CN106535922A - 免疫治疗组合物、治疗方法和诊断方法 - Google Patents

免疫治疗组合物、治疗方法和诊断方法 Download PDF

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Abstract

本文公开一种包含IL‑17的免疫治疗组合物。本文还公开一种增加有需要的受试者的免疫应答的方法。所述方法可包括向所述受试者施用所述免疫治疗组合物。所述增加的免疫应答可保护免受流感病毒。本文进一步公开一种诊断流感病毒感染的方法。

Description

免疫治疗组合物、治疗方法和诊断方法 技术领域
本发明涉及一种免疫治疗组合物、一种治疗和/或预防流感的方法以及一种诊断流感病毒感染的方法。
背景技术
疫苗用于刺激个体的免疫应答，以提供针对特定疾病(例如流感)的保护和/或对特定疾病(例如流感)的治疗。每年，很多人感染和/或死于流感病毒感染。具体地说，幼儿、老年人、免疫系统受损的个体和健康护理工作者易受流感病毒感染并且经常需要住院治疗，从而造成经济和社会负担。具体地说，在过去十年中，三种流感株已经受到关注。H1N1甲型流感病毒亚型是一种常见人流感病毒，其在1919年导致大流行性疾病(在世界范围内杀死5000万至1亿人的西班牙禽流感)并且导致了2010年开始导致超过17,000人死亡的猪H1N1大流行性病。H7N9甲型禽流感病毒亚型是2013年出现在中国并且导致20人死亡和100人感染的新的甲型流感亚型，这对于新的感染来说是异常高的比率。H5N1甲型禽流感病毒亚型出现于2006年，在首先出现于亚洲之后波及全球。它是杀死数千万只鸟并且推动对数亿其它动物的捕杀来阻止其扩散的动物流行病(非人类中的流行病)和动物共患病(影响许多种类的动物，尤其是在广泛区域内)。与2006年6月65次爆发和2007年6月55次爆发相比，2008年6月在世界范围内报道了5个国家(中国、埃及、印度尼西亚、巴基斯坦和越南)中H5N1的11次爆发。在2013年7月，WHO宣布总计630例确诊的人的病例，从2003年导致375人死亡。
因此，流感病毒是高度可变的，并且因此每年制造商需要开发针对流感病毒的新疫苗(即，流感疫苗)，来把这种可变性和新出现的流感病毒株考虑在内。换句话说，流感疫苗生产是基于对在任何给定年中哪一种或哪几种流感株将在人群中最流行的预测。目前，这些流感疫苗通常是通过在鸡卵中生长流感病毒来生产，并且因此，生产受到受精的鸡和卵的供应以及流感病毒在鸡卵中生长的好坏程度的限制。因此，难以响应于大流行病而加速流感疫苗生产，并且难以快速转换成特定疫苗以便使用流感疫苗来靶向一种或多种特定流感株。
因此，在本领域中仍然需要开发安全和有效的免疫治疗组合物，其适用于许多不同的甲型流感亚型，从而提供广泛保护并且逐年促进存活率。
发明内容
概述
本发明针对一种免疫治疗组合物，其包含IL-17。IL-17可以由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11编码。IL-17可以是包含如在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的肽。IL-17可以由核酸编码并且免疫治疗组合物可以进一步包含IL-17肽。
免疫治疗组合物可以进一步包含选自由阿米洛利(amiloride)、流感抗原和白细胞介素组成的组的一种或多种其它抗原。流感抗原可以选自由H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原及其任何组合组成的组。白细胞介素可以选自由IL-23、IL-33、IL-21及其组合组成的组。
免疫治疗组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。IL-17可以是IL-17肽的单体。IL-17可以是IL-17肽的二聚体。本发明还针对一种用于针对流感病毒治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用包含IL-17的免疫治疗组合物，其中受试者由此抵抗多种流感病毒亚型。IL-17可以是包含在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的肽。免疫治疗组合物可以进一步包含编码IL-17肽的核酸。免疫治疗组合物可以进一步包含选自由阿米洛利、流感抗原和白细胞介素组成的组的另外的一种或多种其它抗原。
施用免疫治疗组合物可以包括电穿孔或注射。受试者的免疫应答可以增加至少约4倍。受试者的免疫应答可以增加至少约2倍。流感病毒可以是甲型流感病毒。甲型流感病毒可以是亚型H5N1、H7N9或H1N1。甲型流感病毒可以是亚型H5N1。甲型流感病毒可以是亚型H7N9。受试者的增加的免疫应答可以提供至少约70％的流感病毒存活率。受试者的增加的免疫应答可以提供至少约100％的流感病毒存活率。
本发明进一步针对一种用于诊断有需要的受试者的流感病毒感染的方法。方法可以包括提供从受试者获得的样品并且测量样品中IL-17的水平。方法还可以包括将所测量的IL-17水平与IL-17的阈值水平进行比较，并且如果所测量的IL-17水平高于IL-17的阈值水平，那么确定受试者感染了流感病毒。IL-17可以是包含在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的肽。
样品可以是血液样品、血清样品或血浆样品。方法可以进一步包括向感染流感病毒的受试者施用包含IL-17的免疫治疗组合物。IL-17可以是包含在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的肽。方法可以进一步包括区分轻度流感病毒感染和重度流感病毒感染。流感病毒可以是亚型H5N1、H1N1或H7N9。
附图说明
图1A示出绘制小鼠组对IL-17A血清水平的图；图1B示出绘制感染后天数(dpi)对存活百分比的图；以及图1C示出绘制小鼠组对肺组织中病毒载量的图；
图2A示出绘制小鼠组对IL-17A血清水平的图；图2B示出绘制感染后天数(dpi)对存活百分比的图；以及图2C示出绘制小鼠组对肺组织中病毒载量的图；
图3A示出图3A绘制感染甲型流感病毒H7N9的小鼠的感染后天数(dpi)对体重减轻百分比的图；图3B示出绘制用0.1μg rIL-17A预处理小鼠的和感染甲型流感病毒H7N9的小鼠的dpi对体重减轻百分比的图；以及图3C示出绘制用0.5μg rIL-17A预处理的小鼠和感染甲型流感病毒H7N9的小鼠的dpi对体重减轻百分比的图；
图4A示出来自未处理过的小鼠(顶图)、用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠(中图)和在用甲型流感病毒H5N1激发前用0.5μg重组IL-17A(rIL-17A)预处理的小鼠(底图)的肺组织切片中的以及图4B示出来自未处理过的小鼠(顶图)、用甲型流感病毒H7N9激发的小鼠(中图)以及在用甲型流感病毒H7N9激发前用0.5μg rIL-17A预处理的小鼠(底图)的肺组织切片中的对CD8+T细胞特异的抗体的苏木精和曙红(H&E)染色和免疫组织化学；箭头指示在相应组织切片中已经浸润肺组织的CD8+T细胞；
图5A示出绘制人受试者对IL-17A血清水平的图；图5B示出绘制人受试者对IL-17A血清水平的图；图5C示出绘制人受试者对IL-17A血清水平的图；以及图5D绘制人受试者对IL-17A血清水平的图；
图6A示出绘制小鼠组对细胞因子水平的图；图6B示出绘制感染后天数(dpi)对存活百分比的图；以及图6C示出绘制dpi对存活百分比的图；
图7A示出绘制小鼠组对细胞因子水平的图；图7B示出绘制小鼠组对细胞因子水平的图；以及图7C示出绘制感染后天数(dpi)对存活百分比的图；
图8A示出绘制细胞类型对干扰素-γ(IFN-γ)产生细胞的百分比的图；图8B示出绘制感染后天数(dpi)对存活百分比的图；以及图8C示出绘制dpi对存活百分比的图；
图9A示出描绘将CD8+T细胞过继转移到受体小鼠中的实验方案的说明；图9B示出绘制感染后天数(dpi)对存活百分比的图；以及图9C示出绘制dpi对存活百分比的图；
图10A示出绘制小鼠类型对特异性溶胞百分比的图；以及图10B示出绘制CD8+T细胞群对特异性溶胞百分比的图；
图11A示出mRNA核苷酸序列；图11B示出编码核苷酸序列；以及图11C示出小家鼠(小鼠)IL-17A的氨基酸序列；
图12A示出mRNA核苷酸序列；图12B示出编码核苷酸序列；以及图12C示出智人(人)IL-17A的氨基酸序列；
图13A示出优化的小鼠IL-17A核苷酸序列，其中加下划线的序列含有BamHI位点(GGA TCC)和Kozak序列(GCC ACC)，并且加双下划线的序列含有终止密码子TGA和TAA以及XhoI位点(CTC GAG)；图13B示出优化的小鼠IL-17A编码核苷酸序列；以及图13C示出由图13A和图13B的优化的核苷酸序列(即，SEQ ID NO:7和8)编码的小鼠IL-17A氨基酸序列；以及
图14A示出优化的人IL-17A核苷酸序列，其中加下划线的序列含有BamHI位点(GGA TCC)和Kozak序列(GCC ACC)，并且加双下划线的序列含有终止密码子TGA和TAA以及XhoI位点(CTC GAG)；图14B示出优化的人IL-17A编码核苷酸序列；以及图14C示出由图14A和图14B的优化的核苷酸序列(即，SEQ ID NO:10和11)编码的人IL-17A氨基酸序列。
具体实施方式
详述
本发明涉及一种包含白细胞介素-17(IL-17)的免疫治疗组合物。免疫治疗组合物可以用于保护免受并且治疗任何数量的流感病毒，例如，病原性甲型流感病毒H5N1、H1N1和H7N9。所述保护和治疗可以显著提高感染甲型流感病毒如H5N1、H1N1和H7N9的受试者的存活率。存活率显著增加，这是因为免疫治疗组合物增加了由CD8+T细胞产生的抗病毒细胞因子干扰素-γ的水平。这些CD8+T细胞还具有细胞溶解活性，其破坏携带有甲型流感病毒的细胞，从而防止将溶胞并且成指数地感染身体中的其它细胞的甲型流感病毒颗粒的进一步产生。因此，本文还提供一种用于通过向有需要的受试者施用免疫治疗组合物来治疗和/或保护免受流感病毒感染的方法。
血清中的IL-17水平在感染流感病毒后增加。因此，本发明还涉及一种基于有需要的受试者中的血清IL-17水平诊断流感病毒感染的方法。
1.定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有如本领域的普通技术人员通常所理解的意义。如有冲突，将以本文件(包括定义)为准。虽然在本发明的实践或测试中可以使用与本文所描述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料，但以下描述了优选的方法和材料。本文所提及的所有公布、专利申请、专利以及其它参考文献以引用的方式整体并入本文。本文所公开的材料、方法和实施例仅是说明性的，并且不意图为限制性的。
如本文所用，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“可以(can)”、“含有(contain)”以及其变化形式意图是不排除另外行为或结构的可能性的开放式连接词、术语或词语。除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数引用。无论是否明确地提出，本公开还涵盖“包括本文所呈现的实施方案或要素”、“由本文所呈现的实施方案或要素组成”以及“主要由本文所呈现的实施方案或要素组成”的其它实施方案。
如本文所用的“佐剂”意指添加至本文所描述的免疫治疗组合物中以增强抗原的免疫原性的任何分子。
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”意指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可以进一步包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在向其施用核酸的个体或哺乳动物的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。
如本文所用的“互补序列”或“互补的”意指核酸可以意味着核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间的沃森-克里克(Watson-Crick)(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
如本文可互换使用的术语“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(“EP”)意指使用跨膜电场脉冲在生物膜中诱导微观通路(孔隙)；所述微观通路的存在允许生物分子如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水从细胞膜的一侧穿至另一侧。
如本文所用的“片段”或“免疫原性片段”意指编码能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽的核酸序列或其部分。片段可以是选自编码以下所列出的蛋白质片段的各种核苷酸序列中的至少一种的DNA片段。片段可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的一种或多种以下所列出的核酸序列。在一些实施方案中，片段可以包含以下所列出的核酸序列中的至少一种的至少20个核苷酸或更多、至少30个核苷酸或更多、至少40个核苷酸或更多、至少50个核苷酸或更多、至少60个核苷酸或更多、至少70个核苷酸或 更多、至少80个核苷酸或更多、至少90个核苷酸或更多、至少100个核苷酸或更多、至少150个核苷酸或更多、至少200个核苷酸或更多、至少250个核苷酸或更多、至少300个核苷酸或更多、至少350个核苷酸或更多、至少400个核苷酸或更多、至少450个核苷酸或更多、至少500个核苷酸或更多、至少550个核苷酸或更多、至少600个核苷酸或更多、至少650个核苷酸或更多、至少700个核苷酸或更多、至少750个核苷酸或更多、至少800个核苷酸或更多、至少850个核苷酸或更多、至少900个核苷酸或更多、至少950个核苷酸或更多或至少1000个核苷酸或更多。
如本文所用的片段或免疫原性片段还意指能够在哺乳动物中引发免疫应答的多肽序列或其部分。片段可以是选自以下所列出的各种氨基酸序列中的至少一种的多肽片段。片段可以包含至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的一种或多种以下所列出的蛋白质。在一些实施方案中，片段可以包含以下所列出的蛋白质中的至少一种的至少20个氨基酸或更多、至少30个氨基酸或更多、至少40个氨基酸或更多、至少50个氨基酸或更多、至少60个氨基酸或更多、至少70个氨基酸或更多、至少80个氨基酸或更多、至少90个氨基酸或更多、至少100个氨基酸或更多、至少110个氨基酸或更多、至少120个氨基酸或更多、至少130个氨基酸或更多、至少140个氨基酸或更多、至少150个氨基酸或更多、至少160个氨基酸或更多、至少170个氨基酸或更多、至少180个氨基酸或更多、至少190个氨基酸或更多、至少200个氨基酸或更多、至少210个氨基酸或更多、至少220个氨基酸或更多、至少230个氨基酸或更多或至少240个氨基酸或更多。
如本文所用的“基因构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包含可操作地连接至调控元件的起始信号和终止信号，所述调控元件包括能够在向其施用核酸分子的个体的细胞中指导表达的启动子和多腺苷酸化信号。如本文所用，术语“可表达的形式”是指含有必要调控元件的基因构建体，所述必要调控元件可操作地连接至编码蛋白质的编码序列，使得当所述基因构建体存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。
如本文在两种或更多种核酸或多肽序列的背景下所使用的术语“相同的”或“同一性”意指序列具有指定百分比的在指定区上相同的残基。可以通过以下方式来计算百分比：最优比对两个序列，在指定区上比较两个序列，确定相同残基出现在两个序列中的位置的数目以得到匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以指定区中的位置的总数目，并且将结果乘以100来得到序列同一性的百分比。在两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端并且比较的指定区仅包含单个序列的情况下，单个序列的 残基包括于计算的分母而不是分子中。在比较DNA和RNA时，可以认为胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等同的。可以手动地或通过使用计算机序列算法(如BLAST或BLAST2.0)来执行同一性。
如本文所用的“免疫应答”意指响应于抗原的引入而产生的宿主的免疫系统(例如，哺乳动物的免疫系统)的活化。免疫应答可以呈细胞应答或体液应答或两者兼有的形式。
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”意指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘也定义互补链的序列。因此，核酸还涵盖所描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可以用于与给定核酸相同的目的。因此，核酸还涵盖大致上相同的核酸及其互补序列。单链提供可以在严格杂交条件下与靶序列杂交的探针。因此，核酸还涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可以是单链的或双链的，或可以含有双链序列和单链序列的部分。核酸可以是DNA、基因组和cDNA、RNA或杂交体，其中核酸可以含有脱氧核糖核苷酸与核糖核苷酸的组合以及碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。可以通过化学合成方法或通过重组方法获得核酸。
如本文所用的“可操作地连接”意指基因的表达受其在空间上所连接的启动子的控制。启动子可以定位于受其控制的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可以与所述启动子与其所控制的基因(即启动子的来源基因)之间的距离大约相同。如本领域中已知的，可以容许所述距离的变化而不损失启动子功能。
如本文所用的“肽、”“蛋白质、”或“多肽”可以意指氨基酸的连接序列，并且可以是天然的、合成的、或天然与合成的修饰或组合。
如本文所用的“启动子”意指合成的或天然来源的分子，所述分子能够在细胞中赋予、激活或增强核酸的表达。启动子可以包含一个或多个特异性转录调控序列，以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可以包括远端增强子或阻遏子元件，它们可以位于与转录起始位点相距多达数千个碱基对处。启动子可以源自以下来源，包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物。启动子可以调控基因组分相对于其中发生表达的细胞、组织或器官或相对于发生表达所处的发育阶段或响应于外部刺激(如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)而组成型地或差异性地表达。启动子的代表性实例包括细菌噬菌体T7启动子、细菌噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac 操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。
“信号肽”和“前导序列”在本文可互换使用，并且是指可以连接在本文所列出的IL-17蛋白(和/或一种或多种其它抗原)的氨基末端的氨基酸序列。信号肽/前导序列通常指导蛋白质的定位。本文所使用的信号肽/前导序列优选地促进蛋白质从其产生细胞分泌。信号肽/前导序列通常在从细胞分泌后，从蛋白质(通常称为成熟蛋白质)的剩余部分裂解。信号肽/前导序列连接在蛋白质的N末端。
如本文所用的“受试者”可以意指想要或需要用本文所描述的免疫治疗组合物治疗的哺乳动物。哺乳动物可以是人、黑猩猩、狗、猫、马、牛、小鼠或大鼠。
如本文所用的“大致上相同的”可以意指第一氨基酸序列和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个氨基酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。“大致上相同的”还可以意指第一核酸序列和第二核酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100或更多个核苷酸的区域上至少60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
如本文所用的“测试样品”或“样品”通常是指针对目标分析物进行测试和/或怀疑含有目标分析物的生物材料。生物材料可源自任何生物来源。生物材料的实例包括但不限于：粪便、全血、血清、血浆、红血细胞、血小板、间质液、唾液、眼晶状体液、脑脊髓液、汗液、尿液、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液、阴道液、月经、羊水、精液、或土壤、发酵液细胞培养物、化学反应混合物等。测试样品可如从生物来源获得后直接使用或在预处理以改变样品的特征之后使用。例如，所述预处理可包括从血液制备血浆、稀释粘性流体等。预处理的方法还可涉及过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰组分的灭活、试剂的添加、溶胞等。如果对测试样品采用所述预处理方法，那么所述预处理方法是使得目标分析物在测试样品中保持处于与未处理的测试样品(例如，即未经受任何所述一种或多种预处理方法的测试样品)中的目标分析物成比例的浓度。
如本文所用的“治疗(Treatment)”或“治疗(Treating)”可以意指通过预防、抑制、阻遏的手段保护动物免于疾病或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的免疫治疗组合物。抑制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床出现之前向动物施用本发明的免疫治疗组合物。阻遏疾病涉及在疾病的临床出现之后向动物施用本发明的免疫治疗组合物。
关于核酸而在本文中使用的“变体”意指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)与参考核酸或其互补序列大致相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其互补序列或与其大致相同的序列杂交的核酸。
变体可以进一步定义为通过氨基酸的插入、缺失、或保守性取代而在氨基酸序列上有所不同、但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括被特异性抗体结合或促进免疫应答的能力。变体还可以意指具有氨基酸序列的蛋白质，其中所述氨基酸序列大致上与具有保留至少一种生物活性的氨基酸序列的参考蛋白质相同。氨基酸的保守性取代，即用具有类似特性(例如，亲水性、带电区的程度和分布)的不同氨基酸置换氨基酸，在本领域被认为通常涉及微小变化。如本领域所理解的，这些微小变化可以部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴别。Kyte等，J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。本领域已知具有类似亲水指数的氨基酸可以被取代并且仍然保留蛋白质功能。在一方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可以用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的背景下氨基酸的亲水性的考虑允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，其是据报道与抗原性和免疫原性良好相关的有用测量。如本领域所理解的，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可以产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可以用彼此具有±2之内的亲水值的氨基酸执行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值均受所述氨基酸的具体侧链影响。与所述观察一致，与生物功能相容的氨基酸取代应理解为取决于氨基酸的相对相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它特性所揭示的。
变体可以是在全基因序列或其片段的全长上大致相同的核酸序列。核酸序列可在基因序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。变体可以是在氨基酸序列或其片段的全长上大致相同的氨基酸序列。氨基酸序列可在氨基酸序列或其片段的全长上80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同。
如本文所用的“载体”意指含有复制起点的核酸序列。载体可以是病毒载体、细菌噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是DNA载体或RNA载体。载体可以是自我复制的染色体外载体，并且优选是DNA质粒。
对于本文数值范围的叙述来说，明确地涵盖具有相同精确度的介于其间的每个中间数字。例如，对于6至9的范围来说，除6和9之外，还涵盖数字7和8，并且对于范围6.0至7.0来说，明确地涵盖数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
2.免疫治疗组合物
本文提供一种包含白细胞介素-17(IL-17)、其片段、其变体或其组合的免疫治疗组合物。免疫治疗组合物可以用于保护免受任何数量的流感病毒，从而基于病理学针对多种不同的流感进行治疗。如以下更详细地描述，与未施用免疫治疗组合物的受试者相比，所述保护和治疗可以显著提高感染流感病毒的受试者的存活率(和对受试者死亡的预防)。
与未施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答相比，免疫治疗组合物可以显著增加施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答，从而保护免受并且治疗流感病毒感染。免疫治疗组合物可以增加CD8+T细胞免疫应答。增加的CD8+T细胞应答可以包括增加的细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)应答。增加的CTL应答可以包括增加施用免疫治疗组合物的受试者中靶细胞的抗原特异性溶胞的量。增加的CD8+T细胞应答可以包括增加施用免疫治疗组合物的受试者中CD8+T细胞分泌IFN-γ的群体或频率。产生IFN-γ的CD8+T细胞可以具有受感染细胞的细胞溶解活性，从而在受感染的细胞溶胞后防止新的甲型流感病毒颗粒被细胞机器组装和成指数地感染其它细胞。
与未施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答相比，免疫治疗组合物可以使施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答增加约0.5倍至约15倍、约0.5倍至约10倍或约0.5倍至约8倍。与未施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答相比，免疫治疗组合物可以使施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答增加至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍或至少约15.0倍。
与未施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答相比，免疫治疗组合物还可以使施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答增加约50％至约1500％、约50％至约1000％或约50％至约800％。与未施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答相比，免疫治疗组合物可以使施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答增加至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约1100％、至少约1150％、至少约1200％、至少约1250％、至少约1300％、至少约1350％、至少约1450％或至少约1500％。
免疫治疗组合物可以是DNA免疫治疗组合物、肽免疫治疗组合物，或DNA免疫治疗组合物和肽免疫治疗组合物的组合。DNA免疫治疗组合物可以包含编码IL-17的核酸序列。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至IL-17的接头序列、前导序列或标签序列的另外序列。肽免疫治疗组合物可以包含IL-17肽、IL-17蛋白、其变体、其片段或其组合。DNA免疫治疗组合物和肽免疫治疗组合物的组合可以包含以上所描述的编码IL-17的核酸序列和IL-17肽或IL-17蛋白，其中IL-17肽或IL-17蛋白和所编码的IL-17具有相同氨基酸序列。
免疫治疗组合物可以进一步包含一种或多种其它抗原，例如但不限于，小分子(例如，阿米洛利)、流感病毒多核苷酸、流感病毒肽、编码不同于IL-17的细胞因子的核酸以及不同于IL-17肽的细胞因子肽。在下面对所述一种或多种其它抗原进行描述。一种或多种其它抗原可以包含在以上所描述的DNA、肽或DNA免疫治疗组合物和肽免疫治疗组合物的组合中。
本发明的免疫治疗组合物可以具有有效免疫治疗组合物所要求的特征，如为安全的，以使得免疫治疗组合物本身不会引起疾病或死亡；保护免受由暴露于活的病原体(如病毒或细菌)引起的疾病；诱导中和抗体来预防细胞的感染；诱导针对细胞内病原体的保护性T细胞；以及提供施用容易性、很少副作用、生物稳定性以及每剂量的低成本。
当施用至不同组织(如肌肉或皮肤)时，免疫治疗组合物可以进一步诱导免疫应答。当经由电穿孔或注射或皮下施用时，免疫治疗组合物可以进一步诱导免疫应答。
a.IL-17
如以上所描述，免疫治疗组合物包含IL-17、其单体、其二聚体、其同源二聚体、其异源二聚体、其片段、其变体或其组合。IL-17可以是IL-17A(还称为CTLA-8)、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(还称为IL-25)和IL-17F。IL-17细胞因子可以被分离并且来源于多种细胞类型，例如，17型T辅助(Th17)细胞、活化的T细胞和上皮细胞。IL-17细胞因子具有高度保守的C末端，所述C末端含有半胱氨酸结折迭结构；并且作为二硫键连接的二聚体来分泌(IL-17B除外)。IL-17B作为非共价二聚体来分泌。除同源二聚体之外，异源二聚体也可以在IL-17A与IL-17F之间形成。
免疫治疗组合物可以包含约0.001μg至约5μg、约0.005μg至约4μg、约0.01μg至约3μg、约0.05μg至约2μg或约0.1μg至约1μg的IL-17。免疫治疗组合物可以包含至少约0.001μg、至少约0.002μg、至少约0.003μg、至少约0.004μg、至少约0.005μg、至少约0.006μg、至少约0.007μg、至少约0.008μg、至少约0.009μg、至少约0.01μg、至少约0.02μg、至少约0.03μg、至少约0.04μg、至少约0.05μg、至少约0.06μg、至少约0.07μg、至少约0.08μg、至少约0.09μg、至少约0.1μg、至少约0.2μg、至少约0.3μg、至少约0.4μg、至少约0.5μg、至少约0.6μg、至少约0.7μg、至少约0.8μg、至少约0.9μg、至少约1.0μg、至少约1.5μg、至少约2.0μg、至少约2.5μg、至少约3.0μg、至少约3.5μg、至少约4.0μg、至少约4.5μg或至少约5.0μg的IL-17。
免疫治疗组合物的IL-17细胞因子通过IL-17受体家族的成员传导信号并且这些受体的活化触发细胞间通路，所述细胞间通路诱导促炎细胞因子(例如干扰素-γ(IFN-γ)、IL-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α))的产生。因此，IL-17细胞因子的过量表达可以促进自身免疫性疾病和炎症性疾病的发展，所述疾病如哮喘、类风湿性关节炎、银屑病、移植排斥反应、炎症性肠道疾病和多发性硬化。
IFN-γ具有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤特性，并且可以改变多种基因的转录以产生多种生理应答和细胞应答。由IFN-γ引起的一些作用包括促进自然杀伤(NK)细胞活性、引起正常细胞增加I类MHC分子的表达、增加巨噬细胞中的抗原呈递和溶酶体活性、诱导一氧化氮合酶(iNOS)以及促进Th1分化成有关细胞毒性CD8+T细胞的细胞免疫性，同时抑制体液(抗体)应答中的Th2分化。
细胞毒性CD8+T细胞(细胞毒性T淋巴细胞(CTL))是诱导感染病毒和其它病原体的细胞死亡的T细胞的亚组。在活化后，CTL经历克隆扩增以产生抗原特异性的效应细胞。效应CTL通过指导的胞吐作用(即，脱粒)分子的过程释放，所述分子杀死感染的细胞或靶细胞，例如，穿孔蛋白、粒溶蛋白和颗粒酶。当不再需要时，许多效应CTL死亡，但是一些效应细胞被保留为记忆细胞，以使得当再次遇到抗原时，记忆细胞分化成效应细胞以更快速地发动免疫应答。
如以上所描述，与未施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答相比，免疫治疗组合物可以增加施用免疫治疗组合物的受试者的免疫应答。这种增加的免疫应答可以包括增加的CD8+T细胞应答。增加的CD8+T细胞应答可以包括增加的细胞毒性CD8+T淋巴细胞(CTL)应答。增加的CTL应答可以包括增加施用免疫治疗组合物的受试者中靶细胞的抗原特异性溶胞的量。增加的CD8+T细胞应答可以包括增加施用免疫治疗组合物的受试者中CD8+T细胞分泌IFN-γ的群体或频率。产生IFN-γ的CD8+T细胞可以具有细胞溶解活性。
进而，与未施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平相比，施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平可以增加约0.5倍至约15倍、约0.5倍至约10倍或约0.5倍至约8倍。与未施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平相比，施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平可以增加至少约0.5倍、至少约1.0倍、至少约1.5倍、至少约2.0倍、至少约2.5倍、至少约3.0倍、至少约3.5倍、至少约4.0倍、至少约4.5倍、至少约5.0倍、至少约5.5倍、至少约6.0倍、至少约6.5倍、至少约7.0倍、至少约7.5倍、至少约8.0倍、至少约8.5倍、至少约9.0倍、至少约9.5倍、至少约10.0倍、至少约10.5倍、至少约11.0倍、至少约11.5倍、至少约12.0倍、至少约12.5倍、至少约13.0倍、至少约13.5倍、至少约14.0倍、至少约14.5倍或至少约15.0倍。
与未施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平相比，施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平还可以增加约50％至约1500％、约50％至约1000％或约50％至约800％。与未施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平相比，施用免疫治疗组合物的受试者中的IFN-γ水平还可以增加至少约50％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％、至少约500％、至少约550％、至少约600％、至少约650％、至少约700％、至少约750％、至少约800％、至少约850％、至少约900％、至少约950％、至少约1000％、至少约1050％、至少约1100％、至少约1150％、至少约1200％、至少约1250％、至少约1300％、至少约1350％、至少约1450％或至少约1500％。
(1)IL-17A
IL-17可以是IL-17A、其片段、其变体或其组合。IL-17A可以是单体、同源二聚体或与IL-17F形成的异源二聚体。
IL-17A可以是来自任何数量的有机体的IL-17A蛋白，例如，小鼠(小家鼠)IL-17A蛋白和人(智人)IL-17A蛋白。小鼠IL-17A蛋白可以具有图11C中所示的氨基酸序列 (即，SEQ ID NO:3)、其片段、其变体或其组合。人IL-17A蛋白可以具有图12C中所示的氨基酸序列(即，SEQ ID NO:6)、其片段、其变体或其组合。IL-17A蛋白可以进一步包含一种或多种另外的氨基酸序列元件，例如，免疫球蛋白E(IgE)前导序列(例如，SEQ ID NO:14)、血凝素(HA)标签或IgE前导序列和HA标签二者。
编码IL-17A的核酸可以来自任何数量的有机体，例如小鼠(小家鼠)(图11A的SEQ ID NO:1和图11B的SEQ ID NO:2)和人(智人)(图12A的SEQ ID NO:4和图12B的SEQ ID NO:5)。可以关于密码子使用和对应RNA转录物对编码IL-17A的核酸进行优化。可以针对表达对编码IL-17A的核酸进行密码子和RNA优化。编码IL-17A的核酸可以包含Kozak序列(例如，GCC ACC)以提高翻译起始的效率。编码IL-17A的核酸可以包含多个终止密码子(例如，TGA TAA)以提高翻译终止的效率。编码IL-17A的核酸还可以编码免疫球蛋白E(IgE)前导序列。IgE前导序列在核酸中可以位于IL-17A的5’。编码IL-17A的核酸还可以包含编码IgE前导序列的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:13)。
优化的小鼠IL-17A可以是核酸序列SEQ ID NO:7，其编码SEQ ID NO:9(图13A和图13C)。在一些实施方案中，优化的小鼠IL-17A可以是在SEQ ID NO:7中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其它实施方案中，优化的小鼠IL-17A可以是编码在SEQ ID NO:9中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。
优化的小鼠IL-17A可以是核酸序列SEQ ID NO:8，其编码SEQ ID NO:9(图13B和图13C)。在一些实施方案中，优化的小鼠IL-17A可以是在SEQ ID NO:8中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
小鼠IL-17A可以是在SEQ ID NO:9中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
优化的人IL-17A可以是核酸序列SEQ ID NO:10，其编码SEQ ID NO:12(图14A和图14C)。在一些实施方案中，优化的人IL-17A可以是在SEQ ID NO:10中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。在其它实施方案中，优化的人IL-17A可以是编码在SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列的核酸序列。
优化的人IL-17A可以是核酸序列SEQ ID NO:11，其编码SEQ ID NO:12(图14B和图14C)。在一些实施方案中，优化的人IL-17A可以是在SEQ ID NO:11中所列出的核酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列。
人IL-17A可以是在SEQ ID NO:12中所列出的氨基酸序列的全长上具有至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％,、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
可以提供SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12的免疫原性片段。免疫原性片段可以包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:12。在一些实施方案中，免疫原性片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列(如免疫球蛋白E(IgE)前导序列)。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。
可以提供具有与SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:12的免疫原性片段具有同一性的氨基酸序列的蛋白质的免疫原性片段。所述片段可以包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:9和/或SEQ ID NO:12具有95％或更高同一性的蛋白质。一些实施方案涉及与本文的IL-17A蛋白序列的免疫原性片段具有96％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的IL-17A蛋白序列的免疫原性片段具有97％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的IL-17A蛋白序列的免疫原性片段具有98％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的IL-17A蛋白序列的免疫原性片段具有99％或更高同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含前导序列，例如，免疫球蛋白前导序列，如IgE前导序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含前导序列。
一些实施方案涉及SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的免疫原性片段。免疫原性片段可以包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、 至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列(例如，如IgE前导序列的免疫球蛋白前导序列)的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。
可以提供具有与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的免疫原性片段具有同一性的核苷酸序列的核酸的免疫原性片段。所述片段可以包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10和/或SEQ ID NO:11具有95％或更高同一性的核酸。一些实施方案涉及与本文的IL-17A核酸序列的免疫原性片段具有96％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的IL-17A核酸序列的免疫原性片段具有97％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的IL-17A核酸序列的免疫原性片段具有98％或更高同一性的免疫原性片段。一些实施方案涉及与本文的IL-17A核酸序列的免疫原性片段具有99％或更高同一性的免疫原性片段。在一些实施方案中，免疫原性片段包含编码前导序列(例如，如IgE前导序列的免疫球蛋白前导序列)的序列。在一些实施方案中，免疫原性片段不含编码前导序列的编码序列。
b.其它抗原
免疫治疗组合物可以进一步包含与IL-17组合的一种或多种其它抗原。抗原可以是小分子，例如，如以下所描述的阿米洛利或其它流感核酸、蛋白质或其组合。抗原可以是细胞因子，例如，不同于如以下所描述的IL-17的白细胞介素。
抗原可以是核酸序列、氨基酸序列或其组合。核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA、其变体、其片段或其组合。核酸序列还可以包含编码通过肽键连接至抗原的接头序列或标签序列的另外序列。氨基酸序列可以是蛋白质、肽、其变体、其片段、或其组合。
抗原可以含于来自任何数量的有机体(例如，病毒)的蛋白质、核酸，或其片段、其变体或其组合中，抗原可以与流感相关。
(1)阿米洛利
免疫治疗组合物可以进一步包含阿米洛利。阿米洛利可以具有以下结构：
阿米洛利可以促进将DNA摄取至细胞中。因此，阿米洛利可以以能够促进将DNA摄取至细胞中的量存在于免疫治疗组合物中。与不含任何阿米洛利的相同免疫治疗组合物相比，细胞的DNA摄取的适合有效增加包括多于5％、多于25％或多于50％。
阿米洛利具有适用于促进将DNA摄取至细胞中的一些功能性衍生物。功能性衍生物可以通过修饰位于嘧啶环(在3-位置处)或三胺上的氨基部分来形成。阿米洛利的功能性衍生物可以是苯扎明(benzamil)或5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)。
(2)流感抗原
免疫治疗组合物可以进一步包含流感抗原或其片段或其变体。流感抗原是能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型的免疫应答的那些流感抗原。抗原可以包含全长翻译产物HA0、亚单位HA1、亚单位HA2、其变体、其片段或其组合。流感抗原包含由任何甲型流感亚型(如H7N9、H1N1、H5N1亚型)分离的肽的全长或片段。流感血凝素抗原可以是源自多种甲型流感血清型H1株的共有序列、源自多种甲型流感血清型H2株的共有序列、含有源自不同组的多种甲型流感血清型H1株的两个不同的共有序列的部分的杂交序列或源自多种乙型流感株的共有序列。流感血凝素抗原可以来自乙型流感。
流感抗原还可以含有至少一种抗原表位，所述抗原表位可以有效对抗特定流感免疫原，针对所述流感免疫原的免疫应答可以被诱导。抗原可以提供存在于完整流感病毒中的免疫原性位点和表位的全部谱系。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1、血清型H2、血清型H1N1、血清型H7N9和/或血清型H7N1的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以通过组合两个不同的共有血凝素抗原序列或其部分获得的杂交共有血凝素抗原序列。两个不同的共有血凝素抗原序列各自可以源自不同组的一种血清型的多种甲型流感病毒株，如血清型H1的多种甲型流感病毒株。抗原可以是可以源自血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列，所述血凝素抗原序列来自多种乙型流感病毒株。
在一些实施方案中，流感抗原可以是H1HA、H2HA、H3HA、H5HA或BHA抗原。或者，流感抗原可以是包含共有H1氨基酸序列或共有H2氨基酸序列的共有血凝素抗原。共有血凝素抗原可以是包含两个不同的共有H1序列的部分的合成杂交共有H1序列，所述两个不同的共有H1序列各自源自来自另一者的不同组的序列。为合成杂交共有H1蛋白的共有HA抗原的实例是包含U2氨基酸序列的蛋白质。共有血凝素抗原可以是源自来自乙型流感株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。
共有血凝素抗原可进一步包含一种或多种另外的氨基酸序列元件。共有血凝素抗原可进一步在其N末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列。共有血凝素抗原可进一步包含免疫原性标签，所述免疫原性标签是可以通过可容易获得的抗体进行检测的独特免疫原性表位。所述免疫原性标签的实例是可以连接在共有血凝素C末端的9个氨基酸的流感HA标签。在一些实施方案中，共有血凝素抗原可进一步在其N末端上包含IgE或IgG前导氨基酸序列并且在其C末端上包含HA标签。
共有血凝素抗原可以是由共有流感氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可以是包含非流感蛋白质序列和流感蛋白质序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。
共有H1蛋白的实例包括可由共有H1氨基酸序列组成的那些共有H1蛋白或进一步包含另外元件(如IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者)的那些共有H1蛋白。
共有H2蛋白的实例包括可由共有H2氨基酸序列组成的那些共有H2蛋白或进一步包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些共有H2蛋白。
杂交共有H1蛋白的实例包括可由共有U2氨基酸序列组成的那些杂交共有H1蛋白或进一步包含IgE前导序列或HA标签、或IgE前导序列和HA标签二者的那些杂交共有H1蛋白。
杂交共有乙型流感血凝素蛋白的实例包括可以由共有BHA氨基酸序列组成的那些杂交共有乙型流感血凝素蛋白或它可以包含IgE前导序列或HA标签，或IgE前导序列和HA标签二者。
共有血凝素蛋白可以由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。与可以是源自来自不同株和变体的多种不同的血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白不同，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所使用的编码序列可以不同于用 于编码共有血凝素蛋白序列所源自的多个不同的血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些编码序列。共有核酸序列可以是密码子优化的和/或RNA优化的。共有血凝素核酸序列可包含位于5’非翻译区域中的Kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列是血凝素编码序列的5’。N末端前导子可以促进分泌。N末端前导子可以是IgE前导子或IgG前导子。共有血凝素核酸序列可以包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可以位于蛋白质的C末端上并且编码它的序列是HA编码序列的3’。免疫原性标签提供独特表位，存在针对所述表位的可容易获得的抗体，以使得可以在测定中使用所述抗体来检测和证实蛋白质的表达。免疫原性标签可以是位于蛋白质的C末端处的HA标签。
(3)白细胞介素
免疫治疗组合物可进一步包含白细胞介素或其它白细胞介素和或不同于IL-17的细胞因子的组合。白细胞介素可以是IL-23、其变体、其片段或其组合。白细胞介素还可以是IL-33、其变体、其片段或其组合。白细胞介素可以是IL-21、其变体、其片段或其组合。
c.载体
免疫治疗组合物可以包含一种或多种载体，所述载体包含编码IL-17的核酸并且可进一步包含一种或多种抗原。一种或多种载体可以能够表达IL-17并且可进一步包含一种或多种抗原。载体可以具有含有复制起点的核酸序列。载体可以是质粒、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可以是自我复制染色体外载体抑或整合至宿主基因组中的载体。
一种或多种载体可以是表达构建体，所述表达构建体通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体位于细胞内部，那么通过细胞转录和翻译机器核糖体复合物产生由基因编码的蛋白质。质粒经常经过工程改造以含有调控序列，所述调控序列充当增强子和启动子区域，并且导致表达载体上携带的基因的有效转录。本发明的载体表达大量稳定的信使RNA，和因此形成的蛋白质。
载体可具有表达信号(如强启动子、强终止密码子)、启动子与克隆基因之间的距离的调节以及转录终止序列和PTIS(可移动翻译起始序列)的插入。
(1)表达载体
载体可以是环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导适当的受试者细胞中的特定核苷酸序列的表达。载体可以具有可操作地连接至编码抗原的核苷酸序列的启动子，所述核苷酸序列可以可操作地连接至终止信号。载体还可以含有核苷酸序列的正确翻译所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可以是嵌合的，这意味着至少一种其组分相对于至少一种它的其它组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下，所述启动子仅在宿主细胞暴露于一些特定外部刺激时起始转录。在多细胞有机体的情况下，启动子还可以是对特定组织或器官或发育阶段特异性的。
(2)环状载体和线性载体
载体可以是环状质粒，所述环状质粒可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如，具有复制起点的自主复制质粒)。
载体可以是pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
本文还提供能够经由电穿孔有效地递送至受试者并且表达一种或多种所需的蛋白质、肽和/或抗原的线性核酸或线性表达盒(“LEC”)。LEC可以是没有任何磷酸主链的任何线性DNA。DNA可编码IL-17并且可进一步包含一种或多种抗原。LEC可包含启动子、内含子、终止密码子和/或多腺苷酸化信号。IL-17的表达可由启动子控制并且所述启动子可进一步控制所述一种或多种抗原的表达。LEC可不包含任何抗生素抗性基因和/或磷酸主链。LEC可不包含与所需的IL-17基因表达不相关的其它核酸序列，并且LEC可进一步不包含与所述一种或多种抗原不相关的其它核酸序列。
LEC可源自能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原。质粒可以是pNP(Puerto Rico/34)或pM2(New Caledonia/99)。质粒可以是WLV009、pVAX、pcDNA3.0或provax，或能够表达编码IL-17并且可进一步包含一种或多种抗原的DNA并且使细胞能将序列翻译成IL-17和由免疫系统识别的一种或多种抗原的任何其它表达载体。
LEC可以是pcrM2。LEC可以是pcrNP。pcrNP和pcrMR可以分别源自pNP(Puerto Rico/34)和pM2(New Caledonia/99)。
(3)启动子、内含子、终止密码子和多腺苷酸化信号
载体可具有启动子。启动子可以是能够驱动基因表达并且调控所分离核酸的表达的任何启动子。所述启动子是经由DNA依赖性RNA聚合酶转录所需的顺式作用序列 元件，所述顺式作用序列元件转录本文所描述的IL-17序列并且可进一步转录本文所描述的一个或多个抗原序列。用于指导异源核酸表达的启动子的选择取决于具体应用。在载体中，启动子可定位在距离转录起始点与其天然环境中距离转录起始位点大约相同的位置上。然而，可容许所述距离的变化而不损失启动子功能。
启动子可以可操作地连接至编码抗原以及转录物的有效多腺苷酸化、核糖体结合位点和翻译终止所需的信号的核酸序列。启动子可以是CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯(Rous)肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子，或对于真核细胞中的表达显示有效的另一种启动子。
载体可包含增强子和具有功能性剪接供体和受体位点的内含子。载体可含有位于结构基因下游的转录终止区来提供有效终止。可从与启动子序列相同的基因获得或可从不同的基因获得终止区。
d.赋形剂和免疫治疗组合物的其它组分
免疫治疗组合物可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可以是功能性分子，如媒介物、佐剂、载体或稀释剂。药学上可接受的赋形剂可以是转染促进剂，其可以包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸盐，并且聚-L-谷氨酸盐可以小于6mg/ml的浓度存在于免疫治疗组合物中。转染促进剂还可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物以及囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸还可结合基因构建体施用而使用。DNA质粒免疫治疗组合物还可包含转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白、聚阴离子、聚阳离子或纳米颗粒，或其它已知的转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸盐(LGS))或脂质。免疫治疗组合物中的转染剂的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可以是佐剂。佐剂可以是在替代性质粒中表达的或在免疫治疗组合物中作为蛋白质与以上质粒组合递送的其它基因。佐剂可选自由以下各项组 成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞虏获趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括信号序列缺失的IL-15并且任选地包括来自IgE的信号肽)。佐剂可以是IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板衍生的生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18，或其组合。
可以用作佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变体形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、IL-22、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、无活性的NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素应答基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK LIGAND、Ox40、Ox40 LIGAND、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2以及其功能性片段。
免疫治疗组合物可进一步包含如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所描述的基因免疫治疗组合物促进剂，所述专利文献以引用的方式全部并入。
可以根据待使用的施用方式来配制免疫治疗组合物。可注射的免疫治疗组合物药物组合物可以是无菌、不含热原和不含微粒的。可以使用等渗制剂或溶液。用于等渗性的添加剂可以包括氯化钠、右旋糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。免疫治疗组合物可以包含血管收缩剂。等渗溶液可以包括磷酸盐缓冲盐水。免疫治疗组合物可以进一步包含稳定剂，其包括明胶和白蛋白。稳定剂可以允许制剂在室温或环境温度下稳定持续延长的时间段，所述稳定剂包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。
3.诊断方法
本发明还针对一种用于诊断有需要的受试者的流感病毒感染的方法。方法可以包括提供从受试者获得的样品。样品可以是血液样品、血浆样品或血清样品。方法还可以包括测量样品中的IL-17水平，以及将所测量的IL-17水平和与正常、健康的受试者相关的IL-17的阈值水平进行比较。正常、健康的受试者可以与小于约50 pg/mL的 IL-17水平相关。50pg/mL可以是用于区分正常、健康受试者与感染流感病毒的受试者的阈值水平，其中正常、健康的受试者可以与小于约50pg/mL的IL-17水平相关，而感染流感病毒的受试者可以与大于约50pg/mL的IL-17水平相关。
方法可以进一步包括如果所测量的IL-17水平高于与正常、健康的受试者相关的IL-17的阈值水平，那么确定受试者感染了流感病毒。正常、健康的受试者可以与小于约50pg/mL的IL-17水平相关。如果所测量的IL-17水平大于约50pg/mL，那么受试者感染了流感病毒。如果所测量的IL-17水平小于约50pg/mL，那么受试者未感染流感病毒。可以通过施用免疫治疗组合物来治疗感染流感病毒的受试者。可以通过施用免疫治疗组合物来治疗与大于约50pg/mL的IL-17水平相关的受试者。
所述方法可以进一步包括区分轻度流感病毒感染和重度流感病毒感染。患有轻度流感病毒感染的受试者可以与大于约50pg/mL或大于约500pg/mL的IL-17水平相关。患有轻度流感病毒感染的受试者可以与大于约500pg/mL的IL-17水平相关。患有重度流感病毒感染的受试者可以与大于约50pg/mL、但小于约500pg/mL的IL-17水平相关。换句话说，患有重度流感病毒感染的受试者可以与约50pg/mL与约500pg/mL之间的IL-17水平相关。
与从患有重度流感病毒感染的受试者获得的样品相比，从患有轻度流感病毒感染的受试者获得的样品可以具有更高的IL-17水平。与从患有重度流感病毒感染的受试者获得的样品相比，从患有轻度流感病毒感染的受试者获得的样品可以具有高至少约0.2倍、至少约0.3倍、至少约0.4倍、至少约0.5倍、至少约0.6倍、至少约0.7倍、至少约0.8倍、至少约0.9倍、至少约1.0倍、至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约1.6倍、至少约1.7倍、至少约1.8倍、至少约1.9倍、至少约2.0倍、至少约2.1倍、至少约2.2倍、至少约2.3倍、至少约2.4倍、至少约2.5倍、至少约2.6倍、至少约2.7倍、至少约2.8倍、至少约2.9倍、至少约3.0倍、至少约3.1倍、至少约3.2倍、至少约3.3倍、至少约3.4倍、至少约3.5倍、至少约3.6倍、至少约3.7倍、至少约3.8倍、至少约3.9倍或至少约4.0倍的IL-17水平。与从患有重度流感病毒感染的受试者获得的样品相比，从患有轻度流感病毒感染的受试者获得的样品可以具有高至少约2.0倍的IL-17水平。
4.治疗和/或预防的方法
本发明还针对一种通过向受试者施用免疫治疗组合物来增加受试者对流感的免疫应答的方法。增加的免疫应答可以用于治疗、预防和/或保护免受受试者的疾病，例如，流感病毒感染。增加的免疫应答可以提供约60％至约100％、约65％至约100％、约70％ 至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约60％至约95％、约60％至约90％、约60％至约85％、约60％至约80％、约60％至约75％或约60％至约70％的流感病毒感染的存活率。增加的免疫应答可以提供至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的流感病毒感染的存活率。
增加的免疫应答可以防止约60％至约100％、约65％至约100％、约70％至约100％、约75％至约100％、约80％至约100％、约85％至约100％、约90％至约100％、约95％至约100％、约60％至约95％、约60％至约90％、约60％至约85％、约60％至约80％、约60％至约75％或约60％至约70％的由流感病毒感染所致的死亡。增加的免疫应答可以防止至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的由流感病毒感染所致的死亡。
免疫治疗组合物剂量可以是在1μg至10mg之间的活性组分/kg体重/时间，并且可以是20μg至10mg组分/kg体重/时间。可以每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或31天施用免疫治疗组合物。用于有效治疗的免疫治疗组合物剂量的数目可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
a.流感病毒
如以上所描述，与未施用免疫治疗组合物的受试者相比，施用免疫治疗组合物的受试者可以具有增加的免疫应答。增加的免疫应答可以用于治疗、预防和/或保护免受流感病毒。流感病毒可以是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。流感病毒可以是甲型流感病毒。
(1)甲型流感病毒
流感病毒可以是甲型流感病毒。基于两种表面蛋白(即血凝素(H)和神经氨酸酶(N))的身份将甲型流感病毒分成亚型。分别存在血凝素的十七种不同的亚型和神经氨酸酶的十种不同的亚型。因此，甲型流感病毒是通过血凝素和神经氨酸酶的相应亚型进行鉴别。甲型流感病毒可以是任何数量的亚型，例如但不限于，H3N2、H1N1、H5N1和H7N9。
b.施用
可以根据制药领域中的技术人员所熟知的标准技术来配制免疫治疗组合物。所述组合物可以由医学领域的技术人员在考虑了如具体受试者的年龄、性别、体重和病状以及施用途径的这类因素之后，按其熟知的剂量和技术进行施用。受试者可以是哺乳动物，如人、马、牛、猪、绵羊、猫、狗、大鼠或小鼠。
可以预防性地或治疗性地施用免疫治疗组合物。在预防性施用中，可以以足以诱导免疫应答的量施用免疫治疗组合物。在治疗性应用中，以足以引起治疗效果的量向有需要的受试者施用免疫治疗组合物。足以达到此目标的量定义为“治疗有效剂量”。对于这种用途有效的量取决于(例如)所施用的免疫治疗组合物方案的具体组成、施用方式、疾病的阶段和严重程度、患者的总体健康状况以及处方医师的判断。
可以通过如文献中所描述的本领域熟知的方法来施用免疫治疗组合物，所述文献如下：Donnelly等(Ann.Rev.Immunol.15:617-648(1997))；Felgner等(美国专利号5,580,859，1996年12月3日发布)；Felgner(美国专利号5,703,055，1997年12月30日发布)；以及Carson等(美国专利号5,679,647，1997年10月21日发布)，所有所述文献的内容以引用的方式整体并入本文。可以(例如)使用免疫治疗组合物枪将免疫治疗组合物的DNA与可以施用至个体的颗粒或珠粒进行复合。本领域的技术人员将知道药学上可接受的载体(包括生理学上可接受的化合物)的选择取决于(例如)表达载体的施用途径。
可以经由多种途径来递送免疫治疗组合物。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌肉内或皮下递送。其它途径包括口服施用、鼻内和阴道内途径。特别是对于免疫治疗组合物的DNA来说，可以将免疫治疗组合物递送至个体的组织的间隙空间(Felgner等，美国专利号5,580,859和5,703,055，所有所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。还可以将免疫治疗组合物施用至肌肉，或可以经由皮内或皮下注射或经皮(如通过离子电渗疗法)施用。还可以采用免疫治疗组合物的表皮施用。表皮施用可以涉及机械地或化学地刺激表皮的最外层，以刺激对刺激物的免疫应答(Carson等，美国专利号5,679,647，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文)。
还可以配制免疫治疗组合物，用于经由鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载体是固体)可以包括具有(例如)在约10微米至约500微米范围中的颗粒大小的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即，通过鼻道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。、制剂可以是鼻用喷雾剂、滴鼻剂或通过喷雾器进行气雾剂施用。制剂可以包含免疫治疗组合物的水性溶液或油性溶液。
免疫治疗组合物可以是液体制剂，如混悬剂、糖浆或酏剂。免疫治疗组合物还可以是用于肠胃外、皮下、皮内、肌肉内或静脉内施用(例如，可注射施用)的制剂，如无菌混悬剂或乳剂。
免疫治疗组合物可以掺入脂质体、微球体或其它聚合物基质中(Felgner等，美国专利号5,703,055；Gregoriadis,Liposome Technology,第I卷至第III卷(第二版，1993)，所述文献的内容以引用的方式整体并入本文)。脂质体可以由磷脂或其它脂质组成，并且可以是制造和施用相对简单的无毒的、生理学上可接受的和可代谢的载体。
可以经由电穿孔，(如)通过美国专利号7,664,545中所描述的方法来施用免疫治疗组合物，所述专利的内容以引用的方式并入本文。电穿孔可以通过美国专利号6,302,874、5,676,646、6,241,701、6,233,482、6,216,034、6,208,893、6,192,270、6,181,964、6,150,148、6,120,493、6,096,020、6,068,650和5,702,359中所描述的方法和/或装置来进行，所述专利的内容以引用的方式整体并入本文。可经由微创设备来进行电穿孔。
微创电穿孔设备(“MID”)可以是用于将以上所描述的免疫治疗组合物和相关流体注射至身体组织中的装置。所述设备可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述设备适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将DNA注射至所述身体组织中。这具有以下优点：在插入针的同时逐渐注射DNA和相关流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。由于注射的DNA分布在较大面积上，可减少注射过程中经受的疼痛。
MID可在不使用针的情况下将免疫治疗组合物注射至组织中。MID可将免疫治疗组合物作为小的流或射流以使得免疫治疗组合物穿透组织的表面并且进入下层组织和/或肌肉的力进行注射。小的流或射流之后的力可由压缩气体(如在几分之一秒内通过微小孔的二氧化碳)的膨胀提供。微创电穿孔设备的实例和使用它们的方法在公布的美国专利申请号20080234655、美国专利号6,520,950、美国专利号7,171,264、美国专利号6,208,893、美国专利号6,009,347、美国专利号6,120,493、美国专利号7,245,963、美国专利号7,328,064和美国专利号6,763,264中进行描述，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
MID可包括产生无痛地穿透组织的液体的高速射流的注射器。这类无针注射器可商购获得。本文可以使用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783、4,447,223、5,505,697和4,342,310中所描述的那些，每个所述专利的内容以引用的方式并入本文。
可以使用无针注射器将呈适用于直接或间接电转运形式的所需的免疫治疗组合物引入(例如注射)至待治疗的组织中，通常通过将组织表面与注射器接触，以便以足以 导致免疫治疗组合物渗透至组织中的力致动药剂射流的递送。例如，如果待治疗的组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么将药剂朝向粘膜或皮肤表面以足以导致药剂渗透穿过角质层并且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力进行喷射。
无针注射器非常适合于将免疫治疗组合物递送至所有类型的组织，特别是递送至皮肤和粘膜。在一些实施方案中，无针注射器可以用于将含有免疫治疗组合物的液体推送至表面并且进入受试者的皮肤或粘膜中。可以使用本发明的方法治疗的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽部、口咽、唇、咽、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
MID可具有将组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列(例如设置成矩形或正方形图案)中的多对电极之间脉冲来提供优于在一对电极之间脉冲的结果的改良的结果。(例如)在标题为“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开的是针阵列，其中多对针可在治疗性治疗过程中进行脉冲。在所述应用中(其以引用的方式并入本文，如同其全文陈述一样)，针安置在环形阵列中，但具有连接器和转换装置，从而实现相对对的针电极之间的脉冲。可使用用于将重组表达载体递送至细胞的一对针电极。这种设备和系统在美国专利号6,763,264中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。或者，可使用单针设备，所述设备允许DNA注射和使用类似于正常注射针的单针电穿孔并且施加比通过目前所使用设备递送的电压低的电压的脉冲，从而减少患者经受的电感觉。
MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括具有相同直径或不同直径的两个或多个针。针可均匀或不均匀地间隔开。针可在0.005英寸与0.03英寸之间、0.01英寸与0.025英寸之间，或0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可以是0.0175英寸。针可间隔开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或更多。
MID可由脉冲发生器和在单个步骤中递送免疫治疗组合物和电穿孔脉冲的两个或更多个针免疫治疗组合物注射器组成。脉冲发生器可允许经由闪存卡操作的个人计算机灵活地编程脉冲和注射参数，以及电穿孔和患者数据的全面记录和储存。脉冲发生器可在短的时间段期间递送多种伏特脉冲。例如，脉冲发生器可递送100ms持续时间的三个15伏特脉冲。所述MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen 1000系统，所述系统在美国专利号7,328,064中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
MID可以是CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell PA)设备和系统，其是便于将大分子(如DNA)引入身体或植物中选定组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极、皮下针、提供从可编程恒流脉冲控制器至多个针电极的导电链路的电连接器，以及电源。操作者可以握住安装在支撑结构上的多个针电极，并且将它们牢牢地插入到身体或植物中的选定组织中。然后经由皮下针将大分子递送到选定组织中。激活可编程恒流脉冲控制器，并且将恒流电脉冲施加至多个针电极。所施加的恒流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。由于细胞的过度加热造成的细胞死亡通过借助于恒流脉冲限制组织中的功率消耗而得以最小化。Cellectra设备和系统在美国专利号7,245,963中进行描述，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
MID可以是Elgen 1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen 1000系统可包括提供中空针的设备；和流体递送部件，其中装置适于在使用中致动流体递送部件，以便在将针插入身体组织中的过程中同时(例如，自动地)将流体(本文所描述的免疫治疗组合物)注射至所述身体组织中。优点是：在插入针的同时逐渐注射流体的能力导致通过身体组织的流体的更均匀分布。还据信，由于注射的流体的体积分布在较大面积上，减少了在注射过程中经受的疼痛。
此外，流体的自动注射有助于所注射流体的实际剂量的自动监测和配准。可以根据需要出于文件编制目的通过控制单元来储存这一数据。
应理解，注射速率可以是线性或非线性的，并且可在已经将针插入穿过待治疗的受试者的皮肤之后并且在将所述针进一步插入身体组织中时进行注射。
可通过本发明的装置将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但也可以是肌肉组织。
装置进一步包括用于引导针插入身体组织中的针插入部件。通过针插入的速率来控制流体注射的速率。这具有以下优点：既可以控制针插入，又可以控制流体的注射，以使得可以根据需要使插入速率与注射速率相匹配。它还使装置更易于用户操作。如果需要，可以提供用于将针自动地插入身体组织中的部件。
用户可以选择何时开始流体的注射。然而，理想地，在针的尖端到达肌肉组织时开始注射，并且装置可包括用于感测针何时插入至足以开始注射流体的深度的部件。这意味着当针达到所需深度(其将通常是肌肉组织开始处的深度)时，可以提示以自动地开始流体的注射。肌肉组织开始处的深度可以(例如)采用为预设针插入深度(如4mm的值)，所述深度将被认为是对于针穿过皮肤层来说是足够的。
感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻的变化的部件。在这种情况下，部件可不如此记录针在身体组织中的深度，而将相反适于随着针从不同类型的身体组织移动至肌肉中来感测阻抗或电阻的变化。这些替代方案中的任一个提供相对准确和简单地操作的感测可开始注射的部件。可以根据需要进一步记录针的插入深度，并且所述深度可以用于控制流体的注射，以使得根据正被记录的针的插入深度来确定待注射的流体的体积。
装置可进一步包括：用于支撑针的底座和用于在其中接纳底座的壳体，其中底座可相对于壳体移动，以使得当底座相对于壳体处于第一后方位置时，针缩回壳体内，并且当底座在壳体内处于第二前方位置时，针延伸出壳体外。由于壳体可以在患者的皮肤上对准，并且然后可以通过相对于底座移动壳体来将针插入患者的皮肤中，所以这对于用户来说是有利的。
如上所述，希望实现流体注射的受控速率，以使得在将针插入皮肤中时，流体在针的长度上均匀分布。流体递送部件可包括适于以受控速率注射流体的活塞驱动部件。可以(例如)通过伺服马达来激活活塞驱动部件。然而，可通过在轴向方向上相对于壳体移动的底座来致动活塞驱动部件。应理解，可以提供用于流体递送的替代装置。因此，(例如)可以提供可以被挤压用于以受控或非受控速率流体递送的的封闭容器来代替注射管和活塞系统。
以上所描述的装置可以用于任何类型的注射。然而，设想到它在电穿孔的领域中尤其有用，并且因此它可进一步包括用于向针施加电压的部件。这允许针不仅用于注射，而且还用作电穿孔过程中的电极。这一点是尤其有利的，因为它意味着电场被施加至与所注射的流体相同的面积。传统上电穿孔存在很难准确地将电极与之前注射的流体对准的问题，并且因此用户倾向于在较大的面积上注射大于所要求的体积的流体，并且在较高的面积上施加电场，以试图确保所注射的物质与电场之间的重叠。使用本发明，可减少所注射的流体的体积和所施加的电场的大小，同时实现电场与流体之间的良好配合。
5.治疗试剂盒
本文提供一种治疗试剂盒，所述试剂盒可以用于使用如以上所描述的治疗和/或预防方法来治疗受试者。治疗试剂盒可以包括免疫治疗组合物。治疗试剂盒可以与以上所描述的治疗和/或预防方法结合使用。治疗试剂盒还可以包括一个或多个容器，如小瓶或瓶子，其中每个容器含有单独的试剂。
根据本公开的治疗试剂盒优选包括用于进行本发明的治疗和/或预防方法和/或如何使用治疗试剂盒的说明书。本公开的治疗试剂盒包括的说明书可以粘贴到包装材料上或可以作为包装插入物包括在内。虽然说明书通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此类。本公开涵盖能够储存说明书并且将它们传达给最终用户的任何介质。所述介质包括但不限于：电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带和芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如本文所用，术语“说明书”可以包括提供说明书的网站(internet set)的地址。
6.诊断试剂盒
本文提供一种诊断试剂盒，所述诊断试剂盒可以用于通过执行如以上所描述的诊断方法来诊断有需要的受试者的流感病毒感染。诊断试剂盒可以与以上所描述的诊断方法结合使用。诊断试剂盒还可以包括一个或多个容器，如小瓶或瓶子，其中每个容器含有单独的试剂。诊断试剂盒可以进一步包括从用户角度可期望的其它一种或多种材料，如一种或多种缓冲液、一种或多种稀释剂、一种或多种标准，和/或在样品处理、洗涤或进行本文所描述的诊断方法的任何其它步骤中有用的任何其它材料。
根据本公开的诊断试剂盒优选包括用于进行本发明的诊断方法和/或如何使用诊断试剂盒的说明书。本公开的诊断试剂盒中包括的说明书可以粘贴到包装材料上或可以作为包装插入物包括在内。虽然说明书通常是书写或印刷的材料，但它们不限于此类。本公开涵盖能够储存说明书并且将它们传达给最终用户的任何介质。所述介质包括但不限于：电子存储介质(例如，磁盘、磁带、盒式磁带和芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。如以上所描述，术语“说明书”可以包括提供说明书的网站(internet set)的地址。
本发明具有多个方面，所述方面通过以下非限制性实施例说明。
7.实施例
实施例1
IL-17A介导对H5N1甲型流感病毒感染的抗性
为了确定IL-17A是否可以在体内介导对甲型流感病毒感染的抗性，如以下所描述在C57BL/6小鼠和IL-17A敲除的小鼠中检查H5N1甲型流感病毒感染。
通过经鼻施用病毒用5LD50的甲型流感病毒H5N1(A/鸡/河南/1/2004)对野生型C57BL/6小鼠进行激发。作为对照，通过鼻途径向第二组野生型C57BL/6小鼠施用磷 酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是甲型流感病毒H5N1。在感染后6天(dpi)，通过使用BDTM流式细胞微球阵列术(CBA)测量受激发的小鼠和对照小鼠的血清中的IL-17A蛋白水平。
如图1A中所示，与对照(未受激发的)小鼠相比，IL-17A蛋白水平在受激发的小鼠中显著增加。图1A中的数据代表三次独立实验，误差线反映平均值±平均值的标准误差(SEM)，并且**p<0.01(未配对的学生t-检验)。与对照小鼠相比，用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠具有约5倍的更高IL-17A水平。因此，这一数据指示血清中的IL-17A水平响应于H5N1甲型流感病毒感染而增加。
为了确定IL-17A是否介导针对甲型流感病毒感染的保护，将两组(每组n＝6)野生型C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天分别用0.1μg和0.5μg的重组IL-17A(rIL-17A)进行腹膜内(i.p.)预处理。rIL-17A是小鼠IL-17A同源二聚体。第三组(n＝6)野生型C57BL/6小鼠充当对照，并且不接受用rIL-17A预处理。第四组(n＝6)小鼠(IL-17A敲除的小鼠)也不接受用rIL-17A预处理。IL-17A敲除是在C57BL/6背景下。将四组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行鼻内感染，并且在用病毒激发后每日监测小鼠的死亡率持续16天。
如图1B中所示，IL-17A敲除的小鼠比未处理的C57BL/6小鼠更易受甲型流感病毒H5N1的激发。图1B中的数据代表三次独立实验。具体地说，IL-17A敲除的小鼠在10dpi时死亡，而未处理的C57BL/6小鼠在13dpi时死亡。相比之下，用rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠以剂量依赖性方式被保护免于甲型流感病毒H5N1的激发(图1B)。用0.1μg的rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠被适度地保护，并且在第16天，约70％的小鼠经历甲型流感病毒H5N1的激发仍然存活。用0.5μg的rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠是正常的，并且在第16天(即，研究结束)，100％的小鼠经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活。
为了确定病毒载量是否对应于由IL-17A提供的保护，将两组(每组n＝6)野生型C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天分别用0.1μg和0.5μg的重组IL-17A(rIL-17A)进行腹膜内(i.p.)预处理。第三组(n＝6)野生型C57BL/6小鼠充当对照，并且不接受用rIL-17A预处理。第四组(n＝6)小鼠(IL-17A敲除的小鼠)也不接受用rIL-17A预处理。将四组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行鼻内感染。在6dpi时，处死小鼠并且从每只小鼠收集肺组织。将肺组织匀浆化，并且通过定量实时聚合酶链式反应(PCR)分析来测定相应肺组织中的病毒载量。实时PCR分析检测甲型流感病毒H5N1的HA基因。
如图1C中所示，由用rIL-17A预处理所提供的保护与病毒载量相关。图1C中的数据代表三次独立实验，误差线反映平均值±SEM，*p<0.05(未配对的学生t-检验)，并且**p<0.01(未配对的学生t-检验)。与未用rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠相比，施用rIL-17A的两组C57BL/6小鼠具有较低水平的病毒载量。病毒载量还与向C57BL/6小鼠施用的rIL-17A的剂量相对应，其中0.5μg剂量的rIL-17A导致低于0.1μg剂量的rIL-17A的病毒载量。此外，如以上所讨论的更易受甲型流感病毒H5N1的激发的IL-17A敲除的小鼠具有高于用或未用rIL-17A预处理的野生型C57BL/6小鼠的病毒载量。
概括地说，以上数据指示IL-17A提供针对甲型流感病毒H5N1感染的保护(并且介导对甲型流感病毒H5N1感染的抗性)，因为IL-17A敲除的小鼠更易受病毒感染，而用rIL-17A预处理的野生型小鼠以剂量依赖性方式具有降低的病毒载量和增加的存活率。此外，这些数据指示IL-17A水平在感染甲型流感病毒H5N1后增加，并且因此，IL-17A水平反映流感病毒感染。
实施例2
IL-17A介导对H7N9甲型流感病毒感染的抗性
如以上所描述，IL-17A水平响应于甲型流感病毒H5N1感染而增加。IL-17A还提供针对甲型流感病毒H5N1感染的保护。为了确定IL-17A是否在体内介导对其它甲型流感病毒的抗性，如以下所描述在C57BL/6小鼠中检查H7N9甲型流感病毒感染。
通过经鼻施用病毒用10LD50的甲型流感病毒H7N9(A/上海/4664T/2013)对野生型C57BL/6小鼠进行激发。作为对照，通过鼻途径向第二组野生型C57BL/6小鼠施用磷酸盐缓冲盐水(PBS)，而不是甲型流感病毒H7N9。在感染后7天(dpi)，通过使用BDTM流式细胞微球阵列术(CBA)测量受激发的小鼠和对照小鼠的血清中的IL-17A蛋白水平。
如图2A中所示，与对照(未受激发的)小鼠相比，IL-17A蛋白水平在受激发的小鼠中显著增加。图2A中的数据代表三次独立实验，误差线反映平均值±平均值的标准误差(SEM)，并且***p<0.001(未配对的学生t-检验)。与对照小鼠相比，用甲型流感病毒H7N9激发的小鼠具有约5倍的更高IL-17A水平。这一数据指示血清中的IL-17A水平响应于H7N9甲型流感病毒感染而增加。因此，血清中的IL-17A水平响应于H7N9甲型流感病毒感染(实施例2)或H5N1甲型流感病毒感染(实施例1)而增加。
为了确定IL-17A是否介导针对H7N9甲型流感病毒感染的保护，将两组野生型C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天分别用0.1μg(n＝9)和0.5μg(n＝7)的重组IL-17A(rIL-17A)进行腹膜内(i.p.)预处理。第三组(n＝7)野生型C57BL/6小鼠充当对照，并且不接受用rIL-17A预处理。将三组小鼠在第0天用10LD50的甲型流感病毒H7N9进行鼻内感染，并且在用病毒激发后每日监测小鼠的死亡率持续16天。此外，在用病毒激发后每日监测小鼠的体重持续16天。
如图2B中所示，所有未用rIL-17A预处理并且用甲型流感病毒H7N9激发的C57BL/6小鼠早在8dpi时死亡。图2B中的数据代表三次独立实验。相比之下，约22.2％的用0.1μg rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠经历甲型流感病毒H7N9的激发仍然存活，并且在16dpi时是活的。约71.4％的用0.5μg rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠经历甲型流感病毒H7N9的激发仍然存活，并且在16dpi时是活的。此外，用rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠显示在病毒感染后初始体重减轻，但两组(即，0.1μg和0.5μgrIL-17A预处理)中的存活小鼠到16dpi时恢复全部或大部分减轻的体重(图3A、图3B和图3C)。如以上用甲型流感病毒H5N1观察到，用rIL-17A预处理以剂量依赖性方式提供针对甲型流感病毒H7N9的保护，其中较高剂量的rIL-17A提供针对甲型流感病毒H7N9更多的保护(和对甲型流感病毒H7N9的更大抗性)。
为了确定H7N9病毒载量是否对应于由IL-17A提供的保护，将两组(每组n＝5)野生型C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天分别用0.1μg和0.5μg的重组IL-17A(rIL-17A)进行腹膜内(i.p.)预处理。第三组(n＝5)野生型C57BL/6小鼠充当对照，并且不接受用rIL-17A预处理。将三组小鼠在第0天用10LD50的甲型流感病毒H7N9进行鼻内感染。在7dpi时，处死小鼠并且从每只小鼠收集肺组织。将肺组织匀浆化，并且通过定量实时聚合酶链式反应(PCR)分析来测定相应肺组织中的病毒载量。实时PCR分析检测了甲型流感病毒H5N1的HA基因。
如图2C中所示，由用rIL-17A预处理所提供的保护与病毒载量相关。图2C中的数据代表三次独立实验，误差线反映平均值±SEM，并且**p<0.01(未配对的学生t-检验)。与未用rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠相比，施用rIL-17A的两组C57BL/6小鼠具有显著较低水平的病毒载量。如用甲型流感病毒H5N1观察到的，在用rIL-17A预处理的小鼠的肺组织中以剂量依赖性方式检测到较低水平的甲型流感病毒H7N9。因此，用IL-17A预处理提供针对甲型流感病毒H5N1和H7N9的保护(并且介导对甲型流感病毒H5N1和H7N9的抗性)并且降低这两种病毒的病毒载量。
概括地说，以上数据指示IL-17A提供针对甲型流感病毒H7N9感染的保护(并且介导对甲型流感病毒H7N9感染的抗性)，因为用rIL-17A预处理的小鼠以剂量依赖性 方式具有降低的病毒载量和增加的存活率。此外，这些数据指示IL-17A水平在感染甲型流感病毒H7N9后增加，并且因此，IL-17A水平反映病毒感染。因此，实施例1和2的数据证明IL-17A提供针对多种甲型流感病毒(即，H5N1和H7N9)感染的保护(并且介导对多种甲型流感病毒(即，H5N1和H7N9)的抗性)，并且IL-17A水平反映任一种甲型流感病毒感染。
实施例3
用rIL-17A预处理的小鼠中的肺部炎症性应答
在感染甲型流感病毒H5N1和H7N9后，大量淋巴细胞浸润肺组织，其导致炎症、组织损伤和死亡。采用组织化学和免疫组织化学来检查用或未用rIL-17A预处理并且用甲型流感病毒H5N1或H7N9激发的小鼠的肺组织中的CD8+T细胞浸润。
具体地说，将一组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组C57BL/6小鼠不接受用rIL-17A预处理。将第一组和第二组C57BL/6小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行鼻内感染。第三组C57BL/6小鼠充当空白对照，并且因此，不接受用rIL-17A预处理并且不施用甲型流感病毒H5N1。在6dpi时，处死来自全部三组的小鼠并且从小鼠获得肺组织切片。将组织切片用苏木精和曙红(H&E)进行染色。还用对CD8+T细胞特异的抗体对组织切片进行免疫组织化学。
图4A中的顶图示出来自未处理过的小鼠的代表性肺组织切片的H&E染色(顶部，左图)和CD8+T细胞染色(顶部，右图)。天然小鼠充当正常或健康肺组织的外观的对照。来自用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠的肺组织展现出肺泡壁的增厚和CD8+T细胞的广泛分布(图4A，中间的左图和右图分别示出来自用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠的代表性肺组织切片的H&E染色和CD8+T细胞染色)。来自用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠的肺组织还显示出这些小鼠的重度支气管肺炎。
相比之下，在用甲型流感病毒H5N1激发前用rIL-17A预处理的小鼠的肺组织展现出轻度损伤和浸润CD8+T细胞的不连续的空间分布(图4A，底部的左图和右图分别示出来自在用甲型流感病毒H5N1激发前用rIL-17A预处理的小鼠的代表性肺组织切片的H&E染色和CD8+T细胞染色)。换句话说，与受激发的小鼠相比，在预处理的受激发小鼠的肺组织中发生较少CD8+T细胞的浸润，并且因此，与受激发小鼠的肺组织相比，预处理的受激发小鼠的肺组织展现出较少的组织损伤和炎症。总之，这些数据指示用rIL-17A预处理减少响应于用甲型流感病毒H5N1激发而发生的肺组织的CD8+T细胞浸润，从而减少对同一肺组织的损伤和炎症。
此外，在用甲型流感病毒H7N9激发的小鼠中检查肺组织中的CD8+T细胞浸润。具体地说，将一组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组C57BL/6小鼠不接受用rIL-17A预处理。将第一组和第二组C57BL/6小鼠在第0天用10LD50的甲型流感病毒H7N9进行鼻内感染。第三组C57BL/6小鼠充当空白对照，并且因此，不接受用rIL-17A预处理并且不施用甲型流感病毒H7N9。在6dpi时，处死来自全部三组的小鼠并且从小鼠获得肺组织切片。将组织切片用H&E进行染色。还用对CD8+T细胞特异的抗体对组织切片进行免疫组织化学。
图4B中的顶图示出来自未处理过的小鼠的代表性肺组织切片的H&E染色(顶部，左图)和CD8+T细胞染色(顶部，右图)。如以上所描述，未处理过的小鼠充当正常或健康肺组织的外观的对照。来自用甲型流感病毒H7N9激发的小鼠的肺组织也展现出肺泡壁的增厚和CD8+T细胞的广泛分布(图4B，中间的左图和右图分别示出来自用甲型流感病毒H7N9激发的小鼠的代表性肺组织切片的H&E染色和CD8+T细胞染色)。来自用甲型流感病毒H7N9激发的小鼠的肺组织也显示出这些小鼠的重度支气管肺炎。
相比之下，在用甲型流感病毒H7N9激发前用rIL-17A预处理的小鼠的肺组织展现出轻度损伤和浸润CD8+T细胞的不连续的空间分布(图4B，底部的左图和右图分别示出来自在用甲型流感病毒H7N9激发前用rIL-17A预处理的小鼠的代表性肺组织切片的H&E染色和CD8+T细胞染色)。换句话说，与受激发的小鼠相比，在预处理的受激发小鼠的肺组织中发生较少CD8+T细胞浸润，并且因此，与受激发小鼠的肺组织相比，预处理的受激发小鼠的肺组织展现出较少的组织损伤和炎症。总之，这些数据指示用rIL-17A预处理减少响应于用甲型流感病毒H7N9激发而发生的肺组织的CD8+T细胞浸润，从而减少对同一肺组织的损伤和炎症。
概括地说，用甲型流感病毒H5N1或H7N9激发的小鼠展现出显著的CD8+T细胞浸润肺组织、肺组织损伤、肺组织炎症和重度支气管肺炎。用rIL-17A预处理保护用甲型流感病毒H5N1或H7N9激发的小鼠，因为相对于在病毒激发之前未用rIL-17A预处理的小鼠，这些小鼠的肺组织的CD8+T细胞浸润减少，并且因此，受保护的小鼠具有减少的组织损伤和炎症。因此，IL-17A通过减少肺组织的CD8+T细胞浸润，来提供针对H5N1和H7N9病毒感染的保护(并且介导对H5N1和H7N9病毒感染的抗性)，否则肺组织的CD8+T细胞浸润将会导致肺组织损伤和炎症。
实施例4
感染甲型流感病毒的人受试者的IL-17A水平
以上的实施例1至3证明IL-17A保护小鼠免于感染甲型流感病毒H5N1和H7N9。此外，感染甲型流感病毒H5N1和H7N9的那些小鼠的IL-17A水平升高。为了确定感染甲型流感病毒的人受试者的IL-17A水平是否改变，对从健康人受试者和感染甲型流感病毒H3N2、H5N1、H1N1或H7N9的人受试者获得的血清中的IL-17A水平进行测量。
从50名健康人受试者和99名急性感染甲型流感病毒的人受试者收集血清样品并且进行分析。具体地说，通过使用BDTM流式细胞微球阵列术(CBA)来测量所收集的血清中的IL-17A水平。16名人受试者感染甲型流感病毒H3N2(即，季节性流感)。65名人受试者感染甲型流感病毒H1N1(即，大流行性流感)，其中16名和49名人受试者分别被鉴定为患有重度感染和轻度感染。18名人受试者感染甲型流感病毒H7N9，其中10名和8名人受试者分别被鉴定为患有重度感染和轻度感染。
与健康受试者相比，从感染甲型流感病毒H1N1或H7N9的受试者收集的血清中的IL-17A的水平显著升高(p<0.0001；图5A，其中每个符号表示个体受试者，数据是平均值±SEM，并且水平线表示每组受试者的相应平均值)。来自健康受试者的血清具有小于50pg/mL的IL-17A水平，而来自感染甲型流感病毒H1N1、H7N9或H3N2的受试者的血清具有大于50pg/mL的IL-17A水平。具体地说，与健康受试者相比，感染H1N1的受试者和感染H7N9的受试者分别具有平均16倍和12倍的更高IL-17A水平。与健康受试者相比，从感染甲型流感病毒H3N2的受试者收集的血清中的IL-17A水平也显著增加(p<0.05，图5A)。与健康受试者相比，感染H3N2的受试者的血清中具有平均2倍的更高IL-17A水平。
在受感染的受试者的血清中观察到的升高的IL-17A水平与病毒感染的严重程度对应。患有轻度感染的受试者(即，临床上轻度的受试者)仅展示出流感样症状，并且具有正常的胸部X射线和/或肺计算机断层摄影(CT)扫描。患有重度感染的受试者(即，临床上重度的受试者)具有以下特征：(1)发热持续3天以上；(2)剧烈咳嗽，有时有痰、血和/或胸痛；(3)呼吸困难和发绀；(4)不适感、反应慢、嗜睡和/或惊厥；(5)呕吐和/或腹泻，有时导致脱水；(6)胸部X-射线和/或肺CT扫描显示出多叶实变和重度肺炎；(7)呼吸衰竭或休克和/或多器官衰竭；和/或(8)进入重症监护室。
对于感染甲型流感病毒H1N1或H7N9的受试者来说，与临床上“重度”的受试者相比，临床上“轻度”的受试者展现出较高的IL-17A水平(图5B和图5C，其中每个符号表示个体受试者，数据是平均值±SEM，并且水平线表示每组受试者的相应平均值)。 与患有重度感染的受试者相比，轻度受试者的血清中具有约2倍的更高IL-17A水平。具体地说，来自轻度受试者的血清具有大于500pg/mL的IL-17A水平，而来自重度受试者的血清具有大于50pg/mL、但小于500pg/mL的IL-17A水平。
关于H5N1病毒感染，使用酶联免疫吸附测定来检测从2名感染甲型流感病毒H5N1的受试者在确认感染后第3天、第5天和第10天收集的血清中的IL-17A水平。一名受感染的受试者来自中国广州(GK受试者)，并且第二名受感染的受试者来自中国香港(HK受试者)。作为对照，还从3名健康受试者和1名患有不同于流感的病毒感染的受试者(即，非流感受试者)收集血清样品。
GK受试者住院治疗，并且在10天后由于重度肺功能障碍而死亡。GZ受试者在感染过程中具有较低的IL-17A水平(图5D，其中数据是平均值±SEM)。相比之下，与健康受试者、非流感受试者和GZ受试者相比，HK受试者具有升高的IL-17A水平(图5D)。HK受试者从H5N1病毒感染恢复。
概括地说，这些数据指示与健康受试者相比，感染甲型流感病毒(即，H3N2、H1N1、H7N9和H5N1)的人受试者中的IL-17A水平增加或升高。因此，在感染甲型流感病毒后，人(实施例4)和小鼠(实施例1和2)的IL-17A水平增加，并且因此，升高的IL-17A水平指示感染了甲型流感病毒。IL-17A水平还与人受试者的感染的严重程度对应，其中与患有重度病毒感染的受试者相比，患有轻度病毒感染的受试者的IL-17A水平更高。
实施例5
保护免受病毒感染不需要IL-6和TNF-α
IL-17A可诱导为先天性免疫应答的一部分的细胞因子，例如，白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)。IL-6和TNF-α可介导炎症。为了检查IL-17A是否经由IL-6和/或TNF-α来介导对甲型流感病毒感染的抗性，对从用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠收集的血清中的IL-6和TNF-α的水平进行测量。
具体地说，将两组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天分别用0.1μg和0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。将两组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。第三组C57BL/6小鼠充当对照，并且既不用rIL-17A预处理也不用甲型流感病毒H5N1激发(即，未处理过的小鼠)。在6dpi时，从小鼠收集血清，并且测量所收集的血清中的IL-6和TNF-α水平。
与未处理过的小鼠相比，在病毒激发前用rIL-17A预处理的小鼠的血清中具有增加的IL-6水平(图6A，**p<0.01)。IL-6水平的增加取决于预处理中所给予的rIL-17A的剂量，其中更高的rIL-17A剂量产生更高的血清IL-6水平。然而，用rIL-17A预处理并且用甲型流感病毒H5N1激发未改变TNF-α水平。
此外，将野生型(即，C57BL/6)小鼠、IL-6敲除的小鼠和TNFR1/2(即，TNF-α)敲除的小鼠单独地或与rIL-17A预处理组合用甲型流感病毒H5N1激发。然后测量感染之后的死亡率。如图6B中所示，野生型小鼠到约9dpi时死亡，而IL-6敲除的小鼠到12dpi时死亡。然而，100％的用rIL-17A预处理的野生型小鼠和IL-6敲除的小鼠经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活。这些数据指示虽然在用rIL-17A预处理之后，IL-6水平以剂量依赖性方式增加，但IL-6不是IL-17A介导的针对病毒激发的保护所需要的。
如图6C中所示，野生型小鼠和TNFR1/1敲除的小鼠分别到9dpi和12dpi时死亡。100％的用rIL-17A预处理的野生型小鼠和TNFR1/2敲除的小鼠经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活。这些数据指示TNF-α水平不响应于用rIL-17A预处理而变化，TNF-α也不是IL-17A介导的针对病毒激发的保护所需要的。
概括地说，IL-17A不依赖于IL-6和TNF-α来提供针对H5N1病毒感染的保护(并且介导对H5N1病毒感染的抗性)。
实施例6
保护免受病毒感染需要IFN-γ而不需要IL-4
细胞因子，例如白细胞介素-4(IL-4)和干扰素-γ(IFN-γ)，可控制由甲型流感病毒引起的感染。为了检查IL-17A是否经由IL-4和/或IFN-γ来介导对甲型流感病毒感染的抗性，对从用甲型流感病毒H5N1或H7N9激发的小鼠收集的血清中的IL-4和IFN-γ的水平进行测量。
具体地说，将两组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天分别用0.1μg和0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第三组C57BL/6小鼠不接受rIL-17A预处理。将三组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。第四组C57BL/6小鼠充当对照，并且既不用rIL-17A预处理也不用甲型流感病毒H5N1激发(即，未处理过的小鼠)。在6dpi时，从小鼠收集血清，并且对所收集的血清中的IL-4和IFN-γ水平进行测量。
如图7A中所示，在四组小鼠之间没有观察到IL-4水平的显著性差异。图7A中的数据代表三次独立实验。与未处理过的小鼠相比，用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠的IFN-γ水平增加。然而，与用甲型流感病毒H5N1激发的小鼠相比，IFN-γ水平响应于rIL-17A预处理而以剂量依赖性方式显著增加(图7A，*p<0.05(未配对的学生t检验))。用0.5μg的rIL-17A预处理的小鼠具有高于用0.1μg的rIL-17A预处理的小鼠、用H5N1激发的小鼠以及未处理过的小鼠的血清IFN-γ水平(图7A，分别约1.6倍、约3.25倍和约6.5倍的更高IFN-γ水平)。这些数据指示血清中的IFN-γ水平而不是IL-4水平响应于rIL-17A预处理而以剂量依赖性方式显著增加。
为了进一步检查IL-4和IFN-γ水平，重复以上实验，但用甲型流感病毒H7N9代替甲型流感病毒H5N1。具体地说，将两组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天分别用0.1μg和0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第三组C57BL/6小鼠不接受rIL-17A预处理。将三组小鼠在第0天用10LD50的甲型流感病毒H7N9进行激发。将H7N9病毒经鼻施用至小鼠。第四组C57BL/6小鼠充当对照，并且既不用rIL-17A预处理也不用甲型流感病毒H7N9激发(即，未处理过的小鼠)。在6dpi时，从小鼠收集血清，并且对所收集的血清中的IL-4和IFN-γ水平进行测量。
如图7B中所示，在四组小鼠之间没有观察到IL-4水平的差异。图7B中的数据代表三次独立实验。IFN-γ水平在用甲型流感病毒H7N9激发的小鼠与在病毒激发前用0.1μg rIL-17预处理的小鼠之间具有可比性。然而，与未接受预处理的小鼠和用0.1μgrIL-17A预处理的小鼠相比，用0.5μg rIL-17A预处理的小鼠的IFN-γ水平显著增加(图7B，**p<0.01(未配对的学生t检验))。具体地说，与未接受用rIL-17A预处理的小鼠相比，用0.5μg rIL-17A预处理的小鼠具有约1.9倍的更高IFN-γ水平。这些数据指示血清中的IFN-γ水平而不是IL-4水平响应于rIL-17A预处理而以剂量依赖性方式显著增加。
为了进一步检查IFN-γ，将野生型(即，C56BL/6)和IFN-γ敲除的小鼠单独地或与rIL-17A预处理组合用甲型流感病毒H5N1进行激发。具体地说，将一组野生型小鼠(n＝6)和一组IFN-γ敲除的小鼠(n＝6)在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组野生型小鼠(n＝6)和第二组IFN-γ敲除的小鼠(n＝6)不接受rIL-17A预处理。将四组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。在感染后针对死亡率每日监测小鼠持续16天。
如图7C中所示，用甲型流感病毒H5N1激发的野生型小鼠和IFN-γ敲除的小鼠分别到14dpi和10dpi时死亡。这一数据指示IFN-γ敲除的小鼠比野生型小鼠更易受H5N1病毒感染。此外，与未接受rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠相比，用rIL-17A 预处理IFN-γ敲除的小鼠延迟死亡。到16dpi时，约15％的用rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活。相比之下，100％的用rIL-17A预处理的野生型小鼠经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活。这些数据指示IL-17A通过IFN-γ介导对甲型流感病毒感染的抗性。换句话说，IFN-γ是有效保护免受甲型流感病毒感染所必需的。
概括地说，IL-4水平未响应于rIL-17A预处理而变化。然而，IFN-γ水平响应于rIL-17A预处理而以剂量依赖性方式增加，并且IL-17A经由IFN-γ保护免受甲型流感病毒感染。
实施例7
由CD8+T细胞和自然杀伤细胞产生的IFN-γ
在病毒感染过程中，IFN-γ可由CD4+T细胞、CD8+T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞分泌。为了确定对由rIL-17A预处理诱导而增加的IFN-γ水平负责的一个或多个细胞群，在6dpi时检测IFN-γ阳性细胞。
具体地说，将野生型(即，C57BL/6)小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组C57BL/6小鼠不接受rIL-17A预处理。将这两组野生型小鼠加上一组IL-17A敲除的小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。另一组C57BL/6小鼠充当对照，并且既不用rIL-17A预处理也不用甲型流感病毒H5N1激发(即，未处理过的小鼠)。在6dpi时从四组小鼠分离脾细胞，并且用福尔马林灭活的甲型流感病毒H5N1在体外刺激脾细胞12小时(h)。通过流式细胞术测量由CD4+T细胞、CD8+T细胞或NK细胞分泌的IFN-γ，所述流式细胞术检测IFN-γ的细胞内染色。
如图8A中所示，与来自从未接受rIL-17A预处理(但用病毒激发)的小鼠分离的CD4+T细胞的IFN-γ分泌相比，来自从用rIL-17A预处理(并且用病毒激发)的C57BL/6小鼠分离的CD4+T细胞的IFN-γ分泌被减少。因此，来自CD4+T细胞的IFN-γ分泌响应于rIL-17A预处理而减少。图8A中的数据代表三次独立实验。相比之下，与不存在rIL-17A预处理的情况相比，rIL-17A预处理显著增加来自CD8+T细胞的IFN-γ分泌(图8A，**p<0.01))。与不存在rIL-17A预处理的情况相比，rIL-17A预处理还显著增加来自NK细胞的IFN-γ分泌(图8A，*p<0.05))。因此，这些数据指示CD8+T细胞和NK细胞显著促成响应于rIL-17A预处理而观察到的增加的IFN-γ水平。
因为CD8+T细胞响应于rIL-17A预处理而分泌IFN-γ，所以检查缺乏CD8+T细胞的小鼠(即，CD8敲除的小鼠)耐受甲型流感病毒H5N1激发的能力，来确定IL-17A是否经由CD8+T细胞保护免受病毒感染。具体地说，将野生型(即，C57BL/6)小鼠和CD8敲除的小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组C57BL/6小鼠和第二组CD8敲除的小鼠不接受rIL-17A预处理。将四组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。在感染后针对死亡率每日监测小鼠持续16天。
如图8B中所示，用甲型流感病毒H5N1激发的野生型小鼠和CD8敲除的小鼠分别在12dpi和7dpi时死亡。这一数据指示CD8敲除的小鼠比野生型小鼠更易受H5N1病毒感染。此外，用rIL-17A预处理的CD8敲除的小鼠到8dpi时死亡，并且因此，与未接受rIL-17A预处理的CD8敲除的小鼠相比，用rIL-17A预处理CD8敲除的小鼠的死亡延迟1天(图8B)。如以上所观察，100％的用rIL-17A预处理的野生型小鼠经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活。这些数据指示IL-17A通过CD8+T细胞介导对甲型流感病毒感染的抗性。换句话说，CD8+T细胞是有效保护免受甲型流感病毒感染所必需的。
如以上所证明，NK细胞也响应于rIL-17A预处理而分泌IFN-γ。因此，检查缺失NK细胞的小鼠(即，抗NK 1.1小鼠)耐受甲型流感病毒H5N1激发的能力，来确定IL-17A是否经由NK细胞保护免受病毒感染具体地说，检查四组C57BL/6小鼠。第一组C57BL/6小鼠既不缺失NK细胞也不用rIL-17A预处理。将第二组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg rIL-17A进行腹膜内预处理。将第三组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天、第3天和第1天用抗NK 1.1中和单克隆抗体进行腹膜内注射。将第四组C57BL/6小鼠在病毒感染前第7天、第3天和第1天用抗NK 1.1中和单克隆抗体进行腹膜内注射，并且在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。将四组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。在感染后针对死亡率每日监测小鼠持续16天。
如图8C中所示，用甲型流感病毒H5N1激发的野生型小鼠和NK缺失的(即，抗NK 1.1)小鼠分别到12dpi和9dpi时死亡。这一数据指示NK缺失的小鼠比野生型小鼠更易受H5N1病毒感染。到16dpi时，约70％的用rIL-17A预处理的NK缺失的小鼠(即，抗NK 1.1+rIL-17A)经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活(图8C)。100％的用rIL-17A预处理的野生型小鼠经历甲型流感病毒H5N1激发仍然存活。这些数据指示NK细胞在促进IL-17A介导的针对病毒感染的保护中起的作用(比CD8+T细胞)较 小，因为与用rIL-17A预处理的野生型小鼠相比，缺失NK细胞但用rIL-17A预处理的小鼠具有适度降低的存活率(即，对病毒激发约100％相对于70％的存活率)。
概括地说，CD8+T细胞和NK细胞而不是CD4+T细胞的IFN-γ分泌响应于rIL-17A预处理而显著增加。由rIL-17A预处理提供的保护在不存在CD8+T细胞的情况下显著降低，但在不存在NK细胞的情况下适度降低。相反，在不存在CD8+T细胞的情况下，rIL-17A预处理延迟但不防止死亡。总之，这些数据指示产生IFN-γ的CD8+T细胞显著促成IL-17A介导的针对甲型流感病毒感染的保护(和对甲型流感病毒感染的抗性)。
实施例8
CD8+T细胞的过继转移
如以上所证明，IL-17A通过产生IFN-γ的CD8+T细胞提供针对甲型流感病毒感染的保护(并且介导对甲型流感病毒感染的抗性)。如以下更详细地描述，过继转移用于进一步确立产生IFN-γ的CD8+T细胞有助于IL-17A介导的保护。在图9A中示出用于CD8+T细胞的过继转移的方案。
具体地说，将来自rIL-17A预处理的感染H5N1的小鼠或未处理的感染H5N1的小鼠的野生型CD8+T细胞过继转移到感染H5N1的野生型小鼠中。简单地说，将第一组C57BL/6(即，野生型)小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组C57BL/6小鼠不用rIL-17A预处理。第三组小鼠，即缺乏CD8+T细胞的小鼠(即，CD8敲除的小鼠)用作对照，并且也不用rIL-17A处理。将三组C57BL/6小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将待接受过继转移的C57BL/6小鼠(即，受体小鼠)也在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。
在6dpi时，从用rIL-17A预处理的C57BL/6的小鼠(即，以上的第一组小鼠)中和从未接受rIL-17A预处理的C57BL/6的小鼠(即，以上的第二组小鼠)中分离CD8+T细胞。然后将从第一组小鼠中分离的1x107个CD8+T细胞过继转移到已经感染甲型流感病毒H5N1持续6天的C57BL/6(即，野生型)小鼠中，并且每日监测这些受体小鼠(即，图9B中的WT CD8T细胞+rIL-17A)的死亡率直到16dpi。此外，将从第二组小鼠中分离的1x107个CD8+T细胞过继转移到已经感染甲型流感病毒H5N1持续6天的C57BL/6(即，野生型)小鼠中，并且每日监测这些受体小鼠(即，图9B中的WT CD8+T细胞)的死亡率直到16dpi。还针对死亡率每日监测CD8敲除的小鼠直到16dpi(即，图9B中的CD8KO)。
如图9B中所示(以及在实施例7和图8B中所观察到的)，CD8敲除的小鼠在7dpi时死亡并且充当缺乏CD8+T细胞的小鼠的对照。图9B中的数据代表三次独立实验。接受来自第二组小鼠(即，未接受rIL-17A预处理但用甲型流感H5N1病毒激发的C57BL/6小鼠)的CD8+T细胞的受感染的C57BL/6小鼠在10dpi时死亡(图9B，WTCD8T细胞)。相比之下，50％的接受来自第一组小鼠(即，在用甲型流感H5N1病毒激发前用rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠)的CD8+T细胞的受感染的C57BL/6小鼠在16dpi时存活(图9B，WT CD8T细胞+rIL-17A)。这些数据指示从用rIL-17A预处理的小鼠分离的CD8+T细胞给受体小鼠提供针对病毒感染的保护(并且介导对病毒感染的抗性)。这些数据还指示在rIL-17A处理后，CD8+T细胞能够提供针对甲型流感病毒感染的保护，即使在已经感染所述病毒的小鼠中。
此外，将来自在病毒激发前接受或未接受rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠的CD8+T细胞过继转移到感染H5N1的野生型小鼠中，来进一步确立产生IFN-γ的CD8+T细胞有助于IL-17A介导的针对甲型流感病毒感染的保护。简单地说，将C57BL/6(即，野生型)小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。将第一组IFN-γ敲除的小鼠也在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组IFN-γ敲除的小鼠不用rIL-17A预处理。将两组IFN-γ敲除的小鼠和rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将待接受过继转移的C57BL/6(即，野生型)小鼠(即，受体小鼠)也在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。
在6dpi时，从用rIL-17A预处理的C57BL/6小鼠中分离CD8+T细胞，并且将1x107个这些所分离细胞过继转移到已经感染甲型流感病毒H5N1持续6天的C57BL/6小鼠中。每日监测这些受体小鼠(即，图9C中的WT CD8T细胞+rIL-17A)的死亡率直到16dpi。
此外在6dpi时，从用rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠(即，以上的第一组IFN-γ敲除的小鼠)中和从未接受rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠(即，以上的第二组IFN-γ敲除的小鼠)中分离CD8+T细胞。然后将从第一组IFN-γ敲除的小鼠中分离的1x107个CD8+T细胞过继转移到已经感染甲型流感病毒H5N1持续6天的C57BL/6(即，野生型)小鼠中。每日监测这些受体小鼠的死亡率直到16dpi(即，图9C中的IFN-γKO CD8T细胞+rIL-17A)。此外，将从第二组IFN-γ敲除的小鼠中分离的1x 107个CD8+T细胞过继转移到已经感染甲型流感病毒H5N1持续6天的C57BL/6(即，野生型小鼠)中。对于这些受体小鼠，每日监测死亡率直到16dpi(即，图9C中的IFN-γKO CD8T细胞)。
如图9C中所示(以及在图9B中所观察到的)，50％的接受来自rIL-17A预处理的受感染的C57BL/6小鼠的CD8+T细胞的受感染的C57BL/6小鼠在16dpi时存活(即，图9C中的WT CD8T细胞+rIL-17A)。这一数据与以上所描述的并且在图9B中所示的观察结果一致，并且因此充当图9C的过继转移实验的阳性对照。图9C中的数据代表三次独立实验。
接受来自第二组IFN-γ敲除的小鼠(即，在病毒激发前未接受rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠)的CD8+T细胞的受感染的C57BL/6小鼠在11dpi时死亡(图9C，IFN-γKO CD8T细胞)。这一数据指示不能产生IFN-γ并且源自未接受rIL-17预处理的小鼠的CD8+T细胞不能保护免受甲型流感H5N1病毒感染。接受来自第一组IFN-γ敲除的小鼠(即，在病毒激发前用rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠)的CD8+T细胞的受感染的C57BL/6小鼠在12dpi时死亡(图9C，IFN-γKO CD8T细胞+rIL-17A)。这一数据指示不能产生IFN-γ并且源自用rIL-17预处理的小鼠的CD8+T细胞不能保护免受甲型流感H5N1病毒感染。
概括地说，以上数据指示感染H5N1的小鼠在接受来自rIL-17预处理的小鼠的产生IFN-γ的CD8+T细胞之后恢复并且存活。接受不能产生IFN-γ的CD8+T细胞的感染H5N1的小鼠未从病毒感染中恢复和存活(无论是否用rIL-17预处理)。因此，产生IFN-γ的CD8+T细胞，而不是不能产生IFN-γ的那些CD8+T细胞，有助于IL-17A介导的针对甲型流感病毒感染的保护。CD8+T细胞和从这些CD8+T细胞产生的IFN-γ显著促成IL-17A介导的针对甲型流感病毒感染的保护。
实施例9
CD8+T细胞的溶解活性
细胞溶解性的CD8+T细胞还称为细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)。CTL可以具有抗病毒活性。因此，针对细胞溶解活性检查产生IFN-γ的CD8+T细胞，其有助于IL-17A介导的针对流感感染的保护。具体地说，如以下所描述使用细胞溶解活性的体内和体外测定。
关于细胞溶解活性的体内测定，从未处理过的C57BL/6小鼠(即，既未接受rIL-17A预处理也未用流感病毒激发的小鼠)制备同源脾细胞。将同源脾细胞分成两组。将第一组同源脾细胞用灭活的甲型流感病毒H5N1进行脉冲，并且用10μM的羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE，用于对细胞染色的荧光染料)进行标记。将第二组同源脾细胞用0.5μM的CFSE进行标记。将来自两组的相等数量的脾细胞混合在一起。
将野生型(即，C57BL/6)小鼠和缺乏CD8+T细胞的小鼠(即，CD8敲除的小鼠)在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组C57BL/6小鼠和第二组CD8敲除的小鼠不接受rIL-17A预处理。将四组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将H5N1病毒经鼻施用至小鼠。在6dpi时，将以上所描述的混合的脾细胞静脉内注射到这四组小鼠中。八小时之后，从受体小鼠中分离脾细胞，来确定体内抗原特异性细胞溶解的水平。
如图10A中所示，与未接受rIL-17A预处理的野生型小鼠相比，用rIL-17A预处理的野生型小鼠中的抗原特异性溶胞显著增加(即，分别为图10A中的WT和WT+rIL-17A)。图10A中的数据代表三次独立实验，平均值±SEM，并且***p<0.001(未配对的学生t-检验)。具体地说，rIL-17A预处理的野生型小鼠中的抗原特异性溶胞比未接受rIL-17A预处理的野生型小鼠中的抗原特异性溶胞高约4倍。这一数据指示rIL-17A预处理显著诱导CTL活性。
此外，接受和未接受rIL-17A预处理的CD8敲除的小鼠具有类似水平的抗原特异性细胞溶解活性(图10A，分别为CD8KO+rIL-17A和CD8KO)。而且，无论是否接受rIL-17A预处理，CD8敲除的小鼠的抗原特异性溶胞水平低于野生型小鼠的所观察到的抗原特异性溶胞水平。因此，与野生型小鼠的CTL活性相比，接受和未接受rIL-17A预处理的CD8敲除的小鼠中的CTL活性均降低约2倍。概括地说，这些数据指示CD8+T细胞是细胞溶解活性所需要的，并且这种细胞溶解活性响应于rIL-17A预处理而显著增加。
为了进一步检查CD8+T细胞的细胞溶解活性，并且确定IFN-γ产生是否是细胞溶解活性所必需的，使用体外测定来评估不同CD8+T细胞群的细胞溶解活性。具体地说，将野生型小鼠和IFN-γ敲除的小鼠在病毒感染前第7天和第2天用0.5μg的rIL-17A进行腹膜内预处理。第二组野生型小鼠和第二组IFN-γ敲除的小鼠不接受rIL-17A预处理。将四组小鼠在第0天用5LD50的甲型流感病毒H5N1进行激发。将病毒经鼻施用至小鼠。在6dpi时，从四组小鼠中分离CD8+T细胞并且用作效应T细胞。
从未处理过的C57BL/6小鼠(即，既未接受rIL-17A预处理也未用流感病毒激发的小鼠)制备同源脾细胞。将同源脾细胞分成两组。将第一组同源脾细胞用灭活的甲型流感病毒H5N1进行脉冲并且用10μM的CFSE进行标记。将第二组同源脾细胞用0.5μM的CFSE进行标记并且充当阴性对照。
然后将第一组和第二组脾细胞独立地与从四组小鼠中的每组小鼠中分离的效应T细胞混合。在3天之后，通过流式细胞术分析特异性溶胞。
如图10B中所示，与从未接受rIL-17A预处理的野生型小鼠中分离的CD8+T细胞相比，从用rIL-17A预处理的野生型小鼠中分离的CD8+T细胞具有更高水平的抗原特异性溶胞(分别为图10B中的WT CD8和WT CD8+rIL-17A)。图10B中的数据代表三次独立实验，平均值±SEM，并且**p<0.01(未配对的学生t-检验)。这一数据指示rIL-17A预处理增加CD8+T细胞的细胞溶解活性，如也在以上所讨论的体内测定中所观察到的(图10A和10B)。与从rIL-17A预处理的野生型小鼠中分离的CD8+T细胞相比，不能产生IFN-γ的CD8+T细胞具有显著降低的水平的抗原特异性溶解活性(分别为图10B中的WT CD8+rIL-17A和IFN-γKO CD8)。此外，从rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠中获得的CD8+T细胞具有与从未接受rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠中分离的CD8+T细胞类似水平的抗原特异性溶解活性(分别为图10B中的IFN-γKOCD8+rIL-17A和IFN-γKO CD8)。与从rIL-17A预处理的野生型小鼠中分离的CD8+T细胞的CTL活性相比，从接受和未接受rIL-17A预处理的IFN-γ敲除的小鼠中分离的CD8+T细胞的CTL活性分别降低约3倍和约2倍。这些数据指示与野生型小鼠相比，CD8+T细胞的细胞溶解活性在IFN-γ敲除的小鼠中显著受损。这些数据还指示在没有IFN-γ产生的情况下，rIL-17A预处理未显著诱导CD8+T细胞的细胞溶解活性。
概括地说，从体内和体外抗原特异性溶胞测定获得的数据证明由rIL-17A预处理诱导的CD8+T细胞的细胞溶解活性取决于IFN-γ的产生。
因此，这些数据连同来自以上实施例的数据证明：感染流感病毒的小鼠和人的IL-17A血清水平均显著增加，流感病毒感染的严重程度与人的IL-17A血清水平相对应，IL-17A敲除的小鼠更易受流感病毒感染，并且用rIL-17A预处理以剂量依赖性方式保护小鼠免于死亡。IL-17A介导的针对流感病毒感染的保护(和对流感病毒感染的抗性)由具有抗原特异性细胞溶解活性的产生IFN-γ的CD8+T细胞来促进。这些产生IFN-γ的CD8+T细胞由IL-17A处理来诱导。概括地说，IL-17A处理显著诱导抗病毒免疫应答，所述免疫应答保护接受所述IL-17A处理的受试者免于流感病毒感染。
应理解前述详细描述和随附实施例仅是说明性的，并且不应作为对本发明的范围的限制，本发明的范围仅由所附权利要求和其等效物界定。
所公开的实施方案的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。可以在不背离本发明的精神和范围的情况下做出这类变化和修改，包括但不限于与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间体、合成、组合物、制剂或使用的方法有关的那些变化和修改。

Claims (30)

  1. 一种用于针对流感病毒治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含IL-17的免疫治疗组合物，其中所述受试者由此抵抗多种流感病毒亚型。
  2. 如权利要求1所述的方法，其中IL-17是包含如在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的肽。
  3. 如权利要求1所述的方法，其中施用所述免疫治疗组合物包括电穿孔或注射。
  4. 如权利要求1所述的方法，其中所述流感病毒是甲型流感病毒。
  5. 如权利要求4所述的方法，其中所述甲型流感病毒是亚型H5N1、H7N9或H1N1。
  6. 如权利要求5所述的方法，其中所述甲型流感病毒是亚型H5N1。
  7. 如权利要求5所述的方法，其中所述甲型流感病毒是亚型H7N9。
  8. 如权利要求1所述的方法，其中所述受试者的免疫应答增加至少约4倍。
  9. 如权利要求8所述的方法，其中所述受试者的所述免疫应答增加至少约2倍。
  10. 如权利要求1所述的方法，其中所述受试者的增加的免疫应答提供至少约70％的流感病毒存活率。
  11. 如权利要求10所述的方法，其中所述受试者的所述增加的免疫应答提供至少约100％的流感病毒存活率。
  12. 如权利要求2所述的方法，其中所述免疫治疗组合物进一步包含编码所述IL-17肽的核酸。
  13. 如权利要求2所述的方法，其中所述免疫治疗组合物进一步包含选自由阿米洛利、流感抗原和白细胞介素组成的组的一种或多种其它抗原。
  14. 一种用于诊断有需要的受试者的流感病毒感染的方法，所述方法包括：
    (a)提供从所述受试者获得的样品；
    (b)测量所述样品中的IL-17水平；
    (c)将所述测量的IL-17水平与IL-17的阈值水平进行比较；以及
    (d)如果所述测量的IL-17水平高于IL-17的所述阈值水平，那么确定所述受试者感染流感病毒。
  15. 如权利要求14所述的方法，其中IL-17是包含如在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的肽。
  16. 如权利要求14所述的方法，其中所述样品是血液样品、血清样品或血浆样品。
  17. 如权利要求14所述的方法，其进一步包括向感染所述流感病毒的所述受试者施用包含IL-17的免疫治疗组合物。
  18. 如权利要求17所述的方法，其中IL-17是包含如在SEQ ID NO:12中列出的所述氨基酸序列的肽。
  19. 如权利要求14所述的方法，其进一步包括区分轻度流感病毒感染和重度流感病毒感染。
  20. 如权利要求14所述的方法，其中所述流感病毒是亚型H5N1、H1N1或H7N9。
  21. 一种免疫治疗组合物，其包含IL-17。
  22. 如权利要求21所述的免疫治疗组合物，其中IL-17由SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11编码。
  23. 如权利要求21所述的免疫治疗组合物，其中IL-17是包含如在SEQ ID NO:12中列出的氨基酸序列的肽。
  24. 如权利要求21所述的免疫治疗组合物，其中IL-17由核酸编码，并且其中所述免疫治疗组合物进一步包含IL-17肽。
  25. 如权利要求21所述的免疫治疗组合物，其进一步包含选自由阿米洛利、流感抗原和白细胞介素组成的组的一种或多种其它抗原。
  26. 如权利要求25所述的免疫治疗组合物，其中所述流感抗原选自由H1HA、H2HA、H3HA、H5HA、BHA抗原及其任何组合组成的组。
  27. 如权利要求25所述的免疫治疗组合物，其中所述白细胞介素选自由IL-23、IL-33、IL-21及其组合组成的组。
  28. 如权利要求21所述的免疫治疗组合物，其进一步包含药学上可接受的赋形剂。
  29. 如权利要求21所述的免疫治疗组合物，其中IL-17是IL-17肽的单体。
  30. 如权利要求21所述的免疫治疗组合物，其中IL-17是IL-17肽的二聚体。
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