JPS58997A - ビタミンｂ↓１↓２の検定法およびその検定用のラベル付き誘導体 - Google Patents
ビタミンｂ↓１↓２の検定法およびその検定用のラベル付き誘導体Info
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- JPS58997A JPS58997A JP57106294A JP10629482A JPS58997A JP S58997 A JPS58997 A JP S58997A JP 57106294 A JP57106294 A JP 57106294A JP 10629482 A JP10629482 A JP 10629482A JP S58997 A JPS58997 A JP S58997A
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
- C07H23/00—Compounds containing boron, silicon, or a metal, e.g. chelates, vitamin B12
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はビタミンＢ１１の検定法ならびにこの検定にお
いて有用であるビタミンＢ□の特定のラベル付誘導体に
関する。
いて有用であるビタミンＢ□の特定のラベル付誘導体に
関する。
ビタミンＢ、Ｃ以後簡略のため単にＢ、と呼ぶ）の古典
的な検定法は例えば茎、［鰭旦林を使う微生物学的検定
法である。この検定法は精確で信頼できるものとして広
く受は入れられているけれども、それは人手による技術
を含む比較的ゆつ〈ｐとした方法である＠近年になって
、もつと迅速なそして同様に信頼できる検定法を与える
という考えで、周知の競合的結合反応技術に基いた別の
方法を工夫するための試みがなされた。
的な検定法は例えば茎、［鰭旦林を使う微生物学的検定
法である。この検定法は精確で信頼できるものとして広
く受は入れられているけれども、それは人手による技術
を含む比較的ゆつ〈ｐとした方法である＠近年になって
、もつと迅速なそして同様に信頼できる検定法を与える
という考えで、周知の競合的結合反応技術に基いた別の
方法を工夫するための試みがなされた。
競合的結合に基く検定法はラベル付き反応体すなわち容
易に同定でき、そして検定できる原子または基をもって
いる反広体を有利に使用する。普通に使われるラベルに
は放射性原子、螢光性の基および酵素性の基が含まれて
いる。Ｂ１．の競合的結合検定において放射性のラベル
付きＢ、誘導体を役立てるようにする様々の提案があっ
た。商業的に使われている１つの提案はＢ、、の化合故
において１℃Ｏを組み入れることを含む。これは複雑な
方法であり、そして生産される’Ｃｏ−Ｂ、、は高価で
ある。さらにまた生底物の比放射能は比較的に低く （
２２０μＣ１／μｇ）、従ってこの”Ｃ０−Ｂ、、を使
う競合的結合検定は比較的長い計数時間（少くと４１分
間）を必要とする。低い活性と長時間の計数は非常に望
ましくない。
易に同定でき、そして検定できる原子または基をもって
いる反広体を有利に使用する。普通に使われるラベルに
は放射性原子、螢光性の基および酵素性の基が含まれて
いる。Ｂ１．の競合的結合検定において放射性のラベル
付きＢ、誘導体を役立てるようにする様々の提案があっ
た。商業的に使われている１つの提案はＢ、、の化合故
において１℃Ｏを組み入れることを含む。これは複雑な
方法であり、そして生産される’Ｃｏ−Ｂ、、は高価で
ある。さらにまた生底物の比放射能は比較的に低く （
２２０μＣ１／μｇ）、従ってこの”Ｃ０−Ｂ、、を使
う競合的結合検定は比較的長い計数時間（少くと４１分
間）を必要とする。低い活性と長時間の計数は非常に望
ましくない。
もう１つ別の方法はｌｌ５Ｉ−Ｂ、！誘導体を作ること
であった。米国特許、？ ４，２０９，６１４号明細書
には、Ｂ□をグルタル酸無水物置導体（これはＢ１２の
糖の環を介して”ｔｔに結合する）と反応させ、そして
次にグルタル鐵無水物から誘導された置換基なよう素化
することによって前記の誘導体を作ることが記載されて
いる。
であった。米国特許、？ ４，２０９，６１４号明細書
には、Ｂ□をグルタル酸無水物置導体（これはＢ１２の
糖の環を介して”ｔｔに結合する）と反応させ、そして
次にグルタル鐵無水物から誘導された置換基なよう素化
することによって前記の誘導体を作ることが記載されて
いる。
さらにまた″”Ｉ−Ｂ、、ＩＩ誘導体作る別の方法が米
国特許オ３，９８１，８６３号明細書に記載されている
◎この方法では、Ｂｌｆを先ず温和な加水分解にかけ、
主として（６１−異性体を含むモノカルボン酸の混合物
を生放する（ビタミンＢ１ｆｆ１の構造は才１図に示さ
れている。この混合物を次いでｐ−（アミノアルキル）
フェノールと反応させ、（遊離のカルボン酸基のｌりと
の反応を介して） Ｂ、、酸中へ７エノール基を導入す
る。この混合した置換Ｂ１．誘導体を次にフェノール置
換基においてよう素化する。
国特許オ３，９８１，８６３号明細書に記載されている
◎この方法では、Ｂｌｆを先ず温和な加水分解にかけ、
主として（６１−異性体を含むモノカルボン酸の混合物
を生放する（ビタミンＢ１ｆｆ１の構造は才１図に示さ
れている。この混合物を次いでｐ−（アミノアルキル）
フェノールと反応させ、（遊離のカルボン酸基のｌりと
の反応を介して） Ｂ、、酸中へ７エノール基を導入す
る。この混合した置換Ｂ１．誘導体を次にフェノール置
換基においてよう素化する。
この米ｗＡ４１１許は、そのようにして作った場合１１
ｓＩ−Ｂ、誘導体はこの混合物に対する抗体を使っての
Ｂｌｌのラジオインエノアツセイにおいて有用であるこ
とを教示している。
ｓＩ−Ｂ、誘導体はこの混合物に対する抗体を使っての
Ｂｌｌのラジオインエノアツセイにおいて有用であるこ
とを教示している。
Ｂ□の競合的結合検定法においては、使用する結合性タ
ンパク質の性質が臨界的意義をもつほど重要性であるこ
とが最近明らか（：なった〔例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ
７９／１）０２１Ｇ （国際会橢Ｗｏ ７９１００８８
０を参照されたい）６％（−１その使用が健筆から提案
されていた結合性タンパク質の中にはＢ、ｔに結合する
だけでなくコパラずン類似体にも結合するもののあるこ
とが発見された。例えばトランスフ２２２フ厘シよびＲ
タンパク質はＢ７．だけでなく人間の血清中Ｃ：存在す
るコパラ建ン類似体にも結合することが示された・この
特異性の欠除は検定結果に誤差をもたらす。使用すべき
最良の結合性タンパク質は内因子（１ｎｔｒｉｎｓｉｃ
ｆａ＠ｔｏｒ ：以後ＩＰと略称する）である。なぜ
ならＩＰは人の血清中でＢ、の生理学的活性形に対して
高度に選択性があるからである。このことは今や一般に
認められて１／１６゜従ってＩＰと強く結合するラベル
付きＢ、、Ｉｌｌ導体が求められているのである。
ンパク質の性質が臨界的意義をもつほど重要性であるこ
とが最近明らか（：なった〔例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ
７９／１）０２１Ｇ （国際会橢Ｗｏ ７９１００８８
０を参照されたい）６％（−１その使用が健筆から提案
されていた結合性タンパク質の中にはＢ、ｔに結合する
だけでなくコパラずン類似体にも結合するもののあるこ
とが発見された。例えばトランスフ２２２フ厘シよびＲ
タンパク質はＢ７．だけでなく人間の血清中Ｃ：存在す
るコパラ建ン類似体にも結合することが示された・この
特異性の欠除は検定結果に誤差をもたらす。使用すべき
最良の結合性タンパク質は内因子（１ｎｔｒｉｎｓｉｃ
ｆａ＠ｔｏｒ ：以後ＩＰと略称する）である。なぜ
ならＩＰは人の血清中でＢ、の生理学的活性形に対して
高度に選択性があるからである。このことは今や一般に
認められて１／１６゜従ってＩＰと強く結合するラベル
付きＢ、、Ｉｌｌ導体が求められているのである。
米１ｉｉ特許矛３，９８１，８６３号ＨＡ細書に記載さ
れている１１＠ １− Ｂ、 誘導体の混合物につい
て本発明者は検討したが、この混合物はＩＦを利用する
Ｂ１ｍ検定における使用には適さないことがわかった。
れている１１＠ １− Ｂ、 誘導体の混合物につい
て本発明者は検討したが、この混合物はＩＦを利用する
Ｂ１ｍ検定における使用には適さないことがわかった。
その混合物は前記特許用ＩａＩＦに記載されているよう
に）この混合物に対する抗体を結合性タンパク質として
使う場合には適当であるが、しかしその代りにＩＰを結
合性タンパク質として使う場合にはその検定は精確では
ない、この混合物の様々の区分が、驚くべきことにはＩ
Ｐに対して着しく異った親和力をもっている仁とがその
理由であることを本発明者はさらに発見した。事実、本
発明者は、誘導体の中でモノカルボン酸−（山−異性体
誘導体が伽）−または（ｅ）−異性体誘導体よりもＩＦ
に対して著しく大きい親和力をもっていることを発見し
た。付貫すると、上記の発見は［ｏｌｈｏｕｓｅおよび
人１１＠ｎ（Ｊ、Ｃ１１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、 ６０
、１３８１−１３９２ ）による報文中ｇ二報告された
結果と一致している。なお、その報告はＢ□の検定に関
するものではなく、３ｍのモノカルボン酸のラビットお
よび人間のＩＰに対する次のようｆｋ１！和力を報告し
ている。
に）この混合物に対する抗体を結合性タンパク質として
使う場合には適当であるが、しかしその代りにＩＰを結
合性タンパク質として使う場合にはその検定は精確では
ない、この混合物の様々の区分が、驚くべきことにはＩ
Ｐに対して着しく異った親和力をもっている仁とがその
理由であることを本発明者はさらに発見した。事実、本
発明者は、誘導体の中でモノカルボン酸−（山−異性体
誘導体が伽）−または（ｅ）−異性体誘導体よりもＩＦ
に対して著しく大きい親和力をもっていることを発見し
た。付貫すると、上記の発見は［ｏｌｈｏｕｓｅおよび
人１１＠ｎ（Ｊ、Ｃ１１ｎ、 Ｉｎｖｅｓｔ、 ６０
、１３８１−１３９２ ）による報文中ｇ二報告された
結果と一致している。なお、その報告はＢ□の検定に関
するものではなく、３ｍのモノカルボン酸のラビットお
よび人間のＩＰに対する次のようｆｋ１！和力を報告し
ている。
モノカルボン酸 Ｋａ Ｂ 、 、−Ｃ０ＯＨ異性体
異性体 Ｋａジアノコバラミン（切
０．０００６（ｄ）
０．３（ｍ Ｏ，
００４上記のＩｌｌ方力もちろん遊離酸に関するもので
あるが、しかし一般ｉ：同じオーダーの親和力がその誘
導体においても示されることを本発明者は見出した。
異性体 Ｋａジアノコバラミン（切
０．０００６（ｄ）
０．３（ｍ Ｏ，
００４上記のＩｌｌ方力もちろん遊離酸に関するもので
あるが、しかし一般ｉ：同じオーダーの親和力がその誘
導体においても示されることを本発明者は見出した。
従って適当に放射性の２ベルを付けた（山−異性体の−
導一体が、ＩＦを使うＢ１ｆｆ１の検定で使用するのに
適していることを本発明者は見出したのである。
導一体が、ＩＦを使うＢ１ｆｆ１の検定で使用するのに
適していることを本発明者は見出したのである。
純粋かまたは少くとも実質的に（ｂｌ−または（＠）−
異性体誘導体を含まないラベル付き（２）−誘導体を使
用することは本発明の１つの重要な特徴であるが、それ
というのは（旬−または（・クー異性体誘導体が存在す
ると″不精確な結果が導かれるからである・精製したＢ
１．（山−酸異性体のラベル付きの誘導体は新規であり
、従って本発明の１つの目的は、Ｂ１．のモノカルボン
酸（ψ−異性体の２ベル付キ誘導体を提供することであ
る・なお該誘導体はラベル付きの基を（（Ｉ−カルボン
酸基に結合してもってお９、また蚊異性体または誘導体
はＢ、の他のモノカルボン酸異性体およびそれから作ら
れる誘導体を含まないものであるｅ 本発明の他の目的はＢ、の（山−モノカルボン酸異性体
以外の他のどのようなモノカルボン酸異性体またはそれ
から作られる誘導体も存在させずＣ：、試料とＩＦなら
びにＢｔｌの（ｄｌ−モノカルボン酸異性体のラベル付
き誘導体との競合的結合混合物を作ることから取る、試
料中の８１２の検定法を提供するものである０もしこの
検定法が煮沸工程（それは晋通じ行われることであるが
、必ずしも必要ではない：本発明者らの英国特許オ２，
０１１，０７０号明細書を見られたい）を含むならば、
煮沸工程が完了した後で初めてラベル付き（２）−異性
体を反応混合物に加えることが必要である。
異性体誘導体を含まないラベル付き（２）−誘導体を使
用することは本発明の１つの重要な特徴であるが、それ
というのは（旬−または（・クー異性体誘導体が存在す
ると″不精確な結果が導かれるからである・精製したＢ
１．（山−酸異性体のラベル付きの誘導体は新規であり
、従って本発明の１つの目的は、Ｂ１．のモノカルボン
酸（ψ−異性体の２ベル付キ誘導体を提供することであ
る・なお該誘導体はラベル付きの基を（（Ｉ−カルボン
酸基に結合してもってお９、また蚊異性体または誘導体
はＢ、の他のモノカルボン酸異性体およびそれから作ら
れる誘導体を含まないものであるｅ 本発明の他の目的はＢ、の（山−モノカルボン酸異性体
以外の他のどのようなモノカルボン酸異性体またはそれ
から作られる誘導体も存在させずＣ：、試料とＩＦなら
びにＢｔｌの（ｄｌ−モノカルボン酸異性体のラベル付
き誘導体との競合的結合混合物を作ることから取る、試
料中の８１２の検定法を提供するものである０もしこの
検定法が煮沸工程（それは晋通じ行われることであるが
、必ずしも必要ではない：本発明者らの英国特許オ２，
０１１，０７０号明細書を見られたい）を含むならば、
煮沸工程が完了した後で初めてラベル付き（２）−異性
体を反応混合物に加えることが必要である。
（ｄ）−酸異性体のラベル付誘導体は、すでにラベルを
つけているかまたは後からラベルをつける仁とができる
基を、（ｄ）−酸基に更にカップリングすることによっ
て作る。
つけているかまたは後からラベルをつける仁とができる
基を、（ｄ）−酸基に更にカップリングすることによっ
て作る。
本発明によるＢ１．のゆ−異性体モノカルボン酸に対し
てカップリングするよう素置容体の好ましいものは次の
とおりである。
てカップリングするよう素置容体の好ましいものは次の
とおりである。
（１１−数構造式
１式中の８は炭素原５子１〜１８個をもつアルキレン基
である） で表わされるｐ−アンノア身キルフェノールＮｊばチラ
イン（米国特許オ３，９８１．８６３号Ｅ！４１ＩＢ書
参照）、（２） −数構造式 １式中のＲは炭素原子１〜１８４ｍをもつアルキル基で
ある） で表わされるチロシンのアルキルエステル４ＲＪＬばチ
ロシンメチルエステル、 （３）−数構造式 （式中の８は炭素原子１−１８個をもつアルキレン基で
ある） で表わされるアミノアルキルイミダゾール例えば・ヒス
タミン、 （４）−数構造式 （式中のＲは炭素原子１〜１８＠をもクアルキル基であ
る） で表わされるヒスチジンのアルキルエステル例工ばヒス
チジンメチルエステル・ 上記の（１）または（２）のよう素置容体を含む本発明
の誘導体は、米国特許？ ３，９８１，８６３号明細書
に記載された方法によって作る〔ただしＢ□の（ｄｌ−
モノカルボン酸だけを単独で使う点で骸方法と異なるこ
とはもちろんである〕。仁の米国特許才３．９８１，８
６３号明細書の記載内容は参考として本明細書に含まれ
る一上記の（３）および（４）のよう素置容体をもつ本
発明の誘導体は以下の実施例中に記載の方法によって作
る・ ラベルは例えば１１′Ｉのような放射性原子であること
ができるか、または発螢光団または酵素あるいは他のラ
ベルであることもできる。螢光性ラベル付き異性体は例
えば実質的に（−一および（・）−異性体を含まないＢ
、１の（２）−異性体モノカルボン酸を発１１光団例え
ばフルオレセインチオカルバミルエチレンジアミンと反
応させることによって作ることができる。酵素ラベル付
き異性体は、例えば実質的に僧−および（・２−異性体
を含まないＢ、の（ｄ）−異性体モノカルボン酸を酵素
例えばＩ−ガラクトンダーゼと反応させＢｔｌの酵素ラ
ベル付き−邊体を作ることができる・この目的に使うこ
とがてきる他の普通５使われる酵素としてはホースラデ
イシ＆（Ｈ洋わさび）ペルオキシダーゼおよびアルカリ
性ホス７アダー（がある。
である） で表わされるｐ−アンノア身キルフェノールＮｊばチラ
イン（米国特許オ３，９８１．８６３号Ｅ！４１ＩＢ書
参照）、（２） −数構造式 １式中のＲは炭素原子１〜１８４ｍをもつアルキル基で
ある） で表わされるチロシンのアルキルエステル４ＲＪＬばチ
ロシンメチルエステル、 （３）−数構造式 （式中の８は炭素原子１−１８個をもつアルキレン基で
ある） で表わされるアミノアルキルイミダゾール例えば・ヒス
タミン、 （４）−数構造式 （式中のＲは炭素原子１〜１８＠をもクアルキル基であ
る） で表わされるヒスチジンのアルキルエステル例工ばヒス
チジンメチルエステル・ 上記の（１）または（２）のよう素置容体を含む本発明
の誘導体は、米国特許？ ３，９８１，８６３号明細書
に記載された方法によって作る〔ただしＢ□の（ｄｌ−
モノカルボン酸だけを単独で使う点で骸方法と異なるこ
とはもちろんである〕。仁の米国特許才３．９８１，８
６３号明細書の記載内容は参考として本明細書に含まれ
る一上記の（３）および（４）のよう素置容体をもつ本
発明の誘導体は以下の実施例中に記載の方法によって作
る・ ラベルは例えば１１′Ｉのような放射性原子であること
ができるか、または発螢光団または酵素あるいは他のラ
ベルであることもできる。螢光性ラベル付き異性体は例
えば実質的に（−一および（・）−異性体を含まないＢ
、１の（２）−異性体モノカルボン酸を発１１光団例え
ばフルオレセインチオカルバミルエチレンジアミンと反
応させることによって作ることができる。酵素ラベル付
き異性体は、例えば実質的に僧−および（・２−異性体
を含まないＢ、の（ｄ）−異性体モノカルボン酸を酵素
例えばＩ−ガラクトンダーゼと反応させＢｔｌの酵素ラ
ベル付き−邊体を作ることができる・この目的に使うこ
とがてきる他の普通５使われる酵素としてはホースラデ
イシ＆（Ｈ洋わさび）ペルオキシダーゼおよびアルカリ
性ホス７アダー（がある。
純粋な１φ−モノカルボン酸異性体を作るために、８１
１を先ず米国特許オ３，９８１，８６３号明細臀（Ｊ、
Ｃ。
１を先ず米国特許オ３，９８１，８６３号明細臀（Ｊ、
Ｃ。
Ｓ、 （１９５３） 、 ３８４８〜３８６４も参照さ
れたい〕に記載されているようＣ二種かな酸性加水分解
にかける。
れたい〕に記載されているようＣ二種かな酸性加水分解
にかける。
この結果、３種のモノカルボン酸すなわち（ｂＪ、（ｄ
Ｊおよび（・）異性体の混合物が生成する。代表的には
その混合物は（・）−異性体５０１Ｇ、（Ｍ−異性体２
５チおよび（ｄｌ−異性体２５％から成る。その（ｄ）
−異性体は次に山田等（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、
、 ２４７ 、６２６６〜６２７０ ）によって記載
された方法で他の異性体から分離する。こうして分離し
た各異性体の同定はＡ１１ｅｎら（Ｊ、 Ｃｌ１ｍ、
Ｉｎｖｅｓｔ、 （１９７７） Ｊｌ 、 １３８１〜
１３９２ ）によって記載された方法を使い、ペーパー
クジマドグラフィによって実施することができる。
Ｊおよび（・）異性体の混合物が生成する。代表的には
その混合物は（・）−異性体５０１Ｇ、（Ｍ−異性体２
５チおよび（ｄｌ−異性体２５％から成る。その（ｄ）
−異性体は次に山田等（Ｊ、 Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｗ、
、 ２４７ 、６２６６〜６２７０ ）によって記載
された方法で他の異性体から分離する。こうして分離し
た各異性体の同定はＡ１１ｅｎら（Ｊ、 Ｃｌ１ｍ、
Ｉｎｖｅｓｔ、 （１９７７） Ｊｌ 、 １３８１〜
１３９２ ）によって記載された方法を使い、ペーパー
クジマドグラフィによって実施することができる。
本発明を更に充分ｇ；説明するために以下に実施例を示
すが、仁れは本発明を限定するものではない。
すが、仁れは本発明を限定するものではない。
実施例
モノカルボン酸の製造
個々の異性体は山田およびＨｏｇ＠ｎｋａｍｐ （Ｊ、
Ｂｉｏｌ 。
Ｂｉｏｌ 。
Ｃｈａｍ、 ２４７ 、６２６６〜６２７０ ）の方法
によって作りそして精製する。各異性体の同定はペーパ
ークロマトグラフィ（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖ＠ｓｔ
、 ６０ 、１３８１〜１３９２ ）によって行°う。
によって作りそして精製する。各異性体の同定はペーパ
ークロマトグラフィ（Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｎｖ＠ｓｔ
、 ６０ 、１３８１〜１３９２ ）によって行°う。
ヒスタイン複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ・）の製造前記カ
ルボン酸なインプチルーク′ＯＡ−ホルマート中間体経
由でビスタ２ンと複合体化する（！：ｒｌ−ａｎｇ＠ｒ
、 Ｂｏｒ＠ｅｋ １ＢｅｉｓｅｒおよびＬｉｅｂ＠ｒ
ｍａｎ 、 Ｊ。
ルボン酸なインプチルーク′ＯＡ−ホルマート中間体経
由でビスタ２ンと複合体化する（！：ｒｌ−ａｎｇ＠ｒ
、 Ｂｏｒ＠ｅｋ １ＢｅｉｓｅｒおよびＬｉｅｂ＠ｒ
ｍａｎ 、 Ｊ。
坦躬、９徂ジ、 ２２８ 、７１３ （１９５７）を参
照されたい〕。
照されたい〕。
この反応後、アセトンの添加によってコリノイドを沈さ
せ、その沈でんは水に再ｆＩ！ｉ解する。そして未反応
のカルボン酸はＤｏｗ＠ｘ ＡＧＩ −Ｘ、 ７ ＊
？−トの０．７ｘｌＯｍカラム上を通す仁とによって
除去する。未反応のヒスタミンはフェノール中へ抽出す
ることおよび水中へ逆抽出することによって除去する（
Ｋｏｌｈｏｕｍ＠およびＡｌｌ＠ｎ 、 Ａｎａｌｙ
ｔ、 Ｂｉｏｅｈ＠ｍ。
せ、その沈でんは水に再ｆＩ！ｉ解する。そして未反応
のカルボン酸はＤｏｗ＠ｘ ＡＧＩ −Ｘ、 ７ ＊
？−トの０．７ｘｌＯｍカラム上を通す仁とによって
除去する。未反応のヒスタミンはフェノール中へ抽出す
ることおよび水中へ逆抽出することによって除去する（
Ｋｏｌｈｏｕｍ＠およびＡｌｌ＠ｎ 、 Ａｎａｌｙ
ｔ、 Ｂｉｏｅｈ＠ｍ。
８４ 、４８６〜４９０ （１９７ｇ ）参照〕。最後
にフェノ−ｋ ノｊ終痕跡は、濃水酸化アンモニウム溶
液チーを１０に調整することならびにＤｏｗ＠ｘ ＡＧ
Ｉ −Ｘ２ア竜テートの０．７ Ｘ ＩＱｃ＠ カラ
ム上を通すととじよって除去する。その溶液を酢酸で中
和しそして−ｚｏ”ｃで貯蔵する。
にフェノ−ｋ ノｊ終痕跡は、濃水酸化アンモニウム溶
液チーを１０に調整することならびにＤｏｗ＠ｘ ＡＧ
Ｉ −Ｘ２ア竜テートの０．７ Ｘ ＩＱｃ＠ カラ
ム上を通すととじよって除去する。その溶液を酢酸で中
和しそして−ｚｏ”ｃで貯蔵する。
ヒスタミン複合体のよう素化
コバラインーヒスタ電ド複合体を２７ 、７００の分子
吸光係数を使って３６１ｎｍで分光光度計で測定し、セ
して０・１モル／１９ん酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中で
５０μモル／ ｊｓ二希釈する。複合体溶液１０μｊ（
０，５ｍモル）をＮａ ′Ｉの２０ｔｉｊ （２ｍｃｉ
、 Ｉｎモル）に加え、続いてりｐう建ンーＴ溶液（ｉ
ｆ／Ｊ）１０μ遥を加える。５分後、ビル亜硫酸ナトリ
ウム溶液（１，９ｆ／ｊ ） １０μｊ の添加によっ
て反応を停止する。未反応のよう化物はＤｏｗａｘ Ａ
ＧＩ −Ｘ、 アセテ−） ５０ ／＃ｊで回分処理
して除き、そして樹脂は水で洗う。よう素化生成物を、
ベンジルアルコール９ｔ／Ａを含む水中で１０ｏμｆ／
Ｊ（出発濃度に基づいて）の濃度に希釈し、セして４°
Ｃ〒貯蔵する。
吸光係数を使って３６１ｎｍで分光光度計で測定し、セ
して０・１モル／１９ん酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中で
５０μモル／ ｊｓ二希釈する。複合体溶液１０μｊ（
０，５ｍモル）をＮａ ′Ｉの２０ｔｉｊ （２ｍｃｉ
、 Ｉｎモル）に加え、続いてりｐう建ンーＴ溶液（ｉ
ｆ／Ｊ）１０μ遥を加える。５分後、ビル亜硫酸ナトリ
ウム溶液（１，９ｆ／ｊ ） １０μｊ の添加によっ
て反応を停止する。未反応のよう化物はＤｏｗａｘ Ａ
ＧＩ −Ｘ、 アセテ−） ５０ ／＃ｊで回分処理
して除き、そして樹脂は水で洗う。よう素化生成物を、
ベンジルアルコール９ｔ／Ａを含む水中で１０ｏμｆ／
Ｊ（出発濃度に基づいて）の濃度に希釈し、セして４°
Ｃ〒貯蔵する。
上記のよう素化を８回別々に行ったところ、Ｉの組込み
は４１９１〜５５−の範囲にあって、１２Ｕ’０〜１６
００ Ｃｉ ／ ｆ の範囲にある比放射能を与えた
。
は４１９１〜５５−の範囲にあって、１２Ｕ’０〜１６
００ Ｃｉ ／ ｆ の範囲にある比放射能を与えた
。
よう素化した複合体の結合性
よう素化した物質および〔ゝ’Ｃｏ）ジアノコバラミン
について、米国特許オ３．ｐｓｉ＠ｓａ号明細書に記載
されているように作った抗−Ｂ、ｆｆｉ血清の１０倍過
剰ならびに検定条件（下記参照）下でのＩＦの１０倍過
剰に対する結合能力を試験した。その結果を表１にまと
めた。この結果から、３つの異性体は皆米国特許オ３，
９８１，８６３号の＃４細書に記載の方法で作った抗体
といっしょに使うのｃ４適するが、ＩＦといっしょに使
うのに適しているのは１ｄＪ−異性体だけであることが
ゎかる・ 内因子ＩＦ（＜２１ Ｒ−タンパク質、Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈ−ｅｍｉｃａｌｓ社製品）をほう酸塩緩衝液（５０ｍ
モルモルｐｌ ９．５．１１７１ Ｈ８Ａ含有）に溶郷
し１単位／ｍ （２）濃度とした。トレーサーはジチオ
エリスリトール１１７１およびＫＣＮ ５０ｑ／ｉを含
有するほう酸塩緩衝液中にそれぞれ５０ｎｆ／ノに希釈
した。各検定管はシアノコバラ建ン標準液０．２ｗｇ、
）レーサー１−およびＩＰ ０．１−を含む。最高結合
はｌ−当りｌＯ単位の濃度でＩＦ ０．１ ｍＧを加え
ることによって測定した。非特異的結合はＩＰの代９に
緩衝液を加えることによって測定した。室温で１時間イ
ンキュベーションした後、アルブミンをコーチングした
木炭０．５ｐｆｆを加えた。１５００Ｇで１０分関連心
分離した後、上ゼみ液をチューブの中へ傾斜してと９そ
して計数した・Ｉｌｌからｉ／ＩｋＩｌｉＩｉ結合およ
び非特異的結合に対して補正した標準−−が才２図に示
されているが、その中で曲線人は（Ｃｏ）−ジアノコバ
ラミントレーサーに対するものでＴｏシ、そして−＠Ｂ
は（ＩＩＩＨ）シアノコバラ建ンｄ−Ｗ−ドヒスタミド
トレーサーに対するものである・本発明の検定方法（ニ
ジいては、結合性タンパク質が純！Ｆであることが好ま
しい。しかし結合性タンパク質としてＩＦとＲ−タンパ
ク質との混合物を使うこともでき、その混合物中ではＲ
−タンパク質が消化によりまた・はＲ−タンパク質の結
合部位を不活性化する８１１類似体によって不活性化さ
れてしまっているからである。
について、米国特許オ３．ｐｓｉ＠ｓａ号明細書に記載
されているように作った抗−Ｂ、ｆｆｉ血清の１０倍過
剰ならびに検定条件（下記参照）下でのＩＦの１０倍過
剰に対する結合能力を試験した。その結果を表１にまと
めた。この結果から、３つの異性体は皆米国特許オ３，
９８１，８６３号の＃４細書に記載の方法で作った抗体
といっしょに使うのｃ４適するが、ＩＦといっしょに使
うのに適しているのは１ｄＪ−異性体だけであることが
ゎかる・ 内因子ＩＦ（＜２１ Ｒ−タンパク質、Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈ−ｅｍｉｃａｌｓ社製品）をほう酸塩緩衝液（５０ｍ
モルモルｐｌ ９．５．１１７１ Ｈ８Ａ含有）に溶郷
し１単位／ｍ （２）濃度とした。トレーサーはジチオ
エリスリトール１１７１およびＫＣＮ ５０ｑ／ｉを含
有するほう酸塩緩衝液中にそれぞれ５０ｎｆ／ノに希釈
した。各検定管はシアノコバラ建ン標準液０．２ｗｇ、
）レーサー１−およびＩＰ ０．１−を含む。最高結合
はｌ−当りｌＯ単位の濃度でＩＦ ０．１ ｍＧを加え
ることによって測定した。非特異的結合はＩＰの代９に
緩衝液を加えることによって測定した。室温で１時間イ
ンキュベーションした後、アルブミンをコーチングした
木炭０．５ｐｆｆを加えた。１５００Ｇで１０分関連心
分離した後、上ゼみ液をチューブの中へ傾斜してと９そ
して計数した・Ｉｌｌからｉ／ＩｋＩｌｉＩｉ結合およ
び非特異的結合に対して補正した標準−−が才２図に示
されているが、その中で曲線人は（Ｃｏ）−ジアノコバ
ラミントレーサーに対するものでＴｏシ、そして−＠Ｂ
は（ＩＩＩＨ）シアノコバラ建ンｄ−Ｗ−ドヒスタミド
トレーサーに対するものである・本発明の検定方法（ニ
ジいては、結合性タンパク質が純！Ｆであることが好ま
しい。しかし結合性タンパク質としてＩＦとＲ−タンパ
ク質との混合物を使うこともでき、その混合物中ではＲ
−タンパク質が消化によりまた・はＲ−タンパク質の結
合部位を不活性化する８１１類似体によって不活性化さ
れてしまっているからである。
表 １
ラベル付きＢ１．（ヒスタ建ン複合体）の抗血清および
精製した内因子への結合
精製した内因子への結合
才１１はビタミンＢ１ｆｆ１の構造式を示す説明図であ
る。才２図は最縄結合および非特異的結合に対して表１
から補正を施した標準曲線を示す説明図でＴｏ９、曲線
ムは［”Ｃｏ）−ジアノコバラミントレーサーに対する
ものであり、そして曲線Ｂは〔１■Ｉ〕シアノコパラン
ンｄ−冒一ドヒスタミドトレーサーに対するものである
。また才２図の縦軸は正味の結合−を、そして横軸はコ
パラ虐ン濃度（１ろ）を示す。
る。才２図は最縄結合および非特異的結合に対して表１
から補正を施した標準曲線を示す説明図でＴｏ９、曲線
ムは［”Ｃｏ）−ジアノコバラミントレーサーに対する
ものであり、そして曲線Ｂは〔１■Ｉ〕シアノコパラン
ンｄ−冒一ドヒスタミドトレーサーに対するものである
。また才２図の縦軸は正味の結合−を、そして横軸はコ
パラ虐ン濃度（１ろ）を示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ビタミンＢ□の（ｄＪ−モノカルボン酸異性
体から調製し、（ψ−ｐルボンＩＩ基に結合したラベル
付きの基を含み、そしてビタミンＢｔｚの他のモノカル
ボン酸異性体およびそれらの誘導体を含まないことを特
徴とする、同定ラベルを含み、そしてそれによってビタ
ミンＢＨの競合的結合検定において使うことができ、そ
してそのラベルの測定によって定量することができる、
ビタミン１Ｂｔｔの誘導体０ （２） ラベル付きの基として放射性原子をもつ基を
含む前項（１）に記載の誘導体。 （３）放射性原子として１■を含む前項（２）５二記載
の誘導体・ （４）ビ） −殻構造式 Ｃ式中のＲは炭素原子１〜１８＠をもつアル命しン基で
ある） で表わされるｐ−ア之ノアルキルフェノール、例えばチ
ラｉン、 （叫 −殻構造式 （式中の８は炭素原子１〜１８個をもつアルキル基であ
る） で懺わされるチロシンのアルキルエステル１ＲｊＬばｆ
Ｅｌ シンメチルエステル、 シｉ −ｍ構造式 Ｃ式中のＲは炭素原子１〜１８個をもリアルキレン基で
ある） で表わされるア２ノアルキルイミダゾール例えばヒスタ
ミンおよび に）一般構造式 Ｃ式中の８は炭素原子１〜１８個をもつアルキル基であ
る）。 で表わされるヒスチジンのアルキルエステル例えばヒス
チジンメチルエステル のうちの１つと（ｄ）−カルボン酸基とを結合し、そし
て前記化合物■〜に）のうちの１つと前記（山−カルボ
ン酸基との結合の前または後に前記化合物四〜に）のう
ちの１つに′ｌを導入することによって形成したラベル
付きの基を含む、前項（３）に記載の誘導体・ （５） ラベル付きの基として発螢光団から取る基を
含む前項（１）ζ二記載の誘導体・ （６） （ｄ）−カルボン酸基とフルオレセインチオ
カルバンルエチレンジアミンとを反応させることによっ
て形成したラベル付きの基を含む前項（５）に記載の誘
導体・ （７） ラベル付きの基として酵素を含む基を含む前
項（１）に記載の誘導体。 ｆ８１ （ｄｌ−カルボン酸基と！−ガラクチドース
、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスフ
ァターゼとを反応させることによって形成したラベル付
きの基を含む前項（〕）に記歌の誘導体。 （９） ビタミンＢｔｕを温和な酸性加水分解にかけ
てビタミンＢ０のモノカルボン酸異性体の混合物を生成
し、そして１ｄｌ−異性体を他の異性体から分離するこ
とから成る、前項（１）に記載のビタミンＢ、ｆｉの誘
導体の製法において、分離した（ｄ）−異性体を、その
（ｄｌ−モノカルボン酸基を介して、（１）それ自体が
ラベルである化合物または（■）ラベルを含む化合物と
反応させるか、あるいは（ＩＩ後でラベルを結合するこ
とができる化合物と反応させ続いてラベルをそれに結合
させることを特徴とする、前記のビタきンｆｉ□の誘導
体の製法。 ０１ 内因子およびビタにンＢ□のラベル付き誘導体
と共に試料の競合的結合性混合物を生成し、そして結合
したまたは遊離のラベルなｍｅ、それから試料中のどり
ｔｙＢ、、を定置することから取る、液体試料中のビタ
ミンＢ□の検定方法において、前項（１）〜（８）のい
ずれか（二記載のビタミンＢＩＩのラベル付＊＊導体を
使うことを特徴とする、前記のビタミンＢ、！の検定方
法・ ０υ 試料を煮沸してその中に含まれる内因性のビタミ
ンＢＨ結合性タンパク質を変性する予備工種を含む検定
方法において、ラベル付きの誘導体を試料の澱沸後にそ
の試料と混合する、前項ＯＩに記載の方法。 Ｉ 試料として人間の血清または人間の血漿を使う前項
（ＩＩまたは（１１に記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8119147 | 1981-06-22 | ||
| GB8119147 | 1981-06-22 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58997A true JPS58997A (ja) | 1983-01-06 |
| JPH0553378B2 JPH0553378B2 (ja) | 1993-08-09 |
Family
ID=10522711
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57106294A Granted JPS58997A (ja) | 1981-06-22 | 1982-06-22 | ビタミンｂ↓１↓２の検定法およびその検定用のラベル付き誘導体 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4465775A (ja) |
| EP (1) | EP0069450B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58997A (ja) |
| CA (1) | CA1180273A (ja) |
| DE (1) | DE3262956D1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04363659A (ja) * | 1991-06-10 | 1992-12-16 | Smithkline Beckman Corp | ビタミンｂ１２の分析 |
| JP2003528041A (ja) * | 1999-10-26 | 2003-09-24 | ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション | 蛍光性コバラミンおよびその使用 |
| JP2007515457A (ja) * | 2003-12-22 | 2007-06-14 | ソリダゴ・アーゲー | 異常な細胞の増殖の診断および治療に有効なコバラミン誘導体 |
Families Citing this family (40)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5807832A (en) * | 1987-06-09 | 1998-09-15 | Biotech Australia Pty Limited | Oral delivery of biologically active substances bound to vitamin B12 |
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| US4925931A (en) * | 1988-07-14 | 1990-05-15 | Mccully Kilmer S | N-homocysteine thiolactonyl retinamido cobalamin and methods of use thereof |
| DE3900648A1 (de) * | 1989-01-11 | 1990-07-12 | Boehringer Mannheim Gmbh | Neue cobalamin-saeurehydrazide und davon abgeleitete cobalamin-konjugate |
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| US5405839A (en) * | 1989-02-28 | 1995-04-11 | Teijin Limited | Vitamin B12 derivative, preparation process thereof, and use thereof |
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| DE69221568T2 (de) * | 1991-04-02 | 1998-03-19 | Biotech Australia Pty Ltd | Systeme zur oralen freisetzung von mikropartikeln |
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-
1982
- 1982-05-18 CA CA000403150A patent/CA1180273A/en not_active Expired
- 1982-05-18 EP EP82302523A patent/EP0069450B1/en not_active Expired
- 1982-05-18 DE DE8282302523T patent/DE3262956D1/de not_active Expired
- 1982-05-24 US US06/381,267 patent/US4465775A/en not_active Expired - Fee Related
- 1982-06-22 JP JP57106294A patent/JPS58997A/ja active Granted
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|---|---|
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| US4465775A (en) | 1984-08-14 |
| EP0069450A1 (en) | 1983-01-12 |
| JPH0553378B2 (ja) | 1993-08-09 |
| EP0069450B1 (en) | 1985-04-10 |
| DE3262956D1 (en) | 1985-05-15 |
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