CN101553498B - 用于引发对肿瘤相关巨噬细胞的免疫应答的dna组合物 - Google Patents

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Abstract

一种可以用于引发针对肿瘤相关巨噬细胞的免疫应答的DNA组合物，该组合物包含一种编码半胱氨酸肽链内切酶(例如豆荚蛋白)或编码含有其在诸如肿瘤相关巨噬细胞的肿瘤相关细胞中过表达的至少一个免疫原性片段的多肽的DNA构建体，或该构建体的在免疫细胞中可表达的免疫原性片段，此DNA组合物掺入一种药用可接受的载体中。在一种优选实施方案中，该组合物编码一种多肽，该多肽包含肿瘤相关半胱氨酸肽链内切酶的(例如豆荚蛋白)的多个免疫原性片段，其免疫原性片段之间依次连接，每个片段通过诸如AlaAlaAla或AlaAlaTyr的连接肽连接到至少一个其他片段。在一种优选实施方案中，该组合物也包含编码诸如细胞因子的免疫效应蛋白的DNA构建体。本发明的DNA组合物可以单独使用，也可与化疗药物一起使用，用于治疗诸如肿瘤和肿瘤转移的疾病。

Description

用于引发对肿瘤相关巨噬细胞的免疫应答的DNA组合物
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2006年10月6日提交的申请号为60/849,927的美国临时申请的权益，该临时申请在此作为参考文献整体引述。
政府权利
本发明在美国政府的支持下完成，国防部授权号为DAMD17-02-0137和DAMD17-02-0562，国会医学研署授权编号为W81XWH-05-1-0091和W81XWH-05-1-0318。政府拥有本发明中的特定权利。
发明领域
本发明涉及编码能够引发针对肿瘤相关巨噬细胞的免疫应答的适当分子的脱氧核糖核酸(DNA)组合物。更特别地，本发明涉及DNA组合物，该组合物编码一种肽链内切酶，例如豆荚蛋白(legumain)的至少一个表位，该肽链内切酶在肿瘤相关细胞，例如肿瘤相关巨噬细胞中有表达。本发明也涉及使用该DNA组合物抑制肿瘤生长和肿瘤转移的方法。
发明背景
肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages，TAMs)与肿瘤的恶化和转移有关。一种新的抗肿瘤策略是对被TAM过表达的分子进行免疫，从而改变吸引巨噬细胞并介导它们的作用的肿瘤微环境的结构(参见Oosterling等，2005 J.Pathol.207：147-155；Emens等，2005Endocr.Relat Cancer 12：1-17)。TAM主要由一种极化了的M2(CD206+，F4/80+)巨噬细胞群体组成，由于它们仅能产生有限的一氧化氮和促炎症细胞因子，因此这类巨噬细胞对肿瘤细胞几乎没有细胞毒性(参见Mills等，2000J.Immunol.164：6166-6173)。
TAM也有很弱的抗原呈递能力，并能有效地抑制T细胞激活。事实上，通过分泌多种类型的生长和血管再生前因子以及金属蛋白酶，并通过它们在调节肿瘤细胞基质中成纤维细胞的功能的信号环路中的参与，这些M2表现型的巨噬细胞确实能促进肿瘤细胞的增殖和转移(Mantovani等。2004，Novartis.Found.Symp.256：137-145)。
当前，已有报道表明小分子抑制剂诱导产生的抗TAM效果能够对肿瘤产生抑制效果(参见Lewis等，2005Am.J.Pathol.167：627-635，和Mantovani等，2004，Eur.J.Cancer 40：1660-1667)。例如，yondelis，一种抗肿瘤药，具有对TAM的选择性细胞毒作用，从而明显减少它们产生IL6和CCL2的量，因此对炎症相关人类肿瘤的生长抑制起到效果(参见Allavena等，2005，Cancer Res.65：2964-2971)。另一个这样的例子是一种双磷酸盐化合物，唑来膦酸，它能够抑制TAM分泌MMP9，从而抑制肿瘤金属蛋白酶的活性并逐渐减弱VEGF与其酪氨酸激酶受体在表皮细胞生长中的联系(参见Giraudo等，2004，J.Clin.Invest.114：623-633)。
在另一种不同的实验模型中，趋化因子CCL5被表明在TAM的聚集中具有重要作用。该趋化因子的一种拮抗剂减弱肿瘤的浸润，从而减慢肿瘤生长(参见Robinson等，2003，Cancer Res.63：8360-8365)。因此，尽管TAM作为治疗目标依然是一相对较新的途径，初步的临床结论是令人鼓舞的，因为它们表明以TAM作为靶点可能会带来更多的常规癌症治疗方法。
豆荚蛋白是半胱氨酸蛋白酶C13家族的一种全新的进化分支(参见Ishii 1994，Methods Enzymol.244：604-615)，并且在植物和包含人类的哺乳动物中相当保守。豆荚蛋白最初被作为一种种子萌发过程中的存储蛋白的处理酶发现于植物中，随即在寄生虫中和哺乳动物中也被发现。豆荚蛋白是一种稳定的酸性半胱氨酸肽链内切酶，它具有非常显著的限定特异性，要求其底物序列的P1位置必须有一个天冬酰胺酸(参见Chen et al.1997，J.Biol.Chem.272：8090-8098)。
在本申请中，选择豆荚蛋白作为肿瘤治疗的靶点的事实依据是，编码该肽链内切酶的基因被发现在多种鼠和人类肿瘤组织中都是高度上调的，但在所有这些生长有上述肿瘤的正常组织中则没有或仅有很少量水平的存在。重要地，豆荚蛋白的过表达在诸如肿瘤缺氧的应激条件下发生，并导致肿瘤恶化的增加、血管生成以及肿瘤转移。
豆荚蛋白是本发明的组合物以及方法的一种特别优选的目标肽链内切酶，这是基于如下观察资料：在鼠乳腺癌组织中，基因表达谱和免疫组织化学都表明豆荚蛋白被TAM高度过表达。TAM在肿瘤基质中对豆荚蛋白有尤其充足的表达。与之相比，发挥重要的免疫监视和抗原呈递功能的经典M1表现型巨噬细胞则不表达豆荚蛋白。因而，以过量表达豆荚蛋白的TAM作为靶点不会与(M1)巨噬细胞的包括细胞毒性和抗原呈递的生物学功能发生干扰。本发明提供的DNA组合物能够引发针对过量表达豆荚蛋白或其他在TAM中过量表达的肽链内切酶的TAM的免疫应答，这对治疗肿瘤和其转移是有用的。
发明概述
本发明的DNA组合物包含一种DNA构建体，该构建体编码一种包含在肿瘤相关细胞(例如，肿瘤相关巨噬细胞)中过量表达的半胱氨酸肽链内切酶的至少一个免疫原性片段的多肽。该DNA构建体包含能够协助多肽在该DNA构建体所施用的受试者的免疫细胞中表达的结构性元件。优选地，该肽链内切酶包含豆荚蛋白或至少一种其免疫原性片段(例如，表位)。该DNA构建体被搀入药用可接受的载体中，以便能够施用于患者。组合物可以编码肽链内切酶的单个免疫原性片段(例如豆荚蛋白的一个表位)，包含该肽链内切酶的两个或多个免疫原性片段的多肽(即免疫原性多肽)，整个肽链内切酶蛋白，或其能够引发受试者免疫应答的任何一部分。优选地，该DNA构建体编码具有由SEQ ID NO：2组成的氨基酸残基序列的人类豆荚蛋白，与SEQ IDNO：2的序列具有至少80％序列一致性的蛋白(例如人类豆荚蛋白，猪豆荚蛋白，或小鼠豆荚蛋白)，或其免疫原性片段，且在被施用该DNA构建体的受试者的免疫细胞中可表达。本发明的DNA构建体对抑制肿瘤生长和转移有用。
该DNA构建体可以是裸DNA构建体，优选地，以质粒的形式。这些裸DNA构建体可以被掺入(incorporated in)脂质体递送载体、聚合物递送载体中，或者必要的情况下可以通过电穿孔、基因枪和其他方法施用。在一些优选的实施方案中，DNA构建体可以被掺入减毒病毒载体或减毒细菌载体中。
在一种优选实施方案中，DNA构建体被掺入如减毒鼠伤寒沙门氏菌的减毒细菌载体中，例如双减毒(AroA-、dam-)鼠伤寒沙门氏菌菌株。
可选地，DNA组合物也可以包含编码免疫效应蛋白(如细胞因子)的DNA构建体。优选的细胞因子包括CCL21、IL-2和CD40LT。
在一种尤其优选的实施方案中，本发明的DNA组合物包含编码免疫原性多肽的DNA小基因(minigene)构建体，该多肽包含在肿瘤相关细胞中高表达的半胱氨酸肽链内切酶(例如豆荚蛋白)的大量免疫原性片段(例如抗原表位)。该免疫原性多肽能够引发对肿瘤相关细胞的免疫应答，在免疫细胞中可表达，并被掺入药用可接受的载体中。通过连接肽在每个相邻(successive)多肽片段之间的连接，这些免疫原性片段依次连接在一起。典型地，连接肽长为至少3个氨基酸残基，优选的情况下它包含氨基酸序列AAA或AAY。在此使用的术语“连接肽”指至少2个氨基酸残基的序列，优选地，至少3个氨基酸残基的序列，当它与肽链内切酶的免疫原性片段连接在一起时，形成与天然肽链内切酶不同的氨基酸残基序列。典型地，连接肽与肽链内切酶免疫原性片段的组合包含少于约100个氨基酸残基长的肽，更优选地，约19至约62个氨基酸长(例如，2到约5个免疫原性片段，每个的长度为8至10个氨基酸，由1到4个每个长为3个氨基酸的连接肽连接到一起)的肽。优选地，此DNA小基因构建体编码人类豆荚蛋白(SEQID NO：2)的免疫原性片段。
本发明的DNA组合物可以作为以表达半胱氨酸肽链内切酶，例如豆荚蛋白的肿瘤相关巨噬细胞为目标的疫苗，为T细胞介导的癌症免疫疗法提供一种高度选择性的靶点。与针对仅被肿瘤细胞本身表达的抗原的疗法相比，以如豆荚蛋白的在肿瘤相关巨噬细胞中表达的肽链内切酶为靶点的疗法有多个优势。例如，豆荚蛋白在TAM中高度过表达，因而不会被下调的MHC-抗原表达减弱，这也是肿瘤细胞中的常见情况。此外，由于细胞凋亡信号通路的缺陷、抗细胞凋亡蛋白的上调，或细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes，CTL)的免疫抑制效果，肿瘤细胞常常会逐渐对T细胞介导的杀伤变得更有抵抗力。与使用仅仅在特定类型的肿瘤中表达的抗原的疗法相比，以表达豆荚蛋白的TAM为靶点可以得到一种能够治疗多种不同恶性肿瘤的治疗组合物。
在一种优选的实施方案中，通过将编码本发明DNA组合物的一个或多个免疫原性片段的cDNA作为带减毒细菌递送载体(例如减毒的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株)的口服DNA组合物来递送，本发明的DNA组合物能够瓦解外周T细胞对豆荚蛋白自身抗原的耐受性。在这样的实施方案中，DNA组合物与次级淋巴器官即小肠中的派氏集合淋巴结(Peyer′s patches)中的抗原呈递细胞(antigenpresenting cells，APCs)接触。在一种预防性方法中，包含本发明的DNA组合物的疫苗免疫接种引发T细胞介导的抗肿瘤免疫应答，从而抑制鼠科动物(murine)的多种肿瘤模型中的肿瘤生长。该DNA组合物也能够明显抑制在CT26结肠癌治疗模型中已在进行的肺转移的侵染。
优选的DNA组合物包含减毒沙门氏菌载体，如双减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株，例如包括dam-和AroA-突变的名为RE 88的菌株，它们能够从Remedyne公司(Goleta，CA)获得。在本发明中，减毒沙门氏菌载体被转染从而包含编码肽链内切酶(例如豆荚蛋白)或编码其免疫原性片段的多肽的DNA构建体。肽链内切酶或多肽能够在施用其的哺乳动物的免疫细胞中表达。细菌本身不表达豆荚蛋白或多肽，而是将DNA送达免疫细胞，例如巨噬细胞和树状细胞(dendritic cells，DCs)中，这些细胞接下来会表达肽链内切酶或包含其免疫原性片段的多肽。这样的组合物能够在鼠科动物模型中提供长期的抗肿瘤效果。此外，体内的T细胞去除实验表明，在与编码豆荚蛋白和编码包含豆荚蛋白的免疫原性片段的多肽的组合物相关的免疫原性反应中，有CD8+T细胞的参与，而没有CD4+T细胞的参与。观察到的体外由CD8+T细胞介导的细胞毒性效果特异性针对过量表达豆荚蛋白抗原的靶TAM。
本发明的DNA组合物也可包含编码免疫效应分子的DNA构建体作为组合物的佐剂。这些免疫效应因子包括，例如，IL-2，一种T细胞增殖诱导物；CCL21，一种化学吸引成熟的树状细胞的趋化因子；初始(naive)T细胞；以及CD40LT，一种已知的树状细胞成熟诱导物。优选地，编码免疫效应蛋白的核酸被掺入质粒中。豆荚蛋白和免疫效应蛋白DNA构建体可以被掺入同一质粒或两个单独的质粒中。被诱导产生的针对TAM的CTL反应能抑制多种肿瘤的生长，并不仅针对特定的肿瘤类型。
本发明也提供一种抑制哺乳动物肿瘤生长和转移的方法，该方法包括将足以引发针对表达豆荚蛋白的TAM的免疫应答的量的本发明的DNA组合物施用到哺乳动物。
本发明的另一方面是一种将化疗和本发明的DNA组合物治疗结合在一起的有效组合疗法。在本发明的这一实施方案中，多种化疗药物，例如阿霉素、紫杉醇和/或安道生等在以最大容许剂量(maximumtolerable dose，MTD)施用时不会引发骨髓抑制的化疗药物被与本发明中的DNA组合物一同施用，该DNA组合物包含DNA构建体，所述DNA构建体编码TAM表达的肽链内切酶，如豆荚蛋白或编码其免疫原性部分的多肽，优选地，包含小基因构建体，所述小基因构建体含有肽链内切酶的至少两个免疫原性片段，相邻免疫原性片段之间以连接肽连接。
另一种优选实施方案是一种抑制哺乳动物(例如人类)肿瘤生长或转移的方法，它包括以下步骤：将足以在该哺乳动物体内引发对TAM的免疫应答剂量的本发明的DNA组合物施用到哺乳动物中，其过量表达例如豆荚蛋白的肽链内切酶，然后施用有效抗肿瘤剂量的抗肿瘤化疗药物。
优选地，用本发明的方法治疗的哺乳动物是人类。
在本发明的方法的实施方案中，DNA组合物可以通过肠胃施用，例如口服，或非肠胃施用，例如注射或静脉输液。优选地，组合物通过口服施用。组合物可以包装在密封容器中，并标明用于协助临床医生有效施用该组合物的有用信息。
本发明的DNA组合物对多种疾病状态的治疗和预防有用。例如，患有结直肠癌、乳癌、肺癌及其他的患者，可以通过本发明组合物的免疫效果获益。本发明的组合物也对研究豆荚蛋白在多种癌症中的作用有用。
附图简述
图1：豆荚蛋白在肿瘤基质中的肿瘤相关巨噬细胞中高表达。(A)A部分所示为豆荚蛋白在TAM中的表达。浸润肿瘤的巨噬细胞通过H/E染色显示，并以箭头指明。豆荚蛋白的表达以抗豆荚蛋白抗体和抗CD68抗体双染色标记。(放大率×35)(B)通过对分离自新鲜肿瘤组织的CD206+/F4/80+M2巨噬细胞的双阳性群体使用流动血细胞计数器进行统计，证实TAM中豆荚蛋白表达增加。(C)多色流式细胞术显示，在IL-4、IL-10和IL-13(10ng/ml)培养后，M2巨噬细胞标记物CD206对RAW细胞上调。与下方照片中的野生型RAW细胞相比，在用IL-4、IL-10和IL-13培养后，上方照片中显示的豆荚蛋白在F4/80+/CD206+阳性RAW细胞中高度表达。(D)在使用IL-4、IL-13和IL-10单独或组合进行荧光增强后进行蛋白印迹法测定，确认豆荚蛋白在RAW细胞中的高表达。
图2：以表达豆荚蛋白的细胞为靶点的治疗对肿瘤发展(恶化)的抑制效果。(A)本发明DNA组合物的图示，该组合物由pCMV/myc/cyto载体骨架构建而成，其中豆荚蛋白基因与突变型的多聚泛素的C末端融合。整个片段被插入，并通过Western印迹法显示其蛋白表达。(B)疾病预防模型：免疫接种计划如下：以一周为间隔进行三次免疫化，随后通过静脉注射攻击(challenge)约2×105 D121非小细胞肺癌细胞、约5×104 CT26结肠癌细胞，以及乳腺脂肪垫注射约7×103 4T1乳腺癌细胞给药。在肿瘤细胞攻击第24天(D121或CT-26)或30天(4T1)后，分别测定肺的重量并对每一组进行分析。两个对照组(PBS和/或空载体)与治疗组之间的统计学差异明显。**P＜0.005。正常肺重量为0.2g。(C)治疗模型：BALB/c小鼠组(n＝8)首先通过乳腺脂肪垫注射约7×103 4T1乳腺癌细胞，随后在第3、7、11天分别使用PBS、空载体或pLegumain DNA组合物进行疫苗免疫接种，而原发肿瘤在第12天切除。存活图显示了每一个治疗和对照组中的8只小鼠的结果。空载体对照组和治疗组的统计学差异明显。**P＜0.005。
图3：肿瘤基质中的TAM群体被基于豆荚蛋白的DNA组合物诱导的CD8+特异性CTL削弱。(A)RAW巨噬细胞在使用10ng/ml的IL-4，IL-10，IL-13培养后高度表达豆荚蛋白，并在4小时的51Cr释放实验中作为靶细胞。在体外，使用不同的效靶细胞比，使用pLegumain组合物免疫化的从小鼠中分离出的脾细胞能够有效杀灭使用这些细胞毒素处理过的RAW细胞，但对于没有被激发过从而缺少豆荚蛋白表达的RAW细胞，则无法诱导细胞毒害作用。**与对照组相比，P＜0.005。(B)在免疫接种后的肿瘤组织中，使用流式细胞法检测带有特定巨噬细胞标记(CD206和F4/80)的TAM群体的百分比。从使用本发明的DNA组合物处理过的小鼠中分离出的TAM群体在肿瘤组织细胞中的百分比被降低了。从使用空载体或pLegumain处理并继以CD8+T细胞去除处理的小鼠中分离出的TAM群体则没有减少。(**P＜0.005)。(C)使用共聚焦显微镜对免疫组织化学染色结果进行评估，以此验证流式细胞法的结果。在免疫接种后，肿瘤基质中的TAM群体明显减少。放大率x5(H/E)，x35(对照组，空载体和pLegumain)。
图4：MHC I类抗原限制特定CD8+T细胞对豆荚蛋白表达细胞的反应。(A)FACS图显示，使用DNA处理后能提升树状细胞淋巴细胞对协同刺激分子的表达。从派氏集合淋巴结中获取的淋巴细胞在免疫接种3天后，将抗CD11c抗体与和藻红蛋白(PE)复合的抗CD80抗体、I类抗MHC抗体或抗CD40抗体组合，标记异硫氰酸荧光素(FITC)，使用标记了的异硫氰酸荧光素对上述淋巴细胞染色。(*P＜0.05，与对照组相比)。(B)使用荧光细胞激活分类术(FACS)分析来衡量胞浆内CD8+T细胞的γ-干扰素释放。**P＜0.005，与对照组相比。(C)使用酶联免疫斑点实验(ELISPOT)在单细胞水平上对特定γ-干扰素的产生进行验证。这用于使用豆荚蛋白+4T1肿瘤组织细胞或豆荚蛋白-4T1细胞对免疫化的小鼠重新激发而获得的淋巴细胞，如其每个反应孔中形成的免疫位点数所示。**P＜0.005，与未激发的治疗组相比；##P＜0.005，与对照组相比。(D)通过使用51Cr释放法，从处理过的小鼠中分离出的皮细胞能有效杀灭TAM。(*P＜0.01，与对照组相比)。使用针对H2Kd/H-2Dd MHC I类抗原的抗体进行的抑制实验表明，T细胞介导的肿瘤细胞溶解是MHC I类抗原限制性的。体内CD4+或CD8+T细胞的耗尽表明，从免疫接种过的小鼠中分离出的淋巴细胞中不再含有CD8+T细胞，因而无法诱导靶细胞的细胞毒性杀灭。CD4+T细胞的去除则不能阻止这些相同的靶细胞中的细胞毒性杀灭。*P＜0.01，与PBS或空载体组相比。
图5：TAM的去除导致生长因子释放、肿瘤细胞迁移和转移的减少。(A)本发明的DNA组合物减少了TAM释放的生长因子。在免疫接种和肿瘤细胞攻击12天后，提取4T1乳腺肿瘤组织和小鼠血清。经过24小时或48小时的培育，提取肿瘤组织细胞的上清液，并通过ELISA测定血清或上清液中TGF-β、TNF-α和VEGF的浓度。治疗组和对照组之间存在明显差异。*P＜0.01，**P＜0.005。(B)通过免疫组织化学染色来确定这些生长因子在肿瘤微环境中的表达。与空载体组相比，免疫接种治疗组的TAM中的VEGF、TGF-β和MMP-9的释放减少了。(C)使用transwell migration法测定免疫接种后肿瘤细胞的迁移。在免疫接种后，迁移细胞的数量显著减少。**P＜0.001，与空载体组相比。(D)通过体内实验测定小鼠形成肿瘤转移的能力。使用前述方法中所述的疫苗对小鼠进行处理。在原发肿瘤切除后的第25天，对肿瘤转移水平和肺重量进行测定。肿瘤转移评分以肺表面覆盖的融合转移病灶的百分比表示：0＝无，1＝＜5％，2＝5％到50％，3＝＞50％。使用疫苗处理过的小鼠组与所有对照组之间在肺重量方面存在明显的统计学差异。(**P＜0.005)。
图6：杀灭TAM导致肿瘤血管生长的减少。对VEGF引发的血管生长的抑制：分别使用转染了空载体、pLegumain或经过体内CD8+或CD4+T细胞去除的pLegumain处理的沙门氏菌(S.typhimurium)进行免疫接种。在最后一次接种一周后，通过皮下注射将Matrigel凝胶置入小鼠腹部中线处。血管生成由VEGF或bFGF引发。(A)该图在置入Matrigel凝胶栓(Matrigel plug)后6天用数码相机拍摄。此外，Magrigel凝胶栓中用Massion三色染色标明Matrigel凝胶栓中的血管生长，同时也用箭头指出。(放大倍数：×5)。(B)在体内FITC标记的同工凝集素B4染色后，使用荧光测定法对血管生长定量测定。仅使用编码豆荚蛋白的载体接种后，VEGF引发的新生血管数量有所减少，而用空载体或去除了CD8+T细胞的pLegumain接种则无减少。**P＜0.005，*P＜0.01，与对照组相比。(C)进行免疫组织化学染色，并使用共聚焦显微镜观察。Matrigel凝胶栓的交叉部分被染色，用于确定在凝胶栓中生长的细胞或迁移到其中的细胞。图片表明，带有CD31标记的内皮细胞或带有CD68标记的巨噬细胞在Matrigel凝胶栓中生长，或迁移到其中，在图中以箭头标明(放大倍数：×35).H/E染色作为对照(放大倍数：×5)。
图7：使用带有豆荚蛋白粒的逆转录病毒对4T1细胞系稳定转染，并接下来用作免疫化了的小鼠脾细胞的靶细胞(A部分，左图放大率为5×；右图放大率35×)，图片在转染后2天获取，阳性细胞以箭头标明。51Cr释放法测定的数据在B部分显示。从用pLegumain DNA组合物免疫化了的小鼠体内分离出的脾细胞能够有效杀灭用豆荚蛋白转染的4T1细胞(*P＜0.01，与空载体对照组相比)。肿瘤特异性T细胞介导的杀灭对豆荚蛋白具有特异性，这是由于正常的4T1细胞缺少豆荚蛋白表达，因而不被溶解。
图8显示的是编码人类豆荚蛋白的一种核酸的核苷酸序列(SEQID NO：1)。
图9显示的是人类豆荚蛋白的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：2)。
图10显示的是一种编码鼠科豆荚蛋白的核酸的核苷酸序列(SEQID NO：3)。
图11显示的是鼠科豆荚蛋白的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：4)。
图12显示的是一种编码人类IL-2的核酸的核苷酸序列(SEQ IDNO：5)。
图13显示的是人类IL-2的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：6)。
图14显示的是一种编码人类CCL21的核酸的核苷酸序列(SEQ IDNO：7)。
图15显示的是人类CCL21的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：8)。
图16显示的是一种编码人类CD40L的核酸的核苷酸序列(SEQID NO：9)。
图17显示的是人类CD40L的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：10)。
图18显示的是泛素化鼠科豆荚蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：11)。
图19显示的是泛素化鼠科豆荚蛋白的氨基酸残基序列(SEQ IDNO：12)。
图20显示的是鼠科豆荚蛋白表位序列的氨基酸残基序列。
图21显示的是编码包含有豆荚蛋白免疫原性片段的豆荚蛋白小基因的质粒的图示。
图22显示的是pCMV-Kb/Kd小基因组合物保护小鼠免受D2F2乳腺癌细胞的攻击。对BALB/c小鼠组(n＝8)以1周时间为间隔，使用含有相关载体的双减毒沙门氏杆菌RE-88进行3次免疫化。在最后一次免疫化后1周，使用静脉注射的方法向小鼠注射2×105 D2F2乳腺癌细胞进行攻击。A.实验方法图示。B.肿瘤细胞攻击后5至25天小鼠肿瘤的重量。C.肿瘤细胞攻击后25天的肿瘤重量，*，P＜0.05，与空载体对照组相比。
图23显示的是pKd小基因疫苗阻止D2F2乳腺癌在同源BALB/c小鼠中的转移。对BALB/c小鼠组(n＝8)以一周时间为间隔，使用含有相关载体的双减毒沙门氏杆菌RE-88通过管饲进行三次免疫化。在最后一次免疫化后2周，向小鼠静脉注射1×105 D2F2乳腺癌细胞攻击。A.实验方法图示。B.肿瘤细胞攻击25天后，各实验组中小鼠肺转移评分的平均值。肺部肿瘤转移评分通过估算表面被融合的转移覆盖的百分比来评定，具体如下：0，无转移；1，＜20％；2，20％至50％；3，＞50％，不同的治疗组以不同的符号表示。*P＜0.05，与空载体对照组相比。
图24描绘的是在豆荚蛋白特异性T细胞中，由pCMV-Kb/Kd小基因组合物引发的IFN-γ的释放。A.获取自肿瘤组织的新鲜的4T1细胞的对豆荚蛋白的表达被用作激发细胞。使用流式细胞法来测量豆荚蛋白在那些细胞中的表达。B.从单细胞水平上使用ELISPOT法验证IFN-γ的生成，来自免疫化了的小鼠的淋巴细胞被使用获取自肿瘤组织的新鲜豆荚蛋白+4T1肿瘤细胞或豆荚蛋白-4T1组织培养细胞进行再激发。IFN-γ的释放由每个反应孔中形成的免疫点个数显示。*P＜0.05，与淋巴细胞未使用豆荚蛋白+肿瘤细胞激发的小鼠组相比。#P＜0.05，与对照组相比。
图25描绘的是由pCMV-Kb/Kd小基因组合物引发的豆荚蛋白阳性巨噬细胞的特定CTL杀灭作用。A.在使用IL-4、IL-10和IL-13培养后，巨噬细胞细胞系RAW表达豆荚蛋白。使用Western印迹法来展示豆荚蛋白在这些细胞中的表达。B.在最后一次免疫化2周后，部分免疫化的BALB/c小鼠组(n＝4)被处死，从中分离出的脾细胞被使用被辐照的4T1豆荚蛋白+细胞激发5天。接下来，对野生型RAW豆荚蛋白-细胞(下方部分)或RAW豆荚蛋白+细胞(上方部分)使用细胞毒性方法分析。*P＜0.05，与使用RAW豆荚蛋白+细胞作为靶细胞的空载体对照组相比。
图26描绘的是pCMV-Kb/Kd小基因组合物引发的对同源BALB/c小鼠血管再生的抑制作用。A.Matrigel凝胶法的结果。Matrigel凝胶被置入分别使用空载体、pCMV-Db/Dd或pCMV-Kb/Kd疫苗进行免疫接种的小鼠体内。对Matrigel凝胶栓中血红蛋白(Hb)的浓度进行测定，从而为血管生长定量。每一组小鼠的Matrigel凝胶栓中的Hb浓度平均值以条形图显示(n＝4；平均值+标准差)。*，P＜0.05，与空载体对照组相比。B.对Matrigel凝胶栓置入7天后的Matrigel凝胶部分使用Masson三色染色。箭头所指的是Matrigel凝胶栓中的血管生长。
优选实施方案详述
本发明提供一种DNA组合物，它能够作用于以如肿瘤相关巨噬细胞(TAM)这样的肿瘤相关细胞。该DNA组合物包含一种DNA构建体，该构建体编码一种在肿瘤相关细胞中过量表达的半胱氨酸肽链内切酶或它的能够引发对肿瘤相关细胞的免疫应答的至少一个免疫原性片段，并被掺入药用可接受的载体中。优选地，DNA组合物包含DNA小基因构建体，该小基因构建体编码一种包含在肿瘤相关细胞中高度表达的半胱氨酸肽链内切酶的(例如，豆荚蛋白)多个免疫原性片段的免疫原性多肽，该多肽能够引发对肿瘤相关细胞的免疫应答，并能在免疫细胞中表达。该小基因实施方案中，多个相邻的肽链内切酶的免疫原性片段之间以连接肽彼此相连构成多肽。
优选地，该半胱氨酸肽链内切酶是豆荚蛋白(例如，人类豆荚蛋白，SEQ ID NO：2)。该DNA构建体可以编码一个单独的半胱氨酸肽链内切酶的免疫原性片段(例如，一个表位)，但优选地，它编码包含两个或多个该内切酶的免疫原性片段的多肽。
此处及下文中使用的术语“DNA构建体”指编码一种有意义的蛋白或多肽的DNA结构，例如豆荚蛋白或豆荚蛋白的免疫原性片段(表位)，统称为“豆荚蛋白DNA”，以及蛋白，例如IL-2，CCL21，CD40L等。优选地，每个免疫原性片段包含约8至10个氨基酸残基。DNA构建体包括能够在靶细胞中转录的任意DNA，它们包括线性DNA和质粒DNA以及被掺入细胞或病毒的基因物质中的DNA。优选地，该DNA构建体是一种被掺入病毒或细菌传递载体中的DNA，例如，非致病性的减毒病毒或细菌载体。当目标被使用本发明的组合物处理时，豆荚蛋白DNA被送达免疫细胞(例如，巨噬细胞和树状细胞)，进而表达包含其免疫原性片段的蛋白或多肽。该豆荚蛋白DNA的病毒和细菌载体本身并不表达豆荚蛋白。
在一些优选实施方案中，DNA构建体是一种小基因构建体，该小基因构建体编码包含多个(例如，2到5个)在TAM中高度表达的肽链内切酶的免疫原性片段的多肽。本文使用的术语“小基因”指编码一个有意义的蛋白的多个部分(片段)的DNA构建体，它们连在一起，优选地，通过至少三个氨基酸长的小肽连在一起。因而，小基因编码包含有意义的蛋白的免疫原性部分，但不编码整个有意义的蛋白。优选地，小基因编码包含约2到5个免疫原性片段(即来自该蛋白表位区域的肽序列)的多肽，优选地，它们通过连接肽连在一起。小基因也可以包含编码前导序列或对协助该多肽的表达或运输有意义的序列的序列。
如上提及，优选地，多肽中的免疫原性片段以连接肽或间隔肽在彼此之间连接。优选地，连接肽包含至少三个氨基酸残基(例如AAA或AAY)。优选地，编码豆荚蛋白的免疫原性片段的DNA构建体也编码前导序列，例如内质网(ER)前导序列，它通过一个连接肽连接到DNA构建体编码的多肽的N末端。当DNA构建体编码包含两个或多个豆荚蛋白免疫原性片段的多肽时，优选地，前导序列连接到其自N末端起的第一个免疫原性片段。优选地，肽链内切酶的免疫原性片段包含来自其一个或多个表位区域的大约8到10个相邻的氨基酸残基。
如豆荚蛋白的肽链内切酶的免疫原性片段，包括人类豆荚蛋白，可以使用本领域中众所周知的方法识别，例如美国国立卫生研究院在NIH www网站上的Bioinformatics & Molecular Analysis Section(BIMAS)提供的HLA Binding Predictions程序，在此作为参考引入。
本发明的DNA组合物能够刺激对表达肽链内切酶的肿瘤相关巨噬细胞有效的CTL的形成。这些肿瘤相关巨噬细胞成为本发明的DNA组合物引发的免疫应答产生的CTL的靶点。TAM的去除或取消改变了肿瘤的微环境，并导致对肿瘤生长和转移的抑制。
本文用到的术语“免疫”指针对恶性的传染因子或肿瘤抗原的免疫性保护。术语“免疫化”指暴露于从非恶性来源获取的致病性物质的抗原，从而导致被治疗者对致病原的免疫。
优选地，在本发明的DNA组合物中有用的DNA构建体包含一个编码包含豆荚蛋白(例如，人类豆荚蛋白)或豆荚蛋白的免疫原性片段的多肽的核酸，且该核酸能可操作地连接到免疫细胞中基因表达所需的调控元件。在一种优选实施方案中，DNA构建体编码人类豆荚蛋白(SEQ ID NO：2)的全长或与其有至少80％的高度一致性的多肽(例如猪豆荚蛋白，小鼠豆荚蛋白等)，或其免疫原性片段，并能够引发对过量表达豆荚蛋白的细胞的免疫应答。
在一种特别优选的实施方案中，DNA构建体包含编码2到5个豆荚蛋白(例如，人类豆荚蛋白)的免疫原性片段的的小基因，这些片段之间以三个氨基酸的连接肽(例如，AAA或AAY)连接，每个连接肽位于免疫原性片段之间。
有用的DNA构建体，包括小基因构建体，优选地包括核苷酸表达必须的调控元件。这些元件包括，例如启动子、起始密码子、终止密码子和多腺苷酸化信号。此外，编码免疫原靶蛋白的序列的表达通常会需要增强子。在本领域中已知，优选地，这些元件可操作地连接到编码所需蛋白的序列。优选地，调控元件应选择在将要施用的物种中可实施的类型。优选地，DNA构建体采用质粒的形式，或被掺入病毒或细菌载体中。首先，编码豆荚蛋白的DNA构建体可以使用本领域中众所周知的方法通过转染被掺入细菌载体中。接着，被改造的细菌被培养，以提供在其基因物质中包含了豆荚蛋白DNA的细菌群体。对这些改造的细菌的培养能够提供本发明的DNA组合物的可用来源。
起始密码子和终止密码子优选地被作为其一部分包含到编码本发明DNA组合物中的肽链内切酶或免疫原性多肽的核苷酸序列中。起始和终止密码子必须与编码序列处于同一框中。
优选地，包含于本发明的组合物中的启动子和聚腺苷酸化信号应选择能够在被免疫对象的细胞内能发挥功能的类型。
在本发明的组合物中有用的启动子的例子，尤其是在针对人类的基因疫苗DNA组合物的制备中有用的，包括但不限于来自猿病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)例如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼病毒、巨细胞病毒(CMV)如CMV即刻早期启动子、埃-巴二氏病毒(EBV)、Rous肉瘤病毒(RSV)以及来自人类基因的启动子，例如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸和人类金属硫蛋白。
在本发明的DNA组合物中有用的聚腺苷酸化信号的例子，尤其是在用于人类的DNA组合物的产生中有用的，包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。
除DNA表达所需的调控元件之外，其他元件也可包含在DNA分子中。这些附加元件包括增强子。增强子可以是，例如人类肌动蛋白、人类肌球蛋白、人类血红蛋白、人类肌肉肌酸和病毒增强子，例如来自CMV、RSV和EBV的病毒增强子。
调控序列和调控密码子一般是与物种相关的，因此，为了使蛋白的产生最大化，应优选地选择在将被免疫化的物种中有效的调控序列和调控密码子。掌握本领域中的常规技术的人均可制造在给定目标物种中有效的DNA构建体。
在本组合物中可用的DNA构建体可以是“裸”DNA，该名词在Restifo等的Gene Therapy 2000；7：89-92中定义，其相关内容在此作为参考引入。优选地，DNA构建体以被掺入减毒病毒或减毒细菌的基因物质中的质粒或DNA的形式呈现。有用的传递载体或携带者包括生物降解微囊剂、免疫激发复合物(ISCOMs)和用于裸DNA构建体的脂质体，和多种生理上可接受的用于基因工程减毒的活病毒或细菌的缓冲液。
能够被改造用于包含FAP DNA构建体的适合的减毒活细菌载体的例子包括鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、志贺氏菌(Shigella)种、芽孢杆菌(Bacillus)种、乳杆菌(Lactobacillus)种、卡介菌(BCG)、大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱杆菌(Vibriocholerae)、弯曲菌(Campylobacter)种、李斯特菌(Listeria)种，或任何其他在本领域中已知的适当的细菌载体。优选地，尤其当组合物被用于口服时，该载体是一种减毒的活的鼠伤寒沙门氏杆菌载体。优选的减毒的活鼠伤寒沙门氏杆菌包括例如SL7207的AroA-菌株，或双减毒的AroA-，dam-菌株，如RE88。
用于使用外源性DNA构建体来转化活的细菌载体的方法在本领域中已有充分的描述。参见，例如Joseph Sambrook和David W.Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，第三版，Cold Spring haborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2001)(Sambrook andRussell)。在转化后，外源性的基因物质被整合入细菌的基因物质中，从而当该细菌繁殖时，外源性的DNA与其机体自身DNA一同被复制。因此，一旦细菌被转化，其机体的正常繁殖程序能够提供外源性DNA的现成来源。
优选的病毒载体包括噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒、辛德比病毒、脊髓灰质炎病毒、痘苗病毒和鸟痘病毒。用于使用外源性DNA构建体转化病毒载体的方法在本领域中也已有充分的描述。参见上述Sambrook和Russell的著作。
有用的脂质体载体是单层囊泡或多层囊泡，它们有由亲脂性物质构成的膜部分和内部的亲水部分。亲水部分在本发明中用于容纳将要送达靶细胞的多核苷酸物质。一般来说，形成脂质体的物质优选地有一个阳离子基团，如一个季氨基团，以并有一个或多个亲脂性集团，例如有约6到约30个碳原子的饱和或非饱和烷基。一组适当的物质在European Patent Publication No.0187702有描述，并在U.S.Patent No.6,228,844 to Wolff等中有进一步说明，相关描述在此均作为参考引入。许多其他适当的形成脂质体的阳离子脂类化合物在文献中有描述。参见，例如L.Stamatatos等的Biochemistry 1988；27：3917-3925；和H.Eibl等的Biophysical Chemistry 1979；10：261-271。另一种方式是可以使用诸如聚乳糖-共乙交酯的生物降解微球体。如在本领域中已知的，核酸构建体被包裹到或整合到脂质体或微球体中，用于将核酸送达组织中。
其他有用的载体包括包含生物可降解的聚(原酸酯)物质的聚合物微球体，在Wang等的Nat.Mater.，2004；3(3)：190-6.Epub 2004 Feb.15中有阐述，其相关描述在此作为参考引入。
优选地，用于实施本发明的组合物包含人类豆荚蛋白的免疫原性片段或其功能同源物的DNA构建体。优选地，豆荚蛋白的功能同源物与人类豆荚蛋白有至少80％氨基酸残基序列的一致性，更优选地，至少有90％，最优选地，与人类豆荚蛋白至少有95％的一致性。
GenBank是美国国立卫生研究院(NIH)的基因序列数据库，它是一个附有注解的所有公开的DNA序列的汇集数据库。GenBank是序列数据库国际合作组织的一部分，该合作组织是由日本DNA数据库(DDBJ)、欧洲分子生物学实验室(EMBL)和美国国家生物技术信息中心的GenBank组成的。
编码人类豆荚蛋白的核酸的核苷酸序列，SEQ ID NO：1(图8)在GenBank中的目录编号为BC026250，其描述在此作为参考引入。人类豆荚蛋白相应的氨基酸残基序列为SEQ ID NO：2(图9)。
SEQ ID NO：3的包含鼠豆荚蛋白的DNA的核苷酸序列在图10中显示。鼠豆荚蛋白的对应的氨基酸残基序列为SEQ ID NO：4(图11)。
Chen等，J.Biological Chem.1997，272(12)：8090-8098(在此作为参考引入)中阐述了猪豆荚蛋白的结构和表征，它与人类豆荚蛋白有83％的序列一致性。
由于遗传密码的固有简并性，其他编码人类豆荚蛋白的氨基酸序列可以用在本发明的实践中。这样的DNA序列也包括能够杂交到人类豆荚蛋白的序列。
编码人类豆荚蛋白的并且能依照本发明使用的DNA序列，包括带有对SEQ ID NO：1的序列中的核苷酸缺失、增加或替换为不同的核苷酸的核酸，这些缺失、增加或替换能够产生编码相同的豆荚蛋白基因产物的序列。编码人类豆荚蛋白的功能相当的同系物的DNA分子也可以用于本发明的DNA组合物。
由核酸编码的基因产物也可以包含在豆荚蛋白氨基酸残基序列中氨基酸残基的缺失、增加或替换，这些缺失、增加或替换能带来沉默变化，从而产生功能相当的豆荚蛋白。这些氨基酸替换可以基于相关残基在在极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性特性方面的相似性发生。例如，带有负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带有正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有不带电荷的有相似亲水特性的极性头部的氨基酸包括：亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸；甘氨酸、丙氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。本文所述的功能相当的豆荚蛋白指包含一个或多个表位的蛋白，它们在被T细胞识别的时候，相同的T细胞能够识别在表达豆荚蛋白的细胞中存在的豆荚蛋白表位。在一种优选的实施方案中，功能相当的豆荚蛋白的氨基酸残基序列与人类豆荚蛋白的氨基酸残基序列具有至少80％的一致性，例如，至少90％的序列一致性，或至少95％的序列一致性。
可以对编码豆荚蛋白的DNA构建体进行改造，以便更改编码豆荚蛋白的序列(与天然的豆荚蛋白DNA相关，SEQ ID NO：1)，达到多种目标，包括但不限于能够改变豆荚蛋白基因产物的处理和表达的更改。例如，使用本领域中众所周知的技术，例如点突变，可以将突变引入DNA中，例如插入新的限制性酶切位点、更改糖基化模式、磷酸化等。
在一种优选的实施方案中，本发明的DNA组合物包含一种编码免疫原性多肽的DNA构建体，其免疫原多肽由多个人类豆荚蛋白的免疫原性片段以及一种可操作地编码至少一个免疫效应蛋白的DNA构建体组成，它们二者均在免疫细胞中可表达。在此使用及后面的权利声明中用到的词汇“免疫效应蛋白”指的是一种参与免疫系统通路的调节的蛋白。优选地，免疫效应蛋白是一种细胞因子。
细胞因子是由细胞产生的蛋白和多肽，它们能够影响其他细胞的行为，例如细胞增殖、细胞分化、免疫应答调节、血细胞生成和炎症反应。细胞因子被分为多个家族，其中包括趋化因子、血细胞生成素、免疫球蛋白、肿瘤坏死因子，以及多种未分类的分子。一般参见OxfordDictionary of Biochemistry and Molecular Biology，Revised Edition，Oxford University Press，2000；和C.A.Janeway，P.Travers，M.Walportand M.Schlomchik，Immunobiology，Fifth Edition，Garland Publishing，2001(以下简称“Janeway和Travers”)。细胞因子的一种简明分类在Janeway和Travers，附录III，677-679页，相关描述在此作为参考引入。
血细胞生成素包括，例如促红细胞生成素、白细胞间介素-2(IL-2，一种T细胞产生的133氨基酸的蛋白，它参与T细胞的增殖)，IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-11、IL-13、IL-15(一种类似于IL-2的144氨基酸的蛋白，能够刺激小肠表皮、T细胞和NK细胞的生长)、粒细胞克隆刺激因子(G-GSF)、粒细胞-巨噬细胞克隆刺激因子(GM-GSF)、制癌蛋白-M(OSM)，和白血病抑制因子(LIF)。
干扰素包括，例如IFN-α、IFN-β和IFN-γ(一种由T细胞和NK细胞产生的143氨基酸的同源二聚性蛋白，能够参与巨噬细胞的激活、MHC分子的增量表达和抗原加工组分、IG类别转换以及TH2的抑制)。
免疫球蛋白包括，例如B7.1(CD80)和B7.2(CD86)，二者均能够促进T细胞反应。
肿瘤坏死因子(TNF)家族包括，例如TNF-α、TNF-β(淋巴毒素)、淋巴毒素-β(LT-β)、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BB配体、Trail(肿瘤坏死因子相关性凋亡诱导配体)和OPG配体。
CD40配体(CD40L)的生物学功能，尤其是其在T细胞激活的共同刺激过程中与在抗原加工细胞上表达的CD40的相互作用，是本领域中众所周知的。CD40是一个40kDa的在所有成熟B细胞、大多数成熟的恶性肿瘤以及一些早期B细胞急性淋巴细胞白血病的表面表达，但不在血浆细胞表面表达的的糖蛋白，参见Clark著作TissueAntigens，1990，35：33-36。CD40L，一种约35kDa的II类膜蛋白，在抗原识别后在T细胞的表面表达。TNF家族的膜当作为同源三聚体表达的时候具有最高的生物活性。CD40L在此方面也不例外，并可以通过修饰一个融合到该配体的整个细胞外域的N末端的33氨基酸的亮氨酸拉链结构域来作为同源三聚体(CD40LT)被表达。CD40LT DNA在Gurunathan等J.Immunol.1998，161：4563中有相关阐述，当小鼠以编码高度免疫原性模型抗原β-牛乳糖的DNA免疫接种时，CD40LT DNA能够提升诸如诱发IFN-γ和溶细胞性T细胞活性的细胞免疫应答。
CD40LT是一种T细胞激活过程中的重要因子，它是引发对肿瘤自身抗原的有效保护性免疫的必要因子。一旦MHC I类抗原：肽复合体被树状细胞(DC)获取并提呈到自身的T细胞，第一个抗原信号便通过T细胞受体(TCR)被传递，并继以CD40LT的上调。在T细胞表面，CD40LT接下来通过CD40-CD40LT的相互作用引发对DC的共刺激活动。因此，这些抗原呈递细胞能够表达共刺激分子B7.1(CD80)和B7.2(CD86)，这些共刺激分子通过与CD28的相互作用向T细胞发出第二次共刺激信号，这是完全激活T细胞使其同时产生前发炎性细胞因子INF-γ和IL12并发挥其效应功能的必需步骤。
多种未被归入特定家族的细胞因子包括，例如肿瘤生长因子-β(TGF-β)、IL-1α、IL-1β、IL-1 RA、IL-10、IL-12(自然杀伤细胞刺激因子，一种具有一条197氨基酸链和一条306氨基酸链的异源二聚体，它参与到自然杀伤细胞的激活以及引发T细胞分化为类-T H1细胞的过程中)、巨噬细胞抑制因子(MIF)、IL-16、IL-17(一种引发细胞因子产生的因子，它能够诱导上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞产生细胞因子)以及IL-18。
趋化因子是细胞因子的一个家族，它们是一类相对较小的化学吸引剂蛋白和多肽，能够刺激多种细胞的迁移和激活，例如白细胞的迁移(例如嗜菌细胞和淋巴细胞)。趋化因子在炎症反应和其他免疫应答中发挥作用。趋化因子被分为若干个家族，包括C趋化因子、CC趋化因子、CXC趋化因子以及CX3C趋化因子。它们是根据半胱氨酸(c)残基在分子中的数量和间距来命名的；C趋化因子有一个半胱氨酸，CC趋化因子有两个连续的半胱氨酸，CXC有两个半胱氨酸，之间以一个氨基酸残基分开，而CX3C趋化因子有两个半胱氨酸，之间以三个氨基酸残基分开。趋化因子与细胞表面上的多种趋化因子受体作用。参见Janeway和Travers，附录IV，680页，在此作为参考引入。
此外，趋化因子还能具有免疫调节活性，并与对癌症的免疫应答有关。例如，小鼠6Ckine/SLC是人类二级淋巴组织趋化因子(SLC)在小鼠体内的相似物，现在通常被称为CCL21，被发现能够在C-26结肠癌肿瘤细胞系中引发抗肿瘤反应。参见Vicari等，J.Immunol.2000；165(4)：1992-2000。人类CCL21以及其小鼠的对应物，6Ckine/SLC，属于CC趋化因子，它们能够与CCR7趋化因子受体作用。小鼠6Ckine/SLC(muCCl21)也被Vicari等人阐述为一种CXCR3趋化因子受体的配体。人类CCL21、小鼠muCCL21以及大量其他趋化因子都参与到例如树状细胞、T细胞和自然杀伤(NK)细胞等多种免疫系统细胞的调节之中。
Mig和IP-10是CXC趋化因子，它们能与与激活的T细胞相关的CXCR3受体发生作用。淋巴细胞趋化因子是一种C趋化因子，它能够与和T细胞及NK细胞相关的XCR1受体相互作用。不规则趋化蛋白是一种CX3C趋化因子，它能够与和T细胞、单核细胞、嗜中性白细胞相关的CX3CR1受体相互作用。
将由本发明的DNA组合物编码的尤其优选的免疫效应蛋白包括细胞因子IL-2(一种促红细胞生成素)、CCL21(一种趋化因子)以及CD40配体，例如CD40配体三聚体(CD40LT)，它是TNF家族的细胞因子。
人类IL-2的DNA和蛋白序列已经在GenBank中发布。目录编号BC070338的相关描述在此作为参考引入。小鼠IL-2的DNA和蛋白序列也已被GenBank收录。目录编号NM 008366的相关描述在此作为参考引入。
编码人类IL-2的核酸序列参见图12(SEQ ID NO：5)，其对应的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：6)参见图13。
人类CCL21的DNA和蛋白序列已在GenBank中发布。目录编号AB002409的相关描述在此作为参考引入。
编码人类CCL21的核酸序列参见图14(SEQ ID NO：7)，其对应的氨基酸残基序列(SEQ ID NO：8)参见图15。
人类CD40配体(CD40L)是一个261氨基酸的蛋白，它在其多数的活跃状态下以三聚体(CD40LT)的形式存在。编码人类CD40L(也称CD154)的DNA序列已在GenBank中发布。目录编号NM000074的描述在此作为参考引入(图16，SEQ ID NO：9)。CD40L的对应蛋白序列参见图17(SEQ ID NO：10)。
本发明的方法部分包括将包含编码豆荚蛋白的DNA构建体的DNA组合物施用于一种哺乳动物，其中，该DNA构建体在该哺乳动物的免疫细胞中可表达。优选地，这种哺乳动物是人类。根据组合物制备的特定剂型，该组合物可以通过口服、肌肉注射、鼻腔内、腹膜内、皮下、皮内或局部施用。优选地，该组合物以口服剂型制备，例如溶液、悬液、乳液、胶囊、药片等。
本发明的DNA组合物可以被用于向使用该复合物的患者提供肿瘤生长和/或肿瘤转移的长期抑制效果。在一种优选实施方案中，DNA组合物与抗肿瘤化疗药物配合使用。DNA组合物可以和肿瘤化疗药物以组合剂型的形式一起施用，或者，该组合物和化疗药物也可以以各自的剂型，按照根据该化疗药物的要理性质确定的各自的施用间隔施用。
能够用于和本发明的DNA组合物组合使用的化疗药物包括抗肿瘤药物如阿霉素、紫杉醇、一种环磷酰胺、鬼臼亚乙苷、5-氟尿嘧啶、甲氨喋呤等。
优选地，本发明的DNA组合物应以制药中可用的载体或赋形剂例如水、盐水、葡萄糖、甘油等进行制剂，其组合能够有助于该组合物的配制和给药。组合物也可包含辅助剂物质，例如润湿剂、乳化剂、缓冲液以及其他在制药领域广为人知的辅助物质。
优选地，本发明的组合物以口服的方式，以药用可接受的载体中的溶液或悬液的形式施用于例如人类的哺乳动物，其中的DNA浓度根据编码豆荚蛋白的DNA的重量计算，为每毫升约1到约10毫克。一种尤其优选的用于本发明DNA组合物的剂量是一种在适当的缓冲溶液中的减毒的用豆荚蛋白转染的细菌的悬浊液，能够制备成口服剂。组合物的恰当剂量决定于将被免疫接种的对象，决定于该组合物的活性，还部分地决定于施用或要求施用该组合物的医疗人员的判断。
施用于哺乳动物的剂量，以及如果需要多次给药时的时间安排，均根据不同的哺乳动物以及药剂类型而不同。有效剂量和给药时间安排可以按照本领域中已知的方法，通过临床剂量反应试验来经验性地决定。选定的剂量和给药时间安排应当能够在免疫细胞中产生能够引发该哺乳动物对表达豆荚蛋白的肿瘤相关巨噬细胞的免疫应答的足量的豆荚蛋白表达。优选地，施用于目标哺乳动物的本组合物的剂量能够诱发该哺乳动物的免疫细胞中产生足量的豆荚蛋白的表达，从而能够使对豆荚蛋白提呈肿瘤相关巨噬细胞的免疫应答维持至少一个月，例如，至少6个月或至少约一年。在一些优选实施方案中，施用于患者的用豆荚蛋白改造的细胞是用约0.3到约0.8μg豆荚蛋白DNA转染的约1×108个细胞。
本发明的组合物可以用适当的灭菌容器例如安瓿、瓶或小瓶，以多次剂量或单位剂量的形式包装。优选地，容器在装入本发明的DNA组合物后密封。优选地，组合物装入带有标签的容器中，其标签应标识该组合物类型，并按照政府机构，如美国食品药物监督管理局所规定的形式标明该组合物依照适用法律被批准使用的说明、剂量信息等。标签优选地包含对将该组合物施用于患者的卫生保健专业人员有用的关于该组合物的信息。优选地，包装也包含印刷的关于该组合物的给药、说明、适应症以及任何必需的警告的信息性资料。
以下示例用于进一步说明本发明的特征和实施方案，不具限定性。
材料和方法
动物、菌株和细胞系。雌性BALB/c和C57BL/6小鼠，年龄6-8周，购买自The Scripps Research Institute Rodent Breeding Facility。双减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株RE88(aroA-，dam-)获取自Remedyne公司，Goleta，CA。鼠CT-26结肠癌细胞系由I.J.Fidler博士(MD AndersonCancer Center)提供，鼠D121非小细胞肺癌细胞由L.Eisenbach博士(Weizmann Institute of Science，雷霍沃特，以色列)惠赠。鼠4T1乳腺癌细胞由Suzanne Ostrand-Rosenberg博士提供(马里兰大学)。
免疫组织化学分析。针对4T1肿瘤组织和Matrigel凝胶栓部分进行免疫组织化学分析。巨噬细胞的豆荚蛋白表达在4T1肿瘤组织部分的通过生物素酰化的大鼠抗小鼠CD68单克隆抗体(BDBiosciencePharmingen)识别，并使用携带GFP的抗生蛋白链菌素作为第二报告物。兔抗豆荚蛋白抗血清通过在大肠杆菌中制造的纯化的人类豆荚蛋白进行免疫化来制备(Ishii，Methods Enzymol.1994；244：604-615)。该反应通过携带德州红的抗生蛋白链菌素来可视化。此外，4T1肿瘤组织部分和Matrigel凝胶栓部分在固定后，使用MMP-9、VEGF、TGF-β和F4/80抗体(eBioscience，San Diego，CA)对4T1肿瘤组织部分染色，使用CD68和CD31抗体(BD Bioscience Pharmingen)对Matrigel凝胶栓部分染色。所有组织部分均使用带有德州红或GFP的抗生蛋白链菌素作为第二报告物来可视化，玻片使用共聚焦显微镜(Bio-RadLaboratories)的激光扫描进行分析。所有图片均使用一台SPOTTM冷却的彩色数字摄像系统(Diagnostic Instruments.Inc)拍摄。
免疫化和肿瘤细胞攻击。预防学模型：BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠均被分为三个实验组(n＝8)，并分别使用PBS、空载体或pUb-豆荚蛋白转染的鼠伤寒沙门氏菌免疫化。在最后一次免疫化后1周，所有小鼠都静脉注射(i.v.)约5×104 CT-26细胞(BALB/c)、约2×105 D121细胞(C57BL/6)或通过乳腺脂肪垫注射约7×103 4T1细胞(BALB/c)，用以引发实验性或自发性肺转移。在肿瘤细胞攻击后的第24天测定实验组和对照组的肺重量。治疗模型：BALB/c小鼠被分为三个实验组(n＝8)，首先在第0天向脂肪垫注射约7×103 4T1细胞，然后使用本发明的DNA组合物在第3、7、11天免疫化3次。24天后，原发肿瘤被切除以测定小鼠的肺重量和转移评分或小鼠生存率。
CD4+或CD8+T细胞的体内去除，细胞毒性以及ELISPOT法。在体内对CD4+或CD8+T细胞的去除按照前面所述的方法完成(Ceredig等，1985，Nature 314：98-100)。细胞毒性通过前述的(Zhou等，2005，Blood 106：2026-2032)标准的51Cr释放法测量并计算。ELISPOT法使用ELISPOT试剂盒(BD Bioscience Pharmingen)根据生产商提供的方法完成。
体内Matrigel血管再生实验。Matrigel凝胶被用于测定免疫接种后对血管再生的抑制作用。简单而言，在最后一次免疫接种2周后，采用皮下注射(s.c.)将包含有VEGF或bFGF-2(约200ng/栓)和事先经过1000格雷(约100,000拉德)伽玛辐射处理的4T1肿瘤细胞(约5×103/栓)减少了生长因子的Matrigel(BD Bioscience)注射到小鼠的胸骨区域。在Matrigel植入后6天后，通过静脉注射带有荧光素(VectorLaboratories)的Bandiera simplofica外源凝集素I(同工凝集素B4)对内皮染色。该操作的同时，也对对照动物的内皮染色。约30分钟后，处死小鼠，提取出Matrigel凝胶栓，并通过荧光计测定荧光值。此外，Martigel凝胶栓在置入6天后移除，在包氏液中固定24小时，然后用石蜡包埋。所有组织被切片，装上玻片并用Masson三色染色。所有图片均使用前述的一台SPOTTM冷却的彩色数字摄像系统拍摄。
流式细胞计数(FACS)。T细胞的激活标记物用一台BDBiosciences
Figure G2007800454750D00241
分析仪使用双色流式细胞计数法分析。DC细胞标记物通过对从成功接种的小鼠和对照小鼠中新分离出的淋巴细胞染色来分析，这些小鼠带有抗CD11c抗体以及带有FITC的抗CD40、CD80和MHC II类抗原的抗体。有高水平CD206和F4/80的巨噬细胞使用双色流式细胞技术法定量。肿瘤细胞分离自成功接种的BALB/c小鼠，并使用带有PE的抗CD206抗体(Cell Science，Inc.)、带有APC的抗F4/80抗体以及带有FITC的抗豆荚蛋白抗体染色，并继以FACS分析。所有抗体购买自Pharmingen，San Diego，CA。IFN-γ在细胞内水平上的释放通过在一次免疫后3天取得，并用带有APC的抗CD8抗体染色的派氏集合淋巴结测定。细胞被固定、透性化，随后用标记有PE的抗IFN-γ抗体染色，以检测IFN-γ的细胞内表达。
迁移实验。细胞迁移实验通过使用改造的博伊登室(Transwell，Corning Inc.，Corning，NY)进行。肿瘤细胞从治疗或对照组的小鼠中获取，并进行跨孔迁移实验。在培养4小时候，孔的下表面的细胞使用1％的多聚甲醛固定，使用1％的结晶紫染色并计数(Shi等，2004，Mol.Cancer Res.2：395-402)。
统计分析。实验组和对照组的结果的统计差异显著性使用t检验计算。当双尾P值＜0.05时，结果被认为是存在明显差异的。Kaplan-Meier分析被用于评估小鼠的存活。
实施例1
载体构建、蛋白表达和使用DNA质粒对鼠伤寒沙门氏菌的改造。基于一个pCMV载体制备了两个构建体，pCMV载体可以从Invitrogen，Carlsbad，CA购买得到。pUb-豆荚蛋白构建体包含多聚泛素化的全长的鼠豆荚蛋白。全长的鼠豆荚蛋白DNA(Full-length legumain murinelegumain DNA)的核苷酸序列如图10所示，SEQ ID NO：3(鼠豆荚蛋白的氨基酸残基序列如图11所示，SEQ ID NO：4)。空载体构建体作为对照。鼠豆荚蛋白是用RNA作为模板，使用PCR提取自4T1乳腺癌细胞的。表达载体基于包含在豆荚蛋白序列前方克隆的多聚泛素序列的pCMV-cyto载体(Invitrogen)构建。多聚泛素化的鼠豆荚蛋白的核酸序列如图18所示(SEQ ID NO：11)。泛素化的鼠豆荚蛋白的氨基酸残基序列如图19所示(SEQ ID NO：12)。豆荚蛋白的蛋白表达通过Western印迹法显示，使用多克隆兔抗鼠豆荚蛋白抗体以及抗鼠β-肌动蛋白(Santa Cruz Biotechnology，Inc)作为内参。特定的蛋白通过使用带有山羊-抗兔-HRP的IgG抗体(Bio-Red Laboratories)检测。减毒的鼠伤寒沙门氏菌通过电穿孔法使用DNA疫苗质粒转导，该方法如Luo等，2003，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 100：8850-8855和Xiang等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 97：5492-5497所述。
实施例2
免疫原性鼠豆荚蛋白片段。两个质粒，每个都包含一个编码三个免疫原性豆荚蛋白片段，且片段之间以三氨基酸间隔(AAY)相连的豆荚蛋白小基因，通过将豆荚蛋白小基因插入pCMV/myc/ER MCS质粒来制备，其中pCMV/myc/ER MCS质粒可从Invitrogen，Carlsbad，CA购得(参见图20和21)。该载体包含一个编码ER信号肽的区段，一个myc表位和一个ER滞留信号(参见图21)。小基因被插入到一个ER信号肽区段的BssH II位点和一个Xho I位点之间，如图21所示。第一个豆荚蛋白小基因质粒(pCMV-Db/Dd；在图中也称作pH-2Dd)由一个AAY间隔、免疫原性豆荚蛋白片段legu137、一个AAY间隔、免疫原性豆荚蛋白片段legu238、一个AAY间隔，和免疫原性豆荚蛋白片段legu223构成。第二个豆荚蛋白小基因质粒(pCMV-Kb/Kd；在图中也称作pH-2Kd)由一个AAY间隔、免疫原性豆荚蛋白片段legu405、一个AAY间隔、免疫原性豆荚蛋白片段legu180、一个AAY间隔，和免疫原性豆荚蛋白片段legu229构成。图20显示的是免疫原性豆荚蛋白片段的氨基酸残基序列，以及每个片段的MHC I类结合评分和序列识别号(SEQ ID NO)。肽的表达通过使用单克隆抗myc抗体(Invitrogen)对转染的COS-7细胞进行Western印迹验证。一旦肽的表达被验证，一个结束密码子立即被引入到该载体的myc表位序列的前方。每个生成的小基因质粒载体(pCMV-Db/Dd和pCMV-Kb/Kd)均使用核苷酸测序验证，然后使用电穿孔法转染到减毒RE88鼠伤寒沙门氏菌中，以便将编码豆荚蛋白小基因的本发明的DNA组合物置入。如下详述，这些组合物对于攻击BALB/c小鼠中的4T1和D2F2乳腺癌是有效的。观察到的肿瘤保护反应是经过CD8T细胞介导的，它特异性地杀灭豆荚蛋白+肿瘤相关巨噬细胞，从而明显地抑制肿瘤血管再生。
口服免疫和肿瘤细胞攻击。各组BALB/c小鼠(n＝8)以1周为间隔，3次口服100μl包含约5×108CFU带有空载体、pCMV-Db/Dd质粒或pCMV-Kb/Kd质粒的双减毒鼠伤寒沙门氏菌的PBS。在最后一次治疗的2周后，小鼠通过静脉注射或皮下注射D2F2癌细胞系进行攻击。
细胞毒性实验。细胞毒性使用前面所述的标准51Cr释放法测定。特定靶细胞的溶解百分比使用公式[(E-S)/(T-S)]×100计算，其中E是平均实验性释放量，S是平均自发性释放量，T是平均总释放。
ELISPOT法。在D2F2肿瘤细胞攻击后2周，从所有BALB/c小鼠实验组中收集脾细胞，并使用辐射过的(1000Gy)4T1细胞或来自新鲜4T1乳腺癌组织的4T1细胞培养24小时。本实验根据制造商(BDBioscience，San Jose，CA)提供的操作说明进行。
抗血管生成活性的测定。对血管生成的抑制效果通过前述的Matrigel法测定。Matrigel凝胶中的血管生长通过使用Drabkin试剂(包含1g/L NaHCO3、0.05g/L KCN和0.2g/L K3Fe(CN)6的水溶液)测定血红蛋白的浓度来检测。在Matrigel置入6天后将Matrigel凝胶栓移除，并在Bouin溶液中固定(15份重量的饱和苦味酸水溶液，5份重量的37％福尔马林水溶液以及1份重量的冰醋酸)24小时，然后在石蜡中包埋。所有组织被切片并置于玻片上，使用Masson三色染色。所有图片均使用SPOTTM冷却彩色摄像系统拍摄。使用本发明的小基因方法，同源BALB/c小鼠，抗TAM小基因DNA组合物同时抑制了肿瘤生长和血管生成。6个豆荚蛋白免疫原性的肽被评定为H-2Dd-1，2，3，或H-2Kd-1，2，3-限制性基因，这是根据NIH网站上的BioInformatics &Molecular Analysis部分关于这些MHC I类抗原分子的结合预测的内容评定的。使用
Figure G2007800454750D00261
软件预测这些肽的氨基酸序列和它们的结合活性(DNAStar，Inc.，Madison，WI)的结果如图20所列。
pCMV-Kb/Kd小基因疫苗保护小鼠免受D2F2乳腺癌肿瘤细胞的攻击，并阻止肺转移。起初，小基因DNA组合物使用预防学乳腺癌模型来检验，其中小鼠首先使用该小基因组合物进行免疫接种，然后皮下注射鼠D2F2乳腺癌细胞进行攻击(图22)。使用pCMV-Kb/Kd接种过的BALB/c小鼠中观察到了显著的肿瘤生长抑制，而接种pCMV-Db/Dd的小鼠中则没有观察到。作为对照，所有仅使用空载体对照载体接种的小鼠均有明显的皮下注射肿瘤生长。
pCMV-Kb/Kd豆荚蛋白小基因疫苗通过攻击TAM来抑制肺部D2F2转移，此效果已经通过在最后一次免疫接种后接受静脉注射D2F2肿瘤细胞攻击的BALB/c小鼠体内显著的实验转移抑制效果得到证实。与此相比，pCMV-Db/Dd确实在这一模型中阻止了转移。仅使用空载体对照进行免疫的小鼠体内一致出现了快速的肺部肿瘤生长(图23)。
小基因疫苗诱导CTL反应，它能够杀灭豆荚蛋白+细胞。为了描述在小基因免疫接种后产生的特定的T细胞反应，通过被激活T细胞的特异性IFN-γ释放来展示了T细胞的激活(图24，B部分)。这些细胞均使用来自新鲜4T1肿瘤组织的通过流式细胞法被表明能够高度表达豆荚蛋白的细胞激发(图24，A部分)。重要地，细胞毒性测试明确地显示，仅在免疫过的小鼠中存在显著的CTL活性。靶细胞是鼠类噬菌体细胞系RAW的细胞，它们使用IL-4、IL-10和IL-13细胞因子处理过，用以诱导豆荚蛋白的表达。这也通过Western印迹法得到了确认(图25，A部分)，其中显示野生型RAW细胞为豆荚蛋白隐形。用空载体处理过的从对照组小鼠中分离的脾细胞也显示出类似的RAW细胞的背景杀灭，无论其豆荚蛋白的表达是阳性或是阴性(图25，B部分)。然而，来自pCMV-Kb/Kd处理过的小鼠的脾细胞对豆荚蛋白+靶细胞则引发的杀灭效果，比来自pCMV-Db/Dd或空载体处理过的小鼠的脾细胞引发的杀灭效果明显更强(图25，B部分)。这些数据表明了pCMV-Kb/Kd小基因引发的CTL活性的特异性以及其能够特异性地杀灭豆荚蛋白+巨噬细胞的能力。
pCMV-Kb/Kd小基因疫苗诱导抗血管生成效应。为了验证抗血管生成在pCMV-Kb/Kd疫苗引发的肿瘤保护中发挥关键作用的程度，使用了Matrigel凝胶法，其中，使用重组bFGF在Matrigel凝胶中诱导血管生成。不同的处理组之间血管生成的差异通过测定从免疫化的小鼠或对照组小鼠体内取出的Matrigel凝胶栓提取物中的血红蛋白(Hb)的相对浓度来定量分析。因因此，使用pCMV-Kb/Kd疫苗处理的小鼠体内的Hb平均相对浓度显示出明显的减少(图26，A部分)。此外，当使用Masson三色染色对免疫化的小鼠和对照组小鼠的Matrigel凝胶部分分析时，来自空载体对照组小鼠体内的凝胶部分中发现了丰富多样的血管。与此相比，使用pCMV-Kb/Kd处理过的小鼠的Matrigel凝胶部分中的血管则明显被减少了(图26，B部分)。这些数据显示，使用pCMV-Kb/Kd疫苗的免疫化操作导致了肿瘤血管的减少。综上，这些发现表明，pCMV-Kb/Kd小基因组合物引发了明显的抗血管生成效果，该效果能够从预防的角度减少D2F2乳腺癌细胞对BALB/c小鼠的攻击。
在各自的实验里，在同源C57/BL小鼠中使用D121非小细胞肺癌细胞，pCMV-Kb/Kd和pCMV-Db/Dd组合物均提供了有效的抗TAM免疫应答。
讨论
豆荚蛋白可以作为杀灭肿瘤恶化过程中过量表达的TAM的靶点。众所周知，TAM在肿瘤恶化和转移中有重要作用。因此，以这些M2巨噬细胞作为靶点是一个崭新的抗肿瘤策略。豆荚蛋白最初被确认为TAM的一个重要标记分子，因为它在肿瘤微环境以及基质中的TAM中高度表达。TAM分离自小鼠4T1乳腺癌细胞。流式细胞法(FACS)显示，豆荚蛋白在CD206和F4/80双阳性M2巨噬细胞中高度表达，在与脾中正常的M1巨噬细胞相比时尤其明显(图1，B部分)。这一结果也通过免疫组织化学分析得到了验证，此分析表明，TAM可以使用H/E染色来可视化，而过量表达的豆荚蛋白则使用抗豆荚蛋白抗体(Ab)(绿色)与抗CD68抗体(红色)进行双染色来显示(图1，A部分)。这些数据显示，浸润TAM是4T1肿瘤组织中的一类不均衡的大细胞群体，而豆荚蛋白是潜在的用于杀灭TAM的有效靶点。
使用Th2细胞因子诱导豆荚蛋白在TAM中的表达。一种小鼠细胞系，RAW，在与这些细胞因子共同培育后，被用于评定诸如IL-4、IL-10和IL-13的Th2细胞因子诱导豆荚蛋白在TAM中的表达的程度。在这些RAW细胞中观察到了RAW细胞对CD206+和F4/80+表达的明显增加，同时伴随有豆荚蛋白的上调(图1，C部分)。这些结果通过Western印迹法验证(图1，D部分)。没有证据表明肿瘤细胞系在与这些相同的细胞因子共同培育时对豆荚蛋白的表达。这些发现表明，Th2细胞因子，例如IL-4、IL-10和IL-13，是由肿瘤和其他肿瘤基质细胞释放并在肿瘤微环境中积累的。在这一环境中，细胞因子可以潜在地诱导M1巨噬细胞向带有M2表现型的群体增殖和转变，而后者过量表达豆荚蛋白。
以TAM为靶点能抑制肿瘤恶化。肿瘤的生长和转移与TAM的存在高度协调，因而，以这些巨噬细胞子群体为靶点能够抑制肿瘤的生长和转移。制备一种编码豆荚蛋白的DNA的表达载体，并用它来引发针对这些TAM的免疫应答。减毒鼠伤寒沙门氏菌细菌(RE88菌株)使用一种编码豆荚蛋白的质粒载体被转染，用以提供将豆荚蛋白DNA送达免疫细胞的载体。通过将空的质粒载体掺入相同的减毒细菌菌株中来制备一种对照组合物。图2的A部分简要描绘了一种基于pCMV/myc/cyto载体骨架的载体构造图，其包含有编码豆荚蛋白的DNA。编码豆荚蛋白的基因被融合到变异的多聚泛素(pLegumain)的C末端，用于提高蛋白酶体的抗原提呈。接下来，整个片段被插入到质粒的PstI和NotI保守位点之间。豆荚蛋白的表达使用Western印迹法显示。在预防学和治疗学的实验设置中，使用本发明的基于豆荚蛋白的DNA组合物来减少TAM的数量均在小鼠这一模型中有效地抑制了自发性4T1乳腺癌转移和D121非小细胞肺癌及CT26结肠癌的转移。
在预防学实验设置中，C57BL/6J小鼠使用磷酸缓冲盐溶液(PBS，对照组1)、包含空载体的减毒鼠伤寒沙门氏菌(对照组2)或本发明的DNA组合物(pLegumain转染的减毒鼠伤寒沙门氏菌；治疗组)进行免疫化。最后一次免疫化1周后，这些小鼠通过静脉注射使用约2×105 D121非小细胞肺癌细胞进行攻击。在其24天后，测定和分析肺转移。在两个对照组中，平均非重量明显高于治疗组的数值(图2，B部分)。同源BALB/c小鼠的CT26结肠癌模型和4T1乳腺癌模型中也得到了类似的结果(图2，B部分)。
在更加苛刻的治疗模型设置中，BALB/c小鼠首先使用4T1乳腺癌细胞攻击，然后使用基于pLegumain的DNA组合物(治疗组)、PBS(对照)或空载体(对照)进行3次免疫化，如前所述，并手术切除原发肿瘤。对照组和治疗组的生存曲线表明，75％(6/8)的被pLegumain免疫的小鼠生存了3个月。与之相比，对照组中的小鼠均在1个月内死亡(图2，C部分)。这些数据表明，本发明基于豆荚蛋白的DNA组合物在小鼠4T1乳腺癌、D121非小细胞肺癌和CT-26结肠癌模型中有效地抑制了肿瘤生长和转移。在这些非常富有挑战性的小鼠肿瘤治疗模型中，通过与外科手术相结合，此方法能通过抑制肿瘤细胞转移明显延长小鼠的生存期。
以豆荚蛋白为靶点能够引发肿瘤基质中能够减少TAM群体的特殊CD8+CTL反应。针对豆荚蛋白的免疫化引发针对高度表达该天冬酰胺肽链内切酶的TAM的特殊T细胞反应。该特殊T细胞反应通过51Cr释放法显示，其中从成功地使用本发明的DNA组合物免疫化了的小鼠中提取的脾细胞能有效杀灭RAW巨噬细胞，这些巨噬细胞在使用细胞因子IL-4、IL10和IL-13培养后高水平表达豆荚蛋白。相同的脾细胞不能引发不表达豆荚蛋白的细胞的细胞毒性杀灭(图3，A部分)，这表明T细胞对豆荚蛋白的这一反应具有高度特异性。此外，在51Cr释放法中使用豆荚蛋白转染的细胞作为靶点也得到了相同的结果(图7)。此外，图3的B部分描绘的结果展示了在使用本发明的基于豆荚蛋白的DNA组合物治疗后，F4/80+/CD206+巨噬细胞群体显著减少。这些数据也通过免疫组织化学染色得到了验证，如图3的C部分所示。
MHC I类限定性CD8+CTL对TAM尤其有活性。我们不希望被理论所束缚，据信，被转染的细菌会被肠道中的派氏集合淋巴结获取，其中豆荚蛋白DNA被引入免疫细胞中，例如巨噬细胞和树状细胞(DC)，接下来，树状细胞会表达豆荚蛋白DNA。在成功免疫化的小鼠中找到的派氏集合淋巴结中的DC被发现在疫苗接种pLegumain后3天仍然活跃，正如被上调的DC激活标记物CD40、CD80和MHC-I所表明(图4，A部分)。CD8+T细胞的激活也被发现对豆荚蛋白具有特异性，这可以从来自成功接种的小鼠的脾中INF-gamma和CD8的双染色(图4，B部分)以及由豆荚蛋白阳性细胞刺激而激活的T细胞的INF-gamma释放(图4，C部分)得到证实。此外，CD4+或CD8+T细胞的体内免疫去除也表明，鉴于仅仅CD8+T细胞去除能够消除杀灭效果，因此只有CD8+T细胞在TAM的特异性细胞毒性杀灭中起到关键作用。这一特异性的细胞毒性是MHC I类抗原限定性的，这是因为杀灭作用能够被抗H-2Dd/H-2Kd抗体特异性地抑制(图4，D部分)。综上所述，这些结果表明，本发明基于豆荚蛋白的DNA组合物首先激活派氏集合淋巴结中的DC，然后这些细胞通过MHC I类抗原通路将豆荚蛋白肽提呈到激活的CD8+T上的T细胞受体(TCR)，从而导致灭除TAM的特异性细胞毒性CD8+T细胞反应。
肿瘤基质中TAM的灭除能够减少肿瘤生长因子和促血管生成因子的释放，并能抑制肿瘤细胞的迁移和转移。TAM能够通过几种途径影响肿瘤的转移，这是因为它们能够分泌多种类型的肿瘤生长因子、促血管生成因子和能够诱导肿瘤血管生成和肿瘤迁移和转移的肿瘤相关酶。为了评估TAM的去除能够在多大的程度上减少这些其中的一些因子的释放，我们从接种疫苗的小鼠和其他合适的对照动物中收集它们的血清和肿瘤组织细胞。新分离的肿瘤细胞经过培养，分别在24小时后和48小时候收集其上清液。用于定量TNF-alpha、VEGF和TGF-beta的ELISA表明，在肿瘤细胞上清液和血清中，TNF-alpha和VEGF均被明显的减少。TFG-beta则仅在细胞上清液中被减少，在血清中则没有(图5，A部分)。
免疫组织化学染色也证实了这些因子在肿瘤组织中的表达的减少(图5，B部分)。此外，通过对比治疗组和对照组的转移和入侵实验结果，也观察到肿瘤细胞迁移的明显减少(图5，C部分)。这一结果表明，在疫苗诱导并由TAM的减少导致的肿瘤微环境改变后，肿瘤细胞的性质发生了变化。形成肿瘤转移的能力通过测定转移评分以及在治疗模型设置中切除原发肿瘤24天后的肺部重量的体内实验得到验证。接受治疗的小鼠的转移评分和肺重量与两个对照组相比均明显减少(图5，D部分)。
肿瘤基质中TAM的去除导致肿瘤血管生成的减少。在去除肿瘤基质中的TAM后，观察到了明显的抗血管生成效应，这可能部分地归源于这些M2巨噬细胞能够产生多种促血管生成因子。通过使用FITC标记的同工凝集素B4染色内皮来定量，使用Matrigel凝胶实验检测到体内的新血管生成。这些结果明确的显示，在使用本发明的DNA组合物进行免疫接种后，血管生长被明显地减少了(图6，B部分)。与使用豆荚蛋白DNA组合物治疗的小鼠相比，在对照组被使用空载体免疫化小鼠中取出的Matrigel凝胶栓中则观察到了高出很多的血管数量，这是通过数字成像和Masson三色染色来测定的(图6，A部分)。此外，也通过免疫化学组织学实验对实际迁移到Matrigel凝胶栓中的细胞的类型进行了确定。共聚焦显微镜图像表明，表达CD31的内皮细胞或表达CD68的巨噬细胞在可观的程度上生长或迁移到了空载体对照组的Matrigel凝胶栓中，而在治疗组中这一程度则明显弱得多(图6，C部分)。
表达豆荚蛋白的转基因肿瘤细胞是使用本发明DNA组合物免疫化的小鼠的脾细胞中的靶点。在模型研究中，使用含有豆荚蛋白粒的逆转录病毒稳定转染4T1细胞系，被转染的4T1细胞系被用作靶细胞(图7，A部分，左边的照片放大率为5×，右边的照片放大率为35×)。显微照片图像于转染后2天拍摄。阳性细胞在图7的A部分中以箭头标明(The positive cells are indicated by arrows inf FIG.7，PanelA.)。一次51Cr释放法的数据如图7，B部分所示。从pLegumain DNA组合物免疫化的小鼠中分离出的脾细胞能够有效杀灭用豆荚蛋白转染的4T1细胞(*P＜0.01，与空载体对照组相比)。肿瘤特异性T细胞介导的杀灭对豆荚蛋白是特异性的，这是因为4T1细胞缺少豆荚蛋白表达，它们不被溶解。
本发明提供一种新的肿瘤治疗模式，即通过肿瘤基质中TAM浓度的减少来减少增强肿瘤生长和血管生成的因子的释放，该方法能够改变肿瘤微环境，并明显抑制肿瘤细胞的增殖、血管形成和转移。以肿瘤基质中的TAM为靶点可能引起顾虑：这些细胞的去除可能会影响到这些自身免疫系统的重要成分的正常免疫功能，但这并不会发生。
循环单核细胞是能够分化为多种特异性巨噬细胞类型的多功能前体。事实上，细胞因子环境会极大地影响组织巨噬细胞的分化和功能。由细菌产物和Th1细胞因子激活的巨噬细胞被认为是M1表现型的，即经典激活的具有高细菌活性和对肿瘤细胞的高毒性作用的巨噬细胞。与此相比，由Th2细胞因子激活的巨噬细胞，如IL-4、IL-13，或免疫抑制因子，如维他命D3和IL-10，被归入M2表现型一类，它们具有弱细胞毒性作用和高组织改变活性。
M1细胞具有免疫刺激活性，并保护宿主免受病原性感染，而M2细胞则弱化急性感染反应，有力地清除细胞残渣，并分泌修复受伤组织必须的多种促生长和血管生成因子。此外，从健康或发炎组织中获取的巨噬细胞能够溶解肿瘤细胞、表达免疫刺激细胞因子，且能提呈肿瘤相关抗原以诱导T和NK细胞的增殖和抗肿瘤功能。如TAM的M2巨噬细胞则表现出较弱的上述功能。这可能是因为它们暴露于来自肿瘤的抗发炎分子，例如IL-4、IL10、TGF-beta1和前列腺素E2。事实上，Mantovani及其同事曾提出，暴露于IL-4和IL-10可能会诱导肿瘤组织中的单核细胞发育成分化的II型或M2巨噬细胞(Mantovani等，2002，Trends Immunol.23：549-555)。
根据已有研究的进展，分化的成熟TAM的表现型和功能与II型巨噬细胞相似(Mantovani等，2004，Eur.J.Cancer 40：1660-1667)。因此，在肿瘤微环境中存在的细胞因子有可能能促进新的单核嗜菌细胞的分化并确定其分化方向。事实上，越来越多的证据表明，TAM在肿瘤微环境中是偏向M2巨噬细胞的，且产生多种促肿瘤生长和血管生成因子以及免疫制疫力分子。因此，肿瘤中TAM的存在以及其产物的持续表达和释放可能会有利于而不是组织肿瘤的恶化和转移。
TAM在暴露于IL-4和IL-13后充分地表达CD206，这是一种在M2巨噬细胞中被上调的甘露糖受体(Porcheray等，2005，Clin.Exp.Immunol.142：481-489)。如本文所述，这类巨噬细胞群体高度表达豆荚蛋白。重要地，Th2细胞因子IL-4、IL-10和IL-13上调CD206和豆荚蛋白在巨噬细胞细胞系RAW中的表达。这一发现的最佳理解是，巨噬细胞来自外周血，当它们进入到含有肿瘤细胞和肿瘤基质细胞分泌的IL-4、IL-13和IL-10的肿瘤中时，分化成为M2巨噬细胞(Stein等，1992，J.Exp.Med.176：287-292)。因此，以表达豆荚蛋白的M2巨噬细胞为靶点不仅有益于对肿瘤生长和转移的遏制，还能维持M1表现型的巨噬细胞的正常功能。
TAM的浸润和肿瘤病人的预后之间的关系也已经被多次研究，其结论是，巨噬细胞的浸润越多，预后越差(参见例如Wyckoff等，2004，Cancer Res.64：7022-7029)。多条线索表明，肿瘤基质中的肿瘤细胞和TAM之间存在共生的关系，其中癌细胞系因TAM并维持它们的生存，而TAM则通过产生重要的生长因子和细胞外基质酶来对肿瘤生成的分子做出反应。这依次刺激肿瘤增殖、血管生成以及侵入周边组织(参见例如Wyckoff等2004，Cancer Res.64：7022-7029)。因此，减少肿瘤环境中的TAM提供了一种能够改变肿瘤基质结构和改变肿瘤微环境的有效策略。
本发明的DNA组合物能够引发对豆荚蛋白的有力的CTL反应，其中豆荚蛋白是一种天冬酰胺肽链内切酶，该酶具有应激蛋白的功能，并被TAM高度过表达。抗豆荚蛋白免疫应答被表明是MHC-II类抗原限定性的和CD8+T细胞特异性的。重要地，本发明显示，在使用本发明的基于豆荚蛋白的DNA组合物免疫化后，双阳性CD206+和F4/80+巨噬细胞的浓度，即TAM的浓度，显著降低。此外，TAM释放的多种因子如VEGF、MMP-9和TGF-beta均被表明在培养的肿瘤细胞的上清以及小鼠血清中低水平存在。众所周知，VEGF和金属蛋白MMP-9在肿瘤血管系统的生成和肿瘤血管生成的初始化过程中发挥着重要作用。TAM在这一点上意义重大，因为它们能产生VEGF和MMP-9。日益增强的血管生成与被上调的VEGF和如MMP-9的细胞外蛋白酶的表达相关，其中TGF-beta已知是参与肿瘤细胞向血管迁移的过程的重要生长因子。事实上，TGF-beta能向肿瘤细胞提供增殖和抗血管生成信号，并能激活尿激酶类血浆酶原激活剂(uPA)，这些激活剂可能会有助于血管攻击发生所必需的细胞外基质破碎。
重要地，本发明表明，一旦TAM被特定的CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)从肿瘤组织中去除，肿瘤细胞就会改变它们的性质，其恶性和扩散性均会减弱。肿瘤组织中新生血管的生成也会被本发明的DNA组合物的治疗有力地减少。此外，TAM也被报道参与肿瘤微环境中的免疫抑制和耐受，而且通过经由NO、PGs、TNF-alpha的释放的上调引发的细胞凋亡以及精氨酸酶活性，它还能抑制T细胞反应(参见例如Saio等，2001，J.Immunol.167：5583-5593)。在TAM被去除后，特异性CD8+T细胞活性被明显上调，进一步表明本发明的抗TAM方法可以提供一种解除对肿瘤的免疫耐受性的策略。
在4T1自发性小鼠乳腺癌转移模型中，取得了令人惊讶的生存期的增加，在外科切除原发肿瘤后使用本发明的基于豆荚蛋白的DNA组合物进行治疗，75％(8只中的6只)的小鼠在4T1肿瘤细胞接种到乳腺中后生存了3个月。更出乎意料的是，62％(8只中的5只)的小鼠没有发生肺转移。另外两种肿瘤模型的预防学设置中也获得了类似的结果，即在D121非小细胞肺癌和CT-26结肠癌中。这些额外的炎症性数据表明，以TAM为靶点更改肿瘤微环境，是一种潜在的通用抗肿瘤策略，它能够通过降低TAM释放的能够促进肿瘤生长和血管生成的因子的浓度来抑制肿瘤攻击和转移。
在实施例2中，带有ER信号的哺乳动物表达载体(pCMV/Myc/ER)被用于构造本发明的小基因DNA组合物。ER信号肽将蛋白送达分泌室中。载体也包含一个能够保持内质网(ER)中蛋白的C末端肽。由DNA组合物编码的这个肽在肠道免疫细胞的内质网中被处理，然后与MHC I类抗原的结合位点结合，从而最终被提呈到T细胞受体，进而在表达豆荚蛋白的小鼠体内引发针对TAM的豆荚蛋白特异性T细胞反应。这些构造创造了有效的小基因疫苗，它们能够诱导有效的针对小鼠肿瘤模型中不同器官肿瘤的CD8+T细胞反应。
在同源C57/BL小鼠中使用D121非小细胞肺癌进行的附加实验表明，pCMV-Db/Dd和pCMV-Kb/Kd构建体均提供有效的抗TAM免疫应答。与之相比，在BALB/c小鼠中D2F2细胞的实验结果则表明，pCMV-Kb/Kd构建体比pCMV-Db/Dd或pCMV-Kb/Kd构建体有效得多。对于这一发现的一种可能的解释是，能够与H-2Dd/Kd以更高的预测吸附性结合的豆荚蛋白肽的数量要比与H-2Dd/Kb分子结合的数量明显更多。根据NIH的BioInformatics & Molecular Analysis Section(BIMAS)，豆荚蛋白肽结合H-2Dd和H-2Kd的预测性评分要比H-2Db和H-2Kb的对应评分高得多，而H-2Kd的结合评分是最高的(图20)。
考虑到T细胞受体的类型几乎是无穷无尽的，可能存在远远更多的能够被BALB/c小鼠体内的CTL识别的肽-H-2Dd/Kd复合体。此外，H-2D肽的抗原性指数要比三种H-2K肽中的两种的高得多(图20)。基于这些数据，在抗TAM免疫应答方面，抗原性的预测能力要弱于MHC结合评分。本发明的基于豆荚蛋白的小基因组合物能通过攻击乳腺肿瘤模型中的TAM引发针对肿瘤的有效保护。由基于Kd的小基因疫苗引发的肿瘤保护能够导致对同源BALB/c小鼠体内D2F2乳腺癌微环境的攻击。这一保护性免疫应答被发现是由CD8+T细胞介导的，这类细胞能够特异性地杀灭豆荚蛋白+TAM，且也能明显抑制肿瘤血管生成。重要地，本发明的小基因构建体作为编码整个豆荚蛋白基因的疫苗，被证实具有类似的效力。类似地，基于Dd和Kd的构建体均在C57/BL小鼠体内的D121癌症细胞中产生抗TAM反应。综上所述，这些数据标志着第一个对于TAM有效的抗豆荚蛋白小基因组合物，而这一策略对于具有不同基因背景的不同个体尤其有用，因而提供了一种简单、更安全、更灵活的用于乳腺癌治疗的全基因疫苗策略替代方案。
在不脱离本发明的思想和新特点的情况下，可以对上述实施方案进行多种变化和修改。本文阐明的特定的实施方案的并不意味着或能推断出任何限制。
序列表
<110>REISFELD，Ralph A.
     XIANG，Rong
     LUO，Yunping
<120>用于引发对肿瘤相关巨噬细胞的免疫应答的DNA组合物
<130>TSRI 1215.1PCT
<150>PCT/US2007/021414
<151>2007-10-05
<150>US 60/849,927
<151>2006-10-06
<160>21
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>1302
<212>DNA
<213>人
<400>1
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<210>2
<211>433
<212>PRT
<213>人
<400>2
Met Val Trp Lys Val Ala Val Phe Leu Ser Val Ala Leu Gly Ile Gly
 1               5                  10                  15
Ala Val Pro Ile Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val
            20                  25                  30
Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp
        35                  40                  45
Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu
    50                  55                  60
Gln Ile Val Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Tyr Ser Glu Asp Asn
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Gln Gly Val Pro Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Gln Asn
            100                 105                 110
Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Ile Gly
        115                 120                 125
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Phe Thr Asp His Gly Ser Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Glu Asp
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Ala Ala Asn Pro Arg Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Lys
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Arg Ser Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp
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Asn Thr Asn Asp Leu Glu Glu Ser Arg Gln Leu Thr Glu Glu Ile Gln
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Tyr
<210>3
<211>1308
<212>DNA
<213>鼠
<400>3
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aacgggattc ctgacgagca gatcatagtg atgatgtatg acgacattgc caactctgaa 240
gaaaacccta ccccaggtgt tgtgatcaac cgacctaacg gcacagatgt atacaaggga 300
gtcctgaagg actacaccgg agaggatgtg actccagaga atttcctcgc cgtgctgaga 360
ggtgacgcag aagctgtgaa gggcaaaggg tctggaaaag tcttgaagag tggcccccga 420
gatcatgtct tcatttactt caccgaccac ggagccaccg ggatcctggt gtttcctaat 480
gatgatcttc atgtcaagga cctgaataag actattcgct acatgtatga acacaaaatg 540
taccagaaga tggtgttcta cattgaagct tgtgagtctg gctccatgat gaaccacctg 600
cccgacggca tcaacgttta tgcaactact gcggccaacc ccaaggagtc atcttatgcc 660
tgctactacg acgaggagag gggcacttac ctgggtgact ggtacagcgt caactggatg 720
gaagactccg atgtggagga cctgaccaaa gagacccttc acaagcagta ccacctggtc 780
aagtcccaca ccaacaccag ccatgtcatg caatatggga acaaatctat ctctaccatg 840
aaagtgatgc agtttcaggg aatgaagcac agagccagtt cccccatctc cctgcctccg 900
gtcacacacc ttgacctcac ccccagccct gacgtgcccc tgaccatctt gaagaggaag 960
ctgctgagaa ccaacgacgt gaaggaatcc cagaatctca ttgggcagat ccagcaattt 1020
ctggatgcca ggcacgtcat tgagaagtct gtgcacaaga tcgtttccct gctggcggga 1080
tttggggaaa ctgctgagag acatctgtca gagaggacca tgctcacagc acatgactgc 1140
taccaggagg ctgtaaccca cttccgcaca cactgcttta actggcactc tgtcacgtac 1200
gagcatgcct tgcggtactt gtatgtgctg gccaatctct gtgaggcacc atatccgatt 1260
gacaggatag agatggccat ggacaaagtg tgtcttagtc actactga              1308
<210>4
<211>435
<212>PRT
<213>鼠
<400>4
Met Thr Trp Arg Val Ala Val Leu Leu Ser Leu Val Leu Gly Ala Gly
 1               5                  10                  15
Ala Val Pro Val Gly Val Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp
            20                  25                  30
Val Val Ile Val Ala Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln
        35                  40                  45
Ala Asp Ala Cys His Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro
    50                  55                  60
Asp Glu Gln Ile Ile Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Asn Ser Glu
65                  70                  75                  80
Glu Asn Pro Thr Pro Gly Val Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp
                85                  90                  95
Val Tyr Lys Gly Val Leu Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro
            100                 105                 110
Glu Asn Phe Leu Ala Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly
        115                 120                 125
Lys Gly Ser Gly Lys Val Leu Lys Ser Gly Pro Arg Asp His Val Phe
    130                 135                 140
Ile Tyr Phe Thr Asp His Gly Ala Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn
145                 150                 155                 160
Asp Asp Leu His Val Lys Asp Leu Asn Lys Thr Ile Arg Tyr Met Tyr
                165                 170                 175
Glu His Lys Met Tyr Gln Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu
            180                 185                 190
Ser Gly Ser Met Met Asn His Leu Pro Asp Asp Ile Asn Val Tyr Ala
        195                 200                 205
Thr Thr Ala Ala Asn Pro Lys Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp
    210                 215                 220
Glu Glu Arg Gly Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met
225                 230                 235                 240
Glu Asp Ser Asp Val Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln
                245                 250                 255
Tyr His Leu Val Lys Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr
            260                 265                 270
Gly Asn Lys Ser Ile Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met
        275                 280                 285
Lys His Arg Ala Ser Ser Pro Ile Ser Leu Pro Pro Val Thr His Leu
    290                 295                 300
Asp Leu Thr Pro Ser Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Leu Lys Arg Lys
305                 310                 315                 320
Leu Leu Arg Thr Asn Asp Val Lys Glu Ser Gln Asn Leu Ile Gly Gln
                325                 330                 335
Ile Gln Gln Phe Leu Asp Ala Arg His Val Ile Glu Lys Ser Val His
            340                 345                 350
Lys Ile Val Ser Leu Leu Ala Gly Phe Gly Glu Thr Ala Glu Arg His
        355                 360                 365
Leu Ser Glu Arg Thr Met Leu Thr Ala His Asp Cys Tyr Gln Glu Ala
    370                 375                 380
Val Thr His Phe Arg Thr His Cys Phe Asn Trp His Ser Val Thr Tyr
385                 390                 395                 400
Glu His Ala Leu Arg Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Asn Leu Cys Glu Ala
                405                 410                 415
Pro Tyr Pro Ile Asp Arg Ile Glu Met Ala Met Asp Lys Val Cys Leu
            420                 425                 430
Ser His Tyr
        435
<210>5
<211>814
<212>DNA
<213>人
<400>5
atcactctct ttaatcacta ctcacagtaa cctcaactcc tgccacaatg tacaggatgc 60
aactcctgtc ttgcattgca ctaagtcttg cacttgtcac aaacagtgca cctacttcaa 120
gttctacaaa gaaaacacag ctacaactgg agcatttact gctggattta cagatgattt 180
tgaatggaat taataattac aagaatccca aactcaccag gatgctcaca tttaagtttt 240
acatgcccaa gaaggccaca gaactgaaac atcttcagtg tctagaagaa gaactcaaac 300
ctctggagga agtgctaaat ttagctcaaa gcaaaaactt tcacttaaga cccagggact 360
taatcagcaa tatcaacgta atagttctgg aactaaaggg atctgaaaca acattcatgt 420
gtgaatatgc tgatgagaca gcaaccattg tagaatttct gaacagatgg attacctttt 480
gtcaaagcat catctcaaca ctgacttgat aattaagtgc ttcccactta aaacgtatca 540
ggccttctat ttatttaaat atttaaattt tatatttatt gttgaatgta tggtttgcta 600
cctattgtaa ctattattct taatcttaaa actataaata tggatctttt atgattcttt 660
ttgtaagccc taggggctct aaaatggttt cacttattta tcccaaaata tttattatta 720
tgttgaatgt taaatatagt atctatgtag attggttagt aaaactattt aataaatttg 780
ataaatataa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa                             814
<210>6
<211>153
<212>PRT
<213>人
<400>6
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
 1               5                  10                  15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
            20                  25                  30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
        35                  40                  45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
    50                  55                  60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65                  70                  75                  80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
                85                  90                  95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
            100                 105                 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
        115                 120                 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
    130                 135                 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145                 150
<210>7
<211>852
<212>DNA
<213>人
<400>7
cttgcagctg cccacctcac cctcagctct ggcctcttac tcaccctcta ccacagacat 60
ggctcagtca ctggctctga gcctccttat cctggttctg gcctttggca tccccaggac 120
ccaaggcagt gatggagggg ctcaggactg ttgcctcaag tacagccaaa ggaagattcc 180
cgccaaggtt gtccgcagct accggaagca ggaaccaagc ttaggctgct ccatcccagc 240
tatcctgttc ttgccccgca agcgctctca ggcagagcta tgtgcagacc caaaggagct 300
ctgggtgcag cagctgatgc agcatctgga caagacacca tccccacaga aaccagccca 360
gggctgcagg aaggacaggg gggcctccaa gactggcaag aaaggaaagg gctccaaagg 420
ctgcaagagg actgagcggt cacagacccc taaagggcca tagcccagtg agcagcctgg 480
agccctggag accccaccag cctcaccaac gcttgaagcc tgaacccaag atgcaagaag 540
gaggctatgc tcaggggccc tggagcagcc accccatgct ggccttgcca cactctttct 600
cctgctttaa ccaccccatc tgcattccca gctctaccct gcatggctga gctgcccaca 660
gcaggccagg tccagagaga ccgaggaggg agagtctccc agggagcatg agaggaggca 720
gcaggactgt ccccttgaag gagaatcatc aggaccctgg acctgatacg gctccccagt 780
acaccccacc tcttccttgt aaatatgatt tatacctaac tgaataaaaa gctgttctgt 840
cttcccaccc gc                                                     852
<210>8
<211>134
<212>PRT
<213>人
<400>8
Met Ala Gln Ser Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Ala Phe
 1               5                  10                  15
Gly Ile Pro Arg Thr Gln Gly Ser Asp Gly Gly Ala Gln Asp Cys Cys
            20                  25                  30
Leu Lys Tyr Ser Gln Arg Lys Ile Pro Ala Lys Val Val Arg Ser Tyr
        35                  40                  45
Arg Lys Gln Glu Pro Ser Leu Gly Cys Ser Ile Pro Ala Ile Leu Phe
    50                  55                  60
Leu Pro Arg Lys Arg Ser Gln Ala Glu Leu Cys Ala Asp Pro Lys Glu
65                  70                  75                  80
Leu Trp Val Gln Gln Leu Met Gln His Leu Asp Lys Thr Pro Ser Pro
                85                  90                  95
Gln Lys Pro Ala Gln Gly Cys Arg Lys Asp Arg Gly Ala Ser Lys Thr
            100                 105                 110
Gly Lys Lys Gly Lys Gly Ser Lys Gly Cys Lys Arg Thr Glu Arg Ser
        115                 120                 125
Gln Thr Pro Lys Gly Pro
    130
<210>9
<211>1816
<212>DNA
<213>人
<400>9
cttctctgcc agaagatacc atttcaactt taacacagca tgatcgaaac atacaaccaa 60
acttctcccc gatctgcggc cactggactg cccatcagca tgaaaatttt tatgtattta 120
cttactgttt ttcttatcac ccagatgatt gggtcagcac tttttgctgt gtatcttcat 180
agaaggttgg acaagataga agatgaaagg aatcttcatg aagattttgt attcatgaaa 240
acgatacaga gatgcaacac aggagaaaga tccttatcct tactgaactg tgaggagatt 300
aaaagccagt ttgaaggctt tgtgaaggat ataatgttaa acaaagagga gacgaagaaa 360
gaaaacagct ttgaaatgca aaaaggtgat cagaatcctc aaattgcggc acatgtcata 420
agtgaggcca gcagtaaaac aacatctgtg ttacagtggg ctgaaaaagg atactacacc 480
atgagcaaca acttggtaac cctggaaaat gggaaacagc tgaccgttaa aagacaagga 540
ctctattata tctatgccca agtcaccttc tgttccaatc gggaagcttc gagtcaagct 600
ccatttatag ccagcctctg cctaaagtcc cccggtagat tcgagagaat cttactcaga 660
gctgcaaata cccacagttc cgccaaacct tgcgggcaac aatccattca cttgggagga 720
gtatttgaat tgcaaccagg tgcttcggtg tttgtcaatg tgactgatcc aagccaagtg 780
agccatggca ctggcttcac gtcctttggc ttactcaaac tctgaacagt gtcaccttgc 840
aggctgtggt ggagctgacg ctgggagtct tcataataca gcacagcggt taagcccacc 900
ccctgttaac tgcctattta taaccctagg atcctcctta tggagaacta tttattatac 960
actccaaggc atgtagaact gtaataagtg aattacaggt cacatgaaac caaaacgggc 1020
cctgctccat aagagcttat atatctgaag cagcaacccc actgatgcag acatccagag 1080
agtcctatga aaagacaagg ccattatgca caggttgaat tctgagtaaa cagcagataa 1140
cttgccaagt tcagttttgt ttctttgcgt gcagtgtctt tccatggata atgcatttga 1200
tttatcagtg aagatgcaga agggaaatgg ggagcctcag ctcacattca gttatggttg 1260
actctgggtt cctatggcct tgttggaggg ggccaggctc tagaacgtct aacacagtgg 1320
agaaccgaaa cccccccccc cccccccgcc accctctcgg acagttattc attctctttc 1380
aatctctctc tctccatctc tctctttcag tctctctctc tcaacctctt tcttccaatc 1440
tctctttctc aatctctctg tttccctttg tcagtctctt ccctccccca gtctctcttc 1500
tcaatccccc tttctaacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 1560
acacacacac acacacacac agagtcaggc cgttgctagt cagttctctt ctttccaccc 1620
tgtccctatc tctaccacta tagatgaggg tgaggagtag ggagtgcagc cctgagcctg 1680
cccactcctc attacgaaat gactgtattt aaaggaaatc tattgtatct acctgcagtc 1740
tccattgttt ccagagtgaa cttgtaatta tcttgttatt tattttttga ataataaaga 1800
cctcttaaca ttaaaa                                                 1816
<210>10
<211>261
<212>PRT
<213>人
<400>10
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
 1               5                  10                  15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
            20                  25                  30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
        35                  40                  45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
    50                  55                  60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65                  70                  75                  80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
                85                  90                  95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
            100                 105                 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
        115                 120                 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
    130                 135                 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145                 150                 155                 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
                165                 170                 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
            180                 185                 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
        195                 200                 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
    210                 215                 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225                 230                 235                 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
                245                 250                 255
Gly Leu Leu Lys Leu
            260
<210>11
<211>1533
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成的泛素化鼠豆荚蛋白
<400>11
atgcagatct tcgtgaagac cctgaccggc aagaccatca ccctagaggt ggagcccagt 60
gacaccatcg agaacgtgaa ggccaagatc caggataaag agggcatccc ccctgaccag 120
cagaggctga tctttgccgg caagcagctg gaagatggcc gcaccctctc tgattacaac 180
atccagaagg agtcaaccct gcacctggtc cttcgcctga gaggtggcac ctggagagtg 240
gctgtgcttc tcagcctggt gctgggtgct ggtgccgttc eegtcggtgt ggacgatccc 300
gaggatggag gcaagcactg ggtggtgatt gtggcgggct ccaatggctg gtataattac 360
cgacaccagg cagacgcatg ccacgcctac cagatcatcc accggaacgg gattcctgac 420
gagcagatca tagtgatgat gtatgacgac attgccaact ctgaagaaaa ccctacccca 480
ggtgttgtga tcaaccgacc taacggcaca gatgtataca agggagtcct gaaggactac 540
accggagagg atgtgactcc agagaatttc ctcgccgtgc tgagaggtga cgcagaagct 600
gtgaagggca aagggtctgg aaaagtcttg aagagtggcc cccgagatca tgtcttcatt 660
tacttcaccg accacggagc caccgggatc ctggtgtttc ctaatgatga tcttcatgtc 720
aaggacctga ataagactat tcgctacatg tatgaacaca aaatgtacca gaagatggtg 780
ttctacattg aagcttgtga gtctggctcc atgatgaacc acctgcccga cgacatcaac 840
gtttatgcaa ctactgcggc caaccccaag gagtcatctt atgcctgcta ctacgacgag 900
gagaggggca cttacctggg tgactggtac agcgtcaact ggatggaaga ctccgatgtg 960
gaggacctga ccaaagagac ccttcacaag cagtaccacc tggtcaagtc ccacaccaac 1020
accagccatg tcatgcaata tgggaacaaa tctatctcta ccatgaaagt gatgcagttt 1080
cagggaatga agcacagagc cagttccccc atctccctgc ctccggtcac acaccttgac 1140
ctcaccccca gccctgacgt gcccctgacc atcttgaaga ggaagctgct gagaaccaac 1200
gacgtgaagg aatcccagaa tctcattggg cagatccagc aatttctgga tgccaggcac 1260
gtcattgaga agtctgtgca caagatcgtt tccctgctgg cgggatttgg ggaaactgct 1320
gagagacatc tgtcagagag gaccatgctc acagcacatg actgctacca ggaggctgta 1380
acccacttcc gcacacactg ctttaactgg cactctgtca cgtacgagca tgccttgcgg 1440
tacttgtatg tgctggccaa tctctgtgag gcaccatatc cgattgacag gatagagatg 1500
gccatggaca aagtgtgtct tagtcactac tga                              1533
<210>12
<211>510
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>合成的泛素化鼠豆荚蛋白
<400>12
Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu
 1               5                  10                  15
Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp
            20                  25                  30
Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys
        35                  40                  45
Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu
    50                  55                  60
Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly Thr Trp Arg Val
65                  70                  75                  80
Ala Val Leu Leu Ser Leu Val Leu Gly Ala Gly Ala Val Pro Val Gly
                85                  90                  95
Val Asp Asp Pro Glu Asp Gly Gly Lys His Trp Val Val Ile Val Ala
            100                 105                 110
Gly Ser Asn Gly Trp Tyr Asn Tyr Arg His Gln Ala Asp Ala Cys His
        115                 120                 125
Ala Tyr Gln Ile Ile His Arg Asn Gly Ile Pro Asp Glu Gln Ile Ile
    130                 135                 140
Val Met Met Tyr Asp Asp Ile Ala Asn Ser Glu Glu Asn Pro Thr Pro
145                 150                 155                 160
Gly Val Val Ile Asn Arg Pro Asn Gly Thr Asp Val Tyr Lys Gly Val
                165                 170                 175
Leu Lys Asp Tyr Thr Gly Glu Asp Val Thr Pro Glu Asn Phe Leu Ala
            180                 185                 190
Val Leu Arg Gly Asp Ala Glu Ala Val Lys Gly Lys Gly Ser Gly Lys
        195                 200                 205
Val Leu Lys Ser Gly Pro Arg Asp His Val Phe Ile Tyr Phe Thr Asp
    210                 215                 220
His Gly Ala Thr Gly Ile Leu Val Phe Pro Asn Asp Asp Leu His Val
225                 230                 235                 240
Lys Asp Leu Asn Lys Thr Ile Arg Tyr Met Tyr Glu His Lys Met Tyr
                245                 250                 255
Gln Lys Met Val Phe Tyr Ile Glu Ala Cys Glu Ser Gly Ser Met Met
            260                 265                 270
Asn His Leu Pro Asp Asp Ile Asn Val Tyr Ala Thr Thr Ala Ala Asn
        275                 280                 285
Pro Lys Glu Ser Ser Tyr Ala Cys Tyr Tyr Asp Glu Glu Arg Gly Thr
    290                 295                 300
Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val Asn Trp Met Glu Asp Ser Asp Val
305                 310                 315                 320
Glu Asp Leu Thr Lys Glu Thr Leu His Lys Gln Tyr His Leu Val Lys
                325                 330                 335
Ser His Thr Asn Thr Ser His Val Met Gln Tyr Gly Asn Lys Ser Ile
            340                 345                 350
Ser Thr Met Lys Val Met Gln Phe Gln Gly Met Lys His Arg Ala Ser
        355                 360                 365
Ser Pro Ile Ser Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu Thr Pro Ser
    370                 375                 380
Pro Asp Val Pro Leu Thr Ile Leu Lys Arg Lys Leu Leu Arg Thr Asn
385                 390                 395                 400
Asp Val Lys Glu Ser Gln Asn Leu Ile Gly Gln Ile Gln Gln Phe Leu
                405                 410                 415
Asp Ala Arg His Val Ile Glu Lys Ser Val His Lys Ile Val Ser Leu
            420                 425                 430
Leu Ala Gly Phe Gly Glu Thr Ala Glu Arg His Leu Ser Glu Arg Thr
        435                 440                 445
Met Leu Thr Ala His Asp Cys Tyr Gln Glu Ala Val Thr His Phe Arg
    450                 455                 460
Thr His Cys Phe Asn Trp His Ser Val Thr Tyr Glu His Ala Leu Arg
465                 470                 475                 480
Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Asn Leu Cys Glu Ala Pro Tyr Pro Ile Asp
                485                 490                 495
Arg Ile Glu Met Ala Met Asp Lys Val Cys Leu Ser His Tyr
            500                 505                 510
<210>13
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>13
Ser Gly Pro Arg Asp His Val Phe Ile
 1               5
<210>14
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>14
Leu Pro Pro Val Thr His Leu Asp Leu
 1               5
<210>15
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>15
Tyr Asp Glu Glu Arg Gly Thr Tyr Leu
 1               5
<210>16
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>16
Arg Tyr Leu Tyr Val Leu Ala Asn Leu
 1               5
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>17
Met Tyr Gln Lys Met Val Phe Tyr Ile
 1               5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>鼠
<400>18
Thr Tyr Leu Gly Asp Trp Tyr Ser Val
 1               5
<210>19
<211>18
<212>PRT
<213>鼠
<400>19
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Ala
 1               5                  10                  15
His Ser
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>鼠
<400>20
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
 1               5                  10
<210>21
<211>6
<212>PRT
<213>鼠
<400>21
Ser Glu Lys Asp Glu Leu
 1               5

Claims (26)

1.一种包含编码多肽的DNA小基因构建体的DNA组合物，所述多肽由AAY间隔、SEQ ID NO：13所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu137、AAY间隔、SEQ ID NO：14所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu238、AAY间隔和SEQ ID NO：15所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu223构成，或由AAY间隔、SEQ ID NO：16所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu405、AAY间隔、SEQ ID NO：17所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu180、AAY间隔和SEQ ID NO：18所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu229构成，其中所述多肽能够引发对肿瘤相关细胞的免疫应答，可在免疫细胞中表达，并被掺入药用可接受的载体中。
2.权利要求1的DNA组合物，其中DNA小基因构建体是裸DNA构建体。
3.权利要求2的DNA组合物，其中裸DNA构建体是质粒形式。
4.权利要求1的DNA组合物，其中DNA构建体掺入减毒病毒载体中。
5.权利要求1的DNA组合物，其中DNA构建体掺入减毒细菌载体中。
6.权利要求5的DNA组合物，其中减毒细菌载体是减毒AroA-、dam-鼠伤寒沙门氏菌。
7.权利要求1-6中任一项的DNA组合物，其进一步包含编码能在免疫细胞中表达的免疫效应蛋白的DNA构建体。
8.权利要求7的DNA组合物，其中免疫效应蛋白是细胞因子。
9.权利要求8的DNA组合物，其中细胞因子是CCL21、IL-2或CD40LT。
10.权利要求1-6中任一项的DNA组合物，其中DNA小基因构建体进一步编码连接到多肽N末端的内质网前导肽序列。
11.权利要求1-10中任一项的DNA组合物在制备用于抑制哺乳动物体内肿瘤生长或肿瘤转移的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，其中肿瘤相关细胞是肿瘤相关巨噬细胞。
13.权利要求11和12中任一项的用途，其中哺乳动物是人类。
14.权利要求11或12的用途，其中组合物通过口服施用。
15.权利要求1-10中任一项的DNA组合物和抗肿瘤化疗药剂在制备用于抑制哺乳动物体内肿瘤生长或肿瘤转移的药物中的用途。
16.权利要求15的用途，其中哺乳动物是人类。
17.权利要求15和16中任一项的用途，其中化疗药剂是阿霉素。
18.权利要求15或16的用途，其中组合物通过口服施用。
19.权利要求1-10中任一项的DNA组合物在制备用于在哺乳动物体内抑制肿瘤相关巨噬细胞生成的药物中的用途，所述哺乳动物能够由此抑制获益。
20.权利要求19的用途，其中哺乳动物是人类。
21.权利要求19和20中任一项的用途，其组合物通过口服施用。
22.一种制备物，其包含权利要求1-10中任一项的DNA组合物，所述组合物包装在密封包装的灭菌容器中，所述容器上附有标签，标签上印刷有用于识别该组合物和向将该组合物施用到患者的人提供所需信息的资料。
23.一种包含DNA小基因构建体的质粒载体，所述DNA小基因构建体编码一种多肽，所述多肽由AAY间隔、SEQ ID NO：13所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu137、AAY间隔、SEQ ID NO：14所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu238、AAY间隔和SEQ ID NO：15所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu223构成，或由AAY间隔、SEQ ID NO：16所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu405、AAY间隔、SEQ ID NO：17所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu180、AAY间隔和SEQ ID NO：18所示的免疫原性豆荚蛋白片段legu229构成，并能够在免疫细胞中表达并引发针对过量表达豆荚蛋白的肿瘤相关细胞的免疫应答。
24.权利要求23的载体，它进一步包含编码免疫效应蛋白的DNA构建体。
25.权利要求24的载体，其中免疫效应蛋白是细胞因子。
26.权利要求25的载体，其中细胞因子是CCL21、IL-2或CD40LT。
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