至1×105/gliver。
但是对于auf1-/-MSC而言，IFNγ+TNFα预处理后即可以很好地治疗CIH，而IL-17的加入也不能增强疗效(图12)。至此，本发明人在体内验证了AUF1是介导IL-17增强MSC免疫抑制功能并用于治疗CIH的关键分子。
图12显示AUF1是介导IL-17增强MSC治疗CIH效果的关键分子。
给小鼠静脉注射ConA(15mg/kg)30min后，静脉输入不同细胞因子预处理的WTMSC或auf1-/-MSC(每组3-5只小鼠，每只小鼠给予5×105个细胞)。7.5小时后，取血，处死小鼠取肝脏做后续检测。(A).检测血清ALT水平。(B).研磨肝脏后分离单个核细胞并计数。(C).流式细胞术分析CD4+和CD8+T细胞的比例并换算为绝对数目。(D).取一小叶肝脏做石蜡包埋、H&E染色并拍照，放大倍数为200×。(E).计算(D)图中各组肝脏病理切片中坏死区域的百分比。结果以平均数±标准差表示。
实施例13炎症因子预处理MSCs可以有效治疗肝硬化
给予C57BL/6小鼠每周灌胃四氯化碳(carbontetrachloride，CCL4)，连续8周，以建立肝硬化模型。
在肝硬化模型建立的第8周给予小鼠输注不同炎症因子(10ng/mlIFNγ+10ng/mlTNFα或10ng/mlIFNγ+10ng/mlTNFα+10ng/mlIL-17)处理的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)和未处理的MSCs，观察不同处理MSCs对肝硬化的治疗效果。
研究发现，给予小鼠诱导肝硬化后，小鼠血清中总胆红素(totalbilirubin,TB)、谷丙转氨酶(alanineaminotrans-ferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartateamino-transferase，AST)均显著升高，白蛋白(albumin)水平显著降低。其中，与正常组小鼠相比，肝硬化模型组小鼠体内的TB水平达到12-15μmol/L；ALT水平升高至1200-1800U/L；AST水平升高至3500-4500U/L；白蛋白水平降低至20g/L以下。
对肝硬化模型小鼠输注未经处理的MSCs(1×106)，可以有效抑制肝硬化小鼠血清中的TB、ALT、AST的水平，并显著提高白蛋白(albumin)的水平。输注了MSCs7天后，肝硬化小鼠血清中TB水平降低了50-60％；ALT水平降低约50％；AST水平降低了60％；白蛋白水平升高了5％。
而将炎症因子IFNγ+TNFα预处理12小时后的MSCs(1×106)，输注到肝硬化小鼠体内7天后，肝硬化小鼠血清中TB水平降低了约70％；ALT水平降低了70-80％；AST水平降低了70％左右；白蛋白水平升高了20％。显示了更好的肝硬化治疗效果。因此，炎症因子预处理MSCs可以有效提高MSCs对于肝硬化的治疗作用。
IFNγ+TNFα+IL-17预处理MSCs(1×106)，输注到肝硬化小鼠体内7天后，肝硬化小鼠血清中TB水平降低了85％；ALT水平降低了约80-85％；AST水平降低了约80-90％；白蛋白水平升高了30％。IL-17的加入，表现出了明显的协同作用，可以更为显著的提高MSCs对肝硬化的治疗作用。
讨论
IL-17对于MSC免疫抑制的增强作用的发现使得本发明人对炎症细胞因子调控MSC免疫调节能力的研究更深入了一步，同时也为MSC在临床上的应用奠定了基础。在传统意义上，IL-17是公认的促进免疫应答的炎症因子，很多研究表明IL-17是多种炎症疾病和自身免疫病的致病因子，包括类风湿性关节炎、多发性硬化和炎症性肠病等。IL-17在许多自身免疫病病人的血清和组织中呈高现表达，通过使用IL-17中和抗体或敲除IL-17基因，可以明显缓解这些自身免疫病的症状。尽管如此，IL-17并不是在所有的病理情况下都能促进免疫应答。比如，在DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导的小鼠肠炎模型中，IL-17中和抗体的应用或敲除IL-17基因反而会加速疾病进程。然而，这一现象相关的分子机制至今还未完全阐明。本发明人的研究表明在MSC存在的情况下，IL-17可以发挥免疫抑制作用，而当本发明人用中和抗体去除MSC-T细胞共培养体系中的IL-17时，MSC的免疫抑制功能会受损。本发明人的这些发现为在病理生理条件下研究IL-17的作用提供了新的思路和方向。
ConA诱导小鼠肝损伤(CIH)是一个很经典的模拟人病毒性或自身免疫性急性肝炎的动物模型。在这一模型中，急性免疫应答在介导肝损伤中发挥了主导作用。多种免疫细胞(T淋巴细胞、巨噬细胞、NK细胞)和免疫分子(细胞因子IFNγ、TNFα、IL-10、IL-22、IL-25等)都参与了CIH的病理过程。抑制免疫应答可以很有效地治疗CIH。在本论文中，本发明人采用了小鼠骨髓来源的MSC，并尝试将IL-17增强MSC免疫抑制这一特性应用到其对CIH的治疗上。结果发现，未处理的MSC对CIH的治疗效果较差。这主要是因为MSC对T细胞的免疫抑制作用依赖炎症细胞因子的刺激，虽然在CIH疾病进展中存在多种细胞因子包括IFNγ和TNFα，但是这些细胞因子只能在很短时间内保持较高的浓度，不足以赋予MSC很强的免疫抑制能力；然而IFNγ、TNFα和IL-17三者预处理的MSC可以体现最佳的治疗效果，这一现象与本发明人在体外实验中得出的结论相符。IL-17对MSC治疗CIH的增强作用依赖于IL-17加入后增加MSC表达大量的iNOS，对于iNOS-/-MSC而言，即使提前用IFNγ、TNFα和IL-17三者预处理，也不能使其有效地治疗CIH。因此，本发明人在体内实验中同样验证了IL-17增强免疫抑制这一发现。
本发明人的研究显示，AUF1的敲除可以促进MSC中IFNγ和TNFα诱导的iNOS的表达，提示了AUF1对MSC中基因表达调控的重要性。为了进一步揭示IL-17上调MSC基因表达的分子机制，本发明人检测了IL-17对iNOSmRNA稳定性的影响，结果显示IL-17可以显著增强IFNγ和TNFα诱导的iNOSmRNA稳定性。当AUF1不存在或被敲低后，IL-17不能协同IFNγ和TNFα增强iNOS基因表达，也不能进一步增强iNOSmRNA稳定性。体外免疫抑制实验显示，auf1-/-MSC只需要IFNγ和TNFα存在即可发挥最强的免疫抑制能力，不需要IL-17的补充。本发明人进一步研究了AUF1在IL-17增强MSC中基因表达的具体机制，结果发现MSC在受到IFNγ和TNFα刺激的同时，IL-17的加入可以降低AUF1的表达水平，这一发现揭示AUF1参与了IL-17对MSC相关基因表达的调控，也就是说，IL-17通过降低AUF1的水平进而促进iNOSmRNA的稳定性。免疫共沉淀结果还显示，IL-17刺激后15min，AUF1和Act1的相互作用明显增强。本发明人还研究了AUF1knockdownMSC中IL-17信号通路蛋白激活的变化，结果显示AUF1被敲低后，IL-17信号通路中的p65、ERK等蛋白的磷酸化明显下降，这提示着AUF1敲低使得IL-17信号转导受损。这些数据表明，AUF1在IL-17增强MSC基因表达中起着双重作用：AUF1对IL-17启动信号传导是必需的；而在IL-17与其他细胞因子协同作用时，AUF1同样又是IL-17的靶标，IL-17通过降低AUF1的水平来促进相关mRNA的稳定性。因此，本发明人首次发现了AUF1在介导IL-17增强免疫抑制基因表达中的重要作用，为进一步阐明IL-17作用的分子机制奠定了基础。
综上，本发明人的研究第一次揭示了IL-17可以增强MSC的免疫抑制功能。IL-17的这一作用主要是通过逆转RNA结合蛋白AUF1降解mRNA的作用来实现的。本发明人相信IL-17调节MSC免疫抑制的深入研究将有利于MSC更好地应用于临床。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (11)
1.一种白介素-17、白介素-17的衍生物或其激动剂的用途，其特征在于，用于制备制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒用于：
(1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)增强MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)抑制T细胞的增殖；和/或
(6)治疗肝炎或肝损伤。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述白介素-17是哺乳动物的白介素-17。
3.一种白介素-17拮抗剂的的用途，其特征在于，用于制备制剂或试剂盒，所述制剂或试剂盒用于：
(1)降低间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)下调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)降低MSC中免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)增强RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)促进T细胞的增殖。
4.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括白介素-17或其衍生物、IFNγ和TNFα。
5.一种分离的MSC细胞群，其特征在于，所述MSC细胞群由MSC细胞构成或基本上由MSC细胞构成，并且所述的MSC细胞具有增强的抑制T细胞增殖的能力，
并且，所述的MSC细胞选自下组：
(1)体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用(i)白介素-17或其衍生物、(ii)IFNγ和(iii)TNFα同时、依次或先后进行处理；
(2)Act1蛋白过表达和/或AUF1蛋白缺失或活性降低的细胞群；和
(3)体外经预处理的MSC细胞群，其中所述预处理指用IFNγ和TNFα同时、依次或先后进行处理；
(4)组(1)、组(2)和组(3)的组合。
6.一种遗传改造的细胞株，其特征在于，所述细胞株是经基因工程改造从而导致内源的Act1蛋白过表达和/或AUF1蛋白缺失或活性降低。
7.一种分离的蛋白复合物，其特征在于，所述蛋白复合物为Act1蛋白和AUF1蛋白结合的蛋白复合物。
8.如权利要求7所述蛋白复合物的应用，其特征在于，所述用途为用于筛选药物或化合物，所述药物或化合物促进或抑制Act1蛋白和AUF1蛋白形成所述的复合物。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有以下组分：
(a)白介素-17或其衍生物；
(b)IFNγ；和
(c)TNFα；
以及使用说明书，
其中，所述的组分(a)、(b)和(c)分别位于一个或多个不同的容器或位于同一容器中。
10.一种药盒，其特征在于，所述药盒中包括如权利要求4所述的药物组合物和说明书，所述说明书中记载该药物组合物用于：
(1)提高间充质干细胞的免疫抑制功能；和/或
(2)上调MSC中免疫抑制因子的表达；和/或
(3)增强免疫抑制因子的mRNA的稳定性；和/或
(4)降低RNA结合蛋白AUF1的表达水平；和/或
(5)抑制T细胞的增殖；和/或
(6)治疗肝炎或肝损伤。
11.一种治疗肝炎或肝损伤的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
给需要的对象施加治疗有效量的MSC细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510216007.1A CN105079792A (zh) | 2014-05-14 | 2015-04-29 | Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410203949 | 2014-05-14 | ||
| CN2014102039491 | 2014-05-14 | ||
| CN201510216007.1A CN105079792A (zh) | 2014-05-14 | 2015-04-29 | Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105079792A true CN105079792A (zh) | 2015-11-25 |
Family
ID=54479314
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510216007.1A Pending CN105079792A (zh) | 2014-05-14 | 2015-04-29 | Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105079792A (zh) |
| WO (1) | WO2015172659A1 (zh) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105671000A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-06-15 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 重组间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| CN108424914A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-08-21 | 中国医科大学附属盛京医院 | 抑制人恶性脑胶质瘤的靶向auf1基因抑制剂及其应用 |
| CN109628406A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-04-16 | 北京贝来生物科技有限公司 | 一种治疗自身免疫疾病的间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| CN110612110A (zh) * | 2017-03-17 | 2019-12-24 | 森迪生物科学公司 | 免疫调节细胞回路 |
| CN112402454A (zh) * | 2019-08-22 | 2021-02-26 | 中国科学院上海营养与健康研究所 | 预激活间充质干细胞在治疗皮肤创伤的免疫生物学方面的应用 |
| CN117866905A (zh) * | 2024-03-12 | 2024-04-12 | 北京贝来药业有限公司 | 基于纳米抗体基因修饰的干细胞及其制备方法和产品 |
| CN117866905B (zh) * | 2024-03-12 | 2024-06-04 | 北京贝来药业有限公司 | 基于纳米抗体基因修饰的干细胞及其制备方法和产品 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117835994A (zh) * | 2021-05-13 | 2024-04-05 | 普干基因美国有限公司 | 用于治疗肝病的方法和组合物 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105008521A (zh) * | 2012-12-14 | 2015-10-28 | 罗格斯新泽西州立大学 | 调节干细胞的免疫调节作用的方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003077865A2 (en) * | 2002-03-15 | 2003-09-25 | Baxter International Inc. | Methods and compositions for directing cells to target organs |
-
2015
- 2015-04-29 CN CN201510216007.1A patent/CN105079792A/zh active Pending
- 2015-04-29 WO PCT/CN2015/077862 patent/WO2015172659A1/zh active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105008521A (zh) * | 2012-12-14 | 2015-10-28 | 罗格斯新泽西州立大学 | 调节干细胞的免疫调节作用的方法 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MOSTAFA A. GABR，ET AL: "Interleukin-17 Synergizes with IFN or TNF to Promote Inflammatory Mediator Release and Intercellular Adhesion Molecule-1 (ICAM-1) Expression in Human Intervertebral Disc Cells", 《JOURNAL OF ORTHOPAEDIC RESEARCH JANUARY》 * |
| X HAN，ET AL: "Interleukin-17 enhances immunosuppression by mesenchymal stem cells", 《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》 * |
| 邓福珠等: "无血清培养的脐带间充质干细胞治疗乙型肝炎肝硬化的临床观察", 《组织工程与重建外科杂志》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105671000A (zh) * | 2016-03-02 | 2016-06-15 | 深圳爱生再生医学科技有限公司 | 重组间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| CN110612110A (zh) * | 2017-03-17 | 2019-12-24 | 森迪生物科学公司 | 免疫调节细胞回路 |
| CN108424914A (zh) * | 2018-05-02 | 2018-08-21 | 中国医科大学附属盛京医院 | 抑制人恶性脑胶质瘤的靶向auf1基因抑制剂及其应用 |
| CN108424914B (zh) * | 2018-05-02 | 2020-05-12 | 中国医科大学附属盛京医院 | 抑制人恶性脑胶质瘤的靶向auf1基因抑制剂及其应用 |
| CN109628406A (zh) * | 2019-01-03 | 2019-04-16 | 北京贝来生物科技有限公司 | 一种治疗自身免疫疾病的间充质干细胞及其制备方法和应用 |
| CN112402454A (zh) * | 2019-08-22 | 2021-02-26 | 中国科学院上海营养与健康研究所 | 预激活间充质干细胞在治疗皮肤创伤的免疫生物学方面的应用 |
| CN117866905A (zh) * | 2024-03-12 | 2024-04-12 | 北京贝来药业有限公司 | 基于纳米抗体基因修饰的干细胞及其制备方法和产品 |
| CN117866905B (zh) * | 2024-03-12 | 2024-06-04 | 北京贝来药业有限公司 | 基于纳米抗体基因修饰的干细胞及其制备方法和产品 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015172659A1 (zh) | 2015-11-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105008521B (zh) | 调节干细胞的免疫调节作用的方法 | |
| CN105079792A (zh) | Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用 | |
| EP2658566B1 (de) | Sirna gegen cbl-b kombiniert mit zytokinen und interferonen in der behandlung von krebs | |
| CN101835891A (zh) | 运用体外培养增殖的自我更新型集落形成细胞治疗疾病和功能紊乱症 | |
| RU2649069C2 (ru) | Новый способ лечения повреждения спинного мозга с применением фрагмента hmgb1 | |
| EP3747449A1 (en) | Pharmaceutical composition comprising isolated mitochondria for prevention or treatment of rheumatoid arthritis | |
| KR20140040696A (ko) | 간엽줄기세포 및 면역조절 t 세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물 | |
| CN106167789B (zh) | 低氧处理的间充质干细胞及其应用 | |
| CN101119745B (zh) | 凝集素组合物和调节对抗原免疫应答的方法 | |
| JP2023064023A (ja) | 乾癬を治療／抑制するための医薬の製造における試薬の使用 | |
| KR20190073917A (ko) | 인터류킨-17 억제제 및 종양괴사인자-알파 억제제를 유효성분으로 포함하는 호중구성 폐 염증질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 | |
| He et al. | Nmp4/CIZ suppresses the parathyroid hormone anabolic window by restricting mesenchymal stem cell and osteoprogenitor frequency | |
| WO2016018761A1 (en) | Mesenchymal stem cells expressing biomarkers that predict the effectiveness of the mesenchymal stem cells for treating diseases and disorders | |
| Zembroń-Łacny et al. | Cell and molecular mechanisms of regeneration and reorganization of skeletal muscles | |
| KR20190043880A (ko) | 세사몰린을 유효성분으로 포함하는 자연살해세포의 분화 또는 증식 촉진용 조성물 | |
| CN103124492A (zh) | 使用具有来源于体外培养和扩增的自我更新集落形成细胞的组分的有生命的和无生命的生物反应装置的组合物和方法 | |
| CN1896100B (zh) | 肝再生因子及其应用 | |
| TWI782355B (zh) | 經細胞介白素預刺激之人類臍帶間質幹細胞於治療類風濕性關節炎之組成及用途 | |
| CN101074266A (zh) | 转导肽－人源粒细胞集落刺激因子融合蛋白及其药物组合物 | |
| CN106924815A (zh) | 用于整形充填的自体外周血干细胞和自体脂肪组合物 | |
| CN110684803B (zh) | 一种构建骨髓细胞Drp1基因特异性敲减小鼠模型的方法 | |
| CN108126187A (zh) | 一种组合物和其制备方法 | |
| CN109420166B (zh) | 一种治疗b淋巴细胞相关疾病的联合用药物 | |
| CN109419795B (zh) | 一种治疗肿瘤坏死因子家族相关疾病的联合用药物 | |
| CN105331617A (zh) | 编码人肝活素的基因、载体、转基因细胞和它们的应用及人肝活素的制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20151125 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |