CN108126187A - 一种组合物和其制备方法 - Google Patents

一种组合物和其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108126187A
CN108126187A CN201810051969.XA CN201810051969A CN108126187A CN 108126187 A CN108126187 A CN 108126187A CN 201810051969 A CN201810051969 A CN 201810051969A CN 108126187 A CN108126187 A CN 108126187A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
cell
stem cell
physiological saline
mescenchymal stem
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810051969.XA
Other languages
English (en)
Inventor
丁小梅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Light Life Engineering Technology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen Light Life Engineering Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Light Life Engineering Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen Light Life Engineering Technology Co Ltd
Priority to CN201810051969.XA priority Critical patent/CN108126187A/zh
Publication of CN108126187A publication Critical patent/CN108126187A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/728—Hyaluronic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种组合物，包括无菌注射器，无菌注射器内混合有第一溶液和第二溶液。组合物的施用部位为关节腔内，由于间充质干细胞来源于中胚层，不仅具有向骨、软骨、脂肪及成肌细胞分化的潜能，还具有向神经元分化的潜能，具有获取方便、来源丰富、容易扩增、免疫原性低及多向分化潜能；透明质酸通过与基质和细胞膜上的透明质酸结合蛋白发生作用来行使其对细胞的凋控功能，从而达到抑制炎症的作用，还可疼痛受体产生屏障作用，缓解疼痛；还通过细胞因子和细胞间相互作用，调节关节局部微环境和激活内源性祖细胞，从而发挥修复受损组织的作用。

Description

一种组合物和其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，其涉及用于治疗和/或预防骨关节病的药物的组合物,特别涉及一种组合物和其制备方法。
背景技术
骨关节炎是最常见的关节炎形式，其特征在于关节软骨、软骨下骨的缓慢退行性过程，并伴有边缘骨赘形成和低程度的炎症。据信，慢性形式的骨关节炎影响到15％的人口。其中，四分之一为严重残疾。大多数骨关节炎病例的原因不明，并被称为“原发性骨关节炎”。当骨关节炎的原因已知时，其被称为“继发性骨关节炎”。继发性骨关节炎由其它疾病或情形引起。可导致继发性骨关节炎的情形包括关节结构的反复性损伤或手术、出生时关节异常(先天性异常)、痛风、糖尿病和其它激素紊乱。其它形式的关节炎包括系统性疾病，例如类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE )。
骨关节炎主要涉及髋部、膝部、脊柱和指/趾间关节。骨关节炎的最常见症状是受影响关节在反复使用后产生疼痛。关节疼痛通常在日间的晚些时候更加严重。受影响关节可发生肿胀、发热以及发出咯吱声。关节在长期不活动后也会发生疼痛和僵硬。在严重的骨关节炎中，软骨垫的完全丧失导致骨间发生摩擦，造成静止时的疼痛或在有限运动时的疼痛。
骨关节炎的特征在于在数年间软骨发生缓慢的降解。在正常软骨中，在基质的合成与降解之间存在微妙的平衡；但是在骨关节炎中，软骨的降解超过了合成。合成与降解之间的平衡受年龄影响，并由滑膜和软骨细胞产生的几种因子(包括细胞因子、生长因子、聚集蛋白聚糖酶( aggrecanase )和基质金属蛋白酶)所调控。除了水以外，胞外基质还含有蛋白聚糖，其由连接到透明质酸或其药用盐所形成之骨架上的糖胺聚糖形成，并包封(entrap )于胶原框架或纤丝基质( fibrillary matrix )中。关节软骨中的一种重要蛋白聚糖是聚集蛋白聚糖(aggrecan )，其与透明质酸或其药用盐结合并有助于赋予软骨以可压缩性和弹性。聚集蛋白聚糖被聚集蛋白聚糖酶所切割，这导致其降解以及随后的软骨侵蚀。软骨基质中聚集蛋白聚糖的损失是骨关节炎(OA )中观察到的最初病理生理变化之一。
目前的主要治疗以对乙酰氨基酚、NSAIDs类药物、润滑剂及类固醇激素关节腔注射、软骨保护剂为主，但这些治疗方法的疗效有限，且不能阻止疾病的进展。
间充质干细胞是一种来源于中胚层，具有多向分化潜能的一类细胞，存在于人体骨髓、脂肪组织、新生儿的脐带、胎盘等组织中，研究证明间充质干细胞不仅具有向骨、软骨、脂肪及成肌细胞分化的潜能，还具有向神经元分化的潜能。由于其具有获取方便、来源丰富、容易扩增、免疫原性低及多向分化潜能等优点，使得间充质干细胞广泛应用于心血管系统疾病、神经系统疾病、骨骼肌肉相关疾病、肝病、糖尿病等多种疾病的临床试验中，并且取得初步疗效，展示了其广泛的临床应用前景。
透明质酸（HA）是构成软骨和滑液的主要成分，对关节生理功能的发挥起着重要的作用。HA通过与基质和细胞膜上的HA结合蛋白发生作用来行使其对细胞的凋控功能。HA的浓度是影响HA对细胞作用的重要因素，高浓度的HA抑制毛细血管的生成，在关节发生病变时，细胞对HA受体的表达会发生改变，而HA借此来影响细胞的凋集和免疫反应的发生，从而达到抑制炎症的作用HA还可作用于细胞膜上的疼痛受体，对受体产生屏障作用，缓解疼痛。
细胞因子主要是指活化的干细胞和某些基质细胞分泌的一类非特异性调节免疫应答和介导炎症反应的小分子蛋白质，如趋化因子、黏附因子、生长因子等。
发明内容
为了克服上述所述的不足，本发明的目的是提供一种针对骨关节炎的修复组合物和其组合物的制备方法，具有强大的抗炎作用和免疫调节作用，能通过多种因子和细胞间相互作用调节关节局部微环境和激活内源性祖细胞，从而发挥修复受损组织的作用。
本发明解决其技术问题的技术方案是：一种组合物，包括无菌注射器，所述无菌注射器内混合有第一溶液和第二溶液。
在本具体实施例中，所述第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；所述第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，所述第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。
在本具体实施例中，所述组合物为注射液，注射部位为关节腔。
上述所述的组合物在制备治疗骨关节炎疾病药物中的用途。
本发明还提供了一种组合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、取样本，剪成1mm3的小块，种瓶至T75培养瓶内，每瓶加入6ml间充质干细胞培养液，混匀组织块，放入培养箱内培养。7天后换液，当细胞融合度至30%时，可进行传代；
S2、通过0.25%胰酶消化，用生理盐水洗涤2次，以5000/cm2密度传代培养，再倒置显微镜下每天观察细胞生长状况，当子代细胞融合度至80%时，可进行传代；
S3、收获3代内新鲜收获的间充质干细胞，计数后将一部分用生理盐水重悬至2×106/ml，1ml，另取1×107间充质干细胞离心弃上清备用；
S4、将重悬后的细胞用超声裂解仪破碎细胞，持续5min；
S5、用0.22μm滤器无菌过滤裂解后的细胞悬液，与1×107间充质干细胞混匀，加入生理盐水定容至2.5ml制成第一溶液；
S6、取1g医用透明质酸粉末，加入99ml生理盐水充分混匀，用0.22μm滤器无菌过滤，分装成2.5ml/支，制成第二溶液；
S7、分别取部分最终收获的经无菌过滤后的第一溶液和第二溶液，进行生物制品无菌试验、支原体检测、内毒素检测规程，分别进行细菌、真菌、支原体、内毒素污染检测，确保均无污染。
在本具体实施例中，在S5中，样本来源于中胚层，并通过生物安全柜内剥离华通氏胶，且在培养瓶内，每瓶加1g离华通氏胶，培养箱为CO2培养箱，所述间充质干细胞为原代~第十代间充质干细胞。
在本具体实施例中，第一溶液和第二溶液的分子量为500000~730000道尔顿。
在本具体实施例中，所述第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；所述第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，所述第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。
在本具体实施例中，所述第一溶液内还含有悬浊液。
上述发明其制备过程在无菌条件下进行。
本发明的有益效果为：1、作为优选，组合物的施用部位为关节腔内，关节软骨修复都在关节腔内，可以防止软骨干细胞和血小板的流逝；
2、由于间充质干细胞来源于中胚层，具有多向分化潜能的一类细胞，不仅具有向骨、软骨、脂肪及成肌细胞分化的潜能，还具有向神经元分化的潜能，具有获取方便、来源丰富、容易扩增、免疫原性低及多向分化潜能；
3、透明质酸通过与基质和细胞膜上的透明质酸结合蛋白发生作用来行使其对细胞的凋控功能，从而达到抑制炎症的作用，透明质酸还可作用于细胞膜上的疼痛受体，对受体产生屏障作用，缓解疼痛；
4、本发明还通过细胞因子和细胞间相互作用，调节关节局部微环境和激活内源性祖细胞，从而发挥修复受损组织的作用。
附图说明
为了易于说明，本发明由下述的较佳实施例及附图作以详细描述。
图1为组合物的制备方法流程。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以通过具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
一种组合物，组合物为注射液，注射部位为关节腔，具有强大的抗炎作用和免疫调节作用，能通过多种因子和细胞间相互作用调节关节局部微环境和激活内源性祖细胞，从而发挥修复受损组织的作用。
组合物包括无菌注射器，所述无菌注射器内混合有第一溶液和第二溶液。第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。
生理盐水还可以用水混悬液，其中包含氯化钠，其浓度基本上与生理盐水相当。生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。因此，本发明细胞治疗组合物中的间充质干细胞基本上是分散于生理盐水即质量体积百分数为0 .9％的氯化钠溶液中，其与人体组织的渗透压一致，以此生理盐水作为溶剂，不会对间充质干细胞产生损伤。
组合物存在于动物和人体的生理活性物质，在人皮肤、关节滑膜液、脐带、房水及眼玻璃体中均有分布，组合物具有高黏弹性及仿形性。具有促进细胞增殖和促进细胞成骨、成软骨分化，促进伤口愈合的作用。
使用前用10ml无菌注射器将第一溶液与第二溶液充分混匀后抽入到无菌注射器内。常规消毒，铺洞巾，缓慢全部注入至关节腔。注射完毕后用无菌纱布压迫覆盖针眼，仰卧20min，期间屈伸膝关节数十次。该组合物常温可放置1小时，如超过1小时，请于2~8℃保存，最长不得超过6小时，使用前提前20分钟拿出室温放置。
本发明提供的可注射用的组合物，其在常温下呈注射液状态，适于经关节内施用(经皮注射)给哺乳动物对象(优选人类患者)的关节内。例如，本发明提供的组合物也适于局部施用(经皮注射至哺乳动物对象、优选人类患者的发炎关节内或附近区域)。
本发明提供的组合物对哺乳动物对象(特别是人类患者)经关节内施用组合物能够改善骨关节病相关的症状，例如缓解了骨关节疼痛、改善了关节活动性和/或功能、减少了关节中的炎性积液以及降低了可能由上述疾病或病症引起的关节退化或其进程。
如图1所示，本发明还提供了一种组合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、取样本，剪成1mm3的小块，种瓶至T75培养瓶内，每瓶加入6ml间充质干细胞培养液，混匀组织块，放入培养箱内培养。7天后换液，当细胞融合度至30%时，可进行传代。在S1中，间充质干细胞来源于中胚层，具有多向分化潜能的一类细胞，存在于人体骨髓、脂肪组织、新生儿的脐带、胎盘等组织中，间充质干细胞不仅具有向骨、软骨、脂肪及成肌细胞分化的潜能，还具有向神经元分化的潜能。由于其具有获取方便、来源丰富、容易扩增、免疫原性低及多向分化潜能等优点。样本并通过生物安全柜内剥离华通氏胶，且在培养瓶内，每瓶加1g离华通氏胶，培养箱为CO2培养箱，所述间充质干细胞为原代~第十代间充质干细胞。CO2培养箱是细胞、组织、细菌培养的一种先进仪器，是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必须的关键设备，CO2培养箱是在普通培养的基础上加以改进，主要是能加入CO2，以满足培养微生物所需的环境。CO2培养箱控制CO2的浓度是通过CO2浓度传感器来进行的。
S2、通过0.25%胰酶消化，用生理盐水洗涤2次，以5000/cm2密度传代培养，再倒置显微镜下每天观察细胞生长状况，当子代细胞融合度至80%时，可进行传代。
S3、收获3代内新鲜收获的间充质干细胞，计数后将一部分用生理盐水重悬至2×106/ml，1ml，另取1×107间充质干细胞离心弃上清备用。
S4、将重悬后的细胞用超声裂解仪破碎细胞，持续5min。
S5、用0.22μm滤器无菌过滤裂解后的细胞悬液，与1×107间充质干细胞混匀，加入生理盐水定容至2.5ml制成第一溶液。
S6、取1g医用透明质酸粉末，加入99ml生理盐水充分混匀，用0.22μm滤器无菌过滤，分装成2.5ml/支，制成第二溶液。
具体地，第一溶液和第二溶液的分子量为500000~730000道尔顿。第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；所述第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。第一溶液内还含有悬浊液。
生理盐水还可以用水混悬液，其中包含氯化钠，其浓度基本上与生理盐水相当。生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。因此，本发明细胞治疗组合物中的间充质干细胞基本上是分散于生理盐水即质量体积百分数为0 .9％的氯化钠溶液中，其与人体组织的渗透压一致，以此生理盐水作为溶剂，不会对间充质干细胞产生损伤。
S7、分别取部分最终收获的经无菌过滤后的第一溶液和第二溶液，进行生物制品无菌试验、支原体检测、内毒素检测规程，分别进行细菌、真菌、支原体、内毒素污染检测，确保均无污染。
上述发明其制备过程在无菌条件下进行。
实施例一
S1、取样本，剪成1mm3的小块，种瓶至T75培养瓶内，每瓶加入6ml间充质干细胞培养液，混匀组织块，放入培养箱内培养。7天后换液，当细胞融合度至30%时，可进行传代。在S1中，间充质干细胞来源新生儿的脐带中，间充质干细胞不仅具有向骨、软骨、脂肪及成肌细胞分化的潜能，还具有向神经元分化的潜能。由于其具有获取方便、来源丰富、容易扩增、免疫原性低及多向分化潜能等优点。样本并通过生物安全柜内剥离华通氏胶，且在培养瓶内，每瓶加1g离华通氏胶，培养箱为CO2培养箱，所述间充质干细胞为原代~第十代间充质干细胞。
CO2培养箱是细胞、组织、细菌培养的一种先进仪器，是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必须的关键设备，CO2培养箱是在普通培养的基础上加以改进，主要是能加入CO2，以满足培养微生物所需的环境。CO2培养箱控制CO2的浓度是通过CO2浓度传感器来进行的。
根据本发明的组合物的制备方法，其中所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(胎盘来源)：用PBS缓冲液充分冲洗胎盘小叶，以去除胎盘中残留的血液，剪成1mm3小块。
S2、通过0.25%胰酶消化，用生理盐水洗涤2次，以5000/cm2密度传代培养，再倒置显微镜下每天观察细胞生长状况，当子代细胞融合度至80%时，可进行传代。
S3、收获3代内新鲜收获的间充质干细胞，计数后将一部分用生理盐水重悬至2×106/ml，1ml，另取1×107间充质干细胞离心弃上清备用。
S4、将重悬后的细胞用超声裂解仪破碎细胞，持续5min。
S5、用0.22μm滤器无菌过滤裂解后的细胞悬液，与1×107间充质干细胞混匀，加入生理盐水定容至2.5ml制成第一溶液。
S6、取1g医用透明质酸粉末，加入99ml生理盐水充分混匀，用0.22μm滤器无菌过滤，分装成2.5ml/支，制成第二溶液。
具体地，第一溶液和第二溶液的分子量为500000~730000道尔顿。第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；所述第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。第一溶液内还含有悬浊液。
生理盐水还可以用水混悬液，其中包含氯化钠，其浓度基本上与生理盐水相当。生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。因此，本发明细胞治疗组合物中的间充质干细胞基本上是分散于生理盐水即质量体积百分数为0 .9％的氯化钠溶液中，其与人体组织的渗透压一致，以此生理盐水作为溶剂，不会对间充质干细胞产生损伤。
S7、分别取部分最终收获的经无菌过滤后的第一溶液和第二溶液，进行生物制品无菌试验、支原体检测、内毒素检测规程，分别进行细菌、真菌、支原体、内毒素污染检测，确保均无污染。
上述发明其制备过程在无菌条件下进行。
实施例二
S1、取样本，剪成1mm3的小块，种瓶至T75培养瓶内，每瓶加入6ml间充质干细胞培养液，混匀组织块，放入培养箱内培养。7天后换液，当细胞融合度至30%时，可进行传代。在S1中，间充质干细胞来源于中胚层，具有多向分化潜能的一类细胞，存在于人体骨髓、脂肪组织、新生儿的脐带、胎盘等组织中，间充质干细胞不仅具有向骨、软骨、脂肪及成肌细胞分化的潜能，还具有向神经元分化的潜能。由于其具有获取方便、来源丰富、容易扩增、免疫原性低及多向分化潜能等优点。样本并通过生物安全柜内剥离华通氏胶，且在培养瓶内，每瓶加1g离华通氏胶，培养箱为CO2培养箱，所述间充质干细胞为原代~第十代间充质干细胞。
CO2培养箱是细胞、组织、细菌培养的一种先进仪器，是开展免疫学、肿瘤学、遗传学及生物工程所必须的关键设备，CO2培养箱是在普通培养的基础上加以改进，主要是能加入CO2，以满足培养微生物所需的环境。CO2培养箱控制CO2的浓度是通过CO2浓度传感器来进行的。
根据本发明的组合物的制备方法，其中所述的间充质干细胞的获取方法包括如下步骤(脐带来源)：
脐带组织贴壁处理：取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量维持在5-20块，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上。
S2、通过0.25%胰酶消化，用生理盐水洗涤2次，以5000/cm2密度传代培养，再倒置显微镜下每天观察细胞生长状况，当子代细胞融合度至80%时，可进行传代。
S3、收获3代内新鲜收获的间充质干细胞，计数后将一部分用生理盐水重悬至2×106/ml，1ml，另取1×107间充质干细胞离心弃上清备用。
S4、将重悬后的细胞用超声裂解仪破碎细胞，持续5min。
S5、用0.22μm滤器无菌过滤裂解后的细胞悬液，与1×107间充质干细胞混匀，加入生理盐水定容至2.5ml制成第一溶液。
S6、取1g医用透明质酸粉末，加入99ml生理盐水充分混匀，用0.22μm滤器无菌过滤，分装成2.5ml/支，制成第二溶液。
具体地，第一溶液和第二溶液的分子量为500000~730000道尔顿。第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；所述第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。第一溶液内还含有悬浊液。
生理盐水还可以用水混悬液，其中包含氯化钠，其浓度基本上与生理盐水相当。生理盐水是指生理学实验或临床上常用的渗透压与动物或人体血浆的渗透压相等的氯化钠溶液。因此，本发明细胞治疗组合物中的间充质干细胞基本上是分散于生理盐水即质量体积百分数为0 .9％的氯化钠溶液中，其与人体组织的渗透压一致，以此生理盐水作为溶剂，不会对间充质干细胞产生损伤。
S7、分别取部分最终收获的经无菌过滤后的第一溶液和第二溶液，进行生物制品无菌试验、支原体检测、内毒素检测规程，分别进行细菌、真菌、支原体、内毒素污染检测，确保均无污染。
上述发明其制备过程在无菌条件下进行。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种组合物，包括无菌注射器，其特征在于，所述无菌注射器内混合有第一溶液和第二溶液。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；所述第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，所述第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为注射液，注射部位为关节腔。
4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物在制备治疗骨关节炎疾病药物中的用途。
5.一种组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取样本，剪成1mm3的小块，种瓶至T75培养瓶内，每瓶加入6ml间充质干细胞培养液，混匀组织块，放入培养箱内培养，7天后换液，当细胞融合度至30%时，可进行传代；
S2、通过0.25%胰酶消化，用生理盐水洗涤2次，以5000/cm2密度传代培养，再倒置显微镜下每天观察细胞生长状况，当子代细胞融合度至80%时，可进行传代；
S3、收获3代内新鲜收获的间充质干细胞，计数后将一部分用生理盐水重悬至2×106/ml，1ml，另取1×107间充质干细胞离心弃上清备用；
S4、将重悬后的细胞用超声裂解仪破碎细胞，持续5min；
S5、用0.22μm滤器无菌过滤裂解后的细胞悬液，与1×107间充质干细胞混匀，加入生理盐水定容至2.5ml制成第一溶液；
S6、取1g医用透明质酸粉末，加入99ml生理盐水充分混匀，用0.22μm滤器无菌过滤，分装成2.5ml/支，制成第二溶液；
S7、分别取部分最终收获的经无菌过滤后的第一溶液和第二溶液，进行生物制品无菌试验、支原体检测、内毒素检测规程，分别进行细菌、真菌、支原体、内毒素污染检测，确保均无污染。
6.根据权利要求5所述的组合物的制备方法，其特征在于，在S5中，样本来源于中胚层，并通过生物安全柜内剥离华通氏胶，且在培养瓶内，每瓶加1g离华通氏胶，培养箱为CO2培养箱，所述间充质干细胞为原代~第十代间充质干细胞。
7.根据权利要求5所述的组合物的制备方法，其特征在于，第一溶液和第二溶液的分子量为500000~730000道尔顿。
8.根据权利要求5所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述第一溶液包括1×107个间充质干细胞，2×106个细胞裂解因子以及生理盐水；所述第二溶液包括1%的透明质酸和生理盐水，所述第一溶液和第二溶液每只均为2.5ml。
9.根据权利要求5所述的组合物的制备方法，其特征在于，所述第一溶液内还含有悬浊液。
10.根据权利要求5-9任一项所述，其特征在于，其制备过程在无菌条件下进行。
CN201810051969.XA 2018-01-19 2018-01-19 一种组合物和其制备方法 Pending CN108126187A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810051969.XA CN108126187A (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种组合物和其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810051969.XA CN108126187A (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种组合物和其制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108126187A true CN108126187A (zh) 2018-06-08

Family

ID=62400682

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810051969.XA Pending CN108126187A (zh) 2018-01-19 2018-01-19 一种组合物和其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108126187A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI823964B (zh) * 2018-07-04 2023-12-01 佐伯正典 幹細胞濾液製劑及其調製方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104546915A (zh) * 2015-02-16 2015-04-29 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种治疗骨性关节炎的组合物、其制备方法及其应用
CN105796600A (zh) * 2016-04-28 2016-07-27 博雅干细胞科技有限公司 使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物
CN106727704A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 云南农业大学 犬用干细胞分泌因子注射剂
US20170340673A1 (en) * 2014-11-06 2017-11-30 Servicio Andaluz De Salud Lysates of mesenchymal stem cells for the treatment of skeletal muscle injuries
CN107550935A (zh) * 2017-09-11 2018-01-09 上海亚睿生物科技有限公司 一种治疗关节疾病的生物凝胶剂及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170340673A1 (en) * 2014-11-06 2017-11-30 Servicio Andaluz De Salud Lysates of mesenchymal stem cells for the treatment of skeletal muscle injuries
CN104546915A (zh) * 2015-02-16 2015-04-29 黑龙江天晴干细胞股份有限公司 一种治疗骨性关节炎的组合物、其制备方法及其应用
CN105796600A (zh) * 2016-04-28 2016-07-27 博雅干细胞科技有限公司 使用干细胞治疗骨关节炎的方法和组合物
CN106727704A (zh) * 2016-12-26 2017-05-31 云南农业大学 犬用干细胞分泌因子注射剂
CN107550935A (zh) * 2017-09-11 2018-01-09 上海亚睿生物科技有限公司 一种治疗关节疾病的生物凝胶剂及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
EN-RUNG CHIANG等: "Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Combination with Hyaluronic Acid for the Treatment of Osteoarthritis in Rabbits", 《PLOS ONE》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TWI823964B (zh) * 2018-07-04 2023-12-01 佐伯正典 幹細胞濾液製劑及其調製方法
US12023356B2 (en) 2018-07-04 2024-07-02 Masanori Saeki Stem cell filtrate preparation and method for preparing same

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Sun et al. 3D printing collagen/chitosan scaffold ameliorated axon regeneration and neurological recovery after spinal cord injury
KR101422689B1 (ko) 콜라겐, 히알루론산 유도체 및 포유류의 탯줄 유래 줄기세포를 포함하는 연골세포치료제
US11801331B2 (en) Composition for cartilage regeneration and preparing thereof
KR102034645B1 (ko) 콜라겐 및 히알루론산 유도체를 포함하는 의료용 복합 생체 소재
JP6995752B2 (ja) 細胞拡大培養方法及び治療用組成物
WO2013015579A9 (ko) 콜라겐 및 히알루론산 유도체를 포함하는 의료용 복합 생체 소재
CN102630157A (zh) 组合了黏性补充剂和成纤维细胞生长培养基的关节内应用的可注射组合物
Zhang et al. Tissue-adhesive paint of silk microparticles for articular surface cartilage regeneration
US20110177170A1 (en) implantable neuroendoprosthetic system, a method of production thereof and a method of reconstructive neurosurgical operation
CN109069875A (zh) 产生免疫耐受反应的组合物和方法
Mulbauer et al. Biomimetic scaffolds in skeletal muscle regeneration
CN108865986A (zh) 用于修复关节软骨损伤/缺损的间充质干细胞制剂及其制备方法和应用
CN106929474A (zh) 一种m2巨噬细胞诱导剂
Özdemir et al. Biological augmentation strategies in rotator cuff repair
Sun et al. Advances in the treatment of partial-thickness cartilage defect
CN107693844A (zh) 一种组合物凝胶与应用
CN108126187A (zh) 一种组合物和其制备方法
CN114832156B (zh) 一种新型医美整形填充物改性左旋聚乳酸凝胶
CN108392624B (zh) 活性促进肽以及间充质干细胞在治疗类风湿性关节炎中的应用
Facon-Poroszewska et al. Influence of radial pressure wave therapy (RPWT) on collagenase-induced achilles tendinopathy treated with platelet rich plasma and autologous adipose derived stem cells
CN109072185A (zh) 增强型多能细胞和微血管组织以及其使用方法
TWI539956B (zh) 經輻射線處理之硫酸軟骨素促進骨髓細胞分化之用途
CN103124492A (zh) 使用具有来源于体外培养和扩增的自我更新集落形成细胞的组分的有生命的和无生命的生物反应装置的组合物和方法
CN112451482A (zh) 治疗骨关节炎的方法
Smernoff Mesenchymal Stromal Cells and Their Uses in Bio-Regenerative Therapies for Bone and Cartilage: A Review

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180608