ES2605020T3 - Composición de ADN para inducir una respuesta inmunitaria contra macrófagos asociados a tumor - Google Patents

Composición de ADN para inducir una respuesta inmunitaria contra macrófagos asociados a tumor Download PDF

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Abstract

Composición de ADN que comprende un constructo de minigén de ADN que codifica un polipéptido que comprende una pluralidad de fragmentos de legumaína, consistiendo dicha pluralidad en tres fragmentos inmunógenos de legumaína, estando cada uno de los cuales precedido por los tres aminoácidos AAY, estando los fragmentos inmunógenos unidos entre sí en serie mediante dichos tres aminoácidos AAY entre cada fragmento sucesivo en el polipéptido, en la que el polipéptido puede inducir una respuesta inmunitaria contra las células asociadas a tumor y es expresable en las células inmunitarias, y en la que el constructo de minigén de ADN se incorpora en un portador farmacéuticamente aceptable, en la que dichos fragmentos inmunógenos presentan una secuencia de aminoácidos según SEC ID nº 16, nº 17 y nº 18.

Description

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específica de tumor era específica para la legumaína, ya que las células 4T1 normales, que no presentaban expresión de legumaína, no resultaron lisadas.
Figura 8. Muestra la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico codificante de la legumaína humana (SEC 5 ID nº 1).
Figura 9. Muestra la secuencia de residuos aminoácidos (SEC ID nº 2) de la legumaína humana.
Figura 10. Muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 3) de un ácido nucleico codificante de la legumaína murina.
Figura 11. Muestra la secuencia de residuos aminoácidos (SEC ID nº 4) de la legumaína murina.
Figura 12. Muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 5) de un ácido nucleico codificante de la IL-2 humana.
15 Figura13. Muestra la secuencia de residuos aminoácidos de la IL-2 humana (SEC ID nº 6).
Figura 14. Muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 7) de un ácido nucleico codificante de CCL21 humana.
Figura 15. Muestra la secuencia de residuos aminoácidos de CCL21 humana (SEC ID nº 8).
Figura 16. Muestra la secuencia de nucleótidos (SEC ID nº 9) de un ácido nucleico codificante de CD40L humano. 25 Figura 17. Muestra la secuencia de residuos aminoácidos de CD40L humano (SEC ID nº 10).
Figura 18. Muestra la secuencia de nucleótidos de la legumaína murina ubiquitinada (SEC ID nº 11).
Figura 19. Muestra la secuencia de residuos aminoácidos de la legumaína murina ubiquitinada (SEC ID nº 12).
Figura 20. Muestra la secuencia de residuos aminoácidos de las secuencias de epítopo de la legumaína murina.
Figura 21. Muestra una representación esquemática de plásmidos codificantes de minigenes de legumaína que 35 comprenden fragmentos inmunógenos de la legumaína.
Figura 22. Demuestra que la composición de minigén pCMV-Kb/Kd protege a ratones frente al reto con células de carcinoma mamario D2F2. Se inmunizaron grupos de ratones BALB/c (n=8) 3 veces a intervalos de 1 semana con Salmonella typhimurium RE-88 doblemente atenuada que alojaba los vectores indicados. Los ratones se retaron 1 semana después de la última inmunización mediante la inyección
i.v. de 2x105 células de carcinoma mamario D2F2. A. Esquema del protocolo experimental. B. Volumen tumoral medio de ratones 5 a 25 días después del reto de células tumorales. C. Peso tumoral de los ratones 25 días después del reto celular, *P<0,05 en comparación con el grupo de control de vector vacío.
45 Figura 23. Demuestra que la vacuna de minigén pKd evita la metástasis del carcinoma mamario D2F2 en ratones BALB/c singénicos. Se inmunizaron grupos de ratones (n=8) 3 veces a intervalos de 1 semana mediante sonda con Salmonella typhimurium RE-88 que alojaba los vectores indicados. Los ratones se retaron 2 semanas después de la última inmunización mediante la inyección i.v. de 1x105 células de carcinoma mamario D2F2. A. Esquema del protocolo experimental. B. Puntuación media de metástasis pulmonar de ratones de cada grupo experimental 25 días después del reto de células tumorales. Se establecieron las puntuaciones de metástasis tumoral en los pulmones mediante estimación del % del área cubierta por las metástasis fusionadas de la manera siguiente: 0, ninguna metástasis; 1: <20%; 2: 20% a 50% y 3: >50%, representados por símbolos individuales para cada
55 grupo de tratamiento. *P<0,05 en comparación con el grupo de control de vector vacío.
Figura 24. Ilustra la liberación de IFN-γ en células T específicas de legumaína inducida por la composición de minigén pCMV-Kb/Kd. A. La expresión de legumaína por células 4T1 recién recolectadas procedentes de tejidos tumorales se utilizaron como células estimuladoras. Se llevó a cabo citometría de flujo para indicar el grado de expresión de la legumaína en dichas células B. Se verificó la producción de IFN-γ al nivel de células individuales mediante ELISPOT, reestimulando linfocitos de los ratones inmunizados con células tumorales 4T1 legumaína+ recién recolectadas de tejido tumoral o células en cultivo de tejido 4T1 legumaína-. La liberación de IFN-γ está indicada por el número de inmunopuntos formados por cada pocillo. *P<0,05, en comparación con grupos de ratones los linfocitos de los cuales
65 no resultaron estimulados por las células tumorales legumaína+. #P<0,05, en la comparación con grupos de control.
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se une al primer fragmento inmunógeno desde el extremo N-terminal del mismo. Preferentemente, los fragmentos inmunógenos de la endopeptidasa consisten de aproximadamente 8 a 10 residuos aminoácidos contiguos de una o más regiones epitópicas de la misma.
Los fragmentos inmunógenos de endopeptidasas tales como legumaína, incluyendo la legumaína humana, pueden identificarse mediante métodos bien conocidos de la técnica, tales como el programa HLA Binding Predictions proporcionado por la Bioinformatics & Molecular Analysis Section (BIMAS) del National Institutes of Health (NIH) en el sitio de internet del NIH.
Las composiciones de ADN de la presente invención estimulan la formación de LTC que son activos contra los macrófagos asociados a tumor que expresan la endopeptidasa. Dichos macrófagos asociados a tumor son la diana selectivamente de los LTC que se producen en respuesta a la inmunización con las composiciones de ADN de la invención. La eliminación o anulación de los MAT modifica el microambiente tumoral, resultando en la supresión del crecimiento tumoral y las metástasis tumorales.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "inmunidad" se refiere a la protección inmunitaria a largo plazo frente a la forma virulenta del agente infeccioso o antígeno tumoral. El término "inmunización" se refiere a la exposición a un antígeno de un agente patogénico derivado de una fuente no virulenta, que resulta en inmunidad frente al patógeno en el sujeto tratado.
Un constructo de ADN útil en una composición de ADN indicada en la presente memoria preferentemente comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende legumaína (por ejemplo legumaína humana) o fragmentos inmunógenos de legumaína, y que se encuentra operablemente ligado a elementos reguladores necesarios para la expresión génica en células inmunitarias. En una forma de realización preferida, el constructo de ADN codifica una proteína legumaína humana de longitud completa (SEC ID nº 2) o un polipéptido que comprende un elevado grado de homología, de por lo menos aproximadamente 80%, con la misma (por ejemplo la legumaína porcina, la legumaína de ratón, y similares) o un fragmento inmunógeno de la misma, y que puede inducir una respuesta inmunitaria contra células que sobreexpresan legumaína.
En una forma de realización particularmente preferida, el constructo de ADN comprende un minigén codificante de 2 a 5 fragmentos inmunógenos de la legumaína (por ejemplo la legumaína humana) unidos mediante péptidos conectores de tres aminoácidos (por ejemplo AAA o AAY) con un péptido conector entre cada fragmento inmunógeno.
Entre los constructos de ADN útiles, incluyendo los constructos de minigén, preferentemente se incluyen elementos reguladores necesarios para la expresión de nucleótidos. Entre dichos elementos se incluyen, por ejemplo, un promotor, un codón de inicio, un codón de parada y una señal de poliadenilación. Además, con frecuencia se requieren intensificadores para la expresión de una secuencia que codifica una proteína diana inmunogénica. Tal como es conocido de la técnica, dichos elementos preferentemente se encuentran ligados operablemente a la secuencia que codifica la proteína deseada. Preferentemente se seleccionan elementos reguladores que son operables en las especies en las que deben administrarse. Preferentemente, el constructo de ADN se encuentra en forma de un plásmido o se incorpora en un vector vírico o bacteriano. El constructo de ADN codificante de legumaína inicialmente puede incorporarse en un vector bacteriano mediante transfección, utilizando métodos bien conocidos de la técnica. A continuación, las bacterias transformadas pueden cultivarse para proporcionar una reserva preparada de bacterias, que incluye ADN de legumaína en el material genético de las bacterias. Los cultivos de dichas bacterias transformadas proporcionan una fuente disponible para las composiciones de ADN de la presente invención.
Los codones de inicio y los codones de parada preferentemente se incluyen como parte de una secuencia de nucleótidos que codifica la endopeptidasa o polipéptido inmunógeno en una composición de ADN de la presente invención. Los codones de inicio y de terminación deben encontrarse en el mismo marco que la secuencia codificante.
Los promotores y señales de poliadenilación incluidos en una composición de la presente invención preferentemente se seleccionan para ser funcionales dentro de las células del sujeto que debe inmunizarse.
Entre los ejemplos de promotores útiles en las composiciones de la presente invención, especialmente en la producción de una composición de DAN de vacuna genética para el ser humano se incluyen, aunque sin limitación, los promotores del virus 40 del simio (SV40), el promotor del virus del tumor mamario de ratón (VTMR), el promotor del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), tal como la repetición terminal larga (RTL) del VIH, el virus de Moloney, el citomegalovirus (CMV), tal como el promotor temprano inmediato del CMV, el virus de Epstein Barr (VEB), el virus del sarcoma de Rous (VSR), así como promotores de genes humanos, tales como la actina humana, la miosina humana, la hemoglobina humana, la creatina muscular humana y la metalotioneína humana.
Entre los ejemplos de señales de poliadenilación útiles en las composiciones de ADN de la presente invención, especialmente en la producción de una composición de ADN para el ser humano, se incluyen, aunque sin limitación,
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Nucleotide Sequence Database Collaboration, un esfuerzo combinado del DNA DataBank of Japan (DDBJ), el Laboratorio Europeo de Biología Molecular (LEBM) y el GenBank en el National Center for Biotechnology Information.
La secuencia de ácidos nucleicos de un ácido nucleico codificante de la legumaína humana, SEC ID nº 1 (figura 8) ha sido publicada en GenBank nº de acceso BC026250. La secuencia de residuos aminoácidos correspondiente de la legumaína humana es SEC ID nº 2 (figura 9).
La secuencia de ácidos nucleicos de un ADN codificante de la legumaína murina, SEC ID nº 3, se muestra en la figura 10. La secuencia de residuos aminoácidos correspondiente de la legumaína murina es SEC ID nº 4 (figura 11).
Chen et al., J. Biological Chem. 272(12):8090-8098, 1997, han informado de la estructura y caracterización de la legumaína porcina, que presenta una identidad de secuencia de aproximadamente 83 por ciento respecto a la legumaína humana.
Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden utilizarse en la práctica de la invención otras secuencias de ADN que codifican la secuencia de aminoácidos de la legumaína humana. Entre dichas secuencias de ADN se incluyen las que también son capaces de hibridarse con la legumaína humana.
Entre las secuencias de ADN que codifican la legumaína humana y que pueden utilizarse según la invención, se incluyen ácidos nucleicos que presentan deleciones, adiciones o sustituciones de diferentes residuos nucleótidos respecto a los presentes en SEC ID nº 1, que resultan en una secuencia que codifica el mismo producto génico de legumaína. Las moléculas de ADN codificantes de homólogos funcionalmente equivalentes de la legumaína humana también pueden utilizarse en las composiciones de ADN de la presente invención.
El producto génico codificado por el ácido nucleico también puede contener deleciones, adiciones o sustituciones de residuos aminoácidos dentro de la secuencia de residuos aminoácidos de la legumaína, que resultan en un cambio silencioso, produciendo de esta manera una legumaína funcionalmente equivalente. Dichas sustituciones de aminoácidos pueden realizarse basándose en las similitudes de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o naturaleza anfipática de los residuos implicados. Por ejemplo, entre los aminoácidos cargados negativamente se incluyen el ácido aspártico y el ácido glutámico; entre los aminoácidos positivamente cargados se incluyen lisina y arginina; los aminoácidos con grupos de cabeza polar no cargados que presentan valores de hidrofilicidad similares se incluyen los siguientes: leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina, asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Tal como se utiliza en la presente memoria, una legumaína funcionalmente equivalente se refiere a una proteína que incluye uno o más epítopos, que al ser reconocidas por las células T, permiten a estas mismas células T reconocer los epítopos de legumaína expresados sobre las células expresantes de legumaína. En formas de realización preferidas, una legumaína funcionalmente equivalente presenta una secuencia de residuos aminoácidos que presenta una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 80% respecto a la secuencia de residuos aminoácidos de la legumaína humana (SEC ID nº 2), por ejemplo una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 90%, o una identidad de secuencia de por lo menos aproximadamente 95%.
Los constructos de ADN codificantes de legumaína pueden manipularse con el fin de alterar la secuencia codificante de legumaína (respecto al ADN de legumaína nativa, SEC ID nº 1) para una diversidad de fines, incluyendo, aunque sin limitación, alteraciones que modifican el procesamiento y la expresión del producto génico de legumaína. Por ejemplo pueden introducirse mutaciones en el ADN utilizando técnicas que son bien conocidas, por ejemplo la mutagénesis dirigida a sitio, para insertar nuevos sitios de restricción, para alterar los patrones de glucosilación, fosforilación, etc.
En una forma de realización preferida, la composición de ADN de la invención comprende un constructo de ADN codificante de un polipéptido inmunógeno que comprende una pluralidad de fragmentos inmunógenos de legumaína humana y un constructo de ADN operablemente codificante de por lo menos una proteína efectora inmunitaria, ambas expresables en células inmunitarias. Tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, la expresión "proteína efectora inmunitaria" se refiere a una proteína que participa en la regulación de una ruta del sistema inmunitario. Preferentemente, la proteína efectora inmunitaria es una citocina.
Las citocinas son proteínas y polipéptidos producidos por células que pueden afectar al comportamiento de otras células, tal como la proliferación celular, la diferenciación celular, la regulación de las respuestas inmunitarias, la hematopoyesis y las respuestas inflamatorias. Las citocinas han sido clasificadas en varias familias, incluyendo quimiocinas, hematopoyetinas, inmunoglobulinas, factores de necrosis tumoral y una diversidad de moléculas no asignadas. Ver generalmente el Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, edición revisada, Oxford University Press, 2000, y C.A. Janeway, P. Travers, M. Walport y M. Schlomchik, Immunobiology, quinta edición, Garland Publishing, 2001 (en lo sucesivo, "Janeway y Travers"). Se presenta una clasificación breve de las citocinas en Janeway y Travers, apéndice III, páginas 677 a 679.
Entre las hematopoyetinas se incluyen, por ejemplo, la eritropoyetina, la interleuquina-2 (IL-2, una proteína de 133
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seleccionan para proporcionar una cantidad suficiente de expresión de legumaína en las células inmunitarias para inducir una respuesta inmunitaria en el mamífero contra los macrófagos asociados a tumor que expresan legumaína. Preferentemente, la dosis de la composición administrada en el mamífero sujeto induce la expresión de una cantidad suficiente de antígeno legumaína en las células inmunitarias del mamífero para sostener una respuesta inmunitaria contra los macrófagos asociados a tumor presentadores de legumaína que continuará durante un periodo de por lo menos un mes, por ejemplo por lo menos 6 meses o por lo menos aproximadamente un año. En algunas formas de realización preferidas, la dosis de células transformadas con legumaína que se administra en el paciente es de aproximadamente 1x108 células transfectadas con aproximadamente 0,3 a aproximadamente 0,8 µg de ADN de legumaína.
Las composiciones de la presente invención pueden envasarse en recipientes convenientemente esterilizados, tales como ampollas, botellas o viales, en formas de administración multidosis o unitaria. Los envases preferentemente se sellan herméticamente después de rellenarse con una composición de ADN de la invención. Preferentemente, las composiciones se envasan en un recipiente que presenta una etiqueta adherida al mismo, la cual identifica la composición e incluye una notificación en una forma prescrita por una agencia gubernamental, tal como la Food and Drug Administration estadounidense, que refleja la autorización de la composición bajo la legislación apropiada, información sobre las dosis, y similares. La etiqueta preferentemente contiene información sobre la composición que resulta útil para el profesional de la salud que administra la composición en el paciente. El envase preferentemente contiene además material informativo impreso relacionado con la administración de la composición, instrucciones, indicaciones y cualesquiera advertencias requeridas necesarias.
Los ejemplos a continuación se proporcionan con el fin de ilustrar adicionalmente las características y formas de realización de la presente invención.
Materiales y métodos.
Animales, cepas bacterianas y líneas celulares. Se obtuvieron ratones BALB/c y C57BL/6 hembra, de 6 a 8 semanas de edad, de The Scripps Research Institute Rodent Breeding Facility. La cepa de S. typhimurium doblemente atenuada RE88 (aroA-, dam-) se obtuvo de Remedyne Corporation, Goleta, CA. La línea celular de cáncer de colon CT-26 murina fue amablemente proporcionada por Dr. I. J. Fidler (MD Anderson Cancer Center) y las células de carcinoma pulmonar de células no pequeñas D121 murina se obtuvieron del Dr. L. Eisenbach (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). La células de carcinoma mamario 4T1 murino se obtuvieron de la Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg (University of Maryland).
Análisis inmunohistoquímicos. Los análisis inmunohistoquímicos se llevaron a cabo en tejidos de tumor 4T1 y secciones de tapón de Matrigel. Se identificó la expresión de legumaína de los macrófagos en secciones de tejido de tumor 4T1 con mAb anti-CD68 de ratón biotinilado (BD Bioscience Pharmingen), siendo la estreptavidina conjugada con GFP el reactivo informador secundario. Se preparó antisuero de conejo anti-legumaína mediante inmunización con legumaína humana purificada producida en E. coli (Ishii, Methods Enzymol. 244:604-615, 1994). La reacción se visualizó con estreptavidina conjugada con rojo Texas. Además, se fijaron secciones de tejido de tumor 4T1 y secciones de tapón de Matrigel y se tiñeron con anticuerpos de MMP-9, FCEV, FCT-beta y F4/80 (eBioscience, San Diego, CA) en sección de tejido de tumor 4T1, mientras que se utilizaron los anticuerpos de CD68 y de CD31 (BD Bioscience Pharmingen) en secciones de tapón de Matrigel. Todas las secciones de tejido se visualizaron con reojo Texas o estreptavidina conjugada con GFP como el reactivo informador secundario, y los portaobjetos se analizaron con escaneo láser mediante microscopía confocal (Bio-Rad Laboratories). Todas las imágenes se capturaron con un sistema de cámara digital color enfriado SPOTTM (Diagnostic Instruments Inc.).
Inmunización y reto de células tumorales. Modelo profiláctico: ratones BALB/c o C57BL/6, se dividieron cada uno en tres grupos experimentales (n=8) y se inmunizaron con PBS, vector vacío o S. typhimurium transfectado con pUblegumaína. Todos los ratones se retaron mediante inyección intravenosa (i.v.) con aproximadamente 5x104 células CT-26 (BALB/c), aproximadamente 2x105 células D121 (C57BL/6) o inyección de almohadilla adiposa de glándula mamaria con aproximadamente 7x103 células 4T1 (BALB/c), 1 semana después de la última inmunización, con el fin de inducir metástasis pulmonares experimentales o espontáneas. Los pesos de los pulmones en los grupos experimentales y de control se determinaron 24 días después del reto de células tumorales. Modelo terapéutico: los ratones BALB/c se dividieron en tres grupos experimentales (n=8) y en primer recibieron una inyección en la almohadilla adiposa de aproximadamente 7x103 célula 4T1 el día 0 y después se inmunizaron 3 veces con la composición de ADN de la invención a partir de los días 3, 7 y 11. Tras 24 días, se extirpó el tumor primario para determinar los pesos de pulmón de los ratones y las puntuaciones de metástasis, o las tasas de supervivencia de los ratones.
Reducción in vivo del número de células T CD4+ o CD8+. Citotoxicidad y ensayos ELISPOT. Se llevó a cabo la reducción del número de células T CD4+ o CD8+ in vivo tal como se ha indicado anteriormente (Ceredig et al., Nature 314:98-100, 1985). Se midió la citotoxicidad y se calculó mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr tal como se ha informado anteriormente (Zhou et al., Blood 106:2026-2032, 2005). Se llevaron a cabo ensayos ELISPOT con un kit ELISPOT (BD Bioscience Pharmingen) según las instrucciones proporcionadas por el fabricante.
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