CN101506381B

CN101506381B - 针对肿瘤基质抗原fap的dna组合物及其使用方法

Info

Publication number: CN101506381B
Application number: CN2007800305510A
Authority: CN
Inventors: R·A·雷斯菲尔德; M·勒夫勒; J·A·克吕格尔; A·G·尼萨默
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2007-06-21
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2027-06-21
Also published as: PL2035581T3; CN101506381A; EP2035581A2; PT2035581E; EP2035581B1; DK2035581T3; US20090253778A1; WO2007149518A3; JP2009541328A; WO2007149518A2; CA2657217A1; EP2035581A4; ES2393372T3

Abstract

有效刺激对抗肿瘤细胞和肿瘤转移的免疫应答的DNA组合物，该DNA组合物包含编码可在免疫细胞中表达的成纤维细胞激活蛋白(FAP)的至少一个表位的DNA构建体，该DNA构建体被掺入药学上可接受的载体中。该组合物可以编码FAP的单个表位、包含FAP的两个或多个表位的多肽、整个FAP蛋白、或其将刺激所需免疫应答的任何部分。在一个优选的实施方案中，该组合物还包括编码免疫效应蛋白例如细胞因子的DNA构建体。本发明的DNA组合物可以单独使用或与化疗药物联用，以治疗疾病例如肿瘤和肿瘤转移。

Description

针对肿瘤基质抗原FAP的DNA组合物及其使用方法

相关申请的交叉引用

本申请要求保护2006年6月21日提交的美国临时专利申请序号60/815,316的权益，该专利通过引用结合到本文中。

政府的权利

本发明在National Institutes of Health授予的基金No.CA83856和国防部授予的基金No.BC031079的政府资助下完成。政府具有本发明的某些权利。

发明领域

本发明涉及脱氧核糖核酸(DNA)组合物，其编码有效刺激免疫应答对抗肿瘤中的基质成纤维细胞的合适分子。更详细地讲，本发明涉及DNA组合物，其编码称为成纤维细胞激活蛋白(FAP)的基质抗原。本发明还涉及以下的方法：使用该DNA组合物以抑制肿瘤生长和肿瘤转移，并以增加化疗药物的细胞吸收。

发明背景

逐渐变得清晰的是，肿瘤抗原是用于癌症治疗的难以捉摸的靶标。这可通过对肿瘤细胞唯一的各种特征来解释，这些特征包括它们的抗原的突变和由于MHC-抗原表达的下调的不足够的抗原呈递。此外，细胞凋亡信号途径的缺陷、以及细胞凋亡抑制剂例如存活蛋白、XIAP或bcl-2家族的抗细胞凋亡成员的增量调节不仅对T细胞介导的杀伤赋予抗性，而且也对化疗药物的凋亡诱导效应赋予抗性。

人们逐渐认识到：基质区室(stromal compartment)在肿瘤发生和肿瘤侵入中起决定性的作用。已经显示基质细胞刺激正常上皮细胞的转型，互换生长因子、细胞因子和化学引诱物以激活邻近的细胞外基质和诱导赘生细胞的选择和扩张。在一项研究中，将肿瘤细胞作为混悬液注射进小鼠中据报道为不致瘤的，但注射包含其基质的实体瘤碎片据报道却引起肿瘤生长(见Singh等，J.Exp.Med.1992年；175：139-146)。激活的胞外基质显然赋予由β1整联蛋白介导的化学抗性，β1整联蛋白附着于纤连蛋白，引起β1整联蛋白刺激性酪氨酸激酶的激活，从而抑制化学疗法诱导的细胞凋亡。该现象已经在多柔比星敏感性骨髓瘤细胞中报道，该骨髓瘤细胞在附着纤连蛋白之后发展抗性。最近的报道表明，可通过肿瘤基质成纤维细胞调控或通过分配肿瘤基质网络实现肿瘤排斥。另外，由于与肿瘤相关的巨噬细胞和成纤维细胞具有合成如VEGF、TGF-β1和IL-10的蛋白质的能力，因此它们据报道促进局部免疫抑制环境。VEGF起树突细胞成熟的抑制因子的作用，因此导致耐受T细胞。VEGF也为涉及肿瘤-血管发生的主要因子。VEGF的激活引起存活蛋白和肿瘤-内皮细胞中的许多其它的凋亡抑制蛋白的增量调节，保护它们免受化学疗法的凋亡效应。相反，TGF-β1的抑制可引起肿瘤根除和对抗转移的保护作用。IL-10抑制树突细胞的成熟，因此抑制由Th1细胞介导的细胞介导性抗肿瘤应答。该效应使树突细胞向基本无效的体液免疫反应转变。

成纤维细胞为分泌富含胶原和其它大分子的细胞外基质的结缔组织细胞。肿瘤-基质(即肿瘤支持组织)中的成纤维细胞合成成纤维细胞激活蛋白(FAP)，具有丝氨酸蛋白酶功能的II型跨膜蛋白质。FAP在超过90％的与结肠癌、乳癌和肺癌有关的基质成纤维细胞中选择性地过量表达。在伤口愈合期间和在一些胎儿间充组织中也可观察到FAP的短暂过量表达。另外，据报道该酶切割明胶和I型胶原，已经牵涉进细胞外基质重建中。据报道FAP的过量表达引起肿瘤生长的促进和增加转移的可能性，而用抗FAP抗体治疗抑制肿瘤生长。此外，主要由成纤维细胞产生的I型胶原的肿瘤-基质表达，相反地与包括化疗药物在内的许多化合物的肿瘤内吸收有关，由此维持基质区室与化学疗法抗性的相关性。

已经使用疫苗以通过非常有限地给予预防剂提供对抗许多病症的长期保护，所述预防剂刺激生物体的免疫系统以在病原体可增殖和引起病理效应之前破坏疾病的病原体。在Bernard R.Glick和Jack J.Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles and Applications ofRecombinant DNA，第二版，ASM Press第253-276页(1998)中描述了疫苗和接种疫苗的许多方法。

接种疫苗为诱导身体自身的免疫系统以在感染介质(infectiousagent)形成病理反应之前寻找并破坏感染介质的方法。一般而言，疫苗为活的但减毒的感染介质(病毒或细菌)，或该感染介质的灭活形式。由活细菌或病毒组成的疫苗必须为非致病性的。一般而言，通过物理或化学处理将细菌或病毒的培养物减毒(减弱)。即使该感染介质为无毒的，但它仍然可在用该疫苗治疗的受试者中刺激免疫应答。

由抗原刺激免疫应答，该抗原可为特异性的大分子或感染介质。这些抗原一般为蛋白质、多糖、脂类、或糖脂，它们被名为B细胞和T细胞的淋巴细胞认为是″外来的″。将两种类型的淋巴细胞暴露至抗原，刺激快速的细胞分裂和分化反应，引起被暴露的淋巴细胞克隆形成。B细胞产生浆细胞，浆细胞继而产生称为抗体(Ab)的蛋白质，这些蛋白质选择性地结合在感染介质上存在的抗原，从而中和或灭活病原体(体液免疫)。有时，B细胞应答需要CD4辅助T细胞的协助。

响应抗原暴露而形成的特异性的T细胞克隆为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，该细胞能够结合和消除存在抗原的病原体和组织(细胞介导的免疫或细胞免疫)。有时，抗原呈递细胞(APC)如树突细胞会通过胞吞作用包裹病原体或其它外来细胞。然后APC加工来自那些细胞的抗原，并将这些抗原以组织相容性分子：肽复合体的形式呈递到CTL上的T细胞受体(TCR)，从而刺激免疫应答。

以特异性抗体的形成为特征的体液免疫通常对抗急性细菌感染和来自病毒的重复感染最有效，而细胞介导的免疫对抗病毒感染、慢性胞内细菌感染、和真菌感染最有效。也已知细胞免疫防止某些癌症和引起器官移植的排斥。

在很长的时期内，得自先前感染的抗原的抗体在血液中保持为可检测的，因此提供测定先前暴露于(exposure to)病原体的方法。当再暴露于相同的病原体时，免疫系统通过在病原体可增殖和产生致病性反应之前消除病原体而有效地防止再感染。

由病原体刺激的相同的免疫应答有时也可由存在与病原体相同抗原的非致病介质产生。按该方式，受试者可受到对抗随后暴露于病原体的保护作用，而不需要先前抗击过感染。

然而，并非所有的感染介质都可容易地如形成疫苗所需要地培养和灭活。现代的重组DNA技术已经允许设计新疫苗以设法克服该限制。可产生缺少致病基因的感染介质，因此允许活的、无毒形式的生物体用作疫苗。也可能工程改造相对的非病原生物如E.coli以呈递致病性载体的细胞表面抗原。经接种该转化载体的受试者的免疫系统受″欺骗″而形成针对该病原体的抗体。可对病原体的抗原蛋白质进行工程改造并使之在非致病性物种中表达，该抗原蛋白质可经分离和纯化以生产″亚单位疫苗″。亚单位疫苗具有稳定、安全和化学上明确定义的优点；然而，它们的生产成本太高。

近年来出现制备疫苗的新方法，广泛地称为基因免疫。在该方法中，编码病原体抗原的核酸(多核苷酸)可经操作插入接受免疫的受试者细胞中。受处理的细胞，优选抗原呈递细胞(APC)如树突细胞经转化，产生病原体的抗原蛋白质。然后这些在体内产生的抗原触发所需的宿主免疫应答。在这样的基因疫苗中使用的遗传物质可为DNA构建体或RNA构建体。通常，编码抗原的多核苷酸与其它促进多核苷酸序列联合导入以增强基因的插入、复制、或表达。

可通过许多递送体系将编码抗原基因的DNA疫苗导入受试者的宿主细胞。这些递送体系包括原核生物递送体系和病毒递送体系。例如，一种方法为使用病毒载体，如掺有新型遗传物质的牛痘病毒，以接种宿主细胞。或者，该遗传物质可掺入质粒载体或可作为″裸″多核苷酸，即简单地作为纯化的DNA直接递送至宿主细胞。另外，DNA可稳定地转染进减毒的细菌如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)。当用经转化的沙门氏菌(Salmonella)口服接种病人时，细菌被运输至肠(即次级淋巴组织)中的淋巴集结，然后刺激免疫应答。

DNA疫苗提供机会以对不是由传统病原体引起的病症的免疫，例如遗传性疾病和癌症。通常基因癌症疫苗导入APC编码抗原的基因，经如此转化的APC产生特定类型肿瘤细胞的抗原。因此，对抗许多癌症类型的有效的通用疫苗必然需要许多用于欲免疫对抗的每种类型癌细胞的单一疫苗。

持续需要的是用于免疫对抗各种类型癌症的广泛有效的DNA组合物，例如疫苗。本发明满足该需要。

发明概述

有效抑制肿瘤生长和肿瘤转移的DNA组合物包含以下的DNA构建体：编码可在受试者的免疫细胞中表达的成纤维细胞激活蛋白(FAP)的至少一个表位的DNA构建体，该受试者已经被给予DNA构建体。该DNA构建体被掺入药学上可接受的载体。该组合物可编码FAP的单个表位、包含两个或多个FAP表位的多肽、整个FAP蛋白质、或其将刺激对抗肿瘤基质细胞所需的免疫应答的任何部分。优选地，该DNA构建体编码具有由SEQ ID NO：2组成的氨基酸残基序列的人FAP、或与SEQ ID NO：2具有至少80％相似性并包括至少一个FAP表位的蛋白质。

该DNA构建体可为裸DNA构建体，优选为质粒的形式。如有需要，可将这样的裸DNA构建体结合脂质体递送载体、聚合物递送载体、电穿孔、基因枪等。在一些优选的实施方案中，将该DNA构建体掺入减毒的病毒载体或减毒的细菌性载体中。

在优选的实施方案中，该DNA构建体被掺入减毒的细菌性载体，例如减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，最优选鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的双重减毒的(AroA^-，dam^-)菌株。

任选该DNA组合物也可包含编码免疫效应器蛋白例如细胞因子的DNA构建体。优选的细胞因子包括CCL21、IL-2、和CD40LT。

本发明的DNA组合物可作为靶向肿瘤基质成纤维细胞抗原FAP的疫苗，该肿瘤基质成纤维细胞抗原FAP是作为T细胞介导的癌症免疫疗法的靶标。基质成纤维细胞为在支持肿瘤生长的肿瘤环境中存在的非转化细胞。对于指向对抗被肿瘤细胞单一表达的抗原的疗法，与靶向仅由肿瘤细胞表达的抗原的疗法相比，靶向由基质成纤维细胞表达的FAP的方法具有几个优点。首先，基质成纤维细胞在遗传上比经常突变的异型肿瘤细胞群更加稳定。因此，靶抗原的表达保持更加稳定，充当用于免疫疗法的更可靠的靶标。第二，从基质成纤维细胞到T细胞受体复合物的抗原呈递不会如在肿瘤细胞中经常发生的被减量调节的MHC-抗原表达削弱。第三，由于在凋亡信号途径中的缺陷、抗凋亡蛋白的增量调节、或对CTL的免疫抑制效应，肿瘤细胞往往日渐变得对T细胞介导的杀伤具有抗性。另外，与涉及只被特定肿瘤类型表达的抗原的疗法相反，对在超过90％的结肠癌、乳癌和肺癌的基质区室中特异性过量表达的FAP进行定靶，允许治疗组合物治疗许多不同的恶性肿瘤。

在一个优选的实施方案中，通过将作为口服DNA组合物的FAP自身抗原cDNA与减毒的细菌性递送载体(例如减毒的鼠伤寒沙门氏菌菌株)递送到周围淋巴器官即小肠的淋巴集结中的抗原呈递细胞，本发明的DNA组合物打破外周T细胞对FAP自身抗原的耐受。在预防性方法中，通过用本发明的DNA组合物接种疫苗诱导的T细胞介导的抗肿瘤免疫应答在两个不同的鼠类肿瘤模型(即多重耐药的CT26结肠癌和多重耐药的D2F2乳癌)中抑制肿瘤生长。本DNA组合物还显著地抑制CT26结肠癌治疗模型中已确立的肺转移的扩散。

优选的DNA组合物包含减毒的沙门氏菌(Salmonella)性载体，该载体为名为RE88的鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)双重减毒菌株，包括dam^-和AroA^-突变，得自Remedyne Corporation(Santa Barbara，CA)。减毒的沙门氏菌(Salmonella)性载体包括编码可在免疫细胞中表达的FAP的至少一个表位的DNA。细菌本身不表达FAP，而是递送FAP DNA至免疫细胞(例如巨噬细胞和树突细胞)，免疫细胞随后表达FAP。这样的组合物可延长抗肿瘤效果达10个月，也实现鼠类模型中的T细胞、NK细胞和DC活化标记的显著的增量调节。此外，体内T细胞去除实验表明仅牵涉到CD8+T细胞而不牵涉到CD4⁺T细胞。由CD8⁺T细胞介导的体外细胞毒性效应特异性地靶向过量表达FAP抗原的靶细胞。例如，在概念证实实验中，来自用本发明组合物接种的小鼠的CD8⁺T细胞诱导体外细胞毒素溶解经工程改造以过量表达FAP的肿瘤细胞，这表明对FAP的特异性免疫应答。令人意想不到的是，即使还可发现FAP在伤口愈合期间短暂地过量表达，但是没有观察到由接种本发明的DNA组合物引起的伤口愈合损伤。

本发明的DNA组合物还可掺入编码作为该组合物佐剂的免疫效应分子的DNA构建体。这样的免疫效应分子包括：例如IL-2，T细胞增殖的诱导物；CCL21，化学诱导成熟树突细胞和幼稚T细胞的趋化因子；和CD40LT，已知的树突细胞成熟的诱导物。优选所述编码免疫效应蛋白的核酸被掺入质粒。FAP和免疫效应蛋白DNA构建体可被掺入同一个质粒或两个单独质粒中。诱导对抗肿瘤-基质成纤维细胞的CTL应答可抑制各种肿瘤的生长，对特殊的肿瘤类型为非特异性的。

本发明还提供抑制哺乳动物肿瘤生长或肿瘤转移的方法，该方法包括按足以刺激对抗呈递FAP抗原的肿瘤基质细胞的免疫应答的量，将本发明的DNA组合物给予哺乳动物。

本发明的另一方面为有效的组合治疗方法，该方法包括将化疗药物联合本发明的DNA组合物来给药。在本发明的此方法实施方案中，将各种化疗药物联合本发明的包含编码FAP或其免疫原性部分的DNA构建体的DNA组合物给予病人，所述化疗药物例如有多柔比星、紫杉醇、和/或环磷酰胺，当按最大耐受量(MTD)给药时该化疗药物不引起骨髓抑制。本发明的FAP组合物与上述药物的组合提供附加优点，该优点为I型胶原表达的减量调节，和因此而增加的各种化疗药物和其他化合物的肿瘤内吸收。本发明的DNA组合物引起多种分子的肿瘤细胞吸收增加，所述分子包括但不限于抗肿瘤化疗药物。例如，低分子量染料萤光素(376Da)、高分子量化合物伊文思蓝白蛋白(68,500Da)和抗肿瘤化疗药物5-氟尿嘧啶(5-FU；130Da)，它们全部都在经本发明DNA组合物治疗的小鼠中以相对于用非活性对照组合物治疗的小鼠高很多的水平被肿瘤细胞吸收。本发明的DNA组合物加上抗肿瘤药物多柔比星的组合在50％的接受本组合疗法治疗的小鼠中诱导同位生长的乳腺肿瘤的完全排斥。在单独用DNA组合物或单独用多柔比星治疗的小鼠中没有观察到肿瘤的完全排斥。

优选的方法提供用于增强哺乳动物化疗药物吸收的方法。该方法包括：按足以刺激对抗呈递FAP抗原的哺乳动物细胞的免疫应答的量，将本发明的DNA组合物给予哺乳动物，然后给予该哺乳动物有效量的化疗药物。

另一优选的方法实施方案为在哺乳动物中抑制肿瘤生长或肿瘤转移的方法，该方法包括以下步骤：按足以刺激对抗呈递FAP抗原的哺乳动物细胞的免疫应答的量，将本发明的DNA组合物给予哺乳动物，随后给予该哺乳动物有效抗肿瘤量的抗肿瘤化疗药物。

优选通过本发明方法治疗的哺乳动物为人。

在本发明的方法实施方案中，可以经肠内例如通过口服给药，或经胃肠外例如通过注射或静脉输注，给予所述DNA组合物。优选口服给予该组合物。该组合物可包装在密封容器中，用对临床医生有效地给予该组合物有用的信息贴标签。

本发明的DNA组合物用于治疗和预防许多病症。例如，患有结肠直肠癌、乳腺癌、肺癌等的患者可受益于通过本发明的组合物的免疫。

附图简述

图1为鼠类FAP DNA构建体的表征和化学抗性肿瘤细胞系的表征。分图A阐明编码完整鼠类FAP的质粒cDNA，该质粒cDNA被插入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体(pFAP)的EcoRI位点中。分图B显示在瞬时转染CT26细胞之后通过蛋白印迹法证明的FAP蛋白表达。分图C显示用标明的浓度的各种化疗药物治疗的CT26结肠癌和D2F2乳癌细胞。在孵育48小时之后，用Hoechst-33342染料着色评定细胞核的凋亡。柱条表明3次试验的平均值加上标准差。

图2a-图2c阐明基于FAP的DNA组合物对肿瘤生长的作用。预防设置(setting)：在按照材料和方法中描述进行间隔1周的3次接种疫苗中的最后一次之后10天，用致死量的3×10⁴CT26细胞皮下注射(图2a)或用致死量的3×10⁵D2F2细胞原位(图2b)攻击BALB/c小鼠(n＝8)。描述8只小鼠的平均肿瘤生长，平均值±SE，P＜0.01。治疗设置：首先对BALB/c小鼠(n＝8)静脉注射10⁵CT26细胞，然后在3天和10天之后一旦确定肺转移就马上进行治疗。在18天之后，将肺切除并称重(正常的肺重量为约0.2g)，检查转移情况，通过目测评价打分，如下评定被融合转移灶覆盖的肺表面百分比：0＝0％，1≤20％，2＝20-50％，3≥50％，P＜0.01(图2c)。。

图3阐述由CD8⁺T细胞诱导的细胞毒性。(A)描述的是在经治疗小鼠的效应期期间抗体介导的排除对寿命的影响(^*表示与对照组相比的统计显著性，p＜0.01)。(B)将CD8+T细胞从经治疗小鼠的脾中纯化，用经γ辐射的肿瘤靶细胞进行刺激，然后与经pGFP或pGFP/pFap转染的CT26细胞孵育48h。如下通过用Hoechst-33342染料着色评定细胞核的凋亡：细胞核的凋亡阶段0：不凋亡；阶段1：大规模染色质凝聚；阶段2a：染色质断裂；阶段2b：凋亡小体。(C，D)用经pFap转染的A31成纤维细胞对得自经pFap和空载体免疫的小鼠(n＝3)脾细胞刺激5d，然后对其进行⁵¹Cr-释放试验。(D)使效应细胞和靶细胞与抗MHC I类抗体共孵育(平均值+SD，^*表示与空载体相比的统计显著性，p＜0.05)。(E)经治疗小鼠(n＝2)的CT26肿瘤的单细胞悬液FACS分析，用抗CD3⁺PerCP-Cy5.5抗体和抗CD8⁺FITC抗体着色。描述了两个实验中的一个。(F)用抗CD8 FITC抗体和DAPI核染剂着色的、经pFap和空载体治疗的小鼠的CT26肿瘤的代表性部分。

图4显示FAP/I型胶原的表达和萤光素/白蛋白/5-FU的瘤内吸收。(A)在经治疗小鼠的皮下(s.c.)CT26肿瘤中FAP(上面的分图)和I型胶原(下面的分图)表达的免疫组织化学分析。(B)在经治疗小鼠的皮下CT26肿瘤中FAP和I型胶原的免疫印迹。(C，D，E)条形图表明在萤光素的腹膜内(i.p.)注射、伊文思蓝白蛋白的静脉内(i.v.)注射或14C-5-氟尿嘧啶的静脉内注射之后，来自经治疗的BALB/c小鼠(n＝4)的皮下CT26肿瘤匀浆的光密度或闪烁测量结果的平均值+SE。分别为P＜0.05、P＜0.01和P＜0.05。

图5阐述生物和化学联合疗法的抗转移效果和副作用。(A)预防设置：在以1周为间隔用对照疫苗、PBS或本发明的疫苗的3次接种疫苗中的最后一次之后10天，用3×10⁵D2F2细胞原位(o.t.)攻击BALB/c小鼠(n＝8；平均值±SE)。在5、10和15天之后，用多柔比星治疗上述小鼠。(B)治疗设置：在用10⁵个D2F2肿瘤细胞静脉内注射之后5天，用pFap疫苗或对照疫苗每周治疗BALB/c小鼠(n＝8)。在每次接种后的1天，用多柔比星静脉内治疗上述小鼠(^*描述与对照组相比的统计显著性，p＜0.0001，^**描述与对照组、对照/多柔比星组、pFap组和pFap/多柔比星组相比的显著性，p＜0.0001)。

图6(A)瘤内的多柔比星浓度：用5×10⁵D2F2细胞皮下攻击经治疗的BALB/c小鼠(n＝4)，在16天之后用LC-MS测定混合的肿瘤溶胞产物中的多柔比星浓度(代表两个实验，平均值+SD，P＜0.001)。(B)在经治疗小鼠(n＝4)的上背部造成3mm直径的圆形伤口，测量直至伤口完全闭合的平均时间(平均值+SD)。

图7显示编码人FAP的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。

图8阐述人FAP的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：2)。

图9显示编码鼠类FAP的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。

图10显示鼠类FAP的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：4)。

图11显示编码人IL-2的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：5)。

图12显示人IL-2的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：6)。

图13显示编码鼠类IL-2的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：7)。

图14显示鼠类IL-2的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：8)。

图15显示编码人CCL21的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)。

图16显示人CCL21的氨基酸残基序列(SEQ ID N O：10)。

图17显示编码鼠类CCL21b的核酸的核苷酸序列(SEQ IDNO：11)。

图18显示鼠类CCL21b的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：12)。

图19阐述人CCL21和鼠类CCL21b之间的氨基酸序列相似性。

图20显示编码鼠类CCL21a的核酸的核苷酸序列(SEQ IDNO：13)。

图21显示鼠类CCL21a的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：14)。

图22显示编码人CD40L的核酸的核苷酸序列(SEQ ID NO：15)。

图23显示人CD40L的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：16)。

优选的实施方案的详述

本发明提供有效抑制肿瘤生长或肿瘤转移的DNA组合物，该DNA组合物靶向被称为成纤维细胞激活蛋白(FAP)的肿瘤基质抗原。该DNA组合物包含编码可在免疫细胞中表达的FAP的至少一个表位的DNA构建体，该构建体被掺入药学上可接受的载体中。该DNA构建体可编码FAP的单个表位、包含FAP的两个或多个表位的多肽、整个FAP蛋白质、或其将刺激所需对抗肿瘤和肿瘤转移的免疫应答的任何部分。

当用于本文和所附权利要求时，术语″DNA构建体″是指编码目标蛋白质或多肽例如FAP表位、FAP蛋白质、IL-2、CCL21等的DNA结构。DNA构建体包括可在靶细胞中转录的任何DNA，包括线性DNA和质粒DNA，以及已掺入细胞或病毒的遗传物质中的DNA。优选该DNA构建体为已掺入病毒递送载体或细菌性递送载体(例如不致病的减毒的病毒载体或细菌性载体)中的DNA。当用本发明的组合物治疗受试者时，编码FAP的DNA被递送至免疫细胞(例如，巨噬细胞和树突细胞)，然后表达FAP蛋白质。FAP DNA的病毒载体和细菌性载体本身不表达FAP。

本发明的DNA组合物刺激CTL的形成，CTL有效对抗呈递FAP抗原的细胞例如肿瘤基质细胞(如基质成纤维细胞)。。这样的肿瘤基质细胞选择性地被CTL靶定，后者随接种本发明的DNA组合物而产生。本发明的组合物可减少I型胶原的肿瘤基质表达，随后增强化疗药物的吸收。

本文所用术语″免疫″是指对抗表达抗原细胞的的长期免疫保护。术语″接种″是指暴露于抗原，这致使在经治疗的受试者中产生对表达该抗原的细胞的免疫。

术语″FAP蛋白″是指人FAP、或者与人FAP具有至少80％序列相似性且包括至少一个的人FAP表位的多肽。术语″FAP DNA″是指编码人FAP的DNA、或编码与人FAP具有至少80％序列相似性且包括至少一个的人FAP表位的多肽的DNA。

用于本发明的DNA组合物的DNA构建体优选包含编码包含FAP的一个或多个表位的多肽的核酸，该DNA构建体可操作地连接至在免疫细胞中基因表达所需的调控元件。优选该DNA构建体编码全长FAP蛋白质，或编码与FAP具有至少80％的高度相似性且包括至少一个FAP表位的多肽。有用的DNA构建体优选包括在免疫细胞内核苷酸表达所需的调控元件。这样的元件包括例如启动子、起始密码子、终止密码子、和多聚腺苷酸化信号。另外，编码免疫原性靶标蛋白质的序列的表达经常需要增强因子。如本领域已知，这些元件优选可操作地连接至编码期望蛋白质的序列。优选这些调控元件经过选择，在其将被给予的物种中可操作。优选该DNA构建体为质粒形式，并被掺入病毒载体或细菌性载体中。最初，编码FAP蛋白的DNA构建体可通过转染，使用本领域熟知的方法掺入细菌性载体。随后，可以培养经转化的细菌以提供细菌的备用菌种，该菌种包括在细菌的遗传物质内的FAP DNA。所述经转化的细菌的培养提供用于本发明的DNA组合物的备用源。

优选起始密码子和终止密码子作为编码FAP的核苷酸序列的一部分包括在本发明的DNA组合物之中。起始密码子和终止密码子必须与编码序列在同一个框内。

优选本发明的组合物中所包括的启动子和多聚腺苷酸化信号经过选择，而在待免疫的受试者的细胞内具有功能性。

用于本发明组合物的、特别是产生用于人的基因疫苗DNA组合物的启动子的实例，包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复(LTR)启动子、莫洛尼病毒、巨细胞病毒(CMV)如CMV直接早期启动子，埃巴病毒(EBV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)以及来自人基因的启动子，例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸、和人金属硫蛋白的基因的启动子。

用于本发明的DNA组合物的、特别是产生用于人的DNA组合物的多聚腺苷酸化信号的实例包括但不限于SV40多聚腺苷酸化信号和LTR多聚腺苷酸化信号。

除DNA表达所需的调控元件之外，其它元件也可包括进DNA分子中。这样的附加元件包括增强子。该增强子可为，例如，人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸增强子和病毒增强子例如来自CMV、RSV和EBV的那些增强子。

调控序列和密码子一般依赖于物种，因此为了最大化蛋白质产生，优选调控序列和密码子经过选择，以在待免疫的物种中有效的。本领域技术人员可制备在给定受试物种中具有功能性的DNA构建体。

用于本组合物的DNA构建体可为″裸″DNA，如在Restifo等GeneTherapy 2000；7：89-92中定义，其相关公开通过引用结合到本文中。优选该DNA构建体为质粒形式或为被掺入减毒病毒或减毒细菌的遗传物质中的DNA。有用的递送载体(viehicle或carrier)包括可生物降解的微胶囊、免疫激活复合物(ISCOM)、用于裸DNA构建体的脂质体、和用于经遗传工程改造的减毒活病毒或减毒活细菌的各种生理学可接受的缓冲剂。

可被转化以掺入FAP DNA构建体的合适减毒活细菌性载体的实例包括：鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、志贺氏菌属(Shigella)细菌、芽孢杆菌属(Bacillus)细菌、乳酸杆菌(Lactobacillus)、卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)(BCG)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌(Campylobacter)、李斯特菌(Listeria)、或本领域已知的任何其它合适的细菌性载体。优选载体为减毒的活鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)载体，尤其当该组合物被预定为口服时。优选的减毒活鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)包括AroA^-菌株例如SL7207，或双重减毒的AroA^-、dam^-菌株例如RE88。双重减毒的AroA^-、dam^-鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)为特别优选的载体。

本领域充分描述了用外源DNA构建体转化活细菌性载体的方法。参见，例如，Joseph Sambrook和David W.Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)(Sambrook和Russell)。在转化之后，外源遗传物质被掺入细菌的遗传物质中，因此随着细菌繁殖，外源DNA与该生物体的天然DNA一起复制。因此，细菌一旦经转化，生物的正常繁殖过程就提供外源DNA的备用供给。

优选的病毒载体包括噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、辛德比斯病毒、脊髓灰质炎病毒、痘苗病毒、和禽痘病毒。本领域也充分描述了用外源DNA构建体转化病毒载体的方法。参见上述的Sambrook和Russell。

有用的脂质体载体为单层的或多层的囊泡，并具有由亲脂材料形成的膜和内部的水性部分。将水性部分用于本发明以包含待递送至靶细胞的多核苷酸材料。一般优选形成脂质体的材料具有阳离子基团(例如季铵基团)和一个或多个亲脂基团(例如具有约6个-约30个碳原子的饱和或不饱和烷基)。一组合适的材料在欧洲专利公开第0187702号中描述，在Wolff等的美国专利第6,228,844号中进一步论述，其有关公开通过引用结合到本文中。在文献中描述了许多其它合适的形成脂质体的阳离子脂类化合物。参见例如L.Stamatatos等，Biochemistry1988；27：3917-3925；和H.Eibl等，Biophysical Chemistry 1979；10：261-271。或者，可使用微球体如共聚丙交酯-乙交酯(polylactide-coglycolide)可生物降解的微球体。如本领域已知的，将核酸构建体装入胶囊或另外与脂质体或微球体复合，用于将核酸释放至组织。

其它有用的载体包括包含可生物降解聚原酸酯材料的聚合微球体，如Wang等，Nat.Mater.，2004；3(3)：190-6.Epub 2004年2月15日中所描述的，其相关公开通过引用结合到本文中。

优选用于本发明的组合物包含编码人FAP或其功能性同源体的DNA构建体。FAP的功能同源体优选具有与人FAP至少约80％氨基酸残基序列相似性，更优选至少约90％，最优选与人FAP至少约95％相似性。

GenBank是National Institutes of Health(NIH)的基因序列数据库，是所有公开可用的DNA序列的注解集合。GenBank是InternationalNucleotide Sequence Database Collaboration的一部分，是DNADataBank of Japan(DDBJ)、European Molecular BiologyLaboratory(EMBL)、和National Center for Biotechnology Information的GenBank的联合成果。

编码人FAP的cDNA的核酸序列，SEQ ID NO：1(图7)已经发表在GenBank中，登记号为BC026250，其公开内容通过引用结合到本文中。人FAP的相应的氨基酸残基序列为SEQ ID NO：2(图8)。

编码鼠类FAP的DNA的核酸序列，SEQ ID NO：3(图9)已经发表在GenBank中，登记号为BC019190，其公开内容通过引用结合到本文中。鼠类FAP的相应的氨基酸残基序列为SEQ ID NO：4(图10)。

由于遗传密码的固有简并性，编码人FAP的氨基酸序列的其它DNA序列可用于本发明的实践。这样的DNA序列还包括能够与人FAP杂交的那些DNA序列。

可依照本发明使用的编码人FAP的DNA序列包括以下核酸：该核酸具有对于SEQ ID NO：1的那些核苷酸残基而言不同的核苷酸残基的删除、添加或取代，所述删除、添加或取代产生编码相同FAP基因产物的序列。编码人FAP的功能等效同源体的DNA分子也可用于本发明的DNA组合物。

由核酸编码的基因产物也可包含在FAP氨基酸残基序列之内的氨基酸残基的删除、添加或取代，该删除、添加或取代致使沉默的变化(silent change)，因此产生功能等效的FAP。可根据相关残基在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性质上的相似性进行这样的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的含不带电的极性头基团的氨基酸包括以下：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。本文所用功能等效FAP是指包括一个或多个表位的蛋白质，当被T细胞识别时其允许这些相同的T细胞识别展示在表达FAP的细胞上的FAP表位。在优选的实施方案中，功能等效FAP具有对于人FAP的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：2)而言具有至少约80％相似性、例如至少约90％相似性或至少约95％相似性的氨基酸残基序列。

可工程改造编码FAP的DNA构建体，以为了各种目的而改变FAP编码序列(相对于天然FAP cDNA，SEQ ID NO：1而言)，这些目的包括但不限于修饰FAP基因产物的加工和表达的改变。例如，可使用本领域熟知的技术如定点诱变在DNA中引入突变，以插入新的限制酶切位点，改变糖基化模式、磷酸化作用等。

在一个优选的实施方案中，本发明的DNA组合物包含编码FAP的DNA构建体和可操作地编码至少一种免疫效应蛋白的DNA构建体，两者都可在免疫细胞中表达。当用于本文和所附权利要求时，词组″免疫效应蛋白″意指参与免疫系统途径的调控的蛋白质。优选所述免疫效应蛋白为细胞因子。

细胞因子为由细胞产生的蛋白质和多肽，可影响其它细胞的行为，例如细胞增殖、细胞分化、免疫应答的调控、造血作用、和炎症反应。细胞因子已经被划分成许多家族，包括趋化因子、血细胞生成素、免疫球蛋白、肿瘤坏死因子、和多种未确定的分子。一般见OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，修订版，OxfordUniversity Press，2000；和C.A.Janeway，P.Travers，M.Walport和M.Schlomchik，Immunobiology，第五版，Garland Publishing，2001(下文称″Janeway and Travers″)。在Janeway and Travers，附录III，第677-679页介绍细胞因子的简明分类，其相关公开内容通过引用结合到本文中。

血细胞生成素包括，例如促红细胞生成素、白介素-2(IL-2，由T细胞产生的133个氨基酸蛋白质，与T细胞增殖有关)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-15(114个氨基酸的IL-2样蛋白质，刺激肠上皮细胞、T细胞和NK细胞的生长)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF)、制瘤素M(OSM)、和白血病抑制因子(LIF)。

干扰素包括例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ(由T细胞和NK细胞产生的143个氨基酸的同源二聚体蛋白，参与巨噬细胞激活、MHC分子表达增加和抗原处理成分增加、IG类型转换、和T_H2的抑制)。

免疫球蛋白包括，例如，B7.1(CD80)、和B7.2(CD86)，两者共同刺激T细胞应答。

肿瘤坏死因子(TNF)家族包括，例如，TNF-α、TNF-β(淋巴毒素)、淋巴毒素-β(LT-β)、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BB配体、肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体(Trail)和OPG配体。

本领域熟知CD40配体(CD40L)的生物学作用，尤其是在T细胞活化的共同刺激期间其与在抗原呈递细胞上表达的CD40的相互作用。CD40为在所有成熟B细胞、大多数成熟B细胞恶性肿瘤、和一些早期B细胞急性淋巴细胞性白血病的表面上表达的48kDa糖蛋白，但它不在浆细胞上表达，Clark，Tissue Antiens 1990，35：33-36。CD40L：约35kDa的II型膜蛋白在抗原识别时在T细胞表面上表达。当作为同源三聚体表达时，TNF家族的成员为生物学最有活性的。在这方面CD40L也不例外，其可通过融合到该配体整个胞外结构域N-末端的33个氨基酸的亮氨酸拉链模体的修饰，作为同源三聚体(CD40LT)表达。Gurunathan等，J.Immunol 1998，161：4563已报导，CD40LT DNA增强细胞免疫应答，例如当用编码高免疫原性模型抗原β-半乳糖苷酶治疗小鼠时，诱导IFN-γ和细胞溶解性T细胞活性。

CD40LT为在诱导对抗肿瘤自身抗原的有效保护性免疫所需要的T细胞活化中的重要因子。一旦负载抗原的MHC I类复合体被树突细胞(DC)吸收并呈递给幼稚T细胞，第一抗原信号马上通过T细胞受体(TCR)释放，增量调节CD40LT。然后CD40LT通过CD40与CD40LT的相互作用在T细胞表面上诱导DC上的协同刺激活性。因此已接触过抗原的这些APC可表达共同刺激性分子B7.1(CD80)和B7.2(CD86)，后两者通过与CD28相互作用传送第二共同刺激信号至T细胞：导致T细胞完全活化的事件，以同时产生促炎细胞因子INF-γ和IL12，执行效应物功能。

没有分配到特定家族的许多细胞因子包括，例如，肿瘤生长因子-β(TGF-β)、IL-1α、IL-1β、IL-1RA、IL-10、IL-12(自然杀伤细胞刺激因子；具有197个氨基酸的链和306个氨基酸的链的异二聚体，与活化NK细胞和诱导T细胞分化成T_H1-样细胞有关)，巨噬细胞抑制因子(MIF)、IL-16、IL-17(细胞因子产生诱导因子，在上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞中诱导细胞因子产生)，和IL-18。

趋化因子为细胞因子的家族，所述细胞因子为相对小的化学引诱物蛋白质和多肽，该家族刺激各种细胞(如吞噬细胞和淋巴细胞)的迁移和活化，例如白细胞迁移。趋化因子在炎症和其它免疫应答中起作用。趋化因子已经被划分成许多家族，包括C趋化因子、CC趋化因子、CXC趋化因子、和CX₃C趋化因子。这些名称是指分子中的半胱氨酸(C)残基的数目和间隔；C趋化因子具有一个半胱氨酸，CC趋化因子具有两个相邻的半胱氨酸，CXC具有被单个氨基酸残基分隔的两个半胱氨酸，CX₃C趋化因子具有被三个氨基酸残基分隔的两个半胱氨酸。趋化因子与存在于细胞表面的许多趋化因子受体相互作用。见Janeway和Travers，附录IV，第680页，通过引用结合到本文中。

另外，趋化因子可具有免疫调节活性，并参与对癌症的免疫应答。例如，鼠类6Ckine/SLC，小鼠的人次级淋巴组织趋化因子(SLC)(现在通常称为CCL21)类似物已被报导在C26结肠癌肿瘤细胞系中引出抗肿瘤应答。见Vicari等，J.Immunol.2000；165(4)：1992-2000。人CCL21及其鼠类相应物6Ckine/SLC被归类为CC趋化因子，与CCR7趋化因子受体相互作用。Vicari等报导鼠类6Ckine/SLC(muCCL21)也是CXCR3趋化因子受体的配体。人CCL21、鼠类muCCL21和多种其它趋化因子参与到各种免疫系统细胞如树突细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞的调节。

Mig和IP-10为与和激活的T细胞有关的CXCR3受体相互作用的CXC趋化因子。淋巴细胞趋化蛋白为与和T细胞以及NK细胞有关的XCR1受体相互作用的C趋化因子。Fractalkine为与和T细胞、单核细胞以及嗜中性白细胞有关的CX₃CR1受体相互作用的CX₃C趋化因子。

由本发明的DNA组合物编码的特别优选的免疫效应蛋白包括细胞因子IL-2(血细胞生成素)、CCL21(趋化因子)、以及CD40配体如CD40配体三聚体(CD40LT)、TNF家族细胞因子。

人IL-2的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为BC070338，其公开通过引用结合到本文中。鼠类IL-2的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为NM 008366，其公开内容通过引用结合到本文中。

编码人IL-2的核酸序列呈现于图11中(SEQ ID NO：5)，其相应的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：6)在图12中提供。编码鼠类IL-2的核酸序列呈现于图13中(SEQ ID NO：7)，其相应的氨基序列(SEQ ID NO：8)在图14中提供。

人CCL21的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为AB002409，其公开内容通过引用结合到本文中。鼠类CCL21a变体的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为NM011335，其公开内容通过引用结合到本文中。鼠类CCL21b变体的DNA和蛋白质序列已经发表于GenBank中，登记号为NM011124，其公开内容通过引用结合刊登于本文中。

编码人CCL21的核酸序列呈现于图15中(SEQ ID NO：9)，其相应的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：10)在图16中提供。编码鼠类CCL21(CCL21b变体)的核酸序列呈现于图17中(SEQ ID NO：11)，其相应的氨基序列(SEQ ID NO：12)在图18中提供。

在图19中展示人CCL21与其鼠类相应物(鼠类CCL21b)之间的蛋白质序列相似性。在人CCL21(SEQ ID NO：10)与鼠类CCL21b(SEQ IDNO：12)之间具有约73％的氨基酸残基序列同一性。

编码鼠类CCL21的CCL21a变体的核酸序列呈现于图20中(SEQID NO：13)，其相应的氨基酸序列(SEQ ID NO：14)在图21中提供。

人CD40配体(CD40L)为261个氨基酸的蛋白质，其以最有活性的形式作为三聚体(CD40LT)存在。编码人CD40L(也称为CD154)的DNA序列已经发表于GenBank中，登记号为NM 000074，其公开内容通过引用结合到本文中(图22，SEQ ID NO：15)。CD40L的相应蛋白质序列在图23中显示(SEQ ID NO：16)。

本发明的方法方面包括：给予哺乳动物包含DNA构建体的DNA组合物，该DNA构建体编码可在哺乳动物的免疫细胞中表达的FAP。优选所述哺乳动物为人。该组合物可经口、肌内、鼻内、腹膜内、皮下、皮内、或局部地进行给药，视该组合物被制备的特定剂型而定。优选以口服给药剂型制备该组合物，例如溶液、混悬液、乳剂、胶囊、片剂等。

可使用本发明的DNA组合物以在接受该组合物治疗的患者中提供肿瘤生长和/或肿瘤转移的长期抑制。在一个优选的实施方案中，所述DNA组合物与抗肿瘤化疗药物联合给予。该DNA组合物可与化疗药物一起以组合剂型给药，或者该组合物和化疗药物可以以单独剂型并以适合待给予化疗药物药理学的单独剂量间隔进行给药。

与本发明的DNA组合物联用的化疗药物包括：抗肿瘤剂例如多柔比星、紫杉醇、环磷酰胺、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氨甲蝶呤等。

本发明的DNA组合物优选用药学上可接受的载体或赋形剂例如水、盐水、葡萄糖、甘油等及其组合配制，以辅助组合物的配制成制剂和给予。该组合物也可包含辅助物质例如润湿剂、乳化剂、缓冲剂、和制药领域熟知的其它辅助物质。

优选将本发明组合物作为药学上可接受的载体中的溶液或混悬液，以基于FAP编码DNA的重量计算约1-约10微克/毫升的DNA浓度，经口给予哺乳动物例如人。用于本发明的DNA组合物的特别优选的剂型为在合适的缓冲溶液中的经FAP转染的减毒细菌的混悬液，该剂型可配制用于口服给药。该组合物的合适的剂量取决于欲治疗的受试者，取决于组合物的活性，部分地取决于医师对给药或给予该组合物的要求的判断。

如果将使用多于一次的给药，那么给予哺乳动物的剂量和给药方案将根据不同的哺乳动物和剂型而改变。有效剂量和给药方案可通过临床剂量-反应研究凭经验确定，如本领域所熟知。选择剂量和给药方案以提供免疫细胞中的足量的FAP表达，以刺激哺乳动物的免疫应答对抗存在FAP抗原的细胞。优选给予受试哺乳动物的组合物的剂量在哺乳动物的免疫细胞中刺激足量的FAP抗原表达，以维持对抗存在FAP的细胞的免疫应答，所述免疫应答将持续至少1个月，例如至少6个月或至少约1年的时期。

本发明的组合物可以多剂量或单位剂量的形式包装在适当灭菌的容器例如安瓿、瓶、或小瓶中。优选在装入本发明的DNA组合物之后密封容器。优选该组合物被包装在具有附贴标签的容器中，该标签标识该组合物，并以政府机构例如United States Food and DrugAdministration规定的形式的反映合适的法律下该组合物的批准、剂量信息等的告示。该标签优选包含对保健专业人员将所述组合物给予患者有用的、关于组合物的信息。该包装还优选包含关于组合物的给药、用法说明、适应症和任何必要的警告的印刷信息材料。

提供以下实施例以进一步阐述本发明的特征和实施方案，这些实施例并不旨在限制。

材料、方法和实施例.

动物、细菌菌种、和细胞系。雌性BALB/c小鼠，6-8周龄，得自Scripps Research Institute(TSRI)Rodent Breeding Facility。所有的动物实验均依照关于Care and Use of Laboratory Animals的NationalInstitutes of Health Guide执行，并经TSRI Animal Care Committee批准。双重减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株RE88(AroA^-dam^-)由Remedyne Corporation(Santa Barbara，California)提供。鼠类D2F2乳腺癌细胞得自Dr.Wei-Zen Wei，Karmanos Cancer Center，Detroit，MI，而CT26结肠癌细胞得自ATCC(Manassas，Virginia)，然后将这些细胞培养几个月，以获得化学抗性的亚克隆。

在1％DMSO、所述浓度的依托泊苷、5-氟尿嘧啶、多柔比星、长春碱或紫杉醇(Sigma，St.Louis，Missouri)的存在下，培养鼠类CT26和D2F2癌细胞。在48小时之后，在与DNA特异性Hoechst 33342染料(2μM；Molecular Probes，Eugene，Oregon)温育之后，计数凋亡的细胞核。

CT26结肠癌细胞和D2F2乳腺癌细胞的两个克隆分别具有获得性化学抗性(见图1，分图C)。在将五种不同的诱导凋亡的化疗药物添加至CT26结肠癌克隆(图1，分图C)时，唯独长春碱能够诱导轻度的细胞凋亡效应，然而仅在5μM的非常高的浓度下。对于5-氟尿嘧啶(5-FU)而言，原始的母CT26细胞系(ATCC#CLR-2326)的IC₅₀为约1.85μM，然而5-FU甚至在高达100μM的浓度时仍不能在抗性CT26克隆中诱导细胞核的凋亡。在抗性D2F2乳腺癌细胞中，根据Hoechst-33342染料染色所确定，唯独多柔比星在1μM的最高浓度时能够诱导细胞核的凋亡。这些结果证明：这两种肿瘤细胞系均为多重耐药的。

统计分析。通过学生t检验确定实验组和对照之间差异数据的统计学显著性。通过曼-惠特尼检验确定转移评分的显著性。通过log-rank检验确定存活数据的显著性。假如P值＜0.05，那么数据被视为具有显著性。

实施例1.编码鼠类FAP的DNA组合物1的制备.

将编码鼠类FAP(SEQ ID NO：4，图10)的cDNA(SEQ ID NO：3，图9；由Dr.J.D.Cheng提供)亚克隆入pcDNA3.1/V5-His-TOPO载体(Invitrogen，San Diego，California)的EcoRI限制性酶切位点，以得到真核生物表达载体pcDNA3.1-FAP(pFAP)(见图1，分图A)。通过对来自经瞬时转染的CT26结肠癌细胞的溶胞产物进行蛋白质印迹，来证明来自上述载体的95kDa FAP蛋白的正确表达，该结肠癌细胞本身不表达FAP(图1，分图B)。对经瞬时转染的D2F2乳腺癌细胞也进行同样处理。对于瞬时转染而言，对CT26和D2F2细胞如先前所述进行电穿孔(见Loeffer等，FASEB，J.2001，15：758-767，通过引用结合到本文中)。通过蛋白质印迹法用多克隆兔抗鼠类FAP抗体(由Dr.J.D.Cheng提供)，来证明FAP蛋白质表达。

如下制备DNA组合物1：按照制造商推荐的方法，利用Bio-Rad脉冲发生器在2kV、960μF、和200Ohm下，将pcDNA3.1-FAP载体(约2μg的pDNA)电穿孔入新制备的双重减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(菌株RE88)。在含氨苄青霉素的平板上选择包含所述载体的减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)。第二天挑取菌落，菌落在添加氨苄青霉素的LB肉汤(10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠；EM Science，Gibbstown，NJ)中培养过夜。分离细菌并在磷酸盐缓冲液(PBS)中洗涤。然后将洗涤的细菌悬浮在PBS介质(medium)中，浓度为约10⁹个重组沙门氏菌(Salmonella)/毫升PBS，以形成含以下DNA构建体的DNA组合物1溶液：该DNA构建体可操作地编码鼠类FAP且掺入减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)(AroA^-dam^-)载体中。将该组合物贮藏在密封的安瓿中直至使用。也依照同样的方法制备由单独用pcDNA3.1载体(不含FAPDNA)转化的沙门氏菌(Salmonella)组成的“对照疫苗”。在对沙门氏菌(Salmonella)进行转化之前，将质粒DNA贮藏在约-80℃下。

在构建如上所述(图1，分图A)的真核生物表达载体pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Fap(pFap)之后，通过对来自经瞬时转染的CT26结肠癌细胞和D2F2乳腺癌细胞的溶胞产物的进行蛋白印迹，来证明88kDa FAP蛋白的正确表达，这些细胞本身不能表达FAP(图1，分图B)。

实施例2.编码鼠类FAP、鼠类IL-2、和鼠类CCL21的DNA组合物2的制备.

通过在实施例1中描述的相同的一般方法，将来自ATCC，登记号39892，Manassas，Virginia的编码鼠类IL-2的cDNA(DNA SEQ IDNO：5)、和来自Invitrogen，San Diego，California的鼠类CCL21a的cDNA(DNA SEQ ID NO：7)亚克隆到实施例1的鼠类pFAP载体中。通过在实施例1中所描述的方法，用所产生的载体(pFAP/IL-2/CCL21)转化RE88鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，以提供包含以下DNA构建体的DNA组合物2溶液：该DNA构建体可操作地编码鼠类FAP、鼠类IL-2、和鼠类CCL21a，且被掺入减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)载体中。

实施例3.本发明的DNA组合物在结肠癌和乳腺癌的鼠类模型中的评估.

口服接种，肿瘤细胞攻击和用多柔比星治疗.对于预防设置(prophylactic setting)中的实验而言，通过用包含约10⁹个鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)(AroA^-dam^-)的约100μl PBS的口服管饲法，按约1周间隔对BALB/c小鼠(n＝8)接种3次，该鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)为：用编码鼠类FAP的载体质粒转化的鼠伤寒沙门氏菌(实施例1的DNA组合物1)、用编码鼠类FAP、IL-2和CCL21的载体质粒转化的鼠伤寒沙门氏菌(实施例2的DNA组合物2)、或实施例1的对照疫苗，上述过程通过使用在Niethammer，等.，Nat.Med.，2002，8：1369-1375中描述的方法来进行。在随后的约10天，通过在左前胁腹皮下(s.c.)注射约3×10⁴CT26结肠癌细胞或通过在左边最下面第二乳腺脂肪垫原位(o.t.)注射约3×10⁵D2F2乳腺癌细胞，来对动物攻击。

通过以2维(即长和宽，以毫米为单位)测量肿瘤并按长度的一半乘以宽度的平方计算体积，来计算出肿瘤体积(以mm³为单位)。在治疗设置中，通过静脉内(i.v.)注射约1×10⁵CT26结肠癌细胞来进行起始的肿瘤细胞接种，在此之后约3天和10天通过用对照疫苗或活性DNA组合物来进行口服接种。在约18天之后，对肺称重(正常肺重为约0.2g)，并通过目测评估被融合的转移灶覆盖的肺表面百分比，来对肺部肿瘤转移情况进行检查和评分，评分方法如下：0％的覆盖度为0分，小于约20％的覆盖度为1分，约20％-50％的覆盖度为2分，大于约50％的肺表面被覆盖为3分。在肿瘤攻击之后的5、10和15天，用静脉内给药的约10mg/kg多柔比星(Sigma)对各组小鼠进行多柔比星治疗。

为了去除CD4⁺和CD8⁺T细胞或NK细胞亚群，从用肿瘤细胞攻击的前1天开始，每隔7天腹膜内(i.p.)注射靶向均来自National CellCulture Center(Minneapolis，Minnesota)的CD4(克隆GK1.5)或CD8(克隆2.43)的抗体(500μg)，或抗脱唾液酸的GM1抗体(Wako BioProducts，Richmont，Virginia)。

CD8⁺T细胞的细胞毒性.在按1周间隔的最后3次治疗之后约10天，收集来自各已治疗组的BALB/c小鼠(n＝4)的脾细胞。使用CD8a微珠(Miltenyi Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)，按照制造商的实验方案纯化CD8⁺细胞。然后使这些细胞与经γ-照射(1000Gy，45分钟)的CT26细胞共培养5天来进行刺激，所述CT26细胞用pcDNA3.1/Zeo(实施例1的空载体)或pcDNA3.1/Zeo-FAP(实施例1的pFAP载体)瞬时转染。此后，使CD8⁺T细胞与CT26癌细胞(E∶T＝100∶1)共培养，后者已用作为对照的绿色荧光蛋白(GFP)、(PEGFP；Clontech，Palo Alto，California)或GFP加上编码鼠类FAP的pFAP质粒瞬时转染。在约48小时之后，如上所述用DNA特异性Hoechst 33342染料(2μM)来评估细胞核的凋亡。

为了进行⁵¹Cr释放试验，按周为间隔对Balb/c小鼠(n＝3)治疗4次。脾细胞在最后一次治疗之后13天收获，并与经γ照射(约1000Gy，45分钟)的用pFap进行逆转录病毒感染的A31成纤维细胞(ATCC，Manassas，Virginia)孵育5天。然后使受激的脾细胞与经标记的A31-pFap孵育约4小时，并计算溶解百分比。还使细胞与浓度为约10μg/ml的抗-MHC I类抗体(BD Biosciences，Rockville，Maryland)共孵育。

免疫组织化学。使冷冻切片(约8μm厚)固定于丙酮中并拉紧。在与初级抗体(多克隆兔抗-鼠类FAP抗体(由Dr.J.D.Cheng提供)或多克隆兔抗-鼠类I型胶原抗体(Chemicon，Temecula，California))温育之后，依照制造商的实验方案(DAKO LSAB+试剂盒，过氧化物酶，DAKO，Carpinteria，California)使切片免疫染色。

为了进行聚焦显微镜检查法，固定的冷冻切片用抗-鼠类CD8抗体、生物素化的抗-鼠Ig次级抗体、经FITC标记的链霉抗生物素蛋白(BD Bioscience，Rockville，Maryland)染色，并用DAPI(Sigma，St.Louis，Missouri)共染。使用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)来获取图像，使用Zeiss Image Examiner软件(Carl Zeiss)处理该图像。为了进行T细胞浸润的FACS分析，用pFap或空载体按每周为间隔治疗Balb/c小鼠(n＝6)3次。在最后一次治疗之后的一周，用约3×10⁵CT26肿瘤细胞皮下(s.c.)攻击动物。在3周后采集肿瘤，并通过在补充有I型胶原酶(125U/ml；GIBCO，Gaithersburg，Maryland)的培养基中孵育切成薄片的肿瘤组织45分钟，来制备单细胞悬浮液。在过滤之后，对两种小鼠的细胞进行混合(pool)，用抗-CD3⁺PerCp-Cy5.5和抗-CD8⁺FITC(BDBiosciences，Rockville，Maryland)染色，并用FACS进行分析。

萤光素、伊文思蓝白蛋白和¹⁴C-5-氟尿嘧啶的瘤内吸收。在用对照疫苗(实施例1)、DNA组合物1(实施例1)或DNA组合物2(实施例2)按1周为间隔治疗3次的最后1次之后，在10天后通过在左前胁腹皮下注射约3×10⁴个CT26细胞来攻击小鼠。在此后约19天，给小鼠腹膜内(i.p.)注射按约12μl/g体重计算的1％萤光素钠(Sigma)，静脉内(i.v.)注射约100μl伊文思蓝白蛋白(Sigma)，或静脉内(i.v.)注射约2.5μCi的¹⁴C-5-氟尿嘧啶(Sigma)。分别在约5分钟、30分钟或1小时之后处死小鼠，以分别在490nm、612nm处、或以γ-计数器测定肿瘤匀浆上清液的吸收或闪烁。

为了测定瘤内的多柔比星吸收，用约5×10⁵D2F2细胞在右胁腹皮下(s.c.)攻击Balb/c小鼠(n＝4)。16天后静脉内(i.v.)多柔比星(10mg/kg)，并在此后45分钟采集肿瘤。使用在1100系列LC-MS上的Eclipse XCB-C8柱(Agilent，Foster City，California)，对照内标柔红霉素来测量样品。

潜在的副作用的评估。为了确定对伤口愈合的任何有害作用，对小鼠施行外科手术制造伤口。在按1周间隔的3次治疗中的最后一次之后约10天，用皮肤打孔器(Miltex Inc.，Bethpage，New York)在BALB/c小鼠(n＝4)的上背部造成约3mm直径的圆形伤口。测量伤口闭合所需的时间。尽管事实上FAP在伤口愈合期间过量表达，但本发明的组合物不干扰伤口愈合过程。在经治疗的BALB/c小鼠(n＝4)的背部施以约3mm直径的圆形伤口之后，观察到经治疗小鼠和未治疗小鼠之间的伤口愈合无显著差异。为了进行组织学分析，在检查之前7、14、21天对经治疗小鼠施加伤口。由小鼠病理学家进行皮肤活组织检查，以及检查26种器官和组织。

用基于FAP的DNA组合物的预防性治疗抑制原发性肿瘤生长。在用对照疫苗(实施例1)、DNA组合物1(实施例1)或DNA组合物2(实施例2)按1周间隔3次治疗中的最后一次之后的10天，如上所述用CT26结肠癌细胞在皮下攻击或用D2F2乳腺癌细胞原位攻击不同组的BALB/c小鼠(n＝8)。本发明的DNA组合物抑制多重耐药性CT26细胞(图2a)、以及耐药性D2F2细胞(图2b)的原发性肿瘤生长。编码FAP、CCL21、和IL-2的组合的DNA组合物2，对抑制原发性肿瘤生长是近似等效的(图2a)。

本发明的DNA组合物减少在治疗设置中已确立的转移的生长。在用约1×10⁵CT26结肠癌细胞初次静脉内接种之后3天和10天，用实施例1的DNA组合物1治疗的BALB/c小鼠与用实施例1的对照疫苗治疗的小鼠相比，前者导致实验性肺转移显著减少。相反，对照组的小鼠显示大范围的转移并在肿瘤细胞接种之后的18天开始死亡(图2c)。相似地，pFAP单独与pCCL21的组合也是近似等效的(图2b)。

CD8⁺T细胞提供有效的抗肿瘤免疫应答。小鼠用DNA组合物1(实施例1)按1周间隔静脉内(i.v.)治疗3次，并用约1×10⁵CT26细胞攻击。然后在效应期用抗CD4⁺或CD8⁺T细胞抗体、以及抗NK细胞的抗体对小鼠进行去除其相应的效应细胞处理(图3，分图A)。CD4⁺细胞和NK细胞的去除不降低pFAP治疗的效果，表明CD8⁺T细胞在免疫应答中起重要作用。

为了评估用本发明的FAP DNA组合物治疗能够打破外周T细胞对FAP自身抗原耐受的程度，纯化来自用pFAP或空载体转染的细菌治疗的动物的CD8+T细胞。这些细胞然后用经γ照射的肿瘤靶细胞刺激，并与用作为对照的GFP或GFP/pFap瞬时转染的肝脏肿瘤靶细胞孵育。如图3，分图B所示，根据通过用Hoechst-33342染料对经pFap转染的靶细胞进行染色的评估，只有从用pFap治疗的小鼠纯化的CD8⁺T细胞能够诱导细胞核的凋亡。

经治疗小鼠的脾细胞也用于常规的⁵¹Cr-释放试验。为了该目的，来自用组合物1和对照疫苗治疗的小鼠的脾细胞与用pFap进行逆转录病毒感染的经γ照射的A31成纤维细胞孵育5天。经刺激的脾细胞然后与标记的A31-pFap细胞孵育4小时，并计算溶解的百分比。在靶细胞对效应细胞的比例为1∶100和1∶25时，来自用组合物1治疗的小鼠的脾细胞能够比空载体对照显著溶解更多的成纤维细胞(图3，分图C)。与抗-MHC I类抗体共孵育消除该效应(图3，分图D)。

在此外的评估中，用组合物1或对照疫苗治疗小鼠3次，然后用约3×10⁴CT26肿瘤细胞攻击，以研究在经pFap治疗的小鼠的肿瘤中的CD8⁺T细胞浸润。在3周之后，采集肿瘤，并对单细胞悬浮液中的CD3⁺和CD8⁺细胞染色，并通过FACS分析。当与空载体对照比较时，用组合物1治疗的小鼠显示肿瘤组织中的CD3⁺、CD8⁺细胞显著增加(图3，分图E)。

也用抗-CD8FITC和DAPI核染剂对肿瘤切片染色。使用共聚焦显微镜，用组合物1治疗的小鼠的肿瘤比用实施例1的对照疫苗接种的小鼠显示更显著的CD8⁺细胞浸润(图3，分图F)。总之，这些发现证明：靶向FAP的本发明的DNA组合物可以克服外周T细胞对FAP自身抗原的耐受。

I型胶原表达的抑制增加瘤内的染料吸收。成纤维细胞是I型胶原的原始来源，已经报道：该分子的表达与不同分子量的化合物的瘤内吸收呈反向相关。为了评价该同样的机制是否能应用至本发明的DNA组合物，经治疗的疫苗的小鼠的肿瘤切片用抗FAP的抗体(图4，分图A，上面的照片)或抗I型胶原的抗体(图4，分图A，下面的照片)染色。用组合物1治疗的小鼠组别与仅用对照疫苗(实施例1)治疗的小鼠组别相比，在前者中检测到FAP以及I型胶原表达的减少。用相同抗体染色的这些肿瘤提取物的相应蛋白印迹显示：FAP表达减少约82.63±2.54％(图4，分图B，上面的照片)而I型胶原表达减少约76.36±2.01％(图4，分图B，下面的照片)。

然后用大小和结构上不同的三种化合物注射小鼠：即如上所述的萤光素(376Da)(图4，分图C)、伊文思蓝白蛋白(68,500Da)(图4，分图D)或化疗药物5-氟尿嘧啶(130Da)(图4，分图E)。用pFap DNA组合物1治疗的小鼠的肿瘤比给予对照疫苗的小鼠的肿瘤显著结合更多(p＜0.05)的这些相应的分子。

DNA组合物和化学疗法的联合导致肿瘤排斥。用本发明的DNA组合物免疫接种与D2F2细胞部分敏感的化学治疗药多柔比星联合，开发了治疗方案(图1，分图C)。用实施例1的对照疫苗、或实施例1的组合物1治疗BALB/c小鼠(n＝8)。然后用D2F2乳腺癌细胞原位攻击经治疗的小鼠。然后在肿瘤攻击之后5、10和15天用多柔比星或作为对照的PBS治疗这两组小鼠。如图5，分图A所示，用免疫疗法(组合物1)或化学疗法单独治疗仅能抑制肿瘤生长、但不能根除。相反，用组合物1和多柔比星联合治疗的小鼠组不仅显示肿瘤生长的显著抑制，而且在8只小鼠中的4只中完全排斥肿瘤(图5，分图A)。

在按治疗设置的另一联合治疗方法中，用D2F2肿瘤细胞静脉内(i.v.)攻击BALB/c小鼠(n＝8)。在5天之后待转移一旦确立，就用组合物1每周1次治疗小鼠。在每次治疗之后一天，用多柔比星静脉内(i.v.)注射小鼠。该联合治疗导致这些小鼠的寿命超过对照小鼠的3倍，所述对照小鼠单独用多柔比星或组合物1治疗，并在35-45天后已经死亡(图5，分图B)。

本发明的FAP DNA组合物增加多柔比星的瘤内吸收。为了测定肿瘤组织中的多柔比星浓度，用组合物1以1周的间隔治疗小鼠(n＝4)3次，7天以后用5×10⁵D2F2肿瘤细胞进行攻击，并在16天以后用多柔比星进行静脉内(i.v.)注射。用液相色谱/质谱法(LC-MS)测定瘤内的药物浓度。与对照相比，用组合物1治疗的小鼠的组织显示肿瘤中多柔比星吸收的显著增加(图6，分图A)。这些结果与在用萤光素、白蛋白和5-氟尿嘧啶治疗的小鼠中观察到的肿瘤的化学渗透一致(图4，分图C-D)。

针对FAP的DNA疫苗不削弱伤口愈合或损伤正常组织。因为在伤口愈合期间FAP会过量表达，所以要研究本发明的DNA组合物对伤口愈合的作用。在经治疗的BALB/c小鼠(n＝4)的背上施以直径约3mm的圆形伤口。令人意想不到的是，观察到经治疗小鼠和未治疗小鼠之间的伤口愈合无显著性差异(图6，分图B)。由小鼠病理学家在不同的时间点之后对这些伤口的组织学鉴定显示在伤口愈合过程中无任何定性的异常情况。为了排除由本发明的DNA组合物诱导的任何自身免疫反应，对以下组织和器官进行广泛组织学鉴定：皮肤、脑、脊髓、肌肉、骨、滑膜、心脏、主动脉、肺动脉、胸腺、脾脏、淋巴结、骨髓、甲状旁腺、肾上腺、肾脏、子宫、阴道、阴蒂腺、舌、肝脏、肺脏、胰脏、胃、小肠和结肠。观察到与对照小鼠相比没有可辨别的差异。

上述实施方案的许多变更和修改可以在不脱离本发明新颖特征的精神和范围下起作用。就本文举例说明的具体实施方案而论，无意或不应该推断任何限制。

序列表

<110>R.A.雷斯菲尔德

M.勒夫勒

J.A.克吕格尔

A.G.尼萨默

<120>针对肿瘤基质抗原FAP的DNA组合物及其使用方法

<130>TSRI 951.1PCT

<140>PCT/US2007/014440

<141>2007-06-21

<150>US 60/815,316

<151>2006-06-21

<160>16

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>2648

<212>DNA

<213>人(homo sapiens)

<400>1

ctgaagacag aattagctaa ctttcaaaaa catctggaaa aatgaagact tgggtaaaaa 60

tcgtatttgg agttgccacc tctgctgtgc ttgccttatt ggtgatgtgc attgtcttac 120

gcccttcaag agttcataac tctgaagaaa atacaatgag agcactcaca ctgaaggata 180

ttttaaatgg aacattttct tataaaacat tttttccaaa ctggatttca ggacaagaat 240

atcttcatca atctgcagat aacaatatag tactttataa tattgaaaca ggacaatcat 300

ataccatttt gagtaataga accatgaaaa gtgtgaatgc ttcaaattac ggcttatcac 360

ctgatcggca atttgtatat ctagaaagtg attattcaaa gctttggaga tactcttaca 420

cagcaacata ttacatctat gaccttagca atggagaatt tgtaagagga aatgagcttc 480

ctcgtccaat tcagtattta tgctggtcgc ctgttgggag taaattagca tatgtctatc 540

aaaacaatat ctatttgaaa caaagaccag gagatccacc ttttcaaata acatttaatg 600

gaagagaaaa taaaatattt aatggaatcc cagactgggt ttatgaagag gaaatgcttg 660

ctacaaaata tgctctctgg tggtctccta atggaaaatt tttggcatat gcggaattta 720

atgatacgga tataccagtt attgcctatt cctattatgg cgatgaacaa tatcctagaa 780

caataaatat tccataccca aaggctggag ctaagaatcc cgttgttcgg atatttatta 840

tcgataccac ttaccctgcg tatgtaggtc cccaggaagt gcctgttcca gcaatgatag 900

cctcaagtga ttattatttc agttggctca cgtgggttac tgatgaacga gtatgtttgc 960

agtggctaaa aagagtccag aatgtttcgg tcctgtctat atgtgacttc agggaagact 1020

ggcagacatg ggattgtcca aagacccagg agcatataga agaaagcaga actggatggg 1080

ctggtggatt ctttgtttca acaccagttt tcagctatga tgccatttcg tactacaaaa 1140

tatttagtga caaggatggc tacaaacata ttcactatat caaagacact gtggaaaatg 1200

ctattcaaat tacaagtggc aagtgggagg ccataaatat attcagagta acacaggatt 1260

cactgtttta ttctagcaat gaatttgaag aataccctgg aagaagaaac atctacagaa 1320

ttagcattgg aagctatcct ccaagcaaga agtgtgttac ttgccatcta aggaaagaaa 1380

ggtgccaata ttacacagca agtttcagcg actacgccaa gtactatgca cttgtctgct 1440

acggcccagg catccccatt tccacccttc atgatggacg cactgatcaa gaaattaaaa 1500

tcctggaaga aaacaaggaa ttggaaaatg ctttgaaaaa tatccagctg cctaaagagg 1560

aaattaagaa acttgaagta gatgaaatta ctttatggta caagatgatt cttcctcctc 1620

aatttgacag atcaaagaag tatcccttgc taattcaagt gtatggtggt ccctgcagtc 1680

agagtgtaag gtctgtattt gctgttaatt ggatatctta tcttgcaagt aaggaaggga 1740

tggtcattgc cttggtggat ggtcgaggaa cagctttcca aggtgacaaa ctcctctatg 1800

cagtgtatcg aaagctgggt gtttatgaag ttgaagacca gattacagct gtcagaaaat 1860

tcatagaaat gggtttcatt gatgaaaaaa gaatagccat atggggctgg tcctatggag 1920

gatacgtttc atcactggcc cttgcatctg gaactggtct tttcaaatgt ggtatagcag 1980

tggctccagt ctccagctgg gaatattacg cgtctgtcta cacagagaga ttcatgggtc 2040

tcccaacaaa ggatgataat cttgagcact ataagaattc aactgtgatg gcaagagcag 2100

aatatttcag aaatgtagac tatcttctca tccacggaac agcagatgat aatgtgcact 2160

ttcaaaactc agcacagatt gctaaagctc tggttaatgc acaagtggat ttccaggcaa 2220

tgtggtactc tgaccagaac cacggcttat ccggcctgtc cacgaaccac ttatacaccc 2280

acatgaccca cttcctaaag cagtgtttct ctttgtcaga ctaaaaacga tgcagatgca 2340

agcctgtatc agaatctgaa aaccttatat aaacccctca gacagtttgc ttattttatt 2400

ttttatgttg taaaatgcta gtataaacaa acaaattaat gttgttctaa aggctgttaa 2460

aaaaaagatg aggactcaga agttcaagct aaatattgtt tacattttct ggtactctgt 2520

gaaagaagag aaaagggagt catgcatttt gctttggaca cagtgtttta tcacctgttc 2580

atttgaagaa aaataataaa gtcagaagtt caagtgcgaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640

aaaaaaaa 2648

<210>2

<211>760

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>2

Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His

20 25 30

Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly

50 55 60

Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys

85 90 95

Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val

100 105 110

Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala

115 120 125

Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn

130 135 140

Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro

165 170 175

Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile

180 185 190

Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr

195 200 205

Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala

210 215 220

Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

245 250 255

Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro

260 265 270

Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser

275 280 285

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val

290 295 300

Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile

305 310 315 320

Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln

325 330 335

Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val

340 345 350

Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

355 360 365

Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val

370 375 380

Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile

385 390 395 400

Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu

405 410 415

Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr

420 425 430

Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys

435 440 445

Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu

450 455 460

Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg

465 470 475 480

Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

485 490 495

Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu

500 505 510

Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe

515 520 525

Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro

530 535 540

Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr

545 550 555 560

Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly

565 570 575

Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu

580 585 590

Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile

595 600 605

Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser

610 615 620

Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu

625 630 635 640

Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr

645 650 655

Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

660 665 670

Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

675 680 685

Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn

690 695 700

Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala

705 710 715 720

Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu

725 730 735

Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu

740 745 750

Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

755 760

<210>3

<211>2615

<212>DNA

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>3

ccacgcgtcc gcacagatgc ggtgacccac gctgtgcagt gagaatcagc taacttgcaa 60

aaacatctgg aaaaatgaag acatggctga aaactgtctt tggagttacc accctggctg 120

cgcttgcttt agtggtgata tgcattgtct tacgtccctc aagagtttac aaacctgaag 180

gaaacacaaa gagagctctt accttgaagg atattttaaa tggaacattc tcatataaaa 240

catattttcc caactggatt tcagaacaag aatatcttca tcaatctgag gatgataaca 300

tagtatttta taatattgaa acaagagaat catatatcat tttgagtaat agcaccatga 360

aaagtgtgaa tgctacagat tatggtttgt cacctgatcg gcaatttgtg tatctagaaa 420

gtgattattc aaagctctgg cgatattcat acacagcgac atactacatc tacgaccttc 480

agaatgggga atttgtaaga ggatacgagc tccctcgtcc aattcagtat ctatgctggt 540

cgcctgttgg gagtaaatta gcatatgtat atcaaaacaa tatttatttg aaacaaagac 600

caggagatcc accttttcaa ataacttata ctggaagaga aaatagaata tttaatggaa 660

taccagactg ggtttatgaa gaggaaatgc ttgccacaaa atatgctctt tggtggtctc 720

cagatggaaa atttttggca tatgtagaat ttaatgattc agatatacca attattgcct 780

attcttatta tggtgatgga cagtatccta gaactataaa tattccatat ccaaaggctg 840

gggctaagaa tccggttgtt cgtgttttta ttgttgacac cacctaccct caccacgtgg 900

gcccaatgga agtgccagtt ccagaaatga tagcctcaag tgactattat ttcagctggc 960

tcacatgggt gtccagtgaa cgagtatgct tgcagtggct aaaaagagtg cagaatgtct 1020

cagtcctgtc tatatgtgat ttcagggaag actggcatgc atgggaatgt ccaaagaacc 1080

aggagcatgt agaagaaagc agaacaggat gggctggtgg attctttgtt tcgacaccag 1140

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atattcacta catcaaagac actgtggaaa atgctattca aattacaagt ggcaagtggg 1260

aggccatata tatattccgc gtaacacagg attcactgtt ttattctagc aatgaatttg 1320

aaggttaccc tggaagaaga aacatctaca gaattagcat tggaaactct cctccgagca 1380

agaagtgtgt tacttgccat ctaaggaaag aaaggtgcca atattacaca gcaagtttca 1440

gctacaaagc caagtactat gcactcgtct gctatggccc tggcctcccc atttccaccc 1500

tccatgatgg ccgcacagac caagaaatac aagtattaga agaaaacaaa gaactggaaa 1560

attctctgag aaatatccag ctgcctaaag tggagattaa gaagctcaaa gacgggggac 1620

tgactttctg gtacaagatg attctgcctc ctcagtttga cagatcaaag aagtaccctt 1680

tgctaattca agtgtatggt ggtccttgta gccagagtgt taagtctgtg tttgctgtta 1740

attggataac ttatctcgca agtaaggagg ggatagtcat tgccctggta gatggtcggg 1800

gcactgcttt ccaaggtgac aaattcctgc atgccgtgta tcgaaaactg ggtgtatatg 1860

aagttgagga ccagctcaca gctgtcagaa aattcataga aatgggtttc attgatgaag 1920

aaagaatagc catatggggc tggtcctacg gaggttatgt ttcatccctg gcccttgcat 1980

ctggaactgg tcttttcaaa tgtggcatag cagtggctcc agtctccagc tgggaatatt 2040

acgcatctat ctactcagag agattcatgg gcctcccaac aaaggacgac aatctcgaac 2100

actataaaaa ttcaactgtg atggcaagag cagaatattt cagaaatgta gactatcttc 2160

tcatccacgg aacagcagat gataatgtgc actttcagaa ctcagcacag attgctaaag 2220

ctttggttaa tgcacaagtg gatttccagg cgatgtggta ctctgaccag aaccatggta 2280

tattatctgg gcgctcccag aatcatttat atacccacat gacgcacttc ctcaagcaat 2340

gcttttcttt atcagactga accaatgcaa gtactagcgt gtaggacagt ctgaaggctt 2400

cacatggacg acttggacca tgaatattgt aaaagccgct aaaaatttag gagggctcag 2460

gaggttaggc tcggtattgt ttacatttcc ctatgctctg tgaaagaaga gaaaagggga 2520

gccacacatc ttgctttgga cacaatgttt tatcacctgt tcattgccgg gtagcggaaa 2580

taaagtcaga tgctcaggtt aaaaaaaaaa aaaaa 2615

<210>4

<211>761

<212>PRT

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>4

Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr

20 25 30

Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu

50 55 60

Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys

85 90 95

Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val

100 105 110

Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala

115 120 125

Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr

130 135 140

Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro

165 170 175

Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile

180 185 190

Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr

195 200 205

Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val

210 215 220

Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

245 250 255

Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro

260 265 270

His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser

275 280 285

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val

290 295 300

Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile

305 310 315 320

Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln

325 330 335

Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val

340 345 350

Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

355 360 365

Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val

370 375 380

Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile

385 390 395 400

Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu

405 410 415

Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser

420 425 430

Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys

435 440 445

Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu

450 455 460

Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg

465 470 475 480

Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

485 490 495

Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys

500 505 510

Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe

515 520 525

Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro

530 535 540

Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr

545 550 555 560

Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly

565 570 575

Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu

580 585 590

Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile

595 600 605

Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser

610 615 620

Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu

625 630 635 640

Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr

645 650 655

Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

660 665 670

Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

675 680 685

Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn

690 695 700

Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala

705 710 715 720

Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile

725 730 735

Leu Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe

740 745 750

Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

755 760

<210>5

<211>814

<212>DNA

<213>人(homo sapiens)

<400>5

atcactctct ttaatcacta ctcacagtaa cctcaactcc tgccacaatg tacaggatgc 60

aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg cacttgtcac aaacagtgca cctacttcaa 120

gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact gctggattta cagatgattt 180

tgaatggaat taataattac aagaatccca aactcaccag gatgctcaca tttaagtttt 240

acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tctagaagaa gaactcaaac 300

ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga cccagggact 360

taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg atctgaaaca acattcatgt 420

gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg attacctttt 480

gtcaaagcat catctcaaca ctgacttgat aattaagtgc ttcccactta aaacgtatca 540

ggccttctat ttatttaaat atttaaattt tatatttatt gttgaatgta tggtttgcta 600

cctattgtaa ctattattct taatcttaaa actataaata tggatctttt atgattcttt 660

ttgtaagccc taggggctct aaaatggttt cacttattta tcccaaaata tttattatta 720

tgttgaatgt taaatatagt atctatgtag attggttagt aaaactattt aataaatttg 780

ataaatataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 814

<210>6

<211>153

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>6

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu

20 25 30

Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe

50 55 60

Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu

65 70 75 80

Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys

85 90 95

Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile

100 105 110

Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala

115 120 125

Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe

130 135 140

Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr

145 150

<210>7

<211>939

<212>DNA

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>7

atcacccttg ctaatcactc ctcacagtga cctcaagtcc tgcaggcatg tacagcatgc 60

agctcgcatc ctgtgtcaca ttgacacttg tgctccttgt caacagcgca cccacttcaa 120

gctccacttc aagctctaca gcggaagcac agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 180

agcagcacct ggagcagctg ttgatggacc tacaggagct cctgagcagg atggagaatt 240

acaggaacct gaaactcccc aggatgctca ccttcaaatt ttacttgccc aagcaggcca 300

cagaattgaa agatcttcag tgcctagaag atgaacttgg acctctgcgg catgttctgg 360

atttgactca aagcaaaagc tttcaattgg aagatgctga gaatttcatc agcaatatca 420

gagtaactgt tgtaaaacta aagggctctg acaacacatt tgagtgccaa ttcgatgatg 480

agtcagcaac tgtggtggac tttctgagga gatggatagc cttctgtcaa agcatcatct 540

caacaagccc tcaataacta tgtacctcct gcttacaaca cataaggctc tctatttatt 600

taaatattta actttaattt atttttggat gtattgttta ctatcttttg taactactag 660

tcttcagatg ataaatatgg atctttaaag attctttttg taagccccaa gggctcaaaa 720

atgttttaaa ctatttatct gaaattattt attatattga attgttaaat atcatgtgta 780

ggtagactca ttaataaaag tatttagatg attcaaatat aaataagctc agatgtctgt 840

catttttagg acagcacaaa gtaagcgcta aaataacttc tcagttattc ctgtgaactc 900

tatgttaatc agtgttttca agaaataaag ctctcctct 939

<210>8

<211>160

<212>PRT

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>8

Met Tyr Ser Met Gln Leu Ala Ser Cys Val Thr Leu Thr Leu Val Leu

1 5 10 15

Leu Val Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Ser Thr Ala

20 25 30

Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln His Leu

35 40 45

Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Met Glu Asn

50 55 60

Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Leu

65 70 75 80

Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu Glu Asp Glu

85 90 95

Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Leu Thr Gln Ser Lys Ser Phe

100 105 110

Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg Val Thr Val

115 120 125

Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln Phe Asp Asp

130 135 140

Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cys

145 150 155 160

<210>9

<211>852

<212>DNA

<213>人(homo sapiens)

<400>9

cttgcagctg cccacctcac cctcagctct ggcctcttac tcaccctcta ccacagacat 60

ggctcagtca ctggctctga gcctccttat cctggttctg gcctttggca tccccaggac 120

ccaaggcagt gatggagggg ctcaggactg ttgcctcaag tacagccaaa ggaagattcc 180

cgccaaggtt gtccgcagct accggaagca ggaaccaagc ttaggctgct ccatcccagc 240

tatcctgttc ttgccccgca agcgctctca ggcagagcta tgtgcagacc caaaggagct 300

ctgggtgcag cagctgatgc agcatctgga caagacacca tccccacaga aaccagccca 360

gggctgcagg aaggacaggg gggcctccaa gactggcaag aaaggaaagg gctccaaagg 420

ctgcaagagg actgagcggt cacagacccc taaagggcca tagcccagtg agcagcctgg 480

agccctggag accccaccag cctcaccaac gcttgaagcc tgaacccaag atgcaagaag 540

gaggctatgc tcaggggccc tggagcagcc accccatgct ggccttgcca cactctttct 600

cctgctttaa ccaccccatc tgcattccca gctctaccct gcatggctga gctgcccaca 660

gcaggccagg tccagagaga ccgaggaggg agagtctccc agggagcatg agaggaggca 720

gcaggactgt ccccttgaag gagaatcatc aggaccctgg acctgatacg gctccccagt 780

acaccccacc tcttccttgt aaatatgatt tatacctaac tgaataaaaa gctgttctgt 840

cttcccaccc gc 852

<210>10

<211>134

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>10

Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro

130

<210>11

<211>615

<212>DNA

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>11

gaattcggcc aaagaggcct acggccaaag agggctaaac ttgcggctgt ccatctcacc 60

tacagctctg gtctcatcct caactcaacc acaatcatgg ctcagatgat gactctgagc 120

ctccttagcc tggtcctggc tctctgcatc ccctggaccc aaggcagtga tggagggggt 180

caggactgct gccttaagta cagccagaag aaaattccct acagtattgt ccgaggctat 240

aggaagcaag aaccaagttt aggctgtccc atcccggcaa tcctgttctc accccggaag 300

cactctaagc ctgagctatg tgcaaaccct gaggaaggct gggtgcagaa cctgatgcgc 360

cgcctggacc agcctccagc cccagggaaa caaagccccg gctgcaggaa gaaccgggga 420

acctctaagt ctggaaagaa aggaaagggc tccaagggct gcaagagaac tgaacagaca 480

cagccctcaa gaggatagcc cagtagcccg cctggagccc aggagatccc ccacgaactt 540

caagctgggt ggttcacggt ccaactcaca ggcaaagagg gagctagaaa acagactcag 600

gagccgctag tcgag 615

<210>12

<211>133

<212>PRT

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>12

Met Ala Gln Met Met Thr Leu Ser Leu Leu Ser Leu Val Leu Ala Leu

1 5 10 15

Cys Ile Pro Trp Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Lys Lys Ile Pro Tyr Ser Ile Val Arg Gly Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Pro Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Ser Pro Arg Lys His Ser Lys Pro Glu Leu Cys Ala Asn Pro Glu Glu

65 70 75 80

Gly Trp Val Gln Asn Leu Met Arg Arg Leu Asp Gln Pro Pro Ala Pro

85 90 95

Gly Lys Gln Ser Pro Gly Cys Arg Lys Asn Arg Gly Thr Ser Lys Ser

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Gln Thr

115 120 125

Gln Pro Ser Arg Gly

130

<210>13

<211>878

<212>DNA

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>13

atcccagccc acgcacagac ccccaacttg cagctgccca cctcaccctc agctctggcc 60

tcttactcac cctctaccac agacatggct cagtcactgg ctctgagcct ccttatcctg 120

gttctggcct ttggcatccc caggacccaa ggcagtgatg gaggggctca ggactgttgc 180

ctcaagtaca gccaaaggaa gattcccgcc aaggttgtcc gcagctaccg gaagcaggaa 240

ccaagcttag gctgctccat cccagctatc ctgttcttgc cccgcaagcg ctctcaggca 300

gagctatgtg cagacccaaa ggagctctgg gtgcagcagc tgatgcagca tctggacaag 360

acaccatccc cacagaaacc agcccagggc tgcaggaagg acaggggggc ctccaagact 420

ggcaagaaag gaaagggctc caaaggctgc aagaggactg agcggtcaca gacccctaaa 480

gggccatagc ccagtgagca gcctggagcc ctggagaccc caccagcctc accagcgctt 540

gaagcctgaa cccaagatgc aagaaggagg ctatgctcag gggccctgga gcagccaccc 600

catgctggcc ttgccacact ctttctcctg ctttaaccac cccatctgca ttcccagctc 660

taccctgcat ggctgagctg cccacagcag gccaggtcca gagagaccga ggagggagag 720

tctcccaggg agcatgagag gaggcagcag gactgtcccc ttgaaggaga atcatcagga 780

ccctggacct gatacggctc cccagtacac cccacctctt ccttgtaaat atgatttata 840

cctaactgaa taaaaagctg ttctgtcttc ccacccaa 878

<210>14

<211>134

<212>PRT

<213>小家鼠(mus musculus)

<400>14

Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys

20 25 30

Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr

35 40 45

Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe

50 55 60

Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu

65 70 75 80

Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro

85 90 95

Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr

100 105 110

Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser

115 120 125

Gln Thr Pro Lys Gly Pro

130

<210>15

<211>1816

<212>DNA

<213>人(homo sapiens)

<400>15

cttctctgcc agaagatacc atttcaactt taacacagca tgatcgaaac atacaaccaa 60

acttctcccc gatctgcggc cactggactg cccatcagca tgaaaatttt tatgtattta 120

cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat 180

agaaggttgg acaagataga agatgaaagg aatcttcatg aagattttgt attcatgaaa 240

acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga tccttatcct tactgaactg tgaggagatt 300

aaaagccagt ttgaaggctt tgtgaaggat ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa 360

gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat cagaatcctc aaattgcggc acatgtcata 420

agtgaggcca gcagtaaaac aacatctgtg ttacagtggg ctgaaaaagg atactacacc 480

atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga 540

ctctattata tctatgccca agtcaccttc tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagct 600

ccatttatag ccagcctctg cctaaagtcc cccggtagat tcgagagaat cttactcaga 660

gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct tgcgggcaac aatccattca cttgggagga 720

gtatttgaat tgcaaccagg tgcttcggtg tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg 780

agccatggca ctggcttcac gtcctttggc ttactcaaac tctgaacagt gtcaccttgc 840

aggctgtggt ggagctgacg ctgggagtct tcataataca gcacagcggt taagcccacc 900

ccctgttaac tgcctattta taaccctagg atcctcctta tggagaacta tttattatac 960

actccaaggc atgtagaact gtaataagtg aattacaggt cacatgaaac caaaacgggc 1020

cctgctccat aagagcttat atatctgaag cagcaacccc actgatgcag acatccagag 1080

agtcctatga aaagacaagg ccattatgca caggttgaat tctgagtaaa cagcagataa 1140

cttgccaagt tcagttttgt ttctttgcgt gcagtgtctt tccatggata atgcatttga 1200

tttatcagtg aagatgcaga agggaaatgg ggagcctcag ctcacattca gttatggttg 1260

actctgggtt cctatggcct tgttggaggg ggccaggctc tagaacgtct aacacagtgg 1320

agaaccgaaa cccccccccc cccccccgcc accctctcgg acagttattc attctctttc 1380

aatctctctc tctccatctc tctctttcag tctctctctc tcaacctctt tcttccaatc 1440

tctctttctc aatctctctg tttccctttg tcagtctctt ccctccccca gtctctcttc 1500

tcaatccccc tttctaacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 1560

acacacacac acacacacac agagtcaggc cgttgctagt cagttctctt ctttccaccc 1620

tgtccctatc tctaccacta tagatgaggg tgaggagtag ggagtgcagc cctgagcctg 1680

cccactcctc attacgaaat gactgtattt aaaggaaatc tattgtatct acctgcagtc 1740

tccattgttt ccagagtgaa cttgtaatta tcttgttatt tattttttga ataataaaga 1800

cctcttaaca ttaaaa 1816

<210>16

<211>261

<212>PRT

<213>人(homo sapiens)

<400>16

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

Claims

1.包含DNA构建体的、有效刺激对抗肿瘤基质细胞的免疫应答的组合物，所述肿瘤基质细胞表达成纤维细胞激活蛋白，即FAP，所述DNA构建体编码FAP且被掺入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)载体中，所述的DNA构建体可在免疫细胞中表达，所述的组合物被掺入药学上可接受的载体中。

2.权利要求1的组合物，其中所述DNA构建体编码SEQ ID NO：2所示的人FAP。

3.权利要求1的组合物，其中所述DNA构建体为基本上纯化的DNA，所述DNA具有由SEQ ID NO：1组成的多核苷酸序列。

4.权利要求1的组合物，其中所述组合物还包含编码可在免疫细胞中表达的免疫效应蛋白的DNA构建体，其中所述免疫效应蛋白为细胞因子CCL21或IL-2。

5.下述DNA构建体在制备用于抑制哺乳动物中肿瘤生长或肿瘤转移的组合物中的用途，所述DNA构建体编码FAP且被掺入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌载体中，所述的DNA构建体可在哺乳动物的免疫细胞中表达。

6.权利要求5的用途，其中所述哺乳动物为人。

7.权利要求5的用途，其中所述组合物为经口服给药形式。

8.下述DNA构建体和有效抗肿瘤量的抗肿瘤化疗药物在制备用于抑制哺乳动物中肿瘤生长或肿瘤转移的组合物中的用途，所述DNA构建体编码FAP且被掺入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌载体中，所述的DNA构建体可在哺乳动物的免疫细胞中表达。

9.权利要求8的用途，其中所述哺乳动物为人。

10.权利要求8的用途，其中所述化疗药物为多柔比星。

11.权利要求8的用途，其中所述组合物为经口服给药形式。

12.下述DNA构建体和有效抗肿瘤量的抗肿瘤化疗药物在制备用于增加哺乳动物摄取化疗药物的组合物中的用途，所述DNA构建体编码FAP且被掺入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌载体中，所述的DNA构建体可在哺乳动物的免疫细胞中表达。

13.权利要求12的用途，其中所述哺乳动物为人。

14.权利要求12的用途，其中所述化疗药物为多柔比星。

15.权利要求12的用途，其中所述组合物为经口服给药的形式。