PT2035581E

PT2035581E - Composição de adn contra o antigénio do estroma tumoral fap e métodos de utilização desta

Info

Publication number: PT2035581E
Application number: PT77963056T
Authority: PT
Inventors: Ralph A Reisfeld; Markus Loeffler; Joerg A Krueger; Andreas G Niethammer
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2006-06-21
Filing date: 2007-06-21
Publication date: 2012-12-06
Also published as: EP2035581A4; DK2035581T3; CN101506381A; US20090253778A1; PL2035581T3; CA2657217A1; WO2007149518A2; EP2035581A2; JP2009541328A; CN101506381B; ES2393372T3; WO2007149518A3; EP2035581B1

Description

ΕΡ 2 035 581/PT

DESCRIÇÃO "Composição de ADN contra o antigénio do estroma tumoral FAP e métodos de utilização desta"

CAMPO DO INVENTO

Este invento refere-se a composições de ácido desoxirribonucleico (ADN) codificando moléculas adequadas eficazes para desencadear uma resposta imunitária contra fibroblastos do estroma em tumores. Mais particularmente este invento refere-se a composições de ADN codificando para o antigénio do estroma conhecido como proteina de activação de fibroblastos (FAP). Este invento refere-se também a métodos de utilização da composição de ADN para inibir crescimento tumoral e metástases tumorais para aumentar a tomada celular de agentes quimioterapêuticos.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Tornou-se cada vez mais claro que os antigénios tumorais são alvos esquivos para terapia de cancro. Isto pode ser explicado através de uma variedade de caracteristicas únicas para as células tumorais, incluindo mutações dos seus antigénios e apresentação de antigénio inadequada devido a sub-regulação da expressão do antigénio de MHC. Além disso, defeitos nas vias de sinalização de apoptose, bem como sobre-regulação de inibidores de apoptose tais como survivina, XIAP ou membros anti-apoptóticos da família bcl-2 não só conferem resistência a morte mediada por células T, como também ao efeito indutor de apoptose de agentes quimioterapêuticos.

Existe um reconhecimento crescente de que o compartimento do estroma desempenha um papel crucial na tumorigénese e invasão tumoral. Foi mostrado que as células do estroma estimulam a transformação de células epiteliais normais e o intercâmbio de factores de crescimento, citocinas e quimioatractores para activar a matriz extracelular adjacente e induzir a selecção e expansão de células neoplásicas. Num estudo, células tumorais injectadas em ratinhos como uma suspensão não eram, conforme relatado, tumorigénicas, enquanto a injecção de fragmentos de tumores 2 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ sólidos contendo ο seu estroma levou, conforme relatado, ao crescimento de tumores (ver Singh et al., J. Exp. Med. 1992; 175: 139-146). A matriz extracelular activada confere aparentemente quimiorresistência mediada por integrinas 1, que aderem à fibronectina, conduzindo à activação de tirosina-cinase estimulada pela integrina- 1, que, por sua vez, inibe a apoptose induzida por quimioterapia. Este fenómeno foi relatado em células de mieloma sensiveis a doxorrubicina, que desenvolveram resistência após aderência a fibronectina. Relatórios recentes indicam que a rejeição tumoral pode ser conseguida através da modulação de fibroblastos do estroma tumoral ou através da distribuição da rede do estroma tumoral. Além disso, macrófagos e

fibroblastos associados a tumores contribuem, conforme relatado, para o ambiente imunossupressor local, devido à sua capacidade para sintetizar proteínas, tais como VEGF, TGF- 1 e IL-10. VEGF funciona como um inibidor da maturação de células dendríticas e, portanto, conduz a células T tolerantes. VEGF é também um factor principal envolvido na angiogénese tumoral. A activação de VEGF conduz a sobre-regulação da survivina e muitas outras proteínas inibidoras da apoptose em células endoteliais tumorais, protegendo-as dos efeitos apoptóticos da quimioterapia. Em contraste, a inibição de TGF- 1 pode resultar na erradição de tumores e protecção contra metástases. A IL-10 inibe a maturação de células dendríticas e desse modo suprime as respostas anti-tumorais mediadas por células mediadas por células Thl. Este efeito desloca as células dendríticas para respostas imunitárias humorais grandemente ineficazes.

Os fibroblastos são células do tecido conjuntivo que segregam uma matriz extracelular rica em colagénio e outras macromoléculas. Os fibroblastos do estroma tumoral (i.e., o tecido de suporte do tumor) sintetizam proteína de activação de fibroblastos (FAP), uma proteína transmembranar de tipo II que funciona como uma serina-protease. FAP é selectivamente sobre-expressa em mais de 90% dos fibroblastos do estroma associados a carcinomas do cólon, da mama e do pulmão. A sobre-expressão transiente de FAP pode também ser observada durante a cicatrização de feridas e em alguns tecidos fetais mesenquimatosos. Além disso, esta enzima cliva, conforme relatado, gelatina e colagénio de tipo I, e tem sido 3 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ implicada na remodelação da matriz extracelular. A sobre-expressão de FAP levam conforme relatado, à promoção do crescimento tumoral e a aumentos do potencial metastático, enquanto o tratamento com anticorpos anti-FAP inibe o crescimento do tumor. Além disso, expressão de colagénio de tipo I pelo estroma tumoral, que é principalmente produzido por fibroblastos, correlaciona-se inversamente com a tomada intra-tumoral de vários compostos, incluindo agentes quimioterapêuticos, sustentando assim o envolvimento do compartimento do estroma na resistência à quimioterapia. Têm sido utilizadas vacinas para proporcionar uma protecção de longa duração contra várias condições de doença, através de administração muito limitada de um agente profiláctico, que estimula o sistema imunitário de um organismo para destruir os patogénios das doenças antes que possam proliferar e causar um efeito patológico. Várias abordagens para vacinas e vacinações são descritas em Bernard R. Glick e Jack J. Pasternak, "Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant ADN", ASM Press págs. 253-276 (1998) . A vacinação é um meio de indução do próprio sistema imunitário do organismo para procurar e destruir um agente infeccioso antes que este cause uma resposta patológica. Tipicamente, as vacinas são agentes infecciosos vivos, mas atenuados, (vírus ou bactérias) , ou uma forma morta do agente. Uma vacina consistindo numa bactéria ou vírus vivo deve ser não-patogénica. Tipicamente, uma cultura bacteriana ou virai é atenuada (enfraquecida) através de tratamento físico ou químico. Embora o agente seja não virulento, pode ainda provocar uma resposta imunitária num paciente tratado com a vacina.

Uma resposta imunitária é desencadeada por antigénios, que podem ser macromoléculas específicas ou um agente infeccioso. Estes antigénios são geralmente proteínas, polissacáridos, lípidos, ou glicolípidos, que são reconhecidos como "estranhos" por linfócitos conhecidos como células B e células T. A exposição de ambos os tipos de linfócitos a um antigénio desencadeia uma rápida divisão celular e uma resposta de diferenciação, resultando na 4 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ formação de clones dos linfócitos expostos. As células B produzem células de plasma, que, por sua vez, produzem proteínas denominadas anticorpos (Ab), que se liqam selectivamente aos antigénios presentes no agente infeccioso, neutralizando ou inactivando assim o patogénio (imunidade humoral). Nalguns casos, a resposta de células B requer a ajuda de células T ajudantes CD4. O clone de células T especializadas que se forma em resposta à exposição ao antigénio é um linfócito T citotóxico (CTL), que é capaz de se ligar e eliminar patogénios e tecidos que apresentem o antigénio (imunidade mediada por células ou celular). Nalguns casos, uma célula de apresentação do antigénio (APC) , tal como uma célula dendrítica, envolverá um patogénio ou outra célula estranha através de endocitose. A APC, processa então os antigénios das células e apresenta estes antigénios na forma de uma molécula de histocompatibilidade: o péptido complexa com o receptor da célula T (TCR) nas CTL, estimulando assim uma resposta imunitária. A imunidade humoral, caracterizada pela formação de anticorpos específicos, é geralmente mais eficaz contra infecções bacterianas agudas e infecções repetidas de vírus, enquanto a imunidade mediada por células é mais eficaz contra infecção virai, infecção bacteriana intracelular crónica e infecção fúngica. Sabe-se também que a imunidade celular protege contra certos cancros e é responsável pela rejeição de transplantes de órgãos.

Os anticorpos para antigénios de infecções anteriores permanecem detectáveis no sangue durante períodos de tempo muito longos, proporcionando assim um meio de determinação de exposição anterior a um patogénio. Após re-exposição ao mesmo patogénio, o sistema imunitário previne eficazmente a reinfecção eliminando o agente patogénico antes que este possa proliferar e produzir uma resposta patogénica. A mesma resposta imunitária que seria desencadeada por um patogénio pode também por vezes ser produzida por um agente não patogénico que apresente o mesmo antigénio que o patogénio. Deste modo, o sujeito pode ser protegido contra a 5 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ exposição subsequente ao patogénio sem ter previamente lutado contra uma infecção.

No entanto, nem todos os agentes infecciosos podem ser facilmente cultivados e inactivados, tal como é necessário para a formação da vacina. As técnicas modernas de ADN recombinante permitiram a concepção de novas vacinas para tentar superar esta limitação. Podem ser criados agentes infecciosos que não possuam os genes patogénicos, permitindo assim que uma forma viva, não virulenta do organismo seja utilizada como uma vacina. É também possível conceber um organismo relativamente não patogénico tal como E. coli para apresentar os antigénios de superfície celular de um transportador patogénico. 0 sistema imunitário de um sujeito vacinado com um tal transportador transformado é "enganado" para formar anticorpos para o patogénio. As proteínas antigénicas de um agente patogénico podem ser concebidas e expressas numa espécie não patogénica e as proteínas antigénicas podem ser isoladas e purificadas para produzir uma "vacina de subunidade". As vacinas de subunidade têm a vantagem de ser estáveis, seguras e quimicamente bem definidas; no entanto, a sua produção pode ser de custo proibitivo.

Uma nova abordagem para vacinas tem emergido em anos recentes, geralmente chamada imunização genética. Nesta abordagem, um ácido nucleico (polinucleótido) codificando um antigénio de um agente patogénico é operativamente inserido em células no sujeito a imunizar. As células tratadas, de preferência células de apresentação do antigénio (APC), tais como as células dendríticas, são transformadas e produzem as proteínas antigénicas do patogénio. Estes antigénios produzidos in vivo desencadeiam então a resposta imunitária desejada no hospedeiro. 0 material genético utilizado em tais vacinas genéticas pode ser uma construção de ADN ou ARN. Frequentemente o polinucleótido codificando o antigénio é introduzido em combinação com outras sequências polinucleotídicas promotoras para estimular a inserção, replicação ou expressão do gene.

Vacinas de ADN codificando genes de antigénios podem ser introduzidas nas células hospedeiras do sujeito através de 6 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ uma variedade de sistemas de distribuição. Estes sistemas de distribuição incluem sistemas de distribuição procarióticos e virais. Por exemplo, uma abordagem consiste em utilizar um vector virai, tal como o vírus vacínia incorporando o novo material genético, para inocular as células hospedeiras. Alternativamente, o material genético pode ser incorporado num vector plasmídico ou pode ser distribuído directamente às células hospedeiras, como um polinucleótido "nu", i.e., simplesmente como ADN purificado. Além disso, o ADN pode ser transfectado estavelmente para bactérias atenuadas, tais como Salmonella typhimurium. Quando um paciente é oralmente vacinado com a Salmonella transformada, as bactérias são transportadas para placas de Peyer no intestino (i.e. tecidos linfóides secundários), que estimulam então uma resposta imunitária.

Vacinas de ADN proporcionam uma oportunidade para imunização contra estados de doença que não são causados por agentes patogénicos tradicionais, tais como doenças genéticas e cancro. Tipicamente, uma vacina de cancro genética introduz em APC um gene que codifica um antigénio, e as APC assim transformadas produzem antigénios para um tipo específico de célula tumoral. Uma vacina geral eficaz contra vários tipos de cancro pode assim implicar numerosas vacinas individuais para imunização contra cada tipo de célula de cancro.

Existe uma necessidade contínua de uma composição de ADN geralmente eficaz, tal como uma vacina, para imunização contra várias formas de cancro. 0 presente invento satisfaz esta necessidade.

SUMÁRIO DO INVENTO

Uma composição ADN eficaz para inibição do crescimento tumoral e de metástases tumorais compreende uma construção de ADN que codifica pelo menos um epitopo da proteína de activação de fibroblastos (FAP), que se possa expressar em células imunitárias de um sujeito ao qual a construção de ADN tenha sido administrada. A construção de ADN é incorporada num transportador farmaceuticamente aceitável. A composição pode codificar um único epitopo de FAP, um polipéptido compreendendo dois ou mais epitopos de FAP, a proteína FAP 7

ΕΡ 2 035 581/PT inteira, ou qualquer porção desta que desencadeie a resposta imunitária desejada contra células do estroma tumoral. De preferência, a construção de ADN codifica para FAP humana possuindo a sequência de resíduos de aminoácidos consistindo em SEQ ID NO: 2 ou uma proteína que tenha pelo menos 80% de semelhança de sequência com SEQ ID NO: 2 e que inclua pelo menos um epitopo de FAP. A construção de ADN pode ser uma construção de ADN nu, de preferência na forma de um plasmídeo. Tais construções de ADN nu podem ser incorporadas num veículo de distribuição de lipossomas, um veículo de distribuição polimérico, electroporação, biolistica de genes, e semelhantes, se desejado. Nalgumas concretizações preferidas a construção de ADN é incorporada num vector virai atenuado ou vector bacteriano atenuado.

Numa concretização preferida, a construção de ADN é incorporada num vector bacteriano atenuado, tal como uma Salmonella typhimurium atenuada, de maior preferência a estirpe duplamente atenuada (AroA, dam~) de Salmonella typhimurium.

Opcionalmente, a composição de ADN pode também compreender uma construção de ADN codificando uma proteína efectora imunitária, tal como uma citocina. Citocinas preferidas incluem CCL21, IL-2, e CD40LT.

As composições de ADN do presente invento podem actuar como vacinas que se dirigem ao antigénio de fibroblastos do estroma tumoral FAP, que serve como alvo para imunoterapia de cancro mediada por células T. Os fibroblastos do estroma são células não transformadas presentes no ambiente tumoral, que suportam o crescimento tumoral. A abordagem de direccionamento a FAP expressa por fibroblastos do estroma tem várias vantagens sobre terapias dirigidas contra antigénios que são exclusivamente expressos por células tumorais. Primeiro, os fibroblastos do estroma são geneticamente mais estáveis do que as populações de células tumorais heterogéneas que mutam frequentemente. Consequentemente, a expressão do antigénio alvo permanece mais estável e serve como um alvo mais confiável para 8 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ imunoterapia. Segundo, a apresentação do antigénio de fibroblastos do estroma ao complexo receptor de células T não é prejudica pela sub-regulação da expressão do MHC-antigénio, conforme é frequentemente o caso em células tumorais. Terceiro, as células tumorais tornam-se frequentemente cada vez mais resistentes à morte mediada por células T devido a defeitos nas vias de sinalização de apoptose, sobre-regulação de proteínas anti-apoptóticas, ou efeitos imunossupressores nos CTL. Além disso, o direccionamento a FAP, que é especificamente sobre-expressa no compartimento do estroma em mais de 9 0% dos carcinomas do cólon, da mama e do pulmão permite uma composição terapêutica para tratar várias malignidades diferentes, em contraste com terapias envolvendo antigénios que são expressos unicamente por tipos específicos de tumores.

Numa concretização preferida, as composições de ADN do presente invento quebram a tolerância das células T periféricas contra o auto-antigénio de FAP através da distribuição do seu ADNc como como uma composição oral de ADN com um vector de distribuição bacteriano atenuado (p.ex. uma estirpe atenuada de Salmonella typhimurium) a células de apresentação do antigénio num órgão linfóide secundário, i.e., as placas de Peyer do intestino delgado. Numa abordagem profilática, a resposta imunitária anti-tumoral mediada por células T induzida através de vacinação com uma composição de ADN do invento inibiu o crescimento tumoral em dois modelos de tumores de murídeo diferentes, i.e., em carcinoma do cólon resistente a múltiplos fármacos CT26, e carcinoma da mama resistente a múltiplos fármacos D2F2. As presentes composições de ADN suprimem também significativamente a disseminação de metástases pulmonares estabelecidas num modelo terapêutico de carcinoma do cólon CT26.

Uma composição de ADN preferida compreende um transportador de Salmonella atenuada, que é a estirpe duplamente atenuada de S. typhimurium designada como RE 88, e que inclui as mutações dam~ e Aroa~, disponíveis em Remedyne Corporation (Santa Barbara, CA) . 0 transportador de Salmonella atenuada inclui ADN codificando pelo menos um epitopo de FAP, que se pode expressar em células imunitárias. As bactérias não expressam por si próprias FAP, mas 9

ΕΡ 2 035 581/PT distribuem em vez disso o ADN de FAP a células imunitárias (p.ex., macrófagos e células dendriticas) que por sua vez expressam FAP. Tais composições podem prolongar os efeitos anti-tumorais até 10 meses, e ainda atingir uma sobre-regulação marcada de marcadores de activação de células T, células NK e DC em modelos de murideo. Além disso, experiências de esgotamento in vivo de células T indicaram apenas o envolvimento de células T CD8+, e nenhum envolvimento de células T CD4+. O efeito citotóxico in vitro mediado por vírus T CD8+ foi especificamente dirigido contra células alvo que sobre-expressam o antigénio de FAP. Por exemplo, numa experiência de prova do conceito, células T CD8+ de ratinhos vacinados com uma composição do invento induziram lise citotóxica in vitro de células tumorais modificadas para sobre-expressarem FAP, o que indica uma resposta imunitária específica a FAP. Surpreendentemente, apesar de se verificar que a FAP era também transientemente sobre-expressa durante a cicatrização de feridas, não foi observado comprometimento da cicatrização de feridas causado pela vacinação com as composições de ADN do invento.

As composições de ADN do presente invento podem também incorporar construções de ADN que codificam moléculas efectoras imunitárias como adjuvantes para a composição. Tais moléculas efectoras imunitárias incluem, por exemplo, IL-2, um indutor da proliferação de células T; CCL21, uma quimocina que atrai quimicamente células dendriticas maduras, e células T ingénuas; e CD40LT, um conhecido indutor da maturação de células dendriticas. Os ácidos nucleicos codificando a proteína efectora imunitária são de preferência incorporados num plasmídeo. As construções de ADN de FAP e da proteína efectora imunitária podem ser incorporadas no mesmo plasmideo ou em dois plasmídeos separados. A resposta de CTL induzida contra fibroblastos do estroma tumoral pode inibir o crescimento de uma variedade de tumores, e não é específica de um determinado tipo de tumor. O presente invento proporciona também um método de inibição do crescimento tumoral e das metástases tumorais num mamífero compreendendo a administração a um mamífero de uma composição de ADN do invento numa quantidade suficiente para 10 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ desencadear uma resposta imunitária contra células do estroma tumoral que apresentem o antigénio de FAP.

Outro aspecto do presente invento é um regime terapêutico de combinação eficaz que envolve a administração de um agente quimioterapêutico em conjunto com uma composição de ADN do invento. Nesta concretização do método do presente invento vários agentes quimioterapêuticos, tais como doxorrubicina, paclitaxel, e/ou ciclofosfamida, que não causam supressão da medula óssea quando administrados na dose máxima tolerável (DMT), são administrados ao paciente em conjunto com uma composição de ADN do invento compreendendo uma construção de ADN que codifica FAP ou uma porção imunogénica desta. A combinação de uma composição de ADN de FAP do invento com tais fármacos oferece uma vantagem adicional, que é a sub-regulação da expressão de colagénio de tipo I, e consequentemente, maior tomada intratumoral de vários agentes quimioterapêuticos e outros compostos. As composições de ADN do presente invento conduzem a maior tomada pelas células tumorais de uma variedade de moléculas, incluindo, mas não limitado a agentes quimioterapêuticos anti-tumorais. Por exemplo, o corante de baixo peso molecular fluoresceina (376 Da) , o composto azul de Evans-albumina de elevado peso molecular (68500 Da) , e o agente quimioterapêutico anti-tumoral 5-fluorouracilo (5-FU; 130 Da) , todos foram tomados pelas células tumorais a níveis muito mais elevados em ratinhos tratados com uma composição de ADN do invento relativamente a ratinhos tratados com uma composição de controlo inactiva. A combinação da composição de ADN do invento mais o fármaco anti-tumoral doxorrubicina induziu completa rejeição de tumores da mama criados ortotopicamente em 50% dos ratinhos tratados com a presente terapia de combinação. A rejeição completa de tumores não foi observada em ratinhos tratados com uma composição de ADN sozinha ou doxorrubicina sozinha.

Um método preferido proporciona um meio para aumentar a tomada de um agente quimioterapêutico num mamífero. 0 método compreende a administração a um mamifero da composição de ADN do invento numa quantidade suficiente para desencadear uma resposta imunitária contra células no mamífero que apresentem 11 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ ο antigénio de FAP e depois a administração ao mamífero de uma quantidade eficaz de um agente quimioterapêutico.

Outra concretização preferida do método é um método de inibição do crescimento tumoral ou de metástases tumorais num mamífero compreendendo os passos de administração a um mamífero da composição de ADN do invento numa quantidade suficiente para desencadear uma resposta imunitária contra células no mamífero que apresentem o antigénio de FAP, e subsequentemente a administração ao mamífero de uma quantidade anti-tumoral eficaz de um agente quimioterapêutico anti-tumoral.

De preferência, os mamíferos tratados através dos métodos do presente invento são humanos.

Nas concretizações do método do presente invento, as composições de ADN podem ser administradas entericamente, tal como através de administração oral, ou parentericamente, tal como através de injecção ou infusão intravenosa. De preferência, as composições são administradas oralmente. As composições podem ser empacotadas em recipientes selados e marcadas com informação útil para que um médico administre eficazmente a composição.

As composições de ADN do presente invento são úteis para tratamento e prevenção de vários estados de doença. Por exemplo, um paciente sofrendo de cancro colorrectal, cancro da mama, cancro do pulmão, e semelhantes, pode beneficiar de imunização através das composições do presente invento.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A FIG. 1 é uma caracterização de uma construção de ADN de FAP de murídeo e de linhas celulares tumorais quimio-resistentes. O Painel A ilustra um ADNc plasmídico codificando a FAP inteira de murídeo, inserida no local EcoRI do vector pcADN3.1/V5-HÍS-T0P0 (pFAP). 0 Painel B mostra a expressão da proteína FAP que foi demonstrada através de Western blotting após transfecção transiente de células CT26. 0 Painel C mostra células de carcinoma do cólon CT26 e da mama D2F2 tratadas com vários agentes quimioterapêuticos nas 12 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ concentrações indicadas. Após 48 horas de incubação, a apoptose nuclear foi avaliada através de coloração com corante Hoechst-33342. As barras indicam a média mais o desvio padrão de 3 ensaios.

As FIG. 2a até FIG. 2c ilustram o efeito da composição de ADN baseada em FAP no crescimento tumoral. Configuração profiláctica: 10 dias após a última de 3 vacinações em intervalos de uma semana, realizadas tal como descrito em Materiais e Métodos, ratinhos BALB/c (n=8) foram confrontados através de injecção subcutânea (s.c.) com uma dose letal de 3χ104 células CT26 (FIG. 2a) ou ortotopicamente (o.t.), com uma dose letal de 3xl05 células D2F2 (FIG. 2b) . O crescimento tumoral médio de 8 ratinhos é representado, média + /- EP, P<0,01. Configuração terapêutica: ratinhos BALB/c (n=8) foram primeiro injectados intravenosamente (i.v.) com 105 células CT26 e depois tratados após 3 e 10 dias uma vez estabelecidas metástases pulmonares. Após 18 dias, os pulmões foram excisados e pesados (o peso do pulmão normal era cerca de 0,2 g) , examinados quanto a metástases, e registados através de uma avaliação visual. A percentagem de pulmão coberta por metástases fundidas foi avaliada como se segue: 0 = 0%, 1 = <20%, 2 = 20-50%, 3 = >50%, P<0,01. (FIG. 2c). A FIG. 3 ilustra a citotoxicidade induzida por células T CD8+. (A) É representado o efeito no tempo de vida do

esgotamento mediado por anticorpos durante a fase efectora em ratinhos tratados (* indica significância estatística em comparação com o grupo de controlo, p<0,01). (B) Células T CD8+ foram purificadas a partir de baços de ratinhos tratados, estimulados com células alvo tumorais irradiadas com raios e depois incubadas durante 48 horas com células transfectadas com pGFP ou pGFP/pFap. A apoptose nuclear foi avaliada através de coloração com corante Hoechst-33342 como se segue: Estádio de apoptose nuclear 0: sem apoptose; estádio 1: condensação da cromatina em grande escala; estádio 2a: fragmentação da cromatina; estádio 2b: corpos apoptóticos. (C, D) Esplenócitos de ratinhos imunizados com vector pFap e vazio (/1=3) foram estimulados durante 5 dias com fibroblastos A31 transfectados com pFap e depois sujeitos a um ensaio de libertação de 51Cr. (D) Células efectoras e

alvo foram co-incubadas com anticorpos anti-MHC de classe I 13

ΕΡ 2 035 581/PT (Média + DP, * indica significância estatística em comparação com o vector vazio, p<0,05). (E) Análise de FACS de suspensões de células individuais de tumores CT26 de ratinhos tratados (n=2) corados com anticorpos anti-CD3+ PerCP-Cy5.5 e anti-CD8+ FITC. É representada uma de duas experiências. (F) Secções representativas de tumores CT26 de ratinhos tratados com vector de pFap e vazio, corados com anticorpos anti-CD8 FITC e coloração nuclear com DAPI. A FIG. 4 demonstra a expressão de FAP/colagénio de tipo I e a tomada intra-tumoral de fluoresceína/Albumina/5-FU. (A) Análise imuno-histoquímica da expressão de FAP (painel superior) e colagénio de tipo I (painel inferior) em tumores CT26 s.c. de ratinhos tratados. (B) Immunoblots de FAP e colagénio de tipo I em tumores CT26 s.c. de ratinhos tratados. (C, D, E) Os gráficos de barras indicam médias + EP da densidade óptica ou medições da cintilação de homogenatos de tumores CT26 s.c. de ratinhos BALB/c tratados (n=4), após injecção i.p. de f luoresceína, injecção i.v. de azul de Evans-albumina ou injecção i.v. de 14C-5-fluorouracilo. P<0,05, P<0,01 e P<0,05, respectivamente. A FIG. 5 ilustra os efeitos anti-metastáticos da bioterapia e quimioterapia combinadas e efeitos secundários. (A) Configuração profiláctica: 10 dias após a última das 3 vacinações a intervalos de uma semana com a vacina de controlo, PBS ou a vacina do invento, ratinhos BALB/c (n=8; média ± EP) foram confrontados o.t. com 3xl05 células D2F2. Após 5, 10 e 15 dias, os ratinhos indicados foram tratados com doxorrubicina. (B) Configuração terapêutica: 5 dias após injecção i.v. de 105 células tumorais D2F2, ratinhos BALB/c (/1=8) foram tratados semanalmente com vacina de pFap ou vacina de controlo. Um dia após cada imunização os ratinhos foram tratados com doxorrubicina i.v. tal como indicado (* mostra grande significância em comparação com o grupo de controlo, p<0,0001, ** mostra significância em comparação com o grupo de controlo, controlo/Dox, pFap e pFap/Dox, p<0,0001). FIG. 6 (A) Concentração intra-tumoral de doxorrubicina: Ratinhos BALB/c tratados (n=4) foram confrontados s.c. com 5χ105 células D2F2 e após 16 dias a concentração de 14

ΕΡ 2 035 581/PT doxorrubicina em lisados tumorais reunidos foi determinada através de LC-MS (representativa de duas experiências, média + DP. P<0,001). (B) Feridas circulares de 3 mm de diâmetro foram infligidas na parte superior das costas de ratinhos tratados (n=4) e foi medido o tempo médio até ao completo encerramento da ferida (média + DP). A FIG. 7 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 1) de um ácido nucleico codificando FAP humana. A FIG. 8 ilustra a sequência de resíduos de aminoácidos de FAP humana (SEQ ID NO: 2). A FIG. 9 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 3) de um ácido nucleico codificando FAP de murídeo. A FIG. 10 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de FAP de murídeo (SEQ ID NO: 4). A FIG. 11 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO:5) de um ácido nucleico codificando IL-2 humana. A FIG. 12 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de IL-2 humana (SEQ ID NO: 6). A FIG. 13 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 7) de um ácido nucleico codificando IL-2 de murídeo. A FIG. 14 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de IL-2 de murídeo (SEQ ID NO: 8). A FIG. 15 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 9) de um ácido nucleico codificando CCL21 humana. A FIG. 16 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de CCL21 humana (SEQ ID NO: 10). A FIG. 17 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 11) de um ácido nucleico codificando CCL21b de murídeo. A FIG. 18 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de CCL21b de murídeo (SEQ ID NO: 12). 15 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ A FIG. 19 ilustra a semelhança da sequência de aminoácidos entre a CCL21 humana e a CCL21b de murídeo. A FIG. 20 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 13) de um ácido nucleico codificando CCL21a de murídeo. A FIG. 21 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de CCL21a de murídeo (SEQ ID NO: 14). A FIG. 22 mostra a sequência nucleotidica (SEQ ID NO: 15) de um ácido nucleico codificando CD40L humana. A FIG. 23 mostra a sequência de resíduos de aminoácidos de CD40L humana (SEQ ID NO: 16).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS CONCRETIZAÇÕES PREFERIDAS O presente invento proporciona uma composição de ADN eficaz para inibição de crescimento tumoral ou metástases tumorais, que se direcciona ao antiqénio do estroma tumoral conhecido como proteína de activação de fibroblastos (FAP). A composição de ADN compreende uma construção de ADN que codifica pelo menos um epitopo de FAP, que se pode expressar em células imunitárias, e que é incorporada num transportador farmaceuticamente aceitável. A construção de ADN pode codificar um único epitopo de FAP, um polipéptido compreendendo dois ou mais epitopos de FAP, a proteína FAP inteira, ou qualquer porção desta que desencadeie a resposta imunitária desejada contra células que expressem FAP, tais como células do estroma tumoral. A resposta imunitária desencadeada pelas composições do invento conduz à inibição de crescimento tumoral e metástases tumorais. O termo "construção de ADN", tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas, refere-se a uma estrutura de ADN que codifica para uma proteína ou um polipéptido de interesse, tal como um epitopo de FAP, proteína FAP, IL-2, CCL21, e semelhantes. As construções de ADN incluem qualquer ADN que possa ser transcrito em células alvo, incluindo ADN linear e ADN plasmídico, bem como ADN que tenha sido incorporado no material qenético de uma célula ou vírus. De 16 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ preferência, a construção de ADN é um ADN que tenha sido incorporado num vector de distribuição virai ou bacteriano, p.ex., um vector virai ou bacteriano atenuado que seja não patogénico. Quando um sujeito é tratado com uma composição do invento, o ADN codificando FAP é distribuído a células imunitárias (p.ex., macrófagos e células dendríticas), que expressam então a proteína FAP. Os transportadores virais e bacterianos do ADN de FAP não expressam, eles próprios, FAP.

As composições de ADN do presente invento estimulam a formação de CTL que são activos contra células que apresentem o antigénio de FAP, tais como células do estroma tumoral (p.ex., fibroblastos do estroma). Tais células do estroma tumoral são selectivamente direccionadas por CTL que são produzidos em resposta a imunização através das composições de ADN do invento. As composições do invento podem também reduzir a expressão do estroma tumoral de colagénio de tipo I, que por sua vez aumenta a tomada de agentes quimioterapêuticos.

Tal como aqui se utiliza, o termo "imunidade" refere-se a uma protecção imunológica de longa duração contra células expressando um antigénio. O termo "imunização" refere-se à exposição a um antigénio, que resulta em imunidade às células que expressem o antigénio no sujeito tratado. 0 termo "proteína FAP" refere-se à FAP humana ou a um polipéptido que tenha pelo menos 80% de semelhança de sequência com a FAP humana e que inclua pelo menos um epitopo da FAP humana. O termo "ADN de FAP" refere-se a ADN codificando FAP humana ou codificando um polipéptido que tenha pelo menos 80% de semelhança de sequência com a FAP humana e que inclua pelo menos um epitopo da FAP humana.

Uma construção de ADN útil numa composição de ADN do presente invento compreende de preferência um ácido nucleico que codifica um polipéptido compreendendo um ou mais epitopos de FAP, e que está operativamente ligado a elementos reguladores necessários para a expressão do gene em células imunitárias. De preferência, a construção de ADN codifica para a proteína FAP inteira ou um polipéptido possuindo um elevado grau de semelhança de sequência de pelo menos 80% com 17 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ esta e que inclua pelo menos um epitopo de FAP. Construções de ADN úteis incluem de preferência elementos reguladores necessários para expressão de nucleótidos em células imunitárias. Tais elementos incluem, por exemplo, um promotor, um codão de iniciação, um codão de terminação, e um sinal de poliadenilação. Além disso, são frequentemente necessários estimuladores para expressão de uma sequência que codifique uma proteína alvo imunogénica. Tal como é conhecido na técnica, estes elementos estão de preferência operativamente ligados à sequência que codifica a proteína desejada. De preferência são seleccionados elementos reguladores que sejam operativos na espécie à qual são administrados. De preferência, a construção de ADN está na forma de um plasmídeo ou é incorporada num vector virai ou bacteriano. A construção de ADN codificando a proteína FAP pode inicialmente ser incorporada num vector bacteriano através de transfecção, utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Subsequentemente, as bactérias transformadas podem ser cultivadas para proporcionar uma reserva pronta de bactérias, que inclui ADN de FAP dentro do material genético das bactérias. As culturas de tais bactérias transformadas proporcionam uma fonte pronta para as composições de ADN do presente invento.

Os codões de iniciação e codões de terminação são de preferência incluídos como parte de uma sequência nucleotídica que codifica FAP numa composição de ADN do presente invento. Os codões de iniciação e terminação têm de estar enquadrados com a sequência de codificação.

Os promotores e sinais de poliadenilação incluídos numa composição do presente invento são de preferência seleccionados para serem funcionais dentro das células do sujeito a imunizar.

Exemplos de promotores úteis nas composições do presente invento, especialmente na produção de uma composição de ADN de vacina genética para humanos, incluem mas não se limitam a promotores de Vírus Símio 40 (SV40), promotor do Vírus do Tumor Mamário de Ratinho (MMTV), promotor do Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) tal como o promotor da Repetição Terminal Longa de HIV (LTR), promotor do vírus de 18 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Moloney, de Citomegalovírus (CMV) tal como o inicial imediato de CMV, promotor do Vírus de Epstein Barr (EBV) , Vírus do Sarcoma de Rous (RSV) , bem como de genes humanos, tais como da actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, e metalotioneína humana.

Exemplos de sinais de poliadenilação úteis nas composições de ADN do presente invento, especialmente na produção da uma composição de ADN para humanos, incluem mas não se limitam a sinais de poliadenilação de SV40 e sinais de poliadenilação de LTR.

Além dos elementos reguladores necessários para expressão de ADN, outros elementos podem também ser incluídos na molécula de ADN. Tais elementos adicionais incluem estimuladores. O estimulador pode ser, por exemplo, o estimulador da actina humana, da miosina humana, da hemoglobina humana, da creatina muscular humana e virais tais como os de CMV, RSV e EBV.

As sequências reguladoras e os codões são geralmente dependentes da espécie, assim para maximizar a produção de proteína, as sequências reguladoras e os codões são de preferência seleccionados para serem eficazes na espécie a imunizar. Um perito na técnica pode produzir construções de ADN que sejam funcionais numa dada espécie sujeita.

Construções de ADN úteis nas presentes composições podem ser ADN "nu", tal como definido em Restifo et al. Gene Therapy 2000; 7: 89-92, cuja divulgação relevante é aqui incorporada por referência. De preferência, a construção de ADN está na forma de um plasmideo ou ADN que é incorporado no material genético de um vírus atenuado ou uma bactéria atenuada. Veículos de distribuição ou transportadores úteis incluem microcápsulas biodegradáveis, complexos imuno-estimulantes (ISCOM) e lipossomas para construções de ADN nu, e vários tampões fisiologicamente aceitáveis para vírus ou bactérias vivos atenuados geneticamente modificados.

Exemplos de vectores bacterianos vivos atenuados adequados que podem ser transformados para incorporar uma construção de ADN de FAP incluem Salmonella typhimurium, 19 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Salmonella typhi, espécies de Shigella, espécies de Bacillus, espécies de Lactobacillus, Bacille Calmette-Guerin (BCG), Escherichia coli, Vibrio cholerae, espécies de Campylobacter, espécies de Llsteria, ou qualquer outro vector bacteriano adequado, tal como é conhecido na técnica. De preferência, o vector é um vector Salmonella typhlmurium viva atenuada, particularmente quando se pretende a composição para administração oral. A Salmonella typhimurium viva atenuada preferida inclui estirpes AroA~ tais como SL7207, ou estirpes duplamente atenuadas AroA , damT, tais como RE88. Salmonella typhimurium duplamente atenuada AroA , damT é um vector particularmente preferido. Métodos de transformação de vectores bacterianos vivos com uma construção de ADN exógeno estão bem descritos na técnica. Ver, por exemplo, Joseph Sambrook e David W. Russell, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 3a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) (Sambrook e Russell). Após transformação, o material genético exógeno é incorporado no material genético da bactéria, de modo que à medida que as bactérias se reproduzem, o ADN exógeno seja replicado juntamente com o ADN nativo do organismo. Assim, uma vez transformada a bactéria, os processos reprodutivos normais do organismo proporcionam um fornecimento pronto de ADN exógeno.

Vectores virais preferidos incluem Bacteriófagos, virus Herpes, Adenovirus, virus Adeno-associados, virus Sindbis, virus da Poliomielite, virus Vacinia, e Avipox. Os métodos de transformação de um vector virai com uma construção de ADN exógeno estão também bem descritos na técnica. Ver Sambrook e Russell, acima.

Veículos transportadores de lipossomas úteis são vesículas unilamelares ou multilamelares, possuindo uma porção membranar formada por material lipófilo e uma porção aquosa interior. A porção aquosa é utilizada no presente invento para conter o material polinucleotídico a distribuir à célula alvo. É geralmente preferido que os materiais que formam o lipossoma tenham um grupo catiónico, tal como um grupo amónio quaternário, e um ou mais grupos lipófilos, tais como grupos alquilo saturados ou insaturados possuindo cerca 20

ΕΡ 2 035 581/PT de 6 a cerca de 30 átomos de carbono. Um grupo de materiais adequados é descrito na Publicação de Patente Europeia No. 0187702, e discutido ainda na Patente U.S. No. 6228844 para Wolff et al., cujas divulgações relevantes são incorporadas por referência. Muitos outros compostos lipídicos catiónicos formadores de lipossomas adequados são descritos na literatura. Ver, p.ex., L. Stamatatos et al., Biochemistry 1988; 27: 3917-3925; e H. Eibl et al., Biophysical Chemistry 1979; 10: 261-271. Alternativamente, pode ser utilizada uma microesfera, tal como uma microesfera de poliláctido-coglicólido biodegradável. A construção de ácido nucleico é encapsulada ou de outra forma complexada com o lipossoma ou microesfera para distribuição do ácido nucleico a um tecido, tal como é conhecido na técnica.

Outros veículos transportadores úteis incluem microesferas poliméricas compreendendo materiais poli(ortoéster) biodegradáveis, tal como descrito por Wang et al., Nat. Mater. , 2004; 3(3): 190-6. Epub 15 de Fev. 2004, cujas divulgações relevantes são aqui incorporadas por referência.

De preferência, as composições para o presente invento compreendem construções de ADN que codificam FAP humana ou um homólogo funcional desta. Homólogos funcionais de FAP têm de preferência pelo menos cerca de 80% de semelhança da sequência de resíduos de aminoácidos com FAP humana, de maior preferência pelo menos cerca de 90%, ainda de preferência pelo menos cerca de 95% de semelhança de sequência com FAP humana.

GenBank é uma base de dados de sequências genéticas de National Institutes of Health (NIH), que é uma colecção anotada de todas as sequências de ADN publicamente disponíveis. GenBank é parte da International Nucleotide Sequence Database Collaboration, um esforço combinado do DNA DataBank of Japan (DDBJ), o European Molecular Biology Laboratory (EMBL), e GenBank em National Center for Biotechnology Information. A sequência de ácido nucleico de um ADNc codificando FAP humana, SEQ ID NO: 1 (FIG. 7) foi publicada em GenBank, No. 21 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ de Acesso BC026250, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. A sequência de resíduos de aminoácidos correspondente da FAP humana é SEQ ID NO: 2 (FIG. 8). A sequência de ácido nucleico de um ADN codificando FAP de murídeo, SEQ ID NO: 3 (FIG. 9) foi publicada em GenBank, No. de Acesso BC019190, cuja divulgação é aqui incorporada por referência. A sequência de resíduos de aminoácidos correspondente da FAP de murídeo é SEQ ID NO: 4 (FIG. 10).

Devido à degenerescência inerente do código genético, outras sequências de ADN que codificam a sequência de aminoácidos da FAP humana, podem ser utilizadas na prática do invento. Tais sequências de ADN incluem também as que são capazes de hibridar com FAP humana.

As sequências de ADN que codificam FAP humana, que podem ser utilizadas de acordo com o invento incluem ácidos nucleicos possuindo deleções, adições ou substituições de diferentes resíduos de nucleótidos aos de SEQ ID NO: 1, o que resulta numa sequência que codifica o mesmo produto do gene de FAP. As moléculas de ADN codificando para homólogos funcionalmente equivalentes de FAP humana podem também ser utilizadas nas composições de ADN do presente invento. O produto génico codificado pelo ácido nucleico pode também conter deleções, adições ou substituições de resíduos de aminoácidos dentro da sequência de resíduos de aminoácidos de FAP, o que resulta numa mudança silenciosa produzindo assim uma FAP funcionalmente equivalente. Tais substituições de aminoácidos podem ser feitas com base na semelhança na polaridade, carga, solubilidade, hidrofobia, hidrofilia, e/ou a natureza anfipática dos resíduos envolvidos. Por exemplo, aminoácidos com carga negativa incluem ácido aspártico e ácido glutâmico; aminoácidos com carga positiva incluem lisina e arginina; aminoácidos com grupos de cabeça polares sem carga possuindo valores de hidrofilicidade semelhantes incluem os seguintes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Tal como aqui utilizado, uma FAP funcionalmente equivalente refere-se à proteína que inclui um ou mais epitopos que, quando reconhecidos pelas células T, 22 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ permitem que estas mesmas células T reconheçam epitopos de FAP apresentados em células que expressam FAP. Em concretizações preferidas, uma FAP funcionalmente equivalente tem uma sequência de resíduos de aminoácidos que tem pelo menos cerca de 80% de semelhança de sequência com a sequência de resíduos de aminoácidos da FAP humana (SEQ ID NO: 2), p.ex., pelo menos cerca de 90% de semelhança de sequência ou pelo menos cerca de 95% de semelhança de sequência com a FAP humana.

As construções de ADN codificando FAP podem ser manipuladas para alterar a sequência de codificação de FAP (relativamente ao ADNc da FAP nativa, SEQ ID NO: 1) para uma variedade de fins incluindo, mas não se limitando a alterações que modificam o processamento e a expressão do produto do gene de FAP. Por exemplo, mutações podem ser introduzidas no ADN utilizando técnicas que são bem conhecidas no campo, p.ex., mutagénese dirigida ao local, para inserir novos locais de restrição, para alterar padrões de glicosilação, fosforilação, etc.

Numa concretização preferida, a composição de ADN do invento compreende uma construção de ADN codificando FAP e uma construção de ADN codificando, operativamente, pelo menos uma proteína efectora imunitária, ambas expressáveis em células imunitárias. Tal como aqui utilizado e nas reivindicações anexas a frase "proteína efectora imunitária" significa uma proteína que está envolvida na regulação de uma via do sistema imunitário. De preferência, a proteína imunológica efectora é uma citocina.

As citocinas são proteínas e polipéptidos produzidos por células que podem afectar o comportamento de outras células, tal como proliferação celular, diferenciação celular, regulação de respostas imunitárias, hematopoese e respostas inflamatórias. As citocinas têm sido classificadas em várias famílias, incluindo quimocinas, hematopoetinas, imunoglobulinas, factores de necrose tumoral, e uma variedade de moléculas não atribuídas. Ver em geral "Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology", Edição Revista, Oxford University Press, 2000; e C. A. Janeway, P. Travers, M. Walport e M. Schlomchik, "Immunobiology", Quinta Edição, 23 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Garland Publishing, 2001 (adiante "Janeway e Travers"). Uma classificação concisa de citocinas é apresentada em Janeway e Travers, Apêndice III, páginas 677-679, cujas divulgações relevantes são aqui incorporadas por referência.

As hematopoetinas incluem, por exemplo, eritropoetina, interleucina-2 (IL-2, uma proteína de 133 aminoácidos produzida por células T e envolvida na proliferação de células T), IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-13, IL-15 (uma proteína semelhante a IL-2 de 114 aminoácidos, que estimula o crescimento do epitélio intestinal, de células T e células NK) , factor estimulador de colónias de granulócitos (G-CSF), factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF), oncostatina M (OSM), factor inibidor da leucemia (LIF).

Os interferões incluem, por exemplo, IFN- , IFN- , e IFN- (uma proisa homodimérica de 143 aminoácidos produzida por células T e células NK, a qual está envolvida na activação de macrófagos, aumento da expressão de moléculas de MHC e de componentes de processamento de antigénios, mudança da classe de IG, e supressão de TH2) .

As imunoglobulinas incluem, por exemplo, B7.1 (CD80), e B7.2 (CD86), ambas as quais co-estimulam respostas de células T. A família do factor de necrose tumoral (TNF) inclui, por exemplo, TNF- , TNF- (linfotoxina), linfotoxina- (LT- ) , ligandos de CD40, ligando de Fas, ligando de CD27, ligando de CD30, ligando de 4-1BB, Trail e ligando de OPG.

Os papéis biológicos do ligando de CD40 (CD40L) , particularmente a sua interacção com CD40, expresso em células de apresentação do antigénio durante a co-estimulação da activação de células T, são bem conhecidos na técnica. CD40 é uma glicoproteína de 48 kDa expressa à superfície de todas as células B maduras, na maioria das malignidades de células B maduras, e nalgumas leucemias linfocíticas agudas de células B iniciais, mas não é expressa em células do plasma, Clark, Tissue Antigens 1990, 35: 33-36. CD40L, uma proteína membranar de tipo II de cerca de 35 kDa, é expressa 24 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ à superfície de células T após reconhecimento do antigénio.

Os membros da família TNF são biologicamente mais activos, quando expressos como homotrímeros. CD40L não é excepção a este respeito e pode ser expresso como um homotrímero (CD40LT) através de modificação de um motivo em fecho de leucina de 33 aminoácidos fundido com o terminal N de todo o domínio extracelular deste ligando. Foi relatado por Gurunathan et al. J. Immunol. 1998, 161: 4563 que o ADN de CD40LT estimula respostas imunitárias celulares tais como indução de IFN- e actividade citolítica de células T, quando os ratinhos são tratados com ADN codificando o antigénio modelo altamente imunogénico -galactosidase. CD40LT é um factor importante para a activação de células T necessária para induzir uma imunidade protectora eficaz contra auto-antigénios do tumor. Uma vez tomados os complexos de MHC de classe I carregados de antigénio pelas células dendríticas (CD) e apresentados a células T ingénuas, o primeiro sinal do antigénio é distribuído pelos receptores de células T (TCR), seguido de sobre-regulação de CD40LT. À superfície das células T, CD40LT induz então actividade co-estimuladora nas CD através de interacções CD40-CD40LT. Assim iniciadas, estas APC podem expressar moléculas co-estimuladoras B7.1 (CD80) e B7.2 (CD86), que enviam um segundo sinal co-estimulador às células T através de interacção com CD28, um evento que conduz à activação completa de células T para produzir concorrentemente as citocinas pró-inflamatórias IFN- e IL12, e para realização de funções efectoras. IL-10, Várias citocinas que não estão atribuídas a uma determinada família incluem, por exemplo, factor de crescimento tumoral- (TGF- ) , IL-1 , IL-1 , IL-1 RA, IL-12 (factor estimulador de células assassinas naturais; um heterodímero possuindo uma cadeia de 197 aminoácidos e uma cadeia de 306 aminoácidos, que está envolvido na activação de células NK e indução de diferenciação de células T em células semelhantes a TH1), factor inibidor de macrófagos (MIF), IL-16, IL-17 (um factor de indução da produção de citocinas, que induz a produção de citocinas em epitélios, endotélios, e fibroblastos), e IL-18. 25 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

As quimocinas constituem uma família de citocinas que são proteínas e polipéptidos relativamente pequenos quimiotáticos, que estimulam a migração e activação de diversas células, tal como a migração de leucócitos (p.ex., fagócitos e linfócitos). As quimocinas desempenham um papel na inflamação e noutras respostas imunitárias. As quimocinas têm sido classificadas em várias famílias, incluindo as quimocinas C, quimocinas CC, quimocinas CXC, e quimocinas CX3C. Os nomes referem-se ao número e espaçamento de resíduos de cisteína (C) nas moléculas; as quimocinas C possuindo uma cisteína, as quimocinas CC possuindo duas cisteínas contíguas, CXC possuindo duas cisteínas separadas por um único residuo de aminoácido, e as quimocinas CX3C possuindo duas cisteínas separadas por três resíduos de aminoácidos. As quimocinas interagem com vários receptores de quimocinas presentes na superfície das células. Ver Janeway e Travers, Apêndice IV, página 680, que é aqui incorporado por referência.

Além disso, as quimocinas podem ter actividade imuno-moduladora e têm sido implicadas em respostas imunitárias a cancro. Por exemplo, foi relatado que 6Ckine/SLC de murídeo, o análogo de ratinho da quimocina de tecido linfóide secundário humano (SLC), agora vulgarmente referida como CCL21, induz uma resposta anti-tumoral numa linha celular tumoral de carcinoma do cólon C26. Ver Vicari et al. J. Immunol. 2000; 165(4): 1992-2000. CCL21 humana e seu correspondente de murídeo, 6Ckine/SLC, estão classificadas como quimocinas CC, que interagem com o receptor de quimocinas CCR7. Está também relatado por Vicari et al. que a 6Ckine/SLC de murídeo (muCCL21) é um ligando para o receptor de quimocinas CXCR3. CCL21 humana, muCCL21 de murídeo, e uma variedade de outras quimocinas estão implicadas na regulação de várias células do sistema imunitário tais como células dendríticas, células T, e células assassinas naturais (NK).

Mig e IP-10 são quimocinas CXC, que interagem com o receptor CXCR3, que está associado a células T activadas. A linfotactina é uma quimocina C, que interage com o receptor XCR1 associado a células T e células NK. A fractalcina é uma quimocina CX3C, que interage com o receptor CX3CR1 que está associado a células T, monócitos e neutrófilos. 26 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Proteínas efectoras imunitárias particularmente preferidas a serem codificadas pelas composições de ADN do presente invento incluem as citocinas IL-2 (uma hematopoetina), CCL21 (uma quimocina), bem como ligandos de CD40, tais como o trimero de ligando de CD40 (CD40LT) , uma citocina da família TNF.

As sequências de ADN e proteica para a IL-2 humana foram publicadas no GenBank, No. de Acesso BC070338, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. As sequências de ADN e proteica da IL-2 de murídeo têm estado em GenBank, No. de Acesso NM 008366, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. A sequência de ácido nucleico codificando a IL-2 humana é apresentada na FIG. 11 (SEQ ID NO: 5), e a sua correspondente sequência de resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) é proporcionada na FIG. 12. A sequência de ácido nucleico codificando IL-2 de murídeo é apresentada na FIG. 13 (SEQ ID NO: 7), e a sua correspondente sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) é proporcionada na FIG. 14.

As sequências de ADN e proteica para a CCL21 humana foram publicadas em GenBank, No. de Acesso AB002409, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. As sequências de ADN e proteica da variante CCL21a de murídeo foram publicadas em GenBank, No. de Acesso NM011335, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. As sequências de ADN e proteica da variante CCL21b de murídeo foram publicadas em GenBank, No. de Acesso NM011124, cujas divulgações são aqui incorporadas por referência. A sequência de ácido nucleico codificando a CCL21 humana é apresentada na FIG. 15 (SEQ ID NO: 9), e a sua correspondente sequência de resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) é proporcionada na FIG. 16. A sequência de ácido nucleico codificando a CCL21 de murídeo (variante CCL21b) é apresentada na FIG. 17 (SEQ ID NO: 11), e a sua correspondente sequência de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) é proporcionada na FIG. 18. 27

ΕΡ 2 035 581/PT A semelhança da sequência proteica entre CCL21 humana e seu correspondente de murídeo (CCL21b de murídeo) é ilustrada na FIG. 19. Há cerca de 73% de identidade da sequência de resíduos de aminoácidos entre a CCL21 humana (SEQ ID NO: 10) e a CCL21b de murídeo (SEQ ID NO: 12). A sequência de ácido nucleico codificando a variante CCL21a de CCL21 de murídeo é apresentada na FIG. 20 (SEQ ID NO: 13), e sua sequência de aminoácidos correspondente (SEQ ID NO: 14) é proporcionada na FIG. 21. O ligando de CD40 humano (CD40L) é uma proteína de 261 aminoácidos, que existe como um trímero (CD40LT) na sua forma mais activa. A sequência de ADN codificando CD40L humano (também conhecido como CD154) foi publicada em GenBank, No. de Acesso NM 000074, cuja divulgação é aqui incorporada por referência (FIG. 22, SEQ ID NO: 15). A sequência proteica correspondente de CD40L é mostrada na FIG. 23 (SEQ ID NO: 16) .

Os aspectos do método do presente invento envolvem a administração a um mamífero de uma composição de ADN compreendendo uma construção de ADN codificando FAP, que se pode expressar em células imunitárias do mamífero. De preferência o mamífero é um humano. A composição pode ser administrada oralmente, intramuscularmente, intranasalmente, intraperitonealmente, subcutaneamente, intradermicamente, ou topicamente, dependendo da forma de dosagem particular em que a composição é preparada. De preferência a composição é preparada numa forma de dosagem administrável oralmente, tal como uma solução, suspensão, emulsão, cápsula, comprimido, e semelhantes.

Uma composição de ADN do invento pode ser utilizada para proporcionar inibição de longo prazo do crescimento tumoral e/ou de metástases tumorais num paciente tratado com a composição. Numa concretização preferida, a composição de ADN é administrada em conjunto com um agente quimioterapêutico anti-tumoral. A composição de ADN pode ser administrada juntamente com o agente quimioterapêutico numa forma de dosagem combinada, ou a composição e o agente quimioterapêutico podem ser administrados em formas de 28 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ dosagem separadas e a intervalos de dosagem separados à medida da farmacologia do agente quimioterapêutico a administrar.

Agentes quimioterapêuticos úteis em combinação com as composições de ADN do presente invento incluem agentes anti-tumorais tais como doxorrubicina, paclitaxol, uma ciclofosfamida, etopósido, 5-fluorouracilo, metotrexato, e semelhantes.

As composições de ADN do presente invento são de preferência formuladas com transportadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como água, solução salina, dextrose, glicerol e semelhantes, e combinações destes para ajudar na formulação e administração da composição. As composições podem também conter substâncias auxiliares tais como agentes humidificadores, agentes emulsionantes, tampões, e outras substâncias auxiliares que são bem conhecidas nas técnicas farmacêuticas.

As composições do presente invento são de preferência administradas oralmente a um mamifero, tal como um humano, como uma solução ou suspensão num transportador farmaceuticamente aceitável, a uma concentração de ADN no intervalo de cerca de 1 a cerca de 10 microgramas por mililitro, com base no peso do ADN que codifica FAP. Uma forma de dosagem particularmente preferida para uma composição de ADN do invento é uma suspensão de bactérias atenuadas transfectadas com FAP numa solução tampão adequada, que pode ser formulada para administração oral. A dosagem apropriada da composição dependerá do sujeito a tratar, da actividade da composição, e, em parte, do julgamento do médico que realiza a administração ou solicita a administração da composição. A dosagem a administrar ao mamifero e o plano de administração se for para utilizar mais de uma administração, variarão de mamifero para mamifero e da forma de dosagem. As quantidades de dosagem eficazes e os planos de administração podem ser determinados empiricamente através de estudos clínicos de dose-resposta, tal como é bem conhecido na técnica. A dosagem e o plano de dosagem são seleccionados 29 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ para proporcionar uma quantidade suficiente de expressão de FAP em células do sistema imunitário para desencadear uma resposta imunitária no mamifero contra células que apresentem o antigénio de FAP. De preferência, a dosagem da composição administrada ao mamifero sujeito desencadeia a expressão de uma quantidade suficiente de antigénio de FAP em células imunitárias do mamifero para manter uma resposta imunitária contra células de apresentação de FAP que continuará ao longo de um periodo de pelo menos um mês, p.ex., pelo menos 6 meses ou pelo menos cerca de um ano.

As composições do presente invento podem ser embaladas em recipientes adequadamente esterilizados tais como ampolas, garrafas ou frascos, na forma de dosagem multi-dose ou de dosagem unitária. Os recipientes são de preferência selados hermeticamente após serem enchidos com uma composição de ADN do invento. De preferência, as composições são embaladas num recipiente possuindo um rótulo fixado neste, cujo rótulo identifica a composição, e possui um aviso numa forma prescrita por uma agência governamental tal como a United States Food and Drug Administration reflectindo a aprovação da composição sob as leis apropriadas, informação sobre a dosagem, e semelhantes. O rótulo contém de preferência informação sobre a composição que é útil para que um profissional de cuidados de saúde que administre a composição a um paciente. A embalagem contém também de preferência materiais informativos impressos relativos à administração da composição, instruções, indicações, e quaisquer avisos necessários requeridos.

Os seguintes exemplos são proporcionados para melhor ilustrar as caracteristicas e as concretizações do presente invento, e não se pretende que sejam limitantes.

Materiais, Métodos e Exemplos.

Animais, estirpes bacterianas e linhas celulares.

Ratinhos BALB/c fêmeas, 6-8 semanas de idade, foram obtidos em Scripps Research Institute (TSRI) Rodent Breeding Facility. Todas as experiências com animais foram efectuadas de acordo com National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animais e aprovadas pelo TSRI 30 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Animal Care Committee. A estirpe duplamente atenuada de Salmonella typhimurium RE88 (AroA~ dairf) foi proporcionada por Remedyne Corporation (Santa Barbara, Califórnia). As células de carcinoma da mama D2F2 de murideo foram obtidas em Dr. Wei-Zen Wei, Karmanos Câncer Center, Detroit, MI, e as células de carcinoma do cólon CT26 foram obtidas em ATCC (Manassas, Virgínia) e depois cultivadas ao longo de vários meses para se obter subclones quimiorresistentes.

As células de carcinoma CT26 e D2F2 de murideo foram cultivadas na presença de DMSO a 1%, etopósido, 5-fluorouracilo, doxorrubicina, vinblastina ou paclitaxel (Sigma, St. Louis, Missouri), nas concentrações indicadas. Após 48 horas, os núcleos apoptóticos foram contados após incubação com o corante Hoechst-33342 específico de ADN (2 M; Molecular Probes, Eugene, Oregon).

Dois clones de células de cancro do cólon CT26 e de cancro da mama D2F2, respectivamente, adquiriram quimiorresistência (ver FIG. 1, Painel C) . Após a adição de cinco agentes quimioterapêuticos indutores de apoptose diferentes ao clone de carcinoma do cólon CT26 (FIG. 1, Painel C) , a vinblastina sozinha foi capaz de induzir um ligeiro efeito apoptótico, no entanto apenas a uma concentração muito elevada de 5 μΜ. A linha celular CT26 parental original (ATCC # CLR-2326) teve uma IC50 para 5- fluorouracilo (5-FU) de cerca de 1,85 μΜ, enquanto 5-FU não é capaz de induzir apoptose nuclear mesmo a uma concentração tão elevada quanto 100 μΜ no clone CT26 resistente. Nas células de carcinoma da mama D2F2 resistentes, apenas doxorrubicina à concentração mais elevada de 1 μΜ foi capaz de induzir apoptose nuclear tal como determinado através da coloração do corante Hoechst-33342. Estes resultados demonstram que ambas estas linhas celulares tumorais são resistentes a múltiplos fármacos.

Análise estatística. A significância estatística dos resultados diferenciais entre os grupos experimentais e os controlos foi determinada por teste t de Student. A significância dos registos de metástases foi determinada através do teste U de Mann Whitney. A significância dos dados da sobrevivência foi determinada através do teste de log- 31 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ rank. Os resultados foram considerados significativos, se os valores de P fossem <0,05. EXEMPLO 1. Preparação da Composição de ADN 1 Codificando FAP de Murideo.

Um ADNc (SEQ ID NO: 3, FIG. 9; proporcionado por Dr. J. D. Cheng) codificando FAP de murideo (SEQ ID NO: 4, FIG. 10), foi subclonado no local de restrição EcoRI do vector pcADN3.1/V5-HÍS-TOPO (Invitrogen, San Diego, Califórnia), para produzir o vector de expressão eucariótico pcADN3.1-FAP (pFAP) (ver FIG. 1, Painel A) . A expressão correcta da proteína FAP de 95 kDa a partir do vector foi demonstrada através de Western-blotting de lisados celulares de células de carcinoma do cólon CT26 transfectadas transientemente, que não expressam FAP por si próprias (FIG. 1, Painel B) . Este foi também o caso para células de carcinoma da mama D2F2 transfectadas transientemente. Para transfecções transientes, células CT26 e D2F2 foram electroporadas, tal como descrito anteriormente (ver Loeffer et al., FASEB, J. 2001, 15: 758- 767, aqui incorporado por referência). A expressão proteica de FAP foi demonstrada através de Western blotting com um anticorpo policlonal de coelho anti-FAP de murideo (proporcionado pelo Dr. J.D. Cheng). A composição de ADN 1 foi preparada como se segue: o vector pcADN3.1-FAP (cerca de 2 pg de pADN) foi electroporado para Salmonella typhimurium (estirpe RE88) duplamente atenuada preparada de fresco, utilizando um Pulsador Bio-Rad a 2 kV, 960 pF, e 200 Ohm de acordo com os procedimentos recomendados pelo fabricante. A Salmonella typhimurium atenuada contendo o vector foi seleccionada em placas contendo ampicilina. As colónias foram apanhadas no dia seguinte e cultivadas de um dia para o outro em caldo de Luria-Bertani (LB) (10 gramas de triptona, 5 gramas de extracto de levedura, e 10 gramas de cloreto de sódio em 1 1 de água desionizada; EM Science, Gibbstown, NJ) com adição de ampicilina. As bactérias foram isoladas e lavadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As bactérias lavadas foram então suspensas em meio PBS a uma concentração de cerca de 109 Salmonella recombinante por mililitro de PBS, para formar uma solução de Composição de ADN 1 contendo uma 32 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ construção de ADN que codifica operativamente para FAP de murideo, incorporada num vector de Salmonella typhimurium atenuada (AroA~Dam~) . A composição foi armazenada em ampolas seladas até à utilização. Uma "vacina de controlo" consistindo em Salmonella transformada com o vector pcADN3.1 sozinho (sem ADN de FAP) foi também preparada de acordo com o mesmo procedimento. O ADN plasmidico foi armazenado a cerca de -80°C antes de se transformar a Salmonella.

Após construção do pcADN3.l/V5-His-TOPO-Fap (pFap) eucariótico tal como descrito acima (FIG. 1, Painel A) , a expressão correcta da proteína FAP de 88 kDa foi demonstrada através de Western-blotting dos lisados celulares tanto das células de carcinoma do cólon CT26 como das células de carcinoma da mama D2F2 transientemente transfectadas, que não expressam elas próprias FAP (FIG. 1, Painel B). EXEMPLO 2. Preparação da Composição de ADN 2 Codificando FAP de Murideo, IL-2 de Murideo, e CCL21 de Murideo.

Os ADNc codificando IL-2 de murideo (ADN de SEQ ID NO: 5), de ATCC, Acesso # 39892, Manassas, Virgínia, e CCL21a de murideo (ADN de SEQ ID NO: 7) de Invitrogen, San Diego,

Califórnia, foram subclonados no vector pFAP de murideo do Exemplo 1, através do mesmo procedimento geral descrito no Exemplo 1. Salmonella typhimurium RE88 foi transformada com o vector resultante (pFAP/IL-2/CCL21) através do procedimento descrito no Exemplo 1 para proporcionar uma solução da

Composição de ADN 2 contendo uma construção de ADN que codifica operativamente FAP de murideo, IL-2 de murideo, e CCL21a de murideo, incorporado num vector de Salmonella typhimurium atenuada. EXEMPLO 3. Avaliação de composições de ADN do Invento em Modelos de Murideo de Cancro do Cólon e da Mama.

Imunização oral, confronto de células tumorais e tratamento com doxorrubicina. Para experiências numa configuração profiláctica, ratinhos BALB/c (n=8) foram tratados três vezes a intervalos de cerca de 1 semana através de sondagem esofágica oral, com cerca de 100 μΐ de PBS contendo cerca de 109 de S. typhimurium (AroA~damT) 33 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ transformada com vectores plasmídicos codificando FAP de murideo (Composição de ADN 1 do Exemplo 1), FAP de murídeo, IL-2 e CCL21 (Composição de ADN 2 do Exemplo 2), ou vacina de controlo do Exemplo 1, através de métodos descritos em Niethammer et al., Nat. Med., 2002, 8: 1369-1375. Os animais foram confrontados cerca de 10 dias mais tarde através de injecção subcutânea (s.c.) de cerca de 3xl04 células de carcinoma do cólon CT26 no flanco frontal esquerdo ou através de injecção ortotópica (o.t.) de cerca 3xl05 células de cancro da mama D2F2 na segunda menor almofada de gordura mamária esquerda. O volume do tumor (em mm3) foi calculado através da medição do tumor em 2 dimensões (i.e., comprimento e largura, em milímetros), e cálculo do volume como metade do comprimento vezes o quadrado da largura. Na configuração terapêutica, a inoculação inicial das células tumorais foi através de injecção intravenosa (i.v.) de cerca de ΙχΙΟ5 células de carcinoma do cólon CT26 seguido cerca de 3 e 10 dias mais tarde por vacinações orais com vacina de controlo ou composições de ADN activas. Após cerca de 18 dias, os pulmões foram pesados (o peso normal do pulmão foi de cerca de 0,2 g) e as metástases tumorais pulmonares foram examinadas e registadas através de avaliação visual da percentagem da superfície pulmonar coberta por metástases fundidas como se segue: pontuação de 0 para 0% de cobertura, pontuação de 1 para menos de cerca de 20% de cobertura, pontuação de 2 para cerca de 20-50% de cobertura, pontuação de 3 para mais de cerca de 50% de superfície pulmonar coberta. O tratamento com doxorrubicina foi efectuado em grupos de ratinhos com cerca de 10 mg/kg de doxorrubicina (Sigma) administrada i.v., 5, 10 e 15 dias após confronto com o tumor.

Para o esgotamento de subpopulações de células T CD4+ e CD8+ ou de células NK, os anticorpos (500 pg) dirigidos contra CD4 (clone GK 1.5) ou CD8 (clone 2.43), ambas de National Cell Culture Center (Minneapolis, Minnesota), ou anticorpo anti-asialo GM1 (Wako BioProducts, Richmont, Virgínia) foram injectados i.p. a cada 7 dias começando um dia antes do confronto com células tumorais. 34 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Citotoxicidade de células T CD8+. Cerca de 10 dias após o último dos três tratamentos a intervalos de 1 semana, foram colhidos esplenócitos dos vários grupos tratados de ratinhos BALB/c (n=4). Utilizando microesferas CD8a (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Alemanha), células CD8+ foram purificadas de acordo com o protocolo do fabricante. Estas células foram então estimuladas numa co-cultura de 5 dias com células CT26 irradiadas com raios (1000 Gy, 45 minutos) foram transfectadas transientemente com pcADN3.1/Zeo (vector vazio do Exemplo 1) ou pcADN3.1/Zeo-FAP (vector pFAP do Exemplo 1). Depois disso, as células T CD8+ foram co-cultivadas com células de carcinoma CT26 (E:T=100:1), que tinham sido transfectadas transientemente com proteína verde fluorescente (GFP), (PEGFP; Clontech, Paio Alto, Califórnia) como controlo ou GFP mais plasmídeo pFAP codificando FAP de murídeo. Após cerca de 48 horas, a apoptose nuclear foi avaliada tal como descrita acima com o corante Hoechst 33342 específico de ADN (2 M) .

Para o ensaio de libertação de 51Cr ratinhos Balb/c (n=3) foram tratados quatro vezes a intervalos semanais. Foram colhidos esplenócitos 13 dias após o último tratamento e incubou-se durante 5 dias com fibroblastos A31 irradiados com raios (cerca de 1000 Gy, 45 minutos) (ATCC, Manassas,

Virgínia), que foram infectados retroviralmente com pFap. Esplenócitos estimulados foram então incubados durante cerca de 4 horas com A31-pFap marcado e a percentagem de lise foi calculada. As células foram também co-incubadas com anticorpos anti-MHC de classe I (BD Biosciences, Rockville, Maryland) a uma concentração de cerca de 10 g/ml.

Imuno-histoquímica. Crio-secções (cerca de 8 mm de espessura) foram fixadas em acetona e coadas. Após incubação com o anticorpo primário (um anticorpo policlonal de coelho anti-FAP de murídeo (proporcionado pelo Dr. J.D. Cheng), ou um anticorpo policlonal de coelho anti-colagénio de tipo I de murídeo (Chemicon, Temecula, Califórnia), as secções foram imuno-coradas de acordo com o protocolo do fabricante (DAKO LSAB+ Kit, Peroxidase, DAKO, Carpinteria, Califórnia).

Para microscopia focal, crio-secções fixadas foram coradas com anticorpo anti-CD8 de murídeo, anticorpo 35 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ secundário anti-Ig de rato biotinilado, Estreptavidina marcada com FITC (BD Bioscience, Rockville, Maryland) e co-coradas com DAPI (Sigma, St. Louis, Missouri). Um microscópio confocal de varrimento laser (LSCM) foi utilizado para obter imagens, que foram processadas utilizando o software Zeiss Image Examiner (Cari Zeiss). Para análise de FACS de infiltração de células T, ratinhos Balb/c (n=6) foram tratados três vezes a intervalos semanais com um vector pFap ou vazio. Uma semana após o último tratamento, os animais foram confrontados s.c. com cerca de 3xl05 células tumorais CT26. Os tumores foram colhidos 3 semanas depois e as suspensões de células individuais preparadas através de incubação de tecido tumoral em fatias, durante 45 minutos em meio suplementado com colagenase de tipo I (125 U/ml; GIBCO, Gaithersburg, Maryland). Após filtração, as células de dois ratinhos foram reunidas, coradas com anti-CD3+ PerCP-Cy5.5 e anti-CD8+ FITC (BD Biosciences, Rockville, Maryland) e analisadas através de FACS.

Tomada intra-tumoral de fluoresceína, azul de Evans-albumina, e 14C-5-fluorouracilo. Após o último dos três tratamentos a intervalos de uma semana, com vacina de controlo (Exemplo 1), Composição de ADN 1 (Exemplo 1) ou Composição de ADN 2 (Exemplo 2), os ratinhos foram confrontados 10 dias depois através de injecção subcutânea de cerca de 3xl04 células CT26 no flanco frontal esquerdo. Cerca de 19 dias depois, os ratinhos receberam injecções intraperitoneais (i.p.) de fluoresceina sódica a 1% (Sigma) a cerca de 12 1/g de peso corporal, injecção i.v. de cerca de 100 1 de azul de Evans-albumina (Sigma), ou injecção i.v. de cerca de 2,5 Ci dá4C-5-fluorouracilo (Sigma). Após cerca de 5 minutos, 30 minutos ou 1 hora, respectivamente, os ratinhos foram sacrificados para determinar a absorção ou cintilação dos sobrenadantes de homogenatos tumorais a 490 nm, 612 nm, ou num contador- , respectivamente.

Para a determinação da tomada da doxorrubicina intra-tumoral, ratinhos Balb/c (n=4) foram confrontados s.c. com cerca de 5xl05 células D2F2 no flanco direito. A doxorrubicina foi injectada i.v. 16 dias depois (10 mg/kg) e os tumores foram colhidos 45 minutos depois disso. Foram medidas amostras contra a daunorrubicina padrão interna 36

ΕΡ 2 035 581/PT utilizando uma coluna Eclipse XCB-C8 num LC-MS série 1100 (Agilent, Foster City, Califórnia).

Avaliação dos potenciais efeitos secundários. Para determinar quaisquer efeitos prejudiciais na cicatrização de feridas, os ratinhos foram feridos cirurgicamente. Foi feita uma ferida circular de cerca de 3 mm de diâmetro com uma sovela dérmica (Miltex Inc., Bethpage, Nova Iorque) na parte superior das costas de ratinhos BALB/c (n=4) cerca de 10 dias após os últimos 3 tratamentos a intervalos de 1 semana. O tempo necessário para o encerramento da ferida foi medido. Apesar do facto da FAP ser sobre-expressa durante a cicatrização de feridas, as composições do presente invento não interferem com o processo de cicatrização da ferida. Após infligir uma ferida circular de cerca de 3 mm de diâmetro nas costas dos ratinhos BALB/c tratados (n=4), não foram observadas diferenças significativas na cicatrização das feridas entre os ratinhos tratados e não tratados. Para análise histológica as feridas foram infligidas em ratinhos tratados 7, 14, 21 dias antes do exame. Biopsias da pele, bem como 26 órgãos e tecidos foram examinados por um patologista de ratinhos. O tratamento profiláctico com a composição de ADN baseada em FAP inibe o crescimento tumoral primário. Dez dias após o último dos três tratamentos a intervalos de uma semana com vacina de controlo (Exemplo 1), Composição de ADN 1 (Exemplo 1) ou Composição de ADN 2 (Exemplo 2), diferentes grupos de ratinhos BALB/c (n=8) foram confrontados subcutaneamente com células de carcinoma do cólon CT26 ou ortotopicamente com células de carcinoma da mama D2F2, tal como descrito acima. As composições de ADN do invento suprimiram o crescimento tumoral primário de células CT26 resistentes a múltiplos fármacos (FIG. 2a), bem como de células D2F2 resistentes (FIG. 2b) . A Composição de ADN 2, que codifica para uma combinação da FAP, CCL21, e IL-2, foi quase igualmente eficaz a inibir o crescimento tumoral primário (Fig. 2a).

Uma composição de ADN do invento reduz o crescimento de metástases estabelecidas numa configuração terapêutica.

Ratinhos BALB/c tratados com a Composição de ADN 1 do Exemplo 37 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ 1 três e dez dias após uma inoculação intravenosa inicial com cerca de lxlO5 células de carcinoma do cólon CT26 resultaram numa redução significativa de metástases pulmonares experimentais em comparação com ratinhos tratados com a vacina de controlo do Exemplo 1. Em contraste, os ratinhos no grupo de controlo exibiram metástases extensivas e começaram a morrer 18 dias após a inoculação de células tumorais (FIG. 2c) . Semelhantemente, uma combinação de pFAP com pCCL21 sozinha foi também quase igualmente eficaz (FIG. 2b). Células T CD8+ proporcionam uma resposta imunitária anti—tumoral eficaz. Os ratinhos foram tratados i.v. três vezes a intervalos de 1 semana com a Composição de ADN 1 (Exemplo 1) e confrontados com cerca de lxlO5 células CT26.

Os ratinhos foram então esvaziados das suas respectivas células efectoras durante a fase efectora com anticorpos contra células T CD4+ ou CD8+, bem como células NK (FIG. 3, Painel A). 0 esgotamento de células CD4+ e de células NK não diminuiu a eficácia do tratamento de pFAP, indicando um importante papel para as células T CD8+ na resposta imunitária.

Para avaliar a extensão a que o tratamento com as composições de ADN de FAP do invento é capaz de quebrar a tolerância das células T periféricas contra o auto-antigénio FAP, células T CD8+ de animais tratados com bactérias transfectadas com pFAP ou o vector vazio foram purificadas. Estas células foram então estimuladas com células alvo tumorais irradiadas com raios e incubadas com células alvo tumorais vivas que foram transfectadas transientemente com GFP como controlo ou GFP/pFap. Tal como mostrado na FIG. 3, Painel B, apenas as células T CD8+ purificadas a partir de ratinhos tratados com pFap foram capazes de induzir apoptose nuclear tal como avaliado através de coloração de células alvo transfectadas com pFap com corante Hoechst-33342.

Esplenócitos de ratinhos tratados foram também utilizados num ensaio convencional de libertação de 51Cr. Para este fim, esplenócitos de ratinhos tratados com a Composição 1 e a vacina de controlo foram incubados durante 5 dias com fibroblastos A31 irradiados com raios- , os quais foram infectados retroviralmente com pFap. Os esplenócitos 38 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ estimulados foram então incubados durante 4 horas com células A31-pFap marcadas e a percentagem de lise foi calculada. Os esplenócitos de ratinhos tratados com a Composição 1 foram capazes de lisar significativamente mais fibroblastos que os dos controlos de vector vazio a uma razão de alvo-para-efector de 1:100 e 1:25 (FIG. 3, Painel C) . A co-incubação com anticorpos anti-MHC de classe I eliminou este efeito (FIG. 3, Painel D).

Numa avaliação adicional, os ratinhos foram tratados três vezes com a Composição 1 ou a vacina de controlo e depois confrontados com cerca de 3xl04 células tumorais CT26 para investigar a infiltração de células T CD8+ em tumores de ratinhos tratados com pFap. Após três semanas, os tumores foram colhidos e as suspensões de células individuais coradas para células CD3+ e CD8+ e analisadas através de FACS. Os ratinhos tratados com a Composição 1 mostraram um aumento marcado em células CD3+CD8+ no tecido tumoral quando em comparação com o controlo de vector vazio (FIG. 3, Painel E).

Foram também coradas secções de tumor com FITC anti-CD8 e corante nuclear DAPI. Utilizando microscopia confocal, os tumores de ratinhos tratados com a Composição 1 mostraram uma infiltração mais intensa com células CD8+ do que os ratinhos tratados com a vacina de controlo do Exemplo 1 (Fig. 3. Painel F) . Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a composição de ADN do invento, dirigindo-se a FAP, pode superar a tolerância de células T periféricas contra o auto-antigénio FAP. A supressão da expressão de colagénio de tipo I aumenta a tomada de corante intra-tumoral. Os fibroblastos são a fonte primária de colagénio de tipo I e foi relatado que a expressão desta molécula se correlaciona inversamente com a tomada intra-tumoral de compostos de diferentes pesos moleculares. Para avaliar se este mesmo mecanismo é aplicável às composições de ADN do invento, secções de tumores de ratinhos tratados foram coradas com anticorpos contra FAP (FIG. 4, Painel A, fotografias superiores) ou contra colagénio de tipo I (FIG. 4, Painel A, fotos inferiores). Uma diminuição na expressão de FAP, bem como de colagénio de tipo I foi detectada em grupos de ratinhos tratados com a 39 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Composição 1, em comparação com os ratinhos tratados apenas com a vacina de controlo (Exemplo 1) . Western blots correspondentes destes extractos de tumores, corados com os mesmos anticorpos, revelaram cerca de 82,63 +/- 2,54% de diminuição na expressão de FAP (FIG. 4, Painel B, foto superior) e cerca de 76,36 +/- 2,01% de diminuição na expressão de colagénio de tipo I (Fig. 4, painel B, fotografia inferior).

Os ratinhos foram então injectados com três compostos diferindo no tamanho e na estrutura, i.e., fluoresceina (376 Da) (Fig. 4, Painel C) , azul de Evans-albumina (68500 Da) (Fig. 4, Painel D) ou agente quimioterapêutico 5-fluorouracilo (130 Da) (Fig. 4, Painel E), tal como descrito acima. Os tumores de ratinhos tratados com a Composição de ADN de pFap incorporaram significativamente mais (p<0,05) destas respectivas moléculas do que os dos ratinhos aos quais foi administrada a vacina de controlo. A combinação de composição de ADN e quimioterapia conduz a rejeição tumoral. Foi desenvolvido um protocolo terapêutico combinando o tratamento com uma composição de ADN do invento com o fármaco quimioterapêutico doxorrubicina, ao qual as células D2F2 foram parcialmente sensíveis (FIG. 1, Painel C). Ratinhos BALB/c (n=8) foram tratados com a vacina de controlo do Exemplo 1, ou a Composição 1 do Exemplo 1. Os ratinhos tratados foram então confrontados ortotopicamente com células de carcinoma da mama D2F2. Estes dois grupos de ratinhos foram então tratados com doxorrubicina ou PBS como controlo 5, 10 e 15 dias após o confronto com o tumor. Tal como mostrado na FIG. 5, Painel A, tratamentos individuais com imunoterapia (Composição 1) ou quimioterapia foram apenas capazes de suprimir, mas não erradicar, o crescimento tumoral. Em contraste, o grupo de ratinhos tratados com a Composição 1 e doxorrubicina em combinação não só revelou uma inibição marcada de crescimento tumoral, como também uma rejeição tumoral completa em 4 dos 8 ratinhos (FIG. 5, Painel A) .

Uma vez

Noutra abordagem de terapia de combinação numa configuração terapêutica, ratinhos BALB/c (n=Q) foram confrontados i.v. com células tumorais D2F2. 40 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ estabelecida a metástase após 5 dias, os ratinhos foram tratados semanalmente com a Composição 1. Um dia após cada tratamento, os ratinhos foram injectados i.v. com doxorrubicina. Como resultado deste tratamento de combinação o tempo de vida destes ratinhos excedeu mais de 3 vezes o dos ratinhos de controlo que foram tratados com doxorrubicina ou Composição 1 sozinhas, e morreram logo após cerca de 35-45 dias (FIG. 5, painel B). A composição de ADN de FAP do invento aumenta a tomada intra-tumoral de doxorrubicina. Para determinar a concentração de doxorrubicina no tecido tumoral, ratinhos (n=4) foram tratados três vezes a intervalos de 1 semana com a Composição 1, confrontados 7 dias depois com 5xl05 células tumorais D2F2, e injectados 16 dias depois i.v. com doxorrubicina. A concentração de fármaco intra-tumoral foi determinada com cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC-MS). Os tecidos de ratinhos tratados com a Composição 1 mostraram um aumento significativo da tomada de doxorrubicina no tumor (FIG. 6, Painel A), em comparação com os controlos. Estes resultados estão de acordo com a infiltração química de tumores observada em ratinhos tratados com fluoresceína, albumina, e 5-fluorouracilo (FIG. 4, Painéis C-D). A vacina de ADN contra FAP não prejudica a cicatrização de feridas ou lesões do tecido normal. Uma vez que a FAP é sobre-expressa durante a cicatrização de feridas, os efeitos das composições de ADN do invento na cicatrização de feridas foram investigados. Uma ferida circular de cerca de 3 mm de diâmetro foi feita nas costas de ratinhos BALB/c tratados (/1=4). Surpreendentemente, não foi observada uma diferença significativa na cicatrização de feridas entre os ratinhos tratados e não tratados (FIG. 6, Painel B) . A avaliação histológica por um patologista de ratinhos destas feridas após diferentes intervalos de tempo não revelou anormalidades qualitativas no processo de cicatrização de feridas. Para excluir quaisquer reacções auto-imunes induzidas pelas composições de ADN do invento, foi efectuada uma histologia abrangente dos seguintes tecidos e órgãos: pele, cérebro, espinal-medula, músculo, osso, membrana sinovial, coração, aorta, artéria pulmonar, timo, baço, nódulos linfáticos, medula óssea, paratiróide, glândula supra-renal, rim, útero, 41 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ vagina, glândula clitoridiana, língua, fígado, pulmões, pâncreas, estômago, intestino delgado e cólon. Não foram observadas diferenças discerníveis em comparação com os ratinhos de controlo.

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> REISFELD, Ralph A. LOEFFLER, Markus KROGER, Jõrg A. NIETHAMMER, Andreas G.

<120> COMPOSIÇÃO DE ADN CONTRA O ANTIGÉNIO DO ESTROMA TUMORAL FAP E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DESTA

<130> TSRI 951.1 PCT <150> US 60/815,316 <151> 2006-06-21 <160> 16 <170> FastSEQ para Windows Versão 4.0

<210> 1 <211> 2648 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 42 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ ctgaagacag aattagctaa ctttcaaaaa cafcctggaaa aatgaagact tgggfcaaaaa £0 tcgtatttgg agttgccacc tctgctgtgc ttgccttatt ggtgatgtgc atbgtcttac 120 gcccttcaag agttcataac tcbgaag&aa atacaatgag agcactcaca ctgaaggata 1BO ttttaaatgg aacattttct tataaaacat tttttccaaa ctggatttca ggacaagaat 240 atcttcatca atctgeagat aacaatatag tactttataa tattgaaaca ggacaatcat 300 afcaccatfctt gagtaataga accatgaaaa gbgbgaatgc ttcaa&ttac ggcttabcao 3£Q ctgatcggca atttgtatat ctagaaagtg attattcaaa gctttggaga tactcttaea 420 cagcaacaba tbacatcbab gacctbagca atggagaatt tgcaagagga aatgagcttoc 480 ctcgtccaab tcagtattta tgctggtcgc ctgttgggag taaattagca tatgtctato S40 aaaacaatat ctattcgaaa caaagaccag gagatccacc ttttcaaata acattfcaatg £00 gaagagaaaa taaaatabbb aatggaatcc cagactgggt ttatgaagag gaaafcgcttg 660 ctaçaaaata tgcbetcbgg tggtctccta atggaaaatt tttggcatafc gcggaattta 720 atgatacgga tabaccagtt attgcctatt cctattatgg cgatgaacea tatcetagaa 780 caabaaatab tccataccca aaggctggag ctaagaatec cgttgttcgg afcatttatta B40 tcgataccac ttaccctgcg tatgtaggtc cccaggaagfc gcctgttcca gca&bgatag 900 cctcaagtga bbatbatbtc agttggcfcca cgtgggttac tgabgaacga gbatgfcbtge 960 agtggctaaa aagagbocag aatgtttcgg tectgbctab atgtgacbte agggaagact 1020 ggcagacatg ggattgtcca aagacccagg agcatataga agaaagcaga actggatggg 1080 ctggtggatfc ctttgtttca acaccagttt tcagctatga tgccabttcg bactacaaaa 1140 fcatttagtga caaggatggo tacaaacata tbcactatat caaagacaot gbggaaaatg 1200 ctatteaaat tacaagtggc asgtgggagg ccataaatat attcagagta acacaggatt 1260 cactgtttta ttcfcagcaat gaatttgaag aataccctgg eagaagaaac afcctacagaa 1320 btagcattgg aagctatoet ccaagcaaga agtgtgttac tbgccabcta aggaaagaaa 1380 ggtgccaata ttacacagca agtttcagcg aotacgccaa gtactatgca cfctgtctgct 1440 acggcccagg catceccatt tccacccttc atgatggacg cactgafcc&a gaaactaaae 1500 tcctggaaga aaacaaggaa ctggaaaatg ctttgaaaaa tabccagctg cctaaagagg 1560 aaattaagaa acttgaagta gatgaaatta ctttatggta caagatgatt cttcctcctc 1620 aabttgacag atcaaagaag tatcccttgc taattcaagt gtatggtggt ccctgcagtc 1680 agagtgtaeg gtctgtattt gctgttaatt ggatatccta tcttgcaagfc aeggaaggga 1740 tggtcattgc ettggtggat ggtcgaggaa cagctbtcca aggfcgacaaa otcctetatg 1800 cagtgtatcg aaagctgggt gtttatgaag ttgaagacca gattacagct gbeagaaaat 1860 tcatagaaat gggt.ttcatt gatgaaaaaa gaatagccat atggggotgg bcctatggag 1930 gatacgttcc atcactggcc ctbgoabctg gaactggtct tteeaaatgt ggtatagaag 1980 cacagagaga ttcatgggbc 2040 aactgtgatg gcaagagcag 2100 agcagatgat aatgtgcact 2160 acaagtgga.b ttccaggcaa 2220 cacgaaccaq ttatacaccc 2280 ctaaaaacga tgcagabgca 2340 gacagtttge ttattttatt 2400 gttgttcbaa aggcbgbtaa 2460 taçattbbcb ggtactctgt 2520 cagtgtetta tcacctgttc 2580 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2640 2648 tggctccagt ctccagctgg gaatattacg cgtctgtcta tccçaacaaa ggatgataac cttgagcact ataagaatt-c aatatttcog aaatgtagac tatcttctca tccacggaac ttcaaaactc agcacagatt gctaaagctc tggttaatgc tgtggtactc tgaccagaac cacggcttat ccggcctgto acatgaccca cttccbaaag cagtgtttcb ctttgtcaga sgccfcgtatc agaatctgaa aacctbatab aaacccctca ttttatgttg taaaatgcta gtataaacaa acasattaat aaaaaagatg aggactcaga agttcaagcb aâatattgtt gEiaagaagag aaaagggagt catgcatttb gctttggaca atttgaagaa aaataataaa gtcagaagtt caagtgcgaa aaaaaaaa

<210> 2 <211> 760 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 43 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Met Lys Thr Trp Vai Lys Ile Vai 1 S

Leu Ala Leu Leu Vai Met Cys Ile 20

Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg 35 40

Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr 50 55

Gin Glu Tyr Leu Hia Gin Ser Ala 05 70

Ile Glu Thr Gly Gin Ser Tyr Thr 65

Ser Val Asn Ala ser Aen Tyr Gly 100

Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lye 115 120

Thr Tyr Tyr ile Tyr Asp Leu Ser 130 135

Glu Leu Pro Arg pro ile Gl» Tyr 145 150

Lye Leu Ala Tyr Val Tyr Gin. Asn 165

Gly Asp Pro Pro Phe Gin ile Thr 160

Phe Asn Gly lie Pro Asp Trp Val 195 200

Lye Tyr Ala Leu Txp Trp Ser Pro 210 215

Glu Phe Asn Asp Thr Αβρ Xle Pro 225 230

Asp Glu Gin Tyr Pro Arg Thr Xle 245

Ala Lye Asn Pro Val Val Arg lie 260

Ala Tyr Val Gly Pro Gin Glu Val 275 280

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu 290 2SS

Cys Leu Gin Trp Leu Lys Arg val 305 310

Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gin

Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val 10 15 val Leu Arg Pro Ser Arg Val Hia 25 30

Ala Leu Thr Leu Lye Asp Ile Leu 45

Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly 60

Asp Asn Aen Xle Val Leu Tyr Aen 75 ao

Xle Leu ser Asn Arg Thr Met Lys 90 95

Leu Ser Pro Asp Arg Gin Phe Val 105 110

Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala 125

Asn Gly Glu phe Val Arg Gly Asn 140

Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser 155 160

Asn lie Tyr Leu Lys Gin Arg Pro 170 175

Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Xle

IfS 190

Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr aos

Asn Gly Lys phe Leu Ala Tyr Ala 220

Val Xle Ala Tyr ser Tyr Tyr Gly 235 240

Asn Xle Pro Tyr Pro Lys Ala Gly 250 . 255 phe Xle ile Asp Thr Thr Tyr Pro 26S 270

Pro Val PrO Ala Met Xle Ala Ser 285

Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val 300

Gin Asn Val Ser Val Leu Ser Xle 315 320

Thr Trp Asp Cys pro Lys Thr Gin 44

ΕΡ 2 035 581/PT 325

Glu Hia Ile Glu Glu Ser Axg Thr 340

Ser Thr Pro Vai phe ser Tyr Asp 35S 360

Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys Hia 370 375

Glu αθπ Ala Ile Gin Ile Thr Ser 385 390

Phe Arg Vai Thr Gin Asp Ser Leu 405

Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn lie 420

Pro Pro Ser Lye Lye Cys Vai Thr 435 440

Gin Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser 450 455

Vai Cye Tyr Gly Pro Gly Ile Pro 465 470

Thr- Aap Gin Glu Ile Lye Ile Leu 4BS

Ala Leu Lye Asn Ile Gin Leu Pro 500

Vai Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr 515 520

Asp Arg Ser Lye Lya Tyr Pro Leu 530 535

Cya ser Gin Ser Vai Arg Ser Vai 545 550

Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Vai 565

Thr Ala Phe Gin Gly Asp Lys Leu 580

Gly Val Tyr Glu vai Glu Asp Gin 595 600

Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lye 610 615

Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu 625 630

Fhe Lye Cys Gly Ile Ala Val Ala 645

Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe 660

Asn Leu Glu ais Tyr Lys Asn Ser 675 680

Phe Arg Aen Val Aap Tyr Leu Leu 690 695

Val Hie Fhe Gin Asn Ser Ala Gin 705 710

Gin v&l Asp Phe Gin Ala Ket Trp 725

Ser Gly Leu Ser Thr Aen His Leu 740

Lya Gin Cye Phe Ser Leu Ser Asp 755 760 330 335

Gly Txp Ala Gly Gly Phe Phe Val 345 350

Ala Ile ser Tyr Tyr Lys Ile Phe 365

Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val 380

Gly Lys Trp Glu Ala Ile Aen Ile 3 95 4 00

Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu 410 415

Tyr Arg ile Ser Ile Gly Ser Tyr 425 430 cye His Leu Arg Lye Glu Arg Cys 445

Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu 460

Ile Ser Thr Leu Hie Asp Gly Ara 475 480

Glu Glu Asn Lys Olu Leu Glu Asn 4 90 495

Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu 505 510

Lys Met Ile Leu Pro pro Gin Phe 525

Leu Ile Gin Val Tyr Gly Gly Pro 540

Fhe Ala Val Asn Trp xis Ser Tyr 555 560

Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg’ Gly 570 575

Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lye Leu 585 590 ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile 605

Arg ile Ala lie Trp Gly Trp Ser 620

Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu 635 640

Pro val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr 650 655

Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Aap 665 670

Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr 685 xie His Gly Thr Ala Asp Asp Asn 700,

Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala 715 720

Tyr ser Asp Gin Asn His Gly Leu 730 735

Tyr Thr Sis Met Thr His Phe Leu 745 750

<210> 3 <211> 2615 <212> ADN <213> Mus musculus 45 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ <400> 3 taacttgcaa 60 accctggctg 120 aaacctgaag 1B0 tcatataaaa 240 gatgataaca 300 sgcaccatga 360 tafcctagaaa 420 tacgaccttc 400 ctatgctggt 540 aaacaaagac 600 fcttaatggaa 660 tggtggtctc 720 afcbatfcgcct 780 ccaaaggctg 840 caccacgtgg 900 ttcagctggc 960 cagaatgtct 1020 ccaaagaacc 1080 tcgacaccag 1140 ggttacaaac 1200 ggcaagtggg 1260 aatgaatttg 1320 cctccgagca 1380 gcaagtttca 1440 atttccaccc 1500 gaactggaaa 1560 gacgggggac 1620 aagtaccctt 1680 tttgctgtta 1740 gatggtcggg 1800 ggtgtatatg 1860 atbgatgaag 1920 gcccttgcat 1980 tgggaabatt 2040 aatctcgaac 2100 gactatctte 2160 afctgctaaag 2220 aaccabggta 2280 cfccaagçaat 2340 ctgaaggcfct 2400 gagggeboag 3460 gaaaagggga 2520 gtagcggaaa 2580 2615 ccacgcgtcc gcacagatgc ggtgaeceac gctgtgcagfc gagaateagc aaacatctgg aaaaatgaag acatggctga aaactgtctt tggagttacc cgcttgcttt agtggtgata tgcattgtct tacgtçgctc aagagttt&c gaaacacaaa gagagctctt accttgaagg atattttaaa tggaaçattc catattttcc caactggatt tcagaacaag aatatcttca tcaatctgag tagtatttta taatattgaa ocaagagaat catatatcat tttgagtaat aaagtgtgaa tgctacagat tatggtttgt cacctgatcg gcaafcttgtg gtgattattc aaagctctgg cgatattcafc acacsgcgac atactaçatc agaatgggga atttgtaaga gg&tacgagc tccctcgtcc aattcagtat cgcctgttgg gagtaaatta gcatatgtat atcaaaacaa tatttafcttg caggagatce accttttcaa at&actfcata ctggaagaga aaaUagaata taecagactgr ggtttatgaa gaggaaatgc ttgccacaaa atatgetctt cagatggaaa attfcttggca tatgtagaat fctaatgafctc agatafcacca attcttatta fcggtgatgga cagtatccta gaactataaa tattccatafc gggctaagaa tccggfctgtt cgtgttttta ttgttgacac cacctaccct gcccaatgga agtgccagfct ccagaaatga tagcctcaag tgactattat tcacatgggt gtccagtgaa cgagtatgct tgcagtggct aaaaagagtg eagtcetgto fcatatgtgat ttoagggaag aotggcatgc atgggaatgt aggagcatgt agaagaaagc agaacaggat gggctggtgg attctttgtt cttttagcca ggatgccacfc tcttactaca aaatatttag cgacaaggat atattcaeta catcaaagac actgtggaaa atgctattca aattacaagt aggccatata tatattccge gtaacacagg attçactgtt ttattctagc aaggttaccc tggaagaaga aacatctaca ga&ttagcat tggaaactct agaagtgtgfc taefctgecat ctaaggaaag aaaggtgcca atattaeaca gctacaaagc caagtactat gcactcgtct gctatggccc tggcctccce tccatgatgg ccgcacagac caagaaatae aagtattaga agaaaacaaa attctctgag aaatatccag ctgcctaaag tggagattaa gaagctcaaa tgaotttctg geacaagatg attctgcctc etcagtttga cagatcaaag tgetaattca agtgtatggfc ggtccttgta gecagagfcgt taagtctgfcg attggataac ttatctcgca agtaaggagg ggatagfeeafc tgccctggta gcactgcttt ccaaggtgac aaattcctgc atgccgtgta tcgaaaactg aagttgagga ccagctcaca gctgtcagaa aattcataga aatgggttto aaagaatagc cafcatggggo tggtcctaeg gaggttafcgt theatccctg ctggaactgg tcttttcaaa tgtggcatag cagtggctcc agtctccago acgcatctat etactcagag agattcatgg gcctcccaac aaaggacgao actataaaaa ttcaaotgbg atggcaagag cagaatattt cagaaatgta tcatccacgg aacagçagac gataatgtgc actttcagaa ctcagcacag ctttggttaa tgcacaagtg gatttccagg cgatgtggta ctctgaceag tattatctgg gcgctcccag aatcatttat atacccacat gacgcacfctc gcttttcttt atcagactga accaatgcaa gtactagcgt gbaggacagb cacatggacg acttggacca tgaatattgt aaaagccgct aaaaatttag gaggttaggc tcggtatfegt ttacatttcc ctatgctctg tgaaagaaga gecacacate ttgctttgga cacaatgttt tatcacctgt tcattgccgg taaagtcaga tgcttcaggtt aaaaaaaaaa aaaaa

<210> 4 <211> 761 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

Meu Lys Thr Trp Leu Lya 1 5 Leu Ala Leu Vai Vai Xle 20 Lya Pro Glu Qly Aan Thr 35

The Vai Pha Qly Vai Tbr Thr Leu Ala Ala 10 15

Cya lie Vai Leu Arg Pro Ser Arg Vai Tjrr 25 30

Lya Arg Ala Leu Thr Leu Lya Aap Xl« Xieu 40 4S 46 ΕΡ 2 035 581/ρτ ΛΒΠ Gly *rhr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu 31η 50 55 60 Glu Tyr Leu Hls Gin Ser Glu Asp Asp Asn lie Val Phe Tyr Aen 6S 70 75 80 Ιΐβ Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lye 85 90 95 Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gin Phe Val 100 105 110 Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala 115 120 125 Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gin Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr 130 13S 140 Glu Leu Pro Arg Pro ile Gin Tyr Leu Cye Trp Ser Pro Val Gly Ser 145 150 155 160 Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gin Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gin Arg Pro 165 170 17$ Gly Asp Pro Pro Phe Gin Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Xle ISO 185 190 Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr 195 200 205 Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lye Phe Leu Ala Tyr Val 210 215 220 Glu Phe Asn ASp Ser Asp Ile Pro lie ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly 225 230 235 240 Asp Gly Gin Tyr Pro Arg Thr lie Asn Ile Pro Tyr Pro Lye Ala Gly 245 250 255 Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe ile Val Aep Thr Thr Tyr Pro 260 265 270 Hls Hls Val Gly Pro Met GlU Val pro val pro Glu Met Xle Ala Ser 275 280 285 Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp val Ser Ser Glu Axg Val 290 295 300 Cye Leu Gin Trp Leu Lys Arg Val Gin Asn Val Ser Val Leu Ser Xle 305 310 31S 320 Cye Asp Phe Arg GlU Asp Trp Hla Ala Trp Glu cye Pro Lye Asn Gin 325 330 338 Glu Kis Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val 340 345 350 Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gin Asp Ala Thr ser Tyr Tyr Lye Xle Phe 355 360 365 Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys Hls Xle Hls Tyr xle Lye Aep Thr Val 370 375 300 Glu Asn Ala Ile Gin Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Xle Tyr Xle 305 390 . 39S 400 Phe Arg Vai Thr Gin Asp Ser Leu Phe Tyr ser Ser Aen Glu Phe Glu 405 410 415 Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Xle Tyr Arg Ile Ser Xle Gly Aen Ser 420 425 430 Pro Pro Ser Lys Lys Cye Val Thr Cye Hls Leu Arg Lys Glu Arg Cye 435 440 445 Gin Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu 450 455 460 Vai Cye Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu Hla Aep Gly Arg 455 470 475 480 Thr Asp Gin Glu ile oln val Leu Glu Glu Aen Lys Glu Leu Glu Asr 405 490 495 Ser Leu Arg Asn ile Gin Leu Pro Lye Val Glu ile Lys Lye Leu Lya 500 505 510 Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Mel: Ile Leu Pro Pro Gin Phe 515 520 525 47 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Asp Arg 530 Ser Lya Lya Tyr pro 535 Leu Leu ile Gin Val 54 0 Tyr Gly Gly Pro Cys 545 Ser Gin Ser vai Lya 550 Ser Vai Phe Ala Val 5S5 Asn Trp Xle Thr Tyr 560 Leu Ala Ser Lya Glu Gly 565 Xle val Xle Ala 570 Leu Val Asp Gly Arg Gly 575 Thr Ala Phe Gin 560 Gly Aap Lya Phe Leu £85 His Ala val Tyr Arg 590 Lye Leu Gly Vai Tyr E9S Glu Vai Glu Asp Gin 600 Leu Thr Ala Val Arg 605 Lys Phe Ile Glu Met 610 Gly Phe He Asp Glu 615 Glu Arg xle Ala Xle 620 Trp Gly Trp Ser Tyr 62S Gly Gly Tyr vai Ser 630 Ser Leu Ala Leu Ala £35 Ser Gly Thr Gly Leu 640 Phe Lya Cys Gly Ile 645 Ala Vai Ala Pro Val 650 Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr 655 Ala Ser Ile Tyr 660 Ser Glu Arg Phe Met 665 Gly Leu Pro Thr Lys 670 Aap Asp Asn Leu Glu 675 Hie Tyr Lya Asn Ser 6Θ0 Thr val Met Ala Arg 665 Ala Glu Tyr Phe Arg 690 Asn vai Asp Tyr Leu 695 Leu xle HiS Gly Thr 700 Ala Asp Asp Asn Vai 705 His Phe Gin Asn Sex 710 Ala Gin Xle Ala Lys 715 Ala Leu Val Asn Ala 720 Glri Vai Asp Phe Gin 725 Ala Met Trp Tyr Ser 73 0 Asp Gin Asn Hie Gly Xle 735 Leu Leu Ser Lya Gly Gin 755 Arg 740 Cys Ser Phe Gin Ser Asn Leu Hie Ser 760 Leu 745 ASP Tyr Thr Hie Met Thr 760 His Phe <210> 5 <211> 814 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 5 atcactctct tfcaatcacta cfccacagtaa cctcaactec tgccacaatg tacaggatgc 60 aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg caefctgtcac aaacagtgea cetacbtcaa 120 gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatbbact gctggabbta cagatgattb ISO tgaabggaat taataattae aagaatccca aactcaccag gatgetcaca tttaagttttt 240 acatgcccaa gaaggccaca gaaefcgaaao atcttcagtg tcfcagaagaa gaaetcaaac 300 ctctggagga agtgctaaab ttagctcaaa gcaaaaactt fccacbtaaga occagggaet 360 taatcagcaa tatcaacgta atagbtctgg aactaaaggg atctgaaaca acattcatgt 420 gbgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg attacetttt 460 gtcaaagcat cabctcaaca ctgacttgat aattaagtgc ttcccactta aaacgtatca S40 ggccttctafc tbatfcfcaaat abbtaaabtt tatabttatt gttgaabgba tggbtbgcta 600 ectatbgtaa cbattabbcb fcaafcctfcaaa actabaaaba tggntctttb atgattcttt 660 bfcgbaagcee baggggcbcb aaaatggttt cacttattta bccca&aafca tttattafcta 720 bgtbgaatgt taaatatagt atctatgtag attggttagt aaaactabbt aataaabttg 760 ataaatabaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 614

<210> 6 <211> 153 <212> PRT 48 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ <213> Homo sapiens <400> 6

Tyr Arg Met Gin Leu Leu Ser Cye Xle Ale Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Vai Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lya Thr Gin Leu 20 25 30 Gin Leu Glu Kls Leu Leu Leu Asp Leu Gin Met Xle Leu Asn Gly Xle 35 40 45 Asn Asn Tyr Lya Asn Pro Lya LeU Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Pha 50 55 60 Tyr Met Pro Lys Lys Ala rhr Glu Leu Lys Hia Leu Gin Cye Leu Glu G5 70 75 80 Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu GlU Val Leu Asn Leu Ala Gin Ser Lya 85 90 95 Asn Phe Hia Leu Arg Pro Arg Aap LeU Xle Ser Asn Xle Aan Val Xle 100 105 110 Vai Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala 115 120 12S Aap Glu Thr Ala Thr Xle Vai Glu Phe Leu Asn Arg Trp Xle Thr Phe 130 135 140 CVS Gin Ser Xle Xle Ser Thr Leu Thr 145 150 <210> 7 <211> 939

<212> ADN <213> Mus musculus <400> 7 atcacccttg ctaatcactc ctcãcagtga cctcaagtcc tgcaggcafcg tacagcatgc 60 agctcgcatc ctgtgtcaca ttgacacttg tgctccttgt caacagcgca cccacbbcaa 120 gctccacttc aagctctaca gcggaagcac agcagcagca gcagcagcag cagcagcagc 180 agcagcacct ggagcagcbg ttgatggaec tacaggagcb cctgagcagg atggagaatt 240 acaggaacct gaaactcccc aggatgctea ccttcaaatfc ttactfcgccc aagcaggcca 300 cagaattgaa agafccbtcag tgcctagaag atgaacttgg acctctgcgg catgttctgg 360 atttgactca aagcaaaagc tttcaattgg aagatgctga gaatttcatc agcaatatca 420 gagtaacegfe egtaaaacta aagggetetg acaacacatb tgagtgeeaa bbcgabgatg 480 agtcagcaae cgtggtggac tttctgagga gatggatagc cttctgtcaa agcafccaCcb S40 caaeaagcca tcaataacta tgtacctcct gcttacaaca cataaggctc tctatttabt 600 taaatattta actttaattt atttttggat gtattgttta ctatcttttg taactacbag 660 tcttcagatg ataaatatgg atctttaaag attctttttg taagccccaa gggctcaaaa 720 atgttctaaa ctatttatet gaaattattt attatabtga attgtbaaat atcatgtgta 780 ggtagactca ttaataaaag tatttagatg attcaaatat aaabaagctc agatgtctgt 840 catttttagg acagcacaaa gtaagcgcta aaafcaactbo tcagtbattc ctgtgaactc 900 tatgttaatc agtgttttca agaaabaaag ctcbcctcb 939

<210> 8 <211> 160 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 49 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Met Tyr Ser Met Gin Leu Ala Ser 1 5 Leu val Asn Ser 20 Ala Pro Thr Ser Glu Ala Gin 35 Gin Gin Gin Gin Gin 40 Glu Gin 50 Leu Leu Met Asp Leu 55 Gin Tyr Arg Asn 65 Leu Lys Leu 70 Pro Arg pro Lys Gin Ala Thr Θ5 Glu Leu Lys Leu Gly Pro Leu 100 Arg Hie Val Leu Gin Leu Glu 115 Asp Ala Glu Asn Phe 120 v-al Lya 130 Leu Lys Gly Ser Asp 135 Asn Glu 145 Ser Ala Thr val Val 150 Asp Phe

Cye Vai Thr Leu Thr Leu Vai Leu 10 15

Ser ser Thr ser ser Ser Thr Ala 25 30

Gin Gin Gin Gin Gin. Gin Kls Leu 45

Olu Leu Leu Ser Arg Met Glu Aen 60

Met Leu Thr Phe Lye Phe Tyr Leu 75 oo

Asp Leu Gin Cya Leu Glu Agp GlU 50 95

Asp Leu Thr Gin ser Lye Ser Phe 10S 110 lie Ser Asn Ile Arg vai Thr val 125

Thr Phe Glu Cya Gin Phe Asp Asp 140

Leu Arg Arg Trp Ile Ala Phe Cya 155 160

<210> 9 <211> 852 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 cttgcagctg cccacctcae cetcagctcfc ggcctcttac tcaccctcta ccacagacat 60 ggctcagtca ctggctctga gcctcettat ecfcggfctcfcg gccfcfctggoa tceccagg&o 120 ccaaggcagt gatggagggg ctcaggactg ttgcctcaag taeagceaaa ggaagattce 180 cgccaaggtt*gtccgcagct accggaagca ggaaecaagc ctaggotgct ccateacagc 240 tatcctgttc ttgccccgca agcgctcfcca ggcagagcta tgtgçagacc çaeaggagct 300 ctgggtgcag cagctgatgc agcatctgga caagacacca. tccccacaga aaccagccca 360 gggctgcagg aaggacaggg gggcctccaa gactggcoag aaaggaaagg gctecaaagg 420 ctgcaagagg acfcgagqggt cacagacccc taaagggçca tagcccagtg agc&gcetgg 480 agccctggag accccaccag cctcnccaao gcfctgaagcc tgaaqeçaag afcgcaagaag S40 gaggctatgc tcaggggcec tggagcagec accccatgct ggacttgeoa caetcbttdt 600 cctgctttaa ccaceccatc tgcattccca gctctaccçfc gcatggcfcga getgoceaea 660 gcaggccagg tccagagaga ccgaggaggg agagfcctcac agggageatg agaggaggca 720 gcaggactgt ccccttgaag gagaatcatc aggaccctgg acctgatacg gqtccccngt 780 acaccccacc tcttccttgt aaatatgact tatacctaac tgaataaaaa gctgttctgt 840 cfctcceaccc gc 852

<210> 10 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 50 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Met Ala Gin Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Vai Leu Ala Phe 1 5 10 15

Gly Ile Pro Arg Thr Gin Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gin Aflp Cye Cye 20 25 30

Leu i.ys Tyr ser Gin Arg Lys xie Pro Ala Lye vai Vai Arg ser Tyr 35 40 45

Arg Lys Gin Glu Pro Ser Leu Gly Cye Ser xie Pro Ala xle Leu Phe 50 55 60

Leu pro Arg Lys Arg Ser Gin Ala Glu Leu Cye Ala Asp Pro Lye Glu 65 70 75 80

Leu Trp Vai Gin Gin Leu Met: Gin »ia Leu Asp Lye Thr pro Ser Pro 65 90 95

Gin Lye Pro Ala Gin. Gly cye Arg Lye Asp Arg Gly Ala Ser Lye Thr 100 105 110

Gly Lye Lys Gly Lye Gly Ser Lye Gly Cye Lys Arg Thr Glu Arg Ser 115 120 125

Gin Thr Fro Lye Gly Pro 130 <210> 11 <211> 615

<212> ADN <213> Mus musculus <400> 11 gaattcggcc tneagctctg ctccttagcc caggactgct nggaagcaag cactctaagc cgcctggace acctctaagfc cagcccfccaa caagetgggt gagccgctag aaagaggcct gtctcatcct tggtcctggc gccttaagta aaecaagttt ctgagctatg agcctccagc ctcgaaagaa gaggatagce ggttcacggt tcgag acggccaaag caactCEacc tc tctgcatc cagccagaag aggctgtccc tgcaaacccfc cccagggaaa aggaaagggc cagtagcccg ccaactcaca agggctaaac acaatcatgg- ccctggaccc aaaattccct atcccggcaa gaggaaggct caaagccccg tccaagggct cctggagccc ggcaaagagg ttgcggctgt ctcagafcgafc aaggcagtga acagtattgt tcctgttcte 999tgcagaa gctgcaggaa gcaagagaac aggagatccc gagctagaaa ccatctcacc 60 gactctgage 120 tggagggggt 1B0 ccgaggctat- 24 0 accccggaag 300 cctgatgcge 360 gaaccgggga 420 tgaacagaca 480 ccacgaactt 540 acagactcag 600 615

<210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 51 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Met Ala Gin Met Met Thr Leu Ser Leu Leu Ser Leu Vai Leu Ala Leu 1 S 10 13

Cye He Pro Trp Thr Gin Gly Ser Asp Gly Gly Gly Gin Aep Cye Cyo 20 25 30

Leu Lye Tyr Ser Gin Lye Lye He Pro Tyr Ser He Vai Arg Gly Tyr 35 40 4S

Arg Lye Gin Glu Pro ser Leu Gly Cye Pro Xle Pro Ala Xle Leu Phe 50 55 50

Ser Pro Arg Lye Hle Ser Lye Pro Glu Leu Cye Ala Aan Pro Glu Glu 65 70 75 Θ0

Gly Trp Vai Gin Asn Leu Met Arg Arg Leu Aep Gin Pro Pro Ala Pro 05 90 95

Gly Lye Gin Ser Pro Gly cye Arg Lye Asn Arg Gly Thr Ser Lye ser 100 10S 110

Gly Lye Lye Gly Lye Gly Ser Lye Gly Cye Lye Arg Thr Glu Gin Thr 115 120 125

Gin Pro Ser Arg Gly 130

<210> 13 <211> 878 <212> ADN <213> Mus musculus ttgccacact ctttctcctg ctttaaccec ggctgagctg cccacagcag gecaggtcca agcatgagag gaggcagcag gactgtcccc gatacggctc eccagtacac eccacctctt ta.aaaagctg ttctgtcttc ccacccaa <400> 13 abcccagecc acgcacagac ccccaacttg tcttactcac cctctaccac agacatggct gttctggcctt ttggcatccc caggacccaa ctcaagtaca gccaaaggaa gattcccgcc ccaagcttag gctgctccat cceagcfcatc gagctatgtg eagacccaaa ggagctctgg acaccatcce cacagaaacc agcccagggc ggeaagaaag gaaagggctc caaaggctga gggccatagc ccagtgagca gcctggagcc gaagcctgaa cccaagatgc aagaaggagg çatgctggcc taccctgcat tctcccaggg ccctggacct çctaactgaa

cagctgccca ccfceaeoota agctetggec 60 cagtcactgg ctctgagoct ccttatcctg 120 ggcagtgatg gaggggctca ggactgttgc 1B0 aaggttgtce goagctaccg gaagcaggaa 240 ctgfctcttgc cccgcaagcg etotceggea 300 gtgcagcagc tgatgcagea tctggaceag 360 tgcaggaagg acaggggggc ctccaagact 420 aagaggactg agcggteaca gacccctaaa 480 ctggagaccc caecagccbc accagcgctfc 540 ctatgctcag gggccctgga gcagccacce 600 cccatctgca ttcccagcte 660 gagagaccga ggagggagag 720 ttgaaggaga atcatcagga 780 ccttgtaaafc atgatfctata 840 B7B

<210> 14 <211> 134 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 52 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ

Mefc 3. Ala Gin Ser Leu 5 Ala Leu Ser LeU Leu He 10 Leu Vai Leu Aia 15 ptie Gly Ilè Pro Arg 20 Thr Gin Gly Ser A8p 25 Gly Gly Ala Gin Asp 30 eys cy® Leu Lys Tyr 35 Ser Gin Arg Lye Ile 40 Pro Ala Ly® vai val 45 Arg Ser Tyr Arg Lya 50 Gin Glu Pro Ser Leu 55 Gly Cya Ser Ile Pro 00 Ala Ile Leu Phe Leu 65 Pro Arg Ly® Arg Ser 70 Gin Ala Glu Leu Cys 75 Ala Asp Pro Lya Glu 80 Leu Trp Vai Gin Gin 85 Leu Met Gin Hl® Leu Asp 90 Ly® Thr Pro ser 95 Pro Gin Lya Pro Ala 100 Gin Gly Cya Arg Lys 105 Asp Arg Gly Ala Ser 110 Lys Thr Gly Lya Gin Thr 190 Lye 115 Pro Gly Lya Ly® Gly Gly Pro Ser Lye 120 Gly Cya Lys Arg Thr 125 Glu Arg Ser

<210> 15 <211> 1816 <212> ADN <213> Homo sapiens <40 0> 15 cttctctgcc agaagatacc atttcaactt taacacmgca tgaccgaaac acacaaccaa *>» açttctccco gatctgcggc cactggactg cccatcagca tgaaaatfcfct tatgfcatfcfca 120 cttactgttfc ttcttatcac ccagatgatt gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat 180 agaaggttgg acaagataga agatgaaagg aatcttcatg aagattttgt atteatgaaa 240 acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga tccttatccfc tactgaactg tgaggagatt 300 aaaagccagto tfcgaaggctt tgtgaaggat ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa 360 gaaaacagct tfcgaaatgca aaaaggtgat cagaafccctc aaattgegge acatgtcata 420 agtgaggcca gcagtaaaae aacatctgtg ttacagtggg ctgaaaaagg atactacace 480 atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat gggaaaçagc tgaccgttaa «agacaagga 540 ctctattafca tctatgccca. agtcaccttc tgttccaatc gggaagcttc gagfccaagcfc 500 ccatttafcag ccagccfcctg cctaaagtce cccggtagat tcgagagaat cttactcaga 660 gctgcaaata cccacagttc cgccaaacot tgcgggcaac aatccattea cttgggagga 720 gtatttgaat tgeaaccagg tgcttcggtg tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg 780 ' agccatggca ctggcfcbcac gtcctttggc ttactcáaae tctgaacagC gtcacctfcgc 840 aggctgtggt ggagctgacg ctgggagtct tcataataca gcacageggt taagcccacc 900 ccctgttaac tgcctattta taaccctagg atcctcctta tggagaacta tfctatfcatac 960 actccaaggc atgtagaact gtaataagfcg aattacaggfc cacatgaaac caaaacgggc 1020 cctgctccat aagagcttat afcatctgaag cagcaaccce actgafcgcag aaatccagag 1080 agtcctatga aaagacaagg ccactatgca caggttgaafc tctgagtaaa cagcagafcaa 1140 cttgccaagt tcagttctgt ttctfctgcgfc gcagtgtctt tccatggaea atgcatfctga 1200 tttatcagfcg aagatgcaga agggaaatgg ggagcctcag cteacattea gt&atggttg 1260 actctgggtt cctatggcct tgttggaggg ggccaggcfcc tagaacgtct aacacagCgg 1320 - ngaaceg&aa aatctctctc tctctttctc tcaatccccC acacacacac tgtccctatc cccactcctc tccattgttt cctcttaaca cccccccccc cccccccgcc accctctcgg acagttattc atfcctctttc Τ3Β0 tctccatctc tctctttcag tctctctctc tcaacctctt tcttccaatc 1440 aatctctetg tttccctttg tcagtctctt ccctccccca gtctctcttc 1500 Cttctaacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 1560 acacacacac agagtcaggc cgttgctagt cagttctctt ctttccaecc 1620 tctaccacta tagatgaggg tgaggagbag ggagtgcagc cctgagcctg 1680 attacgaaat gactgtattt aaaggaaatc tattgtacct acctgcagtc 1740 ccagagtgaa cttgtaatta tcttgttatt tattttttga ataataaaga 1800 ttaaaa 1616

<210> 16 <211> 261 <212> PRT 53 ΕΡ 2 035 581/ΡΤ <213> Homo sapiens <40 0> 16 Met ile Glu Thr Tyr Asn Gin Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly 1 5 10 15 Leu Pro Ile Ser Met Lys ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr val Phe Leu 20 25 30 Ile Thr Gin Met Ile Gly ser Ala Leu Phe Ala val Tyr Leu Hia Arg 35 40 45 Arg Leu Aep Lys ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu ABp Phe Val 50 55 €0 Phe Met Lys Thr He Gin Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser €5 70 75 Θ0 Leu Leu Asn Cya Glu GlU Ile Lys Ser Gin phe GlU Gly Phe val Lys B5 90 95 Aep Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lya Lya GlU Asn Ser Phe Glu 100 10S 110 Met Gin Lys Gly Asp Gin Asn Pro Gin Ile Ala Ala His val ile Ser 115 120 125 Glu Ala Ser Ser Lya Thr Thr Ser val Leu Gin Trp Ala Glu Lya Gly 130 135 140 Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gin 145 150 IBS 160 Leu Thr vai Lys Arg Gin Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gin Val Thr 155 170 175 Phe Cys Ser Asn Arg GlU Ala Ser ser Gin Ala Pro Phe Ile Ala Ser 180 185 190 Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe GlU Arg Ile Leu Leu Arg Ala 155 200 205 Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lya Pro Cya Gly Gin Gin Ser Ile Hla 210 215 220 Leu Gly Gly Vai Pbe Glu Leu Gin Pro Gly Ala Ser val Phe Val Aan 225 230 235 240 Vai Thr Asp Pro Ser Gin Vai Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe 245 250 255 Gly Leu Leu Lya Leu 260

Lisboa 2012-11-21

Claims

ΕΡ 2 035 581/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição eficaz para desencadear uma resposta imunitária contra células do estroma tumoral que expressam proteína de activação de fibroblastos (FAP) compreendendo uma construção de ADN que codifica para FAP e é incorporada num vector bacteriano de Salmonella typhimurium atenuada, em que a construção de ADN pode ser expressa em células imunitárias, e é incorporada num transportador farmaceuticamente aceitável.
2. Composição da reivindicação 1 em que a construção de ADN codifica para FAP humana (SEQ ID NO: 2).
3. Composição da reivindicação 1 em que a construção de ADN é um ADN substancialmente purificado possuindo a sequência polinucleotídica de SEQ ID NO: 1 ou uma sequência polinucleotídica que tenha pelo menos cerca de 80% de semelhança de sequência com esta.
4. Composição da reivindicação 1 em que a composição compreende ainda uma construção de ADN codificando uma proteína efectora imunitária que pode ser expressa em células imunitárias.
5. Composição da reivindicação 4 em que a proteína efectora imunitária é uma citocina.
6. Composição da reivindicação 5 em que a citocina é CCL21, IL-2 ou CD40LT.
7. Composição de qualquer uma das reivindicações 1-6 para utilização em inibição de crescimento tumoral ou de metástases tumorais. Lisboa, 2012-11-21