CN101119745B

CN101119745B - 凝集素组合物和调节对抗原免疫应答的方法

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Publication number: CN101119745B
Application number: CN03824201XA
Authority: CN
Inventors: 安德鲁·H·塞加尔; 埃尔胡·扬
Original assignee: Genitrix LLC
Current assignee: Genitrix LLC
Priority date: 2002-08-20
Filing date: 2003-08-20
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2023-08-20
Also published as: ZA200501759B; CN101119745A; US20040039156A1; US7629440B2

Abstract

本发明提供了能与细胞表面结合部分(如碳水化合物)结合并充当细胞表面多肽配体的融合多肽、包含编码这种融合多肽的核酸的载体和包含这种核酸的宿主细胞。本发明还提供了包含承抗原靶位和这种融合多肽的组合物，以及包含病毒或细胞与这种融合多肽的组合物。本发明还涉及使用这种组合物调节动物体内免疫应答的方法。

Description

凝集素组合物和调节对抗原免疫应答的方法

发明背景

通常，针对患者体内抗原的免疫应答的特异性调节需要将另一种物质如佐剂和抗原混合施用，以启动和/或指导调节。但传统的佐剂具有许多缺点。例如，许多是粗制的异源制剂。另外，许多都是较弱的免疫调节剂，某些还导致人体所不能承受的严重局部炎症。纯化的可溶性多肽如细胞因子相对于粗制佐剂具有一些优点，但由于它们在施用时从抗原处扩散，因而限制了其价值。然而某些细胞表面分子可以是潜在的免疫调节剂，如基于细胞的疫苗组分，其应用通常涉及向细胞的基因转移，经常是有问题的。

因此，本发明通过提供能与承抗原靶位(antigen bearing target)如细胞、病毒和分离的抗原结合并在与承抗原靶位一起施用时充当免疫调节剂的分子，填补了迄今未解决的需求。此外，本发明提供了包含这些分子的组合物和相关方法。本发明的组合物和方法也可用于其他应用，如需要使生物效应因子如细胞表面受体的多肽配体结合到靶结构如病毒和细胞的情况下的任何应用。

发明内容

本发明涉及多功能分子，如多肽，其包括能够与承抗原靶位结合的第一部分和能够与细胞结合的第二部分。在一个优选的实施方案中，第一部分是第一细胞表面结合部分，第二部分是第二细胞表面结合部分。在该实施方案中，第一细胞表面结合部分可以与包含抗原的病毒或细胞如肿瘤细胞结合。还特别优选的是，第二细胞表面结合部分可以结合于抗原呈递细胞(APC)的细胞表面多肽，如非免疫球蛋白多肽。因此，在某些实施方案中，本发明的多功能分子可以充当承抗原靶位和APC之间的桥梁或连接物。

本文所用的“承抗原靶位”是包含抗原的实体。例如，本文所用的“承抗原靶位”包括表达抗原的完整细胞、包含抗原的细胞碎片(fraction)、包含抗原的膜碎片、包含抗原的病毒、包含抗原的病毒颗粒或游离于其他细胞或病毒来源材料的抗原，如多肽抗原。可以通过本领域技术人员公知的方法，如Ce1l BiologyALaboratoryHandbook(Academic Press1994Editor J.E.Celis ISBN0-12-164715-3)中所教导的方法制备细胞碎片。

本文所用的术语“抗原”指患者能够针对其引发体液和/或细胞免疫应答的分子。抗原可以是任意类型的细胞分子，例如包括简单的中间代谢物、糖、脂质和激素，以及诸如复合碳水化合物、磷脂、核酸和蛋白质的大分子。常用类别的抗原包括但不局限于病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、原生动物和其他寄生虫抗原、肿瘤抗原、参与自身免疫疾病的抗原、过敏和移植物排斥与其他各种各样的抗原。在本发明的组合物和方法中，优选抗原是多肽，如包含至少7个氨基酸的多肽。

本文所用的“抗原呈递细胞”或“APC”指将抗原摄取并呈递到T细胞的细胞。这些细胞包括吞噬性的白细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和内皮细胞。“专职APC”是能够连续活化T淋巴细胞的细胞。专职APC通常连续表达II型主要组织相容性分子和共刺激分子，如B7-1和/或B7-2。

在一个实施方案中，本发明包括多功能分子，其第一部分是凝集素。因此，多功能分子可以与承抗原靶位的一个或多个碳水化合物结合。在本发明的一个优选实施方案中，多功能分子的第一部分是凝集素，第二部分是细胞表面蛋白的配体(如细胞表面受体的配体)。优选的是，细胞表面蛋白是APC的细胞表面受体。细胞表面受体的配体包括能够与细胞表面蛋白结合的任意配体，优选包括但不局限于调理素、细胞因子、粘附分子、T细胞共刺激分子的反受体、防卫素、CD40分子的配体或热激蛋白或任意这些配体的一部分，包括这些配体中约(或至少约)5、8、10、12、15、20、25、35、50、60、70、80、100或120个相毗连氨基酸。优选的是，包含第一和第二部分的多功能分子包含能够与细胞表面蛋白(如细胞表面受体)结合的氨基酸序列，所述的细胞表面蛋白包括但不局限于粘附分子、T细胞的共刺激分子，或下述类型分子中至少一种的受体：细胞因子、防卫素、热激蛋白、CD40分子或调理素。

本发明中有用的细胞表面蛋白(如细胞表面受体)是能够与本发明的多功能分子配体部分结合的任意细胞表面分子。优选的是，细胞表面受体是CD40分子、T细胞共刺激分子、粘附分子或细胞因子的受体、防卫素、热激蛋白、调理素或粘附分子。本发明中有用的细胞表面蛋白包括但不局限于附录I和II中GenBank注册号所指的细胞表面分子，或附录I或II中GenBank注册号所指的核酸分子所编码的细胞表面分子。

本文所用的术语“细胞因子”指由哺乳动物细胞天然分泌并与白细胞上的细胞表面蛋白结合、引发白细胞变化(如增殖状态的变化、转录谱的变化或迁移倾向的变化)(而非只是占据白细胞上细胞因子受体)的多肽分子。“变化”指与不存在细胞因子的情况相比至少约5％的增加或减少。术语“细胞因子”在本文中还指作为天然存在的细胞因子受体之配体的多肽分子。

在本发明方法和组合物中有用的细胞因子的例子包括：GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、促红细胞生成素受体的配体、免疫球蛋白超家族受体的配体、干扰素受体的配体、TNF受体的配体和趋化因子受体的配体。抗细胞因子受体的抗体也可以是细胞因子。

在本发明的一个实施方案中，优选的是，本发明组合物所含的细胞因子促进Th1免疫应答，即生成表达诸如IL-2和IFN-γ的Th1类细胞因子的T细胞。在另一个实施方案中，优选的是，本发明组合物所含的细胞因子促进Th2免疫应答，即生成表达诸如IL-4和IL-10的Th2类细胞因子的T细胞。

本文所述的“工程化细胞因子”是包含异源细胞表面结合部分的细胞因子。

本文所用的术语“调理素”指能够通过与包含抗原的细胞及抗原呈递细胞(APC)的同时结合或附着来充当抗原和APC之间连接物或偶联剂(衔接物)，从而使包含抗原的细胞被APC更有效地结合、吞入并内化的天然存在的和非天然存在的分子。根据本发明有用的调理素还包括能够通过结合天然存在的调理素的受体与APC结合的非天然存在的调理素。

本文所用的术语“调理素”还指可以被加工从而使一个或多个加工步骤的至少一个产物能够通过与包含抗原的细胞及抗原呈递细胞(APC)的同时结合或附着来充当抗原和APC之间连接物或偶联剂，从而使包含抗原的细胞被APC更有效地结合、吞入并内化的分子。调理素还可以是多链调理素的任意多肽链。

在本发明方法和组合物中有用的调理素的例子包括：玻连蛋白、纤连蛋白、诸如C1q(包括其任意组分多肽链A、B和C)的补体组分、诸如C3d、C3b和C4b的补体片段、甘露糖结合蛋白、共凝集素、表面蛋白A和D、C反应蛋白(CRP)、α-2巨球蛋白和免疫球蛋白，例如免疫球蛋白的Fc部分。

“先天性调理素”是先天性免疫系统的调理素，本领域中公知为先天性免疫系统的分泌性多肽分子，其能够同时与抗原和APC表面结合。因此，它们能够充当“桥梁”，由于该特征，人们认为它们能够促进APC对抗原的内化。调理素与抗原结合的模式随调理素而变化，可以是共价的或非共价的。通常，先天性调理素的抗原结合部分与免疫球蛋白的抗原结合部分的不同之处在于：前者在相同物种的成员中相对不变，在个体的个体发生过程中不发生变化。

如果含有天然存在的APC结合部分的分子具有能稳定结合或吸附到细胞上以使APC结合部分位于细胞外空间的部分，则认为其是调理素，不管调理素分子是否含有其天然抗原结合结构域。

本文所述的“工程化调理素”包括其中用细胞表面结合部分替换调理素的天然抗原结合结构域或将细胞表面结合部分与未修饰或去除调理素中天然抗原结合结构域的调理素连接的分子。

“细胞表面结合部分”是分子能够通过它稳定结合到细胞表面如细胞壁、多糖包膜或质膜的脂质或蛋白质组分，或结合到病毒表面的部分。该部分包括但不局限于交联部分和脂质部分。优选的是，细胞表面结合部分通过不同于多肽与其相关细胞表面多肽相互作用的方式结合于细胞。还优选的是，细胞表面结合部分包括非多肽部分。在一个优选的实施方案中，脂质部分通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)部分与工程化分子连接。在另一个优选的实施方案中，脂质包括脂肪酸，如棕榈酸酯。在本发明另一个优选的实施方案中，细胞表面结合部分在调理素抗原结合末端与调理素或抗原结合结构域-截短调理素连接。在另一个优选的实施方案中，多功能分子包括与APC结合的免疫球蛋白的个体基因型(idiotypic)部分。优选的是，调理素增强型细胞的调理素是一个α’链C3b或甘露糖结合蛋白。

如果调理素是C3的片段，优选的是使之以比CR2更高的亲和力与CR1结合。还优选的是，C3片段不是CR2的配体。优选的是，调理素既不是C3bi、C3d，也不是C3dg。

优选的是，调理素与引发吞噬作用和为非克隆型(non-clonotypic)从而不象例如克隆型(clonotypic)受体那样随细胞而变化的受体结合。非克隆型受体存在于在先天性免疫中发挥作用的细胞上，例如包括非个体基因型受体。这类受体的例子包括CR1、CR2、CR3、CR4和C1q受体、包含C1q受体组分的受体、co1lectin受体、α2m受体、CRP受体和免疫球蛋白的Fc受体。

“外源物”指从细胞外引入或在细胞外产生的物质。

“内源物”指在细胞中天然表达或存在的物质。

“异源物”指在细胞中非天然表达的物质。

优选地，包含第一和第二部分的多功能分子可以通过第二部分结合于抗原呈递细胞(APC)的表面或质膜，所述的抗原呈递细胞即能够将抗原呈递给T细胞的细胞，例如，能至少部分通过将抗原呈递给T细胞而活化T细胞的细胞。APC可以是白细胞，例如单核细胞谱系或树突状细胞。优选的是，多功能分子的结合不依赖于APC上个体基因型，如免疫球蛋白的克隆型决定簇的表达。最优选地，多功能分子包含能与具有抗原的细胞结合的第一末端和能与APC结合的第二末端。

例如，多功能分子可以通过例如插入到细胞膜脂质部分中，或结合到例如与膜的脂质部分物理连接的多肽或碳水化合物结构，来与承抗原靶位细胞结合。所述结构不需要与膜的脂质部分直接接触，而可以间接附着，例如作为细胞表面糖蛋白一部分的碳水化合物。优选多功能分子可以通过第一部分结合于承抗原靶位，优选含有抗原的哺乳动物细胞；并通过第二部分结合于APC。本发明还包括使用能通过第一部分结合于病毒或非哺乳动物细胞，如真菌或细菌细胞；并通过第二部分结合于APC的分子。在后一情况下，第一部分例如可以与细胞壁或包膜组分结合。

在一个优选的实施方案中，包含第一部分和第二部分的多功能分子具有含凝集素的第一部分，和能够结合于白细胞，如APC，如单核细胞谱系或树突状细胞(其自身可以是单核细胞谱系的)的第二部分。根据本发明的“凝集素”是能与碳水化合物如多糖结合的分子或部分分子，如氨基酸序列。天然存在的凝集素的家族包括：

1)galectin，快速增长的动物凝集素家族。其都有半乳糖特异性。

2)钙依赖型(C-型)动物凝集素，由具有各种结构和功能的成员组成的极大家族。

3)在C-型凝集素家族中，选择素由于其在白细胞通过唾液酸-LewisX识别与内皮细胞粘附中的特定功能，形成了可区分的亚家族。

4)co1lectin，C-型凝集素中对甘露糖特异的另一亚家族，其具有由C-型凝集素结构域和胶原样结构域组成的独特结构。其参与先天性免疫。

5)已知无脊椎动物在其体液中含有各种凝集素，可能为身体保护因子。最近发现棘皮类动物的某些凝集素表现出溶血活性。

6)膜联蛋白，具有脂质亲和性的一组蛋白质，最近表明其为与糖胺聚糖结合的凝集素。

7)豆类凝集素家族，其包括许多成员，如ConA，具有与C-型凝集素相当的可变糖特异性。

8)蓖麻毒蛋白(ricin)，100多年前在俄罗斯发现的第一种凝集素。目前已经清楚蓖麻毒蛋白家族具有在毒性或糖结合特异性上不同的其他许多同源性成员。

因此，本发明的多功能分子可以和一种或多种碳水化合物结合。举例来说，凝集素与之结合的碳水化合物还包括含有乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-海藻糖、L-海藻糖(如α-L-海藻糖)、D-半乳糖的碳水化合物、A血型寡聚糖、B血型寡聚糖、含有1-D-Ga1(1->3)[α-Lfuc(1->2)]-β-D-Ga1(1-3/4-β-D-GlcNAc的糖、含有α-唾液酸[2->3]-乳糖、α-D-甘露糖-葡萄糖偶联物、α-NeuNAc-[2->6]-Ga1、α-NeuNAc-[2->6]-GalNAc、α-NeuNAc-[2->3]-Ga1、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺、末端α-D-半乳糖残基、末端β-D-半乳糖残基、N-乙酰乳糖胺、末端α-D-甘露糖残基、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺、末端N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸和末端α-D-半乳糖胺残基的糖。

举例来说，含有凝集素的多功能分子可以包含天然存在的完整凝集素或天然存在的凝集素的一部分，如天然存在的多肽凝集素中约(或至少约)5、8、10、12、15、20、25、35、50、60、70、80、100或120个相毗连氨基酸。在一个实施方案中，多功能分子包含天然存在的凝集素的碳水化合物结合部分，即能在不存在凝集素其他部分的条件下与碳水化合物结合的凝集素部分。在另一个实施方案中，凝集素可以是非天然存在的，如从人工分子库中鉴定到的，或通过修饰天然存在的凝集素结构设计的。

称作“血凝素”的凝集素与红细胞上的碳水化合物如血型抗原结合，当和这些细胞一起孵育时导致这些细胞聚集。举例来说，流感病毒血凝素与唾液酸结合(人副流感病毒3血凝素/神经氨酸酶就是这样)。已知存在有至少15种流感血凝素亚型，通过它们不同的抗原性特征来限定。称作H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14和H15的这些亚型中的任意亚型都提供本发明组合物和方法中有用的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，血凝素是来自感染人类的病毒的亚型，如H1、H2或H3。在另一个实施方案中，血凝素是来自不感染人类的病毒的亚型，如H4-H15中的一种。在给定的亚型中，流感血凝素的氨基酸可以最多改变20％，不同亚型流感血凝素的氨基酸序列可以改变约30％-约70％。

流感血凝素表达为单一多肽链，称作HA0，其在翻译后三聚体化。HA0经蛋白水解产生两个结构域，HA1和HA2，其通过二硫键彼此连接。HA1具有明显的唾液酸结合活性，而HA2锚定在病毒膜上，促进病毒膜和宿主细胞膜的融合。在本发明的优选实施方案中，包含第一和第二部分的多功能分子具有HA1结构域的氨基酸序列。

所述分子可以是融合多肽，其在第一部分和结合于细胞的第二部分之间插入有一个或多个氨基酸，如包含结合于承抗原靶位的第一氨基酸序列、结合于白细胞的第二氨基酸序列和插入在第一部分与第二部分之间的至少一个氨基酸的融合多肽。插入的氨基酸可以包含例如接头序列，其目的是减弱空间位阻或上述第一部分和第二部分之间的其他不必要的相互作用。例如，一种该类型的序列为(Gly₃Ser)_n形式。其他有用的接头包括但不局限于(Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Va1-Pro-Va1-Ala-Thr)_1-5(Xu et a1.，1999，Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A.96：151-156)、(Gly-Ser)_n(Shao et a1.，2000，Bioconjug.Chem.11：822-826)、(Thr-Ser-Pro)_n(Kroon et a1.，2000，Eur.J.Biochem.267：6740-6752)、(Gly-Gly-Gly)_n(Kluczyk et a1.，2000，Peptides21：1411-1420)和(Glu-Lys)n(Klyczyk eta1.，2000，同上)，其中n为1-15(前述每一个参考文献也通过引用并入本文)。在另一个实施方案中，第一和第二部分之间不插入氨基酸。

本发明还提供了编码本发明多功能多肽的核酸分子，优选为重组核酸分子。例如，核酸分子可以是DNA、RNA、cDNA或mRNA。核酸分子可以是天然存在的，或使用本领域技术人员公知的技术部分或完全合成的。在一个优选的实施方案中，核酸分子是DNA分子，其包含编码可结合于承抗原靶位的第一氨基酸序列的第一核酸序列，和编码可结合于APC上细胞表面受体的第二氨基酸序列的第二核酸序列。

本发明还提供了含有编码本发明多功能多肽的核酸分子的载体，如适于在宿主细胞中表达的表达载体，其中宿主细胞优选为真核细胞，较优选为动物细胞，更优选为哺乳动物细胞，还更优选为人类细胞。在另一个优选的实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevesiae)。

本发明还提供了包含核酸载体的宿主细胞，所述的核酸载体含有编码本发明多功能分子的序列。优选的是，宿主细胞是真核细胞，如酵母细胞或动物细胞，优选人类细胞。宿主细胞还可以是原核细胞。

本发明还包括具有第一部分和第二部分的分子，如多肽，如融合多肽，其中所述的第一部分能结合于承抗原靶位如细胞、如含抗原的细胞，所述的第二部分能结合于细胞如白细胞，如APC。该分子还具有本文方法和组合物中所教导的任意特征。优选的是，第一部分和第二部分彼此为异源物。例如，该分子可以是哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞或细菌细胞中表达的重组多肽。

本发明还包括调节动物中免疫应答的方法，其包括在动物中表达，如在动物宿主细胞中表达本发明的多功能分子，如含有可结合于承抗原靶位的第一部分和可结合于细胞的第二部分的多肽。根据本发明，“在动物中表达”指“导致存在于动物中”。当分子是多肽时，优选将编码多肽的核酸体内或离体导入宿主细胞进行表达。如果核酸离体导入宿主细胞中，可以随后将宿主细胞施用于动物。在一个优选的实施方案中，该方法还包括向动物施用调节免疫应答的抗原。例如，抗原可以作为组合物的一部分施用于动物，所述的组合物还包括编码多功能分子的核酸。在另一个优选的实施方案中，在表达多功能分子时，抗原已经存在于动物中。在另一个优选的实施方案中，在使用多功能分子之后将抗原施用于动物。在其他优选的实施方案中，例如通过在动物中表达多功能分子之前或之后，将包含编码抗原的核酸的组合物施用于动物，使抗原在动物中表达。在另一个实施方案中，例如通过将包含所述核酸序列的组合物施用于动物，来将编码多功能分子和抗原的核酸序列导入动物的一种或多种宿主细胞。

如本文所使用，使用本发明的方法和组合物对选定抗原“调节免疫应答”的术语意味着与施用除了不含有本发明多功能分子外各方面都相同的组合物获得的应答相比，使应答有效性更高或更低，速度更快或更慢、在量上更多或更少、更易于或更不易于诱导。在一个优选的实施方案中，与由施用除了不含有本发明的多功能分子外在各方面都相同的组合物获得的应答相比，该应答的有效程度、速度、量上和诱导容易程度的增减范围为约5-100％，或优选约5-50％，或更优选约5-25％

术语“调节免疫应答”可以是指刺激/活化针对选定抗原的免疫应答，或是抑制、消除或中和针对选定抗原的免疫应答。在一个优选的实施方案中，调节免疫应答使针对选定抗原的免疫应答与不存在疫苗下的免疫应答相比刺激/活化约至少5％，或优选5-50％，或更优选50-100％，或使针对选定抗原的免疫应答与不存在疫苗下的免疫应答相比抑制、消除或中和约至少5％，或优选5-50％，或更优选50-100％。在某些情况下，可以增强对抗原的一种免疫应答(如Th1应答)，而减弱对同一抗原的另一种免疫应答(如Th2应答)。

本发明还包括含有本发明多功能分子和承抗原靶位如病毒、朊病毒或细胞的组合物。优选的是，当承抗原靶位是细胞时，多功能分子是细胞的外源物。多功能分子还可以是细胞的异源物。在一个实施方案中，多功能分子在细胞中表达，如从细胞内的重组核酸表达。本发明还包括含有编码本发明多功能分子的核酸的细胞。多功能分子可以具有本文提到的任意特征。举例来说，本发明中有用的承抗原靶位(如细胞)包括病原性和/或自我反应性的恶性肿瘤细胞、良性肿瘤细胞、淋巴细胞，如B或T淋巴细胞；从外源导入的核酸分子表达抗原的细胞；诸如哺乳动物细胞、人类细胞、成纤维细胞、昆虫及真菌细胞的真核细胞；诸如细菌细胞的原核细胞。例如，本发明中有用的病毒包括逆转录病毒，如人免疫缺陷病毒1和2；疱疹病毒，如单纯疱疹病毒1和2、巨细胞病毒和水痘-带状疱疹病毒；人乳头瘤病毒；狂犬病病毒；轮状病毒；流感病毒A、B和C；肝炎病毒A、B、C和E或δ；腺病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；脊髓灰质炎病毒；登革热和其他出血热病毒；西尼罗河热病毒；Eastern马脑炎病毒；Western马脑炎病毒；Venezuelan马脑炎病毒；日本脑炎病毒；鼻病毒；以及足和口疾病病毒。朊病毒包括导致羊瘙痒症、苦鲁病和牛海绵状脑炎的因子。细胞、病毒或朊病毒可以减活，例如通过杀死、照射、化学固定、在培养物中传代来选择低致病性或遗传操作使之不具有致病性。优选的是，组合物还包括白细胞，如单核细胞、单核谱系的细胞、巨噬细胞或树突状细胞或其他APC。

优选的是，在本发明的方法和组合物中，细胞基本不能在体外分裂。“基本不能在体外分裂”指细胞的分裂速度是未进行防止细胞分裂处理的相应细胞分裂速度的约50％以下。在一个优选的实施方案中，细胞的分裂速度是未进行防止细胞分裂处理的相应细胞分裂速度的约30-50％。

优选的是，组合物基本不含培养基。本文所用的“培养基”指用于细胞培养的、含至少2％动物血清如胎牛血清的介质。

更具体地，本发明提供了作为融合多肽的多功能分子，其包括：包含流感病毒血凝素中至少约10个相毗连氨基酸的凝集素；和天然存在的GM-CSF分子中至少约5个相毗连氨基酸。

在一个实施方案中，凝集素位于天然存在的GM-CSF分子中相毗连氨基酸的N末端。

在另一个实施方案中，凝集素位于天然存在的GM-CSF分子中相毗连氨基酸的C末端。

在一个实施方案中，凝集素包含流感病毒血凝素HA1结构域中至少约10个相毗连氨基酸。

在一个实施方案中，凝集素是流感病毒血凝素的HA1结构域。

优选的是，流感病毒血凝素是A型流感病毒的血凝素。在其他优选的实施方案中，流感病毒血凝素是B型流感病毒或C型流感病毒的血凝素。

在一个实施方案中，流感病毒血凝素是来自感染人类的病毒的亚型。优选的是，流感病毒血凝素是H1亚型。更优选的是，流感病毒血凝素来自A型流感病毒株PR/8/34。

在一个实施方案中，流感病毒血凝素是H2亚型。

在一个实施方案中，流感病毒血凝素是H3亚型。

在一个实施方案中，流感病毒血凝素是来自不感染人类的病毒的亚型。

在一个实施方案中，融合多肽包含天然存在的GM-CSF分子的完整氨基酸序列。

优选的是，GM-CSF分子是鼠源GM-CSF。更优选的是，GM-CSF分子是人GM-CSF。

在一个方面中，本发明包括减少患者，如哺乳动物，如人体内转移性病灶，如肿瘤转移性病灶数目的方法，包括向患者施用本文所述的组合物，如含有本发明多功能分子或编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物。通常，这种组合物还包括疾病相关抗原，或编码这种抗原的核酸。该方法还包括本文所述的任何施用组合物、调节免疫应答或治疗疾病的方法。

本发明提供了减少动物体内转移性病灶数目的方法，包括向所述动物施用包括含抗原细胞的组合物，所述的组合物还包括融合蛋白，该融合蛋白含有凝集素和细胞表面蛋白的配体。

本文所用的“转移性病灶”指由恶性肿瘤细胞或感染性生物有机体所致的、已从宿主中一个部位向宿主中第二个部位移动(如从一个部位到非相邻部位；如从第一个器官到第二个器官)的疾病病灶。更具体地说，“转移性病灶”指来源于或分离自并且不同于疾病的原发部位的恶性肿瘤或感染的可检测病灶。因此，“转移性病灶”是患者体内单个器官或组织中或患者体内两个或多个器官或组织中的多个病灶。本文所用的“病灶”可以是至少单个恶性肿瘤细胞或感染细胞，或可以是可以通过下述一种或多种方法检测的可检测病灶。当转移性病灶能够被本领域的技术人员使用下述的一种或多种分析方法检测到时，就说检测到了转移性病灶。

根据本发明，“减少转移性病灶数目”指导致比预期(预期的转移性病灶数目和严重程度基于对未接受本发明多功能分子的组(多于一个)或类似患者所作的观察)更少(如，至少减少10％、20％、30％、50％、70％、90％，最高减少100％)的转移性病灶。在一个实施方案中，“减少转移性病灶数目”可以包括预防转移(如患者不产生疾病的任何可检测病灶)，如在肿瘤患者中；或导致一个或多个已存在的转移性病灶变得不可检测，如通过放射、非侵入性成像技术，或本文所述的其他技术。本领域的技术人员将认识到：即使可以检测到残留的疤痕或纤维化，转移性病灶自身也可以变得不可检测。例如，转移性病灶可以转移到骨、脑、肝脏、肺或脊髓，或其他器官或组织中。

在另一方面中，本发明包括减少患者群体中转移性病灶数目的方法，包括向一个或多个患者施用本文所述的组合物，如含有本发明多功能分子或编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物。通常，这种组合物还包括疾病相关抗原，或编码这种抗原的核酸。该方法还包括本文所述的任何施用组合物、调节免疫应答或治疗疾病的方法。

在另一方面中，本发明包括减小患者体内转移性病灶尺寸的方法，包括向一个或多个患者施用本文所述的组合物，如含有本发明多功能分子或编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物。通常，这种组合物还包括疾病相关抗原，或编码这种抗原的核酸。该方法还包括本文所述的任何施用组合物、调节免疫应答或治疗疾病的方法。本文所用的转移性病灶“尺寸”指转移性病灶所覆盖的一维、二维或三维区域，或者以替换方式，指转移性病灶中存在的恶性肿瘤细胞或感染细胞的数目。例如，通过直接视觉观察或通过非侵入性成像测定的转移性病灶尺寸可以减小至少约10％、至少约20％、30％、50％、70％、90％，最高减小至少100％。

本发明提供了减小动物体内转移性病灶尺寸的方法，包括向所述的动物施用包括含抗原细胞的组合物，所述组合物还包括含凝集素和细胞表面蛋白配体的融合蛋白。

在另一方面中，本发明包括减小患者体内转移性病灶平均尺寸的方法，包括向患者施用本文所述的组合物。该方法还包括本文所述的任何施用组合物、调节免疫应答或治疗疾病的方法。根据本发明，“减小转移性病灶的平均尺寸”可以是使转移性病灶平均比预期更小，如通过防止它们生长到预期大小；或使一个或多个已有的转移性病灶变得更小，从而减小转移性病灶的平均尺寸。例如，通过直接视觉观察或通过非侵入性成像测定的转移性病灶平均尺寸可以减小至少约10％、至少约20％、30％、50％、70％、90％，最高减小至少100％。

在另一方面中，本发明包括减小群体中转移性病灶平均尺寸的方法，包括向一个或多个患者施用本文所述的组合物，如含有本发明多功能分子或编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物。该方法还包括本文所述的任何施用组合物、调节免疫应答或治疗疾病的方法。

因此，在本发明的另一方面中，本发明包括预防或治疗患者体内疾病的方法，包括向患者施用本文所述的组合物，如含有本发明多功能分子或编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物。通常，这种组合物还包括疾病相关抗原，或编码这种抗原的核酸。举例来说，疾病可以是良性或恶性肿瘤、感染性疾病、过敏或自身免疫病。“治疗疾病”指降低患者或患病群体中与该疾病相关的发病率或死亡率。例如，不复发存活或无疾病存活可以延长至少约10％、至少约20％、30％、50％、70％、90％，最高至少100％，或转移性病灶的数目可以减少至少约10％、至少约20％、30％、50％、70％、90％，最高至少100％。对于预防性应用，目标性疾病的发病率可以减小至少约10％、至少约20％、30％、50％、70％、90％，最高至少100％。

在另一个方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含抗原和本发明多功能分子的组合物；和2)向患者施用包含抗原但不包含(不含)步骤1中施用的多功能分子的组合物。通常，两个步骤依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含多功能分子的组合物在不含多功能分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含多功能分子的组合物在包含多功能分子的组合物之前施用于患者。组合物中的抗原可以包含在承抗原靶位如细胞、细胞碎片、病毒或病毒颗粒中。

在另一方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含抗原和编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物；和2)向患者施用包含抗原但不包含(不含)步骤1中施用的核酸分子的组合物。并且，两个步骤通常依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含核酸分子的组合物在不含核酸分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含核酸分子的组合物在包含核酸分子的组合物之前施用于患者。组合物中的抗原可以包含在承抗原靶位如细胞、细胞碎片、病毒或病毒颗粒中。核酸分子可以包含在表达载体中。

在另一方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含编码抗原的核酸分子和本发明多功能分子的组合物；和2)向患者施用包含编码抗原的核酸分子但不包含(不含)步骤1中施用的多功能分子的组合物。通常，两个步骤依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含多功能分子的组合物在不含多功能分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含多功能分子的组合物在包含多功能分子的组合物之前施用于患者。组合物中的抗原可以包含在承抗原靶位如细胞、细胞碎片、病毒或病毒颗粒中。一种或多种核酸分子可以包含在表达载体中。

在另一方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含抗原和本发明多功能分子的组合物；和2)向患者施用包含编码抗原的核酸分子但不包含(不含)步骤1中施用的多功能分子的组合物。通常，两个步骤依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含多功能分子的组合物在不含多功能分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含多功能分子的组合物在包含多功能分子的组合物之前施用于患者。组合物中的抗原可以是包含在承抗原靶位如细胞、细胞碎片、病毒或病毒颗粒中。核酸分子可以包含在表达载体中。

在另一方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含编码抗原的核酸分子和本发明多功能分子的组合物；和2)向患者施用包含抗原但不包含(不含)步骤1中施用的多功能分子的组合物。通常，两个步骤依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含多功能分子的组合物在不含多功能分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含多功能分子的组合物在包含多功能分子的组合物之前施用于患者。组合物中的抗原可以是包含在承抗原靶位如细胞、细胞碎片、病毒或病毒颗粒中。核酸分子可以包含在表达载体中。

在另一方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含编码抗原的核酸分子和编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物；和2)向患者施用包含编码抗原的核酸分子但不包含(不含)步骤1中施用的、编码多功能分子的核酸分子的组合物。并且，两个步骤通常依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含核酸分子的组合物在不含编码多功能分子的核酸分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含编码多功能分子的核酸分子组合物在包含编码多功能分子的核酸分子的组合物之前施用于患者。一种或多种核酸分子可以包含在表达载体中。

在另一方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含编码抗原的核酸分子和编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物；和2)向患者施用包含编码抗原的核酸分子和本发明多功能分子的组合物。步骤1和步骤2的多功能分子可以相同或不同。并且，两个步骤通常依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含核酸分子的组合物在不含编码多功能分子的核酸分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含编码多功能分子的核酸分子的组合物在包含编码多功能分子的核酸分子的组合物之前施用于患者。一种或多种核酸分子可以包含在表达载体中。

在另一方面中，本发明包括调节患者，如哺乳动物，如人类体内针对抗原的免疫应答的方法，包括1)向患者施用包含编码抗原的核酸分子和本发明多功能分子的组合物；和2)向患者施用包含编码抗原的核酸分子但不包含(不含)编码本发明多功能分子的核酸分子的组合物。步骤1和步骤2的多功能分子可以相同或不同。并且，两个步骤通常依次进行，如至少间隔1天，或至少间隔1周，或间隔至少1个月，或间隔至少6个月，或间隔至少1年。在一个实施方案中，包含核酸分子的组合物在不含编码多功能分子的核酸分子的组合物之前施用于患者。在另一个实施方案中，不含编码多功能分子的核酸分子的组合物在包含编码多功能分子的核酸分子的组合物之前施用于患者。一种或多种核酸分子可以包含在表达载体中。

本发明包括调节动物体内免疫应答的方法，包括施用包含多功能分子的组合物，所述的多功能分子如多肽，如融合多肽，其包括能结合于承抗原靶位的第一部分和能结合于细胞的第二部分。在一个优选的实施方案中，组合物还包含抗原，通过施用组合物来调节对该抗原的免疫应答。例如，抗原可以是多肽(如重组多肽)、脂质(如糖脂)或碳水化合物(如多糖，或细菌或真菌细胞壁组分)。因此组合物包含承抗原靶位，不论是同源抗原，还是异源结构，如细胞或病毒。当承抗原靶位是细胞时，其对动物来说可以是自体同源的、同系的、同种异体的或异种的。在另一个优选的实施方案中，在施用所述分子时抗原已经存在于动物体内，和/或抗原在施用所述分子之前施用于动物。在另一个实施方案中，抗原在施用所述分子之后施用于动物。

优选的是，组合物包含不结合承抗原靶位的多功能分子。在一个优选的实施方案中，组合物还包含承抗原靶位，如细胞。在本发明的一个实施方案中，组合物包含多功能分子，其中一些能结合承抗原靶位，如细胞表面，其中一些是外在的，不结合任何靶位。在另一个实施方案中，组合物包含多功能分子，还包含细胞的一部分，如细胞膜碎片(即承抗原靶位)。在另一个实施方案中，组合物包含多功能分子，还包含来源于细胞的多种不同分子，如细胞裂解物中发现的分子。例如，可以通过冻-融，优选反复冻-融来裂解。在一个优选的实施方案中，组合物是不含细胞的。

本发明还包括对动物接种选定抗原的方法，包括向动物施用包含本发明多功能分子的疫苗组合物，所述的多功能分子包括第一部分和第二部分，所述的第一部分是凝集素，所述第二部分是细胞表面蛋白如APC上细胞表面受体的配体。优选的是，凝集素可以结合于包含抗原的承抗原靶位。

在一个实施方案中，本发明提供了一种向动物接种选定抗原的方法，包括从哺乳动物中取出至少一个细胞，其中所述的细胞包含抗原；使离体细胞与包括第一部分和第二部分的多功能分子接触，所述的第一部分是凝集素，其能够与承抗原细胞表面上的至少一种碳水化合物分子结合，所述的第二部分是APC上细胞表面蛋白的配体，以形成承抗原细胞/多功能分子复合物；将复合物再置于动物体内。

在一个优选的实施方案中，组合物包含抗原，通过施用组合物来调节对该抗原的免疫应答。

本发明提供了调节哺乳动物体内对选定抗原免疫应答的方法，包括向所述动物施用包含所述抗原和多功能分子的组合物，所述的多功能分子包括凝集素和细胞表面蛋白的配体。

本发明还涉及对动物接种选定抗原的方法，包括从所述动物取出至少一个细胞，其中所述的细胞包含所述的抗原；使离体细胞与融合蛋白相接触以形成复合物，其中所述的融合多肽包含凝集素和抗原呈递细胞上细胞表面蛋白的配体；并将所述的复合物再置于所述动物体内。

本发明提供了使APC和承抗原靶位并置(juxtaposing)的方法，包括：使APC与承抗原靶位和多功能分子相接触，所述的多功能分子包含能够结合于承抗原靶位上至少一种碳水化合物部分的第一部分，和包含APC上细胞表面蛋白配体的第二部分。优选的是，多功能分子首先与承抗原靶位相接触，然后使所得的承抗原靶位/多功能分子与APC相接触。在一个实施方案中，承抗原靶位是来自含所述抗原的动物的细胞，在允许凝集素与细胞上至少一种碳水化合物部分结合的条件下，离体细胞接触多功能分子。然后将所得的多功能分子/承抗原细胞复合物施用回到从中获得承抗原细胞的动物体内，其中承抗原细胞能够通过多功能分子的配体部分与APC上的细胞表面受体结合，从而使承抗原靶位和APC并置。

本发明的上下文中“并置”包括但不局限于物理接触。如果APC和承抗原靶位足够靠近，从而使APC内化承抗原靶位，则它们是“并置”的。如果APC和承抗原靶位隔开不小于20μm，优选不超过10μm，更优选不超过5μm，更优选不超过1μm，则它们也是“并置”的。

本文所用的“接触”指体外或体内混合。

本文还包括调节对抗原免疫应答的方法，包括在体外使承抗原靶位、本发明多功能分子和APC接触，并将所得的组合物施用于患者。在一个实施方案中，承抗原靶位/多功能分子复合物与APC接触足够长的时间，从而使承抗原靶位能够被APC细胞所内化。在其他的实施方案中，承抗原靶位/多功能分子复合物与APC接触一段时间，使APC对承抗原靶位的内化低于约80％，低于约60％，低于约40％，低于约20％，低于约10％，低于约5％。例如通过测定APC外的剩余量并从起始量中减去该量来确定内化的靶位量的方法是本领域中熟知的。优选的是，承抗原靶位/多功能分子复合物与APC接触少于约10分钟，少于约30分钟，少于约60分钟，少于约90分钟，少于约120分钟或少于约180分钟。

本文所用的“足够长时间”指足够能使选定抗原或承抗原靶位被APC所内化的时间(例如，不超过约14天，或7天，或5天，或3天，或少至约24、12、6、3、2或1小时，甚至少至约30、20、10、5或1分钟)。

本发明还包括使细胞表面多肽的配体与承抗原靶位相附着的方法，包括将承抗原靶位与包含配体的多功能分子相混合。本发明还包括使氨基酸序列与承抗原靶位相附着的方法，包括将承抗原靶位与含氨基酸序列和凝集素的融合多肽混合。本发明还包括包含相混合的承抗原靶位与融合多肽的组合物，所述的融合多肽含有不是凝集素的第一氨基酸序列和具有凝集素的第二氨基酸序列。

本发明还包括在下列所述每种细胞类型中生成本发明的多功能分子的方法：酵母细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞、昆虫细胞。这些方法的每一个都包括如上文教导将编码多功能分子的核酸引入各细胞类型中的步骤。

本发明还包括对本发明的多功能分子进行检测或定量的方法，包括使所述的多功能分子和结合于多功能分子的抗体或其他配体相接触。这种方法包括如下文所述的ELISA分析和流式细胞术。优选的是，要检测或定量的多功能分子与承抗原靶位结合。

发明详述

本发明部分基于下述发现：含第一多肽和第二多肽的多功能分子能有效将承抗原靶位如含目标抗原的细胞靶向到APC中，其中所述的第一多肽是凝集素，所述的第二多肽是APC的细胞表面受体，其中抗原被APC吞入，施用了多功能分子的动物启动对抗原的适当免疫应答。

因此，本发明提供了接种哺乳动物的方法，包括向动物施用含有本发明多功能分子的疫苗组合物，所述的多功能分子具有第一部分和第二部分，所述的第一部分是凝集素，能够结合于承抗原靶位，所述的第二部分是APC上细胞表面蛋白的配体。在一个实施方案中，该方法包括从哺乳动物取出至少一个细胞，其中所述的细胞含有抗原；使离体细胞与包含第一部分和第二部分的多功能分子接触，从而形成承抗原细胞/多功能分子复合物，其中所述的第一部分是凝集素，能够与承抗原细胞表面上至少一种碳水化合物分子结合，所述的第二部分是APC上细胞表面蛋白的配体；并将复合物再置于细胞中。

多功能分子

本发明包括具有第一部分和第二部分的多功能分子，所述的第一部分能结合于承抗原靶位，所述的第二部分是细胞如抗原呈递细胞上细胞表面蛋白的配体。优选的是，结合于承抗原靶位的第一部分是能与承抗原靶位上存在的至少一种碳水化合物分子结合的凝集素。优选的是，凝集素是流感血凝素，与承抗原靶位上存在的唾液酸残基结合。优选的是，抗原呈递细胞上细胞表面蛋白的配体选自调理素、细胞因子、CD40分子的配体、粘附分子、防卫素、热激蛋白或T细胞共刺激分子的反受体。充当多功能分子第二部分受体的细胞表面分子包括CD40分子和调理素、细胞因子、粘附分子、防卫素、热激蛋白或T细胞共刺激分子的反受体的特异性受体，还包括但不局限于附录I和II中所列的细胞表面分子。

凝集素

具有第一部分和第二部分的多功能分子中，第一部分可以是凝集素，第二部分能结合于白细胞，如APC，如单核细胞谱系的细胞或树突状细胞(其自身可以是单核细胞谱系)。根据本发明的“凝集素”是能与碳水化合物如多糖结合的分子或部分分子，如氨基酸序列。天然存在的凝集素家族包括：

3)在C-型凝集素家族中，选择素由于在白细胞通过唾液酸-LewisX识别与内皮细胞粘附中的特定功能，形成了可区分的亚家族。

6)膜连蛋白，具有脂质亲和性的一组蛋白质，最近表明其为与糖胺聚糖结合的凝集素。

7)豆类凝集素家族，其包括许多成员，如ConA，具有与C-型凝集素相当的可变的糖特异性。

8)蓖麻毒蛋白(ricin)，100多年前在俄罗斯发现的第一个凝集素。目前已经清楚蓖麻毒蛋白家族具有毒刑或糖结合特异性不同的其他许多同源性成员。

因此，本发明的多功能分子可以和一种或多种碳水化合物结合。举例来说，凝集素可结合的碳水化合物还包括含有乳糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-海藻糖、L-海藻糖(如α-L-海藻糖)、D-半乳糖的碳水化合物、A血型寡聚糖、B血型寡聚糖、含有α-D-Ga1(1->3)[α-Lfuc(1->2)]-β-D-Ga1(1-3/4-β-D-GlcNAc的糖、含有α-唾液酸[2->3]-乳糖、α-D-甘露糖-葡萄糖偶联物、α-NeuNAc-[2->6]-Ga1、α-NeuNAc-[2->6]-GalNAc、α-NeuNAc-[2->3]-Ga1、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺、末端α-D-半乳糖残基、末端β-D-半乳糖残基、N-乙酰乳糖胺、末端α-D-甘露糖残基、N-乙酰-β-D-葡萄糖胺、末端N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸和末端α-D-半乳糖胺残基的糖。

称作“血凝素”的凝集素与红细胞上的碳水化合物如血型抗原结合，当和这些细胞一起孵育时导致这些细胞聚集。举例来说，流感病毒血凝素与唾液酸结合。已知存在有至少15种流感血凝素亚型，通过它们不同的抗原性特征来限定。称作H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14和H15的这些亚型中的任意亚型都提供本发明组合物和方法中有用的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，血凝素是来自感染人类的病毒的亚型，如H1、H2或H3。在另一个实施方案中，血凝素是来自不感染人类的病毒的亚型，如H4-H15中的一种。在给定的亚型中，流感血凝素的氨基酸可以最多改变20％，不同亚型流感血凝素的氨基酸序列可以改变约30％-约70％。确定氨基酸序列同源性的方法是本领域技术人员所公知的。举例来说，能进行序列比较以确定血凝素变体(或本文所公开的多功能分子任意部分的变体)之间％相同性的其他软件包括但不局限于BLAST软件包(Ausubel et a1.，1995，Short Protocols in Molecular Biology，3rd Edition，John Wiley&Sons)、FASTA(Atschu1etal.，1990，J.Mo1.Bio1.，403-410)和GENEWORKS比较工具组。BLAST和FASTA都可以不联机(offline)获得和在线(online)搜索获得。

虽然最终的％同源性可以测定为相同性，比对过程自身通常并不根据全-或无-配对比较。相反，一般采用比例相似评分矩阵(matrix)，其根据化学相似性或进化远近对每次配对比较指定分值。常用的这种矩阵的例子是BLOSUM62矩阵，其是BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公共缺省值，或惯用符号比较表，如果提供的话。GCG软件包优选使用公共缺省值，或者在使用其他软件的情况下，使用默认矩阵，如BLOSUM62。

有利的是，使用参数设定为缺省值的BLAST算法缺省值。Altschul et al.，(1990)J.Mo1.Bio1.215：403-410中描述了BLAST算法，其通过引用并入本文。搜索参数限定如下，可以有利地设定为限定的缺省值。

有利的是，当通过BLAST评价时“基本相同性”等于与至少约为7、优选至少约9、最优选10或更多的EXPECT值匹配的序列。BLAST搜索中EXPECT的默认阈值通常是10。

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本局部比对搜索工具)是blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所采用的启发式搜索算法；这些程序的重要性在于其搜索采用稍有增强的Karlin和Altschul统计方法(Karlin andAltschu11990，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA87：2264-68；Karlin and Altschul，1993，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA90：5873-7)。BLAST程序适合于序列相似性搜索，例如鉴定与待查询序列的同源性。对于序列数据库相似性搜索中的基本问题的讨论，请参见Altschul et al(1994)NatureGenetics6：119-129。

可通过国立卫生院(NIH；Bethesda，MD)获得的五个BLAST程序执行以下任务：blastp将待查询氨基酸序列与蛋白质序列数据库比较；blastn将待查询的核苷酸序列和核苷酸序列数据库比较；blastx将待查询核苷酸序列的六种框架概念上的翻译产物和蛋白质序列数据库比较；tblastn将待查询蛋白质序列和以所有六种阅读框(两条链)动态翻译的核苷酸序列数据库比较；tblastx将待查询核苷酸序列的六种框架翻译产物和核苷酸序列数据库的六种框架翻译产物比较。

BLAST使用下列搜索参数：

HISTOGRAM-显示每次搜索的柱形图；缺省值为“是”(参见BLAST指南中的参数H)。

DESCRIPTIONS-将所报告的匹配序列的短说明数量限制到指定数目；缺省限制是100条说明(参见指南页中的参数V)。

EXPECT-报告数据库序列的匹配物的统计显著性阈值；缺省值是10，即仅期望根据Karlin和Altschul(1990)的随机摸型随机查找10个匹配物。如果匹配物的统计显著性大于EXPECT阈值，则不报告该匹配物。较低的EXPECT阈值更为严格，导致报告更少的随机匹配物。以小数表示的值是可以接受的。(参见BLAST指南中的参数E)。

CUTOFF-Cutoff值报告高评分的片段对。缺省值从EXPECT值(参见上文)计算。只有数据库序列的统计显著性至少同评分与CUTOFF值相等的独立HSP一样高时，才报告数据库序列的HSP。较高的CUTOFF值更为严格，导致报告更少的随机匹配物。(参见BLAST指南中的参数S)。通常，显著性阈值可以使用EXPECT更直观地控制。

ALIGNMENT-将对其报告高评分片段对(HSP)的数据库序列限定为指定的数目；缺省限制是50。如果出现比满足要报告的统计显著性阈值更多的数据库序列(参见上文的EXPECT和CUTOFF)，只报告具有最大统计显著性的匹配物。(参见BLAST指南中的参数B)。

MATRIX-指定BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX的交替评分矩阵。缺省矩阵是BLOSUM62(Henikoff & Henikoff，1992)。有效的交替选项包括：PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。没有交替评分矩阵可适用于BLASTN；在BLASTN请求中指定MATRIX指令会返回错误响应。

STRAND-将TBLASTN搜索限制在数据库序列的上链或下链；或将BLASTN、BLASTX或TBLASTX搜索限制在待查询序列上链或下链的阅读框上。

FILTER-屏蔽掉具有由Wootton&Federhen(1993)Computers and chemistry17：149-163中SEG程序所确定的低组成复杂性的待查询序列片段，或由Claverie&States(1993)Computers and Chemistry17：191-201中XNU程序确定的、由短周期性内部重复组成的片段，或者，对于BLASTN来说由Tatusov和Lipman(NIH)的DUST程序确定的片段。过滤可以消除由blast输出的具有统计显著性但是生物学上不感兴趣的报告(例如，命中常见的酸性区域、碱性区域或富含脯氨酸的区域)，从而留下可用于与数据库序列特定匹配的待查询序列的更多生物学上感兴趣的区域。

过滤程序查询到的低复杂性序列核苷酸序列中用字母“N”代替(如“NNNNNNNNNNNNN”)，在蛋白质序列中用字母“X”代替(如“XXXXXXXXX”)。

过滤只应用于待查询序列(或其翻译产物)，不应用于数据库序列。BLASTIN的缺省过滤器是DUST，其他程序的缺省过滤器是SEG。

当在SWIISS-PROT中应用于序列时，SEG、XNU或二者常常不屏蔽任何东西，因此，不应期望过滤器总能产生效果。另外，在某些情况下，全部序列都被屏蔽，说明对未过滤的待查询序列报告的任意匹配物的统计显著性是不可信的。

NCBI-gi-导致在输出中除了显示注册号和/或基因座名称之外，还显示NCBI gi标识符。

更优选的，使用NIH提供的BLAST搜索算法进行序列比较。在本发明的某些实施方案中，当确定序列相同性时，不采用罚分制(gap penalty)。

举例来说，在本发明中有用的凝集素分子包括但不局限于表1中所列的凝集素，和表1中所列凝集素序列具有至少50％、70％、90％和高达99％序列同源性的变体。

标号	名称	缩写	类别	凝集素编号
					[1]	/../.	鹌鹑肠凝集素		LECa.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
[2]	/../.	猪心脏凝集素(PHL)		LECa.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
					[3]	/../.	肝脏β-半乳糖苷结合凝集素	S-凝集素或Galectin.	GLTa.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
[4]	/../.	哺乳动物脑β-半乳糖苷结合凝集素	S-凝集素或Galectin.	GLTa.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
					[5]	Aaptos papi1lata.			LECi.Ada.Pap.xx.Xxxx.
[6]	咖啡黄葵			LECp.Abe.Esc.xx.Xxxx.
					[7]	欧鳊			LECp.Abr.Bra.xx.Xxxx.
[8]	相思子	APA；APA-A；APA-C；相思子毒素	β-三叶草凝集素(APA)；2型RIP.	LECp.AbrPre.se.Cgal相思子毒素LECp.AbrPre.se.Cga2(APA).
					[10]	非洲大蜗牛	Achatina fulica ColdAggltutinin；achatinin-H.		LECi.Ach.fu1.xx.Xsi1.
[13]	粘放线菌			LECf.Act.Vis.xx.Xga1.
					[14]	Adenia digitata.	莫迪素	2型RIP.	LECp.AdeDig.ro.Cga1.
[15]	Adenia vo1ksensii.	蒴莲素	2型RIP.	LECp.AdeVo1.ro.Cga1.
					[16]	Aegilops geniculata.		含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Aeg.Gen.se.Hch1.

[19]	Aegopodium podagraria.	APA.		LECp.Aeg.Pod.rh.Hga1.
					[20]	灭鲑气单胞菌			LECb.Aer.Sa1.xx.Xxxx.
[21]	缅茄			LECz.Afz.Afr.xx.Xxxx.
					[22]	Agardhie1la tenera.			LECz.Aga.Ten.xx.Xxxx.
[23]	伞菌			LECz.Aga.sss.xx.Xxxx.
					[24]	双孢蘑菇	ABA-I，ABA-II，ABA-III，ABA-IV.		LECf.Aga.Bis.xx.Xga1.
[25]	姬松茸			LECf.Aga.Bla.xx.Xxxx.
					[26]	蘑菇			LECf.Aga.Cam.xx.Xxxx.
[27]	Agaricus edulis.			LECf.Aga.Edu.xx.Xxxx.
					[28]	土壤放线杆菌			LECu.Agr.Rad.xx.Xxxx.
[29]	柳松菇			LECf.Agr.Aeg.xx.Xxxx.
					[30]	Agropyrum repens.	AREL，ARLL.	Hololectin；单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.Agr.Rep.se.Hchl(AREL_LECp.Agr.Rep.1e.Hchl(ARLL).
[31]	陈皮木耳			LECf.Ale.Aur.xx.Xfu1.
					[32]	火葱	AAA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.A11.Asc.bu.Hma1.
[36]	洋葱	ACA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.A11.Cep.bu.Hma1.
					[37]	黄花落葱	AMA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.A11.Mo1.bu.Hma1.

[38]	韭葱	APA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.A11.Por.1e.Hma1.
					[39]	大蒜	ASA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.A1l.Sat.bu.Hmal(ASA-I)LECp.A11.Sat.bu.Hmal(ASA-11LECp.A11.Sat.bu.Hmal(ASA-I)LECp.A11.Sat.bu.Hmal(ASA-DLECp.All.Sat.bu.Hma2(ASA-II)LECp.All.Sat.1e.Hmal(ASA-III)LECp.A11.Sat.ro.Hmal(ASA-IV).
[40]	熊蒜	AUA-I，AUA-II，AUA-III，AUA-Ir，AUA-L，AUA-Iir.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.A11.Urs.bu.Hmal(AUA-I)LECp.A11.Urs.bu.Hma2(AUA-II)LECp.A11.Urs.1e.Hma1(AUA-L1LECp.A11.Urs.ro.Hmal(AUA-Ir)LECp.A11.Urs.ro.Hma2(AUA-IIr).
					[42]	鸦葱	AVA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.All.Vin.bu.Hma1.
[43]	独角仙			LECi.A11.Dic.xx.Xxxx.
					[44]	紫叶观音莲			LECp.Alo.Ind.tu.Hcul.
[45]	木立芦荟	芦荟素，AAA.	AAA：单子叶植物甘露糖结合蛋白Aloctin-A：u.	LECp.Alo.Arb.1e.？(芦荟素-A)LECp.Alo.Arb.1e.Hmal(AAA).
					[46]	尾穗苋	ACA，苋菜红甙ACL.	β-三叶草凝集素，苋菜红甙类	LECp.Ama.Cau.se.Hga1.

[47]	籽粒苋		苋菜红甙类	LECp.Ama.Cru.se.Hga1.
					[48]	千穗谷	AHML，苋菜红甙.	苋菜红甙类	LECp.Ama.Hyp.xx.Xga11.
[49]	艳红长穗苋		苋菜红甙类	LECp.Ama.Leu.se.Hga1.
					[50]	刺苋	ASL.	苋菜红甙类	LECp.AmaSpi.se.Hga1.
[51]	Amphicarpaea bracteata.	ABrA.	豆类凝集素	LECp.Amp.Bra.se.Hma1.
					[52]	血蚶	Anadarin MS.		LECi.Ana.Gra.xx.Xsi1.
[53]	鳗鲡	AAL.		LECi.Ang.Ang.xx.Xf11.
					[54]	紫海胆		新的，独特的凝集素类型	LECi.Ant.Cra.xx.Xxxx.
[55]	Anthocidaris crassispina Ovum.			LECi.Ant.Cra.xx.Xxxx.
					[57]	芹菜			LECP.Api.Graxx.Xxxx.
[58]	黑指纹海兔			LECi.Ap1.Dac.xx.Xxxx.
					[59]	Aplysia depilans.			LECi.Ap1.Dep.xx.Xga1.
[60]	Aplysina archeria.			LECu.Apl.Arc.xx.Xxxx.
					[61]	花生	PNA，GNL，MNL，PRA-I，PRA-II.	所有的花生凝集素都属于豆类凝集素	LECp.Ara.Hyp.se.Hgal(PNA)LECp.Ara.Hyp.no.Hgal(GNL)LECp.Ara.Hyp.se.Hgal(MNL)LECp.Ara.Hyp.se.Hgal(PRA-I)LECp.Ara.Hyp.se.Hgal(PRA-II).
[62]	Araucaria brasiliensis.	凝集素I，凝集素II.		LECp.Ara.Bra.se.Hmgl(LectinI)LECp.Ara.Bra.se.Hmg2(LectinII).

[63]	Arion empiricorum.			LECi.Ari.Emp.xx.Xxxx.
					[64]	天南星	ACA.		LECp.Ari.Con.tu.Hcu1.
[65]	弯曲天南星	ACmA.		LECz.Ari.Cur.tu.Hcu1.
					[66]	少孢节丛孢菌	AOL.		LECf.Art.Oli.xx.Xxxx.
[68]	Artocarpus hirsuta.			LECp.Art.Hir.xx.Xxxx.
					[69]	面包果树			LECp.Art.Inc.xx.Xxxx.
[70]	天波罗	木波罗凝集素AIA，KM+，Artocarpin.	β^-prism植物凝集素，木波罗凝集素相关的凝集素	LECp.Art.Int.se.Hga1.
					[71]	滇波罗蜜	Artocarpin，ALA-I，ALA-II.	木波罗凝集素相关的凝集素	LECp.Art.Lak.se.Hga1.
[72]	Arum maculatum.	AMA.	单子叶植物结合凝集素	LECp.Aru.Mac.t11.Hma1.
					[73]	蛔虫			LECi.Asc.Lum.xx.Xxxx.
[74]	石刁柏			LECp.Asp.Off.xx.Xxxx.
					[75]	多粘芽孢杆菌			LECb.Bac.Pols.xx.Xxxx.
[76]	松脆厌气杆菌			LECb.Bac.Fra.xx.Xxxx.
					[77]	Bandeiraea simplicifolia.	BS-I，BS-I-A4，BS-I-B4，BS-II.		LECp.Ban.Sim.xx.Xxxx.
[78]	担子菌			LECf.Bas.Sss.xx.Xxxx.
					[79]	红花羊蹄甲	BPA.	豆类凝集素	LECp.Bau.Pur.se.Hga1.
[80]	黄花羊蹄甲			LECz.Bau.Tom.xx.Xxxx.

[81]	球孢白僵菌			LECf.Bea.Bas.xx.Xsi1.
					[82]	甜菜			LECp.Bet.Vu1.xx.Xxxx.
[83]	甜菜			LECp.Bet.Vu1.xx.Xxxx.
					[84]	Biomphalaria glabrata.	BGL-I，BGL-II.		LECp.Bio.Gla.xx.Xxxx.
[85]	Biomphalaria glabrata.			LECi.Bio.Gla.xx.Xxxx.
					[86]	椰子蟹			LECz.Bir.Lat.xx.Xxxx.
[87]	Blaberusdiscoidalis.	BDL1，BDL2，BDL3.		LECi.Bla.Dis.xx.Xxxx.
					[88]	百日咳杆菌	百日咳毒素1PRT.		LECz.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
[89]	Bos Taurus.	甘露糖-6-磷酸受体(1C39).	P-凝集素	LECa.Bos.Tau.xx.Xxxx.
					[90]	特罗斯牛	牛胶固素	C-凝集素或Collecti1.	LECa.Bos.Tau.xx.Xxxx.
[91]	特罗斯牛	牛co1lectin-43(CL-43).	C-凝集素或Co1lectin.	Leca.Bos.Tau.xx.Xxxx.
					[92]	Botry1lus schlosseri.		S-凝集素	LECi.Bot.Sch.xx.Xxxx.
[93]	灰霉菌			LECz.Bot.Cin.xx.Xxxx.
					[94]	Bowringia milbraedii.	BMA.	豆类凝集素	LECp.Bow.Mi1.se.Hmg1.
[951	短柄草	BsyL.	几丁质-结合凝集素	LECp.Bra.Sy1.se.Hch1.
					[96]	慢生型大豆根瘤菌			LECp.Bra.Jap.xx.Xga1.
[97]	Branchiostoma lanceolatum.			LECi.Bra.Lan.xx.Xxxx.

[98]	Brassica campetsris.		LECp.Bra.Ca11.xx.Xxxx.
				99]	芜菁甘蓝		LECp.Bra.Nap.xx.Xxxx.
[100]	甘蓝型油菜		LECp.Bra.Nap.xx.Xxxx.
				[101]	泻根	BDA.	LECp.Bry.Dio.tu.Hga1.
[113]	Cancer antennarius.		LECi.Can.Ant.xx.Xsi1.
				[114]	Candidaalbica1 adhesin.	粘附素	LECf.Can.Alb.xx.Xf11.
[115]	大花美人蕉		LECp.Can.Gen.r1.Hma1.
				[116]	牙龈二氧化碳嗜纤维菌衣氏放线菌		LECu.Cap.Gin.xx.Xxxx.
[117]	青椒		LECp.Cap.Ann.xx.Xxxx.
				118]	锦鸡儿	CAA-I，CAA-II.	LECp.Car.Arb.se.Hgal(CAA-I)LECp.Car.Arb.se.Hga2(CAA-1I).
[119]	Carcharhin1s springeri.		LECa.Car.Spr.xx.Xxxx.
				[120]	Carcinoscorpious rotundacauda.	L10；carcinoscorpin.	LECi.Car.Rot.xx.Xs11.
[121]	番木瓜		LECp.Car.Pap.xx.Xxxx.
				[123]	葛缕子		LECp.Car.Car.xx.Xxxx.
[124]	Carvbdeaalata Hemolysin.		LECi.Car.A1a.xx.Xxxx.
				[125]	日本栗	CCA.	LECp.Cas.Cre.xx.Xxxx.
[126]	CeDaea hortensis.	CHA-I.	LECi.Cep.Hor.xx.Xxxx.

[127]	大刺鳅		LECa.Cha.Pun.xx.Xxxx.
				[129]	茅针花白屈菜		LECp.Che.Maj.se.Hch1.
[132]	野苦苣		LECp.Chi.Int.xx.Xxxx.
				[133]	Cholla oDuntia.		LECp.C11o.Opu.xx.Xxxx.
[134]	鹰嘴豆	CAA.	LECp.Cic.Ar1.se.Hcu1.
				135]	Cinachyre1la a1loclada.		LECi.Cin.A11.xx.Xxxx.
[136]	香樟		LECp.Cin.Cam.xx.Xxxx.
				[137]	西瓜		LECp.Cit.Vu1.xx.Xxxx.
[139]	酸橙		LECp.Cit.Aur.se.Cnd1.
				[140]	酸橙		LECp.Cit.Aur.xx.Xxxx.
[141]	佛手		LECp.Cit.Med.xx.Xxxx.
				[142]	Cladrastis1utea.	CLA-I，CLA-II.	LECp.Cla.Lut.ba.Hmgl(CLA-DLECp.Cla.Lut.ba.Hmg2(CLA-II).
[143]	海州常山	CTA.	LECp.Cle.Tri.fr.Hga1.
				[144]	Clitocyba nebularis.		LECf.Cli.Neb.xx.Xxxx.
[145]	君子兰	CMA.	LECp.Cli.Min.1e.Hma1.
				[146]	肉毒杆菌		LECb.C1o.Bot.xx.Xxxx.
[147]	破伤风杆菌	破伤风毒素(1A8D).	LECb.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
				[148]	大西洋鲱		LECa.Clu.Har.xx.Xxxx.
[149]	红瓜	CIA.	LECp.Coc.Gra.fr.Hch1.

[151]	Cocus nucifera.			LECp.Coc.Nuc.xx.Xxxx.
					[152]	Codium fragilis.		LECu.Cod.Fra.xx.Xxxx.
[153]	阿拉伯咖啡			LECp.Cof.Ara.xx.Xxxx.
					[154]	秋水仙	CAA.	LECp.Co1.Aut.bu.Hcu1.
[155]	毛柄金钱菇			LECf.Col.Vels.xx.Xxxx.
					[156]	Colocasia esculentum.	CEA.	LECp.Co1.Esc.tu.Hma1.
[157]	繁星糯鳗	Congerin I，CongerinII.	S-凝集素	LECi.Co1.Myr.xx.Xga1.
					[159]	暗孢耳霉菌		LECf.Con.Obs.xx.Xga1.
[160]	灰盖鬼伞	Cg1，Cg2.	Galectin.	LECf.Cop.Cin.xx.Xxxx.
					[161]	河蚬Hemolvsin.		LECi.Cor.Flu.xx.Xxxx.
[163]	Corvlus ave1lania.			LECp.Cor.Ave.xx.Xxxx.
					[164]	Cratvlia mo1lis.		LECz.Cra.Mo1.xx.Xxxx.
[165]	Crenomvtilus grayanus.	CGL.		LECi.Cre.Gra.xx.Xxxx.
					[166]	番红花		LECp.Cro.Sat.bu.Hma1.
[1671	青番红花	CVA.		LECp.Cro.Ver.xx.Xxxx.
					[169]	Crotalaria striata.		LECp.Cro.Str.se.Hga1.
[170]	Crotolaria aegyptica.			LECz.Cro.Aeg.xx.Xxxx.
					[171]	Crotolaria falcata.		LECz.Cro.Fa1.xx.Xxxx.
[172]	柽麻			LECp.Cro.Jun.se.Hga1.
					[174]	巴豆		LECp.Cro.Tig.se.Hcu1.

[175]	海参	CEL-III.	LECi.Cuc.Ech.xx.Xxxx.
				[176]	Cucumis catalupensis.		LECp.Cuc.Cat.xx.Xxxx.
[177]	甜瓜		LECp.Cuc.Me1.xx.Xch1.
				[178]	黄瓜		LECp.Cuc.Sat.xx.Xch1.
[180]	黑子南瓜		LECp.Cuc.Fic.xx.Xxxx.
				[181]	笋瓜	CMA，PP2.	LECp.Cuc.Max.ps.Hchl.
[182]	Cucurbita pepe.		L ECp.Cuc.Pep.xx.Xxxx.
				[183]	西葫芦	CPA.	LECp.Cuc.Pep.fr.Hc111.
[184]	Cucurbita sativus.		LECp.Cuc.Sat.xx.Xxxx.
				[185]	Cydonia oblonia.		LECp.Cyd.Ob1.xx.Xxxx.
[186]	Cymbidium hybrid.		LECz.Cym.Hyb.1e.Hma1.
				[187]	树番茄		LECp.Cyp.Bet.xx.Xxxx.
[188]	Cytisis multiflorus.	CMA-I，CMA-II.	LECp.Cyt.Mu1.se.Hchl(CMA-I)LECp.Cyt.Mu1.se.Hful(CMA-II).
				[189]	金雀花	CSA-I，CSA-II，CMH-I，CMH-II.	LECp.Cyt.Sco.se.Hgal(CS-I)LECp.Cyt.Sco.se.Hga2(CS-II).
[190]	Cytisus sessi1folius.		LECp.Cyt.Ses.se.Hchl(CSA-I)LECp.Cyt.Ses.se.Hgal(CSA-II).
				[191]	花耳科菌		LECz.Dac.sss.xx.Xxxx.
[192]	黄檀		LECz.Da1.sss.xx.Xxxx.
				[193]	毛曼陀罗	1	LECp.Dat.Inn.xx.Xxxx.

[194]	曼陀罗	DSA.	几丁质结合凝集素	LECp.Dat.Str.se.Hch1.
					[195]	Daucus carrota.			LECp.Dau.Car.xx.Xxxx.
196]	Dendroaspis iamesoni.	JML，Jameson′sMamba Venon.		LECi.De11.Ja1.xx.Xga1.
					[198]	半知菌纲			LECz.De11.sss.xx.Xxxx.
[199]	Dicolea lehmani.			LECz.Dio.Leh.xx.Xxxx.
					[200]	粘菌	Discoidin I.		LECu.Dic.Dis.xx.Xxxx.
[201]	Dictyostelium purpureum.	羟基茜草素		LECu.Dic.Pur.xx.Xxxx.
					202]	Didemnum candidum.	DTL，DCL-I，DCL-II.		LECi.Did.Sss.xx.Xga1.
[203]	Dieffenbachia sequina.			LECp.Dif.Seq.xx.Xxxx.
					[204]	Dioclea grandifolia.		豆类凝集素	LECp.Dio.Gra.xx.Xxxx.
[205]	Dioclea guianensis.	DLL-I，DLL-II，DLL-III.	豆类凝集素	LECp.Dio.Gui.xx.Xmg1.
					[206]	Dioclea virgata.		豆类凝集素	LECz.Dio.Vir.xx.Xxxx.
207]	双花扁豆	DBA-S，DBA-R，DB-58，DB-57，DB46.	豆类凝集素	ECp.Do1.Bif.se.HgalDBA)LECp.Do1.Bif.p1.HculDB58)ECp.Do1.Bif.p1.Hcu2DB57)LECp.Do1.Bif.ro.？galDB46).
					[208]	果蝇			LECi.Dro.Meg.xx.Xxxx.
209]	Dumasia.			LECz.Dum.sss.xx.Xxxx.
					[210]	Echinocereus enge1manii.			LECp.Echi.Eng.xx.Xxxx.

[211]	Echis multisquamatus.	EMS16.		LECi.Ech.Mu1.xx.Xxxx.
					[212]	电鳗	电凝集素	LECi.Ele.Ele.xx.Xxxx.
[213]			含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Ely.Can.se.Hch1.
					[223]	Ervthrina velutina.		LECp.Ery.Ve1.xx.Xxxx.
[224]	大肠杆菌	甘露糖特异性FimH粘附素(1QUN)，.	志贺样毒素-1：ADP核糖基化毒	LECb.Ech.Col.xx.Xxxx.
					[225]	Euhadra ca1lizoma.		LECz.Euh.Ca1.xx.Xxxx.
[226]	Euphorbia characias.			LECp.Eup.Sss.xx.Xxxx.
					[227]	猩猩草		LECp.Eup.Het.xx.Xga1.
[228]	Evonymus europaea.			LECp.Evo.Eur.se.Hcu1.
					[229]	Falcata iaponica.		LECp.Fal.Jap.se.Hga1.
[230]	Ficus cunia.			LECp.Fic.Cun.xx.Xxxx.
					[231]	Flammulina veltipes.		LECfFla.Ve1.xx.Xxxx.
[232]	木蹄层孔菌			LECz.Fom.Fom.xx.Xxxx.
					[233]	野草莓		LECp.Fra.Ves.xx.Xxxx.
[234]	齿缘墨角藻			LECu.Fuc.Ser.xx.Xxxx.
					[235]	小泡墨角藻		LECu.Fuc.Ves.xx.Xxxx.
[236]	Galactia tashiroi.			LECp.Ga1.Tas.se.Hga1.
					[237]	Galactia tenuiflora.		LECp.Ga1.Ten.se.Hga1.

[238]	雪滴花		单子叶植物凝集素	LECp.Ga1.Niv.bu.Hma1.
					[239]	大蜡螟			LECi.Gal.Me1.xx.Xxxx.
[240]	原鸡	GGL.	S-凝集素或Galectin.	GLTa.Ga1.Ga1.xx.Xxxx.
					[241]	原鸡	鸡肝凝集素(CHL)		LECa.Ga1.Ga1.xx.Xxxx.
[242]	原鸡	鸡卵凝集素		LECa.Gal.Ga1.xx.Xxxx.
					[243]	原鸡	鸡β半乳糖苷结合凝集素	S-凝集素或Ga1acti11.	LECa.Ga1.Ga1.xx.Xxxx.
[244]	原鸡	鸡血清甘露糖结合蛋白	S-凝集素或Co1lectin.	LECa.Ga1.Ga1.xx.Xxxx.
					[245]	原鸡	鸡肝脏甘露糖结合蛋白	S-凝集素或Co1lectin.	LECa.Ga1.Ga1.xx.Xxxx.
[246]	原鸡	鸡胸腺电凝集素(CTE)	S-凝集素或Galectin.	GLT1Gal.Ga1..xx.Xxxx.
					[247]	原鸡	鸡胚皮肤凝集素	S-凝集素或Galectin.	GLTa.Ga1.Ga1.xx.Xxxx.
[248]	Genvpterus blacodes.			LECi.Epi.Tre.xx.Xxxx.
					[249]	Geodia cvdonium.			LECi.Geo.Cyd.xx.Xga1.
[250]	Giardia lambia Surface lectin.	Taglin.		LECu.Gia.Lam.xx.Xxxx.
					[251]	Gliricida sepium.	凝集素A，凝集素B		LECp.Gli.Sep.se.Hgal(凝集素A)LECp.Gli.Sep.se.Hga2(凝集素B)
[252]	G1ossina longipennis凝集素			LECi.G1o.Lon.xx.Xxxx.

[253]	大豆	SBA.	豆类凝集素	LECp.Gly.Max.se.Hga1.
					[254]	Gonatanthus pumilus.			LECz.Gon.P1m.ti.Hcu1.
[256]	Grateu1opia filicina.			ECu.Gra.Fi1.xx.Xxxx.
					[257]	Griffithsia flosculosa.			LECu.Gri.Flo.xx.Xxxx.
[258]	Griffonia Simplicifolia凝集素	GS-I-A4，GS-I-A4，GS-I-B4，GS-II，GS-IV.	豆类凝集素	LECp.Gri.Sim.se.Hgal(GS-I-A4)LECp.Gri.Sim.se.Hga2(GS-I-B4)LECp.Gri.Sim.se.Hchl(GS-II)LECp.Gri.Sim.se.Hfu1(GS-IV)LECp.Gri.Sim.1e.Hgal(GS-I-A4)LECp.Gri.Sim.1e.Hga2(GS-I-B41LECp.Gri.Sim.le.Hch1(GS-II)LECp.Gri.Sim.1e.Hf1l(GS·IV).
					[260]	灰树花	GFL.		LECf.Gri.Fro.xx.Xg81.
[261]	捻转血矛线虫			LECz.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[262]	Ha1idrys siliquosa.			LECu.Ha1.Si1.xx.Xxxx.
[263]	仙掌藻			LECu.Ha1.Opu.xx.Xxxx.
					[264]	Halocvnthia pyriformis.			LECi.Ha1.Pyr.xx.Xxxx.
[265]	海鞘			LECi.Ha1.Ror.xx.Xga1.
					[266]	簇毛麦		含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Hay.Vi1.se.Hch1.
[269]	向日葵		β-prism植物凝集素	LECp.Hel.Ann.xx.Xxxx.

[270]	菊芋	HTA.	Jacalin-相关凝集素	LECp.He1.Tub.tu.Hmmm1.
					[271]	幽门螺旋杆菌	HP-SAL.		LECb.He1.Py1.xx.Xxxx.
[272]	Helix1spe1sa.			LECi.He1.Asp.xx.Xxxx.
					[273]	玛瑙螺	HPA.		LECi.He1.Pom.xx.Xxxx.
[274]	Herpetomonas.			LECz.Her.xx.Xxxx.
					[276]	Heteranthelium piliferum.		含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Het.Pi1.se.Hch1.
[277]	Heterometrus granulomanus.			LECi.Het.gra.xx.Xsi1.
					[279]	橡胶	HBA，橡胶素	含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Hev.Bra.1a.Mch1.
[280]	Hippeastrum hybrid.	HHA.	单子叶植物凝集素	LECp.Hip.Hyb.bu.Hma1.
					[281]	Hippopus hippopus.	Tridacnin.	C-凝集素	LECi.Hip.Hip.xx.Xxxx.
[282]	Hizoctonia solani.			LECz.Hiz.So1.xx.Xxxx.
					[283]	元蘑			LECf.Hoh.Ser.xx.Xxxx.
[284]	美国海嗽蛄	HAA.		LECi.Hom.Ame.xx.Xxxx.
					[285]	人类	选择素(1KJD).	C-凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[286]	人类	人甘露糖结合蛋白(MSP)(1HUP).	C-凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[287]	人类	胃粘液抗沙门氏菌凝集素		LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.

[288]	人类	人膜凝集素(HKML，HCCML).	LECh.Hom.Sap.Xxxx.
				[289]	人类	人滑膜组织凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[290]	人类	人胎盘凝集素(HPL-H，HPL-BG)	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
				[291]	人类	人脑半乳糖苷结合凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[292]	人类	人14-kDa凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
				[293]	人类	人核心特异性凝集素(HCSL).	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[294]	人类	人膜凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
				[295]	人类	肿瘤杀伤性巨噬细胞凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xga1.
[296]	人类	肿瘤相关的脊椎凝集素	LECa.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
				[297]	人类	人凝集素样蛋白	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[298]	人类	甘露糖特异性内吞受体	LECh.Hom.Sap.xx.Xma1.
				[299]	人类	人倒数第二(Pen-u1timate)甘露糖凝集素	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[300]	人类	凝血栓蛋白	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
				[301]	人类	Tetranectin.	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[302]	人类	人树突状细胞免疫受体(DCIR).	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.

[303]	人类	人精液凝集素(HSL).		LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[304]	人类	Charcot-Leyden结晶蛋白(1LCL).	S-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[305]	人类	Galectin II L-14-II(1HLC).	ProtoS-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[3061	人类	人肺表面活性蛋白(1B08).	C-凝集素或Collecti11.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[307]	人类	Galectin III.	ChimeraS-凝集素或Galectin	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[308]	人类	Galectin VII，hGa1-7.	ProtoS-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[309]	人类	Pentraxin(1CRV).	Pentraxin.S-凝集素或Ga1ectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[310]	人类	唾液酸粘附素	L凝集素	LECz.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
[311]	人类	血清淀粉样P成分	Pentraxi11.	LECh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[312]	人类	E-选择素(1ESL).	C-凝集素	SELh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[313]	人类	L-选择素(1KJB).	C-凝集素	SELh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[314]	人类	C-反应蛋白(1CRV).	Pentraxin，S-凝集素或Galecti11.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[315]	人类	Galectin XII.	S-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[316]	人类	Galectin I.	Proto S-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[317]	人类	Galectin IX，Ecalectin.	串联重复S-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.sr.Xxxx.
					[318]	人类	Galectin VIII.	串联重复S-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.

[319]	人类	GalectinIV.	串联重复S-凝集素或Galectin.	GLTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[320]	人类	α-1/β-1整合素	整合素A(或I)结构域	INTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[321]	人类	α-2/β-1整合素	整合素A(或I)结构域	INTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[322]	人类	α-3/β-1整合素	整合素A(或I)结构域	INTh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[323]	人类	α-4/β-1整合素	整合素A(或I)结构域	INTh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[338]	人类	α-5/β-8整合素	整合素A(或I)结构域	INTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
339]	人类	α-4/β-7整合素	整合素	INTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
					[340]	人类	α-E/β-7	整合素	INTh.Hom.Sap.xx.Xxxx.
[341]	人类	粘膜地址素细胞粘附分子-1(MADCAM-1).	地址素	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[342]	人类	血管粘附分子(VCAM-1.		LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[343]	人类	P-选择素	选择素	SELh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[344]	人类	胞间粘附分子(ICAM-1，ICAM-2).	地址素？	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[345]	人类	外周淋巴结地址素(PNAd).	地址素	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[346]	人类	血管粘附蛋白(VAP-1).		LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[347]	人类	LFA-3.	地址素？	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.

[348]	人类	多功能蛋白聚糖	可溶性C-凝集素(′Lecticans′).	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[349]	人类	聚集蛋白聚糖	可溶性C-凝集素(′Lecticans′).	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[350]	人类	神经蛋白聚糖	可溶性C-凝集素(′Lecticans′).	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					351]	人类	Brevican.	可溶性C-凝集素(′Lecticans′).	LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[352]	人类	膜联蛋白V.	膜联蛋白	ANNh.Hom.Sap.xx.Xxx5.
					[353]	人类	膜联蛋白II.	膜联蛋白	ANNh.Hom.Sap.xx.Xxx2.
[354]	人类	膜联蛋白IV.	膜联蛋白	ANNh.Hom.Sap.xx.Xxx4.
					355]	人类	膜联蛋白I(脂皮质蛋白-1)，ANX1.	膜联蛋白	ANNh.Hom.Sap.xx.Xxx1.
[356]	人类	膜联蛋白VII会联蛋白		ANNh.Hom.Sap.xx.Xxx7.
					[357]	人类	活化的白细胞粘附分子(ALCAM).		LECh.Hom.Sapxx.
[358]	人类	E-钙粘着蛋白		CDHh.Hom.Sap.xx.XxxE.
					[360]	人类	钙粘着蛋白(桑椹粘着蛋白)		CDHh.Hom.Sap.xx.XxxN.
[361]	人类	钙粘着蛋白(血管内皮钙粘着蛋白)		CDHh.Hom.Sap.xx.XxxVE.
					[362]	人类	P-钙粘着蛋白		CDHh.Hom.Sap.xx.XxxP.
[363]	人类	膜联蛋白XI(CAP-50)		ANNh.Hom.Sap.xx.Xxx9.
					[364]	人类	内皮细胞选择性粘附分子(ESAM).		CDHh.Hom.Sapxxx.
[365]	人类	ELAM-1.		CDHh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.

[366]	人类	GMP-140.		CDHh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[367]	人类	皮肤淋巴细胞抗原(CLA).		LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[369]	人类	淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)		LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[370]	人类	极迟抗原4(VLA-4).		LECh.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
[371]	大麦	HVA.		LECp.Hor.Vu1.se.Hch1.
					[372]	沙盒素	HCA.	2型RIP.	LECp.Hur.Cre.se.Cgal(HCA)LECp.Hur.Cre.1a.Cga1.
[373]	青黄蜡伞菌			LECf.Hyg.Hyp.xx.Xxxx.
					[374]	长枝沙菜			LECu.Hyp.Cer.xx.Xxxx.
[375]	Hyptos suaveolens.			LECz.Hyp.Sua.xx.Xxxx.
					[376]	Iberis amara.			LECp.Ibe.Ama.xx.Xxxx.
[377]	流感病毒	血凝素	血凝素	LECv.I1f.Vir.xx.Xxxx.
					[378]	甘薯			LECp.Ipo.Bat.xx.Xxxx.
[379]	Iris ho1landica.			LECp.Iri.Ho1.xx.Xxxx.
					[380]	Irishybrid.	IRA.	2型RIP.	LECp.Iri.Hyb.bu.Cga1.
[381]	核桃			LECp.Jug.Reg.xx.Xxxx.
					[382]	Klvveromvces bu1garicus.			LECz.Kly.Bu1.xx.Xxxx.
[383]	Kuehneromyces mutabilis.			LECu.Kue.Mut.xx.Xxxx.
					[384]	Labiaceae origanum.			LECp.Lab.Ori.xx.Xxxx.

[385]	扁豆	DLA，LPA.	豆类凝集素	LECp.Lab.P1r.se.Hmg1.
					[386]	苏格兰金链花	LAA-I，LAA-II.	豆类凝集素	LECp.Lab.Alp.se.Hchl(LAA-DLECp.Lab.Alp.se.Hgal(LAA-II).
[387]	Laccaria amethystina.			LECz.Lac.Ame.xx.Xxxx.
					[389]	Lachesis huta.	BML.		LECi.Lac.Jut.xx.Xxxx.
[390]	松乳菇	LDL.		LECf.Lac.De1.xx.Xga11.
					[391]	黑乳菇			LECz.Lac.Lig.xx.Xxxx.
[392]	Lactuca scario1e.	PLA-I，PLA-II.		LECa.Lac.Sca.xx.Xxxx.
					[393]	Laelia autumnalis.			LECp.Lae.Aut.xx.Xxxx.
[394]	Laetiporus sulfureus.	PSL.		LECf.Lae.Su1.xx.Xxxx.
					[395]	Lathvrus cicera.	LcLi，LcLII.		LECp.Lat.Cic.xx.Xxxx.
[396]	Lathyrus nisso1ia.			LECp.Lat.Nis.xx.Xxxx.
					[397]	Lathvrus ochrus.	LOL-I，LOL-II.	豆类凝集素	LECp.Lat.Och.xx.Xxxx.
[398]	香豌豆			LECp.Lat.Odo.xx.Xxxx.
					[399]	Lathyrus silvestris.			LECp.Lat.Si1.xx.Xxxx.
[400]	Lathyrus tuberosus.			LECp.Lat.Tub.xx.Xxxx.
					[401]	兵豆	LCA，LcH.	豆类凝集素	LECp.Len.Cu1.se.Hmg1.
[402]	独行菜			LECp.Lep.Sat.xx.Xxxx.
					[403]	威德尔海豹			LECz.Lep.Wed.xx.Xxxx.
[404]	Leptospermum archinoides.	LAA.		LECp.Lep.Arc.xx.Xxxx.

[405]	雪片莲属			LECz.Leu.sss.xx.Xxxx.
					[406]	夏雪片莲	LAA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.Leu.Aes.bu.Hma1.
[407]	雪滴花	LVA.	单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.Leu.Ver.bu.Hma1.
					[408]	美洲鲎	Limulin.	Pentraxin.	LECi.Lim.Po1.xx.Xsi1.
[409]	Liocarcinus depurator.			LECi.Lio.Dep.xx.Xxxx.
					[410]	Listeria ovata.	LOA，LOMBP.	单子叶植物甘露糖结合蛋白	LECp.Lis.Ova.1e.Hmal(LOA)LECp.Lis.Ova.1e.Mmal(LMOBP).
[411]	荔枝	LCL.		LECp.Lit.Chi.xx.Xxxx.
					[412]	Lonchocarpus capassa.		豆类凝集素	LECp.Lon.Cap.se.Hga1.
[413]	Lontonis bainesii.		豆类凝集素	LECp.Lon.Bai.se.HgalLECp.Lon.Bai.ro.Hga1.
					[414]	Lophocereus shotti.			LECp.Lop.Sho.xx.Xxxx.
[415]	荆豆	LTA.	豆类凝集素	LECp.Lot.Tet.se.Hf11.
					[416]	丝瓜	LAA.	Cucurbtaceaephloem凝集素	LECp.Luf.Acu.fr.Hch1.
[417]	蚯蚓	EW29.		LECi.Lum.Ter.xx.Xxxx.
					[418]	番茄	LEA，TL，LEL.	几丁质结合凝集素	LECp.Lyc.Esc.fr.Hch1.
[419]	忽地笑		单子叶植物甘露糖结合凝集素	LECp.Lyc.Aur.bu.Hma1.

[420]	怀槐	MALb，MAHb，MAL，MAHs.	豆类凝集素	LECp.Maa.Amu.se.Hsil(MAHs，MAH)LECp.Maa.Amu.se.Hsi2(MAHs，MAH)LECp.Maa.Amu.ba.Hsil(MAHb)LECp.Maa.Amu.ba.Hsil(MALb).
					[421]	Machaerocereus e11ca.	MEA-I，MEA-II.	？.	LECp.Mac.Eru.st.Hga1.
[422]	Machaerocereus gummosus.		含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Mac.Gum.xx.Xxxx.
					[423]	柘橙	MPA.	β-prism植物凝集素	LECi.Mac.Pom.xx.Xxxx.
[424]	水蛭	LL1-63.		LECi.Mac.Dec.xx.Xxxx.
					[425]	罗氏沼虾	MrL.		LECi.Mac.Ros.xx.Xxxx.
[426]	Macrotvloma axi1lare.			LECp.Mac.Axi.xx.Xxxx.
					[427]	Malus officinalis.			LECp.Ma1.Off.xx.Xxxx.
[428]	烟草天蛾	I1111ulectin.	C-凝集素	LECi.Man.Sex.xx.Xxxx.
					[429]	芒果	MIA.		LECp.Man.Iud.xx.Xxxx.
[430]	Marah macrocarpus.			LECp.Mar.Mac.xx.Xxxx.
					[431]	硬柄皮伞菌			LECf.Mar.Ore.xx.Xxxx.
[432]	紫花苜蓿			LECp.Med.Sat.xx.Xxxx.
					[433]	Medicago truncatula.			LECp.Med.Tru.xx.Xxxx.
[434]	Megabalanus rosa.			LECi.Mag.Ros.xx.Xxxx.

[435]	Megapitaria squalida.			LECi.Meg.Squ.xx.Xxxx.
					[436]	Melanoleuca melaleuca.			LECf.Me1.Me1.xx.Xxxx.
[437]	Melastiza chateri.			LECf.Me1.Cha.xx.Xxxx.
					[438]	金黄地鼠		Pentraxin.	LECz.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
[474]	兰科植物			LECp.Orc.Sss.xx.Xxxx.
					[475]	Omithodoros moubata.	Dorin-M.		LECi.Om.Mou.xx.Xxxx.
[476]	水稻	OSA.	几丁质结合凝集素	LECp.Ory.Sat.see.Hchl.
					[477]	阿氏颤藻			LECu.Osc.Aga.xx.Xxxx.
[478]	Otala lactea.			LECi.Ota.Lac.xx.Xxxx.
					[480]	Pachydereus pringleii.			LECp.Pac.Pri.se.Hch1.
[481]	Pacifastacus leniusculus.			LECi.Pac.Len.xx.Xxxx.
					[482]	红藻			LECz.Pa1.Pa1.xx.Xxxx.
[483]	海胆			LECi.Par.Liv.xx.Xxxx.
					[484]	Parkia biglandulosa.			LECp.Par.Big.xx.Xxxx.
[485]	parkia discolor.			LECz.Par.Dis.xx.Xxxx.
					[486]	Parkia platycephala.			LECz.Par.Pla.xx.Xxxx.
[487]	Parkia speciosa.			LECp.Park.Spe.xx.Xxxx.
					[488]	黑毛庄菇			LECz.Pax.Atr.xx.Xxxx.

[489]	Paxi1lus panuoides.			LECf.Pax.Pan.Sss.xx.Xxxx.
					[490]	草虾		LECp.Pen.Ca1.xx.Xxxx.
[492]	南美蓝对虾			LECi.Pen.Sty.xx.Xxxx.
					494]	南美白对虾		LECi.Pen.Van.xx.Xxxx.
[495]	Percafluviatilis.			LECa.Per.F1u.xx.Xxxx.
					[496]	Peresea gratissima.		LECz.Per.Gra.xx.Xxxx.
[497]	鳄梨	PAA.		LECp.Per.Ame.xx.Xxxx.
					[498]	海生八目鳗		LECz.Pet.Mar.xx.Xxxx.
[499]	Petrosecinum hortense.			LECp.Pet.Hor.xx.Xxxx.
					[500]	疣孢褐盘菌		LECp.Pez.Bad.xx.Xxxx.
[501]	噬菌体p22	噬菌体P22尾刺突蛋白(1TSP).		LECb.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
					[502]	苹掌舟蛾	PFA.	LECi.Pha.Fla.xx.Xxxx.
[503]	Pha1lus impudicus.			LECf.Pha.Imp.xx.Xxxx.
					[504]	Pha1lusia mamillata.		LECi.Pha.Mam.xx.Xxxx.
[505]	Phaseolus acutifolius.		豆类凝集素	LECp.Pha.Acu.se.Hcul(erythroagglutinin)LECp.Pha.Acu.se.Hcu2(1ymphoagglutinin).
					[506]	Phaseolusaureus.		LECp.Pha.Aur.xx.Xxxx.
[507]	红花菜豆	PCA.	豆类凝集素	LECp.Pha.Coc.se.Hcul(PCA)LECp.Pha.Coc.se.Hcu2.

[508]	红花菜豆		LECp.Pha.Coc.xx.Xxxx.
				[509]	Phaseolus 1imenesis.	PLA，LBA，LBL.	豆类凝集素	LECp.Pha.Lim.se.Hga1.
[510]	棉豆		LECp.Pha.Lun.se.Xxxx.
				[511]	菜豆	PHA-E，PHA-L	豆类凝集素	LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
[512]	菜豆	GNlL，GNpL，GNsL.	LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
				[513]	菜豆	PintoIII.		LECa.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
[514]	菜豆		LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
				[515]	菜豆			LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
[516]	菜豆		LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
				[517]	菜豆			LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
[518]	菜豆		LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
				[519]	菜豆			LECp.Pha.Vu1.xx.Xxxx.
[520]	橙花糙苏		LECz.Phl.F1u.xx.Xxxx.
				[521]	鳞伞菇	PAA.		LECf.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
[522]	翘鳞环锈伞		LECf.Pho.Sq11.xx.Xxxx.
				[524]	Phoradendron califomicum.			LECz.Pjo.Cal.xx.Xxxx.
[525]	Phragmites.		LECz.Phr.sss.xx.Xxxx.

[526]	芦苇			LECp.P1r.Aus.xx.Xxxx.
					[527]	僧帽水母	Physalitoxin.		LECi.Phy.Phy.xx.Xxxx.
[528]	灯笼草	PA-VII-A，PA-VII-B和PA-VII-C.		LECz.Phy.Ang.xx.Xxxx.
					[529]	绒泡菌			LECu.Phy.Po1.xx.Xxxx.
[530]	美洲商陆	PWM，Pa-1，Pa-2(PL-A)Pa-3，pa-4(PL-C)，Pa-5.		LECp.Phy.Ame.ro.Hch1(Pa-1)LECp.Phy.Ame.ro.Hch2(Pa-2)LECp.Phy.Ame.ro.Hch3(Pa-3)LECp.Phy.Ame.ro.Hch4(Pa-4)LECp.Phy.Ame.ro.Hch5(Pa-5)LECp.Phy.Ame.ro.Hch6(PL-B).
					[531]	甘椒			LECp.Pim.Off.xx.Xxxx.
532]	豌豆	PSA，PsA.	豆类凝集素	LECp.Pis.Sat.se.Hmgl(PSA，PsA)LECp.Pis.Sat.ro.Hmg1.
					[533]	香鱼	PAL.		LECa.Ple.Alt.xx.Xxxx.
[535]	Pleurocvbe11a porrigens.			LECf.Ggg.Sss.xx.Xxxx.
					[536]	粗皮侧耳			LECf.Ple.Ost.xx.Xxxx.
[537]	P1umariaelegans.			LECu.Plu.Ele.xx.Xxxx.
					[538]	Polvandrocarpa misakie1sis.		C-凝集素	LECi.Pol.Mis.xx.Xga1.
[539]	Polygonum multiformum.			LECp.Po1.Mu1.xx.Xxxx.
					[540]	多瘤病毒	1VPN.		LECV.Po1.Vir.xx.Xxxx.

[541]	白多孔菌		LECf.Po1.Fom.xx.Xxxx.
				[542]	宽鳞多孔菌		LECf.Pol.Squ.xx.Xxxx.
[543]	Po1ysphondylium pa1lidum.		LECu.Po1.Pa1.xx.Xxxx.
				[544]	Potamon potamios.		LECi.Pot.Pot.xx.Xxxx.
545]	prunus Americana.		LECp.P111.Ame.xx.Xxxx.
				[546]	欧洲甜樱桃		LECp.Pru.Avi.xx.Xxxx.
[547]	新麦草	含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Psa.Ju11.se.Hch1.
				[548]	绿脓杆菌		LECb.Pse.Aer.xx.Xga1.
[549]	Pseudomonas aplysia.		LECb.Pse.Ap1.xx.Xxxx.
				[550]	四棱豆	PTL-I(WBA-I)，PTL-II(WBA-II)，WBTL，L-I，L-II.	LECp.Pso.Tet.se.Hgal(PTL-I)LECp.Pso.Tet.se.Hga2(1TL-II)LECp.Pso.Tet.ro.Hgal(WBTL)LECp.Pso.Tet.so.Hga2LECp.Pso.Tet.1e.Hga1(L-I)LECp.Pso.Tet.1e.Hga2(L-II).
[551]	Ptilota serrata.		LECu.Pxx.Ser.xx.Xxxx.
				[5521	安石榴		LECp.Pun.Gra.xx.Xxxx.
[553]	牛蛙	表现出RNase活性的凝集素(Leczymes).	LECa.Ran.Cat.xx.Xxxx.

[554]	牛蛙卵凝集素	cSBL.	表现出RNase活性的凝集素(Leczymes).	LECa.Ra11.Cat.xx.Xxxx.
					[555]	Rana iaponica.	iSBL.	表现出RNase活性的凝集素(Leczymes).	LECa.Ran.Jap.xx.Xxxx.
[557]	黑斑蛙			LECa.Ra1.Nig.xx.Xxxx.
					[558]	萝卜			LECp.Rap.Sat.xx.Xxxx.
[559]	Ratus norvegicus.	甘露糖结合蛋白(MBP-A).	C-凝集素或Co1lectin.	LECa.Rat.Nor.xx.Xxxx.
					[560]	大鼠	大鼠腹腔巨噬细胞凝集素		LECa.Rat.Rat.xx.Xf1lLECa.Rat.Rat.xx.Xga1.
[561]	大鼠			LECa.Rat.Rat.xx.Xxxx.
					[562]	大鼠	GalectinII.	S-凝集素或Galectin.	GLT2.Rat.Rat.xx.Xxxx.
[563]	大鼠	Galectin IV.	串联重复S-凝集素或Galecti1.	GLTa.Rat.Rat.xx.Xxxx.
					[564]	红果茶藨子			LECp.Rhe.Rhas.xx.Xxxx.
[565]	红穗醋栗			LECp.Rib.Rubs.xx.Xxxx.
					[566]	蓖麻	RCA-I，RCA-II，蓖麻毒蛋白	β-三叶草凝集素	LECp.Ric.Com.se.Cgal(蓖麻毒蛋白D)LECp.Ric.Com.se.Cga2(蓖麻毒蛋白E)LECp.Ric.Com.se.Cga2(RCA，RSL).

[567]	刺槐	RPA-I，RCA-III.		LECp.Rob.Pse.se.Hcul(RPsA-I)LECp.Rob.Pse.se.Hcu2(RPsA-II)LECp.Rob.Pse.se.Hcul(RPbA-I)LECp.Rob.Pse.se.Hcu2(RPbA-II).
					[568]	黑莓	RFA.	？.	LECp.Rub.Fru.tc.Xga1.
[569]	绒毛悬钩子			LECp.Rub.Ida.xx.Xxxx.
					[570]	鲤鱼			LECv.Rut.Rut.xx.Xxxx.
[571]	红鳟			LECa.Sa1.Gai.xx.Xxxx.
					[572]	Sa1mo sa1arv. Atlantica.			LECa.Sa1.Sa1.xx.Xma1.
[573]	Sa1mo sa1arv. Chinook.			LECa.Sa1.Sa1.xx.Xxxx.
					[574]	Sa1mo trutta			LECa.Sa1.Tru.xx.Xxxx.
[618]	Tetragono1obus pupurea.			LECp.Tet.Pur.xx.Xxxx.
					[619]	ThermoDsis.			LECz.The.sss.xx.Xxxx.
[621]	嗽叭毒棘海胆		C-凝集素	LECi.Xxx.Xxx.xx.Xxxx.
					[622]	木霉菌			LECf.Tri.Sss.xx.Xxxx.
[623]	Tricholoma mongolicum.			LECf.Tri.Mon.xx.Xxxx.
					[624]	口蘑科93-138			LECf.Tri.Sss.xx.Xxxx.
[625]	口蘑科93-34.			LECz.Tri.Sss.xx.Xxxx.
					[626]	日本栝楼	TJA-II，TJA-I，TK-I，TK-II.		LECp.Tri.Jap.xx.Xxxx.
[627]	白三叶			LECp.Tri.Rep.xx.Xxxx.

[628]	小麦	WGA.	含橡胶素结构域的几丁质结合凝集素	LECp.Tri.Aes.se.Hch1.
					[629]	Tulipa gesneriana.	TGA.		LECp.Tu1.Ges.xx.Xxxx.
1630]	郁金香			LECp.Udo.Pet.xx.Xxxx.
					[631]	荆豆	UEA-I，UEA-II，UEA-III.	豆类凝集素	LECp.U1e.Eur.xx.Xxxx.
632]	石莼			LECu.Ulv.Lac.xx.Xxxx.
					[633]	Ulva laetevirens.			LECu.Ulv.Lae.xx.Xxxx.
[635]	U1va rigida.			LECz.Ulv.Rig.xx.Xxxx.
					[637]	Urtica dioica.	UDA，	几丁质结合凝集素	LECp.Urt.Dio.r1.Hch1.
[638]	Vaejovis confuscius.			LECi.Vae.Con.xx.Xxxx.
					[639]	Vatairea macrocarpa.	VML.		LECp.Vat.Mac.xx.Xxxx.
[640]	解藻酸弧菌			LECb.Vib.Alg.xx.Xch1.
					[641]	霍乱弧菌	VPCV；Chitovibrin.		LECb.Vib.Cho.xx.Xxxx.
[642]	苕子			LECp.Vic.Cra.xx.Xxxx.
					[643]	Vicia ervilia.			LECp.Vic.Erv.xx.Xxxx.
[644]	蚕豆	VFA，Favin.	豆类凝集素	LECp.Vic.Fab.xx.Xxxx.
					[645]	Vicia graminea.	VGA.		LECp.Vic.Gra.xx.Xxxx.
[646]	Vicia hyrcanica.			LECp.Vic.Hyr.xx.Xxxx.
					[647]	薇菜			LECp.Vic.Sat.xx.Xxxx.
[648]	歪头菜	VUA.		LECp.Vic.Unj.xx.Xxxx.
					[649]	毛叶苕子	VVA-A4，VVL-A4.	豆类凝集素	LECp.Vic.Vi1.xx.Xxxx.
[650]	Vigna radiata.	MBL-I，MBL-II.		LECp.Vig.Rad.xx.Xxxx.

[651]	长豇豆		LECp.Vig.Ung.xx.Xxxx.
				[652]	槲寄生	ML-I，ML-II，ML-III，槲寄生凝集素VisAlbCEA.	β-三叶草凝集素(ML-I).	LECp.Vis.Alb.p1.Cgal(ML-I，viscu1in)LECp.Vis.Alb.p1.Cga2(ML-II，viscumin)LECp.Vis.Alb.p1.Cga3(ML-III，VAA-II)LECp.Vis.A1b.pl.Hchl(VisAlbCBA).
[653]	葡萄		LECp.Vit.Vin.xx.Xxxx.
				[654]	草菇	VVL.		LECf.Vo1.Vo1.xx.Xxxx.
[655]	多花紫藤	WFA.	LECp.Wis.F1o.xx.Xxxx.
				[656]	多花紫藤			LECp.Wis.Flo.xx.Xxxx.
[657]	紫藤		LECp.Wis.Si11.xx.Xxxx.
				[658]	Wistaris brachbotrvs.			LECz.Wis.Bra.xx.Xxxx.
[659]	千年芋		LECp.Xan.Sag.xx.Xxxx.
				[660]	光滑瓜蟾卵			LECa.X1.Lae.xx.Xga1.
[661]	Xeromus chrvsenteron.		LECz.Xer.C1r.xx.Xxxx.
				[662]	多形炭角菌			LECf.Xyl.Pol.xx.Xxxx.
[663]	玉米	ZMA-I，ZMA-II，ZMEA.	LECp.Zea.May.xx.Xxxx.
				[664]	Cannabis sativa.	CSA.		LECp.CanSat.se.Glu.
[665]	土茯苓	Sarpari1la.	LECp.SmiGla.rh.xxx.
				[666]	蛇爪	蛇爪

凝集素编码采用下列形式：

每种索引变量解释如下。

LLL指凝集素的一般分类。从这一点上说，发现有六种常见的类别：外源凝集素(LEC)、整合素(INT)、钙粘着蛋白(CDH)、膜联蛋白(ANN)、选择素(SEL)和galectin(GLT)。x值指凝集素的分类类别，表1概括了这些类别：

类别	分类类别
		LECa，GLTa	来自高等动物，通常脊椎动物的凝集素或galectin
LECh，GLTh	来自人类的凝集素或galectin
		LECi，GLTi	来自无脊椎动物的凝集素或galectin
LECp	植物凝集素
		LECf	来自真菌的凝集素
LECu	来自单细胞生物体的凝集素
		LECb	来自细菌的凝集素
LECv	病毒凝集素

Ggg代表植物属名的前三个字母(拉丁文)。

Sss代表植物种名的前三个字母(拉丁文)。

Ti指从中分离凝集素的组织。表2概括了用于表示各种组织的标记：

组织、细胞或器官	分类类别	标记(Index)
			树皮	植物	Ba
鳞茎	植物	Bu
			细胞膜	细菌，单细胞	Cm
表皮	人类，脊椎动物	Ep
			果实	植物	Fr
血淋巴	无脊椎动物	He
			乳胶	植物	La
叶	植物	Le
			根瘤(Nodule)	植物	No
器官或细胞类型	人类，脊椎动物，无脊椎动物	Oc

韧皮部树液	植物	Ps
			根状茎	植物	Rh
根	植物	Ro
			种子	植物	Se
血清或血浆	人类，脊椎动物，无脊椎动物	Sr
			孢子或子实体	真菌	Sp
茎	植物	St
			触角	无脊椎动物	Te
块茎	植物	Tu
			整体匀浆	无脊椎动物	Wb
毒液	无脊椎动物	Ve
			未定	人类，脊椎动物、无脊椎动物、细菌、单细胞、病毒、真菌	Un

T指凝集素亚型。Hololectin、merolectin、chimolectin和superlectin分别用字母H、M、C和S表示。

sp指特异性组。每一组用表3中所列的标记表示。

特异性	组别标记
		甘露糖结合凝集素	ma
甘露糖/麦芽糖结合凝集素	mm
		甘露糖/葡萄糖结合凝集素	mg
GlcNAc/(GlcNAc)结合凝集素	ch
		Ga1/GalNAc结合凝集素	ga
海藻糖结合凝集素	fu
		唾液酸结合凝集素	Si
复杂但特异性已知的凝集素	co
		复杂但特异性未知的凝集素	cu
双重特异性的凝集素	du
		具有未确定特异性的凝集素	nd

脂质

本发明的多功能分子还可以是第一部分包含脂质、第二部分包含与细胞表面分子如APC的细胞表面分子结合的氨基酸序列的分子。复合物和细胞混合时，脂质如长链脂肪酸与所述分子如多肽的结合可以使复合物稳定地与质膜相结合(Nagarajan etal，1995，J Immunol Methods184：241-51；McHugh et a1，1995，PNAS92：8059-63；vanden Berg et a1，1995，J Ce1l Biol，131：669-77)。人们认为这是通过脂质对膜的相互作用而发生的。生成脂质相关多肽的方法包括在适当的宿主细胞中表达编码指导翻译后添加TPI部分的部分信号序列的核酸。使用重组DNA技术，通过构建编码连接有异源GPI信号序列的蛋白质的核酸，天然不连接GPI的蛋白质可以表达成连有GPI的蛋白质。举例来说，可以用于本发明目的的编码GPI信号序列的核苷酸序列包括促衰变因子(decay accelerating factor)带有的DPI信号序列(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim BiophysActa1292：223-32的表1中氨基酸序列“22”的序列；编码Caraset al，U.S.Pat.5,109,113中公开的信号序列的序列)；brevican(如Genbank注册号X86406中核苷酸1982-2047)、mesothelin(如Genbank U40434中核苷酸1858-1983)、厌酷球孢子菌(coccidioides immitis)抗原2(如编码NCBI Entrez蛋白质数据库注册#1256444中氨基酸172-194的序列，Zhu et a1，1996，Gene181：121-5)、乙酰胆碱酯酶(如编码Duval et a1，1992，EMBO J11：3255-61中所述＂HC＂肽的序列；(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“19”的序列))、人叶酸受体α和β(如编码NCBI Entrez蛋白质数据库注册#182416中氨基酸230-257的序列，或编码NCBI Entrez蛋白质数据库注册#1655592中氨基酸228-255的序列，Yan and Ratnam，1995，Biochemistry34：14594-600)、5′核苷酸酶(如编码NCBI Entrez protein database注册#404502中氨基酸547-570或547-574的序列，Furukawa et a1，1994，Biochim Biophys Acta1190：273-8；(如编码Bucht andHja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“5”或“6”的序列))、CD59(如为Genbank U48255中核苷酸393-473所编码；编码Bucht andHja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“20”的序列；编码POWELL et a1，1997，J Immuno1158：1692-1702的图2中氨基酸74-101的序列)、T-钙粘着蛋白(如编码Ko1ler and Ranscht，1996，J Biol Chem271：30061-7中所述的鸡T钙粘着蛋白中76个C端氨基酸的序列)、氨肽酶P(如编码NCBI Entrez蛋白质数据库注册#1517942中氨基酸649-673的序列，Hyde et a1，1996，Biochem J319：197-201)、羧肽酶M、CD16B、Thy1、碳酸酐酶IV(如编码NCBI Entrez蛋白质数据库注册#179791中氨基酸284-312的序列，Okuyama et a1，1995，Arch BiochemBiophys320：315-22)、胎盘碱性磷酸酶(如编码NCBI Entrez蛋白质数据库注册#178464中氨基酸498-529的序列，Oda et a1，1994，Biochem J301：577-83)、神经元糖蛋白F3、癌胚抗原(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“28”的序列)、MRC-OX45(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“2”的序列)、RT6.2(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“3”的序列)、粘菌(D.discoideum)前孢子特异性抗原(如编码Bucht andHja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“4”的序列)、微粒体二肽酶(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“8”的序列、CAMPATH-1(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“9”的序列)、布鲁氏锥虫(T.brucei)PARP(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“10”的序列)、布鲁氏锥虫VSG Mit118a(如编码Buchtand Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“11”的序列)、布鲁氏锥虫VSG Mit117a(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，BiochimBiophysActa1292：223-32的表1中氨基酸序列“12”的序列)、布鲁氏锥虫VSG MITat1.1000BC(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim BiophysActa1292：223-32的表1中氨基酸序列“13”的序列)、布鲁氏锥虫VSG MITat1.5b(如编码Bucht andHja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“14”的序列)、布鲁氏锥虫VSG ILTat1.1(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim BiophysActa1292：223-32的表1中氨基酸序列“15”的序列)、布鲁氏锥虫VSGTxTat1(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“16”的序列)、布鲁氏锥虫VSG Mit221(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim BiophysActa1292：223-32的表1中氨基酸序列“17”的序列)、朊病毒(prion)蛋白(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“18”的序列)、尿激酶受体(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，BiochimBiophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“21”的序列)、T.congolense VSG YNat1.1(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“23”的序列)、酿酒酵母(S.cerevesiae)GAS-1(如编码Bucht andHja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“24”的序列)、Thy-1(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim Biophys Acta1292：223-32的表1中氨基酸序列“25”或“26”的序列)、L major PSP(如编码Bucht and Hja1marsson，1996，Biochim BiophysActa1292：223-32的表1中氨基酸序列“29”的序列)、粘菌(D.discoideum)接触位点A糖蛋白(如编码Barth et a1，1996，Biochem J317：533-40中所述的25个C端氨基酸的序列)CD24和合成序列(如Coyne et a1，1993，J Biol Chem268：6689-93中所述序列)。

连有GPI的多肽可以使用下列方法从细胞中提取。沉降5×10⁶细胞并冻于-80℃。将沉淀物融化于14m10.15M NaC1/10mM Tris7.4/0.1mM伯氨喹/2％TritoX-114中，并于14℃搅拌1h，然后于0℃以8800g离心10min。将上清液在-20℃保存过夜，于室温融合，并置于32℃12min。然后于32℃以3000g离心3min。弃上层，往下层加入11m1冷的缓冲液A(0.15M NaCl/10mM Tris7.4/0.1mM伯氨喹/0.06％TritonX-114)。将其在冰上孵育10min。重复12min32℃孵育、32℃3000g离心、弃上层和向下层加入11m1冷缓冲液A。将溶液于0℃以18000g离心10min。重复12min32℃孵育、32℃3000g离心和弃上层步骤。向最终的下相中加入3倍体积的冷丙酮。将溶液以12,000RPM离心30min，去除上清液，真空干燥含GPI成分的蛋白质沉淀物。通过本领域技术人员所熟知的方法纯化特异性蛋白质，如免疫亲和纯化。

生成连有脂质多肽的另一种方法是使多肽和诸如棕榈酸酯的脂肪酸化学连接。将1.5mg/m1的多肽悬浮于含有0.3％deeoxycholic acid、0.1％碳酸氢钠和0.1％叠氮钠的PBS pH7.8中。溶液的最佳终pH是7.6-8.0。将混合物加热至37℃，加入棕榈酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(hydroxysuccinimide ester)(Research Organics，Cleveland，OH)至终浓度为0.1mg/m1。将溶液于室温下孵育过夜。通过用溶于PBS pH7.6的0.15％deeoxycholic acid平衡的16×250mm Sephadex G-75层析柱纯化多肽。

根据本发明有用的交联部分

使配体和承抗原靶位相连的另一种传统的方法是使用交联剂。“交联剂”是能与至少两种其他分子上的官能团反应、从而在与交联剂的反应时使两种分子共价连接的化学实体，所述的至少两种其他分子如两种多肽或多肽与脂质。因此，CD40的配体可以交联在细胞表面的分子上。

双官能团或多官能团的各种交联剂是本领域公知的，是可以从商业途径获得的，如从Sigma(St.Louis，MO)获得。举例来说，这些包括S-乙酰巯基琥珀酸酐、S-乙酰硫代乙醇酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、S-乙酰硫代丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、乙二酸酰肼(adipic acid dihydrazide)、4-叠氮苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、N-(5-叠氮-2-硝基苄氧基)琥珀酰亚胺、6-(4-叠氮-2-硝基苯基氨基)己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、p-叠氮苯酰基溴化物、N-(4-叠氮苯基硫代)棕榈酰亚胺、4-叠氮水杨酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、溴醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、1，4-丁二醇二缩水甘油基酯、羰基-二(L-甲硫氨酸p-硝基苯基酯)、2-重氮基-3，3，3-二氟丙酸p-硝基苯基酯、二乙基malonimidate、1，5-二氟-2，4-二硝基苯、4，4′-二异硫氰酰1，2二苯乙烯-2，2′-二磺酸、二甲基乙二酸亚胺、二甲基3，3′-二硫代二丙酰亚胺、二甲基pimelimidate、二甲基suberimidate、4，4′-二硫代二苯基叠氮化物、二硫代二(丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、乙二醇双-(琥珀酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)、4-氟-3-硝基苯基叠氮化物、双-(4-氟-3-硝基苯基)砜、p-甲酰苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、戊二醛、2-亚氨氢氯化硫醇、6-(iodoacet氨基)己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碘醋酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-malemido乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、3-malemido苯甲酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-malemido)二苯甲酮、γ-malemido丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、ε-malemido己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-malemido甲基)环己羧酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-malemido甲基)环己羧酸3-磺基-N-羟基琥珀酰亚胺酯、β-malemido丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、N，N′-二(3-malemido丙酰基)-2-羟基-1，3-丙二胺、1，4-亚苯基二硫氰酸酯、N，N′-o-亚苯基dimalemide、N，N′-p-亚苯基dimalemide、聚氧乙烯二(缩水甘油醚)、二(聚氧乙烯二(缩水甘油醚))、聚氧乙烯二(咪唑基羰基)、二(聚氧乙烯二(咪唑基羰基))、聚氧乙烯二(p-硝基苯基碳酸酯)、3-(2-二硫吡啶基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、辛二酸二(N-羟基琥珀酰亚胺)酯、琥珀酸malemido乙基N-羟基琥珀酰亚胺酯、1，5-二(succinimidooxy羰基氧基)-pentane和二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯。

细胞表面蛋白的配体

本发明的多功能分子中第一部分是凝集素，其能够与承抗原靶位上至少一种碳水化合物分子结合，第二部分是抗原呈递细胞上细胞表面蛋白的配体。配体可以是能与附录I或II中GenBank注册号所指的一种或多种细胞表面分子结合的任意配体。而更优选的是，配体包括但不局限于调理素、细胞因子、热激蛋白、粘附分子、防卫素或T细胞共刺激分子的反受体；或这些分子中的一部分，如约(或至少约)5、8、10、12、15、20、25、35、40、50、60、70、80、100或120个相毗邻的氨基酸残基，直到全长的这种分子。

根据本发明有用的细胞因子

下文所用的术语“细胞因子”指哺乳动物细胞天然分泌的、与白细胞上细胞表面蛋白结合的多肽分子。本文中的术语“细胞因子”还指作为天然存在的细胞因子受体配基的多肽分子。不同于调理素，细胞因子在自然条件下不同时结合抗原和细胞表面受体。

例如，带有细胞因子受体的白细胞包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞、嗜碱细胞、血小板、淋巴细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞、骨髓瘤细胞、淋巴瘤细胞和白血病细胞。

不拘泥于任何一种机制，认为细胞表面结合的细胞因子通过使细胞因子与细胞稳定并置以增加细胞附近的细胞因子浓度，比游离可扩散的细胞因子更具有优点。

优选的细胞因子是非啮齿类细胞因子，如灵长类，如人类细胞因子。

根据结构和/或功能特征，某些细胞因子属于一个或多个细胞因子家族。其中一个家族由白介素组成。白介素结构上是多样的，但共同特征是由白细胞表达并作用于白细胞。白介素的例子包括IL-1(如Genbank注册No.E15330、M28983、E04743、M15131编码的多肽)、IL-2(如Genbank注册No.E01108、K02797编码的多肽)、IL-3(如Genbank注册No.A02046、M14743编码的多肽)、IL-4(如M13982、M25892编码的多肽)、IL-5(如X06270、J03478编码的多肽)、IL-6(如E02772、M20572编码的多肽)，IL-7(如J04156、M29054-29057编码的多肽)、IL-8(如M28130编码的多肽)、IL-9(如Ke1leher et AL，Blood.1991；77：1436-1441，Immunogenetics1990；31(4)：265-270中公开的序列)、IL-10(如M84340、U16720编码的多肽)、IL-11(如Paul et al，Proc Natl Acad SciUSA.1990；87：7512-7516，Morris et al，Exp Hemato1.1996；24：1369-1376中公开的序列)、IL-12(如Genbank注册No.M86671、S82412编码的多肽；Genbank蛋白P29459、P29460)、IL-13(如U31120、L13028编码的多肽)、IL-14(e.g.sequences disclosed in Ambrus et al，Proceedings of the National Academy of Science(USA)1993；90：6330-4)，IL-15(如AF031167、U22339编码的多肽)、IL-16(如AF006001、M90391编码的多肽)、IL-17(如U32659、U43088编码的多肽)、IL-18(如D49949、D49950编码的多肽)、IL-19(如AY040367编码的多肽)、IL-20(如NM02130、NM018724编码的多肽)、IL-21(如AF254069、AF254070编码的多肽)、IL-22(如AF279437编码的多肽)、IL-23(如AF301619、AF301620、AY055379编码的多肽[p19α链与IL-12p40链结合形成IL-23])、IL-24(如AF276916、NM053095编码的多肽)、IL-25(如NM080837编码的多肽)、TNF-alpha(如M16441，Y00467编码的多肽)和GM-CSF(如X03019、M11220编码的多肽)，及其在物种之间的同源物。在中度-高度严格的条件下，编码同源物的核苷酸序列彼此杂交。

另一个家族由造血因子组成。该家族的成员具有称作螺旋A、B、C和D的螺旋区域。螺旋A、B和螺旋C、D大致各自彼此平行。造血因子的例子包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、1L-15、GM-CSF、G-CSF(如Genbank注册No.E01219、M13926编码的多肽)、抑瘤素M(如Genbank注册No.D31942编码的多肽，Malik et al，Mol Ce1l Bio11989，9：2847-2853中公开的序列)、LIF(如Genbank注册No.X13967、X06381编码的多肽)、CNTF(如Genbank注册No.U05342、X60542编码的多肽)，及其在物种之间的同源物。在中度-高度严格的条件下，编码同源物的核苷酸序列彼此杂交。

人IL2是具有弱碱性PI的133个氨基酸(15.4kDa)的蛋白质。鼠源IL-2和人IL2表现出约65％的同源性。IL2合成为具有153个氨基酸的蛋白质，其前20个末端氨基酸充当疏水性分泌信号序列。该蛋白质含有对其生物活性重要的单一二硫键(位置Cys58/105)。

IL2在第3位苏氨酸上进行O-糖基化。不同分子量和变化的变体缘于可变的糖基化。非糖基化的IL2也具有生物活性。糖基化似乎能促进肝脏细胞对该因子的消除。

通过分离自再生鱼光神经的谷氨酰胺转移酶的作用生成二聚体形式的IL2，其表现为培养的大鼠脑少突细胞的细胞毒性因子。

人IL2基因含有四个外显子。IL2基因定位于人染色体4q26-28(鼠染色体3)。鼠IL2和人IL2编码区域在核苷酸水平上的同源性为72％。

IL2的生物活性由膜受体介导，该受体几乎排他性地在活化而非静息的T细胞上以4-12×10³受体/细胞的密度表达。活化的B细胞和静息的单核白细胞几乎不表达该受体。IL2的表达受IL5和IL6的调节。三种不同类型的IL2受体的区别在于差异性地且独立地表达。高亲和IL2受体(Kdis～10pM)占细胞所表达IL2受体的约10％。该受体是膜受体复合物，由作为配体结合结构域的两个亚基IL2R-α(TAC抗原＝T细胞活化抗原；p55)和IL2R-β(p75；CD122)与作为信号组分的γ链组成。P75在静息的T淋巴细胞、NK细胞和其他多种细胞类型上组成性表达，而p55的表达通常在细胞活化之后发现。但是，许多肿瘤细胞和HTLV-1感染的细胞也组成性合成p55。

单核细胞IL2受体的表达受IFN-γ的诱导，因此这些细胞具有肿瘤细胞毒性。在T细胞中，p75的表达可以为IL3所诱导。中等亲和IL2受体(Kdis＝100pM)由p75亚基和γ链组成，而低亲和受体(Kdis＝10nM)只由p55形成。

p55(如Genbank注册No.01057编码的多肽)长度为251个氨基酸，具有219个氨基酸的细胞外结构域和13个氨基酸的非常短的胞浆结构域。P55定位于人染色体10p14-p15。

p75(如Genbank注册No.M26062、M28052编码的多肽)长度为525个氨基酸，具有214个氨基酸的细胞外结构域和286个氨基酸的胞浆结构域。p75基因含有10个外显子，长度约为24kb。其定位于人染色体22q11.2-q12，定位于鼠染色体15(E带)。

已经描述了IL2受体的第三个64kDa亚基，称作γ亚基(如Genbank注册No.D13821、D11086编码的多肽)。鼠和人受体的γ亚基在核苷酸和氨基酸水平上具有约70％的序列相同性。该亚基是生成高亲和与中等亲和IL2受体所必须的，但是自身并不结合IL2。这两种受体亚型分别为α-β-γ异源三聚体和β-γ异源二聚体。编码IL2受体γ亚基的基因定位于人染色体Xq13，跨度约4.2kb，含有8个外显子。最近表明IL2受体的γ亚基是IL4和IL7受体的组分。其还认为是IL13受体的组分。

p75中与跨膜区域直接相邻的267-317位氨基酸参与IL-2介导的信号传导。此外，IL2受体与参与介导受体链构象变化、受体介导的内吞和信号传导过程的其他多种蛋白质(p22、p40、p100)相关。其中一种鉴定的蛋白质是95kDa的细胞粘附分子ICAM-1，其可能将受体聚集于细胞-细胞接触区域，从而介导旁分泌活性，例如在IL2介导的刺激T细胞过程中。与p75相关的另一种蛋白质是称作lck的酪氨酸特异的蛋白激酶。Lck阴性细胞系中IL2诱导的细胞增殖为蛋白酪氨酸激酶的特异性抑制剂所抑制，表明还有其他的激酶与IL2受体相关。已经鉴定到了称作fyn和lyn的两个这种激酶。另外，IL2受体信号还可以为vav所介导。

活化的淋巴细胞组成性分泌TAC抗原的42kDa片段。该片段在血清和血浆中循环，充当可溶性IL2受体(sIL2R)。该可溶性受体的浓度在不同的病理条件如感染、自身免疫病、白血病或器官移植后变化很大。其水平可增加至100倍。sIL2R的水平似乎与HIV诱导性疾病的严重性相关，在其他环境下还可作为诊断值。

鼠IL2和人IL2都高效导致同源物种的T细胞增殖。人IL2还在类似浓度下刺激小鼠T细胞增殖，但小鼠IL2刺激人T细胞增殖的效率较低(6倍至170倍)。

IL2是所有T淋巴细胞亚群的生长因子。其是T细胞的抗原非特异性增殖因子，诱导静息细胞的细胞周期进行，从而克隆扩增活化的T淋巴细胞。高效应受到诸如催乳素的激素的调节。

IL2还促进活化的B细胞的增殖，这也需要其他因子如IL4的存在。

由于对T细胞和B细胞的效应，IL2是免疫应答的核心调节因子。其还在抗炎反应、造血和肿瘤监督中发挥作用。IL2刺激外周白细胞中IFN-γ的合成，还诱导IL1、TNF-α和TNF-β的分泌。

还认为与扩增LAK细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞)活性相独立的、对肿瘤杀伤性细胞因子的诱导可能是负责IL2抗肿瘤活性的主要因素。

可以使用对IL2应答的细胞系(如ATH8、CT6、CTLL-2、FDCPmix、HT-2、NKC3、TALL-103)在生物分析中对该因子进行分析。也可以采用IL2的特异性ELISA分析和酶免疫分析。还可以使用生物素化的IL2和流式细胞术或ELISA分析来检测可溶性受体。

IL-2对多种肿瘤细胞类型都表现出显著的抗肿瘤活性，因为它支持特异性激发某些肿瘤的T细胞的增殖和克隆扩增。IL2正逐渐用于治疗传统治疗难以控制的癌症患者。对于尚没有常规治疗方法的转移性肾细胞癌，全身施用IL2的联合疗法导致30％的患者长期缓解。还在一定比例的黑素瘤或急性骨髓白血病患者中记录了客观和长期的临床反应。

高剂量的全身性IL2治疗还有大量有害的毒性副作用。IL2对细胞免疫系统中包括B细胞和巨噬细胞的其他组分也具有作用，诱导其他可溶性介质，包括TNF-α、TNF-β和IFN-γ的分泌。这些效应可以导致IL2的抗肿瘤活性，也导致剂量相关的毒性。

用功能性IL2基因转导鼠肿瘤细胞已经表明能够导致同系宿主对遗传修饰细胞的排斥。表达112的、改变了的肿瘤细胞还增加系统免疫性。

人IL4是129个氨基酸(20kDa)的蛋白质，其合成为含24个氨基酸的疏水性分泌信号序列的前体。IL4在两个精氨酸残基(38和105位)糖基化，含有参与二硫键形成的六个半胱氨酸。二硫键对于生物活性是必要的。也已经描述了生物活性不同的一些IL4糖基化变体。对鼠IL4和人IL4的比较表明二蛋白质只在91-128位不同。

重组人蛋白质中Tyr124替换为天冬氨酸残基的IL4变体Y124D以高亲和力与IL4受体结合(Kd＝310pM)。该变体是IL4受体系统的有效拮抗剂。其不具有对T细胞的可检测促增殖活性，竞争性抑制IL4-依赖的T细胞增殖(K(i)＝620pM)。该突变体的存在表明配体中高亲和力的结合和信号产生可以不有效偶联。Y124D还充当IL13受体的有效拮抗剂。

人IL4基因含有4个外显子，长度约10kb。其定位于染色体5q23-31。鼠基因定位于染色体11。IL4基因与编码造血生长因子(如GM-CSF、M-CSF、IL3、IL5)的其他基因非常靠近。IL4和IL5基因之间的距离约为90-240kb。

在核苷酸水平上，人IL4和鼠IL4基因表现出约70％的同源性。IL4的5’区含有多个称作CLE(保守的淋巴因子元件)的序列元件，其是控制该基因和其他基因表达的转录因子的结合位点。IL4基因的5’区中称作P元件(CGAAAATTTCC；SEQIDNO：1)的序列基序是称作NF(P)的、介导T细胞活化信号应答的核因子的结合位点。

IL4的生物活性为特异性受体(Kdis＝20-100pM)所介导，其以100-5000拷贝/细胞的密度表达(如Genbank注册No.M29854、X52425编码的多肽)。IL4受体的细胞外结构域和红细胞生成素(Epo)、IL6和IL2受体的β链的受体相关。其还命名为CD124。

鼠IL4受体的cDNA编码810个氨基酸(包括分泌信号序列)的跨膜蛋白。该受体具有553个氨基酸的大细胞内结构域。人受体具有270个氨基酸的细胞外结构域、24个残基的跨膜结构域和569个氨基酸的大细胞内结构域。

最近表明IL4受体含有IL2受体的γ亚基作为信号传导组分。该γ亚基还和IL4与IL7的受体相关，也可能和IL13的受体相关。已经描述了两种形式的受体，其中一种是分泌型的。分泌的受体只含有细胞外IL4结合结构域，能够阻断IL4活性。以与IL4受体相同的亲和力结合IL4的IL4结合蛋白(IL4-BP)也表明是可溶性IL4受体变体。这些可溶性受体可能通过抑制受体结合或充当转运蛋白而用作细胞因子活性的生理性调节因子。IL1(IL1受体拮抗剂)、IL2、IL7、TNF-α、IGF和IFN-γ的可溶性受体或结合蛋白也有描述。

IL4的生物活性是物种特异的；小鼠IL4对人细胞没有活性，人IL4对鼠细胞没有活性。IL4促进活化B细胞的增殖和分化、静息B细胞中II型MHC抗原和低亲和IgE受体的表达。IL4增强B细胞上II型MHC抗原的表达。它还促进其对其他B细胞刺激作出应答并将抗原呈递给T细胞的能力。这是促进特异性B细胞的克隆扩增、使免疫系统能够对低浓度抗原作出应答的一种方式。如果非B、非T细胞通过其IgE或IgG的Fc受体与其他细胞相互作用，则刺激这些细胞中IL4的生成。IL3可以增强这种效应。IL2和PAF(血小板活化因子)诱导IL4的合成，而TGF-β抑制其合成。

IL3拮抗B细胞中IL2诱导的效应，使IL2受体的表达缓慢降低，从而抑制IL2刺激的人B细胞的增殖。在活化的B细胞中，IL4刺激IgG1和IgE的合成，抑制IgM、IgG3、IgG2a和IgG2b的合成。IFN-γ拮抗B细胞中IL4诱导的这些同工型的转换。抑制IL-6、骨髓瘤生长因子合成的IL4抑制多种骨髓瘤的生长。IL4还抑制人肺泡(alveolar)巨噬细胞中IL6的合成。

用IL4预处理巨噬细胞阻止对细菌内毒素或IFN-γ所致细胞活化应答的IL1、TNF-α和前列腺素的生成。

在集落形成分析中，IL4和Epo与G-CSF/Epo协同作用，产生包含粒细胞或红细胞远祖细胞的集落。

IL4的经典检测方法是B细胞刺激分析法，测定受刺激的纯化B细胞增殖的增加。还可以在使用IL4应答性细胞(如BALM-4；BCL1；CT.4S；CTL44；CTLL-2；Da；FDCPmix；HT-2；L4；L138.8A；MO7E；MC/9；NFS-60；Ramos，Sez627，TF-1；TS1)的生物分析中检测IL4。人IL4的特异性检测方法是在多种B细胞系中诱导CD23，通过流式细胞术或通过荧光免疫分析检测CD23。在防止消耗/降解的条件下快速测定IL4生成速率的免疫分析是细胞因子免疫诱捕(immunotrapping)。

IL4抑制结肠瘤和乳腺瘤的生长。已表明它能增加LAK细胞的产生。已经表明，用功能性IL4基因转导鼠肿瘤细胞导致同系宿主对遗传修饰的细胞的排斥。表达IL4的、改变了的肿瘤细胞还加强系统免疫。接种转导细胞的小鼠排斥非转导细胞的后续激发，某些情况下还排斥已存在的肿瘤。

人IL6是185个氨基酸的蛋白质，在73和172位糖基化。它合成为212个氨基酸的前体蛋白。单核细胞表达至少5种不同分子形式的IL6，分子量为21.5-28kDa。它们的主要不同之处是翻译后变化，如糖基化和磷酸化。

从各种细胞类型分离的IL6在其N端都具有一定的微小异源性(microheterogeneity)。在血浆中发现了42-45kDa的形式，其可能和载体蛋白α-2-巨球蛋白(α2M)相复合。鼠IL6和人IL6在DNA水平上表现出65％同源性，在蛋白质水平上表现出42％同源性。

IL6是还包括LIF、CNTF、制瘤素M(OncostatinM)、IL11和CT-1的细胞因子家族的一个成员。所有已知的1L6细胞因子家族成员都诱导急性相蛋白的肝脏表达。

稳定和高生物活性设计的细胞因子是IL6和可溶性IL6受体的融合蛋白，称作H-IL6，其已经用于人类的造血远祖细胞扩增，在细胞不对IL6作出应答而需要由IL6和可溶性IL6受体组成的稳定复合物时是有用的。

人IL6基因长度约为5kb，含有5个外显子。其定位于标记物D7S135和D7S370之间的人染色体7p21-p14。鼠基因定位于染色体5。IL6和G-CSF基因的核苷酸序列彼此类似，暗示着可能的进化关系。

IL6受体(如Genbank注册No.M20566、E03515编码的多肽)表达在T细胞、分裂原活化的B细胞、外周单核细胞和一些巨噬细胞、B细胞来源的肿瘤细胞类型上。它不表达在静息的B细胞中，但是表达在静息的T细胞中。在肝细胞中，用IL6或IL1处理后IL6受体表达增强。在几种细胞类型中，IL6表达还为糖皮质激素所增强。IL6受体基因定位于染色体1q21。

IL6受体是80kDa的高度糖基化的蛋白质，长度为449个氨基酸。它还称作CD126。其作为468个氨基酸的前体合成。分子结构和M-CSF、PDGF和IL1受体类似，受体在细胞外受体结构域的氨基端区域中都含有免疫球蛋白样序列结构域。

IL6的细胞内结构域长度约为82个氨基酸，与参与细胞内信号传导的其他蛋白质不表现出任何同源性。已经描述了以不同亲和力(Kdis＝10^-9和10^-11M)与IL6结合的两种不同形式的受体，最可能缘于相同受体蛋白的翻译后修饰。还发现，IL6在10^-13-10^-15M浓度时也具有生物活性，说明还存在其他高亲和受体构象，或存在具有高亲和力的的其他受体分子。

IL6受体介导的信号传导涉及蛋白激酶C，还涉及腺苷酸环化酶。

IL6和其受体之间形成的复合物和参与信号传导的跨膜蛋白gp130(918个氨基酸；277个氨基酸的胞质结构域)相连。IL-6与其受体的结合导致二硫键连接的gp130的同源二聚体化和相关的酪氨酸激酶的活化，其为信号传导的第一个步骤。gp130还在不表达IL6受体的细胞中表达。还发现它是其他受体，包括IL11、LIF、制瘤素M和CNTF及CT-1的受体的组分。这解释了为何LIF、CNTF和IL6彼此不相关但都具有许多相同的生物活性。发现与STAT类似的、称作LIL因子的因子参与IL6的信号传导通路，还参与IL1和细菌脂多糖的信号传导通路。

还描述了与gp130相互作用的可溶形式的IL6受体(IL6R-SUP(IL6受体可溶性尿蛋白)。这些可溶性的受体可能通过抑制受体结合或充当转运蛋白用作细胞因子活性的生理性调节因子。还已经描述了IL1(IL1ra，IL1受体拮抗剂)、IL2、IL4、IL7、TNF-α、IGF和IFN-γ的类似可溶性受体或结合蛋白。

一些细胞，包括造血远祖细胞和神经元细胞只是对IL与可溶性IL6受体的组合应答，而不对单独的IL6应答。

人IL6在猴、大鼠和小鼠中具有生物活性。鼠IL6在人细胞中没有活性。描述IL6的许多不同首字母缩略词示例性说明了多种生物活性。IL6是影响抗原特异性免疫应答和炎性反应的多效性细胞因子。它是急性相反应的主要生理性介质之一。在肝细胞中，IL6与糖皮质激素联合诱导金属硫蛋白的合成，增加细胞内锌的水平，从而防止CCL-4诱导的肝脏毒性。IL6是类胆碱能神经元的神经营养因子，促进其在培养物中的存活。一些神经元细胞系可以被IL6诱导分化。

和IL1一样，IL6刺激垂体中ACTH(促肾上腺皮质激素)的合成。对ACTH应答合成的糖皮质激素在体内抑制IL6、IL1和TNF的生成，从而在免疫系统和神经内分泌功能之间建立一种负反馈环。在星形细胞中，IL6诱导神经生长因子(NGF)的合成。

在体内和体外，IL6是B细胞分化因子，是T细胞活化因子。在IL2的存在下，IL6诱导成熟和未成熟T细胞分化成细胞毒性T细胞。IL6还诱导胸腺细胞的增殖，可能在胸腺T细胞的发育中起作用。

如果B细胞预先经IL4活化，IL6能够诱导B细胞最终成熟为分泌免疫球蛋白的浆细胞。在B细胞中，IL6一定程度上刺激抗体的分泌，从而使IgG1水平增加120-400倍。

浓度只为0.002ng/mL的IL6是许多人骨髓瘤的主要自分泌生长调节因子之一。抗IL6的单克隆抗体可以抑制这些细胞的生长。对抗IL6的反义寡核苷酸的导入和IL4也能够抑制其生长。糖皮质激素对骨髓瘤细胞的生长抑制效应可能缘于类固醇诱导的IL6表达的下降。人IL6依赖性骨髓瘤细胞的生长还可以为IFN-γ所抑制。IL6还可以用作其他肿瘤类型的自分泌生长调节因子，其中某些肿瘤类型已经发现能组成性分泌IL6。对于体外宫颈(cervical)肿瘤细胞生长来说，IL6也表明是生长的自分泌调节因子。另一方面，IL6阻断一些实体瘤如乳腺癌、宫颈癌、人肺癌细胞系、组织细胞淋巴瘤和黑素瘤的生长。

IL6和IL3在体外协同促进多能性造血远祖细胞的增殖。IL6还是血小板生成素，在体外诱导巨核细胞的成熟，在体内增加血小板的量。在鼠骨髓培养物、而非在人骨髓培养物中，IL6表现出与GM-CSF类似的活性。

浆细胞瘤细胞生成IL6，还生成IL6受体。表明这些细胞以自分泌方式刺激。还描述了涉及两种细胞群体存在的旁分泌机制，一种细胞群体生成因子，而另一种细胞群体表达受体。

可以在使用IL6应答性细胞系(如7TD1；B9；CESS；KPMM2，KT-3；M1，MH60-BSF-2，MO7E；Mono Mac6；NFS-60；PIL-6；SKW6-C14；T1165；XG-1)的生物分析中检测IL6。也可以通过IL6作为杂交瘤生长因子的活性对IL6进行分析。还存在有灵敏的免疫学分析和比色测试。存在有检测受体相关的gp130蛋白的ELISA分析。

和其他细胞因子(例如IL2)联合，IL6可以用于治疗一些肿瘤类型。用功能性IL6转导鼠肿瘤细胞导致同系宿主对遗传修饰的细胞的排斥。表达IL6的改变了的细胞还增强系统免疫性。接种转导细胞的小鼠排斥后续的非转导细胞的激发，在某些情况下，还排斥已存在肿瘤。

人IL10是同源二聚体蛋白质，其亚基长度为160个氨基酸。人IL10与鼠IL10表现出73％的氨基酸同源性。人IL10含有4个外显子。它与Epstein-Barr病毒BCRF-1基因(Bam HI C片段正向阅读框)产物密切相关(蛋白质水平上84％的同源性)。这两种蛋白质彼此相关程度比与人IL10与鼠IL10之间更为密切。因此，BCRF-1还称作病毒IL10(vIL10)。人IL10基因定位于染色体1。人IL10与鼠IL10在核苷酸水平上表现出81％的同源性。

使用放射性标记的IL10(如Genbank注册No.L12120、U00672编码的多肽)已经在鼠细胞和人细胞上鉴定到了受体。小鼠IL10能够阻断IL10与小鼠细胞的结合，但不能阻断与人细胞的结合。已经克隆了鼠IL10受体。该受体是特异性结合鼠IL10的约110kDa的蛋白质。该受体在结构上与IFN受体相关。

在T细胞的Th1亚群中，而非在Th2细胞中，IL10抑制诸如IFN-γ、IL2和TNF-β的细胞因子的合成。IL4拮抗该活性。对IFN-γ的抑制效应是间接的，似乎是抑制辅助细胞合成IL12的结果。在人系统中，IL10由Th1和Th2细胞产生，并下调这些细胞的功能。在细菌脂多糖刺激的巨噬细胞中，IL6通过促进细胞因子mRNA的降解等抑制IL1、IL6和TNF-α的合成。它还导致对抗原呈递的抑制。在人单核细胞中，IFN-γ和IL10相互拮抗对方的生成和功能。IL10还表明是IL12的生理性拮抗剂。

在辅助细胞的存在下，IL10还抑制分裂原或抗CD3抗体诱导的T细胞增殖，减少IFN-γ和IL2的生成。外源性IL2和IL4抑制增殖抑制效应，但不影响IFN-γ的生成。在LPS刺激的巨噬细胞中，IFN-γ通过抑制IL10的生成来增加IL6的合成。IL10似乎负责Th2上清液抑制Th1细胞合成细胞因子的几乎所有或所有能力。

IL10抑制T细胞对Ig分泌，所述的分泌不依赖于IL5诱导的抗原，而非IL2诱导的抗原。

鼠Ly-1B细胞是IL10的主要来源。与其他B细胞相比，Ly-1B细胞表达组成性和诱导性水平大大增加的IL10。这些细胞还具有连续自我更新的明显特征。用抗IL10抗体连续处理新生小鼠，导致Ly-1B细胞的减少，而将脾B细胞群体维持在正常水平。这些小鼠中血清免疫球蛋白M水平大大降低，其对特异性抗原的抗体应答也受到影响。因此，IL10是Ly-1B细胞的调控因子。Ly-1B细胞减少的机制似乎涉及IFN-γ生成增加，因为同时施用中和性抗IFN-γ抗体基本恢复这些小鼠腹腔中存在的Ly-1B细胞数目。

IL10还是成熟和未成熟胸腺细胞的共刺激因子(和IL2、IL4和IL7一起)，用作细胞毒性T细胞分化因子，促进更多数目的IL2活化的T淋巴细胞前体增殖并分化成毒性效应细胞。IL10在体外维持B细胞活性，还刺激B细胞，促进其分化。它增加B细胞上II型MHC抗原的表达，但抑制单核细胞上II型MHC的表达。在通过其抗原受体或通过CD40活化的B细胞中，IL10诱导IgG、IgA和IgM的分泌。IL4协同增强该效应，而TGF-β拮抗IL10诱导的免疫球蛋白的合成。IL10可以抑制巨噬细胞的活化。

已经表明，人IL10是人T淋巴细胞的强而特异的趋化因子。趋化活性针对表达CD8的细胞，而非针对CD4(+)细胞。IL10还抑制CD4(+)细胞对IL8的趋化性应答，但不抑制CD8(+)细胞对IL8的趋化性应答。可以使用灵敏的ELISA分析对IL10进行检测。可以使用鼠肥大细胞系D36对人IL10进行生物分析。还可以通过流式细胞术检测细胞内因子。

已经利用IL10表达载体向CHO细胞的导入在体内分析局部IL10生成的效果。这些改变的细胞在裸鼠或严重免疫缺陷的(severe combined immunodeficient)SCID小鼠中不再产生肿瘤，并抑制相同数目的共注射CHO细胞的生长。而正常CHO肿瘤通常为巨噬细胞大量浸润，这些在CHO-IL10肿瘤组织中是根本不存在的，说明IL10通过抑制提供促肿瘤生长活性的巨噬细胞的浸润间接抑制某些肿瘤的生长。

人IL12是70kDa的异源二聚化糖蛋白，由通过二硫键连接的40kDa亚基(p40，306个氨基酸；10％碳水化合物)和35kDa亚基(p35，197个氨基酸；20％碳水化合物)组成，所述的二硫键对于IL12的活性是必要的。p40含有10个半胱氨酸和一个肝素结合位点；p35含有7个半胱氨酸。

IL12的两个亚基与其他已知蛋白质不相关。p40与IL6受体的细胞外结构域具有一些同源性，而p35似乎是IL6的同源物。

已经描述了将两个IL12亚基合并在一个分子中的有生物活性的鼠和人IL12融合蛋白。这种设计的细胞因子在体内具有抗肿瘤活性。还描述了Flexi12，保留有二聚化重组IL12的所有生物特征的单链蛋白质。

编码IL12中p40亚基(IL12B)的基因定位于人染色体5q31-q33，位于还含有其他细胞因子基因的相同区域内。编码IL12中p35亚基(IL12A)的基因定位于人染色体3p12-q13.2。两个基因的表达彼此独立地得以调节。

IL12受体似乎是约110kDa的单一蛋白质(如Genbank注册No.U03187、U23922、U64198、U64199编码的多肽)。在各种T细胞分裂原或IL2活化的外周血单核细胞上表达高达1000-9000高亲和力的IL12受体/细胞。IL12受体存在于表达CD4和CD8的活化T细胞与活化的CD56阳性自然杀伤细胞上。静息外周血单核细胞、扁桃体B细胞或anti-IgM/Dx、anti-IgM/Dx+IL2或SAC+IL2活化的扁桃体B细胞不表达该受体。高亲和性IL12受体在转化的狨猴NK样细胞系、HVS.SILVA40上组成性表达。

IL12与其受体的结合可以被抗含有结合位点的p40亚基的单克隆抗体所抑制。IL12的p40亚基与IL6受体的细胞外结构域表现出同源性。p40亚基的病毒编码的同源物是EBV诱导的基因3。

人IL12在鼠淋巴细胞中没有活性。由鼠p35和人p40亚基组成的杂合异源二聚体保留有对鼠细胞的生物活性；但是，人p35和鼠p40的组合对鼠细胞完全不具有活性。鼠IL12对鼠淋巴细胞和人淋巴细胞都具有活性。鼠IL12p40亚基(IL12p40)的p40亚基在不同的分析系统中表现出特异性拮抗IL12异源二聚体的效应，用作IL12异源二聚体的内源特异性抑制剂。

IL12刺激由植物凝集素活化的人成淋巴细胞的增殖。IL12活化CD56阳性的NK细胞，对TNF-α特异的抗体阻断该活性。IL12促进特异性同种异体CTL反应。IL12在还协同增强抗CD3抗体的作用和混合淋巴细胞培养物中同种异体刺激作用，诱导T细胞增殖。

在Thl型外周淋巴细胞中，IL12诱导IFN-γ、IL2和TNF的合成。TNF-α还似乎参与IL12对自然杀伤细胞的效应，因为抗TNF-α的抗体抑制IL12的效应。IL12和TNF-α是IFN-γ生成的共刺激因子，IL2最大化IFN-γ应答。IL10抑制IL12、TNF和IFN-γ的生成。在Th2辅助细胞中，IL12减少IL4、IL5和IL10的合成。

IL12和未达最佳标准的量的IL2协同刺激外周血中单核细胞的增殖，促进LAK细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞)的产生。在增强IL2体内扩增的自然杀伤细胞的细胞毒性方面，皮摩尔浓度的IL12和纳摩尔浓度的IL12同样有效。IL12还充当共分裂原，促进IL2诱导的静息外周细胞的增殖。

IL12增强SCF(干细胞因子)诱导的原始骨髓远祖细胞的骨髓组织生成，和集落刺激因子协同诱导增殖。IL12和IL3、IL11或IL3和SCF协同作用，对定型骨髓远祖远祖细胞具有协同增强效应。

IL12是潜在的临床兴趣所在，因为它降低LAK细胞(淋巴因子活化的杀伤细胞)生成所需的IL2剂量。IL12还表现出在体内抑制各种实验性肿瘤的生长，在体内具有抗血管生成效应，其至少部分由IFN-γ所介导。因此，IL12似乎还是治疗血管生成依赖性恶性肿瘤的潜在候选物。

IL19和IL10共有21％的氨基酸相同性，可能是同源物。在单核细胞中，用细菌脂多糖处理诱导IL19的合成，该效应在IL4或IL13的存在下增强，但不受IFN-γ的影响。GM-CSF直接诱导单核细胞中IL19基因的表达。IL19能够与IL20受体复合物结合(Dumoutier L et al Cutting edge：STAT activation by IL-19，IL-20and mda-7through IL-20receptor complexes of two types.Journal of Immunology167(7)：3545-9(2001)；Ga1lagher G et al Cloning，expression and initial characterization of interleukin-19(IL-19)，a novel homologue of human interleukin-10(IL-10).Genes Immun1(7)：442-50(2000))。

IL20结构上与IL10相关。IL20似乎是角化细胞的自分泌因子，调节其参与炎症。转基因小鼠中IL20的超表达导致新生致死，具有表皮分化受阻为特征的皮肤异常(Blumberg H et a1Interleukin20：discovery，receptor identification，and role inepidermal function.Ce11104(1)：9-19(2001)；Dumoutier L et al Cutting edge：STATactivation by IL-19，IL-20and mda-7through IL-20receptor complexes of two types.Journal of Immunology167(7)：3545-9(2001)；Rich BE and Kupper TS Cytokines：IL-20-a new effector in skin inflammation.Current Biology11(13)：R531-4(2001))。

已经鉴定到了IL20受体，其由两个2型孤儿细胞因子受体亚基组成。该受体在皮肤中表达，其表达在牛皮癣皮肤中明显上调。角化细胞中的受体结合涉及一个STAT蛋白成员STAT3的信号传导。

IL20受体复合物还表现为与IL19和IL24相结合。

Parrish-Novak等人已经在寻找之前已分离的1型细胞因子受体的配体时，从活化CD3(+)细胞的cDNA文库中分离到了IL21。该cDNA编码与IL2和IL15最为相关的131个氨基酸蛋白质的分泌蛋白。IL21基因定位于人染色体4q26-q27，接近IL2基因。IL21mRNA在细胞活化后的CD4(+)细胞中表达，但不在CD8(+)中表达。它也不在B细胞和单核细胞中表达(Asao H et al Cutting edge：the common gamma-chain isan indispensable subunit of the IL-21receptor complex.Journal of Immunology167(1)：1-5(2001)；Ozaki K et al Cloning of a type I cytokine receptor most related to the IL-2receptor beta chain.Proceedings of the National Academy of Science(USA)97：11439-11444(2000)；Parrish-Novak J et al Interleukin21and its receptor are involved inNK ce1l expansion and regulation of lymphocyte function.Nature408：57-63(2000))。

IL21刺激由CD40抗原交联所刺激的B细胞的增殖。它还抑制IL4和anti-IgM所刺激的增殖。IL21增强CD3所介导的天然T细胞(CD45RA(+))增殖的刺激作用，但不增强记忆性T细胞(CD45RO(+))增殖的刺激作用。在IL5的存在下，IL21刺激骨髓远祖细胞的增殖和NK细胞标志物CD56的表达。

Parrish-Novak等人已经分离了IL21受体，并发现其由CD23(+)B细胞、B细胞系、T细胞白血病系和NK细胞系表达。受体基因定位于人染色体16p12。Ozaki等人也分离了同样的受体，称之为NILR(新型白介素受体)。该受体(538个氨基酸)与人IL2β受体最为相关。受体在细胞外区域中还有1型细胞因子受体所特有的WSXWS基序。该受体在NK细胞、T细胞和B细胞系上表达。

已经表明作为IL2、IL4、IL7、IL9和IL15功能性受体复合体中不可缺少亚基的共有γ亚基还是IL21受体复合物的组分。功能性信号传导复合物活化Janus激酶JAK1、JAK3和STAT蛋白STAT1与STAT3(Asao等人)。

IL22(包括信号序列的180个氨基酸；25kDa，还称作IL-TIF)通过cDNA扣除法鉴定为小鼠T细胞中IL9特异性诱导的基因。该蛋白质与IL10表现出有限的同源性(22个氨基酸相同性)。人和鼠IL-TIF蛋白质具有79％的氨基酸相同性。

鼠和人IL-TIF基因都含6个外显子。人单拷贝基因定位于染色体12q15(来自IFN-γ基因的90Kb，来自编码另一种IL10相关细胞因子的AK155基因的27Kb。在小鼠中，该基因也和IFN-γ基因定位在同一区域。在BALB/c和DBA/2小鼠中，该基因是单拷贝基因。在C57B1/6、FVB和129小鼠中，该基因是加倍的。称作IL-TIF-α和IL-TIF-β的两个拷贝在编码区中表现出98％的核苷酸相同性，差别在于缺失了IL-TIF-β中的658核苷酸。该基因是无活性的。

在胸腺淋巴瘤、T细胞和肥大细胞中，IL9诱导IL-TIF的表达，在新鲜分离的脾细胞中，凝集素诱导IL-TIF的表达。T细胞中IL-TIF的表达不需要蛋白质合成，依赖于Janus激酶和STAT蛋白。IL-TIF在胸腺和脑中组成性表达。

在HepG2人肝瘤细胞中IL-TIF上调急性相蛋白的生成。IL-TIF还在体内充当促炎性细胞因子，因为注射该蛋白质还诱导急性相蛋白的合成。IL-TIF的合成在注射细菌脂多糖后快速诱导。与IL10相比，IL22不抑制对细菌脂多糖应答的单核细胞对促炎性细胞因子的生成。它也不影响IL10对单核细胞的作用。IL-TIF对Th2辅助细胞中IL4的生成具有一定的抑制效应。

IL10和IL-TIF使用共同的受体亚基。抗IL10受体β链的抗体阻断IL-TIF对急性相蛋白的诱导。功能性IL-TIF复合物由两个受体链组成。一条链鉴定为在正常肝脏和肾脏中表达的孤儿受体CRF2-4。另一条链是IL10受体-2，IL10受体复合物的第二条链。只表达CRF2-9的猴COS对IL-TIF应答。在仓鼠细胞中，必须表达2条链，以产生功能性IL-TIF受体。虽然两条受体链都能独立地结合IL-TIF，但IL-TIF与受体复合物的结合更强。受体亚基的这种共享与诸如IL2、IL4、IL7、IL9和IL15的细胞因子的通用γ链的共用类似。不对IL10应答的一些细胞系通过活化STAT-1、STAT-3和STAT-5对IL-TIF作出应答。

还描述了称作IL22BP[IL22结合蛋白]的可溶性分泌受体(231个氨基酸)(Kotenko等人)。该蛋白质与IL22R1链的细胞外结构域表现出34％的氨基酸相同性，还称作CRF2-10。其基因定位于人染色体6q24，和IFN-γR1基因相隔35kb。其在各种组织中表达，最大程度表达在乳腺、肺和结肠中。该蛋白结合IL-TIF并抑制其活性，阻断其与细胞表面IL22受体复合物的相互作用，充当天然的细胞因子拮抗剂。IL22BP还阻断HepG2细胞中IL22对细胞因子信号传导抑制因子-3(SOCS-3)基因表达的诱导((Dumoutier L et al Cloning and characterization of IL-10-related Tce1l-derived inducible factor(IL-TIF)，a novel cytokine structura1ly related to IL-10andinducible by IL-9.Journal of Immunology164(4)：1814-1819(2000)；Dumoutier L et alHuman interleukin-10-related T ce1l-derived inducible factor：molecular cloning andfunctional characterization as an hepatocyte-stimulating factor.Proceedings of the NationalAcademy of Science(USA)97(18)：10144-9(2000)；Dumoutier L et al IL-TIF/IL-22：genomic organization and mapping of the human and mouse genes.Genes Immun1(8)：488-494(2000)；Dumoutier L et al Cloning and characterization of i1-22binding protein，anatural antagonist of i1-10-related t ce1l-derived inducible factor/i1-22.Journal ofImmunology166(12)：7090-5(2001)；Kotenko SV et al Identification，cloning，andcharacterization of a novel soluble receptor that binds IL-22and neutralizes its activity.Journal of Immunology166(12)：7096-7103(2001)；Kotenko SV et al Identification of thefunctional interleukin-22(IL-22)receptor complex：the IL-10R2chain(IL-10Rbeta)is acommon chain of both the IL-10and IL-22(IL-10-related T ce1l-derived inducible factor，IL-TIF)receptor complexes.Journal of Biological Chemistry276(4)：2725-32(2001)；XieMH et al Interleukin(IL)-22，a novel human cytokinethat signals through the interferonreceptor-related proteins CRF2-4and IL-22R.Journal of Biological Chemistry275(40)：31335-9(2000))。

IL23是对由IL12的p40亚基(IL12B)和另一个称作p19的19kDa蛋白质组成的因子的命名。P19结构上与IL6、G-CSF和IL12的p35亚基相关。在数据库中，发现p19还具有亚基缩略词SGRF(IL6G-CSF相关因子)。

P19自身无生物活性，而p19和p40的复合物是有活性的。活性复合物由树突状细胞在细胞活化后分泌。

小鼠记忆性T细胞((CD4(+)CD45Rb(1ow))对IL23应答增殖，但不对IL12应答而增殖。已经表明人IL23刺激PHA母性(blast)T细胞和记忆性T细胞对IFN-γ的生成。其还诱导这两种细胞类型的增殖。

IL23与IL12受体的β-1亚基结合，但不与其β-2亚基结合，活化PHA母性T细胞中一种STAT蛋白，STAT4。

转基因小鼠中p19的表达导致发育不良、系统性炎症、不育和3月龄之前死亡。该动物还表现出促炎性细胞因子TNF-α和IL1的高血清浓度。循环中性白细胞的数目增加。急性相蛋白组成性表达。p19的表达最可能是由于表达p19细胞的骨髓移植时造血细胞导致转基因动物中观察到的相同表型(Oppmann B et al Novel p19proteinengages IL-12p40to form a cytokine，IL-23，with biological activities similar as we1l asdistinct from IL-12.Immunity13(5)：715-25(2000)；Wiekowski MT et al UbiquitousTransgenic Expression of the IL-23Subunit p19Induces Multiorgan Inflammation，Runting，Infertility，and Premature Death.Journal ofImmunology166(12)：7563-70(2001))。

IL24是对还称作ST16[致肿瘤抑制因子-16]和MDA-7[黑素瘤分化相关基因]的蛋白质的命名。IL24的大鼠相应部分已经鉴定为mob-5或C49a。小鼠相应部分是FISP。

在使用培养的、对人IFN-β和mezerezin应答丧失增殖能力而终端分化的人黑素瘤细胞的研究中，人黑素瘤细胞MDA-7蛋白(206个氨基酸)最初鉴定为黑素瘤分化相关cDNA。MDA-7表达的上调是终端分化的结果。经人工改造表达MDA-7的H0-1和C8161人黑素瘤细胞生长减慢，在集落形成分析中不形成集落。MDA-7通过促进凋亡所导致的细胞死亡，选择性地抑制人乳腺癌细胞的生长。借助复制缺陷腺病毒的MDA-7异位表达导致广谱的其他癌的生长抑制和凋亡诱导，所述的癌包括黑素瘤、多型性胶质母细胞瘤、骨肉瘤和乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、肺癌、鼻咽癌和前列腺癌。正常上皮细胞和成纤维细胞中表达MDA-7后未观察到明显的有害效应。

在人造血细胞中，MDA表达在对TPA处理应答的巨核细胞分化过程中得以诱导(12-O-四癸酰基-佛波醇-13-乙酸酯)。

人MDA-7基因定位于染色体1q32，与编码IL10、IL19和IL20的基因紧密相连(在195kb的区域中)。

IL24的受体已经鉴定为IL20受体复合物。该受体还与IL19结合(BlumbergHetal Interleukin20：discovery，receptor identification，and role in epidermal function.Ce1l104(1)：9-19(2001)；Dumoutier L et a1Cutting edge：STAT activation by IL-19，IL-20andmda-7through IL-20receptor complexes of two types.Journal of Immunology167(7)：3545-9(2001)；Huang EY et al Genomic structure，chromosoma1localization andexpression profile of a nove1melanoma differentiation associated(mda-7)gene withcancer specific growth suppressing and apoptosis inducing properties.Oncogene20(48)：7051-63(2001)；Jiang H et a1Subtraction hybridization identifiesanove1melanomadifferentiation associated gene，mda-7，modulated during human melanoma differentiation，growth and progression.Oncogene11：2477-2486(1995)；Jiang H et al The melanomadifferentiation associated gene mda-7suppresses cancer ce11growth.Proceedings of theNational Academy of Science(USA)93：9160-9165(1996)；Su Z et al The cancer growthsuppressor gene mda-7selectively induces apoptosis in human breast cancer ce1ls andinhibits tumor growth in nude mice.Proceedings of the National Academy of Science(USA)95：14400-14405(1998))。

IL25(还称作SF20)已经在寻找刺激细胞增殖的因子时得以鉴定。该因子由骨髓基质细胞分泌。

IL25受体还已经鉴定为小鼠胸腺共有抗原-1(thymic shared antigen-1，TSA)。在不表达该受体的一个因子依赖性细胞系BaF3中受体的增强表达导致细胞增殖。表达该受体的FDCP2细胞还响应SF20/IL25而增殖。在其他情况下，抗该受体的特异性阻断抗体抑制这种增殖。

SF20/IL-25不具有可检测的骨髓组织生成活性，但是支持淋巴系细胞的增殖(Tulin EE et al SF20/IL-25，a Novel Bone Marrow Stroma-Derived Growth Factor ThatBinds to Mouse Thymic Shared Antigen-1and Supports Lymphoid Ce1l Proliferation.Journal ofImmunology167(11)：6338-47(2001))。

TNF配体超家族(TNFα、TNF-β、LTβ、CD27配体、CD30配体、CD40配体、CD95配体、41BB、OX40配体、TRAIL)具有共同的生物活性，但是一些特征是一些配体共有的，而其他一些特征是独特的。人TNF-α是17kDa的长度为157个氨基酸的非糖基化蛋白。鼠TNF-α是N-糖基化的。和TNF-β的同源性约为30％。TNF-α形成二聚体和三聚体。17kDa形式的因子通过对233个氨基酸的前体蛋白加工而生成。已表明TNF-α转化酶介导这种转化。还描述了26kDa的跨膜形式。

TNF-α含有一个二硫键，破坏该二硫键不影响该因子的生物活性。Ala84向Va1和Va191向Ala的突变几乎完全降低该因子的细胞毒性。这些位点参与受体结合。7个N端氨基酸的缺失和Pro8Ser9Asp10被ArgLysArg的置换产生一种突变因子，如L-M细胞分析所显示的，其具有约10倍的更高抗肿瘤活性和更强的受体结合，而同时降低了毒性。

基因长度约为3.6kb，含有四个外显子。原始转录产物长度为2762个核苷酸，编码233个氨基酸的前体蛋白。氨基端78个氨基酸充当前导序列。人基因定位于染色体6p23-6q12。其位于HLA-B的I型HLA区和编码补体因子C的基因之间。编码TNF-β的基因位于TNF-α基因下游约1.2kb。但是，这两个基因是独立调控的。两个基因在鼠染色体17上也彼此靠近。

约500-10000个高亲和力的TNF-α受体(Ka＝2.5×10^-9M)表达在除红细胞之外的所有体细胞类型上。已经描述了55kDa(TNF-R1；新的命名：CD120a)(如Genbank注册No.X55313编码的多肽)和75kDa(TNF-R2；新的命名：CD120b)(如GoodwinRG et a1(1991)Molecular Ce1lular Biology11：3020-6中所述)的两种受体。一种受体是455个氨基酸的糖基化蛋白质，含有171个氨基酸的细胞外结构域和221个氨基酸的胞质结构域。细胞外部分中富含半胱氨酸结构域的序列同源性表明受体与NGF的低亲和力受体和人细胞表面抗原相关。

55kDa受体TNF-R1中C末端细胞外结构域的缺失分析表明了所谓死亡结构域的存在，其参与导致程序性细胞死亡的信号传导过程。TNF-R1的死亡结构域与包括TRADD和RIP的其他各种信号传导接头分子相互作用。

两种已知的受体结合TNF-α和TNF-β。p55具体在易受TNF细胞毒作用的细胞上表达。p75也存在于许多细胞类型上，尤其是骨髓来源的细胞类型上(病毒编码的受体亚基同源物是EBV诱导的基因6)。其高表达在受刺激的T细胞和B淋巴细胞上。TNF对各种细胞类型的不同活性，即生长促进和生长抑制活性，可能由多种受体的差异表达和/或调控与其他不同的受体相关蛋白的组合所介导。p55似乎在宿主防御微生物和其病原性因子中起作用。

第三类受体亚型表达在人肝脏中。其与TNF-α结合，但不与TNF-β结合。一些病毒含有编码具有TNF结合活性的分泌蛋白的基因，所述的分泌蛋白与p55和p75受体高度同源。在TNF介导的白细胞与内皮细胞的粘附中也发现了两种受体亚型的不同效应。似乎是p55的特异性参与导致诱导细胞粘附分子ICAM-1、E-选择素、V-CAM-1和CD44，而p55和p75受体的参与诱导α-2整合素的表达。

还已经发现了截短的可溶形式。可溶形式，尤其是p60受体的可溶性细胞外结构域阻断TNF的抗增殖效应，从而调节TNF的有害效应。

IL1和致肿瘤因素如佛波酯减小受体密度。IFN-α、IFN-β和IFN-γ诱导TNF-α受体密度的表达。

与TNF受体超家族成员的胞质结构域相关的信号传导因子包括TRAF(肿瘤坏死因子受体相关因子)。

人TNF-α在鼠细胞上具有活性，但特异活性稍有降低。通常，TNF-α和TNF-β在体外系统中表现出类似的生物活性谱，虽然1NF-β经常效力较低，或表现出明显的部分拮抗活性。

TNF-α表现出宽的生物活性谱。其在体外导致许多肿瘤细胞系的细胞裂解和细胞生长抑制。敏感的细胞暴露于皮摩尔浓度的该因子后数小时内死亡，这至少部分涉及到充当TNF细胞毒性通用介质的线粒体来源的第二信使分子和基因调控信号传导通路。该因子诱导移植肿瘤的出血性坏死。注射TNF-α之后数小时内导致对恶性肿瘤中小血管的破坏。该因子还增强中性粒细胞的吞噬作用和细胞毒性，还调节包括fos、myc、IL1和IL6的许多其他蛋白的表达。

26kDa形式的TNF主要发现在活化的单核细胞和T细胞上。其也具有生物活性，通过直接的细胞-细胞接触介导细胞破坏。

TNF-α增强fMLP(甲酸基-Met-Leu-Phe)对中性白细胞的趋化性质。TNF-α以细胞类型特异性和组织特异性的方式诱导多种趋化性细胞因子的合成，这些细胞因子包括IP-10、JE、KC。

TNF-α是正常人二倍体成纤维细胞的生长因子。它促进成纤维细胞中胶原酶和前列腺素E2的合成。它还在体内充当人慢性淋巴细胞白血病细胞的自分泌生长调节因子，已将其描述为神经母细胞瘤细胞的自分泌生长调节因子。IL4抑制这种自分泌生长促进活性。

在静息的巨噬细胞中，TNF诱导IL1和前列腺素E2的合成。它还刺激巨噬细胞的吞噬作用的超氧化物歧化酶的合成。TNF活化破骨细胞，诱导骨的再吸收。

在白细胞和淋巴细胞远祖细胞中，TNF刺激I型和II型HLA和分化抗原的表达、IL1、集落刺激因子、IFN-γ和花生四烯酸代谢物的生成。它还刺激内皮细胞和滑膜细胞中胶原酶的生物合成。

IL6抑制细菌内毒素和TNF诱导的IL1的合成，和内毒素诱导的TNF的合成。

神经递质SP(P物质)诱导巨噬细胞中TNF和IL1的合成。和IL6一样，IL1刺激垂体中ACTH(促肾上腺皮质激素)的合成。在体内对ACTH应答合成的糖皮质激素抑制IL6、IL1和TNF的合成，从而建立免疫系统和神经内分泌功能之间的负反馈环。

不存在IL2的条件下，TNF-α增强各种刺激剂诱导的T细胞的增殖。一些T细胞亚群只在TNF-α的存在下对IL2作出应答。在IL2的存在下，TNF-α促进B细胞的增殖和分化。

皮肤朗氏细胞的功能性也受TNF-α的影响。这些细胞不能启动初级免疫应答，如接触过敏。它们能被GM-CSF，也能被IL1转化成免疫刺激性树突状细胞。因此，这些细胞是免疫学上不成熟的淋巴样树突状细胞的储备库(reservoir)。TNF-α显著降低成熟朗氏细胞加工抗原能力的提高。

虽然TNF-α也是正常免疫应答所需要的，但其超表达具有严重的致病效果。TNF-α是肿瘤患者中发现的主要恶病质介质(因此命名为恶液汁素)。TNF还在革兰氏阴性脓毒病过程中产生某些严重效应。

TNF-α可以涉及在对其应答的细胞系(如BT-20，CT6，EL4；PK15；L929；L-M；MO7E；T1165；WEHI-3B)的生物分析中得以检测。还可以通过灵敏的三明治酶联免疫分析、ELISA、放免比色分析(IRMA)和称作RELAY的分析(受体介导的标记物转移分析)来检测TNF-α。通过两色免疫荧光流式细胞术检测细胞内因子。Higuchi等已经描述了基于TNF-α或TNF-β处理后经历凋亡的细胞释放含氚胸苷的分析。IFN-α、IFN-β、IFN-γ、TGF-β、IL4、LIF和GM-CSF都表明不干扰该分析。

与化疗药物相比，TNF特异性地攻击恶性肿瘤细胞。广泛的临床研究已经显示出TNF-α对皮下人异种移植物和裸鼠中淋巴结转移的直接细胞生长抑制效应和细胞毒效应，以及对包括中性白细胞、巨噬细胞和T细胞的各种免疫效应细胞的免疫调节作用。单剂量和多剂量I期临床研究已经证实：TNF可以以与抗癌效应相关、而不伴随严重毒性如休克和恶病质的剂量安全施用到晚期恶性肿瘤患者中。但是，不幸的是，临床试验总体上目前还未表现出癌症治疗方面的显著改善，TNF诱导的系统毒性是多数情况下将TNF用作抗肿瘤药物的主要限制点。TNF和细胞毒性或免疫调节性药物，具体IFN-γ，可能IL2的联合使用在治疗某些肿瘤中可能是有利的。在某些情况下，TNF的肿瘤内应用发现在肿瘤控制中是有利的。

最近描述了对p55受体具有选择性的一些突变形式的TNF-β。已经表明p55受体的活化足以能引发对转化细胞的细胞毒性。还表明这些突变体中的一些在携带有移植人肿瘤的裸鼠中具有抗肿瘤活性。

TNF还用于增加淋巴因子活化的杀伤细胞的攻击性。使用实验性纤维肉瘤转移模型的研究表明TNF诱导肺中转移性病灶的数目显著增加。还表明低剂量的内源性TNF或细胞因子治疗过程中施用TNF可以增加循环肿瘤细胞的转移潜力。用功能性TNF-α基因转导鼠肿瘤细胞导致同系宿主对遗传修饰细胞的排斥。

干扰素是在靶细胞中诱导病毒非特异性抗病毒状态的细胞因子家族。干扰素与其受体的结合诱导新的蛋白质合成，而新的蛋白质合成又使起始因子eIF-2失活。这种失活有利于干扰素的抗病毒状态。干扰素还诱导使降解病毒mRNA的细胞内核酸内切酶活化的通路。许多干扰素还具有免疫调节活性，如活化巨噬细胞和淋巴细胞。干扰素的离子包括IFN-1(如Genbank注册No.K01900、J00209、M12350、J00213、J00216、J00214、ML1003、ML1026、M34913、M54886、X01974、L38698、M13710、K01238、M13660、M68944、X01972、X01971、X01973、X01969编码的多肽)、IFN-γ(如Genbank注册No.M28622、X14029、X14455、K00020、J00218、E00171、X04430、A09363、M27327、M16656、M25460、K03196编码的多肽)、IFN-γ(如Genbank注册No.A34532、X87308、E00756、K00083编码的多肽)、IFN-γ(如Genbank注册No.X58822、A12140编码的多肽)、牛滋养层蛋白-1(IFN-γ)(如Genbank注册No.M31556、M31557、M31558编码的多肽)和其在种间的同源物。人IFN-1和IFN-γ都能与不同于IFN-γ受体(如Genbank注册No.J03143、M28233编码的多肽)的通用受体(如Genbank注册No.X60459、M89641编码的多肽)结合。

已知有至少23种不同的IFN-α变体。各蛋白质分子量为19-26kDa，由长度为156-166和172个氨基酸的蛋白质组成。所有的IFN-α亚型在氨基酸位点115-151之间都具有共有的保守序列区，而氨基端是可变的。许多IFN-α亚型的序列只有一个或两个位点的差异。天然存在的变体还包括在羧基端截短10个氨基酸的蛋白质。在位点1/98和29/138的半胱氨酸之间形成二硫键。二硫键29/138对于生物活性是必需的，而1/98键可以去除，不影响生物活性。

人IFN-β是20kDa的糖蛋白(约20％的糖部分)，长度为166个氨基酸。糖基化不是体外生物活性所必需的。该蛋白质含有生物活性所需的二硫键Cys31/141。在DNA水平上，IFN-β与IFN-β-2表现出34％的序列同源性，和其他IFN-α亚型表现出约30％的同源性。与IFN-γ相比，IFN-β在pH2的条件下是稳定的。

人IFN-γ是146个氨基酸的亚基组成的二聚化蛋白。该蛋白质在两个位点上糖基化。pI是8.3-8.5。IFN-γ合成为166个氨基酸的前体蛋白，包括23个氨基酸的分泌信号序列。已经描述了20kDa和25kDa的两种分子形式的生物活性蛋白。二者都在25位糖基化。25kDa形式还在97位糖基化。观察到的天然IFN-γ分子量和电荷上的不同缘自不同的糖基化模式。在非变性条件下观察到的40-60kDa形式是IFN-γ的二聚体和四聚体。

CSF细胞因子家族的成员能够使固定在软琼脂或甲基纤维素上的骨髓细胞生长和分化。造血远祖细胞只能在不存在这类因子的条件下培养较短的时间。其存在使得形成含红细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞、巨噬细胞和/或巨核细胞的集落，取决于具体的因子。对刺激形成支持这些细胞类型生长和形成的集落的各种活性进行生化分析，表明存在有不相同和不同的这类因子。

许多因子都是N-糖基化或O-糖基化的。糖基化表明能增加溶解性、稳定性和对蛋白水解酶的耐受性。但似乎并不是这些因子的完全生物活性谱所需的。已经克隆并定位了编码多种人集落刺激因子的基因。一些基因是彼此靠近的，但除了某些保守区域之外，彼此并不表现出高度同源性。

集落刺激因子由许多不同的细胞类型生成，例如，这些细胞类型包括B淋巴细胞、上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、基质细胞系、T淋巴细胞。它们合成为前体分子，该前体分子含约25-32个氨基酸组成的经典疏水性分泌信号序列。分泌的因子具有极高的特异生物活性，在非常低的浓度(1-100pM)具有活性。这些因子绝对是造血远祖细胞增殖所必需的。只是维持存活的浓度通常比诱导细胞增殖或刺激细胞的特定功能活性所需的浓度低几个数量级。

各因子的命名通常表明对这些因子应答的细胞类型。经典的集落刺激因子包括M-CSF(如Genbank注册No.E03235、M64592、U22386、X05010编码的多肽)(巨噬细胞特异的)、G-CSF(粒细胞特异的)、GM-CSF(巨噬细胞/粒细胞特异的)、113(多功能的)和MEG-CSF(如Genbank注册No.D86370、U70136编码的多肽)(巨核细胞特异的)。G-CSF和M-CSF是谱系特异性的，而GM-CSF和IL3是多功能的造血生长因子，作用于造血远祖细胞的分化早期。

人GM-CSF是由127个氨基酸组成的、具有两个糖基化位点的单体蛋白。该蛋白质合成为144个氨基酸的前体，其在氨基末端包括疏水的分泌信号序列。糖部分不是完全的生物活性谱所需的。非糖基化和糖基化的GM-CSF在体外表现出相同的活性。完全糖基化的GM-CSF在体内比非糖基化的蛋白质具有更高的生物活性。文献中描述的不同分子量形式的GM-CSF是不同程度的糖基化结果。GM-CSF含有四个半胱氨酸残基(位点54/96和88/121)。

GM-CSF的蛋白质序列和其他集落刺激因子的比较表明彼此之间没有高度的同源性。人GM-CSF和鼠GM-CSF在蛋白质水平上表现出60％的同源性，在核苷酸水平上表现出70％的同源性。但是，两种分子不发生免疫交叉反应。GM-CSF作为与硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的复合物与细胞的细胞外基质相关联。这能够将该因子以无生物活性的形式储存。该因子最终从这种储存库释放的确切机制尚不清楚。

人基因的长度为2.5kb，含有4个外显子。GM-CSF基因和IL3基因之间的距离约为9kb。人GM-CSF基因定位于染色体5q22-31，靠近编码造血生长因子(M-CSF、IL3、IL4、IL5)的基因和编码M-CSF受体的基因。GM-CSF基因的5’区含有多个称作CLE(保守的淋巴因子元件)的序列元件。作为转录因子的结合位点调节GM-CSF基因的表达。

GM-CSF受体以几百至几千拷贝/细胞的密度表达在骨髓细胞的细胞表面上。受体还在诸如内皮细胞和小细胞肺癌细胞的非造血细胞上表达。在受体阳性细胞谱系中，受体密度随成熟程度的增加而降低。

受体与包括IL2-β、IL3、IL6、IL7、Epo的其他造血生长因子受体和催乳素受体表现出明显的同源性。克隆的GM-CSF受体的一个亚基(GM-Rα，45kDa)以低亲和力与GM-CSF结合(如Genbank注册No.SEG_HUMGRAS编码的多肽)。第二个亚基(GM-Rβ，120kDa)不与GM-CSF结合。GM-Rα是400个氨基素的蛋白质，只含有54个氨基酸的短胞质结构域。两个受体亚基的聚合形成高亲和力的GM-CSF受体。受体的GM-Rβ亚基(如Genbank注册No.SEG_MUSAIC2B编码的多肽)也是其他细胞因子受体系统的组成部分。它是IL3和IL5的高亲和受体的组成部分，二者还含有细胞特异性亚基(AIC2A)。

人GM-CSF在鼠细胞上没有活性，反之亦然。GM-CSF最初作为在软琼脂培养物(集落形成分析)中刺激含巨噬细胞/粒细胞的集落生长的因子得以分离。GM-CSF是粒细胞和巨噬细胞远祖细胞的生长和发育所不可缺少的。它刺激成髓细胞和成单核细胞，引发这些细胞的不可逆转的分化。GM-CSF和Epo协同促进红细胞和巨核细胞远祖细胞的增殖。和另一种集落刺激因子M-CSF联用，可以观察到协同抑制现象，即两种因子的联合使用导致对含巨噬细胞的细胞集落生成的部分抑制。

对于来源于急性髓样白细胞的某些类型母细胞来说，GM-CSF充当生长的自分泌介质。GM-CSF是中性白细胞的强趋化因子。它增强中性白细胞和巨噬细胞的微生物杀伤活性、氧化代谢和细胞吞噬活性。它还提高这些细胞的细胞毒性。GM-CSF比例如G-CSF表现出较弱的特异性。它刺激中性白细胞、嗜曙红细胞和单核细胞谱系的增殖和分化。它还功能性地活化相应的成熟类型，例如增加某些细胞表面粘附蛋白(CD-11A、CD-11C)的表达。这些蛋白质的超表达可以是对炎症部位发现的粒细胞局部积累的一种解释。此外，GM-CSF还增加中性白细胞活性之刺激因子fMLP(甲酸基-Met-Leu-Phe)的受体的表达。

皮摩尔至纳摩尔浓度的GM-CSF对嗜曙红细胞具有趋化性，还影响这些细胞对其他趋化因子的趋化行为。

在粒细胞中，GM-CSF刺激花生四烯酸代谢物的释放，增加活性氧物质的生成。Na+/H+反向转运系统的活化导致胞液的快速碱化。中性粒细胞的吞噬活性和嗜曙红细胞的细胞毒性也为GM-CSF所显著增加。由于GM-CSF由炎症反应部位的细胞(T淋巴细胞、组织巨噬细胞、内皮细胞、肥大细胞)产生，可以认为它是炎症反应中的重要介质。

皮肤朗氏细胞的功能状态也受GM-CSF的影响。这些细胞不能启动初级免疫应答，例如接触过敏。它们可以由GM-CSF(还有IL1)转化成高效力的免疫刺激性树突状细胞。因此朗氏细胞形成免疫学上未成熟淋巴样树突状细胞的原位库。表现为加工抗原能力增加的这些细胞的成熟受TNF-α的下调。

纳摩尔浓度的GM-CSF诱导嗜碱细胞上补体C3a受体的表达。正常情况下不对C3a作出应答、已经由GM-CSF活化的细胞对C3a刺激剂应答而脱颗粒。这伴随有组胺和白三烯C4的释放。该过程在与炎症反应(T淋巴细胞、组织巨噬细胞、内皮细胞、肥大细胞)相关的过敏性反应中是重要的。GM-CSF还表明是滋养层干扰素(TP-1)的有效诱导剂。

GM-CSF和包括IL1、IL3与G-CSF的其他一些细胞因子协同作用。在体外，GM-CSF和G-CSF必须协调作用，以形成含中性白细胞的集落。

IL3自身只少量地扩增循环血细胞的数目；然而，随后加入一定剂量的G-CSF显著增加细胞数目，这可能是因为IL3首先导致能够对GM-CSF应答的细胞扩增。

多数IL3依赖性细胞系也能在GM-CSF和IL4的存在下生长的现象，以及观察到的GM-CSF和IL4之间的几种协同效应说明这三个因子在控制细胞生长中发挥类似的功能。有一些迹象表明信号传导的机制含有至少一些通用因子。

癌基因编码的酪氨酸特异性蛋白激酶的实验表明所述因子依赖性细胞中这种激酶的表达消除其对GM-CSF、IL3和IL4的依赖性。这些因子调节细胞增殖和分化的确切机制尚不清楚。

在带有组成性表达的GM-CSF基因的转基因小鼠中，已经研究了GM-CSF表达失调的结果。编码GM-CSF的转基因的超表达导致视网膜的病理变化，导致失明，还导致肌肉萎缩。这些小鼠的特征在于活化的巨噬细胞有非常明显的增加。此外，GM-CSF的超表达导致分泌大量IL1和TNF的成熟巨噬细胞的活化，说明这些细胞因子负责转基因小鼠疾病的某些方面。

组织病理学检查表明单核细胞谱系的远祖细胞群体明显增加。GM-CSF转基因小鼠通常在数月内因这些因子超表达所致的大范围组织损伤而死亡。使用具有超表达GM-CSF的骨髓的小鼠也获得了类似的结果，所述的高表达通过用适当的逆转录病毒载体转化进行操作来实现。但是，这些发现似乎并不具有临床意义。用GM-CSF长期处理灵长类动物和小鼠表明不发生危及生命的并发症。

已经在产生自携带靶向缺失基因的ES细胞的小鼠中研究了破坏GM-CSF基因的生物学后果。GM-CSF基因靶向缺失纯合的小鼠特征是具有不受影响的稳态造血作用，说明GM-CSF不是维持血液、骨髓和脾脏中成熟造血细胞主要类型和其前体的正常水平所必需的。

多数GM-CSF缺陷小鼠表面上都是健康且可育的，但是发育成不正常的肺。GM-CSF缺陷小鼠在肺泡中形成表面活性剂脂质和蛋白质的逐渐积累，是先天性人疾病肺泡蛋白沉积症的定义性特征。还发现了与肺导气管和血管相关的广泛(entensive)淋巴样增生。这些结果表现出GM-CSF在肺动态平衡中的出人意料的重要作用。

对编码GM-CSF、IL3和IL5受体复合物的通用β亚基(βC)的基因无效突变纯合的转基因小鼠表现出正常的发育，存活至成鼠(young adult life)。它们发生肺表面支气管血管(peribronchovascular)淋巴样侵润，面积类似肺泡蛋白沉积症。纯合缺失突变体的外周血和骨髓中嗜曙红细胞数目减少，而其他血相参数正常。纯合缺失突变体的骨髓细胞不表现出与GM-CSF的高亲和力结合，而杂合动物的细胞显示中等数目的高亲和受体。在来自纯合缺失突变体的骨髓细胞克隆培养物中，即使高浓度的GM-CSF和IL5也不能在集落形成分析中刺激集落形成。未观察到突变型和野生型同窝动物之间GM-CSF的系统清除和分布差异。

Nishinakamura等人已经将β-c小鼠与IL3缺陷小鼠杂交。双突变的小鼠缺失IL3、GM-CSF和IL5，并且明显是正常可育的。和β-c突变型小鼠一样，该动物表现出嗜曙红细胞相同数目的减少，缺失对寄生虫的嗜曙红性应答。双突变小鼠对李斯特菌(Listeria monocytogenes)的免疫应答是正常的。这些发现说明存在有不依赖于IL3、GM-CSF和IL5的存在而生成血细胞的其他机制。

可以在集落形成分析中通过形成含巨噬细胞、中性白细胞、嗜曙红细胞和巨核细胞的集落对GM-CSF进行分析。还可以使用生长依赖于GM-CSF或对该因子应答的细胞系进行特异性生物分析来检测GM-CSF(如AML-193；B6SUt-A；BAC1.2F5；BCL1；Da；FDCP1；GF-D8；GM/SO；IC-2；MO7E；NFS-60；PT-18；TALL-103；TF-1；UT-7)。

GM-CSF可以用于血细胞异常成熟或白细胞生成减少为特征的所有疾病中造血作用的生理性重构。主要且最重要的GM-CSF临床应用可能是治疗化疗和/或放疗后危及生命的嗜中性白血球减少症，其在GM-CSF的治疗下明显减轻。GM-CSF还可用于矫正化疗诱导的血球减少症，对抗血球减少症相关的感染和出血倾向。

为了避免施用GM-CSF后的潜在并发症，需要在特定的患者群体中进行细心的临床监测，如患有骨髓发育异常(Myelodysplastic)综合征、急性髓样白血病、炎症、自身免疫性血小板减少症或畸形免疫应答的患者群体。

多项研究表明：使用GM-CSF增加对细胞毒性药物治疗的耐受性，可用于防止由于细胞毒性药物治疗的副作用所必须采取的剂量降低。GM-CSF治疗经常可以增加每个疗程中毒性药物的剂量。这些研究还表明GM-CSF治疗下死亡率明显下降。

用功能性GM-CSF基因转导鼠肿瘤细胞导致同系宿主对遗传修饰细胞的排斥。此外，接种转导了GM-CSF的肿瘤细胞抑制随后接种的野生型同系肿瘤细胞的生长。

细胞因子的趋化因子家族由较小的、结构上类似的、诱导白细胞趋化的多肽组成。趋化因子分子量为8-10kDa，在蛋白质水平上彼此表现出约20-50％的同源性。这些蛋白质具有通用的基因结构和三级结构。所有的趋化因子都具有参与分子内二硫键形成的多个保守半胱氨酸残基。

根据各基因的染色体定位，鉴定到了两个不同的亚家族。α-趋化因子的成员还称作4q趋化因子家族，因为编码该家族成员的基因定位于人染色体4q12-21。该家族成员的前两个半胱氨酸残基由一个氨基酸隔开，因此这些蛋白质还称作C-X-C趋化因子。该亚家族包括9E3(如Genebank蛋白P08317)、AMCF(如Genbank注册No.M99367、M99368编码的多肽)、β-血小板球蛋白(如Begg GS et a1(1978)，Biochemistry17：1739-44中公开的多肽)、CINC家族成员(如Genbank注册No.D21095编码的多肽)，ENA-78(如Genbank注册No.X78686编码的多肽)、eotaxin(如Genbank注册No.U46572、U40672编码的多肽)，GCP-2(如Genbank注册No.Y08770、U83303编码的多肽)、IL8、IP-10(如Genbank注册No.L07417、X02530编码的多肽)、KC(如Genbank注册No.J04596编码的多肽)、LIX(如Genbank注册No.U27267编码的多肽)，mig(如Genbank注册No.M34815、Z24725编码的多肽)、MGSA(如Genbank注册No.X12510编码的多肽)、mob-1(如Genbank注册No.U17035编码的多肽)、NAP-2(如CLARK-LEWIS I et a1(1991)Biochemistry30：3128-35，Cohen AB et a1(1992)American Journal of Physiology263：L249-56中所述)、NAP-3(如SCHR

Figure S03824201X20070530D00090155134QIETU

DER JM et al(1991)Journal ofExperimental Medicine171：1091-100中所述)、NAP-4(如SCHR

Figure S03824201X20070530D00090155145QIETU

DERJM et a1(1990)Biochemical and Biophysical Research Communications172：898-904中所述)、PBSF(SDF)(如Genbank注册No.D21072、U16752、D50645编码的多肽)和PF4(如Genbank注册No.M25897编码的多肽).

IL8、MGSA、小鼠KC、MIP-2(如Genbank注册No.X65647编码的多肽和BlumS et a1Three human homologues of a murine gene encoding an inhibitor of stem ce1lproliferation.DNA CellBio1.9：589-602(1990)；Clements JM et al Biological andstructural properties of MIP-1alpha expressed in yeast.Cytokine4：76-82(1992)；Devatelis G et al Cloning and characterization of a cDNAfor murine macrophageinflammatoryprotein(MIP)，a nove1monokine wit1inflammatory and chemokineticproperties.Journal of Experime11tal Medicine167：1939-44(1988)(erratum in JEM170：2189(1989))；Farber JM A macrophage mRNA selectively induced by gamma-interferonencodes a member of the plateletfactor4family of cytokines.Proceedings of t1e NationalAcademy of Science(USA)87：5238-42(1990)；Haski1l S et al Identification of threerelated human GRO genes encoding cytokine functions.Proceedings of the NationalAcademy of Science(USA)87：7732-6(1990)；Poltorak AN et a1(1995)Jou1nal ofInflammation45(3)：207-19；Rossi DL et a1(1997)Journal of Immu1o1ogy158(3)：1033-1036；Sherry B et a1(1988)Jou1nal of Experimental Medicine168：2251-9；Tekamp-O1son P et a1(1990)Journal of Experimental Medicine172：911-9；Wolpe SD eta1(1989)Proceedings of t11e National Academy of Science(USA)86：612-16；Wolpe SDet a1(1989)FASEB Journa13：2565-73所述)、NAP-2、ENA-78和GCP-2包括人C-X-C趋化因子亚组，其由氨基末端附近第一个半胱氨酸残基之前的保守ELR序列基序(谷氨酸-亮氨酸-精氨酸)所限定。具有ELR序列基序的趋化因子已经发现吸引并活化原代中性白细胞。不具有ELR序列基序的趋化因子吸引并活化单核细胞、树突状细胞、T细胞、NK细胞、B淋巴细胞、嗜碱细胞和嗜曙红细胞。

β-趋化因子或17q趋化因子家族成员定位于人染色体17q11-32(鼠染色体11)。前两个半胱氨酸残基是相邻的，因此这些蛋白质还称作C-C趋化因子。该亚家族包括ACT-2(如Genbank注册No.J04130编码的多肽)、C10(如Berger MS et a1(1993)DNA Ce1l Bio1.12：839-47；Berger MS et a1(1996)8：439-447中所述)、CCF18(如Hara Tet a1(1995)Journal of Immunology155：5352-8中所述)、DC-CK1(如Adema GJ et a1(1997)Nature387：713-717中所述)、ELC(如Genbank注册No.AB000887、AF059208编码的多肽)、Eotaxin-2(如Forssmann U et a1(1997)Journal of Experimental Medicine185：2171-2176中所述)、Exodus(如Genbank注册No.U64197、U88320、U88321、U88322编码的多肽)、FIC(如Genbank注册No.L04694编码的多肽)、GDCF和GDCF-2(如Kuratsu J et a1(1989)Journal of the National Cancer Institute81：347-51；Yoshimura T et a1(1989)Journal ofExperimental Medicine169：1449-59；Yoshimura T eta1(1989)Journal of1mmunology142：1956-62中所述)、HC-21(如Chang HC & ReinherzEL(1989)European Journal ofImmunology19：1045-1051中所述)、HCC-1(如Genbank注册No.Z49270编码的多肽)、1-309(如Genbank注册No.M57502编码的多肽)，JE(如Genbank注册No.AF058786、M28226编码的多肽)、LAG-1(淋巴细胞活化基因-1)(如Genbank注册No.X53683编码的多肽)、LARC D86955)、LD78E03130、E03131、MARC(如Thirion S et a1(1994)Biochemical and Biophysical Research Communications201：493-499中所述)、MCAF M24545，并如Ape1la E et a1(1990)Progress in Clinicaland Biological Research349：405-17中所述)、MCP-1(如Genbank注册No.X14768编码的多肽)、MCP-2(如Genbank注册No.Y16645编码的多肽)，MCP-3(如Genbank注册No.X72308、S71251编码的多肽)、MCP-4(如Genbank注册No.X98306编码的多肽)、MCP-5(如Genbank注册No.U50712编码的多肽)、MIP(巨噬细胞炎性蛋白质)(如Genbank注册No.U77180、U77035、U49513、M35590编码的多肽)、MRP-2(如Youn BS et a1(1995)Journal of Immunology155：2661-7中所述)、RANTES SDF(如Genbank注册No.M21121、M77747编码的多肽)、TARC(如Genbank蛋白注册No.Q92583编码的多肽)。

此外，还有多种与趋化因子相关、还未归为两个趋化因子组中的其中一组或不具有两个趋化因子组中任一组典型特征的其他因子(例如ATAC(如Genbank注册No.X86474编码的多肽)、Ltn(如Genbank注册No.U15607、U23772编码的多肽)、SCM-1(如Genbank注册No.D63789、D63790、D43769编码的多肽)。这些称作C型趋化因子或γ-趋化因子。

还鉴定到了包括neurotactin的另一组趋化因子(如Genbank注册No.AF010586编码的多肽，其特征在于具有CX(3)C半胱氨酸特征基序。在结构和功能基础上明确限定的趋化因子亚组的存在说明了白细胞在体内移动调节的多样性。

趋化因子的生物活性由特异性受体介导，还由具有重叠配体特异性的受体介导，该受体结合属于C-C-趋化因子或C-X-C-趋化因子类的多种蛋白质。趋化因子受体属于G蛋白偶联的七跨膜结构域受体大类，其具有跨膜的七个疏水性α-螺旋片段。在通过异源三聚体G蛋白介导信号传导的G蛋白偶联受体亚家族中，这些受体形成结构上相关的一类。

与C-X-C趋化因子结合的受体用CXCR加上一个数字命名(如CXCR-1(例如Genbank注册No.L19591编码的多肽)、CXCR-2(如Genbank注册No.M94582编码的多肽)、CXCR-3(如Genbank注册No.X95876编码的多肽)、CXCR-4(如Genbank注册No.D87747、AF025375编码的多肽)；而结合C-C趋化因子的其他受体用CCR加上一个数字命名(例如CCR-1(如Genbank注册No.L09230、U29678编码的多肽)、CCR-2(如Genbank注册No.U29677，U95626编码的多肽)、CCR-3(如Genbank注册No.U51241编码的多肽)、CCR-4(如Genbank注册No.X90862、X85740编码的多肽)、CCR-5(如Genbank注册No.U54994、U83327编码的多肽)、CCR-6(如Genbank注册No.U95626编码的多肽)、CCR-7(如Genbank注册No.L31581编码的多肽)、CCR-8(如Genbank注册No.Z98206、U45983编码的多肽)。病毒趋化因子受体同源物包括ECRF-3、EBI-1(EBV-诱导的GENE-1)和US28。

目前认为多种趋化因子和其他介质的组合效应是造成炎症部位细胞组成的原因。此外，许多趋化因子也直接活化细胞。其中一些活化粒细胞和/或单核细胞，导致呼吸爆发、脱颗粒和释放溶酶体酶。而其他一些表明是噬碱细胞的强组胺释放因子。提出红细胞通过其混杂的趋化因子受体在趋化因子网络调节中发挥重要作用。与红细胞受体结合的趋化因子已知不能靠近其正常靶细胞。这似乎提供了过剩趋化因子的接收器，限制这些介质的全身效应，而不破坏炎症部位发生的局部过程。

某些C-C趋化因子表现出趋化作用之外的生物活性。一些趋化因子表明能够诱导称作CHAK(C-C趋化因子活化的杀伤细胞)的杀伤细胞的增殖和活化，与IL2活化的细胞类似。

根据根据本发明另一种特别有用的细胞因子是flt-3配体(如注册Nos.U04806、U04807、U03858、L23636、U29874、U29875、U44024编码的多肽)。该细胞因子结合于flt-3酪氨酸激酶(如Genbank注册Nos.Z26652、X59398编码的多肽)。人flt-3还刺激表达鼠flt-3受体的细胞增殖。

flt-3配体的效应由G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL3、PIXY-321和SCF的共表达而协同增强。和SCF与IL3联用，flt-3配体可以扩增具有标记谱CD34(+)CD38(-)的细胞。单独的flt-3配体支持诸如CFU-GM、CFU-GEMM和非常原始的有高度增殖潜力的成集落细胞的成血细胞谱系中前体细胞类型的存活。flt-3配体对红细胞和巨核细胞远祖细胞仅具有边缘效应。

在小鼠中，flt-3配体与G-CSF、GM-CSF、M-CSF、IL3、IL6、IL7、IL11、IL12和SCF协同作用，有效地增强各种类型远祖细胞/前体细胞的生长。flt-3配体支持LTC-IC(长期培养起始细胞)的生长。flt-3配体促进造血远祖细胞存活的能力为TGF-β所取消，为TNF-α所抵消。

AML(急性髓样白血病)和ALL(急性成淋巴白血病)中功能性flt-3受体的表达和对配体应答的研究表现出相当大的不均一性。BCP-ALL尤其不能在flt-3配体的存在下增殖，虽然高表达表面flt-3受体。

已经表明，在再生障碍性贫血患者和伴随有化疗诱导的造血瞬时抑制的癌症患者中，flt-3配体的血清水平与骨髓抑制的程度呈负相关波动。血清中flt-3配体水平与再生障碍性贫血患者的骨髓前体体外形成集落的能力呈反向相关。对用同系成纤维肉瘤细胞激发的小鼠进行flt-3配体治疗导致完全的肿瘤消退和肿瘤生长速度下降。

抗肿瘤细胞因子在本发明的方法和组合物中尤其有用。根据本发明，“抗肿瘤细胞因子”是和细胞混合或施用于动物时，能够在体外或体内限制肿瘤细胞的生长或转移或延长带瘤动物存活的细胞因子。细胞因子可以配制成溶于生物相容性缓冲液如PBS中的溶液，或和体外肿瘤细胞混合。细胞因子的浓度可以从约皮摩尔范围到约微摩尔范围。例如，与单独的缓冲液相比，抗肿瘤细胞因子降低细胞生长速率的至少10％，或抑制细胞的转移性，如表现为细胞粘附性增加，侵入细胞外基质物质如人造基底膜的能力下降。或者，抗肿瘤细胞因子可以在体内抑制肿瘤的生长或转移，或延长带瘤动物的存活。为了评价细胞因子的体内抗肿瘤效应，细胞因子可以配制在药学上可接受的载体中，通过静脉内、肿瘤内或腹腔内注射施用。细胞因子结合细胞施用，如表达或包覆有细胞因子的肿瘤细胞。

生物活性分析

根据本发明，优选的是细胞因子是“有生物活性的”、“有高度生物活性的”“有非常高生物活性的”“有天然生物活性的”或“有超生物活性的(superbioactive)”。不同水平的生物活性与诱导白细胞变化的能力相关(而非只占据白细胞上细胞因子的受体)。根据本发明，所有天然存在的细胞因子都是有天然生物活性的。许多类型的分析可以显示出非天然存在的细胞因子的生物活性。例如，细胞因子可以诱导特定细胞类型的存活和/或增殖。另一个例子是，细胞因子可以改变细胞内第二信使如cAMP、花生四烯酸、钙离子或肌醇三磷酸的浓度。下面是进行生物活性分析的例子。

分析1

往一个或多个60-孔Lux微滴定板的每个孔中加入存在于10μ1含终浓度10％新生胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle’s培养基中的200FDC-P1。往每个孔中加入5μ1体积的浓度至少为微摩尔范围的细胞因子。将板在10％CO₂中于37℃孵育48h。进行活细胞计数。计算活细胞/孔的平均数。例如，该分析可用于鉴定由小鼠GM-CSF受体介导的生物活性。

分析2

将细胞因子样品和相当于天然存在的细胞因子的重组标准品中的每一个连续稀释于96-孔平底微滴定板中的完全RPMI-10培养基中。每个稀释度铺三个重复。收集处于活性对数期生长的CT.4S细胞，在完全RPMI-10中至少洗两次，以1×10⁵细胞/ml重悬于完全RPMI-10中。将50μ1细胞悬液加入到板上的每个孔中，将板在5％CO₂中于37℃孵育24h。将含氚的胸苷加入到每个孔中，将板再孵育24h。然后收获细胞，通过液闪计数测定氚掺入。例如，该分析可用于鉴定由IL4受体介导的生物活性。

分析3(集落形成分析)

通过煮沸3min使琼脂(4％w/v)融化在无菌水中。然后将琼脂冷却至42℃，加入42℃的RPMI-15至终浓度0.4％。将溶液维持在42℃。使用无菌操作技术从幼体动物摘除股骨。使用带有23G针头的的注射器，用无菌的Hank’s缓冲的盐溶液(HBSS)冲洗骨的开口端来收集骨髓。将骨髓置于15m1组织培养管中，涡旋成细胞悬液。使骨段静置5min，取出上清悬液。将悬液调整至7.5×10⁶有核细胞/m1，并加入42℃的RPMI和0.4％琼脂稀释1:100。将2倍系列稀释的细胞因子以≤0.2m1的体积加入35mm组织培养皿中。对照皿不加细胞因子。将1m1保温的细胞悬液加入到每个皿中，使琼脂于室温凝固。将培养物在5％CO₂中于37℃孵育5-7天。然后通过显微镜评价集落形成。记录细胞因子板上给定类型集落的平均数(或给定不同类型集落的总数)和对照板上的平均数。例如，该分析用于鉴定由CSF受体介导的生物活性。

分析4

将细胞因子系列稀释在RPMI1640/25mM HEPES/1％BSA中。25μ1的各稀释液以三次重复铺到多孔趋化室的底部。只含培养基的孔用作阴性对照，含趋化诱导性天然存在的细胞因子的孔用作阳性对照。将聚碳酸酯膜覆盖在趋化室底部，并组装趋化室。向趋化室的每个上孔中加入RPMI/HEPES/BSA中1.5×10⁶细胞/m1的50μ1外周血单核细胞。将趋化室将板在5％CO₂中于37℃孵育90min。将膜取出，洗涤并染色。通过显微镜对每个孔中3-5随机视野中的迁移细胞进行计数。

分析5

在17×100mm管中，用补加培养基将天然存在的细胞因子参照标准品稀释至2ng/m1。还制备了另外3个5倍系列稀释液。在17×100mm管中制备的细胞因子系列稀释液为2ng/m1-20pg/m1。向96-孔平底微滴定板的每个孔中加入50μ1存在于补加培养基中的PHA活化的人成淋巴细胞4×10⁵细胞/m1。将50μ1各稀释度的参照标准品或细胞因子加入到三个复孔中。阴性对照细胞只加入50μ1的补加培养基。将板在5％CO₂中于37℃孵育48h，并将细胞用含氚胸苷标记。通过液闪计数测定掺入量。例如，该分析可用于鉴定由IL-12受体介导的生物活性。

分析6

在另一种生物活性分析中，对有免疫能力的动物接种10⁴-10⁸数量级受辐射的转导细胞因子或包覆细胞因子的肿瘤细胞，并用10⁴-10⁸数量级的野生型活肿瘤细胞(以任意时间顺序)激发。分析结果读数为存活、肿瘤发生或转移性病灶的数目。

可以在下列文献中发现细胞因子分析的其他例子：Ca1lard RE et al Assay forhuman B ce11growth and differentiation factors.in：Clemens MJ et a1(eds)Lymphokinesand Interferons.A practical Approach，pp.345-64，1RL Press，Oxford1987；Coligan JE eta1Current protocols in immunology.Grene and Wiley-Interscience，New York1991)；Dotsika EN Assays for mediators affecting cellular immune functions.Current Opinion inImmuno1ogy2：932-5(1989)；Feldmann M et al Cytokine assays：role in evaluation of thepathogenesis of autoimmunity.Immunological Reviews119：105-123(1991)；Guiguet Met al Misinterpretation of the biological activity of cytokine-containing preparationsattributable to unrecognized interacting components.Analytical Biochemistry247(2)：441-442(1997)；Hamblin AS&O′Garra A Assaysfor interleukins and other related factors.In：Lymphocytes，a practical approach，Klaus GGB(edt)，pp.209-28，IRL Press，Oxford，(1987)；Laska EM & Meisner MJ Statistica1 methods and applications of bioassay.ANNU.Rev.Pharmaco1.Toxico1.27：385-97(1987)；Mosman TR & Fong TAT Specific assaysforcytokine production by T ce1ls Journal of Immunological Methods116：151-8(1989)；Newton RC & Uh1J Assays relevant to the detection and quantitation of cytokines andt1eir inhibitors.Modern Methods in Pharmaco1.5：83-99(1989)；Thorpe R et al Detectionand measurement of cytokines.B1ood Rev.6：133-48(1992)；van Zoelen EJ The use ofbiologica1 assays for detection of polypeptide growth factors.Progress in Growth FactorResearch2：131-52(1990)；Winstanley FP Cytokine bioassay.In：Gallagher G et a1(eds)Tumor Immunobiology，A practical Approach.Oxford UniversityPress，pp.179-303(1993)；Wadha M et al Quantitative biological assays for individual cytokines.In：Ba1kwi1lFR(edt)Cytokines，A practical approach.Oxford University press，pp.309-330(1991)。

根据本发明，如果非天然存在的细胞因子在生物活性分析中给出的读数是等摩尔量非天然存在的细胞因子所生成读数(后者给出分析中的阳性结果)的至少10％，但不超过29％(±1％)，则非天然存在的细胞因子是“有生物活性的”。根据本发明，如果非天然存在的细胞因子在生物活性分析中给出的读数是等摩尔量非天然存在的细胞因子所生成读数(后者给出分析中的阳性结果)的至少30％，但不超过49％(±1％)，则非天然存在的细胞因子是“有高度生物活性的”。根据本发明，如果非天然存在的细胞因子在生物活性分析中给出的读数是等摩尔量非天然存在的细胞因子所生成读数(后者给出分析中的阳性结果)的至少50％，但不超过69％(±1％)，则非天然存在的细胞因子是“有非常高生物活性的”。根据本发明，如果非天然存在的细胞因子在生物活性分析中给出的读数是等摩尔量非天然存在的细胞因子所生成读数(后者给出分析中的阳性结果)的至少70％，但不超过100％(±1％)，则非天然存在的细胞因子是“有天然生物活性的”。根据本发明，如果非天然存在的细胞因子在生物活性分析中给出的读数大于100％的等摩尔量非天然存在的细胞因子所生成的读数(后者给出分析中的阳性结果)，则非天然存在的细胞因子是“有超生物活性的”。根据本发明有用的CD40配体

Genbank注册No.Y10507、M83312和U57745提供了不同物种中编码CD40蛋白的核苷酸序列。人CD40是长度为277个氨基酸(48kDa)的跨膜蛋白。CD40是磷蛋白质，可以表达为同源二聚体。还描述了可溶形式的CD40(28kDa)。CD40蛋白表达在各发育阶段的所有B淋巴细胞、活化的T细胞和单核细胞、滤泡树突状细胞、胸腺上皮细胞和各种癌细胞系上。其表达在大多数B细胞恶性肿瘤上和一些早期B细胞急性淋巴细胞白血病上。CD40还表明存在于多数骨髓瘤细胞系上和浆细胞恶液质患者的骨髓瘤细胞上。

GM-CSF、IL3或IFN-γ处理后的原代人单核细胞中观察到了CD40mRNA的诱导和细胞表面蛋白表达的增加。人CD40基因定位于染色体20。

还认为CD40在记忆细胞的发生中发挥作用。它还在细胞活化中发挥作用，用作感受态因子和进展因子(progression factor)。CD40抗原(与诸如IL4和IL5之类的细胞因子)的交联导致B细胞增殖，诱导免疫球蛋白类型在不存在活化的T细胞时从IgM向IgG、IgA和IgE合成的转换。CD40是使自然B细胞分泌IgA所需的必要信号之一；IgA诱导机制需要IL10和TGF-β的协同。可溶性CD40抑制T细胞依赖的B细胞增殖。

抗CD40的单克隆抗体介导B淋巴细胞上的各种效应，包括诱导细胞间粘附分子(通过CD11a/CD18(LFA-1))、短期和长期增殖、分化和蛋白质的酪氨酸磷酸化增加。由CD40和抗原受体的活化所致的凋亡使胚中心中央细胞不能发生细胞死亡。

在人的静息B细胞中，CD40的表达受IL4的诱导。用IL6处理人B细胞导致细胞内CD40结构域的磷酸化。但是，CD40不充当IL6的受体。在活化的人B细胞中，用抗CD40的单克隆抗体处理细胞诱导IL6的生成，说明CD40参与依赖于IL6的信号传导机制。

已经发现其和神经生长因子、TNF-α与CD27的受体具有一些有限的序列同源性，因此认为CD40可能还参与调节这些和其他细胞因子的生物活性。

CD40还在非免疫细胞中具有生物功能，虽然这些功能还远不清楚。CD40的结合还表明能诱导间充质细胞和上皮细胞来源的转化细胞经凋亡的细胞死亡。这些过程部分由CD40胞质结构域中存在的死亡结构域所介导。

一个特别有用的CD40配体是CD154。CD154(“CD40配体”；人蛋白质29.3kDa，261个氨基酸)是TNF蛋白质家族的成员。人蛋白质和鼠EL4胸腺瘤细胞中分离的类似蛋白质在cDNA水平和蛋白质水平上分别表现出82.8％和77.4％的同源性。这两种蛋白质都是静息B细胞上表达的CD40细胞表面抗原的配体。人类编码CD154的基因定位于染色体Xq26.3-q27。编码各物种天然CD40配体的核苷酸序列由Genbank注册Nos.X67878、X96710、X68550、X65453、Z48469和L07414提供。各物种CD154分子的氨基酸序列由Entrez蛋白质数据库注册No.1705713、231718、560693、3047129、116000、1518170、38412、109639、1083014、38484和37270提供。

CD154天然合成为跨膜多肽。还已描述了人CD154的有生物活性的可溶性片段(Pietrava1le et a1，1996，J Biol Chem271：5965-5967)。Mazzei等人(1995，J Biol Chem270：7025-7028)鉴定到了有生物活性的CD154可溶性片段，其为由完整跨膜CD154的氨基酸Glu108至Leu261组成的多肽的同源三聚体。Graf等(1995，Eur J Immuno125：1749)描述了另一种活性片段，其由在Met113处进行蛋白水解性切割产生的C末端片段组成。Aruffo等在U.S.Pat.5,540,926中公开了可溶形式的CD154和其在体外刺激B细胞的用途。在本发明中，特别有用的CD40配体包括含‘926专利SEQ IDNO.2中47至261个氨基酸残基序列的多肽。这些残基位于人CD154的细胞外结构域中。

另一种特别有用的CD40配体类型是CD40的抗体。这类抗体的例子包括HarlanBioproducts for Science(Indianapolis，IN)的产品分类号为MCA1143和MCA1590的单克隆抗体；Biodesign Internationa1(Kennebunk，ME)的产品分类号为P61640F(由克隆14G7产生)、P42374M(由克隆MAB89产生)、P61046M(由克隆BL-C4产生)和P54486M(由克隆B-B20产生)的单克隆抗体；Upstate Biotechnology(Lake Placid，NY)的产品分类号为05-422(由克隆626.1产生)的单克隆抗体；Mabtech(Nacka，Sweden)的产品分类号为3601(由克隆S2C6产生)的单克隆抗体；Research Diagnostics(Flanders，NJ)的产品分类号为RDI-CBL486(由克隆BB20产生)、RDI-M1691c1b(由克隆CLB-14G7产生)、RDI-mCD40-323(由克隆3/23产生)的单克隆抗体；Schwabe et a1，1997，Hybridoma16：217-226中所述的单克隆抗体；Bjorck et a1，1994，Immunology83：430-437中所述的单克隆抗体；Ledbetter et a1，1994，Circ Shock44：67-72中所述的单克隆抗体G28-5；和Buske et a1，1997，Exp Hemato125：329-337中所述的单克隆抗体。根据本发明有用的调理素

如上文所限定的，“调理素”指能与抗原和抗原呈递细胞(APC)结合的天然存在的和非天然存在的分子，例如，所述的抗原呈递细胞有吞噬性白细胞(包括单核细胞和巨噬细胞)、树突状细胞(例如皮肤的朗氏细胞)、B淋巴细胞和人类中的内皮细胞；或能够得以加工，从而使一个或多个加工步骤的至少一个产物能与抗原和抗原呈递细胞(APC)结合的分子，例如，所述的抗原呈递细胞有吞噬性白细胞、树突状细胞、B淋巴细胞和人类中的内皮细胞。

不拘泥于任何作用机制，认为调理素增强的细胞提供根据本发明的有益效果，因为调理素部分充当抗原和APC之间的联系或偶联剂，从而使抗原更有效的结合、吞入和内化。此外，调理素自身可以和抗原一起内化。“内化”指细胞吸收一种分子，使之进入胞浆中或细胞胞浆的分区区室(compartment)中。细胞吞噬作用是细胞对分子进行内化的过程。

优选的调理素是非啮齿类调理素，如灵长类，如人类调理素。根据本发明有用的调理素与APC(如吞噬性白细胞，如巨噬细胞和吞噬细胞系统的其他细胞)上的受体结合，如和本文所述的、在先天性免疫中发挥作用的受体结合。

一些类型的调理素可以认为在结构上和功能上类似。例如，一个家族包括补体组分C3和C4的片段。这两个组分是高度结构同源的，每一个都具有分子内硫酯(thiolester)键，该键在肽(分别是C3a或C4a)经蛋白水解从天然分子切割时断裂。硫酯键的破坏可以得到能与抗原形成酯键的化学结构。带有该酯键的C3部分，即非C3a部分，称作C3b；C4b是C4切割的类似产物。C3b可以由诸如因子I的蛋白质进一步水解，产生诸如C3bi和C3d的片段，这些片段也通过酯键与抗原连接。

已知有四种结构上独特的蛋白质用作有生物活性的、膜结合的C3和/或C4片段的高亲和受体。CR1是C3的C3b片段和C4的C4b片段的主要受体。其表达在单核细胞和单核细胞来源的APC等细胞类型上。CR2是称作C3d的C3片段的主要受体，表达在例如成熟的B淋巴细胞上，但不表达在单核细胞谱系的细胞上。人们认为B淋巴细胞上CR2的主要作用是与它们的相关抗原协同，直接辅助刺激B细胞。

CR3主要由中性白细胞和单核细胞表达，还在FDC、枯否细胞和NK细胞上表达。CR3是主要对C3bi具有特异性的C3片段受体。人们提出CR3是诸如吞噬作用的过程中粘附相互作用和膜识别所需的细胞骨架事件的重要组织者。

CR4是β2整合素家族的成员，其α链与CR3及LFA-1的α链在结构上类似。其主要的生理性配体认为是C3d和C3d，g；但是其生物活性了解得不如C3R那么清楚。

天然调理素家族的另一个例子是co1lectin，一类胶原(co1lagenous)C-型凝集素，其包括补体组分C1q、甘露糖结合蛋白、表面活性蛋白A和D与共凝集素。每种分子都包括与抗原结合的凝集素结构域，和与吞噬性单核细胞上受体结合的胶原结构域，所述的受体包括与C1q受体完全或部分相同的受体(Nepomuceno et a1，Immunity6：11′9-29；Tenner et AL，Immunity3：485-93；Guan et a1，J Immuno1152：4005-16；Geertsma et AL，Am J Physio1267：L578-84；Miyamura et a1，Biochem J300：237-42；Malhotra et a1，J Exp Med172：955-9；Malhotra et a1，Biochem J293：15-19)。多数已知的co1lectin包括多个多肽链，在某些情况下是同聚物，在其他情况下是异聚物，在翻译后部分通过羟脯氨酸和羟赖氨酸残基的共价交联组装。Co1lectin是例如Pikaar et a1，JInfect Dis172：481-9；Alvarez-Dominguez et AL，Infection & Immunity61：3664-72；Kuh1man et a1，J Exp Med169：1733-45；and Geertsma et a1，op cit中的调理素。

根据本发明有用的其他天然调理素是C反应蛋白(CRP)、α-2巨球蛋白和纤连蛋白。Pentraxin分子家族的成员CRP与单核细胞谱系的细胞上受体结合，已表明是一种调理素(Tebo and Mortenson，J Immunol144：231-8；Holzer et a1，J Immuno1133：1424-30)。和C3、C4一样，α-2巨球蛋白含有分子进行蛋白水解时破坏的内部硫酯键。这种破坏使得分子与抗原共价结合，α-2巨球蛋白与APC的结合能促进对偶联物的吸收。Pentraxin与α5β1整合素结合，还与各种抗原结合，使其作为调理素发挥作用(Cosio，J Lab Clin Med103：613-9；Czop and Austen，J Immuno1129：2678-81)。

免疫球蛋白(抗体)可以通过其可变区结合抗原、通过其恒定区结合APC，用作调理素。通常，免疫球蛋白包括彼此共价结合的两条重链，每一条重链与一条轻链相结合。这些杂合四聚体还能够组装成有序性更高的结构，如五聚体形式的IgM。重链和轻链可变区都有助于形成抗原结合位点，而APC结合位点位于重链恒定区。还描述了重组的单链抗体。APC上免疫球蛋白的受体包括分别针对IgA、IgG、IgE和IgM的Fcα、Fcγ、Fcε和Fcμ受体。

由多细胞真核生物有机体天然表达的调理素是分泌型的。后一特征将调理素与粘附分子区分开。含天然存在的APC结合部分的非天然存在分子也应认为是调理素，只要它含有能通过其与细胞稳定结合或附着从而使APC结合部分位于细胞外间隔的部分，而不论该分子是否含有天然存在抗原的抗原结合部分。可以使分子与细胞稳定结合的部分包括交联部分、跨膜序列和脂质部分。含这些序列或部分的蛋白质的制备是本领域技术人员所公知的。

调理素的“APC结合部分”是包括在嵌合分子中时，至少在纳摩尔范围内能使嵌合分子与APC上生理性表达的受体以一定的亲和力结合的序列或结构域。

存在有包括APC结合部分的调理素片段的多个例子。这种片段可以是任意长度，只要它保留有APC结合功能；例如，它可以是约40个氨基酸；100个氨基酸；150个氨基酸；500个氨基酸；800个氨基酸；或者长达3000个氨基酸。例如，Las Holtetet a1，1994，FEBS Lett344：242描述了以高亲和力与α2m受体结合的人α2m的羧基末端片段(va11299-ala1451)。个氨基酸；包含人α2m中氨基酸1314-1451的片段和大鼠α2m的相应结构域的片段也与α2m受体结合，虽然具有天然α2m的1-2％的亲和力(Van Leuven et al，1986，J Biol Chem261：11369；Enghild et al，1989，Biochemistry28：1406；Salvesen et a1，1992，FEBS Lett313：198；Sottrup-Jensen et a1，1986，FEBS Lett205：20)。

Becherer and Lambris，1988，J Biol Chem263：14586描述了与CR1结合的C3b片段，如C3c，其是经弹性酶处理产生的C3片段，包含C3bα链的N末端；和含有C3bα链中42个N末端氨基酸的合成肽。还描述了C3中对CR3的结合序列(Wright et al，1987，PNAS84：4235)。

C1q的“胶原柄(sta1k)”，即经胃蛋白酶消化获得的N末端片段与C1q受体结合(Reid，1981，Methods Enzymo180：16；Malhotra et al，1993，Biochem J293：15)。Malhotra等人也提供了共凝集素的APC结合部分包括在其55个N-端氨基酸中的证据。Ezekowitz(US Pat5,270,199)提出了人甘露糖结合蛋白中的假定APC结合位点，其由’199专利的图2中核苷酸370-438组成。此外，由于和共凝集素同源，’199专利中公开的外显子1也包含APC结合部分。

IgG的APC结合部分含有CH2结构域和较低的铰链区，包括残基234-237，如Canfield and Morrison，1991，J Exp Med173：1483-91；Lund et al，1991，J Immuno1147：2657-62；和Sarmay et al，1992，Mol Immunol，29：633-9中所述。

可以用于本发明组合物和方法的调理素的例子包括纤连蛋白(如Genbank注册No.X02761、K00799、K02273、X82402、X00307、X00739)、CRP(如Genbank注册No.X17496、M11880、M11881、M11882)、补体组分，如Clq(如Genbank注册No.X66295、M22531、X03084、X58861和Swiss-Prot注册No.P02747，P02745)、补体片段如C3b和C3d(如Genbank注册No.K02782、K02765)、甘露糖结合蛋白(如Genbank注册No.S42292、S42294、X15422)、共凝集素(如Genbank注册No.X71774)、α-2巨球蛋白(如Genbank注册No.M93264、M11313)、表面活性蛋白A(如Genbank注册No.M68519、S48768)和表面活性蛋白D(如Genbank注册No.L40156、X65018、S38981)、免疫球蛋白，及其种间同源物。

表2

根据本发明有用的示例性调理素、APC结合部分/APC受体对

调理素	示例性APC结合部分	受体
			α-2巨球蛋白	人α-2m的Val(1299)-Ala(1451)	α-2m受体，CD91
C3b	C3bα链的42个N末端氨基酸	CR1
			C3bi	C3bi	CR2、CR3
C3d	C3d	CR2、CR4

C1q	胶原柄(Reid，1981，MethodsEnzymo1.80：16)	Co1lectin受体(Nepomuceno eta1.1997，Immunity6：119)，CD93
			共凝集素	牛共凝集素的55个N末端氨基酸	Co1lectin受体，
MBP	1.’199专利的图2中核苷酸370-438编码的多肽2.U.S.Pat.5,270,199的图2中外显子(Econ)......I编码的多肽	Co1lectin受体，CD35，CD14
			CRP	CRP	CRP受体，FcγRI，FcγRIIa(CD32)
纤连蛋白	纤连蛋白	α5β1整合素
			IgG	CH2结构域+包括氨基酸234-237的较低铰链区，如Lund et al，1991，J Immuno1147：2657所述	FcγRI、FcγRII、FcγRIII
表面活性蛋白A表面活性蛋白D	表面活性蛋白A表面活性蛋白D	Co1lectin受体，CD14

根据本发明的调理素的测定

如果根据一种或多种下述分析确定了给定天然存在的调理素具有调理素功能，并且其是分泌型分子，则它是根据本发明有用的。

分析1

在一种调理素作用分析中，如O′Rear和Ross在Current Protocols in Immunology，1994，John Wiley&Sons，pp.13.4.5-9中所述，获得了通过生理性发生的键与候选调理素分子结合的SRBC。将来自天然存在候选调理素的物种的APC以4×10⁶/m1悬浮于冰冷的含1％(w/v)BSA科恩级分(Cohn fraction)的HBSS中。如果候选调理素是C3片段，APC是新鲜取出的、未培养的外周血单核细胞。将与候选调理素或对照SRBC(与前者相同，但不与候选调理素结合)结合的SRBC以2×10⁸/ml悬浮于相同的溶液中。将100μl SRBC悬液和100μlAPC悬液混合到10×75mm塑料管中。将该管于37℃旋转2-20min。将一小滴悬液置于载玻片上，盖上盖玻片，静置5-10min。对盖玻片施压除去多余的液体，然后用例如澄清的指甲油将盖玻片密封到载玻片上。通过显微镜检验载玻片，确定APC与4种或多种SRBC的可见粘附百分比。如果百分比为50％或更高，最高为4×10⁴候选调理素分子/SRBC，则候选调理素是调理素。

分析2(用于蛋白酶活化的调理素)

将候选调理素或放射性标记的候选调理素用1.5-3倍摩尔的过量蛋白酶(0.05M三乙醇胺-0.1％M NaCl，pH8.0，室温过夜)。在该分析中，蛋白酶可以用作抗原，或加入过量的另一种抗原。在结合研究之前，将候选调理素-抗原复合物在HBSS(4℃)中透析。

通过将浓度最高为1.0M的标记配体与200m1体积的(1.5-4.0)×10⁶单核细胞在冰上孵育，测定与单核细胞结合的候选调理素-抗原复合物。在过量100倍摩尔的标记的候选调理素-抗原复合物存在下测定放射性标记配体的非特异性结合。通过在玻璃纤维滤膜上进行快速真空过滤，分离未结合的配体和结合细胞的配体。在冰上进行研究是为了避免由于内吞作用所导致的潜在复杂性。通过分析和非线性拟合确定结合常数和每个细胞上的位点数。如果候选调理素-抗原复合物对单核细胞结合位点的亲和性至少在纳摩尔范围，则候选调理素是调理素。

分析3

第1部分

为了直接评价候选调理素是否与P.carinii表面结合，进行免疫电镜分析。用含1mM钙的TBS从濒死的感染大鼠支气管肺泡的灌洗液中分离P.carinii，以保留表面结合的候选调理素。将分离的有机体固定在高碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛缓冲液中，浸在Lowacry1mounting培养基中(Ted Pe1la，Inc.，Redding，CA)。获得超薄的切片，用正常山羊血清(2％)封闭1h，并与兔抗候选调理素抗体或非免疫兔IgG(25mg/m1)孵育过夜。洗涤后，将切片与偶联有15nM胶体金(Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)的山羊和兔IgG一起孵育。将切片再次洗涤，在透射电镜下进行检验(mode16400：JEOL USA，Inc.，Peabody，MA)。

第1I部分

在抗候选调理素抗体的存在或不存在下，或随着纯化候选物的加入，如下所述对P.carinii与培养的肺泡巨噬细胞的结合进行定量。通过对有机体进行⁵¹Cr-标记，对P.carinii与肺泡巨噬细胞的粘附进行分析。用含1mM钙的TBS从感染大鼠中分离P.carinii，以防止表面结合的候选调理素的丢失。将有机体在2m1含20％FCS和200mCi⁵¹Cr-铬酸钠(New England Nuclear)的DME中于37℃孵育8h，进行放射性标记。从健康大鼠中灌洗正常的巨噬细胞，并铺到组织培养板中(1×10⁵)细胞/孔，所述的孔预包被有正常大鼠IgG(100mg/ml×60min)，以保证巨噬细胞的牢固贴壁。1h后，将巨噬细胞用HBSS轻柔洗涤，去除未贴壁的细胞。这次洗涤后，>95％的巨噬细胞都是贴壁的。向巨噬细胞中加入含结合在表面的候选调理素的⁵¹Cr-P.carinii，再于37℃孵育1小时。然后，通过洗涤除去未附着的P.carinii，将粘附有P.carinii的巨噬细胞单层溶解于1N NaOH，进行定量。P.carinii的粘附定义为：粘附％＝(A/A+B)×100，其中A＝与单层结合的⁵¹Cr-P.carinii，B＝未结合的⁵¹Cr-P..carinii。为了评价候选调理素对P.carinii与培养物中肺泡巨噬肺细胞粘附的影响，在抗候选调理素的多克隆兔抗体(100mg/m1)存在或不存在的条件下进行P.carinii粘附分析。

如果第1部分中候选调理素与P.carinii的结合是明显的，如果第1I部分中，在抗候选调理素抗体的存在下粘附％降低，具有P<0.05的统计学显著性，则候选调理素是调理素。

分析4

如下所述测定细菌与贴壁单核细胞的结合。经Limulus分析，改良PBS和所用的所用缓冲液中内毒素水平低于50pg/m1。使改良PBS中的5×10³单核细胞在Terasaki板的孔中于37℃贴壁2h。用PBS洗涤三次除去未贴壁的细胞，然后加入含有或不含有10-50微克/ml候选调理素的0.5m1缓冲液中的5×10⁴FITC标记的细菌。所用细菌-单核细胞比例为10:1至50:1。在黑暗中于37℃孵育30min后，用温的PBS洗涤5次以去除未粘附的细菌。以四次重复进行分析；在每个孔中，在荧光显微镜下使用×100放大倍数对结合³100单核细胞的细菌进行计数。结果表示为与100个单核细胞结合的细菌数目。如果含候选调理素的计数是不含候选调理素的至少2倍，则候选调理素是调理素。

分析5

第1部分

将1×10⁷-6×10⁷细菌/m1与10mcg/m1的¹²⁵I-候选调理素在总体积为0.7m1的PBS中孵育(20min，0℃)，将100m1的反应混合物层加到150m1的油垫(oil cushion)(60％邻苯二甲酸二丁酯，40％邻苯二甲酸二辛酯)[Eastman Kodak Co.，Rochester，N.Y.]上。并将混合物离心(10,000×g，60s，4℃)。用Mozart刀片切割含有细胞沉淀的管尖端，计放射性。

第1I部分

在使用的前一天晚上将APC以2×10⁵的密度铺到96-孔组织培养板(Costar，Cambridge，Mass)中。将2×10⁶细菌/孔(0.1ml/孔)加入到含或不含100mcg/m1的候选调理素中。然后将板以1,000×g离心7min。37℃15min使细菌吸收后，用冷的PBS洗涤数次以除去游离的细菌。然后在加有一定量抗生素的RPMI1640中孵育(45min，37℃)，所述的抗生素在培养物中存在45min时能杀死所有的细胞外细菌。该孵育阶段结束时定为时间0。将单核细胞用Hank’s缓冲的盐溶液洗3次，加入同样体积的RPMI1640(R0)。冻-融循环数次，将细胞裂解。孵育24h后，通过在血琼脂板(Columbia blood agar；Becton Dickinson，San Jose，Calif.)上进行定量板计数，确定每孔中活细菌的数目(CFU)。每个结果是三次测定的平均值。

如果第1部分中，候选调理素处理的细菌沉淀>75KCPM，且该掺入受未标记的候选调理素的抑制，如果第二部分中，含候选调理素的CFU大于不含候选调理素的CFU(P<0.05)，则候选调理素是调理素。

分析6

制备含10⁷细菌的200μl GHBSS(Hanks缓冲的盐溶液+0.1％明胶)，含10mmolCaC1₂。然后将细菌于4℃和20-100μg/m1候选调理素孵育。在竞争性抑制剂存在或不存在下进行结合分析。孵育30min后，在室温下将细菌于GHBSS+10mmol CaC1₂中洗涤5次，1,300g离心3分钟。然后，将1:1,000稀释的兔抗候选调理素抗血清与细菌在PBS+5％FCS和10mmol CaC1₂中孵育1h，接着在GHBSS+10mmolCaC1₂+0.05％Tween20中将细菌洗涤3次。通过1:1,000稀释的偶联有若丹明(FisherPharmaceuticals，Orangeburg，NY)山羊抗兔IgG抗体检测抗血清的结合。孵育后，在GHBSS+10mmol CaC1₂+0.05％Tween20中将细菌洗涤5次，涂到玻璃载玻片上，并风干。然后，用100％冰冷的甲醇将细菌固定5分钟。阴性对照包括不加候选调理素和第一步抗体。通过荧光显微镜检验三重复分析的多个视野。

第II部分放射性标记的细菌与细胞的结合

将10⁷放射性标记的细菌重悬于200μl GHBSS+10mmol CaC1₂中，并在4℃下与或不与2μg/m1-40μg/m1的候选调理素孵育30min。然后在室温下将细菌于GHBSS+10mmol CaC1₂中洗3次，1,300g离心，重悬于50μ1GHBSS中，加入到含数量级为10⁶的APC的1m1悬液(GHBSS)中。将细菌和APC于37℃轻摇20min，然后在离心机中以82g的差异离心洗涤5次，除去未结合的细菌。在最后一次洗涤之前，从每个样品中取出一小份铺到Labtek载玻片上，使细胞贴附10min，甲醇固定，吉姆萨染色，并通过光学显微镜评分。为了对铺在Labtek载玻片上的细胞进行评分，对至少400个细胞进行计数。噬菌指数表示为每100PMN中结合或摄入的颗粒数。将上述含细胞和放射性标记细菌的沉淀物在100μl PBS+0.5％TritonX-100中，在液闪计数仪中测定放射性。如果第1部分中候选调理素与细菌的结合是明显的，并且在第1I部分中，候选调理素处理以cpm计的细菌特异性吸收比不用候选调理素处理多三倍，则候选调理素是调理素。

分析7

为了研究与Ldonovanipromastigotes的结合，将培养物以5×10⁵寄生虫/ml接种。在最多9天的规则时间点对部分寄生虫进行计数、洗涤，并重悬于1％BSA、0.5mMCa²⁺、0.05％NaN₃、Tris-缓冲的盐水(TBS)(10mM Tris-HC1，0.15MNaC1，pH8.0)中(稀释)至2×10⁵m1^-1。然后将50微升的该悬液加入到200-μl离心管中，所述的离心管含有稀释剂中的5μg/m1放射性标记候选调理素(0.12μCi/μg)，所述的稀释剂不含有EDTA，其覆盖有一层150μ1的邻苯二甲酸二壬基酯/邻苯二甲酸二丁酯(40:60v/v)油混合物。将寄生虫孵育1h，并离心通过油层，将细胞沉淀切下，通过γ计数检测相结合的候选物。每个分析重复3次。还使用活性为0.045μCi/μg、从60μg/m1至0.0151g/m1的两倍稀释度系列的候选物，如上所述测定候选物与体前鞭毛结合的浓度依赖性。

第1I部分

将APC以1×10⁶细胞/孔的密度铺到24-孔组织培养板中的玻璃盖玻片上。将细胞在补充有10％PCS、1mM谷氨酰胺、200U/m1青霉素和200μg/m1链霉素的RPMI1640(Life Technologies)于37℃孵育。24h后，除去未贴壁的细胞，剩余的细胞在6天后使用。将体前鞭毛和或不和30μg/m1的候选物于RPMI1640中孵育1h，洗涤3次，然后加入10⁶/孔的APC培养物。使体前鞭毛感染APC1h，然后洗涤细胞，进行甲醇固定和吉姆萨染色(BDH，Poole，Dorset，UK)，然后进行计数。从四次重复培养物确定APC受感染的百分比和每100个巨噬细胞的寄生虫数。

如果在第1部分中，候选调理素对寄生虫的亲和力至少在纳摩尔范围内；第1I部分中，候选调理素处理的每100个APC吸收的寄生虫数是不用候选调理素处理的至少两倍，则候选调理素是调理素。

分析8

第1部分

将含5％胎牛血清和候选调理素的部分(0.5m1)[³⁵S]标记的培养基和0.1m1或0.2m110％的微生物悬液于室温下孵育30分钟。例如，受试微生物可以包括鼠伤寒沙门菌(Samone1la typhimurium)、枯草芽孢杆菌(Baci1lus subtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。通过在含有2％SDS和0.1M二硫苏糖醇的缓冲液中煮沸来释放结合的蛋白质，并在5％的SDS凝胶上进行分析。

第1I部分

将固定的、用[³H]胸苷标记的细菌(0.1m1；10％体积；10¹⁰有机体/ml)与0.1m1血清在除去或不除去候选调理素的条件下孵育。用PBS洗涤后，将细菌与含二价阳离子的终体积0.9mlPBS中的1×10⁷数量级的APC一起孵育。以一定的间隔取出0.2m1到具有N-ethyimaleimide(2mM)的冰冷PBS中，以阻断进一步的内吞，将细胞进行洗涤(约100g为10秒)。

如果在第1部分中，与候选调理素相对应的条带是明显的，并且如果在第1I部分中，不去除调理素的样品孵育约6-10min后的CPM比去除血清至少高三倍，则候选调理素是调理素。

在分析3、5、6、7、8中第1部分的一系列结果中，如果满足分析第1I部分的候选调理素能在至少纳摩尔的范围内与分析中的抗原结合，则它可以是调理素。

分析9

如O′Rear和Ross在Current Protocols in Immunology，1994，John Wiley & Sons，pp.13.4.5-9中所述制备包覆至少1.2×10⁴分子/细胞的C3片段的SRBC。250μ1的单核细胞以2×10⁵细胞/m1含10％胎牛血清的RPMI的密度加入到8-孔玻璃组织培养板中的每个孔中，于37℃、5％CO₂孵育3h。将细胞用HBSS洗涤两次，将50μl SRBC以1.5×10⁸/ml DVBS²⁺加入到每个孔中。将板于50g离心5min，然后于37℃、5％CO₂孵育3h。将孔(wa1l)用HBSS洗涤两次，进行0.5％戊二醛固定和吉姆萨染色。如果通过光学显微镜检测，>40％的单核细胞与至少一个SRBC形成玫瑰花结，则候选物是调理素。

本发明中有用的热激蛋白

热激蛋白(HSP)在细胞中与广谱的肽、多肽、变性蛋白质和抗原相结合，与它们形成复合物。Srivastava et a1.，＂HEAT shock protein-peptide complexes in cancerimmunotherapy＂in Current Opinion in Immunology(1994)，6：728-732；Srivastava，＂Peptide-Binding Heat Shock Proteins in the Endoplasmic Reticulum＂in Advances inCancer Research(1993)，62：153-177中描述了这种HSP-肽复合物可用在防癌和感染性疾病的疫苗中。HSP-肽复合物似乎作为疫苗起作用，因为它们可以充当抗原携带和呈递分子。Baltz，＂Vaccines in the treatment of Cancer＂in Am.J Health-Syst.Pharm.(1995)，52：2574-2585中描述了使用这种抗原来开发疫苗。热激蛋白的抗原性似乎不源自热激蛋白本身，而是源自相结合的肽，参见Udono et a1.，＂Heat Shock Protein70-associated Peptides Elicit Specific Cancer Immunity＂in J.Exp.Med(1993)，178：1391-1396；Srivastava et a1.，＂Heat shock proteins transfer peptides during antigenprocessing and CTL priming＂in Immunogenetics(1994)，39：93-98；Srivastava，＂ACritical Contemplation on the Roles of Heat Shock Proteins in Transfer of AntigenicPeptides During Antigen Presentation＂in Behring Inst.Mitt.(1994)，94：37-47。HSP似乎是肽转运至主要组织相容性复合物(MHC)分子进行表面呈递的过程的一部分。

已经表明许多不同的HSP都表现出免疫原性，可用于本方面，这些HSP包括但不局限于：gp96、hsp90、hsp100、hsp60、hsp25和hsp70，参见Udono et a1.，同上和Udono et a1.，＂Comparison of Tumor-Specific Immunogenicities of Stress-InducedProteins gp96，hsp90，and hsp70＂in Journal ofImmunology(1994)，5398-5403；gp96andGRP94，Li et a1.，＂Tumor rejection antigen gp96/grp94is an ATPase：implications forprotein folding and antigen presentation＂in The EMBO Journal，Vo1.12，No.8(1993)，3143-3151；and gp96，hsp90and hsp70，Blachere et a1.，＂Heat Shock Protein VaccinesAgainst Cancer＂in Journal ofImmunotherapy(1993)，14：352-356。

用于本发明的热激蛋白可以利用下列步骤纯化，采用DE52离子交换层析，然后在ATP琼脂糖上进行亲和层析，参见Welch et al.，＂Rapid Purification of Mammalian70,000-Dalton Stress Proteins：Affinity of the Proteins for Nucleotides＂in Molecular andCe1lular Biology(June1985)，1229-1237。

本发明中有用的粘附分子

本发明中有用的粘附分子包括参与细胞与其底物及其他细胞的识别和粘附的任意细胞表面蛋白。细胞粘附分子可以分为两种主要类型：Ca²⁺依赖型(钙粘着蛋白)和非C²⁺依赖型。

有许多称作钙粘着蛋白的不同类型Ca2⁺依赖型粘附分子。大多数钙粘着蛋白都是单次跨膜的糖蛋白，由约700-750个氨基酸残基组成。分子中大的细胞外部分通常折叠成5个结构域，每个含有约100个氨基酸残基。这些结构域中的四个含有假定的Ca²⁺结合位点。钙粘着蛋白经常以二聚体存在于细胞膜中。

本发明中有用的钙粘着蛋白包括但不限于钙粘着蛋白E、钙粘着蛋白N、钙粘着蛋白BR、钙粘着蛋白P、钙粘着蛋白R、钙粘着蛋白M、钙粘着蛋白VE、钙粘着蛋白T&H、钙粘着蛋白OB、钙粘着蛋白K、钙粘着蛋白7、钙粘着蛋白8、钙粘着蛋白KSP、钙粘着蛋白LI、钙粘着蛋白18、成纤维细胞1、钙粘着蛋白、成纤维细胞2、desmoglein1、desmoglein2、desmoglein3和protocadherin1、2、3、7、8和9。

其余的粘附分子都是非Ca²⁺依赖型的，和钙粘着蛋白一样，可以用作本发明中APC上细胞表面蛋白的配体。粘附分子的常见类型和本发明中有用的特异性粘附分子如表3所列。

表3

选择素
			L-选择素；E-选择素；P-选择素

整合素
			α1β1；α2β1；α3β1；α4β1；α5β1；α6β1；α7β1；α8β1；α9β1；αvβ1；αLβ2；αMβ2；αXβ2；αIIbβ3；αvβ3；α6β4；αvβ5；αvβ6；avβ7；alELβ7；α11
免疫球蛋白超家族
			神经特异性：神经小胶质细胞上的粘附分子(AMOG)；L1CAM；髓磷脂相关的糖蛋白(MAG)；髓磷脂-少突细胞糖蛋白(MOG)；NCAM-1(CD-56)；NrCAM；OBCAM；P₀蛋白；PMP-22蛋白；Neurofascin；NgCAM系统性IgCAMS：ALCAM；Basigin(CD147)；BL-CAM(CD22)；CD44；ICAM-1(CD54)；ICAM-3(CD50)；淋巴细胞功能抗原-2(LFA-2)；LFA-3(CD58；MHC分子；MAdCAM-1；PECAM(CD31)；T-细胞受体；VCAM
其他粘附分子
			Agrin；CD34；GlyCAM-1；少突细胞-髓磷脂糖蛋白(OMGP)

本发明中有用的防卫素

在一个实施方案中，作为APC上细胞表面蛋白配体的多功能分子部分是防卫素。防卫素是广谱抗微生物肽的一个大家族，最初在兔和人的白细胞中鉴定得到。防卫素，阳离子型极性肽(33-35aa，3-4kDa)，通过保守的三个二硫键和大的β片层结构来区分。当表达在细胞表面时，防卫素假定通过抑制各种致病性微生物占据上皮细胞而充当对抗微生物的生化屏障。本发明中有用的防卫素包括但不局限于人α防卫素1-6、人中性白细胞肽1-4、人β防卫素1和2，以及大鼠β防卫素1和2。

本发明中T细胞共刺激分子的反受体

在本发明的一个实施方案中，作为APC上细胞表面蛋白的配体的多功能分子部分是T细胞共刺激分子的反受体。共刺激定义为不只是简单地增强抗原受体近侧活化事件、还和抗原特异性信号交叉以使淋巴细胞活化的信号传导通路。因此，本发明中有用的共刺激分子的反受体包括但不局限于下列一种或多种的受体：B7-1、B7-2、ICOS：B7h、PD-1：PD-L1/PD-L2、CD48、CD40配体和OX40。本发明中有用的反受体包括但不局限于CD28、CTLA-4、ICOS、PD-1、TNF受体家族成员、CD40、主要B细胞共刺激分子，以及OX-40、4-1BB、CD30和CD27。

肽接头

在一个实施方案中，多功能分子是融合多肽，其包含插入在结合细胞的第一部分和第二部分之间的一个或多个氨基酸，如这么一种融合多肽，其包含与承抗原靶位结合的第一氨基酸序列和与白细胞结合的第二氨基酸序列，其还包含插入在第一部分和第二部分之间的至少一个氨基酸。所述的插入氨基酸可以包含，如减少空间位阻或上述第一部分和第二部分之间的其他不必要相互作用的接头序列。例如，一种类型的序列形式为(GlyxSer)n，其中n是1和15之间的整数，x是1和10之间的整数。其他有用的接头包括但不局限于(Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Val-Ala-Thr)1-5(Xu eta1.，1999，Proc.Nat1.Acad.Sci.U.S.A.96：151-156)、(Gly-Ser)_n(Shao et a1.，2000，Bioconjug.Chem.11：822-826)、(Thr-Ser-Pro)n(Kroon et a1.，2000，Eur.J.Biochem.267：6740-6752)、(Gly-Gly-G1y)_n(Kluczyk et al.，2000，Peptides21：1411-1420)和(Glu-Lys)_n(Klyczyk et a1.，2000，同上)，其中n是1-15(每一篇前述参考文献都通过引用并入本文)。在另一个实施方案中，没有氨基酸插入到第一部分和第二部分之间。

根据本发明有用的抗原

病毒抗原的例子包括但不局限于逆转录病毒抗原，如来自人免疫缺陷病毒(HIV)抗原的逆转录病毒抗原，如gag、pol和env基因的产物、Nef蛋白、逆转录酶和其他HIV成分；肝炎病毒抗原，如乙肝病毒的S.M和L蛋白、乙肝病毒的前体S抗原，和其他肝炎如甲肝、乙肝和丙肝病毒组分，如丙肝病毒RNA；流感病毒抗原，如血凝素和神经氨酸酶和其他流感病毒组分；麻疹病毒抗原，如麻疹病毒融合蛋白和其他麻疹病毒组分；风疹病毒抗原，如蛋白E1和E2及其他风疹病毒抗原；轮状病毒抗原，如VP7sc和其他轮状病毒组分；巨细胞病毒抗原，如包膜糖蛋白B和其他巨细胞病毒抗原组分；呼吸道合胞体病毒抗原，如RSV融合蛋白、M2融合蛋白和其他呼吸道合胞体病毒抗原组分；单纯疱疹病毒抗原，如即早蛋白、糖蛋白D和其他单纯疱疹病毒抗原组分；水痘病毒抗原，如gpI、gpII和其他水痘病毒抗原组分；日本脑炎病毒抗原，如蛋白E、M-E、M-E-NS1、NS1-NS2A、80％E和其他日本脑炎病毒抗原组分；狂犬病病毒抗原，如狂犬病糖蛋白、狂犬病核蛋白和其他狂犬病病毒抗原组分；其他病毒抗原的例子参见Fundamental Virology，Second Edition，e′s.Fields，B.N.and Knipe，D.M.(Raven Press，New York，1991)。

2.细菌抗原

可以用于本发明组合物和方法的细菌抗原包括但不局限于：百日咳细菌抗原，如百日咳毒素、丝状血凝素、pertactin、FIM2、FIM3、腺苷酸环化酶和其他百日咳细菌抗原组分；白喉(diptheria)细菌抗原，如白喉毒素或类毒素和其他白喉细菌抗原组分；破伤风细菌抗原，如破伤风毒素或类毒素和其他破伤风细菌抗原组分；链球菌抗原，如M蛋白和其他链球菌抗原组分；革兰氏阴性杆菌抗原，如脂多糖和其他革兰氏阴性细菌抗原组分；结核分支杆菌抗原，如霉菌酸、热激蛋白65(HSP65)、30kDa主要分泌蛋白、抗原85A和其他分枝杆菌抗原组分；幽门螺旋菌抗原组分；肺炎球菌抗原，如肺炎球菌溶血素、肺炎球菌被膜多糖和其他肺炎球菌抗原组分；嗜血流感细菌抗原，如被膜多糖和其他嗜血流感细菌抗原组分；炭疽菌抗原，如炭疽保护性抗原和其他炭疽菌抗原组分；立克次氏体(rickettsiae)细菌抗原，如romps和其他立克次氏体细菌抗原组分。本文所述的细菌抗原还包括任意的其他细菌，如分枝杆菌、支原体、立克次氏体或衣原体抗原。

3.真菌抗原

可以用于本发明组合物和方法的真菌抗原包括但不局限于：假丝酵母真菌抗原组分；组织胞浆菌真菌抗原，如热激蛋白60(HSP60)和其他组织胞浆菌真菌抗原组分；隐球菌真菌抗原，如被膜多糖和其他隐球菌真菌抗原组分；球霉菌真菌抗原，如小球体抗原和其他球霉菌真菌抗原组分；和癣真菌抗原，如发癣菌素和其他癣真菌抗原组分。

4.寄生虫抗原

原生动物和其他寄生虫的例子包括但不局限于恶性疟原虫抗原，如裂殖子表面抗原、孢子体表面抗原、环孢子(circumsporozoite)抗原、配子细胞/配子表面抗原、血液阶段抗原pfl55/RESA和其他疟原虫抗原组分；弓形体抗原，如SAG、p30和其他弓形体抗原组分；血吸虫抗原，如谷胱甘肽-S-转移酶、副肌球蛋白和其他血吸虫抗原组分；利什曼原虫主要抗原和其他利什曼原虫抗原，如gp63、磷脂聚糖和其相关蛋白和其他利什曼原虫抗原组分；以及克氏锥虫抗原，如75-77kDa抗原、56kDa抗原和其他锥虫抗原组分。

5.肿瘤抗原

可以用于本发明组合物和方法的肿瘤抗原包括但不局限于：端粒酶组分；多药耐药性蛋白，如P糖蛋白；MAGE-1、α胎蛋白、癌胚抗原、突变p53、B细胞来源的恶性肿瘤的免疫球蛋白、由染色体转位并置的基因所表达的融合多肽、人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotrpin)、降钙素、酪氨酸酶、乳头瘤病毒抗原、黑素瘤或其他肿瘤细胞中含神经节苷脂或其他碳水化合物的的组分。本发明认为来自任意类型肿瘤细胞的抗原都可用于本文所述的组合物和方法。

6.与自身免疫性相关的抗原

参与自身免疫病、过敏和移植物排斥的抗原可以用于本发明的组合物和方法。举例来说，参与下列一种或多种自身免疫病或病症的抗原可以用于本发明：糖尿病、关节炎(包括类风湿性关节炎、少年性风湿性关节炎、骨关节炎、牛皮癣性关节炎)、多发性硬化、重症肌无力、系统性红斑狼疮、自身免疫性甲状腺炎、皮炎(包括局部皮炎和湿疹性皮炎)、牛皮癣、Sjogren’s综合征，包括Sjogren’s综合征继发的角膜结膜炎、斑秃、由节肢动物叮咬反应引起的过敏反应、节段性回肠炎、口疮溃疡、虹膜炎、结膜炎、角膜结膜炎、溃疡性结肠炎、哮喘、过敏性哮喘、皮肤红斑狼疮、硬皮病、阴道炎、直肠炎、药疹、麻风逆转反应、麻风结节性红斑、自身免疫性葡萄膜炎、过敏性脑脊髓炎、急性坏死出血性脑病、先天性两侧进行性感觉神经性失聪、再生障碍性贫血、纯红细胞贫血、先天性血小板减少症、多软骨炎、Wegener肉芽肿病、慢性活跃的肝炎、斯蒂文斯-约翰逊综合症、先天性口炎性腹泻、扁平苔癣、节段性回肠炎、Graves眼病、结节病、原发的胆汁性肝硬变、后葡萄膜炎、间质性肺纤维化。参与自身免疫病的抗原的例子包括谷氨酸脱羧酶65(GAD65)、天然DNA、髓磷脂碱性蛋白、髓磷脂蛋白脂质蛋白、乙酰胆碱受体组分、甲状腺球蛋白和甲状腺刺激激素(TSH)受体。参与过敏的抗原的例子包括花粉抗原，如日本雪松花粉抗原、豚草花粉抗原、黑麦花粉抗原；动物来源的抗原，如粉螨抗原和猫抗原；组织相容性抗原、青霉素和其他治疗性药物。参与移植物排斥的抗原的例子包括要移植到移植物受体中的移植物抗原性组分，如心脏、肺、肝脏、胰脏、肾脏和神经移植物组分。抗原还可以是用于治疗自身免疫病的改变的肽配体。

可以用于本发明的组合物和方法的各种抗原的例子包括内源性激素，如促黄体形成激素、滤泡刺激激素、睾酮、生长激素、催乳素和其他激素，药瘾，如咖啡因和海洛因，以及抗原受体的个体基因型(idiotypic)片段，如含部分抗凝集素受体抗体的Fab。

确定多功能分子与承抗原靶位或APC的结合

用于检测蛋白质-蛋白质结合，即本发明的多功能分子与承抗原靶位和APC之一或二者结合的多种技术是本领域技术人员所公知的。

例如，可以通过荧光共振能量转移(FRET)来测定多功能分子和承抗原靶位和/或APC之间的结合，其中一种肽(即多功能分子)含有荧光标记部分，承抗原靶位或APC带有第二种这样的部分，在合适的波长激发时会导致一种标记物对光子的吸收，随后经过FRET，以第二种荧光团特征性的第二波长发射，测定这种发射，其对应于和多功能分子结合的承抗原靶位或APC的量。或者，以下列全面描述的其他许多方式测定这种结合。

“荧光标记物”或“荧光基团”指荧光团或荧光蛋白或其荧光片段，或指荧光氨基酸，如可以掺入到多肽中的色氨酸。“荧光蛋白”指用适当的电磁辐射激发时能发射荧光的任意蛋白质。这种蛋白质包括氨基酸序列是天然的或人工加工的氨基酸序列。

还优选的是，荧光团包含荧光素和四甲基若丹明或另一种合适的配对。在另一个优选的实施方案中，标记物包含两种不同的荧光蛋白。优选的是，荧光蛋白包括选自绿色荧光蛋白(GFP)、蓝色荧光蛋白、红色荧光蛋白和其他人工加工形式的GFP的任意蛋白质。

优选的是，多肽含有半胱氨酸氨基酸，通过该氨基酸，标记物由共价键结合。更优选的是，标记物可以通过伯胺基团如通过赖氨酸残基结合。对本领域技术人员显而易见的是，对于标记和固定本发明的多肽来说，优选避免使用相同的化学方式。例如，如果多肽通过半胱氨酸固定，则标记物可以有利地通过赖氨酸残基结合。

优选的是，通过荧光共振能量转移(FRET)、荧光各向异性或荧光相关分光镜进行测定，或通过测定荧光伴侣多肽与固化多肽的结合来进行测定。进行这种测定的技术是本领域技术人员所熟知的。

优选的是，荧光发射包括两种不同的荧光团，尤其优选的是，荧光团包含荧光素和四甲基若丹明或另一种合适的配对。

如本文所用的，术语用于FRET的荧光标记物的“合适组合”指报道标记物的一种选择，以使一种标记物(“供体”部分)的发射波长谱在另一种标记物(“受体”部分)的激发波长谱内。

不使用标记物的检测方法是本领域共知的。这些方法包括使用表面等离子体激光共振检测如多功能分子质量变化的检测法，如果伴侣多肽的结合增加或减少，则会发生这种变化。例如，可以使用BIACORE仪器进行这种测定。在该实施例中，在多功能分子与承抗原部分和/或APC接触之前，将多功能分子固定在固体支持物上。

除了上述方法，检测本发明的多功能分子与承抗原部分和/或APC的结合的一种技术涉及使用对多功能分子特异的抗体。简言之，例如，将承抗原细胞与本发明的多功能分子在RPMI1640中或其他合适缓冲液中与37℃摇培1-4小时。然后将细胞在含2％FBS或其他细胞培养血清的PBS中洗涤。接着将承抗原细胞与例如FITC标记的抗多功能分子抗体于4℃一起孵育1小时。在PBS中再次洗涤后，通过流式细胞术分析细胞，其中标记细胞的鉴定指示为本发明的多功能分子与承抗原细胞的结合。

制备含根据本发明的重组核酸的细胞

在本发明的一个实施方案中，将编码本发明多功能分子的核酸分子导入能表达该核酸分子的宿主细胞中，以使之生成多功能分子。在一个实施方案中，使宿主细胞离体表达核酸。在一个替代实施方案中，宿主细胞转染编码多功能分子的核酸分子，然后将之重新置于获得宿主细胞的宿主动物中，其中多功能多肽分子在宿主动物中进行体内表达。

如本文教导，宿主细胞通过本领域中的传统方法转染。转化或转染宿主细胞的适当方法可以查阅Sambrook et a1.(Molecular Cloning：A Laboratory Manua1，2ndEdition，Cold Spring Harbor Laboratory press(1989)和其他实验室指南。下面描述了导入编码多功能分子的核酸分子的其他方法。含编码如多功能分子和/或抗原的、待导入的核酸分子的细胞自身可以根据本发明的方法，如在疫苗组合物中施用于患者(和抗原一样)。

A.将无保护的核酸导入细胞

1.DEAE-葡聚糖介导的转染：可以通过形成核酸和DEAE-葡聚糖的混合物并将混合物与细胞孵育，将无保护的核酸导入细胞。可以加入二甲基亚砜或氯喹激发步骤，以增加吸收的核酸量。DEAE-葡聚糖转染只适用于体外改造细胞，可以用于将核酸瞬时导入细胞中，但对于产生稳定转染的细胞来说不是优选的。因此，该方法可用于短期生成基因产物，但不是长期生成基因产物的方法选项。DEAE-葡聚糖介导的转染方案可以查阅Current Protocols in Molecular Biology，Ausube1，F.M.eta1.(e′s.)GreenePublishing Associates，(1989)，Section9.2和Molecular Cloning：A Laboratory Manua1. 2nd Edition.Sambrook et a1.Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)，Sections16.41-16.46，或其他常规的实验室指南。

2.电穿孔：也可以通过使细胞和核酸在合适的缓冲液中一起孵育、使细胞经受高电压电脉冲，将无保护的核酸导入细胞。通过电穿孔将核酸导入细胞的效率受应用电场强度、电脉冲时间长度、温度、核酸的构象和浓度与培养基的离子组成的影响。可以使用电穿孔进行各种细胞类型的稳定(或瞬时)转染，仅适用于细胞的体外改造。电穿孔细胞的方案可以查阅Current ProtocolsinMolecular Biology，Ausube1，F.M.et a1.(e′s.)Greene Publishing Associates，(1989)，Section9.3和Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2nd Edition，Sambrook et a1.Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)，Sections16.54-16.55，或其他常规的实验室指南。

3.脂质体介导的转染(“脂转染”)：可以通过将核酸与含阳离子脂质的脂质体悬液混合，将无保护的核酸导入细胞。然后将核酸/脂质体复合物与细胞一起孵育。可以使用脂质体介导的转染稳定(或瞬时)转染体外培养物中的细胞。方案可以查阅Current ProtocolsinMolecular Biology，Ausube1，F.M.et a1.(e′s.)Greene PublishingAssociates，(1989)，Section9.4和其他常规的实验室指南。此外，已经利用脂质体实现了体内基因递送。例如参见Nicolau et a1.(1987)Meth.Enz.149：157-176；Wang andHuang(1987)Proc.Nat1.Acad Sci.USA84：7851-785S；Brigham et al.(1989)Am.J.Med.Sci.298：278；和Gould-Fogerite et a1.(1989)Gene84：429-438。

4.直接注射：可以通过将核酸直接注射到细胞中，将无保护的核酸导入细胞。对于细胞的体外培养物来说，可以通过微注射导入核酸。由于每个细胞单独进行微注射，当改造大量细胞时该方法非常费力。但是，微注射是产生转基因动物的精选方法(下文将更详细描述)。在这种情况下，核酸稳定导入到受精卵母细胞中，然后使受精卵母细胞在动物体内发育。所得的动物具有携带导入到卵细胞中的核酸的细胞。直接注射已经用于将无保护的核酸导入体内细胞(例如参见Acsadi et a1.(1991)Nature332：815-818；Wolf et a1.(1990)Science247：1465-1468)。可以使用将DNA导入体内细胞的递送装置(如“基因枪”)。这种装置可以通过商业途径获得(如从BioRad获得)。

5.受体介导的DNA吸收：还可以通过使核酸和与细胞表面受体的配体偶联的阳离子如聚赖氨酸复合，将无保护的核酸导入细胞中(例如参见Wu，G.and Wu，C.H.(1988)J.Bio1.Chem263：14621；Wilson et a1.(1992)J.Bio1.Chem.267：963-967；和U.S.专利No.5,166,320)。核酸配体复合物与受体的结合促进受体介导的内吞作用对核酸的吸收。核酸-配体复合物靶向的受体包括转铁蛋白受体和唾液酸糖蛋白受体。可以使用与天然破坏核内体的腺病毒衣壳连接、从而将材料释放到胞浆中的核酸-配体复合物，以避免细胞内溶酶体对复合物的降解(例如参见Curiel et a1.(1991)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA88：8850；Cristiano et a1.(1993)Proc.Nat1.Acad.Sci USA90：2122-2126)。受体介导的核酸吸收可以用于将核酸体外或体内导入细胞，此外，其还具有其他特征，即通过使用与目标靶细胞上选择性表达的受体结合的配体，可以将核酸选择性地靶向到特定的细胞类型中。

通常，当无保护的核酸导入到培养物中的细胞时(例如通过上述的一种转染技术)，通常只有一少部分细胞(105个中约1个)将转染的核酸整合到其基因组中(即核酸以附加体形式存在于细胞中)。因此，为了鉴别吸收外源核酸的细胞，有利的是，将编码选择标记的核酸和目的核酸一起转染到细胞中。优选的选择标记包括赋予药物抗性如G418、潮霉素和氨甲蝶呤抗性的选择标记。作为可替代方案，选择标记可以是表达时能发出可检测信号如绿色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白的一种选择标记。选择标记可以在目的基因的同一质粒上导入，也可以在相分离的质粒上导入。

B.病毒介导的基因转移

将编码基因产物的核酸导入细胞的优选方法是使用含编码基因产物的核酸，如cDNA。用病毒载体感染细胞具有优点，即很大比例的细胞都接受核酸，可以避免选择接受核酸的细胞的需要。此外，病毒载体内所编码的分子，如病毒载体包含的cDNA所编码的分子在接受病毒载体核酸的细胞中有效表达，病毒载体系统可以体外使用，也可以体内使用。

1.逆转录病毒：缺陷型逆转录病毒在基因治疗目的的基因转移中的应用是研究透彻的(参见Mi1ler，A.D.(1990)Blood76：271的评论)。可以构建逆转录病毒基因组中插入有编码目的基因产物的核酸的重组逆转录病毒。此外，可以除去部分逆转录病毒基因组，以使逆转录病毒是复制缺陷型的。然后将复制缺陷型逆转录病毒包装到毒粒中，可以通过常规技术使用辅助病毒将所述毒粒用于感染靶细胞。产生重组逆转录病毒和用这种病毒体外或体内感染细胞的方案可以查阅Current Protocols inMolecular Biology.Ausube1，F.M.et a1.(eds.)Greene Publishing Associates，(1989)，Sections9.10-9.14和其他常规实验室指南。合适逆转录病毒的例子包括本领域技术人员所公知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合适包装病毒株系的例子包括

Figure S03824201X20070530D00119160943QIETU

Figure S03824201X20070530D00119160947QIETU

_2和_Am。逆转录病毒已经用于将各种基因在体外或体内导入到许多不同的细胞类型中，包括上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞、成肌细胞、肝细胞、骨髓细胞(例如参见Eglitis，et a1.(1985)Science230：1395-1398；Danos and Mu1ligan(1988)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA85：6460-6464；Wilson et a1.(1988)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA85：3014-3018；Armentano eta1.(1990)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA87：6141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA88：8039-8043；Ferry et a1.(1991)Proc.Nat1.Acad Sci.USA88：8377-8381；Chowdhury et a1.(1991)Science254：1802-1805；van Beusechem et a1.(1992)Proc.Nat1.Acad Sci.USA89：7640-7644；Kay et a1.(1992)Human Gene Therapy3：641-647；Dai eta1.(1992)Proc.Nat1.AcadSci.USA89：10892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.150：4104-115；美国专利No.4,868,116；美国专利No.4,980,286；PCT申请WO89/07136；PCT申请WO89/02468；PCT申请WO89/05345和PCT申请WO92/07573)。逆转录病毒载体需要靶细胞分裂，以使逆转录病毒基因组(和插入其中的外源核酸)整合到宿主基因组中，以将核酸稳定导入细胞中。因此，需要刺激靶细胞的复制。

2.腺病毒：可以对腺病毒基因组进行人工操作，以使之编码并表达目的基因产物，但其在正常裂解性病毒生命周期中复制的能力是灭活的。例如参见Berkner et a1.(1988)BioTechniques6：616；Rosenfeld et al.(1991)Science252：431-434；和Rosenfeldet a1.(1992)Ce1168：143-155。来自腺病毒株Ad型5d1324或其他腺病毒株(如Adz、Ad3、Ad7等)的合适腺病毒载体是本领域技术人员公知的。重组腺病毒载体的优点在于：它们作为有效的基因递送载体不需要分裂的细胞，可以用于感染各种细胞类型，包括导气管上皮细胞(Rosenfeld et a1.(1992)，同上)、内皮细胞(Lemarchand et a1.(1992)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA89：6482-6486)、肝细胞(Herz and Gerard(1993)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA90：2812-2816)和肌细胞(Quantin et a1.(1992)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA89：2581-2584)。另外，导入的腺病毒核酸(和包含在其中的外源DNA)不整合到宿主细胞的基因组中，而是保留为附加体，因而避免了导入的核酸整合到宿主基因组(如逆转录病毒DNA)时插入诱变所导致的潜在问题。此外，腺病毒基因组对外源DNA的运载能力与其他基因递送载体(Berkner et al.同上；Haj-Ahmand andGraham(1986)J.Virol.57：267)相比较大(最高为8kb)。目前所用的多数复制缺陷型腺病毒载体都缺失所有或部分的病毒E1和E3基因，而保留有多达80％的腺病毒遗传物质。

3.腺相关病毒：腺相关病毒(AAV)是一种天然发生的缺陷型病毒，其需要另一种病毒如腺病毒或疱疹病毒作为辅助病毒，以进行有效复制和完成繁殖生命周期(参见Muzyczka et a1.Curr.TopicsinMicro.and Immunol.(1992)158：97-129的评论)。它还是能够将DNA整合到非分裂细胞中且表现出高效稳定整合的几种病毒之一(例如参见Flotte et a1.(1992)Am.J.Respir.Ce11.Mol.Biol.7：349-356；Samulski et a1.(1989)J.Viro1.63：3822-3828；and McLaughlin et a1.(1989)J.Viro162：1963-1973)。含AAV中少至300个碱基的载体可以包装和整合。外源核酸的空间限制在约4.5kb。可以使用诸如Tratschin et a1.(1985)Mo1.Ce11.Bio1.5：3251-3260中描述的AAV载体将核酸导入细胞。已经使用AAV载体将各种核酸导入不同的细胞类型(例如参见Hermonat eta1.(1984)Proc.Nat1.Acad.Sci.USA81：6466-6470；Tratschin et a1.(1985)Mol.Ce11.Bio1.4：2072-2081；Wondisford et a1.(1988)Mo1.Endocrinol.2：32-39；Tratschin et a1.(1984)J.Virol.51：611-619；和Flotte et a1.(1993)J.Bio1.Chem.268：3781-3790)。

可以通过本领域中所用的常规方法来评价特定表达系统和将核酸导入细胞的方法的效率。例如，可以通过滤膜杂交技术(如Southern印迹)检测导入细胞的核酸，使用Northern印迹、RNase保护或逆转录酶-聚合酶链式反应(RI-PCR)检测所导入核酸转录生成的RNA。可以通过适当的分析来检测基因产物，如通过用特异性抗体对所生成蛋白质进行免疫检测，或通过功能分析检测基因产物的功能活性，如通过酶分析。如果细胞表达的目的基因产物不易进行分析，还可以使用与所用调控元件及载体相连的报道基因首先对表达系统进行优化。报道基因编码易于检测的基因产物，因此可以用于评价系统的效率。用在本领域中的常规报道基因包括编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、荧光素酶和人生长激素的基因。

根据本发明有用的细胞

本发明提供转染有编码本发明多功能分子的核酸构建体的宿主细胞。根据本发明有用的宿主细胞包括但不局限于下列宿主细胞。

宿主细胞可以是能够充当根据本发明的抗原携带者的任意细胞，因此可以是能够人工导入核酸的有核细胞或原核细胞。根据本发明有用的原核细胞包括细菌细胞。根据本发明有用的真核(有核)细胞包括酵母、真菌的细胞、寄生虫细胞和哺乳动物细胞。根据本发明有用的哺乳动物细胞包括但不局限于成纤维细胞，包括特化的间质细胞，如滑膜细胞、角化细胞、上皮细胞、内皮细胞、白细胞和肿瘤细胞。

根据本发明有用的细胞系包括但不局限于B16、CMS-5、纤维肉瘤细胞、Cos1细胞和CHO细胞、TS/A、Lewis肺癌、RENCA、Dunning大鼠前列腺癌，和美国典型培养物收藏中心(Manassas，VA)目录中包括的细胞系。

可以根据本发明，从致病细胞制备含有编码本发明多功能分子的核酸分子的宿主细胞。致病细胞包括肿瘤细胞(如B16细胞、CMS-5纤维肉瘤细胞和标题为“适用于本发明的肿瘤”一节中包括的肿瘤的细胞)，和来自致病性细菌、致病性真菌、致病性病毒、致病性寄生虫或致病性节肢动物的细胞。

检测从人工导入的重组核酸序列的表达的方法

本发明提供了检测从已经人工导入到细胞中的重组核酸分子表达的蛋白质(如多功能分子)的方法。

制备抗体

对根据本发明有用的蛋白质(如多功能分子)特异的抗体可用于蛋白质纯化，用于检测这些蛋白质从细胞的表达，所述细胞已经人工导入表达这些蛋白质的重组核酸分子。我们所用的抗体包括使用这种抗体的结合(可变)区的构建体和其他抗体修饰。因此，本发明中有用的抗体可以包含完整的抗体、抗体片段、多功能抗体聚集体，或一般来讲包含抗体中一个或多个特异性结合位点的物质。抗体片段可以是诸如Fv、Fab或F(ab’)₂片段或其衍生物的片段，如单链Fv片段。抗体或抗体片段可以是非重组的、重组的或人源化的。抗体可以是免疫球蛋白同工型，如IgG、IgM等。此外，适当时也可以使用免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物、衍生物或偶联物。

虽然用于生成抗体的根据本发明的蛋白质(如根据本发明的多功能分子)的蛋白产物(或其片段或寡聚肽)不需要具有生物活性，但其必须具有抗原性。抗体可以针对本发明的多功能分子的任意部分。例如，抗体可以针对多功能分子的凝集素(1ecting)部分，或针对多功能分子的配体部分。用于诱导特异性抗体的肽可以具有由至少5个氨基酸、优选至少10个氨基酸组成的氨基酸序列。优选的是，它们应该和天然蛋白质的区域相同，可以含有小的天然存在分子的全部氨基酸序列。与编码根据本发明有用的蛋白质(如根据本发明的多功能分子)的重组核酸蛋白质产物相对应的短氨基酸段可以和来自另一种蛋白质如钥孔嘁血蓝蛋白或GST的氨基酸相融合，产生对抗嵌合分子的抗体。可以使用本领域中公知的步骤生成针对本发明重组核酸的蛋白质产物的抗体。

对于生成抗体来说，可以通过注射编码根据本发明有用的蛋白质的重组核酸分子的蛋白质产物(或保留有免疫原性特征的其任意部分、片段或寡核苷酸)，免疫包括山羊、兔、大鼠、小鼠等的各种宿主。根据宿主物种，可以使用各种佐剂来增加免疫应答。这种佐剂包括但不局限于弗氏佐剂、矿物胶如氢氧化铝，和表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇(pluronic polyols)、聚阴离子、肽、油乳化剂、钥孔嘁血蓝蛋白和二硝基酚。BCG(卡介苗)和小棒状杆菌可有效地用作人佐剂。

1.多克隆抗体

抗原蛋白可以和传统的载体偶联，以增加其免疫原性，产生针对肽-载体偶联物的抗血清。可以如文献所述进行肽与载体蛋白的偶联和免疫(Dymecki et a1.，1992，J.Bio1.Chem.，267：4815)。通过ELISA(下文)，或通过点或斑点印迹(Boersma and VanLeeuwen，1994，J.Neurosci.Methods，51：317)测定血清抗蛋白抗原的滴度。同时，抗血清可以用在如文献所述制备的组织切片中。有用的血清将通过ELISA和适当的肽发生强烈的反应，例如按照Green et a1.，1982，Ce1l，28：477的程序。

2.单克隆抗体

制备单克隆抗体的技术是公知的，可以使用候选抗原(如水平待测定的、或要灭活或亲和纯化的、优选与载体结合的多特异性分子或凝集素，如Arnheiter et a1.，1981，Nature，294；278所述)来制备单克隆抗体。

单克隆抗体通常从杂交瘤组织培养物获得，或从导入了杂交瘤组织的动物的腹水液体获得。

可以筛选生成单克隆抗体的杂交瘤(或多克隆血清)，获得与靶蛋白相结合的抗体。

3.抗体检测方法

特别优选的免疫测试依赖于单克隆抗体或多克隆抗体的使用，包括酶联免疫分析(ELISA)、免疫印迹和免疫沉淀(参见Vo1ler，1978，Diagnostic Horizons，2：1，Microbiological Associates Quarterly Publication，Wa1kersvi1le，MD；Vo1ler et a1.，1978，J. Clin.Patho1.，31：507；U.S.Reissue Pat.No.31,006；UK Patent2,019,408；Butler，198l，Methods Enzymo1.，73：482；Maggio，E.(ed.)，1980，Enzyme Immunoassay，CRC Press，Boca Raton，FL)或放免分析(RIA)(Weintraub，B.，Principles of radioimmunoassays，Seventh Training Couse on Radioligand Assay Techniques，The Endocrine Society，March1986，pp.1-5，46-49and68-78)。为了分析组织中编码根据本发明有用的蛋白质(如多功能分子或其部分)的重组核酸所产生的蛋白质的存在与否，可以使用免疫组化技术。对于本领域技术人员显而易见的是：必须对抗体分子进行标记，以便于对靶蛋白进行分析。标记抗体分子的技术是本领域技术人员公知的(参见Harlow and Lane，1989，Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory)。

确定免疫应答是否根据本发明得到调节

本文所述的多功能分子根据本发明可用于调节哺乳动物，优选人体体内对承抗原靶位中所包含的一种或多种抗原的免疫应答，所述的承抗原靶位与多功能分子的凝集素部分结合。在一个实施方案中，将包含与承抗原靶位相结合的多功能分子的组合物施用于动物，优选人类。包含APC上细胞表面分子配体的多功能分子的第二部分将组合物靶向到已经施用了组合物的动物中的抗原呈递细胞。承抗原靶位为抗原呈递细胞吸收(即摄入或吞噬)。或者，在能够发生吞噬的条件下使多功能分子/承抗原靶位复合物与抗原呈递细胞在体外相接触，其中APC再返回到它们所源自的宿主有机体。

因此，本发明提供了调节哺乳动物体内免疫应答的方法，包括向哺乳动物施用包括本文所述的至少一种多功能分子的组合物。在一个实施方案中，组合物还包含承抗原靶位。在另一个实施方案中，组合物还包含APC。

“免疫应答”指涉及免疫系统的选定应答的刺激/活化，或选定应答的抑制、消除或中和。在一个优选的实施方案中，免疫应答指涉及免疫系统的选定应答与非CD40配体增强的细胞相比刺激/活化至少5％，或优选5-50％，或更优选50-100％，或至少100％或更多，或者选定应答抑制、消除或中和至少5％，或优选5-50％，或更优选50-100％，或至少100％或更多。因此，调节免疫应答指所需应答与承抗原靶位与APC在不存在多功能分子的条件下接触时相比更有效，更快，量更大和/或更易于诱导。可以差异调节患者体内的不同免疫应答，如可以选择性增强细胞免疫应答，而选择性中和体液免疫应答，反之亦然。

下述的体外和体内分析可以用于确定免疫应答是否根据本发明得以调节。下文详细描述的分析方法测定对抗原的细胞或体液免疫应答的刺激或抑制。下述分析中的抗原是代表性的。对本领域技术人员显而易见的是：可以改变分析方法使之适用于根据本发明有用的选定抗原，使用一种或多种下述分析测定对该抗原的免疫应答。

I.检测吞噬作用增加

使用下述分析方法来确定调理素增强的细胞是否刺激抗原呈递细胞的吞噬作用。

使用37℃下在不加FCS的RPMI中贴壁30min的单核细胞来检验吞噬作用。将绵羊红细胞与调理素或其前体在一定条件下孵育，以使平均不超过300个的这种分子沉积在每个红细胞上。如果使用的是前体，则对包覆的红细胞进行加工，使所有的前体都转化为真正的候选分子(例如参见Carlo et a1.，J.Immuno1.123：523-8(1979))。从受试者体内分离新鲜的单核细胞，将5×10⁴-1×10⁵的这种细胞悬浮于0.25-0.5m1含1％BSA的RPMI培养基中。将该小份样品置于组织培养孔中，于37℃孵育30min。将以1.2×10⁸细胞/ml悬浮的过量包覆的红细胞覆盖到单核细胞上，将板以50g离心5min，并于37℃孵育30min。在使用冰冷裂解缓冲液的两个低渗裂解步骤中除去未摄入的材料，然后对贴壁细胞进行固定和染色，在光学显微镜下对细胞进行检验。通过确定100个单核细胞中摄入一个或多个靶细胞的百分比对吞噬作用进行定量，记录每100个单核细胞摄入红细胞的总数(PI)。根据本发明的对吞噬作用的刺激表示为等于或大于40的致病指数。

另一种吞噬作用分析如下：收获鼠巨噬细胞系的细胞，以4×10⁵/m1悬浮于DMEM-10中。将2.0m1的该悬液分加到各3.5cm细胞培养板中，将板在37℃下于5％CO₂中孵育过夜。和巨噬细胞同一天收获靶细胞和对照细胞，在PBS中洗涤，以5×10⁶细胞/ml重悬于PKH26染料(1m1所供稀释剂中的2μM溶液)中2min。荧光PKH26染料在激发时在红色光谱内发射，而用于巨噬细胞的FITC标记物在绿色光谱内发射。PKH26在巨噬细胞的核内体/溶酶体区室中稳定。用PBS将染色的靶细胞洗涤3次，培养过夜，使PKH26浸出到培养基中。这使分析过程中的染料外漏最小化。第二天收获靶细胞，用PBS洗涤3次，以5×10⁵/m1重悬于无血清的DMEM中。用PBS在培养板上剧烈漂洗吞噬细胞，以除去血清，往每个板中加入2m1靶细胞。0、2、4或8h后，将板用PBS洗3次，以除去未贴壁的细胞，将剩余的细胞与2mMEDTA一起孵育，以使这些细胞从板上释放。将释放的细胞用1％FBS/PBS洗，悬浮于100μ1相同的缓冲液中。加入2μg抗吞噬细胞(如抗CR3)抗体，将细胞置于冰上25min。将细胞用1％FBS/PBS洗3次，重悬于100μl的该溶液中，在冰上用1:25FITC偶联的二级IgG稀释液染色25min。将细胞洗3次，重悬于500μ1的1％FBS/PBS中，然后使用Ce1lQuest软件在Becton Dickinson FACScan上进行分析。

使用FL-1(绿色)荧光来控制(gate)吞噬细胞。然后测定反应PKH26标记的靶细胞内化的这些细胞的FL-2(红色)荧光。调理素诱导的吞噬作用表示为与包覆调理素的靶细胞一起孵育的巨噬细胞的平均FL-2荧光和与未包覆调理素的靶细胞一起孵育的巨噬细胞的平均FL-2荧光之间的差。使用调理素将平均FL-2荧光增加至少10％或足够多，以获得通过学生t检验小于或等于0.05的p值。

II.免疫应答的扩增通常涉及正常呈静息态的类淋巴细胞特定亚群的增殖

增殖分析在临床研究中具有下列应用：(1)评价表现为对多克隆增殖信号如分裂原或抗CD3抗体的应答能力的T细胞或B细胞的总体免疫活性。增殖缺陷指示为基本细胞免疫缺陷。低增殖经常发现是慢性疾病的非特异性继发效应。(2)评价个体对特定抗原的应答，其中低应答指示为普遍的或特异性的免疫缺陷。(3)通过混合淋巴细胞反应(MLR)测定MHC相容性。

此外，增殖分析可用于评估T或B细胞的淋巴因子生成，研究信号传导，评价生长因子需求(如淋巴因子)。本文所概括的程序测定[³H]胸苷向DNA的掺入，其经常和通过细胞数目变化测定的细胞生长密切相关。但是，当活化刺激剂有毒时，化学活化因子如离子霉素和十四烷酰佛波醇乙酯就是这种情况，活化后新DNA合成的爆发不伴随有活细胞的净增加，事实上可观察到细胞数目的减少。在这种情况下，DNA中[³H]胸苷的掺入指示为初始细胞刺激，而非细胞数目的评估。此外，[³H]胸苷的掺入提供了有关细胞群体的信息，而非单个细胞的信息。可以将其他方法，如流式细胞术用于需要这类信息的研究。

分析抗原诱导的T细胞增殖

设计该方案以测试T细胞对特定抗原-破伤风类毒素应答下的增殖。可以对其改进，以测试T细胞对任意蛋白质或多糖抗原应答下的增殖。材料：(T细胞悬液，自体同源的抗原呈递细胞悬液(非T细胞)、破伤风类毒素溶液(Connaught或StateLaboratory Institute ofMassachusetts)。(1)对T细胞计数，并用完全RPMI-10AB调整至1×10⁶细胞/m1。(2)如单向MLR方案的步骤2所述，用丝裂霉素C(或用2500rad照射)处理抗原呈递细胞。调整抗原呈递细胞的浓度至2×10⁵细胞/m1。抗原呈递细胞可以由自体同源性非T细胞或自体同源性单核细胞/巨噬细胞组成。(3)将100μ1T细胞悬液和50μ1抗原呈递细胞群加入到孔中；分配前混合。(4)加入50μl破伤风类毒素，使终浓度为0、1、5、10和20μg/ml。每次稀释制备3个孔。(5)在湿润的37℃、5％CO₂孵箱中孵育6天。(6)用[³H]胸苷脉冲，如支持方案中所述收获。分析淋巴因子依赖的细胞增殖

该方案分析淋巴因子依赖的淋巴细胞群增殖。这里是IL4依赖的B细胞增殖。材料：(扁桃体B细胞悬液、与琼脂糖珠粒交联的抗IgM抗体(Bio-Rad)、完全RPMI-10中的10,000U/ml人Ri1-4(Genzyme))。(1)对扁桃体B细胞计数，并用完全RPMI-10调整至1×10⁶细胞/m1。(2)将100μ1扁桃体B细胞分到每个孔中。每个实验条件制备3个孔。(3)1:10、1:100和1:1000稀释10,000U/ml rIL-4溶液。将20μ1贮液或稀释液加入到合适的孔中，产生1000U/m1、100U/ml、10U/m1和1U/ml。包括不加rIL-4的对照孔。(4)将抗IgM珠粒吸到合适的孔中。

用小试实验确定珠粒的最佳浓度。最好每个实验中包括多个珠粒浓度，以“分出”最佳剂量。单独用扁桃体B细胞和IL-4稀释液、单独用抗IgM珠粒、单独用培养基和IL-4与抗IgM珠粒稀释液的所有组合制备孔。(5)必要的话，用完全RPMI-10将每孔的体积增加至200μl。(6)在湿润的37C、5％CO₂孵箱中培养5天。(7)用[³H]胸苷脉冲，如支持方案中所述收获。

[³H]胸苷脉冲和细胞培养物的收获

该方案和前述方案联用，以进行[³H]胸苷掺入分析。(1)在终止培养之前的固定时间(通常6或18hr)，将200μ150μCi/m1的[³H]胸苷加入到每种培养物中(1.0μCi)。(2)使用能吸出细胞、裂解细胞并将DNA转移到滤纸的自动多孔收集器收获细胞培养物，使未掺入的[³H]胸苷洗去。填充并吸出每排微滴定10次，以保证完全的细胞转移和完全的未掺入胸苷的去除。用100％乙醇洗涤每个滤条，以促进干燥。转移到液闪瓶中。对于半自动的收集器来说，将每个孔的滤纸斑点转移到液闪计数瓶中。对于人工转移来说，在灯下将滤纸干燥，并用镊子转移到液闪瓶中。向每个瓶中加入闪烁液。(3)在液闪计数仪上对样品进行计数，直到标准偏差小于2％。对每种背景培养物和每个实验条件计算平均cpm。在重复培养物中应该有小于20％的变化。

III.诱导和测定体外抗体应答

人免疫系统在体内免疫蛋白或多糖抗原之后启动抗体应答的能力是说明免疫系统中B细胞和T细胞臂(arm)总体完整性的指标。体内免疫后抗体应答的测定是对各种获得性和先天性免疫缺陷和影响免疫系统的其他条件下宿主中免疫功能的合适测试。下列步骤用于体内免疫，利用ELISA技术测定随后的免疫应答。

使用NIP-和HRPO-标记的抗体对细胞因子进行免疫-酶法分析

本方案描述了使用异源、非竞争性免疫分析反应对细胞因子进行的免疫酶法分析，其中细胞因子借助与微滴定板结合的包被抗体固定。未结合的材料洗去，使用半抗原硝基碘苯酚(NIP)标记的不同抗细胞因子抗体进行检测。通过抗NIP抗体的辣根过氧化物酶(HRPO)偶联物检测NIP，用显色底物ABTS显示。在该非竞争性的免疫分析中，免疫分析信号(A₄₀₅)作为样品中存在的细胞因子量的正函数增加。如Current Protocols in Immunology，1995，6.20.2-6.20.10中所述制备抗体。

包被分析板.(1)使用多道移液器，将100μ1包被抗体的合适稀释液转移到要使用的分析板的所有孔中。(2)用微滴定板密封胶或石蜡封口膜将板密封，于37℃孵育2hr。在制备板中制备样品和标准品。(3)用等体积的免疫分析稀释剂稀释待分析的每个样品(或部分条件培养基)。(4)将小于或等于1m1各稀释度的待分析样品转移到单独的Spin-X微过滤装置的上部室中。以10,000rpm离心5min，保存下部室中收集的滤液。(5)将65μ1各稀释度的样品加入制备板(即单独的96-孔微滴定板)的合适孔中。(6)将部分细胞因子于室温下融化，并保证其充分混合。将130μ1吸到制备板的孔中，表示标准曲线上的最高浓度。从该孔中转移65μ1到下一孔中，然后在免疫分析稀释剂中继续进行系列1:1稀释，以使65μ1标准曲线上的各浓度置于制备板的合适孔中。(7)将部分校准液于室温下融化(如果使用的话)。用等体积的免疫分析稀释剂稀释，然后将65μ1稀释的校准液转移到制备板的一个或多个合适孔中。

与包被抗体孵育.(8)从孵箱中取出包被的分析板。浸到装有1×漂洗缓冲液的2-升烧杯中，然后颠倒过来向下拍打，以去除液体。再重复两次，然后在纸塔上重击干燥。(9)使用多道移液器，从制备板的每个孔中转移50μ1溶液到分析板的相应孔中。(10)用微滴定板密封胶或石蜡封口膜将板再次密封，并于室温下孵育21r。

与检测抗体孵育.(11)将NIP标记的、对目的细胞因子特异的检测抗体在检测缓冲液中稀释至1μg/m1。(12)如步骤8所述洗分析板。(13)将75μ1步骤11中的稀释检测抗体加入到分析板的所有孔中，包括不使用的外孔(wa1l)。(14)用微滴定板密封胶或石蜡封口膜将板再次密封，并于室温下孵育1hr。

与HRPO-偶联的抗NIP抗体孵育.(15)将HRPO-偶联的抗NIP Mab在检测缓冲液中以1:3000稀释。(16)如步骤8所述洗分析板。(17)将75μ1步骤15中的稀释的HRPO标记的抗NIP抗体加入到分析板的所有孔中。(18)用微滴定板密封胶或石蜡封口膜将板再次密封，并于室温下孵育1hr。

与显色底物孵育.(19)如步骤8所述洗分析板。(20)将100μlABTS底物工作溶液加入到分析板的所有孔中。将板覆盖，并于室温下孵育，直到显色到所需的水平(通常到含最高浓度标准品的孔A₄₀₅在1.5和2之间)。该方案通常产生可以在30-60min之后读数的分析。

读板和分析数据.(21)使用带有计算机界面的酶标仪，在405nm处以单波长模式测定所有孔中的光吸收，或在405和650nm处以双波长模式测定所有孔中的光吸收。(22)使用曲线拟合软件，将标准数据拟合到最低级(线性)、二级(二次)或四参数(非线性)数学函数所述的曲线上。(23)将未知细胞因子样品的光吸收数据插入到拟合的标准曲线上，计算细胞因子浓度。

IV.体外抗体应答的诱导提供评价免疫系统总体完整性的方法

在这里所示的方案中，白喉类毒素和破伤风类毒素用作代表性的蛋白抗原，肺炎球菌多糖用作代表性的多糖抗原，因为它们安全且易于得到。但是，应注意的是，由于过去的接种或天然接触，这些抗原刺激的应答可能是二次应答。为了获得初始应答，应该使用不常见的抗原，如钥孔嘁血蓝蛋白。

实际上，当通过肌肉内或皮下途径施用抗原时，“系统性”免疫应答得以诱导，测定循环抗体是最合适的。但是，有时评价“局部”或黏膜免疫应答也是有意义的。在该情况下，鼻内给抗原以刺激呼吸道淋巴组织，或口服抗原以刺激胃肠道淋巴组织，对支气管洗液或肠液进行抗体含量分析，而非对血液进行分析。此外，使用更适合刺激局部/黏膜应答的抗原(即用于呼吸应答的流感病毒抗原和用于胃肠道应答的霍乱毒素)。

在体内抗体应答的分析中，重要的是测定对蛋白质和多糖抗原的应答，因为这些抗原刺激免疫系统中的不同组分。从这一点上说，对蛋白抗原的主要抗体应答由IgG和IgG3亚类的抗体组成，而对多糖的主要抗体应答由IgG2亚类抗体组成。

已经使用各种免疫分析技术来测定体内免疫后所获得材料中的抗体应答。其中，ELISA分析可以是最有用的，因为它产生稳定的、易于测定的、可重复且安全的示值读数。

诱导对蛋白质/多糖抗原的体内抗体应答

在该方案中，通过肌肉内或皮下途径施用抗原，收集血清测定应答。(1)取预免疫的血样，使血凝固，通过离心将血清和血凝块分离。将血清在合适标号的塑料管中于-20℃至-70℃保存。(2)将0.5m1类毒素混合物注射到适当准备好的肌肉内部位(三角肌或大腿)，注意不要将材料静脉注射。(3)将0.5m1多价肺炎球菌疫苗注射到适当准备好的肌肉内部位，注意不要将材料静脉注射。(4)以所需间隔，通常在1周、2周和3周时取出免疫后的血样。分离血清，并于-20℃至-70℃保存。。(5)收集所有血清样品后，使用ELISA分析样品中抗体的存在。

ELISA提供快速、灵敏、可重复、非放射性地测定对各种抗原体内抗体应答的方法，所述抗原包括从接种破伤风和白喉激发剂和多价肺炎球菌多糖疫苗的个体获得的血清中的蛋白质和多糖抗原。Current Protocols in Immunology，1995，vols.6and7中详细描述了对破伤风、白喉和肺炎球菌I型、II型和III型多糖特异的分析。

使用肿瘤注射的分析

在另一种免疫调节分析中，对免疫活性动物接种10⁴-10⁸数量级的受辐射的细胞因子包覆的肿瘤细胞。如果这些动物的存活或肿瘤发生与使用相同参数接种受辐射的非细胞因子包覆的细胞而非调理素增强细胞的动物不同，则发生了免疫调节。例如，如果至少10％的测试组动物比对照组的平均存活期长100％，则测试是阳性的。另一个例子是，至少20％的受试动物中肿瘤发生比对照动物中平均发生晚50％。

剂量和施用

本发明包括调节哺乳动物对选定抗原的免疫应答的方法，该方法包括：向哺乳动物施用治疗有效量的包含本文所述多功能分子的组合物，或包含本发明多功能分子和承抗原靶位的组合物，或施用包含治疗有效量的、已经在体内与多功能分子和承抗原靶位相接触的APC的组合物。

本文所述的组合物可以制备成可注射的液态溶液或悬液；也可以制备成注射前适于制成溶液或悬液的固体剂型。制剂还可以是乳化的，或包封在脂质体中。有活性的免疫原性成分经常和药学上可接受的、与活性成分相容的载体混合。术语“药学上可接受的载体”指不导致施用患者中过敏反应或其他不利影响的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”不包括培养基，或含约0.2-2％血清或更多的任意溶液。例如，适当的药学上可接受的载体包括水、盐水、磷酸缓冲的盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等和其组合中的一种或多种。此外，如果需要，疫苗可以含有微量的辅助物质，如湿化剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增加疫苗效率的佐剂。有效的佐剂的例子包括但不局限于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称作去甲MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-丙氨酸-2-1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(COP)19835A，称作MTP-PE)和RIBI，其含有提取自细菌的、2％鲨烯/Tween80乳液中的三种组分：单磷酰基脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂的其他例子包括DDA(二甲基二十八烷基溴化铵)、弗氏完全和不完全佐剂及QuilA。此外，免疫调节物质如淋巴因子(如IFN-、IL2和IL12)或系统性IFN-诱导剂如poly I：C也可以和本文所述的佐剂联用。

可以通过肠道外注射，如皮下注射或肌肉注射来施用本发明的组合物。适用于其他施用方法的其他配方包括栓剂，和某些情况下的口服配方或适于作为气雾剂分配的配方。在口服配方的情况下，采用佐剂对T细胞亚群进行操作、抗原包装或加入单独的细胞因子到各配方中，可以导致具有最佳免疫应答的改进口服疫苗。对于栓剂而言，例如，传统的粘合剂和载体可以包括聚亚烷基甘油或三酸甘油酯；这种栓剂可以从含有0.5％-10％，优选1％-2％的活性成分的混合物形成。口服配方包括正常情况下使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉硬脂酸镁、糖精(sodium saccharine)、纤维素、碳酸镁等。这些组合物可以是溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊、缓释配方或粉末，含有10％-95％的活性成分，优选25-70％。

本发明的组合物可以配制成中性或盐形式的疫苗组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(和肽的游离氨基基团形成)，其与诸如盐酸或磷酸的无机酸形成，或与诸如醋酸、草酸、酒石酸、马来酸等的有机酸形成。与游离羧基基团形成的盐也可来源于无机碱和有机碱，所述的无机碱例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，所述的有机碱例如异丙胺、三甲基胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。

在制备这种组合物的内含物中，这种疫苗组合物的任意细胞组分可以经历涉及疫苗中细胞减毒或灭活的处理，包括例如暴露于抑制细胞分裂的离子辐射、抗增殖试剂，如环磷酰胺、细胞松弛素D或秋水仙素，或固定或不固定条件下杀伤。

将包括承抗原靶位和APC的组合物以与剂量配方相容的方式、以预防和/或治疗有效量施用。要施用的量取决于待治疗的患者，包括患者免疫系统合成抗体的能力，和所需保护的程度。适当剂量范围是每次接种几百微克，优选约0.1μg-1000μg，比如约1μg-300μg，优选为约10μg-50μg。初始施用和强化注射的合适方案也是可变的，但通常是初始施用之后进行随后的接种或其他施用。要施用的活性成分的精确量依赖于职业医生的判断，对每个患者来说是独特的。对于本领域技术人员来说显而易见的是：本发明中治疗有效量的细胞依赖于施用程序、施用抗原的单位剂量、细胞是否与其他治疗性药物联合施用、接受者的免疫状态和健康状况、具体组合物的治疗活性。

组合物可以以单剂量方案中给出，或优选以多剂量方案中给出。多剂量方案中主要接种过程包括1-10个单独剂量，然后以维持或增强免疫应答的时间间隔给其他剂量，例如1-4个月进行第二次剂量，如果需要，在数月后再施用一次或多次剂量。优选以1-5年、通常3年的间隔进行周期性加强，以维持所需水平的保护性免疫。免疫之后可以对与ESAT6或ST-CF共培养的外周血淋巴细胞(PBL)进行体外增殖分析，测定引发的淋巴细胞释放的IFN的水平。可以使用传统的标记物如放射性核苷酸、酶、荧光标记等进行分析。这些技术是本领域技术人员公知的，可以在美国专利No.3,791,932、4,174,384和3,949，064中查到，其通过引用并入本文。

适用于本发明的肿瘤

本发明考虑治疗的肿瘤包括但不局限于下列：

黑素瘤、鳞状细胞瘤、基底细胞癌、星形细胞瘤、多型性神经胶质瘤、脑脊膜瘤、室鼓膜瘤、许旺氏细胞瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、脑脊膜瘤、血管球瘤、肉瘤、骨肉瘤、尤因氏肉瘤、软骨肉瘤、肌肉瘤、滑膜细胞肉瘤、纤维肉瘤、梭形细胞瘤、血管肉瘤、原始性神经外胚细胞瘤、卡波济氏肉瘤、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、头颈部肿瘤、鼻咽癌、咽癌、喉癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、胸腺瘤、食道癌、胃癌、小肠肿瘤、结肠或直肠癌、间皮瘤、肺癌、胰腺癌、胰岛细胞瘤、非胰岛细胞瘤、乳腺癌、心脏粘液瘤、垂体瘤、类癌瘤、肝细胞瘤、胆管上皮癌、肝母细胞瘤、肾细胞癌、肾母细胞瘤、肾胚肿疡、肾上腺癌、嗜铬细胞瘤、生殖细胞瘤、绒毛膜癌、卵巢癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、子宫内膜瘤、前列腺癌、精囊癌、阴道瘤、阴茎癌、葡萄胎、胆囊癌和膀胱癌。

根据本发明治疗的受试者

本发明提供了减小受试者中转移性病灶尺寸和/或数目的方法。该方法包括向受试者施用包含本发明多功能分子的组合物。本文所用的“受试者”指动物界的生物有机体，优选为哺乳动物，更优选为人类。根据本发明的“受试者”也可以是需要抗转移治疗的动物，例如恶性肿瘤转移至一个或多个器官或组织的患者，如患有肺或淋巴结转移的人类患者。根据本发明的“受试者”还可以是转移动物模型，其中通过遗传操作或注射恶性肿瘤或通过本领域技术人员公知的其他方法刺激恶性细胞或感染细胞的病灶出现，所述的病灶是具有天然发生的转移性病灶的类似动物中所观察到的。转移动物模型的生成是本领域所公知的，例如，这种模型的例子可以查阅Ryan MH eta1.，J Immuno1.2001；167：4286-92；Specht JM et a1.，J Exp Med.1997；186：1213-21；Nakanishi et a1.，Tumour Bio1.200324：70-6；Wang et a1.，IntJGastrointest Cancer，2001；29(1)：37-46；Muralidharan et a1.，J C1in Laser Med Surg.200321(2)：75-83；Tanaka eta1.，Chest2003，123(4)：1248-53；Huang et a1.，Clin Exp Metastasis2002；19(4)：359；和Irvine KR et a1.，J Immuno1.1996；156：238-45。本领域的技术人员能够容易地改变本领域中公知的转移动物模型，以产生适于给定应用的目的转移模型。

检测转移性病灶

本发明提供了减小受试者体内转移性病灶数目和/或大小的方法，包括向受试者施用本文所述的多功能分子。本领域的技术人员将意识到：转移性病灶的检测和测量是本领域中常规的，可以使用成熟的方法进行。例如，利用对受试者的一般检查如探测性手术(如剖腹手术)来检测转移性病灶。作为可替代方案，可以利用更不具有侵入性的技术和方法如胸腔镜(thorascopy)、纵隔镜和腹腔镜来检测、测量和/或观察肿瘤转移。本领域的技术人员还可以利用本领域技术人员公知的成像技术来检测转移性病灶的存在。这些技术包括但不局限于射线照相成像、计算机化分层造影法(CT扫描)、磁共振成像(MRI)、正电子发射分层造影法(PET扫描)、单光子激发(SPECT)和放射性核素闪烁扫描法(如骨扫描)。如本领域技术人员所公知的，上述许多成像方法的灵敏性都可以通过向待成像的受试者体内注射或IV施用造影剂(如碘或钡)来增强。评价转移性病灶的存在、或检测或测量转移性病灶的其他方法是通过利用一般检查或组织病理学检查(其中，根据本领域技术人员公知的方法，以大体解剖水平或者组织或超微结构水平之一或二者水平上从待检查受试者中取出组织样品)。上述检测、测量和成像转移性病灶的方法是本领域技术人员公知的，可以根据本领域的常识将其改变，以适合于本领域技术人员要根据本发明进行评价的特定组织、器官或细胞。这些方法的更详细描述可以查阅，例如Oxford Textbook ofOncology.2nd Ed.，NewYork，Oxford University Press，2002。

根据本发明，如果在受试者体内检测到了任意量的转移性病灶，则说明检测到了转移性病灶。也就是说，即使在受试者中检测到了单一的病灶，也可以说检测到了转移性病灶。优选的是，转移性病灶在受试者的一个、优选一个或多个器官中检测出多个转移性病灶。

根据本发明的转基因动物

可以使用编码本文所述的多功能分子的核酸分子来产生非人类的转基因动物，可以分离转基因动物的细胞，用于动物或人类疫苗接种的疫苗配方。

例如，在一个实施方案中，将核酸分子导入受精卵母细胞中或胚胎干细胞中。然后使用这种细胞来产生非人类的转基因动物或同源重组动物，所述转基因动物中编码本发明多肽的外源性核酸分子已被导入其基因组中，所述同源重组动物中内源性核酸分子得以改变。这些动物可用于研究本发明分子的功能和/或活性，鉴定和/或评价本发明分子活性的调节因子。本文所用的“转基因动物”是动物中一个或多个细胞包括转基因的非人类动物，优选哺乳动物，更优选小鼠。转基因是外源性基因，其整合到要发育成转基因动物的细胞的基因组中，并保留在成熟动物的基因组中，从而在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中指导编码的基因产物的表达。

可以通过如微注射将编码本文所述多肽(即多功能分子)的核酸分子导入受精卵母细胞的雄前核中，使卵母细胞在假孕雌性养育动物中发育。还可以在转基因中包括内含子序列和多聚腺苷酸信号，以增加转基因的表达效率。组织特异性的调控序列可以可操作性地与转基因相连，以指导本发明多肽在特定细胞的表达。通过胚胎操作和微注射产生转基因动物，尤其是诸如小鼠的动物的方法已经成为本领域中的常规方法，例如，由Leder等人描述在美国专利No.4,736,866和4,870,009中，由Wagner等人描述在美国专利No.4,873,191中，描述在Hogan，B.，Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)中。使用类似方法来产生其他的转基因动物。可以根据本发明中核酸分子的存在来鉴定转基因建立者动物，如根据其基因组中的转基因和/或动物组织或细胞中转基因mRNA的表达。然后利用转基因建立者动物来繁殖携带转基因的其他动物。此外，携带编码本发明多肽的转基因的转基因动物还可以与携带其他转基因的转基因动物交配。

还通过下面的实施例进一步说明本发明，这些实施例不应认为是进一步限制。

实施例

产生酵母表达载体的起点是pUC19-GM-CSF-哺乳动物GPI信号序列质粒(pUC19-GM-CSF-GPI)。该质粒编码框架上相融合的鼠GM-CSF(上游)和人Thy-1GPI修饰信号序列(下游)。下列两种寡核苷酸购自Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)：

GTX-5

5’pAATTCCGCGCCGGCACAGTGCTCAGAGACAAACTGGTCAAGTGTGAGGGCATCA

GCCTGCTGGCTCAGAACACCTCGTGGCTGCTGCTGCTCCTGCTGTCCCTCTCCCTCCT

CCAGGCCACGGATTTCATGTCCCTGTGACTGGGTAC3’

GTX-5包含：

a.5’端适于和EcoRI位点连接的序列(碱基1-5)；

b.用于产生框架内嵌合编码序列的NgoM1位点(碱基9-14)

c.人Thy-1中GPI修饰序列的编码序列(Genbank注册No.M11749)(碱基15-137)

d.终止密码子(碱基138-140)

e.3’端适于和KpnI位点连接的序列(碱基144-148)

GTX-6

5’pCCAGTCACAGGGACATGAAATCCGTGGCCTGGAGGAGGGAGAGGGACAGCAGG

AGCAGCAGCAGCCACGAGGTGTTCTGAGCCAGCAGGCTGATGCCCTCACACTTGAC

CAGTTTGTCTCTGAGCACTGTGCCGGCGCGG3’

除了在交错的末端，该寡核苷酸与GTX-5互补。

GTX-5和GTX-6溶解于各管的无菌水中，终浓度为1微克/λ。GTX-5和GTX-6以终浓度100ng/λ混合，使之在室温下退火60分钟。

然后将GTX-5：GTX-6双链寡核苷酸克隆到质粒pUC19中。将4微克的pUC19DNA用EcoRI和KpnI消化。电泳后，使用Qiagen(SantaClarita，CA)凝胶纯化试剂盒，根据生产商提供的指示将线形DNA从0.7％琼脂糖凝胶中纯化。将100ngGTX-5：GTX-6寡核苷酸与200ng EcoRI-KpnI消化的pUC19在20微升终体积中于室温连接60分钟。

将质粒转化到购自Stratagene的感受态AG-1细胞中。将转化的E.coli接种到LB-amp平板上。挑取在含氨苄青霉素(100微克/ml)的LB平板上生长的细菌克隆，接种到含氨苄青霉素的1ml LB中，于37℃摇培过夜。

使用常规碱裂解miniprep方案分离质粒DNA，用EcoRI和KpnI消化DNA。将DNA在1.6％琼脂糖凝胶上电泳，用溴化乙锭染色，从而鉴定含约148bp的EcoRI-KpnI片段的菌落。将阳性菌落接种到100m1含氨苄青霉素的LB中，生长过夜。然后使用购自Qiagen的试剂盒纯化质粒DNA。

对称作pUC-GP121的Thy-GPI阳性克隆的核苷酸序列进行测序，证实其特征。

通过PCR从购自Clontech的小鼠肺cDNA文库中扩增GM-CSF编码序列。使用pfu聚合酶和下列引物，PCR进行35个循环。

上游

5’CCGAATTCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCTGGGCATTGTGGTCTAC3’

下游

5’CAGCCGGCTTTTTGGACTGGTTTTTTGCATTCAAAGGGGATATCAGTCAG3’

PCR参数为90℃变性1分钟、60℃退火1分钟和72℃延伸1分钟。

通过1％琼脂糖凝胶纯化GM-CSF链PCR产物。将DNA条带切下，使用购自Qiagen的试剂盒纯化DNA片段。

用EcoRI和NgoM1消化GM-CSF DNA片段。消化后，用酚:氯仿(1:1)抽提反应混合物，然后用氯仿抽提。将水相调整到0.3M醋酸钠pH5.2，用2倍体积的乙醇使DNA于-80℃沉淀2小时。通过离心沉淀DNA，除去乙醇，将沉淀物用70％乙醇漂洗。沉淀物真空干燥。

将GM-CSF DNA重悬于无菌水中，与已经用EcoRI-NgoMI消化的pUC19-GPI21连接。连接于室温下进行1小时。将与GM-CSF DNA连接的pUC19GPI21转化感受态AG-1细胞。在含氨苄青霉素的LB平板上选择转化的AG-1细胞。分离质粒DNA，如上所述进行分析。进行限制性消化，以证实pUC19GPI-GM-CSF嵌合构建体。分离几个阳性克隆的DNA，并进行测序。

用NgoMIV和KpnI消化该质粒，通过1％琼脂糖凝胶电泳后分离较大的所得片段。

通过PCR从酵母粘粒克隆C9952(ATCC)分离酵母蛋白Gas1的280bp GPI修饰信号序列。PCR使用pfu聚合酶和下列引物：

上游引物5’GTAGCCGGCGCTAGCTCGGGGTCTTCTTCCAAGTCTA

下游

引物5’TACGGTACCCCTAGGCCACAATGAAATAAGATACCATACC3’

这些引物向Gas1片段中添加了5’NgoMIV和3’KpnI位点。

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

25个循环

通过1％琼脂糖凝胶电泳后纯化PCR产物，并用NgoMIV和KpnI消化。然后将Gas GPI信号序列连接到上面制备的pUC-GM-CSF-GPI质粒上，使Gas信号序列框架内融合到GM-CSF序列的下游，置换Thy-1序列。该载体称作pUC19-GMCSF-Gas1.1。然后将所得质粒转化到AG-1感受态E.coli(Stratagene)中，通过碱裂解mini-prep分离质粒克隆。然后通过限制性消化筛选质粒中的插入物。对阳性克隆的DNA进行测序，证实GAS1编码区的特征。

然后使用K.Dane Wittrup博士(University of I1linois)惠赠的pITY-4载体生成GPI-GM-CSF的酵母表达质粒。该质粒稳定整合到酵母基因组中，使异源基因高水平表达。pITY-4的特征包括：δ序列(Ty元件的LTR)，其通过同源重组使发生多整合事件；neo/卡那霉素抗性基因，其提供在E.coli中的选择和酵母中的可调选择；Ga1l启动子，用于高水平可诱导的转录；单一的EagI克隆位点；合成的Pre-Pro序列，优化用于有效分泌表达基因；α因子终止序列；和用于在E.coli中增殖的复制起点。在该系统中，酵母在含葡萄糖的培养基中生长3天，然后转到含半乳糖的培养基中，以诱导插入到Ga1l启动子下游的基因的转录。

使用pfu聚合酶和下列引物，通过PCR从pUC19-GMCSF-Gas1.1中扩增上述的GMCSF-Gas1插入物：

上游5’TACGGCCGGCACCCACCCGCTCACCC3’

下游5’TACGGCCGCCACAATGAAAATAAGATACCAT3’

这些引物在两端加有EagI位点，用于克隆到pITY-4质粒中。

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

25个循环

通过1％琼脂糖凝胶电泳后对PCR产物进行纯化，并用EagI消化。将旁侧有EagI的GMCSF-Gas1片段连接到EagI消化的pITY-4中，用于转化E.coli AG1细胞。然后使E.coli在含卡那霉素(100μg/m1)的LB平板上生长。通过mini-prep纯化卡那霉素抗性菌落的质粒，通过限制性消化作出图谱，确定插入物的存在和正确取向。通过测序证实阳性克隆。该质粒定为pITY-GMCSF-Gas1.1。

实施例2.与Gas1GPI修饰信号序列融合的鼠GM-CSF在酵母中的表达

使含pITY-GMCSF-Gas1.1的E.coli克隆的50m1培养物在含100μg/m1卡那霉素的LB中生长，使用Qiagen的Midi-Prep试剂盒纯化质粒。采用醋酸锂(LiAc)方案，用pITY-GMCSF-Gas1.1转化酿酒酵母株BJ5464(ATCC)。将YPD(每升：20g细菌用胰蛋白胨，10g酵母提取物、20g葡萄糖)中的10ml BJ5464过夜培养物接种到100m1的烧瓶中。使酵母于30℃生长3小时，然后于室温以12,000×g离心2分钟收获。用无菌水洗细胞，再次离心。将细胞重悬于1.0m1的100mM LiAc中，转移到1.5m1的离心管中，在Eppendorf离心机中以最高速度离心15秒。然后将细胞重悬于0.5m1的100mM LiAc中，将分装50μL样品到各个管中。使细胞沉淀。然后依次加入240μL PEG(50％w/v)、36μL1.0M LiAc、5μL(10mg/m1)煮过的载体DNA(鲑精DNA，Sigma)和75μL水中的2μg质粒。加入质粒后，将管振荡，于30℃孵育30分钟，并于42℃热激15分钟。然后使细胞沉淀，重悬于无菌水中，铺到含1mg/ml G418的YPD平板上。

挑取G418抗性酵母的单克隆，并在1m1含1mg/ml G418的YPD中生长3天。然后通过在离心机中离心使细胞沉淀，将YPD(含葡萄糖，无半乳糖)培养基换为含G418的YPG(每升20g细菌用胰蛋白胨、10g酵母提取物和20g半乳糖)。酵母于YPG中生长3天，以充分诱导从Ga1l启动子的转录。诱导后，使细胞沉淀，用TN(0.15M NaCl、25mMTris pH7.4)，并在含20mM辛基吡喃葡萄糖苷(OGP)、1mM PMSF和1μg/m1每种抑肽酶、亮肽素和抑胃肽的TN中裂解。用酸洗的玻璃珠(425-600微米，Sigma)振荡，将酵母裂解。使不溶的材料沉淀，使用鼠GM-CSF ELISA(Endogen)对上清液进行分析。鉴定表达高水平GPI-GM-CSF的菌落。根据可溶性GMCSF的标准曲线，我们估算表达约为25μg/L，比哺乳动物表达显著提高，足够进行体内实验。该酵母克隆定为SC-GM-GPI。

将表达载体稳定整合到酵母中的一个优点是：初步克隆和菌落分离后，不再需要抗生素维持。为了证实这一点，细胞在含和不含G418的条件下生长，测试GPI-GM-CSF表达。我们观察到在不存在G418条件下生长8个月的表达水平没有降低。

为了生成适合于体外和体内功能鉴定的规模的GPI-GM-CSF，500m1YPD接种SC-GM-GPI，于30℃摇培3天。于室温下以12,000×g离心2分钟使细胞沉淀，并转移到等体积的YPG中，再生长3天。然后使细胞沉淀，用TN洗，在含20mM OGP、1mM PMSF和1μg/m1每种抑肽酶、亮肽素和抑胃肽的TN中裂解。用20g/500m1培养物的酸洗的玻璃珠(425-600微米，Sigma)振荡，将酵母裂解。于室温下以8,000×g离心10分钟使不溶的材料沉淀，将可溶性材料加到连接在溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B(Sigma)上的抗鼠GMCSF单克隆抗体(Endogen)亲和层析柱上。根据生产商的指示进行单克隆抗体和琼脂糖凝胶的偶联。使用OD₂₈₀监测偶联效率，使用可通过商业途径获得的重组细胞因子验证鼠GM-CSF与固化抗体的结合。

将可溶性酵母来源的材料加到柱上，使通过重力流出。依次用：(a)20倍体积的含1％Triton X-100的TN；(b)5倍体积的50mM Tris pH8.0，1mM OGP；(c)20倍体积的含1mM OGP的TN洗柱。然后用10倍体积的含1mM OGP的0.15MNaC1、25mM Tris pH2.5洗脱结合的材料。将洗脱的材料用1/200体积的1.5M TrispH8.8中和。使用Mecrosep3K离心机(Pa1l Ge1man Laboratory)浓缩纯化的材料。通过ELISA(Endogen)测定GPI-GM-CSF的产率为25μg/L培养物。加入含1mM OGP的0.15MNaCl、25mM Tris pH7.4将终浓度调至40μg/m1。

通过染色的凝胶和western印迹对纯化的GPI-GM-CSF进行分析。对每个泳道大约1μg的纯化GPI-GM-CSF或重组可溶性鼠GM-CSF进行电泳。使用Sigma银染试剂盒，根据生产商的指示(Sigma)，用硝酸银对凝胶进行染色。对于western印迹来说，使用Owl Scientific电转仪将凝胶转移到Protran BA83(Schleicher and Schue1l)上，用含0.05％Tween20和2％脱脂奶粉的TBS(Tris缓冲的盐水)于室温下封闭过夜。然后用封闭缓冲液中以1:5000稀释的一抗(大鼠单克隆抗鼠GMCSF抗体，Endogen)将印迹于室温下孵育2小时。将印迹用TBS-0.05％Tween20洗，与1:10,000稀释的二抗碱性磷酸酶偶联的山羊抗大鼠IgG抗体(Sigma)于室温下孵育1小时。洗涤后，用NBT-BCIP(Sigma)显色。凝胶和印迹上都明显存在以重组可溶性GM-CSF标准品大致相同的速率迁移的单条主带(与蛋白质部分的分子量约14,000相比，GPI部分的分子量仅为1500)。由于与抗GM-CSF抗体的免疫反应性和该物质结合肿瘤细胞膜的能力，这些带似乎是GPI-GM-CSF。而在印迹中可见一些高分子量的物质，可能是聚集体，该物质在灵敏性较差的银染中看不到，说明其以比主带更低的量存在。

实施例3.与Gas1GPI修饰信号序列相融合的鼠GM-CSF和细胞的结合

收获生长在DMEM、10％FBS、Pen-Strep中的野生型CMS-5鼠纤维肉瘤细胞，用RPMI1640(LifeTechnologies)洗两次，并以5×10⁵细胞/ml的浓度重悬于RPMI1640中。将0.9m1小份的细胞悬液分到Eppendorf硅化离心管中。每份接受实施例2中制备的1μg纯化GPI-GM-CSF、1μg可溶性重组鼠GM-CSF(Intergen，供应为冻干粉末，在GPI-GM-CSF的相同缓冲液中以40μg/m1重构)，或只接受培养基。然后将细胞于37℃摇培3小时，然后用含2％FBS的PBS洗3次。

为了通过流式细胞术检测GPI-GM-CSF，将细胞和大鼠抗鼠GM-CSF单克隆抗体(Endogen)于4℃孵育1小时。然后用含2％FBS的PBS将细胞洗3次，和FITC标记的山羊抗大鼠IgG抗体(Sigma)于4℃孵育1小时，再次用含2％FBS的PBS洗3次。在Becton-Dickinson Facscalibur上通过流式细胞术对细胞进行分析。用GPI-GM-CSF修饰导致峰和平均FL-1荧光相对于仅和培养基孵育的细胞增加约10倍。相比之下，和可溶性GM-CSF孵育的细胞事实上具有和阴性对照细胞相同的曲线。这些数据说明GPI-GM-CSF和肿瘤细胞结合，而非可溶性GM-CSF和肿瘤细胞结合。

还通过ELISA检测并定量了与CMS-5细胞结合的GPI-GM-CSF。如上所述收获CMS-5细胞，并洗涤。将1ml RPMI1640中的1×10⁶细胞与1μg纯化的GPI-GM-CSF一起孵育。于37℃孵育2小时后，用含2％FBS的PBS将细胞洗3次。用50微升含0.15％脱氧胆酸盐和去污剂的PBS将细胞沉淀物裂解，随后加入200微升PBS稀释。用PBS将材料系列稀释，使用生产商提供的针对可溶性重组GM-CSF标准品的ELISA试剂盒(Endogen)测定GM-CSF的量。根据这些数据，5个实验中每个细胞掺入GPI-GM-CSF分子的平均数为37,000+/-33,000。大的标准偏差是由于分子/细胞数为66,000的一个实验。排除该实验，平均数为29,500+/-4,500。

还通过ELISA对GPI-GM-CSF修饰的B16鼠黑素瘤细胞进行定量。完全按照对CMS-5细胞所述进行修饰和ELISA。三个实验中的分子/细胞平均数为21,000+/-11,500。

实施例4.与Gas1GPI修饰信号序列相融合的鼠GM-CSF在细胞上的稳定性

为了研究细胞上含GPI-CM-CSF的稳定性，收获CMS-5细胞，如实施例3所述进行修饰。修饰后，用含2％FBS的PBS将细胞洗3次，然后以4×10⁶细胞/m1重悬于RPMI1640中。然后从¹³⁷Cs源以3500rads对细胞进行照射。将细胞在37℃下于5％CO₂中孵育，以小时间隔取出小份，洗涤3次，并在含0.15％脱氧胆酸盐的50μl PBS中裂解。然后加入200μ1的PBS以稀释脱氧胆酸盐。通过ELISA测定细胞结合的GM-CSF。即使在6小时，细胞也仅表现出约20％的细胞表面GPI-GM-CSF丧失。6小时后，通过对台盼蓝染色进行显微镜观察，测定的照射细胞(修饰的和未修饰)的存活力显著折中。但是，体内数据(参见下文)说明GPI-GM-CSF的细胞表面滞留和照射后细胞存活力都足以维持生物效应。

实施例5.与Gas1GPI修饰信号序列相融合的鼠GM-CSF对细胞的生物活性

通过测定分子支持FDC-P1细胞系增殖的能力来分析GPI-GM-CSF的生物活性，所述的FDC-P1细胞系是鼠骨髓来源的GM-CSF依赖型细胞系。使用Biotrak Ce1lProliferation ELISA(Amersham Pharmacia)测定FDC细胞的增殖，其是使用胸苷类似物5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)的一种分析。使WEHI细胞(ATCC)生长在Iscove MEM、10％FBS、青霉素-链霉素中，作为FDC-P1细胞的条件培养基来源。使FDC-P1细胞生长在含25％WEHI条件培养基的DMEM、10％FBS、青霉素-链霉素中，收获，并用DMEM、10％FBS、青霉素-链霉素洗3次。将细胞以1×10⁵/m1重悬于DMEM、10％FBS、青霉素-链霉素中，分装100μ1到96孔微滴定板的各孔中。以三次重复操作的组如下：

A.培养基-无细胞

B.FDC-PI细胞-未刺激

C.FDC-P1细胞+10ng可溶性GM-CSF

D.FDC-PI细胞+10ng GM-CSF作为GPI-GM-CSF(通过针对GM-CSF标准

品的ELISA测定)

E.FDC-PI细胞+10ng GPI-GM-CSF(如“D”中)，通过用氯仿:甲醇(3:1)

抽提蛋白质使之变性，然后丙酮沉淀和重悬。所有的蛋白质溶液都在含1mM OGP的0.15M NaC1、25mM Tris pH7.4中稀释，使加入每孔的体积为100μ1。

根据生产商的指示进行非同位素增殖分析。将所铺的细胞在37℃下于5％CO₂中生长2天。在第3天，将10μ1的BrdU溶液加入到各孔中，将细胞再孵育3小时。然后将板以300×g离心10分钟，弃去上清液。通过于60℃孵育1小时，将板干燥。根据生产商的指示将板固定和封闭。然后将固定的细胞和过氧化物酶标记的抗BrdU抗体孵育90分钟。然后将孔洗涤，并根据生产商的指示用TMB显色。在两个实验中，与可溶性重组GM-CSF相比，GPI-GM-CSF恒定维持增殖的水平要高出一些(约25％)，说明GPI-GM-CSF具有超生物活性。GPI-GM-CSF的效应并非缘自单独的GPI部分，因为变性的GPI-GM-CSF不支持增殖。变性后GPI部分仍与蛋白质相连，因为识别GM-CSF上线形表位的ELISA显示该蛋白质仍能够修饰细胞。

实施例6.用混有GPI-GM-CSF的细胞进行有效免疫

这些实验包括接种下列物质的小鼠：

(a)野生型细胞(WT)

(b)与可溶性GM-CSF孵育的细胞-未洗(总GM-CSF剂量：1微克)

(c)GPI-GM-CSF修饰的细胞-孵育后洗去未结合的GPI-GM-CSF(总GPI-GM-CSF剂量：经ELISA测定为0.74纳克[分别为73ng和75ng的2次实验的平均值]

(d)GPI-GM-CSF修饰的细胞-未洗(总GM-CSF剂量：1微克)

GPI-GM-CSF质量和浓度值表示为与通过ELISA测定的GM-CSF等效的值

(equiverlence to GM-CSF)，所述的ELISA针对可溶性GM-CSF标准品。

使CMS-5细胞在DMEM、10％FBS、青霉素-链霉素中生长至70％融合，用RPMI1640洗3次。对一小份进行台盼蓝染色测定其存活力，然后将4×10⁶细胞/m1浓度的1μ1小份细胞重悬于硅化的离心管中。使细胞与1μg GPI-GM-CSF或1μg可溶性重组鼠GM-CSF/10⁶细胞于37℃孵育3小时。“洗过”的组然后用PBS、2％FBS洗3次，以4×10⁶细胞/m1重悬于RPMI1640中。取出一小份洗过的GPI-GM-CSF修饰的细胞，如上所述通过ELISA测定细胞结合的GM-CSF的量。在两个实验的洗过的修饰组中分别存在有31,000和32,000GPI-GM-CSF分子/细胞。

从¹³⁷Cs源将细胞以3500rads照射。8-10周龄的雌性Balb/c小鼠(对于CMS-5是同系的)通过吸入甲氧基氟烷(metofane)而麻醉，在左腹股沟褶处皮下接种0.25m1中的1×10⁶细胞。7天后，收获70％融合的野生型CMS-5细胞，在HBSS中洗3次。对一小份进行台盼蓝染色测定其存活力，将细胞在HBSS中调整至4×10⁶/ml。然后对之前已接种的小鼠在甲氧基氟烷麻醉下于颈后皮下注射0.5ml HBSS中的2×10⁶活的野生型CMS-5细胞。

通过触诊和直观检查评价肿瘤形成。“开始发生”定义为肿瘤块既可触摸又可见的第一天。观察者不知道每组小鼠所接受的疫苗，以避免偏见。当肿瘤变得难处理时，通过CO₂窒息处死小鼠。如提前计划好的，在肿瘤激发后70天终止实验。

从未洗的GPI-GM-CSF、可溶性GM-CSF和野生型疫苗组的三个实验收集数据。这些组的数据包括淋巴细胞亚组清除实验中的未清除对照。从两个实验收集GPI-GM-CSF洗过组的数据，因为该组不包括在初始的清除实验中。清除实验具有4只小鼠/组，其他实验具有5只/组。对于小鼠总数来说，GPI-GM-CSF未洗组n＝14；GPI-GM-CSF洗过组n＝10；可溶性GM-CSF未洗组为14；WT为14。激发后70天时小鼠无肿瘤存活的大致百分比为：WT，15％；可溶性GM-CSF，50％；GPI-GM-CSF洗过，60％；GPI-GM-CSF未洗，85％。因此，即使GPI-GM-CSF洗过疫苗含有比未西可溶性组低一千多倍的GM-CSF，施用GPI-GM-CSF修饰的细胞也是更有效的。此外，其中一些分子不与细胞结合的GPI-GM-CSF未洗疫苗甚至更有效。

实施例7.与Gas1GPI修饰信号序列相融合的人GM-CSF的克隆和表达

使用pfu聚合酶(Stratagene)从人T细胞cDNA文库(Clontech)中通过PCR扩增人GM-CSF。使用下列引物：

上游

5’GCGAATCCCGGCCGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCC

下游

5’CAGCCGGCCTCCTGGACTGGCTCCCAGCAGTC

上游引物含有位于成熟人GM-CSF蛋白中第一个氨基酸之前的EcoR和EagI限制性位点。由于酿酒酵母中的表达使用酵母前导序列，人GM-CSF的克隆开始于成熟蛋白质的N端。每个下游引物都去除了天然的终止密码子，以使之框架内连接到编码Gas1GPI修饰信号的序列上。下游引物含有NgoM IV限制性位点，与其他构建体中所用的限制性位点一致。

PCR参数是：97℃变性1分钟，

56℃退火1分钟，和

72℃延伸2分钟。

PCR进行产生琼脂糖凝胶电泳上可见条带的最少循环数。扩增后，使反应混合物于4℃冷却10分钟。

PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，使用商业来源的试剂盒(Qiagen)从切下的琼脂糖条带洗脱。纯化的hGM-CSF DNA片段用EcoRI和NgoM IV消化，并与已经用EcoRI和NgoM IV消化的(鼠)pUC19GM-CSF-GPI质粒连接。这将鼠GM-CSF用人的相应部分置换。然后将pUC19hGM-CSF-GPI质粒转化到感受态AG-1E.coli细胞中，挑取30个菌落进行微培养(mini-culture)，分离质粒克隆，并使用商业来源的试剂盒(Qiagen)纯化。通过限制酶试验消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。阳性E.coli菌落以maxi-culture生长过夜，使用Qiagen maxi-prep试剂盒纯化其质粒。对插入物进行测序。

为了将GM-CSF GAS1g克隆到pITY-4表达载体中，从pUC19载体进行该构建体的PCR。引物是：

5’TACGGCCGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCC

3’TACGGCCGCCACAATGAAAATAAGATACCAT

上游引物在成熟GM-CSF的第一个密码子之前具有EagI位点。这去除了哺乳动物分泌信号，使之与酵母信号序列框架内连接。对于小鼠构建体可以使用相同的限制性位点，因为其在人序列中不存在。下游引物在3’端带有EagI位点。使用Pfu聚合酶进行25个循环的PCR。PCR条件是是：90℃变性1分钟，60℃退火1分钟，和72℃延伸1分钟。扩增后，使反应混合物于4℃冷却10分钟。

PCR产物通过1％琼脂糖凝胶电泳分离，使用商业来源的试剂盒(Qiagen)从切下的琼脂糖条带洗脱。纯化的GM-CSF GAS1g DNA片段用EagI消化，与pITY-4连接，并转化到AG-1化学感受态细菌(Stratagene)中。挑取30个菌落进行微培养，分离质粒克隆，并使用商业来源的试剂盒(Qiagen)纯化。通过限制酶试验消化和琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。阳性E.coli菌落以maxi-culture生长过夜，使用Qiagenmaxi-prep试剂盒纯化其质粒。对插入物进行测序。

如实施例2中对于鼠分子所述使GPI-人GM-CSF分子在酿酒酵母中表达。如实施例2中所述进行免疫亲和纯化，以抗人GM-CSF抗体代替抗鼠GM-CSF抗体。使用抗人GM-CSF单克隆抗体进行ELISA对分离的或与承抗原靶位结合的分子进行检测和定量，对分子所修饰细胞进行细胞流式术也是一样。

实施例8：克隆GM-CSF/流感血凝素嵌合蛋白

pUC19GM-CSF-K-Gas1.1

pUC19GM-CSF-K-HA的克隆pUC19GM-CSF-K-Gas1.1开始，其是我们在我们实验室中生成的。该质粒包括编码鼠GM-CSF的序列，其融合到来自酵母GAS1蛋白的下游糖基化磷脂酰肌醇(glycosylphophatidylinosito1)修饰序列上(后者从University of I1linois的D.Wittrup博士处获得)。接头序列插入到GM-CSF和GAS1部分之间。为了插入接头序列，同样由我们实验室构建的质粒pUC19GMCSF-Gas1.1用NgoM IV和NheI消化。这些限制酶分别在GM-CSF分子的3’端和Gas1.1的5’端切割。使用Qiagen生产的试剂盒通过琼脂糖凝胶电泳纯化所得质粒。下列寡核苷酸是购买的：

5’CCGGCACTAGTGGCGGAGGGGGCTCCGGCGGCGGGGGCAGCG

5’CTAGCGCTGCCCCCGCCGCCGGCGCCCCCTCCGCCACTAGTG

合成的寡核苷酸含有：

1.5’突出端，其与NgoM IV消化的质粒DNA退火

2.3’突出端，其与NheI消化的质粒DNA退火

3.编码肽GGGGSGGGGS的DNA序列，其中G代表甘氨酸，S代表丝氨酸。消化这一10氨基酸序列(C₄S)₂，以插入到GMCSF和Gas1.1部分之间的蛋白质扭结/间隔(kink/spacer)中。

4.SpeI位点，以证实小片段的克隆和进行进一步的操作。

将两种寡核苷酸以等摩尔浓度混合，煮沸2分钟，使之于室温下退火。将寡核苷酸连接到NgoM IV-NheI消化的质粒上，并使用质粒转化E.coli株AG-1。在含有100μg/m1氨苄青霉素的LB平板上选择转化子。分离质粒DNA，用SpeI消化，并在琼脂糖凝胶上电泳，以证实(C₄S)₂序列的存在。

pUC19GM-CSF-K-血凝素(HA)

产生质粒pUC19GM-CSF-K-HA，其编码嵌合蛋白，含(从氨基端到羧基端)：

(1)鼠GM-CSF；(2)上述的(C₄S)₂接头；和(3)来自A/PR/8/34A型流感分离物中H1HA的HA1结构域。所用的HA1序列(HA前体的氨基酸18-344)省略了N端前导序列和下游HA2结构域。终止密码子加在氨基酸344之后。

将pUC19GMCSF-Gas1.1用NheI和KpnI消化。NheI在Gas1.1编码序列的5’端切割，KpnI在Gas1.1编码序列的3’端切割。去除了GPI编码区的所得质粒在琼脂糖凝胶电泳后使用Qiagen生产的试剂盒进行纯化。从编码A/PR/8/34流感株的HA基因的质粒通过PCR克隆HA1编码序列。所用HA1序列开始于氨基酸18，成熟蛋白质的起点，即缺失分泌信号序列。3’端对应于氨基酸344，去除了跨膜区，替换了终止密码子。对HA1序列进行PCR的引物如下：

上游HA1引物

5’ATGCTAGCGACACAATATGTATAGGC

下游HA1引物

5’ATGGTACCCGGCCGTTATCATCTGGATTGAATGGACGG

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

使用vent聚合酶进行20个循环的PCR。

PCR后，产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示从凝胶中提取HA1cDNA。纯化的HA1DNA片段用NheI和KpnI消化。为了制备融合蛋白，将纯化的NheI-KpnI HA片段连接到已经用NheI和KpnI消化的pUC19GM-CSF-K-Gas1.1载体，其已除去Gas1.1编码区。使用DNA转化E.coli AG1，在LB-氨苄青霉素平板上选择转化子。分离单菌落的质粒DNA，用限制酶消化。限制性消化鉴定到了pUC19GM-CSF-K-HA质粒。

使用购自Qiagen的试剂盒，根据生产商的指示纯化pUC19GM-CSF-K-HA质粒。

实施例9.将GM-CSF-K-HA克隆到酵母表达载体中

对pUC19GM-CSF-K-HA进行PCR，分离编码GM-CSF-K-HA的DNA片段，用来克隆到酵母表达载体中。PCR产物包含EagI克隆位点，以框架内插入到酵母表达载体中。

上游引物

5’TACGGCCGGCACCCACCCGCTCACCC

下游引物

5’ATGGTACCCGGCCGTTATCATCTGGATTGAATGGACGG

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

使用vent聚合酶进行20个循环的PCR。

PCR后，产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示从凝胶中提取GM-CSF-K-HA基因。纯化的DNA片段用EagI消化，并连接到已经用EagI消化的酵母表达载体ITK中。ITK载体设计用来(1)在E.coli中复制和(2)利用同源重组进行稳定整合后在酵母Saccharomyces cerevisiae中表达基因。该载体含有：

1.在E.coli中复制质粒的序列

2.酵母Gal启动子，用于在含半乳糖的培养基中生长的酵母中表达异源基因。

3.PrePro-合成的DNA序列，优化用于酵母中远端基因的分泌和信号序列切割。

4.单一的EagI位点，用于克隆要表达的基因。

5.α终止子-用于有效终止近端基因的DNA序列。

6.δ序列，通过和酵母染色体中的内源性δ序列重组，使质粒稳定整合。

7.抗生素抗性基因，使在E.coli中用卡那霉素选择，在酵母中用G418选择。

使用该质粒转化E.coli株AG-1。通过在含100μg/m1卡那霉素的LB平板上生长选择转化子。单菌落生长在含卡那霉素的LB培养基中，纯化质粒。限制性消化确定插入物的取向。使用购自Qiagen的试剂盒，根据生产商的指示纯化所得质粒ITKGM-CSF-K-HA。

实施例10.在酵母中表达GM-CSF-K-HA

用Mfe1使纯化的质粒线形化，使用醋酸锂(LiAc)转化酵母株酿酒酵母WDHY131。使用YPD培养基(每升/20g细菌用胰蛋白胨；20g葡萄糖；10g酵母提取物)中于30℃生长至饱和的10μ1酿酒酵母培养物接种带100m1的YPD中。培养物于30℃摇培3小时。以11,000×g离心2分钟收获酵母，并重悬于25m1的无菌水中。如上所述对酵母离心，重悬于1.0m1的100mM醋酸锂中，转到1.5m1离心管中。以12,000×g离心15秒使酵母沉淀，除去上清液。将细胞重悬于0.5m1的100mMLiAc中。将50μl细胞悬液加入到各离心管中，如上所述离心。除去上清液。

向酵母沉淀物中加入包括下列物质的转化混合物：240μL PEG(50％w/v)；36μL1.0M LiAc；5μL单链DNA(10mg/m1)和75μL水中的1μg线性化的ITKGM-CSF-K-HA。将混合物振荡以悬浮细胞沉淀物，于30℃孵育30分钟。然后对细胞于42℃热激15分钟，离心使细胞沉淀，并重悬于0.5ml YPD中。将酵母于YPD培养基中孵育3小时，铺到含2mg/ml G418的YPD平板上。使平板于30℃生长3天，直到出现单菌落。为了筛选GM-CSF-K-HA的表达，使单菌落在1ml YPD培养基中于30℃生长2天。将细胞以8,000×g离心2分钟，除去YPD培养基，替换为1m1的YPG培养基(每升/20g细菌用胰蛋白胨；20g半乳糖；10g酵母提取物)，以诱导gal启动子。使酵母于YPG培养基中生长2天。此时，取出一小份，使细胞沉淀。使用购自Endogen的ELISA试剂盒对上清液检验GM-CSF的表达。方案按照生产商的指示。鉴定到了分泌嵌合蛋白GM-CSF-K-HA的高表达酵母克隆。根据可溶性GMCSF的标准曲线，表达水平约为2.4mg/L的GM-CSF部分。

实施例11.生成pUC19HA(血凝素)-K-GM-CSF

还产生pUC19HA-K-GM-CSF，其编码含下列部分的嵌合蛋白：(1)HA1结构域(2)K，上述的(G₄S)₂接头，和(3)鼠GM-CSF。HA开始于成熟蛋白质的氨基端，氨基酸18，消除了前导序列。3’端终止于氨基酸344。已经加入(G4S)2以供应可变接头。GM-CSF开始于GM-CSF蛋白的氨基酸18，对应于成熟蛋白质的第一个氨基酸。

首先通过PCR从编码流感病毒株A/PR/8/34中HA基因的质粒克隆HA-K序列。上游引物

5’CTGAATTCCGGCCGGACACAATATGTATAGGC

下游引物

5’

ATGGTACCGCTGCCCCCGCCGCCGGAGCCCCCTCCGCCACTTCTGGATTGAATGGAC

GGAAT

用于PCR的寡核苷酸产生具有下列部分的核酸：

1.位于成熟HA的氨基端的5’EcoRI位点

2.位于HA1结构域的羧基端(HA前体的氨基酸344)的(G₄S)₂接头

3.位于(G₄S)₂序列远端的Kpn I位点

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

使用vent聚合酶进行20个循环的PCR。

PCR后，产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示从凝胶中提取HA1-K DNA。纯化的HA-K DNA片段用EcoRI和KpnI消化，并将片段克隆到已经用EcoRI和KpnI消化的pUC中。用质粒转化E.coli AG1，以赋予ampr。挑取单菌落，于LB-amp中生长。通过限制谱鉴别带有正确插入物的质粒。使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示对定为pUC19HA-K的所得质粒进行纯化。

通过PCR克隆GM-CSF片段。

上游引物

5’ACGGTACCGCACCCACCCGCTCACCCATC

下游引物

5’TAGGATCCCGGCCGTCATTTTTGGACTGGTTTTTTGCACG

PCR引物产生带有下列部分的片段：

1.5’KpnI位点，允许从HA-K分子的(G₄S)₂部分到氨基酸18处成熟GM-CSF分子的起点的框架内翻译。

2.位于GM-CSF3’端的终止密码子

3.3’BamHI位点

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

使用vent聚合酶进行20个循环的PCR。

PCR后，产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示从凝胶中提取GM-CSF基因。纯化的片段用KpnI和BamHI消化，并将片段连接到已经用KpnI和BamHI消化的pUC19HA-K质粒中。用质粒转化E.coli AG1，以赋予ampr。挑取单菌落，于LB-amp中生长。通过限制谱鉴别带有正确插入物的质粒。使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示对定为pUC19HA-K-GM-CSF的所得质粒进行纯化。

实施例12.将HA-K-GM-CSF克隆到酵母表达载体中

对pUC19HA-K-GM-CSF进行PCR，以产生编码HA-K-GM-CSF的DNA片段，用来克隆到酵母表达载体中。PCR产物含Eag I克隆位点，用于框架内插入到酵母表达载体中。

上游引物

5’CTGAATTCCGGCCGGACACAATATGTATAGGC

下游引物

5’TAGGATCCCGGCCGTCATTTTTGGACTGGTTTTTTGCACG

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

使用vent聚合酶进行20个循环的PCR。

PCR后，产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示从凝胶中提取HA-K-GM-CSF基因。纯化的DNA片段用EagI消化，并连接到已经用EagI消化的酵母表达载体ITK中。ITK载体设计用来(1)在E.coli中复制和(2)利用同源重组进行稳定整合后在酵母Saccharomyces cerevisiae中表达基因。该载体含有：

1.在E.coli中复制质粒的序列

4.单一的EagI位点，用于克隆要表达的基因。

5.α终止子-用于有效终止近端基因的DNA序列。

使用该质粒转化E.coli株AG-1。通过在含100μg/m1卡那霉素的LB平板上生长选择转化子。单菌落生长在含卡那霉素的LB培养基中，纯化质粒。限制性消化确定插入物的取向。使用购自Qiagen的试剂盒，根据生产商的指示纯化所得质粒ITKHA-K-GM-CSF。

用Mfe1使纯化的质粒线形化，使用醋酸锂(LiAc)转化酵母株酿酒酵母WDHY131。使用YPD培养基(每升/20g细菌用胰蛋白胨；20g葡萄糖；10g酵母提取物)中于30℃生长至饱和的10μ1酿酒酵母培养物接种到100m1的YPD中。培养物于30℃摇培3小时。以11,000×g离心2分钟收获酵母，并重悬于25m1的无菌水中。如上所述对酵母离心，重悬于1.0m1的100mM醋酸锂中，转到1.5m1离心管中。以12,000×g离心15秒使酵母沉淀，除去上清液。将细胞重悬于0.5ml的100mMLiAc中。将50μ1细胞悬液加入到各离心管中，如上所述离心。除去上清液。

向酵母沉淀物中加入包括下列物质的转化混合物：240μL PEG(50％w/v)；36μL1.0M LiAc；5μL单链DNA(10mg/m1)和75μL水中的1μg线性化的ITKHA-K-GM-CSF。将混合物振荡以悬浮细胞沉淀物，于30℃孵育30分钟。然后对细胞于42℃热激15分钟，离心使细胞沉淀，并重悬于0.5ml YPD中。将酵母于YPD培养基中孵育3小时，铺到含2mg/ml G418的YPD平板上。使平板于30℃生长3天，直到出现单菌落。为了筛选HA-K-GM-CSF的表达，使单菌落在1ml YPD培养基中于30℃生长2天。将细胞以8,000×g离心2分钟，除去YPD培养基，替换为1m1的YPG培养基(每升/20g细菌用胰蛋白胨；20g半乳糖；10g酵母提取物)，以诱导ga1启动子。使酵母于YPG培养基中生长2天。此时，取出一小份，使细胞沉淀。使用购自Endogen的ELISA试剂盒对上清液检验GM-CSF的表达。方案按照生产商的指示。

鉴定到了分泌嵌合蛋白HA-K-GM-CSF的高表达酵母克隆。根据可溶性GMCSF的标准曲线，表达水平约为2.0mg/L的可溶性材料。G418不存在下表达水平没有下降。

实施例13.按比例扩大GM-CSF-K-HA的纯化

为了按比例扩大嵌合蛋白的纯化，将酵母接种到500ml YPD中，于30℃生长3天。以12,000×g离心2分钟使细胞沉淀，转移到等体积的YPG中再生长3天。然后以12,000×g离心2分钟使细胞沉淀，收集上清液。将可溶性材料加到与溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B(Sigma)连接的抗鼠GMCSF单克隆抗体(Endogen)的亲和柱上。根据生产商的指示进行单克隆抗体和琼脂糖凝胶的偶联。使用OD₂₈₀监测偶联效率，使用商业来源的可溶性材料验证GM-CSF与固化抗体的结合。

将可溶性酵母来源的材料加到柱上，使通过重力流出。依次用：(a)20倍体积的0.15M NaC1、25mM Tris pH7.4(TN)；(b)5倍体积的50mM Tris pH8.0；(c)20倍体积的TN洗柱。然后用10倍体积的0.15M NaC1、25mM Tris pH2.5洗脱结合的材料。将洗脱的材料用1/200体积的1.5M Tris pH8.8中和。使用Mecrosep3K离心机(Pa1l Ge1man Laboratory)浓缩纯化的材料。通过ELISA(Endogen)，根据生产商的指示测定嵌合蛋白的产率。

纯化的GM-CSF-K-HA

通过western印迹对纯化的GM-CSF-K-HA进行分析。对每个泳道大约1μg的纯化GPI-GM-CSF和可溶性GMCSF并排进行电泳。对于western印迹来说，将凝胶转移到Protran BA83(Schleicher and Schue1l)上，用含0.05％Tween20和2％脱脂奶粉的TBS(Tris缓冲的盐水)于室温下封闭。然后用封闭缓冲液中以1:5000稀释的一抗(大鼠单克隆抗鼠GMCSF抗体，Endogen)将印迹于室温下孵育2小时。将印迹用TBS-0.05％Tween20洗，与1∶10,000稀释的二抗碱性磷酸酶偶联的山羊抗大鼠IgG抗体(Sigma)于室温下孵育1小时。

实施例14.用GM-K-HA修饰细胞

用纯化的GM-CSF-K-HA来修饰GMS5鼠纤维肉瘤细胞。GMS5细胞生长在DMEM、10％FBS、青霉素-链霉素中，通过胰酶消化收获细胞，用RPMI1640(Gibco)洗3次。将细胞以1×10⁶/m1稀释到RPMI1640中，取去一小份0.9m1到硅化的离心管中。将细胞于37℃摇培2小时，然后用含2％FBS的PBS洗3次。与一抗大鼠抗鼠GMCSF单克隆抗体于4℃孵育1小时。如上所述洗细胞，用FITC标记的抗大鼠抗体(Sigma)处理，并于4℃孵育1小时。再次洗涤后，通过流式细胞术分析细胞，证实肿瘤细胞表面上GM-CSF-K-HA的存在。

实施例15.修饰后定量CMS5细胞的细胞表面上的GM-CSF-K-HA

如上所述收获CMS5细胞并洗涤。将1ml RPMI1640中的1×10⁶细胞与1μg纯化的GM-K-HA孵育。于4℃、室温或37℃孵育15min、30min、1小时或2小时后，用含2％FBS的PBS将细胞洗3次。用50微升含0.15％脱氧胆酸盐和去污剂的PBS将细胞沉淀物裂解，随后加入200微升PBS稀释。用PBS将材料系列稀释，并通过ELISA(Endogen)测试。根据细胞裂解物中检测到的GM-CSF的量，有可能对每个细胞结合的GM-CSF分子的平均数进行定量。例如，4℃孵育15min后，每个细胞上存在58,700个分子。室温孵育15min后，每个细胞上存在25,700个分子。37℃孵育15min后，每个细胞上存在17,200个分子。

实施例16.用混有GM-CSF/1凝素融合多肽的肿瘤细胞有效接种

CMS5鼠纤维肉瘤细胞在DMEM、10％FBS、青霉素-链霉素中生长至70％融合，通过胰酶消化收获，用RPMI1640洗3次。对一小份进行台盼蓝染色来测定细胞的存活力，然后将细胞以4×10⁶细胞/m1重悬，按每份1m1分装到硅化的离心管中。将细胞与1μg(微克)鼠GM-CSF-K-HA或10ng(纳克)HA-K-鼠GM-CSF/10⁶细胞于37℃孵育3小时，然后用RPMI1640将细胞洗3次，以4×10⁶细胞/ml重悬于RPMI1640。取出一小份细胞，如上所述通过ELISA测定细胞结合的GM-CSF的量。在GM-CSF-K-HA和HA-K-GM-CSF组中分别有约20，240分子/细胞和18,000分子/细胞。平行制备用作对照疫苗的细胞，不含本发明的分子(或任意其它免疫调节剂)而施用。

从¹³⁷Cs源将细胞以3500rads照射。8-10周龄的雌性Balb/c小鼠(对于CMS-5是同系的)通过吸入甲氧基氟烷(metofane)而麻醉，在左腹股沟褶处皮下接种0.25m1中的1×10⁶细胞。每只小鼠接受来自仅一种疫苗类型的细胞。7天后，收获70％融合的野生型CMS-5细胞，在HBSS中洗3次。对一小份进行台盼蓝染色测定其存活力，将细胞在HBSS中调整至4×10⁶/ml。然后对之前已接种的小鼠在甲氧基氟烷麻醉下于颈后皮下注射0.5m1HBSS中的2×10⁶活的野生型CMS-5细胞。接受HA-K-GM-CSF和对照疫苗的每组都由5只小鼠组成，而接受GM-CSF-K-HA疫苗的组由4只小鼠组成，因为1只小鼠麻醉后不再苏醒。

通过触诊和直观检查评价肿瘤形成。观察者不知道每组小鼠所接受的疫苗，以避免偏见。当肿瘤变得难处理时，通过CO2窒息处死小鼠。肿接受对照疫苗的所有小鼠都在用活肿瘤细胞激发后18天内形成肿瘤。相比之下，接受GM-CSF-K-HA疫苗的100％小鼠和接受HA-K-GM-CSF疫苗的60％小鼠在实验结束时，即激发后40天时仍没有肿瘤。因此，与用包含肿瘤细胞但不包含本发明分子的组合物接种相比，用包含肿瘤细胞和本发明分子的组合物接种提供明显更长的无肿瘤存活期。

实施例17.克隆人GM-CSF-K-HA

pUC19人GM-CSF-K-HA(hGM-CSF-K-HA)的克隆从pUC19GM-CSF-K-HA开始。pUC19GM-CSF-K-HA用EcoRI和NgoM IV消化。EcoRI在鼠GM-CSF编码序列的5’端切割，NgoMIV在鼠GM-CSF分子的3’端切割。通过琼脂糖凝胶电泳后，使用Qiagen生产的试剂盒纯化除去了鼠GM-CSF编码区的所得质粒。通过PCR从商业来源的人cDNA文库(Clontech)生成人GM-CSF编码片段。人序列开始于成熟蛋白的起点氨基酸18，缺失分泌信号序列。3’端对应于氨基酸144，消除了内源性终止密码子。

上游hGM-CSF引物

5’GCGAATTCCGGCCGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGC

下游hGM-CSF引物

5’TAGCCGGCCTCCTGGACTGGCTCCCAGCA

PCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

使用vent聚合酶进行20个循环的PCR。

PCR后，产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示从凝胶中提取hGM-CSF基因。纯化的hGM-CSF DNA片段用EcoRI和NgoM IV消化，并连接到已经用EcoRI和NgoM IV消化以除去鼠GM-CSF序列的pUC19HA-K质粒中。用DNA转化E.coli AG1，于LB-氨苄青霉素平板上选择转化子。分离单菌落的质粒DNA，用限制酶消化，以鉴定带有pUC19hGM-CSF-K-HA的克隆。

使用购自Qiagen的试剂盒，根据生产商的指示对pUC19hGM-CSF-K-HA质粒进行纯化。对pUC19hGM-CSF-K-HA进行PCR，产生编码hGM-CSF-K-HA的DNA片段，用来克隆到酵母表达载体中。PCR产物含EagI克隆位点，用于框架内插入到酵母表达载体中。

上游引物

5’GCGAATTCCGGCCGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGC

下游引物

5’ATGGTACCCGGCCGTTATCATCTGGATTGAATGGACGGPCR条件是：90℃变性1分钟

60℃退火1分钟

72℃延伸1分钟

使用vent聚合酶进行20个循环的PCR。

PCR后，产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，使用Qiagen试剂盒根据生产商的指示从凝胶中提取hGM-CSF-K-HA基因。纯化的DNA片段用EagI消化，并连接到已经用EagI消化的酵母表达载体ITK中。ITK载体设计用来(1)在E.coli中复制和(2)利用同源重组进行稳定整合后在酵母Saccharomyces cerevisiae中表达基因。该载体含有：

1.在E.coli中复制质粒的序列

2.酵母Ga1启动子，用于在含半乳糖的培养基中生长的酵母中表达异源基因。

4.单一的EagI位点，用于克隆要表达的基因。

5.α终止子-用于有效终止近端基因的DNA序列。

使用该质粒转化E.coli株AG-1。通过在含100μg/m1卡那霉素的LB平板上生长选择转化子。单菌落生长在含卡那霉素的LB培养基中，纯化质粒。限制性消化确定插入物的取向。使用购自Qiagen的试剂盒，根据生产商的指示纯化所得质粒ITKhGM-CSF-K-HA。

用Mfe1使纯化的质粒线形化，使用醋酸锂(LiAc)转化酵母株酿酒酵母WDHY131。使用YPD培养基(每升/20g细菌用胰蛋白胨；20g葡萄糖；10g酵母提取物)中于30℃生长至饱和的10μ1酿酒酵母培养物接种到100ml的YPD中。培养物于30℃摇培3小时。以11,000×g离心2分钟收获酵母，并重悬于25m1的无菌水中。如上所述对酵母离心，重悬于1.0m1的100mM醋酸锂中，转到1.5m1离心管中。以12,000×g离心15秒使酵母沉淀，除去上清液。将细胞重悬于0.5m1的100mMLiAc中。将50μ1细胞悬液加入到各离心管中，如上所述离心。除去上清液。向酵母沉淀物中加入包括下列物质的转化混合物：240μLPEG(50％w/v)；36μL1.0M LiAc；5μL单链DNA(10mg/m1)和751L水中的1μg线性化的ITK hGM-CSF-K-HA。将混合物振荡以悬浮细胞沉淀物，于30℃孵育30分钟。然后对细胞于42℃热激15分钟，离心使细胞沉淀，并重悬于0.5ml YPD中。将酵母于YPD培养基中孵育3小时，铺到含2mg/ml G418的YPD平板上。使平板于30℃生长3天，直到出现单菌落。

为了筛选hGM-CSF-K-HA的表达，使单菌落在1ml YPD培养基中于30℃生长2天。将细胞以8,000×g离心2分钟，除去YPD培养基，替换为1m1的YPG培养基(每升/20g细菌用胰蛋白胨；20g半乳糖；10g酵母提取物)，以诱导ga1启动子。使酵母于YPG培养基中生长2天。此时，取出一小份，使细胞沉淀。使用购自Endogen的ELISA试剂盒对上清液检验hGM-CSF的表达。方案按照生产商的指示。

实施例18.减少小鼠模型中的转移性病灶

收获B16F10鼠黑素瘤细胞，在PBS中洗3次。然后将细胞以5×10⁵活细胞/m1悬浮于PBS中，通过用台盼蓝对一小份细胞染色测定其存活力。将100μ1该悬液注射到8-10周龄C57BL/6小鼠的尾静脉中。在肿瘤激发后第1天或第3天，小鼠在左腹股沟褶处皮下接种1×10⁶照射的B16F10细胞。各组(每组3只)接受单独的细胞、混合有1μg可溶性重组鼠GM-CSF(Serologicals Corp.)的细胞或混合有1μg本发明多功能分子的细胞，所述的多功能分子包含N端的鼠GM-CSF、(Gly₄Ser)₂可变接头和C端的流感病毒A/PR/8/34血凝素的HA1结构域。后一组合物包括游离的和细胞结合的多功能分子。

在第12天将小鼠处死，用解剖剪打开胸腔，通过横切气管取出整个肺。通过手持透镜对转移性病灶进行计数。在激发后免疫1天的小鼠中，转移性病灶/小鼠的平均数如下：

单独的细胞 30.00

细胞+GM-CSF 14.33

细胞+多功能分子 0.67

在激发后免疫3天的小鼠中，转移性病灶/小鼠的平均数如下：

单独的细胞 36.33

细胞+GM-CSF 10.33

细胞+多功能分子 1.00

因此，施用包含本发明多功能分子的组合物可以有效地减少转移性病灶，治疗疾病。

实施例19.GM-CSF-HA1介导的体内对肿瘤激发的保护

作为同种异体的肿瘤疫苗模型，C57BL/6小鼠(单倍型b)接种C3H(单倍型k)来源的K1735黑素瘤细胞，然后用C57BL/6来源的B16F10黑素瘤细胞激发。K1735细胞在含10％FBS和青霉素-链霉素的DMEM中生长至70％融合，通过胰酶消化收获，并用RPMI1640洗3次。对K1735来说，对一小份进行台盼蓝染色确定其存活力，然后将细胞以浓度4×10⁶细胞/m1重悬。按每份1m1分配到硅化的离心管中。细胞与1μg mGM-CSF-HA1(N端的鼠GM-CSF、(Gly₄Ser)₂接头和C端的流感病毒A/PR/8/34的HA1结构域)/10⁶细胞于4℃孵育2小时。取出一小份细胞，通过ELISA测定细胞结合的GM-CSF。两个实验的平均细胞结合的GM-CSF约为60,000。在一个实验中，平行制备不混有任何多肽的细胞和混有1μg可溶性鼠GM-CSF(Serologicals Corp.)的细胞作为对照疫苗。

从¹³⁷Cs源将细胞以3500rads照射。8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠(对于CMS-5是同系的)通过吸入甲氧基氟烷(metofane)而麻醉，在左腹股沟褶处皮下接种0.25ml RPMI中的1×10⁶细胞和共1μg的GM-CSF-HA1(包括结合的和游离的融合多肽)。每只小鼠接受来自仅一种疫苗类型的细胞。7天后，收获70％融合的B16F10，在HBSS中洗3次。对一小份进行台盼蓝染色测定其存活力，将细胞在HBSS中调整至1×10⁵/m1。然后对之前已接种的小鼠在甲氧基氟烷麻醉下于颈后皮下注射0.5m1的B16F10细胞悬液。

在从两个实验收集的结果中，激发后70天，已接种混合有融合多肽的细胞的10只小鼠中7只仍无肿瘤。相比之下，仅接种细胞的10只小鼠中10只都形成了肿瘤，接种混合有可溶性鼠GM-CSF的细胞的5只小鼠中4只形成肿瘤。

其他实施方案

上述实施例说明了本发明人在制作和实施本发明时进行和考虑的实施方案。相信这些实施例包括报告本发明实施领域和显示其有用性的技术内容。本领域技术人员将意识到：本文所公开的技术和实施方案是优选的实施方案，一般来说，可以采用多种等价的方法和技术来达到相同的效果。

上面所提到的所有参考文献都以其所描述、所提到的程度在此引用，为组合物和/或方法提供基础或使之成为可能，对于本发明中一个或多个实施方案的实施是重要的。

附录I

BC025704；BC025713；BC025722；BC025717；BC025695；BC025727；BC025691；

AF474992；AF474991；AF474990；AF474989；AF474988；AF453877；U62556；AF449218；

AJ437349；AJ011371；BC025294；BM875542；AY059419；AY059418；AY059417；

AY059420；AC079385；AC078889；AC010168；U14188；U14187；U15637；AF262304；

AF262303；AF262302；AF262301；AF262300；AF262299；AF247361；AF416619；

AF416618；AJ303165；NM_017451；NM_017450；NM_006340；AF350881；AF022044；

AF034773；AF034772；AF034771；AF022047；AF022046；AF022045；U56255；AJ422056；

AY028912；AY028911；AY028910；AY028909；AY028908；AY028907；AY028906；

AH010677；AY028913；BM735809；BM735756；BM735711；AC007165；AF245699；

BC024229；AJ417555；AJ417554；NM_003877；NM_017662；NM_016148；NM_017729；

M13824；M12960；M13823；L12398；M86383；NM_012245；NM_006750；NM_130845；

NM_002846；NM_002845；NM_002844；NM_002843；NM_002841；NM_130440；NM_130393；

NM_130392；NM_130391；NM_003682；NM_130476；NM_130475；NM_002840；NM_130474；

NM_130473；NM_130472；NM_130471；NM_130470；NM_006504；NM_130435；AJ431177；

NM_006474；NM_006794；NM_002842；NM_002839；BC024145；AF469756；AF469755；

AF469754；AF416711；NM_023068；NM_004782；NM_130798；NM_003825；AF439409；

NM_032211；AF411122；NM_130441；NM_030876；NM_032732；NM_030959；NM_018844；

NM_002825；NM_016372；NM_014288；L43588；U77589；AF410465；AF332759；

AF332758；NM_003744；NM_003681；NM_080706；NM_080705；NM_080704；NM_018727；

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附录II

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AF217288；AF206516；NM_021153；AY048509；NG_000012；AE006466；AF376725；

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AF153440；NM_005086；NM_018153；NM_053034；NM_032208；AV225853；AV222771；

BC017058；BM055437；AF328788；NM_052836；NM_022124；NM_004063；NM_004062；

NM_O04933；620：NM_001257；BC009704；BC001496；BC013577；NM_053002；

NM_052995；NM_O14879；NM_052891；BI964203；B1963913；AF293372；BC009696；

NM_031891；NM_004361；NM_033646；AF319952；NM_005756；AF416903；AF416902；

AF416901；AF264740；AF264739；AF264738；AH011143；NM_033467；AF378755；

NM_016227；NM_014283；NM_018475；D83783；D79997；D13626；B1793175；U40271；

BC014554；NM_018916；NM_032407；NM_018929；NM_032406；NM_018928；NM_032101；

NM_018927；NM_032099NM_018925；NM_032100；NM_018926；NM_032097；NM_018924；

NM_032096；NM_018923；NM_032095；NM_018922；NM_032089；NM_018921；NM_032088；

NM_014004；NM_032087；NM_018920；NM_032086；NM_018919；NM_032054；NM_018918；

NM_032053；NM_018917；NM_032011；NM_032009；NM_018915；NM_O31993；NM_032092；

NM_018912；NM_032091；NM_018914；NM_032090；NM_018913；NM_031411；NM_031849；

NM_031860；NM_031442；NM_007000；NM_003332；AF264747；AF264746；AF264744；

AH010821；AF264743；AF264742；AF264741；AH010820；AF264737；AF264736；

AF264735；AH010819；AF336080；AF336079；AH010587；AF336086；AF336085；

AH010572；AF336084；AF336083；AH010571；AF336070；AF336069；AH010569；

AF336068；AF336067；AH010568；AF336082；AF336081；AH010562；AF336078；

AF336077；AH010561；AF336076；AF336075；AH010560；AF336074；AF336073；

AH010546；AF336064；AF336063；AH010545；AF336072；AF336071；AH010532；

AF336066；AF336065；AH010526；NM_022059；NM_000024；AF257472；AJ301609；

AJ301608；B1713761；B1713497；BI712829；BI712748；B1711750；B1711468；

BI711211；BI710795；BC014500；BC014443；BC014339；NM_032405；NM_032404；

NM_032401；NM_024022；AF325418；AF325419；A11011064；NM_022570；AF360695；

AH010989；AY035377；AY035376；NM_013317；AJ318099；NM_021808；AF275150；

AF275149；AF275148；AF275147；AF275146；AF275145；AF275144；AF275143；

AF275142；AF275141；AF275140；AF275139；AF275138；AF275137；AF275136；

AF275135；AF275134；AF275133；AF275132；AF275131；AH009676；NM_017417；

NM_033346；NM_001204；NM_003933；NM_014256；NM_033274；NM_023038；NM_030765；

AB048207；NM_006005；NM_015722；AY038990；BB226825；AF059274；BC013152；

AH011005；AF406650；L11671；L11670；B1468287；BI468286

Claims

1.一种包含编码融合多肽的核酸分子的组合物，所述融合多肽含有：

第一氨基酸序列，其为HA；和

含有细胞表面多肽的配体的第二氨基酸序列，所述配体为GM-CSF。

2.含有编码融合多肽的核酸的表达载体，所述融合多肽含有：

第一氨基酸序列，其为HA；和

3.权利要求2的表达载体，其中所述第二氨基酸序列是人GM-CSF或鼠GM-CSF。

4.权利要求3的表达载体，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列通过肽接头连接。

5.权利要求4的表达载体，其中所述接头选自：(Gly_xSer)_n、(Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Val-Ala-Thr)_1-5、(Thr-Ser-Pro)_n、(Gly-Gly-Gly)_n、和(Glu-Lys)_n；其中n是1至15的整数，x是1至10的整数。

6.权利要求5的表达载体，其中所述接头是(Gly₄Ser)₂。

7.权利要求2的表达载体，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的N端。

8.权利要求2的表达载体，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的C端。

9.含有编码融合多肽的核酸分子的宿主细胞，所述融合多肽含有：

第一氨基酸序列，其为HA；和

10.权利要求9的宿主细胞，其中所述第二氨基酸序列是人GM-CSF或鼠GM-CSF。

11.权利要求10的宿主细胞，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列通过肽接头连接。

12.权利要求11的宿主细胞，其中所述接头选自：(Gly_xSer)_n、(Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Val-Ala-Thr)_1-5、(Thr-Ser-Pro)_n、(Gly-Gly-Gly)_n、和(Glu-Lys)_n；其中n是1至15的整数，x是1至10的整数。

13.权利要求12的宿主细胞，其中所述接头是(Gly₄Ser)₂。

14.权利要求9的宿主细胞，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的N端。

15.权利要求9的宿主细胞，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的C端。

16.含有融合多肽的组合物，所述融合多肽含有：

第一氨基酸序列，其为HA；和

17.含有承载抗原之靶位且还含有融合多肽的组合物，所述融合多肽含有：

第一氨基酸序列，其为HA；和

18.包含承载抗原之靶位且还包含融合多肽的组合物，所述的融合多肽含有：

能与碳水化合物结合的第一氨基酸序列，其为HA；和

含有细胞表面多肽的配体的第二氨基酸序列，所述配体为GM-CSF；

其中所述的承载抗原之靶位含有下列至少一种：病毒抗原、细菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原和朊病毒抗原。

19.包含承载抗原之靶位且还包含融合多肽的疫苗组合物，所述的融合多肽含有：

能与碳水化合物结合的第一氨基酸序列，其为HA；和

20.包含承载抗原之靶位和多种融合多肽的疫苗组合物，每种所述的融合多肽含有：

能与碳水化合物结合的第一氨基酸序列，其为HA；和

含有白细胞的细胞表面多肽的配体的第二氨基酸序列，所述配体为GM-CSF，

其中所述疫苗组合物中的所述多种融合多肽包含与所述承载抗原之靶位上碳水化合物结合的融合多肽，并且

其中所述疫苗组合物中的所述多种融合多肽还包含不与所述承载抗原之靶位上碳水化合物结合的融合多肽。

21.权利要求19或20的疫苗组合物，其中所述第二氨基酸序列是人GM-CSF或鼠GM-CSF。

22.权利要求21的疫苗组合物，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列通过肽接头连接。

23.权利要求22的疫苗组合物，其中所述接头选自：(Gly_xSer)_n、（Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Val-Ala-Thr)_1-5、(Thr-Ser-Pro)_n、(Gly-Gly-Gly)_n、和(Glu-Lys)_n；其中n是1至15的整数，x是1至10的整数。

24.权利要求23的疫苗组合物，其中所述接头是(Gly₄Ser)₂。

25.权利要求19或20的疫苗组合物，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的N端。

26.权利要求19或20的疫苗组合物，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的C端。

27.包含承载抗原之靶位并且还包含融合多肽的组合物用于制备调节哺乳动物体内免疫应答的药物中的用途，其中所述的融合多肽含有：

能与碳水化合物结合的第一氨基酸序列，其为HA；和

含有细胞表面多肽的配体的第二氨基酸序列，其中所述配体为GM-CSF。

28.包含病毒或细胞以及多种融合多肽的组合物用于制备调节动物体内免疫应答的药物中的用途，其中每种所述融合多肽含有：

含有细胞-表面结合部分的第一氨基酸序列，所述结合部分为HA；和

其中所述组合物中的所述多种融合多肽包含与所述病毒或所述细胞结合的融合多肽，并且

其中所述组合物中的所述多种融合多肽还包含不与所述病毒或所述细胞结合的融合多肽。

29.权利要求27或28的用途，其中所述第二氨基酸序列是人GM-CSF或鼠GM-CSF。

30.权利要求29的用途，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列通过肽接头连接。

31.权利要求30的用途，其中所述接头选自：(Gly_xSer)_n、(Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Val-Ala-Thr)_1-5、(Thr-Ser-Pro)_n、(Gly-Gly-Gly)_n、和(Glu-Lys)_n；其中n是1至15的整数，x是1至10的整数。

32.权利要求31的用途，其中所述接头是(Gly₄Ser)₂。

33.权利要求27或28的用途，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的N端。

34.权利要求27或28的用途，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的C端。

35.使第二氨基酸序列与细胞相接触的方法，所述的方法包括使离体细胞与含第一氨基酸序列和第二氨基酸序列的融合多肽接触，其中所述第二氨基酸序列是GM-CSF，其中所述第一氨基酸序列是HA。

36.权利要求35的方法，其中所述细胞来源自纤维肉瘤或黑素瘤。

37.权利要求35的方法，其中所述第二氨基酸序列是人GM-CSF或鼠GM-CSF。

38.权利要求37的方法，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列通过肽接头连接。

39.权利要求38的方法，其中所述接头选自：(Gly_xSer)_n、(Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Val-Ala-Thr)_1-5、(Thr-Ser-Pro)_n、(Gly-Gly-Gly)_n、和(Glu-Lys)_n；其中n是1至15的整数，x是1至10的整数。

40.权利要求39的方法，其中所述接头是(Gly₄Ser)₂。

41.权利要求35的方法，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的N端。

42.权利要求35的方法，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的C端。

43.包含多肽抗原且还包含融合多肽的组合物，所述的融合多肽包含：

能与细胞结合的第一氨基酸序列，其为HA；和

含有白细胞上细胞表面多肽的配体的第二氨基酸序列，所述配体为GM-CSF，所述组合物包含不与所述多肽抗原结合的融合多肽，且所述组合物是不含细胞的。

44.一种融合多肽，其包含流感病毒血凝素和天然存在的GM-CSF分子。

45.权利要求44的融合多肽，其中所述天然存在的GM-CSF分子在所述流感病毒血凝素的N端。

46.权利要求44的融合多肽，其中所述天然存在的GM-CSF分子在所述流感病毒血凝素的C端。

47.权利要求1、16、17、18或43的组合物，其中所述第二氨基酸序列是人GM-CSF或鼠GM-CSF。

48.权利要求47的组合物，其中所述第一氨基酸序列和所述第二氨基酸序列通过肽接头连接。

49.权利要求48的组合物，其中所述接头选自：(Gly_xSer)_n、(Arg-Ala-Arg-Asp-Pro-Arg-Val-Pro-Val-Ala-Thr)_1-5、(Thr-Ser-Pro)_n、(Gly-Gly-Gly)_n、和(Glu-Lys)_n；其中n是1至15的整数，x是1至10的整数。

50.权利要求49的组合物，其中所述接头是(Gly₄Ser)₂。

51.权利要求1、16、17、18或43中任一项的组合物，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的N端。

52.权利要求1、16、17、18或43中任一项的组合物，其中所述第二氨基酸序列在所述第一氨基酸序列的C端。