ES2345200T3 - Vacunas de adn contra el crecimiento tumoral y procedimientos de utilizacion de las mismas. - Google Patents
Vacunas de adn contra el crecimiento tumoral y procedimientos de utilizacion de las mismas. Download PDFInfo
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Abstract
Vacuna de ADN adecuada para provocar una respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que comprende un montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una proteína survivina y por lo menos un producto génico inmunoactivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un vector bacteriano atenuado.
Description
Vacunas de ADN contra el crecimiento tumoral y
procedimientos de utilización de las mismas.
La presente solicitud reivindica los derechos de
la solicitud provisional US para la patente nº de serie 60/457.009
presentada el 24 de marzo de 2003, cuya exposición está incorporada
en la presente memoria como referencia.
La presente invención fue realizada con la ayuda
gubernamental con las subvenciones nº 1R01CA83856-01
y CA83856 de los National Institutes of Health, subvención nº
9RT00-17 del Tobacco Related Disease Research
Program, y las subvenciones nº
DAMD17-02-1-0137 y
nº DAMD17-02-1-0562
del Department of Defense. El gobierno presenta determinados
derechos sobre la invención.
La presente invención se refiere a vacunas de
ácido desoxirribonucleico (ADN) que codifican moléculas adecuadas,
eficaces, para provocar una respuesta inmunitaria contra las células
tumorales. Más específicamente la presente invención se refiere a
vacunas de ADN que codifican un inhibidor asociado al cáncer de la
proteína de la familia Apoptosis (IAP) y un producto génico
inmunoactivo. La presente invención se refiere también a
procedimientos de utilización de las vacunas de ADN para inhibir el
crecimiento del tumor.
Se han utilizado vacunas para proporcionar una
protección de larga duración contra numerosas enfermedades mediante
la administración muy limitada de un agente profiláctico que
estimula un sistema inmunitario del organismo para destruir
organismos patógenos de enfermedades antes de que puedan proliferar
y producir un efecto patológico. Se describen varios procedimientos
para vacunas y vacunaciones en Bernard R. Glick y Jack J.
Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles and Applications
of Recombinant DNA, segunda edición, ASM Press págs.
253-276 (1998).
La vacunación es una manera de provocar al
sistema inmunitario del propio cuerpo para buscar y destruir un
agente infeccioso antes de que produzca un respuesta patológica. Por
lo general, las vacunas son agentes infecciosos vivos, pero
atenuados (virus o bacterias) o una forma destruida del agente. Una
vacuna consistente en bacterias o virus vivos debe ser apatógena.
Por lo general, un cultivo bacteriano o vírico se atenúa (debilita)
por tratamiento físico o químico. Aunque el agente es avirulento,
puede provocar todavía una respuesta inmunitaria en un paciente
tratado con la vacuna.
Los antígenos, que pueden ser macromoléculas
específicas o un agente infeccioso, provocan una respuesta
inmunitaria. Estos antígenos son generalmente proteínas,
polisacáridos, lípidos o glucolípidos, que son reconocidos como
"extraños" por los linfocitos conocidos como linfocitos B y
linfocitos T. La exposición de ambos tipos de linfocitos a un
antígeno provoca una división celular rápida y una respuesta de
diferenciación, dando como resultado la formación de clones de los
linfocitos expuestos. Los linfocitos B producen células de plasma,
que a su vez, producen proteínas denominadas anticuerpos (Ab) que se
unen selectivamente a los antígenos presentes en el agente
infeccioso, neutralizando o inactivando de este modo el patógeno
(inmunidad humoral). En algunos casos, la respuesta del linfocito B
requiere la asistencia de linfocitos T CD4 colaboradores.
El clon del linfocito T especializado que se
forma en respuesta a la exposición al antígeno, es un linfocito T
citotóxico (LTC), que puede unirse a patógenos y eliminarlos y a
tejidos presentadores de antígeno (inmunidad mediada por células o
celular). En algunos casos, una célula presentadora de antígeno
(CPA) tal como un dendrocito, desarrollará un patógeno u otra
célula extraña por endocitosis. La CPA procesa a continuación los
antígenos procedentes de las células y presenta estos antígenos en
forma de un complejo de histocompatibilidad molécula:péptido al
receptor de linfocitos T (RLT) en los LTC, estimulando de este modo
una respuesta inmunitaria.
La inmunidad humoral caracterizada por la
formación de anticuerpos específicos es generalmente la más eficaz
contra las infecciones bacterianas agudas y repiten infecciones
procedentes de virus, mientras que la inmunidad mediada por células
es más eficaz contra la infección vírica, la infección bacteriana
intracelular crónica y la infección micótica. La inmunidad celular
es también conocida porque protege contra cánceres y es responsable
del rechazo de trasplantes de órganos.
Los anticuerpos contra antígenos procedentes de
infecciones anteriores permanecen detectables en la sangre durante
períodos muy prolongados, proporcionando de este modo un medio de
determinación antes de la exposición al patógeno. Durante la
reexposición al mismo patógeno, el sistema inmunitario previene
eficazmente la reinfección eliminando el agente patógeno antes de
que pueda multiplicarse y produzca una respuesta patógena.
La misma respuesta inmunitaria que provocaría un
patógeno puede también a veces ser producida por un agente
apatógeno que presenta el mismo antígeno como patógeno. De esta
manera, el paciente puede ser protegido contra la exposición
posterior al patógeno sin haber combatido previamente una
infección.
No obstante, no todos los agentes infecciosos
pueden cultivarse e inactivarse fácilmente, a medida que se
necesita para la formación de la vacuna. Las técnicas modernas de
ADN recombinante han permitido la modificación genética de nuevas
vacunas para buscar superar esta limitación. Pueden crearse agentes
infecciosos que carecen de genes patógenos, permitiendo así una
forma viva, no virulenta del organismo que va a utilizarse como
vacuna. También es posible modificar genéticamente un organismo
relativamente no patógeno tal como E. coli para presentar
los antígenos de la superficie celular de un vehículo patógeno. El
sistema inmunitario de un paciente vacunado con dicho vehículo
transformado es "engañado" en la formación de anticuerpos
contra el patógeno. Las proteínas antigénicas de un agente patógeno
pueden modificarse genéticamente y expresarse en una especie
apatógena y las proteínas antigénicas pueden aislarse y purificarse
para producir una "vacuna subunitaria". Las vacunas
subunitarias tienen la ventaja de ser estables, seguras y
químicamente bien definidas; sin embargo, su producción puede ser
de coste prohibitivo.
En los últimos años ha aparecido una nueva
metodología para vacunas, denominada a grandes rasgos inmunización
genética. En esta metodología, un gen que codifica un antígeno de un
agente patógeno se inserta de manera operable en las células en el
paciente que va a ser inmunizado. Las células tratadas,
preferentemente células presentadoras de antígeno (CPA) tales como
los dendrocitos, se transforman y producen las proteínas antigénicas
del patógeno. Estos antígenos producidos in vivo
desencadenan a continuación la respuesta inmunitaria deseada en el
hospedador. El material genético utilizado en dichas vacunas
genéticas puede ser un montaje de ADN o de ARN. Con frecuencia el
polinucleótido que codifica el antígeno se introduce en combinación
con otras secuencias activadoras del polinucleótido para aumentar
la inserción, replicación o expresión del gen.
Las vacunas de ADN que codifican genes de
antígeno pueden introducirse en las células hospedadoras del
paciente mediante varios sistemas de administración. Estos sistemas
de administración incluyen sistemas de administración procariótica
y vírica. Por ejemplo, una metodología consiste en utilizar un
vector vírico, tal como un virus de vacuna que incorpora el nuevo
material genético, para inocular las células hospedadoras.
Alternativamente, el material genético puede incorporarse en un
vector plásmido o puede suministrarse directamente a las células
hospedadoras como un polinucleótido "desnudo", es decir
simplemente como ADN purificado. Además, el ADN puede transfectarse
de manera estable en bacterias atenuadas tal como Salmonella
typhimurium. Cuando un paciente es vacunado por vía bucal con
la Salmonella transformada, las bacterias son transportadas a
parches de Peyer en el intestino (es decir, tejidos linfoides
secundarios), que a continuación estimulan una respuesta
inmunitaria.
Las vacunas de ADN proporcionan una oportunidad
para inmunizar contra enfermedades que no son producidas por
patógenos tradicionales, tales como las enfermedades genéticas y el
cáncer. Por lo general, una vacuna genética contra el cáncer
introduce en las CPA un gen que codifica un antígeno, y las CPA
transformadas de este modo producen antígenos contra un tipo
específico de célula tumoral. Una vacuna general eficaz contra
numerosos tipos de cáncer puede suponer numerosas vacunas
individuales para cada tipo de célula cancerosa contra la que va a
ser inmunizada.
El inhibidor de proteínas de apoptosis (es
decir, proteínas de la familia IAP) es una clase antígenos naturales
expresados en muchas células tumorales diferentes. Como sugiere el
nombre, estas proteínas, en su forma natural, inhiben la apoptosis
(es decir, la muerte celular programada), lo que a su vez, puede
conducir a resistencia de las células cancerosas a la apoptosis que
producen agentes quimioterapéuticos, tal como el etopósido. Los
ejemplos de proteínas de la familia IAP incluyen la IAP asociada al
cromosoma X (XIAP), NAIP, cIAP1 (conocida también como BIRC2),
cIAP2 (conocida también como BIRC3), bruce (conocida también como
BIRC6), survivina (conocida también como BIRC5) y livina (conocida
también como BIRC7, KIAP y ML-IAP). La familia de
proteínas IAP de mamífero incluye proteínas con tres dominios BIR
(por ejemplo, XIAP, cIAP1, cIAP2 y NAIP) así como proteínas con un
solo dominio BIR (por ejemplo, survivina y livina).
Tamm et al. Cancer Res. 1998;
58(23):5315-20, han descrito la expresión de
la survivina humana en 60 estirpes de células tumorales humanas.
Tamm et al. han descrito también que la survivina y la XIAP
eran ambas eficaces en la inhibición de la muerte celular
programada (apoptosis) provocada por el tratamiento de las células
tumorales con agentes inductores de apoptosis tales como Bax o Fas
(CD95). La survivina y otras proteínas de la familia IAP inhiben
supuestamente la apoptosis uniéndose a las proteasas efectoras de la
muerte celular, por ejemplo, caspasa-3 y
caspasa-7. Las mutaciones en las proteínas de la
familia IAP pueden conducir a actividad de inhibición reducida de
la apoptosis o incluso a actividad inductora de apoptosis en
comparación con la actividad de la proteína natural de la familia
IAP. Se cree que la actividad antiapoptósica de las proteínas de la
familia IAP está asociada al dominio BIR.
Supuestamente la survivina está presente en las
células cancerosas humanas más comunes, incluyendo en los cánceres
de pulmón, próstata, mama y páncreas. La survivina se ha
identificado también en linfomas no hodgkinianos de calidad
superior pero no en linfomas no hodgkinianos de calidad inferior.
Supuestamente, la survivina está presente en células normales
durante el desarrollo del feto, pero a diferencia de la mayoría de
otras proteínas de la familia IAP, la survivina es prácticamente
indetectable en los tejidos normales humanos de adulto. Véase
Ambrosini et. al. Nat. Med. 1997; 3(8):
917-21.
Se ha detectado livina en algunos tejidos de
adulto y en tejidos embrionarios. Se han publicado niveles de
expresión elevados de livina en melanomas, células de cáncer de
colon, células de cáncer de vejiga y células de cáncer de pulmón.
Se han publicado dos variantes de corte y empalme de livina, las
cuales contienen un solo dominio BIR. La variante alfa completa
tiene 298 restos de aminoácidos, mientras que la variante beta
tiene 280 restos de aminoácidos.
\newpage
Se han identificado también proteínas de la
familia IAP, en numerosas especies además de la humana, incluyendo
mamíferos tales como el ratón, anfibios tales como la especie
Xenopus (ranas africanas de uñas), insectos tal como la
especie Drosophila, y baculovirus.
La naturaleza omnipresente y muy selectiva de la
expresión de survivina en células cancerosas la convierte en un
marcador para diagnóstico potencialmente útil para el cáncer. Por
ejemplo, Rohayem et al. Cancer Res. 2000;
60:1815-17, han identificado supuestamente
anticuerpos contra survivina en pacientes humanos de cáncer de
pulmón y colorrectal.
Se ha identificado también a la survivina como
diana para la terapia del cáncer. El efecto inhibidor de survivina
sobre caspasa-3 y caspasa-7 ha
estado implicado en la resistencia de las células cancerosas a
varios tratamientos quimioterapéuticos que estimulan la apoptosis.
Se ha publicado que un oligonucleótido complementario que dirige la
expresión de survivina regula por disminución la expresión de
survivina en una estirpe de células de adenocarcinoma y sensibiliza
las células cancerosas al etopósido del agente quimioterapéutico.
Véase Olie et al. Cancer Res. 2000;
60:2805-9 y Mesri et al. J. Clinical. Res.,
2001; 108:981-990.
Las citocinas son proteínas y polipéptidos
producidos por células que pueden afectar al comportamiento de
otras células, tal como la proliferación celular, la diferenciación
celular, la regulación de las respuestas inmunitarias, la
hematopoyesis y las respuestas inflamatorias. Las citocinas se han
clasificado en numerosas familias, incluyendo las quimiocinas,
hematopoyetinas, inmunoglobulinas, factores de necrosis tumoral y
varias moléculas sin asignar. Véase generalmente Oxford
Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, edición
revisada, Oxford University Press., 2000; y C. A. Janeway, P.
Travers, M. Walport y M. Schlomchik, Immunobiology, quinta
edición., Garland Publishing, 2001 (en lo sucesivo Janeway y
Travers). Una clasificación concisa de citocinas se presenta en
Janeway y Travers, Apéndice III, páginas 677-679,
cuyas exposiciones aplicables se incorporan en la presente memoria
como
referencia.
referencia.
Las hematopoyetinas incluyen, por ejemplo
eritropoyetina, interleucina-2
(IL-2, proteína de 133 aminoácidos producida por
los linfocitos T e implicada en la proliferación de los linfocitos
T), IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7,
IL-9, IL-11, IL-13,
IL-15 (proteína similar a IL-2 de
114 aminoácidos, que estimula el crecimiento del epitelio
intestinal, los linfocitos T y las células NK), factor estimulante
de colonias de granulocitos (G-CSF), factor
estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos
(GM-CSF), oncostatina M (OSM) y factor inhibidor de
leucemia (LIF).
Los interferones comprenden, por ejemplo,
IFN-\alpha, IFN-\beta,
IFN-\gamma (proteína homodimérica de 143
aminoácidos producida por los linfocitos T y las células NK, que
está implicada en la activación de macrófagos, en el aumento de
expresión de las moléculas MHC y los componentes del tratamiento de
antígenos, en el cambio de posición de la clase IG y en la
supresión de T_{H}2).
Las inmunoglobulinas comprenden, por ejemplo,
B7.1 (CD80), y B7.2 (CD86), ambas coestimulan las respuestas de
linfocitos T.
La familia del factor de necrosis tumoral (TNF)
incluye, TNF-\alpha, TNF-\beta
(linfotoxina), linfotoxina-\beta
(LT-\beta), ligando CD40, ligando Fas, ligando
CD27, ligando CD30, ligando 4-1BB, Trail y ligando
OPG.
Varias citocinas que no están asignadas a una
familia específica incluyen, por ejemplo, el
factor-\beta de crecimiento tumoral
(TGF-\beta), IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-1 RA,
IL-10, IL-12 (factor estimulante de
células destructoras naturales, un heterodímero de una cadena de 197
aminoácidos y de una cadena de 306 aminoácidos, que está implicado
en la activación de las células NK y en la inducción de la
diferenciación de linfocitos T a las células similares a T_{H}1),
factor inhibidor de macrófagos (FIM), IL-16,
IL-17 (factor de inducción de la producción de
citocinas, que induce la producción de citocinas en epitelios,
endotelios y fibroblastos) e IL-18.
Las quimiocinas son una familia de citocinas que
son proteínas y polipéptidos quimiotaxinas relativamente pequeñas,
que estimulan la migración y activación de varias células, tal como
la migración de leucocitos (por ejemplo, fagocitos y linfocitos).
Las quimiocinas desempeñan una función en la inflamación y otras
respuestas inmunitarias. Las quimiocinas se han clasificado en
numerosas familias, incluyendo las quimiocinas C, quimiocinas CC,
quimiocinas CXC, y las quimiocinas CX_{3}C. Las denominaciones se
refieren al número y espaciado de restos de cisteína en las
moléculas; las quimiocinas C que tienen una cisteína, las
quimiocinas CC que tienen dos cisteínas contiguas, las CXC que
tienen dos cisteínas separadas por un solo resto de aminoácido y las
quimiocinas CX_{3}C que tienen dos cisteínas separadas por restos
de tres aminoácidos. Las quimiocinas interactúan con numerosos
receptores de quimiocina presentes en las superficies celulares.
Véase Janeway y Travers, Apéndice IV, pagina 680, cuyas
exposiciones aplicables están incorporadas a la presente memoria
como referencia.
Además, las quimiocinas pueden tener actividad
inmunomoduladora y han estado implicadas en respuestas inmunitarias
al cáncer. Por ejemplo, 6Ckine/SLC, el análogo de ratón de la
quimiocina humana tisular linfoide secundaria (SLC), actualmente
denominada frecuentemente CCL21, se ha publicado que provoca una
respuesta antitumoral, en una estirpe de células tumorales
C-26 del carcinoma de colon. Véase Vicari et al.
J. Immunol. 2000; 165(4):1992-2000.
CCL21 humana y su contrapartida murina, 6Ckine/SLC, están
clasificadas como quimiocinas CC, que interactúan con el receptor de
la quimiocina CCR7. Vicari et al. han publicado también que
la 6Ckine/SLC murina (muCCL21) es un ligando para el receptor de
quimiocinas CXCR3. CCL21 humana, muCCL21 murina y varias otras
quimiocinas están implicadas en la regulación de varias células del
sistema inmunitario tales como los dendrocitos, los linfocitos T y
las células destructoras naturales (NK).
Mig e IP-10 son quimiocinas CXC
que interactúan con el receptor CXCR3, que está asociado a
linfocitos T activados. La linfotactina es una quimiocina C, que
interactúa con el receptor XCR1 asociado a los linfocitos T y a
células NK. La fractalcina es una quimiocina CX_{3}C, que
interactúa con el receptor CX_{3}CR1 que está asociado a
linfocitos T, monocitos y neutrófilos.
Las células NK son linfocitos granulares grandes
que reconocen y destruyen células que han sido infectadas con un
virus. Las células NK pueden ser reguladas por la interacción de
ligandos de polipéptido inmunomoduladores con receptores en la
superficie de la célula NK. Por ejemplo, ligandos para el receptor
NKG2D que pueden regular la actividad de las células NK, incluyen
quimiocinas tales como muCCL21, y ligandos de polipéptido inducibles
por estrés tales como los antígenos relacionados con la cadena de
MHC clase 1 y las proteínas que se unen a UL16. Se ha informado de
que el péptido del antígeno con histocompatibilidad menor H60 murino
se une también al receptor NKG2D. Véase por ejemplo, Robertson et
al. Cell. Immunol. 2000; 199(1):8-14;
Choi et al. Immunity 2002; 17(5):
593-603 y Farag et al., Blood, 2002;
100(6):1935-1947.
La presente invención satisface una necesidad en
curso para las vacunas que pueden estimular una respuesta
inmunitaria general contra las células cancerosas proporcionando una
vacuna de ADN que codifica una proteína de la familia IAP asociada
al cáncer y un producto génico inmunoactivo en un solo vector.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vacuna de ADN eficaz para provocar una
respuesta inmunitaria contra las células cancerosas comprende un
montaje de ADN que codifica operativamente una proteína y un
producto génico inmunoactivo en un vehículo de survivina
farmacéuticamente aceptable. El montaje de ADN se incorpora
operativamente a un vector tal como una bacteria atenuada (por
ejemplo, un vector de Salmonella typhimurium atenuada). La
vacuna de ADN incluye un polinucleótido que codifica por lo menos
una proteína junto con un polinucleótido que codifica un producto
génico survivina inmunoactivo. Preferentemente el producto génico
inmunorreactivo codificado por el montaje de ADN es una citocina,
un ligando para el receptor de la superficie de las células
destructoras naturales o una molécula inmunorreactiva
similar.
similar.
En una forma de realización, la vacuna de ADN
comprende preferentemente un ADN que codifica operativamente una
proteína survivina seleccionada de entre el grupo constituido por
(a) survivina humana natural con la secuencia SEC. ID. nº: 2 de
restos de aminoácidos, (b) un homólogo inmunógeno de survivina
humana natural con la secuencia de restos de aminoácidos por lo
menos 80% idénticos a la SEC. ID. nº: 2, (c) una variante de corte
y empalme de survivina humana con la secuencia de restos de
aminoácidos de SEC. ID. nº: 23, (d) una variante de corte y empalme
de la survivina humana con la secuencia de restos de aminoácidos
SEC. ID. nº: 24, y (e) un fragmento de una proteína survivina que
se une a una molécula MHC de clase I y es reconocido por linfocitos
T citotóxicos.
La citocinas preferidas incluyen quimiocinas,
tales como CCL21 humana, CCL21 murina, linfotactina, fractalcina,
IP-10 y similares, hematopoyetinas, tales como
IL-2, IL-15 y similares;
interferones, tales como IFN-\gamma y similares;
así como otras citocinas asociadas a la migración o proliferación de
linfocitos T y células NK, tales como IL-12,
IL-17 y similares.
Los ligandos receptores de la superficie de las
células destructoras naturales preferidas son proteínas inducibles
por estrés tales como MICA humana, MICB humana, ULBP1 humana, ULBP2
humana, ULBP3 humana y similares, que se unen al receptor de la
superficie de células NKG2D. Los ligandos NKG2D particularmente
preferidos son MICA y MICB.
Los adyuvantes convencionales tales como
alúmina, emulsiones de aceite en agua, conservantes y similares,
pueden estar también presentes en las vacunas. Las vacunas de ADN de
la presente invención estimulan una respuesta inmunitaria contra
las células tumorales, incluyendo la estimulación de la apoptosis de
la célula tumoral, inhibiendo de este modo el crecimiento tumoral y
la metástasis.
En un aspecto del procedimiento de la presente
invención, se utiliza una vacuna de ADN para proporcionar inhibición
del crecimiento del tumor de larga duración en un paciente
vacunado. Una vacuna de ADN que comprende un montaje
polinucleotídico operable que codifica una proteína survivina y un
producto génico inmunoactivo en un vehículo farmacéuticamente
aceptable se administra (preferentemente por vía bucal) a un
paciente necesitado de inhibición del crecimiento tumoral en una
cantidad que es suficiente para provocar un respuesta inmunitaria
contra las células tumorales.
Las vacunas de la presente invención son útiles
para el tratamiento de varios tipos de cánceres. Por ejemplo, un
paciente que padece un cáncer pulmonar, cáncer colorrectal, melanoma
y similares, puede beneficiarse de la inmunización por las vacunas
de la presente invención.
En los dibujos, la figura 1 representa la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica la survivina humana,
SEC. ID. nº: 1;
la figura 2 representa la secuencia de restos de
aminoácidos de la survivina humana, SEC. ID. nº: 2;
la figura 3 representa la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la TIAP murina, SEC. ID. nº: 3;
la figura 4 representa la secuencia de ácidos
nucleicos de la TIAP murina, SEC. ID. nº: 4;
la figura 5 representa la homología de
secuencias entre la survivina humana y la TIAP murina;
la figura 6 representa la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la SLC humana (CCL21), SEC. ID. nº: 5;
la figura 7 representa la secuencia de restos de
aminoácidos de la SLC humana (CCL21), SEC. ID. nº: 6;
la figura 8 representa la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la 6Ckine/SLC murina (muCCL21), SEC. ID. nº:
7;
la figura 9 representa la secuencia de
aminoácidos de la 6Ckine/SLC murina (muCCL21), SEC. ID. nº: 8;
la figura 10 representa la homología de
proteínas entre SLC humana (CCL21) y 6Ckine/SLC murina (
muCCL21);
la figura 11 representa una secuencia parcial de
ácidos nucleicos que codifica el péptido H60 del antígeno murino
con histocompatibilidad menor, SEC. ID. nº: 9;
la figura 12 representa una secuencia parcial de
restos de aminoácidos del péptido H60 del antígeno con
histocompatibilidad menor, SEC. ID. nº: 10;
la figura 13 es una representación esquemática
de montajes de ADN que codifica a una proteína survivina (survivina
murina, conocida también como TIAP) y una quimiocina
inmunomoduladora (CCL21, conocida también como SLC) en un vector
pBudCE4.1;
la figura 14A representa gráficamente el volumen
medio del tumor para la metástasis pulmonar de carcinomas
pulmonares de Lewis en ratones tratados con un tampón de referencia
(E), una vacuna de referencia que comprende un vector vacío (D),
una vacuna de ADN que se compone de una quimiocina (C), una vacuna
que se compone de una proteína (B) survivina y una vacuna de la
invención (A); la figura 14B incluye fotografías de la metástasis
de tumor pulmonar típica extirpada del ratón vacunado tal como se
describe en la Fig. 14A;
la figura 15 representa la citotoxicidad mediada
por linfocitos T provocada por las vacunas de ADN descritas en la
figura 14A contra las células de cáncer pulmonar D121; el porcentaje
de lisis (eje Y) está representado por tres células efectoras
diferentes para las relaciones (E/T) de la célula diana para cada
vacunación (es decir, 100:1, punto del primer dato; 50:1, punto del
segundo dato y 25:1, punto del tercer dato);
la figura 16 ilustra gráficamente la expresión
regulada por aumento de la activación de linfocitos T en ratones
vacunados con una vacuna de la invención, tal como se determina por
el análisis de citometría de flujo;
la figura 17 ilustra gráficamente la expresión
aumentada de moléculas coestimuladoras por dendrocitos, después de
las vacunaciones de ratones con una vacuna de la invención y varias
vacunas de referencia;
la figura 18 ilustra la inducción de liberación
de citocina intracelular después de las vacunaciones de ratones con
una vacuna de la invención y varias vacunas de referencia, tal como
se determina por el análisis de citometría de flujo;
la figura 19 ilustra representaciones en FACS
que demuestran un aumento en la apoptosis en células D121 de tumor
pulmonar después de la vacunación de ratones con la vacuna de la
invención y varias vacunas de referencia (A) 3 horas después de la
vacunación; y (B) 24 horas después de la vacunación;
la figura 20 representa una representación
esquemática de montajes de expresión que incorporan TIAP y un
péptido H60 del antígeno con histocompatibilidad menor;
la figura 21 ilustra gráficamente datos de
ensayos de citotoxicidad de esplenocitos aislados de ratones
vacunados con una vacuna de la invención;
la figura 22 representa pulmones extirpados de
ratones vacunados tal como se describe en el Ejemplo 10 (superior)
y un gráfico de barras (inferior) del peso medio del pulmón de
ratones de los grupos de tratamiento;
\newpage
la figura 23 es un gráfico del porcentaje de
supervivencia de ratones vacunados y sometidos a la prueba de
provocación con células CT-26 de tumor;
la figura 24 ilustra la expresión del péptido
H60 (A) y muSurvivina (B);
la figura 25 ilustra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la variante CCL21b de 6Ckine/SLC, SEC. ID.
nº: 11;
la figura 26 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos de la variante CCL21b de 6Ckine/SLC, SEC. ID. nº:
12;
la figura 27 ilustra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la MICA humana, SEC. ID. nº: 13;
la figura 28 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos de la MICA humana, SEC. ID. nº: 14;
la figura 29 ilustra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la MICB humana, SEC. ID. nº: 15;
la figura 30 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos de la MICB humana, SEC. ID. nº: 16;
la figura 31 ilustra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la ULBP1 humana, SEC. ID. nº: 17;
la figura 32 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos de la ULBP1 humana, SEC. ID. nº: 18;
la figura 33 ilustra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la ULBP2 humana, SEC. ID. nº: 19;
la figura 34 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos de la ULBP2 humana, SEC. ID. nº: 20;
la figura 35 ilustra la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la ULBP3 humana, SEC. ID. nº: 21;
la figura 36 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos de la ULBP3 humana, SEC. ID. nº: 22;
la figura 37 ilustra la secuencia de restos de
aminoácidos de la survivina-2B (SEC. ID. nº: 23)
variante de corte y empalme de la survivina humana y de la
survivina-\DeltaEx3 (SEC. ID. nº: 24) variante y
empalme;
la figura 38 es una reproducción del registro en
GENBANK para el nº de Registro NP 005922, que describe variantes
alélicas de MICB;
la figura 39 representa la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la variante de corte y empalme de livina
alfa humana completa, SEC. ID. nº: 26;
la figura 40 representa la secuencia de
aminoácidos de la variante de corte y empalme de livina alfa humana,
SEC. ID. nº: 27;
la figura 41 representa la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica la variante de corte y empalme de livina
beta humana completa, SEC. ID. nº: 28; y
la figura 42 representa la secuencia de
aminoácidos de la variante de corte y empalme de livina beta humana,
SEC. ID. nº: 29.
\vskip1.000000\baselineskip
Una vacuna de ADN eficaz para provocar una
respuesta inmunitaria contra las células tumorales se compone de un
montaje de ADN que codifica operativamente la proteína survivina y
un producto génico inmunoactivo. La expresión "montaje de ADN"
tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones
adjuntas significa una estructura de ADN sintético que puede
transcribirse en células diana. El montaje puede comprender un ácido
nucleico lineal, tal como un ADN purificado, un ADN incorporado en
un vector plásmido, o un ADN incorporado en cualquier otro vector
adecuado para introducir ADN en una célula hospedadora.
Preferentemente, el ADN se incorpora en un vector vírico o
bacteriano, más preferentemente en un vector vírico o bacteriano
atenuado, que no es patógeno, aún más preferentemente en un vector
bacteriano atenuado.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el
término "inmunidad", se refiere a la protección inmunológica
de larga duración contra la forma virulenta del agente infeccioso o
del antígeno tumoral. El término "inmunización", se refiere a
la exposición profiláctica a un antígeno de un agente patógeno
procedente de una fuente no virulenta, que produce inmunidad al
patógeno en el paciente tratado.
El término "anticuerpo", tal como se
utiliza en la presente memoria, se refiere a una molécula que es una
proteína glucosilada, una inmunoglobulina, que se une
específicamente a un antígeno.
El término "antígeno", tal como se utiliza
en la presente memoria, indica una entidad que, cuando se introduce
en un animal inmunocompetente, estimula la producción de anticuerpo
o anticuerpos específicos que pueden combinarse con el antígeno. El
término "inmunógeno", tal como se utiliza en la presente
memoria, indica una entidad que por sí misma no puede estimular la
producción de anticuerpos pero puede hacerlo si se combina con un
vehículo.
La expresión "sustitución conservadora",
tal como se utiliza en la presente memoria indica el reemplazamiento
de un resto de aminoácido por otro, resto biológicamente similar.
Los ejemplos de sustituciones conservadoras, incluyen la
sustitución de un resto hidrófobo tal como isoleucina, valina,
leucina o metionina por otro, la sustitución de un resto hidrófilo
tal como arginina por lisina o viceversa, ácido glutámico por ácido
aspártico y viceversa o glutamina por asparagina y viceversa y
similares.
La expresión "corresponde sustancialmente",
en sus varias formas gramaticales, tal como se utiliza en la
presente memoria se refiere a medios de secuencias peptídicas, una
secuencia peptídica tal como se describe más o menos de hasta tres
restos de aminoácidos en uno de las dos o ambos terminales amino y
carboxi y que contiene solamente sustituciones conservadoras a lo
largo de la secuencia polipeptídica.
La expresión "producto génico
inmunoactivo", y sus variaciones gramaticales, tal como se
utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas,
incluye proteínas y polipéptidos con actividad inmunomoduladora,
tales como las proteínas y polipéptidos que interactúan con la
actividad de los linfocitos T y de las células NK y la modulan.
La expresión "proteína de la familia IAP",
tal como se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones
adjuntas, incluye cualquiera de las clases de antígenos naturales
expresados en células tumorales, que inhiben la apoptosis en su
forma natural. Las proteínas de la familia IAP incluyen, por
ejemplo, survivina humana, IAP unida al cromosoma X humano (XIAP),
TIAP murina (análogo murino de survivina), livina humana,
c-IAP-1 humana,
c-IAP-2 humana, NAIP humana,
cualquier otra proteína que incluya por lo menos un inhibidor
baculovírico del dominio con repetición (BIR) de apoptosis o un
homólogo de las mismas. El dominio BIR está presente en todas las
proteínas de la familia IAP naturales. Incluye cuatro hélices alfa
relativamente cortas y una zona de estructura de la lámina beta
antiparalela de tres cadenas. El dominio une el Zn utilizando tres
restos de cisteína y un resto de histidina, que se conservan a
través de las proteínas de la familia IAP. La expresión "proteína
de la familia IAP", tal como se utiliza en la presente memoria y
en las reivindicaciones adjuntas incluye también variantes de
proteínas IAP naturales, tales como las variantes de corte y empalme
y las variantes de sustitución, y similares, así como fragmentos y
homólogos inmunógenos de las mismas que se unen a una molécula de
clase I (MHC) con histocompatibilidad mayor y son reconocidas por
los linfocitos T citotóxicos (es decir, epítopos de la proteína
survivina).
La expresión "asociada al cáncer", tal como
se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones
adjuntas, en referencia a las proteínas de la familia IAP significa
una proteína de la familia IAP que se expresa en concentraciones
elevadas en las células de cáncer que está en las células normales,
no cancerosas. Los ejemplos de proteínas de la familia IAP
asociadas al cáncer incluyen, sin limitación, survivina humana y
livina humana.
La expresión "proteína survivina", tal como
se utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas
comprende la molécula survivina humana completa (SEC. ID. nº: 2),
el análogo murino completo de la misma (es decir, TIAP, tal como se
describe en la presente memoria), variantes de survivina humana o de
survivina murina, tal como las variantes de corte y empalme y las
variantes de sustitución, así como fragmentos (por ejemplo,
epítopos) de survivina humana y homólogos inmunógenos de survivina
humana que se unen a una molécula (MHC) de clase I, con
histocompatibilidad mayor y son reconocidos por los linfocitos T
citotóxicos. Las variantes de sustitución conocidas de survivina
humana comprenden una proteína con la sustitución T34A en la
secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de aminoácidos, una proteína que
tiene la sustitución D53A en la secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos
de aminoácidos y una proteína con la sustitución C84A en la
secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de aminoácidos (véase Song et
al., Mol. Biol. Cell, 2004;
15(3):1287-1296, Publicación E de 29 de
diciembre de 2003). Cada una de estas variantes conocidas tiene
actividad apoptósica, en contraste con la survivina natural que
tiene actividad antiapoptósica.
En una forma de realización preferida, la vacuna
de ADN de la presente invención comprende un montaje de ADN que
codifica operativamente una proteína survivina tal como la survivina
humana natural que tiene la secuencia SEC. ID. nº: 2 de restos de
aminoácidos, un homólogo inmunógeno de la survivina humana natural
que tiene una secuencia de restos de aminoácidos por lo menos 80%
idéntica a la SEC. ID. nº: 2, una variante de corte y empalme de la
survivina humana con la secuencia SEC. ID. nº: 23 de restos de
aminoácidos, una variante de corte y empalme de la survivina humana
con la secuencia SEC. ID. nº: 24 de restos de aminoácidos, y un
fragmento de la proteína survivina que se une a la molécula MHC de
clase I y es reconocida por linfocitos T citotóxicos.
La expresión "proteína livina", tal como se
utiliza en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas,
comprende la variante de corte y empalme livina alfa humana completa
(SEC. ID. nº: 27) la variante de corte y empalme de la livina beta
humana (SEC. ID. nº: 29), las variantes de corte y empalme de livina
alfa y beta humanas, así como los fragmentos y los homólogos
inmunógenos de las mismas que se unen a una molécula MHC de clase I
y son reconocidas por los linfocitos T citotóxicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria y en
las reivindicaciones adjuntas, la expresión "homólogo
inmunógeno" y sus variaciones gramaticales, cuando se utilizan
en referencia a las proteínas de la familia IAP asociadas al
cáncer, tales como survivina y livina, significa una proteína con un
alto grado de homología para una proteína de la familia IAP natural
asociada al cáncer y que puede unirse a una molécula MHC de clase I
y puede ser reconocida por linfocitos T citotóxicos que son activos
contra la correspondiente proteína natural de la familia IAP.
Preferentemente los homólogos inmunógenos tienen una secuencia de
restos de aminoácidos que por lo menos es aproximadamente 80%
idéntica a la secuencia de aminoácidos de proteína de la familia IAP
natural asociada al cáncer, más preferentemente por lo menos
aproximadamente 90% idéntica, aún más preferentemente por lo menos
aproximadamente 95% idéntica.
Sin estar ligados por la teoría, se cree que la
vacunación de un paciente, tal como un paciente humano, con una
vacuna de la invención conduce a la presentación selectiva de
antígenos derivados de la proteína de la familia IAP asociada al
cáncer en la superficie de células inmunitarias, tales como las
células presentadoras de antígeno, y además a la expresión
selectiva del producto génico inmunoactivo en estas células. La
presentación aumentada de la proteína de la familia IAP asociada al
cáncer, tal como la proteína survivina o la proteína livina en la
superficie celular de la célula presentadora de antígeno, en
combinación con la expresión de un producto génico inmunoactivo,
tal como una citocina o un ligando para un receptor de la superficie
de la célula NK, conduce a una respuesta inmunitaria aumentada
contra las células cancerosas que expresan proteínas de la familia
IAP asociadas al cáncer, tales como la proteína survivina o la
proteína livina. En personas adultas, la survivina se expresa casi
exclusivamente en células cancerosas. Asimismo la expresión de
livina, es supuestamente elevada en algunas estirpes de células de
cáncer, particularmente en estirpes de células de melanoma.
En una forma de realización preferida, la vacuna
de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica de
manera operativa una proteína survivina y una citocina.
Preferentemente, la proteína survivina es survivina humana, una
survivina murina o un epítopo de las mismas. Preferentemente la
citocina modula la actividad de los linfocitos T o de las células
NK. Las citocinas preferidas incluyen quimiocinas, hematopoyetinas e
interferones. Otras citocinas preferidas incluyen citocinas
activadoras de células NK tales como IL-12 y
factores estimulantes de producción de citocina tal como
IL-17.
Las quimiocinas preferidas incluyen quimiocinas
CC, particularmente aquellas que son ligandos para el receptor CCR7
de quimiocina, tal como CCL21 (SLC) y similares; quimiocinas C que
son ligandos del receptor CR1, tal como linfotactina y similares;
las quimiocinas CX_{3}C que son ligandos del receptor CX_{3}CR1,
tal como la fractalcina y similares; quimiocinas CXC,
específicamente las que son ligandos del receptor CXCR3, tal como
IP-10 y similares. Aún más preferentemente la
quimiocina es la CCL21 humana o el análogo murino de la misma
(CCL21 murina).
Las hematopoyetinas preferidas incluyen los
factores de crecimiento de linfocitos T tales como
IL-2, IL-15 y similares. Los
interferones preferidos incluyen los producidos por los linfocitos T
y las células NK, tales como IFN-\gamma y
similares. Otras citocinas preferidas incluyen las citocinas
activadoras de células NK tales como IL-12 y
similares, y las citocinas que inducen la producción de citocina en
células tales como la de los epitelios, endotelios y fibroblastos,
incluyendo IL-17 y similares.
En otra forma de realización preferida, la
vacuna de ADN comprende una secuencia polinucleotídica que codifica
de manera operativa una proteína survivina y un ligando para un
receptor de la superficie de las células destructoras naturales.
Preferentemente, la proteína survivina es la survivina humana, la
survivina murina o un epítopo de la survivina humana.
Preferentemente el ligando para un receptor de la superficie de las
células destructoras natural es un ligando para el receptor de la
superficie de las células NKG2D. Preferentemente el receptor de la
superficie de las células NKG2D, es un antígeno (MIC) relacionado
con la cadena de MHC de clase I tales como MICA y MICB, una
proteína de fijación UL16 (ULBP) tales como ULBP1, ULBP2 y ULBP3 y
similares. Los ligandos NKG2D murinos comprenden, por ejemplo, Rae1
y el péptido H60 del antígeno de histocompatibilidad menor. Aún más
preferentemente, el ligando para el receptor de la superficie
celular NKG2D es MICA o MICB.
Preferentemente, un montaje de ADN de la
presente invención, que codifica de manera operativa una proteína y
un producto génico inmunoactivo, survivina, está también unido de
manera operativa a los elementos reguladores necesarios para la
expresión génica, que son bien conocidos en la técnica.
Preferentemente, el montaje de ADN se incorpora
de manera operativa, en un vector de expresión tal como el vector
de expresión BUDCE4.1 disponible en Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA.
Otros vectores de expresión adecuados, están disponibles en el
mercado, por ejemplo, en BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA. Una
vez incorporado en el vector de expresión, el montaje de ADN puede
introducirse en un vector hospedador tal como un vector bacteriano
vivo y atenuado transfectando la célula hospedadora con el vector de
expresión para proporcionar una vacuna de la presente
invención.
Los montajes de ADN comprenden preferentemente
elementos reguladores necesarios para la expresión de los
nucleótidos. Dichos elementos incluyen, por ejemplo, un activador,
un codón de iniciación, un codón de terminación y una señal de
poliadenilación. Además, se requieren con frecuencia potenciadores
para la expresión de una secuencia que codifica una proteína diana
inmunógena. Como es conocido en la técnica, estos elementos están
preferentemente unidos de manera operativa a la secuencia que
codifica la proteína deseada. Se seleccionan preferentemente
elementos reguladores que son compatibles con la especie a la que
van a administrarse.
Los codones de iniciación y los codones de
terminación están incluidos preferentemente como parte de una
secuencia nucleotídica que codifica a la proteína survivina y el
polipéptido inmunomodulador es una vacuna genética de la presente
invención. Los codones de iniciación y los codones de terminación
deben estar, desde luego, en el marco con las secuencias de
codificación para la proteína survivina y el polipéptido
inmunomodulador.
Los activadores y las señales de poliadenilación
incluidas en una vacuna de la presente invención se seleccionan
preferentemente para que sean funcionales dentro de las células del
paciente que va a ser inmunizado.
Los ejemplos de activadores útiles en las
vacunas de la presente invención, especialmente en la producción de
una vacuna genética para seres humanos, incluyen pero no se limitan
a los activadores del Virus 40 de Simio (SV40), al activador del
virus del tumor de mama de ratón (MMTV), el virus de
inmunodeficiencia humana (VIH) tal como el activador de la
repetición terminal larga (LTR) del VIH, el virus de Moloney,
citomegalovirus (CMV) tal como el activador precoz inmediato de
CMV, el virus de Epstein-Barr Virus (EBV), el virus
del sarcoma de Rous (RSV) así como activadores de genes humanos,
tales como actina humana, miosina humana, hemoglobina humana,
creatina de los músculos humanos y metaltioneína humana.
Los ejemplos de señales de poliadenilación
útiles en las vacunas de la presente invención, especialmente en la
producción de una vacuna genética para seres humanos, comprenden de
manera no limitativa a las señales de poliadenilación de SV40 y a
las señales de poliadenilación de LTR.
Además de los elementos reguladores necesarios
para la expresión de ADN pueden incluirse también otros elementos
en la molécula de ADN. Dichos elementos adicionales incluyen
potenciadores. El potenciador puede ser, por ejemplo, actina
humana, miosina humana, hemoglobina humana, creatina del músculo
humano y potenciadores víricos tales como los de CMV, RSV y
EBV.
Las secuencias reguladoras y los codones
generalmente dependen de la especie. Para maximizar la producción
de proteínas, las secuencias reguladoras y los codones se
seleccionan para que sean eficaces en las especies que van a
inmunizarse. Un experto en la materia puede producir fácilmente
montajes de ADN que son funcionales en una especie de paciente
dado.
Los montajes de ADN de las presentes vacunas
pueden ser ADN "desnudos" como se define en Restifo et al.
Gene Therapy 2000; 7:89-92, cuya exposición
pertinente incorporada como referencia. Preferentemente, el ADN
está incorporado de manera operativa en un vector. Los vectores de
suministro útiles incluyen microcápsulas biodegradables, complejos
inmunoestimulantes (ISCOM) o liposomas, y vectores vivos atenuados
modificados genéticamente tales como virus o bacterias.
Los ejemplos de vectores bacterianos vivos
atenuados adecuados incluyen Salmonella typhimurium,
Salmonella typhi, especies de Shigella, especies de
Bacillus, especies de Lactobacillus, bacilo
Calmette-Guerin (BCG), Escherichia coli,
Vibrio cholerae, especies de Campylobacter, especies
de Listeria, o cualquier otro vector bacteriano adecuado,
como es conocido en la materia. Preferentemente el vector es un
vector de Salmonella typhimurium vivo atenuado. Las
Salmonella typhimurium vivas atenuadas preferidas incluyen
las cepas AroA^{-} tal como SL7207, o las cepas
AroA^{-} y dam^{-} doblemente atenuadas, tal como
RE88. Las AroA^{-} y dam^{-} doblemente atenuadas
Salmonella typhimurium son un vector particularmente
preferido.
Los procedimientos de transformación de vectores
bacterianos vivos con un montaje de ADN exógeno están bien
descritos en la materia. Véase, por ejemplo, Joseph Sambrook y David
W. Rusell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3ª ed.,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York
(2001) (Sambrook y Rusell).
Los vectores víricos preferidos incluyen
bacteriófagos, herpes virus, adenovirus, virus de la poliomielitis,
virus de la vacuna y virus de la viruela aviar. Los procedimientos
de transformación del vector vírico con un montaje de ADN exógeno
están también bien descritos en la técnica. Véase Sambrook y Rusell,
anteriormente.
Los vectores liposómicos útiles son vesículas
unilaminares o multilaminares, que tienen una parte de la membrana
formada por material lipófilo y una parte acuosa interior. La parte
acuosa se utiliza en la presente invención para contener el
material polinucleotídico que va a suministrarse a la célula diana.
Resulta generalmente preferido que el liposoma que forma los
materiales que tienen un grupo catiónico, como por ejemplo un grupo
amonio cuaternario, uno o más grupos lipófilos, como por ejemplo
grupos alquilo saturados o insaturados, que tienen aproximadamente
6 a aproximadamente 30 átomos de carbono. Un grupo de materiales
adecuados se describe en la solicitud de patente europea 0187702, y
expuesto además en la patente US nº 6.228.844 de Wolff et
al., cuyas descripciones pertinentes están incorporadas como
referencia. Muchos otros compuestos lipídicos catiónicos adecuados
que forman liposomas se describen en la bibliografía. Véase, por
ejemplo, L. Stamatatos, et al., Biochemistry 1988;
27:3917-3925; y H. Eibl, et al., Biophysical
Chemistry 1979; 10:261-271. Alternativamente,
puede utilizarse una microesfera, tal como una microesfera
biodegradable de poliactida-coglicolida. Un montaje
de ácido nucleico está encapsulado o por el contrario acomplejado
con el liposoma o la microesfera para suministrar el ácido nucleico
a un tejido, como se conoce en la técnica.
Otros vectores útiles incluyen microesferas
poliméricas que comprenden materiales poli(ortoéster)
biodegradables, tal como se describe en Wang et al., Nat.
Mater., 2004; 3(3):190-6. Epub 15 de
febrero de 2004, cuyas descripciones aplicables se incorporan a la
presente memoria como referencia.
Un aspecto del procedimiento de la presente
invención implica administrar vacuna de ADN operativamente que
codifica una proteína y un producto génico inmunorreactivo de
survivina al tejido de un mamífero, como por ejemplo un ser humano.
En algunas formas de realización preferidas, las vacunas de ADN se
administran por vía bucal, intramuscular, intranasal,
intraperitoneal, subcutánea, intradérmica o tópica. Preferentemente
la vacuna de ADN se administra por vía bucal.
En un procedimiento preferido, una vacuna de ADN
de la presente invención puede utilizarse para proporcionar
inhibición a largo plazo del crecimiento del tumor en un paciente
tratado por la vacuna. La vacuna de ADN comprende un montaje
polinucleotídico de ADN que codifica operativamente una proteína
survivina, un producto génico inmunoreactivo, como por ejemplo una
citocina, o un ligando para un receptor de la superficie de las
células NK y un vehículo farmacéuticamente aceptable de las mismas.
La vacuna se administra a un mamífero que requiera inhibición de
células crecimiento tumoral en una cantidad que es suficiente para
provocar una respuesta inmunitaria para las células tumorales.
Preferentemente el mamífero tratado con una
vacuna de la invención, es un ser humano. Un paciente que padece
cáncer, tal como, carcinoma pulmonar o de colon, tumores de mama o
tumores de próstata, y cánceres similares, puede beneficiarse de la
inmunización mediante las vacunas de la presente invención.
Las vacunas de la presente invención
preferentemente se formulan con vehículos o excipientes
farmacéuticamente aceptables tales como agua, solución salina,
dextrosa, glicerol y similares, así como combinaciones de los
mismos. Las vacunas pueden contener también sustancias auxiliares,
tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes, tampones,
conservantes, adyuvantes y similares.
Las vacunas de la presente invención, se
administran preferentemente por vía bucal a un mamífero, tal como
un ser humano, en forma de solución o suspensión, en un vehículo
farmacéuticamente aceptable, a una concentración de ADN comprendida
en el intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10
microgramos por mililitro. La dosis apropiada dependerá del
paciente que va a ser vacunado, y en parte del criterio del
especialista médico que administra o solicita la administración de
la vacuna.
Las vacunas de la presente invención pueden
estar envasadas en recipientes esterilizados de manera apropiada,
como por ejemplo ampollas, botellas o viales, en forma de dosis
múltiples o en dosis unitarias. Los recipientes están
preferentemente herméticamente sellados después de rellenarse con
una preparación de la vacuna. Preferentemente, las vacunas se
envasan en un recipiente que tiene una etiqueta fijada al mismo,
etiqueta que identifica la vacuna, y lleva una nota en la forma
prescrita por la agencia gubernamental tal como la United States
Food and Drug Administration que refleja la aprobación de la vacuna
por leyes apropiadas, información de la dosis y similares. La
etiqueta contiene preferentemente información acerca de la vacuna
que es útil para un profesional en atención sanitaria que
administra la vacuna a un paciente. El envase contiene además
preferentemente materiales de información impresos en relación con
la administración de la vacuna, instrucciones, indicaciones y
algunas advertencias necesarias requeridas.
La secuencia de ADN de survivina humana y su
correspondiente secuencia de la proteína han sido descritas por
Strausberg en la base de datos EMBL del European
Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de registro de ADN BC034148, cuyas
descripciones están incorporadas en la presente memoria como
referencia. La secuencia de ADN y la correspondiente secuencia de la
proteína de TIAP murina han sido descritas por Kobayashi et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. 1999; 96:1457-62; nº de
registro de ADN AB01389 en la base de datos EMBL del
Instituto Bioinformático Europeo, Wellcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas descripciones están
incorporadas a la presente memoria como referencia.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la
survivina humana se presenta en la figura 1 (SEC. ID. nº: 1), y su
correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 2)
se proporciona en la figura 2. La secuencia de ácidos nucleicos que
codifica la survivina murina (es decir, TIAP) se presenta en la
figura 3 (SEC. ID. nº: 3), y su correspondiente secuencia de restos
de aminoácidos (SEC. ID. nº: 4) se proporciona en la figura 4.
La homología de proteínas entre la survivina
humana y su contrapartida murina, TIAP, se ilustra en la figura 5.
Hay aproximadamente 83% de identidad de secuencia de restos de
aminoácidos entre la survivina humana (SEC. ID. nº: 2) y la TIAP
murina (SEC. ID. nº: 4) como se muestra en la figura 5.
Mahotka et al., han identificado dos
variantes de corte y empalme de survivina humana, denominadas
survivina-\DeltaEx3 y
survivina-2B, que también son adecuadas para su
utilización en la presente invención. Mahotka et al., Cancer
Res., 1999; 59:6097-6102, cuyas descripciones
pertinentes están incorporadas en la presente memoria como
referencia. Las secuencia de restos de aminoácidos de
survivina-2B (SEC. ID. nº: 23), y de la
survivina-\DeltaEx3 (SEC. ID. nº: 24) se muestran
en la figura 37. Hirohashi et al., han identificado un
epítopo potente de linfocitos T de la survivina-2B
que presenta la secuencia de restos de aminoácidos AYACNTSTL (SEC.
ID. nº: 25), denominada
survivina-2B80-88, que provoca una
respuesta a linfocitos T citotóxicos contra la
survivina-2B. Hirohashi et al., Clinical Cancer
Res., 2002; 8:1731-39, cuyas descripciones
pertinentes están incorporadas a la presente memoria como
referencia. Este epítopo, es un fragmento de survivina que puede
unirse a una molécula MHC de clase I y es reconocido por los
linfocitos T citotóxicos, y es adecuado para su utilización en el
componente de la proteína de la familia IAP de una vacuna de la
presente invención.
Otra variante de corte y empalme de la survivina
humana es la variante survivina-3B descrita por
Badran et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2004;
314(3):902-907. La secuencia polinucleotídica
que codifica la survivina-3B y su correspondiente
secuencia de restos de aminoácidos se describe en la base de datos
EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust
Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de registro de
ADN AB154416, cuyas descripciones están incorporadas a la presente
memoria como referencia.
La livina humana completa (conocida como la
variante alfa) es una proteína de la familia IAP, que tiene un solo
dominio BIR y que está constituida por 298 restos de aminoácidos. La
secuencia de ADN y la correspondiente secuencia de la proteína de
la variante alfa de livina humana han sido publicadas por Clark
et al., en la base de datos EMBL del European
Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de registro de ADN NM 139317, cuyas
exposiciones están incorporadas a la presente memoria como
referencia. La secuencia de ADN y la correspondiente secuencia de la
proteína de la variante beta de livina humana han sido publicadas
por; nº de registro NM 022161 en la base de datos EMBL del
European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están
incorporadas a la presente memoria como referencia.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la
livina humana completa (variante alfa) se representa en la figura
39 (SEC. ID. nº: 26), y su correspondiente secuencia de restos de
aminoácidos (SEC. ID. nº: 27) se proporciona en la figura 40. La
secuencia de ácidos nucleicos que codifica la variante beta de la
livina humana se representa en la figura 41 (SEC. ID. nº: 28), y su
correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº:
29) se proporciona en la figura 42. La variante beta de la livina
humana carece de los restos 216 a 233 de aminoácidos de la variante
de corte y empalme de la livina alfa humana completa (SEC. ID. nº:
27). La variante beta es idéntica a la variante alfa de la livina
humana desde todos los demás puntos de vista. El dominio BIR tanto
de las variantes alfa como beta de la livina humana está en la zona
desde el resto R90 de aminoácido hasta el resto L155 de aminoácido
de las SEC. ID. nº: 27 y la SEC. ID. nº: 29.
En una forma de realización preferida, las
vacunas de la presente invención se componen de montajes de ADN que
codifican una o más proteínas de survivina, tal como la survivina
humana, TIAP (survivina murina) y homólogos inmunógenos de las
mismas. Los homólogos inmunógenos comparten preferentemente por lo
menos aproximadamente el 80% de identidad de secuencia de restos de
aminoácidos con la survivina humana, más preferentemente por lo
menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de restos de
aminoácidos, aún más preferentemente por lo menos aproximadamente
95% de identidad de secuencia de restos de aminoácidos con la SEC.
ID. nº: 2. Alternativamente, la vacuna puede comprender un montaje
de ADN que codifica uno o más epítetos de linfocito T de la proteína
survivina humana.
Debido a la degeneración intrínseca del código
genético, las secuencias de ADN que codifican sustancialmente la
misma secuencia o una secuencia de restos de aminoácidos
funcionalmente equivalente a las proteínas naturales de la familia
IAP asociadas al cáncer (es decir, naturales) tales como la
survivina humana, la survivina murina y otras variantes de corte y
empalme de la livina humana, pueden utilizarse en las vacunas de la
invención. Dichas secuencias de ADN incluyen las que son capaces de
hibridarse con las secuencias de ADN de la survivina natural, así
como las variantes alélicas y similares. Preferentemente el ADN de
los homólogos funcionalmente equivalentes, comparten por lo menos
aproximadamente 70% de identidad de la secuencia de nucleótidos con
el ADN que codifica las proteínas de la survivina natural
mencionada anteriormente, más preferentemente por lo menos
aproximadamente 80% de identidad de secuencia de nucleótidos.
Los productos génicos inmunoactivos codificados
por los montajes de ADN de las presentes vacunas son preferentemente
citocinas o ligandos de receptores naturales de la superficie de la
célula destructora. Particularmente las citocinas preferidas son
las quimiocinas CC. Las quimiocinas CC particularmente útiles son
ligandos para el receptor de la quimiocina CCR7. Los ligandos
selectivos CCR7 incluyen CCL19 (conocido también como
exodus-3, ELC, MIP-3\beta,
CK\beta11) y CCL21 (conocido también como
exodus-2, SLC, 6Ckine, TCA4 y CK\beta9). Las
quimiocinas particularmente preferidas son CCL21 humana y su
contrapartida murina 6Ckine/SLC (muCCL21) y las quimiocinas que
corresponden sustancialmente a éstas.
Las secuencias de ADN y proteínas para SLC
humano han sido publicadas por Nishimura et al., en la base
de datos EMBL del European Bioinformatics Institute, Wellcome
Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., nº de
registro de ADN AB002409, cuyas exposiciones se incorporan en la
presente memoria como referencia. La CCL21a murina, una variante de
ADN de 6Ckine/SLC y las secuencias de la proteína han sido
publicadas por Hromas et al., J. Immunol. 1997;
159(6):2554-2558, nº de registro NM011335 de
ADN en la base de datos EMBL del European Bioinformatics
Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10
1SD, U.K, cuyas exposiciones se incorporan en la presente memoria
como referencia. Se ha informado de la variante de CCL216 murina de
ADN 6Ckine/SLC y las secuencias de proteína por Hedrick et al.,
J. Immunol. 1997; 159(4):1589-1593, nº
de acceso de ADN NM011124 en la base de datos EMBL del European
Bioinformatics Institute, Welcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK, y cuyas exposiciones se incorporan a la presente memoria como referencia.
Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK, y cuyas exposiciones se incorporan a la presente memoria como referencia.
La secuencia de ácido nucleico que codifica
CCL21 humana (SLC) se presenta en la figura 6 (SEC. ID. nº: 5), y
su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº:
6) se proporciona en la figura 7. La secuencia de ácido nucleico
que codifica CCL21 murina (variante de CCL21b) se representa en la
figura 8 (SEC. ID. nº: 7), y su correspondiente secuencia de restos
de aminoácidos (SEC. ID. nº: 8) se proporciona en la figura 9.
La homología de proteínas entre la CCL21 humana
(SLC) y su contrapartida murina (6Ckine/SLC, CCL21b), se ilustra en
la figura 10. Existe aproximadamente 73% de identidad de secuencia
de restos de aminoácidos entre la CCL21 humana (SEC. ID. nº: 6) y
la CCL21 murina (SEC. ID. nº: 8) como se muestra en la figura
10.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la
variatne de CCL21 de SLC murina se presenta en la figura 25 (SEC ID
nº 11) y su secuencia amino correspondiente (SEC ID nº 12) está
prevista en la figura 26.
Los ligandos preferidos para los receptores de
la superficie de las células destructoras naturales son ligandos
para el receptor murino de la superficie de NKG2D. Los ligandos
preferidos para el receptor de la superficie NKG2D son MICA, MICB,
ULBP1, ULBP2, ULBP3 y similares. Aún más preferentemente MICA y
MICB. Otros ligandos conocidos para los receptores de la superficie
NKG2D incluyen Rea-1\beta murino y el péptido H60
del antígeno de histocompatibilidad menor murino.
El ADN del péptido del antígeno con
histocompatibilidad menor H60 murino y las secuencias de proteínas
han sido publicadas por Malarkannan et al., J. Immunol.
1998; 161(7):3501-3509, nº de registro de ADN
AF084643, en la base de datos EMBL del European
Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge CB10 1SD, U.K, cuyas exposiciones están incorporadas en la
presente memoria como referencia. Una secuencia parcial de ácido
nucleico que codifica el péptido murino con antígeno de
histocompatibilidad menor H60 se presenta en la figura 11 (SEC. ID.
nº: 9) y su correspondiente secuencia de restos de aminoácidos
parcial (SEC. ID. nº: 10) se proporciona en la figura 12.
Las secuencias de ADN y proteínas para MICA
humana han sido publicadas por Zwirner et al., nº de registro
de ADN AY204547, en la base de datos EMBL del European
Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton,
Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en
la presente memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico
que codifica la MICA humana se presenta en la figura 27 (SEC. ID.
nº: 13), y su correspondiente secuencia de restos aminoácidos (SEC.
ID. nº: 14) se proporciona en la figura 28.
Las secuencias de ADN y proteínas para MICB
humana han sido publicadas por Bahram et al.,
Immunogenetics 1996; 45(2):161-162,
nº de registro de ADN U65416 en la base de datos EMBL del
European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus,
Hinxton, Cambridge CB10 1SD, U.K., cuyas exposiciones están
incorporadas en la presente memoria como referencia. La secuencia
de ácido nucleico que codifica la MICB humana se presenta en la
figura 29 (SEC. ID. nº: 15), y su correspondiente secuencia de
restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 16) se proporciona en la figura
30. Variantes alélicas de MICB se describen en el nº de registro NP
005922 del GENBANK, incorporadas en la presente memoria como
referencia. La figura 38 es una reproducción de la entrada para el
nº de registro NP 005922.
Las secuencias de ADN y proteínas para la ULBP1
humana han sido publicadas por Cosman et al., Immunity
2001; 14(2):123-133, nº de registro de ADN
AF304377 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics
Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10
1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente
memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica
la ULBP1 humana se presenta en la figura 31 (SEC. ID. nº: 17), y su
correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 18)
se proporciona en la figura 32.
Las secuencias de ADN y proteínas para la ULBP2
humana han sido publicadas por Cosman et al., Immunity
2001; 14(2):123-133, nº de registro de ADN
AF304378 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics
Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10
1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente
memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica
la ULBP2 humana se presenta en la figura 33 (SEC. ID. nº: 19), y su
correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 20)
se proporciona en la figura 34.
Las secuencias de ADN y proteínas para la ULBP3
humana han sido publicadas por Cosman et al., Immunity
2001; 14(2):123-133, nº de registro de ADN
AF304379 en la base de datos EMBL del European Bioinformatics
Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10
1SD, U.K., cuyas exposiciones están incorporadas en la presente
memoria como referencia. La secuencia de ácido nucleico que codifica
la ULBP3 humana se presenta en la figura 35 (SEC. ID. nº: 21), y su
correspondiente secuencia de restos de aminoácidos (SEC. ID. nº: 22)
se proporciona en la figura 36.
Los ligandos particularmente preferidos para el
receptor de la superficie de las células destructoras naturales
comprenden ligandos para el receptor NKG2D tales como MICA, MICB,
ULBP1, ULBP2, ULBP3 y equivalentes funcionales de las mismas. Los
equivalentes funcionales comparten preferentemente por lo menos
aproximadamente el 80% de identidad de la secuencia de restos de
aminoácidos con los polipéptidos inmunomoduladores mencionados
anteriormente, más preferentemente por lo menos aproximadamente el
95% de identidad de la secuencia de restos de aminoácidos.
Debido a la degeneración intrínseca del código
genético, las secuencias de ADN que codifican sustancialmente la
misma secuencia o una secuencia de restos de aminoácidos
funcionalmente equivalente a los productos génicos inmunoactivos
naturales útiles tales como CCL21, CCL21 murina, MICA, MICB, ULBP1,
ULBP2, ULBP3 y y materiales similares equivalentes que corresponden
sustancialmente a éstas pueden utilizarse en la vacunas de la
invención. Dichas secuencias de ADN incluyen las que son capaces de
hibridarse con las secuencias de ADN polipeptídico inmunomodulador,
así como las variantes alélicas y similares. Preferentemente el ADN
de los homólogos funcionalmente equivalentes, comparten por lo
menos aproximadamente 70% de identidad de la secuencia de
nucleótidos con el ADN que codifica los polipéptidos
inmunomoduladores naturales mencionados anteriormente.
Las secuencias de ADN alteradas que pueden
utilizarse según la invención incluyen eliminaciones, adiciones o
sustituciones de diferentes restos nucleotídicos en la secuencia
natural del polinucleótido que codifica una proteína de la familia
IAP asociada al cáncer natural que resulta en una secuencia que
codifica la proteína natural o un homólogo inmunógeno de la misma.
Las secuencias de ADN alteradas que pueden utilizarse según la
invención pueden incluir además eliminaciones, adiciones, o
sustituciones de diferentes restos de nucleótidos en el
polinucleótido natural que codifica un producto génico inmunogénico
que da como resultado una secuencia que codifica el producto génico
inmunoreactivo natural o un equivalente funcional del mismo.
Funcionalmente el producto génico inmunoactivo equivalente puede
contener eliminaciones, adiciones, o sustituciones de restos de
aminoácidos con una citocina natural o ligando el receptor de la
superficie de las células NK que da como resultado un cambio
imperceptible produciendo de este modo una molécula funcionalmente
equivalente. Dichas sustituciones de aminoácidos (por ejemplo,
sustituciones conservadoras) pueden hacerse basándose en la
similitud de polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia
y/o la naturaleza anfipática de los restos implicados. Por ejemplo,
los aminoácidos con carga negativa incluyen ácido aspártico y
glutámico; los aminoácidos con carga positiva incluyen lisina y
arginina; los aminoácidos con grupos principales polares sin carga
que tienen valores de hidrofilia similares incluyen los siguientes,
lisina, leucina, isoleucina, valina; glicina, alanina; asparagina,
glutamina, serina, treonina, fenilalanina y tirosina.
Tal como se utiliza en la presente invención, un
producto génico inmunoactivo funcionalmente equivalente tal como
citocina o el ligando receptor de la superficie de las células NK se
refiere a un polipéptido que tiene sustancialmente la misma
actividad inmunomoduladora que su contrapartida el producto génico
inmunoactivo natural.
Las secuencias de ADN que codifican
operativamente la proteína survivina y los productos génicos
inmunoreactivos útiles en las vacunas de la invención, pueden ser
modificadas para alterar las secuencias de codificación con varios
fines incluyendo, pero sin limitarse a, alteraciones que modifican
el tratamiento y la expresión del producto génico. Por ejemplo,
pueden introducirse mutaciones, utilizando técnicas que son bien
conocidas en la materia, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio
para insertar nuevas áreas de restricción para alterar los modelos
de glucosidación, fosforilación y similares.
Otro aspecto de la presente invención es un
procedimiento de vacunación de un mamífero contra el cáncer. El
procedimiento comprende administrar al mamífero una vacuna de la
presente invención, tal como se describe en la presente memoria, en
una cantidad suficiente para provocar una respuesta inmunitaria
contra las células de cáncer. Preferentemente el mamífero es un ser
humano.
En otro aspecto, la presente invención comprende
también células operadoras transformadas, que han sido transfectadas
con un vector que comprende un montaje de ADN que codifica un
inhibidor de la proteína de la familia Apoptisis y un producto
génico inmunoactivo tal como se describe en la presente memoria. La
célula hospedadora puede ser una célula procariótica o una célula
eucariótica.
La presente invención proporciona también
vectores de plásmido aislados que comprenden un montaje de ADN que
codifica operativamente un inhibidor de la proteína de la familia
Apoptisis y un producto génico inmunoreactivo. Los vectores son
útiles para transfectar células hospedadoras como, tales como las
células bacterianas adecuadas, para preparar las vacunas de la
invención.
Los ejemplos siguientes se proporcionan para
ilustrar con mayor detalle las características y formas de
realización de la presente invención, y no significa que sean
limitativas.
\vskip1.000000\baselineskip
Materiales. Se obtuvieron ratones
C57/BL/6J y Balb/C en la instalación de apareamiento del Scripps
Research Institute. El ADN que codifica TIAP (forma murina de
survivina) fue clonada por PCR a partir de ADNc MC3P. El ADN que
codifica la 6Ckine murina (CCL21 murina) se clonó en esplenocitos.
El ADN que codifica el péptido del antígeno de histocompatibilidad
menor H60 (forma murina de MICA y MICB) fue proporcionado
gentilmente por el Dr. Davis H. Ranlet de la University of
California (Berkley). El ADN para la vacuna que codifica la CCL21
murina (muCCL21, conocido también como 6Ckine/SLC) y survivina
murina (muSurvivina, conocida también como TIAP) se clonó en
vectores de expresión eucariótica pBudCE4.1 de Invitrogen, Inc.,
utilizando las secuencias de restricción HindIII y BamHI para
muCCL21 y utilizando XhoI para ambos extremos muSurvivina. El ADN
para la vacuna que codifica H60 TIAP se clonó en los vectores de
expresión eucarióticos pBudCE41 de Invitrogen, Inc., utilizando las
secuencias de restricción Hind y BamHI para muCCL21, y utilizando
XhoI para ambos extremos de muSurvivina. El ADN para la vacuna que
codifica H60 TIAP se clonó en los vectores de expresión eucarióticos
pBudCE4.1 de Invitrogen, Inc., utilizando las secuencias de
restricción HindIII y XbaI para H60 y para muSurvivina, utilizando
las secuencias de restricción KpnI y Xhol. Una cepa
AroA^{-} atenuada de Salmonella typhimurium (SL2707)
y una cepa de AroA^{-}, dam^{-} doblemente
atenuada de Salmonella typhimurium (RE88) se adquirieron en
Remedyne, Santa Barbara, CA. Se adquirieron anticuerpos en BD
Biosciences, Bedford, MA. El isotiocianato de fluoresceína (FITC) y
R-ficoeritrina (PE) se adquirieron en Molecular
Probes, Eugene, OR. Se prepararon anticuerpos marcados de FITC y
marcados de PE según los protocolos fabricados recomendados.
Parte A. Vacunas de
Salmonella tiphymurium atenuada AroA^{-}
transformada
El vector pBudCE4.1 que contiene ADN de
muSurvivina y muCCL21 (aproximadamente 1 a 10 \mug de ADNp) se
electroporó en Salmonella tiphymurium (SL2707) atenuada,
recién preparada, utilizando un Pulser de Bio-Rad a
2,5 kV, 25 \muF y 200 ohmios según los procedimientos
recomendados por el fabricante. Se seleccionó Salmonella que
contiene el vector en placas que contienen zeocina. Se seleccionaron
las colonias al día siguiente y se cultivaron durante la noche en
caldo de cultivo LB (EM Science, Gibbstown, NJ) con zeocina añadida.
Se aislaron las bacterias y se lavaron en solución salina tamponada
con fosfato (PBS). Las bacterias lavadas se pusieron en suspensión
a continuación en medio PBS a una concentración aproximadamente 1 x
10^{9} de Salmonella recombinante por mililitro de PBS,
para formar una solución de la vacuna para uso posterior.
Se prepararon también según el mismo
procedimiento vacunas de referencia que constan de Salmonella
transformada con el vector solo, un vector que incorpora solamente
ADN con muSurvivina, y un vector que incorpora solamente ADN con
muCCL21. La figura 13 proporciona una representación esquemática de
los montajes de expresión.
Las vacunas se almacenaron en ampollas selladas
hasta ser utilizadas. El ADN plásmido se almacenó a aproximadamente
-80ºC antes de transformar la Salmonella.
\vskip1.000000\baselineskip
Se vacunaron ratones Balb/C (aproximadamente 8
ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del
Ejemplo 1 (aproximadamente 1 x 10^{8} de Salmonella
recombinante en aproximadamente 100 \mul de PBS) por sonda bucal
3 veces en intervalos de 2 semanas.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 1 semana después de la última
vacunación los ratones de Balb/C del Ejemplo 2 (aproximadamente 8
ratones por grupo de tratamiento) se sometieron a la prueba de
provocación con aproximadamente 1 x 10^{5} células de carcinoma
de pulmón D121 Lewis (por vía subcutánea). Los tumores subcutáneos
de pulmón de Lewis se extrajeron quirúrgicamente después de
aproximadamente 2 semanas de crecimiento para permitir la
diseminación espontánea al pulmón. Se midió el crecimiento del
tumor subcutáneo en dos dimensiones cada dos días, y se calculó el
volumen del tumor según la fórmula:
volumen =
(anchura ^{2})(longitud \textdiv
2)
para cada tumor. La cantidad de
metástasis espontánea de D121 en los pulmones se evaluó
aproximadamente 24 a 28 días después de la eliminación del tumor
primario subcutáneo. Se sacrificaron los ratones, se les practicó
la necropsia, y se evaluaron las cargas del tumor de los pulmones
según el porcentaje de la superficie pulmonar que estaba cubierta
por el tumor y se puntuó "0" para carencia de tumor, "1"
para inferior aproximadamente 20% de espacio del tumor, "2"
para aproximadamente 20 a 30% de espacio del tumor, y "3" para
un espacio del tumor superior para aproximadamente un
50%.
Las puntuaciones de la carga del tumor para los
ratones vacunados con las vacunas del Ejemplo 1 se proporcionan en
la Tabla 1. La figura 14, presenta fotografías de los pulmones de
los ratones vacunados con las vacunas del Ejemplo 1. Los volúmenes
del tumor se publican en la Tabla 1 y en la figura 14. En la figura
14, la barra A representa el volumen medio del tumor pulmonar (en
milímetros cúbicos) para los ratones vacunados con la vacuna con
muSurvivina/muCCL21 de la invención; la barra B representa el
volumen medio del tumor para los ratones vacunados con la vacuna
que incorporaba solamente ADN con muSurvivina; la barra C representa
el volumen medio del tumor para los ratones vacunados con la vacuna
que incorporaba solamente ADN con muCCL21; la barra D representa el
volumen medio del tumor para los ratones vacunados con la vacuna que
incorporaba solamente el vector vacío; y la barra E representa el
volumen medio del tumor para los ratones vacunados con tampón PBS.
La figura 14 incluye además fotografías de los pulmones extirpados
representativos de cada grupo de tratamiento, representado a
continuación cada uno de sus respectivas barras en la figura 14.
Los resultados proporcionados en la Tabla 1 y en
la figura 14 (diagramas A y B) demuestran que la vacuna de ADN que
comprende un montaje de ADN que codifica una proteína de la familia
IAP (es decir, muSurvivina) y un producto génico inmunoactivo (es
decir, muCCL21) pueden inmunizar eficazmente ratones contra
metástasis de tumor pulmonar y el crecimiento inhibido de tumores
pulmonares.
\vskip1.000000\baselineskip
Se vacunaron ratones C5/7BL/6J (aproximadamente
8 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del
Ejemplo 1 tal como se describe en el Ejemplo 2. Se aislaron
esplenocitos aproximadamente 4 días después de la vacunación y se
analizó su actividad lítica en un ensayo de liberación de ^{51}Cr
de 4 horas, tal como se describe en Current Protocols
Immunology en 3.11.4, Coligan et al., eds., John Wiley
& Sons, Inc. (1994). Se utilizaron células D121 como células
diana para los esplenocitos.
La figura 15 ilustra gráficamente la
citotoxicidad mediada por linfocitos T contra células D121 de cáncer
pulmonar producidas por las vacunas de ADN de la invención. Los
puntos de los datos representados por los círculos en blanco
representan los datos de los ensayos de inhibición en los que las
células se trataron con 50 \mug/ml de anticuerpos contra antígenos
MHC de clase I H-2K^{b}/H-2D^{b}
(clon SF1-1.1;
34-2-12 IgG2a, \kappa) y los
cuadrados en negro representan datos sin anticuerpos inhibidores. El
porcentaje de lisis de las células tumorales (eje Y) está
representado por tres células efectoras diferentes para las
relaciones (E/T) de la célula diana para cada grupo de vacunación
(es decir, E/T de 100:1 para el primer punto de datos; de 50:1 para
el segundo punto de datos; y de 25:1 para el tercer punto de datos).
Los resultados demuestran que la vacuna de muSurvivina/muCCL21 de
la invención (etiquetada SLC/TIAP) produjo un aumento de casi 5
veces de la lisis a la relación E/T 100:1 en comparación con las
vacunas de referencia que contienen PBS, vector vacío y ADN con
muCCL21, y un aumento de aproximadamente el doble sobre la vacuna de
referencia que comprende ADN con muSurvivina solo.
\vskip1.000000\baselineskip
Se vacunaron ratones C5/7BL/6J (aproximadamente
4 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del
Ejemplo 1 tal como se describió en el Ejemplo 2. Se aislaron
esplenocitos de los ratones inmunizados y el grupo de ratones de
referencia aproximadamente 1 semana después de la última vacunación.
Las células se tiñeron a continuación con anticuerpo CD8+ conjugado
con FITC y anticuerpos conjugados con PE de CD25, CD69 y CD28. Se
evaluaron las suspensiones celulares utilizando un citómetro de
flujo de dos colores Becton Dickenson FAC scan para determinar el
porcentaje de linfocitos T CD8+ positivos para CD25, CD69 y CD28
para cada esplenocito. Los resultados se presentan en la figura 16.
El valor numérico en el cuadrante derecho superior en cada
representación FACS indica el porcentaje de células presentaban
tanto a antígeno CD8+ así como de CD25, CD28 o CD69, como puede
darse el caso. Los resultados numéricos se presentan en la Tabla 2.
Estos resultados demuestran la expresión aumentada del marcador de
linfocitos T con la vacuna de la presente invención, lo que indica
aumento de activación de linfocitos T.
Los datos de la Tabla 2 y de la figura 16
demuestran que la vacuna de la invención del Ejemplo 1, que
comprende un montaje de ADN que codifica la muSurvivina y muCCL21
conducen a la expresión regulada por incremento de las moléculas de
activación de linfocitos T.
\vskip1.000000\baselineskip
Se vacunaron ratones C5/7BL/6J (aproximadamente
4 ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del
Ejemplo 1 tal como se describe en el Ejemplo 2. Se aislaron
esplenocitos de los ratones inmunizados y del grupo del ratón de
referencia aproximadamente 1 semana después de la última vacunación.
Las células se tiñeron a continuación con anticuerpo CD11c
conjugado con FITC en combinación con anticuerpos conjugados con PE
de moléculas coestimuladoras B7 (CD80), ICAM-1 y
DEC205. Se evaluaron las suspensiones celulares utilizando un
citómetro de flujo de dos colores Becton Dickenson FAC scan. La
figura 17 ilustra gráficamente los valores medios de fluorescencia
para las células que presentan aumento de expresión de
ICAM-1 (parte superior), CD80 (medio) y DEC205
(parte inferior) para esplenocitos aislados de ratones vacunados con
la vacuna muSurvivina/muCCL21 de la invención, en comparación con
las vacunas de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
Se sometieron ratones inmunizados a una prueba
de provocación como en el ejemplo 2 (8 ratones por grupo de
tratamiento) con células de cáncer de pulmón D121 como en el Ejemplo
3. Se recogieron esplenocitos de cada ratón aproximadamente una
semana después de la prueba de provocación de la célula tumoral. Los
esplenocitos se tiñeron con anticuerpo CD-3 con
FITC y a continuación se fijaron, se permeabilizaron y se tiñeron
posteriormente con anticuerpo
anti-IFN-\gamma conjugado con PE.
Las células teñidas de dos colores se analizaron por citometría de
flujo FACS. Los resultados se ilustran en la figura 18. Se fijaron
las células utilizando un kit iniciador de tinción intracelular de
BD Pharmingen, La Jolla, CA.
Los resultados representados en la figura 18
demuestran que el porcentaje de células que liberan la citocina
IFN-\gamma aumentaron hasta aproximadamente 3,17%
para los esplenocitos aislados de los ratones vacunados con una
vacuna de la invención, en comparación a solamente 0,41% para los
ratones que reciben la vacuna de referencia con PBS,
aproximadamente 0,38% para los ratones que reciben la vacuna de
referencia con vector vacío, aproximadamente 0,96% para los ratones
que reciben la vacuna de referencia SLC y aproximadamente 1,53%
para los ratones que reciben la vacuna de referencia con
muSurvivina.
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones inmunizados como en el Ejemplo 2 (8
ratones por grupo) se sometieron a la prueba de provocación con
células D121 de cáncer de pulmón como en el Ejemplo 3. Se
recolectaron esplenocitos de cada ratón aproximadamente una semana
después de la prueba de provocación de la célula tumoral. Los
esplenocitos se incubaron con células D121 de tumor a una
temperatura de aproximadamente 37ºC, durante aproximadamente 3
horas. Se aislaron a continuación las células tumorales y se
analizaron por FACS. Se utilizó anexina V-FITC para
cuantificar el porcentaje de células en la población que
experimentan activamente apoptosis. Se utilizó yoduro de propidio
(PI) para distinguir las células viables de las inviables
utilizando un kit de detección de apoptosis disponible en BD
Pharmingen, La Jolla, CA.
\newpage
La figura 19 ilustra gráficamente los resultados
del análisis FACS evaluados después de aproximadamente 3 horas
(serie superior de representaciones) y después de aproximadamente 24
horas (serie inferior de representaciones). El número en el
cuadrante derecho inferior de cada representación representa el
porcentaje de células que experimentan apoptosis para cada grupo de
tratamiento. Después de 3 horas, aproximadamente 5,39% de las
células D121 intactas (es decir, sin exposición a los esplenocitos)
había experimentado apoptosis. Aproximadamente 2,28% de las células
D121 incubadas con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna
de referencia que contiene solamente tampón PBS había experimentado
apoptosis. Solo aproximadamente 5,19% de las células D121 incubadas
con esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia
que comprende el ADN del vector vacío había experimentado
apoptosis. De modo similar, aproximadamente 5,15% de las células
D121 experimentaron apoptosis cuando se incubaron con esplenocitos
de ratones vacunados con una vacuna de referencia que contiene el
ADN con mUCCL21 solo; mientras que aproximadamente 11,46% de las
células D121 experimentaron apoptosis cuando se incubaron con
esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que
comprende el ADN con muSurvivina solo. Sorprendentemente después de
3 horas aproximadamente 18,44% de las células D121 habían
experimentado apoptosis cuando se incubaron con esplenocitos de
ratones vacunados con una vacuna de la invención que comprende
tanto ADN con muCCL21 como con muSurvivina.
Asimismo después de 24 horas, en un análisis
FACS controlado (controlado para las células que experimentan
apoptosis), ninguna de las células D121 íntegras (es decir, sin
exposición a esplenocitos), había experimentado apoptosis.
Aproximadamente 8,46% de las células D121 incubadas con esplenocitos
de ratones vacunados con una vacuna de referencia que contiene
solamente tampón PBS había experimentado apoptosis. Sólo
aproximadamente 4,78% de las células D121 incubadas con
esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de referencia que
comprende el ADN del vector vacío habían experimentado apoptosis.
Sorprendentemente después de 24 horas, aproximadamente 59,2% de las
células D121 había experimentado apoptosis cuando se incubaron con
esplenocitos de ratones vacunados con una vacuna de la invención
que comprende ADN tanto con muCCL21 como con muSurvivina.
El vector pBudCE4.1 que contiene TIAP y el ADN
del antígeno de histocompatibilidad menor H60 murino
(aproximadamente 1 \mug de ADNp) se electroporó en Salmonella
typhimurium (SL2707) atenuada recién preparada, utilizando un
pulsador de Bio-Rad a 2,0 kV, 25 \muF y 100 ohmios
según los procedimientos recomendados por el fabricante. La figura
20 proporciona un diagrama esquemático de los vectores de expresión
para H60 y muSurvivina incorporados en el vector.
Se seleccionaron las Salmonella que
contenían el vector en placas que contenían zeocina. Se eligieron
las colonias al día siguiente y se cultivaron durante la noche en
caldo de cultivo LB (EM Science, Gibbstown, NJ) con zeocina
añadida. Se aislaron las bacterias y se lavaron en solución salina
tamponada con fosfato (PBS). Las bacterias lavadas se pusieron en
suspensión a continuación en medio PBS a una concentración de
aproximadamente 5 x 10^{9} de Salmonella recombinante por
mililitro de PBS, para formar una solución de vacuna para uso
posterior.
Las vacunas de referencia consistentes en
Salmonella transformada con el vector solo, un vector que
incorpora solamente ADN de muSurvivina, y un vector que incorpora
solamente ADN del antígeno de histocompatibilidad menor H60 (H60)
se prepararon también según el mismo procedimiento.
Se almacenaron las vacunas en ampollas selladas
hasta su utilización. El ADN plásmido se almacenó a aproximadamente
-20ºC antes de transformar la Salmonella.
Se vacunaron ratones Balb/C (aproximadamente 8
ratones por grupo de tratamiento) con las vacunas de ADN del
ejemplo 9 (aproximadamente 5 x 10^{8} de Salmonella
recombinante en aproximadamente 100 \mul de PBS) por sonda bucal,
tres veces a intervalos dos semanas.
Se aislaron esplenocitos procedentes de los
ratones vacunados en el Ejemplo 10, y se estimularon con células
CT-26 irradiadas. Después de 5 días se recolectaron
los esplenocitos y se realizaron ensayos citotóxicos contra células
CT-26 y células Yac-1 (linfocitos T
sensibles a NK) en dianas. Se determinó el grado de lisis específica
de la célula a las relaciones E/T de 25:1, 50:1 y 100:1 por un
ensayo de liberación de ^{51}Cr de 4 horas, tal como se describe
en Current Protocols in Immunology en 3.11.4, Coligan, et
al.; editores, John Wiley & Sons, Inc. (1994). Los
resultados están ilustrados gráficamente en la figura 21.
Los resultados indican que los esplenocitos de
ratones vacunados con una vacuna de la presente invención que
contiene ADN de muSurvivina y H60 presentaban unos aumentos del
doble o mayores en la lisis de las células CT-26 de
cáncer colorrectal comparadas con los esplenocitos aislados de
ratones vacunados con el vector vacío, H60 y vacunas de referencia
de muSurvivina en la relación E/T 100:1. Se observó muy poca lisis
de Yac-1 para todas las vacunas en todas las
relaciones E/T, lo que indica que la destrucción observada estaba
mediada probablemente por linfocitos T.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente 2 semanas después de la tercera
vacunación, los ratones Balb/C del ejemplo 10 (aproximadamente 8
ratones por tratamiento) se sometieron a la prueba de provocación
con aproximadamente 1 x 10^{5} células CT-26
murinas de cáncer colorrectal (por vía intravenosa; i.v.).
Se evaluó la cantidad de metástasis espontánea
de las células CT-26 en los pulmones aproximadamente
25 días después de la prueba de provocación i.v. con células
CT-26. Se sacrificaron los ratones, se les practicó
la necropsia y se evaluaron las cargas del tumor de los pulmones
registrando el peso medio de los pulmones de cada grupo. Un peso de
pulmón normal es de aproximadamente 0,2 gramos. La figura 22 ilustra
los pulmones típicos (parte superior) extraídos de los ratones
vacunados, sometidos a prueba de provocación con
CT-26. La figura 22 incluye también un gráfico
(parte inferior) del peso medio del pulmón para cada grupo de
tratamiento. Se observó una disminución drástica en la carga del
tumor en los ratones vacunados con la vacuna H60/muSurvivina de la
invención en comparación con las vacunas de referencia.
La figura 23 incluye un gráfico de porcentaje de
ratones que sobreviven después de 26 días en cada grupo de
tratamiento. Se observó un aumento significativo de la supervivencia
en los ratones vacunados con la vacuna H60/muSurvivina de la
invención en comparación con las vacunas de referencia.
\vskip1.000000\baselineskip
La figura 24A ilustra la expresión de H60. Se
transfectaron células 293T con el vector vacío (V) o pH60 (H)
durante 24 horas, se recolectaron y se tiñeron con el tetrámero
NKG2D y se analizaron por citometría de flujo. La eficacia de la
transfección fue de aproximadamente el 45% evaluada por transfección
con pGFP (proteína verde fluorescente). La figura 24B ilustra la
expresión de muSurvivina. Se transfectaron células 293T con el
vector vacío o pmuSurvivina durante 24 horas, se recolectaron, se
lisaron y analizaron por inmunotransferencia Western. La
inmunotransferencia Western indica que muSurvivina es detectable en
las células transfectadas, pero no en las células naturales.
Parte B. Vacunas de
Salmonella typhimurium doblemente atenuada AroA^{-},
dam^{-}
transformadas
\vskip1.000000\baselineskip
Las zonas codificadoras completas para la
survivina murina (muSurvivina) y CCL21 murina (muCCL21) se ampliaron
por reacción en cadena de polimerasa con transcripción inversa
utilizando 1 \mug del ARN completo extraído de células D121 de
carcinoma de pulmón de Lewis de ratón y esplenocitos de ratón
activados respectivamente. El ARN completo se extrajo con el
RNEASY® Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) y se llevó a cabo la
RT-PCR con un sistema thermoscript
RT-PCR cuantitativo de una etapa de platino
(Gibco/BRL) según las instrucciones del fabricante. Se realizaron
varios montajes basándose en el vector pBudCE4.1 (Invitrogen),
utilizando los productos de la PCR diseñados para la expresión
independiente de dos genes de un solo plásmido en vectores de
expresión de mamífero. El primer montaje muSurvivina/muCCL21 que
comprende la survivina murina completa y CCL21 murina, se insertó
en el punto A de multiclonación entre las secuencias de restricción
HindIII y BamHI. Se generó la muCCL21 de quimiocina insertando el
gen en el punto B de la multiclonación entre las secuencias de
restricción XhoI y NotI, respectivamente. Los demás vectores
utilizados para la vacunación con ADN estaban basados en la primera
construcción más bien que en la ausencia de muCCL21 o muSurvivina.
El vector vacío se generó como referencia.
La expresión proteica de muSurvivina y muCCL21
se demostró por inmunotransferencia Western de lisados celulares
después de la transfección de los plásmidos en células
COS-7 utilizando los anticuerpos
anti-survivina y anti-CCL21,
respectivamente. La expresión de la actividad de EGFP en parches de
Peyer de ratones C57/BL/6J, se detectó en los ratones tras la
administración bucal de Salmonella typhimurium (cepa RE88 de
AroA^{-}, dam^{-}) transformada con pEGFP. Se
sacrificaron los ratones en los puntos de tiempo de 8, 16 y 36 horas
y se extrajeron muestras recientes de intestino delgado para
análisis después de lavado intenso con PBS. La expresión de
fluorescencia de EGFP se detectó con microscopia colfocal.
Se evaluaron posibles toxicidades causadas en el
hospedador por las bacterias atenuadas comparando la cepa RE88
AroA^{-}, dam^{-}, doblemente atenuada, con la
cepa aislada SL2707 AroA^{-} atenuada. La utilización de
la cepa RE88 dio como resultado la supervivencia de los 16 ratones
sin efectos secundarios tóxicos obvios, mientras que 2 de los 16
ratones inmunizados con la cepa SL2707 murieron por toxicidad e
infección. De este modo, la mutación dam^{-} de la cepa
RE88, que controla la virulencia bacteriana, produjo aparentemente
esta cepa particularmente útil en el vehículo de la vacuna de
ADN.
Los ratones C57/BL/6J se dividieron en cinco
grupos y se inmunizaron 3 veces a intervalos de 2 semanas por sonda
nasogástrica con aproximadamente 100 \mul de PBS que contenía
aproximadamente 1 x 10^{8} de S. typhimurium doblemente
atenuada (RE88) que alberga uno de los siguientes: vector pBUd
vacío; vectores de expresión individual de
pBud-muSurvivina/muCCL21,
pBud-muSurvivina o pBud-muCCL21
junto con grupos de tratamiento de PBS. Todos los ratones en los
tratamientos profilácticos se sometieron a la prueba de provocación
mediante inyecciones i.v. de aproximadamente 1 x 10^{5} células
D121 de carcinoma de pulmón de Lewis murino aproximadamente 1 semana
después de la última inmunización. En escenarios terapéuticos se
inyectaron por vía i.v. los ratones en primer lugar con
aproximadamente 1 x 10^{5} células D121 de carcinoma pulmonar de
Lewis murino y 1 semana después se sometieron a 3 vacunaciones con
la S. typhimurium transformada. Se examinaron los ratones
diariamente, se sacrificaron y se examinaron las metástasis
pulmonares aproximadamente 28 días después de la prueba de
provocación con la célula tumoral en el escenario profiláctico o 63
días después de la inoculación de la célula tumoral inicial en el
modelo terapéutico.
Las puntuaciones de la metástasis pulmonar
después de la inmunización con vacunas de PBS, el vector vacío,
CCL21, survivina o CCL21/survivina respectivamente, para tratamiento
profiláctico con las vacunas se presentan en la Tabla 3. Los
resultados en la Tabla 3, se muestran como puntuaciones de
metástasis expresadas como % de la superficie pulmonar cubierta por
los focos metastásicos fusionados: 0 = nada, 1 = inferior al 5%; 2
= 5-50%; y 3 \geq 50%. Las diferencias en las
puntuaciones de las metástasis entre grupos de ratones tratados con
la vacuna CCL21/survivina y todos los grupos de referencia eran
estadísticamente significativos (P \leq 0,001). La inhibición del
crecimiento del tumor se observó también en este modelo
terapéutico.
En este escenario profiláctico los autores se
observó la supresión decisiva de metástasis pulmonares diseminadas
de carcinoma D121 murino de pulmón de Lewis en los ratones vacunados
3 veces a intervalos de 2 semanas y sometidos a continuación prueba
de provocación 1 semana después por inyección i.v. de células
tumorales. De hecho, 6 de cada 8 ratones rechazaron completamente
todas las metástasis de tumor pulmonar mientras que los restantes
animales pusieron de manifiesto un notable incremento de supresión
de las metástasis tumorales (ver la Tabla 3) En cambio, la vacuna de
ADN a base de survivina que carece de la supresión de metástasis
completa producida por muCCL21 en solamente uno de cada 8 animales,
dos presentaron menos del 5% del crecimiento de tumor metastásico,
mientras que todos los ratones restantes presentaban crecimiento del
tumor metastásico extenso. Animales adicionales que fueron tratados
solamente con vacunaciones de referencia de PBS o del vector vacío
no presentaban ninguna protección al tumor en absoluto y murieron 4
semanas después de la prueba de provocación de la célula tumoral
debido a la metástasis extendida. Aunque la inmunización con
Salmonella doblemente atenuada portadora únicamente del
plásmido muCCL21 secretor no suprimió drásticamente la metástasis
tumoral, todavía produjo retrasos de metástasis estadísticamente
significativos cuando se compara con las referencias.
Significativamente la vacuna de ADN a base de
muSurvivina/muCCL21 era además eficaz para suprimir de manera
notable el crecimiento de la metástasis pulmonar ya bien demostrada
en todos los animales experimentales en un escenario terapéutico.
En cambio, todos los ratones que reciben solamente las vacunas a
base de muSurvivina o muCCL21, por sí mismas, o el vector vacío y
las referencias PBS, pusieron de manifiesto grandes metástasis
pulmonares diseminadas de carcinoma de pulmón de células D121 no
pequeñas en este escenario experimental. Los pesos del pulmón de
varios grupos experimentales a partir del modelo terapéutico se
indican en la Tabla 4. El peso normal del pulmón fue
aproximadamente 0,3 g.
Dos semanas después de la última vacunación, se
inyectaron los ratones por vía subcutánea (s.c.) en la región del
esternón con aproximadamente 500 ml de Matrigel reducido con factor
de crecimiento (BD Biosciences) que contenía aproximadamente 400
ng/ml de FGF-2 murino (PeproTech, Rocky Hill, NJ) y
células D121 tumorales (1 x 10^{4}/ml) que se irradiaron con
1.000 Gy. En todos los ratones, excepto en 2 animales de referencia,
se tiñó el tejido del endotelio 6 días más tarde por inyección en
la vena lateral de la cola, con 200 ml de 0,1 mg/ml de lectina I
fluorescente de Bandeiraea simplicifolia, Isolectina B4
(Vector Laboratories, Burlingame, CA); aproximadamente 30 minutos
después se sacrificaron los ratones y se extrajeron los tapones de
Matrigel y se evaluaron al microscopio. Se extrajo a continuación
lectina-FITC de 100 ml de cada tapón en 500 ml de
lisis de RIPA y se analizaron cuantitativamente por fluorimetría a
490 nm. La fluorescencia de fondo hallada en los dos ratones de
referencia no inyectados se sustrajo en cada caso.
La vacuna a base de muSurvivina/muCCL21 suprimió
con decisión la angiogénesis en los vasos sanguíneos del tumor. Se
observó una disminución significativa en la neovascularización del
tumor, tal como se indica en los ensayos con Matrigel, y análisis
cuantitativo por fluorescencia relativa medida después de la tinción
in vivo de endotelio de ratón con lectina conjugada con
FITC. Se observaron diferencias macroscópicamente evidentes en la
vascularización del tumor entre los grupos tratados con la vacuna
muSurvivina/muCCL212 y grupos de referencia de ratones en el examen
de tapones de Matrigel representativos retirados 6 días después de
la inyección s.c. de lectina conjugada con FITC. Los ratones
vacunados con una vacuna de la invención, presentaban
significativamente menos vascularización del tumor en comparación
con los grupos de referencia.
Se aislaron esplenocitos de ratones vacunados
con éxito 5 días después de la prueba de provocación con la célula
tumoral. Se evaluó la toxicidad por un ensayo de liberación de
^{51}Cr habitual contra dianas de células D121 de tumor o células
endoteliales murinas que sobreexpresan survivina. Para determinar la
restricción de citotoxicidad de MHC de clase I específica, se
llevaron a cabo evaluaciones de inhibición con 10 \mug/ml, de
anticuerpos H-2Kb-Db de MHC de clase
I antirratón (PharMingen, San Diego, CA).
El ensayo de liberación de ^{51}Cr indicaba
citotoxicidad notable producida por los linfocitos T CD8^{+}
específicos extraídos de los ratones después de la vacunación y
posterior prueba de provocación con células D121 de carcinoma
pulmonar de Lewis. Los linfocitos T CD8^{+} aislados de
esplenocitos de ratones inmunizados con muSurvivina/muCCL21 o con
la vacuna con muSurvivina por sí misma, lisaron eficazmente el 50% y
el 30% de las células tumorales D121, respectivamente. Por
contraste, los linfocitos T CD8^{+} aislados de animales de
referencia resultaron ineficaces en la provocación de cualquier
destrucción perceptible de células tumorales, ya que presentaban
solamente actividades citotóxicas de fondo. De manera
característica, la citotoxicidad mediada por linfocitos T CD8^{+}
observada fue restringida por el antígeno MHC de clase I ya que la
citotoxicidad fue eliminada completamente por adición de
anticuerpos anti-H2Kb/H2Db.
Los marcadores de activación de los linfocitos T
y la expresión de moléculas coestimuladoras en CD11c y en las DC
positivas a Ag de MHC de clase II se determinaron por análisis
citométrico de flujo de 2 ó 3 colores con un BD Biosciences
FACScan. Se determinó la activación de linfocitos T tiñendo
esplenocitos recién aislados de ratones vacunados con éxito con
anticuerpo anti-CD3e marcado con FITC en combinación
con anticuerpos anti-CD25, CD28 o CD69 conjugados
con PE. La activación de moléculas coestimuladoras en las APC se
midió con anticuerpo anti-CD11c marcado con FITC y
anticuerpo anti-IAb biotinilado, seguido de
estreptavidina-aloficocianina, y en combinación con
los anticuerpos anti-ICAM-1, CD80 o
DEC205 conjugados con PE. Todos los experimentos citométricos de
flujo se llevaron a cabo en presencia 0,1 \mug/ml de yoduro de
propideo para excluir las células muertas. Todos los reactivos para
estos ensayos se adquirieron en BD Pharmingen (La Jolla, CA).
Se utilizó citometría de flujo para la detección
de citocinas intracelulares. Con este fin, se recolectaron
esplenocitos de ratones B57BL/6J aproximadamente 2 semanas después
de la prueba de provocación de las células D121 del tumor y se
cultivaron durante aproximadamente 24 horas en medio de linfocito T
completo junto con las células D121 irradiadas, tal como se
describió anteriormente. Células preincubadas se pusieron en
suspensión con aproximadamente 1 mg de anticuerpo 2.4G2 purificado
(BD Pharmingen) para bloquear la tinción inespecífica. Se lavaron
las células y a continuación se tiñeron con 0,5 mg de anticuerpo
anti-CD3+ conjugado con FITC. Después de lavar 2
veces, se fijaron las células y se tiñeron con 1 mg/ml de PE
conjugado con anticuerpos anti-IL2 o
anti-IFN-g, para análisis
citométrico de flujo. Todos los anticuerpos se adquirieron en BD
Pharmingen (La Jolla, CA.).
Solamente la vacuna muSurvivina/muCCL21 por sí
misma fue eficaz de manera óptima en regular por incremento
notablemente la expresión de los marcadores de activación de
linfocitos T CD25, CD28 y CD69. La regulación por incremento de
CD28 es de particular importancia ya que sus interacciones con las
moléculas coestimuladoras B7 en las DC se sabe que es esencial para
conseguir interacciones críticas y múltiples entre los linfocitos T
naturales y las DC presentadoras al antígeno. En cambio, las vacunas
de ADN que codifican solamente muSurvivina o muCCL21 por sí mismas
aumentaron la expresión de los marcadores de activación del
linfocito T solamente una vez. La activación de los linfocitos T
tanto CD4+ como CD8+ por la vacuna muSurvivina/muCCL21 estaba
también indicada por su aumento decisivo en las citocinas
proinflamatorias intracelulares IFN-g e
IL-2. En comparación, se descubrió que la PBS y las
referencias del vector vacío así como las vacunas de ADN que
codifican solamente muSurvivina o muCCL21 eran considerablemente
menos eficaces en producir estas citocinas.
La expresión regulada por incremento de
ICAM-1, CD80 y DEC205 sobre las DC, conseguida por
la vacuna de ADN a base de muSurvivina/muCCL21 es particularmente
importante ya que es bien sabido que la activación de los
linfocitos T depende críticamente de fuertes interacciones
célula-célula con estas moléculas coestimuladoras
expresadas en las DC con objeto de conseguir ligadura óptima con los
receptores de linfocitos T. De nuevo, la inmunización con
Salmonella typhimurium doblemente atenuada, que lleva
plásmidos eucarióticos que codifican muSurvivina/muCCL21 produjo la
regulación por incremento más eficaz de estos marcadores de
activación, que fue hasta 2 a 3 veces superior a las de las
referencias.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la apoptosis en células D121
tumorales provocada por vacunación aproximadamente a las 3 horas y
aproximadamente a las 24 horas después de la vacunación,
respectivamente. Tanto los animales de referencia como los
experimentales se sometieron a la prueba de provocación i.v. con
aproximadamente 1 x 10^{5} células D121 1 semana después de la
última de 3 inmunizaciones. Se recolectaron esplenocitos de cada
ratón 1 semana después de la prueba de provocación de la célula
tumoral, y después se cultivaron conjuntamente aproximadamente 2,5 x
10^{7} esplenocitos durante 4 horas con aproximadamente 5 x
10^{5} células D121 en placas de 6 pocillos. Se utilizó el kit II
de detección de la apoptosis ANNEXIN®V-FITC (BD
Biosciences, Pharmingen, San Diego, CA) para la confirmación de las
etapas iniciales de apoptosis. Para confirmar la apoptosis de la
célula tumoral en la etapa última, se cultivaron conjuntamente
aproximadamente 5 x 10^{5} células D121 y aproximadamente 2,5 x
10^{7} esplenocitos durante aproximadamente 24 horas y a
continuación se analizó la apoptosis por FACS por el ensayo TUNEL
con el kit APO-DIRECT^{TM} (BD Biosciences
Pharmingen, San Diego, CA) según las instrucciones del
fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
Se observó apoptosis antes de 3 horas y con un
aumento considerable además después de 24 horas, tal como se indica
por análisis citométrico de flujo de los datos obtenidos por los
ensayos con Anexina V o TUNEL. Por lo tanto, la apoptosis en la
etapa inicial fue hasta 3 a 4 veces mayor en los grupos de ratones
inmunizados con la vacuna muSurvivina/muCCL21 que en las
referencias después de incubar conjuntamente los esplenocitos
recolectados de dicho ratón con células tumorales. La vacuna que
codifica muSurvivina sola desencadenó algo de apoptosis, pero
solamente fue una vez superior a las referencias. Sin embargo, a las
24 horas se observó un aumento drástico del 85% en apoptosis
solamente en los ratones inmunizados con la vacuna
muSurvivina/muCCL21, lo que sugiere que una potente inmunidad de
las células tumorales producidas por los CTL desencadenó este
hecho.
Un plásmido que contiene el ligando H60 de NKG2D
murina completo fue una donación generosa de los Drs. A. Diefenbach
y D.H. Raulet (University of California, Berkeley, CA). Se
construyeron vectores de expresión en un eje central de pBudCE4.1
(Invitrogen) tal como se describió anteriormente.
Se transformaron (AroA^{-},
dam^{-}) de S. typhimurium doblemente atenuadas con
plásmidos de la vacuna de ADN por electroporación tal como se
describió anteriormente en la presente memoria. En resumen, las
bacterias recién preparadas (aproximadamente 1 x 10^{8}) en fase
de crecimiento semilogarítmico, se mezclaron con ADN plásmido
(1-2 \mug) en hielo en una cubeta de 0,1 cm y se
electroporaron a aproximadamente 2,0 KV, 25 \muF y 100 \Omega.
Las colonias resistentes que alojan los vectores con la vacuna ADN
se cultivaron y se almacenaron a -80ºC tras la confirmación de las
secuencias de codificación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se inmunizaron dos veces grupos de ratones (n =
4-12) BALB/c A2Kb a intervalos de 2 semanas por
sonda nasogástrica, con 100 \mul de PBS que contenía
aproximadamente 5 x 10^{8} de S. typhimurium doblemente
atenuada que contiene los vectores de expresión. En modelos
profilácticos, los ratones BALB/c se sometieron a la prueba de
provocación i.v. con aproximadamente 1 x 10^{5} células
CT-26 2 semanas después de la última vacunación, y
en escenarios terapéuticos 5 días antes de la primera vacunación. Se
sacrificaron los ratones 25 ó 28 días después de la prueba de
provocación del tumor, y la metástasis pulmonar o los pesos del
tumor, se determinaron respectivamente y se compararon con los de
las referencias. La significación estadística de los resultados de
la fórmula leucocitaria entre los grupos experimentales y las
referencias se determinó por la prueba de la
t-Student. Los resultados se consideraban
significativos, si los valores P de dos colas eran <
0,05.
Se confirmaron las expresiones de H60 y
muSurvivina transfectando células 293T y se comprobaron por
citometría de flujo o por análisis de inmunotransferencia Western.
Se confirmó la expresión de H60 por tinción positiva del tetrámero
NKG2D. Se transfectaron células con survivina con control positivo
tal como se indica por una sola banda en el peso molecular esperado
de aproximadamente 16,5 KDa. El nivel del ligando NKG2D expresado
por CT-26 es relativamente bajo en comparación con
las células Yac-1 con control positivo. Las células
tumorales con bajos niveles de expresión del ligando NKG2D se
publicaron previamente que no pueden provocar rechazo del tumor. En
el escenario profiláctico los pesos de los pulmones y las
puntuaciones de la metástasis (descritos anteriormente en la
presente memoria) se evaluaron tras el sacrificio de los ratones 25
días después de la prueba de provocación del tumor. Los resultados
se presentan en la Tabla 5 y Tabla 6. Los datos demuestran que las
vacunas de H60 y muSurvivina protegieron cada una los ratones en
alguna medida, mientras que la combinación de H60 y muSurvivina
(vacuna muSurvivina/H60) aumentaron en gran medida la protección
contras las pruebas de provocación de tumor como se demostró por
las puntuaciones de las metástasis significativamente inferiores y
las cargas del tumor disminuidas en los pulmones. Estos resultados
fueron estadísticamente significativos en comparación con los
grupos de referencia de PBS, pBub, pH60 y pmuSurvivina (p<0,0001,
0,002, 0,01 y 0,005, respectivamente).
En un escenario terapéutico, es decir, contra
metástasis probada de carcinoma de colon, se evaluó la carga del
tumor pulmonar tras el sacrificio el día 28. Significativamente 8 de
cada 12 ratones tratados con la vacuna H60/muSurvivina
sobrevivieron, y más significativamente, 2 de estos animales
supervivientes estaban completamente exentos de metástasis,
mientras que otros 2 presentaban menos del 5% de su superficie
pulmonar cubierta por metástasis tumoral fusionada. En comparación,
solamente 2 ratones sobrevivieron en el grupo de referencia tratado
con el vector pBud vacío, y más del 50% de la superficie pulmonar de
todos los ratones supervivientes se recubrió por metástasis tumoral
fusionada. La vacunación con la vacuna muSurvivina sola, no produjo
ninguna protección significativa en el modelo terapéutico, y el
tratamiento con la vacuna H60 sola, presentaba solamente efecto
terapéutico marginal. Esto último fue sugerido por una proporción de
supervivencia ligeramente mejorada por uno de los ratones
supervivientes que presentaba solamente < 5% de su superficie
pulmonar cubierta por metástasis tumoral fusionada.
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Se midió la citotoxicidad mediante un ensayo
normalizado de liberación de ^{51}Cr, como se describió
anteriormente en la presente memoria. En resumen, se recolectaron
esplenocitos 2 semanas después de la última inmunización, y se
estimularon in vitro con células CT-26
irradiadas (1.000 Gy) a 37ºC durante 5 días en RPMI 1640 enriquecido
con FBS al 10%, L-glutamina, HEPES 15 mM,
aminoácidos no esenciales, piruvato de sodio, 2-ME e
IL-2 recombinante a 20 U/ml (PeproTech, Rocky Hill,
NJ). Se recolectaron esplenocitos y se separaron con medio de
separación de Lympholyte-M cell (Cedarlane
Laboratories Limited, Hornby, Ontario, Canadá). Se marcaron las
células diana con ^{51}Cr, durante aproximadamente 1,5 horas a
temperatura ambiente y se incubaron con células efectoras en varias
proporciones de célula efectora-célula diana a
aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 4 horas. Se calculó el
porcentaje de lisis específica de células diana mediante la fórmula
[(E-S)/(T-S)] x 100, en la que E es
la liberación experimental media, S la liberación espontánea media y
T la liberación total media.
Se observó que la actividad de NK había
aumentado de manera significativa en los ratones inmunizados con la
vacuna H60, y aún se observó mayor destrucción por NK en los ratones
inmunizados con la vacuna muSurvivina/H60. Los esplenocitos de los
ratones inmunizados con la vacuna muSurvivina/muH60 presentaban la
mayor citotoxicidad contra las células diana CT-26.
En cambio, dichos esplenocitos aislados de las referencias
inmunizadas con pBud pusieron de manifiesto una destrucción
citotóxica mínima, mientras que los esplenocitos de los ratones
vacunados con la vacuna H60 o con muSurvivina de por sí presentaban
una destrucción citotóxica algo mayor. Después de 5 días de cultivo
celular las células NK no parecían desempeñar un papel principal en
este ensayo de citotoxicidad, ya que no se observó ninguna
diferencia significativa, cuando se utilizaban células diana
Yac-1 NK, lo que sugiere que la citotoxicidad
detectada estaba mediada principalmente por los LTC.
Pueden introducirse numerosas variaciones y
modificaciones de las formas de realización descritas anteriormente.
Las formas de realización específicas ilustradas en la presente
memoria no se proporcionan de manera limitativa.
<110> Xiang, Rong
\hskip1cm Zhou, He
\hskip1cm Reisfeld, Ralph A.
\hskip1cm The Scripps Research Institute
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Vacunas de ADN contra el crecimiento
tumoral y procedimientos para la utilización de las mismas
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> TSRI-874.1PC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/457.009
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-03-24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1643
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 142
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 955
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 852
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 615
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 133
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 746
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 878
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 134
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> MUS MUSCULUS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1155
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 384
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2385
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 735
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 246
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 735
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 244
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 165
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> HOMO SAPIENS
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1322
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (174)...(1070)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 298
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1268
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (174)...(1016)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 280
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
Claims (21)
1. Vacuna de ADN adecuada para provocar una
respuesta inmunitaria contra las células cancerosas que comprende
un montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos una
proteína survivina y por lo menos un producto génico inmunoactivo
en un vehículo farmacéuticamente aceptable, en la que el montaje de
ADN se incorpora operativamente en un vector bacteriano
atenuado.
2. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en
la que el montaje de ADN codifica operativamente una proteína
survivina seleccionada de entre el grupo constituido por (a)
survivina humana natural que presenta la secuencia de restos de
aminoácidos de SEC ID nº 2, (b) un homólogo inmunógeno de survivina
humana natural que presenta una secuencia de restos de aminoácidos
por lo menos 80% idéntica a la SEC. ID. nº: 2, (c) una variante de
corte y empalme de survivina humana que presenta la secuencia SEC.
ID. nº: 23 de restos de aminoácidos, (d) una variante de corte y
empalme de la survivina humana que presenta la secuencia de restos
de aminoácidos de SEC ID nº 24, y (e) un fragmento de una proteína
survivina que se une a una molécula MCH de clase I y es reconocido
por los linfocitos T citotóxicos.
3. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en
la que el montaje de ADN codifica operativamente un homólogo
inmunógeno de survivina humana natural que presenta una secuencia de
restos de aminoácidos por lo menos 90%, preferentemente por lo
menos 95% idéntica a la SEC. ID. nº: 2.
4. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en
la que el producto génico inmunoactivo codificado operativamente
por el montaje de ADN es una citocina o un ligando para un receptor
de la superficie de la célula destructora natural.
5. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, en
la que la citocina se selecciona de entre el grupo constituido por
una quimiocina, una hematopoyetina, un interferón un factor
estimulante de células destructoras naturales y un factor de
inducción de la producción de citocinas.
6. Vacuna de ADN según la reivindicación 5, en
la que la citocina es la CCL21.
7. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, en
la que el ligando para un receptor de la superficie de la célula
destructora natural es una proteína inducible por estrés
seleccionada de entre el grupo constituido por MICA humana, MICB
humana, ULBP1 humana, ULBP2 humana, y ULBP3 humana.
8. Vacuna de ADN según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en la que el vector bacteriano atenuado se
selecciona de entre el grupo constituido por Salmonella
typhimurium, Salmonella typhi, especies de
Shigella, especies de Bacillus, especies de
Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio
cholerae, especies de Campylobacter y especies de
Listeria atenuadas.
9. Vacuna de ADN según la reivindicación 8, en
la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa
AroA^{-} de Salmonella typhimurium.
10. Vacuna de ADN según la reivindicación 8, en
la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa
AroA^{-}, dam^{-} de Salmonella
typhimurium.
11. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en
la que el montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos
una proteína survivina comprende una secuencia polinucleotídica
seleccionada de entre el grupo constituido por las SEC. ID. nº 1 y
SEC. ID. nº 3.
12. Vacuna de ADN según la reivindicación 1, en
la que el montaje de ADN que codifica operativamente por lo menos
un producto génico inmunoactivo comprende una secuencia
polinucleotídica seleccionada de entre el grupo constituido por las
SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 7, SEC. ID. nº 11, SEC. ID. nº 13, SEC.
ID. nº 15, SEC. ID. nº 17, SEC. ID. nº 19 y SEC. ID. nº 21.
13. Vacuna de ADN según la reivindicación 11 ó
12, en la que el montaje de ADN se incorpora operativamente en un
vector de Salmonella typhimurium atenuada.
14. Utilización de un montaje de ADN que
codifica operativamente una proteína survivina y un producto génico
inmunoactivo, y de un vehículo farmacéuticamente aceptable para la
preparación de una vacuna de ADN destinada a inhibir el crecimiento
tumoral en un mamífero, debiéndose dicha vacuna de ADN administrar
oralmente al mamífero en una cantidad que provoque una respuesta
inmunológica eficaz y dicho mamífero presenta una respuesta
inmunitaria provocada por la vacuna y específica para las células
tumorales, en la que el montaje de ADN está incorporado
operativamente en un vector bacteriano atenuado.
15. Utilización de un montaje de ADN que
codifica operativamente una proteína survivina y un producto génico
inmunoactivo, y de un vehículo farmacéuticamente aceptable para la
preparación de una vacuna de ADN destinada a vacunar a un mamífero
contra el cáncer, debiéndose dicha vacuna de ADN administrar
oralmente al mamífero en una cantidad que provoque una respuesta
inmunológica eficaz y dicho mamífero presenta una respuesta
inmunitaria provocada por la vacuna y específica para las células
tumorales, en la que el montaje de ADN está incorporado
operativamente en un vector bacteriano atenuado.
16. Utilización según la reivindicación 14 ó 15,
en la que el producto génico inmunoactivo codificado por el montaje
de ADN es una citocina o un ligando para un receptor de la
superficie de la célula destructora natural.
17. Utilización según la reivindicación 14 ó 15,
en la que el mamífero es un ser humano.
18. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 17, en la que el vector bacteriano atenuado
se selecciona de entre el grupo constituido por Salmonella
typhimurium, Salmonella typhi, especies de
Shigella, especies de Bacillus, especies de
Lactobacillus, BCG, Escherichia coli, Vibrio
cholerae, especies de Campylobacter y especies de
Listeria.
19. Utilización según la reivindicación 18, en
la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa
AroA^{-} de Salmonella typhimurium.
20. Utilización según la reivindicación 18, en
la que la Salmonella typhimurium atenuada es una cepa
AroA^{-}, dam^{-} de Salmonella
typhimurium.
21. Artículo de fabricación que comprende una
vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, embalado en
un recipiente estéril, herméticamente sellado, presentando el
recipiente una etiqueta fijada al mismo, llevando la etiqueta
material impreso que identifica la vacuna y que proporciona
información útil para un individuo que administra la vacuna a un
paciente.
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