JP4892705B2 - レクチン組成物および抗原に対する免疫反応を調節するための方法 - Google Patents

レクチン組成物および抗原に対する免疫反応を調節するための方法 Download PDF

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Description

発明の背景
一般に、被検体で抗原に対する免疫反応を的確に調節するにあたって、調節を開始および／または進めるにはアジュバントなどの別の物質を抗原と混合した状態で投与しなければならない。ところが、従来のアジュバントには相当な欠点がある。たとえば、その多くは不均質な粗製調製物である。また、多くは比較的弱い免疫調節物質であり、なかには人間に生じてはならない重篤な局所炎症を引き起こすものもある。サイトカインなどの精製された可溶性ポリペプチドには、粗製のアジュバントよりも有利な点がいくつかあるが、投与時に抗原から離れて拡散してしまうため、その価値は限られてしまう。一方、細胞ベースのワクチンの成分として潜在的な免疫調節物質になり得る細胞表面分子もあるが、使用されるのは細胞への遺伝子導入時が普通で、そこには問題があることが多い。
したがって、本発明は、細胞、ウイルス、単離抗原などの抗原保有標的に結合可能であり、なおかつ抗原保有標的と一緒に投与したときに免疫調節物質として機能できる分子を提供することによって、従来は満たされていない需要を満たすものである。また、本発明は、これらの分子を含む組成物ならびに関連の方法を提供するものである。さらに、本発明の組成物および方法は、細胞表面受容体のポリペプチドリガンドなどの生物学的エフェクタをウイルスまたは細胞などの標的構造に付着させることが望ましいあらゆる用途といった他の用途にも有用である。
発明の概要
本発明は、抗原保有標的に結合できる第１の構成要素と、細胞に結合できる第２の構成要素とを含む、融合ポリペプチドなどの多機能性分子に関する。好ましい実施形態では、第１の構成要素が第１の細胞表面結合部分であり、第２の構成要素が第２の細胞表面結合部分である。この実施形態では、第１の細胞表面結合部分は、抗原を持つ腫瘍細胞などの細胞またはウイルスに付着できる。また、第２の細胞表面結合部分が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の非免疫グロブリンポリペプチドなどの細胞表面ポリペプチドに結合できると特に好ましい。よって、いくつかの実施形態では、本発明の多機能性分子は、抗原保有標的とＡＰＣとの間のブリッジまたはリンクとして機能することができる。
本発明で使用する場合、「抗原保有標的」とは抗原を持つエンティティである。本発明で使用する場合、「抗原保有標的」としては、たとえば、他の細胞由来の物質またはウイルス由来の物質を持たなくてもよい、抗原を発現する細胞全体、抗原を持つ細胞画分、抗原を持つ膜画分、抗原を持つウイルス、抗原を持つウイルス粒子、あるいは、ポリペプチド抗原などの抗原があげられる。細胞画分については、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９４年、Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ、ＩＳＢＮ０−１２−１６４７１５−３）に教示されているものなどの当業者間で周知の方法を用いて調製すればよい。
本発明で使用する「抗原」という用語は、生体に体液性および／または細胞性の免疫反応を起こさせることが可能な分子を示す。抗原は、たとえば、単純な中間代謝物、糖、脂質、ホルモンならびに、複合炭水化物やリン脂質、核酸、タンパク質などの巨大分子をはじめとして、どのようなタイプの生物分子であってもよい。抗原の一般的なカテゴリとしては、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫抗原および他の寄生虫抗原、腫瘍抗原、さらには自己免疫疾患やアレルギー、移植片拒絶に関与する抗原、他のさまざまな抗原があげられるが、これに限定されるものではない。本発明の組成物および方法において、抗原が、少なくとも７のアミノ酸を含むものなどのポリペプチドであると好ましい。
本発明で使用する場合、「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」とは、抗原を喰食し、Ｔ細胞に抗原を提示する細胞を示す。これらの細胞としては、貪食白血球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球、内皮細胞がある。Ｔリンパ球を構成的に活性化できるＡＰＣが「プロフェッショナルＡＰＣ」である。プロフェッショナルＡＰＣは一般に、構成的にクラスＩＩの主要組織適合性分子やＢ７−１および／またはＢ７−２などの共刺激分子を構成的に発現する。
一実施形態において、本発明は第１の構成要素がレクチンである多機能性分子を包含する。よって、この多機能性分子は、抗原保有標的の１以上の炭水化物に結合できる。本発明の好ましい実施形態では、多機能性分子の第１の構成要素がレクチンであり、第２のポーションが細胞表面タンパク質のリガンド（細胞表面受容体のリガンドなど）である。好ましくは、細胞表面タンパク質はＡＰＣの細胞表面受容体である。細胞表面受容体のリガンドには細胞表面タンパク質に結合するあらゆるリガンドが含まれ、好ましくは、オプソニン、サイトカイン、接着分子、Ｔ細胞共刺激分子のカウンターレセプタ、デフェンシン、ＣＤ４０分子または熱ショックタンパク質のリガンド、あるいは、このようなリガンドの約（または少なくとも約）５、８、１０、１２、１５、２０、２５、３５、５０、６０、７０、８０、１００または１２０の連続したアミノ酸をはじめとする、上記のいずれかのリガンドの一部があげられるが、これに限定されるものではない。好ましくは、第１および第２の構成要素を含む多機能性分子が、接着分子、Ｔ細胞の共刺激分子、あるいは、サイトカイン、デフェンシン、熱ショックタンパク質、ＣＤ４０分子またはオプソニンといった分子のうち少なくとも１種の受容体を含むがこれに限定されるものではない、細胞表面タンパク質（細胞表面受容体など）に結合可能なアミノ酸配列を含む。
本発明において有用な細胞表面タンパク質（細胞表面受容体など）は、本発明の多機能性分子のリガンドポーションを結合可能なあらゆる細胞表面分子である。好ましくは、細胞表面受容体は、ＣＤ４０分子、Ｔ細胞共刺激分子、接着分子であるか、サイトカイン、デフェンシン、熱ショックタンパク質、オプソニンまたは接着分子の受容体である。本発明において有用な細胞表面タンパク質としては、添付資料ＩおよびＩＩに記載のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で特定される細胞表面分子、あるいは、添付資料ＩまたはＩＩに記載のＧｅｎＢａｎｋ受託番号で特定される核酸分子によってコードされる細胞表面分子があげられるが、これに限定されるものではない。
本発明で使用する「サイトカイン」という用語は、哺乳類細胞から自然に分泌され、白血球の細胞表面タンパク質に結合するポリペプチド分子であって、白血球に対して（白血球の受容体がサイトカインで単に占有されるだけではない）変化（増殖状態の変化、転写プロファイルの変化または走性の変化など）をもたらすポリペプチド分子を示す。ここでいう「変化」とは、サイトカインが存在しない場合に比して少なくとも約５％増加または減少することを示す。また、本願明細書において、「サイトカイン」という用語は、自然界に存在するサイトカインの受容体のリガンドであるポリペプチド分子を示す。
本発明の方法および組成物に有用なサイトカインの例としては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ヘマトポエチン受容体のリガンド、免疫グロブリンスーパーファミリ受容体のリガンド、インターフェロン受容体のリガンド、ＴＮＦ受容体のリガンド、ケモカイン受容体のリガンドがあげられる。サイトカイン受容体に対する抗体はサイトカインであっても構わない。
本発明の一実施形態では、本発明の組成物によって構成されるサイトカインが、Ｔｈ１免疫反応すなわち、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのＴｈ１サイトカインを発現するＴ細胞の生成を促進するものであると好ましい。もうひとつの実施形態では、本発明の組成物で構成されるサイトカインが、Ｔｈ２免疫反応すなわち、ＩＬ−４およびＩＬ−１０などのＴｈ２サイトカインを発現するＴ細胞の生成を促進するものであると好ましい。
本願明細書に記載の「遺伝子工学操作により改変されたサイトカイン」とは、異種細胞表面結合部分を有するサイトカインのことである。
本発明で使用する「オプソニン」という用語は、抗原含有細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方に同時に結合または付着することで、抗原とＡＰＣとの間の連結因子またはカップリング因子（アダプタ）として作用し、抗原含有細胞をＡＰＣで一層効率的に結合、貪食、内部移行することが可能な、自然界に存在する分子および自然界に存在しない分子を示す。また、本発明で有用なオプソニンとしては、自然界に存在するオプソニンを結合可能な受容体を介してＡＰＣに結合できる、自然界に存在しないオプソニンもあげられる。
本発明で使用する「オプソニン」という用語は、プロセシングステップ（単数または複数）で得られる少なくとも１種の産物が、抗原含有細胞とＡＰＣの両方に同時に結合または付着することで連結因子またはカップリング因子として作用し、他の抗原含有細胞をＡＰＣで一層効率的に結合、貪食、内部移行できるような形でプロセシング可能な分子のことも示し得る。また、オプソニンは多鎖型オプソニンのいずれかのポリペプチド鎖であっても構わない。
本発明の方法および組成物において有用なオプソニンの例としては、ビトロネクチン、フィブロネクチン、Ｃ１ｑ（その成分であるポリペプチド鎖Ａ、Ｂ、Ｃのいずれかを含む）などの補体成分、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂなどの補体断片、マンノース結合タンパク質、コングルチニン、サーファクタントタンパク質ＡおよびＤ、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α−２−マクログロブリン、免疫グロブリンのＦｃ部分などの免疫グロブリンがあげられる。
「自然オプソニン」とは、自然免疫系のオプソニンであり、従来技術においては自然免疫系の分泌ポリペプチド分子として周知であり、抗原とＡＰＣの表面に同時に結合するとされている。このため、自然オプソニンは「ブリッジ」として作用でき、この特性がゆえに、ＡＰＣによる抗原の内部移行を促進すると考えられている。オプソニンがどのように抗原に結合するのかはオプソニンによって異なり、共有結合によることもあれば非共有結合によることもある。一般に、自然オプソニンの抗原結合部分は、同じ種に属するメンバ間で比較的ばらつきがなく、個体の個体発生時に多様化しないという点で、免疫グロブリンの抗原結合部分とは異なる。
自然界に存在するＡＰＣ結合部分を含む分子については、オプソニン分子がその天然抗原結合ドメインを含んでいるか否かに関わらず、ＡＰＣ結合部分が細胞外空間に位置するような形で細胞に対して安定して結合または付着できる部分が含まれていれば、オプソニンとみなされる。
本願明細書に記載の「遺伝子工学操作により改変されたオプソニン」には、細胞表面結合部分が、オプソニンの天然抗原結合ドメインで置換されているか、細胞表面結合部分が、オプソニンの天然抗原結合ドメインの修飾または除去なくオプソニンに連結されている分子が含まれる。
「細胞表面結合部分」とは、細胞壁、多糖莢膜または形質膜の脂質成分またはタンパク質成分などの細胞表面、あるいはウイルスの表面に、分子が安定して結合できる部分のことである。このような部分としては、架橋部分および脂質部分があげられるが、これに限定されるものではない。細胞表面結合部分は、ポリペプチドとその同族細胞表面ポリペプチドとの相互作用以外の手段で細胞に結合することが好ましい。細胞表面結合部分が非ポリペプチド部分を含むものであるとさらに好ましい。好ましい実施形態では、脂質部分が、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）部分を介して遺伝子工学操作により改変された分子に連結している。もうひとつの好ましい実施形態では、脂質がパルミテートなどの脂肪酸を含む。本発明のさらに別の好ましい実施形態では、細胞表面結合部分は、オプソニンまたは抗原結合ドメイン短縮オプソニンに、オプソニンの抗原結合末端で連結している。もうひとつの好ましい実施形態では、この多機能性分子が、ＡＰＣに結合できる免疫グロブリンのイディオタイプ部分を含む。好ましくは、オプソニン増強細胞のオプソニンがα’鎖Ｃ３ｂまたはマンノース結合タンパク質のうちの一方である。
オプソニンがＣ３の断片である場合は、ＣＲ２に対してよりも高い親和性でＣＲ１に結合するものであると好ましい。さらに、このＣ３の断片がＣＲ２のリガンドではないことが好ましい。好ましくは、このオプソニンは、Ｃ３ｂｉ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｄｇのいずれでもない。
オプソニンは、貪食作用の引き金となり、非クロノタイプであり、結果としてクロノタイプ受容体に見られるような細胞間の変化のない受容体に結合するものであると好ましい。非クロノタイプ受容体は、自然免疫に対して何らかの役割を果たす細胞上に存在するもので、非イディオタイプ受容体などがこれに含まれる。このような受容体の例としては、ＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｃ１ｑ受容体、Ｃ１ｑ受容体の成分を含む受容体、コレクチン受容体、α２ｍの受容体、ＣＲＰの受容体、免疫グロブリンのＦｃ受容体を含む。
「外来性の」とは、細胞外から導入されるか、あるいは細胞外で産生されるものを示す。
「内因性」とは、細胞内で自然に発現されるか、細胞内にもともと存在するものを示す。
「異種」とは、細胞内で自然に発現されることのないものを示す。
好ましくは、第１および第２の構成要素を含む多機能性分子が、第２の構成要素を介して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面または形質膜を結合可能である、すなわち、少なくともある程度はＴ細胞に対して抗原を提示することによってＴ細胞を活性化できる細胞など、Ｔ細胞に対して抗原を提示し得る細胞である。ＡＰＣは、単球系の細胞および／または樹状細胞などの白血球であってもよい。好ましくは、多機能性分子の結合が、免疫グロブリンのクロノタイプ決定因子など、イディオタイプのＡＰＣでの発現に依存しないものである。最も好ましくは、多機能性分子は、抗原を持つ細胞に結合可能な第１の末端と、ＡＰＣに結合可能な第２の末端とを含む。
多機能性分子は、細胞膜の脂質ポーションに挿入したり、あるいは膜の脂質ポーションに物理的に関連した、ポリペプチドまたは炭水化物などの構造に結合するなどの方法で、抗原保有標的細胞に結合できる。この構造は、必ずしも膜の脂質ポーションに直接に接触していなくてもよいが、細胞表面糖タンパク質の一部である炭水化物などに間接的に付着させられるものである。好ましくは、多機能性分子は、抗原を持つ哺乳類細胞であると好ましい抗原保有標的に第１の構成要素を介して結合でき、第２の構成要素を介してＡＰＣに結合できる。また、本発明は、真菌細胞または細菌細胞などの非哺乳類細胞またはウイルスに第１の構成要素を介して結合可能であり、第２の構成要素を介してＡＰＣに結合可能な分子の使用も包含する。後者の場合、第１の構成要素は、細胞壁または莢膜の成分などに結合できる。
好ましい実施形態では、第１および第２の構成要素を含む多機能性分子が、レクチンを含む第１の構成要素と、単球系の細胞または樹状細胞（それ自体が単球系のものであってもよい）などのＡＰＣなどの白血球に結合可能な第２の構成要素とを含む。本発明での「レクチン」は、分子であるか、アミノ酸配列など分子の一部であり、多糖類などの炭水化物に結合可能である。自然界に存在するレクチンのファミリとしては、以下のものがあげられる。
１） 急速に家系を拡げつつある動物レクチンであるガレクチン。どのガレクチンもガラクトース特異性を持つ。
２） カルシウム依存性（Ｃ型）動物レクチンすなわち、多様な構造と機能を持つメンバで構成される非常に大きな家系。
３） このＣ型レクチンファミリのうち、シアリル−ルイスＸを認識して白血球を内皮細胞に接着させる特異的な機能が特徴であるサブファミリがセレクチンである。
４） Ｃ型レクチンのもうひとつのサブファミリであるコレクチンは、マンノースに特異性を示し、Ｃ型レクチンドメインとコラーゲン様ドメインからなるユニークな構造を持つ。コレクチンは自然免疫に関与している。
５） 無脊椎動物の体液中には、生体防御因子と考えられる多種多様なレクチンが存在することが分かっている。最近になって、刺皮動物のレクチンの中には溶血活性を示すものがあることが判明している。
６） 最近になってグリコサミノグリカンに一定の結合性を示すレクチンであることが分かった、脂質に親和性を持つ一群のタンパク質であるアネキシン。
７） 多様な糖類特異性がＣ型レクチンに匹敵する、ＣｏｎＡなどの多数のメンバで構成されるマメ科レクチン家系。
８） １００年以上前にロシアで研究調査の対象となっていた最初のレクチンであるリシン。現在では、リシン家系には毒性と糖結合特異性のいずれかが異なる他の相応のメンバが多くあることが分かっている。
よって、本発明の多機能性分子は、１以上の炭水化物に結合できる。レクチンの結合先となり得る炭水化物としては、たとえば、ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース（α−Ｌ−フコースなど）、Ｄ−ガラクトース、血液型Ａ型のオリゴ糖、血液型Ｂ型のオリゴ糖を含む炭水化物、α−Ｄ−Ｇａｌ（１−＞３）［α−Ｌｆｕｃ（１−＞２）］−β−Ｄ−Ｇａｌ（１−＞３／４−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃを含む糖類、α−シアリル［２−＞３］−ラクトース、α−Ｄ−マンノシル複合糖質、α−ＮｅｕＮＡｃ−［２−＞６］−Ｇａｌ、α−ＮｅｕＮＡｃ−［２−＞６］−ＧａｌＮＡｃ、α−ＮｅｕＮＡｃ−［２−＞３］−Ｇａｌ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン、末端α−Ｄ−ガラクトシル残基、末端β−Ｄ−ガラクトシル残基、Ｎ−アセチルラクトサミン、末端α−Ｄ−マンノシル残基、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン、末端Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、末端α−Ｄ−ガラクトサミニル残基を含む糖類もあげられる。
レクチンを含む多機能性分子は、たとえば、自然界に存在するレクチン全体あるいは、自然界に存在するポリペプチドレクチンの約（または少なくとも約）５、８、１０、１２、１５、２０、２５、３５、５０、６０、７０、８０、１００または１２０の連続したアミノ酸など、自然界に存在するレクチンの一部を含み得る。一実施形態では、多機能性分子は自然界に存在するレクチンの炭水化物結合ドメインすなわち、残りのレクチンの非存在下で炭水化物に結合可能なレクチンの一部を含む。もうひとつの実施形態では、レクチンは、分子の人工ライブラリから同定されたものや、自然界に存在するレクチンの構造を一部変更して設計されたものなど、自然界に存在しないものであってもよい。
「赤血球凝集素」として知られるレクチンは、血液型抗原など、赤血球上の炭水化物に結合し、これらの細胞と一緒にインキュベートされたときに細胞を凝集させるものである。インフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、たとえば、シアル酸（ヒトパラインフルエンザウイルス３赤血球凝集素／ノイラミニダーゼの場合と同様）に結合する。インフルエンザ赤血球凝集素のサブタイプには、それぞれに異なる抗原特性で規定される少なくとも１５種類が知られている。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５などと表記されるこれらのサブタイプのいずれにおいても、本発明の組成物および方法において有用なアミノ酸配列が得られる。本発明の一実施形態では、赤血球凝集素は、Ｈ１、Ｈ２またはＨ３など、ヒトに感染するウイルス由来のサブタイプのものである。もうひとつの実施形態では、赤血球凝集素は、Ｈ４乃至Ｈ１５のうちのひとつなど、ヒトに感染しないウイルス由来のサブタイプのものである。アミノ酸配列は、特定のサブタイプの範囲内でインフルエンザ赤血球凝集素で約２０％まで変えることができ、サブタイプが異なればインフルエンザ赤血球凝集素で約３０％から約７０％変えることができる。
インフルエンザ赤血球凝集素は、翻訳後に三量体形成する、ＨＡ０という単一のポリペプチド鎖として発現される。ＨＡ０は、タンパク質分解的に開裂されてＨＡ１およびＨＡ２という２つのドメインになり、これが互いにジスルフィド結合されている。ＨＡ１が有意なシアル酸結合活性を持つのに対し、ＨＡ２はウイルス膜に固着してこの膜と宿主細胞膜とを融合しやすくする。本発明の好ましい実施形態では、第１および第２の構成要素を含む多機能性分子が、ＨＡ１ドメインのアミノ酸配列を有する。
分子は、抗原保有標的に結合可能な第１のアミノ酸配列と白血球に結合可能な第２のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドなど、細胞に結合される第１の構成要素と第２の構成要素との間に介在する１以上のアミノ酸を含み、かつ、第１の構成要素と第２の構成要素との間に介在する少なくとも１のアミノ酸をさらに含む融合ポリペプチドであってもよい。介在するアミノ酸は、上述した第１の構成要素と第２の構成要素との間の立体障害または他の望ましくない干渉を抑えることを目的としたリンカー配列などを含むものであってもよい。たとえば、このようなタイプの一配列は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎの形をとる。別の有用なリンカーとして、（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ）１〜５（Ｘｕら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１５１〜１５６）、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（Ｓｈａｏら、２０００、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１１：８２２〜８２６）、（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）ｎ（Ｋｒｏｏｎら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６７４０〜６７５２）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎ（Ｋｌｕｃｚｙｋら、２０００、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２１：１４１１〜１４２０）、（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）ｎ（Ｋｌｕｃｚｙｋら、２０００、上掲）（式中、ｎは１から１５である）（上記の引用文献各々についても本願明細書に援用する）があげられるが、これに限定されるものではない。もうひとつの実施形態では、第１の構成要素と第２の構成要素との間にアミノ酸は介在しない。
本発明はさらに、本発明の多機能性ポリペプチドをコードする、核酸分子、好ましくは組換え核酸分子を提供するものである。この核酸分子は、たとえば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡにできる。核酸分子は、自然界に存在するものであってもよいし、当業者間で周知の手法で一部または全体が合成されたものであってもよい。好ましい実施形態では、核酸分子は、抗原保有標的に結合可能な第１のアミノ酸配列をコードする第１の核酸配列と、ＡＰＣ上の細胞表面受容体に結合可能な第２のアミノ酸配列をコードする第２の核酸配列とを含むＤＮＡ分子である。
本発明はさらに、宿主細胞での発現に適した発現ベクターなど、本発明の多機能性ポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターであって、宿主細胞が、好ましくは真核細胞であり、一層好ましくは動物細胞であり、一層好ましくは哺乳類細胞であり、なお一層好ましくはヒト細胞であるベクターを提供するものである。もうひとつの好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅなどの酵母細胞である。
また、本発明は、本発明の多機能性分子をコードする配列を含む核酸ベクターを含む宿主細胞を提供するものである。好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞などの真核細胞であるか、動物細胞、好ましくはヒト細胞である。宿主細胞は原核細胞であっても構わない。
さらに、本発明は、抗原を持つ細胞といった細胞などの抗原保有標的に結合可能な第１の構成要素と、ＡＰＣなどの白血球などの細胞に結合可能な第２の構成要素とを含む、融合ポリペプチドといったポリペプチドなどの分子を包含する。ここでの分子は、本願明細書における方法および組成物の説明に教示された特徴であれば、どのような特徴を持つものであってもよい。好ましくは、第１の構成要素と第２の構成要素とは互いに異種のものである。この分子は、哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞または細菌細胞で発現される組換えポリペプチドであってもよい。
また、本発明は、抗原保有標的に結合可能な第１の構成要素と細胞に結合可能な第２の構成要素とを含むポリペプチドなどの本発明の多機能性分子を、動物の宿主細胞で発現させるなど、動物において発現させるステップを含む、動物で免疫反応を調節する方法を包含する。本発明によれば、「動物での発現」とは「動物に存在するようにする」ことを意味する。分子がポリペプチドである場合、好ましくは、このポリペプチドをコードする核酸をｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで宿主細胞に導入することによって発現させる。宿主細胞に核酸をｅｘ ｖｉｖｏで導入する場合、後から宿主細胞を動物に投与してもよい。好ましい実施形態では、この方法は、免疫反応の調節対象となる抗原を動物に投与することをさらに含む。たとえば、多機能性分子をコードする核酸をさらに含む組成物の一部として抗原を動物に投与することができる。もうひとつの好ましい実施形態では、多機能性分子の発現時点で動物にはすでに抗原が存在する。さらに別の好ましい実施形態では、多機能性分子の投与後に動物に抗原を投与する。さらに別の好ましい実施形態では、動物での多機能性分子の発現の前または後のいずれかに、抗原をコードする核酸を含む組成物を動物に投与するなどの方法で、動物で抗原を発現させる。もうひとつの実施形態では、これらの核酸配列を含む組成物を動物に投与するなどの方法で、多機能性分子および抗原をコードする核酸配列を動物の１以上の宿主細胞に導入する。
本発明で使用する場合、本発明の方法および組成物を用いて選択抗原に対する「免疫反応を調節している」という表現は、本発明の多機能性分子を含まないこと以外はあらゆる点で同一である組成物を投与して得られる反応に比べて、程度の差こそあれ反応を効率的にする、程度の差こそあれ高速化する、規模を大きくするまたは小さくするおよび／または程度の差こそあれ容易に誘導することを意味する。好ましい実施形態では、好ましい実施形態では、反応は、本発明の多機能性分子を含まないこと以外はあらゆる点で同一である組成物を投与して得られる反応に比べて、約５から１００％あるいは好ましくは約５から５０％、あるいは一層好ましくは約５および２５％、程度の差こそあれ効率的、程度の差こそあれ高速、規模が大きいまたは小さいおよび／または程度の差こそあれ容易に誘導される。
「免疫反応を調節する」という表現は、選択抗原に対する免疫反応の刺激／活性化を示し得るか、または選択抗原に対する免疫反応の抑制、排除または減弱を示し得る。好ましい実施形態では、免疫反応を調節すると、ワクチン接種を実施しない場合の免疫反応と比べて、選択抗原に対する免疫反応が、少なくとも約５％、あるいは好ましくは５から５０％、あるいは一層好ましくは５０から１００％刺激および／または活性化されるか、ワクチン接種を実施しない場合の免疫反応と比べて、選択抗原に対する免疫反応が、少なくとも約５％、あるいは好ましくは５から５０％、あるいは一層好ましくは５０から１００％抑制、排除または減弱される。場合によっては、抗原に対するひとつの免疫反応（Ｔｈ１反応など）が増大する一方で、同じ抗原に対する別の免疫反応（Ｔｈ２反応など）が低減されることもある。
本発明は、本発明の多機能性分子と、ウイルス、プリオンまたは細胞などの抗原保有標的とを含む組成物も包含する。好ましくは、抗原保有標的が細胞である場合、多機能性分子は細胞にとって外来性のものである。多機能性分子は細胞にとって異種のものであってもよい。一実施形態では、細胞内の組換え核酸由来など、細胞内で多機能性分子を発現させる。本発明は、本発明の多機能性分子をコードする核酸を含む細胞も包含する。この多機能性分子は本願明細書に記載のどのような特徴を持つものであってもよい。本発明において有用な抗原保有標的（細胞など）としては、たとえば、悪性細胞、良性腫瘍細胞、病原性および／または自己反応性であってもよいＢリンパ球またはＴリンパ球などのリンパ球、外部から導入された核酸分子由来の抗原を発現している細胞、哺乳類細胞、ヒト細胞、線維芽細胞、昆虫細胞および真菌細胞などの真核細胞、細菌細胞などの原核細胞があげられる。本発明において有用なウイルスの例としては、たとえば、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型などのレトロウイルス；単純ヘルペスウイルス１型および２型、サイトメガロウイルス、水痘帯状疱疹ウイルスなどのヘルペスウイルス；ヒトパピローマウイルス；狂犬病ウイルス；ロタウイルス；インフルエンザウイルスＡ型、Ｂ型、Ｃ型；Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルスまたはδ因子；アデノウイルス；麻疹ウイルス；流行性耳下腺炎ウイルス；ポリオウイルス；風疹ウイルス；パラインフルエンザウイルス；コクサッキーウイルスＡ型およびＢ型；痘瘡ウイルス；黄熱病ウイルス；デング熱ウイルスおよび他の出血熱ウイルス；ウエストナイル熱ウイルス；東部ウマ脳炎ウイルス；西部ウマ脳炎ウイルス；ベネズエラウマ脳炎ウイルス；日本脳炎ウイルス；ライノウイルス；口蹄疫病ウイルスがあげられる。プリオンには、スクラピー、クールー、ウシ海綿状脳症の因子が含まれる。死滅させる、光線照射、化学的固定化、病原性が低下するように選択した培養中に通す、あるいは遺伝子操作などの方法で、細胞、ウイルスまたはプリオンを減弱化すなわち非病原性にすることができる。好ましくは、この組成物は、単球、単球系の細胞、マクロファージまたは樹状細胞などの白血球あるいは別のＡＰＣをさらに含む。
好ましくは、この発明性のある方法および組成物では、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで実質的に分裂できない。「ｉｎ ｖｉｔｒｏで実質的に分裂できない」とは、細胞が、細胞分裂を防ぐよう処理していない同様の細胞の分裂速度の約５０％未満の速度で分裂することを意味する。好ましい実施形態では、細胞は、細胞分裂を防ぐよう処理していない同様の細胞の分裂速度の約３０〜５０％未満の速度で分裂する。
好ましくは、組成物は実質的に培養液が入っていないものである。本発明で使用する場合、「培養液」とは、ウシ胎仔血清などの動物血清を少なくとも２％含有する、細胞培養に用いられる培地を示す。
特に、本発明は、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素の少なくとも約１０の連続したアミノ酸を含むレクチンと、自然界に存在するＧＭ−ＣＳＦ分子の少なくとも約５の連続したアミノ酸とを含む、融合ポリペプチドである多機能性分子を提供するものである。
一実施形態では、レクチンは自然界に存在するＧＭ−ＣＳＦ分子の連続したアミノ酸に対するＮ末端である。
別の実施形態では、レクチンは自然界に存在するＧＭ−ＣＳＦ分子の連続したアミノ酸に対するＣ末端である。
一実施形態では、レクチンは、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素のＨＡ１ドメインの少なくとも約１０の連続したアミノ酸を含む。
一実施形態では、レクチンはインフルエンザウイルスの赤血球凝集素のＨＡ１ドメインである。
好ましくは、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素はインフルエンザＡ型ウイルスの赤血球凝集素である。他の好ましい実施形態では、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素はインフルエンザＢ型ウイルスまたはインフルエンザＣ型ウイルスの赤血球凝集素である。
一実施形態では、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、ヒトに感染するウイルス由来のサブタイプのものである。好ましくは、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素はＨ１サブタイプのものである。なお一層好ましくは、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素はインフルエンザＡ株ＰＲ／８／３４由来のものである。
一実施形態では、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素はＨ２サブタイプのものである。
一実施形態では、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素はＨ３サブタイプのものである。
一実施形態では、インフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、ヒトに感染しないウイルス由来のサブタイプのものである。
一実施形態では、融合ポリペプチドは、自然界に存在するＧＭ−ＣＳＦ分子のアミノ酸配列全体を含む。
好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦ分子はネズミＧＭ−ＣＳＦである。なお一層好ましくは、ＧＭ−ＣＳＦ分子はヒトＧＭ−ＣＳＦである。
一態様において、本発明は、本発明の多機能性分子または本発明の多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物など、本願明細書に記載のいずれかの組成物を被検体に投与するステップを含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体での腫瘍の転移などの転移数を減らす方法を包含する。一般に、このような組成物は、疾病に関連した抗原またはこのような抗原をコードする核酸をさらに含むことになる。この方法は、本願明細書に記載の組成物を投与する方法、免疫反応を調節する方法または疾病を治療する方法のいずれを含むものであってもよい。
本発明は、抗原を持つ細胞を含み、かつレクチンと細胞表面タンパク質のリガンドとを含む融合タンパク質をさらに含む組成物を、前記動物に投与することを含む、動物で転移数を減らす方法を提供するものである。
本発明で使用する場合、「転移」とは、宿主のひとつの部位から同じ宿主の第２の部位に移動している（ある部位から、この部位とは連続していない他の部位へ、第１の器官から第２の器官へ、など）、悪性細胞または感染生物によって引き起こされる疾病の病巣を示す。具体的には、「転移」とは、疾病の最初の部位から派生し、蔓延し、疾病の最初の部位とは区別される悪性腫瘍または感染の検出可能な病巣を示す。したがって、「転移」とは、被検体の単一の器官または組織あるいは、被検体の２以上の器官または組織における複数の病巣を示す。本発明で使用する「病巣」は、少なくとも単一の悪性または感染性細胞であってもよいし、後述する１以上の方法で検出可能である、検出可能な病巣であってもよい。転移は、後述する１以上のアッセイ方法を用いて当業者が転移を検出できる場合に、検出されると言われる。
本発明によれば、「転移数を減らす」とは、想定されるよりも少ない（少なくとも１０％少ない、２０％、３０％、５０％、７０％、９０％、少なくとも１００％まで少ないなど）転移をそこに引き起こすことを意味し得る（ここで、想定される転移の数または重篤度は、一組（２人以上など）または本発明の多機能性分子を持たない、似たような被検体での観察結果に基づく）。一実施形態では、「転移数を減らす」とは、放射線医学、非観血的画像形成法または本願明細書に記載の他の手法などによって、腫瘍のある被検体などで転移を防ぐ（被検体に疾病の検出可能な病巣が発症しないなど）か、あるいは以前から存在する１以上の転移を検出不能にすることを包含し得る。当業者であれば、残っている瘢痕または線維形成を検出可能であっても転移自体が検出不能になることもあるのは、分かるであろう。転移は、たとえば、骨、脳、肝臓、肺または脊髄、あるいは他のあらゆる器官または組織に対するものがあげられる。
もうひとつの態様において、本発明は、本発明の多機能性分子または本発明の多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物など、本願明細書に記載のいずれかの組成物を１以上の被検体に投与するステップを含む、被検体の個体群において転移数を減らす方法を包含する。一般に、このような組成物は、疾病に関連した抗原またはこのような抗原をコードする核酸をさらに含むことになる。この方法は、本願明細書に記載の組成物を投与する方法、免疫反応を調節する方法または疾病を治療する方法のいずれを含むものであってもよい。
もうひとつの態様では、本発明は、本発明の多機能性分子または本発明の多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物など、本願明細書に記載の組成物のうちいずれかを被検体に投与するステップを含む、被検体で転移のサイズを小さくする方法を包含する。一般に、このような組成物は、疾病に関連した抗原またはこのような抗原をコードする核酸をさらに含むことになる。この方法は、本願明細書に記載の組成物を投与する方法、免疫反応を調節する方法または疾病を治療する方法のいずれを含むものであってもよい。本発明で使用する転移の「サイズ」とは、転移に囲まれた一次元、二次元または三次元のエリアを示すか、そうでなければ転移に存在する悪性細胞または感染性細胞の数を示す。直接的な可視化または非観血的画像形成によって測定できる転移のサイズを、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％、９０％小さくでき、少なくとも１００％まで小さくできる。
本発明は、抗原を持つ細胞を含み、かつレクチンと細胞表面タンパク質のリガンドとを含む融合タンパク質をさらに含む組成物を、前記動物に投与することを含む、動物で転移のサイズを小さくする方法を提供するものである。
もうひとつの態様では、本発明は、本願明細書に記載のいずれかの組成物を被検体に投与するステップを含む、被検体で転移の平均サイズを小さくする方法を包含する。この方法は、本願明細書に記載の組成物を投与する方法、免疫反応を調節する方法または疾病を治療する方法のいずれを含むものであってもよい。本発明によれば、「転移の平均サイズを小さくする」とは、１以上の転移が想定されるサイズまで増殖するのを防ぐなどの方法で、転移を想定されるよりも平均的に小さくさせることか、あるいは１以上のすでに存在する転移を小さくすることで、転移の平均（ｍｅａｎ）サイズを減少させることを意味し得る。直接的な可視化または非観血的画像形成によって求めることができる転移の平均サイズを、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％、９０％小さくでき、少なくとも１００％まで小さくできる。
もうひとつの態様では、本発明は、本発明の多機能性分子または本発明の多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物など、本願明細書に記載のいずれかの組成物を１以上の被検体に投与するステップを含む、個体群で転移の平均サイズを小さくする方法を包含する。この方法は、本願明細書に記載の組成物を投与する方法、免疫反応を調節する方法または疾病を治療する方法のいずれを含むものであってもよい。
よって、もうひとつの態様では、本発明は、本発明の多機能性分子または本発明の多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物など、本願明細書に記載のいずれかの組成物を被検体に投与することで、被検体で疾病を防止または治療することを包含する。一般に、このような組成物は、疾病に関連した抗原またはこのような抗原をコードする核酸をさらに含むことになる。ここでいう疾病とは、たとえば、良性または悪性腫瘍、感染症、アレルギーまたは自己免疫疾患があり得る。「疾病を治療する」とは、患者または疾病に悩む個体群での疾病に伴う羅患率または死亡率を低下させることを意味する。たとえば、生存、再発のない生存または疾病のない生存を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％、９０％延ばすことができ、少なくとも１００％まで延ばすことができたり、転移数を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％、９０％少なくでき、少なくとも１００％まで少なくできる。予防的な用途では、標的疾病の発生率を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、３０％、５０％、７０％、９０％少なくでき、少なくとも１００％まで少なくできる。
さらに別の態様では、本発明は、１）抗原を含み、かつ本発明の多機能性分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原を含み、ステップ１で投与した多機能性分子を含まない（すなわち、これが入っていない）組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。通常は、この２つのステップを、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど、順次行うことになる。一実施形態では、多機能性分子のない組成物よりも前に、多機能性分子を含む組成物を被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、多機能性分子を含む組成物よりも前に、多機能性分子のない組成物を被検体に投与する。組成物の抗原を、細胞、細胞画分、ウイルスまたはウイルス粒子などの抗原保有標的で構成してもよい。
さらに別の態様、本発明は、１）抗原を含み、かつ本発明の多機能性分子をコードする核酸分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原を含み、ステップ１で投与した核酸分子を含まない（すなわち、これが入っていない）組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。繰り返すが、この２つのステップを、通常は、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど順次に行う。一実施形態では、核酸分子を含む組成物を、核酸分子を含まない組成物よりも前に被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、核酸分子が入っていない組成物を、核酸分子を含む組成物よりも前に被検体に投与する。組成物の抗原を、細胞、細胞画分、ウイルスまたはウイルス粒子などの抗原保有標的で構成してもよい。核酸分子については、発現ベクターで構成してもよい。
さらに別の態様では、本発明は、１）抗原をコードする核酸分子を含み、かつ本発明の多機能性分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原をコードする核酸分子を含み、かつステップ１で投与した多機能性分子を含まない（すなわち、これが入っていない）組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。通常は、この２つのステップを、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど、順次行うことになる。一実施形態では、多機能性分子のない組成物よりも前に、多機能性分子を含む組成物を被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、多機能性分子を含む組成物よりも前に、多機能性分子のない組成物を被検体に投与する。組成物の抗原を、細胞、細胞画分、ウイルスまたはウイルス粒子などの抗原保有標的で構成してもよい。１以上の核酸分子を発現ベクターで構成してもよい。
さらに別の態様では、本発明は、１）抗原を含み、かつ本発明の多機能性分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原をコードする核酸分子を含み、かつステップ１で投与した多機能性分子を含まない（すなわち、これが入っていない）組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。通常は、この２つのステップを、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど、順次行うことになる。一実施形態では、多機能性分子のない組成物よりも前に、多機能性分子を含む組成物を被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、多機能性分子を含む組成物よりも前に、多機能性分子のない組成物を被検体に投与する。組成物の抗原を、細胞、細胞画分、ウイルスまたはウイルス粒子などの抗原保有標的で構成してもよい。核酸分子については、発現ベクターで構成してもよい。
さらに別の態様では、本発明は、１）抗原をコードする核酸分子を含み、かつ本発明の多機能性分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原を含み、ステップ１で投与した多機能性分子を含まない（すなわち、これがない）組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。通常は、この２つのステップを、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど、順次行うことになる。一実施形態では、多機能性分子のない組成物よりも前に、多機能性分子を含む組成物を被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、多機能性分子を含む組成物よりも前に、多機能性分子のない組成物を被検体に投与する。組成物の抗原を、細胞、細胞画分、ウイルスまたはウイルス粒子などの抗原保有標的で構成してもよい。核酸分子については、発現ベクターで構成してもよい。
さらに別の態様では、本発明は、１）抗原をコードする核酸分子を含み、かつ本発明の多機能性分子をコードする核酸分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原をコードする核酸分子を含み、ステップ１で投与した、多機能性分子をコードする核酸分子を含まない（すなわち、これが入っていない）組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。繰り返すが、この２つのステップを、通常は、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど順次に行う。一実施形態では、核酸分子を含む組成物を、多機能性分子をコードする核酸分子が入っていない組成物よりも前に被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、多機能性分子をコードする核酸分子が入っていない組成物を、多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物よりも前に被検体に投与する。１以上の核酸分子を発現ベクターで構成してもよい。
さらに別の態様では、本発明は、１）抗原をコードする核酸分子を含み、かつ本発明の多機能性分子をコードする核酸分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原をコードする核酸分子を含み、かつ本発明の多機能性分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。ステップ１およびステップ２の多機能性分子は同一であっても異なっていてもよい。繰り返すが、この２つのステップを、通常は、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど順次に行う。一実施形態では、核酸分子を含む組成物を、多機能性分子をコードする核酸分子が入っていない組成物よりも前に被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、多機能性分子をコードする核酸分子が入っていない組成物を、多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物よりも前に被検体に投与する。１以上の核酸分子を発現ベクターで構成してもよい。
さらに別の態様では、本発明は、１）抗原をコードする核酸分子を含み、かつ本発明の多機能性分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、２）抗原をコードする核酸分子を含み、かつ本発明の多機能性分子をコードする核酸分子をさらに含む組成物を被検体に投与するステップと、を含む、ヒトなどの哺乳類などの被検体で抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。ステップ１およびステップ２の多機能性分子は同一であっても異なっていてもよい。繰り返すが、この２つのステップを、通常は、少なくとも１日あける、または少なくとも１週間あける、または少なくとも１ヶ月あける、または少なくとも６ヶ月あける、または少なくとも１年あけるなど順次に行う。一実施形態では、核酸分子を含む組成物を、多機能性分子をコードする核酸分子が入っていない組成物よりも前に被検体に投与する。もうひとつの実施形態では、多機能性分子をコードする核酸分子が入っていない組成物を、多機能性分子をコードする核酸分子を含む組成物よりも前に被検体に投与する。１以上の核酸分子を発現ベクターで構成してもよい。
本発明は、抗原保有標的に結合可能な第１の構成要素と細胞に結合可能な第２の構成要素とを含む、融合ポリペプチドなどのポリペプチドなどの多機能性分子を含む組成物を投与するステップを含む、動物で免疫反応を調節する方法を包含する。好ましい実施形態では、この組成物は、自己に対する免疫反応が上記組成物の投与によって調節される抗原をさらに含む。抗原は、たとえば、ポリペプチド（組換えポリペプチドなど）、脂質（糖脂質など）または炭水化物（多糖類あるいは、細菌または真菌の細胞壁の成分など）などである。したがって、この組成物には、同種抗原などであるか、細胞またはウイルスなどの異種構造であるかを問わず、抗原保有標的が含まれる。抗原保有標的が細胞である場合、これは動物にとって自家、同系、同種または異種のものであり得る。他の好ましい実施形態では、抗原は上記分子の投与時に動物にすでに存在するおよび／または分子の投与前に動物に抗原を投与する。さらに別の好ましい実施形態では、上記分子の投与後に動物に抗原を投与する。
好ましくは、この組成物は、抗原保有標的に結合していない多機能性分子を含む。好ましい実施形態では、この組成物は、細胞などの抗原保有標的をさらに含む。本発明の一実施形態では、この組成物は、多機能性分子を含み、このうち一部が、細胞の表面といった抗原保有標的に結合し、残りはどの標的からみても外部にあって、どの標的にも結合していない。もうひとつの実施形態では、この組成物は多機能性分子を含み、かつ細胞（すなわち抗原保有標的）の膜画分など、細胞の一部をさらに含む。さらに別の実施形態では、この組成物は多機能性分子を含み、細胞可溶化物に見られるような、細胞由来の多数の異なる分子をさらに含む。細胞を溶解させるには、たとえば、凍結と解凍とを好ましくは繰り返し行えばよい。好ましい実施形態では、組成物は無細胞のものである。
本発明は、レクチンである第１の構成要素と、ＡＰＣの細胞表面受容体など、細胞表面タンパク質のリガンドである第２の構成要素とを含む本発明の多機能性分子を含むワクチン組成物を動物に投与することを含む、選択抗原に対するワクチンを哺乳類に接種する方法をさらに包含する。好ましくは、レクチンが抗原を持つ抗原保有標的に結合可能である。
一実施形態では、本発明は、抗原を持つ少なくとも１つの細胞を哺乳類から取り除き、抗原保有細胞／多機能性分子複合体が形成されるように、抗原保有細胞表面の少なくとも１つの炭水化物分子に結合できる、レクチンである第１の構成要素と、ＡＰＣの細胞表面タンパク質のリガンドである第２の構成要素と、を含む多機能性分子に、細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて接触させ、この複合体を哺乳類に戻すことを含む、選択抗原に対するワクチンを哺乳類に接種する方法を提供するものである。
好ましい実施形態では、この組成物は、自己に対する免疫反応が上記組成物の投与によって調節される抗原を含む。
本発明は、前記抗原を持つ細胞と、レクチンおよび細胞表面タンパク質のリガンドを含む多機能性分子と、を含む組成物を、前記動物に投与することを含む、哺乳類での選択抗原に対する免疫反応を調節する方法を提供するものである。
また、本発明は、選択抗原に対するワクチンを動物に接種する方法であって、前記抗原を持つ少なくとも１つの細胞を前記動物から取り除き、レクチンと抗原提示細胞の細胞表面タンパク質のリガンドとを含む融合ポリペプチドに、複合体が形成されるように前記細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて接触させ、前記複合体を前記動物に戻すことを含む、選択抗原に対するワクチンを動物に接種する方法にも関するものである。
本発明は、ＡＰＣおよび抗原保有標的を、抗原保有標的の少なくとも１つの炭水化物部分に結合できるレクチンを含む第１の構成要素と、ＡＰＣ上の細胞表面タンパク質のリガンドを含む第２の構成要素と、を含む多機能性分子と接触させることを含む、ＡＰＣを抗原保有標的と近接させる方法を提供するものである。好ましくは、最初に多機能性分子を抗原保有標的と接触させ、続いて、このようにして得られる抗原保有標的／多機能性分子複合体をＡＰＣと接触させる。一実施形態では、抗原保有標的は、抗原を持つ動物から得られる細胞であり、細胞の少なくとも１つの炭水化物部分に対するレクチンの結合を可能にする条件下で、ｅｘ ｖｉｖｏにて多機能性分子と接触される。このようにして得られる多機能性分子／抗原保有細胞複合体を、これが多機能性分子のリガンドポーションを介してＡＰＣ上の細胞表面受容体に結合できる場である、抗原保有細胞を採取した動物に投与して戻すことで、抗原保有標的とＡＰＣとを近接させる。
本発明の文脈における「近接」には、物理的な接触を含むがこれに限定されるものではない。ＡＰＣと抗原保有標的は、ＡＰＣにとって抗原保有標的を内在化できる程度に十分近くにあれば、互いに「近接した」状態である。また、ＡＰＣと抗原保有標的は、相互間の距離が２０μｍ以内、好ましくは１０μｍ以内、なお一層好ましくは５μｍ以内、一層好ましくは１μｍ以内のときに、「近接した」状態である。
本発明で使用する場合、「接触させる」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで混合することを示す。
また、本発明は、抗原保有標的、本発明の多機能性分子、ＡＰＣをｉｎ ｖｉｔｒｏにて接触させ、得られる組成物を被検体に投与することを含む、抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。一実施形態では、ＡＰＣによる抗原保有標的の内部移行が可能なだけの十分な時間、抗原保有標的／多機能性分子複合体をＡＰＣと接触させる。他の実施形態では、ＡＰＣによる抗原保有標的の約８０％未満、約６０％未満、約４０％未満、約２０％未満、約１０％未満または約５％未満の内部移行を可能にできるだけの時間、抗原保有標的／多機能性分子複合体をＡＰＣと接触させる。ＡＰＣの外に残っている量を測定して最初の量から減算するなどして、標的の内部移行量を求めるための方法が、従来技術において周知である。好ましくは、約１０分未満、約３０分未満、約６０分未満、約９０分未満、約１２０分未満または約１８０分未満の時間、抗原保有標的／多機能性分子複合体をＡＰＣと接触させる。
本発明で使用する場合、「内部移行が可能なだけの十分な時間」とは、ＡＰＣによる選択抗原または抗原保有標的の内部移行を可能にできる十分な長さの時間（たとえば、約１４日以内または７日以内、あるいは５日間または３日間、あるいはわずか約２４時間、１２時間、６時間、３時間、２時間または１時間、あるいは実にわずか約３０分間、２０分間、１０分間、５分間または１分間）を示す。
また、本発明は、リガンドを含む多機能性分子と抗原保有標的とを混合することを含む、細胞表面ポリペプチドのリガンドを抗原保有標的に付着させる方法を包含する。また、本発明は、アミノ酸配列を含み、かつレクチンをさらに含む融合ポリペプチドと抗原保有標的とを混合することを含む、アミノ酸配列を抗原保有標的に付着させる方法を包含する。また、本発明は、レクチンではない第１のアミノ酸配列とレクチンを含む第２のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドと混合された抗原保有標的を含む組成物を包含する。
また、本発明は、酵母細胞、哺乳類細胞、細菌細胞、昆虫細胞の各細胞タイプで本発明の多機能性分子を生成する方法を含む。これらの方法は各々、多機能性分子をコードする核酸を、以下で教示するようにしてそれぞれの細胞タイプに導入するステップを含む。
また、本発明は、多機能性分子に結合する抗体または他のリガンドと多機能性分子を接触させることを含む、本発明の多機能性分子を検出または定量化する方法を包含する。このような方法としては、後述するＥＬＩＳＡアッセイおよびフローサイトメトリがあげられる。好ましくは、検出または定量化対象となる多機能性分子を抗原保有標的に結合させる。
詳細な説明
本発明は、レクチンである第１のポリペプチドとＡＰＣの細胞表面受容体のリガンドである第２のポリペプチドとを含む多機能性融合タンパク質が、ＡＰＣに対する関心の的である抗原を持っている細胞などの抗原保有標的を効果的に標的できるという発見に、ある意味では立脚している。抗原はＡＰＣに貪食され、多機能性分子の投与対象となる動物によって抗原に対する適切な免疫反応が開始される。
したがって、本発明は、抗原を持つ標的に結合可能な、レクチンである第１の構成要素と、ＡＰＣの細胞表面タンパク質のリガンドである第２の構成要素と、を含む本発明の多機能性分子を含むワクチン組成物を動物に投与することを含む、哺乳類にワクチンを接種するための方法を提供するものである。一実施形態では、この方法は、抗原を持つ少なくとも１つの細胞を哺乳類から取り除き、抗原保有細胞／多機能性分子複合体が形成されるように、抗原保有細胞表面の少なくとも１つの炭水化物分子に結合できる、レクチンである第１の構成要素と、ＡＰＣの細胞表面タンパク質のリガンドである第２の構成要素と、を含む多機能性分子に、細胞をｅｘ ｖｉｖｏにて接触させ、この複合体を哺乳類に戻すことを含む。
多機能性分子
本発明は、抗原保有標的に結合可能な第１の構成要素と、抗原提示細胞などの細胞の細胞表面タンパク質のリガンドである第２の構成要素と、を含む多機能性分子を包含する。好ましくは、抗原保有標的に結合可能な第１の構成要素は、抗原保有標的上に存在する少なくとも１つの炭水化物分子に結合するレクチンである。好ましくは、レクチンはインフルエンザの赤血球凝集素であり、抗原保有標的上に存在するシアル酸残基に結合する。好ましくは、抗原提示細胞の細胞表面タンパク質のリガンドは、オプソニン、サイトカイン、ＣＤ４０分子のリガンド、接着分子、デフェンシン、熱ショックタンパク質またはＴ細胞共刺激分子のカウンターレセプタから選択されるものである。多機能性分子の第２の構成要素の受容体として作用できる細胞表面分子としては、ＣＤ４０分子ならびに、オプソニン、サイトカイン、接着分子、デフェンシン、熱ショックタンパク質またはＴ細胞共刺激分子のカウンターレセプタに特異的な受容体があげられ、また、添付書類ＩおよびＩＩに列挙した細胞表面分子もあげられるが、これに限定されるものではない。
レクチン
第１および第２の構成要素を含む多機能性分子は、レクチンを含む第１の構成要素と、単球系の細胞または樹状細胞（それ自体が単球系のものであってもよい）などのＡＰＣなどの白血球に結合可能な第２の構成要素を含み得る。本発明での「レクチン」は、分子であるか、アミノ酸配列など分子の一部であり、多糖類などの炭水化物に結合可能である。自然界に存在するレクチンのファミリとしては、以下のものがあげられる。
１） 急速に家系を拡げつつある動物レクチンであるガレクチン。どのガレクチンもガラクトース特異性を持つ。
２） カルシウム依存性（Ｃ型）動物レクチンすなわち、多様な構造と機能を持つメンバで構成される非常に大きな家系。
３） このＣ型レクチンファミリのうち、シアリル−ルイスＸを認識して白血球を内皮細胞に接着させる特異的な機能が特徴であるサブファミリがセレクチンである。
４） Ｃ型レクチンのもうひとつのサブファミリであるコレクチンは、マンノースに特異性を示し、Ｃ型レクチンドメインとコラーゲン様ドメインからなるユニークな構造を持つ。コレクチンは自然免疫に関与している。
５） 無脊椎動物の体液中には、生体防御因子と考えられる多種多様なレクチンが存在することが分かっている。最近になって、刺皮動物のレクチンの中には溶血活性を示すものがあることが判明している。
６） 最近になってグリコサミノグリカンに一定の結合性を示すレクチンであることが分かった、脂質に親和性を持つ一群のタンパク質であるアネキシン。
７） 多様な糖類特異性がＣ型レクチンに匹敵する、ＣｏｎＡなどの多数のメンバで構成されるマメ科レクチン家系。
８） １００年以上前にロシアで研究調査の対象となっていた最初のレクチンであるリシン。現在では、リシン家系には毒性と糖結合特異性のいずれかが異なる他の相応のメンバが多くあることが分かっている。
よって、本発明の多機能性分子は、１以上の炭水化物に結合できる。レクチンの結合先となり得る炭水化物としては、たとえば、ラクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース（α−Ｌ−フコースなど）、Ｄ−ガラクトース、血液型Ａ型のオリゴ糖、血液型Ｂ型のオリゴ糖を含む炭水化物、α−Ｄ−Ｇａｌ（１−＞３）［α−Ｌｆｕｃ（１−＞２）］−β−Ｄ−Ｇａｌ（１−＞３／４−β−Ｄ−ＧｌｃＮＡｃを含む糖類、α−シアリル［２−＞３］−ラクトース、α−Ｄ−マンノシル複合糖質、α−ＮｅｕＮＡｃ−［２−＞６］−Ｇａｌ、α−ＮｅｕＮＡｃ−［２−＞６］−ＧａｌＮＡｃ、α−ＮｅｕＮＡｃ−［２−＞３］−Ｇａｌ、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン、末端α−Ｄ−ガラクトシル残基、末端β−Ｄ−ガラクトシル残基、Ｎ−アセチルラクトサミン、末端α−Ｄ−マンノシル残基、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミン、末端Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、末端α−Ｄ−ガラクトサミニル残基を含む糖類もあげられる。
レクチンを含む多機能性分子は、たとえば、自然界に存在するレクチン全体あるいは、自然界に存在するポリペプチドレクチンの約（または少なくとも約）５、８、１０、１２、１５、２０、２５、３５、５０、６０、７０、８０、１００または１２０の連続したアミノ酸など、自然界に存在するレクチンの一部を含み得る。一実施形態では、多機能性分子は自然界に存在するレクチンの炭水化物結合ドメインすなわち、残りのレクチンの非存在下で炭水化物に結合可能なレクチンの一部を含む。もうひとつの実施形態では、レクチンは、分子の人工ライブラリから同定されたものや、自然界に存在するレクチンの構造を一部変更して設計されたものなど、自然界に存在しないものであってもよい。
「赤血球凝集素」として知られるレクチンは、血液型抗原など、赤血球上の炭水化物に結合し、これらの細胞と一緒にインキュベートされたときに細胞を凝集させるものである。インフルエンザウイルスの赤血球凝集素は、たとえば、シアル酸に結合する。インフルエンザ赤血球凝集素のサブタイプには、それぞれに異なる抗原特性で規定される少なくとも１５種類が知られている。Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５などと表記されるこれらのサブタイプのいずれにおいても、本発明の組成物および方法において有用なアミノ酸配列が得られる。本発明の一実施形態では、赤血球凝集素は、Ｈ１、Ｈ２またはＨ３など、ヒトに感染するウイルス由来のサブタイプのものである。もうひとつの実施形態では、赤血球凝集素は、Ｈ４乃至Ｈ１５のうちのひとつなど、ヒトに感染しないウイルス由来のサブタイプのものである。アミノ酸配列は、特定のサブタイプの範囲内でインフルエンザ赤血球凝集素で約２０％まで変えることができ、サブタイプが異なればインフルエンザ赤血球凝集素で約３０％から約７０％変えることができる。アミノ酸配列の相同性を求めるための方法は当業者間で周知である。赤血球凝集素バリアント（または本願明細書に開示の多機能性分子のいずれかのポーションのバリアント）間の配列比較を行って同一率（％）を求めることのできる他のソフトウェアの例として、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９５、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、４０３〜４１０）、比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳのスイートがあげられるが、これに限定されるものではない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡはいずれも、オフラインおよびオンラインでの検索が可能である。
最終的な相同率（％）は同一性の観点から測定可能であるが、アライメントプロセス自体は、いちかゼロかのペア比較に基づくものではないのが普通である。むしろ、通常は化学的類似性または進化距離を基準にした一組ずつの比較結果にスコアを割り振る、一定率の類似性スコアマトリクスが用いられる。一般に用いられている、このようなマトリクスの一例に、ＢＬＡＳＴのスイートプログラムのデフォルトのマトリクスであるＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスがある。ＧＣＧウィスコンシンプログラムでは、公開されているデフォルト値を用いるか、特注のシンボル比較テーブルがある場合はこれを用いるのが普通である。ＧＣＧパッケージでは公開されているデフォルト値を、他のソフトウェアの場合はＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリクスを用いるのが好ましい。
パラメータをデフォルト値に設定してＢＬＡＳＴアルゴリズムを利用すると都合がよい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムについては、本願明細書に援用する、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０に詳細に説明されている。検索パラメータは、以下のとおり定義して既定のデフォルトパラメータに都合よく設定することが可能である。
ＢＬＡＳＴで評価した場合の「実質的な同一性」を、ＥＸＰＥＣＴ値が少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９、最も好ましくは１０またはそれ以上にマッチする配列と同等であるとみなすと都合がよい。ＢＬＡＳＴ検索でのＥＸＰＥＣＴのデフォルト閾値は、通常は１０である。
ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）は、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、ｔｂｌａｓｔｘの各プログラムで利用されるヒューリスティックな検索アルゴリズムである。これらのプログラムでは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの統計的な方法（ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ １９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４〜６８；ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜７）をいくつか強化したものを用いて得られる、その検索結果に有意性があるとされる。このＢＬＡＳＴプログラムは、たとえばクエリ配列との相同を特定する目的で配列の類似性検索ができるように調整されている。配列データベースの類似性検索における基本的な事項に関する説明については、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９４）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ６：１１９〜１２９を参照のこと。
米国国立衛生研究所（ＮＩＨ；メリーランド州ベテスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ））をとおして入手可能な５種類のＢＬＡＳＴプログラムは、次のようなタスクを実行するものである。ｂｌａｓｔｐはアミノ酸のクエリ配列をタンパク質配列データベースと比較する。ｂｌａｓｔｎはヌクレオチドクエリ配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。ｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチドクエリ配列を６つの読み枠で概念翻訳して得られる産物（両鎖）をタンパク質配列データベースと比較する。ｔｂｌａｓｔｎは、タンパク質クエリ配列を、６つすべての読み枠（両鎖）で動的に翻訳したヌクレオチド配列データベースと比較する。ｔｂｌａｓｔｘは、ヌクレオチドクエリ配列を６つの読み枠で翻訳し、ヌクレオチド配列データベースを６つの読み枠で翻訳したものと比較する。
ＢＬＡＳＴでは以下の検索パラメータが用いられる。
ＨＩＳＴＯＧＲＡＭ−検索ごとのスコアの分布表を表示。デフォルトはイエス（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＨを参照のこと）。
ＤＥＳＣＲＩＰＴＩＯＮＳ−マッチしている配列の簡単な説明をいくつまで出力するかを指定。デフォルトの上限は１００件（マニュアルページのパラメータＶを参照のこと）。
ＥＸＰＥＣＴ−データベース配列に対してマッチする結果を出力する際の統計的有意性に関する閾値。ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌの確率モデル（１９９０）によれば、単なる偶然で１０件のマッチが考えられるため、デフォルト値は１０になっている。マッチの統計的有意性がＥＸＰＥＣＴで設定した閾値よりも大きい場合は、そのマッチは出力されない。ＥＸＰＥＣＴの閾値を小さくすればするほどストリンジェントになり、一致する結果が出力される可能性は低くなる。小数値も入力可能である（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＥを参照のこと）。
ＣＵＴＯＦＦ−ハイスコアセグメントペアを出力するためのカットオフスコア。デフォルト値はＥＸＰＥＣＴ値から計算で求められる（上記参照）。あるデータベース配列についてのＨＳＰが出力されるのは、これらのＨＳＰの統計的有意性が、ＣＵＴＯＦＦと同じ値のスコアを持つひとつのＨＳＰの統計的有意性の高さ以上であった場合に限られる。ＣＵＴＯＦＦ値が大きくなればなるほどストリンジェントになり、マッチが出力される可能性は低くなる（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＳを参照のこと）。一般に、有意性の閾値についてはＥＸＰＥＣＴを利用してより一層直感的に運用することが可能である。
ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ−ハイスコアセグメントペア（ＨＳＰ）を出力するデータベース配列の数を指定。デフォルトの上限は５０である。この値を上回る数で統計的有意性の閾値を満足するデータベース配列があれば（後述するＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦを参照のこと）、統計的有意性が最も高いマッチだけが出力される（ＢＬＡＳＴマニュアルのパラメータＢを参照のこと）。
ＭＡＴＲＩＸ−ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸについて置換スコア行列を指定。デフォルトの行列はＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２）である。有効な置換の選択肢には、ＰＡＭ４０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０およびＩＤＥＮＴＩＴＹがある。ＢＬＡＳＴＮでは置換スコア行列は利用できない。ＢＬＡＳＴＮのリクエストでＭＡＴＲＩＸを指定すると、エラー応答が返される。
ＳＴＲＡＮＤ−ＴＢＬＡＳＴＮ検索をデータベース配列のトップまたはボトムちょうどに制限するか、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸまたはＴＢＬＡＳＴＸの検索をクエリ配列のトップストランドまたはボトムストランドの読み枠ちょうどに制限。
ＦＩＬＴＥＲ−Ｗｏｏｔｔｏｎ＆Ｆｅｄｅｒｈｅｎ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１４９〜１６３によるＳＥＧプログラムで求めた構造の複雑度が低いクエリ配列のセグメント、あるいは、Ｃｌａｖｅｒｉｅ＆Ｓｔａｔｅｓ（１９９３）Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１９１〜２０１によるＸＮＵプログラム（ＢＬＡＳＴＮ使用時にはＴａｔｕｓｏｖおよびＬｉｐｍａｎ（ＮＩＨ）のＤＵＳＴプログラム）で求めた、周期の短い内部反復からなるセグメントをマスクする。フィルタリングを行うことで、統計上は有意であるが生物学的には無意味な結果をｂｌａｓｔの出力（一般的な酸性リッチ領域、塩基性リッチ領域またはプロリンリッチ領域にあたるヒット結果など）から除外し、データベース配列との間の特定のマッチングに対して得られる、クエリ配列の生物学的に意味の大きな領域を残すことが可能である。
フィルタプログラムによって見出された低複雑度配列は、ヌクレオチド配列の場合は「Ｎ」の文字（「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」など）タンパク質配列の場合は「Ｘ」の文字（「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」など）で置き換えられる。
フィルタリングはクエリ配列（またはその翻訳産物）にのみ適用され、データベース配列には適用されない。デフォルトのフィルタリングは、ＢＬＡＳＴＮではＤＵＳＴ、他のプログラムではＳＥＧである。
ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴの配列に適用した場合、ＳＥＧ、ＸＮＵ、あるいはその両方でも全くマスクされないことが珍しくないため、フィルタリングが常に功を奏すると考えるべきではない。さらに、場合によっては配列全体がマスクされる場合もあり、これはフィルタリングされていないクエリ配列に対して出力されるマッチの統計的有意性が疑わしいことを意味する。
ＮＣＢＩ−ｇｉ−受託および／またはローカス名に加えて、出力にＮＣＢＩ ｇｉ識別子を表示させる。
最も好ましくは、ＮＩＨから提供されている単純なＢＬＡＳＴ検索アルゴリズムで配列比較を行う。本発明のいくつかの実施形態では、配列の同一性を求めるにあたってギャップペナルティを使用しない。
インフルエンザ赤血球凝集素は、翻訳後に三量体形成する、ＨＡ０という単一のポリペプチド鎖として発現される。ＨＡ０は、タンパク質分解的に開裂されてＨＡ１およびＨＡ２という２つのドメインになり、これが互いにジスルフィド結合されている。ＨＡ１が有意なシアル酸結合活性を持つのに対し、ＨＡ２はウイルス膜に固着してこの膜と宿主細胞膜とを融合しやすくする。本発明の好ましい実施形態では、第１および第２の構成要素を含む多機能性分子が、ＨＡ１ドメインのアミノ酸配列を有する。
本発明において有用なレクチン分子の別の例として、表１に示すレクチンならびに、表１に示すレクチンの配列との配列相同性が少なくとも５０％、７０％、９０％、９９％までである、上記レクチンのバリアントがあげられるが、これに限定されるものではない。
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レクチンコードは次のような形式をとる。
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それぞれのインデックス変数の意味は以下のとおりである。
ＬＬＬはアグルチニンの総合カテゴリを示す。現時点では、レクチン（ＬＥＣ）、インテグリン（ＩＮＴ）、カドヘリン（ＣＤＨ）、アネキシン（ＡＮＮ）、セレクチン（ＳＥＬ）、ガレクチン（ＧＬＴ）の６つの総合カテゴリが確認されている。ｘ値はアグルチニンの分類群を示し、表１にこれらのカテゴリをまとめておく。
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Ｇｇｇは植物の属名（ラテン語）の最初の３文字を表す。
Ｓｓｓは植物の種名（ラテン語）の最初の３文字を表す。
ｔｉはレクチンの単離元となった組織を示す。さまざまな組織にあてたインデックスを表２にまとめておく。
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Ｔはレクチンサブタイプを示す。ホロレクチン（ｈｏｌｏｌｅｃｔｉｎ）、メロレクチン（ｍｅｒｏｌｅｃｔｉｎ）、キメロレクチン（ｃｈｉｍｅｒｏｌｅｃｔｉｎ）、スーパーレクチン（ｓｕｐｅｒｌｅｃｔｉｎ）をそれぞれＨ、Ｍ、Ｃ、Ｓの文字で示す。
ｓｐは特異性群を示す。各群を表３に示すインデックスで表す。
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脂質
また、本発明の多機能性分子は、脂質を含む第１の構成要素と、ＡＰＣの細胞表面分子などの細胞表面分子に結合可能なアミノ酸配列を含む第２の構成要素と、を含む分子であっても構わない。長鎖脂肪酸などの脂質がポリペプチドなどの分子に付着することで、複合体を細胞と混合したときに複合体を安定して形質膜に会合させることができる（Ｎａｇａｒａｊａｎら、１９９５、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：２４１〜５１；ＭｃＨｕｇｈら、１９９５、ＰＮＡＳ ９２：８０５９〜６３；ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｒｇら、１９９５、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ、１３１：６６９〜７７）。これは、脂質が膜内に相互作用することで起こると考えられている。脂質会合ポリペプチドを生成する都合のよい方法のひとつに、ＧＰＩ部分の翻訳後付加を指示するシグナル配列をいくぶんコードする核酸を適当な宿主細胞で発現させることがある。組換えＤＮＡテクノロジーを利用すれば、異種ＧＰＩシグナル配列に連結するタンパク質をコードする核酸を構築して、自然な状態では非ＧＰＩ連結タンパク質であるものをＧＰＩ連結タンパク質として発現することが可能である。この目的に役立つ、ＧＰＩシグナル配列をコードするヌクレオチド配列には、たとえば、補体制御因子（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２２」をコードする配列；Ｃａｒａｓら、米国特許第５，１０９，１１３に開示されたシグナル配列をコードする配列など）；ブレビカン（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ８６４０６のｎｔ１９８２〜２０４７など）、メソセリン（ＧｅｎＢａｎｋＵ４０４３４のｎｔ１８５８〜１９８３など）、コクシジオイデスイミティス抗原２（ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号１２５６４４４のアミノ酸１７２〜１９４をコードする配列、Ｚｈｕら、１９９６、Ｇｅｎｅ １８１：１２１〜５など）、アセチルコリンエステラーゼ（Ｄｕｖａｌら、１９９２、ＥＭＢＯ Ｊ １１：３２５５〜６１に記載されているようなペプチド「ＨＣ」をコードする配列；（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１９」をコードする配列など）など）、ヒト葉酸受容体αおよびβ（ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号１８２４１６のアミノ酸２３０〜２５７またはＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号１６５５５９２アミノ酸２２８〜２５５をコードする配列、ＹａｎおよびＲａｔｎａｍ、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１４５９４〜６００など）、５’ヌクレオチダーゼ（ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号４０４５０２のアミノ酸５４７〜５７０または５４７〜５７４をコードする配列、Ｆｕｒｕｋａｗａら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １１９０：２７３〜８；（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「５」または「６」をコードする配列など）など）、ＣＤ５９（ＧｅｎＢａｎｋＵ４８２５５のｎｔ３９３〜４７３によってコードされる；ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２０」をコードする配列；Ｐｏｗｅｌｌら、１９９７、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：１６９２〜１７０２の図２のアミノ酸７４〜１０１をコードする配列など）、Ｔ−カドヘリン（ＫｏｌｌｅｒおよびＲａｎｓｃｈｔ、１９９６、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：３００６１〜７に記載されているようなヒヨコＴカドヘリンの７６個のＣ末端アミノ酸をコードする配列など）、アミノペプチダーゼＰ（ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号１５１７９４２のアミノ酸６４９〜６７３をコードする配列、Ｈｙｄｅら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３１９：１９７〜２０１など）、カルボキシペプチダーゼＭ、ＣＤ１６Ｂ、Ｔｈｙ １、炭酸脱水酵素ＩＶ（ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号１７９７９１のアミノ酸２８４〜３１２をコードする配列、Ｏｋｕｙａｍａら、１９９５、Ａｒｃｈ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ ３２０：３１５〜２２など）、胎盤アルカリホスファターゼ（ＮＣＢＩのＥｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号１７８４６４のアミノ酸４９８〜５２９をコードする配列、Ｏｄａら、１９９４、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３０１：５７７〜８３など）、神経糖タンパク質Ｆ３、癌胎児抗原（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２８」をコードする配列など）、ＭＲＣ−ＯＸ４５（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２」をコードする配列など）、ＲＴ ６．２（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「３」をコードする配列）、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ予定胞子細胞特異的抗原（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「４」をコードする配列など）、ミクロソームジペプチダーゼ（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「８」をコードする配列など）、ＣＡＭＰＡＴＨ−１（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「９」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＰＡＲＰ（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１０」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ Ｍｉｔ １１８ａ（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１１」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ Ｍｉｔ １１７ａ（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１２」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ ＭＩＴａｔ １．１０００ ＢＣ（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１３」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ ＭＩＴａｔ １．５ｂ（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１４」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ ＩＬＴａｔ １．１（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１５」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ ＴｘＴａｔ １（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１６」をコードする配列など）、Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ ＶＳＧ Ｍｉｔ ２２１（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１７」をコードする配列など）、プリオンタンパク質（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「１８」をコードする配列など）、ウロキナーゼ受容体（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２１」をコードする配列など）、Ｔ．ｃｏｎｇｏｌｅｎｓｅ ＶＳＧ ＹＮａｔ １．１（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２３」をコードする配列など）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ ＧＡＳ−１（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２４」をコードする配列など）、Ｔｈｙ−１（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２５」または「２６」をコードする配列など）、Ｌ．ｍａｊｏｒ ＰＳＰ（ＢｕｃｈｔおよびＨｊａｌｍａｒｓｓｏｎ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １２９２：２２３〜３２の表１のアミノ酸配列「２９」をコードする配列など）、Ｄ．ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ接触部位Ａ糖タンパク質（Ｂａｒｔｈら、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３１７：５３３〜４０に記載されているような２５個のＣ末端アミノ酸をコードする配列）ＣＤ２４および合成配列（Ｃｏｙｎｅら、１９９３、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６８：６６８９〜９３に記載されているものなど）で構成されるものがある。
以下の方法で細胞からＧＰＩ連結ポリペプチドを抽出することができる。５×１０６個の細胞を遠心沈殿し、−８０℃で凍結する。ペレットを、１４ｍｌの０．１５Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス７．４／０．１ｍＭプリマキン／２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４中で撹拌しながら０℃で１時間かけて解凍した後、０℃で１０分間８８００ｇで遠心する。上清を−２０℃で一晩維持し、室温にて解凍した後、３２℃で１２分間放置する。続いて、３２℃で３分間３０００ｇで遠心する。上層をデカントし、１１ｍｌの冷緩衝液Ａ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ／１０ｍＭトリス７．４／０．１ｍＭプリマキン／０．０６％トリトンＸ−１１４）を底層に加える。これを氷上にて１０分間インキュベートする。３２℃で１２分間インキュベーション、３２℃で３０００ｇの遠心、上層のデカント、１１ｍｌの冷緩衝液Ａの底層への添加を繰り返す。この溶液を０℃で１０分間１８０００ｇで遠心する。３２℃で１２分間インキュベーション、３２℃で３０００ｇの遠心、上層のデカントを繰り返す。最終底相に３容量の冷アセトンを加える。この溶液を１２，０００ＲＰＭで３０分間遠心し、上清を取り除き、ＧＰＩ画分を含むタンパク質ペレットを真空下で乾燥させる。イムノアフィニティ精製などの当業者間で周知の方法で特異的タンパク質を精製可能である。
脂質連結ポリペプチドを生成するもうひとつの方法に、ポリペプチドをパルミテートなどの脂肪酸に化学的に連結させることがある。１．５ｍｇ／ｍｌのポリペプチドを、０．３％デオキシコール酸と、０．１％重炭酸ナトリウムと、０．１％アジ化ナトリウムとを含有するｐＨ７．８のＰＢＳに懸濁させる。溶液の最適な最終ｐＨは、７．６〜８．０である。この混合物を３７℃まで温め、最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるまでパルミチン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ、オハイオ州クリーブランド（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ））を加える。この溶液を一晩室温でインキュベートする。ｐＨ７．６のＰＢＳに入れた０．１５％デオキシコール酸で平衡化した１６×２５０ｍｍのセファデックスＧ−７５クロマトグラフィカラムに通して、ポリペプチドを精製する。
本発明で有用な架橋部分
リガンドを抗原保有標的に連結させるのに都合の良い別の方法に、架橋剤を使用することがある。「架橋剤」とは、この架橋剤との反応時に２つの分子が共有結合的に連結されるような形で、２つのポリペプチドまたはポリペプチドと脂質など、少なくとも２つの他の分子の官能基と反応できる化学的実体のことである。よって、ＣＤ４０のリガンドは、細胞表面上の分子に架橋することができる。
二官能性と多官能性の両方で多種多様な架橋剤が従来技術において周知であり、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））などから市販されている。このような架橋剤としては、たとえば、Ｓ−アセチルメルカプトコハク酸無水物、Ｓ−アセチルチオグリコール酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｓ−アセチルチオプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アジピン酸ジヒドラジド、４−アジド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−（５−アジド−２−ニトロベンジルオキシ）スクシンイミド、６−（４−アジド−２−ニトロフェニルアミノ）ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ｐ−アジドフェナシルブロミド、Ｎ−（４−アジドフェニルチオ）フタルイミド、４−アジドサリチル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ブロモ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル、カルボニル−ビス（Ｌ−メチオニンｐ−ニトロフェニルエステル）、２−ジアゾ−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸ｐ−ニトロフェニルエステル、ジエチルマロンイミデート、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸、ジメチルアジピミデート、ジメチル３，３’−ジチオビスプロピオンイミデート、ジメチルピメリミデート、ジメチルスベリミデート、４，４’−ジチオビスフェニルアジド、ジチオビス（プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、エチレングリコールビス−（コハク酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）、４−フルオロ−３−ニトロフェニルアジド、ビス−（４−フルオロ−３−ニトロフェニル）スルホン、ｐ−ホルミル安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、グルタルアルデヒド、２−イミノチオラン、６−（ヨードアセトアミド）カプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ヨード酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−マレミド酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３−マレミド安息香酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（Ｎ−マレミド）ベンゾフェノン、γ−マレミド酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ε−マレミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（Ｎ−マレミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、４−（Ｎ−マレミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸３−スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、β−マレミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ，Ｎ’−ビス（３−マレミドプロピオニル）−２−ヒドロキシ−１、３−プロパンジアミン、１，４−フェニレンジイソチオシアネート、Ｎ，Ｎ’−ｏ−フェニレンジマレミド、Ｎ，Ｎ’−ｐ−フェニレンジマレミド、ポリオキシエチレンビス（グリシジルエーテル）、ビス（ポリオキシエチレンビス（グリシジルエーテル））、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ビス（ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル））、ポリオキシエチレンビス（ｐ−ニトロフェニルカーボネート）、３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スベリン酸ビス（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステル、コハク酸マレミドエチルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、１，５ビス（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）−ペンタン、ビス（Ｎ−スクシンイミジル）カーボネートがあげられる。
細胞表面タンパク質のリガンド
本発明の多機能性分子は、抗原保有標的上の少なくとも１つの炭水化物分子に結合可能なレクチンである一構成要素と、抗原提示細胞の細胞表面タンパク質のリガンドを含む第２の構成要素とを含む。このリガンドは、添付資料ＩまたはＩＩにおいてＧｅｎＢａｎｋ受託番号で示した１以上の細胞表面分子に結合するものであれば、どのようなリガンドであってもよい。しかしながら、一層好ましくはリガンドとしてオプソニン、サイトカイン、熱ショックタンパク質、接着分子、デフェンシンまたはＴ細胞共刺激分子のカウンターレセプタ；あるいは、約（または少なくとも約）５、８、１０、１２、１５、２０、２５、３５、４０、５０、６０、７０、８０、１００または１２０の連続したアミノ酸残基、このような分子の全長までなど、上記いずれかの分子の一部があげられるが、これに限定されるものではない。
本発明で有用なサイトカイン
上記にて定義した「サイトカイン」という用語は、哺乳類の細胞から自然に分泌され、白血球の細胞表面受容体に結合するポリペプチド分子を示す。また、本願明細書では、「サイトカイン」とは自然界に存在するサイトカインの受容体のリガンドであるポリペプチド分子も示す。オプソニンとは異なり、サイトカインは自然な状態では抗原と細胞表面受容体とに同時に結合することはない。
サイトカインの受容体を持つ白血球としては、たとえば、単球、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、血小板、リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ＮＫ細胞、骨髄腫細胞、リンパ腫細胞、白血病細胞があげられる。
いずれの機序にも拘泥することなく、細胞表面関連サイトカインでは、サイトカインが細胞に対して安定的に近接できるようになり、細胞近辺のサイトカイン濃度が高まることから、自由に拡散可能なサイトカインにはない利点が得られると考えられている。
ヒトサイトカインなどの霊長類など、齧歯目以外のサイトカインが好ましいサイトカインである。
サイトカインのなかには、構造および／または機能的な特性に基づくと１以上のサイトカインファミリに属するとみなせるものがある。このようなファミリのひとつがインターロイキンからなるものである。インターロイキン類は構造的には多様であるが、白血球によって発現され、かつ白血球に作用するという共通の特性を持っている。インターロイキンの例としては、ＩＬ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ１５３３０、Ｍ２８９８３、Ｅ０４７４３、Ｍ１５１３１でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｅ０１１０８、Ｋ０２７９７でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ａ０２０４６、Ｍ１４７４３でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−４（Ｍ１３９８２、Ｍ２５８９２でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−５（Ｘ０６２７０、Ｊ０３４７８でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−６（Ｅ０２７７２、Ｍ２０５７２でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−７（Ｊ０４１５６、Ｍ２９０５４−２９０５７でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−８（Ｍ２８１３０でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−９（Ｋｅｌｌｅｈｅｒら、Ｂｌｏｏｄ．１９９１；７７：１４３６〜１４４１、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９０；３１（４）：２６５〜２７０に開示された配列など）、ＩＬ−１０（Ｍ８４３４０、Ｕ１６７２０でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−１１（Ｐａｕｌら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９０；８７：７５１２〜７５１６、Ｍｏｒｒｉｓら、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９６；２４：１３６９〜１３７６に開示された配列など）、ＩＬ−１２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ８６６７１、Ｓ８２４１２でコードされるポリペプチド；ＧｅｎＢａｎｋタンパク質Ｐ２９４５９、Ｐ２９４６０など）、ＩＬ−１３（Ｕ３１１２０、Ｌ１３０２８でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−１４（Ａｍｂｒｕｓら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）１９９３；９０：６３３０〜４に開示された配列など）、ＩＬ−１５（ＡＦ０３１１６７、Ｕ２２３３９でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−１６（ＡＦ００６００１、Ｍ９０３９１でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−１７（Ｕ３２６５９、Ｕ４３０８８でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−１８（Ｄ４９９４９、Ｄ４９９５０でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−１９（ＡＹ０４０３６７でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−２０（ＮＭ０２１３０、ＮＭ０１８７２４でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−２１（ＡＦ２５４０６９、ＡＦ２５４０７０でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−２２（ＡＦ２７９４３７でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−２３（ＡＦ３０１６１９、ＡＦ３０１６２０、ＡＹ０５５３７９［ｐ１９α鎖とＩＬ−１２ ｐ４０鎖との組み合わせでＩＬ−２３が形成される］でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−２４（ＡＦ２７６９１６、ＮＭ０５３０９５でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ−２５（ＮＭ０８０８３７でコードされるポリペプチドなど）、ＴＮＦ−α（Ｍ１６４４１、Ｙ００４６７でコードされるポリペプチドなど）、ＧＭ−ＣＳＦ（Ｘ０３０１９、Ｍ１１２２０でコードされるポリペプチドなど）ならびに種の中でのこれらの相同体があげられる。相同体をコードするヌクレオチド配列をストリンジェンシーが中程度から高い条件下で互いにハイブリダイズさせる。
他にヘマトポエチンからなるファミリもある。このファミリのメンバは、ヘリックスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄとして知られる螺旋領域を含む。ヘリックスＡとＣ、ヘリックスＢとＤが互いにおおむね平行になっている。ヘマトポエチンの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｅ０１２１９、Ｍ１３９２６でコードされるポリペプチドなど）、オンコスタチンＭ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｄ３１９４２でコードされるポリペプチド、Ｍａｌｉｋら、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９８９、９：２８４７−２８５３に開示されている配列など）、ＬＩＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ１３９６７、Ｘ０６３８１でコードされるポリペプチドなど）、ＣＮＴＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ０５３４２、Ｘ６０５４２でコードされるポリペプチドなど）ならびに、種の中でのこれらの相同体があげられる。相同体をコードするヌクレオチド配列をストリンジェンシーが中程度から高い条件下で互いにハイブリダイズさせる。
ヒトＩＬ２は、ｐＩがわずかに塩基性である１３３個のアミノ酸（１５．４ｋＤａ）からなるタンパク質である。ネズミとヒトのＩＬ２はおよそ６５％相同である。ＩＬ２は、疎水性の分泌シグナル配列として機能する最初の２０個のアミノ末端アミノ酸をもつ、１５３個のアミノ酸からなる前駆タンパク質として合成される。このタンパク質は生物活性に不可欠な単一のジスルフィド結合（Ｃｙｓ５８／１０５位）を含む。
ＩＬ２は３位のトレオニンでＯ−グリコシル化されている。グリコシル化の内容に違いがあることが原因で、分子量と電荷の異なるバリアントが生じる。非グリコシル化ＩＬ２も生物学的に活性である。グリコシル化は肝細胞による因子の排除を促進するように見える。
再生魚の視覚神経から単離したトランスグルタミナーゼの作用により生成されるヒトＩＬ２の二量体構造が、培養中でのラット脳オリゴデンドロサイトの細胞障害性因子であることが分かっている。
ヒトＩＬ２遺伝子には４つのエキソンが含まれる。ＩＬ２遺伝子はヒト第４番染色体ｑ２６−２８（ネズミ第３番染色体）に位置する。ネズミとヒトのＩＬ２の相同性はコード領域のヌクレオチドレベルで７２％である。
ＩＬ２の生物活性は、４〜１２×１０３受容体／細胞の密度で、活性化Ｔ細胞ではほぼ無条件に発現されるが休止期Ｔ細胞には発現されない膜受容体が取り持つ形で実現される。活性化Ｂ細胞および休止期単核白血球がこの受容体を発現することはまれである。ＩＬ２受容体の発現はＩＬ５とＩＬ６によって調節される。それぞれ違った形で独立して発現される３種類のＩＬ２受容体が明確に区別されている。高親和性ＩＬ２受容体（Ｋｄｉｓ〜１０ｐＭ）は、細胞によって発現されるＩＬ２受容体全体のおよそ１０％を占める。この受容体は、リガンド結合ドメインとしての２つのサブユニットであるＩＬ２Ｒ−α（ＴＡＣ抗原＝Ｔ細胞活性化抗原；ｐ５５）およびＩＬ２Ｒ−β（ｐ７５；ＣＤ１２２）と、シグナル伝達成分としてのγ鎖と、からなる膜受容体複合体である。ｐ７５は、休止期Ｔリンパ球、ＮＫ細胞、他の多くの細胞型で構成的に発現されるが、ｐ５５の発現が観察されるのは、通常、細胞活性化後だけである。しかしながら、ｐ５５は、多数の腫瘍細胞やＨＴＬＶ−１感染細胞によって構成的に合成される。
単球のＩＬ２受容体発現はＩＦＮ−γにより誘導されるため、これらの細胞は腫瘍細胞障害性となる。Ｔ細胞では、ｐ７５の発現量をＩＬ３によって抑えることが可能である。中親和性ＩＬ２受容体（Ｋｄｉｓ＝１００ｐＭ）はｐ７５サブユニットとγ鎖（下記参照）とで構成されるが、低親和性受容体（Ｋｄｉｓ＝１０ｎＭ）はｐ５５だけで構成される。
ｐ５５（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ０１０５７でコードされるポリペプチドなど）は２５１アミノ酸長であり、２１９個のアミノ酸からなる細胞外ドメインと１３個のアミノ酸からなる非常に短い細胞質ドメインとを有する。ｐ５５遺伝子はヒト第１０番染色体ｐ１４−ｐ１５に位置する。
ｐ７５（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ２６０６２、Ｍ２８０５２でコードされるポリペプチドなど）は５２５アミノ酸長であり、２１４個のアミノ酸からなる細胞外ドメインと２８６個のアミノ酸からなる細胞質ドメインとを有する。ｐ７５遺伝子は１０個のエキソンを持ち、およそ２４ｋｂの長さである。この遺伝子はヒト第２２番染色体ｑ１１．２−ｑ１２ならびにネズミ第１５番染色体（バンドＥ）に位置する。
γで表される、６４ｋＤａのＩＬ２受容体の３番目のサブユニットが明らかになっている（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｄ１３８２１、Ｄ１１０８６でコードされるポリペプチドなど）。ネズミとヒトの受容体のγサブユニットは、ヌクレオチドおよびアミノ酸レベルで配列の同一性がおよそ７０％である。このサブユニットは、高親和性および中親和性のＩＬ２受容体の生成に必要なものであるが、それ自体はＩＬ２を結合しない。これらの２つのタイプの受容体はそれぞれ、α−β−γヘテロ三量体およびβ−γヘテロ二量体からなる。ＩＬ２受容体のγサブユニットをコードする遺伝子は、ヒト染色体Ｘｑ１３に位置し、およそ４．２ｋｂであり、８個のエキソンがある。最近になって、ＩＬ２受容体のγサブユニットはＩＬ４およびＩＬ７の受容体の成分であることが分かっている。また、ＩＬ１３受容体の成分であるとも考えられている。
ｐ７５の膜貫通領域にすぐ隣接している２６７〜３１７位のアミノ酸が、ＩＬ２が取り持つシグナル伝達に関与している。また、ＩＬ２受容体は、受容体鎖のコンフォメーションの変化、受容体が取り持つエンドサイトーシス、さらにシグナル伝達プロセスに関与していると思われる、他の多くのタンパク質（ｐ２２、ｐ４０、ｐ１００）と会合している。同定されたタンパク質のひとつに、９５ｋＤａの細胞接着分子であるＩＣＡＭ−１があり、これはおそらく細胞同士が接触する領域にＩＬ２受容体を集中させ、よって、たとえばＩＬ２を介してのＴ細胞刺激時の傍分泌活性を取り持つことができる。ｐ７５に会合した別のタンパク質に、ｌｃｋと呼ばれるチロシン特異的プロテインキナーゼがある。ＩＬ２によって誘導された細胞増殖がｌｃｋ陰性細胞系でプロテインチロシンキナーゼの特異的阻害剤により阻害されるという観察結果から、他のキナーゼもＩＬ２受容体に会合し得るであろうと考えられる。ｆｙｎおよびｌｙｎと呼ばれる、このような２つのキナーゼが同定されている。さらに、ＩＬ２受容体シグナル伝達もｖａｖによって取り持たれることがある。
活性化リンパ球はＴＡＣ抗原の４２ｋＤａの断片を連続的に分泌する。この断片は、血清および血漿中を循環し、可溶性ＩＬ２受容体（ｓＩＬ２Ｒ）として機能する。この可溶性受容体の濃度は、たとえば、感染、自己免疫疾患、白血病または臓器移植後などのさまざまな病理状態で著しく異なる。レベルについては１００倍まで増やすことができる。ｓＩＬ２Ｒのレベルは、ＨＩＶ誘導疾患の重篤度に相関しているようであり、他の状況での診断値にもなり得る。
マウスとヒトのＩＬ２はいずれも相同的な種のＴ細胞の増殖を高い効率で引き起こす。また、ヒトＩＬ２は似たような濃度でマウスＴ細胞の増殖も刺激するのに対し、マウスＩＬ２がヒトＴ細胞を刺激する際の効率はこれよりも低い（６分の１から１７０分の１）。
ＩＬ２は、Ｔリンパ球の全亜個体群（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の成長因子である。これは、Ｔ細胞の抗原非特異的増殖因子であり、休止期細胞の細胞周期進行を誘導する。よって、活性化Ｔリンパ球のクローン増殖が可能となる。この効果は、プロラクチンなどのホルモンによって調節される。
また、ＩＬ２は活性化Ｂ細胞の増殖も促進し、たとえばＩＬ４などの別の因子の存在も必要とする。
Ｔ細胞およびＢ細胞に影響をおよぼすことから、ＩＬ２は免疫反応の中心的な制御因子のひとつである。また、抗炎症反応、造血、腫瘍サーベイランスでも役割を果たす。ＩＬ２は、末梢白血球のＩＦＮ−γの合成を刺激し、ＩＬ１、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βの分泌も誘導する。
ＬＡＫ細胞（リンフォカイン活性化キラー細胞）増殖の活性とは別に殺腫瘍性サイトカインの分泌が誘導されることが、おそらくはＩＬ２の抗腫瘍活性を担う主な要因であろうと考えられている。
ＩＬ２については、因子（ＡＴＨ８、ＣＴ６、ＣＴＬＬ−２、ＦＤＣＰミックス、ＨＴ−２、ＮＫＣ３、ＴＡＬＬ−１０３など）に応答する細胞系を用いて、バイオアッセイでアッセイすることが可能である。ＩＬ２特異ＥＬＩＳＡアッセイおよび可溶性受容体の酵素イムノアッセイも利用できる。可溶性受容体は、ビオチニル化ＩＬ２とフローサイトメトリまたはＥＬＩＳＡアッセイを利用しての検出も可能である。
ＩＬ２は、特定の腫瘍を特異的に攻撃するＴ細胞の増殖およびクローン増殖をサポートするため、さまざまな腫瘍細胞型について有意な抗腫瘍活性を示す。従来の治療法では対処できないがん患者の治療に、ＩＬ２が用いられることが増えている。ＩＬ２の全身投与との併用療法により、標準的な治療法のない転移性腎細胞癌患者の３０％で長期寛解が得られた。他覚的臨床反応および長期生存の臨床反応が、黒色腫または急性骨髄性白血病の患者の一部でも実証されている。
高用量全身ＩＬ２療法は、望ましいとはいえない多くの中毒性副作用にも関連している。ＩＬ２には、Ｂ細胞やマクロファージをはじめとする細胞性免疫系の他の成分に対してさらに影響し、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−γをはじめとする他の可溶性メディエータの分泌を誘導する。これらの効果は、ＩＬ２の抗腫瘍活性ならびにその用量依存的毒性の一因ともなり得る。
機能的ＩＬ２遺伝子をネズミ腫瘍細胞に形質導入すると、同系宿主によって、遺伝子的に修飾された細胞の拒絶が生じることが分かっている。ＩＬ２を発現している変化した腫瘍細胞も全身免疫を増加させる。
ヒトＩＬ４は、２４個のアミノ酸からなる疎水性の分泌シグナル配列を含む前駆体として合成される１２９個のアミノ酸からなるタンパク質（２０ｋＤａ）である。ＩＬ４は、２つのアルギニン残基（３８位および１０５位）でグリコシル化され、ジスルフィド結合形成に関与する６個のシステイン残基を含む。ジスルフィド結合は生物活性に不可欠である。生物活性の異なる、ＩＬ４のいくつかのグリコシル化バリアントが明らかになっている。ネズミとヒトのＩＬ４を比較することで、これらのタンパク質の違いは９１位から１２８位だけであることが分かる。
組換えヒトタンパク質のＴｙｒ１２４がアスパラギン酸残基で置換された、ＩＬ４バリアントであるＹ１２４Ｄは、高い親和性でＩＬ４受容体に結合する（Ｋｄ＝３１０ｐＭ）。このバリアントはＩＬ４受容体系の強力なアンタゴニストである。検出可能なＴ細胞増殖活性は保持されておらず、ＩＬ−４依存性Ｔ細胞増殖を競合的に阻害する（Ｋ（ｉ）＝６２０ｐＭ）。この変異体が存在することから、高親和性の結合およびシグナル生成をリガンドで効率的に脱共役できることが実証される。Ｙ１２４ＤはＩＬ１３受容体の強力なアンタゴニストとしても作用する。
ヒトＩＬ４遺伝子は４個のエキソンを持ち、およそ１０ｋｂの長さである。この遺伝子は第５番染色体ｑ２３−３１に位置する。ネズミの遺伝子は第１１番染色体に位置する。ＩＬ４遺伝子は、造血増殖因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ５など）をコードする他の遺伝子のすぐ近くにある。ＩＬ４遺伝子とＩＬ５遺伝子との間の距離は、およそ９０〜２４０ｋｂである。
ヌクレオチドレベルで、ヒトとネズミのＩＬ４遺伝子は、およそ７０％の相同性を示す。ＩＬ４の５’領域は、自己の遺伝子や他の遺伝子の発現を制御している転写因子の結合部位である、ＣＬＥ（保存リンフォカインエレメント）と呼ばれる数個の配列エレメントを含む。ヒトＩＬ４遺伝子（−７９位から−６９位）の５’領域のＰ配列（ＣＧＡＡＡＡＴＴＴＣＣ；配列番号１）と呼ばれる配列モチーフは、Ｔ細胞活性化シグナルへの応答をもたらす、ＮＦ（Ｐ）と呼ばれる核因子の結合部位である。
ＩＬ４の生物活性は、１００〜５０００コピー／細胞の密度で発現される、特異的受容体（Ｋｄｉｓ＝２０〜１００ｐＭ）が取り持つ形で実現される（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ２９８５４、Ｘ５２４２５でコードされるポリペプチドなど）。ＩＬ４受容体の細胞外ドメインは、エリスロポエチン（Ｅｐｏ）受容体、ＩＬ６、ＩＬ２受容体のβ鎖に関連する。それはＣＤ１２４という名前で呼ばれている。
ネズミＩＬ４受容体のｃＤＮＡは、８１０個のアミノ酸からなる膜貫通タンパク質（分泌シグナル配列を含む）をコードする。この受容体は、５５３個のアミノ酸からなる大きな細胞内ドメインを有する。ヒト受容体は、２０７個のアミノ酸からなる細胞外ドメインと、２４個の残基からなる膜貫通ドメインと、５６９個のアミノ酸からなる大きな細胞内ドメインとを有する。
最近になって、ＩＬ４受容体はシグナル伝達成分としてＩＬ２受容体のγサブユニットを含むことが分かっている。このγサブユニットはＩＬ４およびＩＬ７の受容体にも会合しており、おそらくはＩＬ１３の受容体にも会合している。２つの受容体形態が明らかになっており、その１つが分泌されている。分泌された受容体だけが細胞外ＩＬ４結合ドメインを含み、ＩＬ４活性をブロックできる。ＩＬ４受容体と同じ親和性でＩＬ４を結合するＩＬ４結合タンパク質（ＩＬ４−ＢＰ）も、可溶性ＩＬ４受容体バリアントであることが分かっている。これらの可溶性受容体はおそらく、受容体結合を阻害することでサイトカイン活性の生理学的制御因子として機能するか、そうでなければ輸送タンパク質として作用する。ＩＬ１（ＩＬ１受容体アンタゴニスト）、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ７、ＴＮＦ−α、ＩＧＦ、ＩＦＮ−γでも可溶性受容体または結合タンパク質が明らかになっている。
ＩＬ４の生物活性は、種特異的であり、マウスＩＬ４はヒトの細胞に対して不活性であり、ヒトＩＬ４はネズミの細胞に対して不活性である。ＩＬ４は、活性化Ｂ細胞の増殖および分化、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現、休止期Ｂ細胞での低親和性ＩｇＥ受容体の発現を促進する。ＩＬ４は、Ｂ細胞上でのＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を亢進する。また、他のＢ細胞刺激への応答やＴ細胞への抗原提示能を促進できる。これは、特異的Ｂ細胞のクローン増殖を促進するひとつの方法であり得るもので、よって免疫系は非常に低濃度の抗原に応答できる。非Ｂ非Ｔ細胞によるＩＬ４の産生は、これらの細胞が、それぞれのＩｇＥまたはＩｇＧのＦｃ受容体を介して他の細胞と相互作用したときに刺激される。この作用はＩＬ３によって増強可能である。ＩＬ２およびＰＡＦ（血小板活性化因子）はＩＬ４の合成を誘導するが、ＴＧＦ−βはそれを阻害する。
ＩＬ３は、Ｂ細胞でのＩＬ２によって誘導される作用に拮抗し、ＩＬ２受容体の発現をゆっくりと低下させ、ＩＬ２によって刺激されるヒトＢ細胞の増殖を阻害する。活性化Ｂ細胞では、ＩＬ４は、ＩｇＧ１とＩｇＥの合成を刺激し、ＩｇＭ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの合成を阻害する。Ｂ細胞でのＩＬ４により誘導されるこのアイソタイプの切り替えは、ＩＦＮ−γにより拮抗される。骨髄腫成長因子であるＩＬ６の合成を阻害するＩＬ４によって、多発性骨髄腫の増殖を抑制できる。ＩＬ４はまた、ヒト肺胞マクロファージにおけるＩＬ６の合成も阻害する。
マクロファージをＩＬ４で前処理することにより、細菌エンドトキシンまたはＩＦＮ−γによる細胞の活性化に応答した、ＩＬ１、ＴＮＦ−αおよびプロスタグランジンの産生が防止される。
ＩＬ４は、コロニー形成アッセイで顆粒球または赤血球前駆細胞を含有するコロニーの生成時にＥｐｏおよびＧ−ＣＳＦ／Ｅｐｏと相乗作用する。
古典的なＩＬ４検出方法に、刺激精製Ｂ細胞の増殖の亢進を測定する、Ｂ細胞共刺激アッセイがある。ＩＬ４は、ＩＬ４応答細胞（ＢＡＬＭ−４；ＢＣＬ１；ＣＴ．４Ｓ；ＣＴＬ４４；ＣＴＬＬ−２；Ｄａ；ＦＤＣＰミックス；ＨＴ−２；Ｌ４；Ｌ１３８．８Ａ；ＭＯ７Ｅ；ＭＣ／９；ＮＦＳ−６０；Ｒａｍｏｓ、Ｓｅｚ６２７、ＴＦ−１；ＴＳ１など）を使用したバイオアッセイでも検出できる。ヒトＩＬ４の特異的検出法のひとつが多数のＢ細胞系でのＣＤ２３の誘導であり、この場合のＣＤ２３は、フローサイトメトリまたは蛍光イムノアッセイのいずれかにより検出される。消費／分解を防ぐ条件下でのＩＬ４産生速度を迅速に求めることができるイムノアッセイがサイトカインイムノトラップである。
ＩＬ４は結腸および乳房の癌の増殖を阻害する。また、ＬＡＫ細胞の発達を増すことが分かっている。機能的ＩＬ４遺伝子をネズミ腫瘍細胞に形質導入すると、同系宿主によって、遺伝子的に修飾された細胞の拒絶が生じることが分かっている。ＩＬ４を発現している変化した腫瘍細胞も全身免疫を増加させる。形質導入細胞をワクチン接種したマウスは、その後の非形質導入細胞の攻撃を拒絶し、場合によっては既存の腫瘍を拒絶する。
ヒトＩＬ６は、７３位および１７２位がグリコシル化された１８５個のアミノ酸からなるタンパク質である。これは２１２個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質として合成される。単球は、分子量が２１．５〜２８ｋＤａの少なくとも５つの異なる分子形のＩＬ６を発現する。それらは主に、グリコシル化やリン酸化などの翻訳後の変化が異なっている。
さまざまな細胞型から単離されたＩＬ６は、そのＮ末端にいくらかの微小不均一性が認められる。おそらくはキャリアタンパク質であるα−２−マクログロブリン（α２Ｍ）と複合体を形成している４２〜４５ｋＤａの形態が血漿中に観察されている。ネズミとヒトのＩＬ６は、ＤＮＡレベルで６５％の配列相同性を示し、タンパク質レベルでは４２％の相同性を示す。
ＩＬ６は、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、オンコスタチンＭ、ＩＬ１１およびＣＴ−１も含む、サイトカインのファミリのメンバである。ＩＬ６サイトカインファミリの周知のメンバはいずれも、急性相タンパク質の肝発現を誘導する。
Ｈ−ＩＬ６と称される、ＩＬ６と可溶性ＩＬ６受容体との融合タンパク質からなる、高度に生物活性かつ安定したデザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）サイトカインが、ヒト造血前駆細胞の増殖に使用され、細胞がＩＬ６には応答しないが、ＩＬ６と可溶性ＩＬ６受容体とからなる安定した複合体が必要な場合には有用である。
ヒトＩＬ６遺伝子は長さがおよそ５ｋｂであり、５個のエキソンがある。これは、マーカーＤ７Ｓ１３５とＤ７Ｓ３７０との間のヒト第７番染色体ｐ２１−ｐ１４に位置する。ネズミの遺伝子は第５番染色体に位置する。ＩＬ６およびＧ−ＣＳＦ遺伝子のヌクレオチド配列は、ある意味で互いに似ており、進化の過程で何らかの関連が可能性あったのではないかと考えられる。
ＩＬ６受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ２０５６６、Ｅ０３５１５ででコードされるポリペプチドなど）は、Ｔ細胞、マイトジェン活性化Ｂ細胞、末梢血単球ならびに、いくつかのマクロファージ由来腫瘍細胞型およびＢ細胞由来腫瘍細胞型で発現される。これは、休止期Ｂ細胞には発現されないが、休止期Ｔ細胞には発現される。肝細胞では、ＩＬ６またはＩＬ１での処理後にＩＬ６受容体の発現が亢進される。いくつかの細胞型ではＩＬ６受容体の発現はグルココルチコイドによっても亢進される。ＩＬ６受容体遺伝子はヒト第１番染色体ｑ２１に位置する。
ＩＬ６受容体は、強くグリコシル化された、８０ｋＤａおよび４４９アミノ酸長のタンパク質である。この受容体はＣＤ１２６と呼ばれている。また、この受容体は４６８個のアミノ酸からなる前駆体として合成される。分子構造は、受容体が細胞外受容体ドメインのアミノ末端領域に免疫グロブリン様配列ドメインを含むという点で、Ｍ−ＣＳＦ、ＰＤＧＦおよびＩＬ１の受容体の分子構造と似ている。
ＩＬ６受容体の細胞内ドメインは、およそ８２アミノ酸長であり、細胞内シグナル伝達に関与する他のタンパク質との相同性は全く認められない。異なる親和性（Ｋｄｉｓ＝１０−９および１０−１１Ｍ）でＩＬ６に結合し、この同じ受容体タンパク質の翻訳後修飾によって生じることが最も多い、２つの異なる形態の受容体が明らかになっている。ＩＬ６の生物活性は、１０−１３〜１０−１５Ｍの濃度でも認められることから、他の高親和性受容体コンフォメーションの存在または親和性がさらに高い別の受容体分子の存在が示唆される。
ＩＬ６受容体が取り持つシグナル伝達には、プロテインキナーゼＣを伴い、アデニル酸シクラーゼも伴う。
ＩＬ６とその受容体との間に形成される複合体は、シグナル伝達に関与する、膜貫通糖タンパク質のｇｐ１３０（アミノ酸９１８個；アミノ酸２７７個からなる細胞質ドメイン）と会合する。ＩＬ６がその受容体に結合することで、ｇｐ１３０のジスルフィド連結ホモ二量体化と、これに関連するチロシンキナーゼの活性化が、シグナル伝達の第一段階として起こる。ｇｐ１３０はＩＬ６受容体を発現しない細胞でも発現される。このタンパク質は、ＩＬ１１、ＬＩＦ、オンコスタチンＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１をはじめとする他の受容体の一成分であることが判明している。このことから、因子自体は互いに関連しないにもかかわらず、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ、ＩＬ６に多くの同じ生物活性が認められるのはなぜなのかが分かる。ＬＩＬ因子と呼ばれる、ＳＴＡＴタンパク質に似た因子が、ＩＬ６のシグナル経路、さらにはＩＬ１および細菌リポ多糖のシグナル経路に関与することが判明している。
ｇｐ１３０とも相互作用する、ＩＬ６受容体の可溶性形態（ＩＬ６Ｒ−ＳＵＰ（ＩＬ６受容体可溶性尿タンパク質））が明らかになっている。これらの可溶性受容体はおそらく、受容体結合を阻害することによるサイトカイン活性の生理学的制御因子として機能するか、輸送タンパク質として作用する。ＩＬ１（ＩＬ１ｒａ、ＩＬ１受容体アンタゴニスト）、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＴＮＦ−α、ＩＧＦ、ＩＦＮ−γに関しても、似たような可溶性受容体または結合タンパク質が明らかになっている。
造血前駆細胞および神経細胞など、細胞のなかには、ＩＬ６と可溶性ＩＬ６受容体との組み合せに対してだけ応答し、ＩＬ６単独では応答しないものがある。
ヒトＩＬ６は、サル、ラット、マウスで生物活性である。ネズミのＩＬ６はヒトの細胞では活性ではない。極めて多くの生物活性が多くの異なる頭字で示されており、これに基づいてＩＬ６が明らかになっている。ＩＬ６は、抗原特異的免疫反応および炎症反応に影響する多面的サイトカインである。このサイトカインは、急性相反応の主要な生理学的メディエータの１つである。肝細胞においては、グルココルチコイドとの組み合わせで、ＩＬ６はメタロチオネインの合成を誘導し、細胞内亜鉛レベルを増加させ、よって、ＣＣＬ４誘導肝毒性を防ぐ。ＩＬ６は、コリン作用性神経の神経栄養性因子であり、培養中でコリン作用性神経の生存をうながす。ＩＬ６によって誘導して誘導して分化可能な神経細胞系もある。
ＩＬ６は、ＩＬ１と同様に、下垂体のＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）の合成を刺激する。ＡＣＴＨに応答して合成されたグルココルチコイドは、ＩＬ６、ＩＬ１、ＴＮＦの産生をｉｎ ｖｉｖｏで阻害することで、免疫系と神経内分泌機能との間に一種のネガティブフィードバックループを確立している。星状膠細胞では、ＩＬ６は神経成長因子（ＮＧＦ）の合成を誘導する。
ＩＬ６は、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏでのＢ細胞分化因子およびＴ細胞の活性化因子である。ＩＬ２の存在下で、ＩＬ６は成熟Ｔ−細胞および非成熟Ｔ細胞の細胞障害性Ｔ細胞への分化を誘導する。また、ＩＬ６は胸腺細胞の増殖も誘導し、おそらくは胸腺Ｔ細胞の発達に何らかの役割を果たしている。
ＩＬ６は、細胞がすでにＩＬ４で活性化されている場合に、Ｂ細胞の免疫グロブリン分泌形質細胞への最終成熟を誘導できる。Ｂ細胞では、ＩＬ６は、血清ＩｇＧ１レベルを１２０〜４００倍に上昇させられる程度まで、抗体の分泌を刺激する。
ＩＬ６は、わずか０．００２ｎｇ／ｍＬの濃度で多くのヒト骨髄腫の主要なオートクライン増殖修飾因子の１つである。これらの細胞の増殖については、ＩＬ６に指向されたモノクローナル抗体により阻害できる。また、ＩＬ６に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入によって、あるいはＩＬ４によって阻害することも可能である。骨髄腫細胞に対するコルチコステロイドの増殖阻害効果は、おそらくはＩＬ６発現のステロイド誘導減少によって達成される。ヒトＩＬ６依存性骨髄腫細胞の増殖については、ＩＦＮ−γによっても阻害できる。ＩＬ６はまた、他の腫瘍型のオートクライン増殖修飾因子としても機能することがあり、そのいくつかはＩＬ６を構成的に分泌することが判明している。ＩＬ６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの子宮頸部腫瘍細胞増殖のオートクライン修飾因子であることが分かっている。その一方で、ＩＬ６は、乳房癌、子宮頸部癌、ヒト肺がん細胞系、組織球リンパ腫、黒色種などのいくつかの固形腫瘍の増殖を阻害する。
ＩＬ６およびＩＬ３は、多能性造血前駆細胞の増殖を促進する上でｉｎ ｖｉｔｒｏにて相乗作用する。ＩＬ６は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで巨核球の成熟を誘導し、ｉｎ ｖｉｖｏで血小板数を増加させるトロンボポエチンでもある。ネズミの骨髄培養ではＩＬ６はＧＭ−ＣＳＦに似た活性を示すが、ヒトの骨髄培養ではこのような活性を示さない。
ＩＬ６は形質細胞腫細胞によって産生され、ＩＬ６受容体も形質細胞腫細胞によって産生される。これらの細胞はオートクライン的に刺激されるのではないかと考えられる。一方は因子を産生し、他方は受容体を発現する、２つの異なる細胞個体群の存在に関与する傍分泌機序も明らかになっている。
ＩＬ６は、ＩＬ６応答性細胞系（７ＴＤ１；Ｂ９；ＣＥＳＳ、ＫＰＭＭ２、ＫＴ−３；Ｍ１、ＭＨ６０−ＢＳＦ−２、ＭＯ７Ｅ；Ｍｏｎｏ Ｍａｃ ６；ＮＦＳ−６０；ＰＩＬ−６；ＳＫＷ６−Ｃｌ４；Ｔ１１６５；ＸＧ−１など）を使用して、バイオアッセイで検出できる。ＩＬ６はまた、ハイブリドーマ成長因子としてその活性によってもアッセイできる。感度の高いイムノアッセイおよび比色試験も利用できる。受容体会合ｇｐ１３０タンパク質の検出にはＥＬＩＳＡアッセイがある。
他のサイトカイン（たとえばＩＬ２）との組み合わせで、ＩＬ６は、いくつかの腫瘍型の処置に有用なものとなり得る。機能的ＩＬ６遺伝子をネズミ腫瘍細胞に形質導入すると、同系宿主によって、遺伝子的に修飾された細胞の拒絶が生じることが分かっている。ＩＬ６を発現している変化した腫瘍細胞も全身免疫を増加させる。形質導入細胞をワクチン接種したマウスは、その後の非形質導入細胞の攻撃を拒絶し、場合によっては既存の腫瘍を拒絶する。
ヒトＩＬ１０は、１６０アミノ酸長のサブユニットを持つホモ二量体タンパク質である。ヒトＩＬ１０とネズミＩＬ１０とのアミノ酸相同性は７３％である。ヒトＩＬ１０には４個のエキソンがある。これはエプスタイン−バーウイルスのＢＣＲＦ−１遺伝子（Ｂａｍ ＨＩ Ｃ断片の右側の読み枠）の産物と密接に関連している（タンパク質レベルで相同性８４％）。これらの２つのタンパク質は、ヒトとネズミのＩＬ１０よりも相互の関連性が密接である。このため、ＢＣＲＦ−１はウイルスＩＬ１０（ｖＩＬ１０）とも呼ばれている。ヒトＩＬ１０遺伝子は第１番染色体に位置する。ヒトＩＬ１０は、ヌクレオチドレベルで、ネズミＩＬ１０に８１％の相同性を示す。
放射標識ＩＬ１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｌ１２１２０、Ｕ００６７２でコードされるポリペプチドなど）を利用してネズミ細胞とヒト細胞で受容体が同定されている。マウスＩＬ１０は、ヒトＩＬ１０がマウス細胞に結合するのをブロックできるが、ヒト細胞への結合はブロックできない。ネズミＩＬ１０受容体がクローン化されている。この受容体は、ネズミＩＬ１０に特異的に結合する、およそ１１０ｋＤａのタンパク質である。この受容体はＩＦＮ受容体に構造的に関連している。
ＩＬ１０は、Ｔ細胞のＴｈ１亜個体群におけるＩＦＮ−γ、ＩＬ２、ＴＮＦ−βなどの多くのサイトカインの合成を阻害するが、Ｔｈ２細胞のサイトカインの合成は阻害しない。この活性はＩＬ４により拮抗される。ＩＦＮ−γの産生に対する阻害作用は間接的であり、補助細胞によるＩＬ１２合成の抑制の結果であるように思われる。ヒト系では、ＩＬ１０は、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞により産生され、これらの細胞の機能を下方制御する。細菌リポ多糖により刺激されたマクロファージでは、ＩＬ１０は、とりわけ、サイトカインｍＲＮＡの分解を促進することにより、ＩＬ１、ＩＬ６、ＴＮＦ−αの合成を阻害する。また、抗原提示の阻害も引き起こす。ヒト単球では、ＩＦＮ−γとＩＬ１０は互いの他の産生ならびに機能を拮抗する。ＩＬ１０はＩＬ１２の生理学的アンタゴニストでもあることが分かっている。
また、ＩＬ１０は、補助細胞の存在下でＴ細胞のマイトジェン誘導増殖または抗ＣＤ３誘導増殖を阻害し、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２の産生を減少させる。外来性ＩＬ２およびＩＬ４は、増殖阻害作用を阻害するが、ＩＦＮ−γの産生には影響しない。ＬＰＳ刺激マクロファージでは、ＩＦＮ−γはＩＬ１０の産生を阻害することでＩＬ６の合成を増加させる。ＩＬ１０は、Ｔｈ１細胞によるサイトカイン合成を阻害するＴｈ２上の持つ機能の大半またはすべてを担っているように見える。
ＩＬ１０は、ＩＬ５により誘導されたＴ細胞非依存性抗原によるＩｇの分泌を阻害するが、ＩＬ２により誘導されたものは阻害しない。
ネズミＬｙ−１Ｂ細胞は主なＩＬ１０源である。他のＢ細胞とは対照的に、Ｌｙ−１Ｂ細胞は、構成的レベルおよび誘導的レベルの非常に高いＩＬ１０を発現する。また、これらの細胞には、連続的な自己補充（ｓｅｌｆ−ｒｅｐｌｅｎｉｓｈｍｅｎｔ）という独特な特性がある。抗ＩＬ１０抗体で新生仔マウスを連続的に処置することにより、正常な脾臓Ｂ細胞個体群は維持されるが、Ｌｙ−１Ｂ細胞は枯渇する。これらのマウスでは免疫グロブリンＭの血清レベルが大幅に低下しており、特異的抗原に対する抗体反応も損なわれる。したがって、ＩＬ１０は、Ｌｙ−１Ｂ細胞発達の制御因子である。Ｌｙ−１Ｂ細胞枯渇の機序は、ＩＦＮ−γの産生増加に関与しているように思われる。なぜなら、中和抗ＩＦＮ−γ抗体を共投与することで、これらのマウスの腹膜常在Ｌｙ−１Ｂ細胞数が実質的に回復するからである。
また、ＩＬ１０は（ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７と共に）成熟胸腺細胞および非成熟胸腺細胞の増殖の共刺激因子でもあり、細胞障害性Ｔ細胞分化因子として機能し、より多数のＩＬ２活性化細胞障害性Ｔリンパ球前駆体が増殖・分化して細胞障害性エフェクタ細胞になるのを促進する。ＩＬ１０はｉｎ ｖｉｔｒｏでＢ細胞の生存能を保持し、Ｂ細胞を刺激し、その分化を促進する。また、Ｂ細胞上のＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現を亢進する一方で、単球上のＭＨＣクラスＩＩの発現を阻害する。自己の抗原受容体またはＣＤ４０を介して活性化されたＢ細胞において、ＩＬ１０は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭの分泌を誘導する。この作用はＩＬ４によって相乗作用されるが、ＩＬ１０で誘導される免疫グロブリンの合成はＴＧＦ−βによって拮抗される。マクロファージの活性化についてはＩＬ１０により防ぐことが可能である。
ヒトＩＬ１０は、ヒトＴリンパ球の強力かつ特異的な化学誘引物質であることが分かっている。走化性活性は、ＣＤ８を発現する細胞には指向されるが、ＣＤ４（＋）細胞には指向されない。また、ＩＬ１０は、ＩＬ８に向けて、ＣＤ４（＋）細胞の走化性反応は阻害するが、ＣＤ８（＋）細胞の走化性反応は阻害しない。ＩＬ１０は、高感度ＥＬＩＳＡアッセイを用いて検出可能である。ネズミ肥満細胞系Ｄ３６を使用して、ヒトＩＬ１０をバイオアッセイすることが可能である。細胞内因子も、フローサイトメトリで検出できる。
ＩＬ１０発現ベクターのＣＨＯ細胞への導入を利用して、ｉｎ ｖｉｖｏでの局所的ＩＬ１０産生の結果を分析した。これらの変化細胞は、ヌードマウスまたは重症複合型免疫不全症ＳＣＩＤマウスで、もはや腫瘍原性ではなく、同時注入した同じ数の正常ＣＨＯ細胞の増殖も抑制した。正常ＣＨＯ腫瘍は通常、実質的にマクロファージにより浸潤されるが、ＣＨＯ−ＩＬ１０腫瘍組織内には実際上存在していないことから、ＩＬ１０が、腫瘍増殖促進活性を与え得るマクロファージの浸潤を阻害することで、ある腫瘍の腫瘍増殖を間接的に抑制しているのではないかと考えられる。
ヒトＩＬ１２は、ＩＬ１２の生物活性に必須なジスルフィド結合により連結した、４０ｋＤａのサブユニット（ｐ４０、アミノ酸３０６個；１０％炭水化物）と３５ｋＤａのサブユニット（ｐ３５、アミノ酸１９７個；２０％炭水化物）とからなる、７０ｋＤａのヘテロ二量体糖タンパク質である。ｐ４０はシステイン１０個とヘパリン結合部位とを含み、ｐ３５にはシステインが７個ある。
ＩＬ１２の２つのサブユニットは、周知の他のどのタンパク質とも関連していない。ｐ４０はＩＬ６受容体の細胞外ドメインとの間にいくらかの相同性を示し、ｐ３５はＩＬ６の相同体のように見える。
単一の分子に２つのＩＬ１２サブユニットを組み合わせた、生物活性ネズミおよびヒトＩＬ１２融合タンパク質が明らかになっている。このデザイナーサイトカインはｉｎ ｖｉｖｏで抗腫瘍活性を保持する。二量体組換えＩＬ１２のすべての生物学的特徴を保持している、単鎖タンパク質であるＦｌｅｘｉ１２も明らかになっている。
ＩＬ１２のｐ４０サブユニット（ＩＬ１２Ｂ）をコードする遺伝子は、他のサイトカイン遺伝子も擁する同じ領域のヒト第５番染色体ｑ３１−ｑ３３に位置する。ＩＬ１２のｐ３５サブユニット（ＩＬ１２Ａ）をコードする遺伝子は、ヒト第３番染色体ｐ１２−ｑ１３．２に位置する。２つの遺伝子の発現は互いに独立的に調節されている。
ＩＬ１２受容体は、およそ１１０ｋＤａの単一のタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ０３１８７、Ｕ２３９２２、Ｕ６４１９８、Ｕ６４１９９でコードされるポリペプチドなど）のようにみえる。１細胞あたり１０００〜９０００個までの高親和性ＩＬ１２受容体が、さまざまなＴ細胞マイトジェンによって、あるいはＩＬ２によって活性化された末梢血単核細胞上に発現される。ＩＬ１２受容体は、ＣＤ４およびＣＤ８を発現する活性化Ｔ細胞上ならびに活性化ＣＤ５６陽性ナチュラルキラー細胞上に存在する。休止期末梢血単核細胞、扁桃腺Ｂ細胞あるいは、抗ＩｇＭ／Ｄｘ、抗ＩｇＭ／Ｄｘ＋ＩＬ２またはＳＡＣ＋ＩＬ２により活性化された扁桃腺Ｂ細胞は受容体を発現しない。高親和性ＩＬ１２受容体は、形質転換マーモセットＮＫ様細胞系、ＨＶＳ．ＳＩＬＶＡ４０上に構成的に発現される。
ＩＬ１２がその受容体に結合するのを、ｐ４０サブユニットに対して指向したモノクローナル抗体で防ぐことができ、よってこの抗体は結合部位を含む。ＩＬ１２のｐ４０サブユニットにはＩＬ６受容体の細胞外ドメインとの間に相同性がある。ｐ４０サブユニットのウイルスのコードされる相同体がＥＢＶ誘導遺伝子−３である。
ヒトＩＬ１２はネズミのリンパ球では活性でない。ネズミｐ３５サブユニットとヒトｐ４０サブユニットとで構成されるハイブリッドへテロ二量体では、ネズミ細胞に対する生物活性が保持される。しかしながら、ヒトｐ３５とネズミｐ４０との組み合わせは、ネズミの細胞では完全に不活性である。ネズミＩＬ１２は、ネズミとヒトの両方のリンパ球に対して活性である。ネズミＩＬ１２サブユニットｐ４０（ＩＬ１２ｐ４０）のｐ４０サブユニットは、さまざまなアッセイ系でＩＬ１２ヘテロ二量体の持つ作用に対して特異的に拮抗し、ＩＬ１２ヘテロ二量体の内因性特異的阻害剤として機能することが分かっている。
ＩＬ１２は、植物性血球凝集素によって活性化されたヒトリンパ芽球の増殖を刺激する。ＩＬ１２はＣＤ５６陽性ＮＫ細胞を活性化し、この活性はＴＮＦ−αに特異的な抗体によってブロックされる。ＩＬ１２は特異的同種間ＣＴＬ反応を促進する。また、ＩＬ１２は抗ＣＤ３抗体および混合リンパ球培養中の同種刺激とも相乗作用する。
Ｔｈ１型の抹消血リンパ球では、ＩＬ１２はＩＦＮ−γおよびＩＬ２ならびにＴＮＦの合成を誘導する。ＴＮＦ−αもナチュラルキラー細胞に対するＩＬ１２の作用の仲介に関与しているようにみえる。というのは、ＩＬ１２の作用はＴＮＦ−αに対して指向された抗体によって阻害されるからである。ＩＬ１２およびＴＮＦ−αはＩＬ１２がＩＦＮ−γ応答を最大にする上でのＩＦＮ−γ産生共刺激物質であり、ＩＬ１２、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γの産生はＩＬ１０によって阻害される。Ｔｈ２ヘルパー細胞では、ＩＬ１２によって、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ１０の合成が減少する。
ＩＬ１２は、末梢血での単核細胞の増殖を促進し、ＬＡＫ細胞（リンフォカイン活性化キラー細胞）の生成を促進するにあたって、最適以下の量のＩＬ２と相乗作用する。ＩＬ２によってｉｎ ｖｉｖｏにて増殖されたナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性を増大する上では、ピコモル濃度のＩＬ１２がナノモル濃度のＩＬと同じ程度に効果的である。また、ＩＬ１２はコマイトジェンとしても作用し、ＩＬ２によって誘導された休止期末梢細胞の増殖を亢進する。
ＩＬ１２は、ＳＣＦ（幹細胞因子）によって誘導された初期の骨髄前駆細胞の骨髄造血を促進し、コロニー刺激因子と相乗作用して増殖を誘導する。ＩＬ１２には、より拘束（ｃｏｍｍｉｔ）された骨髄前駆体に対する相乗作用もあり、ＩＬ３、ＩＬ１１またはＩＬ３プラスＳＣＦと相乗作用する。
ＬＡＫ細胞（リンフォカイン活性化キラー細胞）の生成に必要なＩＬ２の量を少なくできることから、ＩＬ１２に臨床的な関心が持たれる可能性がある。ＩＬ１２は、ｉｎ ｖｉｖｏでさまざまな実験腫瘍の増殖を阻害し、ｉｎ ｖｉｖｏで抗血管新生作用を持つことが分かっているが、この作用は少なくとも一部がＩＦＮ−γによって取り持たれる。このことから、ＩＬ１２は血管新生依存性悪性腫瘍の処置にも役立つ可能性のある候補であろうと思われる。
ＩＬ１９とＩＬ１０はアミノ酸の同一性が２１パーセントであり、おそらくは相同体である。単球では、細菌リポ多糖での処置によってＩＬ１９の合成が誘導され、この作用はＩＬ４またはＩＬ１３の存在下では助長されるがＩＦＮ−γには影響されない。ＧＭ−ＣＳＦは単球においてＩＬ１９遺伝子の発現を直接に誘導する。ＩＬ１９はＩＬ２０受容体複合体に結合することが分かっている（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌら、Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ＳＴＡＴ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ−１９、ＩＬ−２０ ａｎｄ ｍｄａ−７ ｔｈｒｏｕｇｈ ＩＬ−２０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７（７）：３５４５〜９（２００１）；Ｇａｌｌａｇｈｅｒ Ｇら、Ｃｌｏｎｉｎｇ、ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｉｔｉａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１９（ＩＬ−１９）、ａ ｎｏｖｅｌ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０（ＩＬ−１０）．Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １（７）：４４２〜５０（２０００））。
ＩＬ２０はＩＬ１０に構造的に関連している。ＩＬ２０は炎症への関与を制御するケラチノサイトのオートクライン因子であるようにみえる。トランスジェニックマウスでＩＬ２０が過発現されると、表皮分化障害が特徴の皮膚異常を伴う新生仔致死遺伝子症が引き起こされる（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｈら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２０：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １０４（１）：９〜１９（２００１）；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌら、Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ＳＴＡＴ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ−１９、ＩＬ−２０ ａｎｄ ｍｄａ−７ ｔｈｒｏｕｇｈ ＩＬ−２０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７（７）：３５４５〜９（２００１）；Ｒｉｃｈ ＢＥ ａｎｄ Ｋｕｐｐｅｒ ＴＳ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ：ＩＬ−２０−ａ ｎｅｗ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｉｎ ｓｋｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１（１３）：Ｒ５３１〜４（２００１））。
ＩＬ２０受容体はクラス２の２つのオーファンサイトカイン受容体サブユニットからなるものとして同定されている。この受容体は皮膚で発現され、その発現は乾癬皮膚で格段に上方制御される。この受容体がケラチノサイト細胞系に関与するには、ＳＴＡＴタンパク質の一メンバであるＳＴＡＴ３によるシグナル伝達が必要である。
ＩＬ２０受容体複合体はＩＬ１９およびＩＬ２４にも結合することが分かっている。
ＩＬ２１は、すでに単離されていた１型サイトカイン受容体のリガンドを求めていたときに、パリッシュ−ノヴァク（Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ）らの手によって、活性化ＣＤ３（＋）Ｔ細胞由来のｃＤＮＡライブラリから単離されている。このｃＤＮＡは、ＩＬ２およびＩＬ１５に最も密接に関連しているタンパク質である、１３１個のアミノ酸からなる分泌タンパク質をコードする。ＩＬ２１遺伝子はＩＬ２遺伝子付近のヒト第４番染色体ｑ２６−ｑ２７に位置する。ＩＬ２１ ｍＲＮＡは、細胞の活性化後にＣＤ４（＋）において発現されるが、ＣＤ８（＋）Ｔ細胞では発現されない。また、Ｂ細胞および単球でも発現されない（Ａｓａｏ Ｈら、Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ｔｈｅ ｃｏｍｍｏｎ ｇａｍｍａ−ｃｈａｉｎ ｉｓ ａｎ ｉｎｄｉｓｐｅｎｓａｂｌｅ ｓｕｂｕｎｉｔ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−２１ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７（１）：１〜５（２００１）；Ｏｚａｋｉ Ｋら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｔｙｐｅ Ｉ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｓｔ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ＩＬ−２ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｅｔａ ｃｈａｉｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ） ９７：１１４３９〜１１４４４（２０００）；Ｐａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋ Ｊら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２１ ａｎｄ ｉｔｓ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｒｅ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ４０８：５７〜６３（２０００））。
ＩＬ２１は、ＣＤ４０抗原の架橋によって刺激されるＢ細胞の増殖を刺激する。また、ＩＬ４プラス抗ＩｇＭによって刺激される増殖を阻害する。ＩＬ２１は、ナイーブ（ＣＤ４５ＲＡ（＋））増殖刺激を増大するが、ＣＤ３の関与によって取り持たれるメモリ（ＣＤ４５ＲＯ（＋））Ｔ細胞の増殖刺激は増大しない。ＩＬ２１は、ＩＬ１５の存在下にて骨髄前駆細胞の増殖ならびにＮＫ−細胞マーカーＣＤ５６の発現を刺激する。
ＩＬ２１受容体はＰａｒｒｉｓｈ−Ｎｏｖａｋらの手によって単離され、ＣＤ２３（＋）Ｂ細胞、Ｂ細胞系、Ｔ細胞白血病系、ＮＫ細胞系によって発現されることが判明している。この受容体遺伝子はヒト第１６番染色体ｐ１２にマッピングされている。同じ受容体が、これをＮＩＬＲ（新規なインターロイキン受容体）と呼ぶＯｚａｋｉらの手によって単離されている。この受容体（アミノ酸５３８個）はヒトＩＬ２β受容体に最も密接に関連している。この受容体では、１型サイトカイン受容体に典型的なＷＳＸＷＳ（配列番号３）モチーフが細胞外領域にある。この受容体は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞系で発現される。
ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５の機能的受容体複合体の必須のサブユニットである共通のγ鎖が、ＩＬ２１受容体複合体の一部であることも分かっている。機能的シグナル伝達複合体がヤヌスキナーゼＪＡＫ１、ＪＡＫ３およびＳＴＡＴタンパク質ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３を活性化する（Ａｓａｏら）。
ｃＤＮＡサブトラクション法を用いて、マウスＴリンパ球でＩＬ９によって特異的に誘導される遺伝子としてＩＬ２２（シグナル配列を含む１８０個のアミノ酸；２５ｋＤａ；ＩＬ−ＴＩＦとも呼ばれる）を同定した。このタンパク質はＩＬ１０との相同性が限られている（アミノ酸の同一性で２２パーセント）。ヒトとネズミのＩＬ−ＴＩＦタンパク質はアミノ酸の同一性が７９パーセントである。
ネズミとヒトのＩＬ−ＴＩＦ遺伝子はいずれも６個のエキソンを持つ。ヒト単一コピー遺伝子は第１２番染色体ｑ１５に位置する（ＩＦＮ−γ遺伝子から９０Ｋｂ、もうひとつのＩＬ１０関連サイトカインをコードするＡＫ１５５遺伝子から２７Ｋｂ）。マウスでは、この遺伝子はＩＦＮ−γ遺伝子として同じ領域にも位置している。ＢＡＬＢ／ｃマウスとＤＢＡ／２マウスでは、この遺伝子は単一コピー遺伝子である。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス、ＦＶＢマウス、１２９マウスでは、この遺伝子は重複している。ＩＬ−ＴＩＦ−αおよびＩＬ−ＴＩＦ−βと呼ばれる２つのコピーは、コード領域でのヌクレオチド同一性が９８パーセントであり、ＩＬ−ＴＩＦ−βの６５８ヌクレオチドの欠失の点で異なっている。この遺伝子は不活性なこともある。
ＩＬ−ＴＩＦの発現は、胸腺リンパ腫、Ｔ細胞および肥満細胞のＩＬ９ならびに、単離したばかりの脾細胞におけるレクチンによって誘導される。Ｔ細胞でのＩＬ−ＴＩＦの発現にはタンパク質の合成は必要なく、活性化ヤヌスキナーゼおよびＳＴＡＴタンパク質に左右される。ＩＬ−ＴＩＦは胸腺および脳で構成的に発現される。
ＨｅｐＧ２ヒト肝細胞癌細胞では、ＩＬ−ＴＩＦは急性相タンパク質の産生を上方制御する。また、タンパク質の注入によって急性相タンパク質の合成が誘導されるため、ＩＬ−ＴＩＦはｉｎ ｖｉｖｏで起炎症性サイトカインとしても作用する。細菌リポ多糖の注入直後にＩＬ−ＴＩＦの合成が誘導される。ＩＬ１０とは対照的に、ＩＬ２２は細菌リポ多糖に応答しての単球による起炎症性サイトカインの産生を阻害しない。また、単球上のＩＬ１０の機能を損なうこともない。ＩＬ−ＴＩＦには、Ｔｈ２ Ｔヘルパー細胞からのＩＬ４の産生に対するいくらかの阻害作用がある。
ＩＬ１０とＩＬ−ＴＩＦは共通の受容体サブユニットを利用している。ＩＬ１０受容体のβ鎖に指向された抗体は、ＩＬ−ＴＩＦによる急性相タンパク質の誘導をブロックする。機能的ＩＬ−ＴＩＦ受容体複合体は２つの受容体鎖からなる。一方の鎖は、正常な肝臓および腎臓で発現されるオーファン受容体ＣＲＦ２−４として同定されている。他方の鎖は、ＩＬ１０受容体複合体の第２の鎖であるＩＬ１０受容体−２である。ＣＲＦ２−９だけを発現するサルＣＯＳはＩＬ−ＴＩＦに応答する。ハムスターの細胞では、機能的ＩＬ−ＴＩＦ受容体を得るには両方の鎖が発現されなければならない。どちらの受容体鎖も独立してＩＬ−ＴＩＦを結合可能ではあるが、ＩＬ−ＴＩＦの受容体複合体への結合の方が大きい。このような受容体サブユニットの共有は、ＩＬ２、ＩＬ４、ＩＬ７、ＩＬ９、ＩＬ１５などのサイトカインによる共通のγ鎖の共用と似ている。ＩＬ１０に応答しない細胞系のなかには、ＳＴＡＴ−１、ＳＴＡＴ−３、ＳＴＡＴ−５の活性化によってＩＬ−ＴＩＦに応答するものがある。
ＩＬ２２ＢＰ［ＩＬ２２結合タンパク質］と呼ばれる可溶性分泌受容体（アミノ酸２３１個）が明らかになっている（Ｋｏｔｅｎｋｏら）。このタンパク質はＩＬ２２Ｒ１鎖の細胞外ドメインとのアミノ酸同一性が３４パーセントであり、ＣＲＦ２−１０としても知られている。遺伝子はヒト第６番染色体ｑ２４に位置し、ＩＦＮ−γＲ１遺伝子から３５ｋｂである。これはさまざまな組織で発現され、胸部、肺、結腸で発現が最大になる。このタンパク質はＩＬ−ＴＩＦを結合してその活性を阻害し、これが細胞表面ＩＬ２２受容体複合体と相互作用しないようにブロックすることで、天然サイトカインアンタゴニストとして作用する。また、ＩＬ２２ＢＰは、ＨｅｐＧ２細胞でのＩＬ２２によるサイトカインシグナル伝達の抑制因子−３（ＳＯＣＳ−３）遺伝子発現の誘導もブロックする（Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＬ−１０−ｒｅｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ（ＩＬ−ＴＩＦ）、ａ ｎｏｖｅｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ＩＬ−１０ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｂｙ ＩＬ−９．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６４（４）：１８１４〜１８１９（２０００）；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌら、Ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０−ｒｅｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｓ ａｎ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ） ９７（１８）：１０１４４〜９（２０００）；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌら、ＩＬ−ＴＩＦ／ＩＬ−２２：ｇｅｎｏｍｉｃ ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｅｓ．Ｇｅｎｅｓ Ｉｍｍｕｎ １（８）：４８８〜４９４（２０００）；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｌ−２２ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ａ ｎａｔｕｒａｌ ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ ｏｆ ｉｌ−１０−ｒｅｌａｔｅｄ ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ／ｉｌ−２２．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６（１２）：７０９０〜５（２００１）；Ｋｏｔｅｎｋｏ ＳＶら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｃｌｏｎｉｎｇ，ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｏｌｕｂｌｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈａｔ ｂｉｎｄｓ ＩＬ−２２ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｓ ｉｔｓ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６（１２）：７０９６〜７１０３（２００１）；Ｋｏｔｅｎｋｏ ＳＶら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２２ （ＩＬ−２２） ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘ：ｔｈｅ ＩＬ−１０Ｒ２ ｃｈａｉｎ （ＩＬ−１０Ｒｂｅｔａ） ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ＩＬ−１０ ａｎｄ ＩＬ−２２ （ＩＬ−１０−ｒｅｌａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ，ＩＬ−ＴＩＦ）ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７６（４）：２７２５〜３２（２００１）；Ｘｉｅ ＭＨら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ （ＩＬ）−２２、ａ ｎｏｖｅｌ ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｔｈａｔ ｓｉｇｎａｌｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ＣＲＦ２−４ ａｎｄ ＩＬ−２２Ｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７５（４０）：３１３３５〜９（２０００））。
ＩＬ−２３は、ＩＬ１２（ＩＬ１２Ｂ）のｐ４０サブユニットと１９ｋＤａの別のタンパク質（ｐ１９と呼ばれる）とで構成される因子に与えられた名前である。ｐ１９は、ＩＬ６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ１２のｐ３５サブユニットに構造的に関連している。データバンクでは、ｐ１９サブユニットにはＳＧＲＦという頭字語も用いられている（ＩＬ６Ｇ−ＣＳＦ関連因子）。
ｐ１９自体は生物学的に不活性であるが、ｐ１９とｐ４０の複合体は活性である。細胞活性化後には、樹状細胞によって活性複合体が分泌される。
マウスのメモリＴ細胞（ＣＤ４（＋）ＣＤ４５ Ｒｂ（ｌｏｗ））は、ＩＬ２３に応答して増殖するがＩＬ１２に応答して増殖することはない。ヒトＩＬ２３は、ＰＨＡ芽球Ｔ細胞およびメモリＴ細胞によりＩＦＮ−γの産生を刺激することが分かっている。また、両細胞型の増殖も誘導する。
ＩＬ２３は、ＩＬ１２受容体のβ１サブユニットに結合するがβ２サブユニットには結合せず、ＰＨＡ芽球Ｔ細胞でＳＴＡＴタンパク質のうちのひとつであるＳＴＡＴ４を活性化する。
トランスジェニックマウスでｐ１９を発現させると、３ヶ月齢になる前に発育不全や全身炎症、不妊、死に至る。これらの動物では起炎症性サイトカインＴＮＦ−αおよびＩＬ１の血漿濃度が高くなる。循環好中球の数が増える。急性相タンパク質が構成的に発現される。肝臓でｐ１９を特異的に発現している動物にはこれらの異常は認められない。ｐ１９を発現している細胞を骨髄移植するとトランスジェニック動物で観察されたものと同じ表現型が生じることから、ｐ１９の発現は造血細胞によるものである可能性が最も高い（Ｏｐｐｍａｎｎ Ｂら、Ｎｏｖｅｌ ｐ１９ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｎｇａｇｅｓ ＩＬ−１２ｐ４０ ｔｏ ｆｏｒｍ ａ ｃｙｔｏｋｉｎｅ、ＩＬ−２３、ｗｉｔｈ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｓｉｍｉｌａｒ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｒｏｍ ＩＬ−１２．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １３（５）：７１５〜２５ （２０００）；Ｗｉｅｋｏｗｓｋｉ ＭＴら、Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＩＬ−２３ Ｓｕｂｕｎｉｔ ｐ１９ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｍｕｌｔｉｏｒｇａｎ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｒｕｎｔｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ，ａｎｄ Ｐｒｅｍａｔｕｒｅ Ｄｅａｔｈ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６６（１２）：７５６３〜７０（２００１））。
ＩＬ２４はＳＴ１６［造腫瘍性の抑制−１６］およびＭＤＡ−７［黒色腫分化関連遺伝子７］としても知られているタンパク質に与えられた名前である。ＩＬ２４のラットカウンターパートがｍｏｂ−５またはＣ４９ａとして同定されている。。ネズミカウンターパートはＦＩＳＰである。
増殖能を失い、ヒトＩＦＮ−βおよびメゼレインに応答して末期分化する培養ヒト黒色腫細胞を用いての研究で、ＭＤＡ−７タンパク質（アミノ酸２０６個）を、まずは黒色腫分化関連ｃＤＮＡとして同定した。末期分化の結果としてＭＤＡ−７の発現が上方制御される。ＭＤＡ−７を発現するように遺伝子工学操作により改変されたＨ０−１およびＣ８１６１ヒト黒色腫細胞では、増殖が減り、コロニー形成アッセイでコロニーは形成されない。ＭＤＡ−７は、アポトーシスによる細胞死を促進することで、ヒト胸部がん細胞の増殖を選択的に抑制する。複製欠損型アデノウイルスによるＭＤＡ−７の異所性発現によって、黒色腫、多型性神経膠芽腫、骨肉腫ならびに、胸部、子宮頸部、結腸、肺、鼻咽頭、前立腺の癌をはじめとする広範囲にわたる別のがんで、増殖が抑制されるとともにアポトーシスが誘導される。正常な上皮細胞または線維芽細胞では、ＭＤＡ−７の発現後に顕著な有害作用が認められることはない。
ヒト造血細胞では、ＴＰＡ（１２−Ｏ−テトラデカノイル−ホルボル−１３−アセテート）での処置に応答した巨核球分化時にＭＤＡ−７の発現が誘導される。
ヒトＭＤＡ−７遺伝子は第１番染色体ｑ３２に位置し、（１９５ｋｂの領域内で）ＩＬ１０、ＩＬ１９、ＩＬ２０をコードする遺伝子にしっかりと連結されている。
ＩＬ２４の受容体はＩＬ２０受容体複合体として同定されている。この受容体もＩＬ１９に結合する（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｈら、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ２０：ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １０４（１）：９〜１９（２００１）；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒ Ｌら、Ｃｕｔｔｉｎｇ ｅｄｇｅ：ＳＴＡＴ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＬ−１９、ＩＬ−２０ ａｎｄ ｍｄａ−７ ｔｈｒｏｕｇｈ ＩＬ−２０ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｔｙｐｅｓ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７（７）：３５４５〜９（２００１）；Ｈｕａｎｇ ＥＹら、Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、 ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ （ｍｄａ−７） ｇｅｎｅ ｗｉｔｈ ｃａｎｃｅｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０（４８）：７０５１〜６３（２００１）；Ｊｉａｎｇ Ｈら、Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ，ｍｄａ−７，ｍｏｄｕｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｈｕｍａｎ ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １１：２４７７〜２４８６（１９９５）；Ｊｉａｎｇ Ｈら、Ｔｈｅ ｍｅｌａｎｏｍａ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｍｄａ−７ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ） ９３：９１６０〜９１６５（１９９６）；Ｓｕ Ｚら、Ｔｈｅ ｃａｎｃｅｒ ｇｒｏｗｔｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｍｄａ−７ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ）９５：１４４００〜１４４０５（１９９８））。
ＩＬ２５（ＳＦ２０としても知られる）は、細胞増殖を刺激する因子を求めていたときに同定されている。この因子は骨髄間質細胞により分泌される。
ＩＬ２５受容体はマウス胸腺共有抗原−１（ＴＳＡ−１）として同定されている。この受容体を発現しない因子依存性細胞系のひとつであるＢａＦ３で当該受容体を強制的に発現させると、細胞の増殖が引き起こされる。この受容体を発現するＦＤＣＰ２細胞もＳＦ２０／ＩＬ２５に応答して増殖する。いずれの場合も、増殖は上記受容体に指向した特異的ブロッキング抗体によって停止される。
ＳＦ２０／ＩＬ−２５は検出可能な骨髄造血活性を持たないが、リンパ球系統での細胞の増殖を支持する（Ｔｕｌｉｎ ＥＥら、ＳＦ２０／ＩＬ−２５、ａ Ｎｏｖｅｌ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｈａｔ Ｂｉｎｄｓ ｔｏ Ｍｏｕｓｅ Ｔｈｙｍｉｃ Ｓｈａｒｅｄ Ａｎｔｉｇｅｎ−１ ａｎｄ Ｓｕｐｐｏｒｔｓ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６７（１１）：６３３８〜４７（２００１））。
ＴＮＦリガンドスーパーファミリのメンバ（ＴＮＦα、ＴＮＦ−β、ＬＴβ、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＣＤ９５リガンド、４１ＢＢ、ＯＸ４０リガンド、ＴＲＡＩＬ）には共通の生物活性があるが、いくつかの特性はいくつかのリガンドだけに共通で、その他の特性は独特なものである。ヒトＴＮＦ−αは、１７ｋＤａで１５７アミノ酸長の非グリコシル化タンパク質である。ネズミＴＮＦ−αはＮ−グリコシル化されている。ＴＮＦ−βとの相同性はおよそ３０％である。ＴＮＦ−αは二量体および三量体を形成する。１７ｋＤａの形態の因子は、アミノ酸２３３個からなる前駆体タンパク質のプロセシングにより産生される。ＴＮＦ−α変換酵素がこの変換を取り持つことが分かっている。２６ｋＤａの膜貫通形態も明らかになっている。
ＴＮＦ−αは、因子の生物活性を変化させることなく分解できる、単一のジスルフィド結合を含む。Ａｌａ８４からＶａｌおよびＶａｌ９１からＡｌａへの変異により、因子の細胞障害性活性はほぼ完全に減少する。これらの部位は受容体結合に関与している。７Ｎ末端アミノ酸の欠失と、Ｐｒｏ８Ｓｅｒ９Ａｓｐ１０のＡｒｇＬｙｓＡｒｇによる置換により、抗腫瘍活性がおよそ１０倍強くなり、Ｌ−Ｍ細胞アッセイで示されるように受容体の結合が増し、同時に毒性が減少した、変異因子が得られる。
この遺伝子はおよそ３．６ｋｂ長であり、４個のエキソンを含む。一次転写物は、２７６２ヌクレオチド長であり、２３３個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質をコードする。アミノ末端の７８個のアミノ酸はプレ配列として機能する。ヒト遺伝子は、第６番染色体ｐ２３−ｑ１２に位置する。これは、ＨＬＡ−ＢのクラスＩ ＨＬＡ領域と補体因子Ｃをコードする遺伝子との間に位置する。ＴＮＦ−βをコードする遺伝子はＴＮＦ−α遺伝子のおよそ１．２ｋｂ下流である。しかしながら、両遺伝子は独立に制御されている。これらの２つの遺伝子は、ネズミ第１７番染色体上で互いに近接して存在する。
ＴＮＦ−αのおよそ５００〜１００００個の高親和性受容体（Ｋａ＝２．５×１０−９Ｍ）が、赤血球を除くすべての体細胞型で発現される。５５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ１；新規表記：ＣＤ１２０ａ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ５５３１３ででコードされるポリペプチドなど）と７５ｋＤａ（ＴＮＦ−Ｒ２；新規表記：ＣＤ１２０ｂ）（グッドウィン（Ｇｏｏｄｗｉｎ）ＲＧら（１９９１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１：３０２０〜６に記載されているものなど）の２つの受容体が明らかになっている。一方つの受容体は、１７１個のアミノ酸からなる細胞外ドメインと２２１個のアミノ酸からなる細胞質ドメインとを含む、４５５個のアミノ酸からなるグリコシル化タンパク質である。細胞外ポーションのシステインリッチドメインの配列相同性から、この受容体がＮＧＦの低親和性受容体およびヒト細胞表面抗原ＣＤ４０に関連していることがはっきりする。
５５ｋＤａの受容体であるＴＮＦ−Ｒ１のＣ末端細胞内領域の欠失解析によって、プログラムされた細胞死に至るシグナル伝達プロセスに関与する、いわゆる死ドメインの存在がはっきりした。ＴＮＦ−Ｒ１の死ドメインは、ＴＲＡＤＤを含む他のさまざまなシグナル伝達アダプタ分子やＲＩＰと相互作用する。
２つの既知の受容体がＴＮＦ−αとＴＮＦ−βの両方に結合する。ｐ５５は、ＴＮＦの細胞障害性作用の影響を受けやすい細胞で特に発現される。ｐ７５も、特に骨髄起源の細胞型を含む、多くの細胞型に存在する（受容体サブユニットのウイルスコード相同体はＥＢＶ誘導遺伝子−６である）。刺激Ｔ細胞およびＢリンパ球で強く発現される。さまざまな細胞型上でのＴＮＦの格差のある活性すなわち増殖促進活性と増殖阻害活性は、おそらくは他の別個の受容体会合タンパク質との組み合わせで受容体間に差のある発現および／または調節が影響して生じるものである。ｐ５５は、微生物およびその病原因子に対する宿主防御に重要な役割を果たしているようにみえる。
正常なヒト肝臓に３番目の受容体サブタイプが発現される。このサブタイプは、ＴＮＦ−αに結合するがＴＮＦ−βには結合しない。ウイルスのなかには、ｐ５５およびｐ７５ＴＮＦ受容体と近い相同性である、ＴＮＦ結合特性を持つ分泌タンパク質をコードする遺伝子を含むものがある。２つの受容体サブタイプの異なる影響が、ＴＮＦが取り持つ白血球の内皮への接着にも見られた。ｐ５５受容体が関与すると、特に、細胞接着分子ＩＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン、Ｖ−ＣＡＭ−１、ＣＤ４４の誘導につながるのに対し、ｐ５５およびｐ７５受容体の両方が関与すると、α−２インテグリンの発現が誘導される。
短縮可溶性形態の受容体も見出されている。可溶性形態、特にｐ６０受容体の可溶性細胞外ドメインは、ＴＮＦの抗増殖作用をブロックするため、ＴＮＦによる有害な作用を制御することができる。
受容体密度は、ＩＬ１ならびに、ホルボルエステルなどの腫瘍プロモータによって低下する。ＴＮＦ−α受容体の発現密度は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γにより誘導される。
ＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバの細胞質ドメインに会合するシグナルトランスデューサにＴＲＡＦ（腫瘍壊死因子受容体会合因子）が含まれる。
ヒトＴＮＦ−αは、特異的活性がわずかに減少した状態でネズミ細胞で活性である。一般に、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βはｉｎ ｖｉｔｒｏ系で似たような生物活性スペクトルを示すが、ＴＮＦ−βの方が効力が低いことが多く、そうでなければ明確なアゴニスト活性を示す。
ＴＮＦ−αは生物活性の広いスペクトルが広い。これはｉｎ ｖｉｔｒｏで多くの腫瘍細胞系の細胞溶解および細胞分裂停止を引き起こす。感受性細胞はピコモル濃度の因子への曝露後数時間以内に死滅し、これには、少なくとも一部は、ＴＮＦ細胞障害性および遺伝子制御シグナル伝達経路の共通のメディエータとして機能するミトコンドリア由来二次メッセンジャ分子が関与する。この因子は移植腫瘍の出血性壊死を誘導する。注入後数時間以内に、ＴＮＦ−αによって悪性腫瘍内の小血管が破壊される。この因子はまた、好中球顆粒球の貪食作用および細胞障害性を増強し、また、ｆｏｓ、ｍｙｃ、ＩＬ１およびＩＬ６を含む多くの他のタンパク質の発現も調節する。
２６ｋＤａの形態のＴＮＦが活性化単球およびＴ細胞で優先的に見出される。これは生物学的にも活性であり、直接的な細胞間接触により細胞破壊を取り持つ。
好中球のｆＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）の走化特性は、ＴＮＦ−αによって増強される。ＴＮＦ−αは、ＩＰ−１０、ＪＥ、ＫＣをはじめとする多数の化学誘引物質サイトカインの合成を、細胞型特異的および組織特異的な形で誘導する。
ＴＮＦ−αは正常なヒト二倍体線維芽細胞の成長因子である。これは、線維芽細胞におけるコラゲナーゼおよびプロスタグランジンＥ２の合成を促進する。また、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト慢性リンパ球性白血病細胞のオートクライン増殖修飾因子として機能でき、神経芽細胞腫細胞のオートクライン増殖修飾因子であることが明らかになっている。オートクライン増殖促進活性はＩＬ４により阻害される。
休止期マクロファージでは、ＴＮＦは、ＩＬ１およびプロスタグランジンＥ２の合成を誘導する。また、マクロファージでの貪食作用およびスーパーオキシドジスムターゼの合成を刺激する。ＴＮＦは破骨細胞を活性化し、よって骨再吸収を誘導する。
白血球およびリンパ球前駆体では、ＴＮＦは、クラスＩとＩＩのＨＬＡと分化抗原の発現、ＩＬ１、コロニー刺激因子、ＩＦＮ−γの産生、アラキドン酸代謝を刺激する。また、内皮細胞および滑膜細胞でのコラゲナーゼの生合成を刺激する。
ＩＬ６は細菌エンドトキシンおよびＴＮＦにより誘導されるＩＬ１の合成ならびにエンドトキシンにより誘導されるＴＮＦの合成を抑制する。
神経伝達物質ＳＰ（サブスタンスＰ）は、マクロファージでのＴＮＦおよびＩＬ１の合成を誘導する。ＩＬ１は、ＩＬ６と同様に下垂体のＡＣＴＨ（副腎皮質刺激ホルモン）の合成を刺激する。ＡＣＴＨに応答して合成されたグルココルチコイドは、ＩＬ６、ＩＬ１、ＴＮＦの合成をｉｎ ｖｉｖｏで阻害するため、免疫系と神経内分泌機能との間にネガティブフィードバックループが確立される。
ＴＮＦ−αは、ＩＬ２の非存在下で、さまざまな刺激により誘導されるＴ細胞の増殖を亢進する。Ｔ細胞のいくつかの亜個体群だけがＴＮＦ−αの存在下でＩＬ２に応答する。ＩＬ２の存在下で、ＴＮＦ−αはＢ細胞の増殖および分化を促進する。
皮膚ランゲルハンス細胞の機能的能力もＴＮＦ−αに影響される。これらの細胞は、接触感作などの一次免疫反応を開始することができない。それらは、ＧＭ−ＣＳＦによって、またＩＬ１によっても、免疫刺激樹状細胞に変換される。したがって、これらの細胞は免疫学的に未熟なリンパ系樹状細胞レザバーである。成熟ランゲルハンス細胞が抗原を処理する高い機能は、ＴＮＦ−αにより有意に減少する。
ＴＮＦ−αは正常な免疫反応にも必要であるが、過発現は重篤な病理学的結果につながる。ＴＮＦ−αは腫瘍患者に観察される主な悪液質のメディエータである（このため、カヘクチンという名前である）。また、ＴＮＦはグラム陰性敗血症の重篤な作用のうち、いくつかの原因となっている。
ＴＮＦ−αは、これに応答する細胞系（ＢＴ−２０、ＣＴ６、ＥＬ４；ＰＫ１５；Ｌ９２９；Ｌ−Ｍ；ＭＯ７Ｅ；Ｔ１１６５；ＷＥＨＩ−３Ｂなど）を用いるバイオアッセイで検出可能である。また、ＴＮＦ−αは、高感度サンドイッチ酵素イムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、免疫放射線測定法（ＩＲＭＡ）、ＲＥＬＡＹ（受容体ラベル転移アッセイ（ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌａｂｅｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｓｓａｙ））と呼ばれるアッセイによっても検出できる。細胞内因子は２色免疫蛍光フローサイトメトリで検出される。ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのいずれかでの処置後にアポトーシスが生じた細胞からのトリチウム化チミジンの放出を利用したアッセイが、Ｈｉｇｕｃｈｉらによって説明されている。ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＩＬ４、ＬＩＦおよびＧＭ−ＣＳＦは、このアッセイを妨害しないことが分かっている。
化学療法薬とは対照的に、ＴＮＦは悪性細胞を特異的に攻撃する。徹底した前臨床試験により、皮下ヒト異種移植片およびヌードマウスでのリンパ節転移に対するＴＮＦ−αの直接的な細胞分裂停止作用および細胞障害性作用ならびに、好中球、マクロファージ、Ｔ細胞を含むさまざまな免疫エフェクタ細胞に対する多種多様な免疫調節効果が実証されている。単回投与量および複数回投与量での第Ｉ相試験により、ＴＮＦは、ショックや悪液質などの重度の毒性を併発することなく、抗がん効果に関連した投与量範囲で、進行した悪性腫瘍のある患者に安全に投与できることが確認されている。しかしながら、総合的に考えるとこれまで臨床試験では残念ながらがん治療における有意な改善を実証できておらず、大半の場合はＴＮＦ誘導全身毒性がＴＮＦを抗悪性腫瘍剤として使用する上での主な制限になっている。ＴＮＦと細胞障害剤または免疫調節剤、特にＩＦＮ−γおよびおそらくはＩＬ２を併用すると、いくつかの腫瘍の治療で利点を得られることがある。場合によっては、ＴＮＦを腫瘍内に適用することで、腫瘍を制御するのに有利であることが判明している。
最近になって、ｐ５５受容体に選択活性を有するいくつかの変異形のＴＮＦ−βが明らかになっている。ｐ５５受容体の活性化は、形質転換細胞に細胞障害性活性を引き起こすのに十分であることが分かっている。ヒトの腫瘍を移植したヌードマウスに抗腫瘍活性を保持する、これらの変異体のうちのいくつかが明らかになっている。
また、ＴＮＦはリンフォカイン活性化キラー細胞の攻撃性を増す目的でも使用できる。実験線維肉腫転移モデルを用いた研究により、ＴＮＦは肺における転移数の有意な増加を誘導することが分かっている。サイトカイン療法での低用量の内因性ＴＮＦまたはＴＮＦの投与によって、循環腫瘍細胞の転移能が高まることがあるのではないかと考えられた。機能的ＴＮＦ−α遺伝子を用いたネズミ腫瘍細胞の形質導入により、同系宿主によって、遺伝子的に修飾された細胞の拒絶が生じることが分かっている。
インターフェロンは、標的細胞にウイルス非特異的抗ウイルス状態を誘導するサイトカインのファミリである。インターフェロンがその受容体に結合すると、新たなタンパク質の合成が誘導され、これが開始因子ｅＩＦ−２の不活性化につながる。この不活性化は、インターフェロンにより誘導される抗ウイルス状態を導く一因であると考えられる。インターフェロンはまた、ウイルスｍＲＮＡを分解する細胞内エンドヌクレアーゼを活性化する経路を誘導する。多くのインターフェロンがマクロファージやリンパ球の活性化などの免疫調節活性も有する。インターフェロンの例としては、ＩＦＮ−γ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｋ０１９００、Ｊ００２０９、Ｍ１２３５０、Ｊ００２１３、Ｊ００２１６、Ｊ００２１４、Ｍ１１００３、Ｍ１１０２６、Ｍ３４９１３、Ｍ５４８８６、Ｘ０１９７４、Ｌ３８６９８、Ｍ１３７１０、Ｋ０１２３８、Ｍ１３６６０、Ｍ６８９４４、Ｘ０１９７２、Ｘ０１９７１、Ｘ０１９７３、Ｘ０１９６９でコードされるポリペプチドなど）、ＩＦＮ−γ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ２８６２２、Ｘ１４０２９、Ｘ１４４５５、Ｋ０００２０、Ｊ００２１８、Ｅ００１７１、Ｘ０４４３０、Ａ０９３６３、Ｍ２７３２７、Ｍ１６６５６、Ｍ２５４６０、Ｋ０３１９６でコードされるポリペプチドなど）、ＩＦＮ−γ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ａ３４５３２、Ｘ８７３０８、Ｅ００７５６、Ｋ０００８３でコードされるポリペプチドなど）、ＩＦＮ−γ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ５８８２２、Ａ１２１４０でコードされるポリペプチドなど）、ウシ栄養芽層タンパク質−１（ＩＦＮ−γ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ３１５５６、Ｍ３１５５７、Ｍ３１５５８でコードされるポリペプチドなど）、種の中でのこれらの相同体があげられる。ヒトＩＦＮ−γおよびＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−γの受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｊ０３１４３、Ｍ２８２３３でコードされるポリペプチドなど）とは異なる、共通の受容体（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ６０４５９、Ｍ８９６４１でコードされるポリペプチドなど）に結合すると考えられる。
ＩＦＮ−αには少なくとも２３種類のバリアントが知られている。個々のタンパク質は分子量が１９〜２６ｋＤａで、１５６〜１６６アミノ酸長および１７２アミノ酸長のタンパク質からなる。ＩＦＮ−αサブタイプはいずれも、アミノ酸１１５〜１５１位の間に共通の保存配列領域を有するが、アミノ末端はさまざまである。多くのＩＦＮ−αサブタイプで配列の違いは１カ所または２カ所しかない。また、自然界に存在するバリアントは、カルボキシ末端の１０個のアミノ酸が短縮されたタンパク質も含む。１／９８および２９／１３８位のシステイン間にジスルフィド結合が形成される。ジスルフィド結合２９／１３８は生物活性に必須であるが、１／９８結合は生物活性に影響することなく低減できる。
ヒトＩＦＮ−βは２０ｋＤａの糖タンパク質（糖部分およそ２０％）であり、１６６アミノ酸長である。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの生物活性にグリコシル化は必要ない。このタンパク質には、生物活性に必要なジスルフィド結合（Ｃｙｓ３１／１４１）がある。ＤＮＡレベルで、ＩＦＮ−βは、ＩＦＮ−β２と３４％、他のＩＦＮ−αサブタイプとおよそ３０％の配列相同性を示す。ＩＦＮ−γとは対照的にＩＦＮ−βはｐＨ２で安定である。
ヒトＩＦＮ−γは、１４６個のアミノ酸からなるサブユニットを持つ二量体タンパク質である。このタンパク質は２つの部位でグリコシル化されている。ｐＩは８．３〜８．５である。ＩＦＮ−γは、２３個のアミノ酸からなる分泌シグナル配列を含むアミノ酸１６６個からなる前駆体タンパク質として合成される。生物学的に活性な２０および２５ｋＤａの２つの分子形態のタンパク質が明らかになっている。そのいずれも２５位でグリコシル化されている。２５ｋＤａの形態は９７位でもグリコシル化されている。天然のＩＦＮ−γに分子量および電荷の点で違いがあるのは、グリコシル化のパターンが違っていることによるものである。非変性条件下で観察された４０〜６０ｋＤａの形態はＩＦＮ−γの二量体および三量体である。
サイトカインのＣＳＦファミリのメンバは、軟寒天またはメチルセルロース上に固定した骨髄細胞を増殖および分化させることができる。造血前駆細胞は、このような因子が存在しないと短時間しか維持できないが、このような因子が存在すれば、その因子次第で、赤血球系細胞、好中球、好酸球、マクロファージおよび／または巨核球を含むコロニーを発達させる。これらの細胞型の増殖および発達を支持するコロニー形成を刺激するさまざまな活性を生化学的に分析したところ、このような多くの異なる別個の因子が存在することが判明している。
これらの因子の多くはＮ−グリコシル化またはＯ−グリコシル化されている。グリコシル化は、溶解性、安定性、タンパク質分解酵素に対する抵抗性を強めることが分かっている。かたや、これらの因子の生物活性のフルスペクトルには必要ないようである。多くのヒトコロニー刺激因子をコードする遺伝子がすでにクローニングされ、位置決定がなされている。これらの遺伝子のうちいくつかは近位にあるが、若干の保存領域を除いて互いに大きな相同性は認められない。
コロニー刺激因子は、たとえば、Ｂリンパ球、上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、間質細胞系、Ｔリンパ球をはじめとする、多くの異なる細胞型により産生される。これらの因子は、およそ２５〜３２個のアミノ酸からなる古典的疎水性分泌シグナル配列を含む前駆体分子として合成される。分泌因子は極めて低濃度（１〜１００ｐＭ）で活性である、極めて高い特異的生物活性を有する。これらの因子は造血前駆細胞の増殖に絶対的に必要である。単に生存を維持するだけのために必要な濃度は通常、細胞増殖の誘導または細胞の特異的機能活性の顕現に必要な濃度よりも数桁低い。
個々の因子の名称は通常、これらの因子に応答する細胞型を示す。古典的コロニー刺激因子には、Ｍ−ＣＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｅ０３２３５、Ｍ６４５９２、Ｕ２２３８６、Ｘ０５０１０でコードされるポリペプチドなど）（マクロファージ特異的）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球特異的）、ＧＭ−ＣＳＦ（マクロファージ／顆粒球特異的）、ＩＬ３（多機能性）、ＭＥＧ−ＣＳＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｄ８６３７０、Ｕ７０１３６でコードされるポリペプチドなど）（巨核球特異的）がある。Ｇ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦは系統特異的であるが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ３は、造血前駆細胞の分化の初期段階に作用する多機能性造血成長因子である。
ヒトＧＭ−ＣＳＦは、２つのグリコシル化部位を有する、１２７個のアミノ酸からなる単量体タンパク質である。このタンパク質は、１４４個のアミノ酸からなる前駆体として合成され、アミノ末端に疎水性分泌シグナル配列が含まれる。生物活性のフルスペクトルに糖部分は必要ない。非グリコシル化ＧＭ−ＣＳＦとグリコシル化ＧＭ−ＣＳＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで同じ活性を示す。完全にグリコシル化されたＧＭ−ＣＳＦは、非グリコシル化タンパク質よりもｉｎ ｖｉｖｏで生物学的に活性である。文献に記載のある、異なる分子量形態のＧＭ−ＣＳＦ（１４ｋＤａ、３５ｋＤａ）が生じるのは、グリコシル化の程度に差があるのが原因である。ＧＭ−ＣＳＦは４個のシステイン残基（５４／９６位および８８／１２１位）を含む。
ＧＭ−ＣＳＦのタンパク質配列と、他のコロニー刺激因子の配列とを比較することで、これらの配列が互いに強く相同性のものではないことが明確になる。ヒトとネズミのＧＭ−ＣＳＦは、タンパク質レベルで６０％、ヌクレオチドレベルで７０％の相同性を示す。しかしながら、これら２つの因子は免疫学的には交差反応しない。ＧＭ−ＣＳＦは、ヘパランスルフェートプロテオグリカンとの複合体として細胞の細胞外マトリックスと会合できる。これにより、生物学的に不活性な形での因子の貯蔵が可能になる。因子がこれらの貯蔵所から最終的に放出される正確な機序は不明である。
ヒト遺伝子はおよそ２．５ｋｂ長であり、４個のエキソンを持つ。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子とＩＬ３遺伝子との間の距離は、およそ９ｋｂである。ヒトＧＭ−ＣＳＦ遺伝子は、造血成長因子（Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５）をコードする他の遺伝子およびＭ−ＣＳＦ受容体をコードする遺伝子の近位にあたる第５番染色体ｑ２２−３１に位置する。ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の５’領域には、ＣＬＥ（保存リンフォカインエレメント）として知られる数個の配列エレメントが含まれる。これらのエレメントは転写因子の結合部位として機能し、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子の発現を調節する。
ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、骨髄細胞の細胞表面上に数百から数千コピー／細胞の密度で発現される。この受容体は、内皮細胞および小細胞肺癌細胞などの非造血細胞上にも発現される。受容体陽性細胞系統では、受容体密度は成熟度が増すにつれて低下する。
この受容体は、ＩＬ２−β、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、Ｅｐｏ、プロラクチン受容体を含む、造血成長因子の他の受容体と有意な相同性を示す。クローニングされた１つのＧＭ−ＣＳＦ受容体サブユニット（ＧＭ−Ｒα、４５ｋＤａ）は、低い親和性でＧＭ−ＣＳＦを結合する（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．ＳＥＧ＿ＨＵＭＧＲＡＳでコードされるポリペプチドなど）。第２のサブユニット（ＧＭ−Ｒβ、１２０ｋＤａ）はＧＭ−ＣＳＦを結合しない。ＧＭ−Ｒαは、アミノ酸５４個からなる短い細胞質ドメインだけを含む、４００個のアミノ酸からなるタンパク質である。高親和性ＧＭ−ＣＳＦ受容体は、２つの受容体サブユニットの凝集により形成される。ＧＭ−Ｒβ受容体サブユニット（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．ＳＥＧ＿ＭＵＳＡＩＣ２Ｂ、Ｍ５９９４１でコードされるポリペプチドなど）も他のサイトカイン受容体系の構成成分である。これは、ＩＬ３およびＩＬ５の高親和性受容体の一成分であり、両方にサイトカイン特異的サブユニット（ＡＩＣ２Ａ）も含まれている。
ヒトＧＭ−ＣＳＦはネズミ細胞に対して活性でなく、その逆もまたしかりである。ＧＭ−ＣＳＦは、最初は軟寒天培養中でマクロファージ／顆粒球含有コロニーの増殖を刺激する因子として単離された（コロニー形成アッセイ）。ＧＭ−ＣＳＦは、顆粒球およびマクロファージ前駆細胞の増殖と発達には不可欠である。これは骨髄芽球および単芽球を刺激し、これらの細胞の不可逆的分化を引き起こす。ＧＭ−ＣＳＦは、赤血球系および巨核球系前駆細胞の増殖においてＥｐｏと相乗作用する。別のコロニー刺激因子であるＭ−ＣＳＦとの組み合わせで、相乗的抑制現象が観察される。すなわち、これらの２つの因子が組み合わさることにより、マクロファージ含有細胞コロニーの産生が部分的に抑制されることになる。
急性骨髄性白血病患者由来のいくつかの型の芽細胞において、ＧＭ−ＣＳＦは増殖のオートクラインメディエータとして作用する。ＧＭ−ＣＳＦは、好中球の強力な化学誘発物質である。これは、殺菌活性、酸化的代謝ならびに、好中球およびマクロファージの貪食活性を亢進する。また、これらの細胞の細胞障害性も高める。ＧＭ−ＣＳＦは、たとえばＧ−ＣＳＦよりも顕著ではない特異性を示す。これは、好中球、好酸球、単球系の増殖と分化を刺激する。また、対応する成熟形を機能的に活性化し、たとえば、特定の細胞表面接着タンパク質（ＣＤ−１１Ａ、ＣＤ−１１Ｃ）の発現を亢進する。これらのタンパク質の過発現は、炎症部位に顆粒球の局所的な蓄積が観察されることに対する１つの説明となり得る。さらに、ＧＭ−ＣＳＦは、好中球活性の刺激物質である、ｆＭＬＰ（ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ）の受容体の発現も亢進する。
ピコからナノモル濃度のＧＭ−ＣＳＦは好酸球に対して走化性であり、また、他の走化因子に応答したこれらの細胞の走化性挙動にも影響を及ぼす。
顆粒球では、ＧＭ−ＣＳＦは、アラキドン酸代謝物の放出および反応性酸素種の産生増加を刺激する。Ｎａ＋／Ｈ＋対向輸送系が活性化されることで、サイトゾルが迅速にアルカリ化される。好中球顆粒球の貪食活性および好酸球の細胞障害性も、ＧＭ−ＣＳＦにより相当に増強される。ＧＭ−ＣＳＦは、炎症応答部位に存在する細胞（Ｔリンパ球、組織マクロファージ、内皮細胞、肥満細胞）により産生されるので、それは炎症反応における重要なメディエータであろうと推定できる。
皮膚のランゲルハンス細胞の機能的状態もＧＭ−ＣＳＦに影響される。これらの細胞は、たとえば接触感作などの一次免疫反応を開始することができない。それらは、ＧＭ−ＣＳＦによって（またＩＬ１によっても）、非常に強力な免疫刺激樹状細胞に変換される。したがって、ランゲルハンス細胞は免疫学的に未熟なリンパ系樹状細胞のｉｎ ｓｉｔｕレザバーを形成する。抗原処理能増加の形で表れるこれらの細胞の成熟をＴＮＦ−αで下方制御することが可能である。
ナノモル濃度で、ＧＭ−ＣＳＦは好塩基球上の補体Ｃ３ａ受容体の発現を誘導する。通常はＣ３ａに応答せず、ＧＭ−ＣＳＦによって活性化されている細胞は、Ｃ３ａ刺激に応答して脱顆粒する。これには、ヒスタミンおよびロイコトリエンＣ４の放出を伴う。このプロセスは、炎症反応（Ｔリンパ球、組織マクロファージ、内皮細胞、肥満細胞）に関連した過敏症反応に意義のあるものとなり得る。また、ＧＭ−ＣＳＦは、栄養芽層インターフェロン（ＴＰ−１）の強力な誘導物質でもあることが分かっている。
ＧＭ−ＣＳＦは、ＩＬ１、ＩＬ３およびＧ−ＣＳＦをはじめとする、他のいくつかのサイトカインと相乗作用する。ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの好中球含有コロニーの発達を可能とするために連携的に作用しなければならない。
ＩＬ３自体は循環血液細胞数をごくわずかに増すだけであるが、次のＧＭ−ＣＳＦ投与量は細胞数を有意に増加させる。これはおそらく、ＧＭ−ＣＳＦに応答できる細胞がまず最初にＩＬ３によって増殖されるためである。
ほとんどのＩＬ３依存性細胞系がＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ４の存在下でも増殖でき、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ４との間にいくつかの相乗効果が見られるという観察結果から、これらの３つの因子は、細胞増殖の制御において似たような機能を果たすのではないかと考えられる。シグナル伝達機序に少なくともいくつかの共通因子が含まれている徴候もいくつかある。
発癌遺伝子によりコードされるチロシン特異的プロテインキナーゼを用いた実験により、因子依存性細胞でのこのキナーゼ活性の発現は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３およびＩＬ４に対するその依存性をなくすことが分かっている。これらの因子が細胞の増殖および分化を調節する正確な機序は依然として不明である。
ＧＭ−ＣＳＦの調節解除発現の結果を、構成的に発現させたＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を持つトランスジェニックマウスで研究した。ＧＭ−ＣＳＦをコードするトランスジーンが過発現されると、網膜に病理学的変化が生じ、失明が引き起こされ、筋肉の劣化も引き起こされる。これらのマウスは、活性化マクロファージの極めて顕著に増加しているのが特徴である。さらに、ＧＭ−ＣＳＦの過発現により、大量のＩＬ１およびＴＮＦを分泌している成熟マクロファージの活性化が起こることから、これらのサイトカインが、トランスジェニックマウスに見られる疾病のいくつかの態様を生む原因となっているのではないかと考えられる。
組織病理学的検査により、単球系前駆細胞個体群の目立った増加が実証される。ＧＭ−ＣＳＦトランスジェニック動物は、通常、これらの因子の過発現から生じる広範囲の組織損傷が原因で数ヶ月以内に死亡する。適切なレトロウイルスベクターを用いた形質転換でＧＭ−ＣＳＦを過発現するよう操作した骨髄を持つマウスで、似たような結果が得られている。しかしながら、これらの知見には臨床的な意義はないようである。霊長類およびマウスをＧＭ−ＣＳＦで長期にわたって処置しても、生命に危険を及ぼす合併症は起こらないことが示されている。
ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子破壊の生物学的結果を、目的とする遺伝子の欠失があるＥＳ細胞から産生したマウスで研究した。標的とするＧＭ−ＣＳＦ遺伝子破壊にホモ接合性のマウスは、造血が損なわれておらず定常状態にあるのが特徴であり、ＧＭ−ＣＳＦが、血液、骨髄、脾臓における主要な型の成熟造血細胞およびその前駆体の正常レベルを維持するのに不可欠ではないことを示している。
ほとんどのＧＭ−ＣＳＦ欠損マウスは見かけ上は健康で繁殖力もあるが、肺が異常な形で発達する。ＧＭ−ＣＳＦ欠損マウスに、特発性ヒト疾患の肺胞タンパク症を規定する特徴である、肺胞腔にサーファクタント脂質とタンパク質の進行性蓄積が生じる。肺気道および血管に関連した広範なリンパ濾胞増殖症も認められる。これらの結果は、肺のホメオスタシスにＧＭ−ＣＳＦが予想外の重要な役割を果たしていることを示すものである。
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ５受容体複合体の共通βサブユニット（βＣ）をコードする遺伝子のヌル変異にホモ接合性のトランスジェニックマウスは正常な発達を示し、若年成体の生存期間を生き延びる。これらのマウスには、肺胞タンパク症に似た肺気管支血管周囲リンパ浸潤および領域が生じる。ホモ接合の欠失変異体の末梢血および骨髄における好酸球数は減少するが、他の血液学的パラメータは正常である。ホモ接合の欠失変異体由来の骨髄細胞にはＧＭ−ＣＳＦの高親和性結合は見られないが、ヘテロ接合動物由来の細胞では高親和性受容体数が中程度である。ホモ接合の欠失変異体由来の骨髄細胞のクローン培養では、ＧＭ−ＣＳＦとＩＬ５とが高濃度であってもコロニー形成アッセイのコロニー形成が刺激されることはない。変異体と野生型の同腹仔の間に全身クリアランスおよびＧＭ−ＣＳＦ分布の違いは観察されない。
Ｎｉｓｈｉｎａｋａｍｕｒａらは、β−ｃ変異体マウスをＩＬ３が欠失したマウスと交差させた。ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ５の機能がすべて欠失した二重変異マウスは見かけ上は正常な繁殖力を持つ。これらの動物は、β−ｃ変異体マウスと同じように好酸球数が減少し、寄生虫に対する好酸球応答が欠失する。リステリア単球遺伝子に対する二重変異マウスの免疫反応は正常である。フルオロウラシル処置後の造血回復も正常である。これらの知見から、ＩＬ３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ５の存在に左右されない別の血球産生機序が存在するのではないかと考えられる。
ＧＭ−ＣＳＦについては、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球を含むコロニーの発達によるコロニー形成アッセイでアッセイ可能である。ＧＭ−ＣＳＦは、増殖がＧＭ−ＣＳＦの有無に左右されるか、またはこの因子に応答する細胞系（ＡＭＬ−１９３；Ｂ６ＳＵｔ−Ａ；ＢＡＣ１．２Ｆ５；ＢＣＬ１；Ｄａ；ＦＤＣＰ１；ＧＦ−Ｄ８；ＧＭ／ＳＯ；ＩＣ−２；ＭＯ７Ｅ；ＮＦＳ−６０；ＰＴ−１８；ＴＡＬＬ−１０３；ＴＦ−１；ＵＴ−７など）を用いる特異的バイオアッセイでも検出される。
ＧＭ−ＣＳＦは、血球の異常成熟または白血球の産生減少が特徴であるすべての疾病における造血の生理学的再構成に使用できる。ＧＭ−ＣＳＦの主要かつ最も重要な臨床用途は、おそらく化学療法および／または放射線療法後における生命を脅かす好中球減少に対する処置であり、これはＧＭ−ＣＳＦで処置することで大幅に抑えられる。ＧＭ−ＣＳＦは、化学療法誘導血球減少症をなくし、血球減少症に関連して感染や出血を起こしやすくなる問題に対処する目的で使用できる。
ＧＭ−ＣＳＦ投与後に合併症が生じる危険性を避けるために、特定の患者群、たとえば、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、炎症性疾患、自己免疫血小板減少症または免疫反応不全患者には、慎重な臨床監視が必要である。
いくつかの研究から、ＧＭ−ＣＳＦを使用すると細胞障害性薬剤での処置に対する寛容性が高くなり、処置の副作用がゆえに細胞障害性薬剤の用量を減らさなければならなくなるのを防ぐ目的でＧＭ−ＣＳＦを使用できることが実証されている。ＧＭ−ＣＳＦで処置することで、１コースあたりの細胞障害性薬剤の用量を増やせることが多い。これらの研究にから、ＧＭ−ＣＳＦで処置すれば罹患率も有意に減少することが分かっている。
機能的ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子を用いたネズミ腫瘍細胞の形質導入は、同系宿主によって、遺伝子的に修飾された細胞の拒絶が生じることが分かっている。さらに、ＧＭ−ＣＳＦ形質導入腫瘍細胞をワクチン接種することにより、野生型同系の腫瘍細胞の種菌のその後の増殖が防止される。
サイトカインのケモカインファミリは、白血球に走化性を誘導する、比較的小さく、構造的に類似したポリペプチドからなる。ケモカインは分子量が８〜１０ｋＤａであり、タンパク質レベルで互いにおよそ２０〜５０％の配列相同性を示す。これらのタンパク質には、共通の遺伝子構造と三次構造がある。すべてのケモカインが、分子内ジスルフィド結合形成に関与する多くの保存システイン残基を有する。
個々の遺伝子の染色体位置に基づいて、ケモカインの２つの異なるサブファミリを識別する。α−ケモカインのメンバは、４ｑケモカインファミリとも呼ばれる。なぜなら、このファミリのメンバをコードする遺伝子がヒト第４番染色体ｑ１２−２１に位置しているからである。このファミリのメンバの最初の２つのシステイン残基は１個のアミノ酸により分離されているため、これらのタンパク質はＣ−Ｘ−Ｃケモカインとも呼ばれる。このサブファミリとしては、９Ｅ３（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質Ｐ０８３１７など）、ＡＭＣＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ９９３６７、Ｍ９９３６８でコードされるポリペプチドなど）、β−トロンボグロブリン（Ｂｅｇｇ ＧＳら（１９７８）、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １７：１７３９〜４４に開示されているようなものなど）、ＣＩＮＣファミリメンバ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｄ２１０９５でコードされるポリペプチドなど）、ＥＮＡ−７８（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ７８６８６でコードされるポリペプチドなど）、エオタキシン（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ４６５７２、Ｕ４０６７２でコードされるポリペプチドなど）、ＧＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｙ０８７７０、Ｕ８３３０３でコードされるポリペプチドなど）、ＩＬ８、ＩＰ−１０（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｌ０７４１７、Ｘ０２５３０でコードされるポリペプチドなど）、ＫＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｊ０４５９６でコードされるポリペプチドなど）、ＬＩＸ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ２７２６７でコードされるポリペプチドなど）、ｍｉｇ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ３４８１５、Ｚ２４７２５でコードされるポリペプチドなど）、ＭＧＳＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ１２５１０でコードされるポリペプチドなど）、ｍｏｂ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ１７０３５でコードされるポリペプチドなど）、ＮＡＰ−２（Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓ Ｉら（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３１２８−３５、Ｃｏｈｅｎ ＡＢら（１９９２）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２６３：Ｌ２４９〜５６に記載されているようなもの）、ＮＡＰ−３（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＭら（１９９１）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７１：１０９１〜１００に記載されているようなもの）、ＮＡＰ−４（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ ＪＭら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １７２：８９８〜９０４に記載されているようなもの）、ＰＢＳＦ（ＳＤＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｄ２１０７２、Ｕ１６７５２、Ｄ５０６４５でコードされるポリペプチドなど）、ＰＦ４（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ２５８９７でコードされるポリペプチドなど）があげられる。
ＩＬ８、ＭＧＳＡ、マウスＫＣ、ＭＩＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ６５６４７でコードされるポリペプチドならびに、Ｂｌｕｍ Ｓら、Ｔｈｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ ｏｆ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９：５８９〜６０２（１９９０）；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ ＪＭら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ＭＩＰ−１ ａｌｐｈａ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｙｅａｓｔ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ４：７６〜８２（１９９２）；Ｄｅｖａｔｅｌｉｓ Ｇら、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｃＤＮＡ ｆｏｒ ｍｕｒｉｎｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ （ＭＩＰ）、ａ ｎｏｖｅｌ ｍｏｎｏｋｉｎｅ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｎｄ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６７：１９３９〜４４（１９８８）（ＪＥＭ １７０：２１８９（１９８９）の誤記）；Ｆａｒｂｅｒ ＪＭ、Ａ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｍＲＮＡ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｇａｍｍａ−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｅｎｃｏｄｅｓ ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｆａｃｔｏｒ ４ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）８７：５２３８〜４２（１９９０）；Ｈａｓｋｉｌｌ Ｓら、Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｈｕｍａｎ ＧＲＯ ｇｅｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ． Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）８７：７７３２〜６（１９９０）；Ｐｏｌｔｏｒａｋ ＡＮら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ４５（３）：２０７〜１９；Ｒｏｓｓｉ ＤＬら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５８（３）：１０３３〜１０３６；Ｓｈｅｒｒｙ Ｂら（１９８８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６８：２２５１〜９；Ｔｅｋａｍｐ−Ｏｌｓｏｎ Ｐら（１９９０）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １７２：９１１−９；Ｗｏｌｐｅ ＳＤら（１９８９）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ （ＵＳＡ） ８６：６１２〜１６；Ｗｏｌｐｅ ＳＤら（１９８９）ＦＡＳＥＢ Ｊｏｕｒｎａｌ ３：２５６５〜７３に記載されているものなど）、ＮＡＰ−２、ＥＮＡ−７８、ＧＣＰ−２は、アミノ末端付近の最初のシステイン残基直前の保存ＥＬＲ配列モチーフ（グルタミン酸−ロイシン−アルギニン）により規定されるヒトＣ−Ｘ−Ｃケモカインの部分群を含む。ＥＬＲ配列モチーフを持つケモカインが主に好中球を化学誘引および活性化することが判明している。ＥＬＲ配列モチーフを持たないケモカインは、単球、樹状細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂリンパ球、好塩基球、好酸球を化学誘引および活性化するようである。
β−ケモカインまたは１７ｑケモカインファミリのメンバは、ヒト第１７番染色体ｑ１１−３２（ネズミ第１１番染色体）に位置する。最初の２つのシステイン残基は隣接しているため、これらのタンパク質はＣ−Ｃケモカインとも呼ばれる。このサブファミリとしては、ＡＣＴ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｊ０４１３０でコードされるポリペプチドなど）、Ｃ１０（Ｂｅｒｇｅｒ ＭＳら（１９９３）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１２：８３９〜４７；Ｂｅｒｇｅｒ ＭＳら（１９９６）８：４３９〜４４７に記載されているものなど）、ＣＣＦ１８（Ｈａｒａ Ｔら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５５：５３５２〜８に記載されているものなど）、ＤＣ−ＣＫ１（Ａｄｅｍａ ＧＪら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８７：７１３〜７１７に記載されているものなど）、ＥＬＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．ＡＢ０００８８７、ＡＦ０５９２０８でコードされるポリペプチドなど）、エオタキシン−２（Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ Ｕら（１９９７）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １８５：２１７１〜２１７６に記載されているものなど）、エキソダス（Ｅｘｏｄｕｓ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ６４１９７、Ｕ８８３２０、Ｕ８８３２１、Ｕ８８３２２でコードされるポリペプチドなど）、ＦＩＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｌ０４６９４でコードされるポリペプチドなど）、ＧＤＣＦおよびＧＤＣＦ−２（Ｋｕｒａｔｓｕ Ｊら（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ８１：３４７〜５１；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｔら（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １６９：１４４９〜５９；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ Ｔら（１９８９）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １４２：１９５６〜６２に記載されているものなど）、ＨＣ−２１（Ｃｈａｎｇ ＨＣ＆Ｒｅｉｎｈｅｒｚ ＥＬ（１９８９）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １９：１０４５−１０５１に記載されているものなど）、ＨＣＣ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｚ４９２７０でコードされるポリペプチドなど）、Ｉ−３０９（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ５７５０２でコードされるポリペプチドなど）、ＪＥ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．ＡＦ０５８７８６、Ｍ２８２２６でコードされるポリペプチドなど）、ＬＡＧ−１（リンパ球活性化遺伝子−１）（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ５３６８３でコードされるポリペプチドなど）、ＬＡＲＣ Ｄ８６９５５）、ＬＤ７８ Ｅ０３１３０、Ｅ０３１３１、ＭＡＲＣ（Ｔｈｉｒｉｏｎ Ｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１：４９３〜４９９に記載されているものなど）、ＭＣＡＦ Ｍ２４５４５およびＡｐｅｌｌａ Ｅら（１９９０）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３４９：４０５〜１７に記載されているものなど）、ＭＣＰ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ１４７６８でコードされるポリペプチドなど）、ＭＣＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｙ１６６４５でコードされるポリペプチドなど）、ＭＣＰ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ７２３０８、Ｓ７１２５１でコードされるポリペプチドなど）、ＭＣＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ９８３０６でコードされるポリペプチドなど）、ＭＣＰ−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ５０７１２でコードされるポリペプチドなど）、ＭＩＰ（マクロファージ炎症性タンパク質）（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ７７１８０、Ｕ７７０３５、Ｕ４９５１３、Ｍ３５５９０でコードされるポリペプチドなど）、ＭＲＰ−２（Ｙｏｕｎ ＢＳら（１９９５）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５５：２６６１〜７に記載されているものなど）、ＲＡＮＴＥＳ ＳＤＦ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ２１１２１、Ｍ７７７４７でコードされるポリペプチドなど）、ＴＡＲＣ（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質受託Ｎｏ．Ｑ９２５８３など）があげられる。
さらに、ケモカインに関連していながらも上記の２つのケモカイン群にはまだ指定されていないか、上記２つのケモカイン群のどちらの伝統的な特徴も持たない他の因子がいくつかある（たとえば、ＡＴＡＣ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ８６４７４でコードされるポリペプチドなど）、Ｌｔｎ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ１５６０７、Ｕ２３７７２でコードされるポリペプチドなど）、ＳＣＭ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｄ６３７８９、Ｄ６３７９０、Ｄ４３７６９でコードされるポリペプチドなど）。これらの因子はＣ型ケモカインまたはγ−ケモカインと呼ばれている。
ニューロタクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．ＡＦ０１０５８６でコードされるポリペプチドなど）を含むさらに別の群のケモカインも同定されており、その特徴はＣＸ（３）Ｃシステインサイン（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）モチーフを持つことにある。構造的および機能的特性に基づいて明確に規定されたケモカインの部分群が存在するのは、生体での白血球の移動の調節において化学誘引物質の多様性が重要だということである。
ケモカインの生物活性は特異的受容体によって取り持たれ、またこれらのタンパク質のうちのいくつかに結合する重複したリガンド特異性をもつ受容体によっても取り持たれる。これらは常にＣ−ＣケモカインまたはＣ−Ｘ−Ｃケモカイン群のいずれかに属する。ケモカイン受容体は、膜を横断する７個の疎水性αヘリックスセグメントを含む、７回膜貫通ドメインを持つＧタンパク質共役受容体の大きな群に属する。これらの受容体は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質を介してシグナル伝達を取り持つＧタンパク質共役受容体のスーパーファミリ内に構造的に関連する群を形成する。
Ｃ−Ｘ−Ｃケモカインを結合する受容体はＣＸＣＲの後ろに数字を付けて表される（ＣＸＣＲ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｌ１９５９１でコードされるポリペプチドなど）、ＣＸＣＲ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ９４５８２でコードされるポリペプチドなど）、ＣＸＣＲ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ９５８７６でコードされるポリペプチドなど）、ＣＸＣＲ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｄ８７７４７、ＡＦ０２５３７５でコードされるポリペプチドなど））のに対し、Ｃ−Ｃケモカインを結合する受容体はＣＣＲの後ろに数字を付けて表される（ＣＣＲ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｌ０９２３０、Ｕ２９６７８でコードされるポリペプチドなど）、ＣＣＲ−２（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ２９６７７、Ｕ９５６２６でコードされるポリペプチドなど）、ＣＣＲ−３（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ５１２４１でコードされるポリペプチドなど）、ＣＣＲ−４（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｘ９０８６２、Ｘ８５７４０でコードされるポリペプチドなど）、ＣＣＲ−５（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ５４９９４、Ｕ８３３２７でコードされるポリペプチドなど）、ＣＣＲ−６（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｕ９５６２６でコードされるポリペプチドなど）、ＣＣＲ−７（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｌ３１５８１でコードされるポリペプチドなど）、ＣＣＲ−８（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｚ９８２０６、Ｕ４５９８３でコードされるポリペプチドなど））。ウイルスケモカイン受容体相同体には、ＥＣＲＦ−３、ＥＢＩ−１（ＥＢＶ誘導遺伝子−１）、ＵＳ２８がある。
現在、複数のケモカインと他のメディエータとの組み合わせによる効果が、炎症部位での細胞組成物に関与しているであろうと仮定されている。さらに、多くのケモカインが細胞を直接活性化する。ケモカインの中には、顆粒球および／または単球を活性化し、呼吸バースト、脱顆粒、リソソーム酵素の放出を引き起こすものがある。また、免疫細胞を感作して、最適以下の量の他の炎症性メディエータに応答させるケモカインもある。さらに、好塩基球の強力なヒスタミン放出因子であることが分かっているケモカインもある。赤血球が自己の雑多なケモカイン受容体を介してケモカインネットワークの調節に重要な役割を果たしているという見方が出ている。赤血球受容体に結合したケモカインは自己の正常な標的細胞に接近できないことが知られている。これは余分のケモカインのシンク（ｓｉｎｋ）を提供するようにみえ、炎症部位で起こる局所的プロセスを中断させることなく、これらのメディエータの全身効果を制限する上で役立つことがあり得る。
特定のＣ−Ｃケモカインの中には、単なる走化性以外の生物活性を示すものがある。いくつかのケモカインが、ＩＬ２により活性化される細胞に類似した、ＣＨＡＫ（Ｃ−Ｃケモカイン活性化キラー）として知られるキラー細胞の増殖および活性化を誘導できることが分かっている。
本発明の別の特に有用なサイトカインに、ｆｌｔ−３リガンド（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｕ０４８０６、Ｕ０４８０７、Ｕ０３８５８、Ｌ２３６３６、Ｕ２９８７４、Ｕ２９８７５、Ｕ４４０２４でコードされるポリペプチドなど）がある。このサイトカインは、ｆｌｔ−３チロシンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｚ２６６５２、Ｘ５９３９８でコードされるポリペプチドなど）に結合する。ヒトｆｌｔ−３リガンドはネズミｆｌｔ−３受容体を発現している細胞の増殖も刺激する。
ｆｌｔ−３リガンドによる作用は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＰＩＸＹ−３２１、ＳＣＦの共発現により相乗される。ＳＣＦとＩＬ３との組み合わせで、ｆｌｔ−３リガンドは、マーカースペクトルＣＤ３４（＋）ＣＤ３８（−）の細胞の増殖を引き起こすことができる。ｆｌｔ−３リガンドだけが、ＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−ＧＥＭＭなどの血液形成細胞ならびに、非常に原始的な高増殖能コロニー形成細胞の系統の前駆細胞型の生存を支持する。赤血球および巨核球前駆細胞に対して辺縁効果を持つのはｆｌｔ−３リガンドだけである。
マウスでは、ｆｌｔ−３リガンドは、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ３、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ１１、ＩＬ１２およびＳＣＦと相乗して、さまざまな型の前駆体／前駆細胞の増殖を強力に亢進させる。ｆｌｔ−３リガンドは、ＬＴＣ−ＩＣ（長期培養開始細胞）の増殖を支持する。ｆｌｔ−３リガンドが造血前駆細胞の生存を促進する機能はＴＧＦ−βにより抑止され、ＴＮＦ−αにより相殺される。
機能的ｆｌｔ−３受容体の発現ならびに、ＡＭＬ（急性骨髄性白血病）およびＡＬＬ（急性リンパ性白血病）におけるリガンドに対する応答についての研究から、かなりの異種性が示される。特にＢＣＰ−ＡＬＬは、ｆｌｔ−３リガンドの存在下では、表面ｆｌｔ−３受容体の発現が強力であるにも関わらず増殖することができない。
再生不良性貧血患者ならびに化学療法により一過的な造血抑制を誘導したがん患者では、ｆｌｔ−３リガンドの血清レベルが骨髄の機能低下の程度に反比例して変動することが分かっている。ｆｌｔ−３リガンドの血清レベルは、再生不良性貧血患者由来の骨髄前駆体のｉｎ ｖｉｔｒｏでのコロニー形成能と逆相関する。同系線維肉腫細胞で攻撃したマウスをｆｌｔ−３リガンドで処置すると、腫瘍の完全な退行と腫瘍増殖速度の低下につながることが分かっている。
抗腫瘍性サイトカインは、本発明の方法および組成物に特に有用である。本発明によれば、「抗腫瘍性サイトカイン」とは、細胞と混合するか動物に投与したときに、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞の増殖または転移を制限できるか、そうでなければ腫瘍を持つ動物の生存期間を延ばすことができるサイトカインである。このサイトカインは、ＰＢＳなどの生物学的適合性の緩衝液に加えて溶液として製剤化し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞と混合可能なものである。サイトカインの濃度は、ピコモル範囲程度からマイクロモル範囲程度であれば構わない。抗腫瘍性サイトカインは、たとえば細胞接着性が増加したり人工基底膜などの細胞外マトリックス基質への侵入能が低下したりすることから分かるように、たとえば細胞の増殖速度を緩衝液だけの場合よりも少なくとも１０％などの率で低下させるか、細胞の転移特性を阻害する。あるいは、抗腫瘍サイトカインは、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の増殖または転移を阻害できるか、腫瘍を持つ動物の生存期間を延ばすことができる。サイトカインのｉｎ ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果を評価するには、サイトカインを薬学的に許容されるキャリアで製剤化し、静脈内、腫瘍内または腹腔内注射などにより投与すればよい。また、サイトカインを発現するか、あるいはサイトカインで被覆された腫瘍細胞などの細胞に付随してサイトカインを投与してもよい。
生物活性のアッセイ
本発明によれば、サイトカインは、「生物活性」、「高度に生物活性」、「極めて生物活性」、「もともと（ｎａｔｉｖｅｌｙ）生物活性」または「超生物活性」であることが好ましい。生物活性のレベルが異なっているのは、白血球に（サイトカインの白血球受容体への単なる占有以上の）変化を誘導する機能と関連している。本発明によれば、自然界に存在するサイトカインはいずれも、もともと生物活性である。多くのタイプのアッセイで、自然界に存在しないサイトカインの生物活性を実証できる。たとえば、あるサイトカインが特定の細胞型の生存および／または増殖を誘導することを実証できる。別の例として、あるサイトカインは、ｃＡＭＰ、アラキドン酸、カルシウムイオンまたはイノシトール三リン酸などの細胞内二次メッセンジャの濃度を変化させることができる。以下は、生物活性のアッセイの例である。
アッセイ１
１つ以上の６０ウェルＬｕｘマイクロタイタートレーの各ウェルに、新生仔ウシ血清最終濃度１０％で１０ｕｌダルベッコ変法イーグル培地中の２００ＦＤＣ−Ｐ１細胞を入れる。最大でマイクロモル範囲の濃度のサイトカインを、容量５μｌで各ウェルに加える。トレーを１０％ＣＯ２中にて３７℃で４８時間インキュベートする。生存細胞数を計数する。ウェル１つあたりの生存細胞を計数する。このアッセイは、たとえば、ネズミＧＭ−ＣＳＦ受容体を介してなされる生物活性の同定に有用である。
アッセイ２
サイトカイン検体と、自然界に存在するサイトカインと同一の組換え標準試料とを、９６ウェルの平底マイクロタイタープレートの完全ＲＰＭＩ−１０中で各々連続希釈する。各希釈液をトリプリケートで蒔く。増殖が活発な（ａｃｔｉｖｅ）対数期のＣＴ．４Ｓ細胞を回収し、完全ＲＰＭＩ−１０中で少なくとも２回洗浄し、完全ＲＰＭＩ−１０に細胞１×１０５個／ｍｌで再懸濁させる。細胞懸濁液５０ｕｌをプレートの各ウェルに加え、次いでこれを５％ＣＯ２中にて３７℃で２４時間インキュベートする。トリチウム化チミジンを各ウェルに加え、プレートをさらに２４時間インキュベートする。続いて細胞を収集し、トリチウムの取り込みを液体シンチレーション法で測定する。このアッセイは、たとえば、ＩＬ−４受容体を介してなされる生物活性の同定に有用である。
アッセイ３（コロニー形成アッセイ）
寒天（４％ｗ／ｖ）を３分間煮沸して滅菌水中で煮溶かす。続いて、この寒天を４２℃まで冷却し、最終濃度が０．４％になるまで４２℃のＲＰＭＩ−１５に加える。この溶液を４２℃で維持する。若年マウスから無菌法で大腿骨を取り出す。２３Ｇ針付きシリンジで骨の開放端に無菌ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）を流すことにより、骨髄を採取する。骨髄を１５ｍｌ容の組織培養チューブに入れ、ボルテックスをかけ、細胞懸濁液とする。骨断片を５分間静置し、上清懸濁液を除去する。この懸濁液を有核細胞７．５×１０６個／ｍｌに調整し、４２℃の０．４％寒天含有ＲＰＭＩを添加して１：１００に希釈する。サイトカインの２倍連続希釈液を容量０．２ｍｌ以下で３５ｍｍの組織培養皿に加える。対照皿にはサイトカインを加えない。１ｍｌの温細胞懸濁液を各皿に加え、寒天を室温に設定する。培養物を５％ＣＯ２中にて３７℃で５〜７日間インキュベートする。続いて、コロニー形成を顕微鏡で評価する。サイトカインプレートでの特定の型のコロニーの平均数（または特定の異なる型のコロニーの凝集数）と対照プレートでの平均数とを計数する。このアッセイは、たとえば、ＣＳＦ受容体を介してなされる生物活性の同定に有用である。
アッセイ４
サイトカインを、ＲＰＭＩ １６４０／２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ／１％ＢＳＡ中で連続希釈する。各希釈液２５ｕｌをマルチウェル走化性チャンバの底にトリプリケートで蒔く。培地だけしか入っていないウェルを陰性対照として使用し、自然界に存在する走化性誘導サイトカインの入ったウェルを陽性対照として使用する。ポリカーボネート膜をチャンバの底においてチャンバを組み立てる。ＲＰＭＩ／ＨＥＰＥＳ／ＢＳＡ中細胞１．５×１０６個／ｍｌの末梢血単核細胞５０ｕｌをチャンバの上部ウェル各々に加える。このチャンバを５％ＣＯ２中にて３７℃で９０分間インキュベートする。膜を取り出し、洗浄し、染色する。各ウェルの３〜５個のランダムな視野内で移動する細胞を顕微鏡で計数する。
アッセイ５
自然界に存在するサイトカイン基準標準試料を、補充培地を使用して１７×１００ｍｍのチューブで２ｎｇ／ｍｌまで希釈する。５倍の連続希釈液をさらに３つ調製する。２ｎｇ／ｍｌから２０ｐｇ／ｍｌまで、１７×１００ｍｍのチューブでサイトカインの連続希釈液を調製する。補充培地中５０ｕｌのＰＨＡ活性化ヒトリンパ芽球細胞４×１０５個／ｍｌを９６ウェルの平底マイクロタイタープレートの各ウェルに入れる。基準標準試料またはサイトカインの希釈液５０ｕｌずつをトリプリケートでウェルに加える。陰性対照ウェルには補充培地５０ｕｌのみを入れる。このプレートを５％ＣＯ２中にて３７℃で４８時間インキュベートし、細胞をトリチウム化チミジンで標識する。取り込みについては、液体シンチレーション法で測定する。このアッセイは、たとえば、ＩＬ−１２受容体を介してなされる生物活性の同定に有用である。
アッセイ６
生物活性の別のアッセイでは、放射線照射したサイトカイン形質導入腫瘍細胞またはサイトカイン被覆腫瘍細胞を免疫適格性動物に１０４〜１０８個前後ワクチン接種し、１０４〜１０８個前後の生きた野生型腫瘍細胞で（任意の時間的順序で）攻撃する。アッセイのリードアウトは、生存、腫瘍発生または転移数である。
サイトカインアッセイのさらに別の例を、Ｃａｌｌａｒｄ ＲＥら、Ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ．ｉｎ：Ｃｌｅｍｅｎｓ ＭＪら（編）Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第３４５〜６４ページ、ＩＲＬ出版、オックスフォード、１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎ ＪＥら、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｇｒｅｎｅ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク、１９９１）；Ｄｏｔｓｉｋａ ＥＮ Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２：９３２〜５（１９８９）；Ｆｅｌｄｍａｎｎ Ｍら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ａｓｓａｙｓ：ｒｏｌｅ ｉｎ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ １１９：１０５〜１２３（１９９１）；Ｇｕｉｇｕｅｔ Ｍら、Ｍｉｓｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ ａｔｔｒｉｂｕｔａｂｌｅ ｔｏ ｕｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４７（２）：４４１〜４４２（１９９７）；Ｈａｍｂｌｉｎ ＡＳ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ Ａ、Ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｋｌａｕｓ ＧＧＢ （ｅｄｔ），第２０９〜２８ページ、ＩＲＬ出版、オックスフォード（１９８７）；Ｌａｓｋａ ＥＭ＆Ｍｅｉｓｎｅｒ ＭＪ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｉｏａｓｓａｙ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２７：３８５〜９７（１９８７）；Ｍｏｓｍａｎ ＴＲ＆Ｆｏｎｇ ＴＡＴ、Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１６：１５１〜８（１９８９）；Ｎｅｗｔｏｎ ＲＣ＆Ｕｈｌ Ｊ Ａｓｓａｙｓ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｔｏ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｍｏｄｅｒｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：８３〜９９（１９８９）；Ｔｈｏｒｐｅ Ｒら、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．６：１３３〜４８（１９９２）；ｖａｎ Ｚｏｅｌｅｎ ＥＪ、Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒｓ． Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２：１３１〜５２（１９９０）；Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙ ＦＰ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｂｉｏａｓｓａｙ．Ｉｎ：Ｇａｌｌａｇｈｅｒ Ｇら（編）、Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ．オックスフォード大学出版局、第１７９〜３０３ページ（１９９３）；Ｗａｄｈａ Ｍら、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．Ｉｎ：Ｂａｌｋｗｉｌｌ ＦＲ （ｅｄｔ）Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ、Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．オックスフォード大学出版局、第３０９〜３３０ページ（１９９１）などから見出すことが可能である。
本発明によれば、自然界に存在しないサイトカインでの生物活性アッセイのリードアウトが、これと等モル量の自然界に存在するサイトカインで得られるリードアウト（後者はアッセイで陽性結果が出る）の１０％以上２９％以下（誤差１％未満）になる場合、その自然界に存在しないサイトカインは「生物活性」である。本発明によれば、自然界に存在しないサイトカインでの生物活性アッセイのリードアウトが、これと等モル量の自然界に存在するサイトカインで得られるリードアウト（後者はアッセイで陽性結果が出る）の３０％以上４９％以下（誤差１％未満）になる場合、その自然界に存在しないサイトカインは「高度に生物活性」である。本発明によれば、自然界に存在しないサイトカインでの生物活性アッセイのリードアウトが、これと等モル量の自然界に存在するサイトカインで得られるリードアウト（後者はアッセイで陽性結果が出る）の５０％以上６９％以下（誤差１％未満）になる場合、その自然界に存在しないサイトカインは「極めて生物活性」である。本発明によれば、自然界に存在しないサイトカインでの生物活性アッセイのリードアウトが、これと等モル量の自然界に存在するサイトカインで得られるリードアウト（後者はアッセイで陽性結果が出る）の７０％以上１００％（誤差１％未満）になる場合、その自然界に存在しないサイトカインは「もともと生物活性」である。本発明によれば、自然界に存在しないサイトカインでの生物活性アッセイのリードアウトが、これと等モル量の自然界に存在するサイトカインで得られるリードアウト（後者はアッセイで陽性結果が出る）の１００％を上回る場合、その自然界に存在しないサイトカインは「超生物活性」である。
本発明で有用なＣＤ４０のリガンド
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｙ１０５０７、Ｍ８３３１２、Ｕ５７７４５などから、さまざまな種のＣＤ４０タンパク質をコードするヌクレオチド配列が得られる。ヒトＣＤ４０は、２７７アミノ酸長（４８ｋＤａ）の膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ４０はリンタンパク質であり、ホモ二量体として発現可能である。ＣＤ４０の可溶性の形態（２８ｋＤａ）も明らかになっている。ＣＤ４０タンパク質は、さまざまな発達段階にあるすべてのＢリンパ球、活性化Ｔ細胞および単球、濾胞性樹状細胞、胸腺上皮細胞ならびにさまざまな癌腫細胞系で発現される。また、このタンパク質は、ほとんどの成熟Ｂ細胞悪性腫瘍やいくつかの初期Ｂ細胞急性リンパ性白血病でも発現される。形質細胞疾患患者由来の骨髄腫細胞系および骨髄腫細胞の大半にＣＤ４０が認められている。
ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ３またはＩＦＮ−γでの処置後に、初代（ｐｒｉｍａｒｙ）ヒト単球でのＣＤ４０ ｍＲＮＡの誘導ならびに細胞表面タンパク質発現の亢進が観察される。ヒトＣＤ４０遺伝子は第２０番染色体に位置する。
ＣＤ４０はメモリ細胞の発達に何らかの役割を果たすという見方が出ている。また、細胞活性化にも何らかの役割を果たし、コンピテンス因子および進行因子として機能する。ＣＤ４０抗原（ＩＬ４およびＩＬ５などのサイトカインとの組み合わせで）の架橋によりＢ細胞が増殖し、活性化Ｔ細胞の非存在下でＩｇＭからＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥの合成への免疫グロブリンのクラススイッチが誘導される。ＣＤ４０は、ナイーブＢ細胞が確実にＩｇＡを分泌するために必要な必須シグナルのひとつである。ＩｇＡ誘導の機序にはＩＬ１０とＴＧＦ−βとが協働する必要がある。可溶性ＣＤ４０はＴ細胞依存性のＢ細胞増殖を阻害する。
ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は、（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８（ＬＦＡ−１）による）細胞内接着の誘導、短期および長期の増殖、分化、タンパク質のチロシンリン酸化の増加をはじめとして、Ｂリンパ球に対するさまざまな作用を取り持つ。ＣＤ４０および抗原受容体を介した活性化によって、胚中心細胞でのアポトーシスによる細胞死が阻止される。
ヒト休止期Ｂ細胞では、ＣＤ４０の発現はＩＬ４によって誘導される。ヒトＢ細胞をＩＬ６で処置すると細胞内ＣＤ４０ドメインのリン酸化が起こる。しかしながら、ＣＤ４０はＩＬ６の受容体として機能する。活性化ヒトＢ細胞では、ＣＤ４０に指向したモノクローナル抗体で細胞を処置するとＩＬ６の合成が誘導されることから、ＣＤ４０がＩＬ６依存のシグナル形質導入機序に関わっているのではないかと考えられる。
神経成長因子、ＴＮＦ−α、ＣＤ２７の受容体で限られた配列相同性がいくつか見出されており、ＣＤ４０は、これらのサイトカインや他のサイトカインの生物活性の調節にも関与しているのではないかと推測される。
ＣＤ４０には非免疫細胞のような生物学的機能があるが、その大部分は依然として分かっていない。ＣＤ４０のライゲーションにより、間葉および上皮起源の形質転換細胞でアポトーシスによる細胞死が誘導されることが分かっている。部分的に、これらのプロセスはＣＤ４０の細胞質ドメインに存在する死ドメインを介してなされる。
特に有用なＣＤ４０のリガンドのひとつがＣＤ１５４である。ＣＤ１５４（「ＣＤ４０リガンド」；ヒトタンパク質２９．３ｋＤａ、アミノ酸２６１個）は、ＴＮＦファミリのタンパク質のメンバである。このヒトタンパク質は、ネズミＥＬ４胸腺腫細胞から単離した同様のタンパク質に対して、ｃＤＮＡレベルで同一性が８２．８％、タンパク質レベルで７７．４％である。どちらのタンパク質も、休止期Ｂ細胞で発現されるＣＤ４０細胞表面抗原のリガンドである。ＣＤ１５４をコードするヒト遺伝子は染色体Ｘｑ２６．３−ｑ２７に位置する。さまざまな種のナイーブＣＤ４０リガンドをコードするヌクレオチド配列が、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ６７８７８、Ｘ９６７１０、Ｘ６８５５０、Ｘ６５４５３、Ｚ４８４６９、Ｌ０７４１４などで得られる。さまざまな種のＣＤ１５４分子のアミノ酸配列が、Ｅｎｔｒｅｚタンパク質データベース受託番号１７０５７１３、２３１７１８、５６０６９３、３０４７１２９、１１６０００、１５１８１７０、３８４１２、１０９６３９、１０８３０１４、３８４８４、３７２７０などで得られる。
ＣＤ１５４はもともと膜貫通ポリペプチドとして合成されている。それにもかかわらず、ヒトＣＤ１５４の生物活性可溶性断片が明らかになっている（Ｐｉｅｔｒａｖａｌｌｅら、１９９６、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７１：５９６５〜５９６７）。ＣＤ１５４の生物活性可溶性断片が、Ｍａｚｚｅｉら（１９９５、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７０：７０２５〜７０２８）によって、ｉｎｔａｃｔ 膜貫通ＣＤ１５４のアミノ酸Ｇｌｕ １０８からＬｅｕ ２６１で構成されるポリペプチドのホモ三量体として同定された。また、Ｍｅｔ １１３でのタンパク質分解性の開裂によって生成されるＣ末端断片で構成される別の活性断片について、Ｇｒａｆら（１９９５、Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２５：１７４９）による説明がある。ＣＤ１５４の可溶性の形態と、Ｂ細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏにて刺激する目的でこれを使用することが、米国特許第５，５４０，９２６号においてＡｒｕｆｆｏらによって開示されている。本発明では、ＣＤ４０の特に有用なリガンドとして、アミノ酸残基４７から２６１の、’９２６号特許の配列番号２に示される配列を含むポリペプチドがあげられる。これらの残基はヒトＣＤ１５４の細胞外ドメインで構成される。
もうひとつの特に有用なタイプのＣＤ４０のリガンドに、ＣＤ４０に対する抗体がある。このような抗体の例として、Ｈａｒｌａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ（インディアナ州インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ））の製品番号ＭＣＡ１１４３およびＭＣＡ１５９０のモノクローナル抗体；Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（メイン州ケネバンク（Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ））のカタログ番号Ｐ６１６４０Ｆ（クローン１４Ｇ７により産生）、Ｐ４２３７４Ｍ（クローンＭＡＢ８９により産生）、Ｐ６１０４６Ｍ（クローンＢＬ−Ｃ４により産生）、Ｐ５４４８６Ｍ（クローンＢ−Ｂ２０により産生）のモノクローナル抗体；Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ニューヨーク州レークプラシッド（Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ））のカタログ番号０５−４２２（クローン６２６．１により産生）のモノクローナル抗体；Ｍａｂｔｅｃｈ（スウェーデンのネッカ（Ｎａｃｋａ））のカタログ番号３６０１（クローンＳ２Ｃ６により産生）のモノクローナル抗体；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（ニュージャージー州フランダース（Ｆｌａｎｄｅｒｓ））のカタログ番号ＲＤＩ−ＣＢＬ４８６（クローンＢＢ２０により産生）、ＲＤＩ−Ｍ１６９１ｃｌｂ（クローンＣＬＢ−１４Ｇ７により産生）、ＲＤＩ−ｍＣＤ４０−３２３（クローン３／２３により産生）のモノクローナル抗体；Ｓｃｈｗａｂｅら、１９９７、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １６：２１７〜２２６に記載のモノクローナル抗体；Ｂｊｏｒｃｋら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８３：４３０〜４３７に記載のモノクローナル抗体；Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら、１９９４、Ｃｉｒｃ Ｓｈｏｃｋ ４４：６７〜７２に記載のモノクローナル抗体Ｇ２８−５；Ｂｕｓｋｅら、１９９７、Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ ２５：３２９〜３３７に記載のモノクローナル抗体があげられる。
本発明で有用なオプソニン
上記にて定義したように、「オプソニン」は、たとえば、貪食白血球（単球およびマクロファージを含む）、樹状細胞（たとえば、皮膚のランゲルハンス細胞）、Ｂリンパ球、ヒトでの内皮細胞などの抗原および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方に結合する自然界に存在する分子および自然界に存在しない分子、あるいは、プロセス段階（単数または複数）の少なくとも１つの産物が、たとえば、貪食白血球、樹状細胞、Ｂリンパ球、ヒトでの内皮細胞などの抗原および抗原提示細胞（ＡＰＣ）の両方に結合できるように処理され得る分子を示す。
いずれかひとつの作用機序に拘泥されることなく、オプソニン増強細胞は本発明による有益な効果をもたらすものであると考えられる。なぜなら、オプソニンポーションが抗原とＡＰＣと間の連結因子またはカップリング因子として作用し、抗原を一層効率的に結合、貪食、内部移行できるからである。さらに、オプソニン自体が抗原と共に内部移行できる。「内部移行」とは、細胞質または細胞の細胞質内の区画に細胞が入るように、分子が細胞を取り込むことを示す。貪食作用は分子が細胞によって内部移行されるプロセスである。
好ましいオプソニンは、ヒトオプソニンなどの霊長類オプソニンなどの非齧歯類オプソニンである。本発明で有用なオプソニンは、本願明細書に記載したように、自然免疫に何らかの役割を果たす細胞上の受容体などのＡＰＣ上の受容体（マクロファージなどの貪食白血球および貪食系の他の細胞など）に結合する。
何組かのオプソニンについて、構造的および機能的に類似とみなすことができる。たとえば、補体成分Ｃ３およびＣ４の断片を含むファミリがある。これらの２つの成分は、高度に構造的に相同であり、各々、ペプチド（それぞれＣ３ａまたはＣ４ａ）が未変性分子からタンパク質分解的に切断されると破壊される分子内チオールエステル結合を有する。チオールエステルの破壊により、抗原との間でエステル連結を形成できる化学構造を利用できるようになる。このエステル結合があるＣ３部分すなわち非Ｃ３ａ部分はＣ３ｂと呼ばれ、Ｃ４ｂはＣ４開裂の類似産物である。また、Ｉ因子などのタンパク質によりＣ３ｂをさらにタンパク質分解し、エステル結合を介して抗原に連結したままのＣ３ｂｉおよびＣ３ｄなどの断片を得ることができる。
生物学的に活性で膜に結合したＣ３および／Ｃ４の断片の高親和性受容体として機能することが知られる構造的にユニークな４つのタンパク質がある。ＣＲ１は、Ｃ３のＣ３ｂ断片およびＣ４のＣ４ｂ断片の主要な受容体である。それは他の細胞型の中でも特に単球および単球由来ＡＰＣ上に発現される。ＣＲ２は、Ｃ３ｄとして知られるＣ３の断片の主要な受容体であり、成熟Ｂリンパ球などに発現されるが、単球系細胞には発現されない。Ｂリンパ球でのＣＲ２の主な役割は、その同族抗原と連携したＢ細胞の直接的な共刺激であると考えられる。
ＣＲ３は、主に好中球および単球により発現され、ＦＤＣ、クッパー細胞、ＮＫ細胞にも発現される。ＣＲ３は、Ｃ３ｂｉに主な特異性をもつＣ３断片受容体である。ＣＲ３は、貪食作用などのプロセスでの接着相互作用および膜再構成に必要な細胞骨格事象の重要な形成体として提唱されている。
ＣＲ４は、β２インテグリンファミリのメンバであり、そのα鎖は、ＣＲ３およびＬＦＡ−１のα鎖に構造的に類似している。その主な生理学的リガンドは、Ｃ３ｄおよびＣ３ｄ、ｇであると考えられているが、その生物活性はＣＲ３ほどは解明されていない。
自然オプソニンのファミリのもうひとつの例に、補体成分Ｃ１ｑ、マンノース結合タンパク質、サーファクタントタンパク質ＡおよびＤ、コングルチニンを含む、コラーゲン様Ｃ型レクチン群のコレクチンがある。各分子は、抗原に結合できるレクチンドメインならびに、Ｃ１ｑ受容体と全体または一部が同一の受容体を含む、貪食性単核細胞上の受容体に結合できるコラーゲン様ドメインを含む（Ｎｅｐｏｍｕｃｅｎｏら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６：１１９〜２９；Ｔｅｎｎｅｒら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３：４８５〜９３；Ｇｕａｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５２：４００５〜１６；Ｇｅｅｒｔｓｍａら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６７：Ｌ５７８〜８４；Ｍｉｙａｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３００：２３７〜４２；Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７２：９５５〜９；Ｍａｌｈｏｔｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９３：１５〜１９）。周知のコレクチンはその大半が、一部、ヒドロキシプロリン残基とヒドロキシリジン残基の共有結合的架橋により、翻訳後に構築された、あるときはホモマーで別のときはヘテロマーである複数のポリペプチド鎖を含む。コレクチンは、たとえば、Ｐｉｋａａｒら、Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １７２：４８１〜９；Ａｌｖａｒｅｚ−Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚら、Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ＆Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ６１：３６６４〜７２；Ｋｕｈｌｍａｎら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６９：１７３３〜４５；Ｇｅｅｒｔｓｍａら（前掲）において、オプソニンであることが実証される。
本発明で有用な他の自然オプソニンには、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、α−２マクログロブリン、フィブロネクチンがある。ペントラキシンファミリの分子のメンバであるＣＲＰは、単球系細胞上の受容体に結合し、オプソニンであることが分かっている（ＴｅｂｏおよびＭｏｒｔｅｎｓｏｎ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４４：２３１〜８；Ｈｏｌｚｅｒら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １３３：１４２４〜３０）。α−２マクログロブリンは、Ｃ３およびＣ４と同様に、分子がタンパク質溶解されたときに破壊可能な内部チオールエステル結合を含む。このような破壊により、抗原への分子の共有結合が可能となり、α−２マクログロブリンがＡＰＣに結合することで、コンジュゲートの取り込みを促進できる。フィブロネクチンは、α５β１インテグリンに結合し、また、さまざまな抗原にも結合可能なことから、オプソニンとして機能できるようになる（Ｃｏｓｉｏ、Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １０３：６１３〜９；ＣｚｏｐおよびＡｕｓｔｅｎ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２９：２６７８〜８１）。
免疫グロブリン（抗体）は、その可変領域を介して抗原を結合し、定常領域を介してＡＰＣを結合することにより、オプソニンとして機能することが可能である。一般に、免疫グロブリンは、互いに共有結合し、各々が１つの軽鎖に結合した２つの重鎖を含む。これらのヘテロ四量体をさらにＩｇＭの五量体などのさらに高次な構造にすることも可能である。抗原結合部位の構造には重鎖と軽鎖の両方の可変領域によって得られているのに対し、ＡＰＣ結合部位は重鎖の定常領域上に位置する。組換え単鎖抗体も明らかになっている。免疫グロブリンのＡＰＣ受容体は、それぞれＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭのＦｃα、Ｆｃγ、Ｆｃε、Ｆｃμ受容体を含む。
多細胞真核生物によって自然に発現されるオプソニンが分泌される。後者の特徴がオプソニンと接着分子との違いである。自然界に存在するＡＰＣ結合部分を含む自然界に存在しない分子は、自然界に存在する抗原の抗原結合部分を含むか否かに関わらず、ＡＰＣ結合部分が細胞外空間に位置するような形で細胞に対して安定して結合または付着させられる部分がある場合に、オプソニンであるとみなすものとする。分子を細胞に対して安定して結合させられる部分としては、架橋部分、膜貫通配列、脂質部分があげられる。これらの配列または部分を含むタンパク質の調製については、当業者間で周知である。
「オプソニンのＡＰＣ結合部分」は、キメラ分子に含まれた場合に、このキメラ分子が少なくともナノモル範囲の親和性でＡＰＣ上に生理学的に発現される受容体に結合できるようにする、オプソニンの配列またはドメインである。
ＡＰＣ結合部分を含むオプソニン断片には多数の例がある。このような断片は、ＡＰＣ結合機能が保たれる限りどのような長さでもよく、たとえば、約４０アミノ酸、１００アミノ酸、１５０アミノ酸、５００アミノ酸、８００アミノ酸、あるいは実に３０００アミノ酸などで構わない。たとえば、Ｌａｓ Ｈｏｌｔｅｔら、１９９４、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３４４：２４２に、高い親和性でα２ｍ受容体に結合する、ヒトα２ｍのカルボキシ末端断片（ｖａｌ１２９９〜ａｌａ１４５１）が記載されている。ヒトα２ｍのアミノ酸１３１４〜１４５１を含む断片とこれに対応するラットα２ｍのドメインも、天然α２ｍの持つ親和性の１〜２％ではあるが、α２ｍ受容体に結合する（Ｖａｎ Ｌｅｕｖｅｎら、１９８６、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６１：１１３６９；Ｅｎｇｈｉｌｄら、１９８９、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８：１４０６；Ｓａｌｖｅｓｅｎら、１９９２、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ３１３：１９８；Ｓｏｔｔｒｕｐ−Ｊｅｎｓｅｎら、１９８６、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ２０５：２０）。
ＢｅｃｈｅｒｅｒおよびＬａｍｂｒｉｓ、１９８８、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６３：１４５８６に、Ｃ３ｃなどＣＲ１に結合するＣ３ｂの断片、エラスターゼ処理により生成され、Ｃ３ｂのα’鎖のＮ末端を含むＣ３の断片、Ｃ３ｂα’鎖の４２個のＮ末端アミノ酸を含む合成ペプチドが記載されている。ＣＲ３へのＣ３の結合配列も明らかになっている（Ｗｒｉｇｈｔら、１９８７、ＰＮＡＳ ８４：４２３５）。
ペプシン消化により得られたＮ末端断片である、Ｃ１ｑの「コラーゲンの柄」が、Ｃ１ｑ受容体に結合する（Ｒｅｉｄ、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ８０：１６；Ｍａｌｈｏｔｒａら、１９９３、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ２９３：１５）。Ｍａｌｈｏｔｒａによる同書からは、コングルチニンのＡＰＣ結合部分が、その５５個のＮ末端アミノ酸からなるものであるという形跡も得られる。Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚ（米国特許第５，２７０，１９９号）は、この’１９９号特許の図２に示すヌクレオチド３７０〜４３８からなる、ヒトマンノース結合タンパク質の推定ＡＰＣ結合部位について述べている。さらに、コングルチニンとの相同性からみて、’１９９号特許に開示されたエキソン１にはＡＰＣ結合部分が含まている可能性がある。
ＩｇＧのＡＰＣ結合部分には、ＣａｎｆｉｅｌｄおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９１、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １７３：１４８３〜９１；Ｌｕｎｄら、１９９１、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４７：２６５７〜６２；Ｓａｒｍａｙら、１９９２、Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２９：６３３〜９に記載されているように、残基２３４〜２３７を含む、ＣＨ２ドメインおよび下ヒンジ領域がある。
本発明の組成物および方法に使用できるオプソニンの例としては、フィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ０２７６１、Ｋ００７９９、Ｋ０２２７３、Ｘ８２４０２、Ｘ００３０７、Ｘ００７３９など）、ＣＲＰ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ１７４９６、Ｍ１１８８０、Ｍ１１８８１、Ｍ１１８８２など）、Ｃ１ｑなどの補体成分（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ６６２９５、Ｍ２２５３１、Ｘ０３０８４、Ｘ５８８６１およびスイスプロット受託Ｐ０２７４７、Ｐ０２７４５など）、Ｃ３ｂおよびＣ３ｄなどの補体断片（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｋ０２７８２、Ｋ０２７６５など）、マンノース結合タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｓ４２２９２、Ｓ４２２９４、Ｘ１５４２２など）、コングルチニン（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｘ７１７７４など）、α−２−マクログロブリン（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｍ９３２６４、Ｍ１１３１３など）、サーファクタントタンパク質Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｍ６８５１９、Ｓ４８７６８など）、サーファクタントタンパク質Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｌ４０１５６、Ｘ６５０１８、Ｓ３８９８１など）、免疫グロブリンならびに、種の中でのこれらの相同体があげられる。
表２
本発明で有用な代表的なオプソニン、ＡＰＣ結合部分／ＡＰＣ受容体対
Figure 0004892705
本発明によるオプソニン性の判定
自然界に存在する特定のオプソニンが以下のアッセイのうち１つ以上でオプソニン性を持つと判断され、かつ、分泌分子である場合に、そのオプソニンは本発明で有用であると考えられる。
アッセイ１
Ｏ’ＲｅａｒおよびＲｏｓｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、第１３．４．５〜９ページに記載されているような、オプソニン性の一アッセイにおいて、生理学的に生じた連結を介して候補オプソニン分子と結合したＳＲＢＣが得られる。候補オプソニンが天然である種に由来するＡＰＣを、ＢＳＡの１％（ｗ／ｖ）Ｃｏｈｎ画分を含む氷冷ＨＢＳＳ中に４×１０６／ｍｌで懸濁させる。候補オプソニンがＣ３断片である場合、ＡＰＣは新しく得た非培養末梢血単球である。候補オプソニンに連結したＳＲＢＣまたは対照ＳＲＢＣ（前者と同一であるが、候補オプソニンに連結していない）を、同溶液に２×１０８／ｍｌで懸濁させる。ＳＲＢＣ懸濁液１００ｕｌとＡＰＣ懸濁液１００ｕｌとを１０×７５ｍｍのプラスチックチューブで混合する。このチューブを、４０ｒｐｍにて３７℃で２〜２０分間回転させる。懸濁液１滴をスライドガラスにのせ、カバーガラスで覆い、５〜１０分間静置する。余分な液体があればカバーガラスに圧力をかけて取り除けばよく、カバーガラスは透明なマニュキアなどでスライドガラスに密閉させることが可能である。スライドガラスを顕微鏡で検査し、４以上のＳＲＢＣに接着したことが目視確認できるＡＰＣの比率を求める。候補オプソニン分子／ＳＲＢＣの数が４×１０４個までで上記の比率が５０％以上である場合、その候補オプソニンはオプソニンであり得る。
アッセイ２（プロテアーゼ活性化候補オプソニンの場合）
候補オプソニンまたは放射標識候補オプソニンを、１．５〜３倍モル過剰のプロテアーゼ（０．０５Ｍトリエタノールアミン−０．１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０、室温で一晩）で処理する。このアッセイでは、プロテアーゼを抗原として利用してもよいし、別の過剰な抗原を添加してもよい。結合について研究調査をする前に、候補オプソニン−抗原複合体をＨＢＳＳ（４℃）に対して透析する。
１．０Ｍまでの濃度の標識リガンドを氷上にて容量２００ｍｌ中（１．５〜４．０）×１０６個の単球と一緒にインキュベートすることにより、単球に結合している候補オプソニン−抗原複合体を測定する。１００倍モル過剰の標識候補オプソニン−抗原複合体の存在下で放射標識リガンドの非特異的結合を求める。ガラス線維フィルタでの高速真空濾過により、非結合リガンドを細胞および細胞結合リガンドから分離する。エンドサイトーシスが原因で複雑になる可能性を排除するために、研究調査は氷上にて行う。結合定数と細胞１個あたりの部位数とを、分析および非線形曲線フィットによって決定する。単球結合部位に対する候補オプソニン−抗原複合体の親和性が少なくともナノモル範囲である場合、その候補オプソニンはオプソニンである。
アッセイ３
パートＩ
候補オプソニンがＰ．ｃａｒｉｎｉｉの表面に結合するかを直接評価するために、免疫電子顕微鏡法を実施する。、１ｍＭカルシウム含有ＴＢＳを用いて瀕死の感染ラットの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）からＰ．ｃａｒｉｎｉｉを単離し、表面結合候補オプソニンを保存する。単離生物を過ヨウ素酸−リジン−パラホルムアルデヒド緩衝液で固定し、ロウアクリル（Ｌｏｗａｃｒｙｌ）封入剤（Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州レディング（Ｒｅｄｄｉｎｇ））で封入する。超薄切片を得て、正常ヤギ血清（２％）で１時間ブロックし、ウサギ抗候補オプソニンまたは非免疫ウサギＩｇＧ（２５ｍｇ／ｍｌ）と一緒に一晩インキュベートする。洗浄後、１５ｎＭ金コロイド（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｃｏｒｐ．、イリノイ州アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ））にコンジュゲートしたヤギおよびウサギＩｇＧと一緒に切片をインキュベートする。これらの切片を再度洗浄し、透過型電子顕微鏡（モデル６４００：ＪＥＯＬ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州ピーボディ（Ｐｅａｂｏｄｙ））を用いて検討する。
パートＩＩ
候補オプソニンに対する抗体の存在下または非存在下で、あるいは精製した候補を添加した状態で、Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉの培養肺胞マクロファージへの付着を以下のようにして定量する。Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを５１Ｃｒ標識することにより、この生物の肺胞マクロファージへの接着性をアッセイする。１ｍＭカルシウム含有ＴＢＳを用いて感染ラットからＰ．ｃａｒｉｎｎｉを単離し、表面結合候補オプソニンの損失を防ぐ。２０％ＦＣＳおよび２００ｍＣｉの５１Ｃｒクロム酸ナトリウム（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を含む２ｍｌのＤＭＥ中３７℃で８時間インキュベートすることにより、上記の生物を放射標識する。正常な肺胞マクロファージを洗浄法により健康なラットから採取し、正常ラットＩｇＧをプレコート（１００ｍｇ／ｍｌ×６０分間）しておいた組織培養プレート（細胞１×１０５個／ウェル）に蒔き、マクロファージがしっかりと接着されていることを確認する。１時間後、マクロファージをＨＢＳＳで静かに洗浄して非接着細胞を除去する。この洗浄後に９５％を超える量のマクロファージが接着されている。表面会合候補オプソニンを含む５１Ｃｒ−Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ（１×１０６）をマクロファージに加え、３７℃でさらに１時間インキュベートする。続いて、非接着Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを洗い流す。接着Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉを含むマクロファージ単層膜を１Ｎ ＮａＯＨで可溶化し、定量する。Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉの接着性については、接着性の比率＝（Ａ／Ａ＋Ｂ）×１００（ただしＡ＝単層膜に会合した５１Ｃｒ−Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ、Ｂ＝非付着５１Ｃｒ−Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉである）として定義する。培養中でのＰ．ｃａｒｉｎｉｉの肺胞マクロファージ肺細胞への付着に対する候補オプソニンの影響を評価するために、候補オプソニン（１００ｍｇ／ｍｌ）に対して生成したポリクローナルウサギ抗体の存在下または非存在下で、Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉ接着性アッセイを実施する。
パートＩでＰ．ｃａｒｉｎｉｉへの候補オプソニンの結合が明らかであり、なおかつ、パートＩＩでは抗候補オプソニンの存在下で接着率（％）が統計学的有意性Ｐ＜０．０５で減少した場合、その候補オプソニンはオプソニンである。
アッセイ４
細菌と接着単球との会合を以下のようにして測定する。使用した変法ＰＢＳおよび全緩衝液中のエンドトキシンレベルをＬｉｍｕｌｕｓアッセイで求めると、５０ｐｇ／ｍｌ未満である。変法ＰＢＳ中５×１０３個の単球を３７℃で２時間かけてテラサキプレートのウェルに接着させる。非接着細胞をＰＢＳで３回洗浄して除去した後、候補オプソニン１０〜５０マイクログラム／ｍｌを含むまたは含まない緩衝液０．５ｍｌ中５×１０４個のＦＩＴＣ標識細菌を加える。このとき、使用する細菌と単球の比を１０：１から５０：１までとする。３７℃で３０分間、暗所にてインキュベートした後、温かいＰＢＳで非接着細菌を５回洗浄することにより除去する。アッセイをクワドルプリケートに実施し、それぞれのウェルについて、３１００単球に会合した細菌数を倍率×４００の蛍光顕微鏡下で計測する。計測結果を１００単球に会合した細菌数として求める。この候補オプソニンのある場合の数が候補オプソニンのない場合の数と比較して少なくとも２倍である場合、その候補オプソニンはオプソニンである。
アッセイ５
パートＩ
１ｍｌあたり約１×１０７から６×１０７個の細菌を総容量０．７ｍｌのＰＢＳアリコート中１０ｍｃｇ／ｍｌの１２５Ｉ−候補オプソニンと一緒にインキュベート（２０分間、０℃）し、反応混合物１００ｍｌをオイルクッション（６０％フタル酸ジブチル、４０％フタル酸ジオクチル［Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．、ニューヨーク州ロチェスター（Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）］）１５０ｍｌに重層し、混合物を遠心（１０，０００×ｇ、６０秒、４℃）する。細胞ペレットを含むチューブの先端をモーツァルトかみそり刃（Ｍｏｚａｒｔ ｒａｚｏｒ ｂｌａｄｅ）で切断し、放射活性を計測する。
パートＩＩ
９６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、マサチューセッツ州ケンブリッジ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ））に、ＡＰＣを１ｍｌあたり細胞２×１０５個で使用前日の夕方に蒔く。候補オプソニン１００ｍｃｇ／ｍｌを含むまたは含まない培養プレートに、細菌２×１０６個／ウェル（０．１ｍｌ／ウェル）を加える。次いで、このプレートを１，０００×ｇで７分間遠心する。細菌の取り込みを３７℃で１５分間行わせた後、冷たいＰＢＳで数回洗浄して遊離細菌を除去する。続いてこれを、培養中に４５分間存在するとすべての細胞外細菌を殺滅する量の抗生物質をＲＭＰＩ １６４０に加えた中でインキュベート（４５分間、３７℃）する。このインキュベート時間の終了時を時刻０とする。単層膜ハンクス平衡生理食塩水溶液で３回洗浄し、同量のＲＰＭＩ １６４０（Ｒ０）を加える。凍結と解凍を数サイクル行って細胞を溶解させる。インキュベーションの２４時間後に、血液寒天プレート（コロンビア血液寒天；Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ Ｊｏｓｅ））上での定量的プレート測定法で１ウェルあたりの生菌数（ＣＦＵ）を求める。それぞれの結果を３回の測定の平均値で示す。
パートＩで、候補オプソニン処理細菌ペレットが＞７５ＫＣＰＭで、この取り込みを非標識候補オプソニンにより阻害できる場合、かつパートＩＩで候補オプソニンのあるＣＦＵが候補オプソニンのない場合よりも大きい（Ｐ＜０．０５）場合、その候補オプソニンはオプソニンであり得る。
アッセイ６
１０７個の細菌を含む、ＧＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩溶液）２００μｌ＋１０ｍ ｍｏｌ ＣａＣｌ２含有ゼラチン０．１％）を調製する。続いて、候補オプソニン２０〜１００μｇ／ｍｌと一緒に細菌を４℃でインキュベートする。競合的阻害剤の存在下または非存在下で結合アッセイを実施する。インキュベーションの３０分後、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２中、室温にて、１，３００ｇの微量遠心機で３分間かけて細菌を５回洗浄する。その後、ウサギ抗候補オプソニン抗血清の１：１，０００希釈液を、ＰＢＳ＋５％ＦＣＳおよび１０ｍｍｌ ＣａＣｌ２中で細菌と一緒に１時間インキュベートした後、これらの細菌をＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた中で３回洗浄する。ローダミン（Ｆｉｓｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ニューヨーク州オレンジバーグ（Ｏｒａｎｇｅｂｕｒｇ））にコンジュゲートしたヤギ抗ウサギＩｇＧの１：１，０００希釈液により、抗血清の細菌への結合を検出する。インキュベーション後、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌＣａＣｌ２に０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を加えた中で細菌を５回洗浄し、スライドガラスに塗り、空気乾燥させる。その後、細菌を１００％氷冷メタノールで５分間固定する。陰性対照には候補オプソニンおよび第一ステップの抗体を含まない。三重アッセイでの多数の視野を蛍光顕微鏡で調べる。
パートＩＩ 放射標識細菌と細胞の会合。
放射標識細菌１０７個をＧＨＢＳＳ ２００μｌ＋１０ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２中に再懸濁させ、２μｇ／ｍｌから４０μｇ／ｍｌの範囲の候補オプソニンの存在下または非存在下で、４℃で３０分間インキュベートする。次に、ＧＨＢＳＳ＋１０ｍｍｏｌ ＣａＣｌ２中、室温にて、１，３００ｇの微量遠心機で３分間かけて細菌を３回洗浄、５０μｌのＧＨＢＳＳに再懸濁させ、約１０６のＡＰＣ（ＧＨＢＳＳ）を含む懸濁液１ｍｌに加える。細菌およびＡＰＣを３７℃で２０分間静かに振盪した後、微量遠心機にて８２ｇで分画遠心をほどこすことで、付着していない細菌を５回洗浄して除去する。最後の洗浄を行う前に、各検体から得たアリコートを、ラブテック（Ｌａｂｔｅｋ）スライドガラスにのせ、１０分間細胞を付着させ、メタノールで固定し、ギムザ染色し、光学顕微鏡法で評価する。ラブテックスライドガラスにのせた細胞を評価するには、少なくとも４００個の細胞を計数する。貪食係数は、１００ＰＭＮあたりの付着または喰食された粒子の数を示した。続いて、細胞と放射標識細菌を含む上記で得られたペレットを１００μｌ ＰＢＳ＋０．５％トリトンＸ−１００に溶解させ、シンチレーションカウンタで放射活性を測定する。パートＩで細菌に対する候補オプソニンの特異的結合が明らかであり、かつパートＩＩで、候補オプソニンのない場合より候補オプソニンがある場合の方が細菌の特異的取り込み（単位ｃｐｍ）が３倍を超えて上回る場合に、その候補オプソニンはオプソニンであり得る。
アッセイ７
パートＩ
Ｌ ｄｏｎｏｖａｎｉ ｐｒｏｍａｓｔｉｇｏｔｅｓへの結合について調べるために、５×１０５寄生虫ｍｌ−１で培養を播種する。９日間以内の一定の時点で寄生虫画分を計数し、洗浄し、１％ＢＳＡ、０．５ｍＭ Ｃａ２＋に再懸濁させる。０．０５％ＮａＮ３、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）、（１０ｍＭトリスＨＣｌ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）（希釈）を２×１０５ｍｌ−１まで。次に、フタル酸ジノニル／フタル酸ジブチル（４０：６０ｖ／ｖ）油混合物１５０μｌに重層しておいた、ＥＤＴＡ非含有希釈液中５μｇ／ｍｌの放射標識候補オプソニン（０．１２μＣｉ／μｇ）７０μｌを入れた２００μｌ容の微量遠心管に、上記の懸濁液５０マイクロリットルを加える。寄生虫を１時間インキュベートし、油層を通して遠心し、細胞ペレットを切り取り、会合した候補をγ計測により検出する。それぞれのアッセイをトリプリケートで行う。活性を０．０４５μＣｉ／μｇとして、候補は６０から０．０１５μｇ／ｍｌまでの２倍希釈で、上記のようにして候補が前鞭毛虫に結合する際の濃度依存性も測定する。
パートＩＩ
２４ウェル組織培養プレートのカバーガラス上に細胞１×１０６個／ウェルでＡＰＣを蒔く。１０％ＰＣＳ、１ｍＭグルタミン、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で、加湿インキュベータにて３７℃で細胞インキュベートする。２４時間後、非接着細胞を除去し、残りの細胞を６日後に使用する。候補３０μｇ／ｍｌの存在下または非存在下で、ＲＰＭＩ １６４０中、前鞭毛虫を１時間インキュベートした後、３回洗浄した上で１０６個／ウェルでＡＰＣ培養に加える。前鞭毛虫に１時間ＡＰＣを感染させた後、細胞を洗浄し、メタノールで固定し、ギムザ染色（ＢＤＨ、英国ドーセット州プール（Ｐｏｏｌｅ））した上で計数する。感染したＡＰＣの比率および寄生虫数／１００マクロファージを四通りの培養から求める。
パートＩで寄生虫に対する候補オプソニンの親和性が少なくともナノモル範囲であり、かつパートＩＩで取り込まれた寄生虫数が、１００ＡＰＣあたりの数でみて候補オプソニンの存在下で候補オプソニン非存在下の場合の少なくとも２倍である場合、その候補オプソニンはオプソニンであり得る。
アッセイ８
パートＩ
５％ウシ胎仔血清を含有する［３５Ｓ］メチオニン標識培養液の一部（０．５ｍｌ）と候補オプソニンとを、室温にて３０分間、微生物の１０％懸濁液０．１ｍｌまたは０．２ｍｌと一緒にインキュベートする。試験対象とした微生物は、たとえば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを含み得る。結合したタンパク質を、２％ＳＤＳおよび０．１Ｍジチオトレイトールを含む緩衝液中で煮沸することにより放出させ、５％ＳＤＳゲル上で分析する。
パートＩＩ
［３Ｈ］チミジンで標識した、固定細菌（０．１ｍｌ；１０容量％；１ミリリットルあたり生物１０１０個）を、候補オプソニンを枯渇させて、または枯渇させずに、血清０．１ｍｌと一緒にインキュベートする。ＰＢＳでの洗浄後、この細菌を、二価カチオンを含むＰＢＳの最終容量０．９ｍｌで約１×１０７個のＡＰＣと一緒にインキュベートする。Ｎ−エチルマレイミド（２ｍＭ）を含む氷冷ＰＢＳに０．２ｍｌを何回か取り出してエンドサイトーシスがさらに起こらないようにブロックし、細胞を洗浄する（約１００ｇで１０秒間）。
パートＩで候補オプソニンに対応するバンドが明らかである場合、かつパートＩＩで、インキュベーションの６〜１０分後のＣＰＭが血清の枯渇したサンプルよりも血清の枯渇していないサンプルでの方が少なくとも３倍多い場合、その候補オプソニンはオプソニンであり得る。
アッセイ３、５、６、７、８のパートＩから得られた結果の代わりに、アッセイのパートＩＩを満たす候補オプソニンは、少なくともナノモル範囲の親和性でアッセイの抗原と結合できる場合にオプソニンであり得る。
アッセイ９
少なくとも分子１．２×１０４個／細胞のＣ３断片でコートしたＳＲＢＣを、Ｏ’ＲｅａｒおよびＲｏｓｓ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、第１３．４．５〜９ページに記載されているようにして調製する。１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ中細胞２×１０５個／ｍｌの単球２５０ｕｌを、８ウェルガラス組織培養プレートの各ウェルに入れ、５％ＣＯ２にて３７℃で３時間インキュベートする。単球をＨＢＳＳで２回洗浄し、ＤＶＢＳ２＋中１．５×１０８／ｍｌのＳＲＢＣ５０ｕｌを各ウェルに加える。このプレートを５０ｇで５分間遠心した後、５％ＣＯ２にて３７℃３時間インキュベートする。壁をＨＢＳＳで２回洗浄し、０．５％グルタルアルデヒドで固定し、ギムザ染色液で染色する。光学顕微鏡法により測定した場合に、４０％を超える単球が少なくとも１つのＳＲＢＣとロゼットを形成する場合、その候補はオプソニンであり得る。
本発明で有用な熱ショックタンパク質
熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）は細胞内に広く分布しているペプチド、ポリペプチド、変性タンパク質、抗原と会合し、これらと共に複合体を形成する。このようなＨＳＰ−ペプチド複合体は、がんおよび感染症に対するワクチンで役立つことが、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、「Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ−ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ （１９９４）、６：７２８〜７３２；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、「Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ Ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ」、Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９３）、６２：１５３〜１７７に説明がある。このＨＳＰ−ペプチド複合体は、抗原保有・提示分子として機能できるため、ワクチンとして作用するようにみえる。このような抗原を用いたワクチンの開発について、Ｂａｌｔｚ、「Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ」、Ａｍ．Ｊ Ｈｅａｌｔｈ−Ｓｙｓｔ．Ｐｈａｒｍ．（１９９５）、５２：２５７４〜２５８５に説明がある。熱ショックタンパク質の抗原性は、熱ショックタンパク質自体から生じるのではなく、会合したペプチドから生じるようにみえる。Ｕｄｏｎｏら、「Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ ７０−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｅｌｉｃｉｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ」、Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． （１９９３）、１７８：１３９１〜１３９６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａら、「Ｈｅａｔ ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ ＣＴＬ ｐｒｉｍｉｎｇ」、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ （１９９４）、３９：９３〜９８；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ、「Ａ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｃｏｎｔｅｍｐｌａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ｄｕｒｉｎｇ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．（１９９４）、９４：３７〜４７を参照のこと。ＨＳＰは、表面に提示される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子にペプチドが運ばれる際のプロセスの一部であるようにみえる。
ｇｐ９６、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ１００、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ２５およびｈｓｐ７０を含むがこれに限定されるものではない、多数の異なるＨＳＰが免疫原性を示すことが分かっており、本発明において有用である。Ｕｄｏｎｏら（上掲）およびＵｄｏｎｏら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｉｅｓ ｏｆ Ｓｔｒｅｓｓ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｇｐ９６，ｈｓｐ９０，ａｎｄ ｈｓｐ ７０」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９４）、５３９８〜５４０３；ｇｐ９６およびｇｒｐ９４、Ｌｉら、「Ｔｕｍｏｒ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｐ９６／ｇｒｐ９４ ｉｓ ａｎ ＡＴＰａｓｅ： ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ」、Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ、第１２巻、Ｎｏ．８（１９９３）、３１４３〜３１５１；ｇｐ９６、ｈｓｐ９０およびｈｓｐ７０、Ｂｌａｃｈｅｒｅら、「Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ Ａｇａｉｎｓｔ Ｃａｎｃｅｒ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ（１９９３）、１４：３５２〜３５６」を参照のこと。
本発明で使用するにあたり、ＤＥ５２イオン交換クロマトグラフィに続いてＡＴＰ−アガロースでの親和性クロマトグラフィを用いる手順で、熱ショックタンパク質を精製してもよい。Ｗｅｌｃｈら、「Ｒａｐｉｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍａｍｍａｌｉａｎ ７０，０００−Ｄａｌｔｏｎ Ｓｔｒｅｓｓ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ： Ａｆｆｉｎｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８５年６月）、１２２９〜１２３７を参照のこと。
本発明で有用な接着分子
本発明において有用な接着分子としては、認識をｂｅｄｉａｔｉｎｇすることならびにその基質および他の細胞への細胞の接着に関与する、あらゆる細胞表面タンパク質があげられる。細胞接着分子は主にＣａ２＋依存性（カドヘリン）とＣａ２＋非依存性の２つのクラスに分けられる。
カドヘリンと呼ばれるＣａ２＋依存性接着分子には、１２種類を超える異なるタイプのものがある。ほとんどのカドヘリンは、約７００〜７５０個のアミノ酸残基で構成される１回膜貫通型糖タンパク質である。この分子の大きな細胞外構成要素は通常５つのドメインを持ち、その各々が約１００個のアミノ酸残基を含む。これらのドメインのうち４つには推定上のＣａ２＋結合部位が含まれる。カドヘリンは二量体として細胞膜に存在していることが多い。
本発明において有用なカドヘリンとしては、カドヘリンＥ、カドヘリンＮ、カドヘリンＢＲ、カドヘリンＰ、カドヘリンＲ、カドヘリンＭ、カドヘリンＶＥ、カドヘリンＴ＆Ｈ、カドヘリンＯＢ、カドヘリンＫ、カドヘリン７、カドヘリン８、カドヘリンＫＳＰ、カドヘリンＬＩ、カドヘリン１８、線維芽細胞１、カドヘリン、線維芽細胞２、カドヘリン、線維芽細胞３、カドヘリン２３、デスモコリン１、デスモコリン２、デスモグレイン１、デスモグレイン２、デスモグレイン３、プロトカドヘリン１、２、３、７、８、９があげられるが、これに限定されるものではない。
残りの接着分子はＣａ２＋非依存性であり、カドヘリン同様に、本発明ではＡＰＣ上の細胞表面タンパク質のリガンドとして利用できる。接着分子の大まかなクラスと本発明で有用な具体的な接着分子を以下の表３にあげておく。
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本発明で有用なデフェンシン
一実施形態では、多機能性分子のうちＡＰＣの細胞表面タンパク質のリガンドであるポーションがデフェンシンである。デフェンシンは、もともとはウサギとヒトの白血球で同定された、広く分布している抗菌ペプチドからなる大きなファミリである。カチオン性極性ペプチド（３０〜３５ａａ、３〜４ｋＤａ）であるデフェンシンはトリ−ジスルフィドが保存されている点と、大部分はβシート構造とによって識別できる。細胞表面で発現されたときに、デフェンシンは、広範囲にわたる病原性微生物の上皮のコロニー形成を阻害することで微生物感染に対する生物学的障壁機能するのではないかと仮定されている。本発明において有用なデフェンシンとしては、ヒトαデフェンシン１−６、ヒト好中球ペプチド１−４、ヒトβデフェンシン１および２、ラットβデフェンシン１および２があげられるが、これに限定されるものではない。
本発明のＴ細胞共刺激分子のカウンターレセプタ
本発明の一実施形態では、多機能性分子のうちＡＰＣの細胞表面タンパク質のリガンドであるポーションがＴ細胞共刺激分子のカウンターレセプタである。共刺激は、抗原受容体近位活性化事象を単に増大する以上のことをするが、抗原特異的シグナルと相乗的に交差してリンパ球の活性化を可能にするシグナル伝達経路として定義される。したがって、本発明で有用な共刺激分子のカウンターレセプタとしては、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ：Ｂ７ｈ、ＰＤ−１：ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ４８、ＣＤ４０リガンドおよびＯＸ４０のうちの１以上の受容体があげられるが、これに限定されるものではない。本発明で有用なカウンターレセプタとしては、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１、ＴＮＦ受容体ファミリのメンバ、主なＢ細胞共刺激分子であるＣＤ４０ならびに、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ、ＣＤ３０、ＣＤ２７があげられるが、これに限定されるものではない。
ペプチドリンカー
一実施形態では、多機能性分子は、抗原保有標的に結合可能な第１のアミノ酸配列と白血球に結合可能な第２のアミノ酸配列とを含む融合ポリペプチドなど、細胞に結合される第１の構成要素と第２の構成要素との間に介在する１以上のアミノ酸を含み、かつ、第１の構成要素と第２の構成要素との間に介在する少なくとも１のアミノ酸をさらに含む融合ポリペプチドである。介在するアミノ酸は、上述した第１の構成要素と第２の構成要素との間の立体障害または他の望ましくない干渉を抑えることを目的としたリンカー配列などを含むものであってもよい。たとえば、このようなタイプの一配列は（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）ｎの形をとる（式中、ｎは１から１５の整数であり、ｘは１から１０の整数である）。別の有用なリンカーとして、（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｔｈｒ（配列番号２））１〜５（スー（Ｘｕ）ら、１９９９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：１５１〜１５６）、（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ（シャオ（Ｓｈａｏ）ら、２０００、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１１：８２２〜８２６）、（Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ）ｎ（Ｋｒｏｏｎら、２０００、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：６７４０〜６７５２）、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ）ｎ（Ｋｌｕｃｚｙｋら、２０００、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ２１：１４１１〜１４２０）、（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ）ｎ（Ｋｌｙｃｚｙｋら、２０００、上掲）（式中、ｎは１から１５である）（上記の引用文献各々についても本願明細書に援用する）があげられるが、これに限定されるものではない。もうひとつの実施形態では、第１の構成要素と第２の構成要素との間にアミノ酸は介在しない。
本発明で有用な抗原
１．ウイルス抗原
ウイルス抗原の例としては、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子の遺伝子産物などのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）抗原由来のレトロウイルス抗原、Ｎｅｆタンパク質、逆転写酵素および他のＨＩＶ成分などのレトロウイルス抗原；Ｂ型肝炎ウイルスのＳタンパク質、Ｍタンパク質およびＬタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスのプレＳ抗原などの肝炎ウイルス抗原およびＣ型肝炎ウイルスＲＮＡなどのＡ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎の他の肝炎ウイルス成分；赤血球凝集素およびノイラミニダーゼなどのインフルエンザウイルス抗原および他のインフルエンザウイルス成分；麻疹ウイルス融合タンパク質などの麻疹ウイルス抗原および他の麻疹ウイルス成分；タンパク質Ｅ１およびＥ２などの風疹ウイルス抗原および他の風疹ウイルス成分；ＶＰ７ｓｃなどのロタウイルス抗原および他のロタウイルス成分；エンベロープ糖タンパク質Ｂなどのサイトメガロウイルス抗原および他のサイトメガロウイルス抗原成分；ＲＳＶ融合タンパク質、Ｍ２タンパク質などの呼吸器多核体ウイルス抗原および他の呼吸器多核体ウイルス抗原成分；前早期タンパク質、糖タンパク質Ｄなどの単純ヘルペスウイルス抗原および他の単純ヘルペスウイルス抗原成分；ｇｐＩ、ｇｐＩＩなどの水痘帯状疱疹ウイルス抗原および他の水痘帯状疱疹ウイルス抗原成分；タンパク質Ｅ、Ｍ−Ｅ、Ｍ−Ｅ−ＮＳ １、ＮＳ １、ＮＳ １−ＮＳ２Ａ、８０％Ｅなどの日本脳炎ウイルス抗原および他の日本脳炎ウイルス抗原成分；狂犬病糖タンパク質、狂犬病核タンパク質などの狂犬病ウイルス抗原および他の狂犬病ウイルス抗原成分があげられるが、これに限定されるものではない。ウイルス抗原のさらに他の例については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｆｉｅｌｄｓ，Ｂ．Ｎ．およびＫｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．編（Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９１）を参照のこと。
２．細菌抗原
本発明の組成物および方法に利用できる細菌抗原としては、百日咳毒素、線維状赤血球凝集素、パータクチン、ＦＩＭ２、ＦＩＭ３、アデニル酸シクラーゼなどの百日咳菌抗原および他の百日咳菌抗原成分；ジフテリア毒素またはトキソイドなどのジフテリア菌抗原および他のジフテリア菌抗原成分；破傷風毒素またはトキソイドなどの破傷風菌抗原および他の破傷風菌抗原成分；Ｍタンパク質などの連鎖球菌抗原および他の連鎖球菌抗原成分；リポ多糖などのグラム陰性バチルス細菌抗原および他のグラム陰性細菌抗原成分；ミコール酸、熱ショックタンパク質６５（ＨＳＰ６５）、３０ｋＤａの主分泌タンパク質、抗原８５Ａなどのマイコバクテリウム・ツベルクローシス細菌抗原および他のマイコバクテリア抗原成分；ヘリコバクター・ピロリ細菌抗原成分；ニューモリシン、肺炎球菌莢膜多糖などの肺炎球菌抗原および他の肺炎球菌抗原成分；莢膜多糖などのヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原および他のヘモフィルスインフルエンザ細菌抗原成分；炭疸保護抗原などの炭疸菌抗原および他の炭疸菌抗原成分；ｒｏｍｐなどのリケッチア細菌抗原および他のリケッチア細菌抗原成分があげられるが、これに限定されるものではない。また、他のあらゆる細菌抗原、マイコバクテリア抗原、マイコプラズマ抗原、リケッチア抗原またはクラミジア抗原も本願明細書において記載の細菌抗原に含まれる。
３．真菌抗原
本発明の組成物および方法に利用できる真菌抗原としては、カンジダ真菌抗原成分；熱ショックタンパク質６０（ＨＳＰ６０）などのヒストプラスマ真菌抗原および他のヒストプラスマ真菌抗原成分；莢膜多糖などのクリプトコックス真菌抗原および他のクリプトコックス真菌抗原成分；球状体抗原などのコクシジオイデス真菌抗原および他のコクシジオイデス真菌抗原成分；トリコフィチンなどの白癬真菌抗原および他のコクシジオイデス真菌抗原成分があげられるが、これに限定されるものではない。
４．寄生虫抗原
原虫および他の寄生虫抗原の例としては、メロゾイト表面抗原、スポロゾイト表面抗原、スポロゾイト周囲抗原、配偶子嚢／配偶子表面抗原、血液ステージ（ｂｌｏｏｄ−ｓｔａｇｅ）抗原ｐｆ１ ５５／ＲＥＳＡなどの熱帯熱マラリア原虫抗原および他のマラリア原虫抗原成分；ＳＡＧ−１、ｐ３０などのトキソプラズマ抗原および他のトキソプラズマ抗原成分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、パラミオシンなどの住血吸虫抗原および他の住血吸虫抗原成分；森林型熱帯リーシュマニア、ｇｐ６３、リポホスフォグリカンおよびその会合タンパク質などの他のリーシュマニア抗原および他のリーシュマニア抗原成分；７５〜７７ｋＤａの抗原、５６ｋＤａの抗原などのトリパノソーマ・クルージ抗原および他のトリパノソーマ抗原成分があげられるが、これに限定されるものではない。
５．腫瘍抗原
本発明の組成物および方法に利用できる腫瘍抗原としては、テロメラーゼ成分；Ｐ−糖タンパク質などの多剤耐性タンパク質；ＭＡＧＥ−１、α−フェトプロテイン、癌胎児性抗原、変異体ｐ５３、Ｂ細胞由来の悪性腫瘍の免疫グロブリン、染色体転座により近接した遺伝子から発現される融合ポリペプチド、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、カルシトニン、チロシナーゼ、パピローマウイルス抗原、黒色腫または他の腫瘍細胞のガングリオシドまたは他の炭水化物含有成分があげられるが、これに限定されるものではない。本発明では、どのような型の腫瘍細胞に由来する抗原であっても本願明細書に記載の組成物および方法に利用できると考えられる。
６．自己免疫に関連した抗原
自己免疫疾患、アレルギー、移植片拒絶に関与する抗原を、本発明の組成物および方法に利用できる。たとえば、以下にあげる自己免疫疾患または機能不全のうちの１つ以上に関与する抗原を本発明に利用できる。糖尿病、関節炎（慢性関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節症、乾癬性関節炎を含む）、多発性硬化症、筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および浮腫性皮膚炎を含む）、乾癬、続発性シェーグレン症候群の乾燥性角結膜炎を含むシェーグレン症候群、円形脱毛症、節足動物刺咬反応によるアレルギー反応、クローン病、アフタ性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性大腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病の境界反応、らい性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、出血を伴う急性壊死性脳症、特発性両側性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球癆、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ヴェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブン−ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、クローン病、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後ブドウ膜炎、間質性肺線維症。自己免疫疾患に関与する抗原の例としては、グルタミン酸デカルボキシラーゼ６５（ＧＡＤ６５）、天然ＤＮＡ、ミエリン塩基性タンパク質、ミエリンプロテオリピドタンパク質、アセチルコリン受容体成分、チログロブリンおよび甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）受容体があげられる。アレルギーに関与する抗原の例としては、スギ花粉抗原、ブタクサ花粉抗原、ライグラス花粉抗原などの花粉抗原、チリダニ抗原およびネコ抗原などの動物由来抗原、組織適合性抗原、ペニシリンおよび他の治療薬があげられる。移植片拒絶に関与する抗原の例としては、心臓、肺、肝臓、膵臓、腎臓など、移植レシピエントに移植される移植片の抗原成分ならびに神経移植片成分があげられる。抗原は、自己免疫疾患の治療に有用な、変化させたペプチドリガンドでもよい。
本発明の組成物および方法に利用できる種々の抗原の例としては、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、テストステロン、成長ホルモン、プロラクチンなどの内因性ホルモンならびに他のホルモン、コカインおよびヘロインなどの耽溺性薬物、抗レプチン受容体抗体のＦａｂ含有ポーションなどの抗原受容体のイディオタイプ断片があげられる。
抗原保有標的またはＡＰＣへの多機能性分子結合の判定
タンパク質−タンパク質結合を検出するための複数の手法が当業者間で周知である。すなわち、抗原保有標的およびＡＰＣのうちの一方または両方に対する本発明の多機能性分子の結合。
多機能性分子と抗原保有標的および／またはＡＰＣとの会合は、たとえば蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）によって測定できる。この方法では、ペプチド（すなわち多機能性分子）が蛍光標識部分を含み、抗原保有標的またはＡＰＣが同じような第２の部分を持つ。そして、適切な波長での励起によって、条件が揃えば一方の標識によるフォトンの吸収が生じ、続いてＦＲＥＴが生じ、さらに第２のフルオロフォアの第２の波長特性での放出が生じる。この放出を測定し、これが多機能性分子に会合した抗原保有標的またはＡＰＣの量に相当する。あるいは、詳細については後述する他の多くの方法のうちのひとつを使ってこの会合を測定してもよい。
「蛍光タグ」または「蛍光基」とは、フルオロフォアまたは蛍光タンパク質またはその蛍光断片のいずれかを示すか、あるいは、ポリペプチドに取り込むことができるトリプトファンなどの蛍光アミノ酸を示す。「蛍光タンパク質」とは、適切な電磁放射での励起時に蛍光発光するあらゆるタンパク質を示す。これには、アミノ酸配列が自然なものであるまたは遺伝子工学操作により改変されたタンパク質が含まれる。
フルオロフォアがフルオレセインおよびテトラメチルローダミンまたは他の好適な対を含むものであるとさらに好ましい。もうひとつの好ましい実施形態では、標識が２種類の蛍光タンパク質を含む。蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）と、青色蛍光タンパク質と、赤色蛍光タンパク質と、ＧＦＰの他の遺伝子工学操作により改変された形態と、からなる群から選択されるいずれかのタンパク質を含むものであると好ましい。
好ましくは、ポリペプチドがシステインアミノ酸を含み、これによって標識が共有結合により付加される。一層好ましくは、リジン残基を介するなど、第１級アミン基を介して標識を付加することができる。当業者には明らかであろうように、本発明のポリペプチドの標識化と固定化の両方に同じ化学物質を使用するのは避ける方が好ましい。たとえば、ポリペプチドをシステイン残基で固定化するのであれば、標識はリジン残基で付加すると都合がよい。
好ましくは、蛍光エネルギー共鳴移動（ＦＲＥＴ）、蛍光異方性測定または蛍光相関分光法によるか、あるいは固定化したポリペプチドに対する蛍光パートナー（ｐａｒｔｎｅｒ）ポリペプチドの結合を測定することにより、測定を行う。このような測定を行うための手法は当業者間で周知である。
蛍光放出手段は２種類のフルオロフォアを含むものであると好ましく、フルオロフォアがフルオレセインおよびテトラメチルローダミンまたは他の好適な対を含むものであると特に好ましい。
ＦＲＥＴに用いる蛍光標識に関して本発明で使用する場合、「適切な組み合わせ」という表現は、一方（「ドナー」部分）の放出波長スペクトルが他方（「アクセプタ」部分）の励起波長スペクトル内になるようなレポーター標識の選択肢を示す。
標識を使用しない検出方法は従来技術において周知である。これには、パートナーポリペプチドの結合が増減したときに生じるであろう多機能性分子の質量の変化を表面プラスモン共鳴を利用して検出する検出方法が含まれる。このような測定は、たとえば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置を用いて行うことができる。この実施形態では、多機能性分子を固体担体に固定化した上で分子を抗原保有部分および／またはＡＰＣと接触させる。
上記の方法に加えて、抗原保有部分および／またはおよびＡＰＣに対する本発明の多機能性分子の結合を求めるための一手法に、多機能性分子に対して特異的に指向する抗体を用いるものがある。簡単に説明すると、たとえば抗原保有細胞を、本発明の多機能性分子と一緒に、ＲＰＭＩ １６４０または他の好適な緩衝液中で３７℃で１〜４時間振盪しながらインキュベートする。続いて、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳまたは他の細胞培養血清中で細胞を洗浄する。次に、この抗原保有細胞を、たとえばＦＩＴＣ標識抗多機能性分子抗体と一緒に４℃で１時間インキュベートする。ＰＢＳでさらに洗浄した後、フローサイトメトリで細胞を分析する。このとき、標識細胞を同定できればそれがすなわち、本発明の多機能性分子が抗原保有細胞に結合していることを意味する。
本発明による組換え核酸を含む細胞の調製
本発明の一実施形態では、本発明の多機能性分子をコードする核酸分子を、多機能性分子が産生されるようにして上記核酸分子を発現できる宿主細胞に導入する。一実施形態では、宿主細胞にｅｘ ｖｉｖｏにて核酸を発現させる。別の実施形態では、この多機能性分子をコードする核酸分子で宿主細胞をトランスフェクトした後、宿主細胞の採取元となった宿主動物に戻す。この場合、多機能性ポリペプチド分子が宿主動物でｉｎ ｖｉｖｏにて発現される。
本願明細書において教示したようにして、従来技術において周知の従来の方法で、宿主細胞をトランスフェクトする。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための好適な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ（１９８９））および他の実験室マニュアルに記載されている。多機能性分子をコードする核酸分子を導入する方法の別の例については後述する。たとえば多機能性分子および／または抗原をコードする、導入された核酸分子を含む細胞は、ワクチン組成物などにして本発明の方法でそれ自体を（抗原として）被検体に投与することが可能なものである。
Ａ．細胞への裸の核酸の導入
１．ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション：核酸とＤＥＡＥ−デキストランとの混合物を形成し、この混合物を細胞と一緒にインキュベートすることにより、裸の核酸を細胞に導入することができる。ジメチルスルホキシドまたはクロロキンショック（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ ｓｈｏｃｋ）ステップを追加して、核酸の取り込み量を増やすことができる。ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞修飾にのみ適用可能であり、核酸を一時的に細胞に導入するのには利用できるが、安定したトランスフェクト細胞の創製には好ましくない。よって、この方法は、遺伝子産物の短期産生には利用できるが、遺伝子産物の長期産生に向いている方法ではない。ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクションのプロトコールについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．２章およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）、第１６．４１章〜第１６．４６章または他の標準的な実験室マニュアルに記載されている。
２．電気穿孔法：細胞と核酸とを一緒に適切な緩衝液中でインキュベートし、細胞に高電圧電気パルスをかけることで、裸の核酸を細胞に導入することも可能である。電気穿孔法によって核酸を細胞に導入する際の効率は、印加する電場の強度、電気パルスの長さ、温度、核酸のコンフォメーションおよび濃度、培地のイオン組成に影響される。電気穿孔法を利用すれば、多種多様な細胞型を安定して（または一過的に）トランスフェクトすることができるが、電気穿孔法はｉｎ ｖｉｔｒｏでの細胞修飾にのみ適用可能である。細胞を電気穿孔するためのプロトコールについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．３章およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（１９８９）、第１６．５４章〜第１６．５５章または他の標準的な実験室マニュアルに記載されている。
３．リポソームによるトランスフェクション（「リポフェクション」）：カチオン脂質を含むリポソーム懸濁液と核酸を混合することで、裸の核酸を細胞に導入することができる。続いて、この核酸／リポソーム複合体を細胞と一緒にインキュベートする。リポソームによるトランスフェクションを利用すれば、培養中でｉｎ ｖｉｔｒｏにて細胞を安定して（または一過的に）トランスフェクトすることができる。プロトコールについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．４章および他の標準的な実験室マニュアルに記載されている。さらに、リポソームを使ってｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子送達も達成されている。たとえば、Ｎｉｃｏｌａｕら（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１４９：１５７〜１７６；ＷａｎｇおよびＨｕａｎｇ（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＳＡ ８４：７８５１〜７８５Ｓ；Ｂｒｉｇｈａｍら（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８；Ｇｏｕｌｄ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅら（１９８９）Ｇｅｎｅ ８４：４２９−４３８を参照のこと。
４．直接注入：核酸を細胞に直接注入することで、裸の核酸を細胞に導入することができる。細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養では、微量注入によって核酸を導入することができる。この方法では細胞をひとつずつ個々に微量注入するため、多数の細胞を修飾しようとすると非常に手間がかかる。しかしながら、微量注入方が最適な方法になる状況のひとつに、トランスジェニック動物の作出（詳細については後述する）がある。この状況では、受精卵母細胞に核酸を安定して導入した後、これを成長させて動物にする。こうして得られる動物には、卵母細胞に導入した核酸を持つ細胞がある。また、直接注入は裸の核酸をｉｎ ｖｉｖｏで細胞に導入するのにも利用されている（Ａｃｓａｄｉら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３３２：８１５〜８１８；Ｗｏｌｆｆら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４７：１４６５〜１４６８などを参照のこと）。ＤＮＡをｉｎ ｖｉｖｏにて細胞に注入するための送達装置（「遺伝子銃」など）を利用することができる。このような装置は（ＢｉｏＲａｄなどから）市販されている。
５．受容体によるＤＮＡ取り込み：細胞表面受容体のリガンドに連結した、ポリリシンなどのカチオンに核酸を複合体化することで、裸の核酸を細胞に導入することもできる（たとえば、Ｗｕ，Ｇ．およびＷｕ，Ｃ．Ｈ．（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２６３：１４６２１；Ｗｉｌｓｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：９６３〜９６７；米国特許第５，１６６，３２０号を参照のこと）。核酸リガンド複合体を受容体に結合させると、受容体でのエンドサイトーシスによって核酸を取り込みやすくなる。核酸リガンド複合体の標的となった受容体は、トランスフェリン受容体およびアシアロ糖タンパク質受容体を含む。エンドソームを自然に破壊することで物質を細胞質に放出するアデノウイルスキャプシドに連結した核酸リガンド複合体を利用して、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避することができる（たとえば、Ｃｕｒｉｅｌら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８８５０；Ｃｒｉｓｔｉａｎｏら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：２１２２〜２１２６を参照のこと）。受容体による核酸取り込みを利用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで核酸を細胞に導入することができ、さらに、目的の標的細胞にて選択的に発現される受容体に結合するリガンドを用いることで、核酸を特定の細胞型に対して選択的に標的できるという特徴もある。
通常は、（上述したトランスフェクション手法のうちの１つなどにより）裸の核酸を培養中で細胞に導入する場合、一般にごく少数の細胞（１０５個中約１個）だけがトランスフェクトされた核酸をそのゲノムに組み込む（すなわち、核酸がエピゾーム様に細胞に維持される）。よって、外来性核酸を取り込んだ細胞を同定するには、選択マーカーをコードする核酸を、目的の核酸（単数または複数）と一緒に細胞にトランスフェクトすると都合がよい。好ましい選択マーカーとしては、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、メトトレキサートなどの薬剤耐性を付与するものがあげられる。あるいは、選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質または青色蛍光タンパク質などの発現時に検出可能なシグナルを放出するものであってもよい。選択マーカーは、目的の遺伝子（単数または複数）と同じプラスミドに導入してもよいし、別のプラスドに導入してもよい。
Ｂ．ウイルスによる遺伝子導入
遺伝子産物をコードする核酸を細胞に導入するための好ましいアプローチのひとつに、遺伝子産物をコードする核酸、たとえばｃＤＮＡを含むウイルスベクターを使用することがある。細胞のウイルスベクターでの感染には、大多数の細胞が核酸を受容し、核酸を受容した細胞を選択する必要がないという利点がある。さらに、ウイルスベクターに含まれるｃＤＮＡなどによってウイルスベクター内でコードされた分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞で効率的に発現され、ウイルスベクター系をｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで使用できる。
１．レトロウイルス：遺伝子療法目的で遺伝子導入に用いられる欠損型レトロウイルスを十分にキャラクタライズする（概要については、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．（１９９０）Ｂｌｏｏｄ ７６：２７１を参照のこと）。レトロウイルスゲノムに挿入された、目的の遺伝子産物をコードする核酸を有する組換えレトロウイルスを構築することが可能である。さらに、レトロウイルスゲノムの一部を除去してこのレトロウイルスを複製欠損型にすることができる。次に、この複製欠損型レトロウイルスをビリオンで包み込み、これを利用して、ヘルパーウイルスを使って標準的な手法で標的細胞に感染させることができる。組換えレトロウイルスを作出し、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏにて細胞をこのようなウイルスに感染させるためのプロトコールについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら（編）、Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、（１９８９）、第９．１０章〜第９．１４章および他の標準的な実験室マニュアルに記載されている。好適なレトロウイルスの例としては、当業者間で周知のｐＬＪ、ｐＺＩＰ、ｐＷＥおよびｐＥＭがあげられる。好適なパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）ウイルス系の例としては、φＣｒｉｐ、φＣｒｅ、＿２、＿Ａｍがあげられる。レトロウイルスは、上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋芽細胞、肝細胞、骨髄細胞をはじめとする多くの異なる細胞型に、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにてさまざまな遺伝子を導入するのに用いられている（たとえば、Ｅｇｌｉｔｉｓ）（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：１３９５〜１３９８；ＤａｎｏｓおよびＭｕｌｌｉｇａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：６４６０〜６４６４；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３０１４〜３０１８；Ａｒｍｅｎｔａｎｏら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：６１４１〜６１４５；Ｈｕｂｅｒら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８０３９〜８０４３；Ｆｅｒｒｙら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：８３７７〜８３８１；Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５４：１８０２〜１８０５；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：７６４０〜７６４４；Ｋａｙら（１９９２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：６４１〜６４７；Ｄａｉら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０８９２〜１０８９５；Ｈｗｕら（１９９３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：４１０４〜１１５；米国特許第４，８６８，１１６号；米国特許第４，９８０，２８６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０７１３６号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０２４６８号；ＰＣＴ出願第ＷＯ８９／０５３４５号；ＰＣＴ出願第ＷＯ９２／０７５７３号を参照のこと）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノム（およびこれに挿入される外来核酸）を宿主ゲノムに組み込んで核酸を安定して細胞に導入するのに標的細胞分裂を必要とする。よって、標的細胞の複製を刺激しなければならないことがある。
２．アデノウイルス：アデノウイルスのゲノムは、目的の遺伝子産物をコードおよび発現するが、正常な溶解ウイルス生活環での複製能の点では不活性化されているように操作できるものである。たとえば、Ｂｅｒｋｎｅｒら（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１〜４３４；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）Ｃｅｌｌ ６８：１４３〜１５５を参照のこと。アデノウイルス株Ａｄ５型ｄｌ３２４または他のアデノウイルス株（Ａｄｚ、Ａｄ３、Ａｄ７など）由来の好適なアデノウイルスベクターが当業者間で周知である。組換えアデノウイルスは、分裂細胞が効果的な遺伝子送達ベヒクルである必要がないという点で都合がよく、気道上皮（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄら（１９９２）上記にて引用）、内皮細胞（Ｌｅｍａｒｃｈａｎｄら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：６４８２〜６４８６）、肝細胞（ＨｅｒｚおよびＧｅｒａｒｄ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：２８１２〜２８１６）筋肉細胞（Ｑｕａｎｔｉｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２５８１〜２５８４）をはじめとするさまざまな細胞型の感染に利用できる。さらに、導入アデノウイルス核酸（およびそれに含まれる外来ＤＮＡ）は、宿主細胞のゲノムには組み込まれないが、依然としてエピソーム性のままであるため、導入核酸が宿主ゲノム（レトロウイルスＤＮＡなど）に組み込まれる状況での挿入突然変異誘発の結果として起こり得る潜在的な問題が回避される。さらに、アデノウイルスゲノムの外来ＤＮＡ保有能力は、他の遺伝子送達ベクターに比べて大きい（８ｋｂまで）（Ｂｅｒｋｎｅｒら、上記にて引用；Ｈａｊ−ＡｈｍａｎｄおよびＧｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。現在使用されているほとんどの複製欠損型アデノウイルスベクターは、ウイルスＥ１およびＥ３遺伝子の全部または一部が欠失しているが、アデノウイルス遺伝子物質の８０％を保持している。
３．アデノ随伴ウイルス：アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、効率的な複製および増殖生活環のためのヘルパーウイルスとして、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの他のウイルスを必要とする、自然界に存在する欠損型ウイルスのひとつである（概要については、Ｍｕｚｙｃｚｋａら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７〜１２９を参照のこと）。このウイルスは、そのＤＮＡを非分裂細胞に組み込み、高い頻度で安定した組込みを示すことのできる、数少ないウイルスの１つでもある（たとえば、Ｆｌｏｔｔｅら（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９〜３５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２〜３８２８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ６２：１９６３〜１９７３を参照のこと）。ＡＡＶのわずか３００塩基対を含むベクターをパッケージングし、組み込むことができる。外来核酸の空間は約４．５ｋｂに制限されている。Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１〜３２６０に記載されているようなＡＡＶベクターを利用して、核酸を細胞に導入することが可能である。ＡＡＶベクターを使って異なる細胞型にさまざまな核酸が導入されている（たとえば、Ｈｅｒｍｏｎａｔら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：６４６６〜６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２〜２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄら（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２〜３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１〜６１９；Ｆｌｏｔｔｅら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１〜３７９０を参照のこと）。
特定の発現ベクター系の有効性および核酸を細胞に導入する方法については、従来技術で慣用的に用いられている標準的なアプローチで評価できる。たとえば、細胞に導入された核酸は、フィルターハイブリダイゼーション法（サザンブロットなど）により検出でき、導入核酸の転写により産生されたＲＮＡは、たとえば、ノザンブロット、ＲＮａｓｅ保護または逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により検出できる。遺伝子産物の検出は、適当なアッセイにより、たとえば、特異的抗体を用いるなどの方法での産生タンパク質の免疫学的検出により、あるいは酵素アッセイなどの遺伝子産物の機能的活性を検出する機能的アッセイにより行うことができる。細胞により発現される目的の遺伝子産物が容易にアッセイできないものである場合、調節エレメントに連結したレポーター遺伝子と使用する予定のベクターとを用いて、まず最初に発現系を最適化すればよい。レポーター遺伝子は、容易に検出可能な遺伝子産物をコードするため、系の有効性の評価に利用できる。従来技術において用いられている標準的なレポーター遺伝子としては、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ、ヒト成長ホルモンをコードする遺伝子があげられる。
本発明で有用な細胞
本発明は、本発明の多機能性分子をコードする核酸コンストラクトでトランスフェクトした宿主細胞を規定するものである。本発明において有用な宿主細胞としては以下のものがあるが、これに限定されるものではない。
宿主細胞は、本発明による抗原のキャリアとして作用できるものであれば、どのような細胞であってもよく、よって、核酸を人工的に導入できる有核細胞または原核細胞であっても構わない。本発明で有用な原核細胞には細菌細胞がある。本発明で有用な真核（有核）細胞としては、酵母細胞、真菌、寄生虫の細胞および哺乳類細胞があげられる。本発明で有用な哺乳類細胞としては、滑膜細胞などの個別間葉細胞を含む線維芽細胞；ケラチノサイト、上皮細胞、内皮細胞、白血球および腫瘍細胞があげられるが、これに限定されるものではない。
本発明で有用な細胞系としては、Ｂ１６、ＣＭＳ−５線維肉腫細胞、Ｃｏｓ１細胞およびＣＨＯ細胞、ＴＳ／Ａ、ルイス肺癌腫、ＲＥＮＣＡ、ダニングラット前立腺癌ならびに、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ヴァージニア州マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ））のカタログに含まれる細胞系があげられるが、これに限定されるものではない。
本発明の多機能性分子をコードする核酸分子を含む宿主細胞を、本発明による病原性細胞から調製することができる。病原性細胞としては、腫瘍細胞（Ｂ１６細胞、ＣＭＳ−５線維肉腫細胞、「本発明が有効に作用する腫瘍」の章に含まれる腫瘍由来の細胞）ならびに、病原性細菌、病原性真菌、病原性ウイルス、病原性寄生虫または病原性節足動物由来の細胞があげられる。
人工的に導入した組換え核酸配列からの発現の検出方法
本発明は、細胞に人工的に導入した組換え核酸分子から発現されるタンパク質（多機能性分子など）の検出方法を規定するものである。
抗体の調製
本発明で有用なタンパク質に特異的な抗体（多機能性分子など）は、タンパク質の精製に有用であり、また、これらのタンパク質を発現する組換え核酸分子を人工的に導入した細胞からの当該タンパク質の発現の検出に有用である。抗体によって、本願発明者らは、このような抗体の結合（可変）領域および他の抗体修飾を使用した構成を含む。よって、本発明において有用な抗体には、全抗体、抗体断片、多機能性抗体凝集物、または一般に抗体由来の１以上の特異的結合部位を含む物質を含み得る。抗体断片は、Ｆｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片またはその誘導体、たとえば、単鎖Ｆｖ断片などの断片であってもよい。抗体または抗体断片は、非組換え、組換えまたはヒト化したものであってもよい。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンアイソタイプであってもよい。さらに、必要であれば、免疫グロブリンまたはその断片の、凝集物、ポリマー、誘導体およびコンジュゲートを使用することができる。
抗体の産生に有用な本発明によるタンパク質（本発明による多機能性分子など）のタンパク質産物（またはその断片またはオリゴペプチド）には生物活性を必要としないが、抗原性でなければならない。抗体は本発明の多機能性分子のどのポーションに指向したものであってもよい。たとえば、抗体を多機能性分子のレクチンポーションまたは多機能性分子のリガンドポーションに指向させることができる。特異的抗体の誘導に用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸からなり、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を持つものであってもよい。好ましくは、それらは天然タンパク質の領域と同一であり、自然界に存在する小さな分子の全アミノ酸配列を含み得る。本発明で有用なタンパク質（本発明による多機能性分子など）をコードする組換え核酸のタンパク質産物に相当するアミノ酸の短い配列を、スカシ貝ヘモシアニンまたはＧＳＴなどの他のタンパク質由来のアミノ酸と融合させることができ、抗体はキメラ分子に対して産生される。従来技術において周知の手順を利用して、本発明の組換え核酸のタンパク質産物に対する抗体を産生することができる。
抗体を産生するにあたって、本発明で有用なタンパク質をコードする組換え核酸分子のタンパク質産物（または免疫原性の特性を保持するその任意のポーション、断片またはオリゴヌクレオチド）を注入することにより、ヤギ、ウサギ、ラット、マウスなどをはじめとするさまざまな宿主を免疫化し得る。宿主の種に応じて、さまざまなアジュバントを使用して免疫反応を亢進できる。このようなアジュバントとしては、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルション、スカシ貝ヘモシアニン、ジニトロフェノールがあげられるが、これに限定されるものではない。ＢＣＧ（カルメット−ゲランの桿菌）およびコリネバクテリウム・パルバムは、潜在的に有用なヒトアジュバントである。
Ｉ．ポリクローナル抗体
抗原タンパク質の免疫原性を高めるには従来のキャリアにコンジュゲートすればよく、ペプチド−キャリアコンジュゲートに対する抗血清が生じる。キャリアタンパク質へのペプチドの連結と免疫化については、（Ｄｙｍｅｃｋｉら、１９９２、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６７：４８１５）に記載されているようにして実施できる。この血清は、ＥＬＩＳＡ（下記）またはドットブロットまたはスポットブロット（ＢｏｅｒｓｍａおよびＶａｎ Ｌｅｅｕｗｅｎ、１９９４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、５１：３１７）でタンパク質抗原に対して滴定可能である。同時に、この抗血清を記載のようにして調製した組織切片に使用することもできる。有用な血清は、たとえばＧｒｅｅｎら、１９８２、Ｃｅｌｌ、２８：４７７に記載の手順に沿ってのＥＬＩＳＡで、適切なペプチドと強く反応する。
２．モノクローナル抗体。
モノクローナル抗体を調製するための手法は周知であり、Ａｒｎｈｅｉｔｅｒら、１９８１、Ｎａｔｕｒｅ、２９４；２７８に記載されているように、レベルが測定される、あるいは不活性化または親和性精製される、好ましくはキャリアに結合した候補抗原（多特異的分子またはレクチンなど）を用いてモノクローナル抗体を調製することができる。
モノクローナル抗体は一般に、ハイブリドーマ組織培養から、またはハイブリドーマ組織を導入した動物の腹水から得られる。
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（またはポリクローナル血清）を、標的タンパク質への抗体の結合についてスクリーニングできる。
３．抗体検出方法
特に好ましい免疫学的試験は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用することに依存し、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫ブロット法および免疫沈降法を含む（Ｖｏｌｌｅｒ、１９７８、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｈｏｒｉｚｏｎｓ、２：１、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）；Ｖｏｌｌｅｒら、１９７８、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．、３１：５０７；米国再発行特許３１，００６号；英国特許第２，０１９，４０８号；Ｂｕｔｌｅｒ、１９８１、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、７３：４８２；Ｍａｇｇｉｏ（編）、１９８０、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、フロリダ州ボカラトン（Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ）を参照のこと）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｂ．、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ、Ｓｅｖｅｎｔｈ Ｔｒａｉｎｉｎｇ Ｃｏｕｒｓｅ ｏｎ Ｒａｄｉｏｌｉｇａｎｄ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｔｈｅ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ、１９８６年３月、第１〜５ページ、第４６〜４９ページ、第６８〜７８ページ）。本発明で有用なタンパク質（多機能性分子またはその一部など）をコードする組換え核酸によって産生されるタンパク質の有無について組織を分析する場合、免疫組織化学法を利用することができる。標的タンパク質を容易に検出できるようにするには、抗体分子を標識しなければならないことがあることは、当業者には明らかである。抗体分子を標識する手法は当業者間で周知である（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８９、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙを参照のこと）。
免疫反応が本発明のとおりに調節されたか否かの判断
本願明細書に記載の多機能性分子は、哺乳類、好ましくはヒトで、多機能性分子のレクチンポーションに結合した抗原保有標的に含まれる抗原（単数または複数）に対する免疫反応を調節するのに本発明で有用である。一実施形態では、抗原保有標的に結合した多機能性分子を含む組成物を動物、好ましくはヒトに投与する。ＡＰＣの細胞表面分子のリガンドを含む多機能性分子の第２のポーションは、組成物を投与した動物の抗原提示細胞にこの組成物を標的する。抗原保有標的は、抗原提示細胞によって取り込まれる（すなわち喰食されるまたは貪食される）。あるいは、多機能性分子／抗原保有標的複合体を、貪食作用が可能になる条件下にてｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原提示細胞に接触させ、続いてＡＰＣをその由来となった宿主生物に戻す。
よって、本発明は、少なくとも本願明細書に記載の多機能性分子を含む組成物を哺乳類に投与することを含む、哺乳類で免疫反応を調節するための方法を提供するものである。一実施形態では、この組成物は抗原保有標的をさらに含む。さらに他の実施形態では、この組成物はＡＰＣをさらに含む。
「免疫反応」は、免疫系に関与する選択応答の刺激／活性化、または選択応答の抑制、排除または減弱を意味する。好ましい実施形態では、免疫反応は、ＣＤ４０リガンド増強細胞ではない対照細胞と比較して、少なくとも約５％または好ましくは５から５０％または一層好ましくは５０から１００％または少なくとも１００％またはそれ以上の、免疫系に関与する選択応答の刺激／活性化、あるいは、少なくとも約５％または好ましくは５から５０％または一層好ましくは５０から１００％または少なくとも１００％またはそれ以上の、選択応答の抑制、排除、または減弱を示す。よって、免疫反応の調節とは、多機能性分子の非存在下で抗原保有標的をＡＰＣに接触させたときよりも、所望の反応が一層効率的に、一層迅速に、規模が一層大きくおよび／または一層容易に誘導されることを意味する。被検体における異なる免疫反応を、さまざまに調節することができ、たとえば、細胞性免疫反応を選択的に亢進する一方で体液性反応を選択的に減弱することができたり、その逆といったことができる。
以下のｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでのアッセイは、免疫反応が本発明のとおりに調節されたか否かを判断する上で有用である。詳細に後述するアッセイでは、抗原に対する細胞性免疫反応または体液性免疫反応の刺激または抑制を測定する。以下のアッセイで言及した抗原は代表的なものである。本発明で有用な選択抗原に対する免疫反応を、その抗原にアッセイを適合させることで以下のアッセイのうちの１つ以上を用いて測定できることは、当業者には明らかである。
Ｉ．貪食作用の増加の検出
以下のアッセイは、オプソニン増強細胞が抗原提示細胞による貪食作用を刺激するか否かを判断するために使用できるものである。
貪食作用を調べるには、ＦＣＳを添加していないＲＰＭＩ中３７°で３０分間接着させた単球を使用する。ヒツジ赤血球を、オプソニンまたはその前駆体と一緒に、平均して３００以下の分子が各赤血球に沈着するような条件下でインキュベートする。前駆体を使用するのであれば、被覆赤血球を処理して前駆体をすべて実際の候補分子に変換する（Ｃａｒｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２３：５２３〜８（１９７９）などを参照のこと）。被検体から新鮮な単球を単離し、これらの細胞５×１０４〜１×１０５個を、１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地０．２５〜０．５ｍｌに懸濁させる。このアリコートを組織培養ウェルに入れ、３７℃で３０分間インキュベートする。細胞１．２×１０８個／ｍｌで懸濁させた余分な被覆赤血球を単球にのせ、プレートを５０ｇで５分間遠心し、３７℃で３０分間インキュベートする。氷冷溶解緩衝液を使用する２段階の低張溶解工程で非喰食物質を除去し、接着細胞を固定および染色し、細胞を光学顕微鏡で調べる。１以上の標的細胞を喰食した１００単球の比率を求めることにより貪食作用を定量し、喰食Ｅ／１００単球（ＰＩ）の総数を記録する。本発明での貪食作用の刺激は、４０以上の貪食係数により示される。
貪食作用についての他のアッセイは以下のとおりである。ネズミマクロファージ系統の細胞を採取し、ＤＭＥＭ−１０に４×１０５／ｍｌで懸濁させる。この懸濁液２．０ｍｌを３．５ｃｍの細胞培養プレートに一定分量ずつ分け、皿を５％ＣＯ２中にて３７℃で一晩インキュベートする。標的細胞ならびに対照細胞をマクロファージと同じ日に収集し、ＰＢＳで洗浄し、ＰＫＨ２６染料（同梱の希釈液１ｍｌ中２μＭ溶液）に細胞５×１０６個／ｍｌで２分間再懸濁させる。蛍光ＰＫＨ２６染料は励起させると赤色スペクトルで光を放出するのに対し、貪食細胞に用いたＦＩＴＣ標識は緑色スペクトルで光を放出する。ＰＫＨ２６は貪食細胞のエンドソーム／リソソーム区画で安定である。染色した標的細胞をＰＢＳで３回洗浄し、一晩培養してＰＫＨ２６を培地に浸出させる。これによってアッセイ時の染料の漏出が最小限になる。翌日、標的細胞を収集し、ＰＢＳで３回洗浄し、無血清ＤＭＥＭに５×１０５／ｍｌで再懸濁させる。血清を取り除くために貪食細胞を培養プレート上でＰＢＳで強くすすぎ、標的細胞２ｍｌを各プレートに加える。０、２、４または８時間後、プレートをＰＢＳで３回すすいで未接着の細胞をすべて除去し、残った細胞を２ｍＭ ＥＤＴＡと一緒にインキュベートしてこれをプレートに放出する。放出された細胞を１％ＦＢＳ／ＰＢＳで洗浄し、同じ緩衝液１００μｌに懸濁させる。抗貪食細胞（抗ＣＲ３など）抗体２μｇを加え、細胞を２５分間氷上におき、細胞を１％ＦＢＳ／ＰＢＳで３回洗浄し、この溶液１００μｌに再懸濁させ、ＦＩＴＣ−コンジュゲート二次ＩｇＧの１：２５希釈液で氷上にて２５分間染色する。細胞を３回洗浄し、１％ＦＢＳ／ＰＢＳ ５００μｌに再懸濁させた後、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社のＦＡＣＳｃａｎでＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて分析する。
ＦＬ−１（緑色）蛍光を利用して貪食細胞を開閉する（ｇａｔｅ）。これらの細胞のＦＬ−２（赤色）蛍光は、ＰＫＨ２６−標識標的細胞の内部移行を反映するものであるが、これを測定する。オプソニン被覆標的細胞でインキュベートしたマクロファージと非オプソニン被覆標的細胞でインキュベートしたマクロファージとの間の平均ＦＬ−２蛍光の差によって、オプソニンなどで誘導される貪食作用が示される。オプソニンを用いると、たとえば少なくとも１０％など、あるいはスチューデントのｔ検定でｐ値が０．０５以下になるのに十分なだけ、平均ＦＬ−２蛍光が増大する。
ＩＩ．通常、免疫反応の増幅には普通は休止期状態で特定の亜個体群のリンパ系細胞の増殖を含む
増殖アッセイには臨床試験で以下のような用途がある。（１）マイトジェンまたは抗ＣＤ３抗体などのポリクローナル増殖シグナルへの応答能に現れる、Ｔ細胞またはＢ細胞の全体的な免疫学的適合性の評価。増殖の異常は、基本的な細胞性免疫の異常を示す指標であり得る。慢性疾患の非特異的二次作用として低増殖が見られることが多い。（２）特異的抗原に対する個体の応答の評価。ここでの低応答は、一般的または特異的な免疫異常を示す指標である。（３）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によるＭＨＣ適合性の判断。
さらに、増殖アッセイは、リンフォカイン産生の推定、シグナル伝達の調査、Ｔ細胞またはＢ細胞の成長因子要求（リンフォカインなど）を評価するのに有用である。本願明細書で概説した手順では［３Ｈ］チミジンのＤＮＡへの取り込みを測定するが、これは通常、細胞数の変化から求められる細胞の増殖とよく相関する。しかしながら、イオノマイシンにホルボルミリステートアセテート（ＰＭＡ）を加えた化学活性化物質の場合のように、活性化刺激が毒性の場合、活性化後に新規ＤＮＡが急増しても生存細胞の正味の増加が得られないことがあり、事実、細胞数の減少が観察されることもある。この場合、ＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン取り込みは、細胞数の推定よりもむしろ初期細胞刺激を示す指標となる。さらに、［３Ｈ］チミジン取り込みによって、個々の細胞ではなく細胞個体群に関する情報が得られる。フローサイトメトリなどの別の方法を、その種類の情報が必要な研究に利用することもできる。
抗原誘導Ｔ細胞増殖のアッセイ
このプロトコールは、特異的抗原−破傷風トキソイドに応答したＴ細胞の増殖を試験するために設計される。これは、任意のタンパク質または多糖抗原に応答したＴ細胞の増殖を試験するように改変できる。材料：（Ｔ細胞懸濁液、自家抗原提示細胞懸濁液（非Ｔ細胞）、破傷風トキソイド溶液（コノート（Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）またはステートラボラトリーインスティテュートオブマサチューセッツ（Ｓｔａｔｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ））。（１）Ｔ細胞を計数し、完全ＲＰＭＩ−１０ＡＢで細胞１×１０６個／ｍｌに調整する。（２）一方向ＭＬＲプロトコールのステップ２のようにして、抗原提示細胞をマイトマイシンＣで処理（または２５００ｒａｄで光線照射）する。抗原提示細胞の濃度を細胞２×１０５個／ｍｌに調整する。抗原提示細胞は、自家非Ｔ細胞または自家単球／マクロファージで構成できる。（３）Ｔ細胞懸濁液１００ｕｌと抗原提示細胞個体群５０ｕｌとをウェルに入れ、分配直前に混合する。（４）破傷風トキソイド溶液５０ｕｌを加え、最終濃度を０、１、５、１０および２０ｕｇ／ｍｌとする。各希釈について３つのウェルを用意する。（５）加湿３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで６日間インキュベートする。（６）［３Ｈ］チミジンでパルスし、サポートプロトコールに記載されているとおりに収集する。
リンフォカイン依存性細胞増殖のアッセイ
このプロトコールは、リンパ球個体群のリンフォカイン依存性増殖、この場合はＢ細胞のＩＬ−４依存性増殖をアッセイするものである。材料：（扁桃腺Ｂ細胞懸濁液、セファロースビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に架橋した抗ＩｇＭ、完全ＲＰＭＩ−１０中の１０，０００Ｕ／ｍｌのヒトｒＩＬ−４（Ｇｅｎｚｙｍｅ））。（１）扁桃腺Ｂ細胞を計数し、完全ＲＰＭＩ−１０を用いて濃度を細胞１×１０６個／ｍｌに調整する。（２）扁桃腺Ｂ細胞１００ｕｌを各ウェルに分配する。各実験条件について３つのウェルを用意する。（３）１０，０００Ｕ／ｍｌのｒＩＬ−４溶液を、１：１０、１：１００および１：１０００に希釈する。原液または希釈液２０ｕｌを適切なウェルに入れ、１０００Ｕ／ｍｌ、１００Ｕ／ｍｌ、１０Ｕ／ｍｌおよび１Ｕ／ｍｌにする。ｒＩＬ−４なしの対照ウェルを含める。（４）抗ＩｇＭビーズを適切なウェルにピペットする。
パイロット実験で最適なビーズ濃度を求める。最適な用量を「ひとくくりにする」ために、それぞれの実験で何通りかのビーズ濃度を用いるようにすると最もよい。扁桃腺Ｂ細胞およびＩＬ−４希釈液のみ、抗ＩｇＭビーズのみ、培養液のみ、ＩＬ−４および抗ＩｇＭビーズ希釈液すべての組み合わせでウェルを用意する。（５）必要に応じて完全ＲＰＭＩ−１０を使用し、各ウェルの容量を２００ｕｌまで増やす。（６）加湿３７℃、５％ＣＯ２のインキュベータで５日間培養する。（７）［３Ｈ］チミジンでパルスし、サポートプロトコールに記載されているとおりに収集する。
［ ３ Ｈ］チミジンパルスと細胞培養の収集
このプロトコールを先のプロトコールと併用し、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイに必要なことをすべて満たす。（１）５０ｕＣｉ／ｍｌ［３Ｈ］チミジン２０ｕｌを各培養（１．０ｕＣｉ）に一定時間に加え、培養を終了する（通常６時間または１８時間）。（２）細胞を吸引する自動マルチウェルハーベースタを用いて細胞培養を収集し、細胞を溶解し、ＤＮＡを濾紙に移す一方で、取り込まれなかった［３Ｈ］チミジンを洗い流せるようにしておく。各列のマイクロタイタープレートで充填と吸引を１０回繰り返し、細胞を完全に移し、取り込まれなかったチミジンを完全に除去する。濾紙片を各々１００％エタノールで洗浄し、乾燥しやすくする。シンチレーションバイアルに移す。半自動ハーベスタの場合は、各ウェルのフィルタドットをシンチレーションカウンタ用バイアルに移す。手作業で移すのであれば、ランプの下で濾紙を乾燥させ、ピンセットでシンチレーションバイアルに移す。シンチレーション液を各バイアルに加える。（３）標準偏差が２％未満になるまで、シンチレーションカウンタで検体を計数する。バックグラウンド培養と各実験条件での平均ｃｐｍを計算する。複製培養のばらつきは２０％未満とする。
ＩＩＩ．ｉｎ ｖｉｔｒｏ抗体反応の誘導と測定
タンパク質または多糖抗原でのｉｎ ｖｉｖｏ免疫化後に抗体反応を引き起こすヒト免疫系の能力は、免疫系のＢ細胞およびＴ細胞アーム（ａｒｍ）の両方の全体の完全性を表す指標である。このため、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化とこれに続く抗体反応の測定は、さまざまな後天性免疫不全疾患および先天性免疫不全疾患ならびに免疫系に影響を及ぼす他の状態での宿主における免疫機能を調べる上で、まさに適切な試験のひとつである。以下の手順は、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化とこれに続くＥＬＩＳＡ法を使用しての免疫反応の測定についてのものである。
ＮＩＰ標識抗体およびＨＲＰＯ標識抗体を使用したサイトカインについての免疫酵素アッセイ
このプロトコールは、マイクロタイタープレートに結合させたコーティング抗体でサイトカインを固定化する異種非競合的イムノアッセイ反応を利用した、サイトカインについての免疫酵素アッセイについて説明するものである。結合していない物質を洗い流し、ハプテンニトロヨードフェニル（ＮＩＰ）で標識した異なる抗サイトカイン抗体を使用して検出を行う。これをさらに、発色性基質ＡＢＴＳで顕現する抗ＮＩＰ抗体のセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）コンジュゲートで検出する。この非競合的イムノアッセイでは、イムノアッセイシグナル（Ａ４０５）は検体に存在するサイトカイン量の一次関数として増加する。抗体については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９５、６．２０．２〜６．２０．１０に記載されているようにして調製する。
アッセイプレートの被覆。（１）マルチチャンネルピペッタを用いて、被覆抗体の適切な希釈液１００ｕｌを、使用するアッセイプレートのすべてのウェルに移す。（２）プレートをマイクロタイタープレートシーラーまたはパラフィルムで密封し、３７℃で２時間インキュベートする。調製用プレートに検体と標準試料とを調製する。（３）アッセイ対象となる各検体（または条件培地のアリコート）を同容量のイムノアッセイ希釈液で希釈する。（４）アッセイ対象となる各希釈検体１ｍｌ以下を、別のスピン−Ｘ精密濾過装置の上側のチャンバにピペットする。１０，０００ｒｐｍで５分間微量遠心し、下側のチャンバに集まる濾液を保存する。（５）各希釈検体６５ｕｌを調製用プレート（すなわち別の９６ウェルのマイクロタータープレート）の適切なウェルに入れる。（６）サイトカイン標準試料のアリコートを室温にて解凍し、確実に十分に混合する。標準曲線で最高濃度を示した調製用プレートのウェルに１３０ｕｌをピペットする。このウェルから６５ｕｌを次に移した後、標準曲線に表れるそれぞれの濃度で６５ｕｌが調製用プレートの適切なウェルに入るように、イムノアッセイ希釈液で１：１の連続希釈を続ける。（７）カリブレータのアリコートを室温にて解凍する（使用する場合）。同容量のイムノアッセイ希釈液で希釈した後、希釈カリブレータ６５ｕｌを調製用プレートの適切なウェル（単数または複数）にピペットする。
コーティング抗体と一緒にインキュベートする。（８）インキュベータから被覆されたアッセイプレートを取り出す。１×洗浄緩衝液を充填した２リットル容のビーカーに浸漬した後、シンク上でひっくり返して振り、液体を取り除く。さらに２回繰り返し、ペーパータオルの上に押し付けて乾かす。（９）マルチチャンネルピペッタを用いて、調製用プレートの各ウェルから溶液５０ｕｌをアッセイプレートの対応するウェルに移す。（１０）プレートをマイクロタイタープレートシーラーまたはパラフィルムで密封し、室温にて２時間インキュベートする。
検出用抗体と一緒にインキュベートする。（１１）目的のサイトカインに特異的なＮＩＰ標識検出用抗体を、検出用緩衝液中で１ｕｇ／ｍｌまで希釈する。（１２）ステップ８と同様にしてアッセイプレートを洗浄する。（１３）ステップ１１で得られた希釈検出用抗体７５ｕｌを、外側の未使用のウェルも含めてアッセイプレートのすべてのウェルに入れる。（１４）プレートをマイクロタイタープレートシーラーまたはパラフィルム再密封し、室温にて１時間インキュベートする。
ＨＲＰＯコンジュゲート抗ＮＩＰ抗体と一緒にインキュベートする。（１５）ＨＲＰＯコンジュゲート抗ＮＩＰＭａｂを検出用緩衝液で１：３０００に希釈する。（１６）ステップ８と同様にしてアッセイプレートを洗浄する。（１７）ステップ１５で得られた希釈ＨＲＰＯ標識抗ＮＩＰ抗体７５ｕｌをアッセイプレートのすべてのウェルに入れる。（１８）プレートをマイクロタイタープレートシーラーまたはパラフィルムで再密封し、室温にて１時間インキュベートする。
発色性基質と一緒にインキュベートする。（１９）ステップ８と同様にしてアッセイプレートを洗浄する。（２０）ＡＢＴＳ発色基質溶液１００ｕｌをアッセイプレートのすべてのウェルに入れる。プレートをカバーし、発色が所望のレベルに達するまで（通常は濃度が最も高い標準試料の入ったウェルのＡ４０５が１．５から２になるまで）室温にてインキュベートする。このプロトコールでは通常、３０から６０分後に読み取りできるアッセイが得られる。
プレートを読み取り、データを分析する。（２１）コンピュータインタフェースを有するマイクロタイタープレートリーダーを使用して、単波長モードで４０５ｎｍまたは二波長モードで４０５ｎｍと６５０ｎｍですべてのウェルの吸光度を測定する。（２２）カーブフィッティングソフトウェアを用いて、一次（線形）、二次（二次）または四パラメーター（非線形）数学関数により表された曲線に標準データをフィットさせる。（２３）未知のサイトカイン検体からの吸光度データをフィットさせた標準曲線に補間し、サイトカイン濃度を計算する。
ＩＶ．ｉｎ ｖｉｖｏで抗体反応を誘導することで、免疫系全体の完全性を評価するための方法が得られる
本願明細書に記載のプロトコールでは、ジフテリアと破傷風トキソイドを代表的なタンパク質抗原として使用し、安全性と入手しやすさの観点から肺炎球菌多糖を代表的な多糖抗原として使用する。しかしながら、これらの抗原により顕現される応答は、過去のワクチン接種や自然曝露がゆえに二次応答となることが多い点に注意されたい。一次応答を得るには、スカシ貝ヘモシアニンなどの通常とは違った抗原を使用する必要がある。
抗原を本願明細書で行っているように筋肉内または皮下経路で投与する場合、「全身」免疫反応を誘導して循環抗体を測定するのが最も適している。しかしながら、ときには「局所」または粘膜免疫反応を評価したいこともある。この場合、抗原を鼻腔内投与して呼吸器のリンパ組織を刺激するするか、経口投与して胃腸のリンパ組織を刺激し、血液ではなく気管支洗浄液または腸管液を抗体含有量についてアッセイする。さらに、局所／粘膜の応答を刺激するのに一層適切な抗原（すなわち、呼吸器での反応にはインフルエンザウイルス抗原、胃腸での反応にはコレラ毒素）を使用する。
ｉｎ ｖｉｖｏにて抗体反応をアッセイするにあたり、タンパク質抗原と多糖抗原は免疫系の異なる成分を刺激するため、両方の抗原に対する反応を判断することが重要である。そこで、タンパク質抗原に対する主要な抗体反応をＩｇＧ１およびＩｇＧ３サブクラス抗体で構成するのに対し、多糖抗原に対する主要な抗体反応はＩｇＧ２サブクラス抗体で構成する。
ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化後に得られる物質での抗体反応の測定には、さまざまなイムノアッセイ法が用いられている。このうち、おそらくＥＬＩＳＡアッセイが最も有用であろう。なぜなら、容易に測定可能かつ再現可能で安全な安定したリードアウトが得られるためである。
タンパク質／多糖抗原に対するｉｎ ｖｉｖｏ抗体反応の誘導
このプロトコールでは、抗原を筋肉内または皮下経路で投与し、反応の測定用に血清を収集する。（１）事前に免疫化した血液検体を抜き取り、血液を凝固させ、遠心により血塊から血清を分離する。血清を適宜標識したプラスチック管に入れて−２０℃から−７０℃で貯蔵する。（２）適宜準備した筋肉内部位（三角筋または大腿）に、静脈注射しないように注意しながらトキソイド混合物０．５ｍｌを注射する。（３）適宜準備した皮下部位に、静脈注射しないように注意しながら多価肺炎球菌ワクチン０．５ｍｌを注射する。（４）所望の間隔で、通常１、２、３週間感覚で、免疫化後の血液検体を抜き取る。血清を分離し、−２０℃から−７０℃で貯蔵する。（５）すべての血清検体を収集した後、ＥＬＩＳＡを使用して抗体の存在について検体をアッセイする。
ＥＬＩＳＡは、破傷風とジフテリアのブースターならびに多価肺炎球菌多糖ワクチンを接種した個体から得られた血清中のタンパク質および多糖抗原をはじめとするさまざまな抗原に対するｉｎ ｖｉｖｏ抗体反応を測定するための、迅速で感度が高く再現可能な非放射活性の方法となる。破傷風、ジフテリア、肺炎球菌多糖Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型に特異的なアッセイについては、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９５、第６および７巻に詳述されている。
腫瘍拒絶を利用したアッセイ
免疫調節のための他のアッセイでは、放射線照射したサイトカイン被覆腫瘍細胞を免疫適格性（ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｎｔ）動物に１０４〜１０８個前後ワクチン接種し、１０４〜１０８個前後の生きた野生型腫瘍細胞で（任意の時間的順序）攻撃する。これらの動物における生存または腫瘍発生が、オプソニン増強細胞の代わりに放射線照射した非サイトカイン被覆細胞を用いて、同じパラメータでワクチンを接種した動物の場合と比較して違っている場合は、免疫調節が起こっている。たとえば、被験群の動物の少なくとも１０％が対照群での平均生存時間と比較して１００％長く生存した場合、この試験は陽性である。他の例として、被験動物の２０％での腫瘍発生は対照動物での平均的な発生よりも５０％遅くなる可能性がある。
投与量および投与
本発明は、本願明細書に記載の多機能性分子を含む組成物、あるいは本発明の多機能性分子および抗原保有標的を含む組成物を、治療量で哺乳類に投与すること、あるいはｉｎ ｖｉｔｒｏにて多機能性分子および抗原保有標的を接触させたＡＰＣを治療量で含む組成物を投与することを含む、哺乳類で選択抗原に対する免疫反応を調節する方法を包含する。
本願明細書に記載の組成物は、液状溶液または懸濁液のいずれかの注射液として調製でき、感染前に液体に加えて溶液または懸濁液にするのに適した固体を調製することも可能である。この製剤は乳化可能であり、あるいはこれをリポソームに閉じ込めることもできる。活性免疫原性成分は、薬学的に許容され、活性成分と相溶のキャリアと混合されることが多い。「薬学的に許容されるキャリア」という用語は、アレルギー反応または都合の悪い他の作用を、これを投与する被検者に生じないキャリアを意味する。本発明で使用する場合、「薬学的に許容されるキャリア」に培養液は含まれず、血清を約０．２〜２％含む溶液も一切含まれない。薬学的に許容される適切なキャリアとしては、たとえば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどとこれらの組み合わせとのうちの１つ異常があげられる。さらに、必要であれば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤および／またはワクチンの効力を高めるアジュバントなどの補助物質を少量ワクチンに含有させることができる。効果的な場合があるアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ １１６３７、ノル−ＭＤＰとも呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−アラニン−２−１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＯＰ）１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０エマルション中、細菌から抽出された３つの成分すなわちモノホスフォリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を含むＲＩＢＩがあげられるが、これに限定されるものではない。アジュバントの他の例として、ＤＤＡ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、ＱｕｉｌＡがあげられる。さらに、リンフォカイン（ＩＦＮ−、ＩＬ−２、ＩＬ−１２など）などの免疫調節物質またはポリＩ：Ｃなどの合成ＩＦＮ−誘導物質を、本願明細書に記載のアジュバントと併用することができる。
本発明の組成物は、たとえば皮下または筋肉内への注射によって、非経口的に投与可能なものである。他の投与形態に適した別の剤形として、坐剤、場合によっては経口製剤またはエアゾールとしての投与に適した剤形がある。経口製剤の場合には、アジュバント、抗原パッケージングを用いてＴ細胞サブセットを操作するか、あるいは個々のサイトカインをさまざまな剤形に加えることで、免疫反応が最適である改良された経口ワクチンを得ることができる。坐剤の場合、伝統的なバインダおよびキャリアとしてポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドがあげられ、このような坐剤は、０．５％から１０％、好ましくは１％から２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成できる。経口製剤は、たとえば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常用いられている賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤または散剤の形をとり、活性成分を１０％〜９５％、好ましくは２５〜７０％含む。
本発明の組成物は、中性または塩の形としてワクチン組成物に処方できるものである。薬学的に許容される塩としては酸付加塩（ペプチドの遊離アミノ基により形成される）があり、これは、たとえば塩酸またはリン酸などの無機酸または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される。また、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基ならびに、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から、遊離カルボキシル基により形成される塩を誘導することも可能である。
このようなワクチン組成物の任意の細胞成分には、このような組成物に含ませるよう調製する際に、たとえば、細胞分裂を阻害できる電離放射線への曝露、シクロホスファミド、サイトカラシンＤまたはコルヒチンなどの抗増殖剤あるいは固定を伴うまたは伴わない殺滅を含む、ワクチンの細胞の弱毒化または不活性化を伴う処置をほどこすことができる。
抗原保有標的とＡＰＣとを含む組成物を、投与剤形に合った方法で、かつ予防的および／または治療的に効果の得られる量で投与する。投与量は、被検体の免疫系が持つ抗体合成能を含めて処置対象となる被検体ならびに、必要な保護の程度に左右される。好適な用量範囲は、ワクチン接種１回あたり活性成分数百マイクログラム前後で、好ましい範囲は約０．１μｇから１０００μｇであり、たとえば約１μｇから３００μｇの範囲などであり、好ましくは約１０μｇから５０μｇの範囲である。初回投与およびブースター注射に適したレジメンもまちまちであるが、初回投与に続いて追加接種または他の投与を行うのが普通である。投与すべき活性成分の厳密な量は医師の判断によるもので、それぞれの被検体ごとに決まる。本発明の細胞の治療有効量が、特に、投与スケジュール、投与される抗原の単位用量、細胞を他の治療薬との組み合わせで投与するか否か、レシピエントの免疫状態および健康状態、特定の組成物の治療活性に左右されることは、当業者には明らかであろう。
この組成物は単回投与スケジュールで投与することができ、また、好ましくは多回投与スケジュールで投与することができる。多回投与スケジュールとは、ワクチン接種の最初のコースでの用量を１〜１０通りにすることが可能で、続いて、たとえば２番目の用量を１〜４ヶ月で投与するなど、免疫反応の維持およびまた強化に必要な他の用量を次の時間間隔で投与し、必要があれば、数ヶ月後にさらに次の用量（単数または複数）を投与できるものである。所望のレベルの保護免疫を維持するには、１〜５年間隔、通常は３年間隔での定期的な追加接種が好ましい。免疫化のコースに続いて、ＥＳＡＴ６またはＳＴ−ＣＦと共培養した抹消血リンパ球（ＰＢＬ）のｉｎ ｖｉｔｒｏ増殖アッセイを行い、初回抗原刺激後のリンパ球からのＩＦＮ放出レベルを測定することが可能である。このアッセイは、放射線核種、酵素、蛍光標識などの従来の標識を用いて実施可能なものである。これらの手法は当業者間で周知であり、本願明細書に援用する米国特許第３，７９１，９３２号、同第４，１７４，３８４号および同第３，９４９，０６４号に記載されている。
本発明を適用可能な腫瘍
本発明は、以下の腫瘍を含むがこれに限定されるものではない腫瘍の処置を企図するものである。
黒色腫、扁平上皮腫瘍、基底細胞癌、星細胞腫、神経膠腫、多型性神経膠芽腫、髄膜腫、上衣腫、神経鞘腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、髄膜腫、グロムス腫瘍、骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、滑膜細胞肉腫、線維肉腫、紡錘細胞腫瘍、血管肉腫、未分化神経外胚葉性腫瘍およびカポジ肉腫を含む肉腫、リンパ腫、急性白血病および慢性白血病、頭頚部の腫瘍、上咽頭癌、咽頭の癌、喉頭癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、胸腺腫、食道癌、胃癌、小腸の腫瘍、結腸および直腸の癌、中皮腫、腺癌、扁平上皮癌、気管支肺胞癌および小型細胞性腫瘍を含む肺癌、膵癌、島細胞腫および非島細胞腫、乳房の癌、心臓粘液腫、下垂体腫瘍、カルチノイド腫瘍、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、腎細胞癌、腎芽腫、ウィルムス腫瘍、副腎癌、褐色細胞腫、胚細胞腫瘍、絨毛癌、卵巣癌、精巣腫瘍、精上皮腫、子宮内膜腫瘍、前立腺の癌、精嚢の癌、膣の腫瘍、陰茎の癌、胞状奇胎（ｈｙｄａｔｉｆｏｒｍ ｍｏｌｅ）、胆嚢の癌、膀胱の癌。
本発明により処置する被検体
本発明は、被検体で転移のサイズおよび／または数を減らすための方法を提供するものである。この方法は、本発明の多機能性分子を含むワクチン組成物を被検体に投与することを含む。本発明で使用する「被検体」とは、動物界の生物、好ましくは哺乳類、なお一層好ましくはヒトを示すことがある。また、本発明による「被検体」は、肺転移またはリンパ節転移のある人間の患者など、１以上の器官または組織に悪性転移のある患者などの抗転移治療が必要な動物のこともある。また、本発明による「被検体」は転移動物モデルのこともあり、この場合の動物は、自然界に存在する転移を持つ同様の動物で観察される悪性細胞または感染細胞の病巣の出現を刺激するために、遺伝子的に、あるいは悪性細胞を注入するか、そうでなければ当業者間で周知の他の方法で操作されている。転移動物モデルの作出は従来技術において周知であり、このようなモデルの一例が、たとえば、Ｒｙａｎ ＭＨら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；１６７：４２８６〜９２；Ｓｐｅｃｈｔ ＪＭら、Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ．１９９７；１８６：１２１３〜２１；Ｎａｋａｎｉｓｈｉら、Ｔｕｍｏｕｒ Ｂｉｏｌ．２００３ ２４：７０〜６；Ｗａｎｇら、Ｉｎｔ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ Ｃａｎｃｅｒ、２００１；２９（１）：３７〜４６；Ｍｕｒａｌｉｄｈａｒａｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｌａｓｅｒ Ｍｅｄ Ｓｕｒｇ． ２００３ ２１（２）：７５〜８３；Ｔａｎａｋａら、Ｃｈｅｓｔ ２００３、１２３（４）：１２４８〜５３；Ｈｕａｎｇら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２００２；１９（４）：３５９；Ｉｒｖｉｎｅ ＫＲら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６；１５６：２３８〜４５に記載されている。当業者であれば、従来技術において周知の転移動物モデルを特定の用途に合った目的の転移モデルの作出に容易に適合させることができよう。
転移の検出
本発明は、本願明細書に記載の多機能性分子を被検体に投与することを含む、被検体で転移の数および／またはサイズを減らす方法を提供するものである。転移の検出および測定が従来技術において慣用的なものであり、十分に確立された方法を用いて達成できることは、当業者であれば分かるであろう。たとえば、検査手術（開腹手術など）などの被検体の肉眼的検査を利用して転移を検出することができる。あるいは、胸腔鏡検査、縦隔鏡検査および腹腔鏡検査などの非侵襲的手法および方法を用いて、転移を検出、測定および／または観察することができる。また、当業者であれば、当業者間で周知の画像形成法を利用して転移の存在を検出することもできる。このような手法としては、放射線撮影法、コンピュータ断層撮影法（ＣＴスキャン）、核磁気共鳴法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴスキャン）、シングルフォトン断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および放射性核種シンチグラフィ（骨スキャンなど）があげられるが、これに限定されるものではない。上記の画像形成法のうちの多くは、当業者間で周知のように、造影剤（ヨウ素またはバリウムなど）を撮影対象となる被検体に注射またはＩＶ投与することによりその感度を高めることができるものである。転移の存在を評価または検出するまたは測定するための別の方法に、肉眼的または組織学的病理検査（すなわち、被検体から組織検体を採取し、従来技術において周知の方法で、肉眼的解剖レベルまたは組織学的または超微細構造的レベルのいずれかまたは両方で検査）を使用することによるものがある。転移を検出、測定および画像形成するための上記の方法は当業者間で周知であり、当業者が本発明の方法で情報を得たい（ａｃｃｅｓｓ）特定の組織、器官または細胞に対しての従来技術における知識により、適宜改変できるものである。このような方法についてのなお一層詳細な説明は従来技術に見出すことができ、たとえば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、第２版、ニューヨーク、オックスフォード大学出版局、２００２に記載されている。
本発明によれば、転移が被検体で少しでも検出された場合に、転移の検出となる。すなわち、被検体で病巣がわずかひとつ検出されたときでも、転移が検出されたということができる。好ましくは、転移は、被検体の一器官または好ましくは１以上の器官での複数の転移巣として検出される。
本発明でのトランスジェニック動物
本願明細書に記載の多機能性分子をコードする核酸分子は、ヒト以外のトランスジェニック動物の作出に利用可能であり、このようなトランスジェニック動物の細胞を単離して動物または人間のワクチン接種でのワクチン製剤に用いることができる。
たとえば、一実施形態では、受精卵母細胞または胚幹細胞に核酸分子を導入する。次いで、このような細胞を利用すれば、本発明のポリペプチドをコードする外来核酸分子をそのゲノムに導入した非ヒトトランスジェニック動物、あるいは内在性核酸分子を変化させた相同的組換え動物を作出できる。このような動物は、本発明の分子の機能および／または活性の研究や、本発明の分子の活性に対する修飾因子の同定および／または評価に有用である。本発明で使用する場合、「トランスジェニック動物」は非ヒト動物であり、哺乳動物の方がよく、一層好ましくはマウスであり、その動物の１以上の細胞にトランスジーンが含まれる。トランスジーンというのは、細胞のゲノムに取り込まれ、トランスジェニック動物の発達起源となり、成熟した動物のゲノムに残ることで、トランスジェニック動物の１以上の細胞型または組織でコードされた遺伝子産物の発現を指示する、外来核酸のことである。
本発明のトランスジェニック動物は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸分子（すなわち多機能性分子）をマイクロインジェクションなどによって受精卵母細胞の雄性前核に導入し、卵母細胞を偽妊娠仮親雌動物で発育させることにより作出できる。トランスジーンにイントロン配列およびポリアデニル化シグナルも含めるようにすれば、トランスジーンの発現効率を高めることができる。組織特異的制御配列（単数または複数）をトランスジーンに作動的に結合し、本発明のポリペプチドの発現を特定の細胞に指向できる。胚操作およびマイクロインジェクションによってトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作出する方法は、従来技術において慣用的なものであり、たとえば、米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号（いずれもＬｅｄｅｒらによる）、Ｗａｇｎｅｒらによる米国特許第４，８７３，１９１号およびＨｏｇａｎ，Ｂ、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ、(Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）ニューヨーク、１９８６）に記載されている。他のトランスジェニック動物の作出にも似たような方法を用いる。初代トランスジェニック動物については、そのゲノム中のトランスジーンおよび／または動物の組織または細胞でのトランスジーンｍＲＮＡの発現といった、本発明の核酸分子の存在に基づいて同定可能である。次いで、この初代トランスジェニック動物を用いて、トランスジーンを持つ別の動物を繁殖させることができる。さらに、本発明のポリペプチドをコードするトランスジーンを持つトランスジェニック動物を、他のトランスジーンを持つ他のトランスジェニック動物と交配することもできる。
以下、実例をあげて本発明をさらに説明するが、これらの実例は本発明をさらに限定するものと解釈すべきものではない。
実施例１ Ｓ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ Ｇａｓ１ ＧＰＩ修飾シグナル配列に融合させたネズミＧＭ−ＣＳＦのクローニング
酵母発現ベクター作成の開始点にはｐＵＣ１９−ＧＭ−ＣＳＦ−哺乳類ＧＰＩシグナル配列プラスミド（ｐＵＣ１９−ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩ）を用いた。このプラスミドは、ヒトＴｈｙ−１ ＧＰＩ修飾シグナル配列（下流）にインフレームで融合させたネズミＧＭ−ＣＳＦ（上流）をコードする。以下の２種類のオリゴヌクレオチドを、Ｍｉｄｌａｎｄ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（テキサス州ミッドランド（Ｍｉｄｌａｎｄ））から購入した。
ＧＴＸ−５
Figure 0004892705
ＧＴＸ−５は、
ａ．ＥｃｏＲＩ部位へのライゲートに適した５’末端の配列（塩基１〜５）と、
ｂ．インフレームのキメラコード配列を作り出すためのＮｇｏＭｌ部位（塩基９〜１４）と、
ｃ．ヒトＴｈｙ−１（ＧｅｎＢａｎｋ受託Ｎｏ．Ｍ１１７４９）のＧＰＩ修飾配列のコード配列（塩基１５〜１３７）
ｄ．終止コドン（塩基１３８〜１４０）と、
ｅ．ＫｐｎＩ部位にライゲートするための３’末端の配列（塩基１４４〜１４８）と、
を含む。
ＧＴＸ−６
Figure 0004892705
このオリゴヌクレオチドは、ねじれた（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）両末端以外はＧＴＸ−５と相補的である。
ＧＴＸ−５およびＧＴＸ−６を、最終濃度が１マイクログラム／λになるように別々のチューブで滅菌水に溶解させた。ＧＴＸ−５およびＧＴＸ−６を最終濃度１００ｎｇ／λで混合し、室温にて６０分間アニールさせた。
続いて、ＧＴＸ−５：ＧＴＸ−６二本鎖オリゴヌクレオチドをプラスミドｐＵＣ１９にクローニングした。４マイクログラムのｐＵＣ１９ＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化した。電気泳動後、Ｑｉａｇｅｎ（カリフォルニア州サンタクラリタ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｉｔａ））ゲル精製キットを製造業者からの指示どおりに使用して、０．７％アガロースゲルから線状ＤＮＡを精製した。１００ｎｇのＧＴＸ−５：ＧＴＸ−６オリゴヌクレオチドを、室温にて６０分間、最終容量２０マイクロリットルで、２００ｎｇのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ消化ｐＵＣ１９にライゲートした。
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから購入したコンピテントＡＧ−１細胞に上記のプラスミドを形質転換した。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉをＬＢ−ａｍｐプレートに接種した。アンピシリン（１００マイクログラム／ｍｌ）を含有するＬＢプレートで増殖している細菌コロニーを拾い、１ｍｌのａｍｐ含有ＬＢに接種し、３７°で一晩振盪しながら増殖させた。
標準的なアルカリ溶解ミニプレッププロトコールを用いてプラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩでＤＮＡを消化した。臭化エチジウムで染色した１．６％アガロースゲル上でＤＮＡを電気泳動することで、およそ１４８ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片を含むコロニーを同定した。陽性コロニーを１００ｍｌのアンピシリン含有ＬＢに接種し、一晩増殖させた。Ｑｉａｇｅｎから購入したキットで、もう一度プラスミドＤＮＡを精製した。
Ｔｈｙ−ＧＰＩ陽性クローンのヌクレオチド配列（ｐＵＣ−ＧＰＩ ２１と呼ぶ）をシーケンシングし、その同一性を確認した。
ＧＭ−ＣＳＦコード配列を、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したマウス肺ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲで増幅した。ＰＣＲについては、ｐｆｕポリメラーゼと以下のプライマーとを用いて３５サイクル行った。
上流
Figure 0004892705
下流
Figure 0004892705
ＰＣＲパラメータは、変性を９０°で１分間、アニーリングを６０°で１分間、伸長を７２°で１分間とした。
このＧＭ−ＣＳＦ鎖ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後に精製した。ＤＮＡバンドを切り出し、Ｑｉａｇｅｎから購入したキットを用いてＤＮＡ断片を精製した。
続いて、精製ＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭＩで消化した。消化後、反応混合物をフェノール：クロロホルム（１：１）で抽出し、さらにクロロホルムで抽出した。水性相を０．３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．２に調整し、２容量のエタノールを用いて−８０°にて２時間かけてＤＮＡを沈殿させた。このＤＮＡを遠心によりペレット化し、エタノールを除去し、ペレットを７０％エタノールですすいだ。このペレットを真空下にて乾燥させた。
ＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡを滅菌水に再懸濁させ、ＥｃｏＲＩ−ＮｇｏＭＩで消化しておいたｐＵＣ１９−ＧＰＩ ２１にライゲートした。ライゲーションは室温で１時間行った。ＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡにライゲートしたＰＵＣ１９ ＧＰＩ ２１を使用して、コンピテントＡＧ−１細胞を形質転換した。形質転換ＡＧ−１細胞を、アンピシリン含有ＬＢプレート上で選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、上記のようにして分析した。制限消化を行い、ｐＵＣ １９ ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦキメラコンストラクトを確認した。いくつかの陽性クローンから得られたＤＮＡを単離し、シーケンシングした。
このプラスミドをＮｇｏＭＩＶおよびＫｐｎＩで消化し、得られた断片のうち大きいものを１％アガロースゲルでの電気泳動後に単離した。
酵母タンパク質Ｇａｓ１由来の２８０ｂｐのＧＰＩ修飾シグナル配列を酵母コスミドクローンＣ９９５２（ＡＴＣＣ）からＰＣＲ増幅した。このＰＣＲには、ｐｆｕポリメラーゼと以下のプライマーを用いた。
上流プライマー
Figure 0004892705
下流プライマー
Figure 0004892705
これらのプライマーは、Ｇａｓ１断片に５’ＮｇｏＭＩＶ部位と３’ＫｐｎＩ部位とを付加する。
ＰＣＲ条件については次のとおりとした。
変性 ９０°で１分間
アニーリング ６０°で１分間
伸長 ７２°で１分間
サイクル ２５
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後に精製し、ＮｇｏＭＩＶおよびＫｐｎＩで消化した。続いて、Ｔｈｙ−１配列の代わりにＧａｓ１シグナル配列がインフレームでＧＭ−ＣＳＦ配列の下流に融合するように、Ｇａｓ１ ＧＰＩシグナル配列を上記にて調製したｐＵＣ１９−ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩプラスミドにライゲートした。このベクターをｐＵＣ１９−ＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１．１とする。得られたプラスミドをＡＧ−１コンピテントＥ．ｃｏｌｉ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、アルカリ溶解ミニプレップでプラスミドクローンを単離した。次に、プラスミドを制限消化によるインサートについてスクリーニングした。陽性クローンから得たＤＮＡをシーケンシングし、ＧＡＳ１コード領域の同一性を確認した。
次に、Ｋ．Ｄａｎｅ Ｗｉｔｔｒｕｐ博士（イリノイ大学）から快く提供を受けたｐＩＴＹ−４ベクターを利用して、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの酵母発現プラスミドを生成した。このプラスミドは酵母ゲノムに安定して組み込まれ、異種遺伝子の高レベルな発現を可能にする。ｐＩＴＹ−４の特徴は次のとおりである。相同的組換えによる多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅ）組み込みイベントを可能にするδ配列（ＴｙエレメントのＬＴＲ）；Ｅ．ｃｏｌｉでの選択ならびに酵母での調節可能な選択用のｎｅｏ／カナマイシン耐性遺伝子；高レベルな誘導転写用のＧａｌ１プロモータ；ユニークなＥａｇＩクローニング部位；発現遺伝子の効率的な分泌に合わせて最適化した合成Ｐｒｅ−Ｐｒｏ配列；α因子終止配列；Ｅ．ｃｏｌｉでの伝播用の複製起点。この系では、デキストロース含有培地で酵母を３日間増殖させた後、ガラクトース含有培地に切り替え、Ｇａｌ１プロモータの下流に挿入した遺伝子の転写を誘導する。
ｐｆｕポリメラーゼと以下のプライマーとを用いて、上述したＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１インサートをｐＵＣ１９−ＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１．１からＰＣＲ増幅した。
上流
Figure 0004892705
下流
Figure 0004892705
これらのプライマーは、ｐＩＴＹ−４プラスミドへのクローニング用にＥａｇＩ部位を両末端に付加する。
ＰＣＲ条件については次のとおりとした。
変性 ９０°で１分間
アニーリング ６０°で１分間
伸長 ７２°で１分間
サイクル ２５
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで電気泳動した後に精製し、ＥａｇＩで消化した。ＥａｇＩでフランキングしたＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１断片をＥａｇＩで消化したｐＩＴＹ−４にライゲートし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡＧ１細胞の形質転換に利用した。続いて、Ｅ．ｃｏｌｉをカナマイシン含有ＬＢプレート（１００ｕｇ／ｍｌ）で増殖させた。カナマイシン耐性コロニーから回収したプラスミドをミニプレップで精製し、制限消化によってインサートの存在と正しい配向状態をマッピングした。シーケンシングを実施して陽性クローンの同一性を確認した。このプラスミドをｐＩＴＹ−ＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１．１とする。
実施例２ 酵母におけるＧａｓ１ ＧＰＩ修飾シグナル配列に融合させたネズミＧＭ−ＣＳＦの発現
ｐＩＴＹ−ＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１．１を含むＥ．ｃｏｌｉクローンの培養５０ｍｌを、カナマイシン１００ｕｇ／ｍｌとキアゲンから入手したＭｉｄｉ−Ｐｒｅｐキットを用いて精製したプラスミドとを含有するＬＢで増殖させた。次に、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）プロトコールを用いてＳ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅ株ＢＪ５４６４（ＡＴＣＣ）をｐＩＴＹ−ＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１．１で形質転換した。ＢＪ５４６４をＹＰＤ（１リットルあたり：バクトトリプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、デキストロース２０ｇ）に加えた一晩培養液１０ｍｌを用いて１００ｍｌのフラスコに接種した。酵母を３０°で３時間増殖させた後、１２，０００×ｇで２分間、室温での遠心で回収した。細胞を滅菌水で洗浄し、再度遠心した。これらの細胞を１００ｍＭのＬｉＡｃ１．０ｍｌに再懸濁させ、１．５ｍｌ容の微量遠心管に移し、エッペンドルフ微量遠心機で最高速にて１５秒間遠心した。続いて、細胞を１００ｍＭのＬｉＡｃ０．５ｍｌに再懸濁させ、検体５０ｕＬを個々の管に一定分量ずつ分けた。続いて、細胞をペレット化した。ＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ）２４０ｕＬと、１．０ＭのＬｉＡｃ３６ｕＬと、沸騰させたキャリアＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡ、Ｓｉｇｍａ）５ｕＬ（１０ｍｇ／ｍｌ）と、水７５ｕＬに入れたプラスミド２ｕｇとを、この順番に加えた。プラスミドを加えた後、管をボルテックスし、３０°で３０分間インキュベートし、４２°で１５分間ヒートショックした。次に、細胞をペレット化し、滅菌水に再懸濁させ、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＹＰＤプレートに蒔いた。
Ｇ４１８耐性酵母の個々のコロニーを拾い、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＹＰＤ １ｍｌ中で３日間で増殖させた。続いて細胞を微量遠心機で遠心してペレット化し、ＹＰＤ（デキストロース含有、無ガラクトース）培地を１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含有するＹＰＧ（１リットルあたり、バクトトリプトン２０ｇ、酵母エキス１０ｇ、ガラクトース２０ｇ）と交換した。酵母をＹＰＧで３日間増殖させ、Ｇａｌ１プロモータからの転写を十分に誘導した。誘導後、細胞をペレット化し、ＴＮ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭ トリスｐＨ７．４）で洗浄し、２０ｍＭオクチルグルコピラノシド（ＯＧＰ）含有ＴＮ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、各１ｕｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンに溶解させた。酸で洗浄したガラスビーズ（４２５〜６００ミクロン、Ｓｉｇｍａ）を用いてボルテックスにかけ、酵母を溶解させた。不溶性物質をペレット化し、ネズミＧＭ−ＣＳＦ ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用いて上清をアッセイした。高レベルのＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦを発現しているコロニーを同定した。可溶性ＧＭＣＳＦの標準曲線に基づいて、本願発明者らは発現をおよそ２５ｕｇ／Ｌであろうと推測した。これは、哺乳類での発現と比べて有意に向上しており、ｉｎ ｖｉｖｏの実験では十分であった。この酵母クローンをＳＣ−ＧＭ−ＧＰＩとする。
酵母での発現用に安定して組み込まれたベクターの利点のひとつに、初回のクローニングとコロニー単離を終えると、抗生物質の維持が必要ないことがあげられる。これを確認するために、Ｇ４１８を用いる場合と用いない場合で細胞を増殖させ、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの発現について試験した。本願発明者らは、８ヶ月を超えてもＧ４１８の非存在下で発現レベルの減少を見出さなかった。
ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの機能的キャラクタリゼーションに適した規模でＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦを産生するために、ＹＰＤ ５００ｍｌにＳＣ−ＧＭ−ＧＰＩを接種し、振盪しながら３０°で３日間増殖した。１２，０００×ｇで室温にて２分間の遠心により細胞をペレット化し、同容量のＹＰＧに移してさらに３日間増殖させた。続いて細胞をペレット化し、ＴＮで洗浄し、２０ｍＭ ＯＧＰと、１ｍＭ ＰＭＳＦと、各１ｕｇ／ｍｌのアプロチニン、ロイペプチンおよびペプスタチンとを含有するＴＮ ２５ｍｌに溶解させた。続いて、酸洗浄したガラスビーズ、２０ｇ／５００ｍｌの培養（４２５〜６００ミクロン、Ｓｉｇｍａ）を用いてボルテックスすることで、細胞を溶解させた。不溶性物質を８，０００×ｇで室温にて１０分間かけてペレット化し、可溶性物質を、臭化シアノジェン活性化セファロース４Ｂ（Ｓｉｇｍａ）に連結した抗ネズミＧＭＣＳＦモノクローナル抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ）のイムノアフィニティカラムに適用した。製造業者の指示に従ってモノクローナルをセファロースに結合させた。結合効率をＯＤ２８０で監視し、ネズミＧＭ−ＣＳＦの固定化抗体への結合を市販の組換えサイトカインで確認した。
可溶性酵母由来の物質をカラムに通し、重力によって流した。（ａ）２０容量のＴＮに１％トリトンＸ−１００；（ｂ）５容量の５０ｍＭトリスｐＨ８．０、１ｍＭ ＯＧＰ；（ｃ）２０容量のＴＮに１ｍＭ ＯＧＰを用いて、カラムを連続洗浄した。次に、結合した物質を１０容量の０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスｐＨ２．５に１ｍＭ ＯＧＰを加えたもので溶出した。溶出された物質を１／２００容量の１．５ＭトリスｐＨ８．８で中和した。Ｍｉｃｒｏｓｅｐ ３Ｋ遠心装置（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて精製物質を濃縮した。ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの収率をＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）で求めたところ、培養２５ｕｇ／Ｌであった。０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスｐＨ７．４を１ｍＭ ＯＧＰと一緒に添加することで、最終濃度を４０ｕｇ／ｍｌに調節した。
染色ゲルおよびウェスタンブロットによって、精製ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦを分析した。精製ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦまたは組換え可溶性ネズミＧＭ−ＣＳＦを１レーンあたりおよそ１ｕｇ電気泳動させた。続いてＳｉｇｍａ銀染色キットを製造業者の指示（Ｓｉｇｍａ）どおりに用いて用いてゲルを硝酸銀で染色した。ウェスタンブロットを行うために、オールサイエンティフィック（Ｏｗｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）エレクトリックトランスブロッタを用いてＰｒｏｔｒａｎ ＢＡ８３（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にゲルを移し、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０および２％無脂肪ドライミルクを含有するＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）で室温にて一晩ブロックした。続いて、ブロッキング緩衝液で１：５０００希釈した一次抗体（ラットモノクローナル抗ネズミＧＭＣＳＦ、Ｅｎｄｏｇｅｎ）と一緒に室温にて２時間、ブロットをインキュベートした。このブロットをＴＢＳ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄し、１：１０，０００の二次抗体であるアルカリホスファターゼコンジュゲートヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）と一緒に室温にて１時間インキュベートした。洗浄後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。組換え可溶性ＧＭ−ＣＳＦ標準試料とほぼ同じ速度で移動している単一の主バンドが、ゲルとブロットの両方（タンパク質部分の分子量がおよそ１４，０００であるのに対し、ＧＰＩ部分の分子量はおよそ１５００しかない］にはっきりと存在していた。抗ＧＭ−ＣＳＦでの免疫反応性ならびにこの物質の腫瘍細胞膜への結合能からみて、これらのバンドはＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦを表しているのではないかと思われる。凝集体をなしていることもあり得る高分子量の物質がいくつかブロットの中に確認できたが、この物質は感度の低い銀染色では目に見えなかったことから、これは主バンドよりも少ない量で存在していることになる。
実施例３ Ｇａｓ１ ＧＰＩ修飾シグナル配列に融合したネズミＧＭ−ＣＳＦの細胞への付着
ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ中で増殖させた野生型ＣＭＳ−５ネズミ線維肉腫細胞を収集し、ＲＰＭＩ １６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２回洗浄し、細胞５×１０５個／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させた。細胞懸濁液のアリコート０．９ｍｌをシリコン処理済みのエッペンドルフ微量遠心管に分注した。各アリコートに、実施例２で説明したようにして調製した精製ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ １ｕｇまたは可溶性組換えネズミＧＭ−ＣＳＦ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ、凍結乾燥粉末として提供されたものを、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦと同じ緩衝液中にて４０ｕｇ／ｍｌで再構成）１ｕｇあるいは培地のみのいずれかを添加した。次いで振盪しながら３７℃で３時間細胞をインキュベートした後、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで３回洗浄した。
フローサイトメトリでＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦを検出するために、ラット抗ネズミＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ）と一緒に細胞を４℃で１時間インキュベートした。続いて、これらの細胞を２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで３回洗浄し、ＦＩＴＣ−標識ヤギ抗ラットＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）と一緒に４℃で１時間インキュベートし、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで再度３回洗浄した。これらの細胞をＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製のＦａｃｓｃａｌｉｂｕｒでフローサイトメトリ分析した。ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦで覆膜することで、培地のみを用いてインキュベートした細胞と比較してピークと平均のＦＬ−１蛍光がおよそ１０倍増加した。これとは対照的に、可溶性ＧＭ−ＣＳＦを用いてインキュベートした細胞は、陰性対照細胞と事実上同じプロファイルであった。このデータから、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦは腫瘍細胞に結合できるが可溶性組換えＧＭ−ＣＳＦは結合できないことが分かる。
ＣＭＳ−５細胞に付着したＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦを検出し、ＥＬＩＳＡでも定量した。ＣＭＳ−５細胞を収集し、上述したようにして洗浄した。ＲＰＭＩ １６４０ １ｍｌあたり細胞１×１０６個を精製ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ １ｕｇと一緒にインキュベートした。３７℃で２時間のインキュベーション後、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を３回洗浄した。０．１５％デオキシコール酸塩と洗浄剤を含有するＰＢＳ ５０マイクロリットルで細胞ペレットを溶解させ、続いてＰＢＳ ２００マイクロリットルを加えて希釈した。この物質をＰＢＳで倍々希釈し、ＥＬＩＳＡキット（Ｅｎｄｏｇｅｎ）を用いて、製造業者から得た可溶性組換えＧＭ−ＣＳＦ標準試料を基準に、ＧＭ−ＣＳＦの量を求めた。このデータによれば、５回の実験で細胞１個あたりで取り込まれたＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ分子の平均数は３７，０００＋／−３３，０００であった。標準偏差が大きいのは、分子数／細胞が６６，０００の実験が１回あったことによる。この実験を除外すると、平均は２９，５００＋／−４，５００であった。
ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦによるＢ１６ネズミ黒色腫細胞の「覆膜」についてもＥＬＩＳＡで定量した。覆膜とＥＬＩＳＡはＣＭＳ−５細胞で説明したものと全く同じようにして実施した。３回の実験での分子／細胞の平均数は２１，０００＋／−１１，５００であった。
実施例４ Ｇａｓ１ ＧＰＩ修飾シグナル配列に融合したネズミＧＭ−ＣＳＦの細胞上での安定性
取り込まれたＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの細胞上での安定性について検討するために、ＣＭＳ−５細胞を収集し、実施例３で上述したようにして覆膜した。覆膜後、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を３回洗浄した後、細胞４×１０６個／ｍｌでＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させた。これらの細胞に１３７Ｃｓ源から３５００ｒａｄの光線を照射した。続いて、細胞を５％ＣＯ２にて３７℃でインキュベートし、アリコートを１時間間隔で取り出し、３回洗浄し、０．１５％デオキシコール酸塩を含むＰＢＳ ５０ｕｌに溶解させた。続いて、ＰＢＳ ２００ｕｌを加えてデオキシコール酸塩を希釈した。細胞会合ＧＭ−ＣＳＦをＥＬＩＳＡで測定した。６時間の時点ですら、細胞では細胞表面ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの損失がわずか約２０％であった。６時間後、光線を照射された細胞（覆膜細胞と非覆膜細胞の両方）の生存度を、トリパンブルー染色を用いて顕微鏡検査で測定したところ、非常に危険な状態にあった。しかしながら、ｉｎ ｖｉｖｏでのデータ（下記参照）では、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの細胞表面保持と光線照射後の細胞の生存度はいずれも生物学的効果を持続できるだけの十分なものであることが示されている。
実施例５ Ｇａｓ１ ＧＰＩ修飾シグナル配列に融合したネズミＧＭ−ＣＳＦの細胞に対する生物活性
分子がネズミ骨髄由来かつＧＭ−ＣＳＦ依存性細胞系であるＦＤＣ−Ｐ１細胞系の増殖をサポートする機能を求めることで、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの生物活性をアッセイした。Ｂｉｏｔｒａｋ細胞増殖ＥＬＩＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）すなわち、チミジンのアナログである５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いるアッセイで、ＦＤＣ細胞の増殖を測定した。ＦＤＣ−Ｐ１細胞の条件培地源としてのＩｓｃｏｖｅ ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンで、ＷＥＨＩ細胞（ＡＴＣＣ）を増殖させた。２５％ＷＥＨＩ条件培地を含むＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン中でＦＤＣ−Ｐ１細胞を増殖させ、収集し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンで３回洗浄した。これらの細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシンに１×１０５／ｍｌで再懸濁させ、９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェルに１００ｕＬを一定分量ずつ分けた。トリプリケートで設定した群は以下のとおりである。
Ａ．培地−細胞なし
Ｂ．ＦＤＣ−ＰＩ細胞−未刺激
Ｃ．ＦＤＣ−Ｐ１細胞＋可溶性ＧＭ−ＣＳＦ １０ｎｇ
Ｄ．ＦＤＣ−ＰＩ細胞＋ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ標準を基準にしたＥＬＩＳＡで判断）としてのＧＭ−ＣＳＦ １０ｎｇ
Ｅ．ＦＤＣ−ＰＩ細胞＋クロロホルム：メタノール（３：１）でのタンパク質抽出とこれに続くアセトン沈殿および再懸濁によりにより変性させたＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ（「Ｄ」同様）１０ｎｇ。
すべてのタンパク質溶液を、１ｍＭ ＯＧＰを含む０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスｐＨ７．４で１００ｎｇ／ｍｌに希釈し、各ウェルに加える容量が１００ｕＬになるようにした。
非アイソトピック増殖アッセイを製造業者の指示に従って実施した。蒔いた細胞を５％ＣＯ２にて３７℃で２日間増殖させた。３日目、個々のウェルにＢｒｄＵ溶液１０ｕｌを加え、細胞をさらに３時間インキュベートした。続いて、プレートを３００×ｇで１０分間遠心し、上清を取り除いた。このプレートを６０℃で１時間インキュベートして乾燥させた。続いて、製造業者の指示に従ってプレートを固定およびブロックした。次に、固定細胞をペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵと一緒に９０分間インキュベートした。続いて、ウェルを洗浄し、製造業者の指示に従ってＴＭＢで発色させた。２回の実験で、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦでは増殖が一貫して可溶性組換えＧＭ−ＣＳＦの場合よりも若干（約２５％）高いレベルに保たれたことから、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦが超生物活性であることが分かった。変性ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦは増殖をサポートしなかったため、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの作用はＧＰＩ部分だけによるものでなかった。ＧＭ−ＣＳＦでの線形エピトープを認識する、ＥＬＩＳＡの結果によれば、タンパク質は依然として細胞を覆膜でき、ＧＰＩ部分は変性後もタンパク質に連結されたままであった。
実施例６ ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦに混合された細胞での効果的な免疫化
これらの実験には、以下の細胞をワクチン接種したマウスを用いた。
（ａ）野生型細胞（ＷＴ）
（ｂ）可溶性ＧＭ−ＣＳＦと一緒にインキュベートした細胞−未洗浄（全ＧＭ−ＣＳＦ用量：１マイクログラム）
（ｃ）ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ−非結合ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦで覆膜された細胞 インキュベーション後に洗い流し（全ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ用量：ＥＬＩＳＡで０．７４ナノグラム［２回の実験の平均；個々には７３および７５ｎｇ）
（ｄ）ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦで覆膜された細胞−未洗浄（全ＧＭ−ＣＳＦ用量：１マイクログラム）
ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの質量と濃度の値は、可溶性ＧＭ−ＣＳＦ標準を基準にＥＬＩＳＡで求めたＧＭ−ＣＳＦに換算して表される。
ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン中、ＣＭＳ−５細胞を７０％集密するまで増殖させ、収集し、トリプシン化し、ＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄した。アリコートをトリパンブルー染色して生存度を求めた後、細胞４×１０６個／ｍｌの濃度で細胞を再懸濁させ、アリコート１ｕｌをシリコン処理済みの微量遠心管に分注した。細胞１０６個あたりＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ １ｕｇまたは可溶性組換えネズミＧＭ−ＣＳＦ １ｕｇと一緒に細胞を３７℃で３時間インキュベートした。次に、ＰＢＳ、２％ＦＢＳで「洗浄」群を３回洗浄し、細胞４×１０６個／ｍｌでＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させた。洗浄ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ覆膜細胞のアリコートを取り出し、細胞会合ＧＭ−ＣＳＦの量を上述したようにしてＥＬＩＳＡで測定した。２回の実験で、洗浄覆膜群にはそれぞれ、およそ３１，０００個および３２，０００個のＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ分子／細胞が含まれていた。
これらの細胞に１３７Ｃｓ源から３５００ｒａｄの光線を照射した。８〜１０週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（ＣＭＳ−５と同系）をメトファン吸入により麻酔し、０．２５ｍｌ中細胞１×１０６個を皮下注射で左鼡径襞にワクチン接種した。７日後、７０％集密した野生型ＣＭＳ−５細胞を収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄した。アリコートをトリパンブルー染色して生存度を求め、細胞をＨＢＳＳ中で４×１０６／ｍｌに調節した。続いて、先にワクチン接種したマウスの首の後ろに、メトファン麻酔下で、０．５ｍｌ ＨＢＳＳ中２×１０６個の生きた野生型ＣＭＳ−５細胞を皮下注射した。
腫瘍の発達を触診と目視検査で毎日評価した。腫瘍塊が触診可能かつ目視可能になった最初の日を「発生」と定義する。偏見を確実になくすために、観察者には各組のマウスに接種したワクチンについて何も知らせなかった。腫瘍が見苦しくなった時点で、マウスをＣＯ２で窒息させて屠殺した。事前に計画していたとおり、腫瘍攻撃から７０日後に実験を終えた。
ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦの未洗浄群、可溶性ＧＭ−ＣＳＦ群、野生型ワクチン群について３回の実験で得られたデータをプールする。これらの群についてのデータには、リンパ球サブセット欠乏実験での非欠乏対照から得たデータが含まれる。ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ洗浄群は最初の欠乏実験に含めなかったため、この群でのデータは２回の実験からプールする。欠乏実験ではマウス４匹／群、他の実験では５匹／群とした。マウスの総数は、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ未洗浄群でｎ＝１４、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ洗浄群で１０、可溶性ＧＭ−ＣＳＦ未洗浄群で１４、ＷＴでは１４とした。攻撃の７０日後まで腫瘍なしで生存したマウスのおおよその比率は、ＷＴ１５％、可溶性ＧＭ−ＣＳＦ５０％、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ洗浄群６０％、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ未洗浄群８５％であった。よって、未洗浄の可溶性群と比較してＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ洗浄ワクチンにＧＭ−ＣＳＦが１０００分の１未満しか含まれていなくても、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦで覆膜された細胞を投与すると効果が高くなった。さらに、ＧＰＩ−ＧＭ−ＣＳＦ未洗浄ワクチンでは、いくつかの分子が細胞に付着しなかったが、それでも効果は高くなった。
実施例７ Ｇａｓ１ ＧＰＩ修飾シグナル配列に融合したヒトＧＭ−ＣＳＦのクローニングと発現
Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてヒトＧＭ−ＣＳＦをヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ増幅する。以下のプライマーを用いる。
上流
Figure 0004892705
下流
Figure 0004892705
上流プライマーは、成熟ヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質に見られる最初のアミノ酸の直前に、ＥｃｏＲ１およびＥａｇ１制限部位を持つ。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの発現には酵母リーダー配列を利用するため、ヒトＧＭ−ＣＳＦのクローニングは成熟タンパク質のＮ末端で開始される。下流プライマーはそれぞれ、もともとの停止コドンを飛ばし、Ｇａｓ１ ＧＰＩ修飾シグナルをコードする配列へのインフレームでのライゲーションを可能にする。下流プライマーは、他のコンストラクトに用いられる制限部位と一致するＮｇｏＭ ＩＶ制限部位を持つ。
ＰＣＲパラメータは、変性を９７℃で１分間、
アニーリングを５６℃で１分間、
伸長を７２℃で２分間とする。
ＰＣＲを最小サイクル数で実施してアガロースゲル電気泳動の可視バンドを得る。増幅後、反応混合物を４°で１０分間冷ます。
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルでの電気泳動によって単離し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して励起したアガロースバンドから溶出させる。精製ｈＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲ１およびＮｇｏＭ ＩＶで消化し、ＥｃｏＲ１およびＮｇｏＭ ＩＶで消化しておいた（ネズミ）ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−ＧＰＩプラスミドにライゲートする。これによって、ネズミＧＭ−ＣＳＦがそのヒトカウンターパートと置き換わる。続いて、ｐＵＣ１９−ｈＧＭ−ＣＳＦ ＧＰＩプラスミドをコンピテントＡＧ−１ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、ｍｉｎｉ−培養用に３０のコロニーを拾い、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してプラスミドクローンを単離して精製する。制限酵素試験消化とアガロースゲル電気泳動によって、陽性クローンを同定する。陽性Ｅ．ｃｏｌｉコロニーをｍａｘｉ−培養中にて一晩増殖させ、そのプラスミドをキアゲンｍａｘｉ−プレップキットで精製する。インサートをシーケンシングする。
ＧＭ−ＣＳＦ ＧＡＳ１ｇをｐＩＴＹ−４発現ベクターにクローニングするために、ｐＵＣ１９ベクター由来のこのコンストラクトのＰＣＲを実施する。プライマーは以下のとおりである。
Figure 0004892705
Figure 0004892705
上流プライマーは、成熟ＧＭ−ＣＳＦの最初のコドンの直前にＥａｇＩ部位を持つ。これにより、哺乳類分泌シグナルが除去され、酵母シグナル配列へのインフレームでのライゲーションが可能になる。このとき、マウスコンストラクトと同じ制限部位を用いることが可能である。それはヒト配列には存在しないためである。下流プライマーは３’末端にＥａｇＩ部位を付加する。Ｐｆｕポリメラーゼを用いて２５サイクルのＰＣＲを実施する。ＰＣＲ条件は以下のとおりである。変性を９０°で１分間、アニーリングを６０°で１分間、伸長を７２°で１分間。増幅後、反応混合物を４°で１０分間冷ます。
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルでの電気泳動によって単離し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用して励起したアガロースバンドから溶出させる。精製ＧＭ−ＣＳＦ ＧＡＳ１ｇＤＮＡ断片をＥａｇＩで消化し、ｐＩＴＹ−４にライゲートし、ＡＧ−１化学的コンピテント細菌（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換する。ｍｉｎｉ−培養用に３０のコロニーを拾い、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を利用してプラスミドクローンを単離して精製する。制限酵素試験消化とアガロースゲル電気泳動によって、陽性クローンを同定する。陽性Ｅ．ｃｏｌｉコロニーをｍａｘｉ−培養中にて一晩増殖させ、そのプラスミドをＱｉａｇｅｎ ｍａｘｉ−プレップキットで精製する。インサートをシーケンシングする。
実施例２でネズミの分子について説明したようにして、ＧＰＩ−ヒトＧＭ−ＣＳＦ分子をＳ．ｃｅｒｅｖｅｓｉａｅで発現させる。抗ネズミＧＭ−ＣＳＦ抗体の代わりに抗ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗体を用いて、実施例２で説明したようにしてイムノアフィニティ精製を実施する。単離されたものであるか抗原保有標的に結合したものであるかを問わず、分子を検出および定量するためのＥＬＩＳＡを、この分子で覆膜された細胞のフローサイトメトリの場合のように抗ヒトＧＭ−ＣＳＦモノクローナル抗体を用いて実施する。
実施例８ ＧＭ−ＣＳＦ／インフルエンザ赤血球凝集素キメラタンパク質のクローニング
ｐＵＣ１９ ＧＭＣＳＦ−Ｋ−ＧＡＳ１．１
本願発明者らが自らの実験室で生成したｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−Ｇａｓ１．１から開始して、ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡをクローニングした。このプラスミドは、酵母ＧＡＳ１タンパク質（イリノイ大学のＤ．Ｗｉｔｔｒｕｐ博士より入手）由来の下流のグリコシルホスファチジルイノシトール修飾配列に融合したネズミＧＭ−ＣＳＦをコードする配列を持つ。ＧＭ−ＣＳＦポーションとＧＡＳ１ポーションの間にはリンカー配列が介在する。このリンカー配列を挿入するには、同じく本願発明者らの実験室で過去に生成したプラスミドｐＵＣ１９ ＧＭＣＳＦ−Ｇａｓ１．１を、ＮｇｏＭ ＩＶおよびＮｈｅＩで消化した。これらの制限酵素はそれぞれ、ＧＭ−ＣＳＦ分子の３’末端およびＧａｓ１．１配列の５’末端を切断する。このようにして得られるプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ製のキットを使用してのアガロースゲルでの電気泳動後に精製した。以下のオリゴヌクレオチドを購入した。
Figure 0004892705
Figure 0004892705
この合成オリゴヌクレオチドは、以下のものを含む。
１．ＮｇｏＭ ＩＶ消化プラスミドＤＮＡにアニールする５’オーバーハング
２．Ｎｈｅ Ｉ消化プラスミドＤＮＡにアニールする３’オーバーハング
３．ペプチド ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１８）をコードするＤＮＡ配列。Ｇはグリシンを示し、Ｓはセリンを示す。このアミノ酸１０個からなる配列（Ｇ４Ｓ）２はＧＭＣＳＦ部分とＧａｓ１．１部分との間のタンパク質にねじれ（ｋｉｎｋ）／スペーサを挿入するために設計されている。
４．小断片のクローニングの確認ならびに以後の操作を可能にするＳｐｅＩ部位。
これらの２つのオリゴヌクレオチドを等モル濃度で混合し、２分間煮沸し、室温にてアニールさせた。このオリゴヌクレオチドをＮｇｏＭ ＩＶ−Ｎｈｅ Ｉ消化プラスミドにライゲートし、このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＡＧ−１を形質転換した。形質転換体を１００ｕｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢプレートで選択した。プラスミドＤＮＡを単離し、Ｓｐｅ Ｉで消化し、アガロースゲルで電気泳動させて（Ｇ４Ｓ）２配列の存在を確認した。
ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−赤血球凝集素（ＨＡ）
（アミノ末端からカルボキシ末端へ）（１）ネズミＧＭ−ＣＳＦと、（２）上述した（Ｇ４Ｓ）２リンカーと、（３）単離したＡ／ＰＲ／８／３４インフルエンザＡ由来のＨ１ ＨＡのＨＡ１ドメインとを含むキメラタンパク質をコードする、プラスミドｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡを生成した。使用したＨＡ１配列（ＨＡ前駆体のアミノ酸１８から３４４）にはＮ末端リーダー配列と下流ＨＡ２ドメインがない。アミノ酸３４４の後ろに終止コドンを加えた。
ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−Ｇａｓ１．１．をＮｈｅ ＩおよびＫｐｎ Ｉで消化した。Ｎｈｅ ＩはＧａｓ１．１コード配列の５’末端を切断し、Ｋｐｎ ＩはＧａｓ１．１コード配列の３’末端を切断する。このようにして得られる、ＧＰＩコード領域が除去されたプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ製のキットを使用してのアガロースゲルでの電気泳動後に精製した。ＨＡ１コード配列を、インフルエンザのＡ／ＰＲ／８／３４株のＨＡ遺伝子をコードするプラスミドからのＰＣＲによってクローニングした。使用したＨＡ１配列は、成熟タンパク質の開始点であるアミノ酸１８から始まっており、分泌シグナル配列がない。膜貫通領域がなく、終止コドンを置き換えて、３’末端はアミノ酸３４４に相当する。ＨＡ１配列のＰＣＲのプライマーは以下のとおりとした。
上流ＨＡ１プライマー
Figure 0004892705
下流ＨＡ１プライマー
Figure 0004892705
ＰＣＲ条件については次のとおりとした。
変性を９０°で１分間
アニーリングを６０°で１分間
伸長を７２°で１分間
ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを２０サイクル実施した。
ＰＣＲの実施後、産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動させ、Ｑｉａｇｅｎキットを製造業者の指示どおりに用いて、ＨＡ１ ｃＤＮＡをゲルから抽出した。精製ＨＡ１ ＤＮＡ断片をＮｈｅ ＩおよびＫｐｎ Ｉで消化した。融合タンパク質を生成するために、精製Ｎｈｅ Ｉ−Ｋｐｎ Ｉ ＨＡ断片を、Ｎｈｅ ＩおよびＫｐｎ Ｉで消化しておいたｐＵＣ １９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−Ｇａｓ１．１ベクターにライゲートし、Ｇａｓ１．１コード領域を除去した。このＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＡＧ１を形質転換し、形質転換体をＬＢ−アンピシリンプレートで選択した。個々のコロニーから得たプラスミドＤＮＡを単離し、制限酵素で消化した。制限消化によってｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡプラスミドが同定された。
Ｑｉａｇｅｎから購入したキットを用いて、ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡプラスミドを製造業者の指示どおりに精製した。
実施例９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡの酵母発現ベクターへのクローニング
ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡのＰＣＲを利用し、酵母発現ベクターへのクローニング用にＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡをコードするＤＮＡ断片を単離した。このＰＣＲ産物は、酵母発現ベクターへのインフレーム挿入用のＥａｇ Ｉクローニング部位を含む。
上流プライマー
Figure 0004892705
下流プライマー
Figure 0004892705
ＰＣＲ条件については次のとおりとした。
変性を９０°で１分間
アニーリングを６０°で１分間
伸長を７２°で１分間
ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを２０サイクル実施した。
ＰＣＲ後、産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動させ、Ｑｉａｇｅｎキットを製造業者の指示どおりに用いて、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ遺伝子をゲルから抽出した。精製ＤＮＡ断片をＥａｇ Ｉで消化し、Ｅａｇ Ｉで消化しておいた酵母発現ベクターＩＴＫにライゲートした。ＩＴＫベクターは（１）Ｅ．ｃｏｌｉでの複製および（２）相同的組換えによる安定した取り込み後の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの遺伝子発現用に設計されている。このベクターは、
１．Ｅ．ｃｏｌｉでのプラスミドの複製用配列と、
２．ガラクトース含有培地で増殖させた酵母での異種遺伝子発現用の酵母Ｇａｌプロモータと、
３．ＰｒｅＰｒｏ−酵母での遠位遺伝子の分泌およびシグナル配列開裂向けに最適化した合成ＤＮＡ配列と、
４．発現対象となる遺伝子クローニング用のユニークＥａｇ Ｉ部位と、
５．αターミネーター−近位遺伝子の効率的な終止用のＤＮＡ配列と、
６．酵母染色体での内在性δ配列との組換えによるプラスミドの安定した取り込み用のδ配列と、
７．Ｅ．ｃｏｌｉでのカナマイシンを用いた選択ならびに酵母でのＧ４１８を用いた選択用の抗生物質耐性遺伝子と、を含む。
このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＡＧ−１を形質転換した。１００ｕｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートで増殖させることで、形質転換体を選択した。カナマイシン含有ＬＢ培地で個々のコロニーを増殖させ、プラスミドを精製した。制限消化によって、インサートの配向が求められた。このようにして得られたプラスミドＩＴＫ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡを、Ｑｉａｇｅｎから購入したキットを用いて、製造業者の指示どおりに精製した。
実施例１０ 酵母でのＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡの発現
精製プラスミドをＭｆｅ １で直線化し、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）を用いての酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＤＨＹ１３１の形質転換に利用した。ＹＰＤ培地（１リットルあたり／バクトトリプトン２０ｇ、デキストロース２０ｇ、酵母エキス１０ｇ）にて３０°で飽和するまで増殖させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１０ｍｌ培養を利用し、ＹＰＤ １００ｍｌを接種した。培養を振盪しながら３０°で３時間増殖させた。酵母を１１，０００×ｇで２分間の遠心により収集し、滅菌水２５ｍｌに再懸濁させた。この酵母を上記のようにして遠心し、１００ｍＭ酢酸リチウム１．０ｍｌに再懸濁させ１．５ｍｌ容の微量遠心管に移した。酵母を１２，０００×ｇで１５秒間の遠心によりペレット化し、上清を除去した。細胞を１００ｍＭ ＬｉＡｃ ０．５ｍｌに再懸濁させた。細胞懸濁液５０ｕＬを個々の微量遠心管に加え、上記のようにして遠心した。上清を除去した。
酵母ペレットに加えたトランスフォーメーションミックスの構成は次のとおりとした。２４０ｕＬのＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ）；３６ｕＬの１．０Ｍ ＬｉＡｃ；水７５ｕＬ中、５ｕＬの一本鎖ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）および１ｕｇの直線化ＩＴＫ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ。この混合物をボルテックスして細胞ペレットを再懸濁させ、３０°で３０分間インキュベートした。続いて、細胞を４２°で１５分間振盪し、遠心して細胞をペレット化し、ＹＰＤ ０．５ｍｌに再懸濁させた。酵母をＹＰＤ培地で３時間インキュベートし、Ｇ４１８ ２ｍｇ／ｍｌを含むＹＰＤプレートに蒔いた。個々のコロニーが現れるまでプレートを３０°で３日間増殖させた。ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡの発現をスクリーニングするために、ＹＰＤ培地１ｍｌにて３０°で２日間個々のコロニーを増殖させた。細胞を８，０００×ｇで２分間遠心し、ＹＰＤ培地を除去し、ｇａｌプロモータからの誘導用にＹＰＧ培地（１リットルあたり／バクトトリプトン２０ｇ、ガラクトース２０ｇ、酵母エキス１０ｇ）１ｍｌと交換した。酵母をＹＰＧ培地で２日間増殖させた。この時点で、アリコートを取り出し、細胞をペレット化した。Ｅｎｄｏｇｅｎから購入したＥＬＩＳＡキットを利用して、上清のＧＭ−ＣＳＦ発現を試験した。プロトコールについては製造業者に従った。キメラタンパク質ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡを分泌する高発現酵母クローンを同定した。可溶性ＧＭＣＳＦの標準曲線によれば、発現レベルはＧＭ−ＣＳＦ部分およそ２．４ｍｇ／Ｌであった。
実施例１１ ｐＵＣ１９ ＨＡ（赤血球凝集素）−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦの産生
（アミノ末端からカルボキシ末端へ）（１）ＨＡ１ドメインと、（２）Ｋすなわち上述した（Ｇ４Ｓ）２リンカーと、（３）ネズミＧＭ−ＣＳＦとを含むキメラタンパク質をコードする、プラスミドｐＵＣ１９ ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦも生成した。ＨＡ１は成熟タンパク質のアミノ末端であるアミノ酸１８で開始され、リーダー配列がない。３’末端はアミノ酸３４４で終止する。（Ｇ４Ｓ）２は、フレキシブルリンカーを得るために加えておいたものである。ＧＭ−ＣＳＦは、成熟タンパク質の最初のアミノ酸に相当するＧＭ−ＣＳＦタンパク質のアミノ酸１８で開始される。
インフルエンザのＡ／ＰＲ／８／３４株のＨＡ遺伝子をコードするプラスミドからＨＡ１コード配列をＰＣＲして、まずはＨＡ−Ｋ配列をクローニングした。
上流プライマー
Figure 0004892705
下流プライマー
Figure 0004892705
ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドは、
１．成熟ＨＡのアミノ末端の５’ＥｃｏＲＩ部位と、
２．ＨＡ１ドメイン（ＨＡ前駆体のアミノ酸３４４）のカルボキシ末端の（Ｇ４Ｓ）２リンカーと、
３．（Ｇ４Ｓ）２配列末端に対して遠位のＫｐｎ Ｉ部位と、
を有する核酸を生成する。
ＰＣＲ条件については次のとおりとした。
変性を９０°で１分間
アニーリングを６０°で１分間
伸長を７２°で１分間
ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを２０サイクル実施した。
ＰＣＲの実施後、産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動させ、Ｑｉａｇｅｎキットを製造業者の指示どおりに用いて、ＨＡ１−Ｋ ＤＮＡをゲルから抽出した。精製ＨＡ−Ｋ ＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ Ｉで消化し、この断片をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩで消化しておいたｐＵＣ１９にクローニングした。このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＡＧ−１をａｍｐｒに形質転換した。個々のコロニーを拾い、ＬＢ−ａｍｐで増殖させた。プラスミドと正しいインサートとの同一性を制限マッピングにより求めた。このようにして得られたプラスミドをｐＵＣ１９ ＨＡ−Ｋとし、Ｑｉａｇｅｎキットを製造業者の指示どおりに用いて精製した。
ＧＭ−ＣＳＦ断片をＰＣＲによりクローニングした。
上流プライマー
Figure 0004892705
下流プライマー
Figure 0004892705
このＰＣＲプライマーは、
１．ＨＡ−Ｋ分子の（Ｇ４Ｓ）２ポーションからアミノ酸１８の成熟ＧＭ−ＣＳＦ分子の開始までのインフレームでの翻訳を可能にする５’ＫｐｎＩ部位と、
２．ＧＭ−ＣＳＦの３’末端の終止コドンと、
３．３’ＢａｍＨＩ部位と、
を有するＧＭ−ＣＳＦ断片を生成する。
ＰＣＲ条件については次のとおりとした。
変性を９０°で１分間
アニーリングを６０°で１分間
伸長を７２°で１分間
ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを２０サイクル実施した。
ＰＣＲの実施後、産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動させ、Ｑｉａｇｅｎキットを製造業者の指示どおりに用いて、ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をゲルから抽出した。精製断片をＫｐｎ ＩおよびＢａｍＨＩで消化し、この断片をＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩで消化しておいたｐＵＣ１９ ＨＡ−Ｋプラスミドにライゲートした。このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＡＧ−１をａｍｐｒに形質転換した。個々のコロニーを拾い、ＬＢ−ａｍｐで増殖させた。プラスミドと正しいインサートとの同一性を制限マッピングにより求めた。このようにして得られたプラスミドをｐＵＣ１９ ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦとし、キアゲンキットを製造業者の指示どおりに用いて精製した。
実施例１２ ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦの酵母発現ベクターへのクローニング
ｐＵＣ１９ ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦのＰＣＲを利用し、酵母発現ベクターへのクローニング用にＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦをコードするＤＮＡ断片を生成した。このＰＣＲ産物は、酵母発現ベクターへのインフレーム挿入用のＥａｇ Ｉクローニング部位を含む。
上流プライマー
Figure 0004892705
下流プライマー
Figure 0004892705
ＰＣＲ条件については次のとおりとした。
変性を９０°で１分間
アニーリングを６０°で１分間
伸長を７２°で１分間
ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを２０サイクル実施した。
ＰＣＲの実施後、産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動させ、Ｑｉａｇｅｎキットを製造業者の指示どおりに用いて、ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をゲルから抽出した。精製ＤＮＡ断片をＥａｇ Ｉで消化し、Ｅａｇ Ｉで消化しておいた酵母発現ベクターＩＴＫにライゲートした。ＩＴＫベクターは、（１）Ｅ．ｃｏｌｉでの複製および（２）相同的組換えによる安定した取り込み後の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの遺伝子発現用に設計されている。このベクターは、
１．Ｅ．ｃｏｌｉでのプラスミドの複製用配列と、
２．ガラクトース含有培地での異種遺伝子発現用の酵母Ｇａｌプロモータと、
３．ＰｒｅＰｒｏ−酵母での遠位遺伝子の分泌およびシグナル配列開裂向けに最適化した合成ＤＮＡ配列と、
４．発現対象となる遺伝子クローニング用のユニークＥａｇ Ｉ部位と、
５．αターミネーター−近位遺伝子の効率的な終止用のＤＮＡ配列と、
６．酵母染色体での内在性δ配列との組換えによるプラスミドの安定した取り込み用のδ配列と、
７．Ｅ．ｃｏｌｉでのカナマイシンを用いた選択ならびに酵母でのＧ４１８を用いた選択用の抗生物質耐性遺伝子と、を含む。
このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＡＧ−１を形質転換した。１００ｕｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートで増殖させることで、形質転換体を選択した。カナマイシン含有ＬＢ培地で個々のコロニーを増殖させ、プラスミドを精製した。制限消化によって、インサートの配向が求められた。このようにして得られたプラスミドＩＴＫ ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦを、Ｑｉａｇｅｎから購入したキットを用いて、製造業者の指示どおりに精製した。
精製プラスミドをＭｆｅ １で直線化し、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）を用いての酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＤＨＹ１３１の形質転換に利用した。ＹＰＤ培地（１リットルあたり／バクトトリプトン２０ｇ、デキストロース２０ｇ、酵母エキス１０ｇ）にて３０℃で飽和するまで増殖させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１０ｍｌ培養を利用し、ＹＰＤ １００ｍｌを接種した。培養を振盪しながら３０℃で３時間増殖させた。酵母を１１，０００×ｇで２分間の遠心により収集し、滅菌水２５ｍｌに再懸濁させた。この酵母を上記のようにして遠心し、１００ｍＭ酢酸リチウム１．０ｍｌに再懸濁させ１．５ｍｌ容の微量遠心管に移した。酵母を１２，０００×ｇで１５秒間の遠心によりペレット化し、上清を除去した。細胞を１００ｍＭ ＬｉＡｃ ０．５ｍｌに再懸濁させた。細胞懸濁液５０ｕＬを個々の微量遠心管に加え、上記のようにして遠心した。上清を除去した。酵母ペレットに加えたトランスフォーメーションミックスの構成は次のとおりである。２４０ｕＬのＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ）；３６ｕＬの１．０Ｍ ＬｉＡｃ；水７５ｕＬ中、５ｕＬの一本鎖ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）および１ｕｇの直線化ＩＴＫ ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦ。この混合物をボルテックスして細胞ペレットを再懸濁させ、３０°で３０分間インキュベートした。続いて、細胞を４２℃で１５分間振盪し、遠心して細胞をペレット化し、ＹＰＤ ０．５ｍｌに再懸濁させた。酵母をＹＰＤ培地で３時間インキュベートし、Ｇ４１８ ２ｍｇ／ｍｌを含むＹＰＤプレートに蒔いた。個々のコロニーが現れるまでプレートを３０℃で３日間増殖させた。ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦの発現をスクリーニングするために、ＹＰＤ培地１ｍｌにて３０℃で２日間個々のコロニーを増殖させた。細胞を８，０００×ｇで２分間遠心し、ＹＰＤ培地を除去し、ｇａｌプロモータからの誘導用にＹＰＧ培地（１リットルあたり／バクトトリプトン２０ｇ、ガラクトース２０ｇ、酵母エキス１０ｇ）１ｍｌと交換した。酵母をＹＰＧ培地で２日間増殖させた。この時点で、アリコートを取り出し、細胞をペレット化した。エンドジェン（Ｅｎｄｏｇｅｎ）から購入したＥＬＩＳＡキットを利用して、上清のＧＭ−ＣＳＦ発現を試験した。プロトコールについては製造業者に従った。
高レベルのキメラタンパク質を発現しているコロニーを同定した。可溶性ＧＭＣＳＦの標準曲線によれば、発現レベルは可溶性物質およそ２．０ｍｇ／Ｌである。Ｇ４１８の非存在下で発現レベルの低下はない。
実施例１３ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡのスケールアップ精製
キメラタンパク質をスケールアップ精製するために、ＹＰＤ ５００ｍｌに酵母を接種し、３０℃で３日間増殖させた。１２，０００×ｇで２分間の遠心により細胞をペレット化し、同容量のＹＰＧに移してさらに３日間増殖させた。続いて細胞を１２，０００×ｇで２分間の遠心によりペレット化し、上清を回収した。可溶性物質を、臭化シアノジェン活性化セファロース４Ｂ（Ｓｉｇｍａ）に連結した抗ネズミＧＭＣＳＦモノクローナル抗体（Ｅｎｄｏｇｅｎ）のイムノアフィニティカラムに適用した。製造業者に従ってモノクローナルをセファロースに結合させた。結合効率をＯＤ２８０で監視し、市販の可溶性物質でＧＭＣＳＦの固定化抗体への結合効率を試験した。
可溶性酵母由来の物質をカラムに通し、重力によって流した。このカラムを（ａ）２０容量の０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスｐＨ７．４（ＴＮ）、（ｂ）５容量の５０ｍＭ トリスｐＨ８．０、（ｃ）２０容量のＴＮで洗浄した。次に、結合した物質を１０容量の０．１５Ｍ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリスｐＨ２．５で溶出した。溶出された物質を１／２００容量の１．５ＭトリスｐＨ８．８で中和した。Ｍｉｃｒｏｓｅｐ ３Ｋ遠心装置（Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を用いて精製物質を濃縮した。製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）でキメラタンパク質の収率を求めた。
精製ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ
精製ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡをウェスタンブロットで分析した。１レーンあたりＧＭ−Ｋ−ＨＡおよそ１ｕｇを可溶性ＧＭＣＳＦと共に電気泳動させた。ウェスタンブロットを行うために、０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０および２％無脂肪ドライミルクを含有するＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）でブロックしたＰｒｏｔｒａｎ ＢＡ８３（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）にゲルを移した。ブロッキング緩衝液で１：５０００希釈した一次抗体（ラットモノクローナル抗ネズミＧＭＣＳＦ、Ｅｎｄｏｇｅｎ）と一緒に、室温にて２時間、ブロットをインキュベートした。このブロットをＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄した。二次抗体であるアルカリホスファターゼ コンジュゲート抗ラットＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を１：１０，０００で室温にて１時間インキュベートした。
実施例１４ 細胞のＧＭ−Ｋ−ＨＡでの覆膜
精製ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡを用いてＣＭＳ ５ネズミ線維肉腫細胞を覆膜した。ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン中でＣＭＳ ５細胞を増殖させ、トリプシン化により収集し、ＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄した（Ｇｉｂｃｏ）。細胞をＲＰＭＩ １６４０で１×１０６／ｍｌまで希釈し、シリコン処理済みのチューブに０．９ｍｌを一定分量ずつ分けた。細胞を振盪しながら３７℃で２時間インキュベートした後、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで３回洗浄した。一次抗体であるラット抗ネズミＧＭＣＳＦモノクローナルを４℃で１時間インキュベートした。細胞を上記のようにして洗浄し、ＦＩＴＣ標識抗ラット抗体（Ｓｉｇｍａ）で処理し、４℃で１時間インキュベートした。さらに洗浄した後、細胞をフローサイトメトリで分析したところ、腫瘍細胞表面にＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡの存在が確認された。
実施例１５ 覆膜後におけるＣＭＳ ５細胞の細胞表面のＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡの定量
ＣＭＳ ５細胞を収集し、上述したようにして洗浄した。ＲＰＭＩ １６４０ １ｍｌ中細胞１×１０６個を精製ＧＭ−Ｋ−ＨＡと１ｕｇと一緒にインキュベートした。４℃、室温または３７℃で１５分間、３０分間、１時間または２時間のインキュベーション後、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳで細胞を３回洗浄した。０．１５％デオキシコール酸塩および洗浄剤を含有するＰＢＳ ５０マイクロリットルを用いて細胞ペレットを溶解させた後、ＰＢＳ ２００マイクロリットルを加えて希釈した。この物質をＰＢＳで倍々希釈し、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｄｏｇｅｎ）で試験した。細胞可溶化物で検出されたＧＭ−ＣＳＦの量に基づいて、各細胞に会合したＧＭ−ＣＳＦ分子の平均数を定量することができた。たとえば、４℃で１５分間のインキュベーション後、細胞１個あたり５８，７００個の分子が存在していた。室温で１５分間のインキュベーション後、細胞１個あたり２５，７００個の分子が存在していた。３７℃で１５分間のインキュベーション後、細胞１個あたり１７，２００個の分子が存在していた。
実施例１６ ＧＭ−ＣＳＦ／赤血球凝集素融合ポリペプチドと混合した腫瘍細胞での効果的な免疫化
ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン中でＣＭＳ−５ネズミ線維肉腫細胞を７０％集密するまで増殖させ、トリプシン化により収集し、ＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄した。アリコートをトリパンブルー染色して生存度を求めた後、細胞４×１０６個／ｍｌの濃度で細胞を再懸濁させ、１ｍｌのアリコートをシリコン処理済みの微量遠心管に分注した。細胞１０６個あたりネズミＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ １ｕｇ（マイクログラム）またはＨＡ−Ｋ−ネズミＧＭ−ＣＳＦ １０ｎｇ（ナノグラム）と一緒に細胞を３７℃で３時間インキュベートした。続いて細胞をＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄し、細胞４×１０６個／ｍｌでＲＰＭＩ １６４０に再懸濁させた。細胞のアリコートを取り出し、細胞会合ＧＭ−ＣＳＦの量を上述したようにしてＥＬＩＳＡで測定した。ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ群にはおよそ２０，２４０分子／細胞、ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦ群には１８，０００分子／細胞があった。本発明の分子（または他の一切の免疫調節物質）なしで投与対象とした対照ワクチンの細胞を平行して調製した。
これらの細胞に１３７Ｃｓ源から３５００ｒａｄの光線を照射した。８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウス（ＣＭＳ−５と同系）をメトファン吸入により麻酔し、０．２５ｍｌ中細胞１×１０６個を皮下注射で左鼡径襞にワクチン接種した。このとき、それぞれのマウスにはワクチン型１種のみの細胞を接種した。７日後、７０％集密した野生型ＣＭＳ−５細胞を収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄した。アリコートをトリパンブルー染色して生存度を求め、細胞をＨＢＳＳ中で４×１０６／ｍｌに調節した。続いて、先にワクチン接種したマウスの首の後ろに、メトファン麻酔下で、０．５ｍｌ ＨＢＳＳ中２×１０６個の生きた野生型ＣＭＳ−５細胞を皮下注射した。ＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦと対照ワクチンを与える群をそれぞれマウス５匹ずつで構成したのに対し、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡワクチンを与える群ではマウス１匹が麻酔から覚醒しなかったため、マウス４匹で構成した。
腫瘍の発達を触診と目視検査で毎日評価した。偏見を確実になくすために、観察者には各組のマウスに接種したワクチンについて何も知らせなかった。腫瘍が見苦しくなった時点で、マウスをＣＯ２で窒息させて屠殺した。対照ワクチンを与えたすべてのマウスで、生きた腫瘍細胞での攻撃の１８日間以内に腫瘍が発達した。これとは対照的に、ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡワクチンを与えたマウスの１００％とＨＡ−Ｋ−ＧＭ−ＣＳＦワクチンを与えたマウスの６０％は、攻撃の４０日後にあたる実験終了時に無腫瘍のままであった。このように、腫瘍細胞と本発明の分子とを含有する組成物での免疫化により、腫瘍細胞を含むが本発明の分子は含まない組成物での免疫化を行った場合よりも無腫瘍での生存期間が有意に長くなる。
実施例１７ ヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡのクローニング
ｐＵＣ１９ヒトＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ（ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ）を、ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡから開始してクローニングする。ｐＵＣ１９ ＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡをＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ ＩＶで消化する。ＥｃｏＲＩはネズミＧＭ−ＣＳＦコード配列の５’末端で切断し、Ｎｇｏ Ｍ ＩＶはネズミＧＭ−ＣＳＦ分子の３’末端で切断する。このようにして得られた、ネズミＧＭ−ＣＳＦコード領域を除去したプラスミドを、Ｑｉａｇｅｎ製のキットを使用してのアガロースゲルでの電気泳動後に精製した。ヒトＧＭ−ＣＳＦコードセグメントを、ＰＣＲにより市販のヒトｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から生成する。このヒト配列は、成熟タンパク質の開始点であるアミノ酸１８から始まっており、分泌シグナル配列がない。内在性終止コドンをなくして、３’末端はアミノ酸１４４に相当する。
上流ｈＧＭ−ＣＳＦプライマー
Figure 0004892705
下流ｈＧＭ−ＣＳＦプライマー
Figure 0004892705
ＰＣＲ条件については次のとおりとする。
変性を９０°で１分間
アニーリングを６０°で１分間
伸長を７２°で１分間
ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを２０サイクル実施する。
ＰＣＲの実施後、産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動させ、キアゲンキットを製造業者の指示どおりに用いて、ｈＧＭ−ＣＳＦ遺伝子をゲルから抽出する。精製ｈＧＭ−ＣＳＦ ＤＮＡ断片をＥｃｏ ＲＩおよびＮｇｏＭ ＩＶで消化し、ＥｃｏＲＩおよびＮｇｏＭ ＩＶで消化しておいたｐＵＣ １９ネズミＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡベクターにライゲートして、ネズミＧＭ−ＣＳＦ配列を除去する。このＤＮＡを用いてＥ．ｃｏｌｉ ＡＧ１を形質転換し、形質転換体をＬＢ−アンピシリンプレートで選択する。個々のコロニーから得たプラスミドＤＮＡを単離して制限酵素で消化し、ｐＵＣ１９ ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡプラスミドを持つクローンを同定する。
Ｑｉａｇｅｎから購入したキットを用いて、ｐＵＣ１９ ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡプラスミドを製造業者の指示どおりに精製する。ｐＵＣ１９ ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡのＰＣＲを利用し、酵母発現ベクターへのクローニング用にｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡをコードするＤＮＡ断片を生成する。このＰＣＲ産物は、酵母発現ベクターへのインフレーム挿入用のＥａｇ Ｉクローニング部位を含む。
上流プライマー
Figure 0004892705
下流プライマー
Figure 0004892705
ＰＣＲ条件については次のとおりとする。
変性を９０°で１分間
アニーリングを６０°で１分間
伸長を７２°で１分間
ｖｅｎｔポリメラーゼを用いて、ＰＣＲを２０サイクル実施する。
ＰＣＲ後、産物を１．０％アガロースゲルで電気泳動させ、Ｑｉａｇｅｎキットを製造業者の指示どおりに用いて、ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ遺伝子をゲルから抽出する。精製ＤＮＡ断片をＥａｇ Ｉで消化し、Ｅａｇ Ｉで消化しておいた酵母発現ベクターＩＴＫにライゲートする。ＩＴＫベクターは（１）Ｅ．ｃｏｌｉでの複製および（２）相同的組換えによる安定した取り込み後の酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの遺伝子発現用に設計されている。このベクターは、
１．Ｅ．ｃｏｌｉでのプラスミドの複製用配列と、
２．ガラクトース含有培地で増殖させた酵母での異種遺伝子発現用の酵母Ｇａｌプロモータと、
３．ＰｒｅＰｒｏ−酵母での遠位遺伝子の分泌およびシグナル配列開裂向けに最適化した合成ＤＮＡ配列と、
４．発現対象となる遺伝子クローニング用のユニークＥａｇ Ｉ部位と、
５．αターミネーター−近位遺伝子の効率的な終止用のＤＮＡ配列と、
６．酵母染色体での内在性δ配列との組換えによるプラスミドの安定した取り込み用のδ配列と、
７．Ｅ．ｃｏｌｉでのカナマイシンを用いた選択ならびに酵母でのＧ４１８を用いた選択用の抗生物質耐性遺伝子と、を含む。
このプラスミドを用いてＥ．ｃｏｌｉ株ＡＧ−１を形質転換する。１００ｕｇ／ｍｌカナマイシン含有ＬＢプレートで増殖させることで、形質転換体を選択する。カナマイシン含有ＬＢ培地で個々のコロニーを増殖させ、プラスミドを精製する。制限消化によって、インサートの配向が求められる。このようにして得られるプラスミドＩＴＫ ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡを、Ｑｉａｇｅｎから購入したキットを用いて、製造業者の指示どおりに精製する。
精製プラスミドをＭｆｅ １で直線化し、酢酸リチウム（ＬｉＡｃ）を用いての酵母株Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＷＤＨＹ１３１の形質転換に利用する。ＹＰＤ培地（１リットルあたり／バクトトリプトン２０ｇ、デキストロース２０ｇ、酵母エキス１０ｇ）にて３０°で飽和するまで増殖させたＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの１０ｍｌ培養を利用し、ＹＰＤ １００ｍｌを接種する。培養を振盪しながら３０°で３時間増殖させる。酵母を１１，０００×ｇで２分間の遠心により収集し、滅菌水２５ｍｌに再懸濁させる。この酵母を上記のようにして遠心し、１００ｍＭ酢酸リチウム１．０ｍｌに再懸濁させ１．５ｍｌ容の微量遠心管に移す。酵母を１２，０００×ｇで１５秒間の遠心によりペレット化し、上清を除去する。細胞を１００ｍＭ ＬｉＡｃ ０．５ｍｌに再懸濁させた。細胞懸濁液５０ｕＬを個々の微量遠心管に加え、上記のようにして遠心した。上清を除去する。上清を除去する。酵母ペレットに加えたトランスフォーメーションミックスの構成は次のとおりである。２４０ｕＬのＰＥＧ（５０％ｗ／ｖ）；３６ｕＬの１．０Ｍ ＬｉＡｃ；水７５ｕＬ中、５ｕＬの一本鎖ＤＮＡ（１０ｍｇ／ｍｌ）および１ｕｇの直線化ＩＴＫ ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡ。この混合物をボルテックスして細胞ペレットを再懸濁させ、３０°で３０分間インキュベートする。続いて、細胞を４２°で１５分間振盪し、遠心してペレット化し、ＹＰＤ ０．５ｍｌに再懸濁させる。酵母をＹＰＤ培地で３時間インキュベートし、Ｇ４１８ ２ｍｇ／ｍｌを含むＹＰＤプレートに蒔く。個々のコロニーが現れるまでプレートを３０°で３日間増殖させる。
ｈＧＭ−ＣＳＦ−Ｋ−ＨＡの発現をスクリーニングするために、ＹＰＤ培地１ｍｌにて３０°で２日間個々のコロニーを増殖させる。細胞を８，０００×ｇで２分間遠心し、ＹＰＤ培地を除去し、ｇａｌプロモータからの誘導用にＹＰＧ培地（１リットルあたり／バクトトリプトン２０ｇ、ガラクトース２０ｇ、酵母エキス１０ｇ）１ｍｌと交換する。酵母をＹＰＧ培地で２日間増殖させる。続いて、アリコートを取り出し、細胞をペレット化する。Ｅｎｄｏｇｅｎから購入したＥＬＩＳＡキットを利用して、上清のｈＧＭ−ＣＳＦ発現を試験する。プロトコールについては製造業者に従う。
実施例１８ マウスモデルでの転移の低減
Ｂ１６Ｆ１０ネズミ黒色腫細胞を収集し、ＰＢＳで３回洗浄した。続いて、細胞を生存細胞５×１０５個／ｍｌでＰＢＳに懸濁させた。この場合の生存度は細胞のアリコートをトリパンブルーで染色して求めた。この懸濁液１００ｕｌを、８〜１０週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの尾静脈に注射した。腫瘍での攻撃の１日または３日後、１×１０６個の光線照射したＢ１６Ｆ１０細胞を左鼡径襞に皮下注射してマウスを免疫した。複数の群（各々マウス３匹）に、細胞のみ、可溶性組換えネズミＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）１ｕｇと混合した細胞または、Ｎ末端にネズミＧＭ−ＣＳＦ細胞と、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２フレキシブルリンカーと、Ｃ末端にインフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４赤血球凝集素のＨＡ１ドメインとを含む本発明の多機能性分子１ｕｇと混合した。後者の組成物については、遊離多機能性分子と細胞結合多機能性分子の両方を含んでいた。
１２日目にマウスを屠殺し、胸腔を解剖用はさみで切り開き、気管部横切開により肺をｅｎ ｂｌｏｃで取り出した。拡大鏡を使って転移を数えあげた。攻撃の１日後に免疫したマウスでは、平均転移数／マウスは以下のとおりであった。
細胞のみ： ３０．００
細胞＋ＧＭ−ＣＳＦ： １４．３３
細胞＋多機能性分子： ０．６７
攻撃の３日後に免疫したマウスでは、平均転移数／マウスは以下のとおりであった。
細胞のみ： ３６．３３
細胞＋ＧＭ−ＣＳＦ： １０．３３
細胞＋多機能性分子： １．００
このように、本発明の多機能性分子を含む組成物を投与すると、効率的に転移を減らして疾病を治療することが可能であった。
実施例１９ ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍攻撃に対するＧＭ−ＣＳＦ−ＨＡ１による保護
同種腫瘍ワクチンモデルとして、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ハプロタイプｂ）をＣ３Ｈ（ハプロタイプｋ）由来Ｋ１７３５黒色腫細胞で免疫した後、Ｃ５７ＢＬ／６由来Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞で攻撃した。１０％ＦＢＳおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中、Ｋ１７３５細胞を７０％集密するまで増殖させ、トリプシン化により収集し、ＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄した。アリコートをトリパンブルー染色して生存度を求めた後、Ｋ１７３５について細胞４×１０６個／ｍｌの濃度で細胞を再懸濁させた。続いて、アリコート１ｍｌをシリコン処理済みの微量遠心管に分注した。細胞１０６個あたり１ｕｇのｍＧＭ−ＣＳＦ−ＨＡ１（Ｎ末端のネズミＧＭ−ＣＳＦと、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２リンカーと、インフルエンザＡ／ＰＲ／８／３４のＨＡ１ドメインとからなる融合ポリペプチド）と一緒に細胞を４℃で２時間インキュベートした。細胞のアリコートを、ＥＬＩＳＡでの細胞会合ＧＭ−ＣＳＦの測定用に取り出した。２回の実験での平均細胞会合ＧＭ−ＣＳＦはおよそ６０，０００であった。どのポリペプチドとも混合しない細胞と、１回の実験では、可溶性ネズミＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ Ｃｏｒｐ．）１ｕｇと混合した細胞を、対照ワクチンとして平行して調製した。
これらの細胞に１３７Ｃｓ源から３５００ｒａｄの光線を照射した。８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスをメトファン吸入により麻酔し、合計１ｕｇのＧＭ−ＣＳＦ−ＨＡ１（結合した融合ポリペプチドと遊離融合ポリペプチドの両方を含む）と一緒にＲＰＭＩ ０．２５ｍｌ中細胞１×１０６個を皮下注射で左鼡径襞にワクチン接種した。このとき、それぞれのマウスにはワクチン型１種のみの細胞を接種した。７日後、該当する場合は７０％集密したＢ１６Ｆ１０細胞を収集し、ＨＢＳＳで３回洗浄した。アリコートをトリパンブルー染色して生存度を求め、細胞をＨＢＳＳ中で１×１０５／ｍｌに調節した。続いて、先にワクチン接種したマウスの首の後ろに、メトファン麻酔下で、Ｂ１６Ｆ１０細胞懸濁液０．５ｍｌを皮下注射して攻撃した。
腫瘍の発達を触診と目視検査で毎日評価した。腫瘍塊が触診可能かつ目視可能になった最初の日を「発生」と定義する。偏見を確実になくすために、観察者には各組のマウスに接種したワクチンについて何も知らせなかった。腫瘍が見苦しくなった時点で、マウスをＣＯ２で窒息させて屠殺した。事前に計画していたとおり、腫瘍攻撃から７０日後に実験を終えた。
２回の実験でプールした結果では、攻撃の７０日後、融合ポリペプチドと混合した細胞をワクチン接種したマウスの１０匹中７匹が無腫瘍のままであった。これとは対照的に、細胞だけをワクチン接種したマウスでは１０匹中１０匹に腫瘍が発達し、可溶性ネズミＧＭ−ＣＳＦと混合した細胞をワクチン接種したマウスで５匹中４匹も同様であった。
他の実施形態
上記の実施例は、本発明をなしてこれを実施するにあたって本願発明者らが実施して企図した実験を示すものである。これらの実施例は、これを実施する技術分野に本発明について知らせ、その有用性を示すことの両方の役割を果たす手法を開示しているものと考えられる。本願明細書に開示の手法および実施形態は、同じ効果を得るにあたって一般に多数の等価な方法および手法を用いることのできる好ましい実施形態にすぎないことは、当業者には明らかであろう
上記にて引用した参考文献についてはすべて、本発明の１以上の実施形態を実施する上で重要となり得る組成物および／または方法について記述し、説明し、根拠を示し、あるいはこれを可能にできる程度に、明示的に本願明細書に援用する。

Claims (16)

  1. 融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む組成物であって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、組成物。
  2. 融合ポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターであって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、発現ベクター。
  3. 融合ポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞であって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、宿主細胞。
  4. 融合ポリペプチドを含む組成物であって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、組成物。
  5. 抗原保有標的を含み、かつ融合ポリペプチドをさらに含む組成物であって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、組成物。
  6. 抗原保有標的を含み、かつ融合ポリペプチドをさらに含む組成物であって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含み、
    前記抗原保有標的が、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、寄生虫抗原、及びプリオン抗原からなる群より選択される少なくとも１種を含むことを特徴とする、組成物。
  7. 抗原保有標的を含み、かつ融合ポリペプチドをさらに含むワクチン組成物であって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、ワクチン組成物。
  8. 抗原保有標的を含み、かつ融合ポリペプチドをさらに含むワクチン組成物であって、前記融合ポリペプチドが、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含み、
    前記ワクチン組成物が、前記抗原保有標的上の炭水化物に結合した前記融合ポリペプチドを含み、かつ前記抗原保有標的に結合していない前記ポリペプチドをさらに含むことを特徴とする、ワクチン組成物。
  9. 抗原保有標的を含み、かつ多機能性分子をさらに含む、動物の免疫反応を調節することができる医薬組成物であって、前記多機能性分子が、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、医薬組成物。
  10. ウイルスまたは細胞を含み、かつ多機能性分子をさらに含む、動物の免疫反応を調節することができる医薬組成物であって、前記多機能性分子が、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含み、
    前記組成物が、前記ウイルスまたは前記細胞に結合した前記多機能性分子を含み、かつ前記ウイルスまたは前記細胞に結合していない前記多機能性分子をさらに含むことを特徴とする、医薬組成物。
  11. ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにて細胞に付着させて用いる多機能性分子であって、
    前記多機能性分子は、サイトカインと、シアル酸に結合可能なレクチンとを含み、
    前記細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、及び内皮細胞からなる群より選択されることを特徴とする、多機能性分子。
  12. ポリペプチド抗原を含み、かつ多機能性分子融合ポリペプチドをさらに含む組成物であって、
    前記多機能性分子融合ポリペプチドは、サイトカインを含む第１のポーションと、シアル酸に結合可能なレクチンを含む第２のポーションとを含み、
    前記組成物は前記ポリペプチド抗原に結合していない多機能性分子を含み、そして前記組成物は無細胞のものであることを特徴とする、組成物。
  13. インフルエンザウイルスの赤血球凝集素と、自然界に存在するＧＭ−ＣＳＦ分子とを含むことを特徴とする、融合ポリペプチド。
  14. 動物で免疫反応を調節する薬剤の製造のための、抗原保有標的を含み、かつ多機能性分子をさらに含む組成物の使用であって、
    前記多機能性分子が、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含むことを特徴とする、使用。
  15. 動物で免疫反応を調節する薬剤の製造のための、ウイルスまたは細胞を含み、かつ多機能性分子をさらに含む組成物の使用であって、
    前記多機能性分子が、シアル酸に結合可能なレクチンと、サイトカインとを含み、
    前記組成物が、前記ウイルスまたは前記細胞に結合した前記多機能性分子を含み、かつ前記ウイルスまたは前記細胞に結合していない前記多機能性分子をさらに含むことを特徴とする、使用。
  16. ｉｎ ｖｉｖｏにて細胞に接触させて用いられる薬剤の製造のための、サイトカインと、シアル酸に結合可能なレクチンとを含む多機能性分子の使用であって、
    前記細胞が、線維芽細胞、ケラチノサイト、上皮細胞、及び内皮細胞からなる群から選択されることを特徴とする、使用。
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