DE2748657A1 - Verfahren zur bestimmung von ferritin - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von ferritin

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DE2748657A1 DE19772748657 DE2748657A DE2748657A1 DE 2748657 A1 DE2748657 A1 DE 2748657A1 DE 19772748657 DE19772748657 DE 19772748657 DE 2748657 A DE2748657 A DE 2748657A DE 2748657 A1 DE2748657 A1 DE 2748657A1
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Description

"2" 27A8657
Es isterwiesen, daß die Ferritin-Konzentration im Serum ein geeignetes Maß für die Eisenspeicherung des Körpers ist.
Nach J.W. Halliday et al., Clinica Chimica Acta 5£, 207 - 214 (1975), ist bekannt, Ferritin in Serum zu bestimmen, indem man in Plastikrchrchen, welche inwendig mit Anti-Leber-Ferritin-Antikörper überzogen sind, einerseits Leberferritin-Standards und andererseits Serumproben inkubiert, die Lösung abgießt, den Überzug wäscht und anschließend mit Anti-Leberferritin-125-Jod-Antikörper behandelt, den Überstand abgießt und die in den Röhrchen an den Überzug gebundene Radioaktivität im Gammazähler mißt.
Dieses Verfahren hat folgende Nachteile: Es ist außerordentlich schwierig, Reagenzröhrchen reproduzierbar mit Antikörper zu beschichten. Die Antikörperschicht kann außerdem sehr leicht durch Serum oder Puffer abgelöst werden. Sie ist zudem empfindlich, zum Beispiel gegen zu vi6cL oder zu wenig Feuchtigkeit bei der Lagerung. Schließlich kann man nach diesem Verfahren spezifisch das Ferritin nur eines Organs quantitativ bestimmen, und die Ferritine anderer Organe nur angenähert durch Kreuzreaktionen erfassen.
Um diese Nachteile zu vermeiden wurde nun ein Verfahren für die Bestimmung von Ferritin in Serum oder Plasma entwickelt, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Antikörper gerichtet gegen ein organspezifisches Isoferritin kovalent an Nylon qebunden einerseits mit Ferritinstandard'-Lösungen, die ein Isoferritin enthalten, das identisch mit oder verschieden ist von dem zur Produktion des Antikörpers genutzten Isoferritin , und andererseits unter sonst gleichen Bedinaunaen mit Serumproben inkubiert, dann die Inkubationslösungen dekantiert oder absaugt, den gebildeten Nylon-Antikörper-Ferritin-Komplex wäscht und anschließend mit einem jodmarkierten Antikörper gerichtet gegen ein zweites (vom ersten verschiedenen) organspezifisches Isoferritin inkubiert, die Lösung dekantiert, den gebildeten Nylon-Antikörper-Ferritin-Antikörper-125-Jod-Komplex wäscht, seine Radioaktivität int Gammazähler mißt und die Standardproben mit den Serumproben vergleicht.
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Zur Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird zunächst Ferritin einerseits aus menschlicher Leber und andererseits aus menschlicher Milz entsprechend den in der Literatur angegebenen Verfahren, z.B. nach R. Crichton, Structure Bonding Yl_, 68 - 139 (1973), isoliert und gereinigt. Das Organ wird in dest. Wasser homogenisiert und das Honogenisat über Glaswolle filtriert. Nach Erwärmen auf 70 C wird das Filtrat zentrifugiert und der Oberstand bis zur 50 %igen Sättigung mit Ammoniumsulfat versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in Wasser gelöst und gegen Acetat-Puffer dialysiert. Nach Zentrifugieren wird der Niederschlag in Phosphatpuffer-Lösung gelöst. Die Lösung wird über 'Sephadex G200 und
(R)
anschließend über Sepharose 6B chromatographiert. Die Ferritin enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und in einer Ultrafiltrationszelle konzentriert*
Plazentaferritin wurde nach der Methode von H. Bohn, Archiv Gynecology 2_1j>, 263 (1973) isoliert.
Die Ferritinpräparationen sind mindestens 95 % rein (bestimmt mit 2-dimensionaler-Iramuno-Elektrophorese und isoelektrischer Fokussierung) .
Antikörper für das Kuppeln an Nylon werden zweckmäßig in Kaninchen oder vorzugsweise in Schafen und Antikörper für die Radiomarkierung werden zweckmäßig in Kaninchen erzeugt. Dazu weden jeweils 50 μg bis 2 mg Ferritin verwendet. Die Primär-Immunisierung erfolgt durch Injektion einer Isöferritin-Lösung eines der genannten Organe und unter Zusatz von Freud's Adjuvants. Die Folge-Immunisierung , gegebenenfalls mehrfach, wird mit Isoferritinlösung ausgeführt und, wenn erforderlich, wieder Freud's Adjuvants zugesetzt.
Nach einigen Wochen wird den Tieren Serum entnommen, aus dem die Antikörper entweder durch Fällen mit Ammonsulfat oder durch Behandeln mit Immunoadsorbentien (z.B. Cyanbrorai.d-aktivierte Sepharose 6B) isoliert werden.
Der so isolierte Antikörper (Inrauno-ganira-Globulin IgG) wird an Nylon in Form von Netzen, Stäbchen oder vorzugsweise Kugeln von z.B. einigen
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Millimetern Durchmesser nach der Methode von H. Faulstich et al. Federation of the European Biochemical Society Letters 48, 226 (1974) kovalent gebunden.
Zur radioaktiven Markierung der Antikörper wird ein wie vorstehend beschrieben gewonnenes Serum, vorzugsweise Antiplazenta-Ferritin-Serum, durch Adsorption an ein Immunoadsorbens, z.B. an Cyanbromid-aktivierte Sepharose 6B mit Plazentaferritin, spezifisch gemacht, d.h. der Anteil des Plazentaferritin-spezifischen Antikörper wird von z.B. einer Säule des genannten Imrunoadsorbens adsorbiert und anschließend mit verdünnter Salzsäure eluiert und somit isoliert. Dieser spezifische Antikörper wird anschließend unter Benutzung der Methode von Greenwood, Hunter und Glover, Biocham. Journal 8JJ, 114 (1963), radio jodmarkiert.
Zur Herstellung der Isoferritin-Standards wird der Proteingehalt der einzelnen Isoferritine (Leber, Milz, Plazenta) nach der Methode von O.H. Lowry et al., Journal of Biological Chemistry 193, 265 (1951) bestimmt.
Die Isoferritine werden dann mit einer Protein-Pufferlösung, vorzugsweise mit Pferdeserum, auf Konzentrationen zwischen null und 600 Nanogramm Ferritin pro Milliliter verdünnt. Man erhält so die Standardlösungen.
Zur Durchführung der Bestimmung von Ferritin in Serum werden in je ein Reagenzröhrchen ein Nylonstück, vorzugsweise eine Nylonkugel, woran ein Anti-Isoferritin-Antikörper (Antikörper gerichtet gegen ein organspezifisches Isoferritin, z.B. aus Milz oder Leber) kovalent gebunden ist, mehrere Stunden lang, vorzugsweise 3-10 Stunden lang, zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°c, mit 20 - 200 Mikroliter Isofenritin-Standardlösung, in der das Isoferritin identisch mit oder verschieden von dem für die Erzeugung des Antikörpers verwendeten Isoferritins ist, und daneben 20 - 200 Mikroliter Patientenserurn, in dem das Ferritin bestimmt werden soll, sowie jeweils mit 100 - 400 Mikroliter Boratpuffer, vorzugsweise um einen pH-Wert von 8,6 - der außerdem 0,2 bis 1,0
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Gewichtsprozent Rinderserunallxssiin enthält inkubiert. Danach dekantiert man die Lösung und wäscht den gebildeten Nylon-Antikörper-Ferritin-Komplex mit destilliertem Wasser. Anschließend gibt man in jedes Reagenz röhrchen 200 - 400 μΐ einer Lösung des radio jodmarkierten Anti-Isoferritin-Antikörpers (Antikörper gerichtet gegen ein organspezifisches Isoferritin, z.B. aus Plazenta) und inkubiert
mehrere Standen, vorzugsweise 10-20 Stunden, lang, zweckmäßig bei einer Temperatur zwischen 20 und 40° C. Danach dekantiert man die Lösung oder saugt sie ab, und wäscht den gebildeten Nylon-Antikörper-Ferritin-Antikörper-125-Jbd-Koni>lex mit destilliertem Wasser. Die an den Nylonkugeln verbliebene Radioaktivität wird im Garnmazähler gemessen und die Ferritinkonzentration der Serumproben aus den Standardkurven interpoliert.
Im Verfahren gemäß der Erfindung sind folgende Kombinationen vor teilhaft und bevorzugt die drei ersten einzusetzen;
Antikörper an Nylon kovalent gebunden
Isoferritin-Standard
Antikörper radiojcd-markiert
Anti-Leberferritin Anti-Lsberferritin Anti-Leberferritin Anti-Leberferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Plctzentaf er ritin Anti- Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin
Milzferritin
Leberferritin
Leberferritin
Plazentaferritin
Leberferritin
Plazentaferritin
Milzferritin
Plazentaferritin
Leberferritin
Leberferritin
Plazentaferritin
Milzferritin
Ant i-Plazentaferri tin Anti-Milzferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Plazentaferritin Anti-Pia zenta ferritin Anti-Leberferritin Anti-Leberferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin Anti-Milzferritin
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Mit einer solchen Kombination von Antikörpern und Standards ist die Bestimmung des Serumferritin mit einer Empfindlichkeit bis hinab zu 2 Nanogramm Ferritin/ml möglich. Die obere Grenze der Bestimmungsmethode liegt bei 400 Nanogramm Ferritin/ml. Die Werte sind gut reproduzierbar. Es ist auch möglich, höhere Ferritinwerte in Serum zu bestimmen (bis I5.OOO Nanogramm Ferritin/ml), wenn das zu bestimmende Serum mit einem Humanferritin freiem Serum, z.B. Pferdeserum, verdünnt wird.
Es ist zweckmäßig die Reagenzien zur Durchführung des Verfahrens in einem Besteck ("kit") zusammenzustellen.
Dieses enthält z.B. Gefäße mit
100 Nylonkugeln, an die Anti-Leberferretin-Antikörper gebunden ist 1 Antiplazentaferritin-125-Jod
8 Leberferritinstandards 0, 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320 ng/ml 1 Testserum, dessen Ferritingehalt bekannt ist 1 Verdünnungsserum (Pferdeserum)
1 Puffer
Alle Reagenzien sind lyophilisiert.
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Beispiel: Herstellung von Antileberferritin Antikörper
1.1 Immunisierung
Tierart: Schaf
Eine Lösung von 2 mg Leberferritin in 2 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,4 wird in 2 ml Freud's Adjuvans emulgiert und intramuskulär an 4 bis 5 Stellen injiziert. Testblutentnahmen werden jeweils nach 7 bis 10 Tagen ausgeführt und der Titer des Antiserums bestimmt. Wenn ein Titer von 1:16 (Ouchterlony) erreicht ist, wird 1 Liter Blut dem Tier entnommen und daraus das Serum gewonnen.
1.2 Präparation der IgG-Fraktion des Antiserums
Eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung (536 g/l bei 20° C) wird hergestellt und der pH-Wert auf 7,4 eingestellt. Zu 100 ml Antiserum wird die gleiche Menge gesättigter Ammoniuinsulf atlösung zugesetzt und dabei kontinuierlich gerührt. Nach 30 Minuten Rühren bei Zimmertemperatur wird das Material mit 10.000 g 10 Minuten zentrifugiert und der Oberstand abgegossen. Der Niederschlag wird in 50 ml dest. Wasser gelöst und in einen Dialysierschlauch eingefüllt. Die Dialyse wird gegen dest. Wasser bei 4° C so lange fortgesetzt, bis die Dialysate keine Sulfationen mehr enthalten. Die Dialyse ist nach 16 bis 24 Stunden beendet und benötigt im allgemeinen einen 3- bis 4-maligen Wechsel des dest. Wassers (jeweils 3 1) ,
Die so erhaltene Immunoglobulinlösung wird lyophilisiert und bei 4° C im Vakuum über Silikagel aufbewahrt. Die Ausbeute des lyophilisierten Materials beträgt 3,5 g IgG/100 ml Antiserum.
2. Kovalente Bindung von Antileberferritin IgG an Nylonkugeln
5.000 Kugeln werden in 1 1 Tetrachlorkohlenstoff gewaschen und dann getrocknet. Die Kugeln werden dann in das Reaktions-
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gefäß gegeben und 5 1 4,52 N HCl, welche auf Zimmertemperatur abgekühlt ist, dazugegeben. Die Kugeln werden 30 Minuten gerührt, dann auf einen Büchner-Trichter gegeben und mit destilliertem Wasser solange gewaschen, bis keine Säure mehr nachzuweisen ist. Man gibt schließlich die Kugeln in das Reaktionsgefäß zurück und 5 1 0,1 M Na HPO.-Lösung dazu. Allmählich fügt man 100 g Bernsteinsäureanhydrid dazu; der pH-Wert 9,0 der Lösung muß durch gleichzeitige Eingabe von 46 %iger NaOH erhalten bleiben. Man rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur, gibt die Kugeln wiederum auf den Büchner-Trichter und wäscht nacheinander folgend mit 5 1 50 % Essigsäure, 5 1 destilliertem Wasser und 1 1 trocknem Dimethylformamid.
Die nachfolgenden Reaktionen müssen unter wasserfreien Bedingungen ausgeführt werden. Die Kugeln werden in das Reaktionsgefäß zurückgegeben und 5 1 trocknes Dimethylformamid (DMF) eingefüllt. Das Gefäß wird in ein Kühlbad gesetzt und die Temperatur der Reaktionslösung auf einen Bereich von -15° bis -20° C eingestellt. Die Kugeln werden langsam gerührt und 87 ml Triäthylamin und 60 ml Äthylchloroformat dazugegeben. Man läßt 15 Minuten reagieren. Die Kugeln werden mit 2 1 trockenem DMF gewaschen und dann 75 g N-Hydroxysuccinimid, gelöst in 2 1 trocknem DMF, zugesetzt. Man rührt 1 Stunde bei Zimmertemperatur und wäscht die Kugeln mit 5 1 kaltem destilliertem Wasser. Die Kugeln werden danach in eine Reaktionsflasche gegeben, die bereits 2,5 1 der Immunoglobulin-Lösung enthält, und über Nacht bei 4° C langsam gedreht (-^10 Upm) . Die Immunoglobulin-Lösung wird dekantiert und durch 1 1 1 M Glycin-Lösung ersetzt. Die Kugeln sollen dann 30 Minuten bei Zimmertemperatur mit der Glycin-Lösung rotieren. Schließlich wäscht man die Kugeln mit 5 1 Borat-Rinderserumalbumin-Puffer. Man läßt gut abtropfen und legt die Kugeln in einer Schicht auf ein Metallblech und trocknet sie durch Lyophilisieren über Nacht.
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3. Herstellung von Antiplazentaferritin-Antikörper 3.1 Immun i s ierung
Tierart: Kaninchen
Eine Lösung von 100 μg Plazentaferritin in 1 ml isotonischer Phosphat-Puffer-Lösung pH 7,4 wird mit 1 ml Freuds-Adjuvans emulgiert und intradennal an mehreren Stellen injiziert.
Blutproben werden in Abständen von 7 bis 10 Tagen entnommen und der Titer des Antiserums mit Hilfe der Immunodiffusion gegen Leberferritin bestimmt.
Wenn man den Titer 1:4 erreicht hat, ist eine Blutentnahme von 50 ml vorzunehmen. Die Blutentnahmen werden in 14-tägi- gem Abstand wiederholt, bis der Titer unter 1:4 fällt.
Das Blut läßt man jeweils gerinnen und nimmt das Serum ab. 3.2 Präparation des spezifischen IgG
Man löst 6,18 g H3BO3 und 29,22 g NaCl in 900 ml dest. Wasser, titriert mit NaOH auf pH 8,6 und füllt dann mit dest. Wasser auf 1 Liter auf.
Man löst 36 g Na3HPO4 und 3,12 g NaH3PO4^H2O in 1 1 dest. Wasser, prüft das pH 7,4, gleicht an, wenn notwendig.
Eine Lösung von 5 mg Plazentaferritin wird in einen Dialyseschlauch gegeben und 2 χ gegen 250 ml Borat/NaCl-Puffer (pH 8,6) über Nacht dialysiert, bei 4° C. Die CNBr-aktivierte Sepharose(R) (Pharmacia) wird 20 Minuten mit 250 ml 0,001 N HCl unter leichtem Rühren in einer Glasfilternutsche gewaschen. Nachdem die Sepharose trocken ist, wird sie in eine 25 ml-Plastikflasche mit Schraubverschluß gegeben. Man entnimmt die Ferritinlösung dem Dialysierschlauch, verdünnt sie mit Borat/NaCl-Puffer auf ml und gibt sie in die mit aktivierter Sepharose gefüllte
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Flasche. Der Flascheninhalt wird durch Oberkopfrotation bei Raumtemperatur während 2 Stunden vorsichtig gemischt. Man zentrifugiert danach mit 7OOO UpM für 2 Minuten, um die Sepharose abzutrennen. Der Überstand wird abgegossen und dann das Sepharose/ Ferritin-Immunoadsorbens mit 2 χ 10 ml Borat/NaCl-Puffer- 2 χ 10 ml 0,005 N HCl und 2 χ 10 ml Borat/NaCl-Rinderserumalbumin-Puffer gewaschen.
Die folgenden Operationen werden alle bei Zimmertemperatur ausgeführt. Das Immunoadsorbens wird in eine Säule gepackt und die Höhe des Flüssigkeitsreservoirs so gewählt, daß eine Durchflußrate von 1 ml pro 2,5 Minuten erhalten wird. Die Säule wird mit Borat/NaCl-Puffer gespült. Die auf der Säule stehende Flüssigkeit wird abgenommen und 5 ml Antiplazentaferritin Antiserum auf die Säule gegeben. 20 Reagenzgläser mit je 1. ml Phosphat-Puffer, 0,1 M pH 7,4, werden in dem Fraktionssammler vorgelegt, das Reservoir mit 0,005 N HCl gefüllt und dieses mit der Säule verbunden. Die ausfließenden Fraktionen des spezifischen IgG werden zusammengegossen und bei 4° C aufbewahrt.
4. Jodierung
Methode
Das spezifische Anti-Plazentaferritin IgG ist mit Chloramin-T nach Greenwood und Hunter (Biochem. J £9 114 (1963)) jodmarkiert worden.
Produktspezifikation: spezifische Aktivität 11 mCi/mg
Jodierungsgrad 1 Atom J/Molekül
Reinigung; G-200 Sephadex Säule 0,05 M Phosphatpuffer pH 7,4 und 0,2 % Rinderserumalbumin
5. Standards
Es wird eine Lösung von 320 ng Leberferritin/ml in Pferdeserum hergestellt. Diese Vorratslösung ist der höchste Standard, aus dem durch Serienverdünnung die folgenden Standards 160, 80, 40, 20, 10, 5 ng Ferritin/ml hergestellt werden. Der
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Null-Standard besteht aus reinem Pferdeserum.
6. Durchführung der Ferritinbestimmung
Man kennzeichnet eine ausreichende Menqe von Polystyrolröhrchen, um acht Standarts, ein Testserum und eine bestimmte Anzahl von Patientenseren bestimmen zu können, jeweils zweifach. Zusätzlich sind zwei Reagenzröhrchen zur Messung der Gesamtaktivität zu numeriern.
In jedes Reagenzröhrchen wird eine Nylonkugel plaziert.
In jedes Reagenzröhrchen werden dann 200 μΐ Pufferlösung pipettiert.
Dann werden jeweils 100 μΐ der Ständardlösung, 100 μΐ des Testserum und jeweils 100 μΐ der Patientenserumproben in die dafür vorbereiteten Reagenzröhrchen pipettiert.
Man rührt kurz auf Whirlmix und inkubiert 5 Stunden bei 37° C.
Die Lösungen werden anschließend abgesaugt und die Kugeln mit 2 ml destilliertem Wasser gewaschen.
300 μΐ der jodierten AntiHPlazentaferritin-Lösung werden auf die Nylonkugeln pipettiert, kurz auf dem Whirlmix gerührt und die Röhrchen über Nacht bei 37° C inkubiert.
Die Lösung wird abgesaugt, die Kugeln mit 2 ml destilliertem Wasser gewaschen und die Radioaktivität anschließend im Gammazähler gemessen.
Für die Auswertung werden die gemessenen Impulse der acht Standards als Prozent der Gesamtaktivität berechnet. Die Prozent-Aktivität wird als Ordinate gegen die Ferritinkonzentration (ng/ml) (Abszisse) eingetragen und durch eine Kurve verbunden. Die Werte des Testserums und der Patientensera werden auf dieser Kurve interpoliert.
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Claims (2)

  1. HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT
    Aktenzeichen: . HOE 77/F 217
    Datum: 28. Okt. 1977 Dr. KM/ss
    Verfahren zur Bestimmung von Ferritin
    Patentansprüche:
    Verfahren für die Bestimmung von Ferritin in Serum oder Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Antikörper gerichtet gegen ein organspezifischas Tsoferritin kovalent an Nylon gebunden einerseits mit Ferritinstandard-Lösunqen, die ein Isoferrifcin enthalten, das identisch mit oder verschieden ist von dem zur Produktion des Antikörpers genutzten Isoferritin , und andererseits unter sonst gleichen Bedingungen mit Serumproben inkubiert, dann die Inkubationslösungen dekantiert oder absaugt, den gebildeter; Nylon-Antikörper-Ferritin-Komplex wäscht und anschließend mit einem jodmarkierten Antikörper gerichtet gegen ein zweites (vom ersten verschiedenen) organspezifisches Isoferritin inkubiert, die losuiKj dekantiert oder absaugt, den gebildeten Nylon-Antikörper-Ferritin-Antikörper-125-Jod-Komplex wäscht, seine Radioaktivität im GamraazShler mißt und die Standardproben mit den Serumproben vergleicht.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper erzeugt werden gegen und Standards bestehen aus Leber-, Milz- und Plazentaferritin.
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    90 9818/0405 bad original
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