JP2005526750A - Cea及びcd40リガンドをコードするdnaワクチン及びその使用方法 - Google Patents
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Abstract
癌胎児性抗原(CEA)を提示する細胞に対して免疫応答を誘発するために有効なDNAワクチンは、CEAを作動可能にコードするDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするDNA、それぞれ配列番号1及び配列番号2、又はそのホモ三量体CD40LTを含有する。該DNAワクチンは、弱毒化された生きた細菌又はウイルス、又はリポソーム担体などの送達ベクターに組み込むことができる。1つの方法の実施形態では、該DNAワクチンを、結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対して免疫応答を誘発するために、ヒトなどの哺乳動物に経口投与する。1つの好ましい方法の実施形態は、該ワクチンの免疫応答有効性を増強するために、組換え抗体融合タンパク質huKS1/4−IL2で該哺乳動物を処置する付加段階を含む。
Description
(政府の権利)
本発明は、契約第CA83856−01号の下に国立衛生研究所(the National Institutes of Health)による政府援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明は、契約第CA83856−01号の下に国立衛生研究所(the National Institutes of Health)による政府援助を得て為された。政府は本発明に一定の権利を有する。
本発明はデオキシリボ核酸(DNA)ワクチンに関する。より特定すると、本発明は、癌胎児性抗原(CEA)及びCD40リガンドをコードするポリヌクレオチド構築物を含有するDNAワクチンに関する。
ワクチンは、生物の免疫系を刺激する予防薬剤の極めて限られた投与で疾患の病原体を、それらが増殖して病的作用を引き起こしうる前に破壊するように、多くの疾患状態に対して長期的な防御を与えるために使用されてきた。ワクチン及びワクチン接種への様々なアプローチが、Bernard R.GlickとJack J.Pasternak,Molecular Biotechnology,Principles and Applications of Recombinant DNA,第2版、ASM Press p.253−276(1998)に述べられている。
ワクチン接種は、自らの身体の免疫系を、感染因子が病的応答を引き起こす前にそれを捜し出して破壊するように誘導する手段である。典型的には、ワクチンは、生きているが弱毒化された感染性因子(ウイルス又は細菌)又は死滅形態の因子のいずれかである。生きた細菌又はウイルスから成るワクチンは非病原性でなければならない。典型的には、細菌又はウイルス培養物を物理的又は化学的処理によって弱毒化(弱体化)する。該因子は非ビルレントであるが、そのワクチンで処置した被験対象においてまだ免疫応答を誘発することができる。
免疫応答は、抗原、すなわち特異的高分子又は感染性因子のいずれかによって誘発される。これらの抗原は一般に、B細胞及びT細胞として知られるリンパ球によって「外来性(foreign)」と認識されるタンパク質、多糖類、脂質又は糖脂質のいずれかである。どちらの型のリンパ球も、抗原に暴露されると速やかな細胞分裂と分化応答を誘発し、暴露リンパ球のクローンの形成を生じさせる。B細胞は形質細胞を産生し、それは次に抗体(Ab)と呼ばれるタンパク質を生成して、抗体が感染性因子上に存在する抗原と選択的に結合し、それによって病原体を中和する又は不活性化する(体液性免疫)。一部の場合、B細胞応答はCD4+ヘルパーT細胞の助けを必要とする。
抗原暴露に応答して形成される特殊なT細胞クローンは細胞傷害性Tリンパ球(CTL)であり、これは抗原を提示する病原体及び組織に結合してそれらを排除することができる(細胞媒介性又は細胞性免疫)。一部の場合、樹状細胞などの抗原提示細胞(APC)は、エンドサイトーシスによって病原体又は他の外来性細胞を被包する。次にAPCは細胞から抗原をプロセシングして、これらの抗原を組織適合性分子:ペプチド複合体の形態でCTL上のT細胞受容体(TCR)に提示し、それによって免疫応答を刺激する。
特異的抗体の形成を特徴とする体液性免疫は一般に急性細菌感染及びウイルスからの反復感染に対して最も有効であり、一方、細胞媒介性免疫はウイルス感染、慢性細胞内細菌感染及び真菌感染に対して最も有効である。細胞性免疫はまた、癌に対して防護し、臓器移植の拒絶反応の原因になることが知られている。
以前の感染からの抗原に対する抗体は、非常に長い期間にわたって血液中で検出可能なままであり、それ故病原体への事前暴露を決定する手段を提供する。同じ病原体に再び暴露されたとき、免疫系は、病原性因子が増殖して病的応答を生じうる前に病原性因子を排除することによって再感染を有効に予防する。
病原体によって誘導される同じ免疫応答がまた、時として、同じ抗原を病原体として提示する非病原性因子によって生じることがある。このようにして、被験対象は、以前は感染を撃退していなかった病原体にその後で暴露されると防護されうる。
しかしながら、必ずしもすべての感染性因子がワクチン生成の必要に応じて容易に培養でき、不活性化できるわけではない。現代の組換えDNA技術は、この限界を克服することを目指す新しいワクチンの工作を可能にした。病原性遺伝子を持たない、それ故生きた非ビルレント形態の生物をワクチンとして使用することを可能にする感染性因子を創製することができる。また、病原性担体の細胞表面抗原を提示する、大腸菌(E.coli)のような比較的病原性の低い生物を工作することも可能である。そのような形質転換担体で処置した被験対象の免疫系は、病原体に対する抗体を形成するように「だまされる(tricked)」。病原性因子の抗原タンパク質を工作し、非病原種において発現させることができ、その抗原タンパク質を単離し、精製して、「サブユニットワクチン」を生産することができる。サブユニットワクチンは、安定であり、安全であって、化学的に十分に定義されているという点で有利である:しかしながら、それらの生産は手が出せないほど高額となり得る。
近年、広く遺伝子的免疫(genetic immunization)と称される、ワクチンへの新しいアプローチが出現した。このアプローチでは、病原性因子の抗原をコードする遺伝子を、免疫する被験対象の細胞内に作動可能に挿入する。処置される細胞は形質転換され、病原体の抗原タンパク質を生産する。これらのインビボで生産した抗原は、その後、宿主における所望免疫応答の引き金となる。そのような遺伝子的ワクチンにおいて使用される遺伝物質はDNA又はRNA構築物でありうる。しばしば該抗原をコードするポリヌクレオチドは、該遺伝子の挿入、複製又は発現を高めるために他のプロモーターポリヌクレオチド配列と組み合わせて導入される。
抗原遺伝子をコードするDNAワクチンは、様々な発現系によって被験対象の宿主細胞に導入することができる。これらの発現系は、原核生物、哺乳動物及び酵母発現系を含む。例えば、1つのアプローチは、宿主細胞に接種するために、新たな遺伝物質を組み込んだワクシニアウイルスなどのウイルスベクターを利用することである。あるいは、遺伝物質を「裸の」ポリヌクレオチドとして、すなわち単に精製DNAとして、ベクターに組み込むか又は宿主細胞に直接送達することができる。さらに、DNAをネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)などの弱毒化細菌に安定にトランスフェクトすることができる。患者が形質転換したサルモネラ菌(Salmonella)で経口的にワクチン接種されるとき、細菌は腸のパイアー斑(すなわち二次リンパ組織)へと輸送されて、その後免疫応答を刺激する。
DNAワクチンは、遺伝病及び癌のような、伝統的病原体によって引き起こされるのではない疾患状態に対して免疫する機会を提供する。典型的には、遺伝子性癌ワクチンにおいては、特定の型の腫瘍細胞に対する抗原を単離して、ワクチンに導入しなければならない。
腫瘍特異的免疫応答を達成する上での主要な障害の一つは、腫瘍自己抗原に対する末梢T細胞の免疫寛容を克服して、細胞傷害性Tリンパ球(CTL)を誘導することであり、それは播種性腫瘍転移を有効に根絶し、その後腫瘍の再発を防ぐ長期持続性の免疫記憶を維持する。ヒト癌胎児性抗原(CEA)は腫瘍胎児性膜糖タンパク質であり、免疫療法のためのDNAワクチン開発のために適切な腫瘍自己抗原標的を提供する。CEAに基づくワクチンのための有用な動物モデルがClarkeら、Cancer Res.1998,58:1469によって報告されている。このモデルは、ヒトCEAについてのゲノムDNA導入遺伝子を担い、CEAをヒトに対すると同様に組織特異的に発現するマウス系統の樹立を含む。CEAでトランスフェクトした線維芽細胞でインビボで初回免疫した後、Mizobataら、Cancer Immunol.Immuother.2000、49:285によって記述されている、CD4+ T細胞画分中のCEAに免疫寛容であるこれらのトランスジェニックマウスにおいて抗CEA CD8+ T細胞を誘導した。Tsangら、J Nat’l Cancer Inst.1995,87:982によるヒトでの試験は、トランスジェニックマウスで得られた所見と同様に、CEAに特異的なCD8+ CTLが負の選択を受けないことを示した。
CD40リガンド(CD40L)の生物学的役割、特にT細胞活性化の同時刺激の際に抗原提示細胞上で発現されるCD40とのその相互作用は当技術分野において周知である。CD40は、すべての成熟B細胞の表面、大部分の成熟B細胞悪性疾患及び一部の初期B細胞急性リンパ性白血病で発現される48kDa糖タンパク質であるが、形質細胞上では発現されない。Clark,Tissue Antigens 1990,35:33−36。35kDaのII型膜タンパク質であり、腫瘍壊死因子(TNF)遺伝子ファミリーの一員であるCD40Lは、抗原認識時にT細胞表面で発現される。TNFファミリーの成員はホモ三量体として発現されるとき生物学的に最も活性である。CD40Lもこの点に関して例外ではなく、このリガンドの細胞外ドメイン全体のN末端に融合した33アミノ酸のロイシンジッパーモチーフの修飾により、ホモ三量体(CD40LT)として発現されうる。CD40LT DNAは、Gurunathanら、J.Immunol.1998、161:4563により、高度免疫原性モデル抗原β−ガラクトシダーゼをコードするDNAでマウスをワクチン接種したとき、IFN−γ及び細胞溶解性T細胞活性の誘導などの細胞性免疫応答を増強することが報告された。
CD40Lは、腫瘍自己抗原に対して有効な防御免疫を誘導するために必要なT細胞の活性化に重要な関わりを有する。ひとたびMHCクラスI抗原:ペプチド複合体が樹状細胞(DC)によって取り込まれ、ナイーブT細胞に提示されれば、T細胞受容体(TCR)を介して最初の抗原シグナルが送達され、続いてCD40Lの上方調節が起こる。T細胞表面では、次にCD40Lが、CD40−CD40L相互作用によってDCへの同時刺激作用を誘導する。このように感作されて、これらのAPCは今や同時刺激分子、B7.1(CD80)及びB7.2(CD86)を発現し、それらが、プロ炎症性サイトカインINF−γ及びIL12を同時に生産しエフェクター機能を実行するという、T細胞の完全な活性化のために必要な事象であるCD28との相互作用を通して、T細胞に第二の同時刺激シグナルを送る。
DNAワクチンの効果を増強する有効な手段は、その後経口ワクチンとして適用することができる、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)の非複製株においてDNAをコードするプラスミドを増殖させることである。生きた弱毒化細菌は、胃腸管を通して、及び次に腸のパイアー斑を覆うM細胞を通してDNAを輸送する。そこから弱毒化細菌は樹状細胞及びマクロファージなどのAPCに入り、そこで突然変異のために死滅して、食細胞の内部でDNAの多数のコピーを遊離する。
弱毒化細菌は「危険信号」を与え、先天性免疫系を刺激して、IL12のようなプロ炎症性サイトカイン、及び抗原提示を増強し、腫瘍の根絶に結びつくTH1型細胞性免疫応答を促進する酸化窒素などのメディエイタを産生すると考えられる。実際に、弱毒化ネズミチフス菌はマウス黒色腫に対して防御する自家経口DNAワクチンのための有効な担体であると報告されている(Xiangら、Proc.Nat.Acad.Sci(USA)2000、97:5492)。組換えリステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)ワクチンは、原発性マウス黒色腫及びそれらの確立された肺転移の後退を仲介する上で極めて有効であると報告された(Panら、Cancer Res.1999,59:5254)。リステリア・モノシトゲネスは、大部分の他の細胞内細菌と異なり、食胞膜を破壊することによって細胞質に逃げ込み、その結果それが分泌する任意のタンパク質が抗原提示のために感染細胞のMHCクラスI及びクラスIIの両方の経路を標的化することを可能にするので、強力な細胞性免疫応答を生じさせる。
Xiangら、Clin.Cancer Res.,2001、3:8565は、CEA及びヒト汎上皮細胞接着分子(pan−epithelial cell adhesion molecule)、KSAで安定に形質導入した、MC38マウス結腸癌細胞の致死的攻撃誘発に対する部分的腫瘍防御を報告している。経口強制栄養によってマウスに弱毒化ネズミチフス菌が担うCEAベースのDNAワクチンを接種し、それがMHCクラスI抗原拘束性CD8+T細胞応答を誘導して、皮下腫瘍の拒絶を生じさせた。しかしこれは、IL2を腫瘍微小環境に標的化する組換え抗体−IL2融合タンパク質でブーストしたときでも、CEAに関してトランスジェニックである実験マウスの一部においてのみ起こった。
結腸癌に対して改善された効果を有する、CEA自己抗原に対するCD8+T細胞を介した腫瘍防御性免疫応答を誘発するワクチンが求められている。本発明は、特にhuKS1/4−IL2融合タンパク質でのブーストによって補助されるとき、DC及びナイーブTリンパ球の両方を活性化する、CEA及びCD40LTをコードする独自の二元機能DNAワクチンによってこの目標を達成する。
(発明の要旨)
結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対して有効なワクチンが提供される。該ワクチンは、CEA(例えば配列番号1のDNA配列)をコードするプラスミドDNA、及びヒトCD40L、配列番号2のDNA配列などのCD40リガンド又はそのホモ三量体CD40LTをコードするプラスミドDNAを含有する。CEAとCD40L DNA、それぞれ配列番号1と配列番号2は、同じプラスミドか又は異なるプラスミドに組み込むことができる。単一ワクチン中のCEAとCD40リガンドの両方をコードするプラスミドDNAの組合せは、ナイーブT細胞と樹状細胞などの抗原提示細胞の両方の活性化を促進し、それによって2つの異なる免疫応答系を刺激する。
結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対して有効なワクチンが提供される。該ワクチンは、CEA(例えば配列番号1のDNA配列)をコードするプラスミドDNA、及びヒトCD40L、配列番号2のDNA配列などのCD40リガンド又はそのホモ三量体CD40LTをコードするプラスミドDNAを含有する。CEAとCD40L DNA、それぞれ配列番号1と配列番号2は、同じプラスミドか又は異なるプラスミドに組み込むことができる。単一ワクチン中のCEAとCD40リガンドの両方をコードするプラスミドDNAの組合せは、ナイーブT細胞と樹状細胞などの抗原提示細胞の両方の活性化を促進し、それによって2つの異なる免疫応答系を刺激する。
本発明のワクチンのプラスミドDNAは、弱毒化細菌、非複製ウイルス又はリポソーム粒子などの効率的な担体に作動可能に組み込むことができる。
本発明の1つの方法の局面では、CEA(配列番号1)をコードするプラスミドDNA及びCD40L(配列番号2)又はそのホモ三量体CD40LTをコードするプラスミドDNAを含有するDNAワクチンを、結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対する免疫応答を誘発するために有効な量で、ヒトなどの哺乳動物に投与する。
本発明のもう1つの方法の局面では、ヒトなどの哺乳動物に、(a)CEA(配列番号1)及びCD40リガンド(配列番号21)又はそのホモ三量体CD40LTをコードするプラスミドDNAを含むDNAワクチンを、結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対する免疫応答を誘発するために有効な量で、及び(b)組換え抗体−IL2融合タンパク質(huKS1/4−IL2)の有効な免疫応答増強化量を、連続的に投与する。huKS1/4−IL2融合タンパク質は、該DNAワクチンで処置した哺乳動物の免疫応答性を、その免疫系が結腸癌細胞などのCEA提示細胞をより有効に攻撃するように増強する。該ワクチン及び融合タンパク質は、経口的及び非経口的に投与することができる。好ましくは、該ワクチンを経口投与し、該融合タンパク質を静脈内に投与する。
本発明のワクチンは、結腸癌細胞を含む、CEAを提示する細胞に対して免疫応答を誘発することにより、例えば結腸癌などの癌のための予防的治療を提供する。
(好ましい実施形態の詳細な説明)
ある種の癌細胞などのCEA提示細胞に対して有効なDNAワクチンは、CEA(配列番号1)をコードするプラスミドDNA構築物及びCD40Lリガンド(配列番号2)又はそのホモ三量体、CD40LTをコードするプラスミドDNAを含有する。CEAとCD40L DNA、それぞれ配列番号1と配列番号2は、同じプラスミドか又は異なるプラスミドに組み込むことができる。該DNAプラスミドは、弱毒化細菌、非複製ウイルス又はリポソーム粒子などの担体に作動可能に組み込むことができる。該DNAワクチンはまた、「裸の(naked)」DNAも含有しうる。
ある種の癌細胞などのCEA提示細胞に対して有効なDNAワクチンは、CEA(配列番号1)をコードするプラスミドDNA構築物及びCD40Lリガンド(配列番号2)又はそのホモ三量体、CD40LTをコードするプラスミドDNAを含有する。CEAとCD40L DNA、それぞれ配列番号1と配列番号2は、同じプラスミドか又は異なるプラスミドに組み込むことができる。該DNAプラスミドは、弱毒化細菌、非複製ウイルス又はリポソーム粒子などの担体に作動可能に組み込むことができる。該DNAワクチンはまた、「裸の(naked)」DNAも含有しうる。
本発明のDNAワクチンは、結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対して活性なCTLの形成を刺激する。CEAは結腸癌細胞についての特異的マーカーであるので、ワクチンに応答して形成されるCTLは実質的にそのような癌組織だけを標的化する。CD40リガンドは、細胞性免疫応答を生じさせるのを助ける最も有効な型のAPCである、樹状細胞を刺激する。CEAとCD40リガンドをコードするDNA、それぞれ配列番号1と配列番号2の組合せを含むワクチンは、樹状細胞の介入を通して直接及び間接的にナイーブT細胞の活性化を促進することができる。そのような組み合わせワクチンは2つの異なる免疫応答機構を同時に刺激し、それによって治療の効率を高める。
ここで使用するとき、「DNA」という用語は、文法上の単数及び複数の両形態のデオキシリボ核酸を指す。ここで使用するとき、「免疫(immunity)」という用語は、ビルレント形態の感染性因子に対する長期的な免疫学的防御を指す。ここで使用するとき、「免疫化(immunization)」という用語は、処置した被験対象において病原体に対する免疫を生じさせる、非ビルレントソースから誘導した病原性因子の抗原に対する予防的暴露を指す。
本発明のワクチンにおいて有用なDNAは、好ましくは、遺伝子発現に必要な調節エレメントに作動可能に連結された、CEA(配列番号1)及び/又はCD40リガンド(配列番号2)をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、該CD40リガンドはCD40LTである。CEAとCD40リガンドのDNA、それぞれ配列番号1と配列番号2は、ここではpCEA−CD40LT(すなわちプラスミドCEA−CD40LT)と称する単一プラスミドとしてワクチンに組み込まれる。あるいは、該ワクチンは、CEA(配列番号1)をコードするプラスミドDNAとCD40L(配列番号2)をコードする別個のプラスミドDNAを含有しうる。
細胞によって取り込まれたとき、DNA分子は、機能性染色体外分子として細胞中にそのまま存在しうる、及び/又は細胞の染色体DNAに組み込まれうる。DNAは、別個の遺伝物質として存続しうるプラスミドの形態で細胞に導入することができる。あるいは、染色体に組み込まれうる線状DNAを細胞に導入することもできる。DNAを細胞に導入するとき、当技術分野で既知であるように、染色体へのDNA組込みを促進する試薬を添加することができる。組込みを促進するDNA配列も該ワクチンに含めることができる。CEAとCD40リガンドをコードするDNA、それぞれ配列番号1と配列番号2は、弱毒化された生きた微生物又は組換え微生物ベクターの形態であるワクチン中で遺伝物質の一部のままでありえ、患者の細胞において生存することができる。
有用なDNAワクチンは、好ましくは核酸分子の発現に必要な調節エレメントを含む。そのようなエレメントは、例えば、プロモーター、開始コドン、終結コドン及びポリアデニル化シグナルを包含する。さらに、免疫原性標的タンパク質をコードする配列の発現のためにしばしばエンハンサーが必要とされる。当技術分野で既知であるように、これらのエレメントは、好ましくは所望タンパク質をコードする配列に作動可能に連結される。調節エレメントは、好ましくはそれらが投与される種において作動可能であるように選択される。
開始コドン及び終結コドンは、好ましくは本発明の遺伝子ワクチン中に、CEA及びCD40リガンドタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部として含まれる。開始及び終結コドンはコード配列とインフレームでなければならない。
本発明のワクチンに含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは免疫される被験対象の細胞内で機能性であるように選択される。
本発明のワクチンにおいて、特にヒト用の遺伝子ワクチンの生産において有用なプロモーターの例は、シミアンウイルス40(SV40)、マウス乳腺腫瘍ウイルス(MMTV)プロモーター、HIVロングターミナルリピート(LTR)プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス(HIV)、モロニーウイルス、CMV前初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)からのプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン及びヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子からのプロモーターを含むが、これらに限定されない。他の有用なプロモーターは、腫瘍内皮指定プロモーターなどの組織特異的プロモーター、ならびにCEAプロモーターなどの腫瘍選択的プロモーター、及び初期増殖応答プロモーターなどの処置応答性プロモーターを含む。
本発明のワクチンにおいて、特にヒト用の遺伝子ワクチンの生産において有用なポリアデニル化シグナルの例は、SV40ポリアデニル化シグナル及びLTRポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。
DNA発現に必要な調節エレメントに加えて、他のエレメントも該DNA分子に含めることができる。そのような付加的なエレメントはエンハンサーを包含する。エンハンサーは、ここで上述したプロモーターを包含する。好ましいエンハンサー/プロモーターは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びCMV、RSV及びEBVなどからのウイルスエンハンサーを含む。
何らかの理由で遺伝的構築物を受け取る細胞を排除できることが望ましい場合は、細胞破壊の標的として役立つ付加的なエレメントを該ワクチンに加えることができる。例えば、発現可能形態のヘルペスチミジンキナーゼ(tk)遺伝子を該ワクチンに含めることができる。tkを産生する任意の細胞の選択的死滅を引き起こす薬剤、ガンシクロビールを免疫された被験対象に投与することができる。細胞の選択的破壊のための遺伝子標的を導入するためのそのような手段は公知であり、Weinerらへの米国特許第5,817,637号に述べられている。
調節配列及びコドンは一般に種依存性である。タンパク質産生を最大化するために、調節配列及びコドンは、好ましくは免疫される種において有効であるように選択される。当業者は、所与の被験対象種において機能性であるDNA構築物を生産することができる。
本発明のワクチンにおいて有用なDNAは、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、Restifoら、Gene Therapy,2000,7:89−92において定義されているような「裸の(naked)」DNAも包含する。あるいは、該DNAは担体又は送達ベクターに作動可能に組み込むことができる。有用な送達ベクターは、生分解性マイクロカプセル、免疫刺激複合体(ISCOM)又はリポソーム、及びウイルス又は細菌などの遺伝子操作された弱毒化された生きた担体を包含する。
適切な弱毒化生細菌担体/送達ベクターの例は、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、チフス菌(Salmonella typhi)、リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)、赤痢菌属(Shigella)、バチルス属(Bacillus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、カルメット−ゲラン杆菌(Bacille Calmette−Guerin)(BCG)、大腸菌(Escherichia coli)、コレラ菌(Vibrio cholerae)、カンピロバクター菌(Campylobacter)、又は当技術分野で既知である他の何らかの適切な細菌ベクターを含む。好ましい細菌送達ベクターは、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネスを包含する;弱毒化ネズミチフス菌が特に好ましい。生細菌ベクターを外因性DNA構築物で形質転換する方法は当技術分野において広く記述されている。例えば、Joseph SambrookとDavid W.Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(2001)参照。
好ましい弱毒化ウイルス担体は、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、及びアビポックス(Avipox)ウイルスを含む。ウイルスベクターを外因性DNA構築物で形質転換する方法も当技術分野において広く記述されている。上記SambrookとRussell参照。
リポソーム担体は、脂質親和性物質で形成される膜部分と内部水性部分を有する、単層又は多重層小胞である。水性部分は、標的細胞に送達すべきポリヌクレオチド物質を含有するために本発明において使用される。リポソーム形成物質は、第四アンモニウム基などのカチオン基、及び約6個から約30個の炭素原子を有する飽和又は不飽和アルキル基などの1以上の親油基を有することが一般に好ましい。適切な物質の1つの群は、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、欧州特許公開第0187702号に述べられており、Wolffらへの米国特許第6,228,844号の中でさらに論じられている。多くの他の適切なリポソーム形成カチオン脂質化合物が文献において記述されている。例えば、L.Stamatatosら、Biochemistry 27:3917−3925(1988);及びH.Eiblら、Biophysical Chemistry 10:261−271(1979)参照。あるいは、ポリラクチド−コグリコリド生分解性ミクロスフェアなどのミクロスフェアが使用できる。DNAは、当技術分野で既知のように、組織へのDNAの送達のために被包されるか又はさもなければリポソーム又はミクロスフェアと複合される。
本発明のワクチンはまた、処置した細胞によるワクチンの遺伝物質の取込みを改善する促進剤と共に投与することもできる。一部の好ましい実施形態では、該DNAを、その関連する開示が参照してここに組み込まれる、Williamsらへの米国特許第6,248,565号に開示されているような、局所麻酔薬のファミリーなどの安息香酸エステル、アニリド、アミジン、ウレタン及びそれらの塩酸塩から成る群より選択される促進剤と共に製剤する又はそれらと同時に投与することができる。
本発明の1つの方法の局面では、DNAワクチンを、ワクチン接種した患者において結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対する長期的防御を提供するために使用することができる。1つの好ましい方法の実施形態では、CEA及びCD40リガンド、それぞれ配列番号1及び配列番号2の両方を作動可能にコードするプラスミドDNA(例えばpCEA−CD40LT)を含有するDNAワクチンを、CEA提示細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分な量で、CEA提示細胞に対する防御を必要とする哺乳動物に投与する。
本発明のもう1つの好ましい方法の実施形態では、本発明のpCEA−CD40LTワクチンを哺乳動物に接種することによって腫瘍増殖を阻害する。そのような方法の実施形態では、CEA及びCD40L、それぞれ配列番号1及び配列番号2の両方を作動可能にコードするプラスミドDNA構築物を含有するワクチンの、免疫応答を誘導する有効量を、CEA提示細胞を含む増殖性腫瘍を有する哺乳動物に投与する。かかるワクチン接種は、腫瘍細胞に対して該哺乳動物を免疫することにより、腫瘍増殖の停止を生じさせ、新たな腫瘍の形成を最小限に抑える。
本発明のさらにもう1つの方法の局面では、哺乳動物に、(a)CEAをコードするプラスミドDNA及びCD40リガンドをコードするプラスミドDNA、それぞれ配列番号1及び配列番号2を含むDNAワクチンを、結腸癌細胞などのCEA提示細胞に対する免疫応答を誘発するために有効な量で、及び(b)組換えヒト化KS−1/4抗体−IL2融合タンパク質(huKS−1/4−IL2)の免疫応答増強化有効量を、連続的に投与する。huKS−1/4−IL2は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Gilliesら、J.Immunol.,1998、160:6195−6203によって詳細に記述されている。
IL2は活性化T細胞によって産生される複雑なサイトカインであり、B細胞とT細胞の両方の増殖を刺激する。T細胞のIL2活性化はまた、T細胞表面のCD40リガンドの産生も刺激する(一般に、Charles A.Janeway,Jr.とPaul Travers,Immunobiology The Immune System in Health and Disease,第2版、Garland Publishing Co.,New York,1996の第7章参照)。huKS−1/4−IL2融合タンパク質によって腫瘍微小環境に標的化されるIL2の役割は、CTLの活性化における第二同時刺激シグナルとして働くことによって又はIL2受容体を発現するプレ活性化DCをさらに活性化することによって、抗腫瘍T細胞応答を増強することである。huKS−1/4−IL2融合タンパク質は、このようにして、該DNAワクチンで処置した哺乳動物の免疫応答性を、その免疫系がCEA提示細胞をより有効に攻撃するように増強し、それによってワクチン接種の有効性を高める。
本発明のこの方法の実施形態では、該ワクチンを、好ましくは経口投与のように経腸的に、又は静脈内注入のように非経口的に投与する。一部の好ましい実施形態では、該ワクチンを筋肉内、鼻内、腹腔内、皮下、皮内、局所的、又は経口的に投与する。最も好ましくは該ワクチンを、弱毒化細菌送達ベクターに組み込んで、経口的に投与する。好ましくは、該ワクチンは、当技術分野において周知のように、生理食塩水、デキストロース溶液等のような医薬適合性の担体中で提供される。
結腸癌、膵癌、肺癌及び乳癌などの上皮癌に罹患している患者は、本発明のワクチンによる免疫から恩恵を受けることができる。
本発明のワクチンは、好ましくは、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等、及びそれらの組合せのような医薬適合性の担体及び賦形剤と共に製剤化される。該ワクチンはまた、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等のような補助物質も含有しうる。
本発明のワクチンは、好ましくは、約10μg/mlから約100μg/mlの範囲内のDNA濃度で、医薬適合性の担体中の溶液又は懸濁液として、ヒトなどの哺乳動物に経口投与される。適切な用量は、ワクチン接種する被験対象に依存し、及び被験対象の免疫系がワクチンに含まれる核酸を発現する能力に依存しうる。選択される正確な用量は、一部には、ワクチンを投与する又は投与を要求する医療従事者の判断にも依存しうる。
本発明のもう1つの実施形態は、多回用量又は単位投与量形態で、アンプル、ボトル、バイアル等のような適切に滅菌された容器に包装された本発明のワクチンを含むキットである。該容器は、好ましくはワクチン製剤を充填した後密封される。好ましくは、該ワクチンは、該ワクチンを特定し、適用法令の下での該ワクチンの認可を反映する米国食品医薬品局などの政府規制当局によって規定された形態の告知書、投薬情報等を担うラベルが貼付された容器に包装される。そのラベルは、好ましくはワクチンを患者に投与する保健医療の専門家にとって有用な該ワクチンについての情報を含む。該キットはまた、好ましくは、ワクチンの投与に関する印刷された情報資料、指示書、説明書、及び他の必要な警告も含む。
本発明のキットはまた、多回用量又は単位投与量形態で、アンプル、ボトル、バイアル等のような適切に滅菌された容器に包装された組換え抗体融合タンパク質huKS−1/4−IL2も含みうる。好ましくは、該融合タンパク質は、該ワクチンを特定し、適用法令の下での該融合タンパク質の認可を反映する米国食品医薬品局などの政府規制当局によって規定された形態の告知書、投薬情報等を担うラベルが貼付された容器に包装される。そのラベルは、好ましくは該融合タンパク質を患者に投与する保健医療の専門家にとって有用な該融合タンパク質についての情報を含む。キット中に存在する印刷情報資料はまた、好ましくは、該融合タンパク質の投与に関する情報、指示書、説明書、及び他の必要な警告も含む。
該ワクチンの特に好ましい実施形態では、CD40リガンドをコードするプラスミドDNAはCD40リガンド三量体(CD40LT)をコードする。CEA及びCD40LTの両方をコードするプラスミドDNAが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれていることが特に好ましい。好ましい細菌送達ベクターは、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネスであり、最も好ましくは弱毒化ネズミチフス菌である。CEAをコードするDNAと組み合わせてCD40LTをコードする核酸を含有する本発明のワクチンは、2つの異なる免疫応答系(すなわち細胞性及び体液性免疫)を同時に刺激することができる。
癌胎児性抗原ファミリーの一部の成員のヌクレオチド配列は当技術分野において既知である。ヒトCEA遺伝子をコードするヌクレオチド配列は、その開示が参照してここに組み込まれる、the European Bioinformatics Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UKのEMBLデータベースにおいて、Schreweらによって開示された(EMBLアクセッション番号はEMBL:HSCEA01である)(図7、配列番号1)。
ヒトCD40リガンド(CD40L)は、体液性免疫の調節において中心的役割を果たす154アミノ酸のタンパク質である。ヒトCD40L(CD154としても知られる)をコードするDNA配列は、その開示が参照してここに組み込まれる、the European Bioinformatics Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UKのEMBLデータベースにおいて、Grammarらによって公表された(EMBLアクセッション番号はEMBL:HACD40Lである)(図8、配列番号2)。マウスCD40LをコードするDNA配列は、その開示が参照してここに組み込まれる、the European Bioinformatics Institute,Wellcome Trust Genome Campus,Hinxton,Cambridge CB10 1SD,UKのEMBLデータベースにおいて、Marraらによって公表された(EMBLアクセッション番号はEMBL:AI385482である)(図9、配列番号3)。
遺伝子コードの固有の縮重により、CEA及び/又はCD40リガンドと実質的に同じか又は機能的に等価のアミノ酸配列をコードする他のDNA配列が本発明の実施において使用できる。そのようなDNA配列はまた、CEA及び/又はCD40リガンド配列にハイブリダイズできるものも包含する。
本発明に従って使用できる変化したDNA配列は、同じか又は機能的に等価の遺伝子産物をコードする配列を生じる、種々のヌクレオチド残基の欠失、付加又は置換を含む。遺伝子産物自体がCEA及び/又はCD40リガンド配列内にアミノ酸残基の欠失、付加又は置換を含んでもよく、それがサイレントな変化をもたらし、その結果機能的に等価のCEA及び/又はCD40リガンドタンパク質を生成する。そのようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び/又は両親媒性の性質における類似性に基づいて行われうる。例えば、負に荷電したアミノ酸はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含む;正に荷電したアミノ酸はリシン及びアルギニンを含む;類似する親水性値を有する非荷電極性頭部基を持つアミノ酸は次のものを含む:ロイシン、イソロイシン、バリン;グリシン、アラニン;アスパラギン、グルタミン;セリン、トレオニン;フェニルアラニン、チロシン。
ここで使用するとき、CD40リガンドの「機能的等価物」とは、CD40又はそのフラグメントに結合するが、必ずしも天然CD40リガンドと同じ結合親和性ではないリガンドを指す。同様に、CEAの機能的等価物は、ヒトCEAに対して惹起される抗血清に結合するが、必ずしも天然ヒトCEAと同じ結合親和性ではないタンパク質を指す。
ここで及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、癌胎児性抗原(CEA)という用語は、ヒトにおいて認められる天然の抗原及びその機能的等価物を包含する;「CD40リガンド」という用語は、哺乳動物において認められる天然リガンドの単量体、二量体及び三量体、及びそれらの機能的等価物を包含する。好ましくは、CEA及び/又はCD40リガンドDNAの機能的等価物は、上記CEA及び/又はCD40リガンドタンパク質をコードするDNAと少なくとも約80%の相同性を共有する。
本発明のDNA配列は、遺伝子産物のプロセシング及び発現を修飾する変化を含むがそれに限定されない、様々な目的のためにCEA及び/又はCD40リガンドのコード配列を変化させるように工作できる。例えば、新しい制限部位を挿入する等のために、当技術分野において周知の手法、例えば位置指定突然変異誘発を用いて突然変異を導入することができる。
下記の実施例は、本発明の特徴及び実施形態をさらに説明するために提供するものであり、限定を意味しない。
(試験材料及び方法)
試薬:T−STIM培養サプリメントは、BD Biosciences,Bedford,MAより入手した。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)及びR−フィコエリトリン(PE)は、BD Pharmingen,LaJolla,CAより入手した。FITC標識及びPE標識抗体は、製造者の推奨プロトコールに従って作製した。すべての抗体は、BD Biosciences,Bedford,MAより入手した。huKS−1/4−IL2は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Gilliesら、J.Immunol.,1998、160:6195−6203が述べたように作製した。
試薬:T−STIM培養サプリメントは、BD Biosciences,Bedford,MAより入手した。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)及びR−フィコエリトリン(PE)は、BD Pharmingen,LaJolla,CAより入手した。FITC標識及びPE標識抗体は、製造者の推奨プロトコールに従って作製した。すべての抗体は、BD Biosciences,Bedford,MAより入手した。huKS−1/4−IL2は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Gilliesら、J.Immunol.,1998、160:6195−6203が述べたように作製した。
CEAトランスジェニックマウス:ヒトCEAゲノム領域全体(配列番号1)及びゲノムコスミドクローンから単離したフランキング配列を含む32.6Kb AatII制限フラグメントを使用することにより、C57B1/6J CEA−トランスジェニック種畜(breeder)マウスを作製した。その関連開示が参照してここに組み込まれる、Clarkeら、Cancer Res.1998、58:1469の方法によってマウス細胞系[C57B1/6J−TgN(CEAGe)18;FJP]を樹立した。CEAトランスジェニックマウスをThe Scripps Research Instituteの動物飼育施設において飼育した。6週から8週齢のマウスを使用した。すべての動物実験は、国立衛生研究所のGuide for the Care and Use of Laboratory Animalsに従って実施した。
腫瘍細胞系及び細菌株:化学的に誘発したマウス結腸腺癌細胞系、MC38を、Gillesら、J.Immunol.,1998、160:6195が述べたようにCEA(C15−4.3クローン)及び上皮細胞接着分子EPCAM/KSAの両方で安定にトランスフェクトした。弱毒化ネズミチフス菌AroA−Strain SL 7207は、Dr.B.A.D.Stocker(Stanford University,Stanford,CA)の好意により提供された。化学的にコンピテントな大腸菌(E.coli)は、Invitrogen(Carlsbad,CA)より購入し、37℃で、当技術分野で知られているように必要に応じて75μg/mlアンピシリンを補足した、LB肉汁中又は寒天平板上(VWR)でルーチンに増殖させた。
発現プラスミドの構築:CD40LT及びCEA分子をそれぞれDC又はT細胞に標的化するためにいくつかの異なる形態の発現プラスミドを作製した。免疫に使用したプラスミドは、pcDNA3.1/zeo(+)(Invitrogen)から構築した。小胞体(ER)に標的化してそこに保持されるpER−CEA対照プラスミド、及び細胞表面に標的化するpW−CEAプラスミドは、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Xiangら、Clin.Cancer Res.,2001,3:8565によってこれまでに記述されている。CD40LT遺伝子をコードするプラスミド(pCD40LT)は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Fanslowら、Semin.Immunol.,1994,6:267によって述べられているように、細胞表面へのタンパク質発現を指令する又は細胞外へのその分泌を誘導するIL7リーダー配列のC末端に融合した三量体CD40Lの形成を促進するために、改変33アミノ酸ロイシンジッパーモチーフを含んだ。特異的モノクローナル抗体によって検出可能な短い抗原性配列、Flagを組み込むことにより、ウエスタンブロット法によるCD40LTの検出を促進した。プラスミドpCEA−CD40LTは、マウスCD40LのC末端に融合したCEA細胞外ドメイン全体を含み、それ故二元機能キメラ構築物を生成した。
経口免疫、腫瘍細胞攻撃誘発及び抗体−IL2融合タンパク質ブースト:CEA−トランスジェニックC57BL/6Jマウスを7つの実験群(n=8)に分けた。空ベクター(pcDNA3.1)、個々の発現ベクターpER−CEA(対照ワクチン)、pW−CEA(対照ワクチン)、pCD40LT(対照ワクチン)、pCEA−CD40LT(本発明のワクチン)を担持する1×108形質転換され弱毒化されたネズミチフス菌を含むPBS 100μl、又は本発明のワクチンとそれに続くhuKS1/4−IL2でのブーストで、経口強制栄養することによって2週間隔で3回、マウスを免疫した。他の対照実験は、PBS、及びDNAワクチンによる免疫なしでの組換え抗体融合タンパク質huKS1/4−IL2ブーストを含む経口強制栄養、及び照射MC38細胞でのみワクチン接種したマウスの群を含んだ。すべてのマウスを、最後の免疫から2週間後に2.5×105MC38−CEA−KSA細胞の致死用量で、右側腹部に皮下経路で攻撃誘発(challenge)した。腫瘍が触知可能になるまでマウスを毎日検査し、その後は1日おきに直径を測微カリパス(microcaliper)で二次元測定した。
huKS1/4−IL2融合タンパク質の構築は、その関連開示が参照してここに組み込まれる、Gilliesら、J.Immunol.,1998、160:6195−6203によってこれまでに記述されている。上述したように形質転換弱毒化ネズミチフス菌ワクチンで経口強制栄養によって免疫した、CEAに関してトランスジェニックなC57BL.6Jマウスに、腫瘍細胞攻撃誘発後1日目から連続5日間、huKS1/4−IL2融合タンパク質のブースト5μgを与えた。
細胞傷害性アッセイ:その関連開示が参照してここに組み込まれる、Xiangら、Cancer Res.,1997、57:4948の方法に従い、標準51Cr−放出アッセイによって細胞傷害性を測定した。腫瘍細胞攻撃誘発の1週間後に、CEAトランスジェニックマウスから単離した脾細胞を、その後完全T−STIM培養培地(Beckton Dickinson,Bedford,MA)中37℃で3日間培養した。51Cr 0.5mCiで標識したMC38−CEA−KSA標的細胞(3×106)を37℃で4時間、様々なエフェクター:標的細胞(E:T)比率でエフェクター細胞と共にインキュベートした。
トランスフェクション及びタンパク質発現の免疫ブロット評価:COS−7細胞の一過性トランスフェクションのためにリポフェクタミンを製造者(Invitrogen)の指示に従って使用して、6穴平板に2.5×105細胞/穴でCOS−7細胞を接種し、24時間後に、無血清培地中リポフェクタミン5μlとDNA1μgを加えた。先に述べられているように(Xiangら、Cancer Res.,1997、57:4948)、対照溶解産物と共に還元及び非還元条件下でSDS−PAGEによって分離し、ニトロセルロース膜に電気ブロットした、等量のタンパク質(15μl/レーン)に関して免疫ブロット法を実施した。マウス抗ヒトCEA mAb(ICN,Aurora,OH)又は抗FLAG M2 mAb(Sigma,St.Louis,MO)、次いで抗マウスIgG−HRPで染色した後、ブロットをECLウエスタンブロット法検出試薬(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)及びXOMAT−5フィルム(Eastman Kodak Company,Rochester,NY)で展開した。
フローサイトメトリー分析:T細胞及びCD11cとMHCクラスII抗原−陽性DC上の同時刺激分子の発現の活性化マーカーを、Becton Dickinson FACScanでの2色フローサイトメトリー分析によって測定した。T細胞の活性化は、PE複合化抗CD25(H129.19)、LFA−1(2D7)、CD28(37.51)及びCD69(H1.2F3)抗体と組み合わせて、抗CD8 FITC(53−6.7)で成功裏にワクチン接種したマウスから新鮮単離した脾細胞を染色することによって測定した。APC上の同時刺激分子の活性化は、PE複合化抗B7.1(16−10A1)、B7.2(GL1)又はICAM−1と組み合わせた、FITC標識抗CD11c(HL−3)、及びビオチニル化抗IAb(KH74)抗体とそれに続くストレプトアビジンアロフィコシアニンによって測定した。すべてのフローサイトメトリー実験は、死細胞を除外するために0.1μg/mlのヨウ化プロピジウムの存在下で実施した。すべての試薬はBD Pharmingen(LaJolla,CA)より入手した。
サイトカイン誘導アッセイ:2.5×105MC38−CEA−KSA細胞による皮下経路での致死的腫瘍細胞攻撃誘発の1週間後に、すべての実験群のマウスから脾細胞を採取した。Ficoll−Hypaque(BioWhittaker,Walkersvile,MD)でリンパ球を単離し、1×105の照射(15,000ラド)MC38−CEA−KSA細胞と共に完全T細胞培地中で24時間培養した。上清を収集し、使用時まで−70℃で保存した。固相サンドイッチELISAを用いた市販のサイトカイン検出キット(R&D Systems,Minneapolis,MN)により、IFN−γ又はIL12に関してサイトカインを分析した。
CEA及びCD40LTのタンパク質発現
プラスミドpCD40LT、pCEA−CD40LT及びpW−CEAのタンパク質発現を、COS−7細胞へのトランスフェクションによって分析した。ウエスタンブロット法は、還元条件下で分析したトランスフェクト細胞からの溶解産物のSDS/PAGE分析によって示されるように、すべての構築物が予想された分子量(それぞれ35kDa、215kDa及び180kDa)のタンパク質を生産したことを示した(図1A及び1B)。pCD40LTをコードするプラスミドは、非還元条件下で、単量体、二量体及び三量体CD40Lを示す細胞溶解産物中のタンパク質を発現した(図1B)。CD40Lタンパク質はまた、還元条件下でトランスフェクト細胞の上清中でも検出された(図1A)。
プラスミドpCD40LT、pCEA−CD40LT及びpW−CEAのタンパク質発現を、COS−7細胞へのトランスフェクションによって分析した。ウエスタンブロット法は、還元条件下で分析したトランスフェクト細胞からの溶解産物のSDS/PAGE分析によって示されるように、すべての構築物が予想された分子量(それぞれ35kDa、215kDa及び180kDa)のタンパク質を生産したことを示した(図1A及び1B)。pCD40LTをコードするプラスミドは、非還元条件下で、単量体、二量体及び三量体CD40Lを示す細胞溶解産物中のタンパク質を発現した(図1B)。CD40Lタンパク質はまた、還元条件下でトランスフェクト細胞の上清中でも検出された(図1A)。
CD40LT及びCEA分子の両方をコードする二元機能ワクチンによる腫瘍防御免疫の誘導
二元機能DNAワクチン(pCEA−CD40LT)は、CD40LT及びCEAがそれぞれDC及びT細胞を標的化することを示す、いくつかの対照を含む多数の実験を実施した。それらの結果を図2にグラフで示す。図2では、各個体別マウスの腫瘍増殖を実線で表わしている。CEAに関してトランスジェニックなC57B1/6Jマウスを、0日目と7日目に各々2.5×105の照射(15,000ラド)MC38マウス結腸癌細胞の皮下注射によって免疫した。2週間後、致死皮下用量のMC38−CEA−KSA細胞によるこれらの対照の攻撃誘発は、すべてのマウスにおいて速やかに腫瘍の発現を生じさせ、MC38−CEA−KSA細胞がそれ自体は免疫原性でないことを示した(図2A)。これはまた、他の3つの鍵となる対照実験にも当てはまることが認められた:空ベクター、専らERを標的化してER内に保持されるpER−CEAプラスミド、又はpCD40LT構築物単独のいずれかを担う1×108弱毒化ネズミチフス菌を、経口強制栄養によって2週間隔で3回ワクチン接種したマウス(n=6)は、すべて一様に、致死的皮下腫瘍細胞攻撃誘発に対する防御免疫応答を誘導することができず、迅速で均一な腫瘍増殖を明らかにした(図2B、2C及び2D)。これに対し、同じワクチン接種プロトコールによって処置したが、pW−CEAベクターを含有するDNAワクチンを与えられたマウスの群は、腫瘍容積の実質的な減少を明らかにし、8匹の動物のうち3匹は腫瘍細胞攻撃誘発を完全に拒絶した(図2F)。本発明のpCEA−CD40LTワクチンを接種したマウスでは、8匹の動物のうち4匹が腫瘍細胞攻撃誘発を完全に拒絶した。この場合、残りのマウスは、対照と比較したとき腫瘍増殖の劇的な抑制を示した(P<0.001)(図2G)。
二元機能DNAワクチン(pCEA−CD40LT)は、CD40LT及びCEAがそれぞれDC及びT細胞を標的化することを示す、いくつかの対照を含む多数の実験を実施した。それらの結果を図2にグラフで示す。図2では、各個体別マウスの腫瘍増殖を実線で表わしている。CEAに関してトランスジェニックなC57B1/6Jマウスを、0日目と7日目に各々2.5×105の照射(15,000ラド)MC38マウス結腸癌細胞の皮下注射によって免疫した。2週間後、致死皮下用量のMC38−CEA−KSA細胞によるこれらの対照の攻撃誘発は、すべてのマウスにおいて速やかに腫瘍の発現を生じさせ、MC38−CEA−KSA細胞がそれ自体は免疫原性でないことを示した(図2A)。これはまた、他の3つの鍵となる対照実験にも当てはまることが認められた:空ベクター、専らERを標的化してER内に保持されるpER−CEAプラスミド、又はpCD40LT構築物単独のいずれかを担う1×108弱毒化ネズミチフス菌を、経口強制栄養によって2週間隔で3回ワクチン接種したマウス(n=6)は、すべて一様に、致死的皮下腫瘍細胞攻撃誘発に対する防御免疫応答を誘導することができず、迅速で均一な腫瘍増殖を明らかにした(図2B、2C及び2D)。これに対し、同じワクチン接種プロトコールによって処置したが、pW−CEAベクターを含有するDNAワクチンを与えられたマウスの群は、腫瘍容積の実質的な減少を明らかにし、8匹の動物のうち3匹は腫瘍細胞攻撃誘発を完全に拒絶した(図2F)。本発明のpCEA−CD40LTワクチンを接種したマウスでは、8匹の動物のうち4匹が腫瘍細胞攻撃誘発を完全に拒絶した。この場合、残りのマウスは、対照と比較したとき腫瘍増殖の劇的な抑制を示した(P<0.001)(図2G)。
ブースト及び抗体−IL12融合タンパク質によってワクチン接種の効果が増幅される
腫瘍微小環境に標的化した小量の非治療用量のhuKS1/4−IL2融合タンパク質によるブーストは、本発明のDNAワクチンの効果を著明に上昇させた。実際に、pCEA−CD40LTワクチン群について述べたのと同じプロトコールによるCEAトランスジェニックマウスのワクチン接種と、それに続く、腫瘍細胞攻撃誘発後1日目から連続5日間にわたるhuKS1/4−IL2 5μgの静脈注射は、8匹中8匹の実験動物において腫瘍細胞攻撃誘発の完全な拒絶をもたらした(図2H)。重要な対照実験は、5×5μgのhuKS1/4−IL2融合タンパク質の注射自体は、本発明のDNAワクチンによる事前免疫なしで腫瘍攻撃誘発だけを受けたナイーブマウスに投与したとき、本質的に腫瘍増殖に作用を及ぼさなかった(図2E)。M38結腸癌細胞によって発現されないガングリオシドGD2に対する非特異的融合タンパク質hu14.18−IL2での追加抗原投与は全く無効であったので、IL2融合タンパク質ブーストは特異的であった。
腫瘍微小環境に標的化した小量の非治療用量のhuKS1/4−IL2融合タンパク質によるブーストは、本発明のDNAワクチンの効果を著明に上昇させた。実際に、pCEA−CD40LTワクチン群について述べたのと同じプロトコールによるCEAトランスジェニックマウスのワクチン接種と、それに続く、腫瘍細胞攻撃誘発後1日目から連続5日間にわたるhuKS1/4−IL2 5μgの静脈注射は、8匹中8匹の実験動物において腫瘍細胞攻撃誘発の完全な拒絶をもたらした(図2H)。重要な対照実験は、5×5μgのhuKS1/4−IL2融合タンパク質の注射自体は、本発明のDNAワクチンによる事前免疫なしで腫瘍攻撃誘発だけを受けたナイーブマウスに投与したとき、本質的に腫瘍増殖に作用を及ぼさなかった(図2E)。M38結腸癌細胞によって発現されないガングリオシドGD2に対する非特異的融合タンパク質hu14.18−IL2での追加抗原投与は全く無効であったので、IL2融合タンパク質ブーストは特異的であった。
抗原特異的CTL応答は、本発明のpCEA−CD40LT二元機能ワクチンによって上昇する
huKS1/4−IL2融合タンパク質ブーストを伴う又は伴わない、本発明のpCEA−CD40LTワクチンの適用は、個々のプラスミドの各々で免疫したCEAトランスジェニックマウスにおいて明らかにされたように、強い細胞傷害性CD8+T細胞プライミングを誘導した(図3)。図3において、未処置担癌マウスについてのデータを(□)で示し、融合タンパク質だけで処置したマウスを
で示し、プラスミドpER−CEAで免疫したマウスを(○)で示し、pCEA−CD40LTで免疫したマウスを(△)で示し、pW−CEAで免疫したマウスを
で示し、pCEA−CD40LTで免疫したマウスを
で示し、pCEA−CD40LTとhuKS1/4−IL2で免疫したマウスを
で示す。pCEA−CD40LTワクチンに加えて抗体−IL2融合タンパク質によるブーストでワクチン接種を受けたマウスのCTLは最も有効であることを示し、同じワクチンで免疫されたが融合タンパク質ブーストを伴わなかったマウスから得た細胞による45%溶解と比較して、70%までの溶解を誘導した(図3A)。これに対し、対照動物から得た脾細胞ではバックグラウンド溶解だけ観察された。CEA発現を欠く非特異的B16黒色腫細胞を標的として使用すると細胞溶解の完全な欠如を生じたため、腫瘍細胞溶解は特異的であった。重要な点として、図3Bに提示するデータは、H2−Kb/H2−Db MHCクラスI抗原に対する50μg/mlの抗体の存在が細胞傷害作用を完全に阻害したので、MC38−CEA−KSA腫瘍標的細胞に対して免疫したマウスからの脾細胞によって誘発される細胞溶解性応答は、MHCクラスI抗原拘束性であったことを明らかに示している。非特異的抗H−2Kd及びH−2Dd抗体の存在は細胞溶解を阻害しなかったので、この阻害作用は特異的であった。
huKS1/4−IL2融合タンパク質ブーストを伴う又は伴わない、本発明のpCEA−CD40LTワクチンの適用は、個々のプラスミドの各々で免疫したCEAトランスジェニックマウスにおいて明らかにされたように、強い細胞傷害性CD8+T細胞プライミングを誘導した(図3)。図3において、未処置担癌マウスについてのデータを(□)で示し、融合タンパク質だけで処置したマウスを
抗体−IL2融合タンパク質でのブーストによって本発明の二元機能DNAワクチンによるCTL活性マーカーの上方調節が増強される
活性化Tヘルパー細胞上のCD40LTとDC上のそのCD40標的との間の相互作用は、最適の抗原特異的T細胞応答を達成するために重要である。二元機能DNAワクチンがT細胞依存性免疫応答を増強する能力と、T細胞活性化マーカーの発現上昇との間に相関関係が認められた。これは、高親和性IL2受容体α鎖、CD25、初期T細胞活性化抗原、CD69、及び細胞間細胞接着分子ICAM−1を通してのT細胞とDCの初期相互作用のために重要な、リンパ球機能関連抗原、LFA−1の発現上昇から明らかであった(図4)。重要な点として、これらの上方調節されるT細胞活性化マーカーは、DCの同時刺激性B7.1及びB7.2分子についての受容体として働き、CD28とのその連結が、次に、ナイーブT細胞の増殖を同時刺激する、T細胞上で発現されるIgスーパーファミリーの一員であるCD28も包含した(図4)。意外にも、腫瘍細胞攻撃誘発から24時間後のhuKS1/4−IL2融合タンパク質によるブーストは、これらの同じマーカーの発現をさらに20%から35%上昇させた。
活性化Tヘルパー細胞上のCD40LTとDC上のそのCD40標的との間の相互作用は、最適の抗原特異的T細胞応答を達成するために重要である。二元機能DNAワクチンがT細胞依存性免疫応答を増強する能力と、T細胞活性化マーカーの発現上昇との間に相関関係が認められた。これは、高親和性IL2受容体α鎖、CD25、初期T細胞活性化抗原、CD69、及び細胞間細胞接着分子ICAM−1を通してのT細胞とDCの初期相互作用のために重要な、リンパ球機能関連抗原、LFA−1の発現上昇から明らかであった(図4)。重要な点として、これらの上方調節されるT細胞活性化マーカーは、DCの同時刺激性B7.1及びB7.2分子についての受容体として働き、CD28とのその連結が、次に、ナイーブT細胞の増殖を同時刺激する、T細胞上で発現されるIgスーパーファミリーの一員であるCD28も包含した(図4)。意外にも、腫瘍細胞攻撃誘発から24時間後のhuKS1/4−IL2融合タンパク質によるブーストは、これらの同じマーカーの発現をさらに20%から35%上昇させた。
pCEA−CD40LTワクチンでの免疫及び抗体−IL2融合タンパク質でのブーストによる同時刺激分子の発現上昇
T細胞活性化は、T細胞上で発現されるCD28との最適連結を達成するためにDC上の同時刺激分子B7.1及びB7.2の発現の上方調節に依存する。同じく重要であるのは、T細胞インテグリンLFA−1に結合するICAM−1の上方調節である。本発明のDNAワクチンで成功裏に免疫し、抗体−IL2融合タンパク質でブーストしたCEAトランスジェニックマウスから得た脾細胞のフローサイトメトリー分析は、B7.1、B7.2及びICAM−1の発現が対照に比べて1−2倍以上に上方調節されたので、この上方調節が非常に効率的に達成されることを明らかに示した(図5)。抗体−IL2融合タンパク質でのブーストは、同時刺激分子及び接着分子の両方の発現をさらに20%から40%上昇させた(図5)。これらのデータは、pCEA−CD40LT分子でのワクチン接種がCD11c+及びMHCクラスII抗原陽性DC上の同時刺激分子の発現を誘導し、増強させることの証拠を提供し、腫瘍特異的抗原のプロセシング及び提示についてのこれらのAPCの能力が有意に高められることを明らかにした。
T細胞活性化は、T細胞上で発現されるCD28との最適連結を達成するためにDC上の同時刺激分子B7.1及びB7.2の発現の上方調節に依存する。同じく重要であるのは、T細胞インテグリンLFA−1に結合するICAM−1の上方調節である。本発明のDNAワクチンで成功裏に免疫し、抗体−IL2融合タンパク質でブーストしたCEAトランスジェニックマウスから得た脾細胞のフローサイトメトリー分析は、B7.1、B7.2及びICAM−1の発現が対照に比べて1−2倍以上に上方調節されたので、この上方調節が非常に効率的に達成されることを明らかに示した(図5)。抗体−IL2融合タンパク質でのブーストは、同時刺激分子及び接着分子の両方の発現をさらに20%から40%上昇させた(図5)。これらのデータは、pCEA−CD40LT分子でのワクチン接種がCD11c+及びMHCクラスII抗原陽性DC上の同時刺激分子の発現を誘導し、増強させることの証拠を提供し、腫瘍特異的抗原のプロセシング及び提示についてのこれらのAPCの能力が有意に高められることを明らかにした。
pCEA−CD40LTワクチン接種は、抗体−IL2融合タンパク質でさらにブースとされるサイトカインの産生を増強する
照射(15,000ラド)MC38−CEA−KSA腫瘍細胞の存在下で平板培養した後24時間目に様々な脾細胞試料の上清中でそれらの産生を測定した固相サンドイッチELISAによって示されたように、pCEA−CD40LTワクチンはプロ炎症性サイトカイン、IFN−γ及びIL12のT細胞からの放出を増強した。MC38−CEA−KSA細胞での攻撃誘発後にPBS処置したCEAトランスジェニック対照マウスから得た脾細胞の上清を分析したときは、バックグラウンドレベルのIFN−γ及びIL12だけが検出された。しかし、マウスがpCEA−CD40LT DNAワクチンの接種を受けた場合は、IFN−γ及びIL12の産生が、pCD40LT又はpW−CEA単独でワクチン接種されたマウスで観察されたレベルに比べて、それぞれ75%及び50%上昇した(図6)。huKS1/4−IL2融合タンパク質によるブースト後、IFN−γの産生はさらに25%上昇し、IL12の産生は、対照値の3倍及びワクチン接種後に、但しhuKS1/4−IL2ブーストなしで観察されたものに比べて100%上昇した(図6)。これらのデータは、抗体−IL2融合タンパク質のブーストと組み合わせた本発明のワクチンによるDNA免疫が二次リンパ系組織におけるT細胞活性化を決定的に上昇させることを明らかにしている。
照射(15,000ラド)MC38−CEA−KSA腫瘍細胞の存在下で平板培養した後24時間目に様々な脾細胞試料の上清中でそれらの産生を測定した固相サンドイッチELISAによって示されたように、pCEA−CD40LTワクチンはプロ炎症性サイトカイン、IFN−γ及びIL12のT細胞からの放出を増強した。MC38−CEA−KSA細胞での攻撃誘発後にPBS処置したCEAトランスジェニック対照マウスから得た脾細胞の上清を分析したときは、バックグラウンドレベルのIFN−γ及びIL12だけが検出された。しかし、マウスがpCEA−CD40LT DNAワクチンの接種を受けた場合は、IFN−γ及びIL12の産生が、pCD40LT又はpW−CEA単独でワクチン接種されたマウスで観察されたレベルに比べて、それぞれ75%及び50%上昇した(図6)。huKS1/4−IL2融合タンパク質によるブースト後、IFN−γの産生はさらに25%上昇し、IL12の産生は、対照値の3倍及びワクチン接種後に、但しhuKS1/4−IL2ブーストなしで観察されたものに比べて100%上昇した(図6)。これらのデータは、抗体−IL2融合タンパク質のブーストと組み合わせた本発明のワクチンによるDNA免疫が二次リンパ系組織におけるT細胞活性化を決定的に上昇させることを明らかにしている。
(考察)
ヒト腫瘍自己抗原CEAを産生する、CEAトランスジェニックマウスは、ヒト抗腫瘍治療の開発と評価のための有用なモデル生物を提供する。本発明の二元機能経口DNAワクチンは、CEAトランスジェニックマウスにおいて、意外にもCEAに対する末梢性T細胞の免疫寛容を破壊した。重要な点として、CD8+T細胞を介したマウス結腸癌細胞の致死的攻撃誘発の拒絶が、予防的状況において実験マウスの100%において完全に有効であるように起こった。これまでに報告されている、CEAトランスジェニックマウスにおいてCEAベースのDNAワクチンによって達成された腫瘍防御免疫は、必ずしもすべての実験動物において完全に有効ではなかった。意外にも、本発明のワクチンで処置したCEAトランスジェニックマウスにおいて、特に組換え抗体融合タンパク質huKS1/4−IL2のブースター注射と組み合わせて使用したとき、腫瘍防御免疫が成功裏に達成された。
ヒト腫瘍自己抗原CEAを産生する、CEAトランスジェニックマウスは、ヒト抗腫瘍治療の開発と評価のための有用なモデル生物を提供する。本発明の二元機能経口DNAワクチンは、CEAトランスジェニックマウスにおいて、意外にもCEAに対する末梢性T細胞の免疫寛容を破壊した。重要な点として、CD8+T細胞を介したマウス結腸癌細胞の致死的攻撃誘発の拒絶が、予防的状況において実験マウスの100%において完全に有効であるように起こった。これまでに報告されている、CEAトランスジェニックマウスにおいてCEAベースのDNAワクチンによって達成された腫瘍防御免疫は、必ずしもすべての実験動物において完全に有効ではなかった。意外にも、本発明のワクチンで処置したCEAトランスジェニックマウスにおいて、特に組換え抗体融合タンパク質huKS1/4−IL2のブースター注射と組み合わせて使用したとき、腫瘍防御免疫が成功裏に達成された。
本発明のワクチンは、MHC:ペプチド複合体と共にそれらを提示するDCとの相互作用後に、T細胞の有効な活性化に決定的な影響を及ぼすことが知られているいくつかの受容体/リガンド対の発現を上方調節した。本発明のワクチンは、CD40/CD40LT、LFA−1/ICAM−1、CD28/B7.1及びB7.2、及びCD25/IL2を上方調節し、プロ炎症性サイトカインIFN−γ及びIL12の分泌を上昇させた。T細胞及びCD11c+樹状様細胞の著明な活性化が、リンパ球のAPCへの結合に相乗作用することが知られる、T細胞インテグリンLFA−1及びICAM−1の発現の決定的上方調節によって示された。
APCへのナイーブT細胞の一過性結合は、これらの細胞が特異的ペプチドの存在に関して各々のAPCの表面上の数多くのMHC分子をサンプリングする時間を提供する上で重要である。この機構を通して、ナイーブT細胞がその特異的MHC:ペプチドリガンドを認識する機会が上昇し、その後TCRを通してのシグナル伝達及びLFA−1の立体配座変化の誘導が続く。これは、次に、ICAM−1に対するLFA−1の親和性を大きく上昇させ、抗原特異的T細胞とAPCの間の会合を安定化する。
本発明のワクチンによる予防接種及び腫瘍細胞攻撃誘発後の、T細胞上のCD28の発現ならびにDC上の同時刺激分子B7.1及びB7.2の発現の著明な上昇は、ナイーブT細胞の活性化に必要な2つのシグナルを提供するので、特に重要である。1つのシグナルは、TCRへのMHC:ペプチド複合体の結合後にT細胞に伝達される抗原認識を示し、他方のシグナルは、CD28とB7.1及びB7.2の連結を示し、T細胞応答及び武装化(armed)エフェクターT細胞の産生を開始させる。二次リンパ系組織におけるT細胞活性化の明瞭な指標が、CD25、高親和性IL2受容体α鎖及びCD69の発現、初期T細胞活性化抗原の著明な上昇によって与えられた。
本発明の二元機能DNAワクチンによって誘導された、T細胞によるプロ炎症性サイトカインIFN−γ及びIL12の産生の有意の上昇は、第三のシグナルがT細胞に直接作用しうることを示唆する。この「危険シグナル」は、T細胞のクローン増殖を導くTH1分化に必要であることが報告された。実際に、CEAのような腫瘍自己抗原に対する有効なCD8+T細胞応答を生じさせるためにT細胞の助けが必要であるときにはいつでも、抗原特異的CD8+T細胞に遭遇する前にDCの引き金を引くことが必要である。この作用は、APCの表面上のCD40と活性化CD4+T細胞で発現されるCD40Lとの連結によって仲介される。
本発明のDNAワクチンによって発現されるCD40LTは、活性化CD4+T細胞の代用物として働くことができ、B7.1及びB7.2同時刺激分子の決定的上方調節によって示されるようにDCの成熟を導く。CEA及びCD40リガンドの両方をコードする遺伝子を含有する本発明の経口投与二元機能DNAワクチンは、ヒトCEA腫瘍自己抗原に対する極めて効率的な腫瘍防御免疫を誘導する。
上述した実施態様の数多くの変法及び修正が本発明の新規特徴の精神及び範囲から逸脱することなく実施できる。ここで例示する特定実施態様に関していかなる限定も意図されていないこと又は推論されるべきでないことは了解されている。言うまでもなく、本発明の範囲内に含まれるそのような修正はすべて、付属の特許請求の範囲によってカバーされることが意図されている。
図面の中で、
プラスミドCEA及びプラスミドCD40LTを含む、溶解した形質転換Cos−7細胞のウエスタンブロット分析を示し、細胞中にCEA及びCD40LT DNAの両方が存在することを確認する。
本発明のpCEA−CD40LT DNAワクチンを接種したマウスにおける腫瘍増殖の阻害をグラフで示す。
本発明のDNAワクチンを接種したマウスからの脾細胞がMC−38−CEA−KSA腫瘍細胞を死滅させる能力をグラフで示す。
本発明のpCEA−CD40LT DNAワクチンを接種したマウスにおけるT細胞活性化分子の上方調節発現、及び該ワクチン接種マウスをhuKS1/4−IL2融合タンパク質ブーストでさらに処置したときの上方調節の増強をグラフで示す。
本発明のpCEA−CD40LT DNAワクチンを接種したマウスにおいて、それらのワクチン接種マウスをhuKS1/4−IL2融合タンパク質ブーストでさらに処置したときの同時刺激分子の発現増強をグラフで示す。
本発明のpCEA−CD40LT DNAワクチンを接種したマウスにおけるプロ炎症性サイトカインの誘導、及び該ワクチン接種マウスをhuKS1/4−IL2融合タンパク質ブーストで処置したときのその誘導の増強をグラフで示す。
ヒトCEAをコードする遺伝子のDNA配列、配列番号1を示す。
ヒトCD40リガンドをコードするDNA配列、配列番号2を示す。及び
マウスCD40リガンドをコードするDNA配列、配列番号3を示す。
Claims (35)
- 医薬適合性の担体と共に、
(a)癌胎児性抗原(CEA)を作動可能にコードするプラスミドDNA;及び
(b)CD40リガンドを作動可能にコードするプラスミドDNA
を含有する、CEAを提示する細胞に対して免疫応答を誘発するのに有効なDNAワクチン。 - CEAを作動可能にコードするDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするDNAが両方とも同じプラスミドに組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
- CEAを作動可能にコードするDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするDNAが各々別のプラスミドに組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
- 両方のプラスミドDNAが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
- 上記細菌送達ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)及び弱毒化リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)から成る群より選択される細菌である、請求項4に記載のDNAワクチン。
- 両方のプラスミドDNAが弱毒化ウイルス送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
- 上記ウイルスベクターが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスウイルスから成る群より選択されるウイルスの弱毒化形態である、請求項6に記載のDNAワクチン。
- 両方のプラスミドDNAが弱毒化ネズミチフス菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項1に記載のDNAワクチン。
- 上記CD40リガンドがCD40LTである、請求項1に記載のDNAワクチン。
- 癌胎児性抗原(CEA)を作動可能にコードするプラスミドDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするプラスミドDNAを含有する、有効な免疫応答誘発化量のDNAワクチンを、CEAを提示する細胞に対して免疫応答を誘発するのに十分な量で哺乳動物に投与する段階を含む、CEAを提示する癌細胞に対して哺乳動物を免疫する方法。
- 上記哺乳動物がヒトである、請求項10に記載の方法。
- 両方のプラスミドDNAが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項10に記載の方法。
- 上記細菌送達ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネス(Listeria monocytogenes)から成る群より選択される細菌である、請求項12に記載の方法。
- 両方のプラスミドDNAが弱毒化ウイルス送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項10に記載の方法。
- 上記ウイルス送達ベクターが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスウイルスから成る群より選択されるウイルスの弱毒化形態である、請求項14に記載の方法。
- 上記CD40リガンドがCD40LTである、請求項10に記載の方法。
- 癌胎児性抗原を提示する上記細胞が結腸癌細胞である、請求項10に記載の方法。
- 上記ワクチンを経口的に投与する、請求項10に記載の方法。
- CEAを作動可能にコードするDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするDNAが両方とも同じプラスミドに組み込まれている、請求項10に記載の方法。
- CEAを作動可能にコードするDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするDNAが各々別のプラスミドに組み込まれている、請求項10に記載の方法。
- 癌胎児性抗原(CEA)を提示する癌細胞に対して哺乳動物を免疫する方法であって、 (a)CEAを作動可能にコードするプラスミドDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするプラスミドDNAを含有する、免疫応答誘発化量のDNAワクチンを該哺乳動物に投与すること;及び
(b)医薬適合性の担体中の、免疫応答誘発化量の組換え抗体融合タンパク質huKS1/4−IL2を該哺乳動物に投与すること
を含む、方法。 - 上記哺乳動物がヒトである、請求項21に記載の方法。
- 両方のプラスミドDNAが弱毒化細菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項21に記載の方法。
- 上記細菌送達ベクターが、弱毒化ネズミチフス菌及び弱毒化リステリア・モノシトゲネスから成る群より選択される細菌である、請求項23に記載の方法。
- 両方のプラスミドDNAが弱毒化ウイルス送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項21に記載の方法。
- 上記ウイルス送達ベクターが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス及びアビポックスウイルスから成る群より選択されるウイルスの弱毒化形態である、請求項25に記載の方法。
- 上記CD40リガンドがCD40LTである、請求項21に記載の方法。
- 癌胎児性抗原を提示する上記細胞が結腸癌細胞である、請求項21に記載の方法。
- 上記ワクチンを経口的に投与する、請求項21に記載の方法。
- 上記組換え抗体融合タンパク質huKS1/4−IL2を静脈内投与する、請求項21に記載の方法。
- CEAを作動可能にコードするDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするDNAが両方とも同じプラスミドに組み込まれている、請求項21に記載の方法。
- CEAを作動可能にコードするDNA及びCD40リガンドを作動可能にコードするDNAが各々別のプラスミドに組み込まれている、請求項21に記載の方法。
- 上記ワクチンを特定する印刷が為され、上記ワクチンの患者への個々の投与に有用な情報を提供するラベルが貼付された密封滅菌容器内に包装されている、請求項1に記載のワクチンを含むキット。
- CD40リガンドがCD40LTであり、両方のプラスミドDNAが弱毒化ネズミチフス菌送達ベクターに作動可能に組み込まれている、請求項33に記載のキット。
- 融合タンパク質を特定する印刷が為され、前記融合タンパク質の患者への個々の投与に有用な情報を提供するラベルが貼付された密封滅菌容器内に包装されている、医薬適合性の担体と共に組換え抗体融合タンパク質huKS1/4−IL2をさらに含む、請求項33に記載のキット。
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