CN110612110A - 免疫调节细胞回路 - Google Patents

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Abstract

本文提供了用于动态控制和靶向免疫系统的多个分支的方法和组合物。一些方面提供了间充质干细胞(MSC)，其被工程化以产生多种效应分子。在一些情况下，每一种效应分子调节免疫系统的不同细胞类型或细胞的不同功能。本文还提供了使用MSC治疗或缓解例如炎性肠病(IBD)的症状的方法。

Description

免疫调节细胞回路
相关申请
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求于2017年3月17日提交的美国临时申请号62/473,198的优先权，其全部内容通过引用结合于此。
发明背景
免疫系统，作为宿主防御系统，提供针对疾病的保护。免疫系统分为子系统，如先天免疫系统和适应性免疫系统，或者体液免疫和细胞介导的免疫。在人类中，血-脑屏障、血-脑脊液屏障和类似的流体-脑屏障将外周免疫系统与保护大脑的神经免疫系统分隔开。免疫系统利用具有增加的特异性的分层防御来保护有机体免受感染。例如，先天免疫系统提供即时但非特异性的反应，而由先天免疫系统激活的适应性免疫系统提供免疫记忆。免疫系统的失调构成了大量重要且难以治疗的疾病的基础，例如自身免疫疾病和炎性疾病(例如，炎性肠病(IBD)，包括溃疡性结肠炎和克罗恩氏病)以及癌症。
发明内容
用于调节免疫系统的现有策略是有缺陷的，部分是因为它们是非特异性的和可能具有不期望的副作用，仅针对单个细胞因子或机制，并且不能特异性地定位于炎症区域。本文提供了可以局部化、动态地控制(例如，基于定时或炎性状态的感测)，并且可以靶向免疫系统的多个分支(例如，适应性免疫和先天免疫)的技术。特别地，本公开提供了能够实现免疫系统的多因素调节的工程化细胞回路(cell circuit)。
有利地，这些细胞回路可以在真核细胞，例如间充质干细胞(MSC)中工程化，其能够归巢到炎症区域，能够产生抗炎性分泌体，并且是低免疫原性的，因此使得它们能够用于例如同种异体细胞疗法而没有明显的安全性问题或副作用。然而，这些细胞回路也可以在其它细胞类型中工程化，例如免疫系统的细胞，如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞和树突细胞(本文描述了另外的细胞类型)。
如本文所证明的，表达某些效应分子的组合(例如IL-4和IL-10，或者IL-4和IL-22)令人惊讶地产生协同的抗炎作用。例如，这些产生组合抗炎性细胞因子的MSC在抑制外周血单核细胞(PBMC)的促炎性细胞因子产生方面表现出比单一抗炎性细胞因子MSC更强的抑制能力(参见例如图14)。同样令人惊讶的是，即使在使用低数量/剂量的工程化MSC时，也观察到这种协同效应(参见例如图17)。
因此，本公开的一些方面提供了经工程化以产生多种效应分子(例如，两种细胞因子，或细胞因子和归巢分子)的免疫细胞(例如，间充质干细胞(MSC))。在一些实施方案中，效应分子中的至少两种调节免疫系统的不同细胞类型(例如，一种效应子调节一种细胞类型，另一种效应子调节另一种细胞类型)。在其它的实施方案中，效应分子中的至少两种调节免疫系统的相同细胞类型(例如，两种效应分子协同地调节相同的细胞类型)。在一些实施方案中，MSC包含工程化的核酸，其包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，MSC包含工程化的核酸，其包含与编码至少两种效应分子(例如，作为融合蛋白)的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，MSC包含至少两种工程化的核酸，其各自包含与编码至少一种(一种或多种)效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
在一些实施方案中，由MSC产生的至少一种效应分子直接或间接地调节先天免疫细胞，并且由MSC产生的至少一种效应分子直接或间接地调节适应性免疫细胞。
在一些实施方案中，由MSC产生的至少一种效应分子直接或间接地调节促炎性细胞，并且由MSC产生的至少一种效应分子直接或间接地调节抗炎性细胞。
在一些实施方案中，由MSC产生的至少一种效应分子直接或间接地调节骨髓细胞，并且由间充质干细胞产生的至少一种效应分子直接或间接地调节淋巴细胞。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生(一种或多种)归巢分子和/或生长因子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生归巢分子和效应分子(例如，抗炎性细胞因子)。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生两种效应分子，其中一种是归巢分子。在一些实施方案中，间充质干细胞被工程化以在抗炎效应分子之外产生归巢分子，或任选地，替代一种或多种(但不是全部)效应分子(例如，替代一种或多种(但不是全部)抗炎性细胞因子)产生归巢分子。
在一些方面，本文还提供了包括培养工程化的MSC(在适合于基因表达的条件下)和产生效应分子的方法。
在一些方面，本文进一步提供包括向受试者递送工程化的MSC并在体内产生(例如，表达)由间充质干细胞产生的至少一种效应分子的方法。
此外，还提供了治疗疾病或病症的方法。例如，方法可以包括治疗炎性肠病(例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病)，其包括向被诊断患有炎性肠病的受试者递送本公开的工程化MSC(例如，表达特别地用于治疗炎症性肠病的治疗性效应分子的MSC)。
在一些方面，本公开还提供了产生多功能免疫调节细胞的方法，其包括(a)向MSC递送至少一种编码至少两种效应分子的工程化核酸，或(b)向MSC递送至少两种工程化核酸，其各自编码至少一种效应分子，其中每一种效应分子调节免疫系统的不同细胞类型或调节细胞的不同功能。
本文还提供了调节受试者免疫系统的多种细胞类型的方法，其包括向受试者递送至少两种MSC，其各自被工程化以产生效应分子，其中效应分子中的至少两种调节免疫系统的不同的细胞类型。
在一些实施方案中，(至少一种)间充质干细胞经工程化而以足以抑制炎性反应的水平产生两种(至少两种)抗炎性细胞因子。例如，抗炎性细胞因子可选自IL-4、IL-10和IL-22。在一些实施方案中，炎性反应相对于对照被抑制至少20％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。
在一些实施方案中，所述方法包含向受试者(例如，动物模型，例如小鼠或人受试者)递送治疗有效量的被工程化以产生两种抗炎性细胞因子的间充质干细胞的制剂(例如，基本上纯的制剂，例如，其中含有少于1％或少于0.1％的其它细胞类型)，其中治疗有效量足以抑制受试者中的炎性反应。在一些实施方案中，治疗有效量足以将免疫应答抑制相对于对照的至少20％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。
在一些实施方案中，间充质干细胞源自骨髓、脂肪组织或脐带组织。本文考虑了其它间充质干细胞来源。
在一些实施方案中，抗炎性细胞因子水平足以诱导调节性T细胞免疫表型(例如，CD4+)。
在一些实施方案中，抗炎性细胞因子水平足以相对于对照抑制刺激的T细胞的炎性细胞因子产生至少20％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。在一些实施方案中，对照是未修饰的间充质干细胞或未修饰的间充质干细胞的制剂。在一些实施方案中，炎性细胞因子选自IFN-γ、IL-17A、IL-1-β、IL-6和TNF-α。在一些实施方案中，T细胞选自CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞。
在一些实施方案中，间充质干细胞经工程化以产生至少三种抗炎性细胞因子，其水平足以相对于对照抑制炎性反应至少20％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。
在一些实施方案中，间充质干细胞经工程化以表达归巢分子。在一些实施方案中，归巢分子选自：抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；和GPR15。在一些实施方案中，归巢分子选自：CXCR4、CCR2、CCR9和GPR15。
在一些实施方案中，间充质干细胞包含：(a)包含与编码所述两种细胞因子之一的第一核苷酸序列和编码所述两种细胞因子中另一种的第二核苷酸序列可操作地连接的启动子的核酸，任选地其中所述第一和第二核苷酸序列被插入的核苷酸序列(例如，IRES元件或编码2A肽(例如T2A、P2A、E2A、F2A)的序列(参见，例如，Ibrahimi等Hum GeneTher.2009Aug；20(8):845-60；和Kim等PLoS One.2011；6(4)，通过引用并入本文))分隔开；(b)包含(i)与编码所述两种细胞因子之一的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子和(ii)与编码所述两种细胞因子中另一种的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子的核酸；或者(c)包含与编码所述两种细胞因子之一的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子的第一核酸，和包含与编码所述两种细胞因子中另一种的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子的第二核酸。
在一些实施方案中，(a)的启动子，(b)的第一和/或第二启动子，和/或(c)的第一和/或第二启动子是诱导型启动子。
在一些实施方案中，诱导型启动子是核因子κ-B(NF-κB)-响应性启动子。在一些实施方案中，(a)的核酸，(b)的核酸和/或(c)的第一和/或第二核酸还包含与编码报告分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
在一些实施方案中，受试者具有患炎性肠病(例如，在肠(结肠)和/或直肠的最内层中的炎症和/或疮疡(溃疡))的症状。在一些实施方案中，受试者已被诊断患有炎性肠病。在一些实施方案中，炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。受试者可以是动物或人类受试者。
在一些实施方案中，治疗有效量相对于对照降低受试者的体重损失至少20％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。
在一些实施方案中，治疗有效量相对于对照降低受试者中脂质运载蛋白-2的水平至少20％(例如，至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％)。
在一些实施方案中，对照是未修饰的间充质干细胞或未修饰的间充质干细胞的制剂。
本文还提供了工程化的核酸，其包含对炎性细胞因子有响应的启动子，其与编码效应分子(例如，抗炎性细胞因子)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，工程化的核酸包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的核因子κ-B(NF-κB)-响应性启动子。在一些实施方案中，效应分子是抗炎性细胞因子。例如，抗炎性细胞因子可选自IL-4、IL-10和IL-22。
附图简述
图1显示了用于构建使用慢病毒质粒骨架克隆的工程化核酸的方法的实例，该工程化核酸包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
图2显示了用于在体外测试本公开的工程化核酸以验证转基因功能(左图)，在体内测试本发明的工程化核酸以验证效应子功能和(中图)在疾病模型中测试本发明的工程化核酸以验证功效(右图)的方法的实例。
图3A-3B显示了通过pmaxGFP对照定量的核转染的效能数据。在核转染后21小时，在CYTELLTM装置上拍摄显微图像(图3A)。在核转染后24小时，在Sony分析仪上收集流式细胞术数据(图3B)。直方图(图3B)显示了基于大小(前向散射(FSC)对侧向散射(SSC))门控的活间充质干细胞(MSC)群体，以匹配对照、未转染的MSC的大小。
图4显示了经核转染的MSC的白细胞介素-4(IL-4)产生的标准曲线。使用BD试剂盒中包含的分析物标准品混合物和与BD 试剂盒结合的软件包生成IL-4的标准曲线。
图5显示了核转染的MSC的IL-4产生的直方图。直方图描绘了BD试剂盒中用抗IL-4抗体标记的珠群体。这些珠使用两个嵌套的门控与所有其它珠分离：(1)FSC对SSC(大小)，和(2)别藻蓝蛋白(APC)(荧光)。在BD试剂盒中，IL-4与珠结合的程度与藻红蛋白(PE)荧光相关联，因为目标细胞因子也被二级PE标记的抗体结合(类似于夹心酶联免疫吸附分析(ELISA))。该图显示用编码IL-4产生的DNA(巨细胞病毒(CMV)-IL4载体)核转染的MSC产生足够的IL-4以使标准曲线饱和，而所有其它条件没有显示分泌的IL-4相对于未转染对照的变化。
图6显示了核转染的MSC的白细胞介素-10(IL-10)产生的标准曲线。使用BD试剂盒中包含的分析物标准品和混合物及与BD 试剂盒结合的软件包生成IL-10的标准曲线。
图7显示了核转染的MSC的IL-10产生的直方图。直方图描绘了BD试剂盒中用抗IL-10抗体标记的珠群体。这些珠使用两个嵌套的门控与所有其它珠分离：(1)FSC对SSC(大小)，和(2)APC(荧光)。在BD 试剂盒中，IL-10与珠结合的程度与PE荧光相关联，因为目标细胞因子也被二级PE标记的抗体结合(类似于夹心ELISA)。该图显示用编码IL-10产生的DNA(CMV-IL4载体)核转染的MSC产生足够的IL-10以使标准曲线饱和，而所有其它条件没有显示分泌的IL-10相对于未转染对照的变化。
图8是显示核转染的MSC分泌的白细胞介素-6(IL-6)的量的图。使用BD试剂盒测定MSC分泌的IL-6的量。该实验评估单独的电穿孔或用编码转基因的质粒的电穿孔是否影响IL-6的产生。使用IL-6的标准曲线(使用BD试剂盒标准品和软件生成)进行结果的定量。该实验显示电穿孔(使用4D AMAXATM，程序#FF104)诱导骨髓源MSC(BM-MSC)分泌IL-6，并且如果在核转染反应中包括转基因编码DNA，则该诱导被进一步增强。图8中显示的两个重复是通过BD 分析产生的技术重复。
图9显示了实施例2中讨论的刺激条件、诱导的细胞因子和工程化的MSC效应子的示意图。
图10显示了实施例2中描述的实验设计的示意图。
图11显示了表明工程化MSC表达适当的抗炎性细胞因子的图。P＝仅刺激的外周血单核细胞(PBMC)；P+M(cntl)＝与用对照质粒转染的MSC共培养的刺激的PBMC；P+M(4)＝与用IL-4表达质粒转染的MSC共培养的刺激的PBMC；P+M(10)＝与用IL-10表达质粒转染的MSC共培养的刺激的PBMC；P+M(4/10)＝与用IL-4和IL-10表达质粒(单个质粒为一半量)转染的MSC共培养的刺激的PBMC。条形代表生物学三次重复的平均值，误差条表示平均值的标准误差(S.E.M.)。
图12显示了表明工程化抗炎性细胞因子MSC改善MSC对PBMC促炎性细胞因子产生的内在抑制能力的图。
图13显示了表明工程化抗炎性细胞因子MSC抑制PBMC的促炎性细胞因子产生(对照MSC本身不能抑制)的图。
图14显示了表明组合IL-4/IL-10工程化抗炎性细胞因子MSC在抑制PBMC的促炎性细胞因子产生方面表现出比单一工程化抗炎性细胞因子MSC更强的抑制能力的图。平均数条上的斜杠标记表示超出图表标尺上限的水平。
图15显示了表明在某些情况下，工程化的抗炎性细胞因子MSC与对照MSC相比在抑制PBMC的促炎性细胞因子产生方面没有赋予任何更大的抑制能力的图。
图16显示了表明在某些情况下，工程化的抗炎性细胞因子MSC和对照MSC都不能抑制PBMC的促炎性细胞因子产生的图。
图17显示了表明与稀释数量的对照MSC的减小的抑制能力相比，工程化抗炎性细胞因子即使在稀释数量下仍显示出在抑制PBMC的促炎性细胞因子产生的抑制作用的图。
图18显示了表明工程化的抗炎性细胞因子MSC(IL-4)诱导PBMC产生额外的抗炎性细胞因子的图。
图19显示了ConA刺激的PBMC、工程化的MSC和共培养群体的细胞因子产生的总结。NoTrans＝未转染的MSC；Trans-DNA＝未用DNA转染的MSCs；Trans+DNA＝用对照质粒转染的MCS；IL4 MSC＝用IL-4表达质粒转染的MSC；IL10 MSC＝用IL-10表达质粒转染的MSC；ComboDNA＝用IL-4和IL-10表达质粒转染的MSC；Combo细胞＝单独用IL-4或IL-10表达质粒转染，然后以1：1混合的MSC；aPBMC＝用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的PBMC。
图20显示了ConA刺激的PBMC、工程化MSC和共培养群体的细胞因子产生的总结。NoTrans＝未转染的MSC；Trans-DNA＝未用DNA转染的MSC；Trans+DNA＝用对照质粒转染的MCS；IL4 MSC＝用IL-4表达质粒转染的MSC；IL10 MSC＝用IL-10表达质粒转染的MSC；ComboDNA＝用IL-4和IL-10表达质粒转染的MSC；Combo细胞＝单独用IL-4或IL-10表达质粒转染，然后以1：1混合的MSC；aPBMC＝用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激的PBMC。
图21显示与人CD4+T细胞共培养的MSC可以诱导调节性T细胞免疫表型。条形图显示各种培养条件的阳性百分比和MFI。
图22显示T细胞刺激诱导的炎性细胞因子被工程化以分泌抗炎性细胞因子IL-4或IL-10的MSC抑制。
图23显示注射的表达细胞因子的工程化MSC在体内维持细胞因子表达。每一个条形代表收集的每组2-5只小鼠的平均，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
图24显示了DSS结肠炎小鼠中由注射的工程化MSC导致的改善的重量和存活率。每一个群组表示每组8只小鼠的平均，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
图25显示了DSS结肠炎小鼠中由注射的工程化MSC导致的改善的血便和炎性脂质运载蛋白-2水平。每一个群组表示每组8只小鼠的平均，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
图26显示了DSS结肠炎小鼠中的MSC生物分布和持久性。荧光测量为每秒光子数。
图27显示了DSS结肠炎小鼠中结肠和脾内的MSC生物分布和持久性。左上是MSC-GFP，右上是MSC-IL4，左下是MSC-IL10，右下角是无MSC。荧光测量为每秒光子数。
图28显示了DSS结肠炎小鼠中由注射的抗炎性细胞因子特异性的工程化MSC导致的改善的血便和结肠长度。注射群组和测量以双盲方式进行。每一个群组表示每组5只小鼠的平均，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
图29A和29B显示慢病毒工作流程(图29A)和MSC的成功转导以产生工程化MSC(图29B)。
图30显示了产生工程化MSC的慢病毒转导，其导致缺乏炎性细胞因子表达的所需细胞因子表达。条形代表一式两份的技术复制。
图31显示了在DSS结肠炎小鼠中由注射的慢病毒工程化MSC导致的改善的体重、结肠长度、脂质运载蛋白-2水平及结肠组织病理学和增生评分。每一个群组表示每组8-10只小鼠的平均，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
图32显示了在DSS结肠炎小鼠中由注射的慢病毒工程化小鼠IL-4/IL-22组合MSC导致的改善的重量、结肠长度、脂质运载蛋白-2水平和原位结肠炎症L-012水平。每一个群组表示每组8-10只小鼠的平均，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
图33显示了在TNBS结肠炎小鼠中由注射的慢病毒工程化小鼠IL-22和IL-4/IL-22组合MSC导致的改善的结肠长度和原位结肠炎症L-012水平。每一个群组表示每组5只小鼠的平均，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
图34显示了小鼠IL-22的分泌蛋白表达以及工程化以表达小鼠IL-22的慢病毒转导的MSC的功能性受体信号传导磷酸-STAT3活性。
图35显示由工程化MSC产生的TNF-αFab抗体赛妥珠单抗(certolizumab)的成功产生、分泌、结合和TNF-α的功能拮抗作用。所有条件均作为三个生物学重复进行，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
图36显示了在TNBS结肠炎小鼠中趋化因子受体CXCR4、CCR2、CCR9和GPR15的工程化表达的组织生物分布和增加的MSC至发炎结肠的归巢。荧光素酶化学发光测量为每秒光子数。
图37显示了通过慢病毒转导递送至MSC中的由包含条件性NF-kB(核因子κ-B)响应启动子驱动小鼠IL-4，之后组成型启动子驱动GFP组成的遗传回路，其使它们能够感知炎性刺激并通过目标有效载荷IL-4的分泌而作出响应。所有条件均作为三个生物学重复进行，误差条代表平均值的标准误差(SEM)。
发明详述
间充质干细胞(MSC)(也称为间充质基质细胞)是源自中胚层的非造血成体干细胞的亚群。它们具有自我更新能力和多向分化性，不仅分化为中胚层谱系，如软骨细胞、骨细胞和脂肪细胞，还分化为外胚层细胞和内胚层细胞。由于没有伦理问题和畸胎瘤形成，MSC是用于治疗免疫疾病和非免疫疾病的细胞疗法的主要干细胞类型。它们可以很容易地从骨髓、脂肪组织、脐带、胎儿肝脏、肌肉和肺中分离，并且可以在体外成功地扩增。此外，MSC具有归巢至受损组织部位的趋势。当MSC外源性递送和系统地给予人和动物时，它们特别地迁移到具有炎症的受损组织部位。炎症指导的MSC归巢涉及几种重要的细胞运输相关分子，包括趋化因子、粘附分子和基质金属蛋白酶(MMP)。
本文提供了工程化的MSC(或其它免疫细胞类型)产生调节免疫系统的不同细胞类型或调节细胞的不同功能的效应分子的方法。这些MSC在本文中称为“工程化MSC”。这些MSC在自然界中不存在。在一些实施方案中，MSC被工程化以包含含有与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子的核酸(工程化核酸)。启动子可以是内源的(例如，细胞中基因组定位的)或外源的(例如，作为工程化核酸的成分引入细胞中的)。
应当理解，术语“细胞类型”包含“细胞亚型”。因此，经工程化以产生靶向T细胞的效应分子和靶向B细胞的效应分子两者的MSC被认为靶向两种不同的细胞类型。同样地，经工程化以产生靶向Th1细胞的效应分子和靶向Th17细胞的效应分子两者(T细胞的两种亚型)的MSC也被认为靶向两种不同的细胞类型。
“效应分子”是指与另一分子结合并调节与其结合的分子的生物学活性的分子(例如，诸如DNA或RNA的核酸，或者蛋白质(多肽)或肽)。例如，效应分子可以充当配体以增加或降低酶活性、基因表达或细胞信号传导。因此，在一些实施方案中，效应分子调节(激活或抑制)免疫系统的细胞。通过直接结合和调节分子，效应分子也可以间接地调节第二、下游分子。在一些实施方案中，效应分子是分泌的分子，而在其它的实施方案中，效应分子保持为细胞内的。例如，效应分子包括细胞内转录因子、微RNA和shRNA，其改变内部细胞状态以例如增强免疫调节活性、归巢特性或细胞持久性。效应分子的非限制性实例包括细胞因子、趋化因子、调节代谢物水平的酶、调节细胞因子的抗体或诱饵分子、归巢分子和/或整联蛋白。
术语“调节”包括维持生物活性、抑制(部分或完全)生物活性以及激活(部分或完全)生物活性。该术语还包括降低或增加(例如，增强)生物活性。当一种效应分子调节的细胞类型(例如，先天免疫细胞)与由另一种效应分子调节的细胞类型(例如，适应性免疫细胞)不同时，认为两种不同的效应分子“调节免疫系统的不同细胞类型”。
效应分子的调节可以是直接的或间接的。当效应分子与另一分子结合并调节该分子的活性时，发生直接调节。当效应分子与另一分子结合，调节该分子的活性，并且作为该调节的结果，再另一分子(效应分子未与其结合)的活性被调节时，发生间接调节。
在一些实施方案中，免疫系统细胞的调节导致细胞的生物活性相对于细胞的天然生物活性增加或降低至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)。例如，细胞的调节可导致细胞的生物活性相对于细胞的天然生物活性增加或降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。在一些实施方案中，免疫系统细胞的调节导致细胞的生物活性相对于细胞的天然生物活性增加或降低10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。
在一些实施方案中，免疫系统细胞的调节导致细胞的生物活性相对于细胞的天然生物活性增加或降低至少2倍(例如，2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，细胞的调节可导致细胞的生物活性相对于细胞的天然生物活性增加或降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，调节免疫系统的细胞类型可导致免疫系统中细胞的数量或活性相对于细胞的天然生物活性增加或降低2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。
细胞的“天然生物活性”是指细胞在其天然环境中，在不存在产生效应分子的工程化MSC(产生免疫系统细胞的环境中通常不存在的效应分子)的情况下的生物活性。
在一些实施方案中，MSC经工程化以产生至少两种(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种)效应分子，其中每一种效应分子调节免疫系统的不同细胞类型或调节细胞的不同功能。在其它的实施方案中，MSC经工程化以产生至少一种不是由MSC天然产生的效应分子。这种效应分子可以例如，补充由MSC天然产生的效应分子的功能。
在一些实施方案中，效应分子加和地起作用：例如，两种效应分子的作用等于该两种效应分子单独起作用的效果的总和。在其它的实施方案中，效应分子协同地起作用：例如，两种效应分子的作用大于该两种效应分子的组合功能。本公开还包括效应分子与产生它们的免疫细胞之间的加和和协同作用。
调节免疫系统细胞类型的效应分子可以是，例如，分泌的因子(例如，调节免疫系统中涉及的细胞外机制的细胞因子、趋化因子、抗体和/或诱饵受体)、控制细胞状态的细胞内因子(例如，微RNA和/或转录因子，其调节细胞状态以增强抗炎性或促炎性性质)、包装到外来体中的因子(例如，微RNA、细胞溶质因子和/或细胞外因子)、表面展示因子(例如，检查点抑制剂)和/或代谢基因(例如，产生/调节或降解代谢物或氨基酸的酶)。
在一些实施方案中，效应分子可选自以下非限制性分子类别：细胞因子(例如，IL-10)、细胞因子融合蛋白(例如，IL-233)、抗细胞因子抗体(例如，secukinumab，赛妥珠单抗，)、可溶性细胞因子受体(如IL-1RA)、膜结合细胞因子受体(如mIL-1RAII)、细胞因子结合域融合蛋白(如依那西普，)、细胞因子结合蛋白(如，IK18BP)、抗细胞因子受体抗体(如托珠单抗，)、免疫抑制受体(如PD-L1)、抗活化受体抗体、活化受体融合蛋白的配体(如阿巴西普，)、用于产生免疫调节化合物(例如，iNOS)的酶、抑制炎症的病原性效应物、针对细胞类型特异性表位的抗体、趋化因子、趋化因子受体和转录因子(例如用于诱导或维持MSC免疫抑制状态的转录因子)。
在一些实施方案中，MSC包含工程化的核酸，其包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，工程化核酸包含与编码至少2种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。例如，工程化核酸可包含与编码至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，工程化核酸包含与编码1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以包含至少两种工程化的核酸，其中每一种工程化核酸包含与编码至少一种(例如，1、2或3种)效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。例如，可以将MSC工程化为包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种工程化的核酸，其中每一种包含与编码至少一种(例如，1、2或3种)效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，MSC被工程化为包含2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种工程化的核酸，其中每一种包含与编码至少一种(例如，1、2或3种)效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
“工程化核酸”是非天然存在的核酸。然而，应该理解，虽然工程化的核酸作为整体不是天然存在的，但它可以包含天然存在的核苷酸序列。在一些实施方案中，工程化的核酸包含来自不同生物体(例如，来自不同物种)的核苷酸序列。例如，在一些实施方案中，工程化的核酸包含鼠核苷酸序列、细菌核苷酸序列、人类核苷酸序列和/或病毒核苷酸序列。术语“工程化核酸”包括重组的核酸和合成的核酸。“重组核酸”是指通过接合核酸分子而构建，并且在一些实施方案中，可以在活细胞中复制的分子。“合成的核酸”是指扩增的或者通过化学方式或通过其它方式合成的分子。合成的核酸包含化学修饰的或以其它方式修饰的，但可以与天然存在的核酸分子碱基配对的那些核酸。重组的核酸和合成的核酸还包括由前述任一种的复制产生的那些分子。本公开的工程化核酸可以由单一分子(例如，包含在相同的质粒或其它载体中的)或由多个不同分子(例如，多个不同的独立复制分子)编码。
可以使用标准分子生物学方法来产生本公开的工程化核酸(参见，例如，Green和Sambrook，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，2012，Cold Spring HarborPress)。在一些实施方案中，使用GIBSON Cloning产生工程化核酸构建体(参见，例如，Gibson，D.G.等，Nature Methods，343-345，2009；和Gibson，D.G.等，NatureMethods，901-903，2010，其中每一个都通过引用并入本文)。GIBSON 通常在单管反应中使用三种酶活性：5'核酸外切酶、DNA聚合酶的′Y延伸活性和DNA连接酶活性。5'核酸外切酶活性消化(chew back)5'末端序列，并暴露用于退火的互补序列。然后聚合酶活性填充退火区域上的间隙。然后，DNA连接酶将切口密封，并将DNA片段共价连接在一起。邻接片段的重叠序列比Golden Gate Assembly中使用的那些片段长得多，因此导致更高的正确组装的百分比。在一些实施方案中，使用克隆(Clontech)产生工程化的核酸构建体。
“启动子”是指核酸序列的控制区域，在该控制区域处核酸序列的其余部分的转录的起始和速率被控制。启动子还可以含有调节蛋白和分子可以在其处结合的子区域，例如RNA聚合酶和其它转录因子。启动子可以是组成型的、诱导型的、可激活的、可阻抑的、组织特异性的或其任何组合。启动子驱动其调节的核酸序列的表达或驱动其转录。本文中，当启动子处于与其调节的核酸序列相关的正确功能位置和方向中以控制(“驱动”)该序列的转录起始和/或表达时，认为该启动子是“可操作地连接的”。
启动子可以是与基因或序列天然相关的启动子，如可以通过分离位于给定基因或序列的编码区段上游的5'非编码序列而获得的。这种启动子可以称为“内源的”。在一些实施方案中，编码核酸序列可以位于重组或异源启动子的控制下，其是指通常不与其自然环境中的编码序列相关的启动子。这些启动子可包括其它基因的启动子；从任何其它细胞分离的启动子；和非“天然存在的”合成启动子或增强子，例如含有不同转录调节区域的不同元件和/或通过本领域已知的基因工程方法改变表达的突变的那些。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，序列可以使用重组克隆和/或核酸扩增技术来产生，包括聚合酶链式反应(PCR)(参见，例如，美国专利号4,683,202和美国专利号5,928,906)。
工程化核酸的启动子可以是“诱导型启动子”，其是指特征在于在信号存在、受信号影响或与信号接触时调节(例如，启动或激活)转录活性的启动子。信号可以是内源的或者是通常外部的条件(例如，光)、化合物(例如，化学或非化学化合物)或蛋白质(例如，细胞因子)，其以在调节诱导型启动子的转录活性方面是活性的方式与诱导型启动子接触。转录的激活可以涉及直接作用于启动子以驱动转录或通过使阻止启动子驱动转录的阻遏物失活而间接作用于启动子。相反，转录的失活可能涉及直接作用于启动子以阻止转录或通过激活然后作用于启动子的阻遏物而间接作用于启动子。
本文使用的启动子的非限制性实例包括对IFN-γ、IL-17A或TNF-α响应性的启动子。如果在信号存在下，启动子的转录被激活、失活、增加或减少，则启动子对该信号是“响应性”的。在一些实施方案中，启动子包含反应元件。“反应元件”是启动子区域内结合调控(调节)从该启动子的基因表达的特定分子(例如，转录因子)的短DNA序列。可根据本公开使用的反应元件包括但不限于干扰素-γ-激活序列(GAS)(Decker，T.等人，J InterferonCytokine Res.1997Mar；17(3):121-34，通过引用并入本文)、干扰素-刺激的反应元件(ISRE)(Han，K.J.等人，J Biol Chem.2004Apr 9；279(15):15652-61，通过引用并入本文)、NF-kappaB反应元件(Wang，V.等人，Cell Reports.2012；2(4):824-839，通过引用并入本文)和STAT3反应元件(Zhang，D.等人，J of Biol Chem.1996；271:9503-9509，通过引用并入本文)。其它反应元件包含在本文中。
启动子的其它非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、延伸因子(EFS)启动子、MND启动子(包含修饰的MoMuLV LTR的U3区域及骨髓增生性肉瘤病毒增强子的合成启动子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、猿猴病毒40(SV40)启动子和泛素C(UbC)启动子。
在一些实施方案中，本公开的启动子受免疫细胞调节。如果在免疫细胞(例如，产生增加或降低启动子活性的分子的免疫细胞)的存在下，启动子的活性相对于不存在免疫细胞时启动子的活性增加或降低至少10％，则认为免疫细胞调节启动子。在一些实施方案中，启动子的活性相对于不存在免疫细胞时启动子的活性增加或降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。例如，启动子的活性相对于不存在免疫细胞时启动子的活性增加或降低10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。
在一些实施方案中，启动子的活性相对于不存在免疫细胞时启动子的活性增加或降低至少2倍(例如，2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，启动子的活性相对于不存在免疫细胞时启动子的活性增加或降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，启动子的活性相对于不存在免疫细胞时启动子的活性增加或降低2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。
在一些实施方案中，本公开的启动子受到选自分泌IFN-γ、IL-17A或TNF-α的T细胞、Th1细胞、Th17细胞和M1巨噬细胞的免疫细胞的调节。
在一些实施方案中，本公开的启动子在低氧条件下被激活。“低氧条件”是身体或身体区域在组织水平被剥夺充分的氧供应的状态。低氧条件可引起炎症(例如，炎性细胞因子的水平在低氧条件下增加)。在一些实施方案中，在低氧条件下活化的启动子与编码效应分子的核苷酸可操作地连接，所述效应分子降低炎性细胞因子的活性的表达，从而减少由低氧条件引起的炎症。在一些实施方案中，在低氧条件下活化的启动子包含低氧响应元件(HRE)。“低氧响应元件(HRE)”是响应低氧诱导因子(HIF)的应答元件。在一些实施方案中，HRE包含共有基序NCGTG(其中N是A或G)。
在一些实施方案中，工程化MSC产生多种效应分子。例如，MSC可以工程化以产生2-20种不同的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2-11、2-10、2-9、2-8、2-7、2-6、2-5、2-4、2-3、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5、3-4、4-20、4-19、4-18、4-17、4-16、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6、4-5、5-20、5-19、5-18、5-17、5-16、5-15、5-14、5-13、5-12、5-11、5-10、5-9、5-8、5-7、5-6、6-20、6-19、6-18、6-17、6-16、6-15、6-14、6-13、6-12、6-11、6-10、6-9、6-8、6-7、7-20、7-19、7-18、7-17、7-16、7-15、7-14、7-13、7-12、7-11、7-10、7-9、7-8、8-20、8-19、8-18、8-17、8-16、8-15、8-14、8-13、8-12、8-11、8-10、8-9、9-20、9-19、9-18、9-17、9-16、9-15、9-14、9-13、9-12、9-11、9-10、10-20、10-19、10-18、10-17、10-16、10-15、10-14、10-13、10-12、10-11、11-20、11-19、11-18、11-17、11-16、11-15、11-14、11-13、11-12、12-20、12-19、12-18、12-17、12-16、12-15、12-14、12-13、13-20、13-19、13-18、13-17、13-16、13-15、13-14、14-20、14-19、14-18、14-17、14-16、14-15、15-20、15-19、15-18、15-17、15-16、16-20、16-19、16-18、16-17、17-20、17-19、17-18、18-20、18-19或19-20种效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种效应分子。
本公开的工程化MSC产生多种效应分子，其中至少两种调节免疫系统的不同细胞类型。
在一些实施方案中，MSC产生的至少一种效应分子直接或间接调节先天免疫细胞，和MSC产生的至少一种效应分子直接或间接调节适应性免疫细胞。
先天免疫是指抗原在体内出现后立即或数小时内发挥作用的非特异性防御机制。这些机制包含物理屏障如皮肤、血液中的化学物质以及攻击身体内的外来细胞的免疫系统细胞。先天免疫应答由抗原的化学特性激活。先天免疫系统的细胞的实例包括天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。
适应性免疫是指抗原特异性免疫反应。适应性免疫反应比先天免疫反应更复杂。抗原首先必须被处理和识别。一旦抗原被识别，适应性免疫系统就会产生一系列特别设计用于攻击该抗原的免疫细胞。适应性免疫还包括“记忆”，使得针对特定抗原的未来的反应更有效率。适应性免疫系统的细胞的实例包括T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞)和B细胞。
在一些实施方案中，MSC产生的至少一种效应分子直接或间接调节促炎性细胞，并且MSC产生的至少一种效应分子直接或间接调节抗炎性细胞。促炎性细胞的非限制性实例包括M1巨噬细胞、M1间充质干细胞、效应T细胞、Th17细胞、成熟树突细胞和B细胞。抗炎性细胞的非限制性实例包括M2巨噬细胞、M2间充质干细胞、T调节细胞、致耐受性树突细胞、调节性B细胞和Tr1细胞。
在一些实施方案中，MSC产生的至少一种效应分子直接或间接调节骨髓细胞，并且MSC产生的至少一种效应分子直接或间接调节淋巴细胞。骨髓细胞的非限制性实例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突细胞和巨核细胞。淋巴细胞的非限制性实例包括NK细胞、T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种归巢分子。“归巢”是指细胞主动导航(迁移)到靶位点(例如，细胞、组织或器官)。“归巢分子”是指将MSC指引向靶位点的分子。在一些实施方案中，归巢分子起到识别和/或启动MSC与靶位点的相互作用的功能。归巢分子的非限制性实例包括抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；和CXCR7。
在一些实施方案中，例如，归巢分子是结合于靶组织的内皮上的选择蛋白的配体(例如，造血细胞E-/L-选择蛋白配体(HCELL)，Dykstra等，Stem Cells.2016Oct；34(10):2501-2511)。
在一些实施方案中，归巢分子是趋化因子受体(结合趋化因子的细胞表面分子)。趋化因子是由细胞分泌的小细胞因子或信号蛋白，其可诱导细胞中的定向趋化性。趋化因子可分为四个主要亚家族：CXC、CC、CX3C和XC，它们都通过选择性结合位于靶细胞表面上的趋化因子受体发挥生物学作用。可以由本公开的工程化MSC产生的趋化因子受体的非限制性实例包括：CXC趋化因子受体(例如，CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6和CXCR7)、CC趋化因子受体(CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CCR10和CCR11)、CX3C趋化因子受体(例如，CX3Cl1)和XC趋化因子受体(例如，XCR1)。在一些实施方案中，趋化因子受体是G蛋白连接的跨膜受体。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生基质细胞衍生因子1(SDF1)，也称为C-X-C基序趋化因子12(CXCL12)。
在一些实施方案中，归巢分子是整联蛋白。整联蛋白是跨膜受体，其促进细胞-细胞外基质(ECM)粘附。整联蛋白是具有两个亚基的专性异二聚体：α(阿尔法)和β(贝塔)。整联蛋白的α亚基可以是，但不限于：CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、IGTA7、ITGA8、ITGA9、IGTA10、IGTA11、CD11D、CD103、CD11a、CD11b、CD51、CD41和CD11c。整联蛋白的β亚基可以是，但不限于：CD29、CD18、CD61、CD104、ITGB5、ITGB6、ITGB7和ITGB8。本公开的MSC可以工程化以产生整联蛋白α和β亚基的任何组合。
在一些实施方案中，归巢分子是基质金属蛋白酶(MMP)。MMP是切割内皮细胞壁下面的基底膜的组分的酶。MMP的非限制性实例包括MMP-2、MMP-9和MMP。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生抑制MMP的分子(例如蛋白质)的抑制剂。例如，MSC可以工程化以表达膜型1MNM(MT1-MMP)或TIMP金属肽酶抑制剂1(TIMP-1)的抑制剂(例如，RNAi分子)。
术语“归巢分子”还包括调节改善/增强MSC的归巢的分子的产生的转录因子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种生长因子。“生长因子”是刺激细胞生长、增殖、分化和/或愈合的物质。生长因子的非限制性实例包括血小板衍生的生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)和骨形态发生蛋白(BMP)。
生长因子的其它非限制性实例包含：肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、睫状神经营养因子家族、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子(m-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、ephrins、ephrin A1、ephrin A2、ephrinA3、ephrin A4、ephrin A5、ephrin B1、ephrin B2、ephrin B3、促红细胞生成素(EPO)、胎牛生长激素(FBS)、配体GDNF家族、神经胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、neurturin、persephin、artemin、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素、胰岛素样生长因子、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、白细胞介素、IL-1(IL-3和IL-6的辅助因子，激活T细胞)、IL-2(T细胞生长因子，刺激IL-1合成，激活B细胞和NK细胞)、IL-3(刺激所有非淋巴细胞的产生)、IL-4(活化的B细胞、静息T细胞和肥大细胞的生长因子)、IL-5(诱导活化B细胞和嗜酸性粒细胞的分化)、IL-6(刺激Ig合成，浆细胞的生长因子)、IL-7(前B细胞的生长因子)、角质形成细胞生长因子(KGF)、迁移刺激因子(MSF)、巨噬细胞刺激蛋白(MSP)，也称为肝细胞生长因子样蛋白(HGFLP)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经调节蛋白、神经调节蛋白1(NRG1)、神经调节蛋白2(NRG2)、神经调节蛋白3(NRG3)、神经调节蛋白4(NRG4)、神经营养素、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(NT-3)、神经营养素-4(NT-4)、胎盘生长因子(PGF)、renalase(RNLS，抗凋亡生存因子)、T细胞生长因子(TCGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、wnt信号通路中的蛋白质和血小板中的生长因子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种降低炎性细胞因子的表达或活性的效应分子。“炎性细胞因子”(也称为“促炎性细胞因子”)是从免疫细胞和某些其它促进炎症的细胞类型分泌的信号传导分子。炎性细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素-1(IL-1)、干扰素γ(IFN-γ)、IL-17A、IL-6、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18、IL-23、肿瘤坏死因子(TNF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。产生炎性细胞因子的细胞的非限制性实例包括T细胞、Th1细胞、Th17细胞和M1巨噬细胞，例如分泌IFN-γ、IL-17A或TNF-α的那些细胞。
如果炎性细胞因子的表达或活性相对于炎性细胞因子的天然表达或活性降低(减少)至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)，则认为效应分子降低炎性细胞因子的表达或活性。炎性细胞因子的“天然表达”是指在不存在产生效应分子的工程化MSC的情况下，炎性细胞因子在其天然环境中的基因或蛋白质表达水平。炎性细胞因子的“天然活性”是指在不存在产生效应分子的工程化MSC的情况下，炎性细胞因子在其天然环境中的蛋白质活性水平。降低炎性细胞因子表达或活性的效应分子的非限制性实例包括PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗(ustekinumab)、赛妥珠单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素(Galectin)-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗-整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33和CCL22(参见，例如，表1)。
在一些实施方案中，效应分子将炎性细胞因子的表达或活性相对于炎性细胞因子的天然表达或活性降低至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。例如，效应分子可相对于炎性细胞因子的天然表达或活性使炎性细胞因子的表达或活性降低10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。
在一些实施方案中，效应分子将炎性细胞因子的表达或活性相对于炎性细胞因子的天然的表达或活性降低至少2倍(例如，2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，效应分子可使炎性细胞因子的表达或活性相对于炎性细胞因子的天然表达或活性降低至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，效应分子将炎性细胞因子的表达或活性相对于炎性细胞因子的天然表达或活性降低2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种降低抗炎性细胞因子的表达或活性的效应分子。“抗炎性细胞因子”是从免疫细胞和某些其它控制促炎性细胞因子反应的细胞类型分泌的信号传导分子。抗炎性细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素-4(IL-4)、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2和IL-33。
如果抗炎性细胞因子的表达或活性相对于抗炎性细胞因子的天然表达或活性增加至少10％(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或200％)，则认为效应分子增加抗炎性细胞因子的表达或活性。抗炎性细胞因子的“天然表达”是指在不存在产生效应分子的工程化MSC的情况下，抗炎性细胞因子在其天然环境中的基因或蛋白质表达水平。抗炎性细胞因子的“天然活性”是指在不存在产生效应分子的工程化MSC的情况下，抗炎性细胞因子在其天然环境中的蛋白质活性水平。
在一些实施方案中，效应分子使抗炎性细胞因子的表达或活性相对于抗炎性细胞因子的天然表达或活性增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。例如，效应分子可以使抗炎性细胞因子的表达或活性相对于抗炎性细胞因子的天然表达或活性增加10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。
在一些实施方案中，效应分子使抗炎性细胞因子的表达或活性相对于抗炎性细胞因子的天然表达或活性增加至少2倍(例如，2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，效应分子可以将抗炎性细胞因子的表达或活性相对抗炎性细胞因子的天然表达或活性增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，效应分子将抗炎性细胞因子的表达或活性相对于抗炎性细胞因子的天然表达或活性增加2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种效应分子，其促进T调节细胞的转化、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集(例如，全身地或局部地，如在组织损伤或炎症部位处)。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种促进T调节表型的稳定性的效应分子。如果T调节细胞(例如，CD4+、FOXP3+、CD25+T调节细胞)的数量全身性的或者在炎症部位(例如，患病或受损的组织)处相对于天然T调节细胞状态增加至少10％，则效应分子被认为“促进T调节细胞的转化、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集”。“天然T调节细胞状态”是指在不存在效应分子的情况下存在于系统中或炎症部位处的T细胞的数量和类型。促进T调节细胞转化、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集的效应分子的非限制性实例包括TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2和IL-2变体。
在一些实施方案中，效应分子全身性地或在炎症部位上使T调节细胞(例如，CD4+、FOXP3+、CD25+T调节细胞)的数量相对于天然T调节细胞状态增加至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％。例如，效应分子可以全身性地或在炎症部位处使T调节细胞(例如，CD4+、FOXP3+、CD25+T调节细胞)的数量相对于天然T调节细胞状态增加10-20％、10-30％、10-40％、10-50％、10-60％、10-70％、10-80％、10-90％、10-100％、10-200％、20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-100％、20-200％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-100％或50-200％。
在一些实施方案中，效应分子全身性地或在炎症部位处使T调节细胞(例如，CD4+、FOXP3+、CD25+T调节细胞)的数量相对于天然T调节细胞状态增加至少2倍(例如，2、3、4、5、10、25、20、25、50或100倍)。例如，效应分子可以全身性地或在炎症部位处使T调节细胞(例如，CD4+、FOXP3+、CD25+T调节细胞)的数量相对于天然T调节细胞状态增加至少3倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，效应分子全身性地或在炎症部位处使T调节细胞(例如，CD4+、FOXP3+、CD25+T调节细胞)的数量相对于天然T调节细胞状态增加2-10、2-20、2-30、2-40、2-50、2-60、2-70、2-80、2-90或2-100倍。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生IL-4、IL-6或IL-10。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生IL-4、IL-6和IL-10。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生IL-4和IL-6。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生IL-4和IL-10。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生IL-6和IL-10。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生IL-4和/或IL-10，其中至少一种编码IL-4和/或IL-10的核酸与对IFN-γ、IL-17A、TNF-α、IL-18、IL-23、IL-5、IL-13和/或IL-1-β响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对IFN-γ响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对IL-17A响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对TNF-α响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对IL-18响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对IL-23响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对IL-5响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对IL-13响应性的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，MSC包含编码IL-4和/或IL-10的工程化核酸，其中该工程化核酸与对IL-1-β响应性的启动子可操作地连接。
免疫系统的细胞类型
免疫系统包括先天免疫系统和适应性系统，各自包含具有特定功能的不同类型的细胞。先天免疫系统包含保卫宿主免受其它生物体感染的细胞和机制。先天免疫系统(提供针对感染的即时防御)以非特异性方式识别病原体和对其作出响应，并且不向宿主提供持久的免疫力。先天免疫系统(例如，在诸如哺乳动物的脊椎动物中)的主要功能包括：通过产生化学因子将免疫细胞募集到感染部位，所述化学因子包括称为细胞因子的专用化学介质；激活补体级联以鉴别细菌、激活细胞和促进抗体复合物或死细胞的清除；通过专门的白细胞识别和去除器官、组织、血液和淋巴中存在的外来物质；通过称为抗原呈递的过程激活适应性免疫系统；和作为传染因子的物理和化学屏障发挥作用。
先天免疫系统的组成部分包括物理屏障(皮肤、胃肠道、呼吸道)、防御机制(分泌物、粘液、胆汁)和一般免疫反应(炎症)。白细胞(也称为白血球细胞)和吞噬细胞是在先天免疫系统和反应中起作用的主要细胞类型，其识别和消除可能引起感染的病原体。
白细胞不与特定器官或组织紧密相关，并且与独立的单细胞生物体类似地发挥功能。白细胞能够自由移动并与细胞碎片、外来颗粒和入侵的微生物相互作用和将其捕获。与身体中的许多其它细胞不同，大多数先天免疫白细胞不能自行分裂或繁殖，而是存在于骨髓中的多能造血干细胞的产物。白细胞的类型包括但不限于：肥大细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、先天淋巴细胞(ILC)和γ-δT细胞。
肥大细胞是一种先天免疫细胞类型，其驻留于结缔组织和粘膜中。肥大细胞与伤口愈合和针对病原体的防御相关，但也常常与变应性和过敏性相关。在激活时，肥大细胞迅速释放出富含组胺和肝素的特征性颗粒，以及各种激素介质和趋化因子或趋化性细胞因子进入环境中。组胺扩张血管，从而引起炎症的特有体征，并募集中性粒细胞和巨噬细胞。
嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞是与嗜中性粒细胞有关的细胞。当被病原体接触激活时，释放组胺的嗜碱性粒细胞在针对寄生虫的防御中是重要的，并在变态反应如哮喘中发挥作用。激活后，嗜酸性粒细胞分泌一系列高毒性蛋白质和自由基，其在杀死寄生虫方面非常有效，但在变态反应过程中也可能损伤组织。因此，嗜酸性粒细胞激活和毒素释放受到严格调控以防止任何不适当的组织破坏。
自然杀伤细胞(NK细胞)是先天免疫系统的组成部分，其不直接攻击入侵的微生物。相反，NK细胞破坏受损的宿主细胞，例如肿瘤细胞或病毒感染的细胞，其具有异常低水平的细胞表面标志物，称为MHC I(主要组织相容性复合物)-这种情况可能在宿主细胞的病毒感染中出现。NK细胞之所以如此命名，是因为它们不需要活化以杀死具有低表面MHC I分子的细胞的初始概念。
γ-δT细胞表现出使它们处于先天免疫和适应性免疫之间的边界处的特征。在一些情况下，γ-δT细胞可被认为是适应性免疫的组分，因为它们重排TCR基因以产生连接多样性并形成记忆表型。各种亚组也可以被认为是先天免疫系统的部分，其中限制的TCR或NK受体可以用作模式识别受体。例如，大量Vγ9/Vδ2T细胞对微生物产生的常见分子迅速反应，且高度限制的上皮内Vδ1T细胞将对应激的上皮细胞产生反应。
吞噬细胞是吞食或“吞噬”病原体或颗粒的先天免疫细胞。为了吞噬颗粒或病原体，吞噬细胞伸展其质膜的部分，将膜包裹在颗粒周围直至其被包围(颗粒现在在细胞内)。一旦在细胞内部，入侵的病原体就容纳在内体中，内体与溶酶体合并。溶酶体含有杀死和消化颗粒或生物体的酶和酸。通常，吞噬细胞在身体内巡逻而寻找病原体，但也能够对由其它细胞产生的一组高度特化的分子信号(称为细胞因子)起反应。吞噬细胞的类型包括但不限于：巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。
巨噬细胞是大的吞噬细胞，其能够通过迁移穿过毛细血管壁并进入细胞之间的区域以追踪入侵的病原体而移动到血管系统之外。在组织中，器官特异性的巨噬细胞与血液中存在的称为单核细胞的吞噬细胞不同。巨噬细胞是最有效的吞噬细胞，且可以吞噬大量细菌或者其它细胞或微生物。细菌分子与巨噬细胞表面上的受体的结合触发其通过产生“呼吸爆发”从而导致活性氧物质的释放而吞噬和破坏细菌。病原体还刺激巨噬细胞以产生趋化因子，其将其它细胞募集到感染部位。促进炎症的巨噬细胞被称为M1巨噬细胞，而那些减少炎症和促进组织修复的巨噬细胞被称为M2巨噬细胞。
嗜中性粒细胞以及另外两种细胞类型(嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)被称为粒细胞，因为它们的细胞质中存在颗粒，或者被称为多形核细胞(PMN)，因为其独特的裂片细胞核。中性粒细胞颗粒含有杀死或抑制细菌和真菌的生长的多种毒性物质。与巨噬细胞类似，嗜中性粒细胞通过激活呼吸爆发来攻击病原体。嗜中性粒细胞呼吸爆发的主要产物是强氧化剂，包括过氧化氢、游离氧自由基和次氯酸盐。嗜中性粒细胞是大量的，并且通常是第一种到达感染部位的细胞。
树突细胞(DC)是存在于与外部环境接触的组织，主要是皮肤(其中它们通常被称为朗格汉斯细胞)，以及鼻、肺、胃和肠的内部粘膜衬里中的吞噬细胞。它们因其与神经元树突的相似性而得名，但树突细胞不连接到神经系统。树突细胞在抗原呈递过程中非常重要，并且用作先天免疫系统和适应性免疫系统之间的联系。
先天淋巴细胞(ILC)在保护性免疫以及体内平衡和炎症的调节中起重要作用。ILC基于它们产生的细胞因子以及调节其发育和功能的转录因子进行分类。1类ILC产生1型细胞因子并包括自然杀伤细胞。2类ILC产生2型细胞因子，以及3类ILC产生细胞因子IL-17A和IL-22。自然杀伤细胞破坏受损的宿主细胞，如肿瘤细胞或病毒感染的细胞。他们可以在不存在抗体的情况下识别应激的细胞，从而使它们对受损的宿主细胞快速作出反应。
骨髓细胞是在先天免疫系统中起作用的细胞。骨髓细胞包括但不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突细胞和巨核细胞或血小板。淋巴细胞包括T细胞、B细胞和自然杀伤细胞。
适应性免疫系统产生适应性免疫反应。一般形式的适应性免疫反应始于辅助(TH、CD4+)和细胞毒性(CD8+)T细胞亚群通过其与表达与抗原性片段(源自抗原的特定氨基酸序列，其与MHC I和/或MHC II结合以在细胞表面上呈递)相关的主要组织相容性(MHC)-I类或II类分子的抗原呈递细胞(APC)相互作用的敏化。致敏或激发的CD4+T细胞产生参与B细胞以及各种T细胞亚群激活的淋巴因子。致敏的CD8+T细胞响应于淋巴因子而增加数量，并且能够破坏任何表达与匹配的MHC编码的I类分子结合的特异性抗原片段的细胞。因此，在癌性肿瘤的过程中，CTL根除表达癌症相关或癌症特异性抗原的细胞，从而限制肿瘤扩散和疾病发展的进程。
“B淋巴细胞”或“B细胞”是一种白细胞类型。B细胞通过分泌抗体在适应性免疫系统的体液免疫组分中起作用。B细胞具有两个主要功能：它们将抗原呈递给T细胞，和更重要的是，它们产生抗中和感染性微生物的抗体。抗体覆盖病原体表面并发挥三种主要作用：中和、调理素作用和补体激活。
当病原体由于被覆盖在抗体中而不能结合并感染宿主细胞时，发生中和。在调理素作用中，抗体结合的病原体可用作红旗(red flag)以提醒如嗜中性粒细胞和巨噬细胞的免疫细胞吞食和消化病原体。补体是直接破坏或裂解细菌的过程。
抗体以两种方式表达。位于B细胞表面上的B细胞受体(BCR)实际上是抗体。B细胞还分泌抗体以扩散和与病原体结合。这种双重表达是重要的，因为初始问题(例如，细菌)被独特的BCR识别并激活B细胞。活化的B细胞通过分泌抗体(主要是BCR，但是为可溶形式)来响应。这确保了反应特异性针对起动整个过程的细菌。
每一种抗体是独特的，但它们归属于大类：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。(Ig是免疫球蛋白的缩写，这是抗体的另一个名词。)虽然它们具有重叠的作用，但IgM通常对补体激活是重要的；IgD参与激活嗜碱性粒细胞；IgG对中和、调理作用和补体激活是重要的；IgA对胃肠道中的中和至关重要；和IgE对于在寄生和过敏反应中激活肥大细胞是必需的。
记忆B细胞激活始于其靶抗原(其由其亲本B细胞共享)的检测和结合。一些记忆B细胞可以在没有T细胞帮助的情况下被激活，例如某些病毒特异性记忆B细胞，但是其它记忆B细胞需要T细胞帮助。在抗原结合后，记忆B细胞通过受体介导的内吞作用摄取抗原，使其降解，并将其作为与细胞膜上的MHC-II分子复合的肽段呈递给T细胞。衍生自用相同抗原激活的T细胞的记忆T辅助(TH)细胞，通常是记忆滤泡T辅助(TFH)细胞，通过它们的TCR识别和结合这些MHC-II-肽复合物。在TCR-MHC-II-肽结合和传递来自记忆TFH细胞的其它信号后，记忆B细胞被激活并通过滤泡外反应分化成浆母细胞和浆细胞或者进入生发中心反应，在那里它们产生浆细胞和更多的记忆B细胞。
调节性B细胞(Breg)代表小的B细胞群体，其参与免疫调节和免疫反应的抑制。这些细胞通过不同的机制调节免疫系统。主要机制是产生抗炎性细胞因子白细胞介素10(IL-10)。Breg的调节作用在炎症、自身免疫疾病、移植反应和抗肿瘤免疫的各种模型中有所描述。
T细胞具有多种作用，并按亚群分类。基于细胞表面存在哪种蛋白质，T细胞分为两大类：CD8+T细胞或CD4+T细胞。T细胞完成多种功能，包括杀死感染的细胞和激活或募集其它免疫细胞。
CD8+T细胞也称为细胞毒性T细胞或细胞毒性淋巴细胞(CTL)。它们对于识别和清除病毒感染的细胞和癌细胞至关重要。CTL具有特化的区室或颗粒，其含有引起细胞凋亡(程序性细胞死亡)的细胞毒素。由于其效能，颗粒的释放受到免疫系统的严格调控。
四个主要的CD4+T细胞亚群是Th1、Th2、Th17和Treg，其中“Th”指的是“T辅助细胞”。Th1细胞对于协调针对细胞内微生物，特别是细菌的免疫反应是至关重要的。它们产生并分泌醒示和激活其它免疫细胞的分子(如摄入细菌的巨噬细胞)。通过警示B细胞、粒细胞和肥大细胞，Th2细胞对于协调针对细胞外病原体(如蠕虫(寄生蠕虫))的免疫反应是重要的。Th17细胞以其产生白细胞介素17(IL-17)的能力而得名，白细胞介素17是激活免疫和非免疫细胞的信号传导分子。Th17细胞对于募集嗜中性粒细胞是重要的。
调节性T细胞(Treg)监测并抑制其它T细胞的活性。它们防止不利的免疫激活和维持耐受性，或防止对身体自身细胞和抗原的免疫反应。1型调节性T(Tr1)细胞是调节性T细胞的可诱导亚群，其在促进和维持耐受中起关键作用。Tr1细胞控制免疫反应的主要机制是高水平IL-10的分泌，以及通过释放颗粒酶B杀死骨髓细胞。
记忆T细胞是抗原特异性T细胞的亚群，其在初始T细胞反应后长期持续存在。它们在重新暴露于其同源抗原后迅速扩增至大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去抗原的“记忆”。本文所述的癌症疫苗为免疫系统提供针对肿瘤特异性抗原的“记忆”，从而引发针对新出现的癌细胞或转移的癌细胞的强烈免疫反应。
淋巴细胞或淋巴样细胞是脊椎动物的适应性免疫系统中的白血细胞。淋巴细胞包含自然杀伤细胞(NK细胞)(其在细胞介导的细胞毒性先天免疫中起作用)、T细胞(用于细胞介导的、细胞毒性适应性免疫)和B细胞(用于体液、抗体驱动的适应性免疫)。
工程化干细胞的实例
本公开主要提及间充质干细胞(工程化以产生多种效应分子的MSC)。然而，应当理解，本公开不限于工程化MSC，而是旨在涵盖免疫系统的其它细胞类型。例如，如本文提供的，工程化细胞(工程化以产生效应分子)可选自天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞、T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞(CD4+、FOXP3+、CD25+))和B细胞。因此，在任何实施方案中，本发明的MSC可以替代为上述免疫细胞类型之一。
在一些实施方案中，细胞是经工程化以产生多种效应分子的MSC，其中至少两种分子调节免疫系统的不同细胞类型。例如，一种效应分子可以直接或间接调节先天免疫细胞，和另一种效应分子可以直接或间接调节适应性免疫细胞。先天免疫细胞的非限制性实例包括天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。适应性免疫细胞的非限制性实例包括T细胞(例如，CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞(CD4+、FOXP3+、CD25+))和B细胞。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节NK细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节NKT细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节肥大细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜酸性粒细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜碱性粒细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨噬细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜中性粒细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节树突细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节NK细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节NKB细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节肥大细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜酸性粒细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜碱性粒细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨噬细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜中性粒细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节树突细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。
作为另一个实例，一种效应分子可以直接或间接调节促炎性细胞，和另一种效应分子可以直接或间接地抗炎性细胞。促炎性细胞的非限制性实例包括M1巨噬细胞、M1间充质干细胞、效应T细胞、Th1细胞、Th17细胞、成熟树突细胞和B细胞。抗炎性细胞的非限制性实例包括M2巨噬细胞、M2间充质干细胞、T调节细胞、致耐受性树突细胞、调节性B细胞、Th2细胞和Tr1细胞。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1巨噬细胞的效应分子和调节M2巨噬细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1间充质干细胞的效应分子和调节M2巨噬细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节效应T细胞的效应分子和调节M2巨噬细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th1细胞的效应分子和调节M2巨噬细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th17细胞的效应分子和调节M2巨噬细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节成熟树突细胞的效应分子和调节M2巨噬细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节B细胞的效应分子和调节M2巨噬细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1巨噬细胞的效应分子和调节M2间充质干细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1间充质干细胞的效应分子和调节M2间充质干细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节效应T细胞的效应分子和调节M2间充质干细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th1细胞的效应分子和调节M2间充质干细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th17细胞的效应分子和调节M2间充质干细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节成熟树突细胞的效应分子和调节M2间充质干细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节B细胞的效应分子和调节M2间充质干细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1巨噬细胞的效应分子和调节T调节细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1间充质干细胞的效应分子和调节T调节细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节效应T细胞的效应分子和调节T调节细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th1细胞的效应分子和调节T调节细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th17细胞的效应分子和调节T调节细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节成熟树突细胞和调节T调节细胞的效应分子的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节B细胞的效应分子和调节T调节细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1巨噬细胞的效应分子和调节致耐受性树突细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1间充质干细胞的效应分子和调节致耐受性树突细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节效应T细胞的效应分子和调节致耐受性树突细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th1细胞的效应分子和调节致耐受性树突细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th17细胞的效应分子和调节致耐受性树突细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节成熟树突细胞的效应分子和调节致耐受性树突细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节B细胞的效应分子和调节致耐受性树突细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1巨噬细胞的效应分子和调节调节性B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1间充质干细胞的效应分子的和调节调节性B细胞效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节效应T细胞的效应分子和调节调节性B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th1细胞的效应分子和调节调节性B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th17细胞的效应分子和调节调节性B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节成熟树突细胞的效应分子和调节调节性B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节B细胞的效应分子和调节调节性B细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1巨噬细胞的效应分子和调节Th2细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1间充质干细胞的效应分子和调节Th2细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节效应T细胞的效应分子和调节Th2细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th1细胞的效应分子和调节Th2细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th17细胞的效应分子和调节Th2细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节成熟树突细胞的效应分子和调节Th2细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节B细胞的效应分子和调节Th2细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1巨噬细胞的效应分子和调节Tr1细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节M1间充质干细胞的效应分子和调节Tr1细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节效应T细胞的效应分子和调节Tr1细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th1细胞的效应分子和调节Tr1细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节Th17细胞的效应分子和调节Tr1细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节成熟树突细胞的效应分子和调节Tr1细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节B细胞的效应分子和调节Tr1细胞的效应分子。
而作为又一个实施例，一种效应分子可以直接或间接调节骨髓细胞，和另一种效应分子可以直接或间接地淋巴细胞。骨髓细胞的非限制性实例包括单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突细胞和巨核细胞。淋巴细胞的非限制性实例包括NK细胞、T细胞和B细胞。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节单核细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨噬细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜中性粒细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜碱性粒细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜酸性粒细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节红细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节树突细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨核细胞的效应分子和调节NK细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节单核细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨噬细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜中性粒细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜碱性粒细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜酸性粒细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节红细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节树突细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨核细胞的效应分子和调节T细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节单核细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨噬细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜中性粒细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜碱性粒细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节嗜酸性粒细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节红细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节树突细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。在一些实施方案中，MSC被工程化以产生调节巨核细胞的效应分子和调节B细胞的效应分子。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生多种效应分子，其各自靶向不同的T细胞。例如，MSC可以被工程化以产生至少一种(例如，至少2、3或4种)调节(例如，抑制)Th1细胞和Th17细胞的效应分子。作为另一个实例，MSC可以被工程化以产生至少一种(例如，至少2、3或4种)抑制Th1细胞和/或Th17细胞的效应分子和至少一种促进T调节细胞的转化、增加T调节细胞的发生率、增加T调节细胞的募集或促进T调节细胞的稳定性的效应分子。
在一些实施方案中，除了产生多种效应分子之外，MSC可以被工程化以产生归巢分子、生长因子或者归巢分子和生长因子两者。
归巢分子的非限制性实例包括抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；和CXCR7。因此，在一些实施方案中，MSC被工程化以产生抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；和CXCR7；或者两种或更多种前述归巢分子的任何组合。
生长因子的非限制性实例包括PDGF、FGF、EGF和BMP。因此，在一些实施方案中，MSC被工程化以产生PDGF、FGF、EGF和BMP，或者两种或更多种前述生长因子的任何组合。
在一些实施方案中，MSC被工程化以产生至少一种(例如，至少2种或至少3种)选自α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；和CXCR7的归巢分子，和至少一种(例如，至少2种或至少3种)选自PDGF、FGF、EGF和BMP的生长因子。
本公开的间充质干细胞通常包含工程化核酸，其包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。启动子的非限制性实例包括巨细胞病毒(CMV)启动子、延伸因子1-α(EF1a)启动子、延伸因子(EFS)启动子、MND启动子(含有修饰的MoMuLV LTR的U3区及骨髓增生性肉瘤病毒增强子的合成启动子)、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、脾脏病灶形成病毒(SFFV)启动子、猿病毒40(SV40)启动子或泛素C(UbC)启动子。本公开还包含其它天然或合成启动子。
效应分子(例如，由工程化的核酸编码的)的非限制性实例包括PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗-整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33和CCL22(参见表1)。
在一些实施方案中，启动子是CMV，和效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗-整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是抗-TNFα在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是CMV且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是抗TNFα在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是EF1a且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是抗TNFα在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是EFS且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是抗TNFα在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是MND且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是抗TNFα在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是PGK且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是SFFV并且效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是SFFV并且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是抗TNFα在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是SFFV且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是抗TNFα在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是SV40且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM或抗-MMP9。
在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是PD-L1(B7H1)。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IL-1RA。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是可溶性IFNR。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是优特克单抗。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是TNFR的p75。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是抗TNFα在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是阿达木单抗。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是MEDI2070。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IL-10。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IL-11。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IL-13。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IL-4。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IL-35。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IL-22。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是IDO。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是iNOS。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是COX2。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是HO1。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是TSG-6。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是半乳糖凝集素-9。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是LIF。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是HLA-G5。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是HIF-2-α。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是抗-TL1A单克隆抗体。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是抗-整联蛋白α4,β7。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是抗-MAdCAM。在一些实施方案中，启动子是UbC且效应分子是抗-MMP9。
在一些实施方案中，MSC包含与由免疫细胞调节的启动子可操作地连接，且编码降低炎性细胞因子表达或炎性细胞因子活性的效应分子的工程化核酸。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子是对IFN-γ响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子是对IL-17A响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子是对TNFα响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNFα是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNFα是响应性的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。在其中免疫细胞是T细胞且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。
在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对TNFα是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNFα是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNFα是响应性的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α，TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。
在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。
在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。
在一些实施方案中，MSC包含与在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下活化的启动子可操作地连接，并编码降低炎性细胞因子表达或炎性细胞因子活性的效应分子的工程化核酸。在一些实施方案中，启动子包含选自GAS、ISRE、NF-κB反应元件和STAT3反应元件的反应元件。在其中启动子在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下被活化的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中启动子在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下被激活的任何前述实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。
在一些实施方案中，MSC包含与在低氧条件下活化的启动子可操作地连接，并编码降低炎性细胞因子表达或炎性细胞因子活性的效应分子的工程化核酸。启动子可包含例如，低氧响应元件(HRE)。在一些实施方案中，启动子对HIF-1a转录因子是响应性的。在一些实施方案中，效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在一些实施方案中，炎性细胞因子可以是IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNFα、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18或IL-23。
在一些实施方案中，MSC包含与由免疫细胞调节的启动子可操作地连接，并编码降低抗炎性细胞因子表达或抗炎性细胞因子活性的效应分子的工程化核酸。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。
在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。
在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件、IL-17A或TNF-α的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。
在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。
在一些实施方案中，MSC包含与在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下活化的启动子可操作地连接，并编码降低抗炎性细胞因子表达或抗炎性细胞因子活性的效应分子的工程化核酸。在一些实施方案中，启动子包含选自GAS、ISRE、NF-κB反应元件和STAT3反应元件的反应元件。在其中启动子在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下活化的任何前述实施方案中，效应分子可以是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在其中启动子在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下活化的任何前述实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。
在一些实施方案中，MSC包含与在低氧条件下活化的启动子可操作地连接，并编码降低抗炎性细胞因子表达或抗炎性细胞因子活性的效应分子的工程化核酸。启动子可包含例如低氧响应元件(HRE)。在一些实施方案中，启动子对HIF-1a转录因子是响应性的。在一些实施方案中，效应分子是PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。在一些实施方案中，抗炎性细胞因子可以是IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2或IL-33。
在一些实施方案中，MSC包含与由免疫细胞调节的启动子可操作地连接，并编码促进T调节细胞的转化、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集的效应分子的工程化核酸。
在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。在其中免疫细胞是T细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。
在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th1细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35，PD-L1、IL-2或IL-2变体。在其中免疫细胞是Th1细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。
在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是Th17细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。在其中免疫细胞是Th17细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。
在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对IFN-γ是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对IL-17A是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子对TNF-α是响应性的。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含干扰素-γ-激活序列(GAS)。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含干扰素刺激反应元件(ISRE)。在一些实施方案中，免疫细胞是M1巨噬细胞，并且启动子包含NF-κB反应元件。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。在其中免疫细胞是M1巨噬细胞并且启动子包含GAS、ISRE或NF-κB反应元件的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。
在一些实施方案中，MSC包含与在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下活化的启动子可操作地连接，并编码促进T调节细胞的转化、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集的效应分子的工程化核酸。在一些实施方案中，启动子包含选自GAS、ISRE、NF-κB反应元件和STAT3反应元件的反应元件。在其中启动子在IFNγ、IL-17A或TNF-α存在下被活化的任何前述实施方案中，效应分子可以是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。
在一些实施方案中，MSC包含与在低氧条件下活化的启动子可操作地连接并编码促进T调节细胞的转化、增加T调节细胞的发生率的效应分子的工程化核酸。启动子可包含例如，低氧响应元件(HRE)。在一些实施方案中，启动子对HIF-1a转录因子是响应性的。在一些实施方案中，效应分子是TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2或IL-2变体。
方法
本文还提供了包括培养本公开的工程化MSC的方法。培养MSC的方法是已知的。在一些实施方案中，MSC在生长培养基(例如，MSCGM人间充质干细胞生长BULLETKITTM培养基(含血清)、THERAPEAKTMMSCGM-CDTM间充质干细胞化学定义培养基(无血清)或RoosterBio无xeno MSC培养基)中培养。
本文进一步提供的方法包括向受试者(例如，人受试者)递送或施用如本文提供的工程化MSC以在体内产生至少一种由MSC产生的效应分子。在一些实施方案中，MSC静脉内、腹膜内、全身或局部(例如，至炎症部位)施用。在一些实施方案中，MSC在炎症峰值之前或在炎症峰值时施用。
一些方法包括选择具有失调的特定炎症标志物的受试者(或患者群体)，和用调节该失调的炎症标志物的工程化MSC治疗该受试者。例如，受试者可具有升高的TNFα，并且可用产生效应分子(例如，抗-TNFα分子)的工程化MSC治疗，效应分子的表达受TNFα响应启动子调节。
在一些情况下，本公开的工程化MSC可用于治疗炎性肠病，例如溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。本文涵盖其它自身免疫疾病和/或炎性障碍。例如，可以向受试者递送工程化MSC，所述受试者患有阿尔茨海默病、强直性脊柱炎、关节炎(例如，骨关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病性关节炎)、哮喘、动脉粥样硬化、皮炎、憩室炎、纤维肌痛、肝炎、系统性红斑狼疮(SLE)、肾炎或帕金森病。
表1.示例性效应分子
另外的实施方案
本公开包括以编号段落呈现的以下实施方案：
1.一种间充质干细胞，其被工程化以产生(a)多种效应分子(例如，细胞因子、趋化因子、抗体、诱饵受体、酶、细胞表面蛋白或其组合)，其中至少两种调节免疫系统的不同的细胞类型(例如，调节不同细胞类型的功能)或相同细胞类型的不同功能，或者(b)至少一种归巢分子和至少一种调节免疫系统的细胞类型的效应分子。
2.如段落1所述的间充质干细胞，其包含工程化核酸，所述工程化核酸包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
3.如段落2所述的间充质干细胞，其包含工程化核酸，所述工程化核酸包含与编码至少两种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
4.如段落1所述的间充质干细胞，其包含至少两种工程化的核酸，其中每一种包含与编码至少一种效应分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
5.如段落1-4中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子直接或间接调节先天免疫细胞，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子直接或间接调节适应性免疫细胞。
6.如段落5所述的间充质干细胞，其中所述先天免疫细胞选自天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞。
7.如段落5或6所述的间充质干细胞，其中所述适应性免疫细胞选自T细胞和B细胞。
8.如段落7所述的间充质干细胞，其中所述T细胞选自CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞。
9.如段落1-4中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子直接或间接调节促炎性细胞，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子直接或间接调节抗炎性细胞。
10.如段落9所述的间充质干细胞，其中所述促炎性细胞选自M1巨噬细胞、M1间充质干细胞、效应T细胞、Th1细胞、Th17细胞、成熟树突细胞和B细胞。
11.如段落9或10所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞选自M2巨噬细胞、M2间充质干细胞、T调节细胞、致耐受性树突细胞、调节性B细胞和Tr1细胞。
12.如段落1-4中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子直接或间接调节骨髓细胞，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子直接或间接调节淋巴细胞。
13.如段落12所述的间充质干细胞，其中骨髓细胞选自单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红细胞、树突细胞和巨核细胞。
14.如段落12或13所述的间充质干细胞，其中所述淋巴细胞选自NK细胞、T细胞和B细胞。
15.如段落1-14中任一段所述的间充质干细胞，其中该间充质干细胞经工程化以产生归巢分子。
16.如段落15所述的间充质干细胞，其中所述归巢分子选自：抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；和CXCR7。
17.如段落1-16中任一段所述的间充质干细胞，其中该间充质干细胞经工程化以产生生长因子。
18.如段落17所述的间充质干细胞，其中所述生长因子选自：PDGF、FGF、EGF和BMP。
19.如段落2-18中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子是诱导型启动子。
20.如段落2-18中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子是CMV启动子、EF1a启动子、EFS启动子、MND启动子、PGK启动子、SFFV启动子、SV40启动子或UbC启动子。
21.如段落2-18中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子是合成启动子。
22.如段2-21中任一段所述的间充质干细胞，其中所述合成启动子包含转录因子结合结构域。
23.如段落1-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述至少一种效应分子选自PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。
24.如段2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子受免疫细胞(例如，免疫细胞的产物，例如细胞因子或趋化因子)调节，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子降低炎性细胞因子的表达或炎性细胞因子的活性。
25.如段落24所述的间充质干细胞，其中所述免疫细胞选自分泌IFN-γ、IL-17A或TNF-α的T细胞、Th1细胞、Th17细胞和M1巨噬细胞。
26.如段落25所述的间充质干细胞，其中所述启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的。
27.如段落24-26中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含选自干扰素-γ-激活序列(GAS)、干扰素刺激反应元件(ISRE)和NF-κB反应元件的反应元件。
28.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子在IFN-γ、IL-17A、TNF-α或IL-6存在下被激活，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子降低炎性细胞因子的表达或炎性细胞因子的活性。
29.如段落28的间充质干细胞，其中所述启动子包含选自GAS、ISRE、NF-κB反应元件和STAT3反应元件的反应元件。
30.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子在低氧条件下被激活，并且其中由所述间充质干细胞产生的至少一种效应分子降低炎性细胞因子的表达或炎性细胞因子的活性。
31.如段落30所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含低氧响应元件(HRE)。
32.如段落31所述的间充质干细胞，其中所述启动子对HIF-1a转录因子是响应性的。
33.如段落24-32中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子选自PD-L1(B7H1)、IL-1RA、可溶性IFNR、优特克单抗、TNFR的p75、抗-TNFα阿达木单抗、MEDI2070、IL-10、IL-11、IL-13、IL-4、IL-35、IL-22、IDO、iNOS、COX2、HO1、TSG-6、半乳糖凝集素-9、LIF、HLA-G5、HIF-2-α、抗-TL1A单克隆抗体、抗整联蛋白α4,β7、抗-MAdCAM、抗-MMP9、TGF-β、IL-33或CCL22。
34.如段落24-33中任一段所述的间充质干细胞，其中该炎性细胞因子选自：IFN-γ、IL-17A、IL-6、IFN-α、TNF-α、IL-1b、IL-8、IL-12(p70)、IL-18和IL-23。
35.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子受免疫细胞(例如，免疫细胞的产物，例如细胞因子或趋化因子)调节，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子是抗炎性细胞因子，或者其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子增加抗炎性细胞因子的表达或抗炎性细胞因子的活性。
36.如段落35所述的间充质干细胞，其中免疫细胞选自分泌IFN-γ、IL-17A或TNF-α的T细胞、Th1细胞、Th17细胞和M1巨噬细胞。
37.如段落36所述的间充质干细胞，其中所述启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的。
38.如段落35-37中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含选自干扰素-γ-激活序列(GAS)、干扰素刺激反应元件(ISRE)和NF-κB反应元件的反应元件。
39.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子在IFN-γ、IL-17A或TNF-α存在下被激活，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子是抗炎性细胞因子，或其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子增加抗炎性细胞因子的表达或抗炎性细胞因子的活性。
40.如段落39所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含选自GAS、ISRE、NF-κB反应元件和STAT3反应元件的反应元件。
41.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子在低氧条件下被激活，并且其中由所述间充质干细胞产生的至少一种效应分子是抗炎性细胞因子，或其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子增加抗炎性细胞因子的表达或抗炎性细胞因子的活性。
42.如段落41所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含低氧响应元件(HRE)。
43.如段落42所述的间充质干细胞，其中所述启动子对HIF-1a转录因子是响应性的。
44.如段落35-43中任一段所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞因子选自：IL-4、IL-5、IL-10、IL-13、CCL2和IL-33。
45.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子受免疫细胞(例如，免疫细胞的产物，例如细胞因子或趋化因子)调节，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子促进T调节细胞的转化、促进T调节细胞的稳定性、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集。
46.如段落45所述的间充质干细胞，其中该免疫细胞选自分泌IFN-γ、IL-17A或TNF-α的T细胞、Th1细胞、Th17细胞和M1巨噬细胞。
47.如段落46所述的间充质干细胞，其中所述启动子对IFN-γ、IL-17A或TNF-α是响应性的。
48.如段落45-47中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含选自干扰素-γ-激活序列(GAS)、干扰素刺激反应元件(ISRE)和NF-κB反应元件的反应元件。
49.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子在IFN-γ、IL-17A或TNF-α存在下被激活，并且其中所述效应分子促进T调节细胞的转化、促进T调节细胞的稳定性、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集。
50.如段落49所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含选自GAS、ISRE、NF-κB反应元件和STAT3反应元件的反应元件。
51.如段落2-22中任一段所述的间充质干细胞，其中所述启动子在低氧条件下被激活，并且其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子促进T调节细胞的转化、促进T调节细胞的稳定性、增加T调节细胞的发生率或增加T调节细胞的募集。
52.如段落51所述的间充质干细胞，其中所述启动子包含低氧响应元件(HRE)。
53.如段落52所述的间充质干细胞，其中所述启动子对HIF-1a转录因子是响应性的。
54.如段落45-53中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子选自TGF-β、托珠单抗(抗-IL6)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、IL-35、PD-L1、IL-2和IL-2变体。
55.如段落1-22中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子调节由间充质干细胞天然产生的分子。
56.如段落55所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子增加或降低由间充质干细胞天然产生的分子的活性。
57.如段落56所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子和由间充质干细胞天然产生的分子的表达和/或活性通过相同的输入信号调节。
58.如段落56所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子和由间充质干细胞天然产生的分子的表达和/或活性通过不同的输入信号调节。
59.如段落1-22中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子补充由间充质干细胞天然产生的分子。
60.如段落1-22中任一段所述的间充质干细胞，其中由间充质干细胞产生的至少一种效应分子调节和补充由间充质干细胞天然产生的分子。
61.一种方法，其包括培养段落1-60中任一段所述的间充质干细胞以产生效应分子。
62.一种方法，其包括将段落1-60中任一段所述的间充质干细胞递送至受试者以在体内产生由间充质干细胞产生的至少一种效应分子。
63.一种治疗炎性肠病的方法，其包括：
向诊断患有炎性肠病的受试者递送段落1-60中任一段所述的间充质干细胞。
64.如段落63所述的方法，其中该炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
65.一种产生多功能免疫调节细胞的方法，其包括：
(a)向间充质干细胞递送至少一种编码至少两种效应分子的工程化核酸，或
(b)向间充质干细胞递送至少两种工程化的核酸，其中每一种编码至少一种效应分子，
其中每一种效应分子调节免疫系统的不同细胞类型或调节细胞的不同功能。
66.一种调节受试者免疫系统的多种细胞类型的方法，包括向受试者递送至少两种间充质干细胞，其每一种经工程化以产生效应分子，其中效应分子的至少两种调节免疫系统的不同细胞类型。
67.如权利要求1-60中任一项所述的间充质干细胞，其中所述效应分子是抗炎性分子，并且所述归巢分子选自CXCR4、CCR2、CCR9和GPR15(可以使用本文描述的其它归巢分子)。
68.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性分子是IL-4。
69.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性分子是IL-10。
70.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中抗炎性分子是IL-35。
71.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性分子是PD-L1-Ig。
72.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性分子是抗-TNF-α。
73.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性分子是吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)。
74.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性分子是α-1抗胰蛋白酶。
75.如权利要求67所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性分子是伤口愈合分子。
76.如权利要求75所述的间充质干细胞，其中所述伤口愈合分子是IL-22。
77.如权利要求75所述的间充质干细胞，其中所述伤口愈合分子是IL-19。
78.如权利要求75所述的间充质干细胞，其中所述伤口愈合分子是IL-20。
79.如权利要求67-78中任一项所述的间充质干细胞，其中所述归巢分子是CXCR4。
80.如权利要求67-79中任一项所述的间充质干细胞，其中所述归巢分子是CCR2。
81.如权利要求67-80中任一项所述的间充质干细胞，其中所述归巢分子是CCR9。
82.如权利要求67-81中任一项所述的间充质干细胞，其中所述归巢分子是GPR15。
83.如权利要求1-60中任一项所述的间充质干细胞，其中所述效应分子之一是细胞因子(例如，抗炎性细胞因子)，并且效应分子之一是趋化因子(例如，募集抗炎性细胞的趋化因子)。
84.如权利要求1-60中任一项所述的间充质干细胞，其中该间充质干细胞未经工程化以表达趋化因子(例如，不包含编码趋化因子的工程化核酸)。
实施例
实施例1
用选自以下的各种表达载体对间充质干细胞(MSC)进行核转染：
pmaxGFP(阳性对照)
CMV-IL4表达载体(无荧光报告基因)
CMV-IL10表达载体(无荧光报告基因)
2x阴性对照(无DNA，未转染)
在核转染后24小时收集来自MSC的上清液并冷冻。随后使用试剂盒分析上清液，定量七种细胞因子IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17A和IFN-γ。这些实验的结果在图3A-8中示出并描述。
实施例2
用伴刀豆球蛋白A(ConA)或脂多糖(LPS)刺激PBMC以诱导各种促炎性细胞因子的产生。产生了表达抗炎性细胞因子IL-4、IL-10、IL-4/IL-10两者的工程化MSC或对照用于与受刺激的PBMC的共培养实验(在图9中图示)。
用对照质粒、IL-4表达质粒(pN[IL-4])、IL-10表达质粒(pN[IL-10])或IL-4和IL-10表达质粒两者(每一个为单一质粒的一半量)的组合转染骨髓来源的MSC(BM-MSCS)。转染后，将工程化MSC静置过夜。第二天，在有实验样品的组织培养物处理的96孔平底板中以每孔25,000个细胞用LPS[1μg/ml]或ConA[2.5μg/ml]刺激PBMC，其中实验样品仅含有PBMC或以1:10的比率与MSC共培养(25,000个PBMC与2,500个MSC)的PBMC或者在以1：160的比率表示的情况下(16倍稀释)，与适当稀释数量的MSC共培养的PBMC。对于LPS组在刺激后第1天收集上清液，和对于ConA组在刺激后第3天收集(在图10中图示)。使用多分析物珠-抗体偶联的细胞因子捕获和检测测定法通过流式细胞术测量上清液细胞因子。所有条件均以一式三份的生物学重复进行。
当与刺激的PBMC共培养时，用IL-4、IL-10或两者的表达质粒转染的MSC产生如在上清液中测量的预期的抗炎性细胞因子(图11)。P＝仅刺激的PBMC；P+M(cntl)＝与用对照质粒转染的MSC共培养的刺激的PBMC；P+M(4)＝与用IL-4表达质粒转染的MSC共培养的刺激的PBMC；P+M(10)＝与用IL-10表达质粒转染的MSC共培养的刺激的PBMC；P+M(4/10)＝与用单一质粒的一半量的IL-4和IL-10表达质粒转染的MSC共培养的刺激的PBMC。条形表示生物学三重重复的平均值，误差条表示平均值的标准误差(S.E.M.)。
与对照MSC相比，用IL-4、IL-10或两者表达质粒转染的MSC在抑制促炎性细胞因子方面表现出增强的抑制能力，如在与刺激的PBMC共培养时在上清液中测量的(图12)。
与对照MSC的缺乏抑制相比，用IL-4、IL-10或两者表达质粒转染的MSC表现出抑制促炎性细胞因子产生的能力，如在与刺激的PBMC共培养时在上清液中测量的(图13)。
与用单独的IL-4或IL-10表达质粒转染的工程化MSC相比，用IL-4和IL-10表达质粒的组合转染的MSC在抑制促炎性细胞因子方面显示出增强的抑制能力，如在与刺激的PBMC共培养时在上清液中测量的。
与对照MSC相比，用IL-4、IL-10或两者表达质粒转染的MSC未显示出在某些情况下抑制促炎性细胞因子产生的增强的效力，如在与刺激的PBMC共培养时在上清液中测量的(图15)。
用IL-4、IL-10、两者表达质粒或对照MSC转染的MSC在一些情况下没有表现出抑制促炎性细胞因子产生的能力，如在与刺激的PBMC共培养时在上清液中测量的(图16)。
与16倍低的对照MSC的降低的抑制能力相比，用IL-4、IL-10或两者表达质粒转染的MSC即使在以比标准MSC共培养条件低16倍的MSC(16×稀释)共培养时表现出抑制促炎性细胞因子产生的能力，如与刺激的PBMC共培养时在上清液中测量的。IL-4/IL-10的工程化MSC组合与任何单一IL-4或IL-10工程化MSC的抑制能力相匹配，当MSC被稀释16倍时显示出更大的抑制能力(图17)。
与对照MSC、MSC(IL-10)或组合MSC(IL4/IL-10)相比，IL-4表达质粒转染的MSC诱导其它抗炎性细胞因子的产生，如在与刺激的PBMC共培养时在上清液中测量的(图18)。
实施例3
以下实验表明：(1)不同的MSC来源具有变化的固有免疫抑制能力；(2)与人CD4+T细胞共培养的MSC可诱导调节性T细胞免疫表型。
人CD4+T细胞通过磁珠分选从PBMC分离，用CFSE增殖染料染色，并使用抗-CD3/28Dynabeads刺激(有或没有MSC，相对于CD4+T细胞比率为1：10、1：40和1：160)。刺激3天后，收获CD4+T细胞并通过流式细胞术分析以通过CFSE染料稀释评估增殖。流程图描绘了以1:10、1：40和1：160的比率共培养的各种MSC来源(脂肪、骨髓或脐带)条件的CFSE直方图(数据未显示)。所有条件均以三个生物学重复进行。该数据显示不同的MSC来源具有变化的固有免疫抑制能力。
接下来，将来自人PMBC的磁珠分离的CD4+T细胞与人骨髓MSC、人脐带MSC或293T细胞一起培养。单独的PMBC用作对照。将1×106个CD4+T细胞与1×105个MSC或293T细胞一起培养3天，和然后染色用于流式细胞术分析。CD4+细胞首先通过大小(FSC)和粒度(SSC)门控，然后通过CD4的表面表达门控，且测量CD25表达百分比和平均荧光强度(MFI)(未显示流式细胞术点图)。还对CD4+CD25+门控细胞分析了细胞内染色的Foxp3和表面糖蛋白A为主重复(GARP)的表达。条形图显示各种培养条件的阳性百分比和MFI(图21)。每种培养条件进行三次生物学重复。该数据显示与人CD4+T细胞共培养的MSC可诱导调节性T细胞免疫表型。
实施例4
以下实验证明T细胞刺激诱导的炎性细胞因子受到经工程化以分泌抗炎性细胞因子IL-4或IL-10的MSC抑制。使用抗-CD3/28Dynabeads刺激来自PBMC的T细胞，并单独或以指定的比率与骨髓MSC一起培养3天，然后收集上清液以测定细胞因子。MSC是天然的，或用对照pMax载体、IL-4或IL-10进行核转染，并如所示共培养。组合IL-4/IL-10条件是核转染的IL-4和IL-10MSC的等量混合物。通过Luminex细胞因子珠阵列对指定的细胞因子组分析上清液，其包括IFN-γ、IL-10、IL-17A、IL-1β、IL-6和TNF-α。每种培养条件进行三次Luminex技术重复。来自该实验的结果如图22所示。
实施例5
为了证明注射的表达细胞因子的工程化MSC能够改变小鼠中的免疫细胞群体，将3％的葡聚糖硫酸钠(DSS)在饮用水中施用于C57BL/6小鼠2天以诱导结肠炎，然后通过腹膜内注射施用1×106个通过核转染工程化以表达小鼠IL-4或IL-10的MSC。再过3天后，处死小鼠并分离和染色腹膜细胞，通过F4/80标志物表达的流式细胞术分析以标记巨噬细胞。施用的MSC-IL-10工程化细胞导致巨噬细胞略微增加，而MSC-IL-4工程化细胞导致腹膜细胞群体内巨噬细胞减少(数据未显示)。
接下来，如上所述，在另一小鼠群组中再次诱导结肠炎，然后通过腹膜内注射施用1×106个通过核转染工程化以表达小鼠IL-4或IL-10的MSC。再过1或3天后，处死小鼠并分离腹膜液和通过Luminex细胞因子珠多阵列测定细胞因子的表达。每个条形表示收集的每组2-5只小鼠的平均，误差条表示平均值的标准误差(SEM)(图23)。这些实验证明注射的表达细胞因子的工程化MSC在体内维持细胞因子表达。
为了证明DSS结肠炎小鼠中注射的工程化MSC导致的改善的体重和存活率，如上所述在另一组小鼠中诱导结肠炎，然后通过腹膜内注射施用1×106个通过核转染工程化以表达小鼠IL-4或IL-10的MSC。当死亡或体重<80％起始体重时记录小鼠体重及生存评分。注射群组和测量以双盲方式进行(图24)。每一群组表示每组8只小鼠的平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。类似的实验证明在DSS结肠炎小鼠中注射的工程化MSC导致的改善的血便和炎性脂质运载蛋白-2水平(图25)。在DSS开始的第8天记录小鼠血便，并且粪便对于蛋白质进行处理以通过ELISA测量脂质运载蛋白-2(Lcn-2)水平。注射群组和测量以双盲方式进行。每一群组代表每组8只小鼠的平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
以下实验显示DSS结肠炎小鼠中的MSC生物分布和持久性(图26)，且特别是DSS结肠炎小鼠中结肠和脾内的MSC生物分布和持久性(图27)。将3％葡聚糖硫酸钠(DSS)在饮用水中施用于C57BL/6小鼠2天以诱导结肠炎，然后1×106个通过核转染工程化以表达小鼠IL-4、IL-10或对照GFP(pMax)的MSC。对于总体分布研究，MSC用体内荧光跟踪染料XenoLight DiR染色并通过腹膜内注射施用。在DSS第2天(MSC注射日)、第3天(MSC注射后1天)和第4天(MSC注射后2天)在Spectral Instruments Ami成像仪上在激发和发射通道上进行小鼠活体成像用于DiR荧光成像。荧光测量为每秒光子数(图26)。对于器官特异性分布研究，在第4天(MSC注射后2天)处死小鼠并解剖结肠和脾，并在Spectral Instruments Ami成像仪上在激发和发射通道上进行成像以用于DiR荧光成像。左上是MSC-GFP，右上是MSC-IL4，左下是MSC-IL10，右下是无MSC。荧光测量为每秒光子数(图27)。
为了显示在DSS结肠炎小鼠中注射的对于抗炎性细胞因子特异性的工程化MSC获得的改善的血便和结肠长度，如上所述用DSS在小鼠中诱导结肠炎，然后通过腹膜内注射施用1×106个通过核转染工程化以表达小鼠IL-4、IL-10或对照GFP(pMax)的MSC。在DSS开始的第4天记录小鼠血便。在处死小鼠后在第7天测量结肠长度。注射群组和测量以双盲方式进行。每一群组代表每组5只小鼠的平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)(图28)。
实施例6
对于以下实验，使用慢病毒转导MSC以产生工程化MSC。工作流程如图29A和34B中所示。
使用图29A中所示的工作流程转导MSC，且在转导后24小时收集上清液和通过Luminex细胞因子珠多阵列测定细胞因子表达。慢病毒小鼠IL-4和IL-10转导导致上清液中分泌的这些蛋白质的高表达，而基线IL-6水平不受影响。小鼠IL-17A、TNF-α、IL-1β和IFN-γ低于检测限。条形代表重复的技术重复。图30显示了产生工程化MSC的慢病毒转导，导致所需细胞因子表达而不存在炎性细胞因子表达。
实施例7
对于这组实验，将3％葡聚糖硫酸钠(DSS)在饮用水中施用于C57BL/6小鼠2天以诱导结肠炎，然后通过腹膜内注射施用4×106个通过慢病毒转导工程化以表达小鼠IL-22或对照GFP的MSC。在处死小鼠时在第11天测量结肠长度。在第4天或第9天收集粪便蛋白，并通过ELISA测量脂质运载蛋白-2(Lcn-2)水平。解剖结肠，固定在10％福尔马林中，并将整个结肠的纵向切片包埋并用苏木精和曙红(H&E)染色。评分由具有结肠炎小鼠模型经验的盲法动物病理学家进行。组织病理学评分包括炎症的严重程度、受炎症影响的区域百分比、溃疡、导致腺体分离的固有层的纤维化以及粘膜和/或粘膜下层的水肿。增生评分包括增生程度和受增生变化影响的区域百分比。注射群组和测量以双盲方式进行。每一群组代表每组8-10只小鼠的平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。图31显示了在DSS结肠炎小鼠中由注射的慢病毒工程化MSC获得的改善的体重、结肠长度、脂质运载蛋白-2水平及结肠组织病理学和增生评分。
DSS结肠炎小鼠然后腹膜内注射4×106(高)、1×106(中)或0.25×106(低)个通过慢病毒转导工程化以表达小鼠IL-22、IL-4或对照GFP的MSC。组合工程化小鼠IL-4/IL-22注射4×106个MSC，其具有等份的MSC-IL-4(2×106个)和MSC-IL-22(2×106个)。在处死小鼠时在第9天测量结肠长度。在第9天收集粪便蛋白，并通过ELISA测量脂质运载蛋白-2(Lcn-2)水平。在注射L-012后在第9天及在处死小鼠和解剖结肠时测量原位结肠炎症。L-012化学发光测量为每秒光子数。注射群组和测量以双盲方式进行。每一群组代表每组的8-10只小鼠的平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。图32显示了在DSS结肠炎小鼠中由注射的慢病毒工程化小鼠IL-4/IL-22组合MSC获得的改善的体重、结肠长度、脂质运载蛋白-2水平和原位结肠炎症L-012水平。
然后在另一组C57BL/6小鼠中通过在第0天经肛门滴注施用在50％乙醇中2.5％的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导结肠炎。然后，通过腹膜内注射施用1×106个通过慢病毒转导工程化以表达小鼠IL-22、IL-4或对照GFP的MSC。组合工程化小鼠IL-4/IL-22注射1×106个MSC，其具有等份的MSC-IL-4(0.5×106个)和MSC-IL-22(0.5×106个)。在处死小鼠时在第3天测量结肠长度。在注射L-012后在第3天及在处死小鼠和解剖结肠时测量原位结肠炎症。L-012化学发光测量为每秒光子数。注射群组和测量以双盲方式进行。每一群组代表每组5只小鼠的平均值，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。图33显示TNBS结肠炎小鼠中由注射的慢病毒工程化小鼠IL-22和IL-4/IL-22组合MSC获得的改善的结肠长度和原位结肠炎症L-012水平。
图34显示了经工程化以表达小鼠IL-22的慢病毒转导的MSC的小鼠IL-22的分泌蛋白表达以及功能性受体信号磷酸-STAT3活性。将5×105个慢病毒转导的小鼠IL-22或对照GFP工程化MSC接种在1ml培养基中，24小时后收集上清液并通过ELISA测量。上清液还在200ul培养基中以指定的(1:5)或(1:10)稀释度加入5×105个HT-29细胞中15分钟，并使用具有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的M-PER裂解缓冲液制备蛋白质裂解物。蛋白质裂解物在变性SDS-PAGE凝胶上电泳和转移至PVDF膜，并在蛋白质印迹化学发光反应中用针对磷酸-STAT3或总STAT3的抗体探测。
实施例8
图35显示由工程化MSC产生的TNF-αFab抗体赛妥珠单抗的成功产生、分泌、结合和对TNF-α的功能拮抗作用。顶部，24小时后收获来自经工程化以表达c-Myc标记的赛妥珠单抗Fab抗体或对照GFP的慢病毒转导MSC的上清液。ELISA板用1ng/ml的TNF-α、IFN-γ或PBS媒介包被，并将未稀释的MSC上清液孵育过夜，然后使用与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗c-Myc抗体进行检测，且使用TMB底物酶促检测。中间，工程化MSC上清液与1ng/ml TNF-α一起孵育1小时，然后用于涂覆Luminex板过夜。赛妥珠单抗竞争性地干扰来自Luminex捕获/检测TNF-α捕获抗体组的与TNF-α的结合，并导致来自Luminex的较低检测信号。底部，工程化MSC上清液与10ng/ml TNF-α一起孵育1小时，然后添加到5×104TNF-α报告细胞(InvivoGen HEK-Dual TNF-α细胞)，其检测TNF-α并产生分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。然后通过检测SEAP水平。所有条件作为3个生物学重复进行，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
实施例9
接下来，用萤火虫荧光素酶/GFP报告质粒(fLuc-GFP)和等量的指定趋化因子受体质粒(每一种4ug)对MSC进行核转染。在第0天通过肛门滴注将50％乙醇中2.5％的2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)施用于C57BL/6小鼠以诱导结肠炎，然后在第1天通过腹膜内注射施用4×105个工程化MSC。小鼠注射D-荧光素并在第2天(MSC注射后1天)处死，组织如所示解剖，并在Spectral Instruments Ami成像仪上进行成像。荧光素酶化学发光测量为每秒光子数。图36显示TNBS结肠炎小鼠中组织生物分布和通过趋化因子受体CXCR4、CCR2、CCR9和GPR15的工程化表达而增加的MSC至发炎结肠的归巢。
实施例10
对于该实施例，5×103个工程化MSC通过慢病毒转导接收包含驱动小鼠IL-4的条件性NF-kB(核因子κ-B)响应性启动子，随后驱动GFP的组成型启动子的遗传回路(图37，顶部)。转导的MSC然后用200μl培养基中0.1ng/ml、1ng/ml或10ng/ml浓度的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β或来自大肠杆菌的脂多糖(LPS)处理24小时。24小时后收集上清液并通过ELISA测量。图37显示通过慢病毒转导递送到MSC中的遗传回路。该构建体使MSC能够感测炎性刺激并通过分泌目标有效负荷IL-4来反应。左栏显示测量的浓度，右栏显示相对于未处理条件的倍数变化。所有条件作为三个生物学重复进行，误差条表示平均值的标准误差(SEM)。
表2.遗传元件和相关序列
表达载体：pL+MCS
ACGCGTGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCACTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCCTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGGTTAACTTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATCAAAATTTTATCTCGACATGGTGGCGACCGGTAGCGCTAGCGGATCGATAAGCTTGATATCGCCTGCAGCCGAATTCCTTGACTTGGGATCCGCGTCAAGTGGAGCAAGGCAGGTGGACAGTCCTGCAGGCATGCGTGACTGACTGAGGCCGCGACTCTAGTTTAAACTGCGTGACTGACTCTAGAAGATCCGGCAGTGCGGCCGCGTCGACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAAATAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGCTCTAGCTATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGACTTTTGCAGAGACGGCCCAAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTG(SEQ ID NO:49)
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请均通过引用对于各自引用的主题引入，其在某些情况下可涵盖整个文件。
除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一”和“一个”应理解为表示“至少一个”。
还应该理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包括一个以上步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不一定限于其中所列举的该方法的步骤或动作的顺序。
在权利要求以及上面的说明书中，所有过渡短语，例如“包含”、“包含”、“携带”、“具有”、“含有、“涉及”、“持有”、“组成”，等等应理解为开放式的，即表示包含但不限于。只有过渡短语“由......组成”和“基本上由......组成”应当是封闭或半封闭的过渡短语，如美国专利局专利审查程序手册第2111.03节(United States Patent Office Manual ofPatent Examining Procedures,Section2111.03)所述。

Claims (51)

1.一种间充质干细胞，其经过工程化而以足以抑制炎性反应的水平产生两种抗炎性细胞因子。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞，其中所述炎性反应相对于对照被抑制至少20％，任选地其中所述对照是未修饰的间充质干细胞。
3.如权利要求1或2所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞因子选自IL-4、IL-10和IL-22。
4.如权利要求3所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞因子是IL-4和IL-10。
5.如权利要求3所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞因子是IL-4和IL-22。
6.如权利要求3所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞因子是IL-10和IL-22。
7.如权利要求1-6中任一项所述的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞源自骨髓、脂肪组织或脐带组织。
8.如权利要求1-7中任一项所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞因子的水平足以诱导调节性T细胞免疫表型。
9.如权利要求1-8中任一项所述的间充质干细胞，其中所述抗炎性细胞因子水平足以相对于对照抑制受刺激T细胞的炎性细胞因子产生的至少20％，任选地其中所述对照是未修饰的间充质干细胞。
10.如权利要求9所述的间充质干细胞，其中所述炎性细胞因子选自IFN-γ、IL-17A、IL-1-β、IL-6和TNF-α。
11.如权利要求9或10所述的间充质干细胞，其中所述T细胞选自CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞。
12.如权利要求1-11中任一项所述的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞经工程化以产生至少三种抗炎性细胞因子，其水平足以相对于对照抑制炎性反应至少20％，任选地其中所述对照是未修饰的间充质干细胞。
13.如权利要求1-12中任一项所述的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞经工程化以表达归巢分子。
14.如权利要求13所述的间充质干细胞，其中所述归巢分子选自：抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；和GPR15。
15.如权利要求14所述的间充质干细胞，其中所述归巢分子选自：CXCR4、CCR2、CCR9和GPR15。
16.如权利要求1-15中任一项所述的间充质干细胞，其中所述间充质干细胞包含：
(a)包含与编码所述两种细胞因子之一的第一核苷酸序列和编码所述两种细胞因子中另一种的第二核苷酸序列可操作地连接的启动子的核酸，任选地其中所述第一和第二核苷酸序列被插入的核苷酸序列分开，任选地，其中该插入的序列是IRES序列或编码2A肽；
(b)包含(i)与编码所述两种细胞因子之一的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子和(ii)与编码所述两种细胞因子中另一种的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子的核酸；或者
(c)包含与编码所述两种细胞因子之一的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子的第一核酸，和包含与编码所述两种细胞因子中另一种的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子的第二核酸。
17.如权利要求16所述的间充质干细胞，其中(a)的所述启动子，(b)的所述第一和/或第二启动子，和/或(c)的所述第一和/或第二启动子是诱导型启动子。
18.如权利要求17所述的间充质干细胞，其中所述诱导型启动子是核因子κ-B(NF-κB)-响应性启动子。
19.如权利要求16-18中任一项所述的间充质干细胞，其中(a)的所述核酸，(b)的所述核酸和/或(c)的所述第一和/或第二核酸还包含与编码报告分子的核苷酸序列可操作地连接的启动子。
20.一种方法，包括向受试者递送治疗有效量的间充质干细胞的制剂，所述间充质干细胞经工程化以产生两种抗炎性细胞因子，其中所述治疗有效量足以抑制所述受试者中的炎性反应。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述炎性反应相对于对照被抑制至少20％，任选地其中所述对照是未修饰的间充质干细胞的制剂。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述抗炎性细胞因子选自IL-4、IL-10和IL-22。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述抗炎性细胞因子是IL-4和IL-10。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述抗炎性细胞因子是IL-4和IL-22。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述抗炎性细胞因子是IL-10和IL-22。
26.如权利要求20-25中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞源自骨髓、脂肪组织或脐带组织。
27.如权利要求20-26中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量足以诱导调节性T细胞免疫表型。
28.如权利要求20-27中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量足以相对于对照抑制受刺激T细胞的炎性细胞因子产生的至少20％，任选地其中所述对照是未修饰的间充质干细胞的制剂。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述炎性细胞因子选自IFN-γ、IL-17A、IL-1-β、IL-6和TNF-α。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中所述T细胞选自CD8+T细胞、CD4+T细胞、γ-δT细胞和T调节细胞。
31.如权利要求20-30中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞经工程化以产生至少三种抗炎性细胞因子。
32.如权利要求20-31中任一项所述的方法，其中所述受试者具有患炎性肠病的症状。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述受试者已被诊断为患有炎性肠病。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述炎性肠病是溃疡性结肠炎或克罗恩氏病。
35.如权利要求20-34中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量相对于对照减少所述受试者的体重损失至少20％，任选地其中所述对照是未修饰的间充质干细胞的制剂。
36.如权利要求20-35中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量相对于对照降低所述受试者中脂质运载蛋白-2的水平至少20％，任选地其中所述对照是未修饰的间充质干细胞的制剂。
37.如权利要求20-36中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞经工程化以表达归巢分子。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述归巢分子选自：抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；和GPR15。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述归巢分子选自：CXCR4、CCR2、CCR9和GPR15。
40.如权利要求20-39中任一项所述的方法，其中所述间充质干细胞包含
(a)包含与编码所述两种细胞因子之一的第一核苷酸序列和编码所述两种细胞因子中另一种的第二核苷酸序列可操作地连接的启动子的核酸，任选地其中所述第一和第二核苷酸序列被插入的核苷酸序列分开，任选地其中该插入的序列是IRES序列或编码2A肽；
(b)包含(i)与编码所述两种细胞因子之一的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子和(ii)与编码所述两种细胞因子中另一种的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子的核酸；或者
(c)包含与编码所述两种细胞因子之一的核苷酸序列可操作地连接的第一启动子的第一核酸，和包含与编码所述两种细胞因子中另一种的核苷酸序列可操作地连接的第二启动子的第二核酸。
41.如权利要求40所述的方法，其中(a)的所述启动子，(b)的所述第一和/或第二启动子，和/或(c)的所述第一和/或第二启动子是诱导型启动子。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述诱导型启动子是核因子κ-B(NF-κB)-响应性启动子。
43.一种工程化核酸，其包含与编码效应分子的核苷酸序列可操作地连接的核因子κ-B(NF-κB)-响应性启动子。
44.如权利要求43所述的工程化核酸，其中所述效应分子是抗炎性细胞因子。
45.如权利要求44所述的工程化核酸，其中所述抗炎性细胞因子选自IL-4、IL-10和IL-22。
46.一种间充质干细胞，其被工程化以产生多种效应分子，其中的至少两种调节免疫系统的不同细胞类型。
在体内
47.一种产生多功能免疫调节细胞的方法，其包括：
(a)向间充质干细胞递送至少一种编码至少两种效应分子的工程化核酸，或
(b)向间充质干细胞递送至少两种工程化核酸，其各自编码至少一种效应分子，
其中每一种效应分子调节免疫系统的不同细胞类型或调节细胞的不同功能。
48.一种调节受试者免疫系统的多种细胞类型的方法，其包括向受试者递送至少两种间充质干细胞，每一种间充质干细胞经工程化以产生效应分子，其中所述效应分子中的至少两种调节免疫系统的不同细胞类型。
49.一种间充质干细胞，其经工程化以产生效应分子和归巢分子，其水平足以抑制炎性反应。
50.如权利要求49的间充质干细胞，其中所述效应分子选自IL-4、IL-10、IL-35、PD-L1-Ig、抗TNF-α、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、α-1抗胰蛋白酶、IL-22、IL-19和IL-20。
51.如权利要求50的间充质干细胞，其中所述归巢分子选自抗-整联蛋白α4,β7；抗-MAdCAM；CCR9；CXCR4；SDF1；MMP-2；CXCR1；CXCR7；CCR2；和GPR15。
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