DE2363201B2

DE2363201B2 - Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Kallikrein aus biologischem Material

Info

Publication number: DE2363201B2
Application number: DE19732363201
Authority: DE
Inventors: Hideki Takatsuki Aishita; Akira Akimoto; Setsuro Tokushima Fujii; Seiji Takatsuki Hiraku; Yasumichi Kyoto Kajita; Heizo Ibaragi Kira; Keiko Ibaragi Muryobayashi; Ken Taniguchi; Hiroshi Takatsuki Terashima; Minoru Kishiwada Osaka Wada
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1972-12-19
Filing date: 1973-12-19
Publication date: 1980-07-31
Also published as: GB1442796A; FR2210620B1; JPS504227A; DE2363201A1; FR2210620A1; JPS5325030B2

Description

Enzyme, wie Trypsin, Kallikrein, Plasmin und Chymotrypsin, die den Kininstoffwechsel beeinflussen, spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation des Kreislaufsystems. Zusammen mit diesen Enzymen sind die entsprechenden Inhibitoren im Blut und in den Organen wichtig für die Aufrechterhaltung der normalen Körperfunktionen.

Das Prinzip der affinitätschromatographischen Reinigung und Isolierung von physiologisch aktiven Enzymen aus Organextrakten und Blutextrakten unter Verwendung entsprechender an einen unlöslichen Träger gebundener Substanzen ist aus der DE-OS 15 17 753 bekannt. In diesem Zusammenhang nennt diese Druckschrift auch Kallikrein und einen Kallikrein-Inhibitor.

Außerdem sind in der Veröffentlichung »Methods in Enzymology«, Bd. XXU (1971), S. 347/8, Agarose-, Dextran- und Polyacrylamid-Träger für die Affinitätschromatographie genannt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Kallikrein aus biologischem Material zu schaffen, bei dem man Körperflüssigkeit oder einen Extrakt aus Gewebe oder Körperflüssigkeit mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Kallikrein-Inhibitor in Kontakt bringt und das dabei gebundene Kallikrein eluiert. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß sich als Träger Agarose, Dextran oder Polyacrylamid besonders gut eignet. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen 1 bis 3 gekennzeichneten Gegenstand.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Kallikrein mit dem entsprechenden Inhibitor unter Ausbildung eines unlöslichen Komplexes kombiniert und anschließend unter Verwendung eines Elutionsmittels mit einer bestimmten Zusammensetzung freigesetzt.

Als biologisches Material für die Herstellung des Extraktes können beispielsweise Organe, wie Herz, Lüiigf, Bauchspeicheldrüse, Ohrspeicheldrüse, Niere, Leber oder Milz, von Säugetieren, wie Pferden, Rindern, Schweinen, Hunden, Kaninchen, Schafen, Meerschweinchen oder Ratten, oder Körperflüssigkeiten, wie Blut oder Lymphe, von Menschen oder den vorgenannten Säugetieren verwendet werden.

Natürlich vorkommende Inhibitoren für Kallikrein sind bekannt

Diese Inhibitoren können nach chemischen Verfahren an unlösliche Träger gebunden werden, die inaktiv, porös und hydrophil sind. Erfindungsgemäß wird Agarose, Dextran oder Polyacrylamid als Träger

ίο eingesetzt Als Agarose kann beispielsweise modifizierte Agarose (Sepharose), deren Polysaccharidketten zu einem dreidimensionalen Netzwerk verknüpft sind (nachfolgend »modifizierte Agarose« genannt), und als Dextran Sephadex, ein dreidimensional vernetztes Polysaccharide das durch Quervernetzung der linearen Makromoleküle von Dextran erhalten worden ist verwendet werden. Als Polyacrylamid kann beispielsweise Polyacrylamidgel Biogel für die Gelfiltration von Naturstoffen mit Molekulargewichten zwischen 500 und 50 Millionen verwendet werden. Wenn Agarose oder Dextran als unlöslicher Träger verwendet wird, an den ein natürlich vorkommender Inhibitor für Kallikrein chemisch gebunden wird, wird der Träger zuerst mit Bromcyan aktiviert (vgl. Rolf Axen, Jerker Porath & Sverker Ernback, Nature, Bd. 214 [1967], S. 1302 bis 1304). Beispielsweise werden 15 bis 20 g Bromcyan und 100 ml Wasser zu 100 ml Agarose gegeben. Anschließend wird das erhaltene Gemisch unter Rühren und unter Eiskühlung innerhalb von 15 Minuten tropfenweise mit 8 n-NaOH versetzt, wobei der pH-Wert auf 10,5 bis ί 1,5 und die Temperatur auf 10 bis 15⁰C gehalten wird. Dabei werden die Hydroxylgruppen der Agarose zu aktiven Iminocarbonatgruppen

— O

C = NH

umgesetzt. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird anschließend rasch mit etwa 1 Liter 0,1 m wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung auf einer Glasfritte gewaschen und sodann zu einem Gemisch aus 1 g Inhibitor und 100 ml 0,1 m wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung gegeben. Das erhaltene Gemisch wird anschließend etwa 3 Stunden bei Raumtemperatur und sodann über Nacht bei 4° C umgesetzt. Dabei wird eine Aminogruppe des verwendeten Inhibitors direkt an die Agarose über eine Iminocarbonatester-, Carbamidsäureester- oder Pseudoharnstoffbindung gebunden.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, 100 ml der gemäß dem vorstehenden Verfahren aktivierten Agarose zu 100 ml einer 0,2 m Lösung einer ω-Diaminverbindung, wie Äthylendiamin, die mit 6 η-Salzsäure auf den pH-Wert 10 eingestellt worden ist, zu geben und das Gemisch unter Bildung von Aminoäthyl-agarose über Nacht bei 4°C umzusetzen. 1 g Inhibitor und 100 ml

bo Wasser werden zu dem erhaltenen Reaktionsgemisch gegeben, das hierauf auf den pH-Wert 4,7 eingestellt wird. Sodann werden 2,7 g l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid (ein wasserlösliches Carbodiimid) zugegeben, und das Gemisch wird über Nacht bei 4°C

h5 umgesetzt. Dabei kondensiert eine Carboxylgruppe des Inhibitors unter Wasserabspaliung mit einer Aminogruppe, wodurch der Inhibitor über eine Äthylaminogruppe an die Agarose gebunden wird.

Auf die gleiche Weise werden 100 ml einer 2 m Lösung einer ω-Aminocarbonsäure, wie e-Aniinocapronsäure, zu 100 ml der auf die vorstehende Weise aktivierten Agarose gegeben. Das Gemisch wird bei einem pH-Wert von 8 bis 10 bei 4°C über Nacht zu Carboxyalkylagarose umgesetzt. 1 g Inhibitor und 100 ml Wasser werden sodann zu der Carboxyalkylagarose gegeben. Das erhaltene Gemisch wird auf den pH-Wert 4,7 eingestellt, mit 24 g l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid versetzt und über Nacht bei 4° C umgesetzt Dabei kondensiert eine Aminogruppe des Inhibitors unter Wasserabspaltung mit der Carbonsäure, wobei der Inhibitor über eine Carbonylhexylgruppe an die Agarose gebunden ist

Gemäß einer weiteren Ausführungsfonn zur Verknüpfung des Inhibitors mit der Agarose werden 5 mMol Bromessigsäure und 6 mMol N-Hydroxysuccinimid in 40 ml Dioxan gelöst und mit 6 mMol Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, wonach das Gemisch 2 Stunden umgesetzt wird. Der erhaltene Dicyclohexylhainstoff wird abfiltriert und das Fdtrat bei 4°C und einen pH-Wert von 7,5 mit 100 ml Aminoäthyl-agarose umgesetzt Nach 1 stündiger Umsetzung wird das Reaktionsgemisch mit kalter, wäßriger, 0,1 m Natriumchloridlösung gewaschen, wonach Bromacetyl-agarose verbleibt 1 g Inhibitor wird in 0,1 m-Essigsäurepuffer vom pH-Wert 5,1 gelöst und über Nacht bei 4°C mit 100 ml der vorstehend erhaltenen Bromacetyl-agarose umgesetzt. Anschließend wird das Reaktionsgemisch mit wäßriger 0,1 m-Natriumhydrogencarbonatlösung auf einer Glasfritte gewaschen und anschließend in 100 ml der gleichen Natriumhydrogencarbonatlösung suspendiert Die Suspension wird sodann 3 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt und schließlich bei 4°C über Nacht stehengelassen. Dabei wird der Inhibitor über eine Amino-, Tyrosin- und Histidingruppe des Proteins an das Gel gebunden.

Der Inhibitor kann auch nach folgendem Verfahren unter Verwendung von Aminoäthyl-Agarose an Agarose gebunden werden. 100 ml Wasser und 10 g Bernsteinsäureanhydrid werden zu 100 ml Aminoäthyl-agarose gegeben und bis zu einem pH-Wert von 6,0 tropfenweise mit 20prozentiger wäßriger Natronlauge versetzt Nachdem sich ein stabiler pH-Wert eingestellt hat, wird das Gemisch über Nacht stehengelassen. Man erhält Succinylaminoäthylagarose. 100 ml dieses Gemisches werden mit 1 g des Inhibitors vermischt Der pH-Wert des Gemisches wird auf 4,7 eingestellt, und sodann werden 2,5 g l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyI)-carbodiimid zugegeben. Anschließend läßt man das Gemisch über Nacht bei 4° C reagieren. Dabei wird der Inhibitor über eine Aminogruppe an die Succinylaminoäthyl-agarose gebunden.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, 10 ml Aminoäthyl-agarose zu 10 ml einer 0,2 m-Natriumboratlösung vom pH-Wert 9,0, die 40 Prozent Dimethylformamid enthält zu geben und das Gemisch bei Raumtemperatur 1 Stunde mit 30 mg p-Nitrobenzoylazid umzusetzen. Das Reaktionsgemisch wird mit SOprozentigem Dimethylformamid gewaschen und 40 Minuten bei 50⁰C und einem pH-Wert von 8,5 mit 400 mg Natriumhypothionat reduziert Man erhält p-Aminobenzamidoäthylagarose. Dieses Produkt wird anschließend 5 Minuten bei 0⁰C mit einer 0,1 m-Natriumnitritlösung in 0,5 η-Salzsäure diazotiert Das erhaltene Gemisch wird mit 0,2 m-Natriumchloridlösung gewaschen und anschließend sofort 2 Stunden bei O⁰C mit dem inhibitor (iOömg/iömi Wasser) umgesetzt, wobei der pH-Wert des Gemisches mit 1 η-Natronlauge auf 8,5 gehalten wird. Dabei wird der Inhibitor über Tyrosin und Histidin an die Agarose gebunden.

Bei Verwendung von Polyacrylamid als unlöslichem Träger wird 1 g eines Polyacrylamidgels für die Gelfiltration von Naturstoffen mit einem Molekulargewicht zwischen 500 und 50 Millionen mit 15 bis 20 ml Äthylendiamin 8 Stunden bei einer Temperatur von ίο 9O⁰C umgesetzt Sodann wird das Gemisch abgekühlt und mit kalter wäßriger Natriumchloridlösung auf einer Glasfritte gewaschen. Man erhält Aminoäthyl-PolyacrylamidgeL Sodann wird ein Gemisch aus 100 ml des so erhaltenen gequollenen Gels, 1 g Inhibitor, 100 ml

Wasser und 2,5 g l-Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimid bei einem pH-Wert von 4,7 und einer Temperatur von 4° C über Nacht umgesetzt Dabei wird der Inhibitor über eine Carboxylgruppe des Proteins an das Aminoäthyl-Polyacrylamidgel gebunden.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, das gequollene Aminoäthyl-Polyacrylamidgel mit Wasser und hydratisiertem Hydrazin in einer solchen Menge zu versetzen, daß die Hydrazinkonzentration 3 m beträgt und das Gemisch unter Rühren 8 Stunden bei 50⁰C umzusetzen. 1 g des erhaltenen Polyacrylamidgels wird anschließend in 150 ml 0,3 η-Salzsäure suspendiert und sodann auf 4°C abgekühlt. Anschließend werden 10 ml 1 m-Natriumnitritlösung zugegeben. Nach 30minütiger Umsetzung wird das Reaktionsgemisch rasch nachein ander mit 03 n-Salzsäure, 0,1 m-Sulfaminsäure und kaltem Wasser gewaschen und sodann zu 1 g Inhibitor, der in 100 ml 0,1 m-Natriumborat gelöst ist gegeben. Das Gemisch wird I¹/2 Stunden bei 0⁰C umgesetzt und anschließend 2 Stunden mit 20 ml 1 m-Ammoniak und

κ 20 ml 1 m-Ammoniumchloridlösung reagieren gelassen. Schließlich wird das Reaktionsgemisch mit 0,2 m-Natriumchloridlösung gewaschen. Bei der vorstehenden Umsetzung wird der Inhibitor über eine Aminogruppe des Proteins an das Gel gebunden.

Auf ähnliche Weise wird 1 g Hydrazid-Gel in 300 ml 0,1 m-Natriumchloridlösung suspendiert Die Suspension wird allmählich unter Rühren mit Bernsteinsäureanhydrid versetzt, wobei der pH-Wert des Gemisches mit 2 η-Natronlauge auf 4 gehalten wird. Anschließend wird das Gemisch 2 Stunden umgesetzt Nach Waschen mit kaltem Wasser werden 300 mg Inhibitor und 800 mg 1 -Äthyl-S-p-dimethyiaminopropylJ-carbodiimid zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird bei einer Temperatur von 4°C und einem pH-Wert von 4,7 über Nacht umgesetzt. Dabei wird der Inhibitor über eine Aminogruppe des Proteins an das Gel gebunden.

Da die Kallikrein-Inhibitoren in ihrem unlöslichen Zustand in der Lage sind, das Kallikrein spezifisch zu adsorbieren, können sie zum Abtrennen und Reinigen des Kallikreins verwendet werden, indem man die unlöslich gemachten Kallikrein· Inhibitoren mit einer Organextraktlösung oder einer verdünnten Lösung von Blut, Lymphe oder einer anderen Körperflüssigkeit vermischt und rührt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren können die verschiedenen Maßnahmen, wie Extraktion des Kallikreins aus den verschiedenen Organen, Verdünnung von Blut, Lymphe oder anderen Körperflüssigkeiten, Binden des in den Extrakten oder verdünnten Körperflüssigkei ten enthaltenen Kallikreins an den unlöslich gemachten Inhibitor und Waschen des erhaltenen gebundenen Kallikreins in einem pH-Bereich von 4 bis 10 in Wasser oder Pufferlösungen bei einer luneimärke vuii 0 bis 5

durchgeführt werden. Beispiele für geeignete Puffer sind Triäthanolamin-Salzsäure, Trisaminomethan-Salzsäure, Borsäure-Kaliumchlorid-Natriumhydroxid, Essigsäure-Natriumacetat und Kaliumphosphat-Natriumphosphat Die vorgenannten Maßnahmen werden vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis 30⁰C durchgeführt

Das Freisetzen des an den unlöslich gemachten Kallikrein-Inhibitors gebundenen Kallikreins kann in wäßrigen, gegebenenfalls gepufferten Lösungen bei einem pH-Wert von 0,5 bis 6 durchgeführt werden, beispielsweise in verdünnter Salzsäure, Essigsäure, Essigsäure-Natriumacetat-Puffer, Salzsäure-Kaliumchlorid-Puffer, Kaliumphosphat-Natriumphosphat-Puffer und Kaliumcitrat-Natriumhydroxid-Puffer. Dabei wird vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 0 bis 30° C gearbeitet

Zur Extraktion des Kallikreins aus Organen werden die entsprechenden Organe auf geeeignete Weise auf eine zur Homogenisation ausreichende Teilchengröße zerkleinert, beispielsweise in einem Waring-Mischer. Anschließend wird das so zerkleinerte Organ zur Extraktion mit der vorgenannten Pufferlösung versetzt und homogenisiert Die das Kallikrein enthaltende wäßrige Phase wird anschließend durch Zentrifugieren oder Filtrieren vom zerkleinerten Organ abgetrennt. Auf diese Weise erhält man einen Ext akt, der das Kallikrein enthält. Liegt es im Plasma von Rohblut vor, so ist es notwendig, das Rohblut zum Abtrennen der Blutkörperchen zu zentrifugieren. Das so rrhaltene Blutplasma bzw. andere Körperflüssigkeiten können gegebenenfalls mit den vorgenannten Pufferlösungen verdünnt werden, um einen ausreichenden Kontakt mit dem unlöslich gemachten Kallikrein-Inhibitor bzw. eine ausreichende Adsorption sicherzustellen. Dabei wird die Viskosität des Plasmas oder der Körperflüssigkeiten gesenkt und ihr pH-Wert eingestellt.

Das gesamte vogenannte Verfahren kann bei Temperaturen von 0 bis 4°C durchgeführt werden.

Wie aus dem Vorstehenden hervorgeht, kann die Abtrennung und weitere Reinigung des Kallikreins dadurch vorgenommen werden, daß der unlöslich gemachte Kallikrein-Inhibitor durch Vermischen oder Verrühren mit der das Kallikrein enthaltenden Lösung in Kontakt gebracht wird. Eine andere Möglichkeit besteht darin, diese Lösung über eine mit dem unlöslich gemachten Kallikrein-Inhibitor beschickte Säule zu geben und das Kallikerin daran zu adsorbieren, den Säuleninhalt zu waschen und das Kallikrein anschließend unter Verwendung eines geeigneten Puffers oder einer anderen Lösung zu eluieren. Das Kallikrein kann im Eluat durch Nachweis der enzymatischen Aktivität festgestellt werden. Beispielsweise kann eine Esterase-Aktivität unter Verwendung von Acetyltyrosin-äthylester als Substrat, eine Casein-zersetzende Aktivität oder eine Kinin-bildende Aktivität nachgewiesen werden.

Die Menge des zu adsorbierenden Kallikreins hängt von der Menge des an den Träger gebundenen Kallikrein-Inhibitors und vom pH-Wert ab. Die Reinigung und Konzentration des Kallikreins kann nach üblichen Verfahren vorgenommen werden. Beispielsweise kann unter Verwendung eines Eindampfers eingeengt, entsalzt und unter Verwendung einer Molekularsieb-Membran, beispielsweise einer CeIIuIoseacetat-Membran oder einer Polyeiektrolyt-Komplexmembran, eingeengt oder gefriergetrocknet werden, wodurch ein ak Arzneinränarat verwendbar*; Produkt erhalten wird.

Da sich das erfindungsgemäße Verfahren dei Affinität zwischen dem hochmolekularen Kallikrein und einem hochmolekularen taUikrein-Inhibitor bedient tritt eine spezifische und sehr starke Bindung nur zwischen diesen komplementären Molekülen mit hohem Molekulargewicht auf. Durch diese in erster Linie sterisch bedingte Bindung wird ein wesentlich höherer Trenngrad erreicht, als er sich bei Reinigungsverfahren mit Ionenaustauscherharzen ergibt Das erfind'ingsgemäße Verfahren ist aus diesem Grunde den üblichen Reinigungsverfahren weit überlegen. Außerdem weisen an unlösliche Träger gebundene Inhibitoren für Kallikrein nicht nur eine spezifische Bindungsfähig-■-! keit, sondern auch eine ausgezeichnete Stabilität auf, die es ermöglicht, daß sie wiederholt eingesetzt werden können, ohne daß eine komplizierte Regenerationsbehandlung notwendig ist Das erfindungsgemäße Verfahren hat demgemäß einen sehr großen Anwendungsbereich zur Gewinnung von Kallikrein in großtechnischem Maßstab.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, Kallikrein aus biologischem Material in einer einzigen Stufe zu isolieren und zu reinigen. Demgegenüber find bei herkömmlichen Verfahren zur Isolierung und Reinigung eine Anzahl von komplizierten Stufen nötig, beispielsweise fraktionierte Fällung mit Ammoniumsulfat, Fällung mit einem Lösungsmittel und anschließende Abtrennung, Säulenchromatographie und Gelfiltration (vgL B. Kassell, M. Radicevic, S. Berlow, R. J. Peanasky und M. Laskowski Sr, J. Biol. Chem., Bd. 238 [19631 S. 3274 bis 3279, und H. Moriya, A. Kato und H. Fukushima, Biochem. Pharmacol, Bd. 18 [2], 1969, S. 549 bis 552). Außerdem ist es durch das erfindungsgemäße J5 Verfahren möglich, Kallikrein auf wirtschaftliche Weise in hoher Reinheit herzustellen, wodurch die Verwertung von verschiedenen Organen und Körperflüssigkeiten sowie von biologischem Abfallmaterial erleichtert wird. Ober die Eignung von bestimmten Trägern zum Einsatz bei der Affinitätschromatographie zur Reinigung von bestimmten Enzymen lassen sich keine zuverlässigen Vorhersagen treffen. Dies ergibt sich auch aus der DE-OS 15 17 753. Darin ist angegeben, daß bei Verwendung von Copolymerisaten aus Äthylen und Maleinsäureanhydrid als Träger zwar eine Isolierung von Trypsin und Chymotrypsin in Ausbeuten von 90 bis 100% möglich ist, aber das sehr eng mit diesen beiden Proteasen verwandte Kallikrein unter fast gleichen Bedingungen nur in Ausbeuten von 10 bis 20^u/o erhalten so wird.

Somit war es überraschend, daß Kallikrein bei Verwendung der erfindungsgemäß eingesetzten Träger in Ausbeuten von über 80% erhalten wird.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die Herstellung von -wertvollen Arzneipräparaten zu verbessern. Das in biologischem Material vorkommende Kallikrein ist ein wertvolles Hormon zur Kreislaufbehandlung (vgl. IC M. Herrligkoffer, Med. Wsch, Bd. 6 [1952J S. 353).

so Die Beispiele erläutern die Erfindung. Alle Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht.

Beispiel 1 _b5 A. Gewinnung des Inhibitors

1 kg gefrorene Rinderlunge wird in Stücke geschnitten und mit 1 Liter 0,1 m-Triäthanolaminpuffer vom nH-Wprt 7 8 Her 0 ~i m an IMatriiimrhlnriH iinH 0 01m -in

Calciumchlorid ist, versetzt. Das erhaltene Gemisch wird mit Eis gekühlt und 10 Minuten unter Verwendung eines Waring-Mischers homogenisiert. Das Homogenat wird eine weitere Stunde gerührt und sodann mit einem Filterhilfsmittel aus Kieselgel verschiedener Korngröße versetzt. Die erhaltene Suspension wird zentrifugiert. Der Niederschlag wird im gleichen Volumen des vorgenannten Puffers suspendiert und nochmals zentrifugiert. Die vereinigten Überstände werden mit 50prozentiger Trichloressigsäure bis zu einer Endkonzentration von 2,5 Prozent versetzt. Die erhaltene Lösung wird 30 Minuten stehengelassen und sodann zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird mit 3,5 n-Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 7,8 eingestellt und sodann filtriert. Man erhält 1950 ml einer durchsichtigen transparenten Lösung, in der 1 053 000 Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-Einheiten enthalten sind.

Getrennt davon wird 1 g Trypsin bei einem pH-Wert von 9,2 über Nacht mit 100 ml modifizierter Agarose (Sepharose 4B), die vorher mit 10 g Bromcyan aktiviert worden ist, zu Trypsin-Agarose (unlöslich gemachtes Enzym), umgesetzt. 75 ml dieses unlöslich gemachten Enzyms werden in eine Säule der Abmessungen 2,2 χ 20 cm gegeben. Sodann werden 1950 ml der vorstehend erhaltenen Lösung mit 1 053 000 Trypsin-Kallikrein-Inhibitor-Einheiten über die Säule gegeben. Die Säule wird mit 0,1 m-Triäthanolaminpuffer vom pH-Wert 7,8 so lange gewaschen, bis das Eluat vollkommen proteinfrei ist. Anschließend wird die Säule mit 0,25 m-Kaliumchlorid-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert 1,8 eluiert, wobei der Kallikrein-lnhibitor in einer Ausbeute von 80 Prozent erhalten wird. Die spezifische Aktivität des auf diese Weise erhaltenen Inhibitors ist 53- bis 130mal so hoch, wie die entsprechende Aktivität der Ausgangslösung. Das auf diese Weise erhaltene Produkt wird anschließend säulenchromatographisch entsalzt, wobei die Säule mit einem dreidimensional vernetzten Polysaccharid beschickt ist, das durch Quervernetzung der linearen Makromoleküle von Dextran erhalten worden ist.

B. Reinigung von Kallikrein aus Schweineserum

5 ml modifizierte Agarose (Sepharose 4B) werden mit 5 ml Wasser und 1 g Bromcyan versetzt und 10 Minuten umgesetzt, wobei der pH-Wert mit in Natriumhydroxid in einem Bereich von 10,5 bis 12,0 gehalten wird. Sodann wird das Reaktionsgemisch mit 200 ml kaltem Wasser gewaschen und mit 5 ml einer Lösung des gemäß A erhaltenen Kallikrein-Inhibitors in 0,1 m-Boratpuffer vom pH-Wert 9,2 versetzt. Sodann wird das Reaktionsgemisch mit 1 n-Natriumhydroxidlösung auf den pH-Wert 9,2 eingestellt und 17 Stunden bei einer Temperatur von 4°C umgesetzt.

4 ml des auf diese Weise erhaltenen, an die modifizierte Agarose gebundenen Kallikrein-Inhibitors, werden in eine Säule gegeben und mit 20 ml 0,1 m-Trisaminomethan-Salzsäure-Puffer vom pH-Wert

in 8,5, der 0,5 m an Natriumchlorid ist, äquilibriert. Sodann wird eine Kallikrein enthaltende Ammoniumsulfat-Globulinfraktion aus Schweineserum (optische Dichte bei 280 nm: 89,82) zugegeben. Die Säule wird mit dem vorgenannten Puffer gewaschen und anschließend entweder mit 0,1 m-Essigsäure oder 0,01 n-Salzsäure eluiert. Der Reinigungsfaktor beträgt etwa 43 und die Ausbeute, bezogen auf die ursprüngliche Aktivität, etwa 83 Prozent.

Beispiel 2

Ein Gemisch aus 1 g Pankreaspulver und 50 ml kaltem Wasser wird 45 Minuten gerührt und sodann mit 2 m-Essigsäure auf den pH-Wert 4,1 eingestellt. Das Gemisch wird weitere !'Λ Stunden gerührt und anschließend zentrifugiert Man erhält 48 ml Überstand. 2 ml dieses Überstands werden mit 10 ml 0,1 m-Trisaminomethan-Saizsäure-Puffer vom pH-Wert 8,0, der 10 millimolar an Calciumchlorid ist, verdünnt. Die erhaltene Lösung wird auf eine Säule aufgesetzt, die mit 4 ml an

jo modifizierte Agarose (Sepharose 4B) gebundenem Kallikrein-lnhibitor beschickt ist und vorher mit dem vorgenannten Puffer äquilibriert worden ist. Nichtabsorbierte Substanzen mit einer Absorption bei 280 nm werden ausgewaschen. Anschließend wird die Säule nacheinander mit 0,1 m-Acetatpuffer vom pH-Wert 4,0, 0,1 η-Essigsäure und 0,02 m-Salzsäure eluiert. Auf diese Weise werden nacheinander Chymotrypsin, Kallikrein und Trypsin erhalten.

Die Gewinnung von Chymotrypsin und Trypsin wird nicht beansprucht.

Beispiel 3

Gemäß Beispiel IB wird menschlicher Urin unter Verwendung des an modifizierte Agarose (Sepharose 4B) gebundenen Kallikrein-Inhibitors behandelt Gemessen an ihrer hypotensiven Aktivität ergibt sich eine 10fache Reinigung.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isoi/erung und Reinigung von KalHkrein aus biologischem Material, bei dem man Körperflüssigkeit oder einen Extrakt aus Gewebe oder Körperflüssigkeit mit einem an einen unlöslichen Träger gebundenen Kallikrein-Inhibitor in Kontakt bringt und das dabei gebundene Kallikrein anschließend eluiert, dadurch gekennzeichnet, daß man als Träger Agarosc, Dextran oder Polyacrylamid einsetzt

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Elution bei einer Temperatur von 0 bis 3O⁰C und einem pH-Wert von 0,5 bis 6 unter Verwendung von verdünnter Salzsäure, Essigsäure, Acetatpuffer, Boratpuffer, Salzsäure-Kaliumchloridpuffer, Phosphatpuffer oder Citratpuffer durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zusätzlich einengt und das Kallikrein gewinnt