MXPA04008475A

MXPA04008475A - Vacunas de dna que codifican al cea y a un ligando de cd40 y metodos de uso de estas.

Info

Publication number: MXPA04008475A
Application number: MXPA04008475A
Authority: MX
Inventors: Xiang Rong
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 2002-03-02
Filing date: 2003-02-28
Publication date: 2004-12-06
Also published as: AU2003213653A1; KR20040089696A; US20050287123A1; EP1487984A1; ZA200406991B; US20030176377A1; BR0308101A; PL373607A1; AU2003213653B2; WO2003074712A1; CA2477647A1; RU2004129331A; US6923958B2; JP2005526750A; CN1650015A; EP1487984A4; US7279464B2

Abstract

Una vacuna de DNA efectiva para provocar una respuesta inmune contra celulas que presentan un antigeno carcinoembrionario (CEA) comprende un DNA que codifica operablemente a un CEA y un DNA que codifica operablemente a un ligando de CD40, SEC ID NO; 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente, o su homotrimero CD40LT. La vacuna de DNA puede ser incorporada en un vector de liberacion tal como una bacteria o virus vivos atenuados, o un liposoma portador. En una modalidad del metodo, la vacuna de DNA es administrada oralmente a un mamifero tal como un humano, para provocar una respuesta inmune contra celulas que presentan CEA tal como celulas de cancer de colon. Una modalidad preferida del metodo incluye la etapa adicional de tratar al mamifero con la proteina de fusion con anticuerpo recombinante, huKS1/4-IL2 para mejorar la efectividad de la respuesta inmune de la vacuna.

Description

VACUNAS DE DNA QUE CODIFICAN AL CEA Y A UN LIGANDO DE CD40 Y METODOS DE USO DE ESTAS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención concierne a vacunas de ácido desoxiribonucleico (DNA) . Más particularmente, esta invención concierne a vacunas de DNA que contienen construcciones de polinucleótidos que codifican para el antigeno carcinoembrionario (CEA) y un ligando de CD40.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Se han utilizado vacunas para proporcionar una protección a largo plazo contra numerosas condiciones de enfermedades por medio de una administración limitada de un agente profiláctico que estimule un sistema inmune del organismo para destruir los patógenos de enfermedades antes de que puedan proliferar y causar un efecto patológico. Se describen varios procedimientos para vacunas y vacunaciones en Bernard R. Glick y Jack J. Pasternak, Molecular Biotechnology, Principies and Applications of Recombinant DNA, Segunda Edición, ASM Press pag. 253- 276 (1998). La vacunación es un medio de inducir al sistema inmune propio del cuerpo para buscar y destruir un agente infeccioso antes de causar una respuesta patológica.

Típicamente, las vacunas son ya sea agentes infecciosos vivos, pero atenuados (virus o bacterias) o bien una forma muerta del agente. Una vacuna que consiste de una bacteria o virus no debe de ser patógena. Típicamente, un cultivo bacteriano o viral es atenuado (debilitado) por medio de tratamiento químico o físico. Aunque el agente no sea virulento, puede aún provocar una respuesta inmune en un sujeto tratado con la vacuna. Una respuesta inmune es provocada por antígenos, ya sea macromoléculas específicas, o bien un agente infeccioso. Estos antígenos generalmente son ya sea proteínas, polisacáridos, lípidos, o glicolípidos, los cuales son reconocidos como "extraños" por linfocitos conocidos como células B y células T. La exposición de ambos tipos de linfocitos a un antígeno provoca una respuesta de división y diferenciación celular rápida, dando como resultado la formación de clones de los linfocitos expuestos. Las células B producen células plasmáticas, las cuales a su vez, producen proteínas llamadas anticuerpos (Ab) las cuales enlazan selectivamente a los antígenos presentes en el agente infeccioso, neutralizando o inactivando así al patógeno (inmunidad humoral). En algunos casos, la respuesta de las células B requiere de la asistencia de células T auxiliares CD4+.

El clon de células T especializadas que se forma en respuesta a la exposición al antigeno es un linfocito T citotóxico (CTL) , el cual es capaz de enlazar a y eliminar patógenos y tejidos que presentan el antigeno (inmunidad celular o mediada por células) . En algunos casos, una célula presentadora de antigeno (APC) tal como una célula dendritica, desarrollará un patógeno u otra célula extraña por endocitosis. La APC procesa entonces los antigenos desde las células, y presentan estos antigenos en la forma de complejo péptido-molécula con biocompatibilidad hacia el receptor de células T (TCR) sobre CTLs, estimulando asi una respuesta inmune. La inmunidad humoral caracterizada por la formación de anticuerpos específicos es generalmente más efectiva contra infecciones bacterianas agudas e infecciones de repetición de virus, mientras que la inmunidad medida por células es más efectiva contra infección viral, infección bacteriana intracelular crónica, e infecciones fúngicas. La inmunidad celular es también conocida por proteger contra cánceres y es responsable del rechazo del transplante de órganos. Los anticuerpos para antigenos de infecciones previas permanecen detectables en la sangre por periodos de tiempo muy prolongados, dando asi como resultado un medio de determinar la exposición previa a un patógeno. En la re- exposición al mismo patógeno, el sistema inmune efectivamente previene la re-infección al eliminar al agente patógeno antes de poder proliferar y producir una respuesta patógena. 5 La misma respuesta inmune que seria provocada por un patógeno puede también algunas veces ser producida por un agente no patógeno que presenta el mismo antigeno que el patógeno. De esta manera, el sujeto puede ser protegido contra la exposición subsecuente al patógeno sin haber 0 emitido previamente una infección. No obstante, no todos los agentes infecciosos pueden ser cultivados e inactivados fácilmente, como se requiere para la formación de vacunas. Las técnicas modernas de DNA recombinante han permitido el diseño de nuevas vacunas 5 para buscar superar esta limitación. Los agentes infecciosos pueden ser creados sin los genes patógenos, permitiendo así una forma viva, no virulenta del organismo a ser usado como una vacuna. También es posible diseñar un organismo relativamente no patógeno tal como E. coli para 0 presentar los antígenos de superficie celular de un portador patógeno. El sistema inmune de un sujeto tratado con un portador transformado tal es "manipulado" en la formación de anticuerpos para el patógeno. Las proteínas antigénicas de un agente patógeno pueden ser diseñadas y S expresadas en una especie no patógena y las proteínas antigénicas pueden ser aisladas y purificadas para producir una "vacuna subunitaria" . Las vacuna subunitarias tienen la ventaja de ser estables, seguras, y bien definidas químicamente; no obstante, su producción puede tener un costo prohibitivo. Ha surgido un nuevo procedimiento para vacunas en los últimos años, la inmunización genética mencionada ampliamente. En este procedimiento, un gen que codifica a un antígeno de un agente patógeno es insertado operablemente en células en el sujeto a ser inmunizado. Las células tratadas son transformadas y producen las proteínas antigénicas del patógeno. Estos antígenos producidos in vivo entonces activan la respuesta inmune deseada en el huésped. El material genético utilizado en dichas vacunas genéticas puede ser ya sea una construcción de DNA o de RNA. A menudo el polinucleótido que codifica al antigeno es introducido en combinación con otras secuencias de polinucleótidos promotoras para mejorar la inserción, replicación, o la expresión del gen. Las vacunas de DNA que codifican a genes antigénicos pueden ser introducidas en las células huéspedes del sujeto por medo de una variedad de sistemas de expresión. Estos sistemas de expresión incluyen sistemas de expresión procariótico, de mamífero, y de levaduras. Por ejemplo, un procedimiento es utilizar un vector viral, tal como el virus de vaccina que incorpora el nuevo material genético, para inocular a las células huéspedes. Alternativamente, el material genético puede ser incorporado en un vector o puede ser liberado directamente en las células huéspedes como un polinucleótido "desnudo", es decir, simplemente como DNA purificado. Además, el DNA puede ser transfectado establemente en bacterias atenuadas tales como Salmonella typhimurium. Cuando un paciente es vacunado oralmente con la Salmonella transformada, la bacteria es transportada a parches de Peyer en el intestino (es decir, tejidos linfoides secundarios) , la cual entonces estimula una respuesta inmune. Las vacunas de DNA proporcionan una oportunidad para inmunizar contra estados de enfermedades que no son causadas por los patógenos tradicionales, tales como enfermedades genéticas y cáncer. Típicamente, en una vacuna de cáncer genético, los antigenos para un tipo especifico de célula tumoral deben de ser aislados y luego introducidos en la vacuna. Uno de los principales obstáculos para lograr una respuesta inmune especifica de tumor es superar la tolerancia de las células T periféricas contra los antigenos mismos del tumor e inducir linfocitos T citotóxicos (CTLs) , el cual erradica efectivamente la metástasis de tumor diseminada y mantener subsecuentemente una memoria inmunológica de larga duración que previene la recurrencia del tumor. El antigeno carcinoembrionario humano (CEA) es una glicoproteina de membrana oncofetal, la cual proporciona un objetivo auto-antigénico tumoral relevante para el desarrollo de vacunas de DNA para inmunoterapia . Un modelo animal útil para vacunas basadas en CEA se reporta en Clarke y colaboradores Cáncer Res. 1998, 58: 1469. El modelo involucra el establecimiento de una linea de ratón que porta el transgen de DNA humano para CEA humano y expresa a CEA en una manera especifica de tejido similar a humanos. Después de cebar in vivo con fibroblastos transíectados en CEA, células T CD8+ anti-CEA han sido provocadas en estos ratones transgénicos, los cuales fueron tolerantes a CEA en el compartimento de las células T CD4+, descrito por Mizobata y colaboradores Cáncer Immunol. Immunother. 2000, 49:285. Los estudios en humanos por Tsang y colaboradores J. Nati. Cáncer Inst. 1995, 87:982, han indicado que CTLs CD8+ específicos para CEA no son seleccionados negativamente, similar a los hallazgos obtenidos con ratones transgénicos. Son bien conocidos en el arte, los papeles biológicos del ligando de CD40 (CD40L) , particularmente su interacción con CD40 expresado en células presentadoras de antigeno durante la co-estimulación de la activación de células T. CD40 es una glicoproteina de 48 kDa expresada en la superficie de todas las células B maduras, la mayoría de las células B malignas maduras, y algunas de las células B precoces de leucemias linfociticas agudas, pero no es expresada en células plasmáticas, Clark, Tlssue ñntigens 1990, 35: 33-36. CD40L, un tipo de proteina de membrana de tipo II de 35 kDa y un elemento de la familia genética del factor de necrosis de tumor (TNF) , es expresado en las superficies de células T en el reconocimiento de antígenos. Los elementos de la familia de TNT son biológicamente más activos cuando son expresados como homotrímeros . CD40L no es excepción a este respecto y puede ser expresado como un homotrímero (CD40LT) por modificación de un motivo de cierre de leucina de 33 aminoácidos fusionado en el N-terminus de la región extracelular completa de este ligando. El DNA de CD40LT ha sido reportado por Gurunathan y colaboradores J. Immunol . 1998, 161: 4563, para mejorar las respuestas inmunes celulares tales como la inducción de IFN-? y la actividad de células T citolíticas cuando los ratones fueron vacunados con DNA que codifica al modelo muy inmunogénico ß-galactosidasa del antígeno. CD40L está involucrado críticamente en la activación de células T necesarias para inducir una inmunidad protectora efectiva contra auto-antígenos tumorales. Una vez que los complejos péptido-antígeno de Clase I de MHC son captados por las células dendríticas (DCs) y presentadas a las células nuevas, la primera señal del antigeno es liberada via los receptores de células T (TCR) , seguido por la sobre-regulación de CD40L. Sobre la superficie de la célula T, CD40L entonces induce la actividad co-estimuladora sobre DCs via las interacciones CD40-CD40L. Cebadas asi, estas APCs expresan ahora a moléculas co-estimuladoras B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) , las cuales envian una segunda señal co-estimuladora a células T via la interacción con CD28, un evento requerido para la activación total de células T para producir concurrentemente citoquinas INF-y e IL12, y para efectuar funciones efectoras. Un medio efectivo de mejorar la eficiencia de vacunas de DNA es desarrollar el plásmido que codifica al DNA en una cepa no replicadora de Salmonella typhimurium, el cual puede entonces ser aplicado como una vacuna oral. La bacteria atenuada, viva, transporta el DNA a través del tracto gastrointestinal y luego a través de las células T que cubren los parches de Peyer del intestino. De ahi la bacteria atenuada entra a las APCs tales como células dendriticas y macrófagos, en donde mueren, a causa de su mutación, que libera múltiples copias del DNA en el interior de los fagocitos. Se cree que la bacteria atenuada proporciona una "señal de peligro" y estimula el sistema inmune, produciendo citoquinas pro-inflamatorias como IL12 y mediadores tales como óxido nítrico que mejora la presentación del antígeno y promueve respuestas inmunes 5 celulares TH de tipo-1 asociadas con la erradicación de tumores. De hecho, se ha reportado que S. typhimurium atenuada es un portador efectivo para una vacuna de DNA oral autóloga que protege contra melanoma de roedor (Xiang y colaboradores Proc. Wat. Acad. Sci. (USA) 2000, 97- 10 5492) . Una vacuna de histeria monocytogenes recombinante se reportó que era muy efectiva al mediar la regresión de melanoma de roedor primario y su metástasis de pulmón establecida (Pan y colaboradores Cáncer Res. 1999, 59:5254). L. monocytogenes produce una fuerte respuesta 15 celular puesto que, la mayoría de las otras bacterias intracelulares diferentes, escapan en el citoplasma al disruptar la membrana fagosomática permitiendo así a cualquier proteína ser secretada para llevar a cabo las rutas tanto de MHC de clase I y de clase II de células 0 infectadas para presentación antigénica. Xiang y colaboradores, Clin. Cáncer Res., 2001, 3: 8565, reporta sobre la protección de tumor parcial contra una provocación letal de células MC38 de carcinoma de colon de roedor, transducidas establemente con CEA y KSA, 5 una molécula de adhesión celular epitelial humana. Los ratones fueron vacunados por sonda oral con una vacuna de DNA basada en CEA portada Salmonella typhimurium atenuada, la cual indujo las respuestas de células T CD8+ restringidas del antigeno de MHC de clase I, dando como resultado el rechazo de tumores subcutáneos. No obstante, esto ocurrió solamente en algunos de los ratones experimentales transgénicos por CEA, aún cuando se reforzaron con una proteina de fusión IL2-anticuerpo recombinante que llevó a cabo IL-2 en el microámbito del tumor. Hay una necesidad actual por vacunas que provoquen una respuesta inmune protectora de tumor medida por células T CD8+ contra el auto-antigeno de CEA con eficiencia mejorada contra el cáncer de colon. La presente invención logra este objetivo con una vacuna de DNA de función dual, única que codifica al CEA y CD40LT que activa tanto DCs y linfocitos T nuevos, particularmente cuando fueron auxiliados por refuerzos con la proteina de fusión HUKS1/4-IL2.

SUMARIO DE LA INVENCION Se proporciona una vacuna que es efectiva contra células presentadoras de CEA tal como células de cáncer de colon. La vacuna comprende un DNA plásmido que codifica a CEA (por ejemplo, la secuencia de DNA SEC ID NO: 1) y un DNA plásmido que codifica a un ligando de CD40 tal como CD40L humano, la secuencia de DNA SEC ID NO: 2 o sus CD40LT homotrimeros . El DNA de CEA y de CD40L, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente pueden incorporarse en el mismo plásmido o en plásmidos diferentes. La combinación de DNA plásmido que codifica tanto al CEA como a un ligando de CD40 en una vacuna única promueve la activación tanto de células T nuevas como de las células presentadoras de antigeno tales como células dendríticas, estimulando asi dos sistemas de respuesta inmune diferentes . El DNA plásmido de las vacunas de la presente invención pueden ser incorporados operablemente en un portador eficiente tal como una bacteria atenuada, un virus no replicador, o una partícula de liposoma. En una aspecto del método de la presente invención, una vacuna de DNA que comprende un DNA plásmido que codifica al CEA (SEC ID NO: 1) y un DNA plásmido que codifica a un CD40L (SEC ID NO: 2) o su CD40LT homotrímero, es administrada a un mamífero, tal como un humano, en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune contra células presentadoras de CEA tales como células de cáncer de colon. En otro aspecto del método de la invención, un mamífero tal como un humano es administrado secuencialmente (a) una vacuna de DNA que comprende un DNA plásmido que codifica a CEA (SEC ID NO: 1) y a un ligando de CD40 (SEC ID NO: 2) o su CD40LT homotrímero, en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune contra células presentadoras de CEA tales como células de cáncer de colon, y (b) una cantidad efectiva que mejora la respuesta inmune de una proteina de fusión IL2-anticuerpo recombinante (HUKS1/4-IL2) . La proteina de fusión huKSl/4-IL2 mejora la responsabilidad inmune del mamífero tratado con la vacuna de DNA de modo que el sistema inmune ataca más efectivamente a las células presentadoras del CEA, tales como células de cáncer de colon. La vacuna y la proteina de fusión pueden ser administradas oralmente o parenteralmente . Preferiblemente la vacuna es administrada oralmente, y la proteína de fusión es administrada intravenosamente . Las vacunas de la presente invención proporcionan un tratamiento preventivo para cánceres tales como, por ejemplo, cáncer de colon, al provocar una respuesta inmune contra células que presentan el CEA, incluyendo células de cáncer de colon.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos, la FIGURA 1, expone un análisis por tinción Western de células Cos-7 transformadas, lisadas que contienen plásmido de CEA (A) y el plásmido de CD40LT (B) , que confirman la presencia de DNA tanto de CEA como de CD40LT en las células. La FIGURA 2, expone gráficamente la inhibición del crecimiento de tumor en ratones vacunados con la vacuna de DNA de pCEA-CD40LT de la presente invención: A. irradiados, B. Vector vacio, C. pER-CEA, D.pCD40LT, E. huKSl/4-IL2, F. pW-CEA, G. pCD40LT-CEA, H.pCD40LT-CEA + huKSl/4-IL2; La FIGURA 3, expone gráficamente la habilidad de los esplenocitos de ratones vacunados con la vacuna de DNA de la presente invención para matar células tumorales MC-38-CEA-KSA; La FIGURA 4, expone gráficamente la expresión sobre-regulada de moléculas activadoras de células T en ratones vacunados con la vacuna de DNA de pCEA-CD40LT de la presente invención, y la sobre-regulación mejorada cuando ratones vacunados son tratados adicionalmente con los refuerzos de proteínas de fusión huKSl/4-IL2; La FIGURA 5 expone gráficamente la expresión mejorada de moléculas co-estimuladoras en ratones vacunados con la vacuna de DNA de pCEA-CD40LT de la presente invención cuando los ratones vacunados son tratados adicionalmente con el refuerzo de la proteina de fusión huKSl/4-IL2 La FIGURA 6, expone gráficamente la inducción de citoquinas pro-inflamatorias en ratones vacunados con una vacuna de DNA de pCEA-CD40LT de la presente invención, y el mejoramiento de esa inducción cuando los ratones vacunados son tratados con refuerzos de la proteina de fusión huKSl/4-IL2; La FIGURA 7, expone la secuencia de DNA de un gen que codifica para el CEA humano, SEC ID NO: 1 ; La FIGURA 8, expone la secuencia de DNA que codifica para el ligando de CD40 humano, SEC ID NO: 2; y La FIGURA 9, expone la secuencia de DNA que codifica para el ligando de CD40 de roedor, SEC ID NO: 3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Una vacuna de DNA ¦ efectiva contra células presentadoras del CEA tales como células de cáncer de colon comprende una construcción de DNA plásmido que codifica al CEA (SEC ID NO: 1) y un DNA plásmido que codifica a un ligando de CD40 (SEC ID NO: 2) o su homotrimero, CD40LT. El DNA del CEA y CD40L, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente, pueden ser incorporados en el mismo plásmido o en plásmidos diferentes. Los plásmidos de DNA pueden ser incorporados operablemente en un portador tal como una bacteria atenuada, un virus no reproductor, o una partícula de liposoma. La vacuna de DNA puede comprender también DNA "desnudo" .

Las vacunas de DNA de la presente invención estimulan la formación de CTLs que son activas contra células presentadoras del CEA, tales como células de cáncer de colon. A causa de que el CEA es un marcador especifico para células de cáncer de colon, un CTL que forma en respuesta a la vacuna llegará substancialmente solo a dichos tejidos cancerosos. El ligando de CD40 estimula células dendriticas, las cuales son el tipo más efectivo de APCs que ayudan al producir una respuesta celular inmune. Una vacuna que comprende una combinación de DNA que codifica al CEA y a un ligando de CD40, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente, pueden promover la activación de células T nuevas tanto directa como indirectamente por medio de la intervención de células dendriticas. Una vacuna en combinación tal estimula simultáneamente dos diferentes mecanismos de respuestas inmune diferentes, incrementando asi la eficiencia del tratamiento . Como se usa en la presente, y en las reivindicaciones anexas, el término "DNA" se refiere al ácido desoxiribonucleico tanto en las formas gramaticales en singular como en plural. El término "inmunidad", como se usa en la presente, se refiere a la protección inmunológica a largo plazo contra la forma virulenta del agente infeccioso. El término "inmunización", como se usa en la presente, se refiere a la exposición profiláctica a un antigeno de un agente patógeno derivado de una fuente no virulenta y que da como resultado la inmunidad al patógeno en el sujeto tratado. Un DNA útil en las vacunas de la presente invención comprende preferiblemente una secuencia de nucleótidos que codifica al CEA (SEC ID NO: 1) y/o a un ligando de CD40 (SEC ID NO: 2) , unido operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión genética. Preferiblemente el ligando de CD40 es CD40LT. El DNA del CEA y del ligando de CD40, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente, y preferiblemente se incorporan en la vacuna como un solo plásmido, designado en la presente como pCEA-CD40LT (es decir CEA-CD40 LT plásmido) . Alternativamente, la vacuna puede comprender un DNA plásmido que codifica al CEA (SEC ID NO: 1) y un DNA plásmido separado que codifica a CD40L (SEC ID NO: 2) .

Cuando es captada por una célula, la molécula de DNA puede permanecer presente en la célula como una molécula extracromosómica funcional y/o puede integrarse al DNA cromosómico de la célula. El DNA puede ser introducido en células en la forma de un plásmido que puede permanecer como material genético separado. Alternativamente, un DNA lineal que puede integrarse al cromosoma puede ser introducido en la célula. Cuando se introduce el DNA en la célula, pueden añadirse los reactivos que promueven la integración del DNA en los cromosomas, como se sabe en el arte. Las secuencias de DNA que promueven la integración pueden también ser incluidos en la vacuna. El DNA que codifica al CEA y a un ligando de CD40, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente, puede permanecer como parte del material genético en forma de un microorganismo vivo atenuado o de vector microbiano recombinante de la vacuna, los cuales pueden vivir en las células del paciente. Las vacunas de DNA útiles incluyen preferiblemente elementos reguladores necesarios para la expresión de una molécula de ácido nucleico. Dichos elementos incluyen, por ejemplo, un promotor, un codón de iniciación, un codón de detención, y una señal de poliadenilación . Además, se requieren a menudo los me oradotes para la expresión de una secuencia que codifica a una proteina inmunogénica objetivo. Como se sabe en el arte, estos elementos son preferiblemente unidos operablemente a la secuencia que codifica a la proteina deseada. Los elementos reguladores son seleccionados preferiblemente que sean operables en la especie a la cual van a ser administrados. Los codones de iniciación y los codones de detención son preferiblemente incluidos en el arte como parte de una secuencia de nucleótidos que codifican a la proteina del CEA y del ligando de CD40 en una vacuna genética de la presente invención. Los codones de iniciación y de terminación deben de estar en el marco con la secuencia codificadora . Los promotores y las señales de poliadenilación incluidas en la vacuna de la presente invención son seleccionados preferiblemente para ser funcionales en las células del sujeto a ser inmunizado. Los ejemplos de promotores útiles en las vacunas de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no se limitan a promotores de Virus Simiano 40 (SV40) , promotor de Virus de Tumor Mamario de Ratón (MMTV) , Virus d e Inmunodeficiencia Humana (HIV) tales como el promotor de Repetición Terminal Prolongada de HIV (LTR) , Virus de Molney, Citomegalovirus (CMV) tal como el promotor precoz inmediato de CMV, Virus de Epstein Barr (EBV) , Virus del Sarcoma de Rous (RSV) así como también promotores de genes humanos tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina muscular humana, y metalotineina humana. Otros promotores útiles incluyen promotores específicos de tejido tales como promotores dirigidos al endotelio tumoral, así como también promotores selectivos de tumor tales como promotores del CEA, y promotores responsables del tratamiento tales como los promotores de la respuesta de crecimiento precoz.

Ejemplos de señales de poliadenilación útiles en las vacunas de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no se limitan a señales de poliadenilación de SV40 y señales de poliadenilación de LTR. Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión del DNA, pueden incluirse también otros elementos en. la molécula de DNA. Dichos · elementos adicionales incluyen mejoradotes. Los mejoradotes incluyen los promotores descritos anteriormente. Los mej oradores/promotores preferidos incluyen, por ejemplo, actina humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina de músculo humano y mejoradotes virales tales como los de CMV, RSV y EBV. Puede añadirse un elemento adicional a la vacuna para servir como un objetivo para la destrucción celular si es deseable ser capaz de eliminar células que reciben la construcción genética por cualquier razón. Por ejemplo, un gen de timidita quinasa (tk) de herpes, en una forma expresable, puede incluirse en la vacuna. El fármaco ganciclovir, puede ser administrado al sujeto inmunizado, lo cual causará la muerte selectiva de cualquier célula productora de tk. Dichos medios de introducir objetivos genéticos para la destrucción selectiva de células son conocidos y descritos en la Patente U.S. No. 5,817,637 de einer y colaboradores . Las secuencias reguladoras y los codones son especies generalmente dependientes. A fin de maximizar la producción de proteina, las secuencias reguladoras y los codones son seleccionados preferiblemente para ser efectivos en las especies a ser inmunizadas. Uno que tenga experiencia en el arte puede producir construcciones de DNA que son funcionales en una especie de sujetos dada.

DNAs útiles en las vacunas de la presente invención también incluyen DNAs "desnudos" como define Restito y colaboradores Gene Therapy, 2000, 7:89-92, cuya descripción pertinente se incorpora a la presente. Alternativamente, el DNA puede ser incorporado operablemente en un portador o vector de liberación. Los vectores de liberación útiles incluyen microcápsulas biodegradables, complejos inmuno-estimuladores (ISCOMs) o liposomas, y portadores vivos diseñados genéticamente tales como virus o bacterias. Ejemplos de virus de liberación/portadores bacterianos vivos atenuados adecuados incluyen Salmonella typhimurium, Salmonella Typhi, Listeria monocytogenes, Shigella, Bacillus, Lactobacillus, Bacille Calmette-Guérin (BCG) , Escherichia coli. Vibrio cholerae, Campylobacter, y cualquier otro vector bacteriano adecuado, que se conozca en el arte. Los vectores de liberación bacterianos preferidos incluyen Salmonella typhimuzium atenuada y histeria monocytógenes atenuada se prefiere de manera partícula Salmonella typhimurium atenuada. Los métodos de transformar vectores bacterianos vivos con una construcción de DNA exógeno son bien descritos en el arte. Ver, por ejemplo, Joseph Sambrook y David W. Russell, Molecular Cloning: ñ Laboratory Manual, 3a. Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (2001) . Los portadores virales atenuados preferidos incluyen virus del Herpes, Adenovirus, virus de Vaccinia, y virus Avipox. Los métodos de transformar un vector viral con una construcción de DNA exógeno son también bien descritos en el arte. Ver Sanbrook y Russell, anteriores. Los portadores de liposomas son vesículas unilaminares o multilaminares, que tienen una porción de membrana formada de material lipofílico y una porción acuosa interior. La porción acuosa es usada en la presente invención para contener el material polinucleótido para ser liberado en la célula objetivo. De manera general se prefiere que los materiales que conforman los liposomas tengan un grupo catiónico, tal como un grupo amonio cuaternario, y uno o más grupos lipofílicos, tales como grupos alquilo saturados o insaturados que tengan aproximadamente de 6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. Se describe un grupo de materiales adecuados en la Publicación de Patente No. 0187702, y se discute adicionalmente en la Patente U.S. No. 6,228,844 de Wolff y colaboradores, cuyas descripciones pertinentes se incorporan a la presente como referencia. Muchos otros compuestos lipidíeos catiónicos formadores de liposoma adecuados se describen en la literatura. Ver, por ejemplo, L. Stamatatos, y colaboradores, Biochemistry 27:3917-3925 (1988); y H. Eibl, y colaboradores, Biophysical Chemistry 10: 261-271 (1979) . Alternativamente, una microesfera tal como una microesfera biodegradable de polilactida-coglicolida con el liposoma o la microesfera para liberar del DNA a un tejido, como se sabe en el arte. La vacuna de la invención puede también ser administrada conjuntamente con un agente facilitador que mejore la captación del material genético de la vacuna por medio de células tratadas. En algunas modalidades preferidas, el DNA puede ser formulado con o administrado conjuntamente con un facilitador seleccionado del grupo que consiste de ésteres de ácido benzoico, anilidas, amidinas, uretanos y las sales clorhidrato de las mismas tales como las de la familia de anestésicos locales, tales como los descritos en la Patente U.S. No. 6,248,565 de illiam y colaboradores, cuyas descripciones pertinentes se incorporan a la presente como referencia.

En un aspecto del método de la presente invención, una vacuna de DNA puede ser utilizada para proporcionar protección a largo plazo contra células presentadoras de CEA tales como células de cáncer del colon, en un paciente vacunado. En una modalidad preferida del método una vacuna de DNA que comprende un DNA plásmido que codifica operablemente tanto al CEA como al ligando de CD40, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente (por ejemplo, pCEA-CD40LT) , es administrada a un mamífero en necesidad de protección contra células presentadoras de CEA en una cantidad que sea suficiente para provocar una respuesta inmune contra células presentadoras del CEA. El otra modalidad preferida del método de la presente invención, el crecimiento de tumor es inhibido por medio de la vacunación de un mamífero con la vacuna de pCEA-CD40LT de la presente invención. En una modalidad tal del método, una cantidad efectiva de una vacuna que provoca una respuesta inmune que comprende una construcción de DNA plásmido que codifica operablemente tanto al CEA como al CD40L, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente, es administrada a un mamífero que tenga un tumor creciente que comprenda células presentadoras del CEA. La vacunación da como resultado la detención del crecimiento del tumor y minimiza la formación de nuevos tumores al inmunizar al mamífero contra las células tumorales.

En aún otro aspecto del método de la presente invención, se administra secuencialmente a un mamífero (a) una vacuna de DNA que comprende un DNA plásmido que codifica al CEA y un DNA plásmido que codifica al ligando de CD40, SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 2, respectivamente, en una cantidad efectiva para provocar una respuesta inmune contra células presentadoras de CEA tales como células de cáncer del colon, y (b) una cantidad efectiva de la proteina de fusión IL-2 - anticuerpo KS-1/4 (huKS-l/4-IL2 ) que mejore la respuesta inmune. Hu KS1/4-IL2 se describe con detalle por Gillies y colaboradores J. Immunol . 1998, 160:6195-6203, cuya descripción relevante se incorpora a la presente como referencia. IL2 es una citoquina compleja producida por células T activadas, las cuales estimulan el crecimiento tanto de células B como de células T. La activación de células T para producir citoquinas también estimula la producción del ligando de CD40 sobre la superficie de las células T (ver generalmente, el Capitulo 7 de Charles A. Janeway, Jr. Y Paul Travers, Immunology The Inmune System in Health and Disease, Segunda Edición, Garland Publishing Co., New York, 1996) . El papel de IL2 dirigida hacia un microámbito tumoral por medio de la proteina de fusión de huKS-l/4-IL2 es para reforzar las respuestas de las células T anti-tumorales ya sea al actuar como una segunda señal co- estimuladora en la activación de CTLs o al activar adicionalmente DCs pre-activadas que expresan a los receptores de IL2. La proteina de fusión huKS-l/4-IL2 mejora asi la capacidad de respuesta inmune del mamífero tratado con la vacuna de DNA de modo que el sistema inmune ataca más efectivamente a las células presentadoras del CEA, mejorando asi la efectividad de la vacunación. En las modalidades del método de la presente invención, las vacunas son administradas preferiblemente de manera enteral, tal como por administración oral, o parenteralmente, tal como por infusión intravenosa. En algunas modalidades preferidas, la vacuna es administrada intramuscular, intranasal, intraperitoneal, subcutánea, intradérmica, tópica, u oralmente. Más preferiblemente la vacuna es administrada oralmente, incorporada en un vector de liberación bacteriana atenuado, tal como una solución salina fisiológica, solución de dextrosa, y los similares, como es bien sabido en el arte. Los pacientes que sufren de cánceres epiteliales, tales como cánceres del colon, páncreas, pulmón y seno, pueden beneficiarse de la inmunización por medio de las vacunas de la presente invención. Las vacunas de la presente invención son formuladas preferiblemente con portadores y excipientes aceptables farmacéuticamente tales como agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, y los similares, y una combinación de los mismos. Las vacunas pueden también contener substancias auxiliares tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes, reguladores y los similares . Las vacunas de la presente invención son administradas preferiblemente de manera oral a un mamífero, tal como un humano, como una solución o suspensión en un portador aceptable farmacéuticamente, a una concentración de DNA en el intervalo de aproximadamente 10 microgramos por mililitro a aproximadamente 100 microgramos por mililitro. La dosificación apropiada dependerá del sujeto a ser vacunado, y puede depender de la capacidad del sistema inmune del sujeto para expresar a los ácidos nucleicos contenidos en la vacuna. La dosificación exacta seleccionada puede también depender, en parte, del juicio del practicante médico que administre o que solicite la administración de la vacuna. Otra modalidad de la presente invención es un equipo que comprenda la vacuna de la presente invención empacada en contenedores esterilizados adecuados tales como ampolletas, botellas, frasquitos, y los similares, ya sea en formas de dosificación unitaria o multl-dosis. Los contenedores son preferiblemente sellados herméticamente después de ser llenados con una preparación para vacuna. Preferiblemente, las vacunas son empacadas en un contenedor que tenga una etiqueta fijada al mismo, dicha etiqueta identifica la vacuna, y posee una información en una forma prescrita por un agencia reguladora del gobierno tal como la United States Food and Drug Administration que refleja la aprobación de la vacuna bajo las leyes apropiadas, la información de dosificación, y los similares. La etiqueta contiene preferiblemente información acerca de la vacuna que es útil para una administración de la vacuna por profesionales en el cuidado de la salud al paciente. El equipo también contiene preferiblemente materiales con información impresa relacionada con la administración de la vacuna, instrucciones, indicaciones, y cualquier advertencia necesaria que se requiera. El equipo de la presente invención puede también contener la proteina de fusión con el anticuerpo recombinante huKSl/4-IL2 empacada en contenedores esterilizados adecuadamente tales como ampolletas, botellas, frasquitos, y los similares, ya sea en formas de dosis unitaria o multidosis. Preferiblemente, la proteina de fusión es empacada en un contenedor que tenga una etiqueta fijada al mismo, dicha etiqueta identifica la vacuna, y posee una información en una forma prescrita por una agencia del gobierno tal como la United States Food and Drug Administration que refleje la aprobación de la proteina d efusión bajo las leyes apropiadas, la información de dosificación, y los similares. La etiqueta contiene preferiblemente información acerca de la proteina de fusión que sea útil para que la proteina de fusión sea administrada por un profesional en el cuidado de la salud, al paciente. Los materiales con información impresa presentes en el equipo, también contienen preferiblemente información concerniente a la administración de la proteina de fusión, instrucciones, indicaciones, y cualquier advertencia necesaria que se requiera. En modalidades particularmente preferidas de la vacuna, el DNA plásmido que codifica a un ligando de CD40 codifica al trímero de ligando CD40 (CD40LT) . Se prefiere de manera particular que el DNA plásmido que codifica tanto al CEA y a CD40LT es incorporado operablemente en un vector de liberación bacteriana atenuado. Los vectores de liberación bacteriana preferidos son Salmonella typhimurium atenuada y Listeria monocytogenes atenuada, más preferiblemente Salmonella typhimurium atenuada. Las vacunas de la presente invención que comprenden un ácido nucleico que codifica a CD40LT en combinación con un DNA que codifica al CEA puede simultáneamente estimular a dos sistemas de respuesta inmune diferentes (es decir, inmunidad celular y humoral) . Las secuencias de nucleótidos de algunos elementos de la familia de antigenos carcinoembrionarios son conocidos en el arte. La secuencia de nucleótidos que codifica a un gen de CEA humano ha sido descrita por Schre e y colaboradores, en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (el número de acceso de EMBL es EMBL : HSCEA01 ) , cuya descripción se incorpora a la presente como referencia (FIG. 7, SEC ID NO: 1) . El ligando de CD40 humano (CD40L) es una proteina de 154 aminoácidos que desempeña un papel central en la regulación de la inmunidad humoral. La secuencia de DNA que codifica al CD40L humano (también conocidos como CD154) ha sido publicada por Grammar y colaboradores, en la base de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (el número de acceso de EMBL es EMBL : HACD40L) , cuya descripción se incorpora a la presente como referencia (FIG. 8, SEC ID NO: 2) . La secuencia de DNA que codifica a CD40L de roedor, ha sido publicada por Marra y colaboradores, en la base de datos de EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK (el número de acceso a EMBL es EMBL:AI385482) , cuya descripción se incorpora a la presente como referencia (FIG. 9, SEC ID NO: 3) . Debido a la degeneración inherente del código genético, otras secuencias de DNA que codifican substancialmente a la misma o a la secuencia de aminoácidos equivalente funcionalmente al CEA y/o al ligando de CD40 pueden ser usadas en la práctica de la presente invención. Dichas secuencias de DNA también incluyen aquellas capaces de hibridizar a las secuencias de CEA y/o ligando de CD40. Las secuencias de DNA alteradas que pueden usarse de conformidad con la presente invención incluye eliminaciones, adiciones o substituciones de residuos de nucleótidos diferentes dan como resultado una secuencia que codifica al mismo o a un producto genético equivalente funcionalmente. El producto genético mismo puede contener eliminaciones, adiciones o substituciones de residuos de aminoácidos en las secuencias del CEA y/o del ligando de CD40, las cuales dan como resultado un cambio silencioso, produciendo así proteínas del ligando de CD40 y/o del CEA equivalentes funcionalmente. Dichas substituciones de aminoácidos pueden ser hechas con base en la similaridad en la polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad, y/o la naturaleza anfipática de los residuos involucrados. Por ejemplo, aminoácidos cargados negativamente incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos cargados positivamente incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos principales polares no cargados que tengan valores de hidrofobicidad similares incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina, asparagina, glutamina; serina, treonina; fenilalanina, tirosina. Como se usa en la presente, "un equivalente funcional" del ligando de CD40 se refiere a un ligando que enlaza a CD40 o fragmento del mismo, pero no necesariamente con la misma afinidad de enlace que el ligando de CD40 nativo. De manera similar, un equivalente funcional del CEA se refiere a una proteina que enlazará al antisuero cultivado contra el CEA humano, pero no necesariamente con la misma afinidad de enlace que el CEA humano nativo. Como se usa en la presente, y en las reivindicaciones anexas, el término antigeno carcinogénico (CEA) incluye el antigeno natural encontrado en humanos y los equivalentes funcionales del mismo; y el término "ligando de CD40" incluye monómeros, dímeros y trímeros de los ligandos naturales encontrados en mamíferos y equivalentes funcionales de los mismos. Preferiblemente los equivalentes funcionales del DNA de CEA y/o del ligando de CD40 comparten al menos aproximadamente 80 % de homología con el DNA que codifica a las proteínas del ligando de CD40 y/o del CEA anteriormente mencionados. Las secuencias de DNA de la invención pueden ser diseñadas a fin de alterar la secuencia que codifica al ligando de CD40 y/o CEA, por medio de una variedad de extremos que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican el procesamiento y la expresión del producto genético. Por ejemplo, las mutaciones pueden ser introducidas usando técnicas que son bien conocidas en el arte, por ejemplo, mutagénesis en sitio dirigido, para insertar nuevos sitios de restricción, y los similares.

Se proporcionan los siguientes ejemplos para ilustrar adicionalmente los aspectos y las modalidades de la presente invención, y no significa que sean limitantes. MATERIALES Y METODOS Reactivos : El suplemento del cultivo T-STIM se obtuvo de BD Biosciences, Bedford, MA. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) y R- Ficoeritrina (PE) se obtuvieron de BD Pharmigen, La Jolla CA. Los anticuerpos marcados con PE y marcados con FITC se prepararon de conformidad con los protocolos recomendados por los fabricantes. Todos los anticuerpos obtenidos de BD Biosciences, Bedford, MA. Hu KS1/4-IL2 se preparó como describe Gillies y colaboradores, J. Immunol., 1998, 160:6195-6203, cuya descripción relevante se incorpora a la presente como referencia . Ratones Transgénicos por el CEA: Se generaron ratones procreadores transgénicos del CEA, C57B1/6J al usar un fragmento de restricción AatlI de 32.6 Kb que contenia la región genómica del CEA humano completo (SEC ID NO: 1) y las secuencias laterales aisladas desde un clon cósmido genómico. Una linea celular de ratón [C57B1/6J-Tg (CEAGe) 18; FJP] se estableció por medio del método de Clarke y colaboradores Cáncer Res. 1998, 58: 1469, cuya descripción relevante se incorpora a la presente como referencia. Los ratones transgénicos del CEA fueron procreados en las instalaciones de cuidado animal del The Scripps Research Institute's. Los ratones fueron usados entre 6 y 7 semanas de edad. Todos los experimentos de animales se efectuaron de conformidad con el National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animáis. Lineas Celulares Tumorales y Cepas Bacterianas: La linea celular de adenocarcinoma de colon MC38 de roedores inducida químicamente, se transfectó establemente tanto con, CEA (clon C15-4.3) y la molécula de adhesión celular epitelial Ep-CAM/KSA que se describe en Gilíes y colaboradores J. Immunol., 1998, 160:6195. La cepa SL7207 de AroA de Salmonella typhimurium atenuada fue amablemente proporcionada por el Dr. B.A.D. Stocker (Stanford University, Stanford, CA) . E. coli competente químicamente fue adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA) y se desarrollaron de la manera de rutina a 37 °C en caldo LB o sobre placas de agar (VWR) suplementado cuando fue necesario con 75 pg/ml de ampicilina como se conoce en el arte. Construcción de los Plásmidos de Expresión: Se generaron varias formas distintas de plásmidos de expresión para dirigirlos a moléculas de CEA y de CD40LT a DCs o a células T, respectivamente. Los plásmidos usados para la inmunización fueron construidos desde pcDNA3.1/Zeo (+) (Invitrogen). El plásmido control pER-CEA dirigido hacia y retenido en el retículo endoplásmico (ER) , y el plásmido p -CEA dirigido hacia la superficie celular, se han descrito previamente por Xiang y colaboradores Clin. Cáncer Res., 2001, 3:8565, cuya descripción relevante se incorpora a la presente como referencia. El pl smido que codifica al gen CD40LT (pCD40LT) contuvo un motivo de cierre de leucina de 33 aminoácidos modificado a fin de facilitar la formación de CD40L trimérico que fue fusionado en el C-terminus de la secuencia líder de IL7 para dirigir la expresión de la proteína en la superficie celular o inducir su secreción afuera de las células, como describió Fanslow y colaboradores Semin. Im unol . , 6:267, cuya descripción relevante se incorpora a la presente como referencia. La detección de CD40LT por tinción Western se facilitó al incorporar una secuencia antigénica corta, Flag, detectable por anticuerpos monoclonales específicos. El plásmido pCEA-CD40LT contuvo la región extracelular de CEA fusionada al C-terminus de CD40L de roedor, generando así una construcción quimérica de función dual. Inmunización Oral , Provocación de Células Tumorales y Refuerzo con la Proteína de Fusión Anticuerpo-IL2 : Ratones C57BL/6J transgénico de CEA se dividieron en siete grupos experimentales (n=8) . Los ratones fueron inmunizados tres veces a intervalos de dos semanas por medio de sonda oral con 100 µ? de PBS que contenía 1 x 108 de S. typhimurium atenuada, transformada que albergaba ya sea vector vacío (pcDNA3.1), vectores de expresión individuales pER-CEA (vacuna control) , p -CEA (vacuna control) , pCD40LT (vacuna control) , pCEA-CD40LT (vacuna de la invención) , o la vacuna de la invención seguida por el refuerzo con huKSl/4-IL2. Otros experimentos control incluyeron la sonda oral con PBS, y el refuerzo con la proteína de fusión con el anticuerpo recombinante huKSl/4-IL2 sin inmunización por la vacuna de DNA, y un grupo de ratones vacunados solamente con células MC38 irradiados. Todos los ratones fueron provocados subcutáneamente en el flanco derecho con una dosis letal de 2.5 x 105 células de MC38- CEA-KSA dos semanas después de la última inmunización. Los ratones fueron inmunizados diariamente hasta que el tumor se hizo palpable, después de lo cual se midió el diámetro en dos dimensiones con un microca ibrador cada segundo dia. La construcción de la proteina de fusión huKSl/4-IL2 fue descrita por Gillies y colaboradores J. Immunol., 1998, 160: 6195-6203, cuya descripción relevante se incorpora a la presente como referencia. Ratones C57BL/6J transgénicos por CEA que fueron inmunizados por medio de sonda oral con la vacuna de S. typhimurium atenuada, transformada descrita como anteriormente, recibieron 5 ]ig de refuerzo de la proteina de fusión huKSl/4-IL2 por cinco días consecutivos comenzando un dia después de la provocación de la célula tumoral . Ensayo de Citotoxicidad: Se midió la citotoxicidad por medio de un ensayo de liberación de 51Cr estándar de conformidad con el método de Xiang y colaboradores Cáncer y colaboradores Cáncer Res., 1997, 57: 4948, cuya descripción relevante se incorpora a la presente como referencia. Los esplenocitos aislados desde ratones transgénicos por CEA, una semana después de la provocación de la célula tumoral, fueron cultivadas subsecuentemente por tres días a 37 °C en medio de cultivo T-STIM completo (Beckton Dickinson, Bedford, MA) . Células objetivo MC38- CEA-KSA (3 x 106) , marcadas con 0.5 mCi de 51Cr, fueron incubadas con células efectoras en varias proporciones de Efector: célula Objetivo (E:T) a 37 °C por cuatro horas. Transfección y Evaluación de la Inmunotinción de la Expresión de Proteínas : Se usó la lipofectamina para transfección transitoria de células COS-7 de conformidad con las instrucciones del fabricante (Invitrogen) , se sembraron células COS-7 a 2.5 x 105 células por pocilio en una placa de seis pocilios y 24 horas más tarde se añadieron, 1 ]ig de DNA con 5 µ? de lipofectamina en medio libre de suero. Las inmunotinciones fueron efectuadas con cantidades iguales de proteína (15 µ?/banda) , separados por SDS-PAGE bajo condiciones reductores y no reductoras junto con un lisado control y se electrotiñeron sobre una membrana de nitrocelulosa como se describió previamente (Xiang y colaboradores Cáncer Res., 1997, 57: 4948). Después de teñir con mAb de CEA anti-humano de ratón (ICN, Aurora, OH) o mAb de M2 anti-FLAG (Sigma, St. Louis, MO) , seguido por HRP-IgG anti-ratón, se desarrolló la tinción con reactivos para detección de tinción Western de ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) y película de XOMAT-5 (Eastman Kodak Company, Rochester, Y) . Análisis por Citómetría de Flujo: Los marcadores de activación de células T y de expresión de moléculas co-estimuladores sobre DCs positivas al antígeno de CDllc y de MHC de clase II, fueron determinados por análisis por citometria de flujo de dos colores con un explorador FACS de Becton Dickinson. La activación de células T se determinó por tinción de esplenocitos recientemente aislados desde ratones vacunados exitosamente con FITC anti-CDS (53-6.7), en combinación con anticuerpos anti-CD25 conjugados con PE (H129.19), LFA-1 (2D7) , CD28 (37.51) y CD69 (HI.2F3). Se midió la activación de moléculas co-estimuladoreas sobre APCs con los anticuerpos anti-CDllc marcado con FITC (HL-3), en combinación con el anticuerpo anti B7.1 conjugado con PE (16-10al), B7.2 (GL1 ) o ICAM-I, y anti-IAb biotinilado seguido por estrepatvidinaloficocianina. Todos los experimentos de flujo citométrico se efectuaron en la presencia de 0.1 pg/ml de ioduro de propidio para excluir células muertas . Todos los reactivos se obtuvieron de BD Pharmigen (La Jolla, CA) . Ensayo de Inducción de Citoquina: Se cosecharon los esplenocitos de todos los grupos experimentales de ratones una semana después de provocación a la célula tumoral letal subcutánea con 2.5 x 105 células MC38-CEA-KSA. Se aislaron los linfocitos sobre Ficoll-Hypaque (Bio Whittaker, Walkersville, MD) y se cultivaron 24 horas en medio de células T completo con 1 x 105 células MC38-CEA-KSA irradiadas (15,000 radianes). Se colectaron los sobrenadantes y se almacenaron a - 70 °C hasta su uso. Las citoquinas se analizaron con equipos de detección de citoquinas disponibles comercialmente ya sea por IFN-? o IL12 usando un Sistema ELISA emparedado en fase sólida (RSD) , Minneapolis, MN) . Ejemplo 1. Expresión de Proteínas de CEA y de CD 0LT .

La expresión de la proteina de los plásmidos pCD40LT, pCEA-CD40LT y pW-CEA se analizó por medio de la transfección en células COS-7. Las tinciones Western indicaron que todas las construcciones produjeron proteínas de la masa molecular esperada (3 kDa, 215 kDa, y 180 kDa, respectivamente) como se muestra por medio de análisis de SDS/PAGE de los lisados de las células transíectadas, analizadas bajo condiciones reductoras (FIGS. 1A y IB). Un plásmido que codifica a pCD40LT expresó proteínas en el lisado celular, indicativo de CD40L monomérico, dimérico y trimérico, bajo condiciones no reductoras (FIG. IB) . La proteína de CD40 fue también detectada en el sobrenadante de las células transfectadas bajo condiciones reductoras (FIG. 1A) . Ejemplo 2. Inducción de la Inmunidad Protectora de Tumor por medio de la Vacuna de Función Dual que Codifica tanto a moléculas de CD40LT como al CEA. Se efectuaron numerosos experimentos, incluyendo varios controles, los cuales indicaron que la vacuna de DNA de función dual (pCEA-CD40LT) condujo a CD40LT y al CEA en DCs y células T respectivamente. Los resultados son expuestos gráficamente en la FIG. 2. En la FIG. 2, el crecimiento del tumor de cada ratón individual se S representa por medio de una linea sólida. Asi, ratones C57B1/6J transgénicos por CEA fueron inmunizados en los dias 0 y 7 cada uno de los cuales por medio de inyecciones cutáneas de 2.5 x 105 células de carcinoma MC38 de roedor irradiadas (15,000 radianes). La provocación de estos 0 controles dos semanas después con una dosis letal subcutánea de células MC38-CEA-KSA dio como resultado el desarrollo rápido de tumores en todos los ratones indicando que las células MC38-CEA-KSA no fueron inmunogénicas per se (FIG. 2A) . Esto se encontró también 5 en el caso de otros tres experimentos control claves: Ratones (n = 6) vacunados tres veces a intervalos de 2 semanas por medio de sonda oral con 1 x 10s de S. typhimurium atenuadas portadas por ya sea el vector vacio, el plásmido pER-CEA exclusivamente dirigido hacia y retenido en ER, o bien por la construcción de CD40LT sola, todos fallaron uniformemente para provocar la respuesta inmune contra una provocación a célula tumoral subcutánea letal y revelaron un crecimiento de tumor uniforme y rápido (FIGS. 2B, 2C, y 2D) . En contraste, un grupo de ratones tratados por medio del protocolo de vacunación, pero que recibieron la vacuna de DNA que contenia el vector pW-CEA, revelaron una disminución substancial en el volumen del tumor, con 3 de 8 animales que rechazaron completamente la provocación a la células tumorales (FIG. 2F) . En ratones vacunados con la vacuna de pCEA-CD40LT de la invención, 4 de 8 animales rechazaron completamente la provocación a las células tumorales. En este caso, los ratones restantes mostraron una supresión dramática del crecimiento tumoral cuando se comparó con los controles (p < 0.001) (FIG. 2G) . Ejemplo 3. La Eficiencia de la Vacunación es Amplificada por medio de Refuerzos y la Proteína de Fusión Anticuerpo-IL2 ¦ Los refuerzos con dosis pequeñas, no curativas de la proteína de fusión huKSl/4IL2 dirigida hacia el microámbito del tumor incrementó marcadamente la eficiencia de la vacuna de DNA de la invención. De hecho, la vacunación de ratones transgénicos por CEA por medio del mismo protocolo descrito por el grupo de la vacuna de pCEA-CD40LT, seguido por inyecciones intravenosas de 5 pg de huKSl/4-IL2 un día después de la provocación a las células tumorales por cinco días consecutivos, dio como resultado el completo rechazo de la provocación a las células tumorales en 8/8 animales experimentales (FIG. 2H) . Un experimento control importante indicó que la inyección de 5 x 5 ig de la proteína d efusión huKSl/4-IL2 per se no tuvo esencialmente efecto sobre el crecimiento del tumor, cuando se administró a ratones nuevos que solamente habían recibido la provocación al tumor sin inmunización previa por la vacuna de DNA de la invención (FIG. 2E) . El refuerzo de la proteína de fusión de IL2 fue específico, ya que el refuerzo con una proteína de fusión no específica hul4.18-IL2 dirigida contra gangliosida GD2 no expresada por células M38 de carcinoma de colon, fue muy inefectivo. Ejemplo 4. Respuestas de CTL Específicas del Antígeno son Incrementadas por medio de la Vacuna de Función Dual PCEA-CD40LT. La aplicación de la vacuna de pCEA-CD40LT de la presente invención indujo fuerte cebado de células T de CD8+ citotóxicas, ya sea con o sin el refuerzo de la proteína de fusión huKSl/4-IL2, como se demostró en ratones transgénicos por CEA inmunizados con cada uno de los plásmidos individuales (FIG. 3) . En la FIG. 3, los datos parta ratones que poseen tumor sin tratar se indican por (?) , los ratones tratados solamente con la proteína de fusión se indican por (0), los ratones inmunizados con el pER-CEA plásmido se indican por (o) , los ratones inmunizados con pCEA-CD40LT se indican por (?) , los ratones inmunizados con pW-CEA se indican por (El), los ratones inmunizados con pCEA-CD40LT se indicaron con (?) y los ratones inmunizados con pCEA-CD40LT y huKSl/4-IL2 se indicaron por (T) . CTLs de ratones que recibieron vacunaciones con la vacuna pCEA-CD40LT más refuerzo con la proteína de fusión anticuerpo-IL2 probaron ser más efectivos, induciendo hasta 70 % de lisis en comparación con 45 % de lisis por las células obtenidas de ratones inmunizados con la misma vacuna pero sin el refuerzo de la proteína de fusión (FIG. 3A) . En contraste, solamente las lisis anteriores fueron observadas con esplenocitos obtenidos de animales control. Las lisis de células tumorales fueron especificas ya que el uso de células B16 de melanoma no específicas carecieron de la expresión del CEA como objetivos dando como resultado una falta completa de citolisis. De manera importante, los datos presentados en la FIG. 3B demuestra claramente que la respuesta citolítica provocada por esplenocitos de ratones inmunizados contra células MC38-CEA-KSA dirigidas contra tumor fueron restringidas para el antígeno de MHC de clase I, puesto que la presencia de 50 pg/ml de anticuerpos dirigidos contra antígenos H2-Kb/H2-Db de MHC de clase I inhibieron completamente las actividades citotóxicas. El efecto inhibidor fue específico, puesto que la presencia de anticuerpos anti-H-2Kd y H-2Dd no específicos no inhibieron la citólisis.

Ejemplo 5. La Sobre-regulación de Marcadores de la Actividad de CTL por Medio de la Vacuna de DNA de Función Dual de la Invención es Mejorada por medio de Refuerzos con la Proteína de Fusión Anticuerpo-IL2. La interacción entre CD40LT sobre células T auxiliares activadas con su CD40 objetivo sobre DCs es importante para lograr respuestas de células T especificas del antigeno óptimas. Se observó una correlación entre la habilidad de la vacuna de DNA de función dual para mejorar las respuestas inmunes dependientes de células T y el incremento en la expresión de los marcadores de la activación de células T. Esto fue evidente del incremento en la expresión de CD25, la cadena oc del receptor de IL2, CD de alta afinidad, CD69, un antígeno de la activación de células T precoces, y el antigeno asociado con la función del linfocito, LFA-1, importantes para la interacción inicial entre las células T y DCs vía la molécula de adhesión celular intracelular, ICAM-1 (FIG. 4) . De manera importante, estos marcadores de la activación de células T sobre-regulados también incluyeron CD28, un elemento de la superfamilia de Ig expresado en células T que sirve como el receptor para las moléculas B7.2 y B7.1 co-estimuladoras de DCs cuya ligación con CD28, a su vez coestimula el crecimiento de células T nativas (FIG. 4) . De manera sorprendente, los refuerzos con las proteínas de fusión huKSl/4-IL2 24 horas después de la provocación de las células tumorales elevó adicionalmente la expresión de algunos de estos marcadores en 20 % a 35 . Ejemplo 6. La Expresión Creciente de Moléculas Co-estimuladoras por Inmunización con Vacunas de pCEA-CD40LT y Refuerzos por medio de la Proteína de Fusión Anticuerpo-IL2. La activación de células T es dependiente de la expresión sobre-regulada de moléculas B7.1 y B7.2 co-estimuladoras sobre DCs para lograr la ligación óptima con CD28 expresada sobre células T. Es igualmente importante la sobre-regulación de ICAM-1, que enlaza a la integrina LFA-1 de células T. Los análisis por citometría de flujo de esplenocitos obtenidos desde ratones transgénicos por CEA, inmunizados exitosamente con la vacuna de DNA de la invención y reforzados con la proteína de fusión anticuerpo-IL2, indicaron claramente que esta sobre regulación se logró muy efectivamente, ya que la expresión de B7.1, B7.2 e ICA -1 fue sobre-regulada una a dos veces sobre los controles (FIG- 5) . Los refuerzos con la proteína de fusión anticuerpo-IL2 dio como resultado un 20 % a 40 % adicional en el incremento de la expresión tanto de moléculas co-estimuladoras como de adhesión (FIG. 5) . Estos datos proporcionaron evidencia de que la vacunación con moléculas de pCEA-CD40LT induce y mejora la expresión de moléculas co-estimuladoras sobre CDllc+ y DCs positivas al antígeno de las MHC de clase II, demostrando que la capacidad de estos APCs para la presentación y el procesamiento del antigeno especifico de tumor fue significativamente incrementada. Ejemplo 7. La Vacunación con pCEA-CD40LT Mejora la Producción de Citoquiñas Reforzadas Adicionalmente por la Proteina de Fusión Anticuerpo-II-2. La vacuna de pCEA-CD40LT mejoró la liberación de citoquinas pro-inflamatorias, IF -? e IL2 de células T, como se indica por medio de ELISA emparedada en fase sólida que mide su producción en sobrenadantes de varias preparaciones de esplenocitos 24 horas después de ser plaqueadas en la presencia de células tumorales MC38-CEA- SA irradiadas (15,000 radianes). Solamente niveles de fondo de IFN-y y de IL2 fueron detectados cuando se analizaron los sobrendantes de esplenocitos obtenidos desde ratones control transgénicos con CEA tratados con PBS después de la provocación con células MC38-CEA-KSA. No obstante, si los ratones recibieron la vacuna de DNA de pCEA-CD40LT, la producción de IFN-y y de IL2 incrementó en 75 % y 50 , respectivamente, sobre estos niveles observados en ratones vacunados ya sea con pCD40LT o pW-CEA solos (FIG. 6) . La producción de IFN-y fue aumentada adicionalmente en 25 8 después de refuerzos con la proteina de fusión huKSl/4-IL2, mientras el de IL-2 incrementó 3 veces sobre los valores del control y 100 % sobre los observados después de vacunación, pero sin el refuerzo de huKSl/4-IL2 (FIG. 6) . Estos datos demuestran que la inmunización con DNA con la vacuna de la presente invención acoplada con refuerzos de la proteina de fusión anticuerpo-IL2 decisivamente incrementó la activación de células T en tejidos linfoides secundarios. DISCUSION Los ratones transgénicos con CEA, que produjeron el CEA auto-antigénico de tumor humano, proporcionaron un organismo modelo útil para el desarrollo y la evaluación de tratamientos anti-tumor humano. La vacuna de DNA oral de función dual de la presente invención de manera sorprendente destruyó la tolerancia de las células T periféricas contra el CEA, en ratones transgénicos por CEA. De manera importante, tuvo lugar un rechazo mediado por células T CD8+ de una provocación letal de células de cáncer de carcinoma de colon de roedor que fue completamente efectiva en 100 % de los ratones experimentales en un grupo profiláctico. La inmunidad protectora contra tumor reportada anteriormente lograda con una vacuna de DNA basada en CEA en ratones transgénicos por CEA nunca fue completamente efectiva en todos los animales experimentados. De manera sorprendente, el éxito de la inmunidad protectora contra tumor se logró en ratones transgénicos por CEA tratados con la vacuna de la presente invención, específicamente cuando se utilizó conjuntamente con inyecciones de refuerzo de la proteina de fusión con el anticuerpo recombinante huKSl/4-IL2.

Las vacunas de la presente invención sobre-regularon la expresión de varios pares de receptor/ligando conocidos por impactar criticamente la activación efectiva de células T después de su interacción con DCs que las presenta con complejos MHC:péptido. La vacuna de la invención sobre-reguló CD40/CD40LT, LFA-l/ICAM-1, CD28/B7.1 y B7.2 y CD25/IL2, e incrementó la secreción de las citoquinas pro-inflamatorias IF -? e IL2. . Una activación marcada de células T y de células similares a dentriticas CDllc+ se indicó por medo de la sobre-regulación en la expresión de las integrinas de células T, LFA-1 e ICAM-1, las cuales son conocidas por sinergizar en el enlace de linfocitos a APCs. El enlace transitorio de células T nuevas a APCs es importante para dar tiempo para que estas células en gran número de muestras de moléculas de MHC sobre la superficie de cada APC por la presencia de péptidos específicos. A través de este mecanismo la probabilidad de que una célula T nueva reconozca a su ligando péptido- MHC específico es incrementada después de señalar a través del TCR y de la inducción de un cambio conformacional en LFA-1. Esto, a su vez mejora grandemente la afinidad de LFA-1 por ICAM-1 y estabiliza la asociación entre las células T especificas del antigeno y el APC. Es particularmente significativo el marcado incremento en la expresión de CD28 sobre células T asi como también en moléculas B7.1 y B7.2 co-estimuladoras sobre DCs, después de la vacunación con la vacuna y la provocación de la célula tumoral de la invención, ya que proporciona las dos señales requeridas para la activación de las células T. Una señal, que indique el reconocimiento del antigeno, que es transmitida a las células T después del enlace del complejo MHC:péptido al TCR, y la otra señal, la ligación de CD28 con B7.1 y B7.2, que inicia las respuestas de las células T y la producción de células T efectoras armadas. Un claro indicio de la activación de células T en tejidos linfoides secundarios fue proporcionado por el marcado incremento en la expresión de CD25, la alta afinidad de la cadena a de IL2 de alta afinidad y CD69, un antígeno de activación de células T precoces . La elevación significativa en la producción de las citoquinas pro-inflamatorias IFN-? e IL2 por células T inducida por la vacuna de DNA de función dual de la invención sugiere que una tercera señal puede actuar directamente sobre las células T. Esta "señal de peligro", se reportó que se requiere para la diferenciación de TH1 que conduce a la expansión clonal de células T. De hecho, siempre que se requiera el auxilio de las células T para generar una respuesta de células T CD8+ efectiva contra un auto-antígeno de tumor como CEA, la activación de DCs es necesaria antes de su encuentro con una célula T CD8* especifica del antigeno. Este efecto es mediado por la ligación de CD40 sobre la superficie de APCs con CD40 expresada sobre células T CD4+ activadas. CD40LT expresado por la vacuna de DNA de la invención puede actuar como suplentes para células T CD4+ activadas, que conducen a la maduración de DCs como se indica por su decisiva sobre-regulación de las moléculas co-estimuladoras B7.1 y B7.2. La vacuna de DNA de función dual administrada oralmente de la invención que contiene genes que codifican tanto para CEA como para el ligando de CD40 inducen una inmunidad protectora contra tumor muy eficiente contra el autoantígeno de tumor humano CEA. Numerosas variaciones y modificaciones de las modalidades anteriormente descritas pueden efectuarse sin alejarse del espíritu y del alcance de los nuevos aspectos de la invención. Se comprenderá que no se pretende que haya limitaciones con respecto a las modalidades específicas ilustradas en la presente. Por supuesto, se pretende que estén incluidas en las reivindicaciones anexas todas las modificaciones que caigan en el alcance de las mismas.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> The Scripps Research Institute Rong Xiang Ralph A. Reisfeld <120> VACUNAS DE DNA QUE CODIFICAN AL CEA Y A UN LIGANDO DE CD40 Y METODOS DE USO DE ESTAS <130> TSRI-830.0 PCT <150> 10/090,238 <151> 02-03-2002 <160> 3 <170> FastSEQ para Windows versión 4.0 <210> 1 <211> 3281 <212> DNA <213> humano <400> 1 gagctcctca cacggactct gtcagctcct ccctgcagcc tatcggccgc ccacctgagg 60 cttgtcggcc gcccacttga ggcctgtcgg ctgccctctg caggcagctc ctgtccccta 120 caccccctcc ttccccgggc tcagctgaaa gggcgtctcc cagggcagct ccctgtgatc .180 tccaggacag ctcagtctct cacaggctcc gacgccccct atgctgtcac ctcacagccc 240 tgtcattacc attaactcct cagtcccatg aagttcactg agcgcctgtc tcccggttac 300 aggaaaactc tgtgacaggg accacgtctg tcctgctctc tgtggaatcc cagggcccag 360 ccagtgcctg a acggaaca gatgctccat aaatactggt taaatgtgtg ggagatctct 420 aaaaagaaac atatcacctc cgtgtggccc ccagcagtca gagtctgttc catgtggaca 480 caggggcact ggcaccagca tgggaggagg ccagcaagtg cccgcggctg ccccaggaat 540 gaggcctcaa cccccagagc ttcagaaggg aggacagagg cctgcaggga atagatcctc 600 cggcctgacc ctgcagccta atcctgagtt cagggtcagc 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tctagaatgt 2340 gaggtcaggt gttgacaaga gcctggaggg aatagagcag ggaaaggtca gaaaaggaag 2400 acccaaggtc tctagaggag gtgtcaggga agggatctcc caagaatgcc ctgatgtgag 2460 caggacctga aggcaatggg gagggagccg tgaagacccc tggaaaagca gattccacac 2520 agggaaatgc caaggtcgga ggtgctaagg aaataggaga cacactgctg accttgacct 2580 agtaggacac acacacacac acacacacac actcactcac tccagggctg ggggatgaag 2640 agacctgctc aggacccagg accccatttt tccaccctaa tgcataggtc ccaatattga 2700 ccgatgctct ctgctctctc ctagcctcac ttctaacctt ctggaacccg cccaccactg 2760 ccaagctcae tattgaatcc acgccgttca atgtcgcaga ggggaaggag gtgcttctac 2820 ttgtccacaa tctgccccag catctttttg gctacagctg gtacaaaggt gaaagagtgg 2880 atggcaaccg tcaaattata ggatatgtaa tagga ctca acaagctacc ccagggcccg 2940 catacagtgg tcgagagata atatacccca atgcatccct gctgatccag aacatcatcc 3000 agaatgacac aggattctac accctacacg tcataaagtc agatcttgtg aatgaagaag 3060 caactggcca gttccgggta taccgtgagt gattccccca tgacctctgg gtgttggggg 3120 tcagttctac ttcccacaca caggattatc aggcctgggc tgtgctgtgg 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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una vacuna de DNA efectiva para provocar una respuesta inmune contra células que presentan un antigeno carcinoembrionario (CEA) caracterizada porque comprende: (a) un DNA plásmido que codifica operablemente a un CEA; y (b) un DNA plasmido que codifica operablemente a un ligando de CD40; junto con un portador aceptable farmacéuticamente .

2. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el DNA que codifica operablemente a un CEA y el DNA que codifica operablemente a un ligando de CD40 son ambos incorporados en el mismo plásmido .

3. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porgue el DNA que codifica operablemente a un CEA y el DNA que codifica operablemente a un ligando de CD40 son incorporados cada uno en plásmidos aparte.

4. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque ambos DNAs plásmidos son incorporados operablemente en un vector de liberación bacteriana atenuado.

5. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el vector de liberación bacteriano es una bacteria seleccionada del grupo que consiste de Salmonella typhlmuri um atenuada y Listeria monocytogenes atenuada.

6. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque ambos DNAs plásmidos son incorporados operablemente en un vector viral atenuado.

7. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el vector viral es una forma atenuada de un virus seleccionado del grupo que consiste de un virus del Herpes, un Adenovirus, un virus de Vaccinia, y un virus Avipox.

8. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque ambos DNAs plásmidos son incorporados operablemente en un vector de liberación Salmonella typhxmurium atenuada.

9. La vacuna de DNA de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ligando de CD40 es CD40LT.

10. Un método de inmunizar a un mamífero contra células cancerosas que presentan un antígeno carcinoembrionario (CEA) caracterizado porque comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad efectiva de una vacuna de DNA, que provoque la respuesta inmune, que comprende un DNA plásmido que codifica operablemente a un CEA, y un DNA plásmido que codifica operablemente a un ligando de CD40, en una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmune contra células que presentan un CEA.

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el mamífero es un humano.

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque ambos DNA plásmidos son incorporados operablemente en un vector de liberación bacteriana atenuado.

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el vector de liberación bacteriana es una bacteria seleccionada del grupo que consiste de Sal onella typhimurium atenuada y Listeria monocytogenes atenuada.

14. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque ambos DNAs plásmidos son incorporados operablemente en n vector de liberación viral atenuado .

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el vector de liberación viral es una forma atenuada de un virus seleccionado del grupo que consiste de un virus del Herpes, un adenovirus, un virus de Vaccinia, y un virus Avipox.

16. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el ligando de CD40 es CD40LT. 5

17. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque las células que presentan un antígeno carcinoembrionario son células de cáncer de colon .

18. Ei método de conformidad con la reivindicación 10 10, caracterizado porque la vacuna es administrada oralmente .

19. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el DNA que codifica operablemente a un CEA y el DNA que codifica operablemente a un ligando 15 de CD40 son ambos incorporados en el mismo plásmido.

20. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el DNA que codifica operablemente a un CEA y el DNA que codifica operablemente a un ligando de CD40 son incorporados cada uno en plásmidos separados. 0

21. Un método de inmunizar a un mamífero contra células de cáncer que presentan un antigeno carcinoembrionario (CEA) caracterizado porque comprende las etapas de: (a) administrar al mamífero una cantidad de una 5 vacuna de DNA que provoque una respuesta inmune, que comprenda un DNA plásmido que codifique operablemente a un CEA, y un DNA plásmido que codifique operablemente a un ligando de CD40; y (b) administrar al mamífero una cantidad mejoradora 5 de la respuesta inmune de la proteína de fusión con anticuerpo recombinante huKSl/4-IL2 en un portador aceptable farmacéuticamente.

22. El método de conformidad con la reivindicación 21 caracterizado porque el mamífero es un humano. 10

23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque ambos DNAs son incorporados operablemente en un vector de liberación bacteriano atenuado .

24. El método de conformidad con la reivindicación 15 23, caracterizado porque el vector de liberación bacteriano es una bacteria del grupo que consiste de Samonella typhimurium atenuada y Llsteria monocytogenes atenuada .

25. El método de conformidad con la reivindicación 20 21, caracterizado porque ambos DNAs plásmidos son incorporados operablemente en un vector' de liberación viral atenuado.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el vector de liberación viral es 25 una forma atenuada de un virus seleccionado del grupo que consiste de un virus del Herpes, un Adenovirus, un virus de Vaccinia, y un virus Avipox.

27. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el ligando de CD40 es CD40LT. 5

28. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque las células que presentan el antígeno carcinoembrionario son células de cáncer de colon.

29. El método de conformidad con la reivindicación 10 21, caracterizado porque la vacuna es administrada oralmente .

30. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proteina de fusión con el anticuerpo recombinante huKSl/4-IL2 es administrada 15 intravenosamente.

31. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el DNA que codifica operablemente a un CEA y el DNA que codifica operablemente a un ligando de CD40 son ambos incorporados en el mismo plásmido. 0

32. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el DNA que codifica operablemente a un CEA y el DNA que codifica operablemente a un ligando de CD40 son incorporados cada uno en plásmidos separados.

33. Un equipo que comprende una vacuna de conformidad 5 con la reivindicación 1, empacada en un contenedor estéril, sellado herméticamente, el contenedor tiene una etiqueta fijada la mismo, la etiqueta posee material impreso que identifica la vacuna, y que proporciona información útil para un individuo que administre dicha vacuna a un paciente.

34. El equipo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el ligando de CD40 es CD40LT, y ambos DNAs plásmidos son incorporados operablemente en un vector de liberación de Salmonella typhimurium atenuada.

35. El equipo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque comprende una proteína de fusión con anticuerpo recombinante huKSl/4-IL2, junto con un portador aceptable farmacéuticamente, empacada en un contenedor estéril, sellado herméticamente, el contendor tiene una etiqueta fijada al mismo, la etiqueta posee material impreso que identifica a la proteína de fusión y que proporciona información útil para un individuo que administre dicha proteína de fusión a un paciente.