FR2893619A1 - Proteine chimere lectine-defensine - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne une protéine chimère comprenant (i) un domaine, désigné « Lec », de liaison cellulaire d'une lectine et (ii) un domaine d'une défensine, désigné « Def », activable, de lyse des membranes cellulaires ou des agents infectieux, et l'utilisation de cette protéine en thérapie antivirale ou antitumorale.
Description
La présente invention a trait à une protéine chimère lectine-défensine,
utile notamment en thérapie antivirale ou antitumorale.
L'immunité innée exerce ses activités par l'intermédiaire de cellules ou de molécules solubles préexistantes à toute infection, qu'elle soit bactérienne, virale ou parasitaire. Contrairement à l'immunité acquise qui exige une période de maturation de plusieurs jours pour produire anticorps et cellules effectrices, les éléments de l'immunité innée sont immédiatement disponibles pour l'hôte soumis à une infection. Les nombreuses lectines de l'immunité innée possèdent l'avantage d'une reconnaissance beaucoup plus large que les anticorps ou les lymphocytes effecteurs de l'immunité acquise, spécialisés, eux, contre des épitopes restreints. Une lectine déterminée reconnaît un ou plusieurs types d'oligosaccharides portés par tous les variants de plusieurs familles de virus ou plusieurs types de tumeurs. La lectine DC-SIGN, par exemple, reconnaît les oligosaccharides de type mannane trouvés sur plusieurs familles de virus enveloppés, ainsi que des chaînes fucosylées telles que Lewisx et LewisY portées par des antigènes tumoraux (Soilleux, E.J. 2003 ; van Kooyk et Geijtenbeek, 2003; van Gisbergen, et al 2005). La large reconnaissance des lectines de l'immunité innée s'explique par la nature des motifs (oligosaccharidiques) auxquels elles se lient. Les résidus oligosaccharidiques portés par les glycoconjugués sont greffés par des glycosyltransférases, enzymes cellulaires extrêmement bien conservées génétiquement. Les oligosaccharides des enveloppes virales sont d'origine cellulaire et ne varient donc pas en fonction des mutations virales. Ceci explique la reconnaissance de tous les variants viraux d'une ou plusieurs familles virales par une même lectine. Les cellules tumorales peuvent porter des oligosaccharides de surface spécifiques, reconnus par certaines lectines dont la DC-SIGN (van Gisbergen, et al 2005), en modulant l'expression de certaines glycosyltransférases.
Les nombreuses défensines, regroupées en familles alpha, béta et théta (Kagan, et al 1994 ; Cole et Lehrer, 2003 ; Chang et Klotman. 2004; Wang, et al, 2004), sont constituées par de courts peptides, capables de s'intercaler dans les membranes, de les 'perforer' et de provoquer des désordres de perméabilité aboutissant à la lyse (Lehrer, et aI, 1993; Risso, 2000; Yeaman et Yount, 2003; Yount et Yeaman, 2005). Elles sont synthétisées sous forme de propeptide et activées par clivage de la propièce (Valore, et al, 1996). Stockées dans des granules à l'intérieur de cellules spécialisées, ou sécrétées, elles sont délivrées sur les lieux de l'infection. Lectines et défensines sont des molécules ancestrales, retrouvées jusque dans le monde végétal. Elles sont pour la plupart exprimées par des types cellulaires différents: cellules myéloïdes évoluant vers la différenciation granulocytaire ou cellules de Paneth pour les défensines; cellules dentritiques, endothéliales et placentaires, et hépatocytes pour les lectines. Lectines et défensines possèdent, pour la plupart, une spécificité de tissu et des modes d'activité particuliers, qui ne les amènent pas à coopérer.
De manière à potentialiser les propriétés des lectines et défensines, il est maintenant proposé de les associer, de préférence par génie génétique. Pour cela on utilise un domaine lectine capable de reconnaître des oligosaccharides présents sur des agents infectieux, comme l'enveloppe de plusieurs virus, présents à la surface des cellules qui expriment ces virus, présents également à la surface de cellules qui hébergent le provirus HIV-1 de façon latente, ainsi qu'à la surface de certaines cellules tumorales. On utilise en outre un domaine propeptide d'une défensine, fusionné au domaine lectine. Le site d'activation du propeptide est avantageusement modifié pour devenir activable par les éléments ciblés eux-mêmes: cellules ou pathogènes (virus, bactéries...), par l'intermédiaire de leur protéase spécifique, en libérant le peptide actif, virucide et/ou cytolytique. Un objet de l'invention est ainsi une protéine chimère comprenant (i) un domaine, désigné Lec , de liaison cellulaire d'une lectine et (ii) un domaine d'une défensine, désigné Def , activable, provoquant la lyse des membranes cellulaires ou agents infectieux. Dans le contexte de la présente invention, cette protéine est désignée Lec-Def ou Def-Lec , selon l'orientation de la construction.
De préférence, la protéine chimère comprend en outre une séquence d'internalisation cellulaire, insérée dans ladite proteine. Un autre objet de l'invention est un acide nucléique isolé codant pour cette protéine.
Les protéines Lec-Def ou Def-Lec de l'invention peuvent être produites in vitro, par une cellule hôte, eucaryote ou procaryote, transfectée avec l'acide nucléique codant pour la protéine. Elles peuvent être également exprimées in vivo, soit après administration de l'acide nucléique, nu ou vectorisé, soit après administration de cellules hôtes (de préférence autologues) transfectées ex vivo avec l'acide nucléique codant pour la protéine. Les protéines Lec-Def ou Def-Lec de l'invention sont utiles pour le traitement d'infections, notamment d'infections virales, et pour le traitement de tumeurs.
Domaine Lec La protéine chimère de l'invention comprend un domaine dérivé d'une lectine. II peut s'agir de n'importe quelle lectine, de préférence humaine. Toutefois la lectine humaine DC-SIGN est préférée, en raison d'un large spectre de reconnaissance d'agents infectieux ou de cellules tumorales. Cette lectine est exprimée, ainsi que son isoforme DC-SIGNR, par les cellules dentritiques, endothéliales et placentaires. Cette lectine reconnaît plusieurs types de virus, parmi lesquels HIV-1, Hépatite C (HCV), Ebola, Dengue, et Cytomegalovirus. La DC-SIGN reconnaît également plusieurs types de cellules tumorales, parmi lesquels le mélanome, le myxofibrosarcome, le cancer du sein et le cancer colorectal. Molécule transmembranaire des cellules dentritiques, la DC-SIGN fonctionne en tant que récepteur capable d'internaliser l'agent infectieux reconnu et permettre à la cellule porteuse de le présenter aux lymphocytes. C'est également par l'intermédiaire de la DC-SIGN que les cellules dentritiques s'accumulent au sein de certaines tumeurs. Chaque molécule DC-SIGN comporte à partir de l'extrêmité N-terminale: un domaine intracytoplasmique (avec motif d'internalisation), un domaine transmembranaire, suivi d'un domaine extracellulaire comportant une région coiled-coil suivie d'une séquence lectine de type C. Grâce à son domaine superenroulé coiled-coil de type leucine-zipper, la DC-SIGN s'oligomérise en tétramères, ce qui lui confère une très forte affinité pour les oligosaccharides riche en mannose (Feinberg, et al, 2001). II a été démontré que la DC-SIGN reconnaissait également certaines chaînes fucosylées (Lewisx et Lewisy). Ces deux types de liaison sont assurées par des régions différentes de la DC-SIGN (van Die, et al, 2003). D'autres lectines sont utilisables, telles que la Mannose Binding Lectin (MBL) (Ji, et al, 2005 ; Hart, et al 2002), High mannose glycans and sialic acid on), CD94/NKG2A (De Maria et Moretta, 2000), ou la LSLCL (Bannwarth et al, 1998). Dans le cadre de la présente invention, on peut utiliser la lectine entière ou au moins son domaine de liaison cellulaire, à savoir généralement son domaine extracellulaire.
Selon un mode de réalisation préféré, la protéine chimère comprend le domaine extracellulaire seul de la DC-SIGN (lectine de type C + coiled-coil). Il est ainsi possible de ne conserver que la fonction de reconnaissance de la DCSIGN. Une séquence de la DC-SIGN est présentée en annexe (SEQ ID NO :1 pour l'ADNc, et SEQ ID NO :2 pour la protéine, le domaine extracellulaire allant des acides aminés 63 à 404). Afin de permettre l'entrée de la protéine à l'intérieur des cellules ciblées ou des particules virales, les inventeurs ont inclus dans la protéine chimère une séquence d'internalisation, qui est de préférence insérée dans le domaine de liaison cellulaire de la lectine. La séquence d'internalisation est ainsi avantageusement insérée dans le domaine Lec à une position choisie pour que la protéine puisse être extériorisée à l'occasion d'un changement conformationnel intervenant lors de la liaison Lec-Mannan ou Lec-Lewis. Ceci permet d'éviter l'internalisation stochastique des molécules Lec-Def (ou Def- Lec). De préférence ladite séquence d'internalisation est un peptide de 7 à 12 acides aminés, essentiellement basiques.
Par essentiellement basiques , on entend que le peptide comprend au moins 70%, de préférence au moins 80% d'acides aminés basiques (lysine ou arginine). Selon un mode de réalisation préféré, ladite séquence d'internalisation 5 est la séquence RKKRRQRRR (SEQ ID NO : 3). Cette séquence polybasique de la protéine Tat est connue pour sa capacité à provoquer l'internalisation de la molécule qui en est porteuse (Silhol, et al, 2002). Le site préférentiel d'insertion du peptide RKKRRQRRR a été défini en 10 fonction des travaux de Geng et al. (1991) sur GMP-140 (lectine de type C), démontrant un changement de conformation de la région CQNRYTDLVAIQNKNE (SEQ ID NO : 4) après fixation des ions Ca++, au cours de la liaison GMP-140/cible . Cette région est contiguë à la première cystéine du domaine Lec proprement dit. Le site précis d'insertion du peptide 15 RKKRRQRRR se situe entre les 2 hélices alpha: WHDSITACKE (SEQ ID NO : 5) et EEQNFLQLQSSRS (SEQ ID NO : 6) (Feinberg, et al, 2001), (NCBI, références structure 3D de la DC-SIGN: 1 SL5, 1 SL4, 1K91), présentes à ce niveau.
20 Domaine Def La protéine chimère de l'invention comprend un domaine dérivé d'une défensine. II peut s'agir de n'importe quelle défensine, de préférence humaine. Toutefois la défensine humaine alpha 3 est préférée. Une séquence de la défensine alpha 3 est présentée en annexe (SEQ 25 ID NO :7 pour l'ADNc, et SEQ ID NO :8 pour la protéine). La séquence complète est appelée préprodéfensine. Le préfixe `pré' correspond au peptide signal (acides aminés 1 à 20) et le segment 'pro' au domaine protecteur (acides aminés 21 à 64). Pour être actif, le peptide défensine proprement dit (acides aminés 65 à 94) doit être libéré par une endopeptidase cellulaire qui reconnaît 30 le site naturel de clivage au niveau des acides aminés 64-65.
Dans l'invention, le site naturel de clivage de la prodéfensine est, de manière avantageuse, remplacé par une séquence spécifiquement clivable par la cible que reconnaît la protéine chimère Lec-Def ou Def-Lec . Le domaine de lyse de Def comprend ainsi avantageusement une séquence de clivage reconnue (a) par une protéase virale, ce qui rend le domaine de lyse activable par ladite protéase virale, ou (b) par une métalloprotéase surexprimée par les cellules tumorales, ce qui rend le domaine de lyse activable par ladite métalloprotéase. En d'autres termes, la séquence de clivage reconnue par une protéase virale ou par une métalloprotéase remplace la séquence naturelle de clivage qui permet la maturation de la défensine au cours de la différenciation granulocytaire, à savoir le domaine de la prodéfensine qui permet de générer le peptide actif (acides aminés 65-94).
A titre d'exemples, la séquence de clivage reconnue par une protéase virale peut être une séquence reconnue par une protéase choisie parmi une protéase de HIV, notamment HIV-1, de HCV, ou du virus de la Dengue. II peut s'agir notamment d'une séquence de clivage reconnue par la protéase de HIV-1, telle que les séquences SEQ ID NO : 9 à SEQ ID NO : 22.
Cette protéase est présente non seulement dans la cellule infectée mais également dans le virion dont la maturation est achevée en situation extracellulaire. Le site RKVLFLD (SEQ ID NO : 9) (RTp66/INT) a été choisi car il était avantageux d'insérer les acides aminés (aa) VLFL entre les aa R6,K62 et D65 de la HNP3 en éliminant les aa N63M64 au niveau du site de clivage originel: RKNMD (SEQ ID NO :10) - RKVLFLD originale -* modifiée D'autres sites de clivage sont: 30 VSQNY/PIVQN (SEQ ID NO :11), XXAIM/MQKSN, (SEQ ID NO :12), RPGNF/LQSRP, (SEQ ID NO :13), ENLAF/XQGEA, (SEQ ID NO :14), 35 CTLNF/PISPI, (SEQ ID NO :15), IRKVL/FLDGI, (SEQ ID NO :16), KARVL/AEAMS, (SEQ ID NO :17), ERQAN/FLGKI, (SEQ ID NO:18) ERQAN/FLREN, (SEQ ID NO :19), XSFXF/PQITC, (SEQ ID NO :20), GAETF/YVDGA, (SEQ ID NO :21), XDCAW/LEAQE, (SEQ ID NO :22). Il peut s'agir aussi d'une séquence de clivage reconnue par la protéase NS3 de HCV, telle que les séquences SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 27.
Le génome du HCV, virus appartenant à la famille des Flaviviridae, est entièrement transcrit en un seul ARN messager puis traduit en une polyprotéine qui est ensuite découpée par une métalloprotéase cellulaire et la sérine protéase virale NS3 (Penin et al, 2004). La protéase virale a fait l'objet de nombreux travaux. Elle clive les sous-peptides NS4A, NSAB, NS5A et NS5B. Les différents sites de clivage reconnus par NS3 permettent de définir la séquence consensus: (D/E)XXXXC(A/S), (Urbani, et aI,1997). La séquence préférée retenue (SEQ ID NO :23) pour modifier le site de clivage de la défensine selon la stratégie ci-dessus a été: P6 P'I RKNMDCYC -4 RKEDVVCCSMCYC, (les aa soulignés sont conservés). originale * modifiée (les aa requis sont représentés en caractères gras) D'autres sites de clivage sont : NS3/NS4A DLEVVT STWV (SEQ ID NO:24) NS4AINS4B DEMEEÇ ASHL (SEQ ID NO:25) NS4B/NS5A DCSTPÇ SGSW (SEQ ID NO:26) NS5A/NS5B EDWCC SMSY (SEQ ID NO:27)
On peut également utiliser une séquence de clivage reconnue par la protéase NS3 du virus de la Dengue, telle que les séquences SEQ ID NO : 28 à 25 SEQ ID NO : 45. Le virus de la Dengue appartient également à la famille des Flaviviridae. En fonction des travaux de plusieurs équipes à propos des sites de clivage reconnus spécifiquement par la protéase NS3 de ce virus (Chanprapaph, et al 2005, Li, et al, 2005), un site consensus donnant les 720 meilleurs paramètres Km et Vm comporte en P1, P2 et P3 un acide aminé basique (Lys ou Arg préférés), et en P'1 un acide aminé faiblement polaire (Ser, Glu ou Ala). La meilleure séquence retenue (SEQ ID NO :28) pour modifier le site de clivage de Def a été:
P3P1P'1 RKNMDCYC -> RKRSVSGDCYC (les aa soulignés sont conserv originale -* modifiée (les aa essentiels sont représentés en caractères gras,)
D'autres sites de clivage sont SEQ ID NO:29 à SEQ ID NO:44 (Li, et al, 2005): Dengue 1 Dengue 2 Dengue 3 Dengue 4 NS2A/2B KIWGRK/SWPLNE RTSKKR/SWPLNE DTLKRR/SWPLNE KGASRR/SWPLNE NS2B/3 QKKKQR/SGVLWD EVKKQR/AGVLWD QKQTQR/SGVLWD QVKTQR/SGALWD NS3/4A FAAGRR/SVSGDL FAAGRK/SLTLNL FAAGRK/SIALDL FASGRK/SITLDI NS4B/S LGGGRR/GTGAQS TTNTRR/GTGNIG VGTGKR/GTGSQS AQTPRR/GTGTTG Alternativement le domaine de lyse de la défensine peut comprendre une séquence de clivage reconnue par une métalloprotéase, surexprimée par 25 exemple dans le cas d'un cancer colorectal ou d'un cancer du sein (Duffy et McCarthy, 1998 ; Bini, et al, 1999). Les métalloprotéases MMP-3, MMP-7 et MMP-1 sont les plus souvent impliquées. Deux sites de clivage leur sont communs: Thr/Leu et AsnNal (Bini, et al, 1999). La séquence retenue pour modifier le site de clivage de Def a été: 30 RKNMDCYC (SEQ ID NO:45) -* RKNVDCYC (SEQ ID NO:46) originale modifiée (Les acides aminés soulignés sont conservés. Les acides aminés essentiels sont représentés en caractères gras). 35 D'autres sites de clivage d'intérêt sont cités ci-après : RKTLDCYC (SEQ ID NO :47) RKELADCYC (SEQ ID NO :48) RKPLGLGLDCYC (SEQ ID NO :49) 10 15 20 Constructions Lec-Def ou Def-Lec Les domaines Lec et Def sont associés, typiquement sous la forme d'une protéine de fusion. De préférence, le domaine Def est en position N-terminale et le domaine Lec est en position C-terminale, une séquence d'activation du domaine Def séparant les deux domaines Def et Lec . La position inverse (le domaine Def en position C-terminale et le domaine Lec est en position N-terminale) est également possible. Comme décrit ci-dessus, la séquence d'activation est avantageusement une séquence de clivage reconnue (a) par une protéase virale, ce qui rend le domaine de lyse activable par ladite protéase virale, ou (b) par une métalloprotéase surexprimée par les cellules tumorales, ce qui rend le domaine de lyse activable par ladite métalloprotéase. Les séquences protéiques résultant de la fusion entre Lec et Def sont elles-mêmes fusionnées à des séquences de routage en position N-terminale. II peut s'agir de la séquence SiHi de la LSLCL contenant le peptide signal et la région charnière de la LSLCL. Un FLAG peut être inséré dans le SiHi. Il peut s'agir également de la séquence HA, peptide signal d'une hémagglutinine virale dans lequel une étiquette 6xHis pourra être insérée. Une protéine d'intérêt comprend par exemple la séquence SEQ ID NO :51 (séquence complète de la protéine recombinante SiHi-Def-Lec).
L'acide nucléique isolé codant pour la protéine chimère d'intérêt fait également partie de l'invention, de même que toute cellule hôte dans laquelle ledit acide nucléique est transfecté de manière stable ou transitoire. Plus particulièrement l'invention vise un acide nucléique qui comprend la séquence SEQ ID NO :50 (séquence complète de l'ADNc de SiHi-Def-Lec).
Dans cette séquence on repère les les nucléotides (nt) suivants : nt 1-75 peptide signal LSLCL nt 76-99 Flag Sigma nt 100-342 domaine charnière LSLCL nt 343-573 prodéfensine alpha3 (nt 466-486: site de clivage modifié) nt 574-597 pièce de jonction = site de clivage nt 598-1653 DC-SIGN domaine extracellulaire (nt 1276-1302: nonapeptide polybasique) La présente invention englobe également les cassettes d'expression, dans lesquelles une molécule d'acide nucléique codant une protéine chimère de l'invention est associée à des éléments appropriés de contrôle de la transcription (notamment promoteur, et éventuellement terminateur) et éventuellement de la traduction, ainsi que les vecteurs recombinants dans lesquels est insérée ladite molécule d'acide nucléique. L'invention vise également les vecteurs de clonage et/ou d'expression, qui contiennent un acide nucléique codant pour la protéine chimère d'intérêt.
Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule hôte déterminée. Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Les promoteurs préférés sont décrits ci-après. Le vecteur est de préférence maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultants peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques. Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques choisies.
L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par un vecteur selon l'invention.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes.
Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont en particulier les cellules procaryotes, de préférence les bactéries telles que E. coli. Les procédés in vitro de production d'une protéine chimère par voie recombinante comprennent typiquement la transfection d'une cellule hôte avec un acide nucléique (sous forme d'un vecteur), codant pour la protéine, dans des conditions qui permettent l'expression de la protéine. On récupère ensuite la protéine recombinante ainsi produite. Si nécessaire, la protéine peut ensuite être purifiée par des procédures classiques, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art, par exemple par précipitation fractionnée, notamment précipitation au sulfate d'ammonium, électrophorèse, filtration sur gel, chromatographie d'affinité, etc. On peut également préparer les protéines selon l'invention par synthèse chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention. L'homme du métier connaît les procédés de synthèse chimique, par exemple les techniques mettant en oeuvre des phases solides (voir notamment Steward et al., 1984, Solid phase peptides synthesis, Pierce Chem. Company, Rockford, 111, 2ème éd., (1984)) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique.
Promoteurs Dans un mode de réalisation préféré, la séquence codant les domaines Lec et Def est sous le contrôle d'un promoteur inductible ou tissu-spécifique.
Par exemple, le promoteur utilisé peut être inductible par la protéine Tat du HIV-1 et/ou la tétracycline. Le promoteur choisi peut être tissu-spécifique tel que celui de l'anti-thrombine III, ce qui permet de cibler les hépatocytes infectés par le HCV. Le promoteur choisi peut être tumeur-inductible comme pNeu, particulièrement avantageux pour cibler des tumeurs susceptibles de surexprimer c-erbB-2 telles que cancer du sein ou cancers du tractus gastrointestinal.
Un promoteur particulier, inductible par la protéine Tat du virus HIV-1, comprend les éléments suivants, de 5' vers 3': 3 éléments NF-KB, éventuellement un élément PEA3, 3 éléments SPI, 3 éléments TAR. Les avantages de ce type de promoteur sont : (i) la très forte expression induite dans ou au contact de cellules exprimant la protéine Tat, ainsi que (ii) la perte d'évolution vers le silencing (mise sous silence) transcriptionnel, ce qui assure le maintien au long cours de la capacité à répondre à l'induction.
Applications thérapeutiques La protéine chimère décrite ci-dessus, de préférence produite par recombinaison génétique, est utile pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection par un agent pathogène, notamment une infection virale ou au traitement d'une tumeur. Le domaine lectine de la protéine permet le ciblage d'agents infectieux (tels que des virus) ou cellules indésirables (cellules tumorales, ou cellules productrices de virus ou abritant des virus, en situation de latence), et le domaine défensine permet la destruction de ces agents pathogènes ou cellules. Les protéines Lec-Def de l'invention peuvent être particulièrement utiles pour la détection et l'élimination des cellules HIV+ en situation de latence chez les sujets préalablement testés pour l'expression significative de l'épitope LewisY. En effet l'épitope LewisY, reconnu par la DC-SIGN, est significativement retrouvé sur les cellules mononucléées du sang périphérique de certains sujets HIV+ (Adachi, et al, 1988 ; Kashiwagi, et al, 1994). L'agent infectieux visé est de préférence un virus, mais il peut aussi s'agir d'une bactérie ou d'une infestation parasitaire.
L'infection virale visée peut être plus généralement une infection par un rétrovirus, de préférence le virus HIV, le virus HCV ou le virus de la Dengue, ou tout autre virus qui est reconnu par une lectine humaine telle que la DC-SIGN.
Le test de reconnaissance peut être réalisé sur des cellules infectées par le virus candidat à l'aide de la molécule Lec porteuse de l'étiquette 6xHIS, décrite dans la présente invention. La révélation secondaire peut être effectuée alors par un anticorps anti 6xHIS.
La tumeur visée peut être cancéreuse. Il peut par exemple s'agir d'un mélanome, myxofibrosarcome, cancer du sein ou cancer colorectal, ou tout autre tumeur exprimant le marqueur LewisY et/ou Lewisx. La détermination préalable des marqueurs peut être réalisée sur biopsie à l'aide d'anticorps spécifiques tels que le clone F3 (Calbiochem).
L'acide nucléique codant pour une protéine chimère peut également être utilisé pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection virale ou d'une tumeur. II est typiquement administré sous la forme d'un vecteur d'expression, nu (voir EP 465 529). Des techniques de microinjection, électroporation, formulations à l'aide de nanocapsules ou de liposomes sont d'autres techniques disponibles. Le vecteur d'expression peut également être sous la forme d'un virus recombinant. Le vecteur viral peut être par exemple choisi parmi un adénovirus, un rétrovirus, en particulier un lentivirus, ainsi qu'un virus adéno-associé (AAV), un virus de l'herpès (HSV), un cytomégalovirus (CMV), un virus de la vaccine, etc. De manière avantageuse, le virus recombinant est un virus défectif. La protéine chimère peut en outre être produite in vivo par l'administration de cellules, de préférence provenant ou dérivées des cellules du patient, préalablement transfectées ex vivo avec un acide nucléique ou un vecteur codant pour ladite protéine.
Les figures et exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Légendes des figures - La figure annexée représente un schéma de la construction Def- Lec .
Exemples : Exemple 1 : Clonage du domaine Lectine 1.1. Sous-clonage d'un cDNA DC-SIGN tronquée (domaines C- terminaux coiled-coil + lectine de type C) L'ADNc codant pour les aa63-404 (DC-AN-Term), incluant les domaines C-terminaux coiled-coil et lectine de type C (Soilleux et aI, 2000), et éliminant les segments intracytoplasmique et transmembranaire, a été obtenu par PCR sur les ARNm de cellules KG1 activées par PMA selon Soilleux et al, 2000. Les amorces utilisées étaient: DC-S
GACGTCCCCAGCTCCATAAGTCAGGAACAATCC (SEQ ID NO :52) Site Aatll (souligné) DC-AS (situé à distance du codon stop pour des raisons de Tm) GCGCGCAAGGAACTGTAGCTTAAAAGGGGG (SEQ ID NO :53) Site BssHll souligné L'ADNc, appelé ici DC-AN-Term, a été cloné dans pCRII-Topo et séquencé (voir SEQ ID NO :54). 1.2. Insertion du nonapeptide RKKRRQRRR entre 2 hélices alpha du domaine lectine de Lec Le nonapeptide a été inséré dans la séquence DC-SIGN originelle en
éliminant une alanine (entre les 2 hélices du domaine lectine), en aval d'une glycine et en insérant 2 prolines en aval du nonapeptide proprement dit, de manière à restituer l'environnement du nonapeptide présent dans la protéine Tat. 11 WHDSITACKEVGAQLVVIKSAEEQNFLQLQSSRS (hélices a en caractères gras) 4 l TGC AAA GAA GTG GGG GCC CAG CTC GTC GTA C K E V G A Q L V V Séquence insérée (en gras) AAA GAA GTG GGC AGG AAG AAG CGG AGA CAG CGA CGA AGA CCT CCT CAG CTC GTC GTA K E V G R K K R R Q R R R P P Q L V V Primer PoIyB-DC-AS TTT CTT CAC CCG TCC TTC TTC GCC TCT GTC GCT GCT-5' 5'-AGA CAG CGA CGA AGA CCT CCT CAG CTC GTC GTA Primer PolyB-DC-S 14 35 Les deux amorces PolyB-DC, définis ci-dessous, s'hybrident partiellement entre elles, et l'une et l'autre avec les séquences de raccordement de la DC-SIGN, selon la représentation ci-dessus. Amorce PolyB-DC-AS 5'-TCGTCGCTGTCTCCGCTTCTTCCTGCCCACTTCTTT-3' (SEQ ID NO
:55) Amorce PolyB-DC-S 5'-AGACAGCGACGAAGACCTCCTCAGCTCGTCGTA-3' (SEQ ID 10 NO :56) Deux PCR séparées sont menées sur l'ADNc DC-AN-Term l'une avec le couple d'amorces DC-S et PolyB-DC-AS, l'autre avec le couple PolyB-DC-S et DC-AS. Une PCR par chevauchement est ensuite réalisée sur le mélange des deux types d'amplicons obtenus et avec la paire de primers DC-S et DCAS. Le clonage des amplicons 'Lec' permet de vérifier leur séquence.
1.3. Modélisation bio-informatique de la construction Lec La structure tridimensionnelle du domaine lectine de la DC-SIGN définie par diffraction aux rayons X était disponible (Feinberg et al, 2001). Le 20 fichier Genbank 1K91 permet de recréer l'image 3D de ce domaine. Sur cette base, la déformation apportée par le nonapeptide sur le domaine lectine a été étudiée en utilisant le logiciel Modeller.Model4.top. Différents modèles de structures incluant 5 jeux de boucle nonapeptide ont été générés et il a été possible de définir un modèle beaucoup plus stable 25 que les autres, correspondant à la plus forte probabilité de conformation de la nouvelle lectine Lec. Cette structure laisse voir une extériorisation tout à fait convenable de la boucle RKKRRQRRR (SEQ ID NO :57). De plus, le calcul de la surface exposée aux solvants confirme la bonne exposition de la boucle. 1.4. Construction intermédiaire Lec + peptide signal de la LSLCL 30 + FLAG Sigma: 1) Fusion du domaine peptide signal de la LSLCL, lectine sécrétée (Bannwarth, et al, 1998.), comportant le site de clivage de la 'signal peptidase' + le FLAG Sigma Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, en amont du peptide pour obtenir la protéine S-FLAG-Lec.
2)Cette protéine est liguée dans le vecteur rétroviral auto-inactivant pcSinU3-R-tetO (pcSin-2xlnd). Le domaine U3 du LTR 3' de ce vecteur murin a été complètement délété et remplacé par une séquence originale U3-R de HIV-1. Celle-ci comporte 3 motifs NF-KB et 3 séquences TAR complètes en tandem, suivi d'un domaine 7xtetO2. L'ensemble U3-R-7xtetO2 est suivi d'un site multiple de clonage. Ce vecteur s'est révélé être inductible à la fois par la protéine Tat du HIV-1 et la tétracycline. La protéine Tat est nécessaire pour obtenir l'élongation de la transcription initiée dans le domaine U3. Aucun bruit de fond n'est détecté en l'absence de Tat et de Tet (Dox). Par contre, lorsque les cellules TetR, transduites par la construction, sont soumises à l'infection par le HIV-1, on obtient une induction beaucoup plus intense même en l'absence de doxycycline. Par ailleurs, il est possible d'observer l'induction de ce type de promoteur par la tétracycline dans les cellules exprimant TetR, en l'absence de Tat.
1.5. Construction intermédiaire Lec + peptide signal HA + hexahistidine:
Le vecteur pSHT, aimablement fourni par Philip Bird (Madison, et Bird, 1992), permet d'obtenir la sécrétion cellulaire de protéines d'intérêt grâce à la fusion en N-terminal du peptide signal HA (MAIIYLILLFTAVRG.LD, site de clivage de la signal peptidase marqué par une flèche) de l'hémagglutinine du virus influenza AIJAPAN/305/57 (H3N2), particulièrement propice à la sécrétion (Bird, et al,1987). pSHT: HA signal + ARCS AA GCT TGG ATG GCC ATC ATT TAT CTC ATT CTC CTG TTC ACA GCA GTG Met Ala Ile Ile Tyr Leu Ile Leu Leu Phe Tyr Ala Val .AGA GGG GAT CCC GGG ACT AGT TAA CTA AGA ATT C Arq Gly Asp Pro BamHI Sma? Spe2 EcoRI 35 fière étape- Un site multiple de clonage situé en aval de HA nous a permis d'insérer, entre les sites BamHl et Spel, en phase avec HA, une séquence codant pour l'hexapeptide 6xHistidine et un site EcoRV. Ceci a été réalisé à l'aide d'un long linker obtenus par hybridation des 2 oligonucléotides: 5'-GATCCCCATCATCATCATCATCATTCGATATCGGGA-3' (SEQ ID NO 58) et 5'-CTAGTCCCGATATCGAATGATGATGATGATGATGGG-3' (SEQ ID NO : 59)
GAT CCC CAT CAT CAT CAT CAT CAT TCG ATA TCG GGA GG GTA GTA GTA GTA GTA GTA AGC TAT AGC CCT GAT C BamHI EcoRV SpeI
pour donner le vecteur pSHT-6xHis 2ème étape- Afin de permettre la ligation de la DC-SIGN tronquée dans pSHT en aval de la séquence HA + 6xHis, un site Spel a été inséré dans le vecteur de clonage pZERO-Blunt, entre Notl et Aatll par l'intermédiaire du polylinker: 20 GGCCGCACTAGTACCATGGGATCCATCTGACGT CGTGATCATGGTACCCTAGGTAGAC Notl Spel Ncoi Bard-II Aatn 25 à l'aide des deux oligonucléotides: 5'-GGCCGCACTAGTACCATGGGATCCATCTGACGT-3' (SEQ ID NO : 60) et 5'-CAGATGGATCCCATGGTACTAGTGC-3' (SEQ ID NO : 61)
Sème étape- La Lec est ensuite excisée de pZERO-Blunt par Spel et 30 EcoRl et insérée dans le pSHT-6xHis précédemment construit entre les mêmes sites. 4ème étape- La construction 'HA/6xHis/DC-SIGN-PB' est extraite par Hindlll + EcoRl et insérée dans pcDNA3 entre les mêmes sites -3 pcDCSIGN-PB. 15 35 Résultats intermédiaires le domaine Lec modifié est internalisé dans les CEM HIV+ 1)transfection de pcDC-SIGN-PB dans les cellules HEK-293 et sélection des transfectants stables par le G418. 2)incubation de cellules CEM parentales et de CEM HIV+ (chroniquement infectées) dans les surnageants des HEK-293-DC-SIGN pendant 60 minutes, 2 lavages 3)révélation de la DC-SIGN marquée par une étiquette 6xHis sur les cellules traitées par une solution de paraformaldéhyde 1% en PBS, pendant 20 minutes puis perméabilisées dans le mélange PBS/0,1% triton X100, 5% sérum de veau foetal contenant l'anticorps polyclonal de lapin, purifié par affinité, anti-6xHIS (GENTAUR, Bruxelles), dilué 1:100 pendant 30 min. Enfin, après 2 lavages, incubation avec l'anticorps secondaire immunoglobulines de chèvre anti-lapin/FITC (DAKO, Danemarque) dilué 1:100, pendant 30 minutes. Les cellules étaient analysées en cytométrie de flux (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA). L'internalisation de Lec (DC-SIGN modifiée) dans les seules CEM exprimant le HIV-1 a ainsi été vérifiée.
Exemple 2 : Clonage du domaine Def 2.1. Modification du site de clivage de la défensine par un de ceux reconnus par la protéase du HIV-1: 1)La défensine humaine alpha 3 (HNP3) (ici appelée Def) a été clonée par RT-PCR à partir des ARNm de la lignée promyélocytaire HL60. avec les amorces: Def3-S CACGTGTAGCTAGAGGATCTGTGACCCCAG (SEQ ID NO :62) Pmll souligné Def3-AS CAATTGAAGCTCAGCAGCAGAATGCCCAG (SEQ ID NO:63) Muni souligné Le sous-clonage dans pCRII-TOPO a permis de contrôler la séquence. 2)Afin de conférer un mode d'activation spécifique à Def, le site de clivage qui permet la maturation de la défensine au cours de la différenciation granulocytaire, a été remplacé par un site reconnu par la protéase du HIV-1. Cette protéase est présente non seulement dans la cellule infectée mais également dans le virion dont la maturation est achevée en situation extracellulaire. Le site RKVLFLD (RTp66/INT) a été choisi car il était avantageux d'insérer les acides aminés (aa) VLFL entre les acides aminés R61K62 et D65 de la HNP3 en éliminant les acides aminés N63M64 au niveau du site de clivage originel.
Selon la stratégie déjà utilisée, les 4 acides aminés VLFL sont insérés par PCR par chevauchement. Deux PCR initiales sont réalisées séparément sur un clone Défensine-alpha 3 obtenu précédemment, avec les 2 paires de primers Def3-S + Def-prot-AS et Def-prot-S + Def3-AS. Les 2 types d'amplicons obtenus ont été fusionnés au cours d'une troisième PCR réalisée sur leur mélange avec les amorces Def3-S + Def3-AS Primer Def-prot-AS 3' GGT CCG AGT TCC TTT CAG AAC AAG AAC -5' P G S R K V L F L V L F L D C Y C R GTC TTG TTC TTG GAC TGC TAT TGC AGA 20 Primer Def-prot-S Def-prot-S 5'-GTCTTGTTCTTGGACTGCTATTGCAGA-3' (SEQ ID NO:64) Def-prot-AS 25 5'-CAAGAACAAGACTTTCCTTGAGCCTGG-3' (SEQ ID NO :65) Modification du site de clivage de Def par un de ceux reconnus par la protéase NS3 du virus de l'Hépatite C (HCV) Le génome du HCV, virus appartenant à la famille des Flaviviridae, 30 est entièrement transcrit en un seul ARN messager puis traduit en une polyprotéine qui est ensuite découpée par une métalloprotéase cellulaire et la sérine protéase virale NS3 (Penin, et al, 2004). La protéase virale a fait l'objet de nombreux travaux, elle clive les sous-peptides NS4A, NSAB, NS5A et NS5B. Les différents sites de clivage reconnus par NS3 permettent de définir la séquence consensus: (DIE))O(XXC(A/S), (Urbani, et al, 1997). La séquence retenue pour modifier le site de clivage de la défensine 5 selon la stratégie ci-dessus a été: P6 Pi' RKNMDCYC -3 lKEDVVCCSMCYC (les aa soulignés sont conservés). originale -4 modifiée (les aa requis sont représentés en caractères gras) Résultats : Le domaine Def modifié par le site RKVLFLD, clivable par la 10 protéase du HIV-1 était transfecté dans les cellules CEM pour être testé. 1)construction de DefRKVLFLD dans le vecteur rétroviral pMSCV-puro (CLONTECH) entre les sites Bglll et Hpal 2)transfection dans les cellules d'encapsidation GP2-293 (CLONTECH) et sélection de transfectants stables, rapidement obtenus par la 15 sélection puromycine. L'expression correcte de la Défensine modifiée est vérifiée: les ADNc obtenus par RT-PCR à l'aide des amorces Def3-S et Def3-AS sont séquencés et s'alignent à 100% avec la séquence attendue; de plus, la protéine Défensine alpha3 est détectée, dans les cellules GP2-293-Def+ perméabilisées, à l'aide de l'anticorps monoclonal Def-3 (BMA Biomedicals AG, 20 Augst, Suisse). Les cellules GP2-293-Def+ ainsi contrôlées ne manifestent aucun effet cytopathique (ECP), preuve de l'absence de clivage de la proDéfensine alpha3 modifiée dans les cellules parentales. 3)Les cellules GP2-293-Def+ sont surtransfectées par le clone moléculaire infectieux HIV-1 pLN4.3. Après 3 jours de sous-culture, des plages 25 de lyse sont observées. 4) Les cellules GP2-293-Def+ sont surtransfectées, de façon transitoire, par un plasmide capable d'exprimer la glycoprotéine VSV-G, afin d'obtenir des surnageants contenant les pseudotypes capables d'infecter des cellules T CEM pour obtenir les CEM-Def+. 5)Les CEM-Def+ sont sélectionnées par la puromycine; 5 clones sont choisis et soumis à l'infection HIV-1 avec le surnageant de la lignée chroniquement productrice CEMLAI. Des cellules CEM parentales nontransfectées par Def sont également infectées. La lignée CEM ne montre aucun ECP avec la souche HIV-1 LAI et la production virale est chroniquement entretenue grâce à l'ajout périodique (2 fois par semaine) de cellules CEM fraîches. 6)A partir du deuxième jour après infection, aucun ECP n'est observé sur les CEM parentales ; par contre, d'énormes polycaryons sont observés 10 dans les clones CEM-Def+. 7)Au cours des jours suivants, plus de 70% de la population CEMDef+ est lysé.
Exemple 3 : Constructions Lec-Def: 15 Selon le schéma de la figure annexée, les domaines Lec et Def modifiés sont fusionnés, Lec en position C-terminale, Def en N-terminal, et séparé de Lec par le peptide de clivage sensible à la protéase mise en jeu dans le ciblage prévu. L'ensemble est précédé par la cassette Signal peptide + hinge (SiHi) de la LSLCL (aa 1-106), (Bannwarth, et al, 1998). Cette cassette 20 permet de conférer à Lec-Def la double propriété de la LSLCL: protéine à la fois sécrétée et accumulée dans le cytoplasme. De plus, une séquence FLAG (Sigma) est insérée entre les aa 24 et 25 de la cassette SiHi. Un exemple de liaison entre les domaines Def et Lec est celui réalisé pour la chimère Lec-Def anti-HIV à l'aide d'un peptide linker décrit ci-dessous 25 pour lier le site RKVLFL entre les sites Fspl C-terminal de Def et Aatll N- terminal de Lec. 1ère étape: insertion du FLAG dans le SiHi, au moyen d'une PCR par chevauchement et à l'aide des 2 oligonucléotides LSFIag-int-S et LSFIag-int-AS. 30 LSFIag-int-S LSFIag-int-AS 1 GGG GCT CGG GGA GAC GCA TAC AAG GAC GAT GAC GAC MG GAG AGG GAG TGG (SEQ ID NO :66)
2ème étape: insertion du linker Bsu36I-Fspl-Aatll-Xhol entre le site Bsu361, disponible en C-terminal de SiHi, et Xhol, résiduel dans le vecteur de construction. CCTGAGTGCGCAGACGTCTCGAG (SEQ ID NO :67) GGACTCACGCGTCTGCAGAGCTC Bsu36I Fspl Aatll Xhol à l'aide des oligonucléotides Bs-Xho-S (TGAGGACGTCGATATC, SEQ ID NO : 68) et Bs-Xho-AS (TCGAGATATCGACGTCC, SEQ ID NO:69), pour obtenir le linker : TGAGGACGTCGATATC CCTGCAGCTATAGAGCT 3ème étape: insertion de la prodéfensine alpha 3 modifiée par RKVLFL (proDEF = aa20-96 sans peptide signal), entre Bsu36I et Fspl, préparée par PCR à l'aide des oligonucléotides : ProDef3-S (CCTGAGGACGAGCCACTCCAGGCAAGAGCT, SEQ ID NO :70, site Bsu36I souligné ) et ProDef3-As (TGCGCAGCAAAATGCCCAGAGTCT, SEQ ID NO :71, site Fspl souligné) 4ème étape: insertion du peptide linker RKVLFL (SEQ ID NO :72), décrit ci-dessous entre Fspl et Aatll, afin d'assurer la fusion proprement dite entre les domaines Def et Lec par l'intermédiaire d'un site reconnu par la protéase du HIV-1 TTT TGC TGC GCA AGG AAA GTC TTG TTC TTG GAC GTC F C C A R K V L F L D V Fspl Aatll
région simple soulignée mm C-terminale Def région double soulignée = N-terminale Lec
peptide linker: GCA AGG AAA GTC TTG TTC TTG GAC GT CGT TCC TTT CAG AAC AAG AAC C A R K V L F L D 30 CCC p AGC s ème étape: ligation de Lec (modifiée par le nonapeptide RKKRRQRRR) entre les sites Aatll, disponible en N-terminal de Lec, et Xhol, en C-terminal.
SiHi-Def-Lec est séquencée dans les 2 sens sur un AbiPrism 3100 (Applied 5 Biosystems) complète (SEQ ID NO :50).
Afin d'obtenir une expression constitutive de la chimère Def-Lec, la construction SiHi-Def-Lec est insérée dans le vecteur rétroviral pMSCV (Clontech) entre les sites Bg1II et Xhol (pM-SiHi-Def-Lec) en mettant à profit le site BamHI, résiduel en 5' de SiHi-Def-Lec, compatible avec Bglll, et XhoI, résiduel en 3'. Des cellules HEK-293 sont transfectées avec pM-SiHi-Def-Lec. La protéine SiHi-Def-Lec (55 kD) est identifiée dans les surnageants de ces cellules par Western-blot. Pour ce faire, la protéine de 55kD est immunoprécipitée à l'aide de billes Protein A-agarose (Sigma) sensibilisées par l'anticorps polyclonal LeukC préparé contre le peptide ARGAEREWEGGWGGAQEE (Bannwarth, et al, 1998), présent dans le domaine SiHi. Après élution, électrophorèse dans un gel dénaturant et transfert sur membrane Problott (Applied Biosystems), la protéine de 55kD est révélée à l'aide de l'anticorps monoclonal anti-FLAG (Sigma). Les surnageants sont incubés avec des cellules CEM chroniquement productrices de HIV-1. Un nombre significatif de cellules sont lysées par rapport au contrôle cellules CEM parentales. Les surnageants de cellules HEK-293 transfectées avec pM-SiHi-Def-Lec sont mélangés à 50% (v/v) avec des surnageants infectieux de cellules CEM chroniquement productrices de HIV-1. La réduction des titres infectieux est testée sur cellules P4, qui sont des cellules HeLa transduites pour exprimer le récepteur CD4 et le gène lacZ sous le contrôle d'un promoteur U3-R de HIV-1 (Dragic et aI, 1992). Ces cellules permettent de titrer facilement le nombre de particules infectieuse en fonction des foyers colorés par le substrat de IacZ.
C'est ainsi qu'une réduction de titre infectieux est observée après traitement avec SiHi-Def-Lec, en comparaison avec des surnageants infectieux non traités et des surnageants de cellules CEM non-infectées.
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Claims (28)
1. Protéine chimère isolée comprenant (i) un domaine, désigné Lec , de liaison cellulaire d'une lectine et (ii) un domaine d'une défensine, désigné Def , activable, induisant la lyse des membranes cellulaires ou agents infectieux.
2. Protéine selon la revendication 1, comprenant en outre une séquence d'internalisation cellulaire insérée dans ledit domaine de liaison cellulaire.
3. Protéine selon la revendication 2, dans laquelle ladite séquence d'internalisation est un peptide de 7 à 12 acides aminés, essentiellement basiques.
4. Protéine selon la revendication 3, dans laquelle ladite séquence d'internalisation est la séquence RKKRRQRRR (SEQ ID NO :3).
5. Protéine selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle le domaine de liaison est le domaine extracellulaire de la lectine.
6. Protéine selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle la lectine est une lectine humaine DC-SIGN.
7. Protéine selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle la défensine est la défensine humaine alpha 3.
8. Protéine selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le domaine 30 de lyse de la défensine comprend une séquence de clivage qui (i) est reconnue par une protéase virale et qui (ii) remplace la séquence25naturelle de clivage qui permet la maturation de la défensine au cours de la différenciation granulocytaire.
9. Protéine selon la revendication 8, dans laquelle la séquence de clivage reconnue par une protéase virale est une séquence reconnue par une protéase choisie parmi une protéase de HIV-1, de HCV, ou du virus de la Dengue.
10. Protéine selon la revendication 9, dans laquelle ladite séquence de clivage est reconnue par la protéase de HIV-1, et est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 9 à SEQ ID NO : 22.
11. Protéine selon la revendication 9, dans laquelle ladite séquence de clivage est reconnue par la protéase NS3 de HCV, et est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 23 à SEQ ID NO : 27.
12. Protéine selon la revendication 9, dans laquelle ladite séquence de clivage est reconnue par la protéase NS3 du virus de la Dengue, et est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 28 à SEQ ID NO : 44.
13. Protéine selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle le domaine de lyse de la défensine comprend une séquence de clivage qui est (i) reconnue par une métalloprotéase surexprimée par les cellules tumorales, et (ii) remplace la séquence naturelle de clivage qui permet la maturation de la défensine au cours de la différenciation granulocytaire, ce qui rend le domaine de lyse activable par ladite métalloprotéase.
14. Protéine selon la revendication 13, dans laquelle la séquence de clivage reconnue par une métalloprotéase est choisie parmi les séquences SEQ ID NO:46àSEQIDNO:49.
15. Protéine selon l'une des revendications 1 à 14, dans laquelle le domaine Def est en position N-terminale et le domaine Lec est en position C-terminale, une séquence d'activation du domaine Def séparant les deux domaines Def et Lec .
16. Protéine selon l'une des revendications 1 à 14, dans laquelle le domaine Def est en position C-terminale et le domaine Lec est en position N-terminale, une séquence d'activation du domaine Def séparant les deux domaines Def et Lec .
17.Protéine selon la revendication 1, comprenant la séquence SEQ ID NO :51 .
18. Acide nucléique isolé, codant pour une protéine telle que définie à l'une 15 des revendications 1 à 17.
19.Acide nucléique selon la revendication 18, la séquence codant les domaines Lec et Def étant sous le contrôle d'un promoteur inductible ou tissu-spécifique.
20.Acide nucléique selon la revendication 19, ledit promoteur étant inductible par la protéine Tat du virus HIV-1.
21.Acide nucléique selon la revendication 20, ledit promoteur comprenant 25 les éléments suivants, de 5' vers 3': 3 éléments NF-KB, 1 élément PEA3, 3 éléments SPI et 3 éléments TAR.
22.Acide nucléique selon la revendication 20, qui comprend la séquence SEQ ID NO :50.
23. Cellule hôte comprenant un acide nucléique tel que défini à l'une des revendications 18 à 22. 10 20 30
24. Procédé in vitro de production d'une protéine chimère telle que définie à l'une des revendications 1 à 17, ledit procédé comprenant la transfection d'une cellule hôte avec un acide nucléique codant pour ladite protéine, 5 dans des conditions permettant son expression.
25. Utilisation d'une protéine chimère telle que définie à l'une des revendications 1 à 17, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection ou d'une tumeur.
26. Utilisation selon la revendication 25, l'infection étant une infection virale par le virus HIV, le virus HCV ou le virus de la Dengue.
27. Utilisation d'un acide nucléique codant pour une protéine chimère telle 15 que définie à l'une des revendications 1 à 17, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement d'une infection ou d'une tumeur.
28. Utilisation selon la revendication 27, l'infection étant une infection virale par le virus HIV, le virus HCV ou le virus de la Dengue. 10 20
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