JPH04363659A - ビタミンｂ１２の分析 - Google Patents
ビタミンｂ１２の分析Info
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Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は血清などの体液中のビ
タミンＢ１２濃度の定量に使用できるビタミンＢ１２分
析に関する。
タミンＢ１２濃度の定量に使用できるビタミンＢ１２分
析に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】シアノ
コバラミン（ビタミンＢ１２）は人間の食物中の必須ビ
タミンである。それは脂質代謝における酵素メチルマロ
ニル−補酵素Ａムターゼによるアセチル補酵素Ａのメチ
ルマロニル−補酵素Ａへの転換及びＤＮＡの合成に必要
なリボヌクレオチド還元酵素によるリボヌクレオチドの
デオキシリボヌクレオチドへの還元を含む数種の中間代
謝反応において補酵素として関与している。
コバラミン（ビタミンＢ１２）は人間の食物中の必須ビ
タミンである。それは脂質代謝における酵素メチルマロ
ニル−補酵素Ａムターゼによるアセチル補酵素Ａのメチ
ルマロニル−補酵素Ａへの転換及びＤＮＡの合成に必要
なリボヌクレオチド還元酵素によるリボヌクレオチドの
デオキシリボヌクレオチドへの還元を含む数種の中間代
謝反応において補酵素として関与している。
【０００３】患者の血清中のビタミンＢ１２の低レベル
は悪性貧血病の指標となる。この重大な巨大赤芽球貧血
の発生は消化系及び神経系にも悪影響を与える。神経系
の損傷は運動失調及び精神病症状を招くことがある。１
９２６年にビタミンＢ１２がビタミンとして確認される
以前はこれらの病気は不治であり、通常致命的であった
。悪性貧血は厳格な菜食主義食からの食餌ビタミンＢ１
２欠乏によって生じることがあるけれども、最も通常的
な原因は腸からのビタミン吸収不全である。これは胃内
層による内因子（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆａｃｔｅｒ）
（ＩＦ）と呼ばれるムコタンパク質合成の減少によって
生じる。悪性貧血は、そう診断されると、ビタミンＢ１
２服用によって容易に治療される。
は悪性貧血病の指標となる。この重大な巨大赤芽球貧血
の発生は消化系及び神経系にも悪影響を与える。神経系
の損傷は運動失調及び精神病症状を招くことがある。１
９２６年にビタミンＢ１２がビタミンとして確認される
以前はこれらの病気は不治であり、通常致命的であった
。悪性貧血は厳格な菜食主義食からの食餌ビタミンＢ１
２欠乏によって生じることがあるけれども、最も通常的
な原因は腸からのビタミン吸収不全である。これは胃内
層による内因子（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｆａｃｔｅｒ）
（ＩＦ）と呼ばれるムコタンパク質合成の減少によって
生じる。悪性貧血は、そう診断されると、ビタミンＢ１
２服用によって容易に治療される。
【０００４】ビタミンＢ１２はバクテリヤ、ラクトバチ
ルス・ラクチス及び原生動物、ユウグレナ・グラシリス
のようなビタミンを必要とする生物の成長応答を用いる
微生物学的分析により分析されてきた。そのような微生
物学的分析は研究や臨床研究室においてなお広く受け入
れられているけれども、その実施には困難があり、時間
がかかる。近年、試験試料に由来するビタミンＢ１２と
分析試薬としての既知量の標識付けビタミンＢ１２との
間の競争結合反応に基づく上記と別のビタミンＢ１２分
析法を改良する試みがなされてきた。試験試料ビタミン
Ｂ１２及び標識付けビタミンＢ１２は一定量のビタミン
Ｂ１２結合パートナーに対して競争する。典型的な結合
パートナーにはＩＦのような結合タンパク質やタンパク
質ＲがビタミンＢ１２に対して生じる抗体とともに含ま
れる。競争結合分析は伝統的な微生物学的分析に代って
それと同等で信頼性のある迅速な方法を提供している。
ルス・ラクチス及び原生動物、ユウグレナ・グラシリス
のようなビタミンを必要とする生物の成長応答を用いる
微生物学的分析により分析されてきた。そのような微生
物学的分析は研究や臨床研究室においてなお広く受け入
れられているけれども、その実施には困難があり、時間
がかかる。近年、試験試料に由来するビタミンＢ１２と
分析試薬としての既知量の標識付けビタミンＢ１２との
間の競争結合反応に基づく上記と別のビタミンＢ１２分
析法を改良する試みがなされてきた。試験試料ビタミン
Ｂ１２及び標識付けビタミンＢ１２は一定量のビタミン
Ｂ１２結合パートナーに対して競争する。典型的な結合
パートナーにはＩＦのような結合タンパク質やタンパク
質ＲがビタミンＢ１２に対して生じる抗体とともに含ま
れる。競争結合分析は伝統的な微生物学的分析に代って
それと同等で信頼性のある迅速な方法を提供している。
【０００５】ビタミンＢ１２競争結合分析に用いられる
特殊な結合タンパク質は重要である。特に、以前からそ
の使用が提案されていたいくつかの結合タンパク質はビ
タミンＢ１２自体とともにコバラミン類似体とも結合す
ると考えられている。例えば、トランスコバラミンＩＩ
及びＲタンパク質はビタミンＢ１２と同様にヒトの血清
中に存在するコバラミン類似体と結合することが示され
ている。 このような特異性の欠如はビタミンＢ１２分析における
誤差が多いという結果をもたらす。一般にＩＦはヒトの
血清中のビタミンＢ１２の生理学的活性形態である５′
−デオキシアデノシルコバラミンに関し高度に選択的で
あるから競争結合分析用の好ましい結合タンパク質であ
ることが受け入れられている。
特殊な結合タンパク質は重要である。特に、以前からそ
の使用が提案されていたいくつかの結合タンパク質はビ
タミンＢ１２自体とともにコバラミン類似体とも結合す
ると考えられている。例えば、トランスコバラミンＩＩ
及びＲタンパク質はビタミンＢ１２と同様にヒトの血清
中に存在するコバラミン類似体と結合することが示され
ている。 このような特異性の欠如はビタミンＢ１２分析における
誤差が多いという結果をもたらす。一般にＩＦはヒトの
血清中のビタミンＢ１２の生理学的活性形態である５′
−デオキシアデノシルコバラミンに関し高度に選択的で
あるから競争結合分析用の好ましい結合タンパク質であ
ることが受け入れられている。
【０００６】一般に競争分析に基づく分析法は容易に同
定又は定量され得る化学的部分ないし基を保持する標識
付け配位子又は配位子類似体を用いる。そのような標識
の典型例には放射性同位元素、蛍光基及び酵素が含まれ
る。ビタミンＢ１２競争結合分析において、放射性標識
付けビタミンＢ１２誘導体は最も一般的に使用される配
位子類似体であり、数種の異った同位元素が成功裡に使
用されてきた。
定又は定量され得る化学的部分ないし基を保持する標識
付け配位子又は配位子類似体を用いる。そのような標識
の典型例には放射性同位元素、蛍光基及び酵素が含まれ
る。ビタミンＢ１２競争結合分析において、放射性標識
付けビタミンＢ１２誘導体は最も一般的に使用される配
位子類似体であり、数種の異った同位元素が成功裡に使
用されてきた。
【０００７】この種分析に成功裡に使用された最初の同
位元素は５７Ｃｏであった。５７Ｃｏ−標識付けビタミ
ンＢ１２の合成は退屈で複雑な操作で、これは特にシア
ノコバラミン分子中のコバルト単一原子はそのポルフィ
リン環構造の中央に位置し、したがってビタミンＢ１２
の生合成に同位元素を導入するのに必要な化学的置換に
対し比較的反応しないからである。したがって、この操
作により製造された５７Ｃｏ−ビタミンＢ１２は比較的
高価であり、低特異活性である。低特異活性はこの標識
付けビタミンＢ１２を用いる競争結合分析において少な
くとも１分間の比較的長い計数時間を必要とする。これ
らの長い計数時間は試料の処理を遅らせ望ましくない。
位元素は５７Ｃｏであった。５７Ｃｏ−標識付けビタミ
ンＢ１２の合成は退屈で複雑な操作で、これは特にシア
ノコバラミン分子中のコバルト単一原子はそのポルフィ
リン環構造の中央に位置し、したがってビタミンＢ１２
の生合成に同位元素を導入するのに必要な化学的置換に
対し比較的反応しないからである。したがって、この操
作により製造された５７Ｃｏ−ビタミンＢ１２は比較的
高価であり、低特異活性である。低特異活性はこの標識
付けビタミンＢ１２を用いる競争結合分析において少な
くとも１分間の比較的長い計数時間を必要とする。これ
らの長い計数時間は試料の処理を遅らせ望ましくない。
【０００８】その他に １２５Ｉ−ビタミンＢ１２誘導
体の調製が試みられた。ベルステインらの米国特許第４
，２０９，６１４号によれば、そのような誘導体はビタ
ミンＢ１２の糖環を通じてそのビタミンＢ１２と結合す
る無水グルタール酸誘導体とビタミンＢ１２を反応させ
ることによって調製することができる。無水グルタール
酸誘導置換基は次いでヨウ素化される。
体の調製が試みられた。ベルステインらの米国特許第４
，２０９，６１４号によれば、そのような誘導体はビタ
ミンＢ１２の糖環を通じてそのビタミンＢ１２と結合す
る無水グルタール酸誘導体とビタミンＢ１２を反応させ
ることによって調製することができる。無水グルタール
酸誘導置換基は次いでヨウ素化される。
【０００９】もう１つの １２５Ｉ−ビタミンＢ１２誘
導体調製法がニスウェンダーらの米国特許第３，９８１
，８６３号に記載されている。天然のビタミンＢ１２は
そのポルフィリン環上に多数のアミド置換基を含有して
いる。温和な加水分解はこれらアミド基のいくつかを開
裂させ、大部分が（ｅ）−異性体を含有するモノカルボ
ン酸混合物が形成される。酸混合物は次いでｐ−（アミ
ノアルキル）フェノールと反応させカルボン酸基の１つ
との反応によってフェノール基が導入される。混合置換
基ビタミンＢ１２誘導体は次にフェノール置換基をヨウ
素化される。これら １２５Ｉ−標識付け混合誘導体は
この混合物に対して生起した抗体を用いるビタミンＢ１
２の放射性免疫分析に有用である。
導体調製法がニスウェンダーらの米国特許第３，９８１
，８６３号に記載されている。天然のビタミンＢ１２は
そのポルフィリン環上に多数のアミド置換基を含有して
いる。温和な加水分解はこれらアミド基のいくつかを開
裂させ、大部分が（ｅ）−異性体を含有するモノカルボ
ン酸混合物が形成される。酸混合物は次いでｐ−（アミ
ノアルキル）フェノールと反応させカルボン酸基の１つ
との反応によってフェノール基が導入される。混合置換
基ビタミンＢ１２誘導体は次にフェノール置換基をヨウ
素化される。これら １２５Ｉ−標識付け混合誘導体は
この混合物に対して生起した抗体を用いるビタミンＢ１
２の放射性免疫分析に有用である。
【００１０】ＩＦと強力に結合するビタミンＢ１２誘導
体の開発にもまた試みがなされてきた。ホーツの米国特
許第４，４６５，７７５号は部分加水分解されたビタミ
ンＢ１２の（ｄ）−モノカルボン酸異性体から形成され
た標識付け誘導体が（ｂ）−及び（ｅ）−異性体の誘導
体よりも非常に大きいＩＦ親和性を有していることを開
示している。したがってこれらの誘導体はビタミンＢ１
２競争結合分析における標識付け類似体として使用する
のに好ましい。
体の開発にもまた試みがなされてきた。ホーツの米国特
許第４，４６５，７７５号は部分加水分解されたビタミ
ンＢ１２の（ｄ）−モノカルボン酸異性体から形成され
た標識付け誘導体が（ｂ）−及び（ｅ）−異性体の誘導
体よりも非常に大きいＩＦ親和性を有していることを開
示している。したがってこれらの誘導体はビタミンＢ１
２競争結合分析における標識付け類似体として使用する
のに好ましい。
【００１１】これらの免疫分析における放射性化合物の
使用は多くの欠点を示している。これらの貯蔵、使用及
び廃棄には鉛遮蔽や特殊な廃棄物処理操作など極度の安
全性配慮が取られねばならない。放射性の計数には高価
な装置が必要である。同位元素 １２５Ｉの崩壊半減期
は約６０日である。この放射性崩壊は検出に使用し得る
放射能の量を低下させるばかりでなく、残余の試薬を損
なう化学反応を発生させ、さらに感度を低下させる。こ
のように １２５Ｉ−標識付け試薬の貯蔵は数カ月に制
限される。もし他の一般に使用されるヨウ素の同位元素
、 １３１Ｉを標識として用いるとこれらの問題は拡大
される。この同位元素の半減期は９日未満である。
使用は多くの欠点を示している。これらの貯蔵、使用及
び廃棄には鉛遮蔽や特殊な廃棄物処理操作など極度の安
全性配慮が取られねばならない。放射性の計数には高価
な装置が必要である。同位元素 １２５Ｉの崩壊半減期
は約６０日である。この放射性崩壊は検出に使用し得る
放射能の量を低下させるばかりでなく、残余の試薬を損
なう化学反応を発生させ、さらに感度を低下させる。こ
のように １２５Ｉ−標識付け試薬の貯蔵は数カ月に制
限される。もし他の一般に使用されるヨウ素の同位元素
、 １３１Ｉを標識として用いるとこれらの問題は拡大
される。この同位元素の半減期は９日未満である。
【００１２】これらの欠点の結果として、近年、それら
を用いない代りのビタミンＢ１２標識付けスキームの開
発努力が増大してきた。
を用いない代りのビタミンＢ１２標識付けスキームの開
発努力が増大してきた。
【００１３】ビタミンＢ１２競争結合分析において酵素
−標識付けビタミンＢ１２を利用する試みが行われてい
る。 酵素−標識付けビタミンＢ１２誘導体もまたビタミンＢ
１２のモノカルボン酸誘導体を標識付けすることによっ
て調製される。レオニダスら、バイオテクニックス
４，４２−５５（１９８６）はそのような競争結合分析
においてＩＦのような配位子選択結合タンパク質の使用
がビタミンＢ１２と結合する抗体の使用よりも優れてい
ることを示唆している。
−標識付けビタミンＢ１２を利用する試みが行われてい
る。 酵素−標識付けビタミンＢ１２誘導体もまたビタミンＢ
１２のモノカルボン酸誘導体を標識付けすることによっ
て調製される。レオニダスら、バイオテクニックス
４，４２−５５（１９８６）はそのような競争結合分析
においてＩＦのような配位子選択結合タンパク質の使用
がビタミンＢ１２と結合する抗体の使用よりも優れてい
ることを示唆している。
【００１４】レオニダスらの操作によれば、ＩＦを最初
にアガロース・ビーズのような固体支持体の上に固定化
する。固定化ＩＦは次にビタミンＢ１２を含有する試料
と接触させ、指定の時間温置する。続いて一定量の酵素
−標識付けビタミンＢ１２を反応混合物に添加し、さら
に温置を続ける。２回目の温置時間後、固相を洗浄して
結合しなかった物質を除去し、結合した酵素の量を酵素
反応に適合した物質を添加することによって定量する。 適切な物質が使用された場合、結合した酵素の量は比色
定量、典型的には分光測光法により定量することができ
る。吸光度の変化が基質上の酵素の作用結果であり、吸
光度の変化の大きさが試験試料中に存在する未標識ビタ
ミンＢ１２の濃度に反比例する。
にアガロース・ビーズのような固体支持体の上に固定化
する。固定化ＩＦは次にビタミンＢ１２を含有する試料
と接触させ、指定の時間温置する。続いて一定量の酵素
−標識付けビタミンＢ１２を反応混合物に添加し、さら
に温置を続ける。２回目の温置時間後、固相を洗浄して
結合しなかった物質を除去し、結合した酵素の量を酵素
反応に適合した物質を添加することによって定量する。 適切な物質が使用された場合、結合した酵素の量は比色
定量、典型的には分光測光法により定量することができ
る。吸光度の変化が基質上の酵素の作用結果であり、吸
光度の変化の大きさが試験試料中に存在する未標識ビタ
ミンＢ１２の濃度に反比例する。
【００１５】このタイプの順続（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ
）結合分析において、試験試料ビタミンＢ１２及び酵素
−標識付けビタミンＢ１２は固定化ＩＦ上の有効な結合
部位に対して「競争」する。順続添加するのでこの分析
はより正しくは「擬似的競争」と記すべきである。
）結合分析において、試験試料ビタミンＢ１２及び酵素
−標識付けビタミンＢ１２は固定化ＩＦ上の有効な結合
部位に対して「競争」する。順続添加するのでこの分析
はより正しくは「擬似的競争」と記すべきである。
【００１６】このレオニダスらの酵素−標識付け順続結
合法は臨床環境下で定常的に正確なデータを出すに至ら
ないことが見出された。この酵素−標識付けビタミンＢ
１２を用いて得られる用量対応カーブは他の分析物に対
して対比し得る天然の結合タンパク質を用いる他の分析
物の順続結合分析において得られるものほど急勾配では
なかった。レオニダスらは用量対応カーブが緩傾斜なの
は正常にはビタミンＢ１２の周りに三次元的な配座と想
定されるＩＦの結合能力がＩＦが固体支持体に結合され
ると固定化により部分的に損なわれたことによると理論
づけている。
合法は臨床環境下で定常的に正確なデータを出すに至ら
ないことが見出された。この酵素−標識付けビタミンＢ
１２を用いて得られる用量対応カーブは他の分析物に対
して対比し得る天然の結合タンパク質を用いる他の分析
物の順続結合分析において得られるものほど急勾配では
なかった。レオニダスらは用量対応カーブが緩傾斜なの
は正常にはビタミンＢ１２の周りに三次元的な配座と想
定されるＩＦの結合能力がＩＦが固体支持体に結合され
ると固定化により部分的に損なわれたことによると理論
づけている。
【００１７】これに続いて、酵素−標識付けＩＦと磁性
二酸化クロム粒子上に塗布されたビタミンＢ１２を用い
る分析法がワングらによって１９８７年７月のアメリカ
ン・アソシエーション・オブ・クリニカル・ケミスツ・
ミーティングで配布された刊行物に開示されている。こ
の分析において試験試料中の遊離ビタミンＢ１２は存在
する内因子に対して粒子上に塗布されたビタミンＢ１２
と競争する。その後二酸化クロム粒子は磁力の適用によ
り除去され、残存する上澄みの酵素活性が分析される。 臨床的な環境下で定常的に正確なデータを出すことがで
き、レオニダスらによって見出された問題点を排除した
ビタミンＢ１２の競争もしくは擬似的競争結合分析方法
をもたらすことは大いに有益であろう。
二酸化クロム粒子上に塗布されたビタミンＢ１２を用い
る分析法がワングらによって１９８７年７月のアメリカ
ン・アソシエーション・オブ・クリニカル・ケミスツ・
ミーティングで配布された刊行物に開示されている。こ
の分析において試験試料中の遊離ビタミンＢ１２は存在
する内因子に対して粒子上に塗布されたビタミンＢ１２
と競争する。その後二酸化クロム粒子は磁力の適用によ
り除去され、残存する上澄みの酵素活性が分析される。 臨床的な環境下で定常的に正確なデータを出すことがで
き、レオニダスらによって見出された問題点を排除した
ビタミンＢ１２の競争もしくは擬似的競争結合分析方法
をもたらすことは大いに有益であろう。
【００１８】
【課題を解決するための手段】試験試料中のビタミンＢ
１２の競争結合分析方法がこれらの要求を満足させる。 この分析方法の主要な特徴は溶液中で遊離しているビタ
ミンＢ１２結合パートナー、一般には内因子、及び固定
化ビタミンＢ１２誘導体を使用することである。従来の
分析と同様の競争反応が発生するけれども、これら試薬
の役割の逆転が特に臨床的に意義のある濃度範囲内で分
析の効率に予想外の改善の原因となる。
１２の競争結合分析方法がこれらの要求を満足させる。 この分析方法の主要な特徴は溶液中で遊離しているビタ
ミンＢ１２結合パートナー、一般には内因子、及び固定
化ビタミンＢ１２誘導体を使用することである。従来の
分析と同様の競争反応が発生するけれども、これら試薬
の役割の逆転が特に臨床的に意義のある濃度範囲内で分
析の効率に予想外の改善の原因となる。
【００１９】本発明の多数の実施形態のもう１つの重要
な特徴は実質的にすべての内因子分子が少なくとも１つ
のビオチン分子と共有結合で結合しており、かつそのビ
オチン分子が内因子のアミノ基とカップリングしている
ビオチニル化内因子製剤を使用することである。この方
法においてビオチンは「レポーター基」を担持する巨大
分子によって特異的に認知され得るハプテンなどの他の
分子で置き換えることができる。爾後も用いる「レポー
ター基」には酵素、酵素補因子、酵素阻害剤、酵素モジ
ュレーター、蛍光標識、化学発光標識及び電解的に検出
可能な標識が含まれる。
な特徴は実質的にすべての内因子分子が少なくとも１つ
のビオチン分子と共有結合で結合しており、かつそのビ
オチン分子が内因子のアミノ基とカップリングしている
ビオチニル化内因子製剤を使用することである。この方
法においてビオチンは「レポーター基」を担持する巨大
分子によって特異的に認知され得るハプテンなどの他の
分子で置き換えることができる。爾後も用いる「レポー
ター基」には酵素、酵素補因子、酵素阻害剤、酵素モジ
ュレーター、蛍光標識、化学発光標識及び電解的に検出
可能な標識が含まれる。
【００２０】最も一般的には、この分析方法の１つの形
態は次の段階を有してなる：（１）ビタミンＢ１２を含
有する試験試料を（ａ）レポーター基とひき続き結合す
ることができるビタミンＢ１２結合パートナー及び（ｂ
）試験試料中にビタミンＢ１２が存在しないと実質的に
すべての結合パートナーが固定化ビタミンＢ１２によっ
て結合されるのに十分な固定化ビタミンＢ１２と組み合
わせ、（２）次に試料中のビタミンＢ１２の量が固定化
ビタミンＢ１２と結合した結合パートナーの量と反比例
する固定化ビタミンＢ１２と結合した結合パートナーの
量を定量する。
態は次の段階を有してなる：（１）ビタミンＢ１２を含
有する試験試料を（ａ）レポーター基とひき続き結合す
ることができるビタミンＢ１２結合パートナー及び（ｂ
）試験試料中にビタミンＢ１２が存在しないと実質的に
すべての結合パートナーが固定化ビタミンＢ１２によっ
て結合されるのに十分な固定化ビタミンＢ１２と組み合
わせ、（２）次に試料中のビタミンＢ１２の量が固定化
ビタミンＢ１２と結合した結合パートナーの量と反比例
する固定化ビタミンＢ１２と結合した結合パートナーの
量を定量する。
【００２１】試験試料中に遊離のビタミンＢ１２が多け
れば多いほど遊離のビタミンＢ１２と結合する結合パー
トナーの画分が多く、固定化ビタミンＢ１２と結合する
結合パートナーの画分が少ない。固定化ビタミンＢ１２
と結合する結合パートナーの画分のみが実際に定量され
る。
れば多いほど遊離のビタミンＢ１２と結合する結合パー
トナーの画分が多く、固定化ビタミンＢ１２と結合する
結合パートナーの画分が少ない。固定化ビタミンＢ１２
と結合する結合パートナーの画分のみが実際に定量され
る。
【００２２】典型的には、固定化ビタミンＢ１２は固体
支持体に橋かけ結合している。固体支持体は活性化橋か
け結合ポリアクリルアミド、活性化セルロース又はジア
ゾ化アミン誘導体化ポリスチレンであることができる。 ビタミンＢ１２と固体支持体間の橋かけはタンパク質リ
ンカーを経るものであることができる。タンパク質リン
カーはウシの血清アルブミン又はＩｇＧであることがで
きる。結合は次の段階で形成させることができる。
支持体に橋かけ結合している。固体支持体は活性化橋か
け結合ポリアクリルアミド、活性化セルロース又はジア
ゾ化アミン誘導体化ポリスチレンであることができる。 ビタミンＢ１２と固体支持体間の橋かけはタンパク質リ
ンカーを経るものであることができる。タンパク質リン
カーはウシの血清アルブミン又はＩｇＧであることがで
きる。結合は次の段階で形成させることができる。
【００２３】（１）ビタミンＢ１２−モノカルボン酸の
カルボキシル基をカルボニルジイミダゾールよって活性
化し、（２）活性化ビタミンＢ１２−モノカルボン酸を
Ｎ−ヒドロキシスクシミドと反応させてモノカルボン酸
のＮ−ヒドロキシスシンイミジルエステルを得て、（３
）モノカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステルをタンパク質のアミノ基と反応させて、それによ
りビタミンＢ１２をアミド結合の形成によってタンパク
質とカップリングさせる。典型的には、ビタミンＢ１２
−モノカルボン酸は（ｅ）−異性体である。ビタミンＢ
１２−モノカルボン酸はまたその結合パートナーとの親
和性を改善するためその第一級アルコール上でスクシニ
ル化されたものであることができる。
カルボキシル基をカルボニルジイミダゾールよって活性
化し、（２）活性化ビタミンＢ１２−モノカルボン酸を
Ｎ−ヒドロキシスクシミドと反応させてモノカルボン酸
のＮ−ヒドロキシスシンイミジルエステルを得て、（３
）モノカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステルをタンパク質のアミノ基と反応させて、それによ
りビタミンＢ１２をアミド結合の形成によってタンパク
質とカップリングさせる。典型的には、ビタミンＢ１２
−モノカルボン酸は（ｅ）−異性体である。ビタミンＢ
１２−モノカルボン酸はまたその結合パートナーとの親
和性を改善するためその第一級アルコール上でスクシニ
ル化されたものであることができる。
【００２４】レポーター基は酵素、酵素補因子、酵素阻
害剤、酵素モジュレーター又は蛍光性、化学発光性又は
電解的に検出可能な標識であることができる。レポータ
ー基が酵素である場合、その酵素は西洋わさびペルオキ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はβ−ガラクト
シダーゼであることができる。
害剤、酵素モジュレーター又は蛍光性、化学発光性又は
電解的に検出可能な標識であることができる。レポータ
ー基が酵素である場合、その酵素は西洋わさびペルオキ
シダーゼ、アルカリフォスファターゼ又はβ−ガラクト
シダーゼであることができる。
【００２５】結合パートナーがビオチニル化内因子であ
る場合、固定化ビタミンＢ１２と結合したビオチニル化
内因子の量を測定する段階は下記のことを有してなるこ
とができる。（ａ）結合したビオチニル化内因子をレポ
ーター基で標識付けしたアビジンと反応させ、（ｂ）次
いで、内因子と結合したレポーター基を分析することに
よって内因子と結合したアビジンの量を定量する。この
分析はレポーター基が酵素である場合、結合した酵素活
性度の分析である。アジビンはその非特異結合性を減少
させるためスクシニル化されたものであることができる
。
る場合、固定化ビタミンＢ１２と結合したビオチニル化
内因子の量を測定する段階は下記のことを有してなるこ
とができる。（ａ）結合したビオチニル化内因子をレポ
ーター基で標識付けしたアビジンと反応させ、（ｂ）次
いで、内因子と結合したレポーター基を分析することに
よって内因子と結合したアビジンの量を定量する。この
分析はレポーター基が酵素である場合、結合した酵素活
性度の分析である。アジビンはその非特異結合性を減少
させるためスクシニル化されたものであることができる
。
【００２６】内因子がビオチンの代りにハプテンと複合
している場合、抗−ハプテン抗体は上記の方法において
アビジンと置き換えられる。
している場合、抗−ハプテン抗体は上記の方法において
アビジンと置き換えられる。
【００２７】未複合内因子を代りに使用することができ
、次いでアビジン又は抗−ハプテン抗体はレセプター基
と結合した抗−内因子抗体と置き換えられる。
、次いでアビジン又は抗−ハプテン抗体はレセプター基
と結合した抗−内因子抗体と置き換えられる。
【００２８】レポーター基とひき続き結合することがで
きるビタミンＢ１２結合パートナーは抗体であることが
できる。抗体はビオチニル化されたものであることがで
き、レポーター基と共有結合で結合したアビジンを使用
することができる。代りに、第１抗体に対し特異的でレ
ポーター基と共有結合で結合した第２抗体を使用するこ
とができる。
きるビタミンＢ１２結合パートナーは抗体であることが
できる。抗体はビオチニル化されたものであることがで
き、レポーター基と共有結合で結合したアビジンを使用
することができる。代りに、第１抗体に対し特異的でレ
ポーター基と共有結合で結合した第２抗体を使用するこ
とができる。
【００２９】ビタミンＢ１２の結合パートナーはそれ自
体がレポーター基と共有結合で結合したものであること
ができる。その場合、分析方法は下記の段階を有してな
ることができる。（１）ビタミンＢ１２を含有する試験
試料を（ａ）レポーター基と共有結合で結合したビタミ
ンＢ１２結合パートナー及び（ｂ）試験試料中にビタミ
ンＢ１２が存在しないと実質的にすべての結合パートナ
ーが固定化ビタミンＢ１２によって結合されるのに十分
な量の固定化ビタミンＢ１２と組み合わせ、（２）次い
で固定化ビタミンＢ１２に結合したレポーター基を分析
することによって固定化ビタミンＢ１２に結合した結合
パートナーの量を定量する。この方法の形態において、
結合パートナーは内因子又は抗−ビタミンＢ１２抗体で
あることができる。
体がレポーター基と共有結合で結合したものであること
ができる。その場合、分析方法は下記の段階を有してな
ることができる。（１）ビタミンＢ１２を含有する試験
試料を（ａ）レポーター基と共有結合で結合したビタミ
ンＢ１２結合パートナー及び（ｂ）試験試料中にビタミ
ンＢ１２が存在しないと実質的にすべての結合パートナ
ーが固定化ビタミンＢ１２によって結合されるのに十分
な量の固定化ビタミンＢ１２と組み合わせ、（２）次い
で固定化ビタミンＢ１２に結合したレポーター基を分析
することによって固定化ビタミンＢ１２に結合した結合
パートナーの量を定量する。この方法の形態において、
結合パートナーは内因子又は抗−ビタミンＢ１２抗体で
あることができる。
【００３０】特に、試験の１つの重要な形態は下記の段
階を有してなる。（１）試験試料を（ａ）実質的にすべ
ての内因子分子が少なくとも１つのビオチン分子と共有
結合で結合し、そのビオチン分子は内因子のアミノ基と
カップリングしているようなビオチニル化内因子及び（
ｂ）試験試料中にビタミンＢ１２が存在しないと実質的
にすべてのビオチニル化内因子が固定化ビタミンＢ１２
によって結合されるのに十分な固定化ビタミンＢ１２、
ＩｇＧのリンカーによってジアゾ化−アミン誘導体化ビ
ーズポリスチレンビースの固体支持体と共有結合で結合
している固定化ビタミンＢ１２と組み合わせ、（２）固
体支持体及びその固体支持体と結合したすべての内因子
を未結合内因子から分離し、（３）固体支持体をスクシ
ニル化アビジンと共有結合で結合した西洋わさびペルオ
キシダーゼとともに固体支持体に結合したすべての内因
子が西洋わさびペオキシダーゼと結合するように温置し
、（４）次いで存在する西洋わさびペルオキシターゼの
酵素活性が試験試料中に最初に存在した遊離のビタミン
Ｂ１２の量に反比例する固体支持体と結合した西洋わさ
びペルオキシダーゼを分析する。
階を有してなる。（１）試験試料を（ａ）実質的にすべ
ての内因子分子が少なくとも１つのビオチン分子と共有
結合で結合し、そのビオチン分子は内因子のアミノ基と
カップリングしているようなビオチニル化内因子及び（
ｂ）試験試料中にビタミンＢ１２が存在しないと実質的
にすべてのビオチニル化内因子が固定化ビタミンＢ１２
によって結合されるのに十分な固定化ビタミンＢ１２、
ＩｇＧのリンカーによってジアゾ化−アミン誘導体化ビ
ーズポリスチレンビースの固体支持体と共有結合で結合
している固定化ビタミンＢ１２と組み合わせ、（２）固
体支持体及びその固体支持体と結合したすべての内因子
を未結合内因子から分離し、（３）固体支持体をスクシ
ニル化アビジンと共有結合で結合した西洋わさびペルオ
キシダーゼとともに固体支持体に結合したすべての内因
子が西洋わさびペオキシダーゼと結合するように温置し
、（４）次いで存在する西洋わさびペルオキシターゼの
酵素活性が試験試料中に最初に存在した遊離のビタミン
Ｂ１２の量に反比例する固体支持体と結合した西洋わさ
びペルオキシダーゼを分析する。
【００３１】試料が血清である場合、内因子様活性を有
する内因性血清タンパク質を不活性化するためある予備
段階が必要になる。血清に特に有用な分析形態は下記の
段階を有してなる。（１）血清をビタミンＢ１２を安定
化するＫＣＮの存在下でＮａＯＨとジチオトレイトール
で処理して血清中に存在する内因性ビタミンＢ１２結合
活性を不活性化し、（２）処理血清を中和し、（３）中
和した処理血清にビオチニル化内因子を添加し、その結
果の溶液を温置してビタミンＢ１２を内因子と結合させ
、（４）次にビタミンＢ１２が共有結合でカップリング
した固体支持体を添加し、その支持体を溶液中に温置し
て溶液中に残存する未結合ビオチニル化内因子をすべて
結合させ、（５）固体支持体を洗浄してすべての未結合
物を除去し、（６）西洋わさびペルオキシダーゼと複合
したスクシニル化アビジンを固体支持体に添加し、再度
温置し、（７）固体支持体から過剰のアビジン−ペルオ
キシダーゼ複合体を洗浄し、（８）固体支持体にペルオ
キシダーゼ基質ｏ−フェニーレンジアミンを添加し、そ
れにより着色生成物を生成させ、生成した着色生成物の
量は血清試料中に最初から存在した遊離のビタミンＢ１
２の量と反比例するものであり、（９）生成した着色生
成物の吸光度を測定する。
する内因性血清タンパク質を不活性化するためある予備
段階が必要になる。血清に特に有用な分析形態は下記の
段階を有してなる。（１）血清をビタミンＢ１２を安定
化するＫＣＮの存在下でＮａＯＨとジチオトレイトール
で処理して血清中に存在する内因性ビタミンＢ１２結合
活性を不活性化し、（２）処理血清を中和し、（３）中
和した処理血清にビオチニル化内因子を添加し、その結
果の溶液を温置してビタミンＢ１２を内因子と結合させ
、（４）次にビタミンＢ１２が共有結合でカップリング
した固体支持体を添加し、その支持体を溶液中に温置し
て溶液中に残存する未結合ビオチニル化内因子をすべて
結合させ、（５）固体支持体を洗浄してすべての未結合
物を除去し、（６）西洋わさびペルオキシダーゼと複合
したスクシニル化アビジンを固体支持体に添加し、再度
温置し、（７）固体支持体から過剰のアビジン−ペルオ
キシダーゼ複合体を洗浄し、（８）固体支持体にペルオ
キシダーゼ基質ｏ−フェニーレンジアミンを添加し、そ
れにより着色生成物を生成させ、生成した着色生成物の
量は血清試料中に最初から存在した遊離のビタミンＢ１
２の量と反比例するものであり、（９）生成した着色生
成物の吸光度を測定する。
【００３２】本発明はもう１つの局面において本発明の
分析に好適な変性内因子からなる組成物である。最も一
般的には、そのような組成物は実質的に内因子のすべて
の分子が少なくとも１つの配位子と共有結合で結合する
ように内因子のアミノ基を通じて配位子と共有結合でカ
ップリングした変性内因子を有してなる。その組成物は
、例えば、ビオチニル化内因子又はハプテンと共有結合
でカップリングした内因子を有してなることができる。 配位子分子はカルボキシル基を含有し、次いでアミド結
合を通じて内因子分子とカツブリングしたものであるこ
とができる。アミド結合は配位子のカルボキシル基とＮ
−ヒドロキシスクシニミドとの反応によって生成するこ
とができ、それによりＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
エステルの形成及びそれに続くＮ−ヒドロキシスクシン
イミジルエステルの内因子アミノ基との反応によって生
成させることができる。
分析に好適な変性内因子からなる組成物である。最も一
般的には、そのような組成物は実質的に内因子のすべて
の分子が少なくとも１つの配位子と共有結合で結合する
ように内因子のアミノ基を通じて配位子と共有結合でカ
ップリングした変性内因子を有してなる。その組成物は
、例えば、ビオチニル化内因子又はハプテンと共有結合
でカップリングした内因子を有してなることができる。 配位子分子はカルボキシル基を含有し、次いでアミド結
合を通じて内因子分子とカツブリングしたものであるこ
とができる。アミド結合は配位子のカルボキシル基とＮ
−ヒドロキシスクシニミドとの反応によって生成するこ
とができ、それによりＮ−ヒドロキシスクシンイミジル
エステルの形成及びそれに続くＮ−ヒドロキシスクシン
イミジルエステルの内因子アミノ基との反応によって生
成させることができる。
【００３３】さらに本発明はもう１つの局面において内
因子のビオチニル化プロセスであり、それとともにその
プロセスによって生成されるビオチニル化内因子を有し
てなる組成物である。このプロセスは次の段階を有して
なる。（１）内因子をビオチニルアミドカプロン酸のＮ
−ヒドロキシスクシミジルエステルとｐＨ約７．４で、
ビオチン部分と内因子分子との比率約６．３：１から約
１３７５：１において反応させ、（２）次いで残存する
ビオチニルアミドカプロン酸のＮ−ヒドロキシスクシミ
ジルエステルの活性を過剰のエチレンジアミンと反応さ
せることによって除去する。
因子のビオチニル化プロセスであり、それとともにその
プロセスによって生成されるビオチニル化内因子を有し
てなる組成物である。このプロセスは次の段階を有して
なる。（１）内因子をビオチニルアミドカプロン酸のＮ
−ヒドロキシスクシミジルエステルとｐＨ約７．４で、
ビオチン部分と内因子分子との比率約６．３：１から約
１３７５：１において反応させ、（２）次いで残存する
ビオチニルアミドカプロン酸のＮ−ヒドロキシスクシミ
ジルエステルの活性を過剰のエチレンジアミンと反応さ
せることによって除去する。
【００３４】ビタミンＢ１２を結合パートナーと反応さ
せるビタミンＢ１２競争分析において上述の変性内因子
製品のどれかを結合パートナーとして使用することで改
良が得られる。
せるビタミンＢ１２競争分析において上述の変性内因子
製品のどれかを結合パートナーとして使用することで改
良が得られる。
【００３５】新規なビタミンＢ１２用競争結合分析方法
が本発明によって提供される。爾後、用語「競争結合分
析」には競争する種が同時に存在する真の競争結合分析
及び競争する種が順続して存在する擬似的競争結合分析
の両方を含んでいることにする。
が本発明によって提供される。爾後、用語「競争結合分
析」には競争する種が同時に存在する真の競争結合分析
及び競争する種が順続して存在する擬似的競争結合分析
の両方を含んでいることにする。
【００３６】本発明の分析の臨界的な要素は実質的にす
べてのＩＦ分子がビオチニル化されてもビタミンＢ１２
との結合能力に重大な低下をもたらすことなくビオチニ
ル化されるような方法で調製されたビオチニル化ＩＦを
使用することである。このビオチニル化ＩＦはまた酵素
又はその他のレポーター基、例えば、酵素補因子、酵素
モジュレーター、酵素阻害剤、発蛍光団、化学発光団、
又は電解的に検知できる種を分析に導入する手段として
使用される。レポーター基は固体支持体に結合したＩＦ
の量を後に定量するのに用いられる。酵素又は他のレポ
ーター基は酵素又はレポーター基で標識付けされたアビ
ジンとして導入され、ビオチニル化ＩＦのビオチン部分
と緊密かつ特異的に結合する。
べてのＩＦ分子がビオチニル化されてもビタミンＢ１２
との結合能力に重大な低下をもたらすことなくビオチニ
ル化されるような方法で調製されたビオチニル化ＩＦを
使用することである。このビオチニル化ＩＦはまた酵素
又はその他のレポーター基、例えば、酵素補因子、酵素
モジュレーター、酵素阻害剤、発蛍光団、化学発光団、
又は電解的に検知できる種を分析に導入する手段として
使用される。レポーター基は固体支持体に結合したＩＦ
の量を後に定量するのに用いられる。酵素又は他のレポ
ーター基は酵素又はレポーター基で標識付けされたアビ
ジンとして導入され、ビオチニル化ＩＦのビオチン部分
と緊密かつ特異的に結合する。
【００３７】ビオチニル化ＩＦの使用はまたビタミンＢ
１２が標識の代りに固体支持体とカッブリングできるよ
うにする。この競争ビタミンＢ１２試薬とＩＦ試薬の役
割逆転は予想外に分析の効率を特に臨床的に有意義な濃
度範囲において改良することが発見された。この予想外
の改良は不溶化ビタミンＢ１２が試験試料中のビタミン
Ｂ１２と同じ結合パートナー、典型的にはビオチニル化
ＩＦ、と競争する同じ競争反応が生じた場合でも発生す
る。
１２が標識の代りに固体支持体とカッブリングできるよ
うにする。この競争ビタミンＢ１２試薬とＩＦ試薬の役
割逆転は予想外に分析の効率を特に臨床的に有意義な濃
度範囲において改良することが発見された。この予想外
の改良は不溶化ビタミンＢ１２が試験試料中のビタミン
Ｂ１２と同じ結合パートナー、典型的にはビオチニル化
ＩＦ、と競争する同じ競争反応が生じた場合でも発生す
る。
【００３８】分析の実施においては、ビタミンＢ１２を
含有する試験試料中へ典型的には過剰の固定化ビタミン
Ｂ１２を一定量のビオチニル化ＩＦとともに添加する。 不溶化ビタミンＢ１２試薬は試験試料ビタミンＢ１２と
限定された数の反応可能なＩＦ結合部位と競争する。ビ
オチニル化ＩＦと固定化ビタミンＢ１２及び試験試料ビ
タミンＢ１２を予め決められた時間温置し、続いて酵素
−標識付けアビジンを添加する。次に固体相を溶液から
分離し、固体相に随伴した酵素活性を測定して固定化ビ
タミンＢ１２を通じて固体相に結合した標識付けＩＦ試
薬の量を定量する。結合酵素活性の量は試料中のビタミ
ンＢ１２含有量と反比例する。
含有する試験試料中へ典型的には過剰の固定化ビタミン
Ｂ１２を一定量のビオチニル化ＩＦとともに添加する。 不溶化ビタミンＢ１２試薬は試験試料ビタミンＢ１２と
限定された数の反応可能なＩＦ結合部位と競争する。ビ
オチニル化ＩＦと固定化ビタミンＢ１２及び試験試料ビ
タミンＢ１２を予め決められた時間温置し、続いて酵素
−標識付けアビジンを添加する。次に固体相を溶液から
分離し、固体相に随伴した酵素活性を測定して固定化ビ
タミンＢ１２を通じて固体相に結合した標識付けＩＦ試
薬の量を定量する。結合酵素活性の量は試料中のビタミ
ンＢ１２含有量と反比例する。
【００３９】１．内因子のビオチニル化この分析におい
てビタミンＢ１２の結合パートナーとして用いられるビ
オチニル化ＩＦには２つの主要な必要条件がある。第１
の必要条件はＩＦのビタミンＢ１２に対する結合能力を
ビオチニル化後も保持することである。第２の必要条件
は実質的に全てのＩＦをビオチニル化することである。 もしこれらの必要条件のうちの１つが満たされないと、
得られたビオチニル化ＩＦ製剤は競争結合分析における
ビタミンＢ１２の結合パートナーとしての使用に不適で
ある。多くの天然由来の結合タンパク質は結合表面全般
に分布したアミノ官能基を有している。それらのアミノ
基のいくつかは一般に臨界結合部位又はその近くに見出
すことができる。ビオチニル化試薬は通常アミノ基と反
応可能な種の形となっている。ビオチンがそれらアミノ
基と結合部位又はその近くで反応すると、その結合タン
パク質は変性されたものとなりその結合能力を失う。本
発明において、予想外に、ＩＦは徹底的ビオチニル化後
でさえもその結合活性を失っていなかった。これはＩＦ
はそのビタミンＢ１２との結合部位又はその近くにアミ
ノ基を有していないことを示唆している。
てビタミンＢ１２の結合パートナーとして用いられるビ
オチニル化ＩＦには２つの主要な必要条件がある。第１
の必要条件はＩＦのビタミンＢ１２に対する結合能力を
ビオチニル化後も保持することである。第２の必要条件
は実質的に全てのＩＦをビオチニル化することである。 もしこれらの必要条件のうちの１つが満たされないと、
得られたビオチニル化ＩＦ製剤は競争結合分析における
ビタミンＢ１２の結合パートナーとしての使用に不適で
ある。多くの天然由来の結合タンパク質は結合表面全般
に分布したアミノ官能基を有している。それらのアミノ
基のいくつかは一般に臨界結合部位又はその近くに見出
すことができる。ビオチニル化試薬は通常アミノ基と反
応可能な種の形となっている。ビオチンがそれらアミノ
基と結合部位又はその近くで反応すると、その結合タン
パク質は変性されたものとなりその結合能力を失う。本
発明において、予想外に、ＩＦは徹底的ビオチニル化後
でさえもその結合活性を失っていなかった。これはＩＦ
はそのビタミンＢ１２との結合部位又はその近くにアミ
ノ基を有していないことを示唆している。
【００４０】ＩＦの不完全なビオチニル化は未ビオチニ
ル化ＩＦと結合したビタミンＢ１２分子が検出されない
から不十分な抑制曲線を作る結果となることがある。未
ビオチニル化ＩＦはビタミンＢ１２との結合の有無に関
係なく酵素担持アビジンに結合する。一方、ビオチニル
化ＩＦはもしビタミンＢ１２と結合しなければ、時には
酵素−標識付けアビジンを引き寄せ固体相のビタミンＢ
１２部分と結合することができる。従来のビオチニル化
ＩＦ製剤の分析結果はそのビオチニル化製剤中のＩＦ分
子の３５−４０％に及ぶ多くが何等ビオチンを結合して
いないことが示された。
ル化ＩＦと結合したビタミンＢ１２分子が検出されない
から不十分な抑制曲線を作る結果となることがある。未
ビオチニル化ＩＦはビタミンＢ１２との結合の有無に関
係なく酵素担持アビジンに結合する。一方、ビオチニル
化ＩＦはもしビタミンＢ１２と結合しなければ、時には
酵素−標識付けアビジンを引き寄せ固体相のビタミンＢ
１２部分と結合することができる。従来のビオチニル化
ＩＦ製剤の分析結果はそのビオチニル化製剤中のＩＦ分
子の３５−４０％に及ぶ多くが何等ビオチンを結合して
いないことが示された。
【００４１】これらの必要条件に鑑み、優れたビオチニ
ル化ＩＦ製剤が得られるビオチニル化ＩＦ合成方法が開
発された。この製剤は１００％ビオチニル化されており
、そのビタミンＢ１２との結合能力は何等減少していな
いことが示された。
ル化ＩＦ製剤が得られるビオチニル化ＩＦ合成方法が開
発された。この製剤は１００％ビオチニル化されており
、そのビタミンＢ１２との結合能力は何等減少していな
いことが示された。
【００４２】このビオチニル化ＩＦはＩＦをビオチニル
アミドカプロン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステルと反応させることによって調製された。このエス
テルは上記ビオチン誘導体のカルボキシル基を活性化し
、その結果、ビオチン部分のリシンのε−アミノ基又は
ＩＦタンパク質のアミノ末端基のいずれかとの結合を生
じさせる。ＩＦのアミノ基は活性部位又はそれに隣接し
て位置しておらず、それ故、ＩＦの三次元構造ないし活
性のどちらも変えることなく極度に誘導体化され得ると
考えられている。出発反応混合物中におけるビオチン部
分のＩＦ分子に対する比率は６．３から１３７５の範囲
に及ぶことができ、たとえビオチン部分のＩＦ分子に対
する比率がその最低であってもＩＦ分子の全てがビオチ
ニル化された。結合反応の詳細は下記の参考例１で述べ
る。
アミドカプロン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステルと反応させることによって調製された。このエス
テルは上記ビオチン誘導体のカルボキシル基を活性化し
、その結果、ビオチン部分のリシンのε−アミノ基又は
ＩＦタンパク質のアミノ末端基のいずれかとの結合を生
じさせる。ＩＦのアミノ基は活性部位又はそれに隣接し
て位置しておらず、それ故、ＩＦの三次元構造ないし活
性のどちらも変えることなく極度に誘導体化され得ると
考えられている。出発反応混合物中におけるビオチン部
分のＩＦ分子に対する比率は６．３から１３７５の範囲
に及ぶことができ、たとえビオチン部分のＩＦ分子に対
する比率がその最低であってもＩＦ分子の全てがビオチ
ニル化された。結合反応の詳細は下記の参考例１で述べ
る。
【００４３】これらの結果から配位子又は遊離のカルボ
キシル基を持つカルボン酸誘導体に転換し得るかのどち
らの化学種はＮＨＳエステルに転換することができ、Ｉ
Ｆを変性させることなくＩＦと徹底的に反応させること
ができるとの結論が導かれる。これらの種には、ハプテ
ン（例えば、２，４−ジニトロフェノール）、薬剤、レ
ポーター基（例えば、酵素、酵素補因子、酵素阻害剤、
酵素モジュレーター、蛍光性標識、化学発光性標識及び
溶液中のｐＨ又は電位の変化によって検知できる電解的
に活性な標識）が含まれる。
キシル基を持つカルボン酸誘導体に転換し得るかのどち
らの化学種はＮＨＳエステルに転換することができ、Ｉ
Ｆを変性させることなくＩＦと徹底的に反応させること
ができるとの結論が導かれる。これらの種には、ハプテ
ン（例えば、２，４−ジニトロフェノール）、薬剤、レ
ポーター基（例えば、酵素、酵素補因子、酵素阻害剤、
酵素モジュレーター、蛍光性標識、化学発光性標識及び
溶液中のｐＨ又は電位の変化によって検知できる電解的
に活性な標識）が含まれる。
【００４４】さらにこの方法はカルボキシル基を含有す
るか又はＮＨＳを通じて結合する配位子のどちらかのみ
に限定されるものではない。ＩＦのアミノ基は多くの技
術による誘導体化に適した部位を提供する。例えば、チ
オール含有配位子はｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル及び４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルなどの橋かけ剤の使用
によってアミノ基とカップリングさせることができる。 カルボキシル基はカルボジイミドを通じ、又は配位子の
カルボキシル基の酸無水物への転換を通じてＩＦのアミ
ノ基とカップリングさせることができる。
るか又はＮＨＳを通じて結合する配位子のどちらかのみ
に限定されるものではない。ＩＦのアミノ基は多くの技
術による誘導体化に適した部位を提供する。例えば、チ
オール含有配位子はｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル及び４−（Ｎ−マレイ
ミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−ヒ
ドロキシスクシンイミドエステルなどの橋かけ剤の使用
によってアミノ基とカップリングさせることができる。 カルボキシル基はカルボジイミドを通じ、又は配位子の
カルボキシル基の酸無水物への転換を通じてＩＦのアミ
ノ基とカップリングさせることができる。
【００４５】２．ビタミンＢ１２の固体支持体との結合
この分析において、ビタミンＢ１２は固体支持体とカッ
プリングされる。種々の固体支持体及び結合反応を使用
できる。固体支持体として橋かけアクリルアミド、アガ
ロース、セルロース及びナイロンが成功裡に使用された
。
この分析において、ビタミンＢ１２は固体支持体とカッ
プリングされる。種々の固体支持体及び結合反応を使用
できる。固体支持体として橋かけアクリルアミド、アガ
ロース、セルロース及びナイロンが成功裡に使用された
。
【００４６】上述したように、ビタミンＢ１２誘導体は
未変性ビタミンＢ１２よりもＩＦに対する結合特性が弱
い。 ビタミンＢ１２誘導体が嵩高のタンパク質に結合した場
合にも結合は弱くなる。それ自体比較的嵩高のタンパク
質であるＩＦはタンパク質−結合ビタミンＢ１２部分を
結合するのにに困難である。ＩＦのビタミンＢ１２との
安定した結合を改良する一つの方法は固体相上に固定化
された複数のビタミンＢ１２分子を使用することである
。
未変性ビタミンＢ１２よりもＩＦに対する結合特性が弱
い。 ビタミンＢ１２誘導体が嵩高のタンパク質に結合した場
合にも結合は弱くなる。それ自体比較的嵩高のタンパク
質であるＩＦはタンパク質−結合ビタミンＢ１２部分を
結合するのにに困難である。ＩＦのビタミンＢ１２との
安定した結合を改良する一つの方法は固体相上に固定化
された複数のビタミンＢ１２分子を使用することである
。
【００４７】ビタミンＢ１２分子を固定化するには数種
の方法がある。固体表面官能基は適切に化学的に誘導体
化することができ、ビタミンＢ１２−モノカルボン酸と
反応させることができる。代りに、ビタミンＢ１２−モ
ノカルボン酸を適切なタンパク質様担体分子に付着させ
ることができ、このビタミンＢ１２−タンパク質複合体
は多くの公知の方法により固体相に付着させることがで
きる。
の方法がある。固体表面官能基は適切に化学的に誘導体
化することができ、ビタミンＢ１２−モノカルボン酸と
反応させることができる。代りに、ビタミンＢ１２−モ
ノカルボン酸を適切なタンパク質様担体分子に付着させ
ることができ、このビタミンＢ１２−タンパク質複合体
は多くの公知の方法により固体相に付着させることがで
きる。
【００４８】これらの固定化反応において、ビタミンＢ
１２は部分的に加水分解されてモノカルボン酸、好まし
くは、モノカルボン酸異性体のうちで最も固い結合であ
るモノカルボン酸（ｅ）−異性体になる。次にモノカル
ボン酸はウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）又は免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ）、典型的にはウマのＩｇＧ又はウシの
ＩｇＧのどちらかのタンパク質と共有結合でカップリン
グする。
１２は部分的に加水分解されてモノカルボン酸、好まし
くは、モノカルボン酸異性体のうちで最も固い結合であ
るモノカルボン酸（ｅ）−異性体になる。次にモノカル
ボン酸はウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）又は免疫グロ
ブリン（ＩｇＧ）、典型的にはウマのＩｇＧ又はウシの
ＩｇＧのどちらかのタンパク質と共有結合でカップリン
グする。
【００４９】このカップリングはビタミンＢ１２−モノ
カルボン酸のカルボキシル基のカルボニルジイミダソー
ル（ＣＤＩ）による活性化とそれに続く活性化ビタミン
Ｂ１２誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ
）との反応によって生じ、ビタミンＢ１２−モノカルボ
ン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得ら
れる。 この活性化エステルは次にタンパク質のアミノ基と反応
し、ビタミンＢ１２誘導体はアミド結合の形成によって
タンパク質とカップリングする。
カルボン酸のカルボキシル基のカルボニルジイミダソー
ル（ＣＤＩ）による活性化とそれに続く活性化ビタミン
Ｂ１２誘導体のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ
）との反応によって生じ、ビタミンＢ１２−モノカルボ
ン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルが得ら
れる。 この活性化エステルは次にタンパク質のアミノ基と反応
し、ビタミンＢ１２誘導体はアミド結合の形成によって
タンパク質とカップリングする。
【００５０】好ましくはそのビタミンＢ１２はまたビタ
ミンＢ１２の第一級アルコールの無水コハク酸との反応
にょつてスクシニル化される。ビタミンＢ１２のスクシ
ニル化はビタミンＢ１２がタンパク質を通じて固体支持
体にひき続きカップリングした時のビタミンＢ１２のＩ
Ｆとの結合を改良する。
ミンＢ１２の第一級アルコールの無水コハク酸との反応
にょつてスクシニル化される。ビタミンＢ１２のスクシ
ニル化はビタミンＢ１２がタンパク質を通じて固体支持
体にひき続きカップリングした時のビタミンＢ１２のＩ
Ｆとの結合を改良する。
【００５１】ビタミンＢ１２は分析における必要性に応
じて各種多数の固体支持体とカップリングさせることが
できる。
じて各種多数の固体支持体とカップリングさせることが
できる。
【００５２】ａ．ペル１０２
ペル （Ｐｅｌ）１０２（商標）はアミコン （Ａｍｉ
ｃｏｎ） から入手できる独占的な橋かけポリアクリル
アミドで、ＮＨＳで予め活性化されており、アミノ基を
含有する種と容易にカップリングする。もしビタミンＢ
１２モノカルボン酸−ＢＳＡ複合体がペル１０２に添加
されると、ＢＳＡ上のアミノ基は固体支持体と結合した
ものとなる。
ｃｏｎ） から入手できる独占的な橋かけポリアクリル
アミドで、ＮＨＳで予め活性化されており、アミノ基を
含有する種と容易にカップリングする。もしビタミンＢ
１２モノカルボン酸−ＢＳＡ複合体がペル１０２に添加
されると、ＢＳＡ上のアミノ基は固体支持体と結合した
ものとなる。
【００５３】ｂ．ＣＤＩ−活性化セルロースＣＤＩはセ
ルロースのヒドロキシル基をビタミンＢ１２モノカルボ
ン酸−タンパク質複合体中のタンパク質のアミノ酸と反
応させるため活性化する。タンパク質はＢＳＡ、ＩｇＧ
のどちらでも用いることができる。
ルロースのヒドロキシル基をビタミンＢ１２モノカルボ
ン酸−タンパク質複合体中のタンパク質のアミノ酸と反
応させるため活性化する。タンパク質はＢＳＡ、ＩｇＧ
のどちらでも用いることができる。
【００５４】この反応の考案はセルロースとビタミンＢ
１２モノカルボン酸−タンパク質複合体間にスペーサー
を備えて立体障害の可能性を減少させるのに使用できる
。 この考案において、ＣＤＩ−活性化セルロースはヘキサ
ンジアミンによって活性化することができる。アミノ基
に依存するヘキサンジアミンスペーサーの遊離末端は次
いで無水コハク酸と反応させることができる。追加的な
ヘキサンジアミンスペーサーはコハク酸部分の遊離カル
ボキシル基を追加ヘキサンジアミンとカップリングさせ
ることによって組み入れることができる。
１２モノカルボン酸−タンパク質複合体間にスペーサー
を備えて立体障害の可能性を減少させるのに使用できる
。 この考案において、ＣＤＩ−活性化セルロースはヘキサ
ンジアミンによって活性化することができる。アミノ基
に依存するヘキサンジアミンスペーサーの遊離末端は次
いで無水コハク酸と反応させることができる。追加的な
ヘキサンジアミンスペーサーはコハク酸部分の遊離カル
ボキシル基を追加ヘキサンジアミンとカップリングさせ
ることによって組み入れることができる。
【００５５】ｃ．ポリスチレンビーズ
固定化ビタミンＢ１２の固定化洩れの減少及び自動分析
装置用としての適応性の点での最適固体支持体は １／
４インチ（６．３５ｍｍ）のポリスチレンであることが
証明された。固定化ビタミンＢ１２を作製するためのポ
リスチレンビーズの誘導体化は下記一連の反応によって
進行する。
装置用としての適応性の点での最適固体支持体は １／
４インチ（６．３５ｍｍ）のポリスチレンであることが
証明された。固定化ビタミンＢ１２を作製するためのポ
リスチレンビーズの誘導体化は下記一連の反応によって
進行する。
【００５６】１）ポリスチレンビーズのニトロニウムテ
トラフルオロホウ酸又は濃硫酸中の濃硝酸を用いるニト
ロ化、 ２）濃塩酸中の金属スズを用いるニトロポリスチレンビ
ーズのアミノポリスチレンビーズへの還元、３）ＨＣｌ
中の硝酸ナトリウムを用いるアミノポリスチレンビーズ
のジアゾニウムポリスチレンビーズへの転換、及び ４）０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．２における反
応によるビタミンＢ１２−ＩｇＧ複合体のジアゾニウム
ポリスチレンビーズとの結合。これら操作のより詳細は
下記の参考例２及び３に示される。
トラフルオロホウ酸又は濃硫酸中の濃硝酸を用いるニト
ロ化、 ２）濃塩酸中の金属スズを用いるニトロポリスチレンビ
ーズのアミノポリスチレンビーズへの還元、３）ＨＣｌ
中の硝酸ナトリウムを用いるアミノポリスチレンビーズ
のジアゾニウムポリスチレンビーズへの転換、及び ４）０．１Ｍホウ酸ナトリウム、ｐＨ９．２における反
応によるビタミンＢ１２−ＩｇＧ複合体のジアゾニウム
ポリスチレンビーズとの結合。これら操作のより詳細は
下記の参考例２及び３に示される。
【００５７】なおその他のカップリング操作を用いるこ
とができ、それぞれ特殊の分析スキームにおいて有用で
ある。例えば、ビタミンＢ１２のモノカルボン酸誘導体
はＣＤＩによって活性化することができ、遊離アミノ基
が得られる。次いでアミノ誘導体はスクシンイミジル−
４−（Ｎ−マレイミノ）−シクロヘキサン−１−カルボ
ン酸とカップリングすることができる。生成物は次いで
チオール基を含有する如何なるタンパク質ともカップリ
ングさせることができる。
とができ、それぞれ特殊の分析スキームにおいて有用で
ある。例えば、ビタミンＢ１２のモノカルボン酸誘導体
はＣＤＩによって活性化することができ、遊離アミノ基
が得られる。次いでアミノ誘導体はスクシンイミジル−
４−（Ｎ−マレイミノ）−シクロヘキサン−１−カルボ
ン酸とカップリングすることができる。生成物は次いで
チオール基を含有する如何なるタンパク質ともカップリ
ングさせることができる。
【００５８】４．アビジン−標識付け酵素の調製及び使
用 ａ．複合化アビジンの調製 アビジンはビオチンと極度に高い親和性、結合定数約１
０１３Ｍ−１を有している。したがって、酵素のアビジ
ンとのカップリングは試薬の１つがビオチンで標識付け
された免疫反応に酵素標識を導入する優れた方法である
。
用 ａ．複合化アビジンの調製 アビジンはビオチンと極度に高い親和性、結合定数約１
０１３Ｍ−１を有している。したがって、酵素のアビジ
ンとのカップリングは試薬の１つがビオチンで標識付け
された免疫反応に酵素標識を導入する優れた方法である
。
【００５９】使用する酵素はその活性がアビジンとの複
合又はビオチン−標識付けＩＦとの結合によって影響さ
れない検出可能な生成物を生成する検定可能な酵素であ
れば使用することができる。好ましくは検出可能な生成
物は目視的に検出することができる。典型的には酵素は
西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）であるが、β
−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びアル
カリホスファターゼはすべて適した酵素である。酵素と
してＨＲＰＯを使用した場合、ＨＲＰＯとアビジンをカ
ップリングさせるのに数種のカップリング方法を使用す
ることができる。２種の有効な方法は過ヨウ素酸塩−媒
介複合及びマレイミドとチオールとの反応による複合で
ある。
合又はビオチン−標識付けＩＦとの結合によって影響さ
れない検出可能な生成物を生成する検定可能な酵素であ
れば使用することができる。好ましくは検出可能な生成
物は目視的に検出することができる。典型的には酵素は
西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）であるが、β
−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ及びアル
カリホスファターゼはすべて適した酵素である。酵素と
してＨＲＰＯを使用した場合、ＨＲＰＯとアビジンをカ
ップリングさせるのに数種のカップリング方法を使用す
ることができる。２種の有効な方法は過ヨウ素酸塩−媒
介複合及びマレイミドとチオールとの反応による複合で
ある。
【００６０】（１）過ヨウ素酸塩−媒介複合使用される
過ヨウ素酸塩−媒介複合方法はピー・ティーセン及びイ
ー・クルスタック「酵素免疫分析用ペルオキシダーゼ及
び活性ペルオキシダーゼ−抗体複合体の高効率・簡単な
調製方法」アナリティカル・バイオケミストリー １
３６，４５１−４５７（１９８４） 、ピー・ケー・ナ
カネ及びエイ・カワオイ「ペルオキシダーゼ標識付け抗
体：新しい複合方法」ジャーナル・ヒストケミストリー
・シトケミストリー ２２，１０８４−１０９１（１
９７４）に記載の方法と反応時間と試薬量を若干変えた
方法を使用した。
過ヨウ素酸塩−媒介複合方法はピー・ティーセン及びイ
ー・クルスタック「酵素免疫分析用ペルオキシダーゼ及
び活性ペルオキシダーゼ−抗体複合体の高効率・簡単な
調製方法」アナリティカル・バイオケミストリー １
３６，４５１−４５７（１９８４） 、ピー・ケー・ナ
カネ及びエイ・カワオイ「ペルオキシダーゼ標識付け抗
体：新しい複合方法」ジャーナル・ヒストケミストリー
・シトケミストリー ２２，１０８４−１０９１（１
９７４）に記載の方法と反応時間と試薬量を若干変えた
方法を使用した。
【００６１】（２）マレイミドとチオールの反応による
複合 マレイミドを用いる複合反応はエム・イマガワら「マレ
イミド化合物、グルタルアルデヒド及び過ヨウ素酸塩を
用いて調製した抗体−西洋わさびペルオキシダーゼの特
性及び評価」ジャーナル・アプライド・バイオケミスト
リー ４，４１−５７（１９８２）に記載の方法の変
法である。反応条件及び精製操作を上記に示されたのと
若干変更した。この反応において、マレイミド基は１：
２００モル過剰のスルホ−スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸
を用いるリン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．０において
１ないし２時間の処理によってＨＲＰＯ中に導入される
。アビジンはジチオ−ビス−スクシンイミジルプロピオ
ン酸、次いでジチオスレイトールで処理されてチオール
基を導入される。複合反応を行うため２種のタンパク質
は等モル量で２０分から１２０分間混合される。次いで
複合体は過ヨード酸複合体について用いたのと同じカル
ボキシメチル−セファデックス操作によって単離される
。
複合 マレイミドを用いる複合反応はエム・イマガワら「マレ
イミド化合物、グルタルアルデヒド及び過ヨウ素酸塩を
用いて調製した抗体−西洋わさびペルオキシダーゼの特
性及び評価」ジャーナル・アプライド・バイオケミスト
リー ４，４１−５７（１９８２）に記載の方法の変
法である。反応条件及び精製操作を上記に示されたのと
若干変更した。この反応において、マレイミド基は１：
２００モル過剰のスルホ−スクシンイミジル−４−（Ｎ
−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸
を用いるリン酸ナトリウム緩衝液中ｐＨ７．０において
１ないし２時間の処理によってＨＲＰＯ中に導入される
。アビジンはジチオ−ビス−スクシンイミジルプロピオ
ン酸、次いでジチオスレイトールで処理されてチオール
基を導入される。複合反応を行うため２種のタンパク質
は等モル量で２０分から１２０分間混合される。次いで
複合体は過ヨード酸複合体について用いたのと同じカル
ボキシメチル−セファデックス操作によって単離される
。
【００６２】ｂ．分析におけるアビジン−ＨＲＰＯ複合
体の使用 アビジン−ＨＲＰＯ複合体は典型的に分析中に導入され
、次いでビオチニル化ＩＦとの試料の３０分間の温置及
び固定化ビタミンＢ１２の添加後さらに３０分間の温置
を行う。非特異結合を防止するため、アビジン−ＨＲＰ
Ｏの温置は最適には溶液１リットル当り２９．８ｇのＫ
Ｃｌ、１．２ｇのトリス原液、１０．０ｇのＢＳＡ及び
０．５ｇのチメロサル（防腐剤）を含有する「アビジン
緩衝液」中で行われる。
体の使用 アビジン−ＨＲＰＯ複合体は典型的に分析中に導入され
、次いでビオチニル化ＩＦとの試料の３０分間の温置及
び固定化ビタミンＢ１２の添加後さらに３０分間の温置
を行う。非特異結合を防止するため、アビジン−ＨＲＰ
Ｏの温置は最適には溶液１リットル当り２９．８ｇのＫ
Ｃｌ、１．２ｇのトリス原液、１０．０ｇのＢＳＡ及び
０．５ｇのチメロサル（防腐剤）を含有する「アビジン
緩衝液」中で行われる。
【００６３】ｃ．スクシニル化アビジンの使用アビジン
は等電点約ｐＨ１１を有する極度に塩基性のタンパク質
である。その高度の塩基性によりアビジン複合体の高度
の非特異結合性がもたらされる。この非特異結合性を減
少させるため複合体との温置は上記のアビジン緩衝液を
用いて行われなければならない。しかしながら、アビジ
ン緩衝液はある種の自動分析システムにおいては分析の
実施に適合しない。これを避けるため、アビジンは無水
コハク酸を用いる反応でスクシニル化される。このスク
シニル化アビジンは、ＨＲＰＯと複合後、アビジン緩衝
液なしで洗浄緩衝液中に正常な生理的食塩水を用いて分
析に使用することができる。
は等電点約ｐＨ１１を有する極度に塩基性のタンパク質
である。その高度の塩基性によりアビジン複合体の高度
の非特異結合性がもたらされる。この非特異結合性を減
少させるため複合体との温置は上記のアビジン緩衝液を
用いて行われなければならない。しかしながら、アビジ
ン緩衝液はある種の自動分析システムにおいては分析の
実施に適合しない。これを避けるため、アビジンは無水
コハク酸を用いる反応でスクシニル化される。このスク
シニル化アビジンは、ＨＲＰＯと複合後、アビジン緩衝
液なしで洗浄緩衝液中に正常な生理的食塩水を用いて分
析に使用することができる。
【００６４】５．血清分析への適用
実際の血清試料の分析などの使用においては、内因子様
活性を有する内因性試料タンパク質を不活性化する必要
がある。これらのタンバク質はビタミンＢ１２と結合し
、分析結果をゆがめる。これらのタンパク質は従来煮沸
によって不活性化されてきたが、より簡単でより容易に
行える血清の前処理段階が血清試料を迅速に処理するた
め大いに望まれている。そのような前処理段階は血清試
料のＮａＯＨとジチオトレイトール（ＤＤＴ）による１
５分間室温における温置とそれに続くＮａＯＨのトリス
緩衝液を用いる中和（実施例１）を用いてなることがで
きる。
活性を有する内因性試料タンパク質を不活性化する必要
がある。これらのタンバク質はビタミンＢ１２と結合し
、分析結果をゆがめる。これらのタンパク質は従来煮沸
によって不活性化されてきたが、より簡単でより容易に
行える血清の前処理段階が血清試料を迅速に処理するた
め大いに望まれている。そのような前処理段階は血清試
料のＮａＯＨとジチオトレイトール（ＤＤＴ）による１
５分間室温における温置とそれに続くＮａＯＨのトリス
緩衝液を用いる中和（実施例１）を用いてなることがで
きる。
【００６５】また、ＫＣＮの存在は分析混合物中で非常
に重要である。ＫＣＮは分析の遂行中シアノコバラミン
の形でビタミンＢ１２を安定化すると考えられている。
に重要である。ＫＣＮは分析の遂行中シアノコバラミン
の形でビタミンＢ１２を安定化すると考えられている。
【００６６】６．別の分析実施形態
前述したように、アビジン上のレポーター基が酵素であ
る必要はない。代りに酵素補因子、モジュレーター、抑
制剤、化学発光又は蛍光標識、又は電解的に検出可能な
標識を用いることができる。事実、レポーター基はアビ
ジン上又はＩＦに特異的に結合する他の分子上にある必
要はないが、ＩＦ自体上に位置することができる。
る必要はない。代りに酵素補因子、モジュレーター、抑
制剤、化学発光又は蛍光標識、又は電解的に検出可能な
標識を用いることができる。事実、レポーター基はアビ
ジン上又はＩＦに特異的に結合する他の分子上にある必
要はないが、ＩＦ自体上に位置することができる。
【００６７】ビオチンに共有結合で結合したり、後から
添加されるアビジン−標識付け酵素の代りにビタミンＢ
１２の結合パートナーを酵素又は他のレポーター基と共
有結合で複合することができる。この形態においてはア
ビジン−ビオチン系を使用する必要はない。
添加されるアビジン−標識付け酵素の代りにビタミンＢ
１２の結合パートナーを酵素又は他のレポーター基と共
有結合で複合することができる。この形態においてはア
ビジン−ビオチン系を使用する必要はない。
【００６８】また、抗−内因子抗体のようなビタミンＢ
１２の結合パートナーに対し特異的な抗体を使用するこ
とができる。この形態において、酵素又は他のレポータ
ー基を直接抗体に付着させることができる。代りに、結
合パートナーに特異的な第１抗体及び第１抗体に特異的
な第２抗体を使用することができる。この変法において
、酵素又は他のレポーター基を第２抗体に付着させるこ
とができる。例えば、結合パートナーがもしＩＦであっ
たなら第１抗体はウサギの抗−ＩＦ抗体であり、第２抗
体はＨＲＰＯに共有結合で複合したヤギの抗−ウサギＩ
ｇＧであることができよう。
１２の結合パートナーに対し特異的な抗体を使用するこ
とができる。この形態において、酵素又は他のレポータ
ー基を直接抗体に付着させることができる。代りに、結
合パートナーに特異的な第１抗体及び第１抗体に特異的
な第２抗体を使用することができる。この変法において
、酵素又は他のレポーター基を第２抗体に付着させるこ
とができる。例えば、結合パートナーがもしＩＦであっ
たなら第１抗体はウサギの抗−ＩＦ抗体であり、第２抗
体はＨＲＰＯに共有結合で複合したヤギの抗−ウサギＩ
ｇＧであることができよう。
【００６９】ビタミンＢ１２の結合パートナーは典型的
には内因子であるけれども、他の結合パートナー、例え
ば、タンパク質Ｒや抗−ビタミンＢ１２抗体もまた分析
に使用することができる。
には内因子であるけれども、他の結合パートナー、例え
ば、タンパク質Ｒや抗−ビタミンＢ１２抗体もまた分析
に使用することができる。
【００７０】もしＩＦをビオチンでなく２，４−ジニト
ロフェノールのようなハプテンで標識付けすれば、分析
においてハプテンに対して高度に特異強結合する抗体を
アビジンと置き換えることができる。その抗体は前述の
レポーター基のどれを用いても標識付けすることができ
る。代りに、前述のように、ＩＦ自体をこれらレポータ
ー基のどれを用いても標識付けすることができる。
ロフェノールのようなハプテンで標識付けすれば、分析
においてハプテンに対して高度に特異強結合する抗体を
アビジンと置き換えることができる。その抗体は前述の
レポーター基のどれを用いても標識付けすることができ
る。代りに、前述のように、ＩＦ自体をこれらレポータ
ー基のどれを用いても標識付けすることができる。
【００７１】
【実施例】次に、本発明を実施例に基づいてさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【００７２】参考例１
内因子のビオチニル化
０．５ ｍｇ／ｍｌ水溶液の内因子（ＩＦ）の３種の０
．５ ｍｌ アリコートのそれぞれにゆっくりかきまぜ
ながらｐＨ７．４の０．５Ｍのリン酸ナトリウム０．１
ｍｌ を添加した。第１のアリコートには２．５ ｍ
ｇ／ｍｌ溶液のビオチニルアミドカプロン酸のＮ−ヒド
ロキシスクシンイミジルエステル（ビオチン−Ｘ−ＮＨ
Ｓ）５．７μｌ を添加した。第２のアリコートには２
５ ｍｇ／ｍｌ溶液のビオチン−Ｘ−ＮＨＳの５．７μ
ｌ を添加した。第３のアリコートには５０ ｍｇ／ｍ
ｌ溶液のビオチン−Ｘ−ＮＨＳの６２．５μｌ を添加
した。反応混合物を含有する管を室温で２〜３時間攪拌
し、次いで４℃で一晩中攪拌した。反応混合物は透明に
なって残った。次に、第１及び第２のアリコートにリン
酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中の０．１Ｍ のエチ
レンジアミン０．１ ｍｌ を添加した。第３のアリコ
ートにはエチレンジアミン０．１ Ｍ 溶液０．２
ｍｌ を添加した。エチレンジアミン添加後、溶液を室
温で少なくとも２時間攪拌した。最後に、０．１ ｇ／
ｍｌ のウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１ ｍｌ
を各管に添加した。次に、各管の内容物を透析チュービ
ングに移し、ｐＨ７．４の５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ
の３交換で透析し、次いで１０ｍＭに希釈したｐＨ７．
４のリン酸塩緩衝生理的食塩水の２交換でさらに透析し
た。
．５ ｍｌ アリコートのそれぞれにゆっくりかきまぜ
ながらｐＨ７．４の０．５Ｍのリン酸ナトリウム０．１
ｍｌ を添加した。第１のアリコートには２．５ ｍ
ｇ／ｍｌ溶液のビオチニルアミドカプロン酸のＮ−ヒド
ロキシスクシンイミジルエステル（ビオチン−Ｘ−ＮＨ
Ｓ）５．７μｌ を添加した。第２のアリコートには２
５ ｍｇ／ｍｌ溶液のビオチン−Ｘ−ＮＨＳの５．７μ
ｌ を添加した。第３のアリコートには５０ ｍｇ／ｍ
ｌ溶液のビオチン−Ｘ−ＮＨＳの６２．５μｌ を添加
した。反応混合物を含有する管を室温で２〜３時間攪拌
し、次いで４℃で一晩中攪拌した。反応混合物は透明に
なって残った。次に、第１及び第２のアリコートにリン
酸塩緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）中の０．１Ｍ のエチ
レンジアミン０．１ ｍｌ を添加した。第３のアリコ
ートにはエチレンジアミン０．１ Ｍ 溶液０．２
ｍｌ を添加した。エチレンジアミン添加後、溶液を室
温で少なくとも２時間攪拌した。最後に、０．１ ｇ／
ｍｌ のウシの血清アルブミン（ＢＳＡ）０．１ ｍｌ
を各管に添加した。次に、各管の内容物を透析チュービ
ングに移し、ｐＨ７．４の５０ ｍＭ トリス−ＨＣｌ
の３交換で透析し、次いで１０ｍＭに希釈したｐＨ７．
４のリン酸塩緩衝生理的食塩水の２交換でさらに透析し
た。
【００７３】ＩＦ分子に対するビオチン部分の比率は第
１反応混合物では６．３：１、第２では６３：１、第３
では１３７５：１であった。３７Ｃｏ−標識付けビタミ
ンＢ１２及び遊離ビタミンＢ１２とは結合するが内因子
と結合したビタミンＢ１２とは結合しないＢＳＡ−処理
木炭を用いたビオチニル化ＩＦのビタミンＢ１２結合能
力の分析はビオチニル化ＩＦ製剤のビタミンＢ１２結合
能力に何等の減少も無いことを示した。ビオチニル化の
程度の分析も３７Ｃｏ−標識付けビタミンＢ１２、ＢＳ
Ａ−処理木炭及びセルロース上に固定化したアビジンを
用いて行った。この分析においては、少なくとも１つの
ビオチン部分を担持しないＩＦと結合した標識付けビタ
ミンＢ１２のどれもが木炭によっても、セルロース−ア
ビジンによっても結合せず、溶液中に残存する。この分
析は実質的に全てのＩＦ分子がビオチン：ＩＦ比が最低
の６．３：１の場合でさえもビオチニル化されたことを
示した。
１反応混合物では６．３：１、第２では６３：１、第３
では１３７５：１であった。３７Ｃｏ−標識付けビタミ
ンＢ１２及び遊離ビタミンＢ１２とは結合するが内因子
と結合したビタミンＢ１２とは結合しないＢＳＡ−処理
木炭を用いたビオチニル化ＩＦのビタミンＢ１２結合能
力の分析はビオチニル化ＩＦ製剤のビタミンＢ１２結合
能力に何等の減少も無いことを示した。ビオチニル化の
程度の分析も３７Ｃｏ−標識付けビタミンＢ１２、ＢＳ
Ａ−処理木炭及びセルロース上に固定化したアビジンを
用いて行った。この分析においては、少なくとも１つの
ビオチン部分を担持しないＩＦと結合した標識付けビタ
ミンＢ１２のどれもが木炭によっても、セルロース−ア
ビジンによっても結合せず、溶液中に残存する。この分
析は実質的に全てのＩＦ分子がビオチン：ＩＦ比が最低
の６．３：１の場合でさえもビオチニル化されたことを
示した。
【００７４】参考例２
ニトロニウム・テトラフルオロホウ酸によるポリスチレ
ンのニトロ化を用いるポリスチレンビーズ上の固定化ビ
タミンＢ１２の調製 約７０００の直径１／４インチ（６．３５ｍｍ）ポリス
チレンビーズをフラスコ中に入れ、乾燥アクリロニトリ
ル中の０．２５Ｍニトロニウム・テトラフルオロホウ酸
７００ ｍｌ で処理した。フラスコ中のビーズは室温
で４５分間ゆっくり振とうし、次いで７００ ｍｌ の
アクリロニトリルで３回、次いで多量の水で洗浄した。
ンのニトロ化を用いるポリスチレンビーズ上の固定化ビ
タミンＢ１２の調製 約７０００の直径１／４インチ（６．３５ｍｍ）ポリス
チレンビーズをフラスコ中に入れ、乾燥アクリロニトリ
ル中の０．２５Ｍニトロニウム・テトラフルオロホウ酸
７００ ｍｌ で処理した。フラスコ中のビーズは室温
で４５分間ゆっくり振とうし、次いで７００ ｍｌ の
アクリロニトリルで３回、次いで多量の水で洗浄した。
【００７５】ニトロポリスチレンビーズをアミノポリス
チレンに還元するためビーズを７５０ ｍｌ の濃ＨＣ
ｌ中に懸濁させた。ビーズに１５０ ｇのスズ粉を添加
し、混合物をロッカー上で１時間時々手振とうで振とう
した。 その時点で、さらに２００ｇのスズ及び１０００ ｍｌ
の濃ＨＣｌを添加し、その混合物を室温で一晩中振と
うした後、５００ｍｌの濃ＨＣｌを再び添加した。ビー
ズは多量の水で洗浄した。ビーズ上のアミノ基の存在は
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸による試験
で確認した。
チレンに還元するためビーズを７５０ ｍｌ の濃ＨＣ
ｌ中に懸濁させた。ビーズに１５０ ｇのスズ粉を添加
し、混合物をロッカー上で１時間時々手振とうで振とう
した。 その時点で、さらに２００ｇのスズ及び１０００ ｍｌ
の濃ＨＣｌを添加し、その混合物を室温で一晩中振と
うした後、５００ｍｌの濃ＨＣｌを再び添加した。ビー
ズは多量の水で洗浄した。ビーズ上のアミノ基の存在は
２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸による試験
で確認した。
【００７６】アミノポリスチレンビーズをジアゾポリス
チレンビーズに還元するため、塩酸中の亜硝酸ナトリウ
ムを使用した。少量のアミン含有ビーズを５倍容量の４
％（ｗ／ｖ） ＮａＮＯ２ と２ＭのＨＣｌの１：１混
合物を用い４℃で１０分間振とう処理した。
チレンビーズに還元するため、塩酸中の亜硝酸ナトリウ
ムを使用した。少量のアミン含有ビーズを５倍容量の４
％（ｗ／ｖ） ＮａＮＯ２ と２ＭのＨＣｌの１：１混
合物を用い４℃で１０分間振とう処理した。
【００７７】ビーズ上へのビタミンＢ１２−ＩｇＧ複合
体の固定化のため、３０ｍｌのジアゾニウムビーズをｐ
Ｈ７．２、０．１Ｍホウ酸ナトリウム中の複合体で処理
した。複合体自体は例３で述べるようにして調製してあ
った。ビーズは複合体と４℃で一晩中振とうし、その後
ホウ酸塩緩衝剤で洗浄した。
体の固定化のため、３０ｍｌのジアゾニウムビーズをｐ
Ｈ７．２、０．１Ｍホウ酸ナトリウム中の複合体で処理
した。複合体自体は例３で述べるようにして調製してあ
った。ビーズは複合体と４℃で一晩中振とうし、その後
ホウ酸塩緩衝剤で洗浄した。
【００７８】参考例３
硝酸によるポリスチレンのニトロ化を用いるポリスチレ
ンビーズ上の固定化ビタミンＢ１２の調製ニトロ化のた
め、４４０ ｍｌ の濃Ｈ２ ＳＯ４ と３４０ ｍｌ
の濃ＨＮＯ３ を２リットルの三角フラスコ中へ氷中
で振とう、冷却しながら少量ずつ添加した。その酸混合
物へ約１２００ ｍｌのポリスチレンビーズを添加した
。混合物は氷浴中で１時間手で振とうし、その後濾過、
洗浄した。
ンビーズ上の固定化ビタミンＢ１２の調製ニトロ化のた
め、４４０ ｍｌ の濃Ｈ２ ＳＯ４ と３４０ ｍｌ
の濃ＨＮＯ３ を２リットルの三角フラスコ中へ氷中
で振とう、冷却しながら少量ずつ添加した。その酸混合
物へ約１２００ ｍｌのポリスチレンビーズを添加した
。混合物は氷浴中で１時間手で振とうし、その後濾過、
洗浄した。
【００７９】アミン含有ビーズを還元するため、５００
ｍｌ のニトロ化ポリスチレンビーズを１リットルの
真上からのスターラーつき二重くび丸底フラスコへ入れ
た。 １００ｇ のスズ散弾を添加し、次いで４００ｍｌの濃
ＨＣｌを添加した。ビーズ含有フラスコは室温で８時間
攪拌した後、室温で一晩放置した。次に、ビーズを多量
の水で洗浄し、水面下で貯蔵した。
ｍｌ のニトロ化ポリスチレンビーズを１リットルの
真上からのスターラーつき二重くび丸底フラスコへ入れ
た。 １００ｇ のスズ散弾を添加し、次いで４００ｍｌの濃
ＨＣｌを添加した。ビーズ含有フラスコは室温で８時間
攪拌した後、室温で一晩放置した。次に、ビーズを多量
の水で洗浄し、水面下で貯蔵した。
【００８０】ビタミンＢ１２−ＩｇＧ複合体をビーズの
ジアゾ化前に別途調製した。ビタミンＢ１２−ＩｇＧ複
合体調製のため、８７．５ ｍｇ のビタミンＢ１２の
モノカルボン酸（ｅ）−異性体誘導体を２ ｍｌ のジ
エチルホルムアミド中で７０−８０℃に加熱した。ビタ
ミンＢ１２のモノカルボン酸誘導体の全てが溶解したわ
けではなかった。 ８７．５ｍｇのカルボニルジイミダゾールを次に添加し
、１０分間温度を７０−８０℃に保持した。透明な赤色
溶液が形成された。次にその溶液を室温まで冷却し、室
温で４時間攪拌しながら８７．５ｍｇのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（ＮＨＳ）を添加した。次に、ＩｇＧを
１０ｍｇ／ｍｌ で０．１Ｍリン酸塩緩衝生理的食塩水
（ＰＢＳ）中に溶解した。６本の管各々に２．５ｍｌの
ＩｇＧ溶液、１．３ｍｌのＰＢＳ及び表１に示す量の活
性化ビタミンＢ１２を添加した。反応混合物中に存在す
る活性化ビタミンＢ１２のＩｇＧに対する比率は１：１
（管１）から１：５００（管５）の範囲であった。活性
化ビタミンＢ１２とＩｇＧの反応はその後４℃で一晩中
放置して進行させた。 生成物は１０ ｍＭ のＰＢＳに対し透析し、次いでセ
ファデックス（商標）Ｇ−２５カラムを通した後、ビタ
ミンＢ１２のＩｇＧに対する比率が最大の２種の生成物
（管１及び２）を除いて再度透析した。
ジアゾ化前に別途調製した。ビタミンＢ１２−ＩｇＧ複
合体調製のため、８７．５ ｍｇ のビタミンＢ１２の
モノカルボン酸（ｅ）−異性体誘導体を２ ｍｌ のジ
エチルホルムアミド中で７０−８０℃に加熱した。ビタ
ミンＢ１２のモノカルボン酸誘導体の全てが溶解したわ
けではなかった。 ８７．５ｍｇのカルボニルジイミダゾールを次に添加し
、１０分間温度を７０−８０℃に保持した。透明な赤色
溶液が形成された。次にその溶液を室温まで冷却し、室
温で４時間攪拌しながら８７．５ｍｇのＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド（ＮＨＳ）を添加した。次に、ＩｇＧを
１０ｍｇ／ｍｌ で０．１Ｍリン酸塩緩衝生理的食塩水
（ＰＢＳ）中に溶解した。６本の管各々に２．５ｍｌの
ＩｇＧ溶液、１．３ｍｌのＰＢＳ及び表１に示す量の活
性化ビタミンＢ１２を添加した。反応混合物中に存在す
る活性化ビタミンＢ１２のＩｇＧに対する比率は１：１
（管１）から１：５００（管５）の範囲であった。活性
化ビタミンＢ１２とＩｇＧの反応はその後４℃で一晩中
放置して進行させた。 生成物は１０ ｍＭ のＰＢＳに対し透析し、次いでセ
ファデックス（商標）Ｇ−２５カラムを通した後、ビタ
ミンＢ１２のＩｇＧに対する比率が最大の２種の生成物
（管１及び２）を除いて再度透析した。
【００８１】カップリング反応のため、ＩｇＧ複合体を
１５ ｍｌ 、ｐＨ９．２の０．１Ｍホウ酸ナトリウム
で希釈した。ジアゾ化及びカップリングのため、アリコ
ートのビーズに１０ ｍｌ の４％ＮａＳＯ２ 及び１
０ ｍｌ の２ＭＨＣｌを添加し、ビーズ含有管を振と
うし４℃で５分間放置した。次いで溶液をビーズからろ
別し、ビーズを０．０１ＭのＨＣｌで洗浄した。次にビ
タミンＢ１２−ＩｇＧ複合体を添加しビーズを覆うに足
る十分なＰＢＳを添加した。複合体とビーズは振とうし
ながら３日間放置して反応させた。
１５ ｍｌ 、ｐＨ９．２の０．１Ｍホウ酸ナトリウム
で希釈した。ジアゾ化及びカップリングのため、アリコ
ートのビーズに１０ ｍｌ の４％ＮａＳＯ２ 及び１
０ ｍｌ の２ＭＨＣｌを添加し、ビーズ含有管を振と
うし４℃で５分間放置した。次いで溶液をビーズからろ
別し、ビーズを０．０１ＭのＨＣｌで洗浄した。次にビ
タミンＢ１２−ＩｇＧ複合体を添加しビーズを覆うに足
る十分なＰＢＳを添加した。複合体とビーズは振とうし
ながら３日間放置して反応させた。
【００８２】
【表１】
【００８３】実施例１
血清中のビタミンＢ１２の分析
１２ｘ７５ ｍｍ ポリスチレン試験管中へ２００μｌ
の血清試料もしくは標準試料、１００μｌ の０．１
％ＫＣＮ、０．８５％のＮａＣｌ中の０．２％ＤＤＴ及
び５０μｌ の１ＮのＮａＯＨを添加した。試料は室温
で１５分間温置した。次に５００μｌ の１Ｍ、ｐＨ８
のトリス及びビオチン分子対ＩＦ分子比５０：１、希釈
率１／２０００のビオチニル化ＩＦ製剤を添加した。そ
の混合物を３７℃で３０分間温置した。ＨＣｌ／ＨＮＯ
３ を用いるニトロ化（例３）によって調製し、ｐＨ８
、０．１Ｍトリスで３回予備洗浄したビタミンＢ１２−
ＩｇＧ複合体を含有するポリスチレンビーズを添加し、
反応物を１９０ｒｐｍの回転子上で３７℃で３０分間さ
らに温置した。 ビーズをアビジン緩衝液中で洗浄し、３００ ｍｌ の
希釈率１／２０００のアビジン−ＨＲＰＯ（市販品とし
てボーリンガー−マンハイムから入手した）を添加した
。回転子上での３７℃で３０分間の追加温置後、ビーズ
をアビジン緩衝液で３回洗浄し、３００μｌ のクエン
酸緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニイレンジアミンを
ＨＲＰＯ用基質として添加した。酵素活性度を測定する
ため、反応物を室温で１５分間温置した。反応を１ ｍ
ｌ の０．９Ｍ−Ｈ２ ＳＯ４ により停止させ、各試
料について４９０ｎｍにおける吸光度（Ａ４９０）を読
んだ。基質のブランク及びビオチニル化ＩＦなしの非特
異結合コントロールもまた測定した。基質のブランクを
ビタミンＢ１２の各濃度での検定から得たＡ４９０ 平
均値から差し引き、固定化ビタミンＢ１２に結合したビ
オチニル化ＩＦの量に比例する補正平均吸光度（Ｂ）を
得た。ビタミンＢ１２の各濃度でのＢ値を次にビタミン
Ｂ１２の濃度ゼロにおけるＢ値（Ｂ０ ）で割ってＢ／
Ｂ０ 、濃度ゼロにおける結合画分に対比したビオチニ
ル化ＩＦの結合画分の比率を求めた。図１はビタミンＢ
１２の濃度に対するＢ／Ｂ０ のプロット結果を示す。 標準に対する結果を表２及び図１に示す。表３はこの分
析法によるいくつかの血清について得られた結果を同じ
血清についてアメルシャム及びコーニングからの２種の
市販の放射線免疫分析キットを用いて得られた結果と比
較して示す。表３においてＥＩＡの名称で示す本発明の
分析結果とアメルシャム分析又はコーニング分析結果と
の相関関係はアメルシャム分析及びコーニング分析間自
体の相関関係と少なくとも同等に良好もしくはより良好
である。スミスクライン・バイオサイエンスの放射線免
疫分析も同じ試料について実施した。本発明分析とスミ
スクライン・バイオサイエンス分析との相関関係はコー
ニング分析とスミスクライン・バイオサイエンス分析と
の相関関係よりも良好であった。相関係数の自乗値Ｒ２
は本発明分析とコーニング分析との間で０．５６１で
あり、本発明分析とスミスクライン・バイオサイエンス
分析との間で０．６１４であった。その値はコーニング
分析とスミスクライン・バイオサイエンス分析との間で
０．４５９であった。本発明分析とアメルシャム分析と
の間及びアメルシャム分析とコーニング分析との間の値
はほぼゼロであった。
の血清試料もしくは標準試料、１００μｌ の０．１
％ＫＣＮ、０．８５％のＮａＣｌ中の０．２％ＤＤＴ及
び５０μｌ の１ＮのＮａＯＨを添加した。試料は室温
で１５分間温置した。次に５００μｌ の１Ｍ、ｐＨ８
のトリス及びビオチン分子対ＩＦ分子比５０：１、希釈
率１／２０００のビオチニル化ＩＦ製剤を添加した。そ
の混合物を３７℃で３０分間温置した。ＨＣｌ／ＨＮＯ
３ を用いるニトロ化（例３）によって調製し、ｐＨ８
、０．１Ｍトリスで３回予備洗浄したビタミンＢ１２−
ＩｇＧ複合体を含有するポリスチレンビーズを添加し、
反応物を１９０ｒｐｍの回転子上で３７℃で３０分間さ
らに温置した。 ビーズをアビジン緩衝液中で洗浄し、３００ ｍｌ の
希釈率１／２０００のアビジン−ＨＲＰＯ（市販品とし
てボーリンガー−マンハイムから入手した）を添加した
。回転子上での３７℃で３０分間の追加温置後、ビーズ
をアビジン緩衝液で３回洗浄し、３００μｌ のクエン
酸緩衝液中２ｍｇ／ｍｌ ｏ−フェニイレンジアミンを
ＨＲＰＯ用基質として添加した。酵素活性度を測定する
ため、反応物を室温で１５分間温置した。反応を１ ｍ
ｌ の０．９Ｍ−Ｈ２ ＳＯ４ により停止させ、各試
料について４９０ｎｍにおける吸光度（Ａ４９０）を読
んだ。基質のブランク及びビオチニル化ＩＦなしの非特
異結合コントロールもまた測定した。基質のブランクを
ビタミンＢ１２の各濃度での検定から得たＡ４９０ 平
均値から差し引き、固定化ビタミンＢ１２に結合したビ
オチニル化ＩＦの量に比例する補正平均吸光度（Ｂ）を
得た。ビタミンＢ１２の各濃度でのＢ値を次にビタミン
Ｂ１２の濃度ゼロにおけるＢ値（Ｂ０ ）で割ってＢ／
Ｂ０ 、濃度ゼロにおける結合画分に対比したビオチニ
ル化ＩＦの結合画分の比率を求めた。図１はビタミンＢ
１２の濃度に対するＢ／Ｂ０ のプロット結果を示す。 標準に対する結果を表２及び図１に示す。表３はこの分
析法によるいくつかの血清について得られた結果を同じ
血清についてアメルシャム及びコーニングからの２種の
市販の放射線免疫分析キットを用いて得られた結果と比
較して示す。表３においてＥＩＡの名称で示す本発明の
分析結果とアメルシャム分析又はコーニング分析結果と
の相関関係はアメルシャム分析及びコーニング分析間自
体の相関関係と少なくとも同等に良好もしくはより良好
である。スミスクライン・バイオサイエンスの放射線免
疫分析も同じ試料について実施した。本発明分析とスミ
スクライン・バイオサイエンス分析との相関関係はコー
ニング分析とスミスクライン・バイオサイエンス分析と
の相関関係よりも良好であった。相関係数の自乗値Ｒ２
は本発明分析とコーニング分析との間で０．５６１で
あり、本発明分析とスミスクライン・バイオサイエンス
分析との間で０．６１４であった。その値はコーニング
分析とスミスクライン・バイオサイエンス分析との間で
０．４５９であった。本発明分析とアメルシャム分析と
の間及びアメルシャム分析とコーニング分析との間の値
はほぼゼロであった。
【００８４】
【表２】
【００８５】
【表３】
【００８６】本発明のビタミンＢ１２濃度分析方法は探
索されてきた目標を達成するものであり、従来使用され
た分析法に対して多数の有意義な利点を有している。こ
の分析は特に臨床的に有意義な濃度範囲において精度高
く正確である。レオニダスらの分析よりも良好な用量−
対応曲線が得られる。理論的に最も望ましいビタミンＢ
１２結合パートナーである内因子を使用することができ
る。 ビオチニル化内因子を使用することで、この分析は従来
内因子を使用するビタミンＢ１２分析におけるビオチン
−アビジン系の使用を妨げていた問題点、内因子の過小
ビオチニル化又は内因子のビタミンＢ１２結合能力の不
活性化のどちらの問題点も回避している。分析は血清に
対し容易に実施され、血清の内因的ビタミンＢ１２結合
タンパク質の不活性化に単純な方法を適用している。放
射能の使用を必要とせず、試薬の安定性が大きく、貯蔵
寿命が長いという利点が得られている。さらに、放射能
の使用が避けられることはこの分析が従事者に余分の訓
練を必要とせず、従事者自身、協力者ないしは環境に対
するリスクが少ないことを意味している。
索されてきた目標を達成するものであり、従来使用され
た分析法に対して多数の有意義な利点を有している。こ
の分析は特に臨床的に有意義な濃度範囲において精度高
く正確である。レオニダスらの分析よりも良好な用量−
対応曲線が得られる。理論的に最も望ましいビタミンＢ
１２結合パートナーである内因子を使用することができ
る。 ビオチニル化内因子を使用することで、この分析は従来
内因子を使用するビタミンＢ１２分析におけるビオチン
−アビジン系の使用を妨げていた問題点、内因子の過小
ビオチニル化又は内因子のビタミンＢ１２結合能力の不
活性化のどちらの問題点も回避している。分析は血清に
対し容易に実施され、血清の内因的ビタミンＢ１２結合
タンパク質の不活性化に単純な方法を適用している。放
射能の使用を必要とせず、試薬の安定性が大きく、貯蔵
寿命が長いという利点が得られている。さらに、放射能
の使用が避けられることはこの分析が従事者に余分の訓
練を必要とせず、従事者自身、協力者ないしは環境に対
するリスクが少ないことを意味している。
【００８７】本発明をある好ましい形態に関連してかな
り詳細に説明したけれどもその他の形態も可能である。 したがって、別記の請求の範囲の精神及び範囲はここに
含まれる好ましい形態の記載に限定されるものではない
。
り詳細に説明したけれどもその他の形態も可能である。 したがって、別記の請求の範囲の精神及び範囲はここに
含まれる好ましい形態の記載に限定されるものではない
。
【００８８】
【発明の効果】臨床条件下で定常的に正確なビタミンＢ
１２濃度データが効率よく得られる。
１２濃度データが効率よく得られる。
【図１】固定化ビタミンＢ１２とビオチニル化内因子を
用いる本発明の分析用の標準曲線である。
用いる本発明の分析用の標準曲線である。
Claims (49)
- 【請求項１】 （ａ）試験試料を（ｉ）レポーター基
とひき続き結合することができるビタミンＢ１２結合パ
ートナー及び（ｉｉ）試験試料中にビタミンＢ１２が存
在しないと実質的にすべての結合パートナーが固定化ビ
タミンＢ１２によって結合されるのに十分な固定化ビタ
ミンＢ１２と組み合わせ、（ｂ）次に試験試料中のビタ
ミンＢ１２の量が固定化ビタミンＢ１２と結合した結合
パートナーの量と反比例する固定化ビタミンＢ１２と結
合した結合パートナーの量を定量する段階を有してなる
試験試料中のビタミンＢ１２検出用競争結合分析方法。 - 【請求項２】 レポーター基が酵素、酵素補因子、酵
素阻害剤、酵素モジュレーター、蛍光標識、化学発光標
識及び電解的に検出できる標識からなる群から選ばれる
請求項１の方法。 - 【請求項３】 （ａ）試験試料を（ｉ）レポーター基
とひき続き結合することができる内因子及び （ｉｉ
）試験試料中にビタミンＢ１２が存在しないと実質的に
すべて内因子が固定化ビタミンＢ１２によって結合され
るのに十分な固定化ビタミンＢ１２と組み合わせ、（ｂ
）次に試験試料中のビタミンＢ１２の量が固定化ビタミ
ンＢ１２と結合した内因子の量と反比例する固定化ビタ
ミンＢ１２と結合した内因子の量を定量する段階を有し
てなる試験試料中のビタミンＢ１２検出用競争結合分析
方法。 - 【請求項４】 内因子が実質的にすべての内因子分子
が少なくとも１つのビオチン分子と共有結合で結合し、
ビオチン分子は内因子のアミノ基とカップリングしてい
るようにビオチニル化されている請求項３の方法。 - 【請求項５】 固定化ビタミンＢ１２と結合したビオ
チニル化内因子の量を定量する段階が（ｉ）結合したビ
オチニル化内因子をレポーター基で標識付けしたアビジ
ンと反応させ、（ｉｉ）次に内因子と結合したレポータ
ー基を分析することによって内因子と結合したアビジン
の量を定量する段階を有してなる請求項４の方法。 - 【請求項６】 レポーター基が酵素であり、内因子と
結合したアビジンの量を定量する段階が内因子と結合し
た酵素活性を分析する段階を有してなる請求項５の方法
。 - 【請求項７】 アビジンを標識付けする酵素が西洋わ
さびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及び
β−ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる請求項６
の方法。 - 【請求項８】 アビジンがアビジンの非特異結合を減
少させるためスクシニル化されている請求項５の方法。 - 【請求項９】 内因子が実質的にすべての内因子分子
が少なくとも１つのハプテン分子と共有結合で結合し、
ハプテン分子は内因子のアミノ基とカップリングしてい
るようにハプテンと共有結合で複合している請求項３の
方法。 - 【請求項１０】 固定化ビタミンＢ１２と結合した複
合内因子の量を定量する段階が（ｉ）結合した複合内因
子をレポーター基で標識付けした抗−ハプテン抗体と反
応させ、（ｉｉ）次に内因子と結合したレポーター基を
分析することによって内因子と結合した抗−ハプテン抗
体の量を定量する段階を有してなる請求項３の方法。 - 【請求項１１】 レポーター基が酵素であり、内因子
と結合した抗−ハプテン抗体の量を定量する段階が内因
子と結合した酵素活性を分析する段階を有してなる請求
項１０の方法。 - 【請求項１２】 アビジンを標識付けする酵素が西洋
わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及
びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる請求項
１１の方法。 - 【請求項１３】 固定化ビタミンＢ１２と結合した内
因子の量を定量する段階が（ｉ）結合した内因子をレポ
ーター基と結合した抗−内因子抗体と反応させ、（ｉｉ
）次に内因子と結合したレポーター基を分析することに
よって内因子と結合した抗−内因子抗体の量を定量する
段階を有してなる請求項３の方法。 - 【請求項１４】 固定化ビタミンＢ１２が固体支持体
と共有結合で結合している請求項１の方法。 - 【請求項１５】 固体支持体が活性化橋かけ結合ポリ
アクリルアミド、活性化セルロース及びジアゾ化アミン
−誘導体化ポリスチレンからなる群から選ばれる請求項
１４の方法。 - 【請求項１６】 ビタミンＢ１２と固体支持体との結
合がタンパク質リンカーを通じたものである請求項１４
の方法。 - 【請求項１７】 タンパク質リンカーがウシの血清ア
ルブミン及びＩｇＧからなる群から選ばれる請求項１６
の方法。 - 【請求項１８】 （ａ）試験試料を（ｉ）レポーター
基とひき続き結合することができるビタミンＢ１２の結
合パートナー及び（ｉｉ）試験試料中にビタミンＢ１２
が存在しないと実質的にすべての結合パートナーが固定
化ビタミンＢ１２によって結合されるのに十分な固定化
ビタミンＢ１２で、タンパク質を通じて固体支持体と共
有結合で結合し、タンパク質リンカーとビタミンＢ１２
の間の結合が ［ａ］ビタミンＢ１２−モノカル
ボン酸のカルボキシル基をカルボニルジイミダゾールに
よって活性化し、［ｂ］活性化ビタミンＢ１２−モノカ
ルボン酸をＮ−ヒドロキシスクシンイミドと反応させて
モノカルボン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエス
テルを得て、［ｃ］モノカルボン酸のＮ−ヒドロキシス
クシンイミジルエステルをタンパク質のアミノ基と反応
させて、それによりビタミンＢ１２をアミド結合の形成
によってタンパク質とカップリングさせることにより形
成された固定化ビタミンＢ１２と組み合わせ、（ｂ）次
に試験試料中のビタミンＢ１２の量が固定化ビタミンＢ
１２と結合した結合パートナーの量と反比例する固定化
ビタミンＢ１２と結合した結合パートナーの量を定量す
る段階を有してなる試験試料中のビタミンＢ１２検出用
競争結合分析方法。 - 【請求項１９】 ビタミンＢ１２−モノカルボン酸が
（ｅ）−異性体である請求項１８の方法。 - 【請求項２０】 ビタミンＢ１２−モノカルボン酸も
またその第一級アルコールでスクシニル化され、その結
合パートナーとの親和力を改良されたものである請求項
１８の方法。 - 【請求項２１】 ビタミンＢ１２結合パートナーが抗
体である請求項１の方法。 - 【請求項２２】 抗−ビタミンＢ１２抗体がビオチニ
ル化されている請求項２１の方法。 - 【請求項２３】 固定化ビタミンＢ１２と結合した抗
−ビタミンＢ１２抗体の量を定量する段階が（ｉ）固定
化ビタミンＢ１２と結合した抗ビタミンＢ１２抗体をレ
ポーター基で標識付けしたアビジンと反応させ、（ｉｉ
）次に抗−ビタミンＢ１２抗体と結合したレポーター基
を分析することによって抗−ビタミンＢ１２抗体と結合
したアビジンの量を定量する段階を有してなる請求項２
２の方法。 - 【請求項２４】 レポーター基が酵素であり、抗−ビ
タミンＢ１２抗体と結合したアビジンの量を定量する段
階が抗−ビタミンＢ１２抗体と結合した酵素活性を検定
する段階を有してなる請求項５の方法。 - 【請求項２５】 アビジンを標識付けする酵素が西洋
わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及
びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる請求項
２３の方法。 - 【請求項２６】 アビジンがアビジンの非特異結合を
減少させるためスクシニル化されている請求項２３の方
法。 - 【請求項２７】 固定化ビタミンＢ１２と結合した抗
−ビタミンＢ１２抗体の量を定量する段階が（ｉ）固定
化ビタミンＢ１２と結合した抗−ビタミンＢ１２抗体を
抗−ビタミンＢ１２抗体に特異的でレポーター基と共有
結合で結合した第２抗体と反応させ、（ｉｉ）抗−ビタ
ミンＢ１２抗体と結合したレポーター基を分析すること
によって抗−ビタミンＢ１２抗体と結合した第２抗体の
量を定量する段階を有してなる請求項２１の方法。 - 【請求項２８】 レポーター基が酵素であり、抗−ビ
タミンＢ１２抗体と結合した第２抗体の量を定量する段
階が抗−ビタミンＢ１２抗体と結合した酵素活性を分析
する段階を有してなる請求項２７の方法。 - 【請求項２９】 第２抗体と共有結合で結合した酵素
が西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリフォスファタ
ーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選ばれる
請求項２８の方法。 - 【請求項３０】 （ａ）試験試料を（ｉ）レポーター
基と共有結合で結合したビタミンＢ１２結合パートナー
及び（ｉｉ）試験試料中にビタミンＢ１２が存在しない
と実質的にすべての結合パートナーが固定化ビタミンＢ
１２によって結合されるのに十分な固定化ビタミンＢ１
２と組み合わせ、（ｂ）次に固定化ビタミンＢ１２と結
合したレポーター基を分析することによって固定化ビタ
ミンＢ１２と結合した結合パートナーの量を定量する段
階を有してなる試験試料中のビタミンＢ１２検出用競争
結合分析方法。 - 【請求項３１】 結合パートナーが内因子である請求
項３０の方法。 - 【請求項３２】 結合パートナーが抗体である請求項
３０の方法。 - 【請求項３３】 レポーター基が酵素であり、固定化
ビタミンＢ１２と結合した結合パートナーの量を定量す
る段階が固定化ビタミンＢ１２と結合した酵素活性を分
析する段階を有してなる請求項３０の方法。 - 【請求項３４】 酵素が西洋わさびペルオキシダーゼ
、アルカリフォスファターゼ及びβ−ガラクトシダーゼ
からなる群から選ばれる請求項３３の方法。 - 【請求項３５】 （ａ）試験試料を（ｉ）実質的にす
べての内因子分子が少なくとも１つのビオチン分子と共
有結合で結合しており、ビオチン分子は内因子のアミノ
基とカッブリングしているようなビオチニル化内因子及
び（ｉｉ）試験試料中にビタミンＢ１２が存在しないと
実質的にすべてのビオチニル化内因子が固定化ビタミン
Ｂ１２によって結合されるのに十分な固定化ビタミンＢ
１２で、ＩｇＧのリンカーによってジアゾ化アミン−誘
導体化ビーズポリスチレンビーズの固体支持体と共有結
合で結合している固定化ビタミンＢ１２と反応させ、（
ｂ）固体支持体及び固体支持体と結合したすべての内因
子を未結合内因子から分離し、（ｃ）固体支持体をスク
シニル化アビジンと共有結合で結合した西洋わさびペル
オキシダーゼとともに固体支持体と結合したすべての内
因子が西洋わさびペルオキシダーゼと結合するように温
置し、 （ｄ）次に試験試料中に初めに存在した遊離
のビタミンＢ１２の量に反比例して存在する固体支持体
と結合した西洋わさびペルオキシダーゼを分析する段階
を有してなる試験試料中のビタミンＢ１２の特異結合酵
素分析方法。 - 【請求項３６】 （ａ）血清をビタミンＢ１２を安定
化するＫＣＮの存在下でＮａＯＨとジチオトレイトール
とで処理して血清中に存在する内因性ビタミンＢ１２結
合活性を不活性化し、（ｂ）処理血清を中和し、（ｃ）
中和した処理血清にビオチニル化内因子を添加し、その
結果の溶液を温置してビタミンＢ１２を内因子と結合さ
せ、（ｄ）次にビタミンＢ１２が共有結合でカップリン
グした固体支持体を添加し、支持体を溶液中に温置して
溶液中に残存する未結合ビオチニル化内因子をすべて結
合させ、（ｅ）固体支持体を洗浄してすべての未結合物
質を除去し、（ｆ）固体支持体に西洋わさびペルオキシ
ダーゼと複合したスクシニル化アビジンを添加し、再度
温置し、（ｇ）固体支持体から過剰のアビジン−ペルオ
キシダーゼ複合体を洗浄し、（ｈ）支持体にペルオキシ
ダーゼ基質ｏ−フェニレンジアミンを添加し、それによ
り着色生成物を生成させ、生成された着色生成物の量は
血清試料中に最初に存在する遊離のビタミンＢ１２の量
に反比例するものであり、（ｉ）それにより生成された
着色生成物の４９０ナノメーターにおける吸光度を測定
する段階を有してなる血清中のビタミンＢ１２の特異結
合酵素分析方法。 - 【請求項３７】 実質的にすべての内因子分子が少な
くとも１つの配位子と共有結合で結合するように内因子
のアミノ基を通じて配位子に共有結合でカップリングし
ている変性内因子を有してなる組成物。 - 【請求項３８】 配位子分子がカルボキシル基を含有
し、配位子分子が配位子分子のカルボキシル基と内因子
のアミノ基との間のアミド結合を通じて内因子分子とカ
ップリングしている請求項３７の組成物。 - 【請求項３９】 アミド結合がＮ−ヒドロキシスクシ
ニイミジルエステルを形成する配位子のカルボキシル基
とＮ−ヒドロキシスクシンイミドとの反応及びその後の
Ｎ−ヒドロキシスクシニイミジルエステルと内因子のア
ミノ基との反応によって作られる請求項３８の組成物。 - 【請求項４０】 実質的にすべての内因子分子が少な
くとも１つのビオチン分子と共有結合で結合しており、
ビオチン分子は内因子のアミノ基とカップリングしてい
るビオチニル化内因子を有してなる組成物。 - 【請求項４１】 実質的にすべての内因子分子が少な
くとも１つのハプテン分子と共有結合で結合するよう内
因子のアミノ基を通じてハプテンと共有結合でカップリ
ングしている内因子を有してなる組成物。 - 【請求項４２】 （ａ）内因子をビオチニルアミドカ
プロン酸のヒドロキシスクシンイミジルエステルとｐＨ
約７．４、ビオチン部分の内因子分子に対する比率が約
６．３：１から約１３７５：１の間で反応させ、（ｂ）
次に残存するビオチニルアミドカプロン酸のヒドロキシ
スクシンイミジルエステルを過剰のエチレンジアミンと
反応させることによって脱活性化する段階を有してなる
内因子のビオチニル化方法。 - 【請求項４３】 請求項４２の方法により生成された
ビオチニル化内因子を有してなる組成物。 - 【請求項４４】 ビタミンＢ１２を結合パートナーと
反応させるビタミンＢ１２の競争分析において結合パー
トナーとして請求項３７の組成物を使用することからな
る改良方法。 - 【請求項４５】 ビタミンＢ１２を結合パートナーと
反応させるビタミンＢ１２の競争分析において結合パー
トナーとして請求項３８の組成物を使用することからな
る改良方法。 - 【請求項４６】 ビタミンＢ１２を結合パートナーと
反応させるビタミンＢ１２の競争分析において結合パー
トナーとして請求項３９の組成物を使用することからな
る改良方法。 - 【請求項４７】 ビタミンＢ１２を結合パートナーと
反応させるビタミンＢ１２の競争分析において結合パー
トナーとして請求項４０の組成物を使用することからな
る改良方法。 - 【請求項４８】 ビタミンＢ１２を結合パートナーと
反応させるビタミンＢ１２の競争分析において結合パー
トナーとして請求項４１の組成物を使用することからな
る改良方法。 - 【請求項４９】 ビタミンＢ１２を結合パートナーと
反応させるビタミンＢ１２の競争分析において結合パー
トナーとして請求項４３の組成物を使用することからな
る改良方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16339891A JPH04363659A (ja) | 1991-06-10 | 1991-06-10 | ビタミンｂ１２の分析 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16339891A JPH04363659A (ja) | 1991-06-10 | 1991-06-10 | ビタミンｂ１２の分析 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04363659A true JPH04363659A (ja) | 1992-12-16 |
Family
ID=15773139
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16339891A Pending JPH04363659A (ja) | 1991-06-10 | 1991-06-10 | ビタミンｂ１２の分析 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04363659A (ja) |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS52110820A (en) * | 1976-03-15 | 1977-09-17 | Nissui Seiyaku Co | Microanalysis of antigen protein by estimating immunity for enzyme antibody |
| US4082738A (en) * | 1975-02-25 | 1978-04-04 | Rohm And Haas Company | Cyanocobalamin derivatives |
| JPS5344622A (en) * | 1976-09-30 | 1978-04-21 | Mochida Pharm Co Ltd | Immunologically measuring method |
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| JPS63142268A (ja) * | 1986-11-26 | 1988-06-14 | ベーリンガー・マンハイム・ゲゼルシヤフト・ミツト・ベシユレンクテル・ハフツング | 担持材料及びその製法 |
-
1991
- 1991-06-10 JP JP16339891A patent/JPH04363659A/ja active Pending
Patent Citations (12)
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