JPS63142268A - 担持材料及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、特異的結合性の蛋白質物質をイムノアッセイ
の原理により測定するための、相互に特異的に結合性の
物質対の一方の成分が固相に結合している担持材料を製
造する方法並びにこれに好適な担持材料に関する。

従来の技術 特異的結合性の物質を測定するにはしばしばイムノアッ
セイ原理による方法が有用である。

その際に、特異的に相互に結合性である物質対の一方の
成分が、それに対して特異的な、公知方法で標識したレ
セプターと反応する。この両方の物質からの複合体は、
この複合体に又はこの複合体の一方の成分に特異的であ
るレセプターと反応し得る。この免疫学的方法に関して
は多数の別法がある。その際に、レセプターの１つが固
相に結合していると有利である。これは、結合した反応
成分と結合しなかった反応成分の分離を簡便にする。特
異的結合性の物質を測定するに当シ、固相に結合させた
標識反応成分の量を測定するか又は溶液中に存在する標
識反応成分の量を測定し、かつこの量を測定すべき反応
成分の量疋公知方法で換算する。

固相としては、免疫学的方法で常用である内面に反応成
分が固定されているプラスチック小管又は微量滴定プレ
ートあるいは外面に反応成分が固定されている球体を使
用する。一般に、これらのプラスチック小管、微量滴定
プレート又は球体は比較的不活性なプラスチック材料よ
り成り、それ故反応成分の結合は困難を伴なう。

更に、その都度特異的な反応成分を表面に結合させる際
に、その成分がそれに対して特異的に結合性である物質
に対して特異的に結合する能力を失なわないように行な
うべきである。このような理由から、反応成分の固相へ
の結合は九いていの場合吸着によシ行なう。それ故、固
相への反応成分の固定は結合を補助する結合剤を介して
行なうことが既に提案されている。その場合にも核結合
剤への反応成分の結合がその反応成分分子の特異的反応
領域を破壊しないようにもしくは反応成分の反応部位が
固相から遠く離れて結合成分の側に向いて結合するよう
に注意しなければならない。更に西ドイツ跡１特許公開
第２５３３７０１号明細書には、より良好な結合を達成
するために、個々の免役学的に有効な蛋白質を架橋し、
その後でポリスチレン球体に吸着させることが提案され
ている。該文献に他の可能性として、免疫学的特性を有
する蛋白質と同時に不活性蛋白質を架橋させて、不活性
蛋白質と活性蛋白質とからの架橋生成物を生成し、これ
をポリスチレン球体に吸着させることが記載されている
。しかしながらこのような架橋法は選択した反応条件に
応じて１１種々の再現不可能な架橋をもたらし、その際
に架橋されなかった蛋白質並びに不溶性になつ之蛋白質
の割合が変動する。架橋度が異なるために、異なる結合
特性を有する生成物が生じる。類似方法がヨーロッパ公
開特許第１２２２０９号明細書に記載され、同じ欠点を
有している。それ故、これらのすべての公知方法は十分
に満足すべきものではなく、特異的に結合性の物質の最
適な付着をもたらさずかつ塗布された固相の再現可能な
製造にあまり好適ではない。

発明が解決しようとする問題点 それ故、本発明の目的は、特異的に結合性である物質の
固相への付着性を再現可能であるように改良しかつこの
ために好適な担持材料を提供する方法を開示することで
あった。更に、多くの免疫学的方法では混濁を回避する
ために界面活性剤の添加下に作業するので、界面活性剤
の存在でも結合させた、特異的結合性の物質が分離しな
いように付着性を改良するということが本発明の目的で
ある。

問題点を解決するための手段 この目的は、イムノアッセイの原理により特に異種分析
法で使用する念めの、特異的結合性の製法によシ達成さ
れ、約５０００００を上端る分子量を有しかつ特異的結
合性の蛋白質よシも疎水性である可溶性蛋白質を特異的
に結合性の該物質とカップリングさせ、その後反応成分
と蛋白質とからのこの複合体を疎水性固相に吸着させる
ことを特徴とする。

このように固相に固定し九特異的結合性物質は改良され
次付着性を示す。この結合は界面活性剤に対しても安定
である。多くの免疫学的方法で評価するのに必要である
検量曲線の作成では、本発明によシ固相に結合させた特
異的結合性物質により急勾配の検量曲線が得られ、これ
は精度を高める。

本発明方法の他の利点としては、結合した量を正確に制
御することが可能なことである。この付着は従来公知の
方法よりも著しく良好であるので、使用される特異的蛋
白質の量は僅かである。

本発明に好適な可溶性蛋白質の選択に当っては、その分
子量及び疎水性は特異的結合性物質の相応する数値と比
較して確定しなければならない。分子量は尚業者に公知
の方法により測定する。

可溶性蛋白質及び特異的結合性物質との間の疎水性の比
較も轟業者に常用の方法によシ行なうことができる。例
えば好適な方法は次の通シであるニ ー色素に結合後のけい光消失の比較〔“Ｂｌｏ−ｃｈｅ
ｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　”、６２４巻、１
３〜２０頁（１９８０年）〕 一疎水性クロマトグラフイでの溶離挙動の比較〔“Ｂｌ
ｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　’″、５
７６巻、２６９〜２７９頁（１９７９年）〕−表面張力
の比較〔“Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂｌｏｐｈｙｓ、　Ａｃ
ｔａ′″、６７０巻、６４〜７３頁（１９８１年）〕 一疎水相互作用クロマトグラフイ（ＨＩＣ）の保持時間
の比較〔“ＡｎｇｅＷ、　Ｃｈｅｍｌ　ｅ″′、９８巻
、５３０〜５４８頁（１９８６年）、Ｊ。

Ｃｈｒｏｍａｔ、　”　２９６巻、１０７〜１１４頁（
１９８４年）、”Ａｎａｌ、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　”　
、１３７巻、＋６４〜４７２頁（１９８４年）〕。

本発明に好適な物質の疎水性の比較は、“Ｓｅｐ。

Ｓｃｉ、　ＴｅＣｈｎＯｌ、　”、１４巻、３０５〜３
１７頁（１９７９年）に記載されている。それによれば
疎水性は例えば次の順序で上昇する：α２−マクログロ
ブリン（分子！８２００牛血清アルブミン／１４！）血
清アルブミン（分子１に〜７０ｏ００） 卵アルブミン α２ＨＳ−糖蛋白質（分子量〜４９０００）βＬＣ／β
ＩＡ−グロブリン 免疫グロブリン（分子１〜１５００００）トランスフェ
リン（分子量〜９００００）特異的結合性物質としてイ
ムノグロブリンを使用する場合、倒えばヒト血清アルブ
ミン又はα２Ｈ３−糖蛋白質は可溶性蛋白質として前処
理せずには本発明に好適ではない。

両方の蛋白質は疎水化処理及び分子量の増加処理にも念
らさなければならない。トランスフェリンでハ架橋が、
α−マクログロブリンでは疎水化が十分である。

特異的結合性の物質としてのイムノグロブリンとのカッ
プリングに前処理せずに好適である蛋白質は、例えばβ
−リポ蛋白質（分子量約３２０００００）又はα２−リ
ポ蛋白質（分子量約５〜２０００００００）である。

例えば、疎水化は熱の適用、酸、変性剤及び／又はカオ
トロピックイオンによる処理及び／又は疎水性化合物と
の化学的カップリングにより行なうことができる。

例えば、分子量の増加は熱の適用、酸、変性剤及び／又
はカオトロピックイオンによる処理及び／又は二官能性
又は多官能性蛋白質との架橋により行なうことができる
。

処理は、分子量５０００００又はそれ以上の蛋白質重合
体が得られるまで実施する。分子量５０００ｏＯ〜２０
ｏｏｏｏｏｏの蛋白質重合体を使用すると特に優れてい
る。

架橋も行なう場合、疎水化は架橋の前、その間又はその
後で行なうが、特異的結合性物質の存在においては行な
わない。

加熱により疎水化するに当っては、一般に温度４ｏ〜９
５°Ｃを１分間〜１０時間適用し、これは例えば“バイ
オヒミカーバイオフイジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、
　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ）”、６２４巻、１３〜
２ｏ頁（１９８０年）に記載されている。

例えば、酸としては酢酸、プロピオン酸、乳酸又は塩酸
を適用する。常用の濃度は１〜１００ミリモル／　ｔ　
％作用時間は１０分間〜１６時間である。

例えば、好適なカオトロピックイオンはチオシアナート
、ヨジド、フルオリド、プロミド、は尿素である。一般
にその濃度は１０ミリそシフ２〜６モル／ｌである。

疎水性化合物による誘導体合成には、可溶性脂肪酸、リ
ポイドを低分子又は高分子の形で並びに合成重合体、例
えばポリプロピレングリコール又はポリスチレンの可溶
性共重合体を使用する。誘導体合成は当業者に常用の方
法で行なう。

二官能性又は多官能性化合物による架橋は公知の蛋白質
結合試薬で行なう。これは同じか又は異なっていてよい
少なくとも２つの官能基を有しかつこれらの官能基を介
して蛋白質の官能基と反応し得る化合物である。末端位
にスクシンイミド基、マレインイミド基及び／又はアル
デヒド基が存在するアルキル鎖より成る化合物を使用す
ると優れている。

蛋白質を二官能性又は多官能性の化合物を用いて、可溶
性蛋白質と二官能性又は多官能性の化合物とを反応させ
るという公知方法で架橋させる。

疎水化及び／又は架橋に当っては分子量１００００〜７
０００００を有する蛋白質を使用すると優れている。牛
血清アルブミン、リパーゼ又は免疫ｒ−グロブリンが特
に優れている。

該蛋白質に公知方法で特異的結合性の蛋白質物質をカッ
プリングさせる。例えば、好適なカップリング法はイシ
カワ著、”　Ｊ、　ＩｒｒｒｎｕｎＯａＳＳａだ、４巻
、２０９〜３２７頁（１９８３年）に記載されている。

特異的結合性物質としては、例えば抗体、抗体フラグメ
ント、抗原又は／・ブテンのような蛋白質が好適である
。

このようにして得られた特異的結合性蛋白質物質と蛋白
質とからの複合体を固相として有用なプラスチック表面
に吸着させる。固相への吸着結合は種々の強さの相互作
用、疎水力、・双極子−双極子−又はイオン−双極子相
互作用を介して行なわれる。疎水性固相としては、疎水
性の可溶性蛋白質の表面張力よりも小さい表面張力を有
する担持材料が好適である。表面張力〈４　Ｑ　ｅｒｇ
／ｃｍ２の担持材料を使用すると優れている。ポリスチ
レン、ポリメタクリレート、テフロン、プリアミド、ス
チレンとアクリルニトリルとからの共重合体、ガラス及
びセルロース生成物が特に好適である。それらは任意の
形状で、例えばフィルム、プレート、粉末、粒子又は線
維フリース、殊にガラス繊維フリース又はセルロース−
／セルロースエステル線維及び重合体繊維からのフリー
スとして存在していてよい。

疎水性蛋白質は特に良好な吸着結合を呈する。

恐らく、疎水化により蛋白質の分子内架橋結合が開裂し
て、この蛋白質の疎水性部分が表面に達しかつそこで、
非疎水性蛋白質ではまず第一にプラスチック嵌置に見出
される親水性部分よりも良好に疎水性プラスチック表面
に付着する。

本発明方法は特異的結合性物質の測定に好適である。例
えば、一方の反応成分が固相に結合して存在する物質対
としては、抗原−抗体、ハプテン−抗体及び特異的に相
互に結合性の他の蛋白質、例えば特にストレプタビジン
もしくはアビジンとビオチンの系が好適である。

蛋白質と特異的結合性物質とからの複合体を疎水性固相
に吸着させる前に、固相を物理的に又は化学的に前処理
することもできる。例えば、プラスチック表面を前膨潤
させるかあるいは公知方法で活性化することができる。

固相イムノアッセイで使用するための本発明による担持
材料は、特異的結合性物質が結合していて、約５０００
００を上端る分子量を有する蛋白質が吸着している疎水
性固相より成っていることを゛特徴とする。

この担持材料は固相イムノアッセイに使うのに好適であ
る。それというのも特異的結合性物質が非常に良好に付
着しかつ界面活性剤の添加でも脱着しないからである。

例えば、担持材料は小管、微量滴定プレート又は球体の
形で存在し、これらは特異的結合性物質が結合している
架橋された蛋白質で被覆されている。

固相には、架橋させ九蛋白質及び特異的結合性物質から
成る複合体が吸着している。蛋白質は前記のように架橋
された牛血清アルブミン、リパーゼ又は免疫−ｒ−グロ
ブリンであると優れている。

本発明により、特異的結合性物質を良好な付着性をもっ
て持続的だ疎水性固相に固定させるための方法及び担持
材料が得られる。付着性は改良されて界面活性剤の添加
でも物質の分離をもたらさない。本発明方法は簡単に実
施することができる。

実施例 次に本発明を添付図面に基いて実施例によシ詳説する。

例Ｉ ＴＳＨに対するモノクロナール抗体のＦａｂ−７ラグメ
ントをポリスチレン小管に結合（ａ）　　Ｆａｂ−ｙラ
グメｙ）（Ｆａｂ＜ＴＳＨ＞）Ｏ製造 モノクロナール抗体（ＭＡに＜ＴＳＨ＞）をガル７ｖ　
（Ｇａｌｆｒｅ）及びミルＸり（：ｙ　（Ｍｌｌｌｓｔ
ａｌｎ）により記載された方法〔“Ｍｅｔｈ、　Ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌ。

ｇｙ”、７３巻（１９８１年）〕によシ取得する。

更に精製する九めに腹水を硫酸アンモニア沈殿にも念ら
しかつＤＥＡＥ−セルロースを介して通過させる。

引続いて、パ／４’イン分解を行なう〔“Ｂ　ｌ　ｏｃ
ｈｅｍ。

Ｙ、′、７３巻、１１９〜１２６頁（”４９５Ｑ年〕〕
。その際に生成するＦａｂ−７ラグメントを未消化のＩ
ｇＧ−分子及びＦＣ−７ラグメントがらセフ　７ｒりＸ
　（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　Ｉ　Ｑ　Ｑ　ヲ介シテ行
なうグル濾過及びＤＥＡＥ−セルロースを介して行なう
イオン交換体クロマトグラフィにょシ分離する〔“Ｍｅ
ｔｈ、　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”　ｓ　７３巻、
４１８〜４５９頁（１９８１年）〕。

（ｂ）蛋白質を添加しないＦａｂ−７ラグメントの架橋
（比較） Ｆａｂ−７ラグメント５０ダを０．０５％ル／ｌ−リン
酸カリウム緩衝液ＣＰＨ７，５）２ＩＩｔ中に溶かし、
かつジオキサン中に溶がし念（７，４■／ｍｌ　）ジス
クシンイミジルスペラート０．４　Ｒ１（製造者Ｐｉｅ
ｒｃｅ）を攪拌下に加える。２５℃で２時間恒温保持し
た後で、ｏ、１モル／　ｔ　−ＩＪシンヒドロクロリド
０．２−の添加により反応を中断する。反応パッチをリ
ン酸カリウム緩衝液（上記参照）０．２ｊｌｊで稀釈し
かつ遠心分離する。上澄みをｆｙル）　ｏｆｆル（Ｕｌ
ｔｒｏｇｅｌ）　ＡｃＡ２０２−カラム（ＬＫＢ社、Ｇ
ｒｉｆｅｌ　ｌｎｇ　／西ドイツ国在）を介して脱塩し
、その際に蛋白質４５ｒＩＩ９を含有する１１．３１４
が得られる。この調製物の１部をスベｏ　−セ（５ｕｐ
ｅｒｏｓｅｏ）−６−力’ｙ　ム（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ　
Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＧｍｂＨ社製）を用いテ０．０５
モル／ｌ−リン酸カリウム緩衝液（Ｐ）１７、ｏ）中の
流速０．５ｊｌｊ分で分画しかつ分子量約５０００００
〜５００ｏｏｏＯの画分を更に使用する。

ｆＣｌ　　未処理のγ−グロブリンによるＦＢｂ−ｙラ
グメントの架橋（比較） Ｆａｂ−フラグメントと牛からのγ−グロブリン（５ｅ
ｒｖａ社、ハイデルベルク／酉ドイツ国在）とを量比１
：１で混合する。架橋をｂ）に記載し之ように実施する
。

（ψ　前架橋したγ−グロブリンへのＦａｂ−７ラグメ
ントの結合（本発明） γ−グロブリン１．２５　？をＱ、Ｑ５モル／ｌ−リン
酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，８）ＩＣ１ｊ中に溶かし、
かつゾルパル（ｓｏｒｖａｔｔ”）冷却遠心機中で１０
分間５０００ｒｐｍで澄明になるまで遠心する。この溶
液てジスクシンイミジルスベラート１．７５ＩＩＪを添
加しかつ水２．５　ａｇで稀釈する。２５℃で壬時間攪
拌後、０．１モル／１−１７シン１０ｄを添加しかつ一
値を６．８に調節しかつ遠心分離する。上澄みを調製グ
ル濾過カラム（ＴＳＫ３０００％ＬＫＢ社、Ｇｒ；ｉ　
ｔｅｔｒ＋　ｎｇ　／西ドイツ国在）で分離し、限外濾
過を介して濃縮しかつ４℃で保存する。

この架橋したｒ−グロブリン５０■ｔ　０．０５モル／
ｌ−リン酸カリウム緩衝液５Ｒｔ中に溶かしかつ声値を
固体炭酸ナトリウムの添加によシ９．５に調節する。そ
の後、Ｎ−アセチルホモシスティンチオラクトン（５ｅ
ｒｖａ社、ハイデルベルク／西ドイツ国在）５０■を加
えかつ窒素ガスを送り込みながら２５°Ｃで５時間攪拌
する。

引続いて、このパッチを０．１モル／　ｔ−ＩＪン酸カ
リウ、１．（ｐ）１７．０）、Ｏ，ＯＯ１％ル／１ｔｊ
ｌ化ｖグネシウム及び塩化ナトリウム０．０５モル／ｌ
からの緩衝液中でウルトログル■ＡｃＡ　２０２−カラ
ムを介して脱塩する。

ａ）Ｋよシ製造したＦａｂ−７ラグメント（０，０１モ
ル／ｌ−リン酸カリウム緩衝液（ｐ）１７．Ｏ）１−中
１０■）をＤＭＳＯ（３３ｒＩＩ９／ａｊ　）中ツマレ
インイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ド：ｒ−ｘ　ｆｈ　（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ
ｈｅ−Ｉｍ　ＧｍｂＨ社）０．００２ｉｕＫよｐ２５℃
で２時間活性化し、引続いて遠心分離しかつＡｃＡ２０
２−・カラムを介して脱塩する。

次いで、このフラグメントをγ−グロブリンと合つしく
蛋白質の量比１：１）かつ２５℃及び声７．０で１時間
恒温保持する。引続いて、脱塩水に対して４℃及び蛋白
質濃度２．５１ｎ９／　ｌｊで一晩にわたって透析する
。

この複合体を直接面相への吸着に使用することができる
。

（ｅｌ　　テルモ（Ｔｈｅｒｍｏ）−ＲＳＡ（牛血溝７
Ａ／プミン）にカップリングさせたＦａｂ−７ラグメン
トの製造（本発明） テルモ−ＲＳＡ（牛血清アルブミン）の製造： ＲＳＡ−１１Ｐｔ−５０ミリモル／ｌ−リン酸カリウム
（ｐＨ７，０）１００罰中に溶かし、７０　”０に加熱
しかつこの温度で軽く攪拌しながら４時間保持する。こ
の溶液を冷却し、濾過しかつ限外濾過セル（排除限界３
０００ｏダルトン）中で濃度５０■／　ａｔ　ＶＣ調節
する。引続いて、３０倍容量の再蒸留水に対して透析し
、次いで凍結乾燥する。生成物は分子量約７０００００
を有する。

Ｆａｂ−フラグメントへのカップリングの前に、テルモ
−ＲＳＡを活性化する。このために、テルモ−ＲＳＡ６
８■を０．１モル／ｌ−リン酸カリウム（ＰＨ７，８）
ｇｓｚ中だ溶かしかつＳ−アセチルメルカプトコハク酸
アンヒドリド（ＳＡＭＢＡ）３．８〜の溶液を加える。

３時間の反応後に、５０ミリモル／ｌ−リン酸カリウム
（ｐ）ｔ６．５）２ｔに対して４’Ｏで透析する。この
テルモ−Ｒ９Ａ　ｔ−ｄ）によシ活性化したＦａｂ−フ
ラグメントと量比１：１で２５℃及び−７，０で１時間
恒温保持し、引続いて脱塩水に対して４℃及び蛋白質濃
度２．５■／ｄで１晩透析する。

この生成物を直接被覆に使用する。

ｆ）β−ガラクトシダーゼにカップリングさせたＦａｂ
−フラグメントの製造（本発明）Ｆａｂ−フラグメント
をｄ）に記載したように活性化しかつβ−がラクトシダ
ーゼのＳＨ−基に“Ｊ、　ｌｒｒｍｕｎｏａｓｓａｙ”
　、　４巻、２０９〜３２７頁（１９８３年）４Ｃより
カップリングさせる。

使用シたβ−ガラクトシダーゼは分子量５００゜ＯｏＯ
〜２００００００　を有する。

他の実験では架橋β−がラクトシダーゼ（分子量〜５０
０００００　）を使用し友。

ｇ）ポリスチレン小管をＦａｂ−ｙラグメントもしくは
その複合体で負荷 Ｆａｂ−フラグメントもしくはその複合体５０■を再蒸
留水ＩＱａｆ中に溶かす、。この溶液ｌａｄをリン酸二
水素ナトリウム５．２５１−／を及びアジ化す）　ＩＪ
ウム１？／ｌからの負荷緩衝液１０００−中で稀釈しか
つ室温で３０分間攪拌する。

それぞれのポリスチレンもしくはルーラン（Ｌｕｒａｎ
＠、製造者ＢＡＳＦ）製の小管中に前記の溶液１，５ｄ
を充填しかつ一晩（約２２時間）負荷する。その後、小
管を完全に空にし、かつ下記の機能試験を行なう。

ｈ）ＴＳＨ−測定に関する機能試験 ｇ）によシ塗布したポリスチレン−もしくはルーランロ
ー小管をＴＳＨ−臣ンチ五ン（Ｅｎｚ−ｙｍｕｍｏ−試
験（Ｂｏｅｈｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｇｍ−
ｂＨ社製、注文ｍ７３６０８２）と同様にＴＳＨ−測定
試薬で使用し、かつ検量曲線を試験処方く相応して測定
する。その際に、表１もしくは第１図中に記載の測定値
が得られる。

第１図からは、蛋白質を添加せずに固定したＦａｂ−７
ラグメントでは非常にフラットな検量曲線が得られるこ
とが明らかである（曲線１及び２）。５０００００を下
端る分子量及び低い疎水性の蛋白質へのカップリングに
より検量曲線の勾配は高くなる（曲線３）。しかしなが
ら満足すべき結果は達成されていない。これに対して、
本発明により製造した複合体を用いると十分圧高い勾配
の検量曲線が得られる（曲線４）。

※　吸着時の全蛋白質量：小管１本に対し蛋白質５μｆ
／ａｔを含有す る１、５ｄ ※※Ｔｐ（分）　例３参照 １）測定曲線の最低値（可能な限り低い方がよい） ２）測定曲線の最高値（可能な限り高い方がよい） 例２ ストレプタピジンの固定化 ａ）架橋し念ストレプタビジンの製造 ストレプタビジン（製造者：　Ｂｏｅｈｒ　Ｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅ　ｉｍ　ＧｍｂＨ）　ｈ例１ｂ）と同様に
架橋する） ｂ）ＲＳＡもしくはβ−ガラクトシダーゼに結合し念ス
トレプタビジンの製造 未架橋のＲＳＡもしくはβ−ガラクトシダーゼへの結合
は例１ｆと同様に行なう。

Ｃ）テルモ−ＲＳＡにカップリングし念ストレプタビジ
ンの製造 ストレプタビジンの活性化： ストレプタビジン６０１に９を５０ミリモル／を一リン
酸カリウム／１００ミリモル／を一塩化ナトリウム（ｐ
）１７．ｏ）６ｄ中に溶解しかつ４℃で放置する。マレ
インイミドヘキサノイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミ
ドエステル６．１６■をジオキサン６２０μを中に溶か
しかつストレプタビノン溶液中に攪拌装入する。４°Ｃ
で２時間反応させた後で、２回５０ミリモル／　ｔ　−
ＩＪン酸カリウム／１００ミリモル／を一塩化ナトリウ
ム（ｐＨ５）ｌｚに対して４℃で透析する。

ストレプタビジン及びテルモ−ＲＳＡからの複合体の製
造： ストレプタビジン６６■を５０ミリモル／ｌ−リン酸カ
リウム（ｐＨ５，０）及び塩化ナトリウム１００ミリモ
ル／　１１０　Ｉｌｌ中に溶かしかつ５０ミリモル／ｌ
−リン酸カリウム／１０ｏミリモル／を一塩化ナトリウ
ム（ｐ）１６．５）５扉を中の活性ｆルモ−ＲＳＡ−３
ＡＭＢＡ（例１ｅ）Ｉｃ！り製造）７２〜を添加する。

混合後、反応を停止させるために１モル／ｌ−ヒドロキ
シルアミン（ｐ）１７．０）５μｔを加える。３時間後
に、反応生ｆｆ物ｅｒルク０　’ｒ　トクラ７　（（５
ｕｐｅｒｏｓｅ（Ｂ）６．５０ミリモル／ｌ−リン酸カ
リウム／１００ミリモル／を一塩化ナトリウムｐ）１７
．５）を介して精製する。分子量１００００００〜５０
０００００　の複合体が得られる。

ｄ）ポリスチレン−もしくはルーラン［Ｆ］−小管をス
トレプタピジンもしくはストレプタビジン複合体で負荷 負荷を例１　ｇ）に記載し念ように行なう。

ｅ）ＴＳＨ−測定に関する標準値の測定ｄ）により負荷
した小管をＴＳＨ−エンチムン０−試験試薬（＋倍の複
合体活性）中で使用する。記載されている処方とは異な
り固定化抗体の代りにビオチニル化ＭＡに＜ＴＳＨ＞を
使用する。

このビオチニル化ＭＡＫの製造は“ＪＡＣ３”、１００
巻、３５８５〜３５９０頁（１９７８年）により行なう
。抗体は該試験において他の試薬と共に試験小管１本轟
り濃度４００ｍ９で使用する。結果は第２図に示す。図
からは、増加する分子量及び上昇する疎水性と共に検量
曲線の勾配とそれ故達底可能な精度は上昇することが明
らかである。

例３ 本発明により負荷した小管を用いてＴ３−試験を行なっ
た。そのために、試料もしくは標準溶液２００μｔをＰ
ＯＤで標識したポリクロナール抗体り合体５００μｔと
一緒に、テルモ−ＲＳＡにカップリングし之ストレプタ
ビジンで塗布し念小管中で予め恒温保持した。５分後に
、公知方法でビオチニル化し九重合Ｔ　３４００ｎｇを
緩衝液５００μを中で３０分間恒温保持した。

緩衝液としては、ＲＳＡ０．２０チ及び８−アニソノ−
１−ナフタリンスルホン酸（ＡＮＳ）０．０４チを含有
するｐｉ−１８，６５のリン酸水素ナトリウムの溶液を
使用し之。この恒温保持後に、３回洗浄し、引続いてＡ
ＢＴＳ−基質溶液ｌ　ｍｌを添加した。更に３０分間恒
温保持した後で、４０５ｎｍで光度計を用いて測定し次
。測定値は第３図の曲線から明らかである。

例牛 本発明により塗布した小管を用いてＨＢｓＡｇ−試験を
実施し念。そのために、例１　ｇ＞によシ塗布し九小管
中に、ＨＢｓ−抗原に対するビオチニル化モノクロナー
ル抗体４００　ｎ？及びＰＯＤで標識した同じ抗体５０
ミリＵを同時に、例３と同じ組成の緩衝液ｌ　ｗｒｌ中
に溶かして、標準溶液２００μｔと一緒に装入した。標
準溶液として、１つとしては精製ＨＢｓＡｇ　サブタイ
プａｙ及び１つとしては精製したＨＢｓＡｇサブタイプ
ａｄを加えた。その後、室温で手暗間恒温保持した。

小管を３回洗浄した後で、ＡＢＴＳ−基質溶液１ｄを添
加した。２０分後に反応はほぼ終結しかつ吸光度を４０
５　ｎｍで光度計を用いて測定し念。測定値は第４図か
ら明らかであり、実線の曲線はＨＢｓＡｇサブタイプａ
ｄ　　についてであシかつ点線の曲線はＨＢｓＡｇサブ
タイプａｙＫつてである。

例５ 本発明により塗布し念小管と公知方法により塗布した小
管の分離とを比較した。その念めに一方の小管を４０ミ
リモルーリン酸水素ナトリウム（声７．４）中のストレ
ゾタビジンーテルそ−Ｒ３Ａ−溶液（４μ？／ｄ　）　
１．５−を用いて２０℃で１８〜２４時間負荷した。小
管を空にした後で、塩化す）　ＩＪウム０，９慢及びＲ
Ｓ　Ａ　０．３チを含有する２％−サッカロース溶液ｌ
、　８ｍｌにより後負荷を行なつ念。この後負荷は２０
℃で３０分間行なった。引続いて、小管を２０”Ｏ及び
相対湿度４ｏチで２４時間乾燥させた。この小管は試験
の実施に使うことができる。更に、小管を公知方法で純
粋なストレゾタビジンで負荷した。これらの小管を用い
て、界面活性剤の作用による分離挙動を試験し念。結果
は次の表分離率の測定は当業者に常用の方法で、例えば
ストレゾタビジン及びストレゾタビジルーテルモーＲ８
Ａの１２５Ｉ−標識又は酵素的測定を介して行なう。

分離率の酵素的測定に当っては、塗布し念小管を、夛２
による界面活性剤を添加し念５０ミリモル／ｌ〜リン酸
カリウム緩衝液（ｐ）１７．０）と共に表２゛による条
件で恒温保持する。

引続いて室温で１時間恒温保持し、前記の緩［ｒｌ”ｔ
’洗い、ビオｆｙ−ＰＯＤ（ＰＯＤ活性２００ｍｕ／ｓ
ｕ）からの複合体と室温で１時間恒温保持し、洗浄しか
つＡ　Ｂ　Ｔ　Ｓ’−溶液Ｃ例７　）　２　ａｒｔ　全
添加する。１時間の基質反応後に、４０５　ｎｍで吸光
劇を測定しかつその測定からストレゾタビジンモしくは
ストレゾタビジン−テルモ−ＲＳＡの分離率を標準検量
曲線を介して測定する。

例６ 疎水相互作用クロマトグラフィ（ＨＩＣ）による蛋白質
の疎水性の測定 種々の化合物の疎水性は液体クロマトグラフイ（ＨｅＷ
ｔｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒｄ　１０ＱＯＬＵＳＩ）Ｋよシ
試験した。予備カラムはＢｉｏＲａｄ−Ｂｌｏｇｅｚ■
Ｔ　Ｓ　Ｋ　−フェニル−５ＰＷ　（Ｈす５ｎ＋ｘ内径
４゜６０）、カーフ　五ｄ　ＢＩｏＲａｄ−８ｉｏｇｅ
ｚ＠Ｔ　Ｓ　Ｋ　−フェニル−５ＰＷ（長さ７５ｎ×内
径７．５鶴、１０　ｔｔｍ、　１０００１　）　テ；ｈ
ッｆｔ。検ａｌとしては日立Ｆ　１．０００−フルオリ
メータを使用し念。

溶離剤／グラジェント（表３） ａ）１／１００％ルｌ／、−にＨ２ＰＯ４−１１衝Ｈ（
Ｆ！′１６．８）中ｃｏ　１．５　モル／　ｔ　−（Ｎ
Ｈ）　Ｓ。

一溶液 ｂ’）１／１００モルフ　ｔ　−ＫＨ２ＰＯ４−緩衝液
、−６，８ 表　　３ ０　　　　　　１００　　　　　３０　７０−−０．５
ｆ＋作業源度：冷却室、＋７℃ 試料準備：試料は未稀釈で使用し念。

試料の容量はｌＯμｔであった。

試験化合物は濃度０．２〜１．４〜／ｄで１０ミリモル
／ｌ−リン酸カリウム（ｐ）１６．８）中に溶解した。

表４に、種々の蛋白質もしくは特異的結合性物質の保持
時間を掲載する。保持時間が長い程、疎水性は高い。

表　　４ Ｆａｂ　ＴＳＨ４１，５ ＲＳＡ　　　　　２３．２ ｒ−グロブリン　　　　　　　　３２０β−ガラクトシ
ダーゼ　　　　　　３９，６β−ガラクトシダーゼ　架
橋した　４０．２ストレプタビジン　　　　　　　　　
３８．３テルモ−ＲＳＡ（例１ｅ）　　　　溶離不可ｒ
−グロブリン　架橋　　　　　溶離不可Ｃ例１ａ） これらの条件下で溶離不可能な蛋白質が特忙好適である
。テルモ−ＲＳＡが特に優れている。

例７ テルモーＲＳＡ〜ストレプタピジンのガラス繊維フリー
スへの吸着 ガラス繊維フリース（６Ｘ６ｍ）を吸引容量（約３０μ
ｌ）で５０ミリモル／ｌ−リン酸カリウム緩衝液（ｐ）
ｊ７．０）中の３０　ａｔ〜−テルモ−ＲＳＡ−ストレ
ゾタピジン（例２Ｃ）　ＶＣより製造）の溶液で含浸し
かつ循環空気筒中５０℃で乾燥させる。

ビオチン結合能の測定に当り、ペルオキシダーゼ（ＰＯ
Ｄ）及びＰＯＤ活性５０ｍＵ／Ｉｎｌのビオチンからの
複合体から成り、ビオチン濃度０゜５．１０．２０，３
０．＋０．５０，１００゜２００　、１０００１＃ｇ／
Ｉ／ノヒオｆ７ｊｉＪ４ｆｌｉｆ）試薬３０μｊでスト
リップを含浸しかつ２分間恒温保持する。引続いて、ツ
イーン２０２％を含む５０ミリそル／ｌ−リン酸カリウ
ム緩衝液（＃７．’Ｏ）の過剰量で洗いかっＡＢＴＳ溶
液ｄ １００ミリモル／ｌ−クエン酸塩緩衝液ｐＨ４，４５，
２ミリそル／を一過硼素酸塩 １．９モル／ｚ−Ａ８ＴＳ■（２、２’−アジノージ〔
３−エチル−ベンズチアゾリンスルホン酸（６）〕ジア
ンモニウム塩 中に装入しかつ１５分間動かす。１時間の基質反応後に
＋　０５　ｎｍで吸光度を測定して、ビオチン結合能は
半最大値のシグナルの低下を介して測定される。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴＳＨ測定用検量曲線を表わし、曲線１は未架
橋のＦａｂ＜ＴＳＨ＞、曲線２は架橋し１ｐ　ＦＢｂ＜
ＴＳ）Ｉ＞、曲線３はＦａｌ）＜ＴＳＨ＞／β−Ｇａｔ
−複合体、曲ｇ！４けＦａｂ＜ＴＳＨ＞／テルモー　Ｒ
ＳＡ−複合体を使用して、ルーラン■−小管中で得られ
念ものであり、第２図は固定化ストレゾタビジン及びビ
オチニル化ＡＫ＜ＴＳＨ＞の使用下に得られたＴＳＨ測
定用検量曲線であシ、曲線１は未架橋のストレゾタピジ
ン、曲線２Ｖｉ架橋し次ストレゾタビジン、曲線３はス
トレゾタピジン／β−Ｇｅｔ−複合体、曲線養はストレ
ゾタビジン／ＲＳＡ−複合体、曲線６はストレゾタビジ
ン／テルモ−ＲＳＡ−複合体を使って固相としてのルー
ラン［Ｆ］−小管中で得られ、曲線６は固相としてのポ
リスチレン小管中でストレゾタＶジン／テルモ−ＲＳＡ
−複合体の使用下に得られたものであう、第３図はＴ３
試験用検量曲線、第４図はＨＢｓＡｇサブタイプａｄ／
ａｙ−試験用検量曲線である。 ＦＩＧ、Ｉ Ｔ！９ＨＩＪＩＪＩｍ ＦＩＧ、２ １５１−１３＋ＬＬｌＩＩｌｌ ＦＩＧ、３ ■３−標準濃度

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、固相イムノアツセイで使用するための担持材料にお
   いて、該材料が約５０００００を上廻る分子量を有する
   疎水性蛋白質及び特異的結合性の蛋白質物質からの複合
   体を吸着させた疎水性固相より成ることを特徴とする担
   持材料。 ２、疎水性固相がポリスチレン、ポリメタクリレート、
   ポリアミド、テフロン又はスチレンとアクリルニトリル
   とからの共重合体より成る特許請求の範囲第１項記載の
   材料。 ３、蛋白質が疎水化された牛血清アルブミン（テルモ−
   ＲＳＡ）、疎水化されたリパーゼ又は疎水化された免疫
   −γ−グロブリンである特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の材料。 ４、特異的結合性物質が抗原又は抗体である特許請求の
   範囲第１項から第３項までのいずれか１項記載の材料。 ５、特異的結合性物質がストレプタビジン又はアビジン
   である特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか
   １項記載の材料。 ６、担体がガラス繊維フリース又はセルロース−／セル
   ロースエステル繊維及び重合体繊維からのフリースであ
   る特許請求の範囲第１項から第３項までのいずれか１項
   記載の材料。 ７、イムノアツセイ原理により使用する、特異的結合性
   の蛋白質物質が結合している不溶性担持材料を製造する
   方法において、特異的結合性の蛋白質物質よりも疎水性
   である、約５０００００を上廻る分子量を有する可溶性
   蛋白質をこの特異的結合性物質にカップリングさせ、か
   つ反応成分と蛋白質とからのこの複合体を疎水性固相に
   吸着させることを特徴とする担持材料の製法。 ８、可溶性蛋白質として分子量５０００００〜２０００
   ００００の蛋白質を使用する特許請求の範囲第７項記載
   の製法。 ９、可溶性蛋白質は、分子量１００００〜７０００００
   の蛋白質から５０００００〜２０００００００を上廻る
   分子量に高めることにより製造する特許請求の範囲第８
   項記載の製法。 １０、蛋白質をカップリング前に二官能性又は多官能性
   の蛋白質試薬により所望の分子量が達成されるまで架橋
   する特許請求の範囲第７項から第９項までのいずれか１
   項記載の製法。 １１、疎水化された蛋白質を使用する特許請求の範囲第
   ７項から第１０項までのいずれか１項記載の製法。 １２、蛋白質をカップリング前に、熱の適用、酸、変性
   剤又はカオトロピックイオンによる処理及び／又は疎水
   性化合物との化学的カップリングにより疎水化する特許
   請求の範囲第１１項記載の製法。 １３、二官能性化合物としてジスクシンイミジルスベラ
   ートを使用する特許請求の範囲第１０項記載の製法。 １４、蛋白質として牛血清アルブミン、リパーゼ及び／
   又は免疫−γ−ブロブリンを使用する特許請求の範囲第
   ９項から第１３項までのいずれか１項記載の製法。