DE3623846C2

DE3623846C2 - Zusammensetzung zur selektiven Bestimmung einer biologisch aktiven Substanz

Info

Publication number: DE3623846C2
Application number: DE3623846A
Authority: DE
Inventors: Beka Salomon; Zeev Hollander; Ephraim Katchalski-Katzir
Original assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Current assignee: Ramot at Tel Aviv University Ltd
Priority date: 1985-07-17
Filing date: 1986-07-15
Publication date: 1995-03-16
Anticipated expiration: 2006-07-16
Also published as: JPS62209363A; US4876191A; IL75828A; IL75828A0; DE3623846A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen zur spezifischen Bindung eines bestimmten biologisch aktiven Proteins, wobei die Zusammensetzung einen wasserunlöslichen Träger enthält, an die ein Antikörper chemisch an die Fc-Region eines Immunglobulins gebunden ist, wobei dort ein für das biologisch aktive Protein spezifischer Antikörper immunchemisch gebunden ist.

Die Proteine der Wahl sind Enzyme, deren biologische Aktivität in einem großen Ausmaß aufrechterhalten wird, und dies im wesentlichen aus den folgenden Gründen:
a. Die Anti-Enzym-Antikörper werden so ausgewählt, daß sie die Enzyme ohne Beeinflussung der enzymatischen Aktivität fest binden;
b. Die Befestigung der Enzymmoleküle an der festen Phase (die im biologischen Sinn "feindlich" ist), wird über ein langes Zwischenteil bewirkt, das zwischen dem Träger und dem aktiven Teil des Enzymmoleküls gelegen ist.

Der Träger-Antikörper gegen die Fc-Region von Immunglobulin- Konjugat kann verwendet werden, um eine Vielzahl spezifischer Antikörper an ihn zu binden, von denen jeder für ein gewünschtes biologisch aktives Protein spezifisch ist. Solche Proteine können somit aus Flüssigkeiten einschließlich Körperflüssigkeiten extrahiert und bestimmt werden.

Träger-gebundene Enzyme sind seit den Pionierarbeiten von Katchalsky und Bar-Eli bekannt. Solche Enzyme werden in den verschiedensten Gebieten und auch in großindustriellen Verfahren eingesetzt. In der Medizin ist die quantitative Bestimmung bestimmter Enzyme in Körperflüssigkeiten ein wichtiges diagnostisches Werkzeug. Die Menge und Art vorkommenden Enzyme zeigt verschiedene Zustände pathologischer Bedingungen an, die teilweise mit anderen Mitteln nicht entdeckt oder bestimmt werden können. Zur Bestimmung von Enzymen und Isoenzymen sind verschiedene Verfahren in Gebrauch, wie beispielsweise die Bestimmungen spezifischer Enzymaktivitäten, gegebenenfalls in Gegenwart von Inhibitoren oder Aktivatoren, um zwischen Isoenzymen zu unterscheiden; die Verwendung von Abtrennungsverfahren, mit denen sich Enzyme und Isoenzyme abtrennen lassen, und die darauf folgende Bestimmung derselben; oder Immunbestimmungen von Enzymen auf der Grundlage verschiedener Antikörper. Die meisten dieser bekannten Verfahren sind ziemlich mühsam und teuer.

Die Verwendung monoklonaler Antikörper bewirkt eine hohe Spezifität solcher Proben, es ist möglich eine große Zahl solcher monoklonaler Antikörper herzustellen, die auf spezielle wohldefinierte Stellen eines gegebenen Proteins gerichtet sind. Es wurde bereits vorgeschlagen, momoklonale Antikörper herzustellen, diespezifisch sind für verschiedene Enzyme mit hoher Affinität, ohne die enzymatische Aktivität nachteilig zu beeinflussen. An einen Träger gebundene Antikörper sind für ein gegebenes Enzym spezifisch. Die vorliegende Erfindung vermeidet eine Anzahl von Nachteilen der bekannten Systeme von Träger-gebundenen biologisch aktiven Proteinen und bietet wertvolle Mittel zur Anwendung in der Diagnose und auch in industriellen Verfahren, in denen Träger-gebundene Proteine und insbesondere Enzyme verwendet werden.

Es werden Zusammensetzungen geschaffen, die bioaktive Moleküle, wie beispielsweise biologisch aktive Proteine oder andere Verbindungen zur Bestimmung einer Antikörper-Produktion binden können, wenn sie in geeignete Labortiere injiziert werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen bestehen aus einem Drei-Komponenten-Konjugat A-B-C-, worin
A einen wasserunlöslichen Träger, und
B einen Antikörper gegen die Fc-Region eines Immunglobulins, an welcher dort ein Antikörper über eine immunchemische Bindung gebunden ist, bezeichnet, und
C spezifisch ist für den Teil, der an das A-B-C- Konjugat befestigt werden soll. Wenn dies ein bioaktives Molekül ist, wie beispielsweise ein Enzym, kann es aus dem flüssigen System, wie z. B. Körperflüssigkeiten, quantitativ extrahiert und quantitativ bestimmt werden. Es kann auch eine Säule aus Trägergebundenen aktiven Proteinen A-B-C-E, wie z. B. Enzymen, vorgesehen sein, worin E ein solches aktives Protein (Enzym) bezeichnet, und solche Säulen können zur Durchführung enzymatischer Verfahren verwendet werden. Es können auch Träger-gebundene Stoffe A-B-C-E verwendet werden, in denen A in Form von Kügelchen oder anderen Teilchen vorliegt, und in denen das enzymatische Verfahren durch Kontaktieren des Substrats mit solchen Träger-gebundenen Enzymen in Teilchenform durchgeführt wird.

Im folgenden wird die Erfindung unter Bezugnahme auf biologisch aktive Proteine und insbesondere Enzyme näher beschrieben. Sie kann auch bei anderen geeigneten bio-aktiven Molekülen angewendet werden.

Die neuen Zusammensetzungen können für analytische Zwecke, wie für die Bestimmungen aktiver Stoffe (Proteine, insbesondere Enzyme) verwendet werden; sie können auch für Zwecke verwendet werden, bei denen ein Träger-gebundener vorteilhaft ist:
Beispielsweise können Säulen aus Träger-gebundenen aktiven Proteinen (Enzyme und dergl.) geschaffen werden, die es ermöglichen, bestimmte Umwandlungen, und mit Enzymen enzymatische Verfahren, durchzuführen.

Im folgenden wird die Erfindung anhand von Enzymen näher erläutert, dem Fachmann ist aber ersichtlich, daß dies lediglich zum Zwecke der Erläuterung geschieht und daß auch andere Haptene (aktive Proteine und andere Stoffe, die zur Bestimmung einer Antigen- Bildung geeignet sind, verwendet werden können.
Die Bindung A-B ist im allgemeinen stabil, beispielsweise eine kovalente Bindung, eine hydrophobe Bindung oder eine andere Bindung von gleicher Stärke. Der Antikörper richtet sich gegen die Fc-Region eines Immunglobulins. Es können sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper verwendet werden, die die nachstehend im einzelnen beschriebenen Eigenschaften aufweisen.

Das A-B-C-Konjugat bindet den Stoff, beispielsweise das Enzym, gegenüber den der C-Antikörper spezifisch ist, selektiv. Das schließlich erhaltene Konjugat kann für die quantitative Bestimmung von Enzymen oder zur Durchführung enzymatischer Verfahren verwendet werden. Das A-B-Konjugat ist der Basis-Teil, und es kann eine große Zahl an Antikörpern daran gebunden werden, insbesondere an den Stoff, der bestimmt werden soll oder dessen Aktivität verwendet werden soll.

Der Träger-gebundene Antikörper kann zur selektiven Extraktion eines spezifischen Enzyms aus Körperflüssigkeiten und zu seiner Bindung verwendet werden, wobei die volle enzymatische Aktivität erhalten bleibt. Die oben definierte A-B-Kombination kann jeden gewünschten Antikörper-Typ binden, sei es von Maus, Kaninchen, Menschen oder anderen Quellen.
Das A-B-Konjugat kann zusammen mit einem oder mehreren Antikörpern, die entsprechend den spezifischen Anforderungen an den A-B-Teil gebunden sind, als kommerzielles Produkt angeboten werden. Dies ergibt eine große Flexibilität, und somit können Mittel zur selektiven Bindung einer großen Zahl spezifischer Enzyme vorgesehen werden, entsprechend der in dem A-B-C-Teil vorgesehenen C-Teil. Die hohe Spezifität der C-Antikörper ergibt einen sehr hohen Grad an Spezifität des Träger-gebundenen Antikörpers.
Die Einführung des B-Teils erhöht die Spezifität und die spezifische Aktivität des Endproduktes beträchtlich; sie ergibt Universalität, Vielseitigkeit und Flexibilität.

Der feste Träger A kann aus einer großen Zahl von geeigneten Feststoffen ausgewählt werden, wie z. B. Sepharose, Eupergit C, Polystyrol, Polyamiden, Polyacrylamid-Gelen, Glas, Polyvinylpyrrolidon usw. Die verschiedenen Polymere können in Form von Festkörpern, Platten, Röhren, Hohlfasern, Fasern, Kugeln usw. eingesetzt werden. Teil B ist ein spezifischer Antikörper, der spezifisch für die Fc-Region eines ausgewählten Immunglobulins ist. Dies kann Mäuse-, Kaninchen- oder menschliches Immunglobulin sein; falls erforderlich, kann ein solches Immunglobulin species-spezifisch sein. Die Bindung von B an A kann eine stabile chemische Bindung (kovalente Bindung) sein oder es kann die hydrophobe Auflösung von zwei hydrophoben Stoffen verwendet werden. Die Bindung sollte von entsprechender Stärke sein, und unter den verschiedenen Möglichkeiten sei als Bestandteil B genannt:

1. Polyklonale Antikörper:
Anti-Maus-Antikörper können durch Injektion in irgendein geeignetes Tier hergestellt werden; der polyklonale Antikörper kann gegen die Fc-Region (Maus) gewonnen werden, in ähnlicher Weise kann er gegen die menschliche Fc-Region gewonnen werden.
2. Monoklonale Antikörper:
Es können monoklonale Antikörper zur Bestimmung der Fc-Region eines gewünschten Säugetier-Immunglobulins (Maus, Kaninchen, Mensch) hergestellt werden, die nicht mit anderen interferierenden Immunglobulin- Arten reagieren.

Der C-Teil: Antikörper zur Enzym-Bindung

Es wird eine Antikörper-Präparation hergestellt, die sich so an ein spezifisches Enzym anlagern kann, daß die Enzymaktivität nicht nachteilig beeinflußt wird. Die Bindung soll von entsprechender Stärke sein, was durch eine geeignete Auswahl erreicht werde kann. Die Affinität des Enzyms soll hoch sein (in der Größenordnung von 10⁸ M^-1), wodurch die Bindung zum Enzym oder Isoenzym eine adäquate Stärke erreicht.

Dies gilt sowohl für monoklonale als auch für polyklonale Antikörper. Versuche haben gezeigt, daß eine so hohe Bindungsstärke ohne wesentlichen Aktivitätsverlust erreicht werden kann.

Der Teil C des A-B-C-Konjugats kann ein maßgeschneiderter Antikörper sein, der spezifisch ist für irgendeinen Stoff, der die Antikörperbildung nach üblichen Verfahren ermöglicht. Der C-Teil kann somit spezifisch sein für gewisse Stoffe, die als Körperflüssigkeiten entfernt werden sollen, wie beispielsweise Serum. Bevorzugt werden für diesen Zweck monoklonale Antikörper mit hoher Spezifität gegenüber dem zu entfernenden Stoff verwendet. Ein solches System kann beispielsweise für die Entfernung bestimmter Typen von Drogen und anderer geeigneter Materialien aus menschlichem Serum verwendet werden, das danach wieder dem Körper des Patienten zugeführt wird.

Der oben definierte Stoff A-B-C-E- ist durch einen hohen Grad an Stabilität und Enzymaktivität charakterisiert. Die Aktivität des gebundenen Enzyms kann für eine quantitative Bestimmung des gleichen Enzyms verwendet werden. Das Präparat kann auch in Form einer Säule oder in anderer Form, wie es bei Träger-gebundenen Enzymen üblich ist, zur Durchführung von enzymatischen Umwandlungen verwendet werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung.

Beispiel 1: Immobilisierte Carboxypeptidase (CPA)

Das gewünschte mAb für CPA wurde nach bekannten Standardverfahren hergestellt und gereinigt. Es wurde über die Oxirangruppen des Polymers (siehe Fig. 1) an Eupergit C oder über das Fc-Fragment des Antikörpers an Sepharose-Protein A gebunden. Carboxypeptidase A wurde dann mit den Konjugaten von Eupergit C-mAb oder Sepharose-Protein A-mAb umgesetzt und ergab immobilisierte Carboxypeptidase- A-Präparate, in denen praktisch die gesamten gebundenen Enzymmoleküle ihre volle katalytische Aktivität beibehalten hatten. Das erhaltene Präparat von Eupergit C-mAb-CPA und Sepharose-Protein A-mAb-CPA behielten auch bei längerer Lagerung in der Kälte praktisch ihre gesamte ursprüngliche Aktivität.

Die Immobilisierung von Schweine-Lactat-Dehydrogenase (Isoenzym-5; LDH-5) wurde wie folgt durchgeführt:
Maus-Hybridoma-Zellen, die monoklonale Antikörper an das Enzym abgaben, wurden in üblicher Weise hergestellt. Diejenigen, die monoklonale Antikörper erzeugten, die mit hoher Affinität an das Enzym gebunden wurden, ohne ihre Aktivität zu beeinflussen, wurden isoliert. Gleichzeitig wurde ein Ziegen-Anti- Maus IgG (Fc)- Eupergit-C-Konjugat (Eupergit C-GAMIgG (Fc)) hergestellt. Das letztere wurde mit dem gewünschten Maus-mAb, das in dem Überstand zugegen war, in dem die selektierten und isolierten Hybridoma kultiviert worden waren, umgesetzt und ergab Eupergit C-GAMIgG (Fc)-mAb-Konjugat. Es wurde gefunden, daß das Konjugat leicht mit LDH-5-Isoenzym reagierte und komplexes GAMIgG(Fc)-mAb-LDH-5 ergibt. Es wurde gefunden, daß die gesamten LDH-5-Moleküle ihre ursprüngliche Aktivität beibehielten und beim Lagern in der Kälte auch einige Monate aufrechterhielten.

Carboxypeptidase A (CPA) wurde als wässrige Kristall- Suspension eingesetzt (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA). Die Kristalle wurden mit bidestilliertem Wasser gewaschen, zentrifugiert und in 0,05 M Tris-HCl/ 0,5 M NaCl-Puffer, pH 7,5 gelöst. Das unlösliche Material wurde durch Zentrifugieren entfernt. Die Proteinkonzentration wurde bei einer Absorption bei 278 nm unter Verwendung eines Perkin-Elmer-Spektrophotometers Modell 550-S erhalten. Es wurde angenommen, daß die molare Absortivität für natives CPA bei 278 nm 6,42×10⁴ M^-1 cm^-1 beträgt ⁵. Die Proteinkonzentration wurde auch nach der Bradford-Methode⁶ unter Verwendung von Rinderserumalbumin (BSA) als Standard bestimmt.

Eupergit C-Kügelchen wurden von der Röhm-Pharma-GmbH, Darmstadt, bezogen und entsprechend den Herstellerempfehlungen bei -18°C gelagert. Nach den Untersuchungen enthalten die Kügelchen 800 bis 1000 Mikromole Oxiran- Gruppen pro 1 g Trockengewicht, bestimmt nach der Axen-Thiosulfatmethode⁷. Es wurde gefunden, daß sie etwas adsorbiertes Aceton enthalten. Da das letztere eine beträchtliche Absorption bei 278 nm zeigt, wird empfohlen, die Kügelchen mit destilliertem Wasser zu waschen, bis die Waschlaugen keine erkennbare Absorption bei 278 nm mehr zeigen.

Protein-A-Sepharose CL-4B wurde von Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, bezogen. 1 g des Trockenmaterials quoll in 0,1 M Phosphatpuffer beim pH 8 und ergab 3,5 ml Gel mit einem Gehalt von 2 mg Protein A pro ml.

Bestimmung der Enzymaktivität von nativer und immobilisierter Carboxypeptidase A

Die Enzymaktivitäten von CPA und deren Derivaten wurden nach Whitaker et al.⁸ spektrophotometrisch bei 254 nm und 25°C bestimmt, wobei 10^-3 M Hippuryl- L-phenylalanin in 0,05 M Tris-HCl/0,5 M NaCl-Puffer pH 7 als Peptidasesubstrat und 10^-3 M Hippuryl-DL-β- phenyl-milchsäure im gleichen Puffer als Esterasesubstrat verwendet wurden. Die empfohlene Analysenmischung enthielt 2 µm CPA pro 1 µl Substratlösung. Eine Peptidase- oder Esterase-Aktivitätseinheit wurde definiert als die Menge Enzym, die die Hydrolyse von 1 Mikromol Substrat pro Minute unter spezifizierten Bedingungen katalysiert. Die spezifische Aktivität des eingesetzten CPA betrug 270 Esterase- Einheiten/mg und 56 Peptidase-Einheiten/mg. Die katalytische Aktivität des immobilisierten CPA von Immobilisiertem Enzym enthaltend 2 µg gebundenes Enzym 1 ml Standard-Substratlösung (10^-3 M Hippuryl- L-phenylalanin oder Hippuryl-DL-phenylmilchsäure in 0,05 Tris-HCl/0,5 M NaCl-Puffer, pH 7,5) wurde bestimmt durch einminütiges Schütteln bei Raumtemperatur, Abzentrifugieren des immobilisierten Enzyms und Bestimmung der Zunahme der Absorption bei 254 nm.

Herstellung eines monoklonalen Antikörpers für Carboxypeptidase, der die Enzymaktivität nicht beeinflußt

Monoklonale Antikörper der Maus für CPA wurden nach der beschriebenen Methode⁹ hergestellt, indem die bekannte Fusionstechnik von Köhler und Milstein¹⁰ verwendet wurde. Die Überstände der wachsenden Hybridoma- Zellen wurden gesammelt und unter Verwendung des ELISA-Verfahrens auf CPA-Bindung untersucht.

Hybridomas, die Überstände mit relativ hohen Titern erzeugten, wurden ausgewählt, geklont und für die Herstellung der entsprechenden Aszitesflüssigkeiten verwendet. Die in diesen Aszitesflüssigkeiten anwesenden monoklonalen Antikörper wurden dann durch Fällung mit 50%igem Ammoniumsulfat¹¹ isoliert und ihre Bindungskonstante nach einem modifizierten ELISA-Verfahren unter Verwendung von β-Galaktosidase, die mit F(ab)₂-Fragmenten von Schaf-Antimaus-IgG als zweitem Antikörper konjugiert war, bestimmt¹². Die monoklonalen Antikörper (mAb), die für die Enzymimmobilisierung ausgewählt worden waren, zeigten eine Bindungskonstante von 10⁹ M^-1 und beeinflußten weder die Peptidase- noch die Esteraseaktivitäten der CPA. Ihre chemische Natur wurde als IgG₁ identifiziert durch den Ouchterlony-Doppel-Immunodiffusionstest¹³. Es konnte so unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose- Affinitätssäule⁴ gereinigt werden. Die Elution der IgG₁-Subklasse wurde bei einem pH 6,0 unter Verwendung eines 0,1 M Citratpuffers durchgeführt. Der erhaltene Peak, der durch Messung der Proteinabsorption bei 280 nm gemessen wurde, wurde gesammelt, auf einen pH 8,0 gebracht, durch Ultrafiltration unter Verwendung einer Diaflo PM30-Membran konzentriert und wie oben rechromatographiert. 10 ml der ausgewälten Aszites- Flüssigkeit ergaben 10 mg gereinigte monoklonale Antikörper (mAb).

Der Einfluß des gereinigten mAb auf die enzymatische Aktivität von CPA wurde wie folgt bestimmt:
Das Enzym (2 µg in 2 µl 0,05 M Tris-HCl/0,5 M NaCl- Puffer, pH 7,5) wurde 1 Std. bei Raumtemperatur mit wachsenden Mengen des gereinigten mAb (10-100 µg in 100 µl des gleichen Puffers) inkubiert. Die Peptidase- und Esteraseaktivitäten der Inkubationsmischung wurde wie oben beschrieben bestimmt. Selbst bei den höchsten angewandten mAb-Konzentrationen wurde kein Einfluß auf die jeweiligen Enzymaktivitäten festgestellt.

In diesem Zusammenhang ist festzustellen, daß alle untersuchten Aszitesflüssigkeiten, die die verschiedenen monoklonalen Antikörperpräparate enthielten, sowohl die Peptidase- als auch die Esteraseaktivitäten der CPA nichtspezifisch inhibierten. In diesem Fall war somit eine Reinigung der monoklonalen Antikörper erforderlich, um die Art der Wechselwirkung zwischen CPA und deren monoklonalen Antikörpern aufzuklären.

Herstellung des Eupergit C-Monoklonale Antikörper- Carboxypeptidase A-Komplex (Eupergit C-mAb-CPA)

Eupergit C (100 mg) wurde zu einer Lösung von gereinigtem mAb (1 mg) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0 (1 ml) zugegeben und die erhaltene Suspension wurde 24 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen. Am Ende dieses Zeitraums waren praktisch die gesammten Antikörper an den Träger gebunden. Der Eupergit C-mAb-Komplex wurde durch Zentrifugation abgetrennt und die verbleibenden aktiven Oxirangruppen durch Inkubation mit 10% Äthanolamin, pH 9,0 (1 ml) über einen Zeitraum von weiteren 24 Std. bei Raumtemperatur blockiert. Das erhaltene immobilisierte Antikörperpräparat wurde wiederholt mit destilliertem Wasser gewaschen und schließlich mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) äquilibriert. Die erhaltene Suspension von Eupergit C- mAb in PBS (0,8 ml) wurde 1 Std. bei Raumtemperatur mit CPA (400 µg) in 0,5 M NaCl (0,2 ml) inkubiert. Die Menge des auf dem Träger immobilisierten Proteins wurde aus der Differenz zwischen der Anfangsmenge des Proteins in der Reaktionsmischung, bestimmt durch den Bradfordtest, und der nach dem Kuppeln im Überstand gefundenen Menge, bestimmt. Etwa 50% der anfänglich vorhandenen Menge des Enzyms wurden unter den aufgeführten experimentellen Bedingungen immobilisiert. Ähnliche Ergebnisse wurden aus der Differenz zwischen der Anfangs-Enzymaktivität und der im Überstand nach dem Kuppeln verbliebenen erhalten. Die Messungen der Peptidase- und Esteraseaktivitäten des immobilisierten CPA zeigten, daß das gebundene Enzym praktisch seine gesamte ursprüngliche katalytische Aktivität beibehalten hatte. Es wurde gefunden, daß die so erhaltene CPA-Präparation bei der Lagerung in PBS bei 4°C nahezu die gesamte Anfangsaktivität für einige Monate beibehielt.

Herstellung von Sepharose-Protein A-monoklonalen Antikörpern-Carboxypeptidase A-Komplex (Sepharose- Protein A-mAb-CPA)

Sepharose-Protein A-Kügelchen (100 mg in 1 ml 0,1 Phosphatpuffer, pH 8,0) wurden mit Aszites-Flüssigkeit (400 µl, enthaltend 400 µg mAb) vermischt und die Mischung 1 Std. bei Raumtemperatur inmubiert. Die Kügelchen, die die gebundenen Antikörper enthielten, wurden zentrifugiert und mit dem obigen Phosphatpuffer gewaschen, bis die Waschlaugen keine erkennbare Absorption bei 280 nm mehr zeigten. Zu den im gleichen Puffer (1 ml) suspendierten Sepharose-Protein A-mAb- Kügelchen wurde CPA (100 µg) in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0 (150 µl) hinzugegeben und die Reaktionsmischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt. Die Menge des nicht umgesetzten Enzyms wurde durch Messung der Enzymaktivität oder des im Überstand nach der Zentrifugation verbliebenen Proteins bestimmt. Etwa 20% der ursprünglichen Enzymaktivität (oder des Anfangs-Proteingehalts) wurden unter den angewandten experimentellen Bedingungen im Überstand gefunden. Die Messung der Enzymaktivität der Sepharose-Protein A- mAb-CPA-Kügelchen ergab, daß praktisch das gesamte gebundene Enzym seine ursprüngliche Peptidase- und Esteraseaktivitäten beibehalten hatte. Es wurde gefunden, daß die so erhaltenen CPA-Präparate ihre Anfangsaktivitäten nahezu völlig beibehielten, wenn sie einige Monate in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0 bei 4°C gelagert wurden.

Einige charakteristische Eigenschaften der immobilisierten Carboxypeptidase A-monoklonale Antikörper- Präparate

Die Analyse der Hydrolysekinetik von Hippuryl-L-phenyalanin und Hippuryl-DL-β-phenylmilchsäure durch Eupergit C-mAb-CPA oder Sepharose-Protein A-mAb-CPA zeigte, daß die charakteristischen kinetischen Parameter K_M und V_max bei beiden immobilisierten CPA-Präparaten gleich waren und fast völlig mit den für das native Enzym in der Literatur¹⁴ angegebenen entsprechenden Parametern übereinstimmten (K_M = (2,6-4,0)×10^-4 M und V_max = (5,0-9,0)×10^-5 M/min pro mg Enzym für die Peptidaseaktivität und K_M = (7,9-9,0)×10^-5 M und V_max = (2,0-5,0 ×10^-4 M/min pro Enzym für die Esteraseaktivität). Die Wirkung von Phenylpropionsäure auf die Aktivitäten der beiden immobilisierten CPA-Präparate war ähnlich wie deren Wirkung auf das native Enzym¹⁵, d. h., es wirkte bezüglich der Peptidaseaktivität als kompetitiver Inhibitor und bezüglich der Esteraseaktivität als nichtkompetitiver Inhibitor. Nach einer 2stündigen Inkubation bei 50°C verlor das in PBS suspendierte Sepharose-Protein A- mAb-CPA 40% seiner ursprünglichen Aktivität, das in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 8,0 suspendierte Sepharose-Protein A-mAb-CPA verlor 65% seiner ursprünglichen Aktivität, während das native CPA in Lösung (PBS, pH 7,4) etwa 80% seiner ursprünglichen Aktivität verlor. Es wurde gefunden, daß die pH- Aktivitätskurve von Eupergit C-mAb-CPA der des nativen Enzyms¹⁶ sehr ähnlich war, daß aber die Stabilität im pH-Bereich 4,5-7,5 etwas größer war. Die pH-Aktivität und -Stabilität von Sepharose-Protein A-mAb-CPA kann unterhalb des pH 6,0 nicht gemessen werden wegen der Dissoziation des mAb-Protein A-Komplexes.

Immobilisierung von Milchsäure-Dehydrogenase Materialien

Schweine-Lactat-Dehydrogenase (Isoenzym-5; LDH-5) Typ XXXII (E.C. 1.1.1.27), Natriumpyruvat und NDH wurden von Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo., USA, bezogen. Das Enzym wurde als kristalline Suspension in Ammoniumsulfat erhalten. Da hohe Verdünnungen des Enzyms in PBS, pH 7,5 verwendet wurden, erwies sich eine Dialyse des Ammoniumsulfats als nicht erforderlich.

Es sind verschiedene tetramere LDH-Isoenzyme bekannt¹⁷. Die folgenden Isoenzyme, die aus den Untereinheiten M (Muskel) und H (Herz) bestehen, sind charakterisiert worden: LDH-1 = H₄; LDH-2 = H₃M; LDH-3 = H₂M₂; LDH-4 = HM₃; und LDH-5 = M₄. In der unten beschriebenen Immobilisations-Verfahrensweise wurde LDH-5 verwendet.

Die Enzymaktivität von nativem LDH wurde nach Kornberg¹⁸ gemessen, indem die Abnahme der Absorption bei 340 nm bei der Oxideation von NADH in Gegenwart von Pyruvat verfolgt wurde.

Die Aktivität von immobilisiertem Enzym wurde wie folgt bestimmt;
100 µl der immobilisierten Enzymsuspension, die etwa 1,5 µg gebundene LDH-Protein enthielt, wurde zu 1 ml der Pyruvat/NADH-Analysenlösung hinzugegeben¹⁸. Die Mischung wurde 1-2 sec lang bei Raumtemperatur verwirbelt und dann 40 sec bei 37° stehen gelassen. Das immobilisierte Enzym wurde mit 10.000 g innerhalb einer Minute bei Raumtemperatur abzentrifugiert und seine enzymatische Aktivität aus der Abnahme der Absorption bei 340 nm berechnet.

Ziegen-Antimaus-IgG-(Fc)-Serum wurde von Bio-Yeda, Kiryat Weizmann, Rehovot, Israel, bezogen. Nach den Herstellerangaben enthielt es 4,7 mg Antimaus-IgG pro ml Serum. Gereinigtes Ziegen-IgG (GAMIgG) (95%) wurde durch Behandlung des Serums mit DEAE-Cellulose (DE-52, bezogen von Whatman Biochemicals, Springfield Mill, Maidstone, Kent, England) nach Stanworth¹⁹ erhalten.

Eupergit C: Die charakteristischen Eigenschaften dieses unlöslichen Polymerträgers sind in dem vorigen Abschnitt beschrieben, der sich mit der Herstellung von immobilisiertem CPA befaßt. In den in diesem Abschnitt beschriebenen verschiedenen Eupergit C- Präparaten wurde eine Entfernung des absorbierten Acetons nicht durchgeführt. Der Proteingehalt wurde in allen Fällen nach der Bradford-Methode⁶ durchgeführt, da eine ausgeprägte Aceton-Absorption bei 280 nm die Bestimmung des Proteingehalts durch die Absorption bei dieser Wellenlänge verhinderte. Die Abtrennung des Eupergit C und seiner verschiedenen beschriebenen Derivate aus der Flüssigphase, in der sie suspendiert waren, wurde (wenn nichts anderes angegeben) durch Zentrifugieren bei 1500 g über einen Zeitraum von 10 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt.

Herstellung von Hybridoma-Kulturmedium, enthaltend monoklonale Antikörper für LDH-5

Monoklonale Maus-Antikörper für LDH-5 wurden nach dem Verfahren von Köhler und Milstein¹ unter Verwendung der von Stahli et al.²⁰ empfohlenen Immunisierungs- Verfahrensweise hergestellt. Die Hybridoma-Zellen, die die monoklonalen Antikörper für LDH-5 absonderten, wurden auf einem Dulbeco-modifizierten Eagle-Medium, das mit 10% Pferdeserum angereichert war, kultiviert. Die Anwesenheit der monoklonalen Antikörper wurde nach der ELISA-Methode getestet, und es wurden nur Überstände, die monoklonale Antikörper (mAbs) enthielten, die die Enzymaktivität nicht beeinflußten, für die weiteren Untersuchungen ausgewählt.

Die Bindungskonstanten für die Bindung des LDH-5 an die monoklonalen Antikörper-Präparate wurden nach Scatchard²¹ bestimmt. Die Trennung des gebundenen und freien Antigens (LDH-5) wurde nach der Doppel- Antigen-Festphasenmethode (DASP)²² unter Verwendung von Eupergit C gebundenem GAMIgG als Festphasen- Reagens (siehe unten) durchgeführt. Die Konzentrationen der monoklonalen Antikörper in den verschiedenen Hybridoma-Kulturmedien wurden nephelometrisch bestimmt²³. Eine unabhängige Bestimmung der Konzentrationen der monoklonalen Antikörper kann auch aus den in den oben beschriebenen Scatchard-Experimenten erhaltenen Daten durchgeführt werden. Der Immunglobulin- Typ der erhaltenen monoklonalen Antikörper wurde nach der Doppel-Immunodiffusions-Standard-Methode nach Ouchterlony¹³ bestimmt.

Zwei Hybridoma-Überstände wurden als Quelle für die Herstellung der nachfolgend beschriebenen immobilisierten LDH-5 Proben monoklonalen Antikörper ausgewählt. Es wurde gefunden, daß der Überstand I 45 µg mAb des IgGl-Typs pro ml Überstand mit einer Bindungskonstante von 5×10⁸ M^-1 und der Überstand II 20 µg mAb des IgG2A-Typs pro ml Überstand mit einer Bindungskonstante von 1×10⁹ M^-1 mit LDH-5 enthielt.

Eupergit C-Ziegen-Antimaus-IgG(Fc) (Eupergit C-GAMIgG)

Die gereinigte GAMIgG-Fraktion wurde in PBS, pH 7,5, gelöst und die Lösung auf eine optische Enddichte von 3,8 bei 280 nm (entsprechend einer Proteinkonzentration von 2,8 mg pro ml) gebracht. 4 ml dieser Lösung wurden dann zu 1 g trockenem Eupergit C zugegeben. Die Dicke Suspension wurde 48 Std. bei Raumtemperatur stehen gelassen und dann mit 4 ml PBS, pH 7,5 vermischt. Der erhaltene Eupergit C-GAMIgG-Komplex wurde zentrifugiert und der Überstand auf verbliebenes Protein untersucht. Praktisch das gesamte Protein war unter den angewandten experimentellen Bedingungen an den Träger gebunden. Der Eupergit C-GAMIgG-Komplex wurde intensiv mit PBS, pH 7,5, gewaschen, bis die Waschlaugen eine vernachlässigbare Absorption bei 280 nm zeigten. Der Überschuß der nicht umgesetzten Oxirangruppen in den Eupergit C-GAMIgG-Pellets wurde durch Zugabe von 10 ml 10%igem wässrigem Äthanolamin, das mit konzentrierter HCl auf einen pH von etwa 9,0 gebracht worden war, neutralisiert. Die erhaltene Mischung wurde aus einen pH von 9,0 eingestellt und die so erhaltene Suspension über Nacht bei 4°C leicht gerührt. Das erhaltene Konjugat wurde zentrifugiert und wiederholt mit PBS, pH 7,5, gewaschen, bis die Waschlaugen den gleichen pH hatten wie der Puffer.

Ein rohes Eupergit C-GAMIgG(Fc)-Präparat konnte durch Umsetzung des Polymerträgers mit einem entsprechenden Volumen Ziegen-Antimaus-Serum unter den oben angegebenen Bedingungen erhalten werden. Das rohe Träger-Konjugat zeigte jedoch eine beträchtlich niedrigere Wirksamkeit (pro 1 g) bei der Bindung von monoklonalen Murin-Antikörpern als diejenige, die bei dem Kupplungsprodukt von Eupergit C mit gereinigtem Ziegen-Antimaus- IgG gemessen wurde. Die Eupergit C-GAMIgG-Präparate wurden in Suspension in PBS, pH 7,5, in der Kälte gelagert. Ihre Bindungskapazität für Murin-Antikörper blieb bei der Lagerung über einige Monate erhalten.

Immobilisiertes LDH-5 der Struktur Eupergit C-Ziegen- Antimaus IgG-Monoklonale Antikörper-LDH-5 (Eupergit C-GAMIgG-mAb-LDH-5)

Die Eupergit C-GAMIgG-Suspension in PBS, pH 7,5, (200 µl, enthaltend 25 Vol.-% aktives Gel) wurde zentrifugiert und das Pellet mit 0,4 ml Überstand I oder II vermischt (siehe den Abschnitt über die Herstellung von Hybridoma-Kulturmedium, enthaltend monoklonale Antikörper für LDH-5). Die erhaltene Suspension wurde unter schütteln 1 Std. bei 37°C inkubiert. Das erhaltene Eupergit C-GAMIgG-mAb wurde zentrifugiert und mit PBS, pH 7,5 gewaschen. Das Waschen wurde unter Verwendung von 6 ml-Portionen Puffer für jede Wäsche wiederholt. Zu dem Pellet wurden 0,2 ml einer Lösung in PBS, pH 7,5, hinzugegeben, die 180 µg LDH-5 und 1 mg BSA pro 1 ml enthielt, und die Suspension wurde unter Schütteln 1 Std. bei 37°C inkubiert. Das erhaltene Konjugat, das aus Eupergit C-GAMIgG-mAb- LDH-5 bestand, wurde dann zentrifugiert und wie oben mit PBS, pH 7,5, gewaschen. Das erhaltene Pellet wurde nach der Zentrifugation in PBS, pH 7,5, suspendiert und in der Kälte gelagert.

Die Menge des absorbierten LDH-5, das durch Eupergit C- GAMIgG-mAb absorbiert war und das immobilisierte Enzym ergab, wurde aus der Differenz zwischen der Gesamt- Enzymaktivität in der Anfangs-Reaktionsmischung und derjenigen nach der Absorption berechnet. Praktisch das gesamte unter Verwendung der Überstände I oder II anfänglich eingesetzte Enzym wurde durch den immobilisierten Eupergit C-Komplex absorbiert.

Die Bestimmung der Enzymaktivität der Eupergit C-GAMIgG- mAb-LDH-5-Präparate zeigte, daß praktisch das gesamte gebundene Enzym seine volle Aktivität beibehielt. Die Lagerung des immobilisierten Enzyms in PBS, pH, 7,5, in der Kälte führte zu einer Abnahme der Aktivität um 30% innerhalb von sechs Monaten.

Beispiel: Trägergebundenes Schweine-Lactat-Dehydrogenase- Isoenzym-5 (PLDH5)

Eine Glassäule mit einem Radius von 0,6 cm und einer Höhe von 2,7 cm wurde mit 3 ml Eupergit C-Kügelchen gepackt, an das polyklonales Ziegen-Antimaus-IgG (1 mg pro 1 ml Kügelchen) angelagert war. Ein Volumen von 0,5 ml Aszites-Flüssigkeit, enthaltend monoklonale Antikörper gegen PLDH5 (2 mg), das die Enzymaktivität nicht beeinflußte (Bindungskonstante etwa 0,5×10⁸ M^-1), wurde langsam (15 Minuten) bei Raumtemperatur durch die Säule geleitet. Die Säule wurde dann mit PBS, pH 7,5, gewaschen, das 0,1% Tween 20 enthielt, bis keine nennenswerte Absorption des Eluats bei 280 nm mehr beobachtet werden konnte. Ein Volumen von 2 ml PBS, pH 7,5, enthaltend PLDH5 (2 mg/ml) und Rinder-Serum-Albumin (2 mg/ml) wurde dann über einen Zeitraum von 30 Minuten bei Raumtemperatur durch die Säule geleitet. Die Säule wurde dann mit der gleichen Lösung wie oben gewaschen, bis praktisch keine Aktivität in dem Eluat festgestellt werden konnte. Die Proben wurden dann von der Säule entfernt und die Aktivität der immobilisierten Enzyme untersucht. Auf dem Träger wurde die volle Aktivität der gebundenen Menge (insgesamt 2 mg PLDH5 pro 3 ml Träger) zurückbehalten. Die Säule wurde dann mit 30 ml 0,2 M Glycin-HCl-Puffer, pH 2,2, gewaschen und mit PBS äquilibriert, bis der pH des Eluats der gleiche war wie der pH des verwendeten Puffers. Die enzymatische Aktivität des auf dem Träger gebundenen PLDH5 wurde auf den von der Säule entnommenen Proben untersucht. Dabei wurde keine meßbare Aktivität gefunden.

Elution monoklonaler Antikörper

Die monoklonalen Antikörper gegen die Enzyme werden danach eluiert. Dies ermöglicht es, einen unterschiedlichen Enzym-spezifischen Antikörper anzulagern. Das Immobilisierungsverfahren der monoklonalen Antikörper- Immobilisierungsstufe wurde mit einem unterschiedlichen Antikörper wiederholt und wie oben beschrieben fortgesetzt. Die enzymatische Aktivität des so nach dem zweiten Immobilisierungsverfahren immobilisierten Enzyms wurde untersucht. Es wurde die volle enzymatische Aktivität des immobilisierten Enzyms aufrechterhalten.

Das in die Säule gepackte Produkt kann, wenn es die richtigen monoklonalen Antikörper enthält, als Mittel zum Extrahieren und Entfernen unerwünschter Materialien aus Lösungen dienen und sie für die gewünschten Zwecke geeigneter machen.

Beispielsweise ist es möglich, das Serum eines Patienten durch eine solche Säule zu leiten, giftige Drogen oder Materialien daraus zu entfernen und es danach wieder in den Körper des Patienten zurückzuführen.

Das folgende Experiment dient der Erläuterung:
Verwendung von Immunoadsorbent A-B-C- zur Extraktion von Enzym aus Serum:

In diesem Experiment sind:
A = Eupergit C
B = Speziesspezifisches Ziegen-Antimaus IgG (reine Antikörper)
C = Reine monoklonale Antikörper gegen Schweine-LDH- Isoenzym-5 (PLDH5), das die Enzymaktivität nicht beeinflußt und eine Bindungskonstante von 5,6 ×10⁸ M^-1 aufweist
Enzym = Schweine-LDH-Isoenzym-5 und die Serenproben von Mensch oder Pferd
Gleiche Teile (0,1 ml) verschiedener PLDH5-Konzentrationen (32-64 Mg/ml) wurden zu Proben (1 ml) von menschlichem oder Pferdeserum hinzugegeben. Zu jeder Probe wurden 125 ml immobilisierte monoklonale Antikörper ("A-B-C-") hinzugegeben.

Die Suspensionen wurden unter konstantem Schütteln bei 37°C inkubiert, zentrifugiert und der Überstand entfernt. Die auf dem Immunoabsorbent immobilisierte Enzymaktivität wurde gemessen. Fast das gesamte (99%) Enzym wurde aus den Seren entfernt, das bis zu einer Gesamtkonzentration von 40 mg/ml in den Serumproben enthalten war. Fast 100% des immobilisierten Enzyms behielt seine Aktivität auf dem A-B-C-Träger.

Literatur

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Claims

1. Zusammensetzung zur selektiven Bindung einer biologisch aktiven Substanz zur Bestimmung einer Antikörper- Produktion, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung die Struktur A-B-C aufweist, worin
A einen wasserunlöslichen Träger,
B einen Antikörper gegen die Fc-Region eines bestimmten Immunglobulins, und
C einen für die biologisch aktive Substanz spezifischen Antikörper bezeichnen,
wobei der Antikörper an den B-Teil durch eine immunchemische Bindung gebunden ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz ein Enzym oder Isoenzym ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger Eupergit C (T.M.), Sepharose 4B (T.M.), Polystyrol, Polyamide, Polyacrylamid-Gele; Glas in Form von Platten, Stäben, Röhren, Kugeln, Teilchen; und/oder geschäumten Kunststoffen ist.

4. Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der an den festen Träger gebundene Antikörper ein monoklonaler oder polyklonaler Antikörper ist, der spezifisch ist für die Fc-Region von Mäuse- oder menschlichem Immunglobulin.

5. Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymspezifische Antikörper an den Antikörper gegen die Fc-Region des Immunglobulins durch eine immunchemische Bindung gebunden ist.

6. Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der enzymspezifische Antikörper spezifisch ist für Milchsäure-Dehydrogenase.

7. Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger-Anti-Fc-Antikörper-Bindung eine chemisch stabile Bindung ist, insbes. eine kovalente oder hydrophobe Bindung.

8. Zusammensetzung nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Konjugat A-B-C in Form einer gepackten Säule vorliegt.