本发明的目的是研制一种能有效地促进各种家畜生长,提高饲料报酬、成本低廉而又安全性高,无激素残留,无潜在危险又不降低畜产品质量的基因工程活载体疫苗。
本发明的实施方案如下:
1、生长抑素基因工程体—重组痘苗病毒(vv-HBs/SS),其构建方法为:
1、1)SS基因合成 SS为14个氨基酸残基组成的短肽,其氨基酸序列和密码子如下:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′
用380型DNA自动合成仪合成A52和A23 2个两端有酶切位点的SS基因片段:A525′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT
3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′
A23
将2条合成单链摩尔等混合,退火,补齐,即成两端有粘性末端的SS基因,并将其基因克隆于pUC12,获得带SS基因的pUC12-SS质粒;
BamHI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 stop5′-
GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′
CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC A
TTCGAA
HindIII
1、2)SS基因与HBsAg融合基因的构建
从带HBs基因的pWR13-HBs/4经改造成PWR13-HBs/6后,从中切下7000bp的HBs基因片段,将其插入pUC12-ss质粒,构建成带HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss质粒;
1、3)HBs/ss表达质粒的构建 将HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表达载体pGJP-5的启动子P7.5之后,获得pGJP-HBs/ss质粒;
1、4)带HBs/ss基因的重组痘苗病毒克隆
将pGJP-HBs/ss转染,经痘苗病毒感染的CV-1细胞,由于该质粒中外源基因插入部位的两侧带有痘苗病毒TK基因的同源序列,可与痘苗病毒基因组同源重组而获得带HBs/ss基因的重组痘苗病毒(vv-HBs/ss)。
2、生长抑素基因工程活载体疫苗,其配制方法如下:
2、1)鸡胚苗的接种、收获 取生产用重组痘苗病毒(vv-HBs/ss)毒种,用灭菌生理盐水稀释1000-10000倍,取0.2ml接种于绒毛尿囊膜上,置35~37℃继续孵育,每天照蛋1-2次,取48小时至120小时死胚及120小时活胚,无菌收集有痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜,置无菌容器内结冻保存,用于制苗。
2.2)半成品检验 取样作无菌检查,应无细菌生长。
2.3)配苗 将合格的绒毛尿囊膜称重,按2.5ml/g量加入5%蔗糖脱脂奶,制成匀浆,滤过。
2.4)分装、冻干 将混合后的疫苗定量分装,迅速进行冷冻真空干燥,按《制品冷冻真空干燥法》进行。
2.5)瓶器与包装 按《兽医生物制品规程》进行。
本发明与现有技术相比其优点和积极效果表现在:构建了一株可用于生产生长抑素基因工程活载体疫苗的基因工程体。该工程体能在靶动物(哺乳动物)体内复制增殖,并不断分泌HBsAg/ss融合蛋白。此表达产物能组装成大小20nm左右的病毒样颗粒,具有良好的免疫原性,能诱导动物产生抗HBsAg和SS两种抗体,后者能中和SS,促进内源性生长激素(GH)分泌增加,进一步促使胰岛素样生长因子-1(IGF-1)分泌增加,从而加速动物生长;前者能防治近年来大量报道的动物类乙型肝炎,起到一箭双雕的作用。
本发明首次提出应用鸡胚培养增殖重组痘苗病毒制备SS活载体疫苗。生产乙肝表面抗原(HBsAg)的重组痘苗病毒(vTH2)通常采用Vero细胞培养,我们对在vTH2的HBs基因上插入SS基因的新的重组痘苗病毒(vv-HBs/ss)分别在Vero细胞和鸡胚绒毛尿膜上培养,比较病毒增殖和基因表达水平。结果发现,在鸡胚培养上vv-HBs/ss的空斑数远远超过Vero细胞培养,几乎是细胞培养的100倍;HBsAg和SS的表达量也为细胞培养的7倍。不仅大大改进了用Vero细胞生产HBsAg的常规方法,并且避开了用Vero细胞制备活苗,难以通过完全性评估的难题。
vv-HBs/ss经豚鼠角膜痕试验和家兔皮内接种试验表明其毒力已较原痘苗病毒显著减弱,接种靶动物11天后即不带毒,在病毒增殖期内不排毒,不引起同居感染。用以制备生长抑素活载体苗(激生1号疫苗),免疫猪、牛、羊、兔均十分安全,未见有不良反应,并均获得显著的增重效果。可用以制备能有效地促进各种家畜生长,提高饲料利用率,成本低,容易生产,而又安全性高,无激素残留,无潜在危险的新型基因工程疫苗。该设苗于1999年3月和9月2次向农业部农业生物遗传工程评价委员会申请生长抑素基因工程疫苗商品化生产评价。于2000年12月批准同意,在川、苏2省进行商品化生产。
实施例:
(一)基因工程体——重组痘苗病毒(vv-HBs/SS)的构建
1.SS基因合成 SS为14个氨基酸残基组成的短肽,其氨基酸序列和密码子如下:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ala Gly Cys Lys Aan Phe Phe Trp Lys Thr Phe Thr Ser Cys5′-CCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT-3′
用380型DNA自动合成仪合成A52和A23 2个两端有酶切位点的SS基因片段:
A52
5′-GGATCCGATGGCTGGCTGCAAGAACTTCTTCTGGAAGACTTTCACATCCTGT
3′-AAGTGTAGGACAATCATTCGAAA-5′
A23
将2条合成单链摩尔等混合,退火,补齐,即成两端有粘性末端的SS基因,并将其基克隆于pUC12,获得带SS基因的pUC12-SS质粒。
BanHI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 stop5′-
GGATCCG ATG GCT GGC TGC AAG AAC TTC TTC TGG AAG ACT TTC ACA TCC TGT TAG TAAGCTTT-3′
CCTAGGC TAC CGA CCG ACG TTC TTG AAG AAG ACC TTC TGA AAG TGT AGG ACA ATC A
TTCGAA
HindIII
2.SS基因与HBsAg融合基因的构建
从带HBs基因的pWR13-HBs/4经改造成PWR13-HBs/6后,从中切下7000bp的HBs基因片段,将其插入pUC12-ss质粒,构建成带HBs/ss嵌合基因的pUC12-HBs/ss质粒(见图1)。
3.HBs/ss表达质粒的构建 将HBs/ss嵌合基因克隆到痘苗病毒表达载体pGJP-5的启动子P7.5之后,获得pGJP-HBs/ss质粒。此重组基因在大肠杆菌胞浆内随质粒的复制而复制,不与细菌染色体DNA融合,具有良好的安全性(见图2)。
4.带HBs/ss基因的重组痘苗病毒克隆
转基因方法为同源重组,将pGJP-HBs/ss转染,经痘苗病毒感染的CV-1细胞,由于该质粒中外源基因插入部位的两侧带有痘苗病毒TK基因的同源序列。因而可因同源重组而获得带HBs/ss基因的重组痘苗病毒(vv-HBs/ss),该痘苗病毒的TK基因,因插入外源基因而失活(见图3)。
(二)疫苗的制备(重组痘苗病毒的增殖和表达)
1.在Vero细胞上增殖和表达
vv-HBs/ss接种Vero细胞37℃4h后,加营养液培养72h收获。在Vero细胞上测定空斑单位(PFU)并用ELISA测定HBsAg含量,用RIA测定SS含量。结果病毒产量为5×106~107PFU/106细胞。SS表达水平为19.3ng/106细胞,其中分泌液中10.9ng,细胞内8.4ng,对照培养物中无SS。HBsAg表达量为5800ng/106细胞,其中分泌液中3420ng,细胞内2380ng。表达产物分别用SS抗体和HBsAg抗体免疫沉淀后,作电镜检查,结果均测定到大小20nm左右的病毒样颗粒,与报道的HBsAg颗粒,大小,形态完全一致。表明本基因工程体表达产物为颗粒性多价抗原,具有SS和HBsAg 2种抗原表位。
2.在鸡胚中增殖和表达
vv-HBs/ss接种11日龄鸡胚绒毛尿膜,继续孵化,120h后,收获带痘斑的绒毛尿膜和尿囊液,高速匀浆后,在Vero细胞上测定vv-HBs/ss空斑单位(PFU)并用RIA和ELISA测量SS,HBsAg表达水平。结果收获114只鸡胚,除4只污染外,其余的绒毛尿囊膜上均产生明显痘斑,其大小为0.2~3.0nm。病毒产量平均为5×108~10×108PFU/胚。尿囊液中HBsAg量平均为12.0μg/胚,绒毛尿囊膜匀浆液中为24.0μg/胚,总量约36.0μg/胚。SS表达量在尿囊液中为48ng/胚,绒毛尿囊膜匀浆液中为90ng/胚,总量约138.0ng/胚。见下表
重组痘苗病毒在鸡胚和细胞培养中增殖与表达的比较
培养方法 |
接毒量(PFU) |
病毒产量(PFU) |
HbsAg表达量(μg/胚) |
ss表达量(ng/胚) |
鸡胚培养(每个胚) |
1×104 |
5×108~10×108 |
36.0 |
138.0 |
Vero细胞培养(25cm2) |
1×105 |
5×106~10×106 |
5.8 |
19.3 |
鸡胚培养无论病毒产量(PFU/胚)和HBsAg和SS表达量均显著高于细胞培养,几乎是细胞培养的100倍,且鸡胚培养方法简易,收获绒毛尿膜上的痘斑,匀浆后即可直接配苗,成本低廉,应可作为本疫苗生产的首选方法。
(三)生长抑素基因工程疫苗实验室小试
1.家兔免疫试验
家兔(新西兰纯种,雄性,1.5kg/只)皮内注射重组病毒vv-HBs/ss,1×10-8PFU/只,分背部6点注射。只带HBs基因的重组痘苗病毒(vTH2)免疫家兔作阴性对照。未经任何处理的兔为空白对照。每间隔一周采血分离血清,以备测定抗体和SS水平,至第12周为止。SS抗体及SS含量测定用RIA方法,HBsAg抗体用酶标免疫法测定。
家兔免疫试验主要用于检测SS疫苗能否刺激SS抗体产生,进而使SS水平下降。本试验只用了3只家兔进行试验。其结果见图4。vv-HBs/ss免疫兔在第2,5周血清中出现SS抗体阳性,与空白兔血清测定的cpm之比(P/N)大于2.1,其中第5周出现的抗体峰较为明显。vTH2阴性对照兔和空白兔血清中未测出ss抗体的产生,免疫兔第2、5周出现HBsAg抗体峰,与SS抗体产生的时间极相吻合。见图4(a、b)。
免疫兔从第2周开始出现SS含量下降,第4、5周出现第2个较明显的SS含量下降谷,SS含量为30-40pg/ml,第7周回升到正常水平,阴性对照和空白兔血清中SS含量都在90-190pg/ml之内波动,免疫兔SS显著下降时期与SS抗体上升峰相符。见图4(c)。
2.大白鼠免疫试验
大白鼠(SD品系,雄性,约100g/只)分3组,免疫组(7只)背部3点皮内注射vv-HBs/ss。1×107PFU/只。阴性对照组9只,同样剂量及部位注射vTH2。另10只为空白组。免疫组在第30日,用纯化的HBsAg/ss杂合颗粒(9μg/只)皮下注射以强化免疫一次,每间隙5天称重一次,第55天捕杀动物,数据以平均值标准差表示,并经t-检验。
结果,vv-HBs/ss免疫组大鼠的增重比vTH2阴性对照组和空白组大鼠增重快,在第2次免疫后尤为明显。从共观察的55天的结果显著,免疫组平均日增重5.20g,阴性对照组4.43g,空白组4.67g,即免疫组比阴性组增重提高17.3%(p<0.05),比空白组提高11.3%(p<0.05)。见图5。
(四)疫苗的中试生产
1.种毒
1.1种毒来源 由南京农业大学生长抑素基因工程疫苗研究课题构建,并提供成都药械厂作为中试生产的种毒。
1.2种毒基本特性 本疫苗种毒为南京农业大学构建的遗传工程体——重组痘苗病毒(vv-HBs/ss),是将HBsAg/ss嵌合基因插入痘苗病毒的TK基因中,构建而成。其基本特性同痘苗病毒,能在多种细胞培养和鸡胚绒毛尿膜上生长。人工接种能感染各种哺乳动物。病毒能在宿主体内复制,并持续一定时间。在此期间能不断释放基因的表达产物——HBsAg/ss融合蛋白。它能聚合形成大小20nm左右的病毒样颗粒,是一种颗粒性多价免疫原,能刺激动物产生抗SS和抗HBsAg抗体。前者能中和SS,从而促进GH和IGF释放,促使动物生长;后者能防治动物的类乙型肝炎。因此本遗传工程体是一种既能促长,又能防病的基因工程二联活载体苗。在外界环境中不能复制、增殖,不污染环境。
1.3种毒生物学特性测定
1.3.1毒价滴定
1.3.1.1空斑计数 种毒原液分别用MEM溶液或生理盐水作10倍递进稀释,接种10-5、10-6两个滴度。每个滴度接种3个已长成良好单层Vero细胞中方瓶,每瓶加入0.5ml,在37℃~38℃吸附60分钟,加入MEM营养液,继续培养5~7天,进行空斑计数。计数时,用记号笔在瓶底面点数,求出同一稀释度3瓶中平均蚀斑数,计算出每毫升种毒原液所含空斑数。对种毒及其在鸡胚继代后不同代数进行空斑(PFU)计数,结果参见1.3.4。
1.3.1.2鸡胚半数感染量(EID50)滴定 取鸡胚毒(收获有痘斑的绒毛尿囊膜)按湿重用生理盐水1∶10稀释,研磨匀浆,置-25℃反复冻融3~5次。用生理盐水作10-1、10-2、……等10倍系列稀释,取其中10-3~10-84个稀释倍数接种10~12日龄的鸡绒毛尿囊膜,每胚0.2ml。每个滴度10个胚,置37℃继续孵育,每天照蛋一次。剔除48小时内的死胎,收获第48小时后死胎及120小时内活胚,置4℃冰箱过夜,打开鸡蛋,观察绒毛尿囊膜上的痘斑数量、大小、色泽、中心有无坏死;膜水肿情况。以出现痘斑的最大稀释度为终点,计算EID50。
1.3.2种毒毒力及稳定性试验
1.3.2.1角膜划痕试验 将样品以灭菌生理盐水作1000×、2000×、5000×、10000×、20000×等稀释度,每一稀释各划种体重300~500g豚鼠1只,先以2%普鲁卡因滴入一侧眼角膜,施以局部麻醉,以角膜镊子夹持结合膜,用手术刀在角膜上均匀地划出3条平行刀痕,以肉眼看出痕迹,但未将角膜划穿为度。然后自高倍稀释度开始,分别将稀释病毒滴液滴在角膜上,每只2滴,涂布均匀,静置1分钟左右,放回饲养。逐日观察,第4天判定结果。
角膜反应判定标准
+++:角膜呈混浊白色,虹彩完全不见,
++:角膜混浊,虹彩清晰可见,
+:角膜轻度混浊,有2/3混浊面,
±:角膜有1/3以下混浊面
-:角膜完全透明,仅有刀痕
种毒复苏后,在鸡胚连续继代,取F1、F3、F5、F8各代毒作角膜划痕试验。结果见下表:
种毒鸡胚继毒角膜划痕试验结果
种毒代数 |
稀 释 倍 数 |
1000× |
2000× |
5000× |
10000× |
20000× |
F1 |
+++ |
++ |
+ |
- |
- |
F3 |
+++ |
+ |
+ |
- |
- |
F5 |
++ |
++ |
- |
- |
- |
F7 |
+++ |
++ |
+ |
- |
- |
原痘苗病毒的毒力通常在10000×+++以上,本重组痘苗病毒毒力稳定在1000×+++左右,表明其毒力已较痘苗病毒显著减弱。
1.3.2.2家兔皮内接种试验
将样品用灭菌生理盐水作10-1~10-5递增稀释,取1.8~3.0kg健康兔2只,背部剃毛后,每兔接种5点,每一稀释度1点,每点0.1ml,观察4d,判定结果。按痘苗病毒标准:10-1及10-2接种部位坏死直径不得超过10mm;10-3~10-5接种部位不得有坏死。5个稀释度的浸润直径总和平均不得小于50mm,结果见下表:
种毒鸡胚继代毒家兔皮内接种试验结果
种毒代数 |
稀 释 倍 数 |
10-1 |
10-2 |
10-3 |
10-4 |
10-5 |
F1 |
4mm |
2mm |
- |
- |
- |
F2 |
3mm |
4mm |
2mm |
- |
- |
F5 |
5mm |
5mm |
4mm |
- |
- |
F7 |
4mm |
2mm |
- |
- |
- |
-为无浸润。
结果表明,所有稀释度均不引起坏死。在10-1、10-2均出现直径2~5mm的浸润斑,5个稀释度的浸润直径总和不超过14mm。以上2项试验均表明其毒力比较原痘苗病毒已显著减弱,且相当稳定,不因继代而增强。
1.3.3种毒在靶动物体内消长规律测定
种毒复苏后,采鸡胚毒匀浆,稀释至一定浓度,肌肉注射3月龄新西兰兔及1月龄仔猪,每只兔或猪的接种剂量均为4×107PFU。于接种后第2、3、5、7、11、15、20天定期扑杀2只。无菌采集各组织器官样品,用PBS研磨制成1∶10匀浆,离心后取上清,接种9日龄鸡胚绒尿膜,每个样品接种鸡胚3只。逐日照蛋,于接种后96小时内收胚,观察记录绒尿膜痘斑情况,并剪取接种部位绒尿膜(直径约2cm),加该胚绒尿液1ml研磨成匀浆后,用HBsAg ELISA试剂盒检测HBsAg。根据痘斑和HBsAg检测结果,综合判定样品中是否含有重组病毒,从而弄清重组痘苗病毒(vv-HBsAg/ss)在家兔和猪体内各组织器官中的分布情况和消长规律。为了查明接种动物的排毒相关情况,在对其分泌、排泄物进行病毒检测的同时,我们在猪的试验中,还设计了同居组。于同居第6天、第8天和第11天各扑杀2只,同上采样检测重组病毒。
1.3.3.1种毒在兔体内的分布动态
重组痘苗病毒在兔体检测结果见表1。
表1 家兔各组织器官重组痘苗病毒检测结果
—表示未检出病毒和HBsAg,/表示未做。
由表1可见,在接种后7天后,血液及绝大多数组织器官内均有重组病毒检出,到第11天,肝、肺、肾仍有检出,第15天后的所有样品均为阴性。尿样、脑和胸腺组织始终未检出病毒。
重组病毒在猪体内的分布和消长情况与兔体非常相似,在第15天和20天的所有样品中均未分离和检出到重组病毒。
1.3.3.3猪的同居感染试验
6只受试猪的所有样品均未检出到重组痘苗病毒。
1.3.4种毒表达水平及其稳定性试验
本疫苗的基因工程体其表达产物为SS和HBsAg的融合蛋白(HBsAg/ss),能组装成病毒样颗粒,在颗粒表面可检出HBsAg和SS两种抗原,HBsAg可用测HBsAg的ELISA试剂检测。方法按试剂盒说明书进行。并用已知含量的标准品HBsAg倍比稀释后作ELISA检测。各稀释之间呈良好的线性关系。用HBsAg含量为横座标,OD450值为纵座标,作成标准曲线。其回归曲线的公式为Y=0.349+0.05X。
将HBsAg测定的OD450值代入回归曲线公式,即可求得各样品的HBsAg含量(μg/ml)。测SS目前主要用放射免疫分析(RIA),但因检测试剂价格昂贵,并需特定的脉冲计数器和防务设备,非常规实验室所能做到。由于HBsAg和SS系在同一工程体上联锁表达,二者之比值是一定的。我们用多个样品同时测定HBsAg和在上海第二军医大学用RIA测定SS含量,发现二者之比值衡定在210∶1。在本试验中我们用HBsAg的含量按上述比值测算SS含量。
将低温冰箱中保存的冻干种毒取出,在鸡胚绒毛尿膜上连续继代8代,收获F1~F8各代的绒毛尿膜,按常规制苗方法匀浆后,分别作空斑滴定,进行HBsAg测定和SS测定。结果见下表:
激生1号疫苗空斑数表达水平和稳定性试验结果
*
检测项目 |
F1 |
F2 |
F3 |
F4 |
F5 |
F6 |
F7 |
F8 |
空斑滴定(PFU/ml) |
4.26×106 |
1.67×108 |
5×108 |
4.13×108 |
2×108 |
4.3×108 |
1.7×108 |
-*** |
HBsAg测定**(OD450)(μg/ml) |
0.305 |
1.165 |
1.515 |
1.31 |
1.605 |
1.61 |
1.28 |
1.53 |
1.88 |
16.32 |
35.00 |
19.22 |
25.12 |
25.22 |
18.62 |
23.62 |
SS含量(μg/ml) | 8.95 | 77.71 | 166.67 | 91.52 | 119.62 | 120.09 | 88.67 | 112.48 |
*作ELISA测定时,每个样品均加2个孔,表中数据为其均值
**上行为OD450值,下行为每ml匀浆原液含量
***-表示未做
结果表明,各代空斑数,除F1因刚复苏空斑数较低外,其余各代均较稳定,最低为1.67×108,最高为5×108,平均为3.13×108,完全符合制苗标准。HBsAg的表达量亦均以F1代最低,F2次之。其余各代均稳定在较高水平,OD450最高达1.61,平均为1.47。代入回归曲线公式求得其含量,最高为25.22μg/ml,最低为18.62μg/ml,平均22.42μg/ml。并求得SS含量,最高为120.09ng,最低88.67ng,平均106.76ng。
我们已建立用捕捉法ELISA检测本疫苗中HBs/ss杂合颗粒中SS含量的专用方法,此法,正在进一步完善和试剂标准化及稳定性的测试。用新建的方法测定一部分疫苗中SS含量,检测结果与上述推算结果基本符合。
1.4种毒鉴定和保存
1.4.1空斑数测定
1.4.2表达水平测定
1.4.2.1 HBsAg含量测定 在一般成品检验时测HBsAg的表达水平用OD450表示即可,但在种毒鉴定时最好能测到具体表达量。参见1.3.4。
1.4.2.2 SS含量测定 通常用RIA测定,但此法不能在一般实验室,我们按表达产物中SS与HBsAg的衡定比例测算SS含量。参见1.3.4。
1.4.3毒力测定 同1.3.2.1
1.4.4无菌检验 按常规方法进行
1.4.5支原体检验 按常规方法进行
1.4.6外源病毒检验 按常规方法进行
1.4.7结果 种毒测定结果见表1:
表1:种毒鉴定结果
*
代数 |
鸡胚数 |
PFU/ml |
HbsAgμg/ml |
SSng/ml |
EID50/0.2ml |
无检 |
支原体 |
外源病毒 |
9801F1 |
60 |
4.58×108 |
34.5 |
138 |
10-7.40 |
无菌 |
无 |
无 |
9802F3 |
138 |
5.52×108 |
38.5 |
152 |
10-7.60 |
无菌 |
无 |
无 |
9901F1 |
520 |
5.50×108 |
40.9 |
164 |
10-7.56 |
无菌 |
无 |
无 |
*本表中的ml系指鸡胚绒毛尿囊膜的匀浆原液。
表1结果表明,3代毒种完全符合毒种标准,可作生产用毒种。
1.4.8冻干保存 所有被测毒均符合予定指标要求,选择其中空斑数高,表达水平稳定者,冻干后-70℃冷冻保存,作为种毒批,生产中应用时,在鸡胚复壮继代3代后应用作为生产用种毒。
2.疫苗制造和半成品检验
2.1生产用毒的制备
2.1毒种繁殖 取冷冻保存的毒种,接种鸡胚绒毛尿囊膜,无菌收膜,传2~3代,加入保护剂,分装小瓶中,封口,保存于-20℃低温冰柜中,注明收获日期、毒种代数及PFU数等。
2.2制苗材料的选择 选发育良好的10-11日龄SPF鸡胚作制苗材料。
2.3制苗用毒液的繁殖
2.3.1鸡胚苗的接种、收获取生产用毒种,用灭菌生理盐水稀释成10-4,取0.2ml接种于绒毛尿囊膜上,接种后封闭针孔,置35℃~37℃继续孵育,不必翻蛋,每天照蛋2次。将48小时前死亡的鸡胚弃之,取48小时后至120小时死胚及120小时活胚,每若干个胚为一组,无菌收集有痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜,置无菌容器内结冻保存,用于制苗。
2.4半成品检验
每组分别取样作无菌检查,应无细菌生长。
2.5配苗及分装冻干
2.5.1配苗 将合格的绒毛尿囊膜称重,按2.5ml/g膜湿重量加入5%蔗糖脱脂奶,制成匀浆,滤过。
2.5.2分装、东干 将混合后的疫苗定量分装,迅速进行冷冻真空干燥,按《制品冷冻真空干燥法》进行。按冻干后的空斑数确定对各种家畜接种的头份。
2.6瓶器与包装 按《兽医生物制品规程》进行。
3.成品检验
3.1物理性状 本品为微红色海绵状疏松团块,易与瓶壁脱离,加稀释液后,迅速溶解。
3.2无菌检验 按《无菌检验规程》进行。应无菌。
3.3病原体检验 按《病原体检验法》进行。应无病原体生长。
3.4外源病毒检验 按《兽医生物制品标准》进行,应无外源病毒污染。
3.5安全检验
用18g小白鼠10只,每只皮内注射0.5ml,观察15天。应健活。
3.6表达产物测定 每瓶疫苗加适量生理盐水,恢复成冻干前匀浆原液容积。按1.3.4方法测定HBsAg。每ml匀浆原液OD450≥1.2,含量≥17.02μg/ml为合格。
3.7空斑计数 每批疫苗抽样3瓶,按1.3.1.1作空斑计数。根据空斑单位确定使用头份,牛等大动物用108PFU/头左右,猪、羊等中动物用107PFU/头左右。
3.8表达水平测定 按3.4.2.1和3.4.2.2法进行。
3.9剩余水分测定 按《冻干制品剩余水分测定法》进行。应符合规定。
3.10真空度测定 应符合规定。
9批疫苗成品检验结果见表2:
表2 9批疫苗生产检验结果
*
批号 |
鸡胚数 |
PFU/ml |
HbsAg(μg/ml) |
SS(ng/ml) |
物理性状 |
水份 |
无检 |
安检 |
9801 |
350 |
1.35×108 |
35.8 |
210 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9802 |
600 |
4.50×107 |
23.2 |
110 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9803 |
900 |
1.65×107 |
19.9 |
95 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9804 |
1400 |
4.18×108 |
34.2 |
163 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9805 |
1500 |
3.17×107 |
23.6 |
112 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9806 |
776 |
4.50×108 |
34.5 |
164 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9901 |
4200 |
2.65×108 |
32.0 |
152 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9902 |
4500 |
1.68×108 |
34.0 |
161 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
9903 |
4800 |
2.37×107 |
22.7 |
108 |
合格 |
合格 |
阴性 |
安全 |
*本表中的ml数系指绒毛尿膜匀浆原液。
4.作用与用途 用于促进猪、牛、羊动物生长。
5.用法与用量 使用时按瓶签注明头份,用生理盐水稀释,肌注。
6.贮藏 在-15℃以下保存,有效期不超过2年。2~8℃保存不超过
3个月。
(五)疫苗田间试验
1.免疫途径试验 痘苗病毒疫苗(牛痘苗)在人通常用皮肤划种。对家畜我们也曾试用划种,但操作困难,容易引起皮肤感染,效果也不确实。故改用多点皮内注射。我们比较了皮内注射与肌肉注2种免疫途径的免疫增重效果。
1.1预备试验 用三元杂交公猪35日龄断奶6头去势后,分成3组,第1组皮内注射,剂量1ml/头(1.05×107PFU),分5点注射,第2组肌肉注射1ml/头(1.05×107PFU),第3组注射生理盐水皮内注射对照。免疫后,皮内组在注射部位出现丘疹、水疱、化脓等出痘反应,第9天消退,2周后结痂脱落,局部形成白色凹陷疤痕,肌肉组和对照组均无可见反应,以后于接种后3、6、9、12、15、17周称重,并计算饲料消耗,结果见下表:
免疫途径试验增重与饲料消耗表
分组 |
皮内免疫组 |
肌注免疫组 |
盐水对照组 |
头数 |
2 |
2 |
2 |
始重(kg) |
9.7 |
9.6 |
9.5 |
终重(kg) |
84.7 |
87.1 |
79.8 |
终重较正比值(kg)l* |
85.6 |
87.1 |
78.8 |
日增重(g/头/天) |
0.64 |
0.65 |
0.58 |
增重提高率 |
10.3% |
12.1% |
- |
净增重(K/头) |
6.6 |
8.2 |
- |
总饲料消耗(kg) |
466.1 |
481.4 |
461.5 |
料肉比 |
3.11∶1 |
3.11∶1 |
3.28∶1 |
饲料利用率提高(%) |
5.5 |
5.5 |
- |
1*最小二乘均数
皮内组织和肌肉组日增重均显著高于对照组,增重提高率分别为10.3%和12.1%,净增重分别为6.6kg/头和8.2kg/头,饲料利用率均提高5.5%。
1.2 55~60日龄猪免疫途径试验取58日龄左右的架子猪23头,分为皮内注射组,剂量8.4×107PFU/头;大剂量肌肉注射组,剂量1.2×109PFU/头和生理盐水对照组,观察、称重4个月。结果见下表。
50~60日龄猪不同途径免疫增重结果
组别 |
注射途径 |
头数 |
免疫剂量(PFU/头) |
平均体重和累计增重(%) |
称重时间(免疫后周数) |
增重率(%) |
0 |
3 |
6 |
9 |
12 |
16 |
1 | 皮内 | 8 | 8.4×107 | XΔ
X | 17.70 | 30.312.6 | 43.625.9 | 58.140.4 | 74.356.6 | 88.370.6 | 115.3 |
2 | 肌肉 | 8 | 1.2×109 |
XΔ
X | 17.70 | 28.610.9 | 41.824.1 | 56.638.9 | 72.254.5 | 78.660.9 | 94.8 |
3 | 盐水对照 | 7 | - |
XΔ
X | 17.80 | 29.211.4 | 42.825.1 | 55.337.5 | 71.954.1 | 81.163.3 | 100 |
结果皮内组免疫后可持续增重4个月,提高增重15.3%,净增重7.3kg/头,本试验未设同样剂量的肌肉注射组,而设了一个大剂量肌注组是个错误,但却因此发现大剂量免疫不仅不能提高免疫增重效果,反而出现负增重(-5.2%)这一值得重视的现象。
1.3 85~90日龄肥猪不同途径免疫试验 取85~90日龄的肥育猪30头,分成4组,第1组为皮内注射组,第2组为肌注组,剂量均为8.4×107/头,第3组先肌肉注射后于130日龄时用大剂量(8.4×108PFU/头)加强免疫,第4组为盐水对照组,观察、称重12周,结果见下表:
85~90日龄猪不同途径免疫增重结果
组别 |
注射途径 |
头数 |
免疫剂量(PFU/头) |
平均体重和累计增重(%) |
称重时间(免疫后周数) |
增重率(%) |
0 |
3 |
6 |
9 |
12 |
1 | 皮内 | 8 | 8.4×107 | XΔ
X | 30.20 | 41.311.1 | 50.420.2 | 62.031.8 | 74.544.3 | 108.8 |
2 | 肌肉 | 7 | 8.4×107 | XΔ
X | 31.10 | 42.711.6 | 52.521.4 | 64.733.6 | 75.544.4 | 109.1 |
3 |
肌肉大剂量加强免疫 | 7 | 8.4×108 | XΔ
X | 29.40 | 39.910.5 | 51.522.1 | 64.635.2 | 72.943.5 | 106.9 |
4 | 盐水对照 | 8 | - | XΔ
X | 32.20 | 43.010.8 | 50.418.2 | 63.631.4 | 72.940.7 | 100 |
结果皮内和肌肉组增重效果不相上下,分别提高8.8%和9.1%,净增重为3.6kg/头和3.7kg/头,大剂量加强免疫组在加注前均高于以上2组,加强注射后至12周称重体重时显著落后,增重提高为6.9%,净增重2.8kg/头,再一次说明大剂量免疫反而抑制增重。
1.4小结 从以上3次试验看,皮内注射和肌肉注射增重效果无显著差异,前2次试验提高增重率和净增均高于第3次试验。这主要由于观察、称重的时间不同,前二者均为4个月,而后者为3个月,与免疫日龄关系不大。由于皮内注射操作麻烦,且兽医习惯用肌肉注射,因此确定以后免疫途径一律采用肌肉注射。至于免疫日龄建议在出栏前3~4个月免疫为佳。加大免疫剂反而影响生长,这是一个重大发现是应用激素免疫调控时应该注意的。
3.安全试验
3.1家兔安全试验 在重组痘苗病毒在动物体内消化规律研究中,我们用4×107PFU/头的剂量(猪的1免疫剂量)给14只家兔免疫,均未见有不良反应,在最适免疫量试验中,用108、107、106、105PFU/头剂量,分别免疫10只家兔,亦均未见有不良反应。其中108PFU/头已是家兔最适免疫剂量的100倍。免疫兔不排毒,不引起同居感染,说明本疫苗对家兔是十分安全的。
3.2猪的安全试验 先后在四川地区近百个猪场和部分农户中试用,共免疫猪20700头,无一例出现精神异常、食欲降低等不良反应。其中有16头猪用10倍以上剂量接种,亦无不良反应。在进行不同途径免疫试验中,亦曾用1.2×109PFU/头(10头份)和8.4×108PFU/头(8头份)大剂量免疫猪,亦均无不良反应,免疫猪不排毒,不引起同居感染,说明本疫苗对猪是十分安全的。
3.3牛、羊的安全试验 在江苏、安徽、四川、新疆等地区免疫肉牛938头,绵羊和山羊7304头,均无任何不良反应。表明本疫苗对牛、羊都是十分安全的。
3.4怀孕动物的安全性试验 取健康怀孕豚鼠10只,饲养观察1周后,接种激生1号疫苗107PFU/只(兔的10倍剂量)。观察10天,未见有任何不良反应,也不引起流产。继续饲养,直至各豚鼠均安全分娩,表明本疫苗对怀孕动物是安全的。
4.免疫猪屠宰试验 在对猪85~90日龄段的免疫猪,在用本疫苗肌肉注射及皮内注射,免疫后4个月的猪及对照,各选3头体重在84~90kg的猪进行屠宰测定,屠宰前空腹12~24h,宰后的胴右片进行膘厚、眼肌面积、胴体长、pH值、肉色等测量。其左半胴体取第3~5腰椎处背最长肌中心部分各取样100g作肉脂化学成分的常规分析,测定水份、粗脂肪、粗蛋白等成分。
结果:对照、肌注和皮内各组宰前平均活重为85.9kg、89.3kg和85.7kg、屠宰率对照为72.9%、肌肉组为73.4%、皮内组为72.4%。差异不显著,平均膘厚分别为2.53cm、2.57cm和2.48cm、瘦肉率分别为52.9%、48.2%和52.4%,肌肉组屠宰体重大,瘦肉率低,但因个体差异大,差异不显著,试验猪皮、脂、骨、肉的比例均与对照相近。只是板油重和板油率,对照组为2.22kg和2.57%,而肌肉组和皮内组分别为1.70kg和1.9%,1.93kg和2.20%,均低于对照组。各组肉质的物理分析;pH值均在6.4~7.0之间,其他嫩度、大理石纹、系水力,肉色均无明显的差异。对肉质的化学成分进行分析;对照组水分、蛋白质、粗脂肪分别占72.2%,19.4%,8.1%;肌注组分别占73.3%,19.8%,6.7%;皮主组分别占73.5%,20.3%,5.5%。各组间差异不大。屠宰测定的结果说明激生I号促进肉猪的增重并不影响猪肉的质量,它是一种安全的疫苗。
5.田间试验和区域试验 本疫苗至1999年已试生产疫苗5万头剂(猪),发出进行田间试验和区域试验4万余头剂。经返回信息,猪20700头,羊7304头,牛938头。结果表明免疫增重效果显著,兹分别叙述于下:
5.1猪的田间试验和区域试验 猪一次免疫可持续增重3~4个月,提高增重率最低1.3%,最高51.6%,平均10%以上。每头猪净增重则视免疫日龄、气候和饲料管理条件、疾病干扰以及观察称重时间,而有很大差异。平均在5kg/头左右。以四川都江堰市的区域示范试验为例,试验在该市畜牧局下属17个猪场进行,共参试猪677头,其中免疫组383头,对照组294头。免疫后观察、称重99~143天,结果免疫组比对照组日增重平均提高12.15%,平均净增重6.35kg/头,四川省及重庆市等地区使用本疫苗后的情况见表3:
表3四川省及重庆市等部分地区使用生长抑素基因工程活载体疫苗情况
使用时间 |
使用地区 | 动物类别 | 批号 | 使用头份 | 疫苗反应情况 | 增重情况 |
1999年 |
重庆市荣昌县 | 猪 |
99019902 | 1300 |
对仔猪安全、无毒副作用 |
平均提高增重率15%以上,缩短育肥期10-20天,每头净增重5.6kg |
1999年4月~2000年2月 | 四川省绵阳市八个县市区 | 猪 |
990199029903 | 12000 | 安全出栏、无任何毒副作用 | 试验猪比对照猪多增重8~25%,每头约多增重5kg |
牛(西门塔尔) |
99029903 | 850 |
安全出栏、无任何毒副作用 |
3个月试验牛比对照牛多增重25~40kg/头 |
1999年8月~2000年3月 | 四川省内江市 | 羊(大耳羊) | 9902 | 4800 |
安全无任何毒副作用,屠宰后胴体无明显改变 |
3个月平均提高增重22.2%~34.5%,每头多增重2.3~3.3kg |
1999年4月~12月 | 四川省仁寿县 | 猪 |
980498059806 | 7400 | 安全出栏,无毒副作用 | 3个月试验猪比对照猪平均多增重4.8kg |
羊(成都麻羊) |
980498059806 | 1800 | 安全无任何毒副作用 |
使用3个月平均增重提高率18.9%,试验羊比对照羊多增重1.5~3.0kg |
5.2肉牛的田间试验和区域试验 共免疫肉牛938头,其中每月称重,共返馈称重纪录的3个肉牛场共免疫牛49头。对照组38头。观察、称重83和116天。结果称重至83天者提高增重44.8%和31.9%,净增重分别为20.2kg/头和14.4kg/头。称重至116天者提高增重27.8%和17.5%,净增重为11.93kg/头和7.27kg。如后者按95天称重统计,则提高增重率为32.96%和28.98%。也就是说第4个月免疫增重效力显著降低,有一个组甚至出现负增重。结果显示牛一次免疫可持续增重3个月。如需继续饲养,应加强免疫,但本疫苗因系活载体苗不适于再次免疫。对于生长期的大家畜和乳用家畜,如乳牛、乳羊用于促进泌乳,增加乳产量,则需研究其他激生系列疫苗,以期更上一层楼。目前对肉牛来说以在出栏前3个月时免疫为宜。
5.3羊的田间试验和区域试验 绵羊田间试验返回按月称重记录的有A、B1、B2三个,羊群A群参试羊共63头,免疫31头,对照32头,称重3个月,结果试验组比对照组增重提高33.6%,净增重4.7kg,B1群参试羊60头,免疫和对照各30头,称重63天,结果增重提高仅7.4%,净增重0.67kg/头,但如将公母羊分开计算,则母羊增重提高11%,公羊4.2%,净增重母羊0.87kg/头,公羊0.36kg/头,存在明显性别差异。B2群参试羊16头,免疫、对照各8头,均为不去势公绵羊,称重63天。结果提高增重24.9%,净增重1.92kg/头,3个组之间有明显差异,这可能是由于后二者观察称重时间短(少1个月)有一定影响。另外对公羊去势比不去势的效果要好。山羊田间试验做得较少,只有四川成都郊区麻羊的一次试验共5个羊群,共参试羊188头,免疫组96头,试验组92头,增重率最低11.7%,最高37.4%,净增重最低0.33kg/头,最高1.46kg/头,平均0.66kg/头,其中最高的一组始重最高。这是一条重要的经验,本疫苗给山羊的时间适当推迟更好。从免疫剂量看,其免疫量以降低至107PFU/头为宜。
根据四川内江市对大耳绵羊的区域试验,共参试绵羊4800头,观察3个月,平均提高增重22.2~34.5%,每头净增重2.3~3.3kg。共参试山羊1800头。观察3个月,平均提高增重18.9%,每头净增重1.5~3.0kg。