CN103180340A - 细胞内免疫 - Google Patents

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Abstract

一种含有配体和RING结构域和/或TRIM21表达的诱导子的化合物，如果所述配体不是TRIM21的PRYSPRY结构域，所述配体直接或间接地特异地结合病原体抗原。

Description

细胞内免疫
技术领域
本发明涉及化合物，其是特异于病原体的配体与RING结构域的缀合物。在一个实施方式中，RING结构域衍生自TRIM多肽，例如TRIM21。
背景技术
病毒及其宿主共同进化了数百万年，这导致了免疫复合系统传统地分为固有和适应性反应1。固有免疫包括识别病原体相关分子模式或PAMPs的种系编码的受体和效应子机制2。固有免疫的优点是其迅速且普适；但是，病毒善于通过抑制固有免疫或通过改变其分子模式来躲避识别。相反地，适应性免疫能够“治愈”感染的宿主并提供保护以免于将来的感染。与固有免疫的PAMP受体不同，适应性免疫利用如抗体的蛋白质来靶向病原体。人类中的抗体是独特的，在于其在个体的生命过程中进化，能够持续靶向进化的病原体3。适应性免疫的弱点在于其花费1－2周以达到完全的效果。而且，最近100年抗体免疫的教义是抗体仅仅提供细胞外保护1。认为一旦病毒进入细胞溶质，抗体就不能预防其感染。
已经开发了细胞内抗体；例如，参见Moutel S,Perez F.,Med Sci(Paris).2009Dec;25(12):1173-6;Stocks M.,Curr Opin Chem Biol.2005Aug;9(4):359-65。但是，使用细胞内抗体或胞内抗体（intrabody）的结果被混合了。一般地，开发细胞内抗体的尝试着眼于单链抗体片段，例如scFv，以及单一结构域抗体，例如VHH抗体和dAbs。
抗体和免疫血清被长时间用于治疗病原体感染。例如，在1890年代马抗血清被用于治疗破伤风和白喉。但是，抗血清被人免疫系统视为外源性的，其通过产生对抗其的抗体进行反应，特别是在重复剂量时。在20th世纪的大多数时期，动物抗体的副作用促进了来自供体的人抗血清的使用，这些供体是疾病的恢复者，典型地用于呼吸道和B型肝炎感染的预防。在由于毒性的问题而使抗体疗法的普及降低之后，人源化和人抗体消除了这些问题，并导致这些治疗方法的恢复。参见Casadevall等人，Nature Reviews Microbiology2,695-703（2004九月）用于回顾。使用抗体疗法所靶向的疾病包括炭疽、百日咳、咳嗽、破伤风、肉毒中毒（Botulism）、隐球菌病、隐孢子虫病、肠病毒的胃肠道感染、链球菌群感染、坏死性筋膜炎、B型肝炎、麻疹、肺结核、脑膜炎、再生障碍性贫血、狂犬病、RSV感染、肺炎、带状疱疹、水痘和VZV引起的肺炎、和天花。虽然有这些发展，但是，仅仅当没有其它适合的疗法存在时才考虑抗体疗法，其需要大剂量抗体并产生不可预期的结果。
抗病原体的抗体有效性被理解为至少部分依赖于抗体Fc部分，该部分负责介导补体的作用。因而，尽管其具有小尺寸和较低的生产成本的优点，通常并不提议将抗体片段用于抗病毒疗法。
病毒疾病的初级疗法仍然是接种，其是预防性的方法。相信由抗原提呈细胞如树突细胞处理的病毒抗原被提呈至免疫系统并诱导初始T细胞（
Figure BDA00002945915300021
T-cells）分化为记忆和效应T细胞。记忆T细胞负责对次级感染的更攻击性的和迅速的免疫反应，介导接种的益处。参见Kaech等人Nature Reviews Immunology,volume2,四月2002,251用于回顾。
另一种对感染疾病疗法的基于免疫的方法是细胞因子的应用，包括干扰素。干扰素是首先被提议用于治疗癌症和多发性硬化，以及病毒感染的。从1998年起已被许可用于C型肝炎的治疗。而且，尤其在东欧，施用低剂量的口服或鼻内干扰素用于感冒和流感的治疗。但是，其作用机制不清楚，因为所用的剂量被认为低于可观察到抗病毒效果的剂量。O'Brien等人，J Gen Virol.2009Apr;90(Pt 4):874-82使用干扰素作为抗VEEV腺病毒递送的疫苗的佐剂；他们观察到抗病毒保护中的降低，但在对病毒载体的免疫反应中的增强。
最近，我们描述了一种称为TRIM21的细胞内细胞溶质蛋白，其能够通过它的PRYSPRY结构域结合抗体分子的不变区域4。我们发现该活性在哺乳动物当中是结构、热动力学和动力学保守的5。已经提出了对TRIM21功能的假设，包括其参与凋亡以及将B细胞中产生的未折叠IgG引导到蛋白酶体中的作用。
发明内容
抗体是细胞外蛋白，其全部为已知的哺乳动物IgG受体（FcRn除外，其是细胞内的但不是细胞溶质的）。因而，对于我们而言似乎是不一致的，因为TRIM21应该普遍是保守的细胞内蛋白，且仍然是高亲和性、高特异性的IgG受体。我们假设可能是目前对抗体免疫的理解是不完全的，存在一些发生在细胞内的由TRIM21介导的“不明（missing）”免疫系统。文中呈现的数据证明这种不明的免疫系统的存在，并证明了其在预防两种不相关病毒—dsDNA腺病毒和ssRNA克萨奇病毒—感染中的活动。
因而，在本发明的第一方面，提供了一种化合物，其包括：
（a）配体，如果所述配体不是TRIM21的PRYSPRY结构域，则其直接或间接地特异地结合于病原体的抗原；和
（b）RING结构域和/或TRIM21表达的诱导子。
我们表明TRIM21是对免疫球蛋白高亲和性的配体。TRIM21的RING结构域是E3连接酶，其是泛素化的，且将免疫球蛋白与其结合的抗原一起引导至蛋白酶体。
根据本发明，至少一个RING结构域，例如TRIM多肽的RING结构域能够结合针对抗原的配体。这种配体优选直接结合抗原，并可以包括免疫球蛋白分子的至少一部分；但是，可以使用其它配体，包括肽、基于肽和核酸的适体（aptamer）、天然发生的配体、受体及其结合片段。
在另一个实施方式中，配体间接地结合抗原。例如，配体可非特异性地结合免疫球蛋白，例如结合免疫球蛋白的Fc部分。在该实施方式中，配体不是TRIM21的PRYSPRY结构域。示例性的配体包括蛋白A、蛋白G、蛋白L、肽，例如识别免疫球蛋白Fc区域的、抗Fc抗体及其片段的肽、等等。在此情况下，由对病原体抗原特异的抗体或抗体片段提供靶向特异性。这种抗体可以与本发明的化合物共同施用，或可以是天然发生的。
在本发明的上下文中，术语“配体”用于指结合对当中两个中的任一个。
当配体是免疫球蛋白时，其可以是任何免疫球蛋白分子，例如选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、F(ab')2、Fab、Fv、scFv、dAb、VHH、IgNAR、TCR及其多价组合的免疫球蛋白分子。多价抗体包括，例如二价抗体和抗体片段、双特异抗体和抗体片段、其三价版本、以及如双价抗体（diabody）的专有形式。单一结构域抗体，例如dAbs和VHH抗体，特别适合结合以形成多价和/或多特异性的分子。
当配体是抗体时，抗体分子包括VH结构域和VL结构域、或其等同物中的至少一个。
在一个实施方式中，TRIM多肽选自TRIM5α、TRIM19、TRIM21和TRIM28。尽管由于其抗体结合特性，优选TRIM21，但是如果多肽或其结构域本身结合其抗原或对抗原特异的配体，则不再需要抗体结合能力。在这样的情况中，可以使用来自TRIM多肽的RING结构域，而不是TRIM21，以达到相同的作用。有利地，还可增加其它结构域，如B盒结构域或卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋结构域负责TRIM21的二聚化。
优选地，RING结构域在根据本发明的化合物上以两个或更多拷贝出现。通过其卷曲螺旋结构域发生TRIM21的二聚化，且有助于蛋白通过E3介导的泛素连接靶向至蛋白酶体。
在一个实施方式中，本发明的化合物包括基本上完整的TRIM多肽，其中PRYSPRY（B30.2）结构域被抗原或抗原特异的配体所取代。例如，其能够被包含VH结构域和VL结构域中的至少一个的抗体所取代。
在进一步的实施方式中，本发明的化合物包含TRIM表达的诱导子，而非TRIM结构域，或者也包含TRIM结构域。TRIM21的表达被干扰素上调，因而TRIM表达的诱导子有利地是干扰素或干扰素诱导子。本领域中已知多种干扰素诱导子，包括细菌多糖和核苷类似物例如聚I：C。
干扰素诱导子可细胞内发挥作用，或在细胞表面发挥作用。当干扰素诱导子在细胞表面发挥作用时，向受试者施用的化合物的至少一部分停留在细胞表面，结合于干扰素诱导子受体。在一个有利的实施方式中，干扰素诱导子可通过不稳定的连接结合于化合物，例如在生理条件下具有有限半衰期的连接。例如，半衰期将足以使配体结合至病原体以及结合至干扰素受体，但没有显著地更长。
在第二个方面中，提供了一种用于治疗病原体感染的方法，其包括向受试者施用根据本发明第一方面的化合物。
相似地，提供了根据本发明第一方面的化合物用于在受试者中诱导免疫反应的用途。
在第三方面中，本发明提供了用于在受试者中治疗感染的方法，包括向受试者联合施用对引起所述感染的病原体抗原特异的抗体，以及包含结合所述抗体的配体和RING结构域的多肽。
相似地，提供了对在受试者中引起感染的病原体的抗原特异的抗体，和包含结合所述抗体的配体和RING结构域的多肽用于治疗所述感染的用途。
我们证明了用病毒特异性抗体和野生型的或修饰的TRIM21的细胞治疗导致了病毒感染性的抑制，甚至在内源TRIM21被敲低（knockdown）的细胞中。相应地，TRIM21的联合施用可被用于增强用于治疗感染性疾病的抗病毒疗法。
在第四个方面中，提供了用于在遭受感染的受试者中治疗这种感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的包含间接结合病原体抗原的配体和RING结构域的多肽。
相似地，提供了包含间接结合病原体抗原的配体和RING结构域的多肽用于在受试者中治疗感染性疾病的用途。
优选地，包含TRIM21的PRYSPRY结构域和RING结构域的多肽包含TRIM多肽的其它结构域，例如来自TRIM21的。在一个实施方式中，多肽包含卷曲螺旋结构域和/或B盒结构域。在一个实施方式中，多肽是TRIM21，优选人TRIM21。
以前没有提出过TRIM21具有抗感染特性。但是，如文中所示，其以非常高的亲和性结合至IgG和IgM的Fc受体，并将抗体以及任何结合的抗原引导至蛋白酶体。因而，外源TRIM21增强了内源抗体对病原体的反应。
我们的结果揭示了存在不明的细胞内免疫系统，通过所述免疫系统抗体介导被感染细胞的细胞溶质内的病毒中和。该细胞内系统结合了传统地独占地与适应性或固有的免疫相关的性质。通过适应性免疫以抗体的形式提供病原体靶向，而由细胞内受体（TRIM21）和固有的降解途径提供中和。TRIM21不同于其它抗体效应子机制，其是系统的并基于免疫监视。TRIM21在大多数细胞中表达，且并不仅仅是专门的免疫细胞，这意味着每一次感染事件是一个中和的机会。包裹于宿主细胞中的免疫可能对抑制病毒的扩散是非常重要的。最后，TRIM21既利用IgM又利用IgG，表明其既与感染早期阶段的固有免疫一并行动，又与适应性免疫一并行动，以提供长期保护。
在最近100年，TRIM21已经促成了许多抗体中和实验。事实上，如我们所看到的，TRIM21介导有力的腺病毒的抗体中和，重新评价是否其它病毒的抗体中和是由进入的阻断所引起的，或者是否是TRIM21依赖的，将是重要的。在疫苗设计中这可能是一个重要的考虑，因为有效的疫苗可能需要刺激TRIM21免疫。我们表明在其它病毒的抗体中和中，TRIM21参与的良好预测物将是干扰素和抗体间的协同关系。事实上，已经报道了对于单纯疱疹病毒8、肠病毒708和辛德比斯病毒9的干扰素和抗体间的未解释的协同性。TRIM21可能还增进了没有添加抗体的实验中的病毒中和，因为在常规组织培养中所用的胎牛血清含有潜在交叉反应特异性的抗体库（repertoire）。
TRIM21/抗体细胞内免疫反应的存在可能有助于解释在病毒感染中一些未解释的现象。已经报道了，甚至当允许病毒预粘附于靶细胞时，发生了脊髓灰质炎病毒10和呼吸道合胞体病毒11的抗体中和。还观察到单一的IgG足以介导脊髓灰质炎病毒12和腺病毒13的中和，对于鼻病毒仅需要5－6个IgG分子14。最后，有许多完整抗体比其蛋白降解片段远远更有效的报导，甚至比维持二价抗原结合的Fab2更有效。例如，已经表明Fab2片段在中和黄热病毒15、HSV16和流感病毒17中没有完整的IgG有效，表明Fc结构域效应子有效的中和功能。TRIM21介导的降解可能解释所有这些现象。
附图说明
图1：TRIM21介导细胞内抗体中和。（A）腺病毒感染的HeLa细胞的共聚焦显微镜图像。可以在细胞内看到预包被于抗体、且在感染后用次级Alexa-fluor546（红色）检测的腺病毒。以绿色表示内源性TRIM21的位置，蓝色表示DAPI染色的核。这些通道的融合表明TRIM21定位于抗体包被的病毒颗粒。图像是Z投影，在缩放框中比例尺是10μm和2μm。（B）用IFNα、TRIM21siRNA(KD)、siRNA对照（HeLa）或IFNα&TRIM21siRNA（IFNαKD）处理的细胞在不同的多克隆抗体浓度下感染GFP腺病毒。通过测量GFP阳性细胞百分比确定感染水平，对于每个条件，相对于不存在抗体的水平进行归一化。在TRIM21表达水平最高的细胞中，腺病毒感染降低了2-log。（C）在每个条件下的TRIM21蛋白水平的Western印迹。（D）在浓度渐增的人血清IgG存在下用克萨奇病毒处理的细胞的感染。IFNα和抗体协同作用来中和病毒。通过特异地敲低TRIM21来逆转该作用。
图2：TRIM21不依赖细胞类型和抗体中和感染。（A）在抗体存在下，TRIM21的中和通过敲低被逆转，不依赖于siRNA序列或siRNA比shRNA。（B）TRIM21在三种不同细胞系中中和腺病毒感染。通过IFNα增强中和，而通过敲低（KD）逆转中和。（C）当使用不同的多克隆或抗六邻体（Hexon）单克隆IgG时，TRIM21中和腺病毒感染。（D）与TRIM21介导的中和相比，进入中和（entry neutralisation）极小。病毒的抗体依赖的TRIM21中和需要Fc结构域的存在。Fab2片段是二价的，对于进入中和具有与完整IgG相同的潜能，但是其对感染表现出有限的作用。通过敲低TRIM21确认了这一点，敲低逆转了IgG的中和。（E）TRIM21结合血清IgM。IgM与TRIM21的结合测定为荧光各向异性的改变，并拟合至标准二次表达式（Materials&Methods）以给出16.8μM±1.5μM的亲和性。（F）TRIM21也能够使用血清IgM抗体来中和病毒。TRIM21的敲低（KD）逆转了该作用，而IFNα增强了它。从一式三份的实验中计算所有组（panel）中的误差棒。（G）TRIM21还可以使用IgA抗体来中和病毒。使用siRNA（siTRIM21）的TRIM21的敲低逆转了该作用，而IFNα增加了它。对照siRNA（si对照）没有作用。
图3：TRIM21的中和机制。（A）TRIM21（黑色）、IgG（浅灰）以及TRIM21与IgG的复合体（深灰）的SEC MALS色谱。连续轨迹代表RI信号（左侧轴），并且是蛋白浓度的指示。短的水平线代表在每个峰值内在每个取样间隔（1s）处的计算质量（右侧轴）。分析表明TRIM21是质量为107kDa的二聚物，IgG具有154kDa的质量，以及TRIM21：IgG复合体产生这样一个峰值，其对应着游离IgG和质量为～280kDa的1：1复合体。（B&C）用全长TRIM21（左侧）和ΔRING-ΔBOX TRIM21（右侧）的IgG稳定状态的荧光滴定。滴定拟合至标准二次表达式（Materials&Methods）得出全长TRIM21对抗体的亲和性为0.6±0.1nM（B）以及对于ΔRING-ΔBOX TRIM21而言亲和性为0.9±0.2nM（C）。（D）蛋白酶体抑制剂MG132逆转了TRIM21的中和，但自噬抑制剂3-MA不能。从一式三份的实验计算误差棒。（E）MG132浓度和TRIM21中和逆转之间的直接相关性。MG132仅逆转抗体存在时的中和。（F）蛋白酶体的降解，TRIM21和抗体在相同的病毒中和途径中是必要的因子。例如，TRIM21的敲低避免了MG132的作用。
图4：TRIM21E3泛素连接酶功能对于病毒中和是重要的。（A）重组全长TRIM21中和病毒，但缺少RING和B盒结构域的TRIM21不能。（B）TRIM21是活性E3连接酶，但RING和B盒结构域的缺失防止了自身泛素化。（C）感染期间，TRIM21不直接将六邻体或其相关抗体泛素化。（D）共聚焦显微镜Z投影表明HeLa细胞感染有抗体包被的腺病毒。TRIM21共定位（co-localised）的病毒颗粒对于泛素是阳性的。（E）感染后1－6小时，六邻体、抗体和TRIM21蛋白水平的Western印迹。腺病毒六邻体蛋白和抗体以TRIM21依赖的方式快速降解。MG132的添加部分地缓和了降解。降解不显著影响TRIM21的细胞池（pool）。
图5：细胞内抗体包被的珠召集TRIM21，且是泛素化的。链霉亲和素缀合的乳胶珠包被有抗链霉亲和素抗体并转染到细胞内。细胞内珠被TRIM21识别，并与泛素共定位。缩放框中的比例尺代表10μm和5μm。
具体实施方式
除了另有说明，文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在本发明的实践或测试中可以使用任何相似于或等同于文中描述的方法或材料。现在描述适合于该用途的方法、装置和材料。所有文中引用的出版物以其整体并入文中做参考，目的在于描述和公开可能与本发明联合使用的出版物中报道的方法学、试剂和工具。
除非另外指明，本发明的实践采用本领域技术人员已知的化学、生物化学、分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学和药理学的传统方法。这些技术在文献中已有充分的解释。参见，例如Gennaro,A.R.,编辑(1990)Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.；Hardman,J.G.,Limbird,L.E.,和Gilman,A.G.,编辑(2001)The Pharmacological Basis of Therapeutics,第10版,McGraw-Hill Co.；Colowick,S等人编辑,Methods In Enzymology,Academic Press,Inc.;Weir,D.M.,和Blackwell,C.C.编辑(1986)Handbook of ExperimentalImmunology,Vols.I-IV,Blackwell Scientific Publications；Maniatis,T.等人编辑(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版，Vols.I-III,Cold Spring HarborLaboratory Press；Ausubel,F.M.等人编辑(1999)Short Protocols in MolecularBiology,第4版，John Wiley&Sons；Ream等人编辑.(1998)Molecular BiologyTechniques:An Intensive Laboratory Course,Academic Press；Newton,C.R.,和Graham,A.,编辑(1997)PCR(Introduction to Biotechniques Series),第2版Springer Verlag。
在本发明的上下文中，根据将被施用的试剂（reagent）、化合物或基因构建体，通过细胞培养的标准技术进行施用。例如，可以通过加入到细胞培养基、通过磷酸钙沉淀、通过电穿孔、通过病毒转导或通过其它方法导入细胞内进行施用。如果本发明的方法采用非人哺乳动物作为测试系统，哺乳动物可以是转基因的，并在其内源性细胞中表达必要的试剂。
在本发明的上下文中，抗原是能够被配体识别的分子，其具有病原体特异的表位。典型地，抗原是病原体如病毒或细菌的抗原决定簇，在生理条件下其暴露以被配体如抗体结合。优选的抗原包括被已知的病原体特异的中和抗体或疫苗靶向的表位。
病原体可以是任何异源体，如生物体，例如细菌或原生动物、或病毒，其能够感染受试者。有利地，病原体是病毒。病毒可以是有包膜的或无包膜的。在一个实施方式中，病原体是无包膜的病毒。
直接结合抗原的配体是在生理条件下能够特异地结合抗原的配体。如文中所述，术语“配体”可以指特异性结合对的两部分的任一个；例如，其可以指抗体－抗原对中的抗体或抗原。抗体是优选的配体，且可以是本领域已知的完整抗体或抗体片段，包括例如IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、F(ab')2、Fab、Fv、scFv、dAb、VHH、IgNAR、修饰的TCR、和其多价组合物。配体还可以是基于可选的非免疫球蛋白支架、肽适体、核酸适体、在非肽骨架上衬（subtend）有多肽环的结构多肽、天然受体或其结构域的结合分子。
间接结合抗原的配体是通过第二配体结合抗原的配体。例如，它是结合抗体的配体。配体以非依赖抗体结合特异性的方式结合抗体；例如，其能够结合Fc区。在一个实施方式中，配体选自蛋白G、蛋白A、蛋白L、TRIM21的PRYSPRY结构域、抗免疫球蛋白抗体、以及特异识别抗体的肽，例如在Fc区域中。
TRIM21的PRYSPRY结构域由PRY和SPRY区组成，其分别位于如SEQ IDNo.1所示的人TRIM21氨基酸序列的286-337和339-465位置。
RING结构域是如SEQ ID No.1所示的人TRIM21氨基酸序列的氨基酸15和58之间的人TRIM21。
BBOX结构域是如SEQ ID No.1所示的人TRIM21氨基酸序列的氨基酸91和128之间的人TRIM21。
卷曲螺旋结构域是如SEQ ID No.1所示的人TRIM21氨基酸序列的氨基酸128和238之间的人TRIM21。
术语“免疫球蛋白”指保留抗体分子免疫球蛋白折叠特性的多肽家族，其含有两个β片层，以及通常地，一个保守的二硫键。免疫球蛋白超家族成员涉及体内细胞和非细胞相互作用的许多方面，包括免疫系统中普遍的作用（例如，抗体、T细胞受体分子等）、涉及细胞粘附（例如ICAM分子）和细胞内信号传导（例如，受体分子、例如PDGF受体）。本发明可适用于所有的具有结合结构域的免疫球蛋白超家族分子。优选，本发明涉及抗体。
如果在生理条件下靶向抗原导致基本上排它的靶向病原体，则抗原是病原体特异的。
免疫球蛋白的重链和轻链的可变结构域，以及在其它蛋白中的等同物，例如T细胞受体的α和β链，负责决定抗原结合特异性。VH和VL结构域能够独立地结合抗原，如在VH和VL dAbs中。VH和VL结构域的参考包括VH和VL结构域的修饰版本，无论是合成的或是天然发生的。例如，天然发生的VH变体包括骆驼科（camelid）VHH结构域，以及软骨鱼的重链免疫球蛋白IgNAR。
TRIM多肽是蛋白的三重基序（TRIM）家族的成员，其包括人基因组中70个成员，包括TRIM21（Ro52）。TRIM蛋白参与多种细胞过程，包括细胞增殖、分化、发展、瘤形成和凋亡。TRIM蛋白是多结构域的，如此称谓是由于它们保守的N端RBCC结构域：编码E3泛素连接酶活性的RING指、B盒以及介导低聚化的卷曲螺旋结构域。C端PRYSPRY或B30.2结构域通常通过作为靶向模块发挥作用来决定不同TRIM多肽的功能。参见Nisole等人Nature Reviews Microbiology3,799-808(2005年10月)。RING结构域定义为配位（coordinate）两个锌原子的半胱氨酸和组氨酸的有规律的排列，且见于大量蛋白中。其特征在于结构C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-(N/C/H)-X2-C-X(4-48)C-X2-C，并与TRIM多肽中的B盒结构域相关。参见Freemont,Curr Biol.2000Jan27;10(2):R84-7。
结构域是折叠蛋白结构，其保留了独立于蛋白剩余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的不连续的功能特性，在许多情况下可以添加、去除或转移至其它蛋白而不损失蛋白和/或结构域的其余功能。TRIM多肽的RING、B盒、卷曲螺旋和PRYSPRY结构域是其实例。通过抗体可变结构域指含有抗体可变结构域特征的序列的折叠多肽结构域。因而，其包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环被如下取代：不是抗体可变结构域特征的序列、或被截短的或包含N或C端延伸的抗体可变结构域，以及保留全长结构域的至少部分结合活性和特异性的可变结构域折叠片段。
TRIM表达的诱导子是增加所需TRIM多肽细胞内水平的试剂。优选地，多肽是TRIM21。TRIM21表达的诱导子中的I型干扰素。
如参照本文，共同施用是两个试剂的同时的、同时的独立的或相继的施用，从而其在目标位点同时有效。因而，在抗体和TRIM21多肽的共同施用的上下文中，应当施用两个试剂，从而使抗体在被细胞内化之前被TRIM21多肽结合。因此，可以在施用前，混合抗体和TRIM21多肽，或独立地施用，从而其同时存在在循环中。
在它们感染细胞之前抗体靶向病原体。我们在此处表明通过感染，这些抗体保持结合病原体，并指导每个细胞内存在的细胞内免疫反应。我们证明每个细胞具有细胞溶质IgG受体，TRIM21，其比任何人体中的其它IgG受体以更高的亲和性结合抗体。这使得TRIM21能够快速召集至细胞内结合抗体的病毒，并通过其E3泛素连接酶活性在蛋白酶体内靶向病毒使其降解。在生理的抗体浓度下，TRIM21完全中和病毒感染。这些发现代表广谱免疫的前所未有的系统，揭示了抗体介导的保护并没有终止于细胞膜，而是在细胞内继续提供抗感染的最后防线。
TRIM21的PRYSPRY结构域负责抗体结合，在该意义上TRIM21看似在TRIM多肽家族当中是独特的。但是，负责蛋白酶体靶向的TRIM结构域，RING结构域是TRIM21非特异的；当然，这对包括TRIM家族的蛋白是常见的。
细胞中TRIM21表达的诱导依赖于干扰素，其受病毒机制的延迟和干扰。因而，本发明提供了融合至RING结构域的抗原特异性配体，从而当病原体被细胞内化时，结合病原体的配体立刻引导其至蛋白酶体以降解。这有效地允许细胞治愈其自身的病原体感染。
1.配体
任何在生理条件下能结合病原体相关抗原并被细胞内化的配体，适合用于本发明。天然免疫系统使用抗体作为病原体的配体，抗体或抗体片段用于本发明是理想的。其它可能性包括来自其它受体的结合结构域，以及工程化的肽和核酸。
1a.抗体
文中提及的抗原或病原体特异的抗体、抗原或病原体结合的抗体以及特异于抗原或病原体的抗体是几乎一致的（coterminous），并且指抗体、或源自抗体的结合片段，其以特异的方式结合存在于病原体上的抗原，且基本上与循环中或组织中存在的其它分子没有交叉反应。
文中应用的“抗体”包括但不局限于多克隆、单克隆、重组的、嵌合的、接枝（grafted）互补决定区（CDR）、单链的、双特异的、Fab片段和由Fab表达库产生的片段。这些片段包括保留其对目标抗原结合活性的完整抗体的片段、Fv、F(ab')、F(ab')2片段和F(v)或VH抗体片段以及融合蛋白和其它含有抗体的抗原结合位点的合成蛋白。而且，抗体及其片段可以是人或人源化的抗体，如下面进一步详述的。
抗体和片段还包括抗体变体和其片段。变体包括含有一个或多个氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽和多肽，其与抗原特异性抗体或其片段具有相同的或基本上相同的表位结合亲和性和特异性。
氨基酸残基的缺失、插入或取代可以产生沉默的改变而获得功能上等同的物质。可以根据残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性的性质相似性产生经考虑的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似的亲水值的带有不带电头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。
例如可以根据下表生成保守取代。在第二列相同格中的以及优选在第三列相同行中的氨基酸可以互相取代：
Figure BDA00002945915300101
同源取代（文中取代和置换均用来指用可替换的残基的现有氨基酸残基的互换）可发生，即一对一（like-for-like）的取代，例如碱对碱、酸对酸、极性对极性等。非同源取代也可以发生，即从一类残基到另一类，或可选的，涉及纳入非天然氨基酸，例如鸟氨酸（以下称为Z）、二氨基丁酸鸟氨酸（以下称为B）、非亮氨酸鸟氨酸（以下称为O）、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、萘基丙氨酸和苯甘氨酸。
因此，变体可以包括含有向抗原特异性抗体或其片段取代、缺失、和/或添加一个或多个氨基酸序列的肽和多肽，其中该取代、缺失、和/或添加不引起结合表位亲和性和特异性的实质改变。抗体或其片段的变体可以具有轻链和/或重链氨基酸序列的改变，其是天然发生的、或使用重组DNA技术通过天然序列的体外工程化而引入的。天然发生的变体包括“体（somatic）”变体，其在产生对外来抗原的抗体反应的过程中，在体内在相应的种系核苷酸序列中产生。
可以通过致突变技术制备抗体和结合片段的变体。例如，可以贯穿抗体编码区随机地引入氨基酸改变，可以筛选得到的变体对靶抗原的结合亲和性，或其它特性。可选地，可以将氨基酸改变引入抗体的选定区域中，比如轻链和/或重链CDRs中、和/或框架区中，并筛选得到的抗体对靶抗原的结合或一些其它活性。氨基酸变化包括CDR中的一个或多个氨基酸取代，范围从指定CDR内的单个氨基酸差异到引入氨基酸的多个重排（permutation）。还包括由插入氨基酸来增加CDR大小所产生的变体。
抗原结合抗体及其片段可以是人源化的或人工程化的抗体。如文中所用的，“人源化抗体”，或其抗原结合片段是重组多肽，其包括来自非人抗体的抗原结合位点部分和人抗体的框架部分和/或恒定区。人工程化的抗体或抗体片段是非人（如，小鼠）抗体，通过修饰（如缺失、插入或取代）特定位点的氨基酸以降低或消除修饰抗体在人中任何可检测的免疫原性使该非人抗体工程化。
人源化抗体包括嵌合抗体和CDR接枝的抗体。嵌合抗体是包括连接至人恒定区的非人抗体可变区的抗体。因而，在嵌合抗体中，可变区多数是非人的，恒定区是人的。嵌合抗体及其生成方法在，例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6841-6855(1984)中描述。但是，它们比小鼠单克隆抗体的免疫原性低，施用嵌合抗体与对抗体非人部分的人免疫反应（HAMA）相关。
CDR接枝的抗体是这样的抗体，其包括连接至来自人“受体”抗体的框架区的来自非人“供体”抗体的CDR。能用于生产人源化抗体的方法还描述于，例如US5,721,367和6,180,377。
“外饰抗体（Veneered antibodies）”是非人或人源化的（如嵌合或CDR接枝的抗体）抗体，其被工程化以替代某些暴露于溶剂的氨基酸残基，从而降低其免疫原性或增加它们的功能。嵌合抗体的外饰可以包括鉴别嵌合抗体非人框架区中暴露于溶剂的残基，并用来自人框架区的相应的表面残基替代其中的至少一个。可通过任何适合的工程化技术完成外饰。
抗体、人源化抗体、人工程化抗体和它们的制备方法的进一步的详细内容可见于Antibody Engineering,Springer,New York,NY,2001。
人源化或人工程化抗体的例子是IgG、IgM、IgE、IgA和IgD抗体。抗体可以是任何类别（IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等）或同种型，其可以包括κ或λ轻链。例如，人抗体可以包括IgG重链或确定的片段，例如同种型、IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的至少一个。作为另一个实施例，抗体或其片段可包括IgG1重链和κ或λ轻链。
抗原特异性抗体及其片段可以是人抗体－如结合抗原的、且被人种系免疫球蛋白核酸序列天然发生的体变体的核酸序列编码的抗体，以及其片段、合成变体、衍生物和融合蛋白。该抗体可以通过本领域任何已知的方法产生，例如通过使用转基因哺乳动物（如转基因小鼠），其中天然免疫球蛋白被哺乳动物染色体中的人V基因取代。
靶向所需抗原的人抗体还可以通过使用转基因动物产生，该动物不产生内源性免疫球蛋白，将该动物工程化使其含有人免疫球蛋白基因座，如WO98/24893和WO91/00906中描述的。
还可以通过体外筛选抗体展示库产生人抗体（J.Mol.Biol.(1991)227:381）。已经描述了多种含有抗体的噬菌体展示库，且可以轻易制备。库可以包含多种人抗体序列，如人Fab、Fv和scFv片段，可以对抗适当的靶来筛选抗体。除抗体外噬菌体展示库可以包括肽或蛋白，其可以被筛选以鉴别能够选择性结合所需抗原的试剂。
通过在丝状噬菌体表面展示抗体组库（repertoires），噬菌体展示过程模仿免疫选择，以及由其对所选抗原的结合进行噬菌体的随后选择。一个这样的方法描述于WO99/10494。可通过筛选重组组合的抗体库分离抗原特异性抗体，优选scFv噬菌体展示库，其使用从源自人淋巴细胞的mRNA制备的人VL和VH cDNA制备。制备和筛选这种库的方法是本领域公知的。有商售的用于生产噬菌体展示库的试剂盒。
如文中所用的，术语“抗体片段”指完整全长抗体的部分－如完整抗体的抗原结合或可变区。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；双价抗体；线性抗体；单链抗体分子（如scFv）；多特异抗体片段如双特异、三特异和多特异的抗体（如双价抗体、三价抗体、四价抗体）；结合结构域免疫球蛋白融合蛋白；骆驼化抗体（camelized）；小抗体；螯合重组蛋白；三体（tribodies）或二体（bibodies）；胞内抗体；纳米体；小模体免疫药物（SMIP）、含有VHH的抗体；以及任何其它由抗体片段形成的多肽。
抗原结合抗体和片段包括结合至所需抗原的单链抗体片段（scFv）。ScFv包括可操作地连接至抗体轻链可变区（VL）的抗体重链可变区（VH），其中重链可变区和轻链可变区共同地或单独地形成结合至抗原的结合位点。ScFv可以包括位于氨基端的VH区和位于羧基端的VL区。可选地，scFv可包括位于氨基端的VL区和位于羧基端的VH区。而且，尽管Fv片段的两个结构域，VL和VH被两个分开的基因编码，使用重组方法通过合成的接头它们可以被连接，通过合成接头允许它们作为单一蛋白链被产生出来，其中VL和VH区配对形成单价分子（称为单链Fv（scFv））。ScFv可任选地进一步包括重链可变区和轻链可变区之间的多肽接头。
抗原结合抗体和其片段还包括免疫粘附素（immunoadhesin）。一个或多个CDR可以以共价或非共价形式并入分子当中以使其成为免疫粘附素。免疫粘附素可以包含CDR作为较大的多肽链的部分，可以使CDR共价连接至另一个多肽链，或非共价地包括CDR。CDR允许免疫粘附素特异地结合所需抗原。
抗原结合抗体及其片段还包括包含一个或多个构建于有机或分子支架上（如蛋白或碳水化合物支架）的抗原结合部分的抗体模拟物。具有相对确定的三维结构的蛋白通常称为蛋白支架，可以用作用于抗体模拟物设计的试剂。这些支架典型地含有一个或多个容易控制的特异的或随机的序列变异区域，常常进行这种序列随机化来生产所需产物所选自的蛋白库。例如，抗体模拟物可包括具有免疫球蛋白样结构域的嵌合非免疫球蛋白结合多肽，所述免疫球蛋白样结构域含有具有两个或多个暴露于溶剂的环的支架，该环含有插入各环的不同于亲本抗体的CDR，并对亲本抗体所结合的配体展现出选择性结合活性。非免疫球蛋白支架被建议用于获得具有新的结合特性的蛋白。
抗原特异性抗体或其抗体片段典型地以高亲和性结合所需抗原（如，用BIAcore所确定的），如例如具有对抗原的平衡结合解离常数（KD）为大约15nM或更小、10nM或更小、大约5nM或更小、大约1nM或更小、大约500pM或更小、大约250pM或更小、大约100pM或更小、大约50pM或更小、或大约25pM或更小、大约10pM或更小、大约5pM或更小、大约3pM或更小、大约1pM或更小、大约0.75pM或更小、或大约0.5pM或更小。
1b肽配体
肽，如肽适体，可通过筛选过程选择肽库。实践中，任何适合在真核细胞中表达短核酸序列的载体系统可被用于表达肽库。在一个优选的实施方式中，高滴度的逆转录病毒包装系统可被用于生产肽适体库。存在各种载体以及兼嗜性（amphotropic）和亲嗜性（ecotropic）包装细胞系，其可被用于生产感染小鼠或人细胞的高滴度逆转录病毒。这些递送和表达系统可容易地被调整用于任何哺乳动物细胞类型的有效感染，并可被用于在一个实验中感染数以百万计的细胞。包含编码小数量氨基酸残基（如5、6、7、8、9、10或更多，但优选少于100，更优选少于50，以及最优选少于20）的随机组合的核酸序列的适体库可以作为游离的实体在逆转录病毒感染的细胞中表达，或取决于给定筛选的靶向，作为融合至异源蛋白的融合蛋白，如可作为特异的蛋白支架发挥作用的蛋白（用于促进，肽适体的例如表达力、细胞内或细胞内定位、稳定性、分泌力、分离能力或可检测力）。当由例如7个氨基酸组成时，随机肽适体库编码大得足以代表显著且特异的结构信息的分子，并具有107或更多可能组合在可被检测的细胞数的范围内。
优选地，使用来自靶抗原的序列信息生产适体。
在鉴定适体中，例如，用表达适体库成员的基因构建体感染细胞群，并评估适体结合抗原的能力，例如在BIAcore平台上。在第一循环的筛选中选择的适体编码序列通过PCR进行扩增，再克隆并再导入初始细胞（
Figure BDA00002945915300131
cells）中。然后可以重复使用相同或不同的系统进行选择，以便验证原始池中的个体适体。在随后的选择循环中所鉴别的细胞内适体编码序列可以反复进行扩增和亚克隆，然后使用标准技术由DNA测序确定活性适体的序列。
1c结构多肽
固定至合成分子结构的多肽是本领域中已知的（Kemp,D.S.和McNamara,P.E.,J.Org.Chem,1985；Timmerman,P等人,ChemBioChem,2005）。Meloen和同事使用三（溴甲基）苯和相关分子快速定量地将多重肽环环化至蛋白表面结构模拟的合成支架上（Timmerman,P.等人ChemBioChem,2005）。用于候选药物化合物生产的方法公开于WO2004/077062和WO2006/078161中，其中所述化合物通过将含有半胱氨酸的多肽连接至分子支架例如三（溴甲基）苯而生产。
WO2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。特别地，该文献公开了含有第一和第二反应基团的各种支架分子，在偶联反应中使所述支架与进一步的分子接触，以形成至少两个支架与进一步分子间的连接。
WO2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和类肽物。该文献公开了取自现有蛋白的肽的多种集合的人工合成。然后将这些肽与具有某些引入的氨基酸改变的恒定合成肽组合，以产生组合库。通过化学连接来区分表征各种氨基酸改变的肽，通过引入这种多样化，提供了更多发现所需结合活性的机会。该文献的图7表明了代表多种环肽构建体合成的示意图。
国际专利申请WO2009098450描述了使用生物选择技术，例如噬菌体展示，来选择固定至合成分子结构的肽。在该方法中，肽表达在噬菌体上，然后在适当条件下与分子支架反应，从而结构上受限的肽在噬菌体表面展示。
可设计这种结构肽以结合任何所需抗原，并能够偶联至RING结构域，以引导抗原配体复合体至细胞内的蛋白酶体。
1d间接配体
间接配体通过特异地识别抗原的第二配体结合抗原。例如，第二配体是抗原特异性的抗体。可制备免疫球蛋白特异性的如上1a至1c部分中描述的配体，但其以不依赖于靶免疫球蛋白结合特异性的方式结合至其上。例如，可制备抗Fc抗体、肽和结构肽。可使用抗体结合肽例如蛋白A、蛋白G和蛋白L。
2.RING结构域
三重基序（TRIM）蛋白构成了基于保守结构域结构的蛋白家族（称为RBCC），其特征在于RING指结构域、一个或两个B盒结构域、卷曲螺旋结构域和可变的C端。
TRIM蛋白参与多种细胞功能，包括分化、凋亡和免疫。已发现一些TRIM蛋白表现出抗病毒活性或已知参与固有免疫相关过程中。如Carthagena等人PLoSOne(2009)4,3:e4894所注意到的，TRIM5a负责灵长类动物细胞中各种逆转录病毒的物种特异的进入后限制，包括N-MLV和HIV-1，而TRIM1/MID2还表现出抗逆转录病毒活性，其特异地影响N-MLV感染。已表明TRIM22，也称为Staf50，抑制HIV-1复制，尽管仍不清楚阻断发生在哪一步。TRIM28限制鼠胚胎细胞中MLV LTR驱动的转录。而且，已经报道了通过TRIM19/PML的大范围的RNA和DNA病毒的抑制。至今进行的最广泛的筛选表明一些TRIM蛋白，包括TRIM11、TRIM31和TRIM62，能够干扰MLV或HIV-1复制的多个阶段。最后，已经表明TRIM25通过其E3泛素连接酶活性控制RIGI介导的抗病毒活性。
如文中定义的，TRIM21的RING指负责引导抗体/抗原复合体至蛋白酶体。这归因于RING结构域的E3泛素连接酶活性。因而，有利地，本发明使用的RING结构域具有E3连接酶活性。
用异源TRIM结构域取代RING结构域，在IM蛋白之间替换它们，是本领域公知的。参见Li等人J.Virol.(2006)6198-6206。
RING结构域由Freemont等人Cell.1991Feb8;64(3):483-4描述。认为结构域作为E3连接酶发挥作用；参见Meroni&Roux,BioEssays27,11:1147-1157(2005)。它们是RING指结构域（非常令人感兴趣的新基因（Really Interesting New Gene））超家族的成员，结合两个锌原子的40至60个残基的Zn指的特殊类型；被定义为“交叉支撑（cross-brace）”基序C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-(N/C/H)-X2-C-X(4-48)C-X2-C。在该家族中有两个变体，C3HC4-型和C3H2C3-型(RING-H2指)，其具有不同的半胱氨酸/组氨酸模式。
优选的RING结构域源自TRIM蛋白，且可以是TRIM蛋白的部分。在一个实施方式中，本发明提供了一个TRIM多肽，其中赋予其特异性的B30.2结构域被抗原特异结合结构域所替代。至少PRYSPRY(B30.2)结构域被替代；只要保留RING结构域E3连接酶功能，其它结构域可被替代或删掉。
3.TRIM表达的诱导
并非将TRIM多肽的RING结构域偶联至所需的抗原，或者除其以外，可能刺激细胞内的内源性TRIM21的表达。TRIM21以高亲和性结合抗体，并将抗体和任何结合的抗原引导至蛋白酶体。
由于TRIM21结合至抗体的Fc部分，如果通过将配体缀合至TRIM表达的诱导子来刺激内源TRIM21的表达，则配体包含TRIM21的PRYSPRY结构域的结合位点。优选地，配体包含抗体Fc区域，在一个实施方式中，配体是抗体。例如，抗体可以是IgG或IgM抗体。
通过干扰素诱导TRIM21表达。因而，在一个实施方式中，TRIM表达的诱导子是干扰素，或干扰素诱导子。
优选干扰素是I型干扰素，例如α干扰素或β干扰素。
干扰素在一些治疗应用中是本领域中已知的，但是特别用于HBV和HCV的疗法。干扰素的衍生物，例如聚乙二醇干扰素（聚乙二醇化的干扰素）和albuferon（无对应中译文，缀合至HSA的干扰素）与抗病毒剂例如核苷类似物共同施用。
干扰素诱导子是本领域中已知的。一般而言，许多疫苗佐剂用作干扰素诱导子。其包括已知多年用作疫苗佐剂的物质，包括病毒抗原、细菌抗原例如LPS、合成的聚合物例如poly I:C（如
Figure BDA00002945915300151
）。最近，已经表明Toll样受体（TLR）的激动剂是有效的干扰素诱导子。例如从US2010120799、US2010048520、US2010018134、US2010018132、US2010018131、US2010018130、US2010003280中已知一些干扰素诱导子。而且，正在开发小分子干扰素诱导子，例如Musmuca等人J.Chem.Inf.Model.,2009,49(7),pp1777–1786中所述的。
4.抗体缀合物
将药物或其它小分子药物粘附于抗体片段的方法是已知的。在本领域中建立了多种肽缀合化学品，包括双功能化学接头例如，N-琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)-氨基苯甲酸酯、磺基琥珀酰亚胺(4-碘乙酰)-氨基苯甲酸酯、4-琥珀酰亚胺-氧羰基-[α]-(2-吡啶基二硫)甲苯、磺基琥珀酰亚胺-6-[[α]-甲基-[α]-(吡啶基二硫)-苯甲酸酰胺基]己酸酯、N-琥珀酰亚胺-3-(-2-吡啶基二硫)-丙酸酯、琥珀酰亚胺-6-[3(-(-2-吡啶基二硫)-丙酰氨基（proprionamido）]己酸酯、磺基琥珀酰亚胺-6-[3(-(-2-吡啶基二硫)-丙酰氨基]己酸酯、3-(2-吡啶基二硫)-丙酰酰肼、Ellman's试剂、二氯三嗪酸、S-(2-硫代吡啶)-L-半胱氨酸等。进一步的双功能连接分子公开于美国专利号5,349,066、5,618,528、4,569,789、4,952,394和5,137,877，以及Corson等人,ACSCemical Biology3,11,pp677-692,2008。
RING结构域和包括抗体的多肽配体，可通过在一个（或两个）多肽上的功能或反应基团缀合。其典型地由在多肽聚合物中发现的特定氨基酸的侧链形成。此反应基团可以是半胱氨酸侧链、赖氨酸侧链、或N端氨基基团或任何其它适合的反应基团。
反应基团能够形成与待附着的配体的共价键。官能团是在形成官能团的天然或非天然氨基酸内的原子的特定基团。
天然氨基酸适合的官能团是半胱氨酸的巯基、赖氨酸的氨基、天门冬氨酸或谷氨酸的羧基、精氨酸的胍基、酪氨酸的酚基或丝氨酸的羟基。非天然氨基酸可提供广范围的官能团包括叠氮化物、酮羰基、炔、乙烯基、或芳基卤基团。多肽末端的氨基和羧基基团也可以作为官能团来形成与所需配体的共价键。
可选地，巯基介导的缀合可被用于通过共价相互作用将配体附着至多肽。通过产生带有具有必要的化学官能团的非天然氨基酸，组合上带有互补官能团的小分子，或通过当分子在分泌/分离阶段后产生时将非天然氨基酸合并入化学或重组合成的多肽，来使用这些方法，而不是使用巯基介导的方法（或与该方法组合使用）。
并入噬菌体上的肽和蛋白的非天然氨基酸包括1）能够与肼、羟胺及其衍生物特异地反应的酮官能团（如在对位或间位乙酰基苯丙氨酸中发现的）（Addition ofthe keto functional group to the genetic code of Escherichia coli.Wang L,Zhang Z,Brock A,Schultz PG.Proc Natl Acad Sci U S A.2003Jan7;100(1):56-61；Bioorg MedChem Lett.2006Oct15;16(20):5356-9.Genetic introduction of a diketone-containingamino acid into proteins.Zeng H,Xie J,Schultz PG），2)能够通过铜催化的“点击化学”或应变促进的（strain promoted）（3+2）环加成与炔反应以形成相应的三唑的叠氮化物（如在对位叠氮苯丙氨酸中发现的）（Addition of p-azido-L-phenylalanineto the genetic code of Escherichia coli.Chin JW,Santoro SW,Martin AB,King DS,Wang L,Schultz PG.J Am Chem Soc.2002Aug7;124(31):9026-7；Adding aminoacids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae.Deiters A,Cropp TA,Mukherji M,Chin JW,Anderson JC,Schultz PG.J Am Chem Soc.2003Oct1;125(39):11782-3），或能通过Staudinger连接与芳基膦反应的叠氮化物（SelectiveStaudinger modification of proteins containing p-azidophenylalanine.Tsao ML,Tian F,Schultz PG.Chembiochem.2005Dec;6(12):2147-9），以形成相应的酰胺，4）能与叠氮化物反应以形成相应的三唑的炔（In vivo incorporation of an alkyne intoproteins in Escherichia coli.Deiters A,Schultz PG.Bioorg Med Chem Lett.2005Mar1;15(5):1521-4），5)能够与含有一个以上适当的空间羟基基团特异地反应或进行钯介导的与卤化化合物偶联的硼酸（硼酸盐）（Angew Chem Int Ed Engl.2008;47(43):8220-3.A genetically encoded boronate-containing amino acid.,Brustad E,Bushey ML,Lee JW,Groff D,Liu W,Schultz PG），6）金属螯合的氨基酸，包括带有联吡啶的、能特异配位金属离子的那些（Angew Chem Int Ed Engl.2007;46(48):9239-42.A genetically encoded bidentate,metal-binding amino acid.Xie J,Liu W,Schultz PG）。
非天然氨基酸可以通过用携带以下的质粒或质粒组合转化大肠杆菌被并入蛋白或肽：1）在对密码子反应中指导非天然氨基酸并入的正交氨酰tRNA合成酶和tRNA，2）经改变以便在非天然氨基酸并入的位点含有选择的密码子的噬菌体DNA或噬菌粒质粒（Proc Natl Acad Sci U S A.2008Nov18;105(46):17688-93.Proteinevolution with an expanded genetic code.Liu CC,Mack AV,Tsao ML,Mills JH,LeeHS,Choe H,Farzan M,Schultz PG,Smider VV；A phage display system with unnaturalamino acids.Tian F,Tsao ML,Schultz PG.J Am Chem Soc.2004Dec15;126(49):15962-3）。正交氨酰-tRNA合成酶和tRNA可源自加氏甲烷球菌（Methancoccus janaschii）酪氨酰对或合成酶（Addition of a photocrosslinking aminoacid to the genetic code of Escherichiacoli.Chin JW,Martin AB,King DS,Wang L,Schultz PG.Proc Natl Acad Sci U S A.2002Aug20;99(17):11020-4）以及天然并入吡咯赖氨酸的tRNA对（Multistep engineering of pyrrolysyl-tRNA synthetase togenetically encode N(epsilon)-(o-azidobenzyloxycarbonyl)lysine for site-specificprotein modification.Yanagisawa T,Ishii R,Fukunaga R,Kobayashi T,Sakamoto K,Yokoyama S.Chem Biol.2008Nov24;15(11):1187-97；Genetically encodingN(epsilon)-acetyllysine in recombinant proteins.Neumann H,Peak-Chew SY,Chin JW.Nat Chem Biol.2008Apr;4(4):232-4.Epub2008Feb17）。用于并入的密码子可以是琥珀密码子（UAG）的另一个终止密码子（UGA或UAA），可选择地，其可以是四碱基密码子。氨酰-tRNA合成酶和tRNA可以由现有载体产生，包括pBK系列载体、pSUP（Efficient incorporation of unnatural amino acids into proteins inEscherichia coli.Ryu Y,Schultz PG.Nat Methods.2006Apr;3(4):263-5）载体和pDULE载体（Nat Methods.2005May;2(5):377-84.Photo-cross-linking interactingproteins with a genetically encoded benzophenone.Farrell IS,Toroney R,Hazen JL,Mehl RA,Chin JW）。使用的大肠杆菌菌株表达F’菌毛（通常通过tra操纵子）。当使用琥珀抑制时，大肠杆菌菌株自身将不含有活性琥珀抑制子tRNA基因。氨基酸将被添加至生长介质，优选终浓度为1mM或更高。可以通过使用具有正交核糖体结合位点的表达构建体以及翻译带有核糖X的基因增强氨基酸并入效率（Evolved orthogonal ribosomes enhance the efficiency of synthetic genetic codeexpansion.Wang K,Neumann H,Peak-Chew SY,Chin JW.Nat Biotechnol.2007Jul;25(7):770-7）。这将允许提供附着至配体的多位点的有效的非天然氨基酸的多位点并入。
该方法有助于将RING结构域附着至抗体和其它配体，包括非肽配体。它们还有助于附着小分子干扰素诱导子，和其它TRIM21表达的诱导子。
用于将抗体缀合至药物和其它化合物的技术也描述于Carter&Senter,CancerJournal:May/June2008-Volume14-Issue3-pp154-169；Ducry和Stump,Bioconjugate Chem.,2010,21(1),pp5–13中。
可选地，可使用双特异的抗体。例如，双特异结构域抗体是本领域已知的，且有助于靶向所需抗原和RING结构域，或含有RING结构域的多肽。
血清中抗体缀合物的半衰期取决于许多因素，但较小的抗体片段倾向于很快被从循环中清除。因而，例如包含结构域抗体和RING结构域的较小构建体有利地偶联至增加血清半衰期的多肽。例如，它们偶联至HSA。优选地，对HSA的结合是不稳定的，例如具有有限的半衰期，从而当结合至细胞时，构建体从HSA释放，并在没有HSA时被内化。一个有用的方法是使用多特异的配体构建体，从而配体也结合HSA，将其保持在循环中。可调节配体对HSA的亲和性，从而使配体能够恰当地被细胞内化。
5.TRIM21和抗体的共同施用
治疗性抗体是本领域已知的。TRIM21结合IgG和IgM抗体的Fc部分，因而共同施用于受试者有效地促进细胞对病原体的破坏。
表1列出现有的可获得的治疗病原体感染的抗体药物。指示TRIM21与这些药物共同施用可用于治疗。
与抗体药物共同施用的多肽优选包含TRIM21PRYSPRY结构域和RING结构域，能够作为E3连接酶发挥作用。但是，可以使用其它免疫球蛋白特异的配体，例如蛋白A、蛋白G或蛋白L或抗Fc肽，其以非依赖于抗体靶向特异性的方式结合免疫球蛋白。
优选地，多肽还包括卷曲螺旋结构域和/或B盒结构域。在一个优选的实施方式中，其基本上是完整的TRIM21多肽。
TRIM21优选是人TRIM21，如SEQ ID No.1所示；参见Tanaka,M.,等人Histochem.Cell Biol.133(3),273-284(2010)。
本发明包括修饰的TIM21衍生物，其至少保留了抗体结合和E3连接酶功能。例如，只要充分保留了所需功能，本发明包括TRIM21氨基酸序列内的取代、添加或缺失。多肽可享有与SEQ ID NO.1至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性（同源性）。
本发明多肽上的突变可以靶向其特定的结构域。例如，在PRYSPRY结构域中要求较高水平的序列同一性的保守性。该结构域负责多肽的抗体结合。例如，在RING结构域中通常要求较低水平的同一性。RING结构域广泛分布于基因组中，并具有保守的E3连接酶功能。有利地，保留一致序列C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-(N/C/H)-X2-C-X(4-48)C-X2-C。
表1：抗体抗感染药物
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6.化合物的施用
一般地，根据本发明的化合物将以纯化形式与药学上合适的载体一同使用。典型地，这些载体包括水或乙醇/水溶液、乳液或混悬液、任何包括盐和/或缓冲介质。不经肠胃道的载体（vehicles）包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠和乳酸盐林格溶液。为了在混悬液中保持多肽复合体，如果必要时，适合的生理上可接受的佐剂可以选自增稠剂例如羧甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、凝胶和海藻酸盐。
静脉内的载体包括液体和营养补充剂和电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些。还可以存在防腐剂和其它添加剂，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体（Mack(1982)Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版）。
本发明的化合物可作为分别施用的组合物或与其它试剂联合使用。这些可进一步包括抗体、抗体片段和缀合物、和各种免疫治疗药物，例如环胞素、氨甲蝶呤、阿霉素或顺铂和免疫毒素。药物组合物可以包括各种细胞毒或其它试剂与本发明所选抗体、受体或其结合蛋白联合的“混合液（cocktails）”，或甚至根据本发明的具有不同特异性的所选多肽的组合，例如使用不同靶向配体选定的多肽，无论是否在施用前将其合并。
根据本发明的药物组合物的施用途径可以是任何本领域普通技术人员公知的那些。对于疗法，包括但不限于免疫疗法，可以根据标准技术向任何患者施用本发明所选抗体、受体或其结合蛋白。可以以任何适当的模式施用，包括不经肠胃道、静脉内、肌肉内、腹腔的、经皮的、通过肺途径的、或还可以恰当地，通过用导管的直接输注。施用的剂量和频率取决于患者的年龄、性别和状态、其它药物的共同施用、禁忌症以及临床医生考虑的其它参数。
本发明的组合物可以冻干保存，在使用前在适当的载体中重建。已经表明该技术是有效的，并使用本领域已知的冻干和重建技术。本领域技术人员将理解冻干和重建可以导致不同程度的活性丧失，并且理解应上调使用水平以补偿。
可施用含有本发明的肽配体或其混合液的组合物用于预防性和/或治疗性治疗。在特定治疗性应用中，足以实现至少部分选定细胞群的抑制、压制、调节、杀死或一些其它可测量参数的量被定义为“治疗有效量”。需要实现这一剂量的量将取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的总体状态，但通常为每千克体重从0.005至5.0mg范围的选定肽配体，更通常使用的剂量为0.05至2.0mg/kg/剂量。对于预防性应用，含有本发明肽配体或其混合液的组合物可以以相似的或稍低的剂量施用。
可以以预防性或治疗性的设置使用含有根据本发明化合物的组合物，以辅助哺乳动物中选定靶细胞群的改变、失活、杀死或移除。另外，文中描述的多肽的选定组库可生物体外（extracorporeally）或体外选择性使用，以便从细胞的异源集合中杀死、消除或否则有效地去除靶细胞群。来自哺乳动物的血液可与选定肽配体在生物体外组合，从而杀死不需要的细胞、或否则将其从血液中去除并根据标准技术重输回哺乳动物。
在以下的实施例中进一步描述本发明。
材料和方法
细胞系
在补充有10%胎牛血清和100IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的Dulbecco’s改良Eagle介质（DMEM）中，在37°C在湿润的孵育器中维持HEK293T、HeLa、TE671、QT35和HT1080。在不含血清的Freestyle介质(Invitrogen)中在37°C下在轨道振荡器上以50rpm培养293F细胞（Invitrogen,Paisley,UK）。适当时，用1mg/mlG418（Invitrogen）或2μg/ml嘌呤霉素（Sigma-Aldrich,Poole,UK）选择细胞。
病毒的产生
用修饰如18所述产生克萨奇病毒。根据生产商的说明书，使用Superfect（Qiagen,Crawley,UK）将编码带有eGFP序列的株pH3的质粒eGFP-CVB3和位于病毒多肽N端的切割序列转染至10cm皿上的HEK293T细胞中。48小时后，从皿上机械地去除细胞，冻融3次以释放病毒颗粒，在用0.45μm过滤前在1,000g下使上清澄清。在HeLa细胞中扩增病毒储存液持续48小时，通过如上所述的冻融和过滤收集病毒颗粒。在-80°C下冷冻等份直至需要时。滴度典型地在106至107IU/ml范围。在反式互补细胞系293F中培养腺病毒Ad5-GFP1972小时，而后进行3轮冻融以释放病毒颗粒，并在0.45μm下过滤。在氯化铯梯度上通过2轮超离心显带（banding）来纯化病毒储存液，稀释于PBS/10%甘油中，在-80°C下冷冻直至需要时。典型地，纯化的病毒滴度为108至109IU/ml。
稳定敲低和过度表达细胞系的产生
将人TRIM21DNA作为NotI/SalI限制性片段克隆至pDONAI(Takara,Saint-Germain-en-Laye,France)以产生pDON-T21。将编码针对人TRIM21序列GCAGCACGCTTGACAATGA的小发夹（sh）RNA的DNA克隆至pSIREN Retro-Q(Clontech)以产生pSIREN-shT21。pSIREN-shLuc编码指导荧光素酶的对照shRNA。逆转录病毒转导颗粒通过如下产生：用5μg pDON-T21、pSIREN-shT21、空pDONAI或pSIREN-Luc连同5μg MLV gag-pol表达质粒pCMVi和5μg VSV-G表达质粒pMDG一起转染4×106HEK293T细胞20。72小时后收获上清，在0.45μm下过滤，并用于转导HeLa细胞。用G418（pDON-T21,pDONAI）或嘌呤霉素（pSIREN-shT21,pSIREN-shLuc）选择稳定转导的细胞。通过Western印迹监测TRIM21蛋白的水平（sc-25351,Santa Cruz）。
瞬时siRNA敲低
将细胞以每孔1×105个细胞铺板在六孔板上，使其过夜粘附。使用Oligofectamine（无对应中译文）（Invitrogen）将150pmol各小干扰（si）RNA寡核苷酸T21siRNA1（UCAUUGUCAAGCGUGCUGC；Dharmacon,Lafayette,CO,USA）和150pmol T21siRNA2（UGGCAUGGAGGCACCUGAAGGUGG；Invitrogen)或300pmol对照寡核苷酸（Invitrogen）转染至细胞。3小时后洗涤细胞，并在感染前孵育72小时。当指明时，敲低后48小时加入1000U的IFN-α（PBLInterferonSource,Edison,NJ,USA）。
病毒中和分析
对于Ad5-GFP和eGFP-CVB3感染，在感染前1天，以每孔1×105个细胞将靶HeLa细胞接种在六孔板上的2ml完全DMEM中。如所述的，用1000U的IFN-α孵育细胞。在加到细胞前，5×104感染单元（IU）AdV5-GFP与抗体在10μl体积中在室温下孵育30分钟。将细胞孵育48小时，而后洗涤、胰蛋白酶消化，并在4%多聚甲醛中固定。对于克萨奇病毒，在200μl孵育液中2×104IU与抗体在室温下孵育30分钟。感染后8小时，固定感染的细胞以防止感染扩散。对于两种病毒，使用流式细胞术计数GFP阳性细胞（FACSCalibur,BD Biosciences,San Jose,CA,USA）。
VNAs中使用的抗体是合并的人血清IgG和IgM（090707和090713；AthensResearch and Technology,Athens,GA,USA）、纯化的9C12抗腺病毒5六邻体小鼠IgG（获自Developmental Studies Hybridoma Bank,University of Iowa,IA,USA的杂交瘤）、羊抗腺病毒多克隆抗体（0151-9004,Abd Serotec,Oxford,UK和AB1056,Millipore,Watford,UK）。
免疫荧光
将2.5×104HeLa细胞接种在24孔板的盖玻片上，允许其粘附过夜。感染前在DMEM中洗涤细胞两次。用多克隆或单克隆抗六邻体腺病毒抗体孵育5×104IUAdV5-GFP（例如在加入230μl DMEM前，在室温下，在20μl体积中500ng小鼠单克隆抗体IgG持续30分钟）。在37°C用250μl该混合物感染细胞30分钟。用PBS洗涤细胞3次，用4%多聚甲醛固定，用PBS中的0.5%Triton X-10进行透析，并用PBS-BSA（PBS中5%牛血清白蛋白、0.1%吐温）封闭1小时。用兔50kDa Ro/SSA一抗20960（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,U.S.A.）进行TRIM21的免疫染色，且对于泛素，使用PBS-BSA中以1：200稀释的羊一抗6085（Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Santa Cruz,U.S.A.）。AlexaFluor缀合的二抗（Invitrogen）以1：200稀释被用于检测一抗。链霉亲和素包被的0.25μm乳胶珠（Sigma-Aldrich）与兔抗链霉亲和素多克隆血清S6390（Sigma-Aldrich）在4°C下过夜孵育。用PBS洗涤珠3次，使用Oligofectamine转染至细胞。转染后3小时用PBS洗涤细胞，并如上固定。用小鼠抗重组TRIM21RBCC中产生的免疫血清进行TRIM21免疫染色，而对于缀合的泛素，如上所述在PBS-BSA中以1：200稀释进行。AlexaFluor缀合的二抗（Invitrogen）以1：500稀释被用于检测一抗。使用Zeiss63X镜头在Jena LSM710显微镜（Carl Zeiss MicroImaging GmbH,Germany）下拍共聚焦图像。
衣壳命运的分析
将HeLa细胞以每孔2×105个细胞铺板于6孔板的2ml DMEM中，使其过夜粘附。一部分孔用8μM MG132（Boston Biochem）处理4小时。在处理期间将未处理的细胞暴露于等量DMSO。4×107IU Ad5-GFP与6μg9C12单克隆抗体混合，在室温下孵育30分钟，然后加到1ml完全介质中的细胞中。在移除感染混合物前，在37°C孵育感染1小时，并用DMEM取代。初次感染后，在指定的时间点收获细胞，并在具有还原剂（Invitrogen）的100μl1×LDS样本缓冲液中煮沸。用羊抗六邻体Ad5（1:1000,AB1056,Millipore）和HRP缀合的抗羊IgG（1:5000,sc-2056,Santa Cruz）检测病毒。用驴抗小鼠IgG（1:500,AP192Millipore）和蛋白A-HRP（1:2000,610438,BD Biosciences）检测抗体。用TRIM21RBCC免疫血清（1:2000）和蛋白A HRP检测TRIM21以避免在凝胶上对小鼠抗体的交叉反应。
免疫印迹
刮下6孔板的一个孔中的细胞，再悬浮，并在具有还原剂（Invitrogen）的100μl1×LDS样本缓冲液中98°C下加热5分钟。将等体积物加载到4-12%NuPAGE凝胶上，并在1×MOPS缓冲液（Invitrogen）中电泳。将蛋白质转移到Protran硝化纤维膜（Whatman）上，并用指定的抗体进行免疫印迹。在所有的情况中，在含有5%奶、0.1%吐温的PBS中用抗体孵育印迹，并用PBS-吐温洗涤。使用ECL PlusWestern Blotting Detection System（GE Healthcare）进行可视化。根据生产商的说明书用1×Re-Blot Plus Strong Solution（2504,Millipore）脱去westerns印迹，以便于再次探针杂交（re-probing）。用兔多克隆β-肌动蛋白（1:1000,#4967,CellSignalling）进行加载对照的印迹。
荧光滴定
全长和ΔRING-盒重组TRIM21作为MBP融合蛋白在大肠杆菌中表达，并使用直链淀粉树脂和尺寸排除色谱法进行纯化。通过tev蛋白酶切除MBP标签，将切断的TRIM21在20mM Tris pH8、100mM NaCl、1mM DTT中透析。使用CaryEclipse荧光分光光度计（Varian）在20°C下进行稳态荧光滴定实验，使用15nm缝隙宽度和850的PMT电压，在296nm下激发并在335nm下发射。以5s的平均时间测量在IgG滴定下的固有TRIM21色氨酸荧光中的淬灭。使用Kaleidagraph（Synergy Software）将每次滴定拟合至二次表达式F=FTR+f'((-(I0-TR0+Kd)±(((I0-TR0+Kd)2)+(4KdTR0))1/2))/2；其中F是观察到的荧光，FTR是摩尔TRIM21荧光，f'是荧光中的摩尔改变，(TR0)是总TRIM21浓度，(I0)是总抗体浓度，以及Kd是解离常数。
荧光各向异性
如前所述，表达并纯化TRIM21的PRYSPRY结构域4，5。用Alexa Fluor4885-SDP酯（Invitrogen）标记蛋白，并在具有200mM NaCl的50mM Tris pH8中透析。使用Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian）进行各向异性实验，使用10nm缝隙宽度和600的PMT电压，在488nm下激发并在530nm下发射。将IgM（AthensResearch and Technology,Athens,GA,USA）滴定至50nM PRYSPRY中，极化荧光以5s进行平均。通过将各向异性中的改变用Kaleidagraph（Synergy Software）拟合至上述二次表达式来确定解离常数（Kd）。
SEC MALS
使用连接至Wyatt Optilab rEX在线折光指数检测器的Wyatt Heleos II18角度光散射仪进行SEC MALS。如上所述制备样本，以0.5ml/min在Superdex S-200分析凝胶过滤柱上运行来进行分离，之后以标准SEC MALS模式通过光散射和折光指数检测器。对于1mg/ml，基于0.186ΔRI由折光指数来确定蛋白浓度，并与观察到的散射强度组合，使用Wyatt’s ASTRA分析软件来计算绝对分子质量。TRIM21中的主要种类在指定的峰区间具有平均107kDa的质量。单体TRIM21的预测质量是54kDa，使得在溶液中TRIM21是二聚物，而不是如前报道的三聚物。IgG的SEC MALS给出预期的154kDa的质量，具有低水平（<10%）的二聚物质量325kDa，尤其对于IgG。TRIM21-IgG复合体以多峰的形式分离，对应着过量的IgG，其质量和稀释体积如前所述，且峰的质量为～280kDa。280kDa峰与TRIM21:IgG的1：1复合体是一致的，其中各蛋白为同源二聚物。
使用外源TRIM21的互补中和分析
在感染前一天，以每孔1×105个细胞在六孔板中的2ml完全DMEM中接种HeLa细胞。用4μg羊抗腺病毒多克隆抗体（AB1056,Millipore,Watford,UK）对5×104IU AdV5-GFP孵育15分钟，之后加入200μg适当的重组TRIM21蛋白，总体积为100μl，并进一步在室温下孵育15分钟。用该混合物替换细胞上的介质，用完全DMEM调整至1ml。在湿润的孵育器中在37°C下孵育细胞48小时，然后按照病毒中和分析中所述的处理细胞（如上）。
体外泛素化分析
基本上如前所述进行体外分析21。如前所述，在添加有2mM ATP、300ngHis-Uba1、300ng His-UbcH5c、1μg泛素（Sigma）和50ng MBP-TRIM21或MBP-TRIM21ΔRing-盒的1×泛素化缓冲液（50mM Tris-HCl pH7.4,2.5mM MgCl2,0.5mM DTT）中进行反应。如前所述21，在细菌中表达人Uba1和UbcH5c，并使用Ni-NTA树脂（Qiagen）纯化。通过每150ng羊多克隆抗六邻体（Millipore）5×104IU AdV5-GFP孵育30分钟，制备抗体腺病毒混合物，其中1μl混合物含有3.6×104IU和106ng抗体。如上所述，向反应混合物中加入渐增的量。分别仅含有Ad5或抗六邻体抗体的1.25×105IU和150ng抗体用作对照。在37°C下孵育反应混合物1小时，然后通过加入LDS样本缓冲液并加热至98°C持续5分钟停止反应。如所述，在凝胶上运行样本并对TRIM21（1:500,sc-25351,Santa Cruz）、Ad5六邻体（驴抗羊IgG HRP1:5000sc-2056,Santa Cruz）或泛素（1:1000,FK-2,Enzo Lifesciences）进行Western印迹。
实施例1：抗体被内化
认为在病毒感染期间抗体通常不进入细胞溶质中。为了检测这一说法，我们用抗体预先孵育腺病毒（引起呼吸道疾病的人病毒模型），并向培养的HeLa细胞中加入病毒颗粒。选择腺病毒是因为其为非包膜的病毒，在细胞感染之前其衣壳天然地暴露于血清抗体。在感染30分钟后，固定细胞，并加入荧光抗IgG抗体以检测抗体包被的病毒颗粒。如在图1A中所见，抗体包被的病毒颗粒成功地感染细胞。使用多克隆抗六邻体抗体和人血清IgG获得相似的结果。腺病毒通过结合CAR受体而进入细胞，并被内吞。我们发现加入抗体并不阻止这一过程，抗体在进入之后仍然保持与病毒的附着。
实施例2：TRIM21介导的细胞内病毒中和
为了了解抗体包被的病毒是否可接触到细胞溶质TRIM21，我们对TRIM21进行联合染色。如图1A所示，TRIM21有效地被召集至抗体包被的病毒颗粒。
而后，通过定量腺病毒感染的水平，我们检测了TRIM21召集至病毒颗粒的作用。我们使用携带GFP基因的病毒从而可以通过流式细胞术分析确定感染的效率。在用对照siRNA、TRIM21siRNA、干扰素-α（IFNα）或IFNα和TRIM21siRNA预处理的HeLa细胞上进行标准的病毒中和分析（图1B）。为了顾及这些不同条件间的细胞毒性和可变的细胞死亡，我们测量了由于添加抗体而导致的感染的降低。在没有抗体时，腺病毒感染～50%的细胞。随着抗体浓度的增加，被感染的细胞百分比快速降低，从而在400ng/μl抗体时，感染降低了50倍以上（Figure1B）。但是，在除去了TRIM21的细胞中，添加400ng/μl抗体对感染作用最小（～3倍）。
在免疫反应期间，IFNα激活了抗病毒基因的转录。我们发现TRIM21是IFNα调节的，且最低水平的内源性TRIM21蛋白被IFNα极大地增加（图1C）。与该结果一致，用IFNα预先孵育细胞增加了抗体中和的作用，从而在400ng/μl抗体时，感染降低了230倍以上。IFNα具有多效（pleiotropic）作用，但没有加入抗体时，我们观察到对腺病毒感染的微弱影响。为了表明IFNα/抗体中和协同作用是TRIM21依赖的，我们特异地消除了由IFNα上调的TRIM21水平，导致95%以上的感染性恢复（图1B）。在所有的实验中，病毒感染的抗体中和直接与TRIM21水平相关（图1C）。例如，表达最多TRIM21的细胞对腺病毒感染的抵抗力比表达最少的那些细胞几乎多2个数量级。
实施例3：条件的变异
为了证实TRIM21/抗体细胞内中和不是腺病毒特异的，我们检测了其对克萨奇病毒B3感染的作用。克萨奇病毒B3是微小核糖核酸病毒，与脊髓灰质炎病毒是相同的属，是无菌性脑膜炎的主要原因。使用携带GFP受体基因的有复制能力的株感染如上所述的用TRIM21siRNA和IFNαA组合预处理的HeLa细胞。感染时间限于<16小时以防止感染扩散。TRIM21的内源性水平不足以介导显著的阻断（在TRIM21消除时感染增加2倍），但是在15μg/ml抗体存在时，用IFNα的处理几乎完全阻断了感染（图1D）。在IFNα处理的细胞中除去TRIM21将感染水平恢复到未处理过的细胞的水平，证明其为TRIM21依赖的作用。
通过检验不同siRNA序列、细胞类型和抗体类型的作用，我们确认了该表型的稳健性（robustness）。如图2A所见，具有不同靶序列的不同TRIM21siRNA通过敲低TRIM21水平逆转了腺病毒感染的抗体中和。其次，我们测试了一些细胞系，包括HeLa、HT1080和TE671。在每一种情况中，使用基于siRNA2序列的shRNA载体建立稳定的TRIM21敲低系。在所有的细胞中，TRIM21介导腺病毒的抗体中和（图2B）。最后，我们测试了两种不同的抗Ad5多克隆抗体（Abd Serotec和Millipore）以及抗Ad5六邻体单克隆（9C12）对腺病毒中和的作用。在每种情况中，通过TRIM21上调加强了腺病毒中和，并通过TRIM21KD逆转了腺病毒中和（图2C）。
通常认为抗体通过阻断受体结合和防止进入细胞中和病毒。但是，我们观察到的>90%的腺病毒的抗体中和是通过TRIM21介导的（例如，在200ng/μl抗体时，在HeLa对照中有0.27%的感染细胞，而在消除TRIM21的细胞中有10%的感染细胞）。为了验证这两个机制中的哪一个在多克隆反应中占主导，我们通过合并的人血清IgG观察腺病毒中和。我们发现，中和作用主要（在测试浓度范围内）由TRIM21介导（图2D）。TRIM21通过Fc结构域结合至IgG，因而缺少Fc的抗体片段则不再能有效地中和病毒。为了证实是TRIM21，而不是受体阻断，是病毒中和的主要原因，我们用胃蛋白酶处理血清IgG。胃蛋白酶切除IgG的Fc，产生了Fab2片段，其仍然是二价的并能够交联抗原。而且，Fab2片段以与IgG相同的亲和性与抗原结合。我们发现Fab2片段再不能有效地中和腺病毒感染（图2D）。而且，当使用Fab2时，IFNα处理或TRIM21KD不再影响腺病毒感染。
实施例4：与IgM和IgA的相互作用
上述实施例证实了为了使抗体介导细胞内病毒中和，其必须含有Fc片段，且TRIM21必须存在。
在感染的早期阶段，其中固有免疫是重要的，IgM而不是IgG抗体决定抗体组库。我们测试了TRIM21是否与IgM相互作用，如果是，TRIM21在IgM病毒中和中是重要的。为了调查TRIM21：IgM结合，我们用Alexa488荧光团标记TRIM21PRYSPRY结构域，并在IgM滴定下测量其荧光各向异性（图2E）。得到的滴定曲线(Materials&Methods)进行拟合，给出16.8μM±1.5μM的亲和性（KD）。但是，由于全长TRIM21是多聚物，TRIM21对IgM的体内亲和性可能显著地更高。当作为单体检测时，以纳摩尔亲和性的水平结合IgM的补体C1q具有检测不到的亲和性6。
之后，我们检测了血清IgM对腺病毒感染的作用。我们发现合并的人血清IgM和TRIM21协同作用来中和腺病毒感染（图2F）。而且，如使用IgG一样，通过IgM的病毒中和需要TRIM21。这表明TRIM21与固有免疫一同发挥作用，在体液免疫反应的早期阶段是保护性的。
在IgA方面看到了相同的作用（图2G）。由于其是粘膜中主要的同种型，IgA是重要的，其通常是与病毒接触的第一方面。使用血清分泌的IgA的感染实验表明TRIM21可以使用IgA来中和病毒。抗TRIM21siRNA防止了病毒中和，而IFN-α增强了病毒中和。
实施例5：TRIM21免疫的机制
前面的实施例证实了存在一种通过TRIM21和能够防止病毒感染的抗体所介导的细胞内免疫反应。之后，我们检验了该细胞内中和发生的机制。我们以三种方式调查了该机制。首先，我们确定了TRIM21是如何靶向抗体的，以及相互作用的热动力学。其次，我们检验了中和所需要的靶向后的事件。第三，我们询问了病毒是如何被中和的。
TRIM21是由RING、B盒、卷曲螺旋和PRYSPRY结构域组成的多结构域蛋白。应用多角度光散射（MALS）和荧光滴定光谱，我们测试了在IgG结合中这些结构域的作用。MALS数据分析揭示了重组全长TRIM21形成了稳定的二聚物，而不是先前报道的三聚物7（图3A）。而且，当与IgG混合时，TRIM21形成由1个抗体和1个TRIM21组成的理论配比的（stoichiometric）复合体（图3A）。RING结构域单独缺失导致重组蛋白丧失稳定，但是RING和B盒二者的缺失不影响TRIM21的稳定性或其二聚化的能力（数据未显示）。荧光滴定光谱揭示了结合至IgG的全长TRIM21和ΔRING-盒具有相似的<1nM的解离常数（KD）（图3B&C）。由于单体PRYSPRY结构域以～150nM的亲和性结合4，5，这表明TRIM21二聚化需要卷曲螺旋结构域，且两条IgG重链同时参与。TRIM21对IgG的亚nM亲和性使得TRIM21成为人体中最高亲和性的受体。这种高亲和性相互作用的进化解释了TRIM21是如何有效靶向病毒的。
下面，我们观察了TRIM21召集后病毒发生了什么，以及RING和B盒结构域的作用。由于RING结构域常常展示出E3泛素连接酶活性，我们假设TRIM21可以靶向结合的病毒以通过泛素化进行降解。对于泛素化的物质的降解，细胞具有两个途径-蛋白酶体和自噬。为了探索TRIM21的病毒中和中这些途径的作用，在MG132（一种蛋白酶体抑制剂）和3-甲基腺嘌呤（3-MA；一种自噬抑制剂）存在时，我们进行了病毒感染实验。自噬抑制剂对感染性没有作用，但是MG132显著逆转了感染性的TRIM21中和（图3D）。滴定实验表明渐增的MG132水平与降低的中和之间直接相关（图3E）。MG132逆转中和的能力依赖于抗体和TRIM21的存在。而且，加入MG132不能恢复消除了TRIM21的细胞中的感染，表明TRIM21和蛋白酶体功能是中和途径中的重要成分（图3F）。
为了确认泛素化对于病毒靶向蛋白酶体是否重要，我们测试了全长TRIM21和ΔRING-盒重组蛋白中和感染的能力。我们用抗体包被的病毒颗粒孵育蛋白，并允许病毒感染消除TRIM21的细胞。如在图4A中所见，RING和B盒结构域的消除防止了病毒的TRIM21中和。我们试图在过度表达TRIM21的细胞中重复这些实验，但是其导致了功能的丧失。用干扰素可部分恢复功能的丧失，表明过度表达滴定了重要的辅因子，而不产生失活的蛋白（数据未显示）。为了确认我们用重组蛋白所观察到的中和与泛素连接酶活性相关，我们比较了全长和ΔRING-盒蛋白自动泛素化的能力。尽管RING和B盒结构域的缺失对IgG结合无作用，但是其废除了泛素化（图4B）。因而，TRIM21泛素化活性和蛋白酶体功能都是病毒中和所需的。为了证实是细胞内TRIM21相关病毒颗粒被泛素化了，我们用共聚焦显微镜检测了感染的细胞，并对泛素进行染色。如我们在图4C中所见，与TRIM21共定位的病毒颗粒也是泛素阳性的。
尽管已知E3泛素连接酶是自身泛素化的，认为从泛素到底物的传递对于蛋白酶体靶向是重要的。可是，通过自身泛素化的蛋白酶体靶向将允许TRIM21中和任何病毒，并防止逃离泛素缀合的病毒突变的演变。与该机制一致，我们同时发现TRIM21在其自身上有效地形成泛素链，在我们的体外泛素化分析中我们没有发现可检测的IgG或病毒的泛素化（图4D）。这与TRIM21已经进化而具有极高的结合抗体的亲和性相关。如果TRIM21通过正常的酶流动（turnover）将泛素传递至抗体或病毒，那么高亲和性将体现为高度低效的KM。
为了确定病毒在TRIM21介导的靶向至蛋白酶体后发生了什么，我们进行了衣壳命运的时间进程实验。我们比较了感染的HeLa细胞与消除了TRIM21的细胞中，六邻体蛋白（病毒衣壳）的水平。感染后2小时，与消除了TRIM21的细胞相比，HeLa中的六邻体显著减少（图4E）。这既表明TRIM21介导病毒降解，又表明其是一个迅速的过程。加入MG132防止了六邻体水平的降低，确认了病毒是以蛋白酶体依赖的方式被物理降解的。由于通过TRIM21的蛋白酶体靶向需要病毒结合至抗体，我们还观察了感染细胞中的抗体水平。我们发现病毒的破坏与抗体的处置平行（图4E）。相反地，我们几乎没有看到MG132对TRIM21水平的影响，这表明细胞内TRIM21仅有部分总池被降解或TRIM21是循环利用的（图4E）。
抗体靶向和TRIM21自身泛素化的组合意味着中和并不需要直接的病毒相互作用。这意味着TRIM21介导的免疫对大多数细胞内病原体广泛有效。为了验证该点，我们用包被在抗链霉亲和素抗体上的链霉亲和素乳胶珠转染细胞。TRIM21被有效地召集至抗体结合的珠（图5）。而且，TRIM21相关的珠是泛素阳性的。因而，TRIM21不需要任何直接的病原体相互作用用于结合或泛素化，TRIM21对广谱病原体应是有效的，且难以逃避。
实施例6：细胞培养中的活性
从野生型或TRIM21KO C57BL/6小鼠（22）制备胚胎纤维母细胞，并在9C12、单克隆的抗六邻体抗体（可获自DSHB,Iowa）存在下用GFP腺病毒攻击该细胞；六邻体是腺病毒主要的包衣（coat）蛋白。9C12强效地防止野生型小鼠的细胞感染，但对防止敲低小鼠的细胞感染几乎没有作用。敲低小鼠中几乎所有细胞都被感染，甚至在饱和浓度的抗体存在下。参见图6。这表明TRIM21提供了对病毒感染非常强效的保护，而且其对抗体的中和能力非常重要，因为在TRIM21缺失时，强效的中和抗体变成了无中和活性。
实施例7：野生型和敲低小鼠中的活性
病毒制备
用小鼠腺病毒1型（MAV-1）感染3T3小鼠纤维母细胞系，参照株购自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection）（ATCC）。四天后，收集感染的细胞和上清。通过3次重复的冻融循环，使病毒从细胞释放。细胞上清和无状沉淀物的细胞裂解物合并到一起，并通过2次在连续CsCl梯度中的平衡离心纯化MAV-1颗粒。通过测量对应于1.8x1013pfu/ml的A260值定量病毒。通过终点稀释分析和组织培养50%感染剂量值（TCID50）测量病毒感染性，由Reed和Munch方法计算，感染性为8.4x108/ml或5.8x108pfu/ml。
实验性感染
为了确定LD50，通过腹腔（i.p.）注射（每个剂量四只动物）100ul PBS中10倍系列稀释剂量的MAV-1来感染六周龄C57BL6小鼠，每天观察多至两次发病率和致死率。用4x105pfu的野生型小鼠感染导致75%致死率（图8）。因而，对于所有进一步的在C57BL/6野生型和TRIM21敲除（knockout）小鼠中的实验，我们选择亚临床剂量的4x104pfu MAV-1。
病毒滴度
为了测试TRIM21在对感染的免疫中的参与，我们用4x104pfu剂量的MAV-1攻击6只WT和6只KO未处理的小鼠。除非小鼠超出中等症状，否则在p.i.第9天剔除小鼠。从剔除的小鼠收集脾脏和脑，并制备病毒和基因组DNA。基因组DNA用在使用特异的六邻体引物的RT-PCR中，来定量病毒水平。通过TCID50来滴定病毒，以便确定每个动物中的病毒血症。这样设计实验，从而TRIM21增强初级免疫反应（IgM）的能力是生存和/或病毒血症的主要决定因素。
为了确定TRIM21在保护性免疫（IgG）中的作用，在具有对病毒的中和抗体的、MAV-1攻击的小鼠上进行实验。因此，用亚临床剂量的MAV-1攻击小鼠，9天后用临床剂量的病毒再次攻击。
在两个实验中，观察到作为MAV-1感染的结果，TRIM21KO小鼠表现出增加的病毒负载和/或致死率。我们得出结论，TRIM21的存在对于介导小鼠中的抗体处理的抗病毒作用是重要的，其已知可有效对抗腺病毒感染（16）。
实施例8：抗体-TRIM21融合
我们检测了单克隆抗六邻体小鼠抗体（9C12），发现其具有强效的抗腺病毒感染的中和活性（参见实施例6）。从9C12杂交瘤细胞中制备cDNA，使用以下引物通过PCR扩增轻链和重链：
轻链：
pBudCE4.1的CMV启动子中的kappa链:
正向:
VL1S acgtGTCGACccaccATG GAG ACA GAC ACA CTC CTG CTA T
VL2S acgtGTCGACccaccATG GAT TTT CAA GTG CAG ATT TTC AG
VL3S acgtGTCGACccaccATG GAG WCA CAK WCT CAG GTC TTT RTA
VL4S acgtGTCGACccaccATG KCC CCW RCT CAG YTY CTK GT
VL5S acgtGTCGACccaccATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG
反向：
CLX catgtctagaCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC
重链
pBudCE4.1的EF-1a启动子中的重链gamma-1（图7）:
正向
VH1N aataGCGGCCGCcaccATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT
VH2N aataGCGGCCGCcaccATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT
VH3N aataGCGGCCGCcaccATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT
VH4N aataGCGGCCGCcaccATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG
反向
CHKpn catgGGTACCTCATTTACCAGGAGAGTGGGAG
其中:r=a,g;y=c,t;m=a,c;k=g,t;s=c,g;w=a,t;v=a,c,g;n=a,c,g,t.
然后测序扩增的DNA，给出以下轻链和重链序列：
重链:SEQ ID NO13
轻链:SEQ ID NO14
然后将相应的氨基酸序列逆翻译成pBudCE4.1中用于表达的密码子优化的DNA序列（图7）。用N端分泌信号克隆每个链以保证抗体蛋白的分泌。
优化的序列如下：
重链:SEQ ID NO15
轻链:SEQ ID NO16
然后使用得到的重组9C12表达载体作为起点来克隆融合蛋白，从而重链C端（CH3的端）通过短接头连接至TRIM21的起点。克隆三个变体，其代表全长TRIM21、RING、B盒和卷曲螺旋结构域，或RING和B盒的融合。在一个形式中，获得的融合序列如下：
9C12-全长TRIM21融合:SEQ ID NO17
9C12-RBCC融合:SEQ ID NO18
9C12-RB融合:SEQ ID NO19
在各情况中，这些重链融合与未修饰的轻链在多链表达载体pBud中共同表达（参见图7）。这些构建体的表达可以在如悬浮细胞系293F的细胞系中进行。抗体被分泌至介质中。为了从介质中纯化抗体，将上清加载至蛋白A亲和树脂，然后在低pH缓冲液中洗脱。洗脱后，将纯化的蛋白返回生理盐缓冲溶液。通过SDSPAGE分析纯化的蛋白的纯度。
然后应用下面的实验检测嵌合蛋白的效率：GFP腺病毒与嵌合蛋白在一定范围的浓度下预孵育。以经过设计产生～0.5MOI的病毒滴度，向培养的细胞中加入腺病毒嵌合混合物。感染细胞孵育～24小时，通过FACS分析通过计数GFP阳性细胞数目确定感染效率。可被用于检测效率的细胞系包括容许腺病毒的细胞系，例如293、HeLa和MEF。为了进一步证明嵌合物的有效性，可在由siRNA或shRNA消除内源的TRIM21的条件下或在TRIM21被遗传敲除的细胞中进行这些实验。
实施例9
上述实验涉及这样的分子，其中病毒结合活性和TRIM21功能组合在一个多肽中。如果这样的一个多肽需要另一个多肽链以发挥功能（例如轻链），其必须在与病毒孵育前加入，通常在表达过程中。在下一个实施例中，我们描述了在不存在内源TRIM21蛋白时能够结合抗体并具有TRIM21活性的分子。因而，不是在一个分子中既具有病毒结合又具有TRIM21功能，而是两种活性独立地加在两个分离的分子中-一个具有结合病原体的能力（例如抗体），另一个具有结合第一个并引起病原体被中和的能力（例如TRIM21）。之前我们已经描述了外源地加入TRIM21，并表明了其具有抗病毒活性。该实施例描述了蛋白A（pA）的抗体结合结构域至TRIM21催化结构域的融合。给出了三个实施例：使用RING、B盒和卷曲螺旋结构域，RING和B盒结构域，或RING结构域。进一步的实施例是一个变化，其中蛋白A结构域被发现于C端。考虑了其它构建体，其中用其它抗体结合结构域（如蛋白G、选择的肽配体）替代pA，和/或其中替代催化结构域（如用其它TRIM蛋白的那些）以保留泛素-蛋白酶体召集。
pA-RBCC SEQ:ID NO20
pA-RB:SEQ ID NO21
pA-R:SEQ ID NO22
RBCC-Pa:SEQ ID NO23
将这些序列克隆至具有亲和性标签的细菌表达构建体，以允许有效的纯化（His和MBP标签）。在25°C下过夜表达蛋白，裂解细胞并在亲和树脂上纯化蛋白，之后凝胶过滤。在一定范围浓度下通过用抗病毒抗体（如9c12）孵育蛋白，并在以～0.5的MOI感染培养的细胞之前，将混合物加入病毒（如GFP腺病毒），来测试抗病毒效率。必须使用允许的细胞系（例如对于腺病毒-HeLa、293、MEFs）。然后通过GFP阳性细胞数目的计数由FACS确定感染效率。
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Figure IDA00002945916300011
Figure IDA00002945916300021
Figure IDA00002945916300031
Figure IDA00002945916300041
Figure IDA00002945916300061

Claims (24)

1.一种化合物，其包括：
（a）直接或间接地，特异地结合病原体抗原的配体，只要所述配体不是TRIM21的PRYSPRY结构域；和
（b）RING结构域和/或TRIM21表达的诱导子。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述配体直接地结合抗原，并选自免疫球蛋白分子的至少部分、肽和/或核酸适体、以及结构多肽配体。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中免疫球蛋白分子选自IgG、IgA、IgM、IgE、IgD、F(ab')2、Fab、Fv、scFv、dAb、VHH、IgNAR、修饰的TCR和其多价组合。
4.根据权利要求3所述的化合物，其中免疫球蛋白分子包括VH结构域和VL结构域的至少一个。
5.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中抗原对病毒是特异的。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中配体间接地结合抗原，且选自蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗免疫球蛋白肽和抗免疫球蛋白抗体。
7.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中RING结构域具有E3连接酶活性。
8.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其中RING结构域源自TRIM多肽。
9.根据权利要求8所述的化合物，其中TRIM多肽选自TRIM5α、TRIM19、TRIM21和TRIM28。
10.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其具有两个或多个RING结构域。
11.根据前述权利要求任一项所述的化合物，其进一步包括TRIM多肽B盒结构域和/或TRIM多肽卷曲螺旋结构域。
12.根据权利要求11所述的化合物，其包括TRIM多肽，其中B30.2结构域被VH结构域和VL结构域的至少一个所替代。
13.根据权利要求1至12任一项所述的化合物，其中TRIM21表达的诱导子是干扰素或干扰素诱导子。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中干扰素诱导子选自病毒或细菌抗原、多聚阴离子、TLR激动剂和小分子干扰素诱导子。
15.根据权利要求13或权利要求14所述的化合物，其中干扰素或干扰素诱导子通过不稳定接头结合至化合物。
16.一种治疗病原体感染的方法，其包括向受试者施用根据上述权利要求任一项所述的化合物。
17.根据权利要求1至15任一项所述的化合物用于治疗病原体感染的用途。
18.一种用于治疗受试者中感染的方法，其包括向受试者联合施用特异于引起所述感染的病原体抗原的抗体，以及包括结合至所述抗体的配体的多肽，和RING结构域。
19.特异于在受试者中引起感染的病原体抗原的抗体、和包括结合至所述抗体的配体的多肽和RING结构域用于治疗所述感染的用途。
20.一种用于在遭受感染的受试者中治疗这种感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的多肽，该多肽包括包含间接结合病原体抗原的配体的多肽，和RING结构域。
21.包括包含间接结合病原体抗原的配体的多肽和RING结构域的多肽用于在受试者中治疗感染性疾病的用途。
22.根据权利要求18或20所述的方法，或根据权利要求19或21所述的用途，其中配体选自TRIM21PRYSPRY结构域、蛋白A、蛋白G、蛋白L、抗免疫球蛋白肽和抗免疫球蛋白抗体。
23.根据权利要求18至22任一项所述的方法或用途，其中多肽进一步包括TRIM多肽卷曲螺旋结构域和/或TRIM多肽B盒结构域。
24.根据权利要求23所述的方法或用途，其中多肽是人TRIM21。
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