CN105007938A - 流感核酸分子和由其制备的疫苗 - Google Patents

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Abstract

本文提供编码HA血凝素和/或乙型流感血凝素的新型共有氨基酸序列的核酸序列以及表达所述序列的遗传构建体/载体和疫苗。本文也提供用于使用提供的疫苗来产生针对一种或多种甲型流感血清型和/或乙型流感血清型或其组合的免疫反应的方法。

Description

流感核酸分子和由其制备的疫苗
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请号61/787,182的优先权权益，所述专利申请各自的内容以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及改进的流感病毒疫苗、用于诱导针对流感的免疫反应的改进的方法、用于相对于受感染流感哺乳动物宿主来诊断疫苗接种的哺乳动物宿主以及用于防治性和/或治疗性使个体对流感免疫的改进的方法。
发明背景
通常称为流行性感冒的流感是一种由正粘病毒科的RNA病毒引起的感染性疾病。流感或流行性感冒病毒会感染禽类和哺乳动物。正粘病毒科的五个属类中的三个是以下流感病毒：甲型流感病毒、乙型流感病毒和丙型流感病毒。在这些流感病毒中，甲型流感病毒最常见。
流感通常是通过由咳嗽或打喷嚏产生的浮质中的空气，以及通过与含有病毒的体液或污染表面直接接触来传播。季节性流感流行病在世界范围内发生，并且每年导致几十万例死亡。在一些年份中，大流行病发生，并且导致数百万例死亡。此外，家畜(特别是家禽和猪)也易患导致大量动物死亡和金钱损失的年度性流行病和偶发性大流行病。
在结构上，流感病毒是类似的，具有由类似分子组分组成的约80–120nm的通常呈球形或丝状的病毒粒子。包含病毒蛋白质和病毒RNA的中心核由病毒包膜覆盖，所述包膜由源于在其中产生病毒粒子的细胞的两种不同糖蛋白和脂质衣壳组成。两种其它不同糖蛋白锚定在病毒包膜内，并且包括在表面上向外突出的部分。
流感病毒RNA基因组通常以8个不同单链负义RNA区段形式提供，所述区段一起组成基因组的11个编码11种蛋白质(HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NEP、PA、PB1、PB1-F2、PB2)的病毒基因。8个RNA区段是：1)HA，其编码血凝素(制备一个病毒粒子需要约500个血凝素分子)；2)NA，其编码神经氨酸酶(制备一个病毒粒子需要约100个神经氨酸酶分子)；3)NP，其编码核蛋白；4)M，其通过使用来自同一RNA区段的不同阅读框来编码两种基质蛋白(M1和M2)(制备一个病毒粒子需要约3000个基质蛋白分子)；5)NS，其通过使用来自同一RNA区段的不同阅读框来编码两种不同非结构蛋白(NS1和NEP)；6)PA，其编码RNA聚合酶；7)PB1，其通过使用来自同一RNA区段的不同阅读框来编码RNA聚合酶和PB1-F2蛋白(诱导细胞凋亡)；以及8)PB2，其编码RNA聚合酶。
在这11种蛋白质中，血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是锚定在病毒包膜中，并且存在于病毒粒子的外表面上的两种大型糖蛋白。这些蛋白质充当针对流感的免疫反应的免疫原。HA，是一种介导病毒结合靶标细胞以及病毒基因组进入靶标细胞中的凝集素，表达为单一基因产物HA0，并且稍后由宿主蛋白酶加工以产生两个亚单位HA1和HA2，其一起在流感病毒粒子的表面上形成复合物。NA涉及于受感染细胞中产生的新产生的成熟病毒粒子的释放中。
甲型流感病毒存在16种已知HA血清型和9种已知NA血清型。病毒粒子中存在的不同血清型的身份通常用于描述病毒。举例来说，H1N1是具有HA血清型H1和NA血清型N1的流感病毒；H5N1是具有HA血清型H5和NA血清型N1的流感病毒。仅H1、H2和H3血清型以及N1和N2血清型通常感染人。
流感病毒株通常具有物种或属类特异性；即可感染猪的流感病毒株(猪流感病毒)通常不感染人或禽类；可感染禽类的流感病毒株(禽流感病毒)不感染人或猪；并且可感染人的流感病毒株(人流感病毒)不感染禽类或猪。然而，流感病毒株可突变，并且变得自一个物种至另一物种具有感染性。举例来说，仅感染猪的病毒株(猪流感)可突变或重组以变为可仅感染人或可感染猪与人两者的病毒株。通常称为“猪流行性感冒”的流行性感冒病毒是一种可感染人，并且源于先前对猪具有特异性的病毒株的流感病毒株，如H1N1病毒株(即猪流行性感冒病毒是一种猪源人流感或猪源性人流感)。通常称为“禽类流行性感冒”的流行性感冒病毒是一种可感染人，并且源于先前对禽类具有特异性的病毒株的流感病毒株，如H5N1病毒株(即禽类流行性感冒病毒是禽源人流感或禽源性人流感)。
在发达国家，季节性地向许多人，并且有时向家畜提供针对流感的疫苗接种。所用疫苗在它们的保护效果方面是有限的，因为由疫苗诱导的免疫反应对某些病毒亚型具有特异性。每年基于国际监测和科学家估计哪些病毒类型和病毒株将在给定年份中流行来开发并施用不同流感疫苗。病毒因区段的突变、重组和重配而显著变化。因此，在某一年份中产生的疫苗不被视为针对在次年广泛传播的季节性病毒株具有保护性。
美国疾病控制和预防中心通常提倡的“流行性感冒疫苗注射物”通常含有三种杀死/灭活的流感病毒：一种甲型(H3N2)病毒、一种甲型(H1N1)病毒和一种乙型病毒。因此，明显的是疫苗接种局限于对亚型的预测以及针对那个亚型的特异性疫苗的可用性。
已研究直接施用核酸序列以针对动物和人疾病进行疫苗接种，并且许多尝试已集中在有效且高效核酸递送手段以产生所需抗原的必要表达，从而导致免疫原性反应以及最终这个技术的成功。
DNA疫苗具有超过更传统疫苗接种方法(如活减毒病毒和重组蛋白质基疫苗)的许多概念性优势。DNA疫苗是安全、稳定、易于产生并且在人中良好耐受的，其中临床前试验指示少许质粒整合迹象[Martin,T.等,Plasmid DNA malaria vaccine:the potential for genomicintegration after intramuscular injection.Hum Gene Ther,1999.10(5):第759-68页；Nichols,W.W.等,Potential DNA vaccine integration intohost cell genome.Ann N Y Acad Sci,1995.772:第30-9页]。此外，归因于疫苗的功效不受预先存在的针对载体的抗体滴度影响的事实，DNA疫苗充分适于重复施用[Chattergoon,M.,J.Boyer和D.B.Weiner,Genetic immunization:a new era in vaccines and immune therapeutics.FASEB J,1997.11(10):第753-63页]。然而，临床采用DNA疫苗的一个主要阻碍已为当移动至较大动物中时，平台的免疫原性降低[Liu,M.A.和J.B.Ulmer,Human clinical trials of plasmid DNA vaccines.AdvGenet,2005.55:第25-40页]。在DNA疫苗免疫原的工程化方面的新近技术进步(如密码子优化、RNA优化以及添加免疫球蛋白前导序列)已使DNA疫苗的表达和免疫原性改进[Andre,S.等,Increasedimmune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gp120sequence with optimized codon usage.J Virol,1998.72(2):第1497-503页；Deml,L.等,Multiple effects of codon usage optimization onexpression and immunogenicity of DNA candidate vaccines encoding thehuman immunodeficiency virus type 1Gag protein.J Virol,2001.75(22):第10991-1001页；Laddy,D.J.等,Immunogenicity of novelconsensus-based DNA vaccines against avian influenza.Vaccine,2007.25(16):第2984-9页；Frelin,L.等,Codon optimization and mRNAamplification effectively enhances the immunogenicity of the hepatitis Cvirus nonstructural 3/4A gene.Gene Ther,2004.11(6):第522-33页]，并且，新近开发了质粒递送系统方面的技术，如电穿孔[Hirao,L.A.等,Intradermal/subcutaneous immunization by electroporation improvesplasmid vaccine delivery and potency in pigs and rhesus macaques.Vaccine,2008.26(3):第440-8页；Luckay,A.等,Effect of plasmid DNAvaccine design and in vivo electroporation on the resultingvaccine-specific immune responses in rhesus macaques.J Virol,2007.81(10):第5257-69页；Ahlen,G.等,In vivo electroporation enhances theimmunogenicity of hepatitis C virus nonstructural 3/4A DNA byincreased local DNA uptake,protein expression,inflammation,andinfiltration of CD3+T cells.J Immunol,2007.179(7):第4741-53页]。此外，研究已表明相较于单独天然抗原，使用共有免疫原可能够增加细胞免疫反应的宽度[Yan,J.等,Enhanced cellular immune responseselicited by an engineered HIV-1subtype B consensus-based envelopeDNA vaccine.Mol Ther,2007.15(2):第411-21页；Rolland,M.等,Reconstruction and function of ancestral center-of-tree humanimmunodeficiency virus type 1proteins.J Virol,2007.81(16):第8507-14页]。
一种用于如质粒DNA的递送核酸序列的方法是电穿孔(EP)技术。所述技术已用于用以递送如博莱霉素(bleomycin)的抗癌药物的人临床试验中，以及关于许多动物物种的许多临床前研究中。
仍然需要免疫原性流感共有血凝素蛋白、编码所述蛋白的核酸构建体和适用于在哺乳动物中诱导针对多种流感病毒株具有广泛交叉反应性的免疫反应的组合物。仍然需要有效针对流感的，具有经济性，并且在众多流感亚型之间有效治疗个体，包括能够针对多种流感病毒株进行交叉保护的疫苗。
发明概述
本发明提供一种多共有亚型疫苗，其中所述疫苗提供针对多种流感病毒株的交叉反应性。在一个实施方案中，疫苗包含至少一种共有血凝素抗原。
在一个实施方案中，共有血凝素抗原选自由H1血凝素、H2血凝素、H3血凝素和乙型流感血凝素及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，H1血凝素选自由HS09、H1Bris、H1TT、H1U及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，H3血凝素选自由H3HA-1、H3HA-2及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，乙型流感血凝素选自由BHA-1、BHA-2及其任何组合组成的组。
在一个实施方案中，HS09包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:2的核酸序列、与编码SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H1Bris包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:20的核酸序列、与编码SEQ ID NO:20的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H1TT包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:22的核酸序列、与编码SEQ ID NO:22的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H1U包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:36的核酸序列、与编码SEQ ID NO:36的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，HS09包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H1Bris包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:19、与SEQ ID NO:19至少95％同源的核酸序列；SEQID NO:19的片段；与SEQ ID NO:19的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H1TT包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:21、与SEQ ID NO:21至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:21的片段；与SEQ ID NO:21的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H1U包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:35、与SEQ ID NO:35至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:35的片段；与SEQ ID NO:35的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H3HA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:38的核酸序列、与编码SEQ ID NO:38的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H3HA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:24的核酸序列、与编码SEQ ID NO:24的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H3HA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:37、与SEQ ID NO:37至少95％同源的核酸序列；SEQID NO:37的片段；与SEQ ID NO:37的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，H3HA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:23、与SEQ ID NO:23至少95％同源的核酸序列；SEQID NO:23的片段；与SEQ ID NO:23的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，BHA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:14的核酸序列、与编码SEQ ID NO:14的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，BHA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:26的核酸序列、与编码SEQ ID NO:26的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，BHA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:13、与SEQ ID NO:13至少95％同源的核酸序列；SEQID NO:13的片段；与SEQ ID NO:13的片段至少95％同源的核酸序列。
在一个实施方案中，BHA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:25、与SEQ ID NO:25至少95％同源的核酸序列；SEQID NO:25的片段；与SEQ ID NO:25的片段至少95％同源的核酸序列。
本发明也提供一种在哺乳动物中诱导针对多种流感病毒株的交叉反应性的方法。在一个实施方案中，方法包括向有需要的哺乳动物施用本发明的疫苗。在一个实施方案中，本发明的疫苗包含至少一种共有血凝素抗原。
在一个实施方案中，分开向哺乳动物施用各共有血凝素抗原。在一个实施方案中，同时向哺乳动物施用各共有血凝素抗原。
本文提供包含选自由以下组成的组的核酸序列的分离的核酸分子：SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1至少95％同源的核酸序列；SEQID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:6；与SEQ ID NO:6至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:6的片段；与SEQ ID NO:6的片段至少95％同源的核酸序列；SEQID NO:9、与SEQ ID NO:9至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:9的片段；与SEQ ID NO:9的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:13；与SEQ ID NO:13至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:13的片段；与SEQ ID NO:13的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:19；与SEQ ID NO:19至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19的片段；与SEQ ID NO:19的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:21；与SEQ ID NO:21至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21的片段；与SEQ ID NO:21的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:23；与SEQ ID NO:23至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:23的片段；与SEQ ID NO:23的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:25；与SEQ ID NO:25至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25的片段：与SEQ ID NO:25的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:27；与SEQ ID NO:27至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:27的片段；与SEQ ID NO:27的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:29；与SEQ ID NO:29至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:29的片段；与SEQ ID NO:29的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:31；与SEQ ID NO:31至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:31的片段；与SEQ ID NO:31的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:33；与SEQ ID NO:33至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:33的片段；与SEQ ID NO:33的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ IDNO:35；与SEQ ID NO:35至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35的片段；与SEQ ID NO:35的片段至少95％同源的核酸序列；以及SEQID NO:37；与SEQ ID NO:37至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:37的片段；与SEQ ID NO:37的片段至少95％同源的核酸序列。
在本发明的一些方面，存在选自由以下组成的组的分离的核酸分子：编码SEQ ID NO:2的核酸序列、与编码SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:7的核酸序列；与编码SEQ ID NO:7的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:7的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:7的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10核酸序列、与编码SEQ ID NO:10的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列；与编码SEQ ID NO:14的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列；与编码SEQ ID NO:20的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列；与编码SEQ ID NO:22的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列；与编码SEQ ID NO:24的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列；与编码SEQ ID NO:28的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列；与编码SEQ ID NO:30的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列；与编码SEQ ID NO:32的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列；与编码SEQ ID NO:34的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列；与编码SEQ ID NO:36的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；以及编码SEQ ID NO:38的核酸序列；与编码SEQ ID NO:38的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
也提供组合物，其包含：a)一种或多种选自由以下一个或多个组成的组的第一核酸序列：SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:6；与SEQ ID NO:6至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:6的片段；与SEQ ID NO:6的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:9、与SEQ ID NO:9至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:9的片段；与SEQ ID NO:9的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:13；与SEQ ID NO:13至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:13的片段；与SEQ ID NO:13的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19；与SEQ ID NO:19至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19的片段；与SEQ ID NO:19的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21；与SEQ ID NO:21至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21的片段；与SEQ ID NO:21的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:23；与SEQ ID NO:23至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:23的片段；与SEQ ID NO:23的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25；与SEQ ID NO:25至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25的片段：与SEQ ID NO:25的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:27；与SEQ ID NO:27至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:27的片段；与SEQ ID NO:27的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:29；与SEQ ID NO:29至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:29的片段；与SEQ ID NO:29的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:31；与SEQ ID NO:31至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:31的片段；与SEQ ID NO:31的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:33；与SEQ ID NO:33至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:33的片段；与SEQ ID NO:33的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35；与SEQ ID NO:35至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35的片段；与SEQ ID NO:35的片段至少95％同源的核酸序列；以及SEQ ID NO:37；与SEQ ID NO:37至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:37的片段；与SEQ ID NO:37的片段至少95％同源的核酸序列；以及b)一种或多种编码选自由以下一个或多个组成的组的蛋白质的第二核酸序列：甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素或神经氨酸酶或其片段。
也提供组合物，其包含：a)一种或多种选自由以下一个或多个组成的组的第一核酸序列：编码SEQ ID NO:2的核酸序列、与编码SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ IDNO:2的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:7的核酸序列；与编码SEQID NO:7的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:7的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:7的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10核酸序列、与编码SEQ IDNO:10的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列；与编码SEQ IDNO:14的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列；与编码SEQ IDNO:20的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列；与编码SEQ IDNO:22的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列；与编码SEQ IDNO:24的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列；与编码SEQ IDNO:26的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列；与编码SEQ IDNO:28的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列；与编码SEQ IDNO:30的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列；与编码SEQ IDNO:32的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列；与编码SEQ IDNO:34的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列；与编码SEQ IDNO:36的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；以及编码SEQ ID NO:38的核酸序列；与编码SEQID NO:38的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；以及b)编码选自由以下一个或多个组成的组的蛋白质的第二核酸序列：甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素或神经氨酸酶或其片段。
在一些方面，存在可具有照此组合的疫苗：
a)一种或多种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒株的广泛交叉反应性免疫反应的第一流感核酸序列H1血凝素，其选自以下：
选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:9、与SEQ ID NO:9至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:9的片段；与SEQ ID NO:9的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19；与SEQ ID NO:19至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19的片段；与SEQ ID NO:19的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21；与SEQ ID NO:21至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21的片段；与SEQ ID NO:21的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35；与SEQ ID NO:35至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35的片段；与SEQ ID NO:35的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核酸序列、与编码SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQID NO:2的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10核酸序列、与编码SEQID NO:10的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列；与编码SEQ IDNO:20的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列；与编码SEQ IDNO:22的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列；与编码SEQ IDNO:36的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段；以及与编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
b)一种或多种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒株的广泛交叉反应性免疫反应的第一流感核酸序列H3血凝素，其选自以下：
选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:23、与SEQ IDNO:23至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:23的片段：与SEQ IDNO:23的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:27、与SEQ IDNO:27至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:27的片段；与SEQ IDNO:27的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:29；与SEQ IDNO:29至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:29的片段；与SEQ IDNO:29的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:37；与SEQ IDNO:37至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:37的片段；与SEQ IDNO:37的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列、与编码SEQ ID NO:24的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列；与编码SEQ ID NO:28的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列；与编码SEQ ID NO:30的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列；与编码SEQ ID NO:38的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段；以及与编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
c)一种或多种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒株的广泛交叉反应性免疫反应的第一流感核酸序列乙型流感血凝素，其选自以下：
选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:13、与SEQ IDNO:13至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:13的片段；与SEQ IDNO:13的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25、与SEQ IDNO:25至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25的片段：与SEQ IDNO:25的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:31；与SEQ IDNO:31至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:31的片段；与SEQ IDNO:31的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:33；与SEQ IDNO:33至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:33的片段；与SEQ IDNO:33的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列、与编码SEQ ID NO:14的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列；与编码SEQ ID NO:32的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列；与编码SEQ ID NO:34的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段；以及与编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
本发明的一些方面提供一种包含可操作地连接于调控元件的本发明的核酸序列的表达载体。
本发明的一些方面提供诱导免疫反应的方法，其包括以下步骤：向个体施用所述核酸分子和/或组合物。
本发明的其它方面提供保护个体免受感染的方法。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用防治有效量的包含所述核酸序列的核酸分子或组合物；其中所述核酸序列在所述个体的细胞中表达，并且诱导针对一种或多种流感病毒株的保护性免疫反应。在某一实施方案中，免疫反应是针对猪源人流感的保护性免疫反应。
在本发明的一些方面，提供方法以治疗已受流感感染的个体。所述方法包括以下步骤：向所述个体施用治疗有效量的所述核酸分子和/或组合物。在某一实施方案中，免疫反应针对多种流感病毒株具有广泛交叉反应性。
附图简述
图1是2999个碱基对骨架载体质粒pVAX1(Invitrogen,CarlsbadCA)的图谱。CMV启动子位于碱基137-724处。T7启动子/引发位点在碱基664-683处。多克隆位点在碱基696-811处。牛GH聚腺苷酸化信号在碱基829-1053处。卡那霉素抗性基因在碱基1226-2020处。pUC起点在碱基2320-2993处。
基于可自Invitrogen获得的pVAX1的序列，在用作pGX2009的骨架的pVAX1的序列中发现以下突变：
C>G 241  在CMV启动子中
C>T 1942  骨架，在牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGHpolyA)的下游
A>-2876  骨架，在卡那霉素基因的下游
C>T 3277  在pUC复制起点(Ori)中，高拷贝数突变(参见Nucleic Acid Research 1985)
G>C 3753  在RNASeH位点的pUC Ori上游极末端中
在骨架中，在CMV启动子的上游，碱基对2、3和4自ACT变化成CTG。
图2显示也称为pH1HA09的质粒pGX2009的两个图谱。质粒pGX2009的核酸序列(SEQ ID NO:5)包括共有H1蛋白构建体(氨基酸SEQ ID NO:4，由SEQ ID NO:3编码)的编码序列，所述构建体包括连接于共有H1氨基酸序列(氨基酸SEQ ID NO:2，由SEQ IDNO:1编码)的N末端的IgE前导物(氨基酸SEQ ID NO:17)，所述共有H1氨基酸序列在它的C末端连接于HA标签(SEQ ID NO:18)。共有H1蛋白(氨基酸SEQ ID NO:4，由SEQ ID NO:3编码)被标记为SwiHum Con HA和H1HA09。
图3显示质粒pGX2006的图谱。质粒pGX2006的核酸序列(SEQID NO:8)包括被标记为H2HA的共有H2蛋白(SEQ ID NO:7，由SEQ ID NO:6编码)的编码序列。
图4显示来自用来自免疫的雪貂的血清进行的血凝集抑制测定的数据。
图5显示免疫和未免疫的雪貂用新型H1N1病毒株激发的结果。
图6显示在过去20年的病毒株的基因的流感H1血凝素(H1HA)基因遗传树，其显示各种H1HA流感病毒株之间的遗传关系。
图7A-G显示由用来自免疫的小鼠(未处理、H1U(SEQ IDNO:35)、HS09(SEQ ID NO:1)、ConBris(或H1Bris；SEQ ID NO:19)、ConTT(或H1-TT；SEQ ID NO:21)、组合(全部4种，即H1U、HS09、ConBris和ConTT))的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种季节性病毒的许多抑制滴度图。
图8A-C显示由用来自免疫的小鼠(未处理、H1U(SEQ IDNO:35)、HS09(SEQ ID NO:1)、ConBris(或H1Bris；SEQ ID NO:19)、ConTT(或H1-TT；SEQ ID NO:21)、组合(全部4种，即H1U、HS09、ConBris和ConTT))的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种大流行性病毒的许多抑制滴度图。
图9A-B显示由用来自免疫的豚鼠(组合(全部4种，即H1U、HS09、ConBris和ConTT))的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种季节性病毒的许多抑制滴度图；9A显示数据点；而9B显示平均值和标准偏差。
图10A-B显示由用来自免疫的豚鼠(组合(全部4种，即H1U、HS09、ConBris和ConTT))的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种大流行性病毒的许多抑制滴度图；10A显示数据点；而10B显示平均值和标准偏差。
图11A-C显示由用来自雪貂(用HS09和H1U的组合免疫)的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对11A)A/墨西哥/InDRE4108/2009大流行性病毒株；和11B)A/墨西哥/InDRE4487/2009大流行性病毒株的滴度图；以及显示当用2009H1墨西哥流感病毒株激发时的雪貂存活百分比的图。
图12显示来自过去20年的病毒株的乙型流感血凝素(BHA)遗传基因树，其显示各种BHA病毒株之间的遗传关系。
图13A-F显示由用来自免疫的小鼠(未处理、BHA-1(SEQ IDNO:13)、BHA-2(SEQ ID NO:25)、组合(BHA-1与BHA-2两者)的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种病毒的许多抑制滴度图。
图14A-C显示由用来自免疫的小鼠(未处理、BHA-1(SEQ IDNO:13)、BHA-2(SEQ ID NO:25)、组合(BHA-1与BHA-2两者))的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种病毒的许多抑制滴度图。
图15A-D显示由在免疫前(“pre”)、在第1剂后(PD1)、在第2剂后(PD2)或在第3剂后(PD3)用来自免疫的豚鼠(BHA-1(SEQID NO:13)、BHA-2(SEQ ID NO:25)、组合(BHA-1与BHA-2两者)的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种病毒的许多抑制滴度图。
图16A-C显示由在免疫前(“pre”)、在第1剂后(PD1)、在第2剂后(PD2)或在第3剂后(PD3)用来自免疫的豚鼠(BHA-1(SEQID NO:13)、BHA-2(SEQ ID NO:25)、组合(BHA-1与BHA-2两者)的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种病毒的许多抑制滴度图。
图17A-C显示由在免疫前(“pre”)、在第1剂后(PD1)、在第2剂后(PD2)或在第3剂后(PD3)用来自免疫的豚鼠(BHA-1(SEQID NO:13)、BHA-2(SEQ ID NO:25)、组合(BHA-1与BHA-2两者)的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种病毒的许多抑制滴度图。
注意：对于图15A-D；16A-C；和17A-C，“组合”样本是用组合分别免疫的豚鼠(BHA-1与BHA-2分开递送)；而关于组合(混合物)，混合并同时递送BHA-1和BHA-2。
图18显示来自过去20年的病毒株的流感H3血凝素(H3HA)遗传基因树，其显示各种H3HA病毒株之间的遗传关系。
图19A-E显示由用来自免疫的小鼠(未处理、H3HA-1(SEQ IDNO:37)、H3HA-2(SEQ ID NO:23)、组合(H3HA-1与H3HA-2两者)的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种病毒的许多抑制滴度图。
图20A-F显示由用来自免疫的小鼠(未处理、H3HA-1(SEQ IDNO:37)、H3HA-2(SEQ ID NO:23)、组合(H3HA-1与H3HA-2两者)的血清进行的血凝集抑制测定产生的针对各种病毒的许多抑制滴度图。
详述
提供甲型流感H1和H2各自的共有氨基酸序列(在本文中分别称为“共有H1S”或“HS09”(SEQ ID NO:2)和“共有H2”或“H2HA”(SEQ ID NO:7))、合成杂交共有H1甲型流感血凝素氨基酸序列(在本文中称为“共有U2”或“H1U2”(SEQ ID NO:10))、乙型流感血凝素的共有氨基酸序列(在本文中称为“共有BHA”或“BHA-1”(SEQID NO:14))、共有氨基酸序列H1Bris血凝素“ConBris”或“H1Bris”(SEQ ID NO:20)、共有氨基酸序列H1TT血凝素“ConTT”“H1TT”(SEQ ID NO:22)、共有氨基酸序列H3血凝素或“H3HA-2”(SEQ IDNO:24)、共有氨基酸序列乙型流感血凝素或“BHA-2”(SEQ IDNO:26)、共有氨基酸序列H3血凝素或“H3HA-3”(SEQ ID NO:28)、共有氨基酸序列H3血凝素或“H3HA-4”(SEQ ID NO:30)、共有氨基酸序列乙型流感血凝素或“BHA-3”(SEQ ID NO:32)、共有氨基酸序列乙型流感血凝素或“BHA-4”(SEQ ID NO:34)、合成杂交共有H1甲型流感血凝素“共有U”或“H1U”(SEQ ID NO:36)以及共有氨基酸序列H3血凝素或“H3HA-1”(SEQ ID NO:38)，其可提供对哺乳动物针对流感的保护。此外，提供包含共有H1氨基酸序列、共有H2氨基酸序列、共有U2氨基酸序列和/或共有BHA氨基酸序列的蛋白质。在一些方面，提供编码包含HS09氨基酸序列(例如SEQID NO:1或SEQ ID NO:3)、H2HA氨基酸序列(例如SEQ ID NO:6)、H1U2氨基酸序列(例如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:11)、BHA-1氨基酸序列(例如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15)、H1Bris氨基酸序列(例如SEQ ID NO:19)、H1TT氨基酸序列(例如SEQ ID NO:21)、H3HA-2氨基酸序列(例如SEQ ID NO:23)、BHA-2氨基酸序列(例如SEQ ID NO:25)、H3HA-3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:27)、H3HA-4氨基酸序列(例如SEQ ID NO:29)、BHA-3氨基酸序列(例如SEQ ID NO:31)、BHA-4氨基酸序列(例如SEQ ID NO:33)、H1U氨基酸序列(例如SEQ ID NO:35)和H3HA-1氨基酸序列(例如SEQID NO:37)的蛋白质的核酸序列。
在不受科学理论束缚下，可用于引发广泛针对多种流感亚型的免疫反应(体液性、细胞性或两者)的疫苗可包含以下一个或多个：1)编码包含共有H1HA氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；2)包含共有H1HA氨基酸序列的蛋白质；3)编码包含共有H2HA氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；4)包含共有H2HA氨基酸序列的蛋白质；5)编码包含共有H1U和/或H1U2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；6)包含共有H1U和/或H1U2氨基酸序列的蛋白质；7)编码包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；以及8)包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。
可执行免疫方法，并且可制备使用和/或组合两种或更多种以下组分的疫苗：1)编码包含共有H1氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；2)包含共有H1氨基酸序列的蛋白质；3)编码包含共有H2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，4)包含共有H2氨基酸序列的蛋白质；5)编码包含共有U2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，6)包含共有U2氨基酸序列的蛋白质，7)编码包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，以及8)包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。为达成针对流感的更广泛治疗，可执行免疫方法，并且可制备使用和/或组合一种或多种其它流感蛋白质(如甲型流感H1-H16、甲型流感N1-N9、乙型流感血凝素、乙型流感神经氨酸酶)和/或编码这些蛋白质的基因以及一种或多种以下组分的疫苗：1)编码包含共有H1氨基酸序列的蛋白质的核酸序列；2)包含共有H1氨基酸序列的蛋白质；3)编码包含共有H2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，4)包含共有H2氨基酸序列的蛋白质；5)编码包含共有U2氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，6)包含共有U2氨基酸序列的蛋白质，7)编码包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质的核酸序列，以及8)包含共有BHA氨基酸序列的蛋白质。
1.定义。
本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的而并不意图具有限制性。除非上下文另外明确规定，否则如说明书和随附权利要求中所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个指示物。
关于对本文数值范围的叙述，明确涵盖在其之间的具有相同精度的各插入数值。举例来说，对于范围6-9，除6和9之外也涵盖数值7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
a.佐剂
如本文所用的“佐剂”是指添加至本文所述的DNA质粒疫苗中以增强由DNA质粒和下文所述的编码核酸序列编码的抗原的免疫原性的任何分子。
b.抗体
如本文所用的“抗体”是指IgG、IgM、IgA、IgD或IgE类别的抗体或其片段、片段或衍生物，包括Fab、F(ab')2、Fd和单链抗体、双链抗体、双特异性抗体、双功能性抗体及其衍生物。抗体可为对所需表位或源于其的序列展现足够结合特异性的自哺乳动物的血清样本分离的抗体、多克隆抗体、亲和纯化抗体或其混合物。
c.编码序列
如本文所用的“编码序列”或“编码核酸”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。编码序列可进一步包括可操作地连接于能够指导在核酸所施用的个体或哺乳动物的细胞中表达的调控元件(包括启动子和聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。
d.互补序列
如本文所用的“互补序列”或“互补”是指核酸可意味着在核酸分子的核苷酸或核苷酸类似物之间进行Watson-Crick(例如A-T/U和C-G)或Hoogsteen碱基配对。
e.共有或共有序列
如本文所用的“共有”或“共有序列”是指基于对特定流感抗原的多种亚型的比对的分析所得到的多肽序列。可制备编码共有多肽序列的核酸序列。包含含有共有序列的蛋白质和/或编码所述蛋白质的核酸分子的疫苗可用于诱导针对特定流感抗原的多种亚型或血清型的广泛免疫性。共有流感抗原可包括甲型流感共有血凝素氨基酸序列，包括例如共有H1、共有H2或乙型流感共有血凝素氨基酸序列。
f.恒定电流
如本文所用的“恒定电流”是指由组织或限定所述组织的细胞在向相同组织递送的电脉冲的持续时间内接受或经受的电流。电脉冲是自本文所述的电穿孔装置递送。这个电流在电脉冲的工作期限内在所述组织中保持在恒定安培下，因为本文提供的电穿孔装置具有反馈元件，优选具有瞬时反馈。反馈元件可在整个脉冲持续时间期间测量组织(或细胞)的电阻，并且使电穿孔装置改变它的电能输出(例如增加电压)，因此相同组织中的电流在整个电脉冲期间(微秒数量级)以及在脉冲之间保持恒定。在一些实施方案中，反馈元件包括控制器。
g.电流反馈或反馈
“电流反馈”或“反馈”可互换使用，并且是指提供的电穿孔装置的主动反应，此包括测量在电极之间的组织中的电流，以及相应地改变由EP装置递送的能量输出以维持电流在恒定水平下。这个恒定水平由使用者在启始脉冲序列或电处理之前预设。反馈可由电穿孔装置的电穿孔组件(例如控制器)达成，因为其中的电路能够连续监测在电极之间的组织中的电流，并且将监测的电流(或组织内的电流)与预设电流进行比较并连续进行能量输出调整以维持监测的电流在预设水平下。反馈环路可为瞬时的，因为它是模拟闭环反馈。
h.分散电流
如本文所用的“分散电流”是指自本文所述的电穿孔装置的各种针电极阵列递送的电流的模式，其中模式使被电穿孔的组织的任何区域上的电穿孔相关的热应激的发生减至最小限度，或优选消除。
i.有效
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是化合物的足以向所述化合物所施用的受试者提供有益作用的那个量。递送媒介物的“有效量”是足以有效结合或递送化合物的那个量。
j.电穿孔
如在本文中可互换使用的“电穿孔”、“电渗透”或“电动力学增强”(EP)是指使用跨膜电场脉冲来在生物膜中诱导显微路径(孔)；它们的存在允许如质粒、寡核苷酸、siRNA、药物、离子和水的生物分子自细胞膜的一侧穿到到达另一侧。
k.编码
“编码”是指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中的特定核苷酸序列用以在生物过程中充当合成具有确定核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或确定氨基酸序列以及由其所致的生物性质的其它聚合物和大分子的模板的固有性质。因此，如果在细胞或其它生物系统中转录和翻译对应于某一基因的mRNA产生蛋白质，那么那个基因编码所述蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同，并且通常提供于序列表中)与非编码链(用作基因或cDNA的转录的模板)两者均可称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
l.反馈机制
如本文所用的“反馈机制”是指由软件或硬件(或固件)执行的过程，所述过程接收所需组织的阻抗并将其与现值(优选是电流)进行比较(在递送能量脉冲之前、期间和/或之后)，并且调整递送的能量脉冲以达成预设值。反馈机制可由模拟闭环电路执行。
m.片段
如本文关于核酸序列所用的“片段”是指编码能够在哺乳动物中引发与全长野生型病毒株流感抗原(包括例如甲型流感H1血凝素、甲型流感H2血凝素或乙型流感血凝素)交叉反应的免疫反应的多肽的核酸序列或其一部分。片段可为选自编码共有氨基酸序列的各种核苷酸序列和包含所述序列的构建体中的至少一个的DNA片段，包括SEQ ID NO:1、6、9、13、15、19、21、23、25、27、29、31、33、35和37；以及编码SEQ ID NO:2、7、10、14、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38的核苷酸序列。DNA片段可包含免疫球蛋白前导物(如IgE或IgG序列)的编码序列。DNA片段的长度可为30个或更多个核苷酸、45个或更多个、60个或更多个、75个或更多个、90个或更多个、120个或更多个、150个或更多个、180个或更多个、210个或更多个、240个或更多个、270个或更多个、300个或更多个、360个或更多个、420个或更多个、480个或更多个、540个或更多个、600个或更多个、660个或更多个、720个或更多个、780个或更多个、840个或更多个、900个或更多个、960个或更多个、1020个或更多个、1080个或更多个、1140个或更多个、1200个或更多个、1260个或更多个、1320个或更多个、1380个或更多个、1440个或更多个、1500个或更多个、1560个或更多个、1620个或更多个、1680个或更多个、1740个或更多个、1800个或更多个、1860个或更多个、1820个或更多个、1880个或更多个、1940个或更多个、2000个或更多个、2600个或更多个、2700个或更多个、2800个或更多个、2900个或更多个、2910个或更多个、2920个或更多个、2930个或更多个、2931个或更多个、2932个或更多个、2933个或更多个、2934个或更多个、2935个或更多个、2936个或更多个、2937个或更多个、或2938个或更多个。DNA片段可少于10个核苷酸、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个、少于75个、少于90个、少于120个、少于150个、少于180个、少于210个、少于240个、少于270个、少于300个、少于360个、少于420个、少于480个、少于540个、少于600个、少于660个、少于720个、少于780个、少于840个、少于900个、少于960个、少于1020个、少于1080个、少于1140个、少于1200个、少于1260个、少于1320个、少于1380个、少于1440个、少于1500个、少于1560个、少于1620个、少于1680个或少于1740个核苷酸、少于1800个、少于1860个、少于1820个、少于1880个、少于1940个、少于2000个、少于2600个、少于2700个、少于2800个、少于2900个、少于2910个、少于2920个、少于2930个、少于2931个、少于2932个、少于2933个、少于2934个、少于2935个、少于2936个、少于2937个或少于2938个。
关于多肽序列的“片段”是指能够在哺乳动物中引发与全长野生型病毒株流感抗原(包括例如甲型流感H1血凝素、甲型流感H2血凝素或乙型流感血凝素)交叉反应的免疫反应的多肽。片段可为选自本发明的各种多肽序列中的至少一个的多肽片段，包括SEQ IDNO:2、7、10、14、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。可分析多肽片段以与如由公开可用的数据库，如Los Alamos NationalLaboratory的HA序列数据库提供的至少一种抗原性表位相联系。多肽HA片段可进一步包含免疫球蛋白前导物(如IgE或IgG)的氨基酸序列。多肽片段的长度可为30个或更多个氨基酸、45个或更多个、60个或更多个、75个或更多个、90个或更多个、120个或更多个、150个或更多个、180个或更多个、210个或更多个、240个或更多个、270个或更多个、300个或更多个、360个或更多个、420个或更多个、480个或更多个、540个或更多个、600个或更多个、660个或更多个、或710个氨基酸或更多个。多肽片段的长度可少于10个氨基酸、少于20个、少于30个、少于40个、少于50个、少于60个、少于75个、少于90个、少于120个、少于150个、少于180个、少于210个、少于240个、少于270个、少于300个、少于360个、少于420个、少于480个、少于540个、少于600个、少于660个、少于700个、少于701个、少于702个、少于703个、少于704个、少于705个、少于706个、少于707个、少于708个、少于709个或少于710个氨基酸。
n.遗传构建体
如本文所用，术语“遗传构建体”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA或RNA分子。编码序列包括可操作地连接于能够指导在核酸分子所施用的个体的细胞中表达的调控元件(包括启动子和聚腺苷酸化信号)的起始和终止信号。如本文所用，术语“可表达形式”是指基因构建体，其含有可操作地连接于编码蛋白质的编码序列的必要调控元件，以使当存在于个体的细胞中时，编码序列将被表达。
o.相同
如本文在两个或更多个核酸或多肽序列的情形下所用的“相同”或“同一性”是指序列在指定区域具有指定百分比的相同残基。百分比可通过以下方式来计算：最优比对两个序列，在指定区域比较两个序列，确定相同残基存在于两个序列中所处的位置的数目以产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以指定区域中的位置的总数，以及用100乘以结果以产生序列同一性百分比。在其中两个序列具有不同长度或比对产生一个或多个交错末端以及所比较的指定区域仅包括单一序列的情况下，将单一序列的残基包括在计算的分母而非分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可被视为等效。可手动或通过使用如BLAST或BLAST 2.0的电脑序列算法来进行同一性确定。
p.阻抗
“阻抗”可在讨论反馈机制时使用，并且可根据欧姆定律换算成电流值，由此使得能够与预设电流比较。
q.免疫反应
如本文所用的“免疫反应”是指响应于如流感血凝素共有抗原的抗原的引入来激活宿主的免疫系统，例如哺乳动物的免疫系统。免疫反应可呈细胞反应或体液反应或两者形式。
r.核酸
如本文所用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指至少两个共价连接在一起的核苷酸。对单链的描绘也限定互补链的序列。因此，核酸也涵盖描绘的单链的互补链。核酸的许多变体可出于相同目的用作给定核酸。因此，核酸也涵盖大致上相同的核酸及其互补序列。单链提供可在严格杂交条件下杂交于靶标序列的探针。因此，核酸也涵盖在严格杂交条件下杂交的探针。
核酸可为单链或双链，或可含有双链序列与单链序列两者的部分。核酸可为DNA(基因组DNA与cDNA两者)、RNA或杂交物，其中核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。核酸可通过化学合成方法或通过重组方法来获得。
s.可操作地连接
如本文所用的“可操作地连接”是指基因的表达受控于它在空间上与之连接的启动子。启动子可位于受控于它的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与那个启动子与它在所述启动子所源于的基因中控制的基因的距离近似相同。如本领域中所知，可接受这个距离的变化形式而不损失启动子功能。
t.启动子
如本文所用的“启动子”是指能够赋予、激活或增强核酸在细胞中的表达的合成或天然源性分子。启动子可包含一种或多种特定转录调控序列以进一步增强表达和/或改变核酸的空间表达和/或时间表达。启动子也可包含远端增强子或阻遏子元件，其可位于离转录起始位点多达数千个碱基对。启动子可源于包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可组成性调控基因组分的表达，或关于其中发生表达的细胞、组织或器官或关于发生表达所处的发育阶段或响应于如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂的外部刺激差异性调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子-启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。
u.严格杂交条件
如本文所用的“严格杂交条件”是指第一核酸序列(例如探针)将与第二核酸序列(例如靶标)如以复杂核酸混合物形式杂交所处的条件。严格条件依赖于序列，并且在不同情况下将不同。严格条件可选择为低于特定序列在确定离子强度pH下的热解链点(Tm)约5-10℃。Tm可为在平衡时，50％的互补于靶标的探针杂交于靶标序列所处的温度(在确定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为靶标序列过量存在，在Tm下，在平衡时，50％的探针被占据)。严格条件可为其中在pH 7.0至8.3下，盐浓度小于约1.0M钠离子，如约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度是至少约30℃(对于短探针(例如约10-50个核苷酸)而言)以及至少约60℃(对于长探针(例如大于约50个核苷酸)而言)的那些条件。严格条件也可在添加如甲酰胺的去稳定剂下达成。对于选择性或特异性杂交，正信号可为背景杂交的至少2至10倍。示例性严格杂交条件包括以下：50％甲酰胺、5xSSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5xSSC、1％SDS，在65℃下孵育，其中于0.2xSSC和0.1％SDS中在65℃下洗涤。
v.大致上互补
如本文所用的“大致上互补”是指在具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070个或更多个核苷酸或氨基酸的区域，第一序列与第二序列的互补序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或两个序列在严格杂交条件下杂交。
w.大致上相同
如本文所用的“大致上相同”是指在具有8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540、630、720、810、900、990、1080、1170、1260、1350、1440、1530、1620、1710、1800、1890、1980、2070个或更多个核苷酸或氨基酸的区域，第一序列和第二序列至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同，或就核酸而言，如果第一序列大致上互补于第二序列的互补序列。
x.亚型或血清型
“亚型”或“血清型”：如本文可互换，并且提及流感病毒时是指流感病毒的遗传变体以致一种亚型由免疫系统识别为与不同亚型无关。
y.变体
本文关于核酸使用的“变体”是指(i)参照核苷酸序列的部分或片段；(ii)参照核苷酸序列或其部分的互补序列；(iii)大致上与参照核酸或其互补序列相同的核酸；或(iv)在严格条件下杂交于参照核酸、其互补序列或大致上与其相同的序列的核酸。
关于肽或多肽的“变体”因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列方面不同，但保留至少一种生物活性。变体也可指氨基酸序列大致上与具有某一氨基酸序列的参照蛋白相同的保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守性取代，即用具有类似性质(例如亲水性、带电荷区域的程度和分布)的不同氨基酸置换某一氨基酸，在本领域中被认定为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑如本领域中所了解的氨基酸的亲疏水性指数来鉴定。Kyte等,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数是基于对它的疏水性和电荷的考虑。本领域中已知的是可用具有类似亲疏水性指数的氨基酸进行取代，并且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，用亲疏水性指数是±2的氨基酸进行取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算那个肽的最大局部平均亲水性，这是已报道与抗原性和免疫原性良好关联的适用度量。美国专利号4,554,101以引用的方式完全并入本文。如本领域中所了解，具有类似亲水性值的氨基酸的取代可产生保留生物活性，例如免疫原性的肽。可用亲水性值在彼此的±2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数与亲水性值两者均受那个氨基酸的特定侧链影响。与那个观察结果一致的是，可与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对类似性，并且特别是那些氨基酸的侧链的相对类似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小和其它性质所揭示。
z.载体
如本文所用的“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可为载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可为DNA或RNA载体。载体可为自我复制型染色体外载体，并且优选是DNA质粒。
范围：在整篇本公开中，本发明的各个方面可以范围形式呈现。应了解，以范围形式进行的描述仅为方便和简洁起见，并且不应解释为刚性限制本发明的范围。因此，对范围的描述应视为具有明确公开的所有可能的子范围以及那个范围内的个别数值。举例来说，对如1至6的范围的描述应视为具有明确公开的子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等、以及那个范围内的个别数值，例如1、2、2、7、3、4、5、5、3和6。无论范围的宽度如何，这个都适用。
2.流感抗原
本文提供能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型的免疫反应的抗原。抗原可能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型，包括针对一种或多种大流行性病毒株，如2009H1N1猪源性流感的免疫反应。抗原可能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型，包括针对猪源性人流感的一种或多种病毒株的免疫反应。抗原可包含使它们特别有效作为可诱导抗流感免疫反应所针对的免疫原的表位。
抗原可包含全长翻译产物HA0、亚单位HA1、亚单位HA2、其变体、其片段或其组合。流感血凝素抗原可为源于多种甲型流感血清型H1病毒株的共有序列、源于多种甲型流感血清型H2病毒株的共有序列、含有源于多组多种不同甲型流感血清型H1病毒株的两种不同共有序列的部分的杂交序列或源于多种乙型流感病毒株的共有序列。流感血凝素抗原可来自乙型流感。抗原可含有至少一个抗原性表位，其相对于可诱导免疫反应所针对的特定流感免疫原可为有效的。抗原可提供完整流感病毒中存在的免疫原性位点和表位的整个谱系。抗原可为可源于来自多种具有一种血清型的甲型流感病毒株，如多种具有血清型H1或血清型H2的甲型流感病毒株的血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列。抗原可为可由组合两种不同共有血凝素抗原序列或其部分获得的杂交共有血凝素抗原序列。两种不同共有血凝素抗原序列各自可源于多种具有一种血清型的不同组甲型流感病毒株，如多种具有血清型H1的甲型流感病毒株。抗原可为可源于来自多种乙型流感病毒株的血凝素抗原序列的共有血凝素抗原序列。
共有血凝素抗原可为包含SEQ ID NO:2(共有H1氨基酸序列)的蛋白质，其中氨基酸1-343对应于前体HA0共有H1氨基酸序列的HA1亚单位，而氨基酸344-566对应于HA0共有H1氨基酸序列的HA2亚单位。共有血凝素抗原也可为源于来自H1HA病毒株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含SEQ ID NO:20(H1Bris)或SEQ IDNO:22(H1TT)的蛋白质。共有血凝素抗原可为包含SEQ ID NO:7(H2HA)的蛋白质。共有血凝素抗原可为源于来自H3HA病毒株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含SEQ ID NO:24(H3HA-2)、SEQ ID NO:28(H3HA-3)、SEQ ID NO:30(H3HA-4)或SEQ ID NO:38(H3HA-1)的蛋白质。共有血凝素抗原可为包含各自源于一组不同于另一组的序列的两种不同共有H1序列的部分的合成杂交共有H1序列。是合成杂交共有H1蛋白的共有HA抗原的实例为包含SEQ IDNO:10(H1U2)或SEQ ID NO:36(H1U)的蛋白质。共有血凝素抗原可为源于来自乙型流感病毒株的血凝素序列的共有血凝素蛋白，如包含SEQ ID NO:14(BHA-1)、SEQ ID NO:26(BHA-2)、SEQ ID NO:32(BHA-3)或SEQ ID NO:34(BHA-4)的蛋白质。
共有血凝素抗原可进一步包含一种或多种其它氨基酸序列成分。共有血凝素抗原可在它的N末端上进一步包含IgE或IgG前导氨基酸序列。IgE前导氨基酸序列可为SEQ ID NO:17。共有血凝素抗原可进一步包含免疫原性标签，其是可由可易于获得的抗体检测的独特免疫原性表位。所述免疫原性标签的实例是9氨基酸流感HA标签，其可连接在共有血凝素C末端上。HA标签氨基酸序列可为SEQ IDNO:18。在一些实施方案中，共有血凝素抗原可在它的N末端上进一步包含IgE或IgG前导氨基酸序列，并且在它的C末端上进一步包含HA标签。
共有血凝素抗原可为由共有流感氨基酸序列或其片段和变体组成的共有血凝素蛋白。共有血凝素抗原可为包含非流感蛋白质序列和流感蛋白质序列或其片段和变体的共有血凝素蛋白。
共有H1蛋白的实例包括可由共有H1氨基酸序列(SEQ ID NO:2)组成的那些或进一步包含其它成分，如IgE前导序列、或HA标签、或IgE前导序列与HA标签两者的那些。包括IgE前导序列与HA标签两者的共有H1蛋白的实例是SEQ ID NO:4，其包含共有H1氨基酸编码序列(SEQ ID NO:2)，所述编码序列在它的N末端连接于IgE前导氨基酸序列(SEQ ID NO:17)，并且在它的C末端连接于HA标签(SEQ ID NO:18)。
共有H2蛋白的实例包括可由共有H2氨基酸序列(SEQ ID NO:7)组成的那些或进一步包含IgE前导序列、或HA标签、或IgE前导序列与HA标签两者的那些。
杂交共有H1蛋白的实例包括可由共有U2氨基酸序列(SEQ IDNO:10)组成的那些或进一步包含IgE前导序列、或HA标签、或IgE前导序列与HA标签两者的那些。共有U2蛋白的实例是SEQ IDNO:12，其包含共有U2氨基酸序列(SEQ ID NO:10)，所述氨基酸序列在它的N末端连接于IgE前导氨基酸序列(SEQ ID NO:17)，并且在它的C末端连接于HA标签(SEQ ID NO:18)。
杂交共有乙型流感血凝素蛋白的实例包括由共有BHA氨基酸序列(SEQ ID NO:14)组成的那些，或它可包含IgE前导序列、或HA标签、或IgE前导序列与HA标签两者。共有BHA蛋白的实例是SEQID NO:16，其包含共有BHA氨基酸序列(SEQ ID NO:14)，所述氨基酸序列在它的N末端连接于IgE前导氨基酸序列(SEQ ID NO:17)，并且在它的C末端连接于HA标签(SEQ ID NO:18)。
共有血凝素蛋白可由共有血凝素核酸、其变体或其片段编码。不同于可为源于来自不同病毒株和变体的多种不同血凝素序列的共有序列的共有血凝素蛋白，共有血凝素核酸是指编码共有蛋白质序列的核酸序列，并且所用编码序列可不同于用于编码共有血凝素蛋白序列所源于的多种不同血凝素序列中的特定氨基酸序列的那些。共有核酸序列可为密码子优化的和/或RNA优化的。共有血凝素核酸序列可在5’未翻译区域中包含Kozak序列。共有血凝素核酸序列可包含编码前导序列的核酸序列。N末端前导序列的编码序列是血凝素编码序列的5’。N末端前导物可促进分泌。N末端前导物可为IgE前导物或IgG前导物。共有血凝素核酸序列可包含编码免疫原性标签的核酸序列。免疫原性标签可在蛋白质的C末端上，并且编码它的序列是HA编码序列的3’。免疫原性标签提供存在针对其的可易于获得的抗体的独特表位，以使所述抗体可用于用以检测并确认蛋白质的表达的测定中。免疫原性标签可为在蛋白质的C末端的H标签。
共有血凝素核酸可具有编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:38的蛋白质的多核苷酸序列。编码SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:36或SEQ ID NO:38的共有血凝素核酸可分别为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37。共有血凝素核酸可进一步包含编码IgE前导氨基酸序列的多核苷酸序列、或编码HA标签氨基酸序列的多核苷酸序列、或两者。SEQ ID NO:17是IgE前导多肽序列。SEQ ID NO:18是HA标签多肽序列。进一步包含编码IgE前导序列和HA标签的多核苷酸序列的血凝素共有核酸的实例包括编码包含氨基酸序列SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ IDNO:16的蛋白质的核酸分子。编码SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:16的共有血凝素核酸可分别为SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:15。
3.遗传构建体和质粒
本文提供可包含编码血凝素抗原的核酸序列的遗传构建体。遗传构建体可以包含编码血凝素抗原的核酸的功能性染色体外分子形式存在于细胞中。包含编码血凝素抗原的核酸的遗传构建体可为包括着丝粒的线性微型染色体、端粒或质粒或粘粒。
遗传构建体也可为重组病毒载体的基因组的一部分，所述重组病毒载体包括重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。遗传构建体可为减毒活微生物或生活在细胞中的重组微生物载体中的遗传物质的一部分。
遗传构建体可包含用于血凝素核酸的基因表达的调控元件。调控元件可为启动子、增强子、起始密码子、终止密码子或聚腺苷酸化信号。
组合物可包含以下一种或多种核酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQID NO:33、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:37。组合物可包含编码选自由以下一个或多个组成的组的血凝素共有抗原的第一核酸序列：甲型流感共有血凝素H1抗原、甲型流感共有血凝素H2抗原、甲型流感共有血凝素H1U和/或H1U2抗原、以及乙型流感共有血凝素蛋白BHA，所述第一核酸序列可包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQID NO:35、SEQ ID NO:37、或编码以下一个或多个的核酸序列：SEQID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ IDNO:38；并且可进一步包含一种或多种编码一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的其它核酸序列：甲型流感血凝素蛋白H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、甲型流感神经氨酸酶N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素(BHA)和乙型流感神经氨酸酶(BNA)，包括一种或多种本文提供的共有序列。第一核酸序列和其它核酸序列可存在于同一核酸分子或不同核酸分子上。第一核酸序列和其它核酸序列可受控于在人细胞中起作用的调控元件。其它编码序列可编码来自一种或多种流感病毒株的一种或多种H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、BHA和BNA，或可为源于多种具有血清型的病毒株的共有序列，或可为包括来自两种或更多种共有序列的序列的杂交物。
核酸序列可组成可为载体的遗传构建体。载体可能够在哺乳动物的细胞中以在所述哺乳动物中有效引发免疫反应的量表达共有血凝素抗原。载体可为重组的。载体可包含编码共有血凝素抗原的异源核酸。载体可为质粒。载体可适用于用编码共有血凝素抗原的核酸转染细胞，在其中发生共有血凝素抗原的表达的条件下培养并维持转化的宿主细胞。
载体可包含编码共有血凝素抗原的异源核酸，并且可进一步包含可在共有血凝素编码序列的上游的起始密码子、以及可在共有血凝素编码序列的下游的终止密码子。起始和终止密码子可与共有血凝素编码序列同框。载体也可包含可操作地连接于共有血凝素编码序列的启动子。可操作地连接于共有血凝素编码序列的启动子可为来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)启动子(如牛免疫缺陷病毒(BIV)长末端重复序列(LTR)启动子)、莫洛尼(Moloney)病毒启动子、禽白血病病毒(ALV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子(如CMV立即早期启动子)、艾伯斯坦巴尔病毒(Epstein Barr virus，EBV)启动子或劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)启动子。启动子也可为来自人基因，如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或人金属硫蛋白的启动子。启动子也可为天然或合成组织特异性启动子，如肌肉或皮肤特异性启动子。所述启动子的实例描述于美国专利申请公布号US20040175727中，所述公布的内容整体并入本文。
载体也可包含可在HA编码序列的下游的聚腺苷酸化信号。聚腺苷酸化信号可为SV40聚腺苷酸化信号、LTR聚腺苷酸化信号、牛生长激素(bGH)聚腺苷酸化信号、人生长激素(hGH)聚腺苷酸化信号或人β-球蛋白聚腺苷酸化信号。SV40聚腺苷酸化信号可为来自pCEP4载体(Invitrogen,San Diego,CA)的聚腺苷酸化信号。
载体也可在共有血凝素编码序列的上游包含增强子。增强子可为DNA表达所必需。增强子可为人肌动蛋白。人肌球蛋白、人血红素、人肌肉肌酸或病毒增强子，如来自CMV、HA、RSV或EBV的增强子。多核苷酸功能增强描述于美国专利号5,593,972、5,962,428和WO94/016737中，所述专利各自的内容以引用的方式完全并入本文。
载体也可包含哺乳动物复制起点以在染色体外维持载体，并且在细胞中产生多个载体拷贝。载体可为来自Invitrogen(San Diego,CA)的pVAX1(图1)、pCEP4或pREP4，其可包含艾伯斯坦巴尔病毒复制起点和核抗原EBNA-1编码区，此可产生高拷贝游离性复制而不进行整合。载体可为具有变化的pVAX1，所述变化如在以上附图简述章节中关于图1的段落中所述的那些。载体的骨架可为pAV0242。载体可为复制缺陷性5型腺病毒(Ad5)载体。
载体也可包含可充分适于基因在向其中施用载体的哺乳动物或人细胞中表达的调控序列。共有血凝素编码序列可包含可使编码序列在宿主细胞中更高效转录的密码子。
载体可为pSE420(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在大肠杆菌(E.coli)中产生蛋白质。载体也可为pYES2(Invitrogen,SanDiego,Calif.)，其可用于在酵母的酿酒酵母菌株中产生蛋白质。载体也可为MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在昆虫细胞中产生蛋白质。载体也可为pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen,San Diego,Calif.)，其可用于在如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的哺乳动物细胞中产生蛋白质。载体可为用以通过常规技术和可易于获得的起始物质，包括Sambrook等,Molecular Cloningan Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor(1989)来产生蛋白质的表达载体或系统，所述书目以引用的方式完全并入本文。
载体可为pGX2009或pGX2006，其可用于表达共有血凝素抗原。载体pGX2009(4739bp，图2；SEQ ID NO:5)是具有编码包含连接于共有H1氨基酸序列(氨基酸SEQ ID NO:2，由SEQ ID NO:1编码)的IgE前导序列(氨基酸SEQ ID NO:12，由SEQ ID NO:11编码)的共有H1蛋白(氨基酸SEQ ID NO:4，由SEQ ID NO:3编码)的核酸序列的修饰的pVAX1质粒。载体pGX2006(4628bp；图3，SEQ IDNO:8)是具有编码共有H2蛋白(氨基酸SEQ ID NO:7，由SEQ IDNO:6编码)的核酸序列的pVAX1质粒。或者，在与pGX2006类似的DNA质粒骨架pVAX1(或pVAX(Invitrogen))中，具有以下任一个的核酸插入物可替换H2HA序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、或编码以下一个或多个的核酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36或SEQ IDNO:38；或本文所述的任何片段和变体。
本文公开的包括共有血凝素编码序列的遗传构建体和组分可用于表达其它流感蛋白质，如甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素或神经氨酸酶蛋白，借此甲型流感蛋白质H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素或神经氨酸酶蛋白的编码序列替代共有血凝素编码序列被包括。
4.药物组合物
本文提供根据本发明的药物组合物，其包含约1纳克至约10mgDNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克、或至少1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克、或至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg或大于10mg；与2)多达并包括15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100纳克、或多达并包括1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895.900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995或1000微克、或多达并包括1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5或10mg之间。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约5纳克至约10mg DNA。在一些实施方案中，根据本发明的药物组合物包含约25纳克至约5mg DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约50纳克至约1mgDNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约5至约250微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约10至约200微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约15至约150微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约20至约100微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约25至约75微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约30至约50微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约35至约40微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约10微克至约100微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约20微克至约80微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约25微克至约60微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约30纳克至约50微克DNA。在一些实施方案中，药物组合物包含约35纳克至约45微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约0.1至约500微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约1至约350微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约25至约250微克DNA。在一些优选实施方案中，药物组合物含有约100至约200微克DNA。
根据待使用的施用模式配制根据本发明的药物组合物。在其中药物组合物是可注射药物组合物的情况下，它们是无菌、无热原以及无颗粒的。优选使用等张制剂。通常，用于达成等张性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。在一些情况下，如磷酸盐缓冲盐水的等张溶液是优选的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，添加血管收缩剂至制剂中。
优选地，药物组合物是疫苗，并且更优选是DNA疫苗。
本文提供一种能够在哺乳动物中产生针对一种或多种流感血清型的免疫反应的疫苗。疫苗可包含如上讨论的遗传构建体。疫苗可包含各自针对一种或多种甲型流感血清型(如H1-H16)、乙型流感血凝素或其组合的多种载体。疫苗可包含一种或多种编码一种或多种共有血凝素抗原的核酸序列。当疫苗包含一种以上共有血凝素核酸序列时，所有所述序列都可存在于单一核酸分子上，或各所述序列可存在于不同核酸分子上。或者，包含一种以上共有血凝素核酸序列的疫苗可包含具有单一共有血凝素核酸序列的核酸分子和具有一种以上共有血凝素核酸序列的核酸分子。此外，包含一种或多种共有血凝素核酸序列的疫苗可进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的编码序列：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9和乙型流感神经氨酸酶。
在一些实施方案中，疫苗可包含蛋白质。一些疫苗可包含一种或多种共有血凝素抗原，如H1、H2、U2和BHA。疫苗可包含一种或多种选自由以下组成的组的其它蛋白质：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9和乙型流感神经氨酸酶。疫苗可包含一种或多种与一种或多种选自由以下组成的组的其它蛋白质组合的共有血凝素抗原：H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素和神经氨酸酶。
疫苗可为DNA疫苗。DNA疫苗可包含多种相同或不同包含一种或多种共有血凝素核酸序列的质粒。DNA疫苗可包含一种或多种编码一种或多种共有血凝素抗原的核酸序列。当DNA疫苗包含一种以上共有血凝素核酸序列时，所有所述序列都可存在于单一质粒上，或各所述序列可存在于不同质粒上，或一些质粒可包含单一共有血凝素核酸序列，而其它质粒具有一种以上共有血凝素核酸序列。此外，DNA疫苗可进一步包含一种或多种选自由以下组成的组的蛋白质的一种或多种共有编码序列：甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素和神经氨酸酶。所述其它编码序列可彼此在同一或不同质粒上，并且来自包含一种或多种共有血凝素核酸序列的质粒。
在一些实施方案中，疫苗可包含与流感抗原组合的编码流感抗原的核酸序列。在一些实施方案中，核酸序列编码一种或多种共有血凝素抗原，如H1(包括H1U和H1U2)、H2、H3和BHA。在一些实施方案中，核酸序列编码一种或多种选自由以下组成的组的其它蛋白质：甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素和神经氨酸酶。在一些实施方案中，疫苗包含一种或多种共有血凝素抗原，如H1(包括H1U和H1U2)、H2、H3和BHA。在一些实施方案中，疫苗包含一种或多种选自由以下组成的组的其它蛋白质：甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素和神经氨酸酶。
在一些实施方案中，疫苗包含三种或更多种共有血凝素核酸序列的组合，所述序列包括编码H1(包括H1U和H1U2)、H2和BHA中的一个或多个的那些。在一些实施方案中，疫苗包含三种或更多种血凝素核酸序列的组合，所述序列包括编码共有H1U和/或H1U2、共有BHA和H3血凝素的那些。在一些实施方案中，疫苗包含三种或更多种血凝素核酸序列的组合，所述序列包括编码共有BHA、H1血凝素和H3血凝素的那些。在一些实施方案中，疫苗包含一种或多种编码一种或多种以引用的方式并入本文的美国序列号12/375,518和/或以引用的方式并入本文的美国序列号12/269,824中公开的流感抗原的核酸序列。在一些实施方案中，疫苗包含来自美国序列号12/375,518(其中SEQ ID NO:36)和/或美国序列号12/269,824(其中SEQ ID NO:9)的编码H1血凝素的核酸序列。在一些实施方案中，疫苗包含来自美国序列号12/269,824的编码H3血凝素的核酸序列(其中SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，疫苗包含三种或更多种包括H1、H2、U2和BHA中的一个或多个的共有血凝素蛋白的组合。在一些实施方案中，疫苗包含三种或更多种包括共有U2、共有BHA和H3血凝素的血凝素蛋白的组合。在一些实施方案中，疫苗包含三种或更多种包括共有BHA、H1血凝素和H3血凝素的血凝素蛋白的组合。在一些实施方案中，疫苗包含一种或多种来自美国序列号12/375,518和/或美国序列号12/269,824的抗原。在一些实施方案中，疫苗包含美国序列号12/375,518(其中SEQ ID NO:37)和/或美国序列号12/269,824(其中SEQ ID NO:10)中公开的H1血凝素。在一些实施方案中，疫苗包含美国序列号12/269,824中公开的H3血凝素(其中SEQ ID NO:12)。
在一些实施方案中，疫苗包含1)共有血凝素U2蛋白和/或编码共有血凝素U2蛋白的核酸序列，2)共有血凝素BHA蛋白和/或编码共有血凝素BHA蛋白的核酸序列，以及3)美国序列号12/269,824中公开的血凝素H3蛋白(其中SEQ ID NO:12)和/或美国序列号12/269,824中公开的编码血凝素H3蛋白的核酸序列(其中SEQ IDNO:11)的组合。
在一些实施方案中，疫苗包含1)共有血凝素BHA蛋白和/或编码共有血凝素BHA蛋白的核酸序列，2)美国序列号12/269,824(其中SEQ ID NO:10)或美国序列号12/375,518(其中SEQ ID NO:37)中公开的血凝素H1蛋白和/或美国序列号12/269,824(其中SEQ IDNO:9)或美国序列号12/375,518(其中SEQ ID NO:36)中公开的编码血凝素H1蛋白的核酸序列，以及3)美国序列号12/269,824中公开的血凝素H3蛋白(其中SEQ ID NO:12)和/或美国序列号12/269,824中公开的编码血凝素H3蛋白的核酸序列(其中SEQ IDNO:11)的组合。
优选地，可将本文提供的抗原的组合配制成在提供针对广泛范围的季节性流感病毒株以及大流行性流感病毒株的交叉反应性的疫苗接种的哺乳动物中导致血清转化的疫苗。可通过测量针对不同血凝素流感病毒株的抑制滴度来测定血清转化和广泛交叉反应性。优选组合包括至少一种来自以下组的抗原：1)共有H1血凝素；2)共有H2血凝素；3)共有H3血凝素；以及4)乙型流感血凝素；并且更优选组合包括至少一种来自以下组的抗原：1)共有H1血凝素；2)共有H3血凝素；以及3)乙型流感血凝素。
在一些实施方案中，疫苗可具有照此的组合：
a)一种或多种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒株的广泛交叉反应性免疫反应的第一流感核酸序列H1血凝素，其选自以下：
选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:9、与SEQ ID NO:9至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:9的片段；与SEQ ID NO:9的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19；与SEQ ID NO:19至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19的片段；与SEQ ID NO:19的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21；与SEQ ID NO:21至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21的片段；与SEQ ID NO:21的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35；与SEQ ID NO:35至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35的片段；与SEQ ID NO:35的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核酸序列、与编码SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQID NO:2的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10核酸序列、与编码SEQID NO:10的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:10的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列；与编码SEQ IDNO:20的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列；与编码SEQ IDNO:22的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列；与编码SEQ IDNO:36的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段；以及与编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
b)一种或多种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒株的广泛交叉反应性免疫反应的第一流感核酸序列H3血凝素，其选自以下：
选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:23、与SEQ IDNO:23至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:23的片段：与SEQ IDNO:23的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:27、与SEQ IDNO:27至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:27的片段；与SEQ IDNO:27的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:29；与SEQ IDNO:29至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:29的片段；与SEQ IDNO:29的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:37；与SEQ IDNO:37至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:37的片段；与SEQ IDNO:37的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列、与编码SEQ ID NO:24的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列；与编码SEQ ID NO:28的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:28的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列；与编码SEQ ID NO:30的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:30的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列；与编码SEQ ID NO:38的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段；以及与编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
c)一种或多种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒株的广泛交叉反应性免疫反应的第一流感核酸序列乙型流感血凝素，其选自以下：
选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:13、与SEQ IDNO:13至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:13的片段；与SEQ IDNO:13的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25、与SEQ IDNO:25至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25的片段：与SEQ IDNO:25的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:31；与SEQ IDNO:31至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:31的片段；与SEQ IDNO:31的片段至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:33；与SEQ IDNO:33至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:33的片段；与SEQ IDNO:33的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列、与编码SEQ ID NO:14的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列；与编码SEQ ID NO:32的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:32的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列；与编码SEQ ID NO:34的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段；以及与编码SEQ ID NO:34的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
在一些实施方案中，除以上a)、b)和c)之外，组合也可包括一种或多种能够在哺乳动物中产生针对多种流感病毒株的广泛交叉反应性免疫反应的流感核酸序列H2血凝素，其选自以下：SEQ IDNO:6、与SEQ ID NO:6至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:6的片段；与SEQ ID NO:6的片段至少95％同源的核酸序列；编码SEQ IDNO:7的核酸序列；与编码SEQ ID NO:7的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:7的核酸序列的片段；以及与编码SEQ IDNO:7的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
DNA疫苗公开于美国专利号5,593,972、5,739,118、5,817,637、5,830,876、5,962,428、5,981,505、5,580,859、5,703,055和5,676,594中，所述专利以引用的方式完全并入本文。DNA疫苗可进一步包含抑制它整合至染色体中的成分或试剂。疫苗可为血凝素抗原的RNA。可将RNA疫苗引入细胞中。
疫苗可为包含上述遗传构建体或抗原的重组疫苗。疫苗也可包含一种或多种呈一种或多种蛋白质亚单位、一种或多种包含一种或多种共有血凝素抗原的杀死的流感粒子、或一种或多种包含一种或多种共有血凝素抗原的减毒流感粒子的形式的共有血凝素抗原。减毒疫苗可为减毒活疫苗、杀死的疫苗和使用重组载体来递送编码一种或多种共有血凝素抗原的外来基因的疫苗、以及亚单位和糖蛋白疫苗。减毒活疫苗、使用重组载体来递送外来抗原的疫苗、亚单位疫苗和糖蛋白疫苗的实例描述于美国专利号：4,510,245；4,797,368；4,722,848；4,790,987；4,920,209；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734；5,474,935；5,482,713；5,591,439；5,643,579；5,650,309；5,698,202；5,955,088；6,034,298；6,042,836；6,156,319和6,589,529中，所述专利各自以引用的方式并入本文。
疫苗可包含针对来自世界上特定区域，例如亚洲的甲型流感血清型的载体和/或蛋白质。疫苗也可针对目前感染人的猪源甲型流感血清型。疫苗可包含针对来自世界上特定区域的乙型流感的载体和/或蛋白质。疫苗也可针对感染人的乙型流感。疫苗可包含针对一种或多种甲型流感和/或乙型流感病毒株的一种或多种载体和/或一种或多种蛋白质。
提供的疫苗可用于诱导免疫反应，包括治疗性或防治性免疫反应。可产生针对共有血凝素抗原以及广泛跨越多种流感病毒亚型的抗体和/或杀伤T细胞。可分离所述抗体和细胞。
疫苗可进一步包含药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的赋形剂可为作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能性分子。药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂，其可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯(squalene)和角鲨烯(squalene))、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其它已知转染促进剂。
转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染促进剂是聚-L-谷氨酸，并且更优选地，聚-L-谷氨酸在小于6mg/ml的浓度下存在于疫苗中。转染促进剂也可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、胞壁酰肽、醌类似物和囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，并且透明质酸也可用于连同遗传构建体一起施用。在一些实施方案中，DNA载体疫苗也可包括转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其它已知转染促进剂。优选地，转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染剂在疫苗中的浓度是小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可为佐剂。佐剂可为在替代性质粒中表达或作为蛋白质与在疫苗中的以上质粒组合来被递送的其它基因。佐剂可选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括缺失信号序列，并且任选包括来自IgE的信号肽的IL-15)。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
可为适用佐剂的其它基因包括编码以下的那些：MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素(L-selectin)、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶(Caspase)ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Re1、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能性片段。
疫苗可进一步包含如1994年4月1日提交的美国序列号021,579中所述的遗传疫苗促进剂，所述专利以引用的方式完全并入本文。
5.递送方法
本文提供一种用于递送药物制剂，优选是疫苗的方法，所述药物制剂用于提供血凝素抗原的遗传构建体和蛋白质，其包含使得它们成为可诱导对流感病毒性感染的免疫反应所针对的特定有效免疫原的表位。可提供递送疫苗的方法或疫苗接种以诱导治疗性和/或防治性免疫反应。疫苗接种方法可在哺乳动物中产生针对多种流感亚型，包括H1N1血清型(如2009猪源性H1N1)或其它季节性和/或大流行性种类的免疫反应。可向个体递送疫苗以调节哺乳动物的免疫系统的活性，并且增强免疫反应。递送疫苗可为以核酸分子形式转染HA抗原，所述核酸分子在细胞中表达，并且被递送至细胞表面，此后，免疫系统识别，并且诱导细胞性反应、体液性反应、或细胞性反应和体液性反应。递送疫苗可用于通过向哺乳动物施用如本文讨论的疫苗来在哺乳动物中诱导或引发针对多种流感病毒的免疫反应。
在向哺乳动物递送疫苗，并且随即载体进入哺乳动物的细胞中后，转染的细胞将表达并分泌对应流感蛋白质，包括至少一种共有抗原，并且优选是H1、H2、U2和BHA。这些分泌的蛋白质或合成抗原将由免疫系统识别为外来物，此将发动可包括以下的免疫反应：针对抗原产生的抗体和特异性针对抗原的T细胞反应。在一些实例中，用本文讨论的疫苗进行疫苗接种的哺乳动物将具有致敏免疫系统，并且当用流感病毒株激发时，致敏免疫系统将允许通过体液性清除、细胞性清除或两者来快速清除后续流感病毒。可向个体递送疫苗以调节个体的免疫系统的活性，由此增强免疫反应。
可以DNA疫苗形式递送疫苗，并且递送DNA疫苗的方法描述于美国专利号4,945,050和5,036,006中，所述专利均以引用的方式完全并入本文。
可向哺乳动物施用疫苗以在哺乳动物中引发免疫反应。哺乳动物可为人、非人灵长类动物、母牛、猪、绵羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、牛、鹿、刺猬、象、美洲驼、羊驼、小鼠、大鼠或鸡，并且优选是人、母牛、猪或鸡。
a.与其它抗原和佐剂组合
本文所述的药物组合物(优选是疫苗)可与一种或多种其它流感蛋白质或编码甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素和神经氨酸酶的基因组合施用。疫苗可与蛋白质或编码佐剂的基因组合施用，其可包括：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、IL-12、IL-15、IL-21、IL-23、IL-28、IL-33、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、pl50.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Re1、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、非活性NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1或TAP2或其功能性片段。
b.施用途径
疫苗可通过不同途径来施用，包括经口服、经胃肠外、经舌下、经皮、经直肠、经粘膜、局部、通过吸入、通过经颊施用、胸膜内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、鼻内、鞘内和关节内或其组合。对于兽医学使用，可根据正常兽医学规范以可适合接受的制剂形式施用组合物。兽医可易于确定最适于特定动物的给药方案和施用途径。疫苗可通过传统注射器、无针注射装置、“微粒轰击基因枪”或其它物理方法，如电穿孔(“EP”)、“流体动力学方法”或超声来施用。
可通过若干熟知技术来向哺乳动物递送疫苗的载体，所述技术包括伴有和不伴有体内电穿孔的DNA注射(也称为DNA疫苗接种)、脂质体介导、纳米粒子促进、重组载体，如重组腺病毒、重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。可通过DNA注射，并且连同体内电穿孔一起来递送HA抗原。
c.电穿孔
通过疫苗的质粒的电穿孔来施用疫苗可使用可被配置来向哺乳动物的所需组织递送有效导致在细胞膜中形成可逆孔的能量脉冲的电穿孔装置达成，并且能量脉冲优选是与由使用者预设的电流输入类似的恒定电流。电穿孔装置可包括电穿孔组件和电极总成或处理总成。电穿孔组件可包括和并入电穿孔装置的各种元件中的一个或多个，包括：控制器、电流波形产生器、阻抗测试器、波形记录器、输入元件、状态报告元件、通信端口、记忆组件、电源和电力开关。电穿孔可使用用以促进细胞被质粒转染的体内电穿孔装置，例如EP系统(VGX Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)或Elgen电穿孔仪(Genetronics,San Diego,CA)来达成。
电穿孔组件可充当电穿孔装置的一个元件，并且其它元件是与电穿孔组件通信的单独元件(或组件)。电穿孔组件可充当电穿孔装置的一个以上元件，其可与电穿孔装置的与电穿孔组件分开的其它元件通信。电穿孔装置的作为一个电机装置或机械装置的部分存在的元件可不受限制，因为元件可充当一个装置或彼此通信的单独元件。电穿孔组件可能够递送在所需组织中产生恒定电流的能量脉冲，并且包括反馈机制。电极总成可包括具有呈一定空间排列的多个电极的电极阵列，其中电极总成接收来自电穿孔组件的能量脉冲，并且通过电极将其递送至所需组织。多个电极中的至少一个在递送能量脉冲期间是中性的，并且测量所需组织中的阻抗并将阻抗通信至电穿孔组件。反馈机制可接收测量的阻抗，并且可调整由电穿孔组件递送的能量脉冲以维持恒定电流。
多个电极可以分散样式递送能量脉冲。多个电极可通过根据程序化序列控制电极来以分散样式递送能量脉冲，并且程序化序列由使用者输入至电穿孔组件。程序化序列可包含依序递送的多个脉冲，其中多个脉冲中的各脉冲由至少两个活性电极递送，其中一个中性电极测量阻抗，并且其中多个脉冲中的后续脉冲由至少两个活性电极中的不同电极递送，其中一个中性电极测量阻抗。
反馈机制可由硬件或软件执行。反馈机制可由模拟闭环电路执行。反馈每50μs、20μs、10μs或1μs发生，但优选是实时反馈或瞬时的(即大致上瞬时的，如通过可用于测定反应时间的技术所确定)。中性电极可测量所需组织中的阻抗并将阻抗通信至反馈机制，并且反馈机制对阻抗起反应并调整能量脉冲以维持恒定电流处于与预设电流类似的值下。反馈机制可在递送能量脉冲期间连续以及瞬时维持恒定电流。
可促进递送本发明的DNA疫苗的电穿孔装置和电穿孔方法的实例包括Draghia-Akli等的美国专利号7,245,963、由Smith等提交的美国专利公布2005/0052630中所述的那些，所述专利的内容据此以引用的方式整体并入本文。可用于促进递送DNA疫苗的其它电穿孔装置和电穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同待决以及共同拥有的美国专利申请序列号11/874072中提供的那些，所述申请根据35USC 119(e)要求2006年10月17日提交的美国临时申请序列号60/852,149和2007年10月10日提交的美国临时申请序列号60/978,982的权益，所述申请都据此整体并入本文。
Draghia-Akli等的美国专利号7,245,963描述模块化电极系统和它们促进将生物分子引入身体或植物中所选组织的细胞中的用途。模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；提供自可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；以及电源。操作者可抓住固定在支撑结构上的多个针电极，并且将它们坚固地插入身体或植物中的所选组织中。接着通过皮下注射针将生物分子递送至所选组织中。启动可编程恒定电流脉冲控制器，并且将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进将生物分子引入多个电极之间的细胞中。美国专利号7,245,963的整个内容据此以引用的方式并入本文。
由Smith等提交的美国专利公布2005/0052630描述一种电穿孔装置，其可用于有效促进将生物分子引入身体或植物中所选组织的细胞中。所述电穿孔装置包括操作由软件或固件指定的电动力学装置(“EKD装置”)。EKD装置基于使用者控制和脉冲参数的输入而在呈一定阵列的电极之间产生一系列可编程恒定电流脉冲样式，并且允许储存和获得电流波形数据。电穿孔装置也包括具有一阵列针电极的可替换电极盘、供注射针用的中心注射通道、以及可移除导向盘。美国专利公布2005/0052630的整个内容据此以引用的方式并入本文。
美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/0052630中所述的电极阵列和方法可适合于不仅深度穿透如肌肉的组织，而且也深度穿透其它组织或器官。由于电极阵列的配置，注射针(用以递送所选生物分子)也被完全插入靶标要点中，并且注射是在由电极预先勾划的区域中垂直于靶标组织来施用。美国专利号7,245,963和美国专利公布2005/005263中所述的电极优选是20mm长和21规格。
另外，在并有电穿孔装置及其用途的一些实施方案中，预期存在是以下专利中所述的电穿孔装置的电穿孔装置；1993年12月28日颁予的美国专利5,273,525、2000年8月29日颁予的美国专利6,110,161、2001年7月17日颁予的美国专利6,261,281和2005年10月25日颁予的美国专利6,958,060、以及2005年9月6日颁予的美国专利6,939,862。此外，涵盖2004年2月24日颁予的美国专利6,697,669(其涉及使用多种装置中的任一个递送DNA)和2008年2月5日颁予的美国专利7,328,064(涉及注射DNA的方法)中提供的主题的专利被涵盖在本文中。以上专利以引用的方式整体并入本文。
d.制备疫苗的方法
本文提供用于制备构成本文讨论的DNA疫苗的DNA质粒的方法。在最终亚克隆至哺乳动物表达质粒中的步骤之后，DNA质粒可用于使用本领域中的已知方法在大规模发酵罐中接种细胞培养物。
可使用已知装置和技术的组合来配制或制造供与本发明的EP装置一起使用的DNA质粒，但优选地，它们是使用2007年5月23日提交的许可共同待决美国临时申请美国序列号60/939,792中所述的优化质粒制造技术制造。在一些实例中，可在大于或等于10mg/mL的浓度下配制用于这些研究中的DNA质粒。除美国序列号60/939792中所述的那些之外，制造技术也包括或并有通常为本领域普通技术人员所知的各种装置和方案，包括2007年7月3日颁予的许可专利美国专利号7,238,522中所述的那些。以上参照的申请和专利(即分别是美国序列号60/939,792和美国专利号7,238,522)据此整体并入本文。
实施例
本发明进一步在以下实施例中说明。应了解，尽管指示本发明的优选实施方案，但这些实施例仅通过说明方式给出。根据以上讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的必要特征，并且在不脱离本发明的精神和范围下，可对本发明进行各种变化和修改以使它适应于各种用途和情况。因此，除本文所示和所述的那些修改之外，本发明的各种修改将为本领域技术人员根据先前描述而显而易知。所述修改也意图属于随附权利要求的范围。
实施例1
pGX2009(pH1HA09)–编码2009H1N1流感(猪流行性感冒)血凝素抗原的质粒
pGX2009(H1HA09)的骨架是受控于巨细胞病毒立即-早期(CMV)启动子的修饰的表达载体pVAX1(Invitrogen,Carlsbad,CA)。原始pVAX1购自Invitrogen(目录号V260-20)，并且在-20℃下维持。如上所指示，序列分析揭示用作pGX2009的骨架的pVAX1的序列与可自Invitrogen获得的pVAX1序列之间的差异。以上阐述所述差异。
也称为pH1HA09的质粒pGX2009包含编码共有2009H1N1流感(猪流行性感冒)血凝素分子的核酸序列。用于产生共有序列的79个一级序列选自流感序列数据库。
编码各种甲型流感血凝素H1蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列以及由核苷酸序列编码的氨基酸序列的登录号在GenBank数据库中对应于以下登录号。不在括号中的登录号公开核苷酸序列和由它们编码的其它清单氨基酸序列。括号中的登录号是针对GenBank的蛋白质数据库中的相应氨基酸序列的条目。
登录号如下：GQ323579.1(ACS72657.1)、GQ323564.1(ACS72654.1)、GQ323551.1(ACS72652.1)、GQ323530.1(ACS72651.1)、GQ323520.1(ACS72650.1)、GQ323495.1(ACS72648.1)、GQ323489.1(ACS72647.1)、GQ323486.1(ACS72646.1)、GQ323483.1(ACS72645.1)、GQ323455.1(ACS72641.1)、GQ323451.1(ACS72640.1)、GQ323443.1(ACS72638.1)、GQ293077.1(ACS68822.1)、GQ288372.1(ACS54301.1)、GQ287625.1(ACS54262.1)、GQ287627.1(ACS54263.1)、GQ287623.1(ACS54261.1)、GQ287621.1(ACS54260.1)、GQ286175.1(ACS54258.1)、GQ283488.1(ACS50088.1)、GQ280797.1(ACS45035.1)、GQ280624.1(ACS45017.1)、GQ280121.1(ACS45189.1)、GQ261277.1(ACS34968.1)、GQ253498.1(ACS27787.1)、GQ323470.1(ACS72643.1)、GQ253492.1(ACS27780.1)、FJ981613.1(ACQ55359.1)、FJ971076.1(ACP52565.1)、FJ969540.1(ACP44189.1)、FJ969511.1(ACP44150.1)、FJ969509.1(ACP44147.1)、GQ255900.1(ACS27774.1)、GQ255901.1(ACS27775.1)、FJ966974.1(ACP41953.1)、GQ261275.1(ACS34967.1)、FJ966960.1(ACP41935.1)、FJ966952.1(ACP41926.1)、FJ966082.1(ACP41105.1)、GQ255897.1(ACS27770.1)、CY041645.1(ACS27249.1)、CY041637.1(ACS27239.1)、CY041629(ACS27229.1)、GQ323446.1(ACS72639.1)、CY041597.1(ACS27189.1)、CY041581.1(ACS14726.1)、CY040653.1(ACS14666.1)、CY041573.1(ACS14716.1)、CY041565.1(ACS14706.1)、CY041541.1(ACS14676.1)、GQ258462.1(ACS34667.1)、CY041557.1(ACS14696.1)、CY041549.1(ACS14686.1)、GQ283484.1(ACS50084.1)、GQ283493.1(ACS50095.1)、GQ303340.1(ACS71656.1)、GQ287619.1(ACS54259.1)、GQ267839.1(ACS36632.1)、GQ268003.1(ACS36645.1)、CY041621.1(ACS27219.1)、CY041613.1(ACS27209.1)、CY041605.1(ACS27199.1)、FJ966959.1(ACP41934.1)、FJ966982.1(ACP41963.1)、CY039527.2(ACQ45338.1)、FJ981612.1(ACQ55358.1)、FJ981615.1(ACQ55361.1)、FJ982430.1(ACQ59195.1)、FJ998208.1(ACQ73386.1)、GQ259909.1(ACS34705.1)、GQ261272.1(ACS34966.1)、GQ287621.1(ACS54260.1)、GQ290059.1(ACS66821.1)、GQ323464.1(ACS72642.1)、GQ323473.1(ACS72644.1)、GQ323509.1(ACS72649.1)、GQ323560.1(ACS72653.1)、GQ323574.1(ACS72655.1)和GQ323576.1(ACS72656.1)。自NCBI序列数据库下载氨基酸序列，并且使用Clustal X产生比对和共有序列。将高效前导序列IgE前导物同框融合在起始密码子的上游以促进表达。为具有较高表达水平，使这个融合基因的密码子用法适合于智人基因的密码子偏倚。此外，也进行RNA优化：避免GC含量极高(>80％)或极低(<30％)的区域以及顺式作用序列基元，如内部TATA框、chi位点和核糖体进入位点。在Geneart(Regensburg,Germany)合成产生整个序列。合成工程化H1HA09基因的长度是1818bp(SEQ IDNO:3)，并且由Geneart在BamHI和XhoI位点处克隆至pVAX1中(图2)。
实施例2
HS09流感(pGX2009)免疫的雪貂
使用作为一种优选流感模型的雪貂进行实验。使用质粒pGX2009(SEQ ID NO:5，包括插入物HS09(SEQ ID NO:1))使雪貂免疫。
动物：4组x5个动物/组，外加具有4个动物的一个对照组＝总计24只雪貂(雄性)
持续时间：18周(包括激发)
剂量：.2mg质粒
方案概述：将雪貂随机分配至DNA疫苗组中。在研究第0天、第28天和第56天使动物免疫。根据核准的麻醉方案用氯胺酮/咪达唑仑混合物、异氟烷或等效物使动物麻醉，并且用流感DNA疫苗组合进行肌肉内疫苗接种。使用适应性恒定电流电穿孔(EP)装置在0.5安培、52毫秒脉冲、各脉冲之间0.2秒、4秒启动延迟、3次总脉冲下对组1和2进行立即电穿孔。对照动物是未处理对照(无质粒、不EP)。使雪貂在它们的笼中自麻醉恢复，并且密切监测24小时以确保完全恢复。
食物和水在研究的时长可随意获得。在第84天，通过用1mlMX10(A/墨西哥/InDRE4487/2009；5x105PFU/ml)进行鼻内感染来激发动物。使用确定且核准的计分单，每日监测动物的临床征象(重量、温度等)。在1、3、6、9和15dpi，收集鼻洗涤物和直肠拭擦物。在第15天收集肺。当适当时，将样本储存在RNAlater(用于通过实时PCR来获得病毒载量)、培养基(用于获得感染性病毒(TCDI50))和福尔马林(用于组织学研究)中。
HAI滴度
将雪貂放血，并且将血清样本立即储存在干冰上，随后运送至BIOQUAL(Rockville,MD)以进行处理。通过用3份酶稀释1份血清来用受体破坏酶处理血清，并且在37℃水浴下孵育过夜。通过在56℃下孵育30分钟来使酶失活，随后添加6份磷酸盐缓冲盐水以达成1/10的最终稀释度。使用4个血凝集单位的病毒和1％红细胞，在V形底96孔微量滴定板中进行HAI测定。自CDC的流感分部获得用于HAI测定的病毒(H1N1/墨西哥/InDRE4487/2009病毒株)。图4显示用来自免疫雪貂(3次免疫)的血清进行的血凝集抑制测定。滴度>1:40被视为“具有保护性”。点线指示1:40记号。所有动物在3次免疫之后都高于1:40记号。
激发研究
图5显示免疫和未免疫的雪貂用新型H1N1病毒株MX10(A/墨西哥/InDRE4487/2009)激发的结果。所有免疫的雪貂都存活，而75％的未处理雪貂在15天时期内死亡。
实施例3
H1血凝素组合研究
使用各种动物(小鼠、豚鼠和雪貂)进行实验。使用具有骨架pVAX1的质粒构建体使动物免疫，其中各构建体具有不同插入物：
在图7A-G、8A-C、9A-B、10A-B、11A-C中：未处理(仅pVAX1)；H1U1(具有SEQ ID NO:35插入物的pVAX1)；HS09(SEQ ID NO:5)；ConBris(或H1Bris)(具有SEQ ID NO:19插入物的pVAX1)；ConTT(或H1TT)(具有SEQ ID NO:21插入物的pVAX1)；
在图13A-F、14A-C、15A-D、16A-C、17A-C中：未处理(仅pVAX1)；BHA-1(具有SEQ ID NO:13插入物的pVAX1)；BHA-2(具有SEQ ID NO:25插入物的pVAX1)；BHA-3(具有SEQ ID NO:31插入物的pVAX1)；BHA-4(具有SEQ ID NO:33插入物的pVAX1)。
在图19A-E、20A-F中：未处理(仅pVAX1)；H3HA-1(具有SEQ ID NO:37插入物的pVAX1)；H3HA-2(具有SEQ ID NO:23插入物的pVAX1)；H3HA-3(具有SEQ ID NO:27插入物的pVAX1)；H3HA-4(具有SEQ ID NO:29插入物的pVAX1)。
剂量：0.2mg质粒
方案概述：将动物随机分配至DNA疫苗组中。在研究第0天、第28天和第56天使动物免疫。根据核准的麻醉方案用氯胺酮/咪达唑仑混合物、异氟烷或等效物使动物麻醉，并且用流感DNA疫苗组合进行肌肉内疫苗接种。使用CELLECTRA适应性恒定电流电穿孔(EP)装置(Inovio Pharmaceuticals,Blue Bell,PA)在0.5安培、52毫秒脉冲、各脉冲之间0.2秒、4秒启动延迟、3次总脉冲下对组1和2进行立即电穿孔。对照动物是未处理对照(无质粒、不EP)。使动物在它们的笼中自麻醉恢复，并且密切监测24小时以确保完全恢复。
HAI测定
将动物放血，并且将血清样本立即储存在干冰上，随后运送至BIOQUAL(Rockville,MD)以进行处理。通过用3份酶稀释1份血清来用受体破坏酶处理血清，并且在37℃水浴下孵育过夜。通过在56℃下孵育30分钟来使酶失活，随后添加6份磷酸盐缓冲盐水以达成1/10的最终稀释度。使用4个血凝集单位的病毒和1％红细胞，在V形底96孔微量滴定板中进行HAI测定。自CDC的流感分部获得用于HAI测定的病毒(H1N1/墨西哥/2009病毒株)。
H1研究：
实验显示用组合(全部四种H1抗原)进行疫苗接种的小鼠显示针对10个病毒株中的9个的保护性滴度(图7A-7F和图8A-C)。这显示在病毒株之间的强力交叉反应性。类似地，实验显示用组合进行疫苗接种的豚鼠显示针对全部10个病毒株的保护性滴度(参见图9A-B和10A-B)。
乙型流行性感冒研究：
实验显示用组合(BHA-1抗原与BHA-2抗原两者)进行疫苗接种的小鼠显示针对9个病毒株中的4个的保护性滴度(图13A-13C和图14C)；而2个病毒株显示边界1:40(图13D和图14A)。个别抗原显示针对9个病毒株中的4个(BHA-1)以及9个病毒株中的3个(BHA-2)的保护性滴度。类似地，实验显示用组合进行疫苗接种的豚鼠显示针对全部10个病毒株的保护性滴度(参见图9A-B和10A-B)。
实验显示用组合(BHA-1抗原与BHA-2抗原两者)进行疫苗接种的豚鼠显示针对10个病毒株中的全部10个的保护性滴度(查看第3剂后“PD3”)。然而，在另一方面，用单一抗原进行免疫不提供所述交叉保护，其中BHA-1仅提供针对10个病毒株中的7个的保护性滴度(图15A-D和图16A-C)。
H3研究：
实验显示用组合(H3HA-1抗原与H3HA-2抗原两者)进行疫苗接种的小鼠显示针对11个病毒株中的4个的保护性滴度(图19A-D)以及针对2个病毒株的接近保护性滴度(图19E和图20F)。然而，在另一方面，在H3HA-1的情况下，单一抗原显示针对11个病毒株中的4个的交叉保护(图19A-D)，但在任何其余病毒株中未展现HAI滴度。组合H3混合物显示比单独一种H3抗原略微更广泛的交叉保护。
激发研究
食物和水在研究的时长可随意获得。在第84天，通过用1mlMX10(A/墨西哥/2009；5x105PFU/ml)进行鼻内感染来激发雪貂。使用确定且核准的计分单，每日监测动物的临床征象(重量、温度等)。在1、3、6、9和15dpi，收集鼻洗涤物和直肠拭擦物。在第15天收集肺。当适当时，将样本储存在RNAlater(用于通过实时PCR来获得病毒载量)、培养基(用于获得感染性病毒(TCDI50))和福尔马林(用于组织学研究)中。
H1HA疫苗接种–激发
用HS09和H1U进行疫苗接种的雪貂显示免疫保护，因为全部五只雪貂在感染后14天存活；而五只未处理雪貂中仅一只存活。参见图11A-C。

Claims (20)

1.一种多共有亚型疫苗，其中所述疫苗提供针对多种流感病毒株的交叉反应性，所述疫苗包含至少一种共有血凝素抗原。
2.如权利要求1所述的疫苗，其中所述共有血凝素抗原选自由H1血凝素、H2血凝素、H3血凝素和乙型流感血凝素及其任何组合组成的组。
3.如权利要求2所述的疫苗，其中所述H1血凝素选自由HS09、H1Bris、H1TT、H1U及其任何组合组成的组。
4.如权利要求2所述的疫苗，其中所述H3血凝素选自由H3HA-1、H3HA-2及其任何组合组成的组。
5.如权利要求2所述的疫苗，其中所述乙型流感血凝素选自由BHA-1、BHA-2及其任何组合组成的组。
6.如权利要求3所述的疫苗，其中HS09包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:2的核酸序列、与编码SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:2的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；
其中H1Bris包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ IDNO:20的核酸序列、与编码SEQ ID NO:20的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:20的核酸序列的片段；与编码SEQ IDNO:20的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；
其中H1TT包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ IDNO:22的核酸序列、与编码SEQ ID NO:22的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:22的核酸序列的片段；与编码SEQ IDNO:22的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；
其中H1U包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ IDNO:36的核酸序列、与编码SEQ ID NO:36的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:36的核酸序列的片段；与编码SEQ IDNO:36的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
7.如权利要求3所述的疫苗，其中HS09包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:1、与SEQ ID NO:1至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:1的片段；与SEQ ID NO:1的片段至少95％同源的核酸序列；
其中H1Bris包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ IDNO:19、与SEQ ID NO:19至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:19的片段；与SEQ ID NO:19的片段至少95％同源的核酸序列；
其中H1TT包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ IDNO:21、与SEQ ID NO:21至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:21的片段；与SEQ ID NO:21的片段至少95％同源的核酸序列；并且
其中H1U包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:35、与SEQ ID NO:35至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:35的片段；与SEQ ID NO:35的片段至少95％同源的核酸序列。
8.如权利要求4所述的疫苗，其中H3HA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:38的核酸序列、与编码SEQ IDNO:38的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:38的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；
其中H3HA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ IDNO:24的核酸序列、与编码SEQ ID NO:24的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:24的核酸序列的片段；与编码SEQ IDNO:24的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
9.如权利要求4所述的疫苗，其中H3HA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:37、与SEQ ID NO:37至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:37的片段；与SEQ ID NO:37的片段至少95％同源的核酸序列；
其中H3HA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ IDNO:23、与SEQ ID NO:23至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:23的片段：与SEQ ID NO:23的片段至少95％同源的核酸序列。
10.如权利要求5所述的疫苗，其中BHA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ ID NO:14的核酸序列、与编码SEQ IDNO:14的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段；与编码SEQ ID NO:14的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列；
其中BHA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：编码SEQ IDNO:26的核酸序列、与编码SEQ ID NO:26的核酸序列至少95％同源的核酸序列；编码SEQ ID NO:26的核酸序列的片段；与编码SEQ IDNO:26的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
11.如权利要求5所述的疫苗，其中BHA-1包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ ID NO:13、与SEQ ID NO:13至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:13的片段；与SEQ ID NO:13的片段至少95％同源的核酸序列；
其中BHA-2包含选自由以下组成的组的核酸序列：SEQ IDNO:25、与SEQ ID NO:25至少95％同源的核酸序列；SEQ ID NO:25的片段：与SEQ ID NO:25的片段至少95％同源的核酸序列。
12.一种在哺乳动物中诱导针对多种流感病毒株的交叉反应性的方法，所述方法包括向有需要的哺乳动物施用权利要求1-11中任一项所述的疫苗。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述共有血凝素抗原各自分开向所述哺乳动物施用。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述共有血凝素抗原各自同时向所述哺乳动物施用。
15.一种分离的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核酸序列、编码氨基酸序列SEQID NO:20的核酸序列、编码氨基酸序列SEQ ID NO:22的核酸序列、编码氨基酸序列SEQ ID NO:36的核酸序列、编码氨基酸序列SEQ IDNO:38的核酸序列、编码氨基酸序列SEQ ID NO:24的核酸序列、编码氨基酸序列SEQ ID NO:14的核酸序列、编码氨基酸序列SEQ IDNO:26的核酸序列，
与编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核酸序列至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:20的核酸序列至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:22的核酸序列至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:36的核酸序列至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:38的核酸序列至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:24的核酸序列至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:14的核酸序列至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ IDNO:26的核酸序列至少95％同源的核酸序列，
编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核酸序列的片段、编码氨基酸序列SEQ ID NO:20的核酸序列的片段、编码氨基酸序列SEQ IDNO:22的核酸序列的片段、编码氨基酸序列SEQ ID NO:36的核酸序列的片段、编码氨基酸序列SEQ ID NO:38的核酸序列的片段、编码氨基酸序列SEQ ID NO:24的核酸序列的片段、编码氨基酸序列SEQID NO:14的核酸序列的片段、编码氨基酸序列SEQ ID NO:26的核酸序列的片段，
与编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:20的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:22的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ IDNO:36的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:38的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:24的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:14的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列、与编码氨基酸序列SEQ ID NO:26的核酸序列的片段至少95％同源的核酸序列。
16.一种分离的核酸分子，其包含一种或多种选自由以下组成的组的核酸序列：
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:25，
与SEQ ID NO:1至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:19至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:21至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:35至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:37至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:23至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:13至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:25至少95％同源的核酸序列，
SEQ ID NO:1的片段、SEQ ID NO:19的片段、SEQ ID NO:21的片段、SEQ ID NO:35的片段、SEQ ID NO:37的片段、SEQ ID NO:23的片段、SEQ ID NO:13的片段、SEQ ID NO:25的片段，
与SEQ ID NO:1的片段至少95％同源的核酸序列、与SEQ IDNO:19的片段至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:21的片段至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:35的片段至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:37的片段至少95％同源的核酸序列、与SEQID NO:23的片段至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:13的片段至少95％同源的核酸序列、与SEQ ID NO:25的片段至少95％同源的核酸序列。
17.一种表达载体，其包含可操作地连接于调控元件的权利要求15-16中任一项的核酸序列。
18.一种包含第一核酸序列和第二核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列包含权利要求15的序列，
并且其中所述第二核酸序列包含一种或多种编码选自由以下一个或多个组成的组的蛋白质的核酸序列：甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素、神经氨酸酶及其片段。
19.一种包含第一核酸序列和第二核酸序列的组合物，其中所述第一核酸序列包含权利要求16的序列，
并且其中所述第二核酸序列包含一种或多种编码选自由以下一个或多个组成的组的蛋白质的核酸序列：甲型流感H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16、N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8、N9、乙型流感血凝素、神经氨酸酶及其片段。
20.一种在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包括向所述哺乳动物施用权利要求15-19中任一项的核酸序列。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023208118A1 (zh) * 2022-04-27 2023-11-02 瑞可迪（上海）生物医药有限公司 核酸构建体及其应用

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20130075732A (ko) 2010-03-30 2013-07-05 마운트 시나이 스쿨 오브 메디슨 인플루엔자 바이러스 백신 및 이의 용도
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP2758075B1 (en) 2011-09-20 2023-05-03 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2013362935B2 (en) 2012-12-18 2018-10-04 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
BR112016024644A2 (pt) 2014-04-23 2017-10-10 Modernatx Inc vacinas de ácido nucleico
KR20230145241A (ko) * 2014-10-01 2023-10-17 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 항원 및 어쥬번트로서 인터류킨-21을 갖는 백신
US10736956B2 (en) 2015-01-23 2020-08-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccination regimens
EP3302328A4 (en) * 2015-06-03 2018-06-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Apparatus, method and system for selectively affecting and/or killing a virus
WO2017218624A1 (en) * 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
US11254733B2 (en) 2017-04-07 2022-02-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza B virus neuraminidase antibodies and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1771054A (zh) * 2003-03-24 2006-05-10 英特塞尔股份公司 改进的疫苗
US20110182938A1 (en) * 2010-01-26 2011-07-28 Weiner David B Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5705545B2 (ja) * 2007-11-12 2015-04-22 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア インフルエンザウイルスの複数のサブタイプに対する新規ワクチン
US20110177122A1 (en) 2008-09-26 2011-07-21 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health & Human Services Dna prime/activated vaccine boost immunization to influenza virus
WO2011003100A2 (en) 2009-07-02 2011-01-06 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for diagnosing and/or treating influenza infection
WO2011044152A1 (en) 2009-10-05 2011-04-14 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Office Of Technology Transfer Protection against pandemic and seasonal strains of influenza
US10226527B2 (en) 2010-10-04 2019-03-12 Massachusetts Institute Of Technology Hemagglutinin polypeptides, and reagents and methods relating thereto
WO2012061239A2 (en) * 2010-11-02 2012-05-10 Opko Pharmaceuticals, Llc Novel vaccines against pandemic influenza virus a/h1n1
KR20140047069A (ko) * 2011-06-20 2014-04-21 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 계산에 최적화된 광범위 반응을 나타내는 ｈ１ｎ１ 인플루엔자를 위한 항원
US9504741B2 (en) 2011-11-23 2016-11-29 Vacdiagn Biotechnology Co., Ltd. Immune methods against influenza viruses and combinatorial vaccines thereof
US20140286981A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Broadly reactive mosaic peptide for influenza vaccine

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1771054A (zh) * 2003-03-24 2006-05-10 英特塞尔股份公司 改进的疫苗
US20110182938A1 (en) * 2010-01-26 2011-07-28 Weiner David B Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023208118A1 (zh) * 2022-04-27 2023-11-02 瑞可迪（上海）生物医药有限公司 核酸构建体及其应用

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Publication number Publication date
US10022434B2 (en) 2018-07-17
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KR20150127586A (ko) 2015-11-17
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US20160022806A1 (en) 2016-01-28
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US20180344842A1 (en) 2018-12-06

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